اﻟﺷﻌﺑﯾﺔ اﻟدﯾﻣﻘراطﯾﺔ اﻟﺟزاﺋرﯾﺔ اﻟﺟﻣﮭورﯾﺔ La sélection des

‫ندً سٌح ندض شٌح نذًٌ ش ٍح ن ثٍح‬
REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE
Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique
Université D’Oran Es-Senia
Faculté des Sciences
Département de Biologie
Mémoir de Magister
Spécialité : Microbiologie fondamentale et appliquée
Option : Contrôle et hygiène microbiologique
Thème
La sélection des souches de Leuconostoc mesenteroides productrices de
substances antimicrobiennes
Présenté par : Mr Bouricha M’hamed
Devant le jury :
Président :
Mr Henni Je.
Examinateur : Mr Aoues AEK.
Examinateur : Mr GUESSAS B.
Rapporteur :
Mr Kihal M.
Coraporteur : Melle Benmechernene Z.
Professeur à l’Université d'Oran
Professeur à l’Université d’Oran
MCA à l’Université d’Oran
Professeur à l’Université d’Oran
MCA à l’Université d’Oran
Année universitaire : 2010/2011
REMERCIEMENT
Ce travail n’aura pas vu jour sans la bienveillance de dieu qui
je remercie.
Je remercie mon professeur Mr Kihal M. mon encadreur et le
directeur du laboratoire de la microbiologie fondamentale et
appliquée.
Je remercie aussi mon professeur Melle Benmchercnen Z. qui
m’a guidé pour réaliser ce travail
Je remercie les membres de jury, le président Mr Henni Dj. et
Mr Aouas A.E.K. et Mr Guessas B. qui ont accepter d’évaluer
ce travail
J’exprime ma gratitude à Mr Guessas B. qui m’a beaucoup
aider dans ce mémoire
Je remercie aussi Mr AEK du laboratoire pédagogique de
microbiologie
A mes parents
Dédicace
Je tenais en mon âme à dédire ce fruit aux être
les plus chers : mes parents que dieu les garde
pour moi
Un spécial dédicace à mon neveu Z. Abdelkader
et ma nièce zouzou
Je dédie ce travaiL à Ma sœur Hiziya et sON
mari Houari
a Mes sœurs KHeira et Zineb et Atika
A mes frères Mohamed et Sid Ahmed
A toute la famille Bouricha et la famille
Larabi
A mes deux chers amis Mohamed et Mourad
A Kenza, Halima, Zino et Wafaa
A Abdeslam, Younes, Wassim, Mohamed, Amina et
Fouzia.
A RACHIDA
Sommaire
Sommaire
Liste des figures
Listes des tableaux
Résumé
abstruct
‫الملخص‬
1-Etude bibliographique
Introduction .............................................................................................................. 1
1-Généralité sur le lait de chamelle et les bactéries lactiques .................................. 2
1-1-Définition du lait de chamelle............................................................................ 2
1-1-1- Caractéristiques du lait de chamelle .............................................................. 2
1-1-1-1- Caractères physiques et organoleptiques ................................................... 2
1-1-1-2- Composition chimique ............................................................................... 2
1-1-1-3-La matière grasse ........................................................................................ 3
1-2- Définition des bactéries lactiques .................................................................... 4
1-2-1-L’origine des bactéries lactiques ................................................................... 4
1-2-2-Taxonomie des bactéries lactiques ................................................................ 4
2- Le genre Leuconostoc ......................................................................................... 6
2-1-Historique .......................................................................................................... 6
2-2-Ecologie des Leuconostocs ............................................................................... 6
2-2-1- Dans divers environnement ........................................................................... 7
2-2-2- Produits fermentés ......................................................................................... 7
2-2-3- Produits laitiers ............................................................................................. 7
2-3- Caractérisation et taxonomie ........................................................................... 8
2-4- Taxonomie récente............................................................................................ 9
2-5- Résistances des leuconostocs au stress ........................................................... 10
3-Bactériocines des bactéries lactiques ................................................................... 11
3-1- Définition des bactériocines ............................................................................ 11
3-2-Classification des bactériocines ........................................................................ 13
3-2-1-Groupe 1 ........................................................................................................ 13
3-2-2-Groupe II ....................................................................................................... 13
Sous-groupe IIa : bactériocines formées d'un seul peptide ..................................... 13
Sous-groupe IIb : bactériocines formées de deux peptides ..................................... 14
3-2-3-Classes III et IV ............................................................................................. 14
3-3-Détermination de l’activité de la bactériocine .................................................. 14
3-4- La biosynthèse des bactériocines ..................................................................... 16
3-5-Mode d'action ................................................................................................... 22
3-6- Les bactériocines produites par les leuconostocs ........................................... 27
4-Le genre Listeria ................................................................................................. 28
4-1-Systématique ..................................................................................................... 28
4-2-Principaux caractères bactériologiques ............................................................ 28
4-3-Habitat et épidémiologie .................................................................................. 29
4-4-Éléments d'épidémiologie concernant les listérioses animales ........................ 30
4-5-Éléments d'épidémiologie des listérioses humaines ......................................... 30
4-6-Pouvoir pathogène ............................................................................................ 32
4-6-1-Ruminants ..................................................................................................... 32
4-6-2-Autres espèces animales ................................................................................ 34
4-7-Diagnostic ......................................................................................................... 34
4-8-Sensibilité aux antibiotiques ............................................................................. 35
2-Matériel et méthodes :
1- Prélèvement et collection des échantillons ......................................................... 37
2- Isolement et purification des souches de Leuconostoc ....................................... 37
2-1- Milieux de cultures utilisés pour l’isolement................................................... 37
2-2- Traitement des échantillons ............................................................................. 37
2-3- Isolement et purification ................................................................................. 37
3-Identification et caractérisation des isolats ......................................................... 37
3-1-Test phénotype .................................................................................................. 38
3-1-1- Examen Macroscopique ............................................................................... 38
3-1-2- Examen microscopique ............................................................................... 38
3-1-3- La catalase .................................................................................................... 38
3-1-4- conservation des souches.............................................................................. 38
3-1-4-1-Conservation courte durée ......................................................................... 39
3-1-4-2-Conservation longue durée......................................................................... 39
3-2- Test physiologiques ......................................................................................... 41
3-2-1- Croissance en milieu hypersalé .................................................................... 41
3-2-2- Croissance à pH4.8 et pH6.8 ........................................................................ 41
3-2-3- Croissance à différentes températures .......................................................... 41
3-3-Test biochimique ............................................................................................. 41
3-3-1 Production de dextrane ................................................................................. 41
3-3-2-Recherche de l’Arginine dihydrolase (ADH) .............................................. 41
3-3-3-Test de citrate ............................................................................................... 42
3-3-4- Recherche du type fermentaire .................................................................... 42
3-3-5-Etude de profil fermentaire ........................................................................... 42
4- Test biotechnologique ........................................................................................ 43
4-1- Cinétique d’acidité et de croissance ............................................................... 43
4-1-1- Dosage d’acidité (Guiraud, 1998) ............................................................... 44
4-1-2- Mesure de la croissance ............................................................................... 44
4-2- Etude des interactions bactériennes ................................................................ 45
4-2-1-Interaction par méthode directe (méthode de double couche) ...................... 45
4-2-2-Détermination de l’agent inhibiteur (méthode indirecte) .............................. 46
a- inhibition due au peroxyde d’hydrogène............................................................. 46
b- inhibition due à l’acide lactique .......................................................................... 46
c- recherche de la nature protéique de la substance antimicrobienne ..................... 46
d- Effet de la température ........................................................................................ 47
4-3-Cinétique d’acidité et de croissance en culture mixte ...................................... 47
3-Résultats et discussion :
1-Isolement et caractérisation des isolats ................................................................ 48
2- Caractérisation morphologique .......................................................................... 48
2-1-Caractérisation macroscopique ........................................................................ 48
Sur milieu solide...................................................................................................... 48
Sur milieu liquide .................................................................................................... 48
2-2-Caractérisation microscopique.......................................................................... 48
3- Caractérisation physiologique et biochimique .................................................... 50
3-1- Test physiologiques ........................................................................................ 50
3-2- Test biochimiques : .......................................................................................... 51
3-2-1 Production de dextrane .................................................................................. 51
3-2-2-Recherche de l’Arginine dihydrolase (ADH) .............................................. 52
3-3-3-Test de citrate ............................................................................................... 52
3-3-4 Type fermentaire ........................................................................................... 54
3-3-5-Profil fermentaire .......................................................................................... 55
4- Test biotechnologique ......................................................................................... 57
4-1- Cinétique d’acidité et de croissance ................................................................ 57
4-2- Etude des interactions bactériennes ................................................................ 59
4-2-1- Les interactions et la recherche de la nature de l’agent inhibiteur ............... 59
4-2-2-Détermination de l’agent inhibiteur (méthode indirecte) .............................. 65
4-3-Cinétique d’acidité et de croissance en culture mixte ...................................... 69
4-Conclusion
5-Référencces bibliographiques
6-Annexe
Liste des figures :
Figure 1. Schéma montrant l’arbre phylogénique basée sur la comparaison du gène de l’ARN
16 S, en groupant les bactéries lactiques à faible pourcentage CG et la relation lointaine avec
les germes à gram positif de haut pourcentage CG du genre Bifidobacterium et
propionibacterium .
Figure2. Schéma de la biosynthèse des bactériocines dont la production est régulée par un
système à deux composantes. Le facteur d'induction (FI) peut être la bactériocine elle-même
ou un autre peptide .
Figure 3. Schéma de la formation post-traductionnelle d'un résidu lanthionine dans
un lantibiotique .La réaction 1 est ladéshydratation du résidu sérine.
Figure 4. Montre l’action des bactériocine de la classe I qui peuvent induire la formation de
pore par un mouvement transmembranaire selon le modèle de Wedge (A) et celles de la classe
II, qui peuvent fonctionner en créant des pores sous forme de pores en barils (B) ou par un
mécanisme de moquette par lequel les peptides s’orientent en parallèle à la surface de la
membrane et interagit avec la structure de la membrane .
Figure 5. Schéma représentant la structure et le mécanisme d’action des bactériocines de la
classe-IIa à travers la perforation de la membrane cellulaire: (a) structure de la bactériocine;
(b) possibilité d’interactions avec la surface de la membrane; (c) insertion de la molécule de
bactériocine et la formation des pores hydrophiliques.
Figure (6) : Schéma résumant la méthode utilisée pour l’isolement et la purification des
souches
Figure (7) : schéma représente l’utilisation de la plaque d’Elisa pour effectuer le profil
fermentaire des souches.
Figure (8) : aspect des colonies de Leuconostoc obtenu après 24h d’incubation.
Ensemencement par stries.
Figure (9) : Aspect de culture pure de Leuconostoc sur milieu MRS liquide après 18h
d’incubation
Figure (10): observation microscopique des Leuconostoc sous le microscope optique
Figure (11) : production de dextran par les Leuconostoc
Figure (12) : test de l’hydrolyse de l’arginine.
Figure (13) : test de citrate sur milieu KMK
Figure (14) : type fermentaire sur milieu MRS liquide glucosé contenant la cloche de durham.
Figure (15) : profil fermentaire
Figure (18) : l’inhibition de Lactococcus sp par Leuconostoc mesenteroides en utilisant la
méthode directe.
Figure (19) : l’inhibition de Lactobacillus plantarum par Leuconostoc mesenteroides en
utilisant la méthode directe.
Figure (20) : l’inhibition de Listeria innoccua par Leuconostoc mesenteroides en utilisant la
méthode directe.
Figure (21) : l’inhibition d’ E. coli par Leuconostoc mesenteroides en utilisant la méthode
directe.
Figure (22) :
l’inhibition d’ St. aureus par Leuconostoc
mesenteroides en utilisant la
méthode directe.
Figure (23) : l’inhibition de Listeria ivanovii par Leuconostoc mesenteroides en utilisant la
méthode directe
Figure (24) : activité antibactérien de Leuconostoc mesenteroides vis-à-vis listeria innoccua
en utilisant milieu tamponné.
Figure (25) activité antibactérien de Leuconostoc mesenteroides vis-à-vis listeria ivanovii en
utilisant milieu tamponné.
Figure (26) activité antibactérien de leuconostoc vis-à-vis listeria inoccua on utilisant milieu
tamponné traité avec la chymotrypsine
Figure (27) activité antibactérien de leuconostoc vis-à-vis listeria ivanovii on utilisant milieu
tamponné traité avec la chymotrypsine
Figure (28) : variation du pH en fonction du temps cher les souches : ln5, B7
Listeria inoccoua et Listeria ivanovii .en culture pure.
Figure (29) : variation du pH en fonction du temps cher les souches : ln5, B7
Listeria inoccoua et Listeria ivanovii .en culture mixte.
Figure (30) : variation de l’acidité exprimée en dergrés dornic en fonction du temps cher les
souches : ln5, B7, Listeria inoccoua et Listeria ivanovii .en culture pure.
Figure (31) : variation de l’acidité exprimée en dergrés dornic en fonction du temps cher les
souches : ln5, B7, Listeria inoccoua et Listeria ivanovii .en culture mixtepure.
Figure (32) : représentation graphique de la croissance exprimé par (logN) en fonction du
temps des souches ln5, B7, Listeria inoccoua et Listeria ivanovii en culture pure.
Figure (33) : représentation graphique de la croissance exprimé par (logN) en fonction du
temps des souches ln5, Listeria inoccoua et Listeria ivanovii en culture mixte.
Figure (34) : représentation graphique de la croissance exprimé par (logN) en fonction du
temps des souches, B7, Listeria inoccoua et Listeria ivanovii en culture mixte.
Liste des tableaux :
Tableau (1) : Les espèces incluent dans le genre Leuconostoc
Tableau 2 : Rôle des protéines impliquées dans la biosynthèse d'une bactériocine
Tableau (3) : résultats des test physiologiques
Tableau (4) : le profil fermentaire des 15 souches
Résumé
Les bactéries lactiques sont utilisées dans la fermentation des produits alimentaires
depuis très longtemps à cause de leur pouvoir technologique. Tels que la dégradation des
sucres et surtout le lactose en donnant de l’acide lactique qui est le produit majeur.
Et quelques souches de bactéries lactiques ont le pouvoir de produire d’autres
substances à partir de la fermentation des sucres comme le CO 2, H2O2, les acides organiques
et les acides gras, ce groupe des bactéries est appelé hétérolactiques qui regroupe deux genres
les lactobacilles hétérolactiques et les leuconostoc.
Les Leuconostocs sont des bactéries gram positif catalase négatif capables de produire
le CO2, les produits aromatiques les acides organiques. Les études ont montrés aussi que les
espèces de ce genre de bactéries lactiques ont la capacité de produire des substances
antibactériennes type batériocine qui ont un effet sur listeria monocytogénes.
Dans notre travail nous avons isolé et purifié et identifié treize souches de
Leuconostoc mesenteroides, à partir du ait de chamelle, en utilisant les méthodes
microbiologique de base ainsi testé leur pouvoir acidifiant et leur effet antimicrobien vis-à-vis
des bactéries indésirables tels que Escherchia coli : ATCC 25922 (E.coli), Staphylococcus
aureus : ATCC 43300, Listeria inocoua ATCC 33090 et Listeria ivanovii ATCC 19119. et
finalement nous avons recherché la nature de l’agent inhibiteur.
L’inhibition de la croissance des bactéries indésirables à été remarqué par les souches
de Leuconostoc mesenteroides , les substances antimicrobiennes produites par les souches de
Leuconostoc sont de nature protéique thermorésistant. La cinétique de croissance en culture
mixte à bien montré la sensibilité des deux souches Listeria inocoua ATCC 33090 et Listeria
ivanovii ATCC 19119 aux souches de Leuconostoc .
Mots clé :
Leuconostoc, bacteries lactiques, listeria, bacteriocine, intéraction
Abstract
Lactic acid bacteria are used in the fermentation of food for a very long time because of their
technological power. Such as the breakdown of sugars and especially lactose into lactic acid,
giving is the major product.
And some strains of lactic acid bacteria have the power to produce other substances from the
fermentation of sugars such as CO2, H2O2, organic acids and fatty acids, this group of
bacteria is called hétérolactiques which includes two genera lactobacilli hétérolactiques and
Leuconostoc.
The Leuconostoc are catalase negative gram positive bacteria capable of producing CO2,
aromatic organic acids. Studies have also shown that species of this genus of lactic acid
bacteria have the ability to produce antibacterial substances such batériocine that impact on
Listeria monocytogenes.
In our work we have isolated and purified and identified thirteen strains of Leuconostoc
mesenteroides from the camel has, using basic microbiological methods and tested their
acidifying power and their antimicrobial effect vis-à-vis the undesirable bacteria such as
Escherchia coli ATCC 25922 (E. coli), Staphylococcus aureus ATCC 43300, ATCC 33090
Listeria inocoua and Listeria ivanovii ATCC 19119. and finally we investigated the nature of
the inhibitor.
Inhibition of growth of undesirable bacteria was noticed by strains of Leuconostoc
mesenteroides, the antimicrobial substances produced by strains of Leuconostoc are
proteinaceous heat-resistant. The kinetics of growth in mixed culture with clearly
demonstrated the sensitivity of the two strains ATCC 33090 and Listeria inocoua Listeria
ivanovii
ATCC
19119
strains
Keywords:
Leuconostoc, lactic acid bacteria, Listeria bacteriocin, interaction
of
Leuconostoc.
‫الملخص‬
‫تغتخذو تكتٍش خ نحهٍة يُز ن ذٌى فً نتخًش خ نغز ٍح نى تتًٍض ته يٍ خصا ص تكُ ن خٍح يٍ أهً ا تحهٍم‬
‫نغكشٌاخ و َتاج كًٍح يٍ حًط نهثٍ نزي ٌ تثش نُاتح ألعاعً ن ًهٍح نتخًش‪.‬‬
‫كًا أٌ هُاك ت ط نغالالخ نتً ن ا ن ذسج عهى إَتاج ي د أخشى َطالقا يٍ تخًٍشها نهغكشٌاخ يثم‬
‫‪ CO2, H2O2‬و‬
‫ألحًاض ن ض ٌح و ألحًاض نذهٍُح‪ .‬هز نُ ع يٍ نثكتٍش خ ٌطهق عهٍه عى يتغاٌشج نتخًش يٍ أهى ألخُاط‬
‫‪.Leuconostoc.‬‬
‫و يٍ أهى خصا ص هز ندُظ ي خثح ندش و عانثح نكتالص قادسج عهى َتاج ي د عطشٌح ألحًاض ن ض ٌح و‬
‫‪ CO2‬كًا ن ا ن ذسج عهى َتاج ياد يثثطح نًُ نثكتٍش خ غٍش نًشغ ب فٍ ا خاصح ‪Listeria monocytogénes‬‬
‫قًُا فً عيهُا هز ت ضل و ت خٍص ‪ 13‬عالنح يٍ َ ع ‪ Leuconostoc mesenteroides‬يٍ حهٍة نُاقح‬
‫تاعت ًال نطشق نًٍكشوتٍ ن خٍح كًا قًُا تذس عح قذست ا نتحًٍضٍح و كزنك قذست ا عهى تثثٍط ًَ نغالالخ غٍش‬
‫نًشغ ب فٍ ا‬
‫‪Escherchia coli : ATCC 25922 (E.coli), Staphylococcus aureus : ATCC 43300,‬‬
‫‪Listeria inocouaATCC 33090‬و‪ Listeria ivanovii ATCC 19119‬وي شفح َ ع نًادج نًُتدح نًثثطح‪ .‬نتً‬
‫وخذخ تأَ ا ر خ طثٍ ح تشوتٍٍُح وي اويح نهحش سج‪.‬‬
‫و قذ الحظُا أٌضا أٌ نهغالنتٍٍ ‪ B7‬و ‪ ln5‬ن ًا ن ذسج عهى تثثٍط ًَ كم‬
‫‪Listeria ivanovii‬‬
‫فً نحهٍة و رنك تاعت ًال نًض س ع نًختهطح‪.‬‬
‫كلمات المفتاح‬
‫‪ ،‬تكتشٌا حًط نالكتٍك‪ ,‬نتضاد نثكتشٌ عٍُاخ‪.Listeria sp. Leuconostoc,‬‬
‫يٍ‪Listeria inocoua‬‬
Rappel bibliographique
Introduction
Les bactéries lactiques sont économiquement importantes à cause de leur utilisation
étendue dans les fermentations de nourriture et d’aliments. Plusieurs espèces de bactéries
lactiques produisent une large variété de substances avec une activité antimicrobienne qui
peut être utilisée pour la préservation des aliments. Dans un certain nombre de cas, l’activité
inhibitrice pourrait être attribuée aux produits de fin du métabolisme comme l’eau oxygénée,
diacétyl st les acides organiques (Daeschel, 1989).
Les leuconostoc des bactéries lactiques héhéroferfermentaires capable de produire a la
fois de l’acide lactique, l’acide acétique, des prduits aromatiques et le CO 2 ( Kihal, 1996). Ce
genre de bactéries a la capacité de produire des substances antimicrobinnes type bactériocine
qui ont la capacité d’inhiber listeria moncytogenes (Wilson et al ;2005. Meyr-Broseta et al
2002)
Les recherches ont montré que le genre de Listeria appartient aux bactéries gram
positives phylogénitiquement proche aux bactéries lactiques. Ce genre est caractérisé par sa
pathogénicité et sa résistance à la condition de conservation, ce qui représente un risque pour
la santé humaine.
Plusieurs travaux de recherche ont montré que certaines espèces du genre
Leuconostoc sont capables de produire des substances antimicrobiennes type bactériocines
capable d’inhiber Listeria monocytogéne.
Pour ces multiple raisons est basé le choix de notre sujet: l’étude des interactions
bactériennes qui permettra de contrôler la présence indésirable de Listeria par l’action des
substances antimicrobiennes produites par des souches de Leuconostoc isolées à partir du lait
de chamelle.
1-Généralité sur le lait de chamelle et les bactéries lactiques :
1-1-Définition du lait de chamelle:
Le lait de chamelle constitue depuis des temps très lointains, la principale ressource
alimentaire pour les peuplades nomades qui le consomment habituellement à l'état cru ou
fermenté. Il est considéré comme l’aliment de base pour une période annuelle prolongée, dans
la plupart de ces zones pastorales sahariennes. (Siboukeur, 2009)
Même s’il présente une composition physico-chimique relativement similaire à celle
du lait bovin, ce lait se singularise néanmoins par une teneur élevée en vitamine C et en
niacine et par la présence d'un puissant système protecteur, lié à des taux relativement élevés
en Lysozyme, en Lactoperoxydase (système LP/ SCN/ H2O2), en Lactoferrine et en
bactériocines produites par les bactéries lactiques. Ceci prolonge naturellement sa
conservation de quelques jours sous des températures relativement élevées. (Sboui,2009)
1-1-1- Caractéristiques du lait de chamelle
1-1-1-1- Caractères physiques et organoleptiques
Le lait de chamelle est de couleur blanche, en raison notamment de la structure et de la
composition de sa matière grasse, relativement pauvre en β-carotène (Sawaya et al, 1984). Il
est légèrement sucré, avec un goût acide, parfois même salé (Abdel-Rahim, 1987) et/ou amère
(Ramet, 2003). Cette variabilité dans le goût est liée au type de fourrage ingéré ainsi qu’à la
disponibilité en eau (Yagil et Etzion, 1980 ; Wangoh et al, 1998). Le pH du lait camelin se
situe autour de 6,6 et l'acidité est de l'ordre de 15° Dornic. Sa densité oscille entre 0,99 et
1,034 avec une viscosité moyenne de 2,2 centipoises (Hassan et al, 1987) et un point de
congélation variant de –0,53 à –0,61°C.
1-1-1-2- Composition chimique
La composition chimique globale du lait de chamelle, même si elle fluctue selon les
auteurs (donc selon les animaux et l’environnement considéré), montre néanmoins des teneurs
importantes et équilibrées en nutriments de base (protéines, matière grasse et lactose) avec des
proportions similaires à celles présentes dans le lait de vache. Les teneurs en protéines et en
matière grasse varient respectivement de 2,5 à 4% et de 1,1 à 4,6% (avec une fréquence
élevée à des taux supérieurs à 3%), alors que la teneur en lactose fluctue entre 2,5 et 5,6%.
(Siboukeur, 2009).
Les concentrations élevées observées pour ce dernier nutriment expliqueraient la
saveur parfois sucrée du lait de chamelle rapportée par plusieurs auteurs (Gnan et Shereha,
1986 ; Bayoumi, 1990).
La teneur en eau du lait camelin, qui varie selon son apport dans l’alimentation, atteint
son maximum pendant la période de sécheresse. En effet, il a été montré que la restriction en
eau alimentaire des chamelles se traduit par une dilution du lait : un régime riche en eau
donne un lait ayant un taux de 86% alors que dans un régime déficient, celui-ci s’élève à 91%
(Yagil et Etzion, 1980a ; Faye et Mulato, 1991). Cette dilution pourrait être l’effet d’un
mécanisme d’adaptation naturelle pourvoyant en eau les chamelons durant la période de
sécheresse.
Les sels minéraux présents dans le lait de chamelle sont aussi diversifiés que ceux
rencontrés dans le lait de vache. On y dénombre en effet des macro et des oligo-éléments qui
se trouvent sous forme de sels (phosphates, chlorures et citrates) ou de métaux divers
(sodium, potassium, magnésium, calcium, fer, cuivre, zinc...etc.).
Le lait de chamelle se singularise par sa richesse relative en vitamines B3 (niacine) et
en vitamine C. Même si des variations importantes (de 25 à 60 mg/l) de la teneur de cette
dernière dans les laits camelin sont rapportés (Farah, 1993), il n’en demeure pas moins que les
teneurs signalées (autour de 36 mg/l selon Farah et al, 1992) sont en moyenne 3 fois plus
élevées que celles présentes dans le lait bovin, qui ne dépassent pas 22 mg/l selon Mathieu
(1998). Cette caractéristique est particulièrement intéressante, car elle permet au lait de cette
espèce, par son apport important en cette vitamine, de répondre aux besoins nutritionnels,
aussi bien du jeune chamelon que des populations locales, qui vivent dans un environnement
où l’apport en ce type de vitamine est particulièrement limité.
Farah (1993) signale que le lait camelin contient des teneurs plus faibles en vitamines
A et E et en certaines vitamines du groupe B (vitamine B2, B5 et B9).
1-1-1-3-La matière grasse :
La matière grasse laitière qui représente une source importante d’énergie, est
constituée essentiellement de lipides et de substances lipoïdiques. Néanmoins des composés
protéiques sont présents dans la membrane du globule gras. Elle constitue également, un
apport important en acides gras essentiels et en vitamines liposolubles.
Les quelques études consacrées à cette matière ont mis en évidence son apport quantitatif et
qualitatif (Glass et al, 1967 ; Hagrass et al, 1987).
Néanmoins, pour ce dernier volet, la composition et les propriétés physicochimiques et
structurales de cette matière lipidique n’ont fait l’objet que de quelques investigations limitées
1-2- Définition des bactéries lactiques :
Comme toutes les bactéries, les bactéries lactiques (BL) sont des micro-organismes
vivants et unicellulaires (procaryotes) très répandus dans la nature car se reproduisant
rapidement. On les trouve notamment dans le sol et le lait. Les BL font partie d’un grand
groupe bactérien divisé en différents sous groupes selon le genre (ex : Lactobacilles ou Lb.) et
l’espèce (ex ; Lb. lactis, Lb. acidophilus, Lb. casei…). Des espèces qui peuvent encore être
classées en sous espèces, variétés et souches (ex : Lactococcus lactis ssp. lactis var.
diacetylactis). Les BL peuvent avoir différentes formes : sphériques (coques/genre
Streptococcus, Lactococcus…), en bâtonnets (bacilles/genres Lactobacillus) ou encore
ovoïdes. Elles ont cependant toutes en commun le fait de produire de l’acide lactique. C’est
pourquoi elles sont classées ensembles (Metchnikoff, 1908 ; Sandine et al., 1972 ; Carr et al.,
2002).
Les bactéries lactiques sont gram positive, immobiles, asporulées, de formes coccoide
ou bâtonnet, fermentent les carbohydrates en acide lactique principalement.
En produisant de l’acide lactique, les BL modifient le milieu dans lequel elles se trouvent.
Cette fermentation lactique est utilisée dans la fabrication de nombreux produits fermentés.
Produits laitiers essentiellement (yaourts, fromages etc.), mais aussi légumes (choucroute,
olives, cornichons), alcool (vin, cidre, bière), charcuteries (jambon, saucissons), pains au
levain etc. La fermentation modifie les textures et les saveurs des aliments d’origine et en
améliore la conservation.
1-2-1-L’origine des bactéries lactiques :
Les bactéries lactiques ont été isolées à partir de nombreux milieux naturels (végétaux,
animaux et humains) (Adams, 1995; Valerie et al, 2003 ).
1-2-2-Taxonomie des bactéries lactiques :
Ce groupe de bactéries appartient aux genres suivants: Carnobacterium, Enterococcus,
Lactobacillus, Lactococcus, Lactosphaera, Leuconostoc, Melissococcus, Oenococcus,
Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus et Weissella (Vandamme et al.,
1996; Stiles et Holzapfel, 1997, Axelson, 2004).
Aussi les genres Aerococcus, Microbacterium et Propionibacterium qui regroupent
des bactéries gram positif et non sporulées et productrices d’acide lactique appartenant à la
famille des actinobactriacé (Sneath et Holt, 2001) ainsi que le genre Bifidobacterium (Gibson
et Fuller, 2000; Holzapfel et al., 2001) sont aussi impliquées dans l’industrie agro-alimentaire.
La taxonomie récente des bactéries lactiques est basée sur l’étude de la comparaison
de l’ARN ribosomal 16S (caractères phylogénétiques).
Figure 1. Schéma montrant l’arbre phylogénique basée sur la comparaison du gène de l’ARN
16 S, en groupant les bactéries lactiques à faible pourcentage CG et la relation lointaine avec
les germes à gram positif de haut pourcentage CG du genre Bifidobacterium et
propionibacterium (Holzapfel et al., 2001).
2- Le genre Leuconostoc :
2-1-Historique :
Le genre Leuconostoc a été défini par Van Thieghem en 1878. Le terme Leuconostoc
vient du mot Nostoc qui est une algue bleue mucilagineuse et de leuco qui veut dire blanc. Les
Leuconostocs sont apparus à l'origine (rappelons qu'à cette époque, l'examen microscopique,
c'est-à-dire la morphologie, était un critère prédominant de l'identification), sous forme de
chaînes, d'aspect mucilagineux, non pigmentés. Les premières souches ont été isolées à partir
d'accidents apparus dans des sucreries. Or les Leuconostocs responsables de ces accidents
produisent des dextranes et en milieu saccharosé, les chaînes de cocci sont entourées d'une
gaine bien distincte à l'examen microscopique: gaine qui rappelle celle des Nostocs. Ce n'est
qu'en 1912 que Beijerinck isola du beurre et d'autres produits laitiers des microorganismes
identiques aux Leuconostocs antérieurement décrits, ces microorganismes produisaient de la
gomme à partir du saccharose: il les appela Lactococcus dextranicus.
En 1919, Orla-Jensen, dans son étude sur les bactéries lactiques sépara le genre
Betacoccus du genre Streptococcus. Il choisit de donner le nom de leuconostocs en
technologie laitiere Betacoccus à ces bactéries produisant de l'acide lactique D( -) parce que
ces bactéries se trouvaient sur les betteraves (Beta communis) et autres produits végétaux. Les
résultats d'ORLA-JENSEN montraient pour la première fois qu'il existait une relation possible
entre les Leuconostocs produisant des dextranes (Betacoccus) et certains streptocoques
producteurs d'acide lactique, streptocoques trouvés dans les produits laitiers et les végétaux
fermentés. ORLA-JENSEN divisait le genre Betacoccus en deux espèces B. arabinosaceus et
B. bovis d'après leur capacité de fermenter l'arabinose.
En ce qui concerne le caractère hétérofermentaire des Leuconostocs, c'està- dire leur
capacité de produire du CO2 à partir du glucose, mis en évidence en 1918 par EVANS, il fut
confirmé par HUCKER en 1928.
Les Leuconostocs ont pris peu à peu un intérêt économique potentiel et des tentatives
de classification sont apparues dès les années 30.
2-2-Ecologie des Leuconostocs :
Les Leuconostocs sont très répandus dans la nature;(Sanchez et al ,2005). Elles
colonisent des écosystèmes très* varié du point de vue physico chimique tel sue les végétaux
et les animaux.
2-2-1- Dans divers environnement :
Les leuconostocs sont présentes dans divers écosystèmes, elles colonisent les végétaux
qui constituent leur habitat écologique normale (Sanchez et al ,2005). Bien que leur
population soit réduite comparée à celles des autres bactéries et des levures aérobies
(Buckenhukes, 1993). A partir de cet habitat d’origine, ils peuvent facilement se propager
dans diverses niches comprenant les matières végétales telles que les légumes et les ensilages
(Ennahar et al, 2003) et les produits alimentaires fermentés.
Les bactéries du genre Leuconostoic peut être isoler à partir de la matière fécale des
humains et des échantillons de lait de mammite (Dal Bello et al, 2003). Et aussi elles ont été
isolées à partir de la microflore de bétail (Brashears et al, 2003), de poisson (Ringo et
Gatesoupe, 1998), et des insectes (Ohkuma et Kudo, 1998 ; Reeson et al, 2003) .
Le genre Leuconostoc était parmi les premiers genres du groupe de bactéries lactiques
étudié pour leur role causatif dans des pertes commerciales dans l’industrie du sucre (Day,
1992). Ces bactéries ont été également associées à la détérioration des poissons (Lyhs,2002)
et des produits carnés (Bjorkroth et al, 2000 ; Hamasaki et al, 2003) .
2-2-2- Produits fermentés :
Les leuconostocs jouent un rôle important dans la fermentation des produits
alimentaires varies. La source da la flore microbienne peut êtres la matières première quant à
la production du fromage de lait cru, de la choucroute et de quelque saucisses fermentées ou
des cultures de ferment référencier.
Pendant la fermentation, les produits finaux du métabolisme d’hydrate de carbone
contribuent non seulement à l’acidification mais également à la saveur et à la texture du
produit. La fermentation peut également augmenter la qualité alimentaire du produit en
augmentant sa degestibilité, comme dans la fermentation du lait en fromage, ou en réduisant
sa toxicité (Gueguen et al, 1997).
2-2-3- Produits laitiers :
Les souches Ln. mesenteroide subsp. cremeoris ou de Ln. lactis sont classiquement
utilisées dans la production du beurre et de crème et quelques produits laitiers fermentés
(Vedamuthu, 1994).
La présence de Leuconostoc est régulière dans de nombreuses variétés de fromages,
sans adition des ferments starters de Leuconostoc, en particulier en fromage du lait cru. Cogan
et al (1997) dans une étude étendue sur la flore lactique de 35 fromages européens différents
comprenant 14 fromages artisanaux, ont constaté que parmi 4379, 10% de souche étaient des
leuconostocs, ce taux a été comparé aux taux des lactobacilles (mésophile, 12% et
thermophile, 14%). Et les entérocoques 17%. Ces résultats confirment des données
précédentes indiquant la présence du Leuconostoc dans la majorité des fromages de lait cru
(Devoyod et Poullain, 1998).
De nombreuses études sont encore consacrées à l’écologie des fromages artisanaux, et
l’évolution des principaux groupes microbiens pendant la fabrication. Les études éditées les
cinq dernières années se sont fondées progressivement sur de nouvelles méthodes qui se base
sur la biologie moléculaire (Mas et al, 2002 ; Tavaria et Malcata, 2003).
Leuconostoc est présent dans une grande variété de lait fermenté. Ces bactéries sont
également parmi les composants du grain de kéfir ; légèrement comparés aux levures,
intervenant dans la production de l’éthanol et de l’acétate (Robinson et al, 2002).
2-3- Caractérisation et taxonomie :
La connaissance de l’écologie microbienne dans diverses places et des processus de
fermentations pourrait également s’améliorer par l’apparition de l’identification moléculaire
quoique les caractères biochimiques demeurent d’intérêt principal pour des applications
technologiques. Il a été basé depuis longtemps sur des caractères phénotypiques pour isoler et
caractériser les bactéries lactiques y compris les leuconostocs, ainsi pour différencier entre
l’espèce ou la sous-espèce (tableau 1). on peut citer : la tolérance à l’oxygène, la résistance à
la salinité dans différentes concentrations, l’aptitude à produire du gaz et des produits
aromatiques, le profil fermentaire et la production des exopolysaccarides.
L’emploi de ces méthodes classiques a l’inconvénient de ne refléter qu’une quantité
réduite d’information sur l’espèce et la sous-espèce de plus le choix des critères considérés
comme des critères de base se diffère d’un auteur à un autre, ce qui est une source potentielle
d’instabilité, dans les dernières décennies, les nouveaux outils moléculaires, en particulier les
techniques basé sue les progrès réaliser dans la connaissance de l’ADN, ont contribué
largement à clarifier la phylogénie du Leuconostoc et identifier de nouvelles espèces et ont
donné une identification fiable et cohérente. Ces techniques sont employées seuls ou
combinées pour estimer la diversité moléculaire ou pour identifier les leuconostocs au niveau
de l’espèces ou la sous- espèces (Gurtler et Mayall, 2001).
Les méthodes basées sur l’ADN sont extensivement employées pour la différentiation
des leuconostocs (Reeson et al, 2003). La séparation de l’ADN 16S ribosomal par
l’éléctophorèse de gel de gradient de Température Temporelle (TTGE) est d’intérêt particulier
parce qu’elle permet une identification rapide de la plupart des espèces bactériennes qui
colonisent les produits laitiers, y compris les leucnostocs (Ogier et al, 2002). La distinction
entre les sous-espèces de Ln. mesenteroides : dextranicum et cremoris a été confirmé en
utilisant des modèles du profil protéique ou ribotypage (Perez et al, 2002 ; Ghazi et al, 2006)
tandis que Cibik et al (2000) ont proposé que ces sous-espèces puissent être des biovars, en
utilisant d’autres méthodes moléculaires.
Tableau (1) : Les espèces incluent dans le genre Leuconostoc
Les espèces récentes de Leuconostoc
L’ancienne nomenclature
Ln. mesenteroides
Subsp. cremoris
Subsp. dextranicum
Subsp. Mesenteroides
Ln. lactis
Ln pseudomesenteroides
Ln carnosum
Ln. gelidum
Ln. fallax
Ln. cireum
Ln. amelibiosum
Ln. argentinum
Ln. gasicomitatum
Ln. kimchi
Ln. ficulneum
Ln. fructosum
Lactobacillus fructosus
2-4- Taxonomie récente :
Seulement quatre espèces de Leuconostoc sont été inclues dans le manuel de Bergey
de la systématique bactériologique (Garvie, 1986), les espèces de Ln. mesenteroides
comportant trois sous-espèces Ln. mesenteroides subsp mesenteroides, Ln. mesenteroides
subsp dextranicum et Ln. mesenteroides subsp cremoris (tableau 1). Les deux faits principaux
au sujet du leuconostoc sont la découverte du genre Weissella qui comporte W.
paramesenteroide (précédemment Ln paramesenteroides) et Ln. Oenos comme nouveau
genre, Oenococcus oeni (Dick, et al, 1995). Onze nouvelles espèces ont été décrites : ln
gelidum et Ln. carnosum isoler dans des produits à base de viande, Ln. citrieum et Ln.
pseodomesenteroides à partir des isolats ciliniques ; Ln. fallax de la choucroute, Ln.
argentinum du lait cru de l’argentine, Ln. gasicomitaatum lié à la détérioration de viande, Ln.
kimchii et Ln. inhae provenant du kimchi, Ln. ficulneum des figues mures et lnfructosum
(précédemment Lb. fructosus). Les souches trouvées dans la microflore de Vespula germanica
présentent une homologie de 90% avec les espèces connues de Leuconostoc et peuvent
constituer un nouveau taxon (Reeson et al, 2003).
2-5- Résistances des leuconostocs au stress :
Les espèces de Leuconostoc peuvent survivre à de longues durées dans des
environnements défavorables aussi divers que le sucre, le pétrole ou les industries laitières.
Elles sont restées viables pendant plusieurs années sur la surface (du gerle en bois), les
moules en métal ou en plastique et d’autres outils en bois ou en verre utilisés dans les
fromageries traditionnels (Devoyod et poullain, 1998).
L’environnement hostile favorise les phénomènes d’interaction à travers la formation des
colonies visqueuses en présence du saccharose et des traces minéraux, sou forme d’un biofilm
qui protège les cellules contre les agents nuisible (Kim et al, 2000). Le lait caillé du fromage
muri permet probablement la survie du Leuconostoc qui ont été détecté a un niveaux
cellulaires très élevés (Devoyod et poullain, 1998 ; Mor-Mur et al, 1994).
Dans une solution tamponnée avec un tampon de potassium, la capacité des cellules
non proliférantes de se lyser était inférieur pour les cellules développées en MRS contenant le
lactose ou le galactose que celui qui contient du glucose et varie en fonction de la souche de
7% à 44% après 24heures d’incubation à 300C at pH 6.5 (Cibik et Chapot-Chartier, 2000). En
technologie fromagère, la dépendance des souches de Leuconostoc a été également démontrée
et une faible lyse qui a été observé cofirme celle observé dans le tampon (Marteley et Crow,
1993).
L’homéostasie du pH interne est essentielle pour la croissance et la survie de tout les
micro-organismes y compris les leuconostocs mais la croissance bactérienne est un processus
d’autoinhibition par l’acidification du milieu externe et l’accumulation d’acide (Cogan et
Jordan, 1994 ; Konings, 2002). Par exemple quand le pH du milieu externe se diminue, le pH
interne de cellules de Ln mesenteroides diminues aussi contrairement aux espèces de LC.
lactis. La croissance s’arrête quand les valeurs du pH internes (cellulaire) atteintes 5.4 à 5.7.
En revanche, le pH cellulaire externe est considérablement influencé par le pH du milieu de
culture, la concentration et la nature des acides organiques.
3-Bactériocines des bactéries lactiques :
3-1- Définition des bactériocines :
Les bactériocines sont une famille de peptides ou protéines synthétisés naturellement
par certaines bactéries. Une bactériocine consiste généralement en un composé protéique de
20 à 60 acides aminés.
Les bactériocines ne sont pas des antibiotiques mais elles possèdent des propriétés
antibiotiques :

elles peuvent être bactéricides, c'est-à-dire éliminer certains micro-organismes.

elles peuvent être bactériostatiques, c'est-à-dire inhiber la croissance de certains
micro-organismes.
L'activité bactéricide ou bactériostatique est orientée contre certaines espèces proches
de la souche productrice.
Les bactériocines jouent un rôle important dans la compétition entre souches
bactériennes. Leur production semble stimulée par la présence de nombreuses bactéries dans
le milieu de croissance (phénomène de Quorum Sensing). Les bactériocines ont un mode
d'action lié à la membrane des bactéries. Elles se fixent à certains récepteurs membranaires et
y provoquent la formation de pores. La membrane est ainsi rendue perméable à certains
composés tels les ions, les molécules d'adénosine-tri-phosphate, ... Cela est généralement létal
pour la bactérie-cible. Elles sont généralement thermorésistantes et supportent de grands
écarts de pH (2 à 10) mais sont sensibles à l'action de la plupart des protéases.
Puisqu'elles agissent sur la membrane cellulaire, les bactériocines ne sont
généralement actives que contre les bactéries à Gram positif. Cependant, en situation de stress
(pH bas, stress au froid ou à la chaleur, présence de chélateurs, absence d'ions métalliques,
stress au sel...), certaines bactéries à Gram négatif sont sensibles à l'action de certaines
bactériocines.
La bactérie synthétisant ce composé se voit protégée de ses effets. En revanche chez
les autres bactéries sensibles, la molécule induit leur lyse ce qui est favorable à la bactérie
productrice puisqu'il y a libération d'ADN et d'autres composés cellulaires que cette dernière
pourra utiliser. Par exemple, l'ADN libéré va pouvoir permettre un échange de gènes par
mécanisme de transformation.
La première bactériocine a été découverte en 1925. Appelée la « Colicine », elle fut
identifiée chez Escherichia coli.
La deuxième fut découverte en 1927. Nommée « Nisine » et produite par Lactococcus
lactis, elle est utilisée de façon courante comme additif alimentaire (E234) pour la
conservation de certains aliments, dont celle de la viande. Elle est par ailleurs la seule
bactériocine pouvant légalement être utilisée comme agent de conservation. Mais les
bactériocines sont aussi naturellement présentes dans un certain nombre d’aliments
(saucisson...)
Les bactériocines produites par les bactéries lactiques sont des peptides antimicrobiens
de faible poids moléculaire. Elles ont une activité inhibitrice dirigée contre les bactéries
proches de la souche productrice. Leur spectre d’action est généralement étroit. Cependant, la
plupart ont une activité contre des pathogènes alimentaire tel que Listeria monocytogenes.
L’application des bactériocines ou des souches productrices dans les aliments pour y éviter le
développement de bactéries pathogènes ou altérantes a donc été envisagée. Cet article décrit
la classification, la structure, la fonction, le mode d’action, la biosynthèse et les applications
alimentaires des principales bactériocines produites par les bactéries lactiques.
La définition qui reste la plus largement acceptée est celle de Klaenhammer (1988) qui
définit les bactériocines comme des protéines, ou complexes de protéines, avec une activité
bactéricide contre des espèces proches de la souche productrice. Les bactériocines
représentent une large classe de substances antagonistes qui varient considérablement du point
de vue de leur poids moléculaire, de leurs propriétés biochimiques, de leur spectre d’action et
de leur mode d’action (Klaenhammer, 1988). Toutes les bactériocines produites par des
bactéries lactiques décrites jusqu’à présent ont une activité dirigée contre les bactéries Gram+.
Aucune bactériocine produite par des bactéries lactiques avec une activité contre des bactéries
Gram- n’a été décrite, la membrane externe des bactéries Gram- ne permettant pas aux
bactériocines d’atteindre la membrane interne, siège de leur activité.
3-2-Classification des bactériocines
Les bactériocines ont été divisées en quatre classes (Klaenhammer, 1993). Cependant,
aucune bactériocine de L. lactis n'appartient aux cIasses III et W. Un classement en deux
groupes, plus pratique pour L. lactis, a été proposé (Nissen-Meyer et al., 1997) :
3-2-1-Groupe 1
Le groupe 1 (ou classe 1 selon Klaenhammer, 1993) comporte des petites
bactériocines nommées lantibiotiques. Il s'agit de peptides dont la taille est inférieure à 5 kDa.
Ces peptides conservent leur activité après une exposition à la chaleur. 11s se composent d'un
nombre variable d'acides aminés modifiés après la traduction de la protéine. Ces acides
aminés sont la lanthionine, la B-méthyllanthionine et les résidus déshydratés (déhydroalanine
et déhydrobutyrine). Quelques bactériocines ayant été identifiées comme appartenant à ce
groupe sont : carnocine UI49 ; cytolysine ; lacticine 3147 ; lacticine 481 ; lactocine S et
Nsine.
3-2-2-Groupe II
Le groupe II (ou classe II selon Klaenhammer, 1993) inclut des peptides de taille
inférieure à 10 kDa. Ces peptides demeurent également stables après un traitement à la
chaleur. Ils ne contiennent pas d'acides aminés modifiés après la traduction. Un site de
maturation composé de deux glycines successives est présent dans le précurseur de la
bactériocine. Ce groupe comprend deux sous-groupes, nommés IIa et IIb. Un autre sousgroupe avait été proposé par Klaenhammer (1993), celui des bac té riocines thiol-activées. La
seule bactériocine thiol-activée alors connue était la lactococcine B. Cependant, cette
propriété de la lactococcine B a depuis été réfutée par Venema et al. (1996).
Sous-groupe IIa : bactériocines formées d'un seul peptide
Le sous-groupe IIa est composé des bactériocines formées d'un seul peptide. Certaines
de ces bactériocines sont apparentées à la pédiocine. Pour ces dernières, une similarité de
séquence en acides aminés plus élevée est retrouvée à l'extrémité N terminale du peptide. On
y retrouve deux cystéines réunies par un pont disulfure dans le peptide mature : -Y-GN-GVXl-C-X--K/N-X3-&-C- , où XI à X4 représentent des résidus polaires non chargés ou chargés.
Cette séquence consensus est appelée la boite pédiocine n. Certaines de ces bactériocines
possèdent un autre pont disulfure situé dans la région C-terminale. Ces peptides ont la
particularité d'être actifs contre le genre Listeria. Les bactériocines apparentées à la pédiocine
sont : bavaricine IMN ; carnobacteriocines BM1 et B2 ; curvacine A ; enterocine A ;
leucocine A ; mesentericine Y105 ; pediocine PA1 ; piscicocine Via ; piscicoline 126 et
sakacine P. Ce sous-groupe comprend aussi les bactériocines non apparentées à la pédiocine
comme : AS-48 ; carnobacteriocine A ; crispacine A ; divergicine 750 ; lactococcines A et B ;
lactococcine 972 et enterocine B.
Sous-groupe IIb : bactériocines formées de deux peptides
Ce sous-groupe comprend les bactériocines dont l'activité nécessite la présence de dew
peptides distincts. Les deux peptides doivent être présents en quantités approximativement
équivalentes pour obtenir une activité optimale (Nissen-Meyer et al., 1992 ; Allison et al.,
1994 ; MOU et al., 1996 ; Anderssen et al., 1998). Les gènes structuraux qui codent pour de
tels peptides sont habituellement situés un à la suite de l'autre, dans un même opéron (Ailison
et al., 1994 ; Diep et al., 1996 ; Nes et al., 1996b ; Stephens et al., 1998). Les bactériocines
appartenant à ce sous-groupe sont: lactacine F ; tactobine A ; lactococcine G ; pediocine L50 ;
plantaricines E/F, J/K et S ; therrnophiline 13.
3-2-3-Classes III et IV
La classification en quatre classes proposée par Klaenhammer en (1993) comporte
deux classes supplémentaires : les classes III et IV. La classe III regroupe les bactériocines de
haut poids moléculaire (plus de 30 kDa). Ces bactériocines sont sensibles à la chaleur. La
classe IV comporte les bactériocines composées d'une partie non protéique nécessaire à
l'activité inhibitrice (sucre ou lipide). Cependant, aucune bactériocine produite par L. lactis
n'appartient à l'une de ces deux classes. La classe IV a été ajoutée suite à l'observation de la
perte d'activité de certaines bactériocines après leur incubation en présence d'enzymes
dégradant les sucres et les lipides (Jiménez- Diaz et al., 1993). Cependant, la purification de
ces bactériocines a révélé qu'elles avaient la même composition que les bacténocines
régulières (Jiménez-Diaz et al., 1995). L'existence de cette quatrième classe pour les
bactériocines reste donc controversée (Nes et al., 1996).
3-3-Détermination de l’activité de la bactériocine
L’étude des interactions bactériennes est très commune. Les bactériocines représentent
une catégorie de substances produites par les bactéries qui inhibent d’autres. Dès 1676,
Antonie van Leeuwenhoek a défini l’antibiose comme étant le produit excrété par un microorganisme capable d’inhiber un autre (Joerger et al., 2000). En 1877, Louis Pasteur et Joubert
ont rapporté l'effet inhibiteur de bactéries de l'urine sur Bacillus anthracis. Comme mentionné
plutôt, en plus des bactériocines, les substances inhibitrices produites par les bactéries
incluent les antibiotiques cliniques ou thérapeutiques de faible poids moléculaire, les agents
lytiques, toxines, enzymes bactériolytiques, bactériophages, et autres métaboliques
secondaires, tel que l’eau oxygénée et le diacétyle. Ainsi, dans une niche écologique, un seul
type de bactérie peut être plus compétitif qu'un autre vis-à-vis de la source nutritionnelle ou la
sensibilité à un facteur environnemental, tel que la disponibilité de l’oxygène. Avec une telle
variabilité de produits inhibiteurs ou conditions environnementales, l’antagonisme n’est pas
dû dans sa totalité par les bactériocines. L’étude des bactériocines des bactéries lactiques doit
prendre en compte la grande quantité d’acides organiques produite au cours du métabolisme
bactérien et devrait écarter l’inhibition due à ces acides. Un moyen commun pour rechercher
l'activité des bactériocines est l'utilisation des milieu gélosé en boite de Petri. Mayr-Harting et
al. (1972), Piddock (1990), Parente et Riccardi (1999) et Akçelik (2006) ont passés en revue
les méthodes de détection et d’évaluation de l’activité des bactériocines. Il y a beaucoup de
variations dans ces méthodes, la plupart d'elles dérivent de la méthode dite de la double
couche, un test direct, dont la souche productrice et sensible sont co-cultivées et incubées puis
des zones d’inhibition autour de la colonie de la souche productrice sont recherchées.
L’exemple conçu est la culture de la souche productrice par touche ou strie, sur milieu gélosé
sur laquelle une surcouche de gélose moelle contenant la souche indicatrice ou sensible
(Sabine, 1963). Les différentes méthodes permettent de respecter le temps et les conditions de
culture relatives à la souche productrice et sensible, ces dernières sont plus sensibles que les
méthodes directes (Tagg et al., 1976).
Kekessy et Piguet (1970) décrivaient une procédure ou la souche productrice et
indicatrice étaient cultivées chacune sur leur milieu optimal respectif. La souche productrice
était cultivée sur milieu gélosé et après incubation le milieu est complètement délogé à l’aide
d’une spatule et déposé dans une autre boite en sens inverse (culture au dessous). Une
surcouche de gélose moelle ensemencée par la souche indicatrice est coulée sur le premier
milieu. Après incubation, la production de bactériocine se traduit par l’apparition d’un halo
claire sur la surcouche contenant la souche indicatrice. Cet essai minimise les effets d'acides
et l’action des bactériophages, du fait que les deux souches sont séparées physiquement par
une couche d’agar. La composition du milieu de culture est un facteur important dans les
essais en boite de pétri, mais la question va au-delà des exigences nutritionnelles de la souche
productrice et la souche cible. L’utilisation de l’agar dans les milieux solides peut perturber la
diffusion de la bactériocine, donc limiter l’efficacité de la méthode utilisée (Lindgren et
Clevstrom 1978). Les autres composés peuvent entraver les résultats. Par exemple, Hoover et
al., (1989) ont trouvés que β-glycérol phosphate (utilisé comme tampon) dans le milieu M17
avec la méthode Kekessy-Piguet interfère avec les zones d'inhibition causées par Pediococcus
acidilactici (PO2) comparé à d’autre milieu x de culture et substances tampon. Cependant,
Spelhaug et Harlander (1989), n’ont rencontré aucune difficulté à faire exprimer
l'antagonisme de la bactériocine produite par Pediococcus pentosaceus FBB61 et FBB63DG2 sur milieu solide M17-glucose. Peut-être, ceci est dû à une bactériocine différente
produite par ces souches ou la méthodologie utilisée était légèrement différente. Rose et al.,
(1999) ont adapté la spectrométrie de masse pour une détection rapide de la pediocin, la
nisine, la brochocins A et B, et l’enterocins A et B à partir de surnageants de culture. La
méthode est dite matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectroscopy
(MALDI-TOF MS) qui a été conçue originairement pour l'examen de grandes molécules, tel
que les biopolymers. Dans ce protocole, un lavage du surnageant pendant 30 seconde est
opéré afin d’éliminer les impuretés puis la procédure est suivit jusqu’à purification complète
de la bactériocine. La PCR est utilisée pour détecter les gènes responsables de la production et
la régulation de la bactériocine dans les cultures bactériennes. Rodriguez et al, (1995) ont pu
amplifier le gène structural de la lactocine S chez 7 souches de lactobacilles isolés du
saucisson fermenté. Dans un autre travail, Garde et al., (2001) ont détecté le gène de
production du lacticine 481 et la nisine en utilisant la PCR avec une spécificité dans
l’isolement de Lactococcus lactis subsp. lactis à partir du fromage de lait cru. Rodriguez et
al., (1998) ont détecté l’enterocine AS-48 à partir des entérocoques isolés du lait et les
produits laitiers en utilisent la méthode d'hybridation des colonies. Martinez-Bueno et al.,
(1994) ont réalisé le séquençage des gènes codant la synthèse de l’enterocine AS-48. Une
technique PCR a été développée pour détecter rapidement ces gènes (Joosten et al., 1997).
Mugochi et al., (2001) ont développé une méthode rapide et sensible pour détecter les
bactériocines à partir du milieu de fermentation. Les faibles concentrations d'ions de
potassium ont été mesurées, ainsi la quantité libérée par la souche bactérienne sensible
corrélée avec la quantité de bactériocine présente dans la portion de bouillon nutritif entrant
dans celle-ci. Cette méthode se compare facilement à celle de la méthode de diffusion en
milieu solide.
3-4- La biosynthèse des bactériocines
Plusieurs étapes sont nécessaires à la production d'une bactériocine mature par une
bactérie. L'induction de la biosynthèse, la transcription en ARN et la traduction en protéines
des différentes composantes du système de biosynthèse, la modification des acides aminés
dans le cas des lanthionines, la maturation et finalement le transport de la bactériocine vers
l'extérieur de la cellule constituent les différentes étapes de biosynthèse (figure 2). II faut
aussi inclure dans ces étapes l'immunité, qui rend la cellule productrice résistante à sa propre
bactériocine. Le tableau suivant résume le rôle des diverses protéines impliquées dans la
biosynthèse d'une bactériocine.
Tableau 2 : Rôle des protéines impliquées dans la biosynthèse d'une bactériocine
Protéine(s)
Rôle
Induction
Reçoit un signal de l'inducteur (externe a la cellule)
et provoque la transcription des gènes codant pour la
code pour la bactériocine immature
Structure
Modification
biosynthèse de la bactériocine
dans le cas des lantibiotiques, modifie des acides
aminés sur la bactériocine immature
transport
coupe la bactériocine immature de son signai Nterminal
clivage
Transporte la bacteriocine à l'extérieur de la celluIe
immunité
rend la cellule productrice résistante à sa bactériocine
Pour la plupart des bactériocines les inducteurs provoquant leur biosynthèse sont inconnus.
Pour la nisine et la carnobacteriocine 82, l'inducteur est la bactériocine ellemême, qui
provoque sa propre production (Kuipers et al., 1995 ; Quadri et al., 1997).
Les enteroncines A et B, produites par Enterococcus fnecium, possèdent d'autres types
d'inducteurs qui ne sont pas des bactériocines. Il a été démontré que leur production était
induite par la production extra-cellulaire d'un peptide dont le gène structural est nommé entF
(Nilsen et al., 1998). Ce demier code pour une protéine de 41 acides aminés. La protéine
mature possède 25 acides aminés après clivage. L'inducteur immature possède une séquence
leader de 16 acides aminés et est de type double glycine. La production d'autres bactériocines
est induite par ce type de protéine. C'est le cas des inducteurs de type bactériocine comme la
plantaricine A (Diep et al., 1994 ; Diep et al., 1995) et des inducteurs non bactéricide de la
sakacine P (Eisjink et al., 1996). L'accumulation de l'inducteur provoque non seulement la
production de la bactériocine, mais aussi sa propre production. Les gènes codant pour ces
types d'inducteurs ont été retrouvés dans des opérons de régulation à deux composantes qui
contiennent les gènes d'une histidine kinase et d'un régulateur de réponse (Diep et al., 1996 ;
Huhne et al. 1996 ; Brurberg et al. 1997). Le système de régulation de la biosynthèse de la
nisine possède deux composantes (figure2), soit les deux protéines NisK et NisR (Kuipers et
al., 1995 ; Dodd et al., 1996 ; Entian et de Vos, 1996 ; Ra et al., 1996 ; de Ruyter et al., 1996
; Kleerebezem et al., 1997). Dans ce système, un signal extra-cellulaire dépendant de la phase
de croissance active une histidine kinase qui résulte en une auto-phosphorylation. L'histidine
kinase transfère ensuite le résidu phosphate à un régulateur de réponse intracellulaire. Ce
dernier active la transcription des gènes nécessaires à la production de la nisine en
interagissant avec le promoteur situé devant les gènes de la bactériocine (Risoen et al., 1998).
Les systèmes à deux composantes régulent la production de plusieurs autres bactériocines,
dont la sakacine A, la sakacine P, la carnobacteriocine B2 et les plantaricines produites par
Lactobacillzrs plantarum Cl1 (Nes et al., 1996a ; Kleerbezem et al., 1997).
Figure2. Schéma de la biosynthèse des bactériocines dont la production est régulée par un
système à deux composantes. Le facteur d'induction (FI) peut être la bactériocine elle-même
ou un autre peptide (adapté de Nissen-Meyer et al., 1997).
Certains acides aminés d'un lantibiotique nouvellement synthétisé requièrent une
modification permettant à la bactériocine d'être fonctionnelle. Les acides aminés modifiés
retrouvés le plus fréquemment dans les lantibiotiques se présentent sous forme de lanthionine
et de P-méthyllanthionine. Les acides aminés sont d'abord modifiés par la déshydratation d'un
résidu sérine ou thréonine. Cette modification est suivie de la formation d'un lien thioéther
entre le résidu déshydraté et un résidu cystéine. Selon que le groupement thiol de la cystéine
se joigne à un résidu déshydraté sérine ou thréonine, il en résultera une lanthionine ou une
Pmé thyllanthionine respectivement (figure3). La lanthionuie peut ainsi être décrite comme
étant un résidu D-alanine relié à un résidu L-alanine par un atome de soufre. Le lien thioéther
augmenterait la stabilité de la structure de la bactériocine et serait plus stable qu'un lien
disulfure (Sahi et al., 1995). Dans le cas de la nisine, les protéines NisB et NisC catalysent la
réaaion de modification des acides aminés (Entian et de Vos, 1996 ; Siegers et al., 1996). Le
transport des bactériocines vers l'extérieur de la cellule se fait pendant la maturation de celleci. Les protéines transportant les bactériocines à l'extérieur de la cellule font partie de la
famille des transporteurs ABC ("ATP-binding cassette"). Le transporteur de la nisine est la
protéine NisT (Entian et de Vos, 1996 ; Siegers et al., 1996). Certaines bactériocines comme
I'acidicine B sont toutefois sécrétées par la voie sec-dépendante. Leur séquence signal ne
respecte donc pas le consensus des séquences signal des transporteurs ABC. En effet, ils ne
possèdent pas de doublet glycine au site de coupure (Leer et al., 1995). Le clivage de la
séquence signal de la bactériocine immature se produit pendant sa sortie de la cellule. Dans le
cas de la nisine, c'est NisP, une protéine extra-cellulaire liée a la membrane, qui clive la
protéine immature (Entian et de Vos, 1996 ; Siegers et al. 1996). Dans le cas de la
lactococcine G, une protéase est couplée au transporteur ABC impliqué dans l'excrétion de la
bactériocine (Havarstein et al., 1995). Le signal ''leader" des lantibiotiques possède une
séquence propice à former une hélice-a amphiphile avec une charge nette négative, ce qui
contraste avec la charge nette cationique caractéristique du signal "leader" des autres
bactériocines (Sahl et al., 1995). La fonction du signal "leader" pourrait être de garder le
lantibiotique inactif jusqu'à sa sortie de la cellule. Il pourrait aussi permettre de faciliter les
interactions entre le transporteur et/ou les protéines de modification du peptide (Sahl et al.,
1995).
L'immunité de la souche productrice à sa propre bactériocine est assurée par une ou
plusieurs protéine(s) de la membrane. Dans le cas de la nisine, la protéine responsible est Nid,
dont le poids moléculaire est d'environ 20 kDa. Il s'agit d'une protéine possédant une moitié
extra-cellulaire accrochée à la membrane par un lipide (Kuipers et al., 1993 ; Entian et de
Vos, 1996 ; Saris et al., 1996). Les autres pro téines impliquées dans l'immunité de la souche
productrice de la nisine sont nommées NisE, NisF et NisG. Ces protéines formeraient un
transporteur ABC. Dans le cas de la lactococcine A, une protéine ne possédant pas d'acides
aminés modifiés, la protéine d'immunité serait aussi associée à la membrane (Nissen-Meyer et
al.. 1993 ; Venema et al., 1994 ; Quadri et al., 1995). Il a été démontré que cette protéine
n'interagit pas directement avec la lactococcine A (Nksen-Meyer et al., 1993). Le
fonctionnement exact de ces protéines reste toutefois inconnu à ce jour.
Figure 3. Schéma de la formation post-traductionnelle d'un résidu lanthionine dans
un lantibiotique (adapté de Nissen-Meyer et al., 1997). La réaction 1 est la
déshydratation du résidu sérine.
3-5-Mode d'action
La plupart des bactériocines produites par les lactocoques qui ont été caractérisées
démontrent un mode d'action semblable. En effet, à part la lactococcine 972 qui sera décrite
par la suite, les bactériocines semblent former des pores dans la membrane des cellules
sensibles. Certaines bactériocines, comme la nisine, n'ont pas de récepteur spécifique (Abee et
al., 1995). En effet, la nisine semble se lier aux lipides et phospholipides cationiques présents
à la surface de la cellule (Rink et al., 2005; Moll et al. 1999). Par contre, il semblerait que
pour les lactococcines A, B et M. l'initiation de la formation de pores nécessite la présence
d'un récepteur spécifique qui permet la fixation de la bactériocine à la membrane cellulaire
(van Belkum et al., 1991). De plus, certaines bactériocines, telles que, la bactériocine J46 dont
l’activité dépendent de la présence d'une force proton motrice sur la membrane pour pouvoir
s'y lier (Huot et al., 1996). Le modèle actuel propose que les bactériocines se concentrent à la
surface de la membrane avant de s'y insérer en adoptant une structure en forme de tonneau. Il
résulte généralement de la formation des pores une perte du potentiel de membrane ainsi
qu'une perte du gradient de pH, les deux facteurs responsables de la force proton motrice. En
plus, les lipides anioniques de la membrane cytoplasmique sont les récepteurs primaires de la
bactériocine des bactéries lactiques pour initier la formation des pores (Abee 1995; Moll et
al., 1999). La conductivité et la stabilité des pores induits par les lantibiotiques, peuvent être
surélevés en fixant des molécules membranaires (lipide II, le précurseur du peptidoglycan).
Dans le cas des bactériocines de la classe II, apparemment, les récepteurs dans la membrane
cible agissent pour déterminer la spécificité (Venema et al., 1995b; 1995c). Les bactériocine
de la classe I, peuvent induire la formation de pore par un mouvement transmembranaire
selon le modèle de Wedge, et celles de la classe II, peuvent fonctionner en créant des pores
sous forme de pores en barils (Figure4, Figure5) ou par un mécanisme de moquette par lequel
les peptides s’orientent en parallèle à la surface de la membrane et interagit avec la structure
de la membrane (Moll et al., 1999). Pour la nisine par exemple, les pores peuvent atteindre
une dimension de 1,2 nm. La présence de ces pores induit la perte de plusieurs composés de
faible poids moléculaire (ions, acides aminés et ATP) qui vont quitter l'intérieur de la cellule.
La perte d'ions est ainsi responsable de la déstabilisation du potentiel de membrane, de la
perte d'ATP et du gradient de pH. La disparition de la force proton motrice et l'inhibition de la
synthèse de macromolécules provoquent la mort de la cellule sensible après 20-30 minutes de
contacte (DeVuyst et Vandamme, 1994).
Figure 4. Montre l’action des bactériocine de la classe I qui peuvent induire la formation de
pore par un mouvement transmembranaire selon le modèle de Wedge (A) et celles de la classe
II, qui peuvent fonctionner en créant des pores sous forme de pores en barils (B) ou par un
mécanisme de moquette par lequel les peptides s’orientent en parallèle à la surface de la
membrane et interagit avec la structure de la membrane (Moll et al., 1999).
Figure 5. Schéma représentant la structure et le mécanisme d’action des bactériocines de la
classe-IIa à travers la perforation de la membrane cellulaire: (a) structure de la bactériocine;
(b) possibilité d’interactions avec la surface de la membrane; (c) insertion de la molécule de
bactériocine et la formation des pores hydrophiliques (Abee 1995)
Gravesen et al., (2002b) ont examiné la résistance de Listeria monocytogenes à la
classe II des bactériocines et ont trouvés un rapport avec le site spécifique de reconnaissance.
Huit mutants de L. monocytogenes résistants aux bactériocines de la classe IIa, tel que la
pediocine PA-1 et la leucocine A, ont été isolés et étudiés. La mutation trouvée dans toutes les
souches mutantes résistantes était dûe à une sous unité d'une enzyme dans un système
d’enzyme appartenant à la phospho-transférase phosphoenolpyruvate-dépendant mannosespécifique régulée par le facteur de transcription spécifique nommé σ54. Il a été interprété que
la résistance à ces bactériocines dans L. monocytogenes et autres bactéries Gram-positives est
fondamentalement en rapport avec ce site commun sans aucun rapport avec la souche, ni le
type de bactériocine de la classe IIa, ou les conditions de cette expérience. Il a été suggéré que
la mutation à cette sous unité spécifique localisée dans la membrane a changé le site de
reconnaissance de la cible des bactériocines de la classe IIa.
La lacticine 3147 est un lantibiotique constitué de 2 composants, 2 peptides appelés
lac 1 et lac 2 (McAuliffe et al., 1998); les deux composants sont nécessaire pour exercer une
activité antagoniste complète résultant de la formation de pores ioniques spécifiques dans la
membrane de la cellules gram positive cible. McAuliffe et al., (2000) ont démontrés que la
lacticine 3147 exige une enzyme de modification séparée pour chacun des prepeptides lac1 et
lac2. Deux autres bactériocines à deux composants connues sont la lacticine F (Abee et al.,
1994), la lactococcine G (Nissen-Meyer et al., 1992), et la thermophiline 13 (Marciset et al.,
1997).
La première étape d’action dans son adsorption à la membrane cellulaire bactérienne
nécessaire dans la rupture de la membrane par la nisine est souvent comparée à un détergent
cationique actif en surface. Cela est suivi par une inactivation du groupe sulfhydryl. Bruno et
al., (1992) ont démontré que la nisine dissipe complètement la force protonique motrice chez
L. monocytogenes Scott A. D’autres souches de L. monocytogenes ont été trouvées également
sensibles à la nisine, en exprimant une réponse similaire à la détérioration du gradient pH et le
potentiel membranaire. D’autre bactériocines de la classe I des bactéries lactiques se
comportent d’une manière similaire. La carnocine UI49 agit sur la membrane cytoplasmique
dans un modèle semblable à la nisine (Stoffels et al., 1994). La perméabilité aux ions ou la
formation de canaux dans les membranes cytoplasmiques provoqués par les bactériocines de
Lactobacillus acidophilus, a été démontrée en utilisant des membranes lipidiques artificielles
(Palmeri et al., 1999). L’augmentation de la conductance de la membrane a été détectée et des
canaux avec une conductance élémentaire de 68 à 70 mV a été mesurée en appliquant un
voltage externe de polarité différente.
La lactocine 27, produite par Lactobacillus helveticus LP27, a été décrite dans les
travaux de Upreti et Hinsdill (1975) comme une bactériocine dont l'effet était bactériostatique.
Elle a été adsorbée aussi bien par des souches sensibles que par des souches résistantes en
inhibant la synthèse des protéines.
Cependant, il y avait un effet remarquable sur l’ADN, la synthèse de l’ARN et l'ATP.
Zajdel et al., (1985) trouvez que la lactostrepcine, Las 5, bloque immédiatement la synthèse
d'ADN, de l’ARN, et les protéines, mais ces conséquences étaient probablement une réaction
secondaire à de multitude ruptures sévère membranaire et perte de composants
intracellulaires. Les souches bactériennes sensibles et résistantes adsorbent de la même
manière la bactériocine Las 5. Les protoplastes des souches bactériennes sensibles n'ont pas
été affectés par Las 5, indiquant ainsi la nécessité les récepteurs membranaires cellulaires
pour l'action de la bactériocine. Andersson (1986) a démontré que les souches gram-négatif
résistantes telle que Escherichia coli, Erwinia carotovora, Pseudomonas aeruginosa, et
Serratia. marcescens pourraient être rendus sensible à la bactériocine de Lactobacillus
plantarum en transformant les cellules gram-négatif en sphéroplastes. Des travaux
subséquents ont montré l’inactivation de bactéries pathogènes à gramnégatif avec les
bactériocines de bactéries gram-positives avec l'usage d'agents chélateurs (EDTA), qui
diminue les propriétés des barrières fourni par les LPS membranaires externes de ces bactéries
gram-négatives (Stevens et al., 1991; Shefet et al.,1995; Scannell et al., 1997; Helander et al.,
1997). Des stress supplémentaires aux bactéries gram-négatives comme une approche à savoir
l’application simultanée de plusieurs processus peut rehausser l'efficacité d'une bactériocine.
Cutter et Siragusa (1995) ont montré que la nisine (à 2000 IU/ml) était efficace contre les
bactéries gram-négatives (E. coli O157:H7 et Salmonella enterolytica serovar typhimurium)
quand elle est utilisée avec l’EDTA, le citrate, ou le lactate. Ganzle et al., (1999) ont
démontré que la curvacine A et la nisine en combinaison avec un pH bas, une concentration
de NaCl supérieure à 5%, ou le propylparabene provoque une augmentation de la sensibilité
de Salmonella et E. coli envers ces bactériocines. Tel effet est suggérer par de nombreux
travaux, la combinaisons de l’action de la bactériocine avec des agents additionnels et d’une
manière appropriée qui peut élargir considérablement le spectre d’action de quelques
bactériocines des bactéries lactiques contre les bactéries gram négative.
3-6- Les bactériocines produites par les leuconostocs :
Les bactériocines produites par les souches de Leuconostoc appartiennent aux
bactériocines de la sous- classe IIa comme les pediocines : petits peptides non modifiés
thermostables, et actifs contre Listeria sp (Ennahar et al, 2000). La mesentericine Y105 et
B105 et la mesenterocine 52 Q et 52B des Leuconostoc ont été intensivement décrits et leur
activité biologique, ainsi que leur structure et leur propriétés ont été analysés (Corbier et al,
2001 ; Morisset et Frére, 2002). Les gènes structuraux de mesentiricine Y105et B105, la mes
Y et la mes B respectivement ont été clonés par plusieurs chercheurs (Héchard et al, 1999 ;
Castano et al, 2005). L’action de la mesentericine Y105 a été mise en évidence par cytométrie
en flux (CMF), cette technique a permis de suivre en direct une co-culture de Leuconostoc
mesenteroides Y105 et Listeria monocytogenes (Héchard et al, 1999) ou le dénombrement
pour chaque bactérie a montré une dominance rapide de Leuconostoc mesenteroides Y105, la
mesentericine Y105 semble avoir une action spécifique contre Listeria monocytogenes.
Castano et al, (2005) ont aussi confirmé cette propriété et ils ont rapporté que cette
bactériocine est constitué par 37 résidus et réticulé, par un pont bisulfure. La leucocine H
(Blom et al, 1999) et la dextranicine 24 (Revol-Junelles et lefèbvre, 1996) ont été ainsi décrite
comme des bactériocines produites par Leuconostoc.i
La leucocine J produite par Ln. sp. J2 possède un spectre d’activité plus vaste, hormis
les bactéries lactiques elle inhibe aussi un grand groupe de bactéries pathogènes : Listeria
monocytogenes, St. aureus, E. cli, Seratia marcescems et Yersinia enterocolitica.
Les différents mécanismes y compris la composition de la membrane en acide gras ou
en protéine putative d’immunité, induisent des phénomènes de résistance aux bactériocines
chez les leuconostocs (Limonet et al, 2002).
Bien que les bactériocines produites par les leuconostoc d’origine laitières (la
mesentericne Y105) soient étudié pour leur usage possible dans la conservation des aliments,
l’addition d’une bactériocine produite par des leuconostocs dans les aliments n’a été jamais
rapporté. En effet, pour l’efficacité optimale contre les aliments contaminé par les bactéries
pathogènes et des germes de détérioration, des bactériocines peuvent être employer autant
qu’un système de conservation des aliments, qui implique un ensemble de facteurs
antimicrobiens (Ennahar et al, 2000 ; Cleveland et al, 2001)
4-Le genre Listeria
Les Listeria sp. sont des bactéries largement répandues dans le milieu extérieur.
Durant de nombreuses années, les listérioses étaient principalement considérées comme des
maladies des animaux même si des cas sporadiques et parfois dramatiques étaient décrits chez
l'homme. Dans les années 1979/1980, Listeria monocytogenes a été identifiée comme une des
bactéries responsables d'infections d'origine alimentaire et, depuis cette époque, les Listeria
sp. ont suscité de nombreuses inquiétudes chez les consommateurs.
4-1-Systématique
Le genre Listeria est classé dans le domaine ou empire des "Bacteria" ou des
"Eubacteria", le phylum des "Firmicutes", la classe des Bacilli, l'ordre des Bacillales et la
famille des Listeriaceae. (Sheehan, et al 1994; Engelbrecht,et al 1996)
Les espèces validement publiées du genre Listeria sont listées dans le fichier Listeria
in List of Prokaryotic Names with Standing in Nomenclature. Deux espèces sont importantes
en médecine vétérinaire, Listeria ivanovii et, surtout, Listeria monocytogenes. (Jones, 1992)
4-2-Principaux caractères bactériologiques
Petits bacilles droits, à Gram positif, de 0,4 à 0,5 µm de diamètre sur 0,5 à 2,5 µm de
longueur, aux extrémités arrondies, se présentant de manière isolée ou groupés en V ou en L
ou en palissades ou parfois en courtes chaînes, non acido-résistants, non capsulés, non
sporulés, mobiles lorsqu'ils sont cultivés à 20 - 28 °C, aéro-anaérobies mais cultivant mieux
en aérobiose, catalase positive et oxydase négative. (Sheehan, et al 1994; Engelbrecht,et al
1996)
La présence de 15 antigènes somatiques (antigènes O) et de 5 antigènes flagellaires
(antigènes H) permet de reconnaître au moins 17 sérovars au sein du genre Listeria.
(Engelbrecht, 1998)
Les Listeria sp. ne sont pas des germes exigeants et la culture est obtenue sur les
milieux classiques telles qu'une gélose nutritive ou une gélose au sang. Sur gélose nutritive,
après 24 heures d'incubation en aérobiose à 30-37 °C, les colonies sont lisses, légèrement
convexes, à bords réguliers, translucides et leur diamètre varie de 0,5 à 1,5 mm. Sur une
gélose contenant 5 p. cent de sang de mouton ou de cheval ou de lapin ou d'homme, les
colonies de Listeria ivanovii et de Listeria monocytogenes sont bêta hémolytiques. L'optimum
thermique est compris entre 30 et 37 °C mais la croissance est possible pour des températures
allant de 1 à 45 °C et certaines souches de Listeria monocytogenes peuvent même se
développer, avec un temps de génération de 62 à 131 heures, à des températures légèrement
inférieures à 0 °C. Les Listeria sp. présentent une certaine halotolérance et toutes les souches
cultivent en présence de 10 %de NaCl. Certaines souches tolèrent même des concentrations
en sel de 20 % et/ou peuvent survivre un an, à pH 6, dans un milieu contenant16% de NaCl.
La valeur optimale de l'aw est de 0,97 mais la croissance est possible pour une aw de
0,943 alors qu'elle n'a pas lieu pour une aw inférieure à 0,92. Toutefois, le germe reste viable
(sans multiplication) plusieurs jours pour des valeurs d'aw plus faibles (par exemple, 84 jours
à + 4 °C dans un salami dont l'aw est de 0,79-0,86).
Le typage des souches est indispensable pour des enquêtes épidémiologiques et pour une
meilleure connaissance de l'écologie. Pour des enquêtes épidémiologiques, le typage des
souches de Listeria monocytogenes doit faire appel à plusieurs méthodes. La sérotypie et la
lysotypie permettent le criblage d'un grand nombre de souches, mais le typage moléculaire (et
tout particulièrement l'analyse des profils de macrorestriction) apporte des informations
supplémentaires permettant de détecter et de caractériser des clones au sein d'un lysovar
responsable d'une anadémie.
4-3-Habitat et épidémiologie
Les Listeria sp. sont des bactéries résistantes dans le milieu extérieur (survie de 1 à 2
ans dans le sol, 21 mois dans du lait naturellement contaminé, 1 à 18 mois dans les fèces, 6
mois dans la paille), très largement répandues dans l'environnement (sols, végétaux,
pâturages, eaux douces, eaux de mer, vase, eaux d'égouts), dans les locaux d'élevage (litière,
sol, parois, fenêtres, mangeoires, abreuvoirs...) et dans les locaux d'habitation (torchons,
serpillières, périphérie des conduites d'évacuation, réfrigérateurs et même brosses à dents).
Elles sont présentes dans les fèces de nombreuses espèces animales (10 à 30% des bovins,
ovins, porcins ou poulets sont porteurs au niveau de l'intestin et ce portage a également été
mis en évidence chez des rats et des chiens), elles sont présentes dans les fèces de l'homme (5
à 10 % des humains hébergent Listeria monocytogenes dans leur tube digestif et cette valeur
peut atteindre 90 % chez des techniciens de laboratoire) et elles sont parfois hébergées au
niveau du rhino-pharynx.
Bien que les Listeria sp. et Listeria monocytogenes soient des bactéries ubiquistes, la
plupart des cas de contamination résultent de l'ingestion d'aliments fortement contaminés. La
dose infectante pour l'homme n'est pas connue avec certitude, elle varie avec le statut
immunitaire des individus et la virulence de la souche mais, les aliments incriminés
contiennent généralement plus de 103 Listeria monocytogenes par gramme et dans la majorité
des cas ils en renferment plus de 106 par gramme. Par voie orale, la dose infectante, est de
l'ordre de 108 cellules pour la souris normale et de 109 cellules pour des singes.
4-4-Éléments d'épidémiologie concernant les listérioses animales
Dès les années 1940 et, surtout, depuis les années 1960, le rôle des ensilages dans la
contamination des ruminants a été mise en évidence. Lors de leur préparation, les ensilages
peuvent être contaminés par un faible nombre de bactéries. En surface et dans les premiers
centimètres de l'ensilage, les conditions d'aérobiose permettent la multiplication des Listeria
sp. et la faible acidification des couches superficielles de l'ensilage (pH en surface et sur les
premiers centimètres supérieur ou égal à 5) associée à la température du milieu extérieur (un
ensilage de maïs préparé en automne va passer l'hiver à l'extérieur) permettent un véritable
enrichissement sélectif. Compte tenu du fait qu'il s'écoule au minimum 3 semaines et souvent
plusieurs mois entre la fabrication d'un ensilage et sa distribution aux animaux, le nombre de
bactéries peut être très important au moment de la consommation (plus de 107 unités formant
colonies par kg). Lorsque l'ensilage est mal conservé et/ou mal préparé (notamment un
tassement insuffisant), l'acidification à cœur est insuffisante (pH supérieur ou égal à 5) et
l'anaérobiose n'est pas totale ce qui permet une prolifération des Listeria sp.
Les ensilages ne sont pas seuls en cause et la pratique de l'enrubannage est également
impliquée. Dans un enrubannage (balle d'herbe semi-séchée et enveloppée sous plastique), la
conservation est assurée par l'action conjointe de la fermentation et de la dessiccation. Le pH
d'un enrubannage (de l'ordre de 5,5 à 6) et le taux d'humidité (de l'ordre de 40%) autorisent la
croissance de Listeria monocytogenes. (Glaser,et al 2001).
4-5-Éléments d'épidémiologie des listérioses humaines
Chez l'homme, les premiers cas de listériose ont été décrits dans les années 1960 mais
il fallut atteindre les années 1979-1980 pour observer les premières anadémies et mettre en
évidence le rôle des aliments. Ces anadémies se traduisent par de petites bouffées de moins de
20 cas ou par d'importantes anadémies pouvant regrouper plusieurs centaines de cas, évoluant
sur des périodes prolongées (4 ans par exemple, dans l'anadémie suisse) et responsables d'une
importante mortalité. Outre les anadémies, la transmission alimentaire est bien documentée
pour un certain nombre de cas sporadiques dont on estime qu'environ 33 p. cent ont une
origine alimentaire. Les infections nosocomiales étant très rares, il est probable qu'il existe
d'autres modes de contaminations non identifiés. (Sheehan, et al 1994; Engelbrecht,et al
1996)
La recherche systématique de Listeria a permis de montrer que de très nombreuses
denrées peuvent être contaminées : végétaux (laitues, choux, céleris, concombres,
champignons, pommes de terre, radis...), lait et produits laitiers (fromages à pâte molle et à
croûte fleurie, fromages à pâte molle et à croûte lavée, fromages à pâte persillée, fromages à
pâte pressée cuite ou non cuite, pâtisseries, poudres de lait et, dans une moindre mesure, les
beurres, les crèmes glacées et les yaourts) carcasses de volailles (poulets, dindes, canards),
viandes de porcs, viandes de bovins, viandes d'ovins, produits carnés (plats cuisinés à base de
viande, jambons cuits, rillettes, langues en gelée, saucisses de type hot-dog, saucisses à base
de viande de volailles, chipolatas, merguez, saucisses de Morteau, viandes séchées, salamis,
pâtés, saucissons, sandwichs au poulet, poulets frits, beignets de poulet, hamburgers au
poulet...), poissons et produits dérivés (saumon fumé, truite fumée, surimi, "caviar" de
saumon...), coquillages (huîtres, moules, coques, palourdes...), crustacés (crevettes grises,
crevettes roses, crabes, homards...)... Un aliment, même contaminé, n'est pas toujours
dangereux. En effet, les résultats des dénombrements dans les aliments montrent que les cas
de listériose humaine sont généralement dus à un aliment contaminé avec plus de 100 Listeria
monocytogenes par gramme ou par millilitre. Ce fait suggère que seules les denrées fortement
contaminées présentent un risque réellement important. Les produits les plus sensibles sont
ceux qui peuvent favoriser la croissance des Listeria, qui ont une durée de vie longue et qui
peuvent être consommés sans être chauffés (produits laitiers, charcuteries et produits de la
pêche). (Jones, 1992)
En revanche, les produits stérilisés et notamment les conserves (par exemple, les
charcuteries en conserve) sont totalement indemnes de Listeria avant ouverture.
La contamination peut intervenir à tous les stades de la fabrication et de la distribution
mais, elle peut aussi se produire chez le consommateur. La prévalence de l'infection est faible
(5 à 10 cas par million d'habitants) mais le taux de mortalité atteint 20 à 30%. La listériose de
l'homme est présente dans les pays industrialisés mais elle est quasiment absente des pays en
voie de développement. Outre les différences existant dans les moyens de diagnostic et de
surveillance sanitaire, cette répartition géographique s'expliquerait par une meilleure hygiène
et
par
la
généralisation
de
la
chaîne
du
froid
dans
les
pays
développés.
En effet, de manière paradoxale, il semble que ce soit la bonne hygiène des procédés de
fabrication et le développement de la chaîne du froid qui soit à l'origine d'une augmentation
des cas de listériose observée depuis une quarantaine d'années. L'amélioration des conditions
sanitaires sur les lieux de transformation des denrées alimentaires a pour conséquence une
réduction de la contamination par des flores d'altération et/ou de putréfaction (Glaser,et al
2001). De ce fait, associée à une réfrigération systématique, la date limite de consommation
des aliments augmente. Si l'aliment contenait au départ quelques Listeria monocytogenes,
celles-ci ont le temps de se multiplier d'autant plus que leur multiplication n'est pas entravée
par d'autres proliférations microbiennes. L'aliment devient fortement contaminé et il est
d'autant plus dangereux qu'il ne présente aucun signe d'altération visible. Bien sûr, un mauvais
respect de la chaîne du froid ou de mauvaises conditions de stockage (peu de réfrigérateurs
domestiques ont une température, en tous points, inférieure à + 4 °C !) accroissent les risques.
Depuis quelques années, dans tous les pays développés, l'incidence des listérioses
diminue. Cette baisse est due à un meilleur contrôle des denrées alimentaires et à
l'information des populations à risque. (Glaser,et al 2001).
4-6-Pouvoir pathogène
Listeria monocytogenes a été isolée pour la première fois lors d'une épidémie observée
chez des lapins et des cobayes de laboratoire. Par la suite, des infections ont été décrites, dans
pratiquement tous les pays, chez plus de 40 espèces d'animaux domestiques et sauvages ainsi
que chez l'homme. Chez les ruminants, les deux espèces les plus fréquentes sont Listeria
monocytogenes et Listeria ivanovii. Chez les autres espèces animales et chez l'homme seule
Listeria monocytogenes est vraiment importante. (Jones, 1992)
4-6-1-Ruminants
Chez les ruminants domestiques, Listeria monocytogenes est responsable de méningoencéphalites, de septicémies, d'avortements et de mammites et Listeria ivanovii est à l'origine
d'avortements. La contamination se fait par voie digestive et les ensilages de mauvaise qualité
sont une source majeure de germes. L'évolution de la maladie varie selon la forme clinique
mais dans les formes nerveuses le pourcentage de mortalité est proche de 100. (Glaser,et al
2001).
Les méningo-encéphalites sont une forme classique chez les adultes mais aussi chez
les très jeunes animaux. Après une incubation de l'ordre de 2 à 6 semaines, elles se traduisent
par une prostration, un port anormal de la tête (l'animal regarde ses flancs), une marche en
cercle (d'où le nom de "circling disease" donné à la maladie par les auteurs anglo-saxons), une
perte de l'équilibre, parfois une hyperthermie, une atteinte des nerfs crâniens V, VI, VII, VIII,
IX, X et XII se traduisant par une paralysie faciale et souvent unilatérale (strabisme, chute des
paupières, chute des oreilles, difficultés de mastication, dysphagie, salivation excessive,
protrusion de la langue, et diminution de la sensibilité à la douleur) puis, la maladie évolue
vers un décubitus et la mort. Chez les ovins et les caprins la mort intervient en 2 à 3 jours
mais, chez les bovins, la durée d'évolution est plus longue (4 à 14 jours). L'atteinte du cerveau
pourrait résulter soit d'une migration intra-axonale dans les terminaisons nerveuses du nerf
trigéminé soit d'une dissémination par voie hématogène (Baylis et al,2000).
Les septicémies sont principalement observées chez les animaux nouveau-nés et chez
les jeunes mais, elles ont également été observées chez des brebis gravides. Dans ce dernier
cas, les animaux présentent de la fièvre, une entérite sévère, des lésions d'ulcération sont
présentes dans l'abomasum et sur la muqueuse intestinale et les plaques de Peyer présentent
des abcès. (Glaser,et al 2001).
Les avortements peuvent être dus à Listeria monocytogenes et, moins fréquemment, à
Listeria ivanovii. Ils résultent d'une contamination de l'utérus gravide par voie hématogène.
La durée d'incubation est de l'ordre de 5 à 12 jours, les animaux sont affaiblis, anorexiques, ils
peuvent présenter de la fièvre et une diarrhée profuse mais, parfois, aucun signe clinique n'est
observé. Les avortements sont tardifs, ils sont généralement sporadiques (bien que, dans
certains troupeaux de petits ruminants, ils puissent concerner jusqu'à 15% des femelles
gravides) et ils s'accompagnent de rétention placentaire. Des complications de mammite, de
métrite puis de septicémie sont parfois observées. Lors d'une infection proche du part, on note
une mortalité néonatale. (Bille et al , 1996)
Les mammites sont peu fréquentes et elles évoluent soit sous une forme clinique soit
sous une forme sub-clinique. Dans certains cas, les animaux excrètent le germe sans présenter
aucune inflammation mammaire. La présence de Listeria monocytogenes dans le lait constitue
un danger important pour les consommateurs de lait cru ou pour la fabrication de produits au
lait cru car les traitements antibiotiques sont peu efficaces et le germe est excrété dans le lait
en grande quantité et durant une longue période (ainsi, une vache a excrété Listeria
monocytogenes durant 3 lactations consécutives à des concentrations moyennes de 103 unités
formant colonies par mL). La contamination de la mamelle résulterait soit d'une localisation
secondaire soit d'une pénétration par le canal du trayon. (Bille et al , 1996)
Des uvéites, des kératoconjonctivites, des pneumonies, des endocardites et des
myocardites ont également été décrites.
4-6-2-Autres espèces animales
Chez les monogastriques, les listérioses sont rares mais des septicémies et des
méningo-encéphalites ont été décrites chez plusieurs espèces (chiens, chats, porcelets,
poulains). ( Farber et al, 1996)
Chez les oiseaux, les infections provoquent une septicémie, des nécroses du foie, des
nécroses du myocarde et des péricardites. Plus rarement, l'infection se traduit par des
encéphalites (abattement, ataxie, torticolis, chute sur le côté, mouvements désordonnés des
membres...).
Chez les lapins et chez les rongeurs de laboratoire, la forme la plus fréquente est une
septicémie et, chez le lapin on note une monocytose marquée qui est à l'origine de
l'appellation monocytogenes. Chez le cobaye, les infections spontanées sont rares mais
quelques cas de septicémie et de conjonctivite ont été décrits. (Glaser,et al 2001).
4-7-Diagnostic
L'isolement des Listeria sp. est relativement simple lorsqu'elles sont abondantes dans
le prélèvement à analyser et que celui-ci n'est pas contaminé par une flore associée.
L'ensemencement d'une gélose d'usage courant telle qu'une gélose trypticase soja au sang (5
% de sang de mouton, de cheval ou de lapin) permet alors l'isolement. Dans le cas particulier
d'une hémoculture, les milieux classiquement utilisés conviennent pour les Listeria sp.
(Glaser,et al 2001).
Dans les formes neuro-méningées, le LCR contient souvent un nombre faible de
bactéries car l'infection intéresse le parenchyme cérébral et ne se propage que secondairement
aux méninges. Des techniques de PCR ont fait l'objet d'évaluation et elles permettent une
détection de 200 unités formant colonies par mL.
Dans la majorité des cas, notamment dans les denrées alimentaires, les Listeria sont en
faible nombre et la flore associée est abondante. Il faudra alors avoir recours à des techniques
d'enrichissement sélectif suivies d'un isolement sur des milieux sélectifs. (Graves et al ,1999)
Des tests commerciaux permettent une détection rapide des Listeria présentes dans les
denrées alimentaires après enrichissement sélectif. Certains de ces tests ont été validés par
L'AFNOR. Ils reposent soit sur des techniques immuno-enzymatiques utilisant des anticorps
monoclonaux spécifiques du genre Listeria soit sur des techniques faisant appel à des sondes
spécifiques de Listeria monocytogenes et à des tests PCR. Ces différents tests ne sont pas
destinés à un diagnostic clinique effectué à partir de prélèvements d'origine humaine ou
animale.
Le
diagnostic
sérologique
(agglutination,
fixation
du
complément,
immunoprécipitation, détection des anticorps anti-listériolysine O) est soit trop peu sensible
soit trop peu spécifique pour apporter à l'heure actuelle une aide au diagnostic. (Graves et al
,1999).
4-8-Sensibilité aux antibiotiques
In vitro, Listeria monocytogenes et les autres Listeria spp. sont généralement sensibles
à de nombreux antibiotiques : pénicilline G, ampicilline, amoxicilline, azlocilline, imipénème,
gentamicine, sisomicine, nétilmicine, amikacine, kanamycine, streptomycine, érythromycine,
clarithromycine, roxithromycine, tyrothricine, vancomycine, teicoplanine, daptomycine,
triméthoprime-sulfaméthoxazole, rifampicine et tétracyclines. ( Farber et al, 1996)
Un résistance naturelle est notée vis-à-vis des céphalosporines (notamment vis-à-vis
des céphalosporines de 3ème génération à large spectre comme la céfotaxime ou la céfépime),
de l'aztréonam, de l'acide nalidixique, de l'ofloxacine (la D-ofloxacine est complètement
inactive alors que le deuxième composant de l'ofloxacine, la lévofloxacine, est modérément
active), des fluoroquinolones récentes et de la fosfomycine. (Danielsson-Tham et al, 1993)
La
sensibilité
est
intermédiaire
pour
la
céfalotine, la
ciprofloxacine, le
chloramphénicol et la clindamycine. ( Farber et al, 1996)
Quelques rares souches sont capables d'acquérir une résistance à la streptomycine, à la
kanamycine, à la gentamicine, au triméthoprime, aux tétracyclines ou à la rifampicine.
L'émergence des souches résistantes résulte généralement de l'acquisition de plasmides ou de
transposons conjugatifs. La résistance à la tétracycline est la résistance acquise la plus
fréquemment observée chez Listeria monocytogenes aussi bien chez des souches isolées de
prélèvements cliniques que chez des souches isolées des aliments et de l'environnement.
(Farber et al, 1996)
Le traitement fait généralement appel à une association pénicilline G (ou ampicilline) gentamicine. L'association triméthoprime - sulfaméthoxazole constitue une bonne alternative
chez les sujets allergiques aux bêta-lactamines. Cette dernière association présente l'avantage
de bien pénétrer la barrière hémoméningée et d'être active sur les bactéries intracellulaires.
Chez l'homme, la vancomycine est parfois utilisée dans le traitement des formes
septicémiques (la grande variabilité des concentrations atteintes dans le LCR conduit à
émettre des réserves sur son utilisation dans les formes neuro-méningées).
Matériel et méthodes
Matériel et méthodes :
1- Prélèvement et collection des échantillons :
Les souches de Leuconostoc utilisées dans notre travaille ont été isolées à partie de
deux échantillons de lait de chamelle : -Le premier échantillon provienne de la région de
Abadla, Bechar ; c’est un mélange de plusieurs chamelles (espèce : Camelus dromados ; age
entres 6à 10ans de couleurs différentes).
Et le deuxième provienne de la région de Abadla, Bechar ; d’une chamelle de race Camelus
dromados ; age moin de 10 ans de couleur maron.
Le prélèvement s’effectue en soutirant une quantité suffisante du liquide dans un
flacon stérile. Il faut nettoyer la source de prise (le prélèvement a été fait aseptiquement après
que les mamelles ont été désinfectées par l’eau tiède contenants de l’eau de javel 2%), en suite
l’échantillon est mis dans un flacon stérile et conserver à 4 oC jusqu’à sont utilisation.
2- Isolement et purification des souches de Leuconostoc :
2-1- Milieux de cultures utilisés pour l’isolement :
Nous avons utilisé des milieux sélectifs pour les Leuconostoc afin d’éliminer et
ralentir la croissance des autres genres de bactéries lactiques :
-Milieu MRS (De Man Rogosa et sharpe, 1960) additionné à un agent sélectif qui est un
antibiotique la vancomycine à raison de 30µg/ml, car la plupart des bactéries lactiques sont
sensible à cette dose.
-Milieu MSE (mayeux, sandine et Elliker, 1962); (Badis et al, 2005).
2-2- Traitement des échantillons:
1 ml de chaque échantillon est pipeté aseptiquement dans 10 ml d'eau physiologique et
des dilutions décimales est réalisées (10-1 à 10-4), un ml de trois dernières dilutions est
ensemencé en profondeur dans les deux milieux MRSv solide et MSE solide. Toutes les
boites sont incubées à 300C pendant 24h à 72h. (Mathot et al, 1993 ; Khedid et al 2006).
(Selon le plan dans la figure 6)
2-3- Isolement et purification :
L’isolement des bactéries suspect Leuconostoc à été fait à partir des boites de pétrie
contenant un nombre de colonies compris entre 25 et 250 réalisé selon les méthodes décrites
par la fédération international du lait. (Selon le plan dans la figure 6)
La purification des bactéries isolées a été établie par la réalisation des subcultures sur
bouillon et milieu MRS solide jusqu'à l’obtention des colonies bien distincte et homogène.
(Selon le plan dans la figure 6)
La pureté des souches est vérifié par l’étude microscopique et les Leuconostocs seront
identifiées selon les testes classiques (Mathot et al,1994 ; Kihal et al,1996).
3-Identification et caractérisation des isolats :
3-1-Test phénotype :
3-1-1- Examen Macroscopique :
Cette étude est basée sur l’observation visuelle de la culture des isolats sur milieu
MRS solide et liquide ; pour caractériser la taille, la forme et la couleur des colonies sur
milieu MRS solide (Badis et al, 2005). Et la trouble dans le milieu liquide.
Généralement les colonies des leuconostocs ont une forme circulaire de contour
régulier, très petite de taille environ 0.5et 1mm.
3-1-2- Examen microscopique :
Il s’agit d’observer la morphologie cellulaire et le type d’association par la coloration
de Gram. Les leuconostocs sont généralement des cocci ovoïdes et se regroupe en paire et
chaînette (Rodolphe et al, 2002 ; Khedid et al, 2006).
3-1-3- La catalase :
La catalase est une enzyme respiratoire qui permet la dégradation du perxyde
d’hydrogène en eau oxygéné selon la réaction suivante :
H2O2
catalase
H2O +1/2O2
La recherche de la catalase se fait par la mise en contacte d’une colonie bien isolée
avec une goutte d’eau oxygéné sur une lame propre. Un dégagement gazeux abondant sous
forme de mousse ou de bulles traduits la décomposition de l’eau oxygéné sous l’action de la
catalase (Guiraud, 1998).
3-1-4- conservation des souches :
Tous les isolats suspects des bactéries lactiques (gram positif et catalase négatif) sont
conservés.
Deux types de conservation de nos souches sont à noter. Une de courte durée et l’autre
à longue durée.
3-1-4-1-Conservation courte durée
Les souches sont ensemencées sur gélose MRS (ou M17) incliné en tube. Ces cultures
sont gardées à 4 °C. Les repiquages se font toutes les deux semaines (Saidi et al., 2002).
3-1-4-2-Conservation longue durée
A partir de jeunes cultures (18-48 h) sur milieu liquide, les cellules sont récupérées par
centrifugation à 4000 t / min pendant 10 min. Une fois le surnageant éliminé, on ajoute le
milieu de culture de conservation sur le culot. Le milieu de conservation contient du lait
écrémé, 0,2% d’extrait de levure et 30% de glycérol. Les cultures sont conservées en
suspension dense et en tubes eppendorfs à –20 °C. Accolas et al. (1977) indiquent que des
suspensions très concentrées résistent mieux à la congélation. En cas de besoin, les cultures
sont repiquées dans du lait écrémé à 0,5 % d’extrait de levure, avant utilisation
Echantillon du lait
9ml d’eau physiologique
Dilutions décimales
1ml transférer et ensemencer
Profondément dans MRS vancomyciné
Et MSE
Incubation à 300C pendant 24h à 72h
Colonies blanchâtres de forme
Lenticulaire
Ensemencement dans MRS liquide
Incubation à 300C pendant 24h à 48h
Ensemencement dans MRS solide par stries
Incubation à 300C pendant 24h à 48h
Realistion de la coloration de Gram et le test de la catalase
(Conservation des souches Gram positif et catalase négatifs dans le MRS incliné)
Figure (6) : Schéma résumant la méthode utilisée pour l’isolement et la purification des
souches
3-2- Test physiologiques :
3-2-1- Croissance en milieu hypersalé :
Après avoir une cultures jeune des isolats (culture de 18h à 30 0C), ces derniers sont
ensemencés dans un milieu MRS liquide contenant 3% et 6.5 % de chlorure de sodium (NaCl)
et incubés à 300C avec un témoin MRS liquide sans sel pendant 5 jours (Guessas et Kihal,
2004).
La croissance des bactéries est appréciée par l’apparition d’un trouble dans les tubes
(Leveau et Bouix, 1980).
3-2-2- Croissance à pH4.8 et pH6.8 :
Ce test est effectué en inoculant un bouillon MRS dont le pH est porté à 4.8 et 6.8 par
des précultures de 18h des souches pures, les tubes sont incubés à 300C pendant 48h.
3-2-3- Croissance à différentes températures:
Des cultures sont ensemencées sur MRS liquide et incubées pendant 5 jours à des
différentes températures : 40C, 150C, 300C, 370C et 450C. (Guessas et Kihal, 2004).
3-3-Test biochimique :
3-3-1 Production de dextrane :
La production du dextrane à partir du saccharose est mise en évidence sur milieu
solide MSE (Mayeux et al, 1962). Les souches productrices de dextrane sont caractérisées par
la formation de colonies larges, visqueuses et gluantes. Ce test est aussi considéré comme clé
d’indentification permettant aussi de différencier entre les leuconostocs productrices et non
productrice de dextran. (Sanchez et al, 2005).
On à réaliser des ensemencements sur milieu MSE par des préculture de 18h et
incuber à 300C pendant 24h à48h.
3-3-2-Recherche de l’Arginine dihydrolase (ADH) :
La recherche de l’arginine déhydrolase (ADH) est étudiée sur le milieu M16 BCP
(Thomas, 1973). Ce milieu contient du lactose (2 mg / ml) et de l’arginine (4 mg / ml) et un
indicateur de pH le pourpre de bromocrésol (0,05 mg / ml). Les bactéries lactiques utilisent le
lactose en acidifiant le milieu, les colonies donnant ainsi une coloration jaunatre. D’autres
bactéries lactiques sont capables d’utiliser l’arginine et ré-alcalinisent le milieu, leurs colonies
apparaissent blanchâtres. La couleur de l’indicateur de pH demeure inchangée.
On à réaliser des ensemencements sur milieu M16BCP par des préculture de 18h et incuber à
300C pendant 24h à48h.
3-3-3-Test de citrate :
La dégradation du citrate se fait grâce à la citratase qui est une enzyme existe dans
certaines espèces de Leuconostoc donc cette étude oriente l’identification des espèces.
L’utilisation du citrate est étudiée sur milieu Kempler et Mc Kay (1980) (Kihal et al ,1996 ;
Moulay, 2006). Ce milieu contient une solution de ferricyanide de potassium et une solution
de citrate ferrique. La présence du citrate dans le milieu inhibe la réaction entre l’ion ferrique
et le potassium ferricyanide. Les colonies qui fermentent le citrate lancent la réaction entre ces
ions il en résulte la formation de colonies bleues ou ayant un centre bleu (après 18 h-72 h
d’incubation). Les colonies incapables de fermenter le citrate restent blanches.
3-3-4- Recherche du type fermentaire :
Ce test permet de s’avoir le type du métabolisme (homofermentaire ou
heterofermentaire) par le quel le substrat carboné est transformé, et la production du gaz à
partir de le dégradation du glucose.
Ce test est effectuer par l’ensemencement des souches dans un milieu MRS liquide
glucosé contenant la cloche de durham est l’icubation à 30 0C pendant 24h à 48h. Le
développement d’une bactérie hétérofermentaire se manifeste par l’apparition de gaz dans la
cloche de durham qui est absent chez les bactéries homofermentaires. (Bourgeois et al ;
1991).
3-3-5-Etude de profil fermentaire :
La dégradation de différents sucres permet de différentier entre les espèces et sous
espèces des Leuconostoc.
La fermentation des carbohydrates a été mené sur milieu MRS sans extrait de viande et
additionné au pourpre de bromocrysol (BCP) comme indicateur de pH (MRSBCP-EV). La
source de carbone est représentée par l'un des sucres suivant : 1-arabinose- 2- maltose- 3rhamnose
4- esculine 5- manitol
10-glucose
11-sucrose
6- sorbitole
7- galactose
8-Lactose
9-fructose
12 xylose.
Les solutions sucres sont préparée à 3% et stérilisées par autoclavage. Un millilitre de
la solution sucrée est additionné à 10 ml de MRSBCP. Vu le nombre important de souches
étudiées ainsi que le nombre de tubes à essai à utiliser avec chaque souche, une mini
préparation est réalisée au laboratoire. Une plaque d'Elisa est utilisée pour ses puits. Les puits
de chaque ligne contiendront une source de carbone qui sera utilisée par différentes souches
(figure7).
Une solution bactérienne servant à ensemencer les puits contenant les différentes
sources de carbone a été préparée. Une culture de 18 heures de la souche appropriée est
centrifugée à 5000 tr/mn pendant 15 min. Le culot ainsi récupéré est additionné de 2 ml de
tampon phosphate puis recentrifugé aux mêmes conditions pour le débarrasser des restes du
milieu de culture et obtenir un culot cellulaire pur. A ce culot, 5 ml de milieu MRSBCP-EV
est additionné pour former la solution cellulaire servant à ensemencer les puit contenant
différentes source de carbone ; 100 μl de cette solution bactérienne est déposée dans chaque
puit. La lecture des résultats se fait après 24 et 48 heures d’incubation.
Sucres utilisés
Souches
Figure (7) : schéma représente l’utilisation de la plaque d’Elisa pour effectuer le profil
fermentaire des souches.
4- Test biotechnologique :
4-1- Cinétique d’acidité et de croissance :
La production de l’acide lactique par les leuconostocs indique leurs croissances et
provoque la coagulation du lait et la diminution du pH.
Pour effectuer cette étude nos souches (on a choisis deux souche ln5 et B7) sont
ensemencer par stries sur milieu MRS solide et incubées à 30 0C pendant 18h, après leur
croissance une colonie est ensemencée dans MRS liquide et incubée à 300C pendant 18h, de
cette solution 100µl est inoculée dans 10ml du lait écrémé à 0.3% d’extrait de levure et
incubée à 300C pendant 18h.
En suite on a réalisé une culture dans 3ml de la préculture précédente dans des flacon
de 100ml de lait écrémé à 0.3% d’extrait de levure. Le contenue des flacons a été répartit dans
des tubes stériles à raison de 10ml par tubes, le tout est incubé à 30 0C pour la mesure du pH et
la quantité d’acide lactique et l’étude de la croissance.
4-1-1- Dosage d’acidité (Guiraud, 1998) :
L’acidité titrable du lait peut être exprimé de plusieurs manières, dans l’industrie
laitière on emploi le plus souvent les degrés dornic 0D.
Pour doser l’acide on peut utiliser une solution de base dont on connâit la
concentration à l’équivalence le nombre de mole de protons (H+) apporter par l’acide est égal
au nombre de mole de protons captés la base.
Pour cela :
On ajoute 5goutes de la solution phénophtaléine à 1% au 10ml du lait et on ajoute une
solution de soude 1/9N goûte à goûte à l’aide d’une burette jusqu'à l’obtention de la couleur
rose pale, et on note le volume de la soude ajouter.
Acidité (0D) = 10 V de la soude = 01 g/l l’acide lactique.
4-1-2- Mesure de la croissance :
On a utilisé la méthode de numérotation sur milieu solide qui prend en compte que les
cellules vivantes et aptes à se développer sur milieu sélectif.
Les souches sont inoculées dans 10ml de lait écrémé. Une série de dilution dans 9ml
d’eau physiologique est réalisée, après les souches sont ensemencées en profondeur dans
milieu MRS solide.
Et on incube de 24h à 48hà 300C, on dénombre les boites contenant seulement entre 30
et 300 colonies (Guiraud, 2003).
Les résultats sont exprimés selon la relation (Joffin et Leyral, 2006).
Ʃ C
N=
(n1 +0,1n2) d
Ʃ C : la somme des colonies comptées sur les boites.
n1 : le ombres de boites comptées à la dilution la plus faible.
n2 : le ombres de boites comptées à la dilution la plus élevée.
d : est la valeur correspondant à la dilution à partir de la quelle les premiers
dénombrements ont été retenus.
4-2- Etude des interactions bactériennes :
Pour tester la capacité de nos souches de produire une substance antimicrobienne nous
avons adopté la méthode de Fleming et al (1975) et c’est la méthode la plus intéressante selon
la littérature et aboutis à des résultats qualitatifs et quantitatifs.
Pour détecter le pouvoir inhibiteur de nos isolats nous avons utilisé les souches suivantes
comme souche indicatrices :
Lactobacillus plantarum. Provienne du laboratoire da la microbiologie appliquée d’Oran
Lactococcus sp. Provienne du laboratoire da la microbiologie appliquée d’Oran
Escherchia coli : 25922 (E.coli). Provienne du C.H.U d’Oran
Staphylococcus aureus : 43300 (St. Aureus). Provienne du C.H.U d’Oran
Listeria inocoua ATCC 33090.
Listeria ivanovii ATCC 19119.
4-2-1-Interaction par méthode directe (méthode de double couche):
Les nombreuses méthodes décrites pour la détection de souches lactiques productrices
de substances protéiques antimicrobiennes sont basées sur le principe que ces substances
protéiques peuvent diffuser dans un milieu de culture solide ou semi solide qu’on inocule
préalablement avec une souche cible. La production de bactériocine est détectée par le
pouvoir inhibiteur du filtrat du micro-organisme testé sur la croissance du germe cible.
(Benkerroum et al ; 1993)
Les souches de Leuconostoc en phase exponentielle sont ensemencées par touche à
l’aide d’un multipoint sur milieu MRS gélosé et incubées pendant 24h à30 0C. (Barefoot et
Klaenhammer, 1983)
Après la croissance des souches on inocule la deuxième couche qui contient 10ml du
milieu MH semi-solide contenant 100µl d’une culture jeune de la souche considérée
indicatrice. On laisse solidifier le milieu puis on incube à 37 0C pendant 24h.
Le résultat positif se manifeste par l’apparition d’une zone autour de la souche productrice
(Leuconostoc).
4-2-2-Détermination de l’agent inhibiteur (méthode indirecte):
Afin de déterminer la nature de la substance inhibitrice produite par nos bactéries
lactiques, il est impératif de réaliser une série de test on utilisant la méthode indirecte.
Cette méthode permet de mettre en contacte le surnageant de la souches lactiques productrice
de substance antimicrobienne avec la souche test. Les souches précédemment sélectionnées
pour leur production de substances antimicrobienne sont concernées par ce test.
Les souches sont cultivées dans du milieu MRS liquide et incubées pendant 18 heures. Après
incubation, le milieu est centrifugé (8000 rpm/mn 10 min) et le surnagent est conservé. Dans
une boite de Pétri contenant du MRS solide et ensemencé par la souche test, des puits sont
réalisés avec un emporte pièce et celée par 10 μl de gélose MRS. Les puits recevront 100 μl
du surnageant de la souche à testée et les boites sont incubée pendant 24 à 48 heures. Les
colonies entourées d'une zone claire dans la nappe de culture de la souche test et ayant un
diamètre supérieur à 2 mm sont considérées comme positive.
.a- inhibition due au peroxyde d’hydrogène
Pour écarter l’effet du peroxyde d’hydrogène dans l’inhibition nous avons utilisé des
souches qui possèdent la catalase comme souche indicatrices tel que Staphylococcus aureus
Listeria inocoua et Listeria ivanovii
b- inhibition due à l’acide lactique
L’acide lactique est un facteur majeur dans les inhibitions par les bactéries lactiques.
Afin d’éliminer son effet, les leuconostocs sont cultivés dans du MRS liquide tamponné; ainsi
l’acide lactique produit par la souche lactique sera neutralisé et seule la substance
antimicrobienne si elle est produite exprime son action sur les souche indicatrices.
c- recherche de la nature protéique de la substance antimicrobienne
La recherche de substances antimicrobiennes comme les bactériocines, nécessitent la
recherche de la nature de cette substance qui si elle appartenait aux bactériocines devrait avoir
une nature protéique. Pour ce faire le filtrat de culture de la bactérie lactique productrice est
traité par différents types d’enzymes protéolytiques. Ainsi, 1 ml du filtrat de culture est traité
par 1 mg/ml de trypsine ou chymotrypsine et incubé à 37°C pendant 1 heure. Le filtrat ainsi
traité est stérilisé par filtration sur filtre millipore de 45 μm de diamètre. L’action de ce filtrat
est testé par la méthode des puits sur milieu Chapman et incubé à 37°C pour 24 à 48 heure.
d- Effet de la température
Les substances antimicrobiennes ont été testées pour leur résistance à la température et
la conservation de leur activité vis-à-vis des souches indicatrices. Le filtrat de culture de la
souche lactique productrice est traité par différentes températures (75, 80 et 100°C) puis testé
sur les souches indicatrices sur milieu gélose nutritif par la méthode des puits.
4-3-Cinétique d’acidité et de croissance en culture mixte:
Même protocole qui a été utilisé précédemment dans la cinétique d’acidification a été
utilisé pour mesurer le pH et l’acidité Dornic.
La mesure de population bactérienne a été réalisée en utilisant la méthode de
dénombrement en profondeur sur milieu Gélose nutritive (sur ce milieu on a remarqué une
différence entre les colonies de Leuconostoc et les colonies de Listeria sp la deuxième donne
une forme plus grandes). Les deux souches productrices ln5 et B7 ainsi que les deux souches
test Listeria inocoua et Listeria ivanovii ont été repiquées de façons routinière dans 10 ml de
lait écrémé stérile contenant l’extrait de levure, et après 18h d’incubation on a inoculé 3 ml
dans des flacons de 100ml de lait écrémé stérile contenant l’extrait de levure pour les cultures
pure. Pour les culture mixtes on mélangé 1.5ml d’une préculture dans 10ml de lait écrémé
stérile contenant l’extrait de levure d’une bactérie productrice et 1.5ml d’une bactérie test.
Puis on a distribué le contenue des flacons dans des tubes stériles à raison de 10ml chaque
tube. Et on fait la lecture du pH et la production d’acidité et le dénombrement chaque 3heures
pendant 24heures.
Résultats et discussion
Résultats et discussion :
1-Isolement et caractérisation des isolats :
Afin d’isoler les souches de Leuconostoc, deux milieux sélectifs sont utiliser : Le MRS
et le MSE. Une concentration de 30µg/ml de la vancomycine a été additionnée au MRS pour
minimiser la croissance des autres bactéries lactiques qui ne résistent pas à cet agent sélectif
contrairement les leuconostocs qui ont montré une résistance à telle concentration de cet
antibiotique. Nous avons obtenu des colonies de forme lenticulaires ou circulaire de petite
taille sur MRS. Et une forme visqueuse et gluante sur milieu MSE qui indique la production
de dextrane.
2- Caractérisation morphologique :
2-1-Caractérisation macroscopique :
Sur milieu solide :
Après la purification des souches. L’observation macroscopique sur milieu MRS
solide nous a permis de distinguer des colonies de couleur blanchâtre, forme lenticulaire ou
circulaire. Ces colonies sont envieront 0,5 à 1mm de diamètre.(Kihal, 1996 ; Carr et al, 2002)
(Figure8)
Sur milieu liquide :
La croissance des bactéries apparaît sous forme de trouble dans le milieu MRS liquide,
cette trouble est concentrée au fon du tube à la recherche des conditions anaérobiques de ces
bactéries. (Kihal, 1996 ; Carr et al, 2002) (Figure 9).
2-2-Caractérisation microscopique :
Après effectuer l’examen de la recherche de la catalase et la coloration de Gram, toute
les bactéries Gram positif et catalase négatif sont présumées comme bactéries lactiques.
L’observation microscopique nous a permis de voir des cellules forme ovoïde ou
coccobacille ; dont le mode d’association est toujours en chaînes incurvées de nombre paires.
(Kihal, 1996 ; Carr et al, 2002) (Figure 10).
Leuconostoc mesenteroides
Leuconostoc mesenteroides
subsp. mesenteroides
subsp. dextranicum
Figure (8) : aspect des colonies de Leuconostoc obtenu après 24h d’incubation.
Ensemencement par stries.
A
B
Figure (9) : Aspect de culture pure de Leuconostoc sur milieu MRS liquide après 18h
d’incubation.
A : phase claire.
B : trouble de croissance.
1µm
Leuconostoc mesenteroides
subsp. mesenteroides
1µm
Leuconostoc mesenteroides
subsp. dextranicum
Figure (10): observation microscopique des Leuconostoc sous le microscope optique
3- Caractérisation physiologique et biochimique :
3-1- Test physiologiques :
Les résultats des test physiologique ainsi que la croissance des souches dans des
conditions hostiles son montrées dans le tableau (3). Ces examens nous indiques que nos
isolats ont montrées une croissance sur milieu MRS à 3%de NaCl et sur milieu MRS à pH6.8
et l’absence de la croissance sur le milieu MRS à 6.5% de NaCl et sur milieu MRS à pH 4.8
(milieu acide). (Garo, 1998)
Aussi on a remarquer que toutes les isolats poussent dans les températures : 15 oC, 30
o
C et 37 oC et l’absence de la croissance dans les températures 4 oC et 45 oC qui confirme que
nos souches sont des mésophiles.
Tableau (3) : résultats des test physiologiques
souches Gram
Catalase
Croissance
en présence
de NaCl
3%
6.5%
+
1
+
2
+
3
+
4
+
5
+
6
+
7
+
8
+
B1
+
B2
+
B3
+
B5
+
B7
(+) résultat positif ou croissance.
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
pH
4.8 6.8
Croissance à
4oC
15 30 37 45
o
C oC oC oC
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
(-) résultat négatif ou pas de croissance.
3-2- Test biochimiques :
3-2-1 Production de dextrane :
Sur milieu MSE on a obtenue des colonies visqueuse, gluante et large (figure 11). Qui
veut dire toutes les souches produit le dextrane. Ce caractère important nous a permis de
différencier entre les espèces de Leuconostoc et de supposer leurs appartenance à une des
deux espèces productrices de dextrane : Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides,
Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum .(Carr et al, 2002)
Colonies visqueuses
Figure (11) : production de dextran par les Leuconostoc
3-2-2-Recherche de l’Arginine dihydrolase (ADH) :
Toutes nos souches n’ont pas la capacité à hydrolyser l’arginine, car les Leuconostoc
ne possèdent pas l’ADH (arginine déhydrolase). (Kheddid et al, 2006). Sur M16BCP on
observe des colonies jaunes a cause de la dégradation du sucre qui donne de l’acide lactique
ce dernier rond le milieu jaune. (Figure12).
ln1
ln2
Colonies de couleur jaune
ln7
ln3
ln6
ln4
ln5
ln8
B1
B3
B5
B2
colonies de couleur jaune
B7
Figure (12) : test de l’hydrolyse de l’arginine.
Colonie de couleur jaune : résultat négatif (pas de dégradation de l’arginine)
3-3-3-Test de citrate :
Le milieu KMK différencié entre les bactéries qui utilisent le citrate pour donner des
produits aromatiques et les bactéries qui n’utilisent pas le citrate.Dans le premier cas les
résultats se manifestent par des colonies de couleur bleus contrairement les résultats négatif
donnent des colonies de couleur blanche. Figure (13).
Sur milieu KMK (1980)qui est utilisé pour savoir le pouvoir des bactéries de dégrader
le citrate, ce dernier qui se trouve en faible concentration dans le lait mais il est constitue
néanmoins une substance clé dans l’élaboration des produits laitiers fermentés(François,
1986 ; Sanchez et al, 2005)). Le métabolisme du citrate génère des aromes notamment
diacétyle. Le milieu utilisé contient du citrate de fer et du ferrocyanure de potassium. Les
souches capables de fermenter le citrate permettant la réaction entre l’ion ferrique et le
potassium ferricyanide de cette façon résulte la formation des colonies bleues, et ces les cas
pour les souches : ln2, ln3, ln4, ln5, ln6, ln7, ln8, B1, B2, B3, B5 et B7 contrairement la
souche ln1 qui ne dégrade pas le citrate cette perte de la capacité d’utiliser le citrate est peut
être due à une perte de plasmide codant pour le citrate permease (Kihal et al, 1996) .
ln2
ln3
ln1
Colonies blanches
ln4
Colonies bleues
ln5
ln7
ln6
B1
ln8
B2
B3
B7
B5
Figure (13) : test de citrate sur milieu KMK
Colonie de couleur blanche : résultat négatif
Colonie de couleur bleu : résultat positif
3-3-4 Type fermentaire :
Toutes les souches ont donnez du gaz (CO2).à partir du glucose qui apparaisse dans la
cloche de durham et le flottement de cette dernière dans le milieu (figure14). Donc tous les
isolats ont révélé un métabolisme lors de la fermentation des sucres qui est un caractères
spécifique pour les Leuconostoc (Mathot et al, 1994 ; Badis et al 2005)
ln1
ln2
B1
ln3
ln4
B2
ln5 ln6
ln7
B3
ln 8
B5
T
B7
Figure (14) : type fermentaire sur milieu MRS liquide glucosé contenant la cloche de
durham.
3-3-5-Profil fermentaire
Pour mieux identifier les isolats au niveau de l’espèce et de la sous espèce on a établit
leur profil fermentaire de douze sucres on utilisant le milieu MRS BCP qui contient le
bromocrésol qui est un indicateur de pH, leur virage au jaune révèle l’aptitude des souches
utiliser les différents sucres qui ont été disponible. L’utilisation de ce caractère permet de
conclure la pré-identification de nos isolats.
Tableau (4) : le profil fermentaire des 15 souches
souches
arabinose
maltose
rhamnose
esculine
manitol
sorbitole
galactose
lactose
fructose
glucose
sucrose
xylose
ln1
+
-
+/-
+/-
-
-
+
+
+
+
+
+
ln 2
+
+
-
+
+
-
+
+
+
+
+
+
ln 3
+
+
-
-
+
-
+
+
+
+
+
+
ln 4
+
+
-
+
+
+/-
+
+
+
+
+
+
ln 5
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
ln 6
+
+/-
-
+/-
-
+/-
+
+
+
+
+
+
ln 7
+
+
-
+
+/-
+
+
+
+
+
+
+
ln 8
-
+
-
-
-
-
+
+
+
+
+
+
B1
-
+
-
-
-
-
+
+
+
+
+
+
B2
-
+
-
-
-
-
+
+
+
+
+
+
B3
+
+
-
-
-
-
+
+
+
+
+
+
B5
-
+
-
-
-
-
+
+
+
+
+
+
B7
-
+
-
-
-
-
+
+
+
+
+
-
(+) Dégradation du sucre.
(-) pas de dégradation.
Le profil fermentaire des sucres nous a permis de confirmer la pré-identification de
nos isolats en se basant sur des donnés bibliographiques établis par Carr et al, (2002) et
Khedid e tal , (2006). La fermentation de l’arabinose et à l’aide du résultat obtenus par le test
de la production de dextrane nous ont permis de différencier les sous espèces de Leuconostoc
mesenteroides, de classer les souches ln1, ln2, ln3, ln4, ln5, ln6, ln7, ln8 et B3 comme
Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides, et les souches B1, B2, B5, B7 comme
Leuconostoc mesenteroides subsp dextranicum.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A
B
C
D
E
F
G
Figure (15) : profil fermentaire :
Couleur jaune dégradation du sucre.
Couleur bleue résultat négatif.
Sucres : 1-arabinose- 2- maltose- 3- rhamnose
7- galactose
Souches: A- B1,
8-Lactose
9-fructose
4- esculine 5- manitol
10-glucose
11-sucrose
6- sorbitole
12 xylose
B- B2, C-B3, D-B5, E-B7, F-ln8
G- temoin
Au cours de notre étude nous avons pu collecter sur la bases des critères
phénotypiques rapporter par plusieurs auteur (Carr et al, 2002 ; Badis et al, 2005 ; Hammes et
Hertel, 2006 ; Khedid et al, 2006) 13 souches de Leiuconostoc mesenteroides .
4- Test biotechnologique :
4-1- Cinétique d’acidité et de croissance :
La production de l’acide lactique à été suivie en fonction du temps en utilisant les
cultures pures des souches sélectionnées (ln5 et B7), cette activité acidifiante est souvent
utilisée dans le choix des souche pour l’industrie alimentaire.
Le suivi de la quantité d’acide lactique produite et l’évolution du pH dans les
conditions mésophiles nous a permis de conclure que le temps d’incubation à influencer
positivement sur le rendement de nos souches. Les résultats sont présentés sous forme de
diagramme (figure16 et 17).
De ces résultats nous avons constaté que la quantité d’acide lactique produite change
selon le stade de vie de la bactéries cette différence de production peu être expliqué par une
déficience dans le système du transport des substances fermentescibles du milieu vers le
cytoplasme cellulaire. (Albenzino et al, 2001).
Nous remarquons aussi que la production d’acide lactique par nos souches est moi
importante, on explique ceci par leur métabolisme hétérofermentaire donc la production
d’autre composé organique tel que l’acide acétique, le glyceraldehyde, l’éthanol et le CO2
plus l’acide lactique (Kihal et al ,2006).
Le suivi du pH montre une diminution progressive pour les souches sélectionnées, et
on a remarquer une variation entre les deux souches dans la production d’acide lactique et
aussi la diminution du pH cela s’explique par plusieurs facteur le plus important est l’aptitude
des souches a possédé une activité protéolytique qui est
chromosomique (Juillard et al, 1998).
codé par un matériel extra-
7
6,5
pH
6
B7
5,5
ln5
5
4,5
4
0h
3h
6h
9h
18
24h
temps( heures)
OD
Figure (16) : variation du pH en fonction du temps cher les souches : ln5, B7
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
ln5
B7
0h
3h
6h
9h
18
24h
temps (heures)
Figure (17) : variation de l’acidité exprimée en degrés dornic en fonction du temps
cher les souches : ln5, B7
4-2- Etude des interactions bactériennes :
4-2-1- Les interactions et la recherche de la nature de l’agent inhibiteur :
La détermination de l’activité antimicrobienne e nos isolats sont mettre en évidence
par la diffusion sur milieu solide en utilisant la méthode d’interaction directe (Rayan et al
1996), vis a vis les bactéries lactiques (Lactobacillus sp. Lactococcus sp.).
Après l’incubation à300C et pendant 18h nous avons remarqué l’apparition d’une
zone claire autour de la souche productrice. Cette zone indique l’inhibition des deux bactéries
indicatrices par les souches sélectionnées.(figure18 et 19).
ln1
ln4
ln2
ln5
ln3
Zone claire
ln6
ln7
Ln8
B3
B1
B5
B2
Zone claire
B7
Figure (18) : l’inhibition de Lactococcus sp par Leuconostoc
utilisant la méthode directe.
La zone claire est l’indice de l’inhibition
mesenteroides en
ln1
ln2
ln3
Zone claire
ln4
ln5
ln6
ln7
ln8
B1
Zone claire
B2
Zone claire
B3
.
B5
B7
Figure (19) : l’inhibition de Lactobacillus plantarum par Leuconostoc mesenteroides
en utilisant la méthode directe.
Pour étudier le spectre d’inhibition, nous avons tester les 13 souches avec quatre
bactéries
indésirables
Escherchia
coli :
25922
(E.coli).
Staphylococcus
aureus :
43300(St.Aureus).Listeria inocoua ATCC 33090. et Listeria ivanovii ATCC 19119. en
utilisant la méthode directe et on a obtenu des résultats positif (l’inhibition des bactéries
pathogènes). Alors on a présumé que les 13 souches de Leuconostoc sont des souches
productrices de substances antimicrobiennes.( figures20,21,22,23)
ln1
ln2
ln4
ln5
ln3
zone claire
ln6
ln7
ln8
B1
B2
zone claire
B7
B3
B5
Figure (20) : l’inhibition de Listeria innoccua par Leuconostoc mesenteroides en
utilisant la méthode directe.
ln1
ln2
ln4
ln3
ln5
zone claire
ln6
ln7
ln8
B1
B3
B5
B2
zone claire
B7
Figure (21) : l’inhibition d’ E. coli par Leuconostoc mesenteroides en utilisant la
méthode directe.
ln1
ln2
ln4
ln3
ln5
ln7
B2
B5
ln8
ln6
zone claire
B1
B3
B7
zone claire
Figure (22) : l’inhibition d’ St. aureus par Leuconostoc mesenteroides en utilisant la
méthode directe.
ln1
ln4
ln7
B2
B5
ln2
ln3
ln5
ln8
zone claire
ln6
B1
B3
zone claire
B7
Figure (23) : l’inhibition de Listeria ivanovii par Leuconostoc mesenteroides en
utilisant la méthode directe.
Au cour de la chaîne de fabrication et de la conservation, les produits fermenté ne sont
jamais à l’abri de contamination par les bactéries indésirables pathogènes et de détérioration
(Castano et al, 2005) Clostriium Sp., Bacillus cereus, Listeria moncytogénes et
Staphylococcus aureus, sont parmi les germes pathogènes majeurs impliqués dans les toxiinfections alimentaires(Benhamouche, 2005 ; Guessas, 2007). Comme d’autres bactéries
lactiques telles que les leuconostocs produisent une variété de substances antimicrobienne,
tels que les acides organiques, peroxyde d’hydrogène, les phages lysogènes et les
bactériocines (Castano et al, 2005).
Notre étude d’interaction nous a permis de conclure que le diamètre d’inhibition varis
selon les espèces. Le tableau (5) illustre les diamètres des zones d’inhibition de la croissance
des bactéries indicatrices.
Souchesproductrice
ln1
ln2
ln3
ln4
ln5
ln6
ln7
ln8
B1
B2
B3
B5
B7
7
8
11
8
9
10
11
8
8
9
7
8
9
Lactococcus sp
8
6
8
8
7
7
9
11
10
9
9
9
5
Escherchia coli
8
9
7
10
10
8
9
7
9
8
9
7
7
Staphylococcus
8
8
7
9
11
8
9
9
10
8
7
7
8
Listeria inocoua
8
6
9
9
8
10
11
7
8
9
9
8
9
Listeria ivanovii
8
9
7
9
11
10
9
9
10
8
7
7
8
Souchesindicatrices
Lactobacillus
plantarum
aureus
4-2-2-Détermination de l’agent inhibiteur (méthode indirecte):
Les bactéries lactiques peuvent produire des substances inhibitrices différentes des
bactériocines. Pour éliminer l’effet de l’acidité on utiliser le milieu tamponné, et on utiliser le
surnageant pour confirmer qu’il y a une substance produite.
Pour rechercher si la cause d’inhibition est due à une substance de nature protéique ou
au moins dont la partie portante cette activité est protéique on a éliminé deux cause
d’inhibition ; l’acidité du milieu et le H2O2.
Les leuconostocs produisent des acides organiques tels que l’acide lactique et acétique
(Kihal et al, 2006) qui se libèrent dans le milieu de culture ce qui conduit à l’acidification et
qui peuvent être une cause principale d’inhibition des souches indésirables. L’utilisation du
milieu tamponné nous a permis de stabiliser le pH et donc d’exclure l’effet de l’acidité qui
présente un pouvoir antimicrobien. Des travaux similaire ont été réaliser par Labioui et al
(2005) lorsqu’ils ont neutralisé le surnageant pour éliminer le facteur acidifiant lors des études
faites sur la sélection de bactéries lactiques antimicrobiennes.
On a remarqué que le diamètre de la zone d’inhibition sur milieu tamponné est moins
important que celui sur milieu normal. (Figure 24 et25)
ln1
ln2
ln4
ln5
ln3
zone claire
ln6
ln7
ln8
B3
B1
B5
B2
zone claire
B7
Figure (24) : activité antibactérien de Leuconostoc mesenteroides vis-à-vis listeria
innoccua en utilisant milieu tamponné.
ln1
ln4
ln2
ln3
ln5
zone claire
ln6
ln7
ln8
B1
B3
B5
B2
zone claire
B7
Figure (25) activité antibactérien de Leuconostoc mesenteroides vis-à-vis listeria
ivanovii en utilisant milieu tamponné.
Après le traitement du surnageant avec la température on a remarqué qu’il y à une
inhibition même après le chauffages d’une température de 100 0C. Qui veux dire que la
substance résiste à la température (Lachance ,2000 ; Labioui et al,2005).
Les deux figures (26et 27) montrent qu’il y à une disparition de la zone d’inhibition
après le traitement du surnageant avec la chymotrypsine, ceci indique que l’agent inhibiteur
est sensible au protéase.
Les résultats obtenus après le traitement thermique du surnageant contenant la
substance et les tests des enzymes protéolytiques ainsi que l’élimination de l’acidité et le
H2O2 (en utilisant les bactéries catalase positive) nous on permis de sélectionner des souches
productrices de substance antimicrobienne d’une nature protéique thermorésistant (Hugas et
al, 2003).
Figure (26) activité antibactérien de leuconostoc vis-à-vis listeria inoccua on utilisant
milieu tamponné traité avec la chymotrypsine
Figure (27) activité antibactérien de leuconostoc vis-à-vis listeria ivanovii on utilisant
milieu tamponné traité avec la chymotrypsine
4-3-Cinétique d’acidité et de croissance en culture mixte:
L’étude de l’acidité produite par les deux souches ln5 et B7 en milieu lait est évaluée
par la quantité d’acide lactique produit et exprimée en degré Dornic ( 0D). Une production
d’acide lactique de 130D pour les deux souches après 6h d’incubation, cette production
augmente avec le temps pour depasser 450D après 24h d’incubation. Le pH diminue avec le
temps de 6.8 à 0h pour arriver à 5.2pourr la soucheln5 et 4.8 pour la souche B7 après 24h
d’incubation.Cette production d’acide lactique est liée à la croissance des bactéries
La croissance de Listeria inoccua et Listeria ivanovii en culture mixte avec ln5 etB7,
est évaluée sur milieu lait. On a remarquer une diminution de la croissance de Listeria
inoccua et Listeria ivanovii après 9h dd’incubation. Par contre en remarque une croissance de
Listeria inoccua et Listeria ivanovii en culture pure. On peu dire que la diminution de la
croissance des deux bactéries Listeria inoccua et Listeria ivanovii est due à une inhibition par
les deux souches ln5 et B7, cette inhibition est combinée par la production d’acidité et /ou la
production de substance antimicrobienne (bacteriocin-like). On peu comparer ces résultats
avec celles de Guessas (2007) dans son étude d’inhiber la croissance de Staphylococcus
aureus par Lactococcus lactis en cultures mixtes.
L’acidité et la production des substances antimicrobiennes jouent un rôle important
dans les fermentations alimentaires et surtout la production fromagère.
7
6,5
pH
6
ln5
B7
Listeria inoccoua
Listeria ivanovii
5,5
5
4,5
4
0h
3h
6h
9h
18
24h
temps (heure)
Figure (28) : variation du pH en fonction du temps cher les souches : ln5, B7
Listeria inoccoua et Listeria ivanovii .en culture pure.
7
6,5
ln5+ Listeria inoccoua
pH
6
ln5 + Listeria ivanovii
5,51
B7+ Listeria inoccoua
5
B7+ Listeria ivanovii
4,5
4
0h
3h
6h
9h
18
24h
temps (heure)
Figure (29) : variation du pH en fonction du temps cher les souches : ln5, B7
Listeria inoccoua et Listeria ivanovii .en culture mixte.
70
0
D
60
50
ln5
40
30
B7
20
Listeria ivanovii
Listeria inoccoua
10
0
0h
3h
6h
9h
18
24h
temps (heure)
Figure (30) : variation de l’acidité exprimée en dergrés dornic en fonction du temps cher les
souches : ln5, B7, Listeria inoccoua et Listeria ivanovii .en culture pure.
70
0
D
60
50
ln5+ Listeria inoccoua
40
30
ln5 + Listeria ivanovii
20
B7+ Listeria ivanovii
B7+ Listeria inoccoua
10
0
0h
3h
6h
9h
18
24h
temps(heure)
Figure (31) : variation de l’acidité exprimée en dergrés dornic en fonction du temps cher les
nombre des cellules (logN)
souches : ln5, B7, Listeria inoccoua et Listeria ivanovii .en culture mixtepure.
11
10,5
10
9,5
9
8,5
8
7,5
7
6,5
6
5,5
5
Souche ln5
Souche B7
Souche Listeria
inoccoua
Souche Listeria
ivanovii
0h
3h
6h
9h
18h
24h
temps (heure)
Figure (32) : représentation graphique de la croissance exprimé par (logN) en fonction
du temps des souches ln5, B7, Listeria inoccoua et Listeria ivanovii en culture pure.
nombre des cellules(logN)
10
9,5
9
8,5
8
7,5
7
6,5
6
5,5
5
ln5+ Listeria inoccoua ln5
ln5+ Listeria inoccoua
Listeria inoccoua
ln5+ Listeria ivanovii ln5
0h
3h
6h
9h
temps (heure)
18h
24h
ln5+ Listeria ivanovii Listeria
ivanovii
Figure (33) : représentation graphique de la croissance exprimé par (logN) en fonction
du temps des souches ln5, Listeria inoccoua et Listeria ivanovii en culture mixte.
Figure (34) : représentation graphique de la croissance exprimé par (logN) en fonction du
temps des souches, B7, Listeria inoccoua et Listeria ivanovii en culture mixte.
Conclusion :
Les bactéries lactiques regroupent un ensemble d’espèces hétérogènes dont le trait
commun est la production d’acide lactique. Elles appartiennent à divers genres comme
Bifidobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus,
Streptococcus, Aerococcus, Alloicoccus et Carnobacterium.
Elles interviennent dans l’industrie laitière et dans la fermentation de nombreux autres
produits alimentaires : saumurage des légumes, boulangerie, fabrication du vin, saurissage des
poissons, des viandes et des salaisons, etc. Elles contribuent à la texture, à la saveur des
aliments et à la production de composés aromatiques.
Elles fermentent les glucides en acide lactique, d’où une diminution du pH favorable à
la conservation des aliments. Leur pouvoir antagoniste résulte aussi d’une compétition pour
les substrats et, si les conditions de développement sont favorables, de l’élaboration
debactériocines comme la nisine.
Dans ce travail nous avons sélectionné des souches de Leuconostoc isolé à partir du
lait de chamelle, en utilisant le milieu MRS additionner à la vancomycine (30µg/ml) pour
sélectionner les leuconostocs qui résistent à cette antibiotique contrairement les autres
bactéries lactiques . Cette résistance est chromosomique.
Apres effectuer les testes physiologiques et biochimiques nous avons identifier les
souches isolées (13 souches). Toutes les souches sont catalase négatif et gram positif, et ne
possèdent pas l’arginine dé-hydrolase (ADH négatif).
Toutes les souches dégradent le saccharose en donnant les exoploysaccahrides (tel le
dextrane).Aussi les 13 souches dégradent le citrate pour donner des produits aromatiques. A
par la souche -ln1- qui ne le dégrade pas.
Nous avons identifié les souches :
 ln1, ln 2, ln 3, ln 4, ln5, ln6, ln 7, ln8 et B3 Leuconostoc misenteroides subsp
misentiroides
 B1, B2, B5 et B7
Leuconostoc misenteroides subsp dixtranicum
L’étude des interaction nous a permis de confirmer que les Leuconostoc ont la capacité
de produire des substances antimicrobiens qui ont un effet sur les bactéries Garm positif
(bactéries lactiques et Listeria sp et St aureus) et gram négatif ( E coli). Les différent teste ont
montré que la substance produite et de nature protéique (bacteriocin like).
Cette étude nous a permet de sélectionner des souches de Leuconostocs ayant la
capacité d’inhiber les croissance des bactéries pathogènes sur milieu lait.
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annexes
Annexe :
Milieux de culture :
Milieu MRS (Man Rogosa et Sharpe, 1960)
Extrait de levure
5g
Extrait de viande
10 g
Polypeptone
10 g
Citrate de sodium
2g
Acétate de sodium
5g
Glucose
20 g
KH2PO4
2g
MgSO4
0,25g
MnSO4
0,05 g
Agar-Agar
15 g
Eau distillée
1000 ml
pH
6.2
Autoclavage 120°C/ 20 minutes
Milieu MSE (Mayeux, Sandine et Elliker, 1962)
Tryptone
20 g
Gélatine
2.5 g
Extrait de levure
5g
Saccharose
100 g
Glucose
5g
Citrate de sodium
1g
Azide de sodium
0.075 g
Agar-Agar
15 g
Eau distillée
1000 ml
pH
6,8
Autoclavage 120°C/ 20 minutes
Milieu KMK (Kempler et Mc Kay, 1980)
Extrait de levure
3g
Biopolytone
2,5g
Glucose
5g
Agar
15 g
Eau distillée
1000 ml
pH
6.6
Le milieu est réparti à raison de 100 ml par flacon, puis autoclavé 15 minutes à 121°C.
Au moment de l’emploi on ajoute :
1 ml d’une solution aqueuse de ferricyanide de potassium 10 % (p/v)
1 ml d’une solution aqueuse à 2.5 % (p/v) de citrate ferrique et citrate de sodium (p/p)
Ces solutions sont stérilisées par filtration sur filtre millipore 0.22 μm et sont
conservées à l’obscurité à 4°C.
Milieu M16 BCP (Thomas, 1973)
Extrait de levure
2,5 g
Extrait de viande
5g
Peptone
10 g
Acide ascorbique
0,5 g
Lactose
2g
L-arginine
4g
Pourpre de Bromocrésol
0,05 g
Agar-Agar
15 g
Eau distillée
1000 ml
pH
6,8
Autoclavage 120°C pendant 20 minutes
Milieu MRS BCP
MRS (milieu liquide) moins l’extrait de viande et sans sucre
1000 ml
Bromocrésol pourpre
0,025 mg
pH
7.0
Autoclavage 120°C/ 20 minutes
Milieu Mueller-Hinton (Mueller et Hinton, 1941)
Infusion de viande de bœuf
3000 cm3
Peptone de caséine
17,5 g
Amidon de mais
1,5 g
Agar-agar
17 g
pH
7.4
Autoclavage 120°C/ 20 minutes
Gélose nutritive
Extrait de viande
1g
Extrait de levure
2g
Peptone
5g
Chlorure de sodium
5g
Agar-agar
15 g
Eau distillée
1000 ml
pH
7,4
Autoclavage 120 °C pendant 20 minutes
Bouillon nutritif
Extrait de viande
1g
Extrait de levure
2g
Peptone
5g
Chlorure de sodium
5g
Eau distillée
1000 ml
pH
7,4
Autoclavage 120 °C pendant 20 minutes
Lait écrémé
Lait en poudre
110 g
Eau distillée
1000 ml
Extrait de levure
3g
Autoclavage 110°C pendant 10 minutes
Eau Physiologique
Chlorure de sodium
8,5 g
Peptone
0,5 g
Eau distillée
1000 ml
pH
7,0
Autoclavage 120°C pendant 20 minutes.
Tampon phosphate de sodium
Solution (a) : 27.8g NaH2PO4 dans 100ml d’eau distillée.
Solution (b) : 53.65g Na2HPO4 dans 100ml d’eau distillée.
Tampon 0.1 M : 39ml solution (a) + 61 ml solution (b).
Stérilisation à 1100C pendant 20mn.