utilisation des ovocytes de xenope

UNIVERSITE DE NICE SOPHIA ANTIPOLIS
FACULTE DES SCIENCES
UTILISATION DES OVOCYTES DE XENOPE
EXTRAIT DE LA THÈSE
de Docteur en SCIENCES
mention Sciences de la Vie
de Fabrice DUPRAT
Étude par Électrophysiologie des Relations Structure-fonction,
de la Pharmacologie et des Régulations de Canaux Potassiques
Clonés.
Soutenue le 9 janvier 1998
Institut de Pharmacologie Moléculaire et Cellulaire
Sophia Antipolis
TABLE DES MATIÈRES
II MATÉRIELS ET MÉTHODES .............................................................................................19
II-A OVOCYTE DE XÉNOPE .........................................................................................................19
II-A-1 Généralités..................................................................................................................19
II-A-2 Maintenance des Xénopes ...........................................................................................20
II-A-3 Préparation des ovocytes.............................................................................................20
II-A-4 Injection d’ARN et d’ADN...........................................................................................20
II-A-5 Canaux ioniques endogènes à l'ovocyte.......................................................................21
II-A-5-a Canal sodique................................................................................................................... 21
II-A-5-b Canaux chlore.................................................................................................................. 21
II-A-5-c Canaux calciques.............................................................................................................. 22
II-A-5-d Canaux potassiques.......................................................................................................... 22
II-A-5-e Canaux cationiques........................................................................................................... 24
II-A-5-f Canaux ioniques induit...................................................................................................... 24
II-A-6 Récepteur de l'ovocyte.................................................................................................26
II-A-7 Canal potassique des cellules folliculaires ..................................................................26
II-A-8 Récepteurs des cellules folliculaires modulant un courant K+......................................26
II-A-9 Récepteurs des cellules folliculaires modulant un courant Cl- .....................................28
II-A-10 Conclusion : l'ovocyte comme modèle d'expression ...................................................28
II-A-11 Enregistrements en double microélectrodes...............................................................33
II-A-12 Enregistrement en "Ovocyte ouvert"..........................................................................33
II-A-13 Enregistrement avec des électrodes garnies d'agarose...............................................34
II-A-14 Enregistrements en patch-clamp................................................................................34
9
ABRÉVIATIONS
ABC
9-AC
AC
ACh
ADP
ADN
ADNc
4-AP
AMPc
ARN
ARNc
ARNm
ATCC
ATP
BAPTA
CK
CFTR
CGRP
CHO
ChTX
COS
8CPT-AMPc
CTX
DAG
DEAE
diC8
DHP
DIDS
DMEM
DMSO
DNP
DTX
EC50
ECG
EEG
EGTA
EMG
ENG
EOG
epsp
ERG
FSH
GDP
GMPc
GTP
HCG
HEK
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ATP-binding cassette
Acide anthracene-9-carboxylique
Adénylate cyclase
Acétylcholine
Adénosine 5'-diphosphate
Acide désoxyribonucléique
ADN complémentaire
4-Aminopyridine7
Adénosine monophosphate cyclique
Acide ribonucléique
ARN complémentaire
ARN messager
American type cell collection
Adénosine triphosphate
Acide 1,2bis(2-aminophénoxy) éthane-N,N,N',N' tétraacétique
Caséine kinase
Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator
Calcitonin gene related peptide
Chinese hamster ovary
Charybdotoxine
CV-1 Origin SV40
8-(4-chlorophenylthio) AMPc
Cholératoxine
Diacylglycérol
Diéthylaminoéthyl
1,2-dioctanoyl-sn-glycérol
Dihydropyridines
Acide 4-4'-diisothiocyanatostilbene-2-2'-disulphonique
Dulbecco modified eagle medium
Diméthylsulfoxyde
Dinitrophénol
Dendrotoxine
Concentration de demi effet (utilisé pour les activations)
Électrocardiogramme
Électroencéphalogramme
Acide éthylène glycol-bis-(β-aminoéthyl éther) N,N,N',N'-tétraacétique
Électromyogramme
Électronystagmogramme
Électrooculogramme
Excitatory postsynaptic potential
Électrorétinogramme
Follicle stimulating hormone
Guanosine diphosphate
Guanosine monophosphate cyclique
Guanosine triphosphate
Human chorionic gonadotropin
Human epithelial kidney
4
HEPES
HVA
IBMX
IbTX
IC50
IGF
IP3
Kapamine
KATP
KCa
K2P
KG
Kinward
Kir
KM
Koutward
Kv
LVA
2MeSATP
MS
NDGA
NPPB
PBS
PCR
PDA
PGA
PGE
PKA
PKC
PKG
PKII
PLC
PMA
PO
PF
ROC
RT-PCR
Sf9
SITS
SMOC
s/u
SUR
tBHP
TEA
TTX
TyrK
VOC
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Acide N-2-hydroxyethyl-piperazine-N'-2-ethanesulfonique
High voltage activated
3-Isobutyl 1-methyl xanthine
Ibériotoxine
Concentration de demi inhibition
Insulin growth Factor
Inositol triphosphate
Canal K+ apamine-sensible
Canal K+ ATP-sensible
Canal K+ Ca2+-sensible
Canal K+ à 2 segments P
Canal K+ protéine G-sensible
Canal K+ à rectification entrante
Canal K+ à rectification entrante
Constante de Michaelis
Canal K+ à rectification sortante
Canal K+ voltage dépendant (6 segments transmembranaires)
Low voltage activated
2-méthylthio ATP
Méthylsulfonate
Acide nordihydro guaiarétique
Acide 5-nitro-2-(3-phenylpropylamino)-benzoique
Phosphate buffered saline
Réaction de polymérisation en chaîne de l'ADN ("polymerase chain reaction")
4α-phorbol-12,13-didecanoate
Prostaglandine A
Prostaglandine E
Protéine kinase A (AMPc sensible)
Protéine kinase C (calcium sensible)
Protéine kinase G (GMPc sensible)
Protéine kinase II (calmoduline sensible)
Phospholipase C
Phorbol 12-myristate 13-acétate
Probabilité d'ouverture
Probabilité de fermeture
Receptor operated channel
Reverse Transcriptase PCR (PCR sur de l'ADN complémentaire)
Spodoptera frugiperda 9
Acide 4-acetamido-4isothiocyanostilbene-2,2'-disulfonique
Second messenger operated channel
Sous-unité
Sulfonylurea receptor
tert-butyl hydropéroxyde
Tétraéthylammonium
Tétrodotoxine
Tyrosine kinase
Voltage operated channel
5
II MATERIELS ET METHODES
II-A OVOCYTE DE XENOPE
II-A-1 Généralités
Le Xenopus laevis est un amphibien de l'ordre des anoures et de la famille des pipidés. Les ovocytes
ont été utilisés pour l'expression d'ARN exogène dès 1971 (Gurdon et al., 1971) afin d'étudier les
mécanismes de traduction de l'ARN messager de l'hémoglobine. En 1985, l'expression du récepteur à
l'acetylcholine cloné marque le début de l'étude des propriétés fonctionnelles de protéines exogènes
exprimées dans l'ovocyte (Sakmann et al., 1985). Ensuite, ce système permit le clonage par
expression fonctionnelle de l'interleukine-4 (Noma et al., 1986). Ce système devint vite très
populaire pour l'expression hétérologue et la caractérisation fonctionnelle de canaux ioniques, de
récepteurs et de transporteurs clonés (voir les revues de Dascal, 1987; Sigel, 1990).
Les ovocytes de Xénope comportent plusieurs avantages par rapport aux lignées cellulaires pour
l'expression hétérologue:
-
-
Les Xénopes sont facile à entretenir, n'exigent pas trop de place, ne coûtent pas très cher et
permettent l'obtention de plusieurs milliers d'ovocytes par opération.
Le diamètre des ovocytes est d'environ 1 mm, ce qui facilite leur manipulation et l'injection de
substances.
Les conductances endogènes sont relativement faibles en amplitude (voir II-A-5, page 20).
Les ovocytes sont capables de traduire l'ARN ou l'ADN injecté mais également dans certains cas
d'effectuer des modifications post-traductionnelles nécessaire au fonctionnement de la protéine
(Sigel, 1990).
La manipulation des ovocytes est faite à température ambiante, en milieu non stérile, et ils
peuvent être maintenus près de 12 jours dans un milieu adéquat.
Les ovocytes évoluent dans l'ovaire du Xénope et sont classés en six stades sur des critères
morphologiques (Dumont, 1972), les ovocytes de stade 5 et 6 (les plus gros) sont ceux utilisés pour
l'expression hétérologue.
Un ovocyte est entouré de plusieurs couches de cellules (Figure 3) :
- Membrane vitelline : couche non cellulaire fibreuse qui donne sa rigidité à l'ovocyte
- Cellules folliculaires : couche de cellules qui ont de nombreuses connections avec l'ovocyte via
des jonctions de type Gap (Browne et al., 1979).
- Thèque : une couche de tissu de connexion composé de cellules musculaires lisses, de fibres
nerveuses et de capillaires.
Chaque ovocyte est divisé en deux moitiés, le pôle "animal" de couleur foncé (forte concentration de
pigments) et le pôle "végétatif" de couleur clair. Le noyau est très volumineux et se trouve du côté
du pôle animal (Figure 3). Le diamètre moyen d'un ovocyte au stade 6 est de 1 mm, la surface
géométrique apparente est donc de 3.106 µm2 et le volume de 5 µl. Due à de nombreux replis de la
membrane, la surface totale de la membrane d'un ovocyte, mesurée d'après la capacité, est d'environ
20.106 µm2, plus de six fois supérieure à la surface calculée (Methfessel et al., 1986). La capacité
spécifique d'un ovocyte au stade VI est d'environ 4 µF/cm2 (Dascal, 1987).
18
Les concentrations ioniques et les potentiels d'équilibre calculés d'un ovocyte défollicularisé sont
indiqués dans le Tableau 1. Les potentiels d'équilibre sont calculés avec le milieu externe
généralement utilisé, le ND96 (Nathan Dascal), contenant 96 mM NaCl, 2 mM KCl, 1,8 mM CaCl2,
2 mM MgCl2, 5 mM HEPES avec un pH de 7,4 (NaOH).
Tableau 1 : Concentrations ioniques et potentiels d'équilibre Eion de l'ovocyte de Xénope.
Ions
Ovocyte follicularisé
[Ion]int
Eion
Ovocyte défollicularisé
[Ion]int
Eion
120 mM
-103 mV
150 mM
-109 mV
K+
+
18 mM
+42 mV
22,5 mM
+37 mV
Na
62 mM
-13 mV
62 mM
-13 mV
Cl
0,1-0,4 µM
>106 mV
0,1-0,4 µM
>106 mV
Ca2+
Source : (Dascal, 1987), Eion calculés d'après l'équation 3 dans du ND96.
Le potentiel de repos des ovocytes follicularisé est de -41 mV et peut diminuer à -30 mV après le
traitement à la collagenase (Kusano et al., 1982).
II-A-2 Maintenance des Xénopes
Les Xénopes sont achetés au Laboratoire de Biologie de la Régulation (Campus Beaulieu 35042
Rennes) ou au CRBM (BP 5051 34033 Montpellier) et élevés par douzaine dans des bacs contenant
environ 15 litres d'eau. L'eau est préalablement ventilée dans des bacs à décantation en présence de
bulleurs pour éliminer le chlore et la mettre à température ambiante (20°C). Les animaux sont nourris
deux fois par semaine avec des granules Aquatic 3 (Special Diets Services PO Box 705 Witham
CM83AD Angleterre) et la photopériode est 12h/12h pour pouvoir obtenir des ovocytes toute
l'année.
II-A-3 Préparation des ovocytes
Les femelles Xénope sont anesthésiées dans la glace pendant 30 minutes puis positionnée en
décubitus dorsal sur une table d'opération toujours en présence de glace. Une petite incision
d'environ 8 mm est réalisée dans la zone iliaque pour accéder à l'ovaire où les ovocytes sont retirés
par paquets de plusieurs milliers. Les ovocytes seront maintenus tous le long de leur utilisation dans
le ND96. Le plan musculaire et la peau incisés sont recousus puis l'animal est sorti de la glace jusqu'à
son réveil complet puis remis dans les bacs d'élevage.
Les sacs d'ovocytes prélevés sont individualisés avec des pinces fines puis subissent un traitement
enzymatique de 2h30 (collagenase IA, Sigma 2 mg/ml et inhibiteur trypsique IIS, Sigma 0,8 mg/ml),
ils sont ensuite maintenus à 19°C dans un incubateur dans du ND96 additionné d'antibiotiques (soit
gentamycine 50 mg/l, soit pénicilline 10 mg/l + streptomycine 20 mg/l, soit ceftazidime 8 mg/l).
La défollicularisation semble endommager la membrane de l'ovocyte car le potentiel de membrane
devient moins négatif, aussi est-il conseillé de n'utiliser les ovocytes que plusieurs heures après, voir
le lendemain de leur préparation (Dascal, 1987).
II-A-4 Injection d’ARN et d’ADN
Dès le soir de leur prélèvement les ovocytes peuvent être injectés avec 50 nl d'ARN ou 10 nl
d'ADNc, à l'aide d'un microinjecteur (Inject+matic, Genève) et de fin capillaires étirés. Les ARN sont
injectés à une concentration de 1 ng à 1 µg/ml, l'ADN entre 1 et 10 ng/µl. L'ADN nécessite d'être
19
injecté dans le noyau aussi faut-il les injecter au centre du pôle animal (couleur foncée) et enfoncer la
pipette environ au 1/6ème de l'ovocyte pour être quasiment certain d'injecter le noyau (Figure 3). Les
canaux ioniques exprimés sont mesurables dès le lendemain ou 48h après l'injection selon les cas. Des
ovocytes sains peuvent être maintenus jusqu'à 12 jours après l'opération.
II-A-5 Canaux ioniques endogènes à l'ovocyte
II-A-5-a Canaux sodiques
♦ INa(V)
Un canal voltage-dépendant lent avec un seuil d'activation à -25 mV a été décrit en 1982. Ce canal
est activé lorsque la membrane est maintenu dépolarisée à l'aide de pulses de plusieurs secondes
(Figure 4). La relation courant-potentiel est une courbe en cloche dirigée vers le bas avec un pic à
+50 mV et une amplitude de courant d'environ 300 nA (Baud et al., 1982).
♦ INa(t)
Un canal sodique transitoire est également présent sur certains lot d'ovocytes (Figure 4). Le courant
d'une amplitude d'environ 300 nA est bloqué par 0,5 mM de tétrodotoxine (Parker & Miledi, 1987).
II-A-5-b Canaux chlore
♦ ICl(Ca)
Le canal chlore transitoire calcium-dépendant ICl(Ca) est la conductance endogène la plus
fréquemment enregistrée dans les ovocytes de Xénope (Miledi, 1982; Barish, 1983), son amplitude
est d'environ 30 à 500 nA (Figure 4). Toutes les stimulations aboutissant à une augmentation du
calcium interne activent ce canal chlore c'est à dire des dépolarisations qui ouvrent le canal calcium
voltage dépendant des ovocytes (s'il est présent) ou bien des agonistes des récepteurs endogènes
couplés à la phospholipase C. Ce canal est bloqué par le gadolinium (50 µM) et par le lanthanum de
façon irréversible, mais également par le cadmium, le cobalt, le nickel et le manganèse (tous à 50
µM) avec une faible réversibilité (30 à 80 %). Le zinc (100 µM) est sans effet sur ICl(Ca). L'amplitude
du courant est stable pendant au moins 6 jours après l'opération du Xénope (Tokimasa & North,
1996).
♦ ICl(h)
Le courant chlore activé par hyperpolarisation ICl(h) est un courant voltage- et temps-dépendant
(Peres & Bernardini, 1983). Son amplitude varie beaucoup d'un lot d'ovocyte à l'autre mais il peut
atteindre 12 µA pour une hyperpolarisation à -150 mV, la valeur moyenne étant 1,1 ± 2,1 µA. Son
activation est lente et est caractérisée par deux constantes de temps d'activation 200 ± 96 ms et de
13 ± 8 ms (à -140 mV), ce courant ne présente pas d'inactivation (Figure 4). Sa sélectivité suit la
séquence suivante I->NO3->Br->Cl->propionate>acetate. Ce canal est insensible au calcium et aux
variations de pH mais est bloqué par le baryum (IC50=180 µM) et partiellement bloqué par les
inhibiteurs des canaux chlore: 37,7 % d'inhibition avec le SITS 1 mM, 15,9 % avec le bumétamide
1 mM et 14,1 % avec le 9-AC 1 mM (Kowdley et al., 1994).
Un blocage réversible par le lanthanum (IC50 = 8 µM) a été observé alors que des inhibitions
partielles furent obtenues avec le zinc (56 % d'inhibition), le cadmium (37%), le cobalt (34%) et le
nickel (7%). Le gadolinium, le manganèse, le baryum et le strontium sont inactifs à 100 µM.
L'amplitude de ICl(h) varie depuis le jour de l'extraction des ovocytes de l'ovaire, le courant est
maximum un jour après l'opération puis diminue pour atteindre un minimum aux jours 3 et 4 puis
augmente de nouveau au jour 5 (Tokimasa & North, 1996). Contrairement aux résultats de
Kowdley, l'article de Tokimasa montre une sensibilité des courbes d'activation de ICl(h) vis à vis du
20
pH, avec des déplacements de -20 mV (pH 6,5) et de +15 mV (pH 8,5) et une absence d'inhibition
par le baryum. Ces divergences sont expliquées par les auteurs par la différence des méthodes de
défollicularisation (manuelle pour Kowdley et enzymatique pour Tokimasa).
♦ ICl(swell)
Une réduction de 50 % de l'osmolarité du bain externe (de 220 mOsm à 110 mOsm) induit un
courant chlore, ICl(swell), d'une amplitude d'environ 2 µA à +50 mV (Figure 4). Les mesures de
sélectivité montrent que ce courant est différent du canal cationique mécanosensible Istretch. ICl(swell) est
bloqué par plusieurs inhibiteurs des canaux chlore; NPPB (IC50=10 µM), DIDS (IC50=30 µM) et
SITS (IC50=60 µM). Le lanthanum et le gadolinium sont également de bons bloqueurs de ce canal
avec des IC50 de 60 µM et 250µM respectivement. L'acide niflumique qui est un bloqueur du canal
chlore calcium sensible ICl(Ca) est inactif (à 50 µM) sur ICl(swell), et ce canal n'est pas sensible à
l'incubation dans un chélateur du calcium (BAPTA-AM 50 µM pendant 5h) ce qui semble démontrer
que c'est un autre canal que le chlore calcium dépendant (Ackerman et al., 1994).
II-A-5-c Canaux calciques
♦ ICa(V)
Un canal calcique voltage-dépendant est mesurable en substituant le calcium par du baryum et en
substituant la chlore par de l'acide méthane sulfonique pour éliminer le courant chlore calciumdépendant (Figure 4). Dans des conditions physiologiques ce canal n'est pas mesurable car il est
masqué par ICl(Ca) (Dascal et al., 1986). ICa(V) est de faible amplitude (33nA à +10mV), il présente une
constante d'inactivation de 250 ms (à +10mV) et est observé dans 50% des lots d'ovocytes. Ce
courant est insensible aux effecteurs suivants : BayK 8644 (1 µM), nicardipine (10 µM),
ω conotoxine (1 µM), amiloride (10 µM), Ni2+ (10 µM). Une concentration plus importante de Ni2+
(1 mM) bloque ce courant endogène. Une augmentation de l'AMPc interne obtenue soit par injection
directe d'AMPc (50 pmole) soit avec l'IBMX (1 mM) se traduit par une augmentation de ICa(V)
pouvant atteindre 300% à –10 mV. La stimulation de la PKC à l'aide d'OAG (2 µM) ou de PMA
(300nM) augmente également ce courant d'environ 220% (à –10 mV) (Bourinet et al., 1992).
♦ ICa(IP3)
Un récepteur à l'IP3 a été mis en évidence sur la membrane nucléaire d'ovocyte. Le meilleur fit de la
relation courant potentiel fut obtenu avec l'équation de GHK et des perméabilités ioniques de 8 pour
le Ca2+, 1 pour le K+ et 0,05 pour le Cl- (voir VI-B-4-e, page 95). Le canal a une conductance de 113
pS en K+ symétrique pour les courants faibles (± 2,5 pA) et une conductance beaucoup plus
importante pour les courants plus grands. Les courants unitaires présentent trois sous-états, un
principal M (90 % du temps ouvert), un second (conductance double de celle de M) et un troisième
rarement observé (conductance moitié de M). L'héparine (100 µg/ml) bloque l'activité du canal (Mak
& Foskett, 1994).
II-A-5-d Canaux potassiques
♦ IK(V)
Un canal potassique à rectification retardée a été décrit en 1990 (Figure 5). Le seuil d'activation est
vers -50 mV, il présente une activation rapide (en 150 ms) et une inactivation lente (constante de
temps de 16,5 s a -10 mV). Il est insensible au calcium, et bloqué par la quinine (Ki=35µM). Les
amplitudes de courant sont très variables d'un lot de Xénope à l'autre (30 à 400 nA) (Lu et al.,
1990).
21
♦ IK(IsK)
L'ADNc codant pour la protéine IsK ou minK (126 à 130 acides aminés selon l'espèce) a été isolée à
partir d'une banque de rein de rat (Takumi et al., 1988). IsK a également été cloné dans le cœur de
rat nouveau-né (Folander et al., 1990), le cœur de souris (Honoré et al., 1991), les lymphocytes T
humains (Attali et al., 1992) ainsi que dans l'utérus de rat (Pragnell et al., 1990). Son profil
d'hydrophobicité ne prédit qu'un seul segment transmembranaire. La protéine IsK injectée dans
l'ovocyte à une concentration inférieure à 100 ng/µl induit un courant potassique, IK(IsK), ressemblant
au courant IKs du cœur (Takumi et al., 1988; Attali et al., 1993). La protéine IsK est très bien
exprimée mais ne peut pas induire de courant potassique dans des lignées cellulaires tels que la lignée
de muscle squelettique C2C12, les fibroblastes CHO, la lignée de lymphocyte T Jurkat ou bien la
lignée d'insecte Sf9 (Lesage et al., 1993). Dans l'ovocyte, le courant IK(IsK) peut atteindre 2 µA
(Figure 5) et résulte de l'interaction de la protéine IsK avec une sous-unité endogène à l'ovocyte,
XKvLQT1, qui a été cloné et présente 88% d'identité en acide aminé avec un canal voltage
dépendant à 6 segments transmembranaires humain KvLQT1 (Sanguinetti et al., 1996).
La pharmacologie de IK(IsK) a été très étudiée. Ce courant est inhibé par le clofilium (IC50=80 µM), le
TEA (IC50= 20mM) et le vérapamil (IC50= 50µM) mais est insensible à la charybdotoxine et au 4-AP
(Attali et al., 1992). 68% du courant (à +40 mV) est inhibé par un anesthésique général, l'halothane à
340 µM (Zorn et al., 1993). Les chromanols sont également de bons bloqueurs de IK(IsK) avec des
IC50 allant de 5 µM pour le 434B à 59 µM pour le 360B (Suessbrich et al., 1996). IK(IsK) est activé
par une augmentation du calcium interne (A23187 1 µM) et inhibé par l'activation de la protéine
kinase C (PMA 30 nM) (Attali et al., 1992).
♦ IK(Ca)
Des canaux potassiques voltage-dépendant activés par le calcium IK(Ca) ont été enregistrés en patchclamp. Leur conductance est de 200 pS en potassium symétrique (110 mM), leur densité est faible
avec 1 canal / 3000 µm2 soit environ 3000 canaux par ovocyte (Figure 5). Ces canaux sont
insensibles à la 4-AP (1 mM) mais sont bloqués par le tétraethylammonium externe (50 % de blocage
à 250 µM) et par la charybdotoxine (plus de 90% de blocage à 50 nM) (Krause et al., 1996).
♦ IK(Na)
Un canal potassique activé par le sodium interne IK(Na) serait mesurable dans 50% des patch en
configuration inside-out (Figure 5). Sa conductance est d'environ 140-170 pS en potassium
symétrique et est complètement abolie en absence de sodium interne (Egan et al., 1992).
♦ IK(IR)
Un canal potassique à rectification entrante est présent sur certains lots d'ovocytes de Xénopes. Ce
courant est observé en milieu externe riche en potassium (118 mM), il s'inactive partiellement entre
-20 et -80 mV et s'inactive complètement pour des potentiels plus négatifs (Figure 5). Ce courant est
partiellement inhibé par le baryum, le césium ou la quinine (tous à 5 mM) et est compris entre 75 et
600 nA (à -120 mV en milieu hyperpotassique) selon la saison et les lots d'ovocytes (Bauer et al.,
1996).
♦ IXIR
Un canal présentant 78% d'identité en acides aminés avec le canal à rectification entrante CIR
(Kir3.4) a été cloné dans l'ovocyte (Hedin et al., 1996). Ce canal, XIR (Xenopus Inwardly
Rectifying K+ channel), n'est pas actif seul mais il permet l'expression des canaux de la famille Kir3.0
qui nécessitent la formation de complexes hétéromultimériques pour être fonctionnels (voir III-C-3,
page 47).
22
II-A-5-e Canaux cationiques
♦ Istretch
Des canaux mécanosensibles Istretch activés par des pressions positives ou négatives supérieures à
5 mbar ont été décrits dans l'ovocyte. Ce sont des canaux cationiques d'une conductance de 28 pS
dans le Ringer. La densité de ces canaux est estimée à 0,5-2 par µm2 de membrane soit environ 107
canaux/ovocyte (Methfessel et al., 1986). Une étude détaillée au niveau du courant unitaire a été
réalisée en patch clamp, des conductances de 30 à 78 pS ont été mesurées selon l'ion porteur de
charge (Figure 6) (Yang & Sachs, 1990).
Le gadolinium est un excellent bloqueur du Istretch (à 10 µM) et permet de s'en affranchir pour étudier
d'autres canaux. Son effet est de diminuer le temps moyen d'ouverture, le courant unitaire et la
probabilité d'ouverture des canaux. Le calcium diminue également le temps moyen d'ouverture du
canal mais il est perméant et son action atteint un plateau vers 10 mM contrairement au gadolinium
(Yang & Sachs, 1989).
♦ Ic et Icreep
La diminution de la concentration en cations divalents (Ca2+, Mg2+) du milieu externe des ovocytes
révèle un courant cationique Ic (Na+, K+), entrant à -60 mV et non inactivant, d'une amplitude de
472 nA à +50 mV (Figure 6). Le blocage par le Ca2+ (IC50= 61 µM à -60 mV et 212 µM à 0 mV) et
le Mg2+ (IC50= 201 µM à -60 mV et 710 µM à 0 mV) est voltage dépendant ce qui implique un site
de fixation dans le pore du canal. Des dépolarisations de plusieurs minutes activent également un
courant de même nature Icreep mais de plus faible amplitude (environ 113 nA à +50 mV). Ce canal
ressemble beaucoup à Istretch mais ce dernier est perméant au Ca2+ contrairement à Ic. Istretch ne semble
pas aussi sensible au retrait du calcium externe et il nécessite une variation de pression pour être
activé (Arellano et al., 1995).
♦ Ifond
Un courant de fond d'environ 60 nA (à -20 mV), Ifond, inhibé par les ouvreurs de canaux K+ ATPsensible a été enregistré sur les ovocytes défollicularisé. Ce courant n'est probablement pas purement
potassique car son potentiel d'inversion est de -51 mV au lieu de -95 mV pour un canal purement
sélectif au potassium (Figure 6). Le lemakalim (BRL38227) est un ouvreur de canaux potassiques
ATP-sensible et le BRL38226 est un énantiomère non actif. Ifond est inhibé par le BRL38226 (IC50 =
150µM) ainsi que par le baryum (500 µM) et le cromakalim (BRL34915). Ce courant est
partiellement inhibé par 3 mM 4-AP (environ -40%) ainsi que par 1 mM Co2+, Ni2+ ou La3+, par
contre il est insensible au glibenclamide, à l'apamine, la dendrotoxine I, le MCD peptide, la
charybdotoxine ou la β bungarotoxine (100 nM) (Honoré & Lazdunski, 1991b).
♦ Pompe Na+/K+
La pompe Na+/K+ de l'ovocyte génère un courant d'environ 20 nA, son activité est diminué de 40 %
par un activateur de la protéine kinase C, le diC8 50 µM, et augmentée de 80 % par l'injection
d'AMPc (concentration finale 50 µM) (Vasilets & Schwarz, 1992).
II-A-5-f Canaux ioniques induit
L'expression de certaines protéines (M2, phospholemman, Mat-8, CHIF, IsK) induit un courant dans
l'ovocyte de Xénope. Les courants induits sont probablement endogènes car ces protéines n'ont pas
des structures proches de celles des canaux ioniques, néanmoins à part le courant K+ induit par IsK
(voir ci-dessus) aucune expérience ne montre clairement l'origine endogène des ces courants.
23
♦ INa(M2)
Le virus influenza est constitué d'un ensemble de protéines dont M2 qui comprend 97 acides aminés
et est largement exprimé sur les membranes plasmiques des cellules infectées par le virus. La protéine
M2 traverse la membrane une fois et présente 23 résidus N-terminaux sur la face extracellulaire et 54
résidus C-terminaux sur la face cytoplasmique. L'amantadine est une drogue antivirale qui, utilisée
dans la gamme du µM, inhibe spécifiquement la réplication du virus influenza. Après expression dans
l'ovocyte de Xénope, cette protéine induit un courant entrant principalement sodique d'une amplitude
de 80 à 200 nA à -130 mV (Figure 7). Ce courant est complètement inhibé par 10 µM d'amantadine
et est activé par les H+ externes (1,7 µA à pH 5,8). Des mutants ont été fabriqués, ils induisent de
fort courant (2,7 µA) insensibles à l'amantadine et certains sont insensibles au pH. Les propriétés des
courants de déactivation obtenus avec les mutants sont différentes de celle du M2 sauvage. Ces
résultats permettent de supposer que M2 participe directement au canal responsable du courant
observé (Pinto et al., 1992).
♦ ICl(PLM)
Le phospholemman est une protéine de 72 acides aminés provenant du sarcolemme cardiaque et
composée d'un seul segment transmembranaire. L'injection de cette protéine dans l'ovocyte active un
canal chlore ICl(PLM) qui s'ouvre en hyperpolarisation (Figure 7). Ce canal présente une activation très
lente, ne s'inactive pas et est augmenté par une plus haute fréquence de stimulation, des potentiels de
maintien plus dépolarisés et par un pH externe acide. L'injection de 9-AC à 200 µM final réduit le
courant de plus de 50 %, par contre l'injection de calcium de modifie pas ce courant. Appliqué dans
le bain, le baryum bloque complètement ICl(PLM) avec un IC50 de 360 µM, le cadmium (1 mM) ne
bloque que 17 % du courant et le césium ou le TEA (10 mM) sont inactifs (Moorman et al., 1992).
Ce canal présente certaines similitudes avec ICl(h) (même sélectivité) mais leurs propriétés
biophysiques et pharmacologiques sont différentes (Kowdley et al., 1994).
♦ ICl(Mat-8)
Une autre protéine de 67 acides aminés, Mat-8 (Mammary tumor, 8 kDa), dont le domaine
extracellulaire et l'unique domaine transmembranaire est homologue au phospholemman, est
également capable d'activer un courant chlore dans l'ovocyte (Figure 7). Mat-8 a été isolé dans des
tumeurs mammaires de souris (Morrison et al., 1995).
♦ IK(CHIF)
Une autre protéine régulatrice, CHIF (CHannel Inducing Factor), est capable d'induire un courant
K+ très similaire à IK(IsK) mais pas de courant chlore (Figure 7). CHIF ne présente pas d'homologie de
séquence avec IsK mais présente près de 50% d'homologie avec certaines régions du
phospholemman (Attali et al., 1995).
♦ ICl(IsK)
La protéine IsK (voir IK(IsK) ci-dessus) injectée à une concentration de 1 µg/µl, induit dans l'ovocyte
de Xénope un courant chlore, ICl(IsK), d'une amplitude de 500 nA à -130 mV et qui ressemble à ICl(h)
(Figure 7). IsK injectée à une concentration plus faible induit un courant potassique (voir IK(IsK) cidessus) (Attali et al., 1993).
Une autre équipe a suggéré que ce courant puisse être induit non spécifiquement par la forte
concentration en ARN utilisée. Ils ont observé le même courant après avoir exprimé dans l'ovocyte
des protéines aussi différentes qu'un canal K+ à rectification sortante muté pour le rendre non
fonctionnel (shW434F), un canal K+ à rectification entrante non fonctionnel seul (BIR9), un
transporteur d'acide aminé (EAAT2), le récepteur D2 dopaminergique et la β galactosidase, tous
injectés à 1 µg/µl. Les courants induit sont observés 4 à 8 jours après l'injection d'ARN ce qui est 2 à
4 fois plus long qu'avec IsK. Le retrait de tout le calcium externe du milieu des ovocytes révèle un
24
courant cationique, après expression d'IsK. Les auteurs concluent que l'injection de fortes
concentrations en ARN induit deux courants, ICl(IsK) et Icationique (Tzounopoulos et al., 1995).
Le groupe de Bernard Attali a montré qu'un fragment peptidique de 34 acides aminés de la portion
N-terminale de la protéine IsK (N34) est suffisant pour activer le courant chlore et qu'un fragment Cterminale de 27 acides aminés (C27) est suffisant pour activer le courant potassique (Benefraim et
al., 1996).
II-A-6 Récepteur de l'ovocyte
♦ Muscarinique
L'acetylcholine induit une dépolarisation de la membrane des ovocytes via l'ouverture de canaux
chlore (Figure 8 A) (Kusano et al., 1977; Arellano & Miledi, 1993). Ces récepteurs agissent via une
mobilisation du calcium interne par l'IP3.
Dés la concentration de 10-9 M l'acetylcholine est capable d'activer son récepteur, son effet est
bloqué par un antagoniste muscarinique, l'atropine (10-7 M), mais pas par la tétrodotoxine (10-6 M),
ni par un antagoniste nicotinique, l'α-bungarotoxine (1 µg/ml). Aucune réponse n'est obtenu avec les
agonistes nicotiniques (nicotine, 1,1-dimethyl-4-phenylpiperazinium). Ces résultats suggèrent que ces
récepteurs sont de type muscarinique (Kusano et al., 1982). Le type exact de ces récepteurs qui sont
des M1 (minoritaire) et M3 (majoritaire) a été déterminé à l'aide d'antagonistes plus ou moins
spécifiques des récepteurs muscariniques (pirenzepine, AFDX-116, himbacine, méthobromure de 5diphenylacetoxy-N-methyl-piperidine, atropine) et par injection d'oligonucléotides antisens
spécifiques des récepteurs M1 et M3 (Davidson et al., 1991; Oron & Dascal, 1992). Par contre, une
autre étude montre le clonage de l'ADNc des récepteurs de type M4 et montre par PCR qu'il serait le
seul messager présent dans l'ovocyte (Herrera et al., 1994).
II-A-7 Canal potassique des cellules folliculaires
Cette conductance peut être étudier en enregistrant les courants au niveau de l'ovocyte car les
cellules folliculaires sont couplées électriquement à l'ovocyte qu'elles entourent via des jonctions gap
(Browne et al., 1979).
♦ IK(ATP)
Les ouvreurs de canaux K+ ATP sensible activent des courant IK(ATP) dans les cellules folliculaires des
ovocytes (Figure 8 B). Plusieurs classes d'ouvreurs ont été testés avec dans l'ordre d'efficacité: le
P1075 (EC50 = 5 µM), P1060 (EC50 =12 µM), BRL38227 ou lemakalim (EC50 = 77 µM), RP61419
(EC50 = 100 µM), (-) pinacidil (EC50 = 300 µM). Le sulfate de minoxidil, le nicorandil, le RP49856
et le diazoxide sont sans effet. Les effets des ouvreurs sont annulés par le glibenclamide (Honoré &
Lazdunski, 1991b).
Ce canal à une conductance unitaire de 19 pS, il nécessite la présence de 20 µM ATP et de Mg2+
pour pouvoir être activé par les ouvreurs, par contre une concentration de l'ordre du mM en ATP ou
en ATP[γS] inhibe le canal. Une augmentation de la concentration en AMPc interne ou bien
l'application directe de la sous-unité catalytique de la PKA active le courant IK(ATP) (Honoré &
Lazdunski, 1993).
II-A-8 Récepteurs des cellules folliculaires modulant un courant K+
De nombreux récepteurs sont localisés au niveau des cellules folliculaires et peuvent notamment
induire une activation de l'adénylate cyclase (voir Miledi & Woodward, 1989a).
♦ Adénosine
25
Des récepteurs purinergiques et à l'adénosine induisent une dépolarisation rapide produit par un
courant chlore (ID) puis une hyperpolarisation lente impliquant des courants potassiques (IH) dans les
ovocytes follicularisés (Figure 8 C). L'effet sur IH passe par une augmentation de l'AMPC, est
modulé par la concentration interne en calcium et est antagonisé par une stimulation muscarinique
(Stinnakre & Van Renterghem, 1986). Les agonistes ont des effets variables sur IH avec dans l'ordre
croissant : AMP et adénosine > ATP et ADP, de plus une forte diminution de la réponse est obtenue
avec la théophylline (50 µM), ce qui suggère un récepteur à l'adénosine de type A2 (anciennement
purinergique de type P1) (Lotan et al., 1982).
♦ Adrénergique
Les ovocytes répondent aux agonistes β-adrénergiques (isoprotérénol 10 µM, épinephrine 1 µM) par
l'activation d'un courant potassique et la réponse est antagonisée par les bloqueurs β-adrénergique
(propranolol et dichloro isoprotérénol 10 µM). Les agonistes α-adrénergiques (phenyléphrine 100
µM) et les bloqueurs α-adrénergiques (phentolamine) sont inactifs. Cette réponse semble être due à
des récepteurs présents sur les cellules folliculaires entourant l'ovocyte car elle n'est pas obtenue sur
des ovocytes défollicularisés (Kusano et al., 1977; Kusano et al., 1982).
♦ Angiotensine II
Un récepteur à l'angiotensine II a été décrit sur des ovocytes follicularisés. La réponse, caractérisée
par un EC50 de 150 nM, est une dépolarisation d'environ +18 mV pour 1 µM d'angiotensine II. La
dépolarisation est absente des ovocytes défollicularisés (Lacy et al., 1989).
♦ CGRP
Un récepteur au CGRP est présent dans les cellules folliculaires, sa stimulation active le KATP via
l'AMPc. C'est un récepteur de type CGRP1 car la réponse est spécifiquement antagonisée par le
CGRP(8-37) (Guillemare et al., 1994).
♦ Dopamine
Une hyperpolarisation induite par la dopamine (1 µM) a été brièvement décrite par Kusano (1977).
♦ Gonadotrophines
Des préparations de FSH (de porc) ou de hCG (humain) à 10 µg/ml activent des courants
potassiques et la même réponse est obtenue avec une injection d'AMPc (Woodward & Miledi,
1987a).
♦ IGF
Une potentialisation des courants KATP (voir le chapitre II-A-5-d, page 21) a été observé avec l'IGF
(0,4 nM) et l'insuline (4 nM) et qui implique un récepteur à l'IGF couplé à une protéine G pertussis
toxine sensible (Sakuta, 1994). Une autre équipe a montré que l'IGF-1 est capable de stimuler
l'activité phosphodiesterase in-vivo dans l'ovocyte et d'inhiber in-vitro l'adénylate cyclase (Sadler &
Maller, 1987).
Des mesures de liaison donne un KD de 9 nM pour l'IGF-1. Il y aurait également un phénomène
d'endocytose de l'IGF avec implication d'une tyrosine kinase, ce mécanisme aurait un rôle dans la
maturation de l'ovocyte (Taghon & Sadler, 1994).
♦ Prostaglandines, ocytocyne, ANF, VIP
Les prostaglandines (PGE1, PGE2, PGA1, PGA2, PGB1, 11-deoxy-PGE1, 11-β-PGE2) à 1 nM ainsi
que l'ocytocyne (2 µM) stimule un courant potassique lent en présence des cellules folliculaires. Cet
effet est reproduit avec des augmentations d'AMPc (forskoline 5 µM) et amplifié en inhibant les
phosphodiesterases (théophylline et IBMX). Par contre les prostaglandines PGF2α, PGI2, PGD2 et 826
courant cationique, après expression d'IsK. Les auteurs concluent que l'injection de fortes
concentrations en ARN induit deux courants, ICl(IsK) et Icationique (Tzounopoulos et al., 1995).
Le groupe de Bernard Attali a montré qu'un fragment peptidique de 34 acides aminés de la portion
N-terminale de la protéine IsK (N34) est suffisant pour activer le courant chlore et qu'un fragment Cterminale de 27 acides aminés (C27) est suffisant pour activer le courant potassique (Benefraim et
al., 1996).
II-A-6 Récepteur de l'ovocyte
♦ Muscarinique
L'acetylcholine induit une dépolarisation de la membrane des ovocytes via l'ouverture de canaux
chlore (Figure 8 A) (Kusano et al., 1977; Arellano & Miledi, 1993). Ces récepteurs agissent via une
mobilisation du calcium interne par l'IP3.
Dés la concentration de 10-9 M l'acetylcholine est capable d'activer son récepteur, son effet est
bloqué par un antagoniste muscarinique, l'atropine (10-7 M), mais pas par la tétrodotoxine (10-6 M),
ni par un antagoniste nicotinique, l'α-bungarotoxine (1 µg/ml). Aucune réponse n'est obtenu avec les
agonistes nicotiniques (nicotine, 1,1-dimethyl-4-phenylpiperazinium). Ces résultats suggèrent que ces
récepteurs sont de type muscarinique (Kusano et al., 1982). Le type exact de ces récepteurs qui sont
des M1 (minoritaire) et M3 (majoritaire) a été déterminé à l'aide d'antagonistes plus ou moins
spécifiques des récepteurs muscariniques (pirenzepine, AFDX-116, himbacine, méthobromure de 5diphenylacetoxy-N-methyl-piperidine, atropine) et par injection d'oligonucléotides antisens
spécifiques des récepteurs M1 et M3 (Davidson et al., 1991; Oron & Dascal, 1992). Par contre, une
autre étude montre le clonage de l'ADNc des récepteurs de type M4 et montre par PCR qu'il serait le
seul messager présent dans l'ovocyte (Herrera et al., 1994).
II-A-7 Canal potassique des cellules folliculaires
Cette conductance peut être étudier en enregistrant les courants au niveau de l'ovocyte car les
cellules folliculaires sont couplées électriquement à l'ovocyte qu'elles entourent via des jonctions gap
(Browne et al., 1979).
♦ IK(ATP)
Les ouvreurs de canaux K+ ATP sensible activent des courant IK(ATP) dans les cellules folliculaires des
ovocytes (Figure 8 B). Plusieurs classes d'ouvreurs ont été testés avec dans l'ordre d'efficacité: le
P1075 (EC50 = 5 µM), P1060 (EC50 =12 µM), BRL38227 ou lemakalim (EC50 = 77 µM), RP61419
(EC50 = 100 µM), (-) pinacidil (EC50 = 300 µM). Le sulfate de minoxidil, le nicorandil, le RP49856
et le diazoxide sont sans effet. Les effets des ouvreurs sont annulés par le glibenclamide (Honoré &
Lazdunski, 1991b).
Ce canal à une conductance unitaire de 19 pS, il nécessite la présence de 20 µM ATP et de Mg2+
pour pouvoir être activé par les ouvreurs, par contre une concentration de l'ordre du mM en ATP ou
en ATP[γS] inhibe le canal. Une augmentation de la concentration en AMPc interne ou bien
l'application directe de la sous-unité catalytique de la PKA active le courant IK(ATP) (Honoré &
Lazdunski, 1993).
II-A-8 Récepteurs des cellules folliculaires modulant un courant K+
De nombreux récepteurs sont localisés au niveau des cellules folliculaires et peuvent notamment
induire une activation de l'adénylate cyclase (voir Miledi & Woodward, 1989a).
♦ Adénosine
25
Des récepteurs purinergiques et à l'adénosine induisent une dépolarisation rapide produit par un
courant chlore (ID) puis une hyperpolarisation lente impliquant des courants potassiques (IH) dans les
ovocytes follicularisés (Figure 8 C). L'effet sur IH passe par une augmentation de l'AMPC, est
modulé par la concentration interne en calcium et est antagonisé par une stimulation muscarinique
(Stinnakre & Van Renterghem, 1986). Les agonistes ont des effets variables sur IH avec dans l'ordre
croissant : AMP et adénosine > ATP et ADP, de plus une forte diminution de la réponse est obtenue
avec la théophylline (50 µM), ce qui suggère un récepteur à l'adénosine de type A2 (anciennement
purinergique de type P1) (Lotan et al., 1982).
♦ Adrénergique
Les ovocytes répondent aux agonistes β-adrénergiques (isoprotérénol 10 µM, épinephrine 1 µM) par
l'activation d'un courant potassique et la réponse est antagonisée par les bloqueurs β-adrénergique
(propranolol et dichloro isoprotérénol 10 µM). Les agonistes α-adrénergiques (phenyléphrine 100
µM) et les bloqueurs α-adrénergiques (phentolamine) sont inactifs. Cette réponse semble être due à
des récepteurs présents sur les cellules folliculaires entourant l'ovocyte car elle n'est pas obtenue sur
des ovocytes défollicularisés (Kusano et al., 1977; Kusano et al., 1982).
♦ Angiotensine II
Un récepteur à l'angiotensine II a été décrit sur des ovocytes follicularisés. La réponse, caractérisée
par un EC50 de 150 nM, est une dépolarisation d'environ +18 mV pour 1 µM d'angiotensine II. La
dépolarisation est absente des ovocytes défollicularisés (Lacy et al., 1989).
♦ CGRP
Un récepteur au CGRP est présent dans les cellules folliculaires, sa stimulation active le KATP via
l'AMPc. C'est un récepteur de type CGRP1 car la réponse est spécifiquement antagonisée par le
CGRP(8-37) (Guillemare et al., 1994).
♦ Dopamine
Une hyperpolarisation induite par la dopamine (1 µM) a été brièvement décrite par Kusano (1977).
♦ Gonadotrophines
Des préparations de FSH (de porc) ou de hCG (humain) à 10 µg/ml activent des courants
potassiques et la même réponse est obtenue avec une injection d'AMPc (Woodward & Miledi,
1987a).
♦ IGF
Une potentialisation des courants KATP (voir le chapitre II-A-5-d, page 21) a été observé avec l'IGF
(0,4 nM) et l'insuline (4 nM) et qui implique un récepteur à l'IGF couplé à une protéine G pertussis
toxine sensible (Sakuta, 1994). Une autre équipe a montré que l'IGF-1 est capable de stimuler
l'activité phosphodiesterase in-vivo dans l'ovocyte et d'inhiber in-vitro l'adénylate cyclase (Sadler &
Maller, 1987).
Des mesures de liaison donne un KD de 9 nM pour l'IGF-1. Il y aurait également un phénomène
d'endocytose de l'IGF avec implication d'une tyrosine kinase, ce mécanisme aurait un rôle dans la
maturation de l'ovocyte (Taghon & Sadler, 1994).
♦ Prostaglandines, ocytocyne, ANF, VIP
Les prostaglandines (PGE1, PGE2, PGA1, PGA2, PGB1, 11-deoxy-PGE1, 11-β-PGE2) à 1 nM ainsi
que l'ocytocyne (2 µM) stimule un courant potassique lent en présence des cellules folliculaires. Cet
effet est reproduit avec des augmentations d'AMPc (forskoline 5 µM) et amplifié en inhibant les
phosphodiesterases (théophylline et IBMX). Par contre les prostaglandines PGF2α, PGI2, PGD2 et 826
iso-PGE1 sont incapable d'induire ce courant. L'ANF (60 nM) en présence d'IBMX (500 µM) induit
un courant potassique similaire (Miledi & Woodward, 1989b) ainsi que le VIP (Woodward &
Miledi, 1987b).
II-A-9 Récepteurs des cellules folliculaires modulant un courant Cl♦ Purinergique
Nous utilisons la dernière nomenclature des récepteurs purinergiques et à l'adénosine (TINS, 1997;
Féolde, 1997).
Les récepteurs purinergiques et à l'adénosine induisent une dépolarisation rapide produite par un
courant chlore (ID) puis une hyperpolarisation lente impliquant des courants potassiques (IH) (Figure
8C). La sensibilité aux agonistes est dans l'ordre croissant ATP, ADP > AMP, adénosine pour le
courant chlore ID ce qui correspond au profil des récepteurs purinergiques P2y (Lotan et al., 1982;
Miledi & Woodward, 1989a). Des expériences avec des agonistes spécifiques indiquent que dans les
cellules folliculaires il n'y aurait effectivement que des récepteurs à l'adénosine et des récepteurs
purinergiques de type P2y et P2U (maintenant nommés P2y1 et P2y2) (Pintor et al., 1996). Les
récepteurs P2U (ou P2y2) ont pour agonistes l'UTP et l'ATP, ils sont antagonisés par la suramine et
active un courant sodique amiloride sensible (IC50=31 µM). Les récepteurs P2Y ont pour agoniste le
2MeSATP, ils sont insensibles à la suramine et active un courant chlore (King et al., 1996).
♦ FSH
Il a également été montré que le FSH (1 µg/ml) permet l'activation d'un courant chlore, le calcium
interne ne semble pas impliqué (chélation avec l'EGTA ou le BAPTA) (Arellano & Miledi, 1993).
II-A-10 Conclusion : l'ovocyte comme modèle d'expression
Les Tableaux 2, 3, 4 et 5 ci-dessous résument les propriétés biophysiques, pharmacologiques et la
régulation des courants mesurables dans l'ovocyte. Les pourcentages de variation des courants sont
négatifs pour les inhibitions et positifs pour les activations, 0% indiquant aucun effet. Les potentiels,
les concentrations utilisées ou les IC50 sont indiqués entre parenthèses. Les produits sont appliqués
sur la face externe sauf indication contraire. Pour les produits injectés dans l'ovocyte les
concentrations finales sont indiquées (injection d'environ 50 nl pour un volume total de 5 µl, soit une
dilution au 1/100).
La Figure 9 résume les voies de transduction et les effets des récepteurs présents sur les membranes
des ovocytes (voir page 4 pour les abréviations).
27
Tableau 2 : Courants Cl- de l'ovocyte de Xénope.
Propriétés :
Abréviations page 4
ICl(h)
ICl(Ca)
ICl(IsK)
ICl(PLM)
ICl(swell)
Niveau de courant
1-2µA
(-150mV)
50-500nA
(+20mV)
500nA
(-130mV)
5µA (-150mV)
3µA (+70mV)
Seuil d'activation
τactivation
13 et 200ms
(-140mV)
τinactivation
E1/2inactivation
τréactivation
Sélectivité
<1ms
484ms (+70mV)
-62 mV
3s
DIDS
SITS
-38% (1mM)
-60% (1mM)
0% (1mM)
9-AC
-14% (1mM)
0% (2mM)
NPPB
Bumétamide
Acide niflumique
H+
Na+ = 0
Cs+
Ca2+ = 0
Ba2+
Cd2+
Co2+
Ni2+
Mn2+
Zn2+
Sr2+
La3+
Gd3+
TEA
Clofilium
AMPc externe
ATP
GTP
Injection EGTA
Injection BAPTA
Injection Ca2+
Injection IP3
PMA
Injection GTPγγS
Leukotriène D4
Arachidonate
Références :
SCN->I-≥NO3-=Br->Cl>MS≥HCO3-≥acétate
>gluconate>glutamate
IC50=30µM
IC50=60µM
I->NO3->Br->Cl>propionate
>acétate
-50% (200µM
interne)
0% (2mM)
IC50=10µM
-16% (1mM)
0% (50µM)
inhibition
0%
0%
IC50=180µM
-37% (100µM)
-34% (100µM)
-7% (100µM)
0% (100µM)
-56% (100µM)
0% (100µM)
IC50=8µM
-3% (100µM)
-100%
+60%
IC50=400µM
-100% (50µM)
-100% (50µM)
-100% (50µM)
-100% (50µM)
0% (100µM)
0% (10mM)
activation
IC50=360µM
-17% (1mM)
-100% (50µM)
-100% (50µM)
0%
IC50=60µM
IC50=250µM
0% (10mM)
+50%(100µM)
IC50=3,5mM
Inhibition (5mM)
Inhibition (5mM)
-100% (1 mM)
0% (5mM)
+100% (1 µM)
+100% (1 mM)
0%
0% (50µM)
0%
+60% (30nM)
0%
0% (100µM)
0% (2µM)
0% (100µM)
(Kowdley et al.,
1994; Tokimasa
& North, 1996)
(Barish, 1983;
Parker &
Miledi, 1986;
Tokimasa &
North, 1996)
(Attali et al.,
1993)
(Moorman et
al., 1992)
(Ackerman et al.,
1994)
28
Tableau 3 : Courants K+ des cellules folliculaires et de l'ovocyte de Xénope.
Propriétés :
Abréviations page 4
Conductance unitaire
Fréquence ou densité
Cellules folliculaires
Ovocyte
Ovocyte
Ovocyte
IK(ATP)
IK(V)
IK(Na)
IK(IR)
19 pS
30-400nA
(+30mV)
-50mV
<50ms
Courant global
Seuil d'activation
τactivation
τinactivation
Cs+
Ca2+
Ba2+
TEA
4-AP
DTX-I
ChTX
Apamine
Quinine
Glibenclamide
Tolbutamide
RP61419
Lemakalim
P1060
P1075
(-) Pinacidil
Minoxidil
Nicorandil
[Na+]interne = 0
AMPc
s/u catalytique PKA
PMA
Chloramine T
Références :
140-170pS
47% patch
75-600nA
75 et 552ms (140mV)
-25% (5mM)
17s (-10mV)
0% (1µM)
0% (1µM)
0% (1µM)
0%
0% (10mM)
-15% (10mM)
-15% (10mM)
-47% (5mM)
-50% (50mM)
-10% (10mM)
0% (10nM)
0% (1µM)
IC50=35µM
-46% (5mM)
IC50=200µM
-40% (100µM)
EC50=100µM
EC50=77µM
EC50=12µM
EC50=5µM
EC50=300µM
0% (300µM)
0% (300µM)
-100%
activation (300µM)
activation (150 UI/ml)
-100% (30nM)
-50% (2mM)
(Honoré & Lazdunski, 1991b;
Honoré & Lazdunski, 1991a;
Honoré & Lazdunski, 1993)
(Lu et al.,
1990)
(Egan et al.,
1992)
(Bauer et al., 1996)
29
Tableau 4 : Courants K+ de l'ovocyte de Xénope.
Propriétés :
Abréviations page 4
Conductance unitaire
Fréquence ou densité
Courant global
Sélectivité
Seuil d'activation
τactivation
E1/2activation
Cs+
Ba2+
La3+
TEA
4-AP
DTX-I
ChTX
Apamine
β bungarotoxine
MCD peptide
Quinine
Quinidine
Amiodarone
Sotalol
Tedisamil
Clofilium
Vérapamil
Halothane
[Ca2+]interne
IK(Ca)
IK(slow)
IK(IsK)
IK(CHIF)
65nA (+10mV)
1µA (+20mV)
K+>Rb+>NH4+>Cs+>Na+>Li+
-40mV
3 et 25 s (+15mV)
1µA (+30mV)
200 pS
1/3000µm2
-70mV
370ms (-50mV)
-32mV
-100% (2mM)
IC50=250µM
O% (1mM)
0% (50mM)
-90% (50nM)
-80% (5mM)
-50% (30mM)
0% (4mM)
0% (50nM)
0% (500µM)
0% (300µM)
-60% (100µM)
Activation
(>1µM)
+30% (1µM)
A23187
8-Br AMPc
PMA
OAG
PKII + calmoduline
Références :
-11 mV
IC50=21mM
IC50=2,4mM
-50% (1mM)
IC50=20mM
0% (3mM)
0% (10nM)
0% (50nM)
0% (100nM)
0% (10nM)
0% (100nM)
0% (300µM)
0% (300µM)
0% (300µM)
0% (300µM)
0% (300µM)
IC50=100µM
IC50=50µM
-68% (340µM)
-50mV
4 et 26s
(+20mV)
(Krause et al.,
1996)
(Tokimasa & North,
1996)
-60% (30nM)
-50% (100µM)
+30% (10µg/ml+50µM)
(Folander et al., 1990; Honoré
et al., 1991; Attali et al., 1992;
Hausdorff et al., 1991)
+300% (1µM)
+50% (1mM)
-50% (30nM)
(Attali et al.,
1995)
30
Tableau 5 : Courants Na+, Ca2+ et cationiques de l'ovocyte de Xénope.
Noms :
Propriétés :
Abréviations page 4
Conductance unitaire
INa(V)
INa(t)
INa(M2)
ICa(V)
Sélectivité
Densité
Niveau de courant
Seuil d'activation
τactivation
100nA
(+50mV)
-25mV
18s (+55mV)
300nA
(+50mV)
-40mV
80 à 200 nA
(-130mV)
τinactivation
IC
28 pS
K+>NH4+>Cs
+
>Rb+>Na+>
Li+>Ca2+
2 canaux/µm2
Cs+>Na+,K+
33nA
(+10mV)
-50mV
470nA
(+50mV)
250ms
(+10mV)
1s et 4s
(-110mV)
Ifond
60nA
(-20mV)
+830%
(pH5,8)
H+
Li+
Ca2+
Mg2+
Co2+
Ni2+
Gd
Istretch
IC50=340µM
-100%
IC50=61µM
IC50=201µM
-40% (3mM)
-40% (3mM)
0% (10 µM)
-100%
(10µM)
-100%
(100µM)
-100%
(100µM)
3+
La3+
Lu3+
-40% (3mM)
4-AP
DTX-I
ChTX
Apamine
β bungarotoxine
glibenclamide
MCD peptide
-40% (3mM)
0% (100nM)
0% (100nM)
0% (100nM)
0% (100nM)
0% (10µM)
0% (100nM)
-100%
(1mM)
TTX
Vératridine
BRL38226
0%
IC50=150µM
ω conotoxine
0% (1µM)
Nicardipine
BayK 8644
0% (10µM)
0% (1µM)
-100%
(10µM)
Amantadine
Théophylline
0% (100µM)
+300%
(50 pmole)
~ +300%
(1 mM)
+220%
(2 µM)
AMPc
IBMX
0% (100µM)
OAG
Références :
(Baud et al.,
1982; Baud
& Kado,
1984)
(Parker &
Miledi,
1987)
(Pinto et al.,
1992)
(Dascal et
al., 1986;
Bourinet et
al., 1992)
(Methfessel
et al., 1986;
Yang &
Sachs, 1989;
Yang &
Sachs, 1990)
(Arellano et
al., 1995)
(Honoré &
Lazdunski,
1991b)
31
II-A-11 Enregistrements en double microélectrodes
La résistance membranaire d'un ovocyte défollicularisé est de 1 à 3 MΩ et la capacité totale est
d'environ 100 nF. Les microélectrodes utilisées ont des résistances comprises entre 1 MΩ
(microélectrode de courant) et 2 MΩ (microélectrode de potentiel). L'amplificateur est un TEV200
de DAGAN.
Plusieurs précautions doivent être prises pour étudier les ovocytes de Xénope en voltage clamp. La
taille importante de la cellule empêche d'imposer uniformément et immédiatement le potentiel désiré
sur l'ensemble de la membrane (problème de "space-clamp"). Il faut veiller à placer les électrodes le
plus loin possible l'une de l'autre et éviter d'écraser l'ovocyte lors du positionnement des
microélectrodes. Des courants supérieurs à 20 µA induisent des erreurs sur le potentiel dues aux
résistances séries (Document de Dave Featherstone obtenu sur Internet "The TEV report" et Ruben
et al., 1997).
Plusieurs conductances endogènes sont présentes dans l'ovocyte (voir II-A-5, page 20) avec des
niveaux de courant très variable selon les lots d'ovocytes, selon la saison (malgré la photopériode
contrôlée) et pouvant également varier selon la présence des cellules folliculaires et la technique
employée pour les retirer. Néanmoins la plupart de ces conductances se traduisent en général par des
courants relativement faibles (<400 nA) comparés aux courants des canaux exogènes qui peuvent
atteindre 20 µA.
Il est aisé de surexprimer un canal mais il a été montré dans notre laboratoire que les canaux
exogènes avec des niveaux d'expression trop fort voyaient leurs propriétés biophysiques, leur
pharmacologie et leur régulation très significativement modifiés. Ces modifications de propriétés lors
d'une trop forte densité de canaux sont liées à la présence du cytosquelette (Honoré et al., 1992;
Guillemare et al., 1992).
Par conséquent, l'étude de canaux exogènes dans l'ovocyte de Xénope nécessite un fin réglage entre
la quantité d'ARN/ADN injecté pour ne pas obtenir des courants à trop forte densité mais pour
maintenir un niveau de courants permettant de négliger les conductances endogènes, c'est à dire des
courants d'environ 2 µA. L'étude des ovocytes non injecté est néanmoins indispensable notamment
lors des études de régulation qui peuvent dans certains lots faire apparaître des conductances
endogènes non négligeables, notamment lors des variations de calcium interne.
Les voies PLC et AMPc sont présentes dans les ovocytes (voir II-A-6, page 25 et pour les cellules
folliculaires II-A-8, page 25, et II-A-9, page 27) et l'existence de 12(S)- et de 15(S)-lipoxygenase a
également été montrée (Hawkins & Brash, 1989), ce qui donne plusieurs possibilités pour les études
de régulation.
Il faut noter que l'ovocyte de Xénope ne semble pas être un bon modèle pour l'étude de la
pharmacologie des canaux car de nombreux produits sont inactifs sur les canaux exprimés dans
l'ovocyte alors qu'ils sont actifs dans d'autres systèmes d'expression tels que les lignées de type COS
(observations personnelles non publiées). La membrane vitelline et les cellules folliculaires semblent
être des causes possibles de ces diminutions d'activités pharmacologiques probablement par fixation
non spécifique des composés (Madeja et al., 1997).
II-A-12 Enregistrement en "Ovocyte ouvert"
Cette technique (Taglialatela et al., 1992), que nous n'avons pas utilisée, permet d'améliorer la
technique de double microélectrode avec:
32
i)
ii)
iii)
iv)
Une diminution du bruit des courants faibles
Un contrôle de la composition du milieu interne
Une résolution rapide
Des enregistrements stables pendant des heures
Elle est réalisée à l'aide d'une cuve spécial sur laquelle l'ovocyte, dont la base a été coupée, est posé
avec un joint étanche. L'ovocyte étant ouvert, son milieu interne est contrôlé et le potentiel
parfaitement maintenu.
II-A-13 Enregistrement avec des électrodes garnies d'agarose
Cette technique très simple consiste en l'utilisation pour l'électrode de courant de grosses pipettes
avec de très faibles résistances inférieures à 1 MΩ. Pour éviter une fuite du KCl des pipettes la
pointe est remplie avec un mélange chaud de KCl 3M et d'agarose 1% (filtré à 0,22 µm). La taille
importante des pipettes permet de mieux contrôler le potentiel en injectant des courants de fortes
amplitudes et les enregistrements sont plus stables. Cette technique permet un contrôle très rapide du
potentiel mais pour tirer pleinement partie de ce dernier avantage il est nécessaire d'avoir un
amplificateur capable de compenser les résistances séries, car elles provoquent une chute de potentiel
non négligeable à cause des fortes intensités de courant (Schreibmayer et al., 1994).
II-A-14 Enregistrements en patch-clamp
L'enregistrement en cellule entière en patch clamp est impossible car l'ovocyte est beaucoup trop
gros, seuls les autres configurations sont utilisées. Au préalable, il est nécessaire d'enlever la
membrane vitelline en laissant l'ovocyte quelques minutes dans un milieu hyperosmotique d'environ
565 mOsm : 300 mM KCl, CaCl2 1,8 mM, MgCl2 2 mM, HEPES 10 mM, pH 7,4 (KOH), ce qui
facilite la dissection manuelle de cette membrane. Ensuite l'ovocyte est placé avec précautions (il est
très fragile sans la membrane vitelline) sous une loupe ou un microscope, plusieurs patch peuvent
être réalisés sur le même ovocyte.
33
Figure 3: Ovocyte de Xenopus laevis et tissus l'entourant
Ovocyte follicularisé
Ovocyte défollicularisé
membrane
vitelline
noyau
pôle animal
pôle végétal
membrane
plasmique
thèque
cellule
épitheliale
(D'après Snutch, 1988)
cellule
folliculaire
Figure 4: Courants Na+, Cl- et Ca2+ de l'ovocyte de Xénope
INa(V)
[Na+]ext = 84,5
mM
-60 mV
200 I (nA)
+50 mV
-100
-50
100
50
-100
40 s
(Baud et al. 1982)
-200
INa(t)
-50 à -20 mV
100
V (mV)
-50 à -20 mV
-100 mV
-100 mV
contrôle
TTX 600 nM
(Parker et Miledi 1987)
10 ms
ICl(Ca)
600 I (nA)
+28 mV
-70 mV
300
[Ca2+]ext = 30 mM
2s
ICl(h)
V(mV)
-30
-10 mV
[Cl-]ext = 158
-160 mV
-150
30 60
(Barish et al. 1983)
V (mV)
-100
-50
I (µA)
-5
0,5 s
(Kowdley et al. 1994)
-10
ICl(swell)
-70 mV
[Cl-]ext = 55,6 mM
+70 mV
-70
mV
0,5 s
[Ba2+]ext = 40 [Cl-]ext = 0 mM
0 mV
mM
I (µA)
2
110 mOsm
200 ms
ICa(V)
3
-80 -40
1
V (mV)
40 80
-1
(Ackerman et al. 1994)
V (mV)
-60 -20 20 60
-10
-14
I (nA)
(Dascal et al. 1986)
Figure 5: Courants K+ de l'ovocyte de Xénope
IK(V)
[K+]ext = 2 mM
500
+30 mV
I (nA)
400
-90 mV
300
200
V (mV)
-100
1s
IK(IsK)
[K+]ext = 2
mM+30 mV
-50
0
50
100
(Lu et al. 1990)
-50 mV
1
I (µA)
V (mV)
-100
-50
50
(Honoré et al. 1992)
5s
IK(Ca)
20
[K+]ext = 105
mM + 60 mV
[Ca2+]ext = 10 µM
10
[K+]ext = 0 mM
-100
50 ms
IK(Na)
V (mV)
-60
-20
-20
[K+] int = 0 mM [K+] ext = 150
-60mM
mV
60
100
(Krause et al. 1996)
Non déterminé
(Egan et al. 1992)
25 ms
-20 mV
20
-10
[K+]ext = 105
mM
[Na+]ext = 150
IK(IR)
I (pA)
[K+]ext = 90 mM
-120 mV
50
-150
-100
-50
I (nA)
V (mV)
50
-50
-100
-150
500 ms
(Bauer et al. 1996)
Figure 6: Courants cationiques de l'ovocyte de Xénope
IStretch
-100 mV
2
-150
-100
-50
-2
I (nA)
50
100
V (mV)
-4
-6
25 ms
-8
(Yang et Sachs 1990)
-10
IC
-10 mV
3
-110 mV
[Ca2+]ext =
0
-100 -50
I (µA)
50
V (mV)
-3
5s
Ifond
(Arellano et al. 1995)
-6
+60 mV
100 I (nA)
-80 mV
50
-100
-150
1s
50
-50
100
V (mV)
(Honoré et Lazdunski 1991)
Figure 7: Courants induits de l'ovocyte de Xénope
INa(M2)
(Na+)ext = 70 mEq/l
-40 mV
-140
-130 mV
V (mV)
-100
-60
-100
(Pinto et al. 1992)
-200
ICl(PLM)
2s
-10 mV
[Cl-]ext = 161 mM
-150 mV
(int
= 65 mM )
V (mV)
-150 -100 -50
2
-2
-4
50
100
(Moorman et al. 1992)
0,5 s
ICl(Mat-8)
[Cl-]ext = 161 mM
-10 mV
-160
mV
V (mV)
-160 -120 -80
-6
-40
(Morrison et al. 1995)
-5
-10
1s
IK(CHIF)
-15
[K+]ext = 2 mM
+40 mV
2
-80 mV
1
(Attali et al. 1995)
V (mV)
ICl(IsK)
5s
-50 mV
-150 -100
[Cl-]ext = 105,6 mM
-130 mV
-50
V (mV)
-150 -100 -50
50
100
1
-2
(Honoré et al. 1992)
1s
-4
Figure 8: Courants K+ et Cl- couplés aux récepteurs endogènes
IK(ATP) des cellules folliculaires
+
[K ]ext = 2 mM
+60mV
600 I (nA)
-80mV
200
-100
-150
-50
50
-200
1s
100
V (mV)
(HonoréetLazdunski1991)
Courants induit par les récepteurs à l'adénosine et à l'ATP
-50 mV
IK+
[Cl-]ext = 128,6 mM [K+]ext = 2 mM
IClAdenosine(40µM)
25nA
IK+
1 min
ICl-
(Lotan et al. 1982)
ATP(40µM)
Courantsinduitparlesrécepteursàl'acétylcholine
-100 mV
I (nA)
[Cl-]ext = 93,6 mM
600
400
200
Vm(mV)
ICl
2 min
ACh
-100 -80
-60 -40
-20
-200
-400
-600
(Arellano et Miledi 1993)
Gq
M1,M
-
+
+
PKC
+
-
PIP2
PLC
+
+
PDE
+
Gi
DAG
AMP
+
GMPc
+
OVOCYTE
+ ACh
- atropine
I K+
+
ANF
Hyperpolarisation
IGF
Insuline
-
PTX
[Ca2+]
+
IP3
FSH
+
AMPc
IBMX
théophylline
Gs
β
-
+
+
+
+
+
Gs
+
+
ATP
IP3
+
PLC
+
PIP2
AC
forskoline
+
+
+
Gs
CGRP Dopamine
Gs
- propranolol
+ épinéphrine
+ isoprotérénol
ICl-
PG
+
Angiotensine II
FSH, hCG
amiloride
sensible
INa+
Dépolarisation
[Ca2+]
+
Gq
-
Gs
CELLULES
FOLLICULAIRES
CTX
Gs
Ocytocine
AMP, Adénosine
A2
ATP, ADP
P2y
Gs
VIP
VII REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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