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METHODES D’ETUDE DE LA CELLULE BREIZH TUT 2016/2017 SOMMAIRE I. Le matériel d’observation II. Les compléments optiques III. Préparation en microscopie photonique IV. Méthodes de visualisation Introduction La cellule est une unité trop petite pour être observée par l’œil humain, ainsi certains outils sont nécessaires pour grossir les éléments d’une cellule. Introduction Quelques définitions : Limite de résolution : plus petite distance devant séparer deux objets pour qu’ils apparaissent distincts. Profondeur de champs : espace entre le début et la fin de la zone nette. Plus le grossissement est élevée plus la profondeur de champs diminue. (*) I. Le matériel d’observation A. La loupe binoculaire ou stéréomicroscope • Observation par transparence et d’objet opaque. • Limite de résolution : 2 μm (*) • Grossissement : x200 (*) I. Le matériel d’observation B. Microscope photonique classique ou droit • Observation par transparence uniquement et d’objet peu épais. •Limite de résolution : 0,25 μm (*) • Grossissement : de x40 à x1250 (*) I. Le matériel d’observation C. Microscope inversé • Le microscope inversé a les mêmes caractéristiques que le microscope photonique classique. • L’objet est éclairé par le haut. • Surtout utilisé pour observation des cellules en culture. I. Le matériel d’observation D. Microscope confocal Caractéristiques : L’objet est éclairé par un balayage LASER. Il y a une meilleure résolution et une meilleure observation des cellules fluorescentes. Possibilité de reconstitution 3D informatique. II. Les compléments optiques A. Le contraste de phase Le condensateur contient un anneau clair et l’objectif un anneau sombre, permettant de sélectionner la lumière réfractée (la lumière émise par l’objet). Particularité : présence d’un allo blanc Observation de cellules vivantes, en culture. II. Les compléments optiques B. Le contraste interférentiel Dispositif complexe avec des phénomènes d’interférence, qui ne nécessite pas de coloration. Particularité : présence d’un relief caractéristique Observation de cellules vivantes. II. Les compléments optiques C. Le fond noir Le condenseur est opaque, ainsi seule la lumière déviée par l ’objet est observée. Observation utilisée en bactériologie II. Les compléments optiques D. La polarisation Permet l’observation de structures déviant le plan de l’onde lumineuse. Technique utilisée en minéralogie par exemple. II. Les compléments optiques E. L’épifluorescence La fluorescence est la capacité d’émettre des photons de plus faible longueur d’onde que la lumière incidente. Technique permettant l’observation d’objet fluorescent ou d’objet après marquage moléculaire. III. Préparation en microscopie photonique Il existe deux types de matériel biologique : Les cellules isolées qui sont étalées, fixées puis colorées. (*) Les tissus biologiques qui sont fixés, inclus, coupés puis colorés. (*) III. Préparation en microscopie photonique A. La fixation La fixation permet la préservation et un petit durcissement des structures par coagulation ou pontage des protéines. En pratique le formol tamponné, le liquide de Bouin ou le Carnoy sont utilisés. III. Préparation en microscopie photonique B. L’inclusion en paraffine L’inclusion en paraffine assure la consistance homogène de la pièce et une bonne conservation. La pièce biologique est en milieu aqueux avec le fixateur. La paraffine étant hydrophobe, il est nécessaire de la déshydrater dans des bains d’alcool croissant. Elle est ensuite plonger dans des bains de solvant, puis plonger dans de la paraffine liquide à 56°c. Le tout refroidit et donne un bloc solide. III. Préparation en microscopie photonique C. La coupe La coupe du bloc de paraffine se fait grâce à un microtome (couteau qui exerce un va et vient) réalisant des coupes de 4 à 6 μm. D. La coloration La coloration se fait en solution aqueuse ou alcoolique qui ne diffuse pas dans la paraffine. Il est donc nécessaire de réhydrater la pièce biologique. III. Préparation en microscopie photonique E. Le montage de la lame La préparation est de nouveau déshydratée car une résine hydrophobe de même indice de réfraction que le verre est utilisée. Puis on y dépose une lamelle. F. Avantages et inconvénients de l’inclusion en paraffine AVANTAGES INCONVENIENTS La conservation Lent ( 36 à 48h) Des images de qualité Elimination des lipides et petites molécules Réactions enzymatiques arrêtées III. Préparation en microscopie photonique G. Les coupes en congélation Pas de fixation, ni d’inclusion. La coloration est rapide. La coupe se fait à l’aide d’un cryo-microtome. AVANTAGES INCONVENIENTS Rapide Qualité médiocre Maintient l’activité biochimique Conserve les lipides IV. Méthodes de visualisation Les colorations Colorations vitales Colorations générales Colorants acides Colorants basiques Erythrosine Encre de Chine - protéines - sy stèm e phagocy taire m ononucléé Bleu de Nil - diffuse à trav ers les m em branes Bleu de Trypan - cellules m ortes Bleu de toluidine - acides nucléiques (ADN, ARN) cy toplasm iques (rouge/rose) Eosine - protéines cy toplasm iques (orange) Vert lumière - protéines cy toplasm iques (v ert) Colorant métachromatique (Bleu) Hématéine - acides nucléiques (brun) Colorations histochimiques PAS - grandes chaines sucrées Feulgen Rosenbeck - ADN Colorations argentiques - m élanine - am ines biogènes - neurofibrilles des neurones Julsss IV. Méthodes de visualisation En pratique 2 ou 3 colorants sont associés : Hématéine-éosine et hématéine-éosine-safran pour les coupes. May Grünwald giemsa (MGG) pour les frottis sanguins. IV. Méthodes de visualitaion L’histo-enzymologie Recherche d’activité enzymatique sur des coupes en congélation ou sur étalement de cellule. IV. Méthodes de visualitation L’immuno-histochimie Très spécifique (*) et localise des molécules données à l’aide d’Ac. L’immunofluorescence directe L’immunofluorescence indirecte IV. Méthodes de visualisation L’immuno-enzymologie Dans ce cas le marquage de l’Ac secondaire se fait par une enzyme. Plein de courage et de réussite !!!
