il était une fois mifobio..... - gdr-Miv

Transcription

Partenaires Académiques Mifobio 2014 MiFoBio 2014
SOMMAIRE
Remerciements....................................................................................................... 1
Il était une fois MiFoBio..... ..................................................................................... 3
COMITES ORGANISATION ....................................................................................... 6
PRE-MODULES ........................................................................................................ 7
MODULES ............................................................................................................. 11
Module 1 : Organisation moléculaire du vivant et nanoscopie ............................ 12
Module 2 : Mécano-biologie moléculaire et cellulaire : expérimentation et
modélisation................................................................................... 17
Module 3 : Microscopie aux différentes échelles du vivant pour une biologie
intégrative de la molécule à l'organisme ......................................... 23
Module 4 : Optogénétique et biosenseurs .......................................................... 29
Module 5 : Dynamique moléculaire .................................................................... 35
Module 6 : Contrôle des ondes pour l'imagerie du vivant – gdr Ondes ................ 43
Module 7 : Nouvelles imageries et microscopies mutlimodales .......................... 48
SEMINAIRES .......................................................................................................... 55
MODULES AVANCES / TABLES RONDES ................................................................. 59
ATELIERS ............................................................................................................... 75
Planning ateliers ................................................................................................. 76
Fiches descriptives des ateliers ........................................................................... 87
SPONSORS .......................................................................................................... 165
PARTENAIRES...................................................................................................... 167
LISTE DES PARTICIPANTS ..................................................................................... 173
LISTE DES INTERVENANTS ................................................................................... 183
Ecole thématique interdisciplinaire du CNRS : Microscopie Fonctionnelle en Biologie
MiFoBio, Seignosse, 3-10 octobre 2014
Remerciements
REMERCIEMENTS
L’équipe d’organisation est heureuse
de vous accueillir pour cette nouvelle
édition de l’école MiFoBio 2014. Cette
formation est portée par le GDR2588
et FranceBioImaging (FBI) dans le
cadre des actions de la Formation
Permanente du CNRS en collaboration
avec les formations permanentes de
l’INSERM. Elle bénéficie aussi des
soutiens d’AVIESAN (ITMO BCDE et ITS), du réseau technologique de microscopie
optique (RT mfm), de l'Institut Fresnel associé au pôle de Compétitivité Optitec, de
l’ENS de Lyon et de BioSciences Gerland. Enfin, le "Bordeaux Imaging Center",
l'Institut Interdisciplinaire de Neurosciences, l'Institut Jacques Monod et l'Institut
Curie ont sponsorisé la participation d'intervenants étrangers.
Nous souhaitons remercier les personnels des formations permanentes et des
services administratifs du CNRS et de l’INSERM, en particulier Marie Noëlle
Fourmaux, Pierre Silveira, Nathalie Froger, Cyril Marchal et Aline Macau pour leur
soutien et leur aide dans la mise en place de cette école.
Nous exprimons nos sincères remerciements aux intervenants pour leur
participation, la qualité de leurs cours et conférences, et pour leur enthousiasme. De
même, nous remercions ceux qui ont accepté d’animer les pré-modules, les modules
avancés et tables rondes.
L’ensemble de l’équipe tient à remercier tous les collègues impliqués dans la mise
au point et la réalisation de chaque atelier dont la variété est une richesse pour
l’école, mais aussi ceux qui ont assuré la mise à disposition des modèles cellulaires
et animaux, ainsi que le déplacement de systèmes expérimentaux "home made". Ces
ateliers nécessitent du matériel biologique vivant, que ce soit des cellules ou des
petits animaux. Que l’ensemble de l’équipe qui assure le fonctionnement de la salle
de culture trouve ici l’expression de la gratitude du comité d'organisation et de
l'ensemble des participants.
1
Remerciements
Nous remercions les partenaires industriels de cette école pour leur engagement
dans cette aventure, leur fort soutien et la mise à disposition d’un parc
technologique exceptionnel, voire peut-être unique au monde, qui nous permet de
réaliser les ateliers pratiques dans d’excellentes conditions et sur du matériel "upto-date".
Nous remercions le comité scientifique de MiFoBio qui a rendu possible ce projet,
ainsi que plusieurs DSA et chargés de missions, en particulier à l’INSB, INC et l’INSIS,
pour leur soutien. De même, nous remercions les comités des sections scientifiques
du CNRS qui nous ont fortement soutenu et aidé par leurs remarques constructives
lors de leur évaluation du projet.
Nous remercions également le personnel du centre de vacances Belambra, pour leur
accueil et leur aide, la mise à disposition de locaux et le soutien technique qu’ils nous
ont apportés.
Enfin, que l’ensemble des membres du comité d’organisation et plus généralement
tous ceux et celles qui ont mis la "main à la pâte" trouvent ici l’expression de notre
gratitude pour la qualité des échanges et du travail réalisé depuis 9 mois. Parmi eux,
nous remercions particulièrement Paulette, Claire et Nelly pour leur très forte
implication et leur patience.
Merci à toutes et tous pour avoir rendu possible cette exceptionnelle aventure
humaine et technologique.
Le comité de Pilotage :
Frédéric Boltze (Strasbourg), Christophe Chamot (Lyon), Fabrice Cordelières
(Bordeaux), Didier Decimo (Lyon), Alain Dieterlen (Mulhouse), Laurent Héliot (Lille),
Sandrine Lécart (Orsay), Cédric Matthews (Marseille), Karine Monier (Lyon), Serge
Monneret (Marseille), Tristan Piolot (Paris), Christine Terryn (Reims).
2
Il était une fois MiFoBio.....
IL ÉTAIT UNE FOIS MIFOBIO.....
En septembre 2004, avait lieu à La Vieille Perrotine (Ile d'Oléron) la première édition
de l'école thématique de Microscopie Fonctionnelle en
Biologie... MiFoBio était né! ... Il y a 10 ans!!!
Le projet de cette école thématique du CNRS avait été
déposé en juillet 2003 au nom du tout nouveau GDR2588
(microscopie fonctionnelle du vivant). Le Réseau
Technologique RTmfm, créé en février 2004 sous l'égide de
la MRCT, fut rapidement associé à l'animation de cette
école qui ne tarda pas à fédérer la communauté biophotonique dans un esprit de
partage interdisciplinaire.
Dès le départ de cette aventure, l'école présentait trois originalités : (i) un domaine
d'intérêt associant à la fois des questions fondamentales et des technologies,
impliquant des enseignements variés et de niveaux multiples ; (ii) un public
extrêmement interdisciplinaire issu de la biologie, physique, informatique, analyse
d'image, chimie, instrumentation ; et (iii) la volonté de faire interagir ces participants
autour de véritables expériences sur du matériel biologique vivant. Une telle
alchimie ne pouvait que permettre de pousser dans leur retranchement les
instruments disponibles, et imaginer de nouvelles approches méthodologiques.
MiFoBio s'est directement inscrit dans une prise de conscience collective des besoins
d'imagerie en biologie. L'école a aussi bénéficié de l'émergence de la biophotonique
au niveau international, associée à d'importants et rapides progrès dans les
technologies optiques et dans les outils de biologie cellulaire. Ceux-ci ouvrent la voie
à l'étude intégrative, multi-échelle du vivant allant de la dynamique moléculaire à la
réponse physiologique des organismes.
Notre volonté de rester proche de la pratique expérimentale et d'amener théoriciens
et expérimentateurs à partager ensemble autour d'une "manipe" a conduit l'école
MiFoBio à devenir unique de par le nombre de systèmes d'imagerie mis à disposition
par les partenaires industriels et les équipes académiques. La relation de confiance
et de partage technologique que nous avons pu bâtir avec nos partenaires industriels
va bien au-delà de la vente d'équipement. Elle s'est traduite par des premières
technologiques, ainsi que par la naissance de collaborations fructueuses ayant
3
débouché sur de nouveaux systèmes commerciaux. Ainsi l'école MiFoBio a toujours
proposé l'accès à des technologies innovantes telles que le FRET/FLIM et la FCS, le
FRAP rapide, les suivis de particules uniques, nanoscopies STED/éclairement
structuré/PALM/STORM, les microscopies non linéaires, l'optogénétique, la
microscopie quantitatives de phase, le CLEM… alors même qu'elles étaient encore
en développement dans les laboratoires, ou tout juste commercialisées. En 2014, ce
sont plus de 80 ateliers qui vous sont proposés par les académiques sur ces systèmes.
La qualité des cours maintenue au fil des années est l'autre point fort de l'école
MiFoBio. Le comité d'organisation veille à conserver un équilibre entre des
enseignements très avancés sur les domaines les plus "chauds" de la biophotonique
et des cours plus fondamentaux adressés à un public issu de champs disciplinaires
très différents. La construction du programme de cours et le choix des enseignants
est un travail certes difficile, mais récompensé par l'investissement de nos
intervenants que l'on ne peut que remercier pour la qualité de leurs enseignements
qui place MiFoBio parmi les formations majeures en biophotonique. Pour cette
édition 2014, nous vous proposons une nouvelle formule comprenant une partie des
enseignements dispensés en parallèle, afin de répondre au mieux à nos objectifs
interdisciplinaires, mais aussi pour proposer quelques cours sur des thématiques très
avancées ou mal connues de la communauté, avec un objectif d'ouverture sur
d'autres domaines scientifiques liés à l'étude du vivant. Ainsi, et ceci depuis
maintenant 10 ans, MiFoBio renouvelle son contenu à chaque édition tout en
conservant son esprit d'aventure, sa part de surprise et de dépassement.
L'organisation de cette école thématique du CNRS est portée par le "GDR 2588"
(baptisé "Microscopie et Imagerie du Vivant" MIV depuis 2013), avec le soutien du
réseau RTmfm (rattaché à la Mission pour l'Interdisciplinarité du CNRS). Au fil des
années, MiFoBio a aussi reçu le soutien d'organismes de plus en plus nombreux.
Cette année, l'INSERM, l'ENS de Lyon, BioSciences Gerland, AVIESAN, et France
BioImaging, mais aussi plusieurs instituts de recherche dont l'Institut Jacques Monod
à Paris, l'Institut Interdisciplinaire de Neurosciences de Bordeaux et l'Institut Fresnel
de Marseille ont apporté leur soutien financier à l'école.
L'une des principales prouesses dans cette aventure depuis 2004 est d'avoir réussi à
déployer pour une semaine une infrastructure permettant de travailler avec des
technologies de pointes sur du matériel vivant. Ceci est possible grâce à une solide
équipe d'organisation constituée de scientifiques qui prennent sur leur temps pour
rendre possible cette école. Cette équipe a elle aussi évolué au cours des années ;
les collègues ayant porté les premières éditions se souviendront des camionnettes
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chargées de matériel de culture et tables optiques partant de Lille, ainsi que de Didier
se battant pour mettre en route la salle de culture dans des conditions les plus
sportives à Oléron. Depuis 2008 et grâce à la détermination de quelques-uns, nous
pouvons aussi travailler sur des modèles animaux aquatiques. Au fur et à mesure des
éditions nous avons su ensemble faire évoluer l'organisation de MiFoBio tout en
conservant l'esprit d'aventure… Le succès de la manifestation nous a aussi conduits
à passer de 150 à 330 participants sur site depuis 2010 (hors industriels). Nous avons
malheureusement dû refuser plus de 80 demandes cette année. L'équipe qui vous
accueille en 2014 à Seignosse a fortement contribué depuis plusieurs années à
l'amélioration et la pérennisation de l'école, tout en conservant la souplesse et le
don d'adaptation qui en font un lieu unique (une fourmilière?) d'expérimentations
et de rencontres où nous sommes tous tantôt étudiant tantôt enseignant, tant le
champ disciplinaire est varié.
Pour la première fois, et à l'occasion de ses 10 ans, l'école MiFoBio revient au pied
d'un phare déjà visité en 2010, à Seignosse, mais avec un programme renouvelé et
enrichi de ses nouveaux modules d'enseignement et ateliers. MiFoBio 2014
permettra d'explorer les plus récents développements en super résolution et
microscopie corrélative et leurs applications en biologie cellulaire, de présenter des
approches de plus en plus interdisciplinaires pour comprendre et interpréter les
dynamiques et interactions moléculaires en cellules, de suivre les développements
en optogénétique et en biosenseurs, d'appréhender la continuité entre la
biomécanique cellulaire et l'imagerie dynamique dans les petits animaux, de
découvrir les nouvelles imageries du vivant et le potentiel émergeant des progrès en
optique et biologie cellulaire... L'aventure continue, et nous souhaitons que MiFoBio
reste tel un phare et un lieu d'échange pour les explorateurs de la biophotonique
que nous sommes tous...
Microscopie et Imagerie du Vivant
5
COMITES ORGANISATION
COMITES ORGANISATION
Responsables
Scientifiques
Laurent Héliot
IRI
03 26 53 17 35
[email protected]
Serge Monneret
Institut Fresnel-UMR7249
04 91 28 80 52
[email protected]
Responsables
Formations Permanentes
Pierre Silveira
Formation DR 18
03 20 12 36 88
[email protected]
Responsable
Administrative
Paulette Souillard
Laboratoire TIMC-IMAG, 38710
La Tronche
04 56 52 00 75
[email protected]
Marie-Noëlle Fourmaux-Priem
Formation Inserm DR Nord-Ouest
03 20 29 86 78
[email protected]
Comité de pilotage
Nelly Bardet, Frédéric Bolze, Christophe Chamot, Fabrice Cordelières, Didier Décimo, Alain Dieterlen, Claire
Guéné, Laurent Héliot, Sandrine Lécart, Cédric Matthews, Karine Monier, Serge Monneret, Tristan Piolot,
Paulette Souillard, Christine Terryn
Ont participé à l’Organisation :
Modules et séminaires
Logistique de la salle de
Informatique
Bourses GDR2588 ou
Laurent Blanchoin
culture
Christophe Chamot
RTmfm
Frédéric Bolze
Didier Décimo
Claude-Marie Bachelet
Gestion des
Sophie Brasselet
(RT-mfm)
Culture cellulaire
intervenants
Maxime Dahan
Olivier Haeberlé
Sophie Abélanet
Frédéric Bolze
Mathieu Coppey
(GDR-MIV)
Astrid Canivet
Paulette souillard
Lydia Danglot
Bertrand Simon(GDRBenjamin Cappe
Support cours et mise
Laurent Héliot
MIV)
Guillaume Fargier
en ligne des cours
Charles Kervrann
Lydia Danglot (GDRFrédérique Gaits-Iacovoni
Mariano Gonzalez-Pisfil MIV)
Sandrine Lévêque-Fort
Maeva Gesson
Corentin Le Nezet
Serge Monneret
Mélanie Henry
Communication,
Nadine Peyrieras
Vidéo
Karine Monier
Affiche et Couverture
Yves Usson
Julien Cau
Claire Guéné
Animalerie
Pierre Vincent
Corentin Le Nezet
Nelly Bardet
Nadine Peyriéras
Julien Vermot
Posters
Franck Riquet
Transport participants
Pré-modules
Bertrand Simon
Sylvia Bruneau
et intervenants
Anne Cantereau
Didier Décimo
Documents Mifobio
Gestion des partenariats
Julien Cau
Anne Cantereau
Nelly Bardet
industriels
Modules avancés et Tables
Fabrice Cordelières
Anne-Sophie Bonne
Loisirs et animation
rondes
Laurent Héliot
Cédric Matthews
Claire Guéné
Alain Dieterlen
Serge Monneret
Tristan Piolot
Site Web
Perrine Paul-Gilloteaux
Accueil d'écoles
Logistique et mise en
Corentin Le Nezet
Management technologique
Marie Noelle Soler
place des ateliers
Serge Monneret
des ateliers
Frédéric Bolze
Christophe Chamot
Sponsor
Tristan Piolot
Sébastien Marais
Gestion des inscrits
Didier Decimo
Gestion des Ateliers
Tristan Piolot
Serge Monneret
Cédric Matthews
Fabrice Cordelières
Olivier Renaud
Nelly Bardet
Gestion financière
Sandrine Lécart
Didier Décimo
Aline Macon
Paulette souillard
Christine Terryn
Julien Savatier
6
PRE-MODULES
PRE-MODULES
Pré-Modules (PM1 à PM6)
Samedi 4
13h30
14h30
15h00
13h30 - 15h00
PM2 : L'optique pour
les non physiciens
(deb.)
14h30-16h30
PM1 : La biologie pour
les non biologistes
13h30 - 16h30
PM4 : Analyse des
images en microscopie
14h30 - 15h30
PM5 : Métrologie des
systèmes
14h30-16h30
PM3 : Base de
fluorescence et
processus associés
14h30-16h30
PM6 : Détecteurs en
microscopie
Dimanche 5
Lundi 6
14h30-16h30
PM3 : Base de
fluorescence et
processus associés
14h30-16h30
les non physiciens
(Restaurant)
(Restaurant)
Mardi 7
Mercredi 8
15h00 - 16h30
les non physiciens
(inter.)
16h30-18h30
PM1 : La biologie pour
les non biologistes
16h30
(Jai Ala)
21h30-23h30
21h30 -23h30
PM4 : Script et
programmation
graphique sous Icy
(d 'Artagnan)
21h30-23h30
PM5 : Métrologie des
systèmes
( Restaurant)
Les pré-modules sont l'occasion d'acquérir et/ou de rafraîchir des notions
essentielles qui sont ensuite utilisées dans les cours (et qui ne sont pas reprécisées à
cette occasion). Conçus en fonction des différentes catégories d'élèves (origine
Maths, Informatique, Physique, Chimie, Biologie), ils offrent les connaissances de
base pour suivre les modules de l'école MiFoBio.
- PM1 biologie : la biologie pour les non biologistes (14h30, Delphine Muriaux,
Charlotte Mariani)
Ce pré-module permettra de présenter à un public non biologiste les différentes
structures et les grandes fonctions cellulaires. L'intervenant sera chargé d'essayer de
balayer ces différents aspects sans se concentrer sur une fonction particulière.
Alternativement, nous proposons une inscription anticipée au pré-module pour
permettre éventuellement aux intervenants d'interroger les futurs participants sur
leurs attentes précises (par exemple un type de structure, un type de fonction
particulier) et éventuellement une information sur la préparation d'échantillons
pour la microscopie.
La partie pratique se concentrerait sur la culture cellulaire et la transfection de
plasmides (exprimant les protéines d’intérêt fluorescentes).
Durée : 1h de théorie (D. Muriaux) et 1h de pratique
Ce pré-module est reproposé en cours de semaine.
7
PRE-MODULES
- PM2 L'optique pour les non physiciens (13h30, Olivier Haeberlé)
Ce prémodule sera l'occasion d'aborder les différentes notions de bases nécessaires
à la compréhension des cours. Le microscope est un outil de routine en biologie dont
l'utilisation est simplifiée grâce à une ergonomie judicieusement conçue. Certains
des élèves de MIFOBIO, tout en utilisant régulièrement des techniques de
microscopie (confocal, multiphoton, F-techniques) ont besoin d'un rappel sur les
bases physiques permettant la formation de l'image et sur la conception des
microscopes modernes. Le public 2012 était important pour ce pré-module et nous
proposons de le scinder en deux, un module Niveau débutant (13h30) avec les
notions "basiques" (structure d'un microscope, trajet optiques, éléments, notion de
résolution, aberrations, choix des objectifs, fluorescence), un module niveau
intermédiaire (15h) avec des notions plus avancées (optique de Fourier, techniques
de microscopie de fluorescence).
Durée : 1h30 de niveau débutant, 1h30 de niveau avancé. Possibilité de s’inscrire au
seul niveau avancé.
- PM3 : base de fluorescence et processus associés (14h30, Dominique Bourgeois)
Beaucoup de participants à l'école MIFOBIO utilisent la microscopie de fluorescence.
Cependant, les propriétés complexes des marqueurs fluorescents sont parfois
méconnues. Ce pré-module propose de faire un point sur les différents processus
liés à la fluorescence et sur les propriétés des fluorophores (spectres, IC, ISC,
fluorescence, phosphorescence, états singulets, triplets, réactions avec
l'environnement, bleaching, blinking, coef. d'absorption molaire, section croisée, QE,
brillance, 1p ou 2p, notion de flux de photon en microscopie de fluorescence WF,
confocale ou 2p, durée de vie). Nous donnerons aussi une ouverture sur les
processus non fluorescents (SHG/THG par exemple).
Durée : 2h
- PM4 : Analyse des images en microscopie (13h30, Alexandre Dufour, Fabrice de
Chaumont)
La réalisation d’une expérience suit un ensemble d’étapes toutes aussi critiques que
les autres. En particulier, l’étape d’analyse, pour être correcte, suppose une
connaissance du contenu informatif de l’image et de sa conservation dans les
différents formats de sauvegarde (dynamique, métadonnées). Ce pré-module
retracera ces problématiques et présentera les principaux outils de traitement des
images et d’identification des objets d’intérêt. Une première partie théorique sera
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PRE-MODULES
suivie d’une session pratique (insertion dans le planning à définir). Elle utilisera le
logiciel support (Icy) qui sera utilisé comme vecteur pour expliquer toute la richesse
d'analyse que l'on peut retirer d'une image, tout en expliquant et sensibilisant à
l'utilisation des différentes représentations (colormaps, vues 2D,3D), ainsi que les
formats d'images à utiliser, la création des ROIs et quelques petits algorithmes.
Durée : 1h de théorie (A. Dufour), 2h de pratique
La partie pratique (Icy) de ce pré-module est reproposée en cours de semaine sous la
forme d’un atelier.
- PM5 : Métrologie des systèmes (13h30, Groupe Métrologie RTmfm*)
La technicité des appareils utilisés pour l’observation du vivant, leur complexité, et
la généralisation des mesures quantitatives imposent un suivi rigoureux des
appareils. Au cours de ce pré-module, une introduction présentera les différents
points de mesures sur un système de microscopie, une présentation générale du
fonctionnement des principaux capteurs : caméras (CCD, EM-CCD, sCMOS) et
détecteurs (PMT, GaAsp, HyD, APD, MCP), la fonction d’étalement (PSF), les
différentes aberrations rencontrées en microscopie et les différents étalons en
métrologie. Les outils utilisés et mis à disposition par le groupe de travail seront
présentés (greffons permettant la génération de PSF théorique ou l’analyse d’images
de billes par le greffon MetroloJ). Ce cours s’adressera uniquement à ceux qui
débutent en métrologie. Au cours de ce Pré-Module le groupe de travail «
Métrologie » du RTmfm/MI fournira aux participants le matériel nécessaire (billes,
milieu de montage, lames, lamelles, …) pour la préparation de lames de billes pour
la métrologie. C'est notamment avec ces lames que tout un chacun pourra participer
au « Challenge de la PSF » qui sera organisé durant Mifobio.
* Groupe de travail Métrologie du RTmfm dont Damien Schapman, Aurélien
Dauphin, Perrine Frère, Fabrice Cordelières, Alain Dieterlen, Daniel Zaharia.
Durée : 2h
3 ateliers sur ce thème sont proposés par le groupe de travail en cours de semaine.
Ce prémodule pourra être reproposé en cours de semaine.
- PM6 : Détecteurs en microscopie (14h30, Sébastien Marais et Marc Tramier)
Les détecteurs sont les éléments clés qui conditionnent, en fonction de leur
sensibilité ou des résolutions spatiale et temporelle qu’ils autorisent, la qualité de
l’image finale. Connaître le fonctionnement, les performances et limites des
différents capteurs est donc particulièrement utile pour concevoir une expérience
en biologie. Ce prémodule s’adresse aux utilisateurs et personnes chargées de
concevoir un poste de microscopie en fonction du besoin expérimental. Ce
prémodule présentera en introduction les propriétés communes de ces détecteurs
(capacité, bruit, rendement, dynamique, linéarité, types de gains). Puis, les
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PRE-MODULES
caractéristiques et utilisations des capteurs pour les approches champ plein seront
abordées (capteurs matriciels de type CCD classiques, EM-CCD, sCMOS). Les
performances comparatives de ces capteurs seront analysées. Enfin, les propriétés
des différents capteurs utilisés dans les approches utilisant le balayage (confocal,
multiphoton monopoint simples, certaines F-techniques) tels que les PMT, HyD ou
les photodiodes seront présentés.
Durée : 2h
La participation à ce pré-module pourra être complétée par l’atelier proposé par
Sébastien Marais sur les tests simples autour de différentes caméras sur échantillons
fixés et vivants. Ce pré-module sera reproposé au cours de la semaine.
10
MODULES
MODULES
Dimanche 5
8h30 - 12h45
Lundi 6
Mardi 7
Module 3 :
Microscopie aux
Module 4 :
différentes échelles du
Optogénétique et
vivant pour une biologie
biosenseurs
intégrative de la
molécule à l’organisme
Module 1 :
Organisation
moléculaire du
vivant et
nanoscopie
Mercredi 8
Jeudi 9
Vendredi 10
Module 5 :
Dynamique et
interaction
moléculaire en
cellules vivantes
Module 6 :
Contrôle des ondes
pour l’imagerie du
vivant
8H00
Module 7 :
Nouvelles
imageries et
microscopies
multimodales
Module 2 :
Mécano-biologie
cellulaire et
16h45 - 20h00
tissulaire :
expérimentation et
modélisation
11
MODULES
MODULE 1 : ORGANISATION MOLECULAIRE DU VIVANT ET NANOSCOPIE
Dimanche 5 octobre - 08h30
Coordination : Lydia Danglot et Maxime Dahan
PALM, from the fundamentals to rapid, automated and robust imaging
Suliana Manley,
EPFL - Laboratoire de biophysique expérimentale - Lausanne
Salle Atlantique – Cours plénier
Photoactivated localization microscopy, or PALM, uses control of fluorescent states
to temporally separate signals from single molecules and enable superresolution
imaging and high-density single molecule tracking. These breakthroughs are finding
applications in many biological contexts. In this lecture, we will go from the
fundamental concepts and essential components of this kind of imaging, to the
current frontiers in applying it to answer biological questions and further developing
the technology.
***
Single particle imaging in living neurons
Laurent Groc,
"Development and Adaptations of Neuronal Circuits" - Interdisciplinary Institute for
Neuroscience, Université de Bordeaux, CNRS UMR 5297
Understanding the molecular and cellular mechanisms that shape and regulate the
communication between neurons is one of the key challenges in neuroscience.
Thanks to development and application of the single molecule imaging in live cells
years ago, our comprehension of the neuronal communication and synaptic
molecule organization has simply been revolutionized. I will here specifically discuss
recent advances in glutamate receptor dynamics using for instance single
nanoparticle tracking in neuronal networks.
***
12
MODULES
STED Microscopy: Principle, practical aspects and applications
Gael Moneron,
Institut Pasteur Paris
Salle Galipot – Session parallèle
Owing to its spatial resolution (typically better than 50nm), STED "nanoscopy"
bridges the gap between the resolving powers of electron-microscopy and standard
light-microscopy while maintaining the flexibility and specificity of fluorescence
labeling for live cell imaging. The principle of the technique, important practical
aspects as well as the state-of-the-art of its implementation will be presented before
a discussion of a few applications illustrating its powerfullness.
***
Superresolution imaging of nuclear organisation with 3D structured illumination
microscopy
Lothar Schermelleh,
Université d'Oxford, biochemistry Dpt, Oxford
Superresolution 3D-structured illumination microscopy (3D-SIM) allows multicolour
sectioning of entire cells with enhanced resolution along the x,y and z-axis. The
combined features make 3D-SIM probably the most versatile of current superresolution techniques and particularly suited to study the internal organisation of
mammalian cell nuclei. In the first part of my talk I will shine light on the particular
challenges when imaging these largest and most complex eukaryotic organelles and
I will present recent examples of our studies on structural features of
subchromosomal organisation and epigenetically controlled genome activity in fixed
and living cells.
Generally the application of 3D-SIM still imposes many challenges. In particular,
there is a lack of expertise and tools to evaluate the quality of the generated data. In
the second part of my talk, I will outline typical problems and artifacts encountered
when applying this technique to biological specimens and summarise our current
best practice for optimal sample quality and system calibration. I will further
introduce SIMcheck, an ImageJ plugin toolset that we developed for standardised
quality control of 3D-SIM data sets.
13
MODULES
***
Quantitative single-molecule super-resolution microscopy of cellular structures
Mike Heilemann,
Goethe-University Frankfurt, Institute of Physical and Theoretical Chemistry,
Frankfurt, Germany
Salle Atlantique – Session parallèle
In the fluorescence microscopy field, much interest has focused on new superresolution techniques (collectively known as PALM/STORM, STED, SIM and others)
[1] that demonstrated to bypass the diffraction limit and provide a spatial resolution
reaching a near-molecular level. With these techniques, it has become possible to
image cellular structures in far greater detail than ever before. Single-molecule
based methods such as photoactivation-localization microscopy (PALM) [1],
stochastic optical reconstruction microscopy (STORM) [2] and directSTORM
(dSTORM) [3] employ photoswitchable fluorophores and single-molecule
localization to generate a super-resolution image.
The important next step is to obtain reliable quantitative information from superresolution images of cellular structures. Single-molecule super-resolution techniques
can be applied to study the aggregation of membrane proteins and the nanostructural organization of HIV-1 envelope protein in intact cells [4] and single viruses.
Furthermore, single-molecule counting of nucleosome-associated proteins [5] and
transcription-associated proteins [6] will be presented.
References
[1]
[2]
[3]
[4]
[5]
[6]
E. Betzig et al., Science 2006, 313, 1642-1645.
M. J. Rust et al., Nature Methods 2006, 10, 793-795.
M. Heilemann et al., Angewandte Chemie 2008, 47, 6172-6176.
W. Muranyi et al., Plos Pathogens 2013, 9(2), e1003198
Lando et al., Open Biology 2012, 2:120078.
Endesfelder et al., Biophys J 2013, 105, 172-181.
***
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MODULES
Optical schemes for 3D single-molecule imaging: application to tracking and
super-resolution microscopy
Maxime Dahan, Laboratoire Physico-Chimie, Institut Curie
Only a few years after its inception, single molecule imaging has become widely
employed in biological studies, with applications ranging from dynamic tracking to
localization-based super-resolution microscopy. Traditionally, the detection of
individual emitters in vitro or in vivo is achieved with total internal reflection
microscopy (TIRF). Yet, TIRF is limited to 2D imaging of molecules in the cell
membrane. Since most biological systems are three-dimensioanl, accessing the 3D
localization of single molecules is an important goal but it still raises many
challenges. To address these challenges, optical and computational techniques for
3D single molecule imaging have been developed. They include engineering of the
point-spread function, multiplane imaging, interferometric detection or light-sheet
imaging. Here I will review the principles of these techniques, illustrate their
results, and discuss their benefits and limitations.
Review: Hajj B, El Beheiry M, Izeddin I, Darzacq X, Dahan M, Accessing the third
dimension in localization-based super-resolution microscopy. Phys Chem Chem
Phys. 2014
***
Dans la même thématique :
Modules Avancés et Tables rondes
Microscopie SIM aveugle (Blind-SIM)
MA-1-1
Quelles références pour quelles mesures en métrologie, vers la
TR-1-1
métrologie de la super-résolution
Ateliers
 A1 - 2D Single Particule Tracking
 A2 - Microscopie super-résolutive PALM associée à l'optique adaptative
 A3 - dSTORM 3D à l’aide de l’émission « super critique »
 A4 - Imagerie de super-résolution par diffraction conique
 A5 - PALM STORM Démocratique
 A6 - Mise en place du BALM : technique de microscopie à haute résolution
nécessitant un microscope confocal et des fluorochromes conventionnels
15
MODULES







A7 - Ultrastructure of centrosomes
A8 - 3D PALM sur plantes
A9 - Utilisation de la super-résolution STORM pour définir l'architecture d'un
compartiment neuronal
A10 - Microscopie super-resolution PALM/dSTORM 3D pour étudier la
répartition des récepteurs membranaires
A11 - In celulo assessment of photophysical parameters of fluorescent
proteins used as markers for PALM microcopy
A12 - Atelier transversal : Comparaison des techniques de super résolution
STED 3X et microscopie STORM sur la localisation de protéines synaptiques
A13 - STED 3D multicouleurs cytosquelette et levure
16
MODULES
MODULE 2 : MECANO-BIOLOGIE
MOLECULAIRE
ET
CELLULAIRE
:
EXPERIMENTATION ET MODELISATION
Dimanche 5 octobre - 16h45
Coordination : Laurent Blanchoin
Mechanisms and dynamics of actin-dependent protrusion
Klemens Rottner,
Institute of Genetics, Bonn
Cell migration as observed for instance in metastatic cancer cells is frequently
initiated by protrusion of thin leaflets of cytoplasm called lamellipodia or of rods
termed filopodia. Lamellipodia are built of dense networks of actin filaments and are
also called ‘ruffles’ when lifting up- and backwards during protrusion and retraction.
Lamellipodia formation and turnover are controlled by continuous polymerization
and depolymerisation of actin filaments, but the precise temporal and spatial
features of regulation of these processes are controversial. In addition, filament
assembly directly depends availability of actin monomer, the distribution and
transport of which remain incompletely understood.
In recent years, we have employed photomanipulation techniques such as FRAP or
photoactivation to obtain more insight into rate and mode of actin filament turnover
in different protrusion types. We have also begun to explore the mobility and
turnover of various regulators of actin filament assembly and of actin monomer. Our
results allow specific conclusions about biochemical activities of actin regulators in
protrusions. They also provide evidence for the regulation of actin monomer
distribution and transport.
All these results have been complemented by functional assays such is inhibition or
elimination of specific pathways regulating actin assembly/disassembly in
lamellipodia, including for instance the Rac/WAVE/Arp2/3 complex pathway or
ADF/cofilin. Examples for these will be discussed.
Current and future efforts are aimed at defining the precise biochemical activities
that operate in situ, both at the network/bundle and at the individual filament level,
to shed more light on the molecular regulation of actin-based cell edge protrusion.
***
17
MODULES
Morphogenetic Functions of Actomyosin
Stephan W. Grill,
Biotechnology Center TU Dresden, Dresden
Morphogenesis refers to the generation of form in Biology. Much is known about
molecular mechanisms of regulation, but little is known about the physical
mechanisms by which an unpatterned blob of cells develops into a fully structured
and formed organism. The actomyosin cortex is a thin layer underneath the cellular
membrane that can self contract, which drives many of the large-scale
morphogenetic rearrangements that are observed during development. How this
cortex reshapes and deforms, and how such morphogenetic processes couple to
regulatory biochemical pathways is largely unknown. I will discuss two emergent
physical activities of the actomyosin cytoskeleton, an active contractile tension and
an active torque, both of which can serve to drive flows and large-scale chiral
rotations of the actomyosin cytoskeleton. I will illustrate how active tension drive
flows, how molecular constituents of the cortex affect flows, and how
morphogenetic patterns can be formed by coupling regulatory biochemistry to active
cortical mechanics. A particular focus will be the investigation of how active chiral
torques drive chiral flow, and the resulting functions of such chiral activities of the
actomyosin cytoskeleton for left-right symmetry breaking in development.
***
Force scaling in stress fibers
Laetitia Kurzawa,
Physics of the Cytoskeleton and Morphogenesis, Institute of Life Science Research
and Technology, Grenoble, France
Mammalian cells have the remarkable ability to sense changes in their
microenvironment and to remodel their shape and microstructures accordingly.
This process is mainly driven by the actin cytoskeleton that can both transmit and
generate mechanical forces. An important challenge in understanding cell
mechanics is to establish the mechanisms controlling the interplay between actin
dynamics, cytoskeleton architecture and mechanical properties of the cells. In this
context, we are combining complementary approaches including micropatterning
fabrication methods to control cell architecture and geometry and cutting-edge
imaging-based techniques. We are able to retrieve the contractile energy
18
MODULES
contained in stress fibers following nanosurgery experiments with a UV-pulsed
laser. In parallel, we can study the dynamics and turnover of molecular
components of stress fibers while performing photoconversion experiments. We
will present how we can combine all this tools toward a molecular understanding
of cell mechanics.
5 keywords about the research project: cytoskeleton, micropatterning,
photoconversion, photoablation, Traction force microscopy
***
The inner dynamics of cellular structures revealed at the molecular scale by single
protein tracking of photo-activable fluorescent proteins (sptPALM) in living cells:
applications to cell adhesion and motility.
Olivier Rossier,
Institut Interdisciplinaire de Neuroscience, Bordeaux
In this lecture, we will describe how single protein tracking techniques (spt) and
super-resolution microscopies (PALM) open new avenues to reach a molecular
understanding of cellular functions such as cell adhesion and motility. Such functions
are supported at the meso-scale by macro-molecular complexes of proteins, which
are stable on the timescale of several minutes. Critical proteins undergo movements
and transient interactions that are essential to form such meso-scale assemblies.
This is particularly true during the assembly and stabilization of adhesion sites where
proteins triggering adhesion and connection to F-actin must be at a specific location
at a precise time in order to transmit mechanical forces.
To reveal the true molecular behavior at the base of seemingly stable cellular
structures, we are combining high-resolution microscopy (PALM-photo-activation
localization microscopy) and single protein tracking (spt) methods. In doing so, it is
now possible to characterize movements and transient interactions of proteins at a
spatial resolution well below the diffraction limit. Such techniques rely on photoactivable or photo-convertible fluorescent proteins and allow access to protein
dynamics within dense macromolecular complexes present in cells (e.g. adhesion
sites, actin meshworks). As an example, I will show how we deciphered the nanoscale
dynamic organization of integrins and talin directly within adhesion sites (1) and how
bulky membrane glycoproteins, which are part of the glycocalyx, increase integrinmediated adhesion (2). In those studies, we started to build the methodology
towards a molecular understanding of integrin function and activation during more
integrated mechano-biological processes and pathologies.
19
MODULES
1-Rossier, O., Octeau, V., Sibarita, J.-B., Leduc, C., Tessier, B., Nair, D., Gatterdam, V., Destaing, O.,
Albigès-Rizo, C., Tampé, R., Cognet, L., Choquet, D., Lounis, B., & Giannone, G. (2012) β1- and β3integrins display differential dynamic nano-organizations inside focal adhesions. Nature Cell Biology
14, 1057–1067
2-Paszek, M. J., Dufort, C. C., Rossier, O., Bainer, R., Mouw, J. K., Godula, K., Hudak, J. E., Lakins, J. N.,
Wijekoon, A. C., Cassereau, L., Rubashkin, M. G., Magbanua, M. J., Thorn, K. S., Davidson, M. W.,
Rugo, H. S., Park, J. W., Hammer, D. A., Giannone, G., Bertozzi, C. R., and Weaver, V. M. The cancer
cell glycocalyx mechanically primes integrin-dependent growth and survival. Nature (in press)
***
Mechanosensing of living cells: from single cell response to substrate rigidity to
collective cell migration
Benoît Ladoux / René-Marc Mège,
Institut Jacques Monod, Paris
Formation of living organisms results from mechanical processes that first affect its
basic components, tissue cells. As opposed to passive materials, living cells actively
respond to the mechanical perturbations occurring in their environment. Cell
adhesion and migration require the ability of cells to generate active forces. We will
first present physical concepts of single cell adhesion and the unexpected cellular
responses to mechanical cues such as stiffness sensing. We will present how the
development of microfabricated substrates of defined stiffness and topology as well
as microcaptor force arrays and cell confinement within patterned adhesive
extracellular matrix has allowed probing single cell response to mechanical cues. We
will discuss how probing of single molecule mechanical properties have allowed
identifying molecular mechanosensors at work at cell adhesion sites.
Besides the mode of single cell mechanosensing and migration, detailed knowledge
obtained over the past 30 years indicates that an additional mechanism is important
for cell cohesion and migration within tissues: the establishment of intercellular
junctions and the cell to cell transmission of mechanical forces. In particular we will
focus on the movement of cell groups consisting of multiple cells connected by cell–
cell junctions. This collective cell behaviour plays a pivotal role in regulating various
processes such as gastrulation, morphogenesis and tissue organization. By
combining experimental approaches and numerical modelling, we can study how
physical constraints modulate collective behaviours of epithelial cell sheets. We will
20
MODULES
discuss how these approaches can be used to probe the mechanical properties of
epithelial tissues.
***
Traction Force Microscopy: a tool box for cell mechanical phenotyping
Martial Balland,
Laboratoire interdisciplinaire de Physique, Université Joseph Fourier-Grenoble
Using a highly accessible style and format this lecture will provide an understanding
of the underlying principles, benefits, and limitations of traction force microscopy to
its application in cell biology. Without relying on complex mathematics we are going
to address the theoretical and experimental aspects of TFM and also explores new
advances such as patterned traction cytometry and its potentiality to link cell internal
architecture to their associated traction forces. Of course we'll also have to spend
some time on multiple appendices on soft substrate preparation and image
manipulation.
***
21
MODULES
Aspect modélisation physique et bio et interface surface ; TR Création MA-2-1 &
axe mécano Bio au GDR"
TR
Descripteurs 3D avancés pour l'analyse de la morphologie cellulaire
MA-2-2
Ateliers
 A15 - Suivi des tensions mécaniques au niveau des jonctions cellules-cellules
en utilisant des biosenseurs FRET
 A16 - Analyse dynamique des fibres de stress d’actine par photoconversion
et nano-ablation
 A17 - Microfluidique en microscopie à fluorescence champ large et confocale
 A42 - Microscopie multimodale (vidéo microscopie 4D, FRAP, TFM)
22
MODULES
MODULE 3 : MICROSCOPIE AUX DIFFERENTES ECHELLES DU VIVANT POUR UNE
BIOLOGIE INTEGRATIVE DE LA MOLECULE A L'ORGANISME
Lundi 6 octobre - 08h30
Coordination : Nadine Peyriéras et Julien Vermot
Multiscale Imaging and quantification of tissue morphogenesis: from gene to
forces
Yohanns Bellaïche,
Génétique et biologie du développement / Institut Curie - Paris
How proliferative tissues adopt their shape is a central question in developmental
biology. Many tissues undergoing extensive proliferation concomitantly adopt their
shape during development. Hence, the apparent coordination between growth and
morphogenesis underlies the development of organs and tissue of defined size and
shape adapted to their physiological function in the organism. The mono-layered
epithelium of the Drosophila pupa undergoes extensive proliferation and
morphogenesis to shape the Drosophila adult. To study the morphogenesis of the
dorsal thorax, we implemented an innovative multi-scale imaging method to follow
both cell dynamics (5 minutes time resolution, 200nm resolution) and tissue global
morphogenetic (global imaging of the tissue for up to 24 hours) in a living organism.
Qualitative observations suggest that the tissue undergoes extensive proliferation
(up to three cell cycles) while reshaping by convergence extension
movements. Image velocimetry and segmentation based image analysis allow us to
describe and quantify tissue morphogenesis from the cell level to the tissue level.
Using this novel model system, we have determined the role of the planar cell
polarity pathway Fat-Dachsous in epithelial tissue morphogenesis. More generally,
our results indicate how global gene expression patterns can trigger local changes in
mechanical cell properties to drive tissue morphogenesis.
***
23
MODULES
Using the ascidian Phallusia mammillata embryo to illuminate cell behaviour
Alex McDougall,
Laboratoire de Biologie du Développement de Villefranche-sur-mer, Observatoire
Océanographique, Villefranche-sur-mer, UPMC Univ Paris 06, and CNRS
Techniques:
3D reconstruction using Imaris, mathematical modeling to predict cleavage plane,
and a suite of GFP-based molecular tools created using the Gateway system to study
microtubules, chromosomes, cell shape, and other biological structures.
Phallusia model:
In the Observatoire Oceanologique de Villefranche sur Mer the European ascidian
Phallusia mammillata has been developed as a model system for cell biological
studies of early embryonic development since the 1980s. Ascidians are primitive
marine chordates that are a sister group of vertebrates. Twelve hours following
fertilization ascidians form a tadpole larva composed of around 2600 cells that swims
using a muscular tail to find a settlement site (generally in the shade). The simple
tadpole has just 36 muscles and a small central nervous system designed to respond
to light and gravity. I will bring you up to speed with how we have developed live cell
imaging techniques in early Phallusia embryos to study cell behaviour during
development and the challenges that remain to be addressed.
Biological questions:
Cell cycle control mechanisms affect cell number, cell size and cell position in
multicellular organisms. Cell number, cell size and cell position are all also regulated
during embryonic development but the mechanisms behind this regulation are not
fully elucidated. Ascidian embryos are a useful biological system in which to study
cell division in an embryonic setting because of their relative simplicity. Before
formation of the tadpole ascidian embryos gastrulate when they have 112 cells.
Every cell in these gastrula-stage embryos has a predetermined position due to what
is called an “invariant cleavage pattern”. One of our questions is what controls the
invariant cleavage pattern. Because there are a small number of cells (112) it is
possible to perform a 3D reconstruction coupled with mathematical modeling of
every cell to find out what mechanism lies behind this invariant cleavage pattern.
***
24
MODULES
Approches quantitatives appliquées à la mesure des forces mécaniques générées
dans l’embryon
Julien Vermot,
IGBMC - Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire- Illkirch
Nous décrirons les différentes approches mises en place pour mesurer les forces
mécaniques ainsi que les réponses cellulaires qui leur sont associées. Nous parlerons
des applications des outils associées à la microscopie du vivant pour caractériser et
quantifier les forces mécaniques générées au cours de la morphogénèse du système
cardiovasculaire. Nous nous focaliserons sur le modèle poisson zèbre et les
approches qui ont été développées pour comprendre l’impact des forces
hémodynamiques lors du développement des vaisseaux sanguins et du système
cardiaque.
***
Microscopies en Biologie du développement: observer, quantifier, reconstruire,
modéliser.
Nadine Peyriéras,
Institut de Neurobiologie Alfred Fessard, Gif sur Yvette
Il s'agit d'explorer les attentes de la biologie du développement en termes de
microscopie. Comment exploiter les moyens de la biologie cellulaire, voire de la
biologie structurale dans une approche intégrée des dynamiques multi-niveaux dans
un organisme en développement ? Observer, quantifier analyser l’évolution des
structures et la dynamique des processus biologiques in vivo dans l'organisme entier
est un défi renouvelé pour chaque organisme modèle et chaque stade de
développement. Nous discuterons les possibilités d’approches in vivo de la
dynamique des phénomènes biologiques aux différents niveaux d'organisation
(génétique, moléculaire, cellulaire, tissulaire) d'un embryon en développement dans
le cas de modèles animaux établis (Nématode, Drosophile, Oursin, Zebrafish, Souris)
où en exploration (Tuniciers, Amphioxus, Roussette, Lapin).
***
25
MODULES
Mechanotransduction in the Evolutionary Emergence of Complex Organisms
Emmanuel Farge,
Institut Curie, Paris
The modulation of developmental biochemical pathways by mechanical cues is an
emerging feature of animal development, but its involvement in evolution has non
been explored. Here, we reveal that a common mechanosensitive pathway involving
-catenin specifies early mesodermal identity at gastrulation in zebrafish and
Drosophila (representatives of deuterostomes and protostomes). Mechanical strains
developed by zebrafish epiboly and Drosophila mesoderm invagination trigger the
phosphorylation of -catenin tyrosine 667 (pY667--cat) that impairs its interaction
with E-cadherin in adherens junctions in the future mesoderm. This leads to the
release of -catenin into the cytoplasm and nucleus, where it triggers and maintains,
respectively, the expression of the zebrafish brachyury ortholog notail and of
Drosophila twist, both crucial transcription factors for early mesoderm
differentiation and development. The conserved role of this -catenin
mechanosensitive pathway in the establishment of mesodermal identity in zebrafish
and Drososphila at such a large evolutionary distance, and including an ecdysozoan,
suggests that the establishment of mesoderm identity during development by
mechanically induced Y667--cat phosphorylation, in response to the first
morphogenetic movements associated with gastrulation, could date back at least to
the last bilaterian common ancestor, more than 570 million years ago.
Evolutionary conservation of early mesoderm specification by mechanotransduction in Bilateria, T.
Brunet, A. Bouclet, et al, A. Plessis, E. Farge, Nature Communciations, 2013, 4:2821. doi:
10.1038/ncomms3821.
***
Fast in vivo imaging with light-sheet microscopy
Willy Supatto,
Laboratoire Optique et Biosciences, Inserm, Palaiseau
Multiscale and multidimensional study of biological processes tremendously
benefits from recent advances in live microscopy. In the past decade, light-sheet
microscopy has gained widespread recognition due to its distinct advantages for
26
MODULES
imaging live organisms: the ability to carry out fast, three-dimensional optical
sectioning with both an extended field of view and limited photodamage is a unique
advantage of light-sheet microscopy. In this lecture, we will first introduce the
principle and benefits of light-sheet illumination for live imaging. Its favorable
characteristics we be illustrated with recent applications in developmental biology
and in neurosciences. However, the imaging speed of this technique comes with
several limitations, including uneven image quality or limited imaging depth. To
adress these issues, several recent approaches will be presented, including
multiphoton excitation, Bessel beam illumination, or confocal slit detection.
***
An integrative biology platform for the measurement and computational
modeling of multicellular dynamics from 3D+time in vivo imaging of MA-3-1
animal early embryogenesis
Stratégies de manipulation d’organismes modèles pour l’imagerie in vivo
TR-3-1
in toto multi échelles et multimodale
Ateliers
 A18 - Nouvelles sondes biocompatibles pour l’étude de la morphogenèse de
l’embryon de zebrafish par microscopie biphotonique
 A19 - Recording neuronal activity in Drosophila neurons using bi-photon
microscopy and genetically encoded calcium sensors
 A20 - Utilisation de biosenseurs chez le poisson zèbre : comment rapporter
une activité biologique in vivo
 A21 - Etude de la repousse axonale chez la drosophile : protocoles
d'acquisition et analyse d'images
 A22 - Correlative light and electron microscopy with Array tomography
 A23 - Optimisation de la résolution axiale et de la pénétration dans
l’échantillon : nouveaux milieux de montage à haut index réfractaire
 A24 - Du microscope à l'analyse des neurones chez la souris: mosaïque et
Imagerie 3D sur neurones en culture et tissus en profondeur
 A25 - Imagerie multiphotonique grand champ : application à l’étude de
tumeurs dans leur contexte tissulaire
 A26 - Microscopie à feuille de lumière sur échantillons végétaux (jeunes
racines)
27
MODULES

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
A27 - Accéder au monde de la super-résolution sous illumination structurée
(SR-SIM)
A28 - L'imagerie de fluorescence haute résolution : du modèle murin au
patient
A29 - Apport de l'endomicroscopie confocale (ECM) à l'étude des lésions
inflammatoires intestinales chez l'animal et l'homme
A30 - Test de dispositifs à feuille de lumière "open source")
A31 - Application de la microscopie multiphotonique et de la technologie des
capsules cellulaires à l’imagerie des modèles tumoraux des mammifères
A32 - Apport de la microscopie multiphotonique pour l’imagerie en
profondeur
A33 - Ultramicroscope : Acquisition en feuille de lumière d’échantillons
transparents fixés
A34 - Multiscale analysis of morphogenesis
A35 - Imagerie multi couleurs et multi échelles d’embryons de poisson zébré
A36 - Manipulation optogénétique et imagerie 3D et 3D+temps d’embryons
de poisson zébré trangéniques de type “rainbow” ou « photo »
28
MODULES
MODULE 4 : OPTOGENETIQUE ET BIOSENSEURS
Mardi 7 octobre - 08h30
Coordination : Mathieu Coppey et Frank Riquet/Pierre Vincent
Chemical approaches for control and analysis of biological processes
Ludovic Jullien,
Département de Chimie, Ecole Normale Supérieure
The external control of biologically-active substrates with high spatial and temporal
resolutions has already strongly impacted many fields of Biology. This lecture will
illustrate how light can be used to control and analyze biological processes.
***
Sensing cellular cAMP levels by FRET: development and characterization of FRET
sensors and introduction of a fast FLIM assay
Kees Jalink,
The Netherlands Cancer Institute, Amsterdam,
The Netherlands, and the van Leeuwenhoek Centre for Advanced Microscopy (LCAM),
Amsterdam.
Förster (Fluorescence) Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful
tool to study the inner workings of the cell. FRET may occur when an excited donor
fluorophore is in very close proximity to a suitable acceptor: the excited state energy
is transferred from the donor to the acceptor, with a consequent increase in
emission from the acceptor and decrease in donor emission. Typical applications
include the readout, both in living cells and entire organisms, of protein-protein
interactions and the analysis of metabolic states of cells. The latter is carried out
using so-called FRET sensors: genetically engineered constructs that change FRET as
a function of the metabolic state (e.g., second messenger level, kinase activity, redox
potential) of the cell.
FRET is commonly read out either by detecting the ratio of the donor and acceptor
intensities (sensitized emission) or by detecting the excited state lifetime of the
donor, which decreases with increasing FRET (Fluorescence Lifetime IMaging or
FLIM). Sensitized emission is fast and simple, but due to channel leak-through and
29
MODULES
ongoing bleaching, it requires quite some calibration in order to arrive at
quantitative results. FLIM, on the other hand, is more immune to bleaching and
inherently quantitative, but typically much slower and less photon-efficient.
After introducing these techniques I will discuss our newest generation of FRET
sensors for cyclic Adenosine MonoPhosphate (cAMP). These sensors are based on
mTurquoise21, regarded as currently the best cyan fluorescent protein that features
excellent quantum yield, very high photostability and single-exponential decay. We
sandwiched the cAMP-binding protein EPAC between the mTurquoise2 donor and
tandem-mVenus acceptors to generate superior cAMP sensors2. In addition, we
generated a high-affinity version of this sensor, as well as cAMP sensors that are
optimized for FLIM readout.
In the final part of my presentation I will discuss a novel approach to dramatically
increase speed and photon efficiency of fluorescence lifetime detection3 which we
termed single-image FLIM (siFLIM). Using a new dedicated CCD camera with
electronically modulated pixels, we achieved FLIM readout at 20 frames per second.
Jeffrey Klarenbeek, Marcel Raspe, Kasia Kedziora, Bram van den Broek (NCI, Amsterdam), Sander de
Jong, Johan Herz (Lambert Instruments, Roden), Qiaole Zhao, Ted Young (Delft University of
Technology, Delft), Joachim Goedhart, Dorus Gadella (University of Amsterdam, Amsterdam); Jan
Bosiers (Teledyne-DALSA, Eindhoven).
Supported by grants from Agentschap NL, ERC and NWO.
1Goedhart et al, Nat Commun. 2012; 2Klarenbeek et al, 4th-generation cAMP FRET sensors; submitted;
3Raspe et al, siFLIM: Single Image Frequency-Domain FLIM provides fast and photon-efficient lifetime
data; submitted.
***
Contrôle spatiotemporel de la signalisation intracellulaire avec l’optogénétique
Mathieu Coppey,
L’optogénétique a révolutionné la neurobiologie en permettant de contrôler
l’activité de neurones par stimulation optique. Grace aux canaux ioniques sensibles
à la lumière, il est maintenant possible de stimuler sélectivement des neurones ou
même d’effectuer des stimulations subcellulaires avec un excellent contrôle spatial
et temporel. La même révolution est en train de s’opérer pour la biologie cellulaire
grâce au développement récent de protéines intracellulaires dont l’activité est
contrôlée par la lumière. Parmi ces outils moléculaires encodées génétiquement, les
30
MODULES
dimers activable par la lumière semblent être les plus prometteurs. Leurs versatilité
permet entre-autres : de manipuler la localisation de protéines, de contrôler la
formation d’agrégats, d’induire l’expression d’un gène cible, ou encore de séquestrer
une protéine. Ces différentes modalités de contrôle peuvent être utilisé pour
perturber spatialement et temporellement un processus biologique tel que l’activité
d’une voie de signalisation, avec une résolution allant jusqu’au micron et à la
seconde. Je présenterai au cours de cet exposé une revue actuelle de ces outils et de
leurs applications, en insistant en particulier sur les contraintes de microscopie ainsi
que sur les limites de ces systèmes en termes de résolution. Enfin, je montrerai les
nouvelles questions biologiques qui émergent grâce à ces outils, en prenant pour
exemple la dissection quantitative subcellulaire de la transduction d’un signal (RhoA
vers la polymérisation de l’actine).
***
Two-photon imaging of visual neural circuits in living zebrafish
Christoph Gebhardt
A major objective of modern neuroscience is to understand how a set of
environmental stimuli is detected, integrated and transformed into a meaningful
behavioral response by multiple layers of neural circuits. The relationship between
singular stimuli and subsequent behavioral responses is often adequately
established but how the intermediary neural circuits compute this transition is
insufficiently understood.
We use as a model system the zebrafish larva because it shows, for one, already at
very early stages a rich repertoire of complex visually evoked behaviors, like e.g. prey
capturing. Moreover, due to their optical transparency at these stages, zebrafish
larvae are perfectly suited to optically record and manipulate the activity of many
neurons.
To identify brain regions that show a specific activity response to a particular visual
stimulus, we use new genetically encoded calcium indicators (GCaMPs), in
combination with two-photon microscopy. The change of fluorescence in neurons
throughout the larva brain is then recorded while the animal is being visually
stimulated with an OLED device providing us with brain activity maps that are
stimulus specific.
31
MODULES
Eventually, creating these brain activity maps will help us bridging the gap in
understanding how neural circuits are computing the crucial transition between
environmental stimuli input and behavioral output.
***
Fluorescent Peptide Biosensors for probing kinase activities – a chemical toolbox
for cancer diagnostics and drug discovery
May C. Morris,
Institut des Biomolécules Max Mousseron-UMR5247, Montpellier,
One of the challenges of modern biology and nanomedicine is to visualize
biomolecules in their natural environment, in real-time and in a non-invasive fashion,
so as to gain insight into their behaviour in both physiological and pathological
conditions. To this aim, the development of molecular probes to image specific
targets in a dynamic and reversible fashion has enabled new technologies for
imaging specific signaling pathways, for monitoring cancer biomarkers and assessing
the response to therapeutics. In particular, fluorescent biosensors constitute potent
tools for probing biomolecules and their dynamic behaviour in complex biological
samples, living cells and organisms. Moreover they are well suited for highlighting
molecular alterations associated with pathological disorders, thereby offering means
of implementing sensitive and alternative technologies for diagnostic purposes.
Cyclin-dependant kinases (CDK/cyclins) constitute a class of heterodimeric kinases
whose members play a central role in coordinating cell cycle progression, as well as
a wide variety of essential non-cell cycle functions including transcription, neuronal
differentiation and metabolism. CDK/Cyclins are hyperactivated in most human
cancers, thereby contributing to sustain proliferation of cancer cells and constituting
attractive pharmacological targets for anticancer therapeutics. In order to probe
abundance, activity and conformational activation of cyclin-dependent kinases our
group has developed a toolbox of peptide and protein-based fluorescent biosensors
which report on CDK/Cyclin levels, activities and conformational states. This
generation of non-genetic fluorescent biosensors relies on synthetic probes whose
spectral properties are sensitive to environmental changes, thereby offering a
straightforward means of sensing alterations in kinase levels and activities with a
high level of versatility. The design, engineering, applications and limitations of these
non genetic fluorescent biosensors in vitro and in vivo will be described, with
particular focus on drug discovery and cancer diagnostics. We will further present
32
MODULES
recent developments of photoactivatable derivatives and synthetic platforms for
multisensing purposes.
References :
[1] Morris M.C. Fluorescent Biosensors of Intracellular Targets: from genetically-encoded reporters to
modular polypeptide probes. Cell Biochem.Biophys. 56,19-37(2010)
[2] Kurzawa L, Pellerano M, Coppolani JB, Morris MC.Fluorescent peptide bioprobe for quantification
of cyclin-dependent kinases in living cells, PloS ONE, 6(10):e26555.
[3] Van, T.N.N. & Morris, M.C. Fluorescent sensors of protein kinases: from basics to biomedical
applications.Progr. Mol. Biol. Trans. Science, 113, 217-274 (2013)
[4] Morris MC. Fluorescent Biosensors - Probing Protein Kinase Function in Cancer and Drug Discovery.
Biochim Biophys Acta 1834(7),1387-95 (2013)
[5] Prével, C., Pellerano, M., Van, T.N.N., Morris, M.C. Fluorescent Biosensors for High Throughput
Screening of Protein Kinase Inhibitors. Biotechnology J. 9, 253-65 (2014)
[6] Van T.N.N., Pellerano, M., Lykaso S., Morris, M.C. Fluorescent protein biosensor for probing
CDK/Cyclin activity in vitro and in living cells. ChembioChem (2014) doi.org/10.1002/cbic.201402318
***
Application de biosenseurs FRET à l’étude de la voie AMPc/PKA dans les myocytes
cardiaques
Grégoire Vandescasteele
Signalisation des Nucléotides Cycliques et Physiopathologie Cardiaque, UMR-S 769,
Université Paris Sud- Faculté de pharmacie
La voie AMPc/PKA joue un rôle majeur dans le contrôle de l’activité du cœur par le
système nerveux autonome et différentes hormones. La noradrénaline, le
neurotransmetteur du système nerveux sympathique, se fixe sur les récepteurs βadrénergiques couplés positivement aux adénylates cyclases et provoque la
synthèse d’AMP cyclique dans les myocytes cardiaques. L’augmentation d’AMPc
active la protéine kinase AMPc-dépendante, qui phosphoryle de nombreuses cibles
dans différents compartiments subcellulaires : protéines du couplage excitationcontraction au niveau du sarcolemme, du réticulum sarcoplamique et des
myofilaments ou encore certains facteurs de transcription dans le noyau. Les
concentrations d’AMPc sont finement régulées par une famille d’enzymes, les
phosphodiestérases, qui dégradent ce second messager et contrôlent l’intensité, la
durée et la localisation des signaux AMPc dans les myocytes cardiaques. La
présentation montrera comment l’utilisation de biosenseurs basés sur le transfert
d’énergie de fluorescence par resonance (FRET) permet de mesurer en temps réel
33
MODULES
les variations d’AMPc et d’activité PKA et d’étudier les mécanismes qui régulent cette
voie de signalisation dans différents compartiments du myocyte cardiaque.
***
Sondes et actuateurs encodés génétiquement :
Approche optogénétique intracellulaire et biosenseurs FRET
MA-4-1
Outils Chimiques pour la photorégulation d’activités biologiques
MA-4-2
Ateliers
 A15 - Suivi des tensions mécaniques au niveau des jonctions cellules-cellules
en utilisant des biosenseurs FRET
 A20 - Utilisation de biosenseurs chez le poisson zèbre : comment rapporter
une activité biologique in vivo
 A37 - Real time visualization of MAP kinase ERK activity and localization
dynamics in living cells using multi-parameters FRET imaging
 A38 - Illumination structurée pour manipulation optogénétique et
photopatterning
 A39 - Contrôle et visualisation de protéines in vitro par optogénétique
34
MODULES
MODULE 5 : DYNAMIQUE MOLECULAIRE
Mercredi 8 octobre - 08h30
Coordination : Sandrine Lévêque-Fort
Mapping Molecular Interactions and Transport in Living Cell via Image Correlation
Methods
Paul W. Wiseman,
Departments of Physics and Chemistry McGill University Salle Atlantique – Cours plénier
Image correlation methods provide a new window of analysis for measurement of
protein-protein interactions and macromolecular transport properties from
fluorescence images of living cells. These approaches are based on space and time
correlation analysis of fluctuations in fluorescence intensity within images recorded
as a time series on a laser scanning or TIRF microscope. We recently introduced
spatio-temporal image correlation spectroscopy (STICS) which measures vectors of
protein flux in cells based on the calculation of a spatial correlation function as a
function of time from an image time series. Here we will describe the application of
STICS and its two color extension, spatio-temporal image cross-correlation
spectroscopy (STICCS), for measuring transport maps of adhesion related
macromolecules such as integrin, alpha-actinin, paxillin, talin, and vinculin within, or
associated with the basal membrane in living fibroblast and CHO cells. These
measurements have allowed us to propose a model for the molecular clutch that
regulates connections between the extracellular matrix, integrins in the membrane
and the cytoskeleton during cell protrusion and migration. We will also introduce
application of STICS with a moving time window to generate time dependent vector
maps which reveal "transport waves" of vinculin, talin and actin between podosome
adhesion structures in human immune dendritic cells. Finally , if there is time, we will
also highlight recent advances we have made with a new form of reciprocal (k-) space
ICS, called kICS, that allows us to measure unbiased transport coefficients of
U2OS on LN
fluorescently labeled membrane proteins even if there is complex photophysics
(such as nanoparticle emission blinking) of the probe. We will describe kICS
measurements of the transport properties of quantum dot labeled receptors in the
cell membrane as well as determination of clustering properties of QD labeled
receptors based on kICS correlation studies of changes in the nanoparticle blinking.
35
MODULES
Cross-correlation velocity map (rab) of retrograde co-transport of integrin alpha6EGFP and paxillin mKO during focal adhesion turnover in a migrating U2OS
osteosarcoma cell plated on laminin. Measured by TIRF microscopy and STICCS
analysis.
***
Protein-protein interactions at the cellular interface: Biophotonics approaches to
live cell FRET measurements
Simon M. Ameer-Beg,
King's College London, Londres
The control of cellular function and intracellular signaling is clearly complex and
highly regulated. Many signaling cascades have been extensively investigated and
the relationships between proteins have been partially delineated using biochemical
techniques. Microscopical techniques coupled with immunocytochemical methods
have allowed researchers to image the relative localization of multiple signaling
molecules. However, both types of measurement assume (different degrees of) cell
homogeneity, which means that important variations in behaviour across the cell,
and localisation of signaling events to specific parts of the cell, will be missed. Many
intracellular structures are heterogeneous below the 200 nm length scale resolvable
by widefield microscopy. Measurement of the near-field localization of protein
complexes may be achieved by the detection of Förster resonant energy transfer
(FRET) between protein-conjugated fluorophores1. FRET is a non-radiative, dipoledipole coupling process whereby energy from an excited donor fluorophore is
transferred to an acceptor fluorophore in close proximity2,3. The dependence of the
coupling efficiency varies with the inverse sixth power of the distance between
36
MODULES
acceptor and donor and is typically described in terms of the Förster radius (distance
at which the efficiency of energy transfer is 50%), typically of the order 1-10 nm.
Since the process depletes the excited state population of the donor, FRET will both
reduce the fluorescence intensity and fluorescence lifetime of the donor. The
advantage of using donor fluorescence lifetime to detect FRET is that the method is
independent of fluorophore concentration, donor-acceptor stoichiometry and
optical path length and is therefore well suited to studies in intact cells4,5. Combined
with confocal or multiphoton techniques to examine the localization of effects in
cellular compartments, FLIM/FRET allows us to determine populations of interacting
protein species on a point-by-point basis at each resolved voxel in the cell6-8. The
use of ‘ensemble’ FRET/FLIM techniques to probe protein-protein interactions in
intact cells is now an established technique9. We and others have adapted the FLIMbased protein-protein interaction assays to directly monitor post-translational
modifications (PTMs) of proteins (such as phosphorylation by PKC10,
ubiquitination11 and sumoylation12) within live and fixed cells.
In this presentation, I will discuss recent developments in high-speed, multiphoton
FLIM that allows us to image fluorescence lifetime changes due to FRET in a fraction
of a second using multifocal multiphoton microscopy. Examples of protein-protein
interactions in the ErbB network will be shown along with future developments.
Furthermore, I will present a recently developed FRET technique13, which allows
quantification of protein interaction by acceptor fluorescence anisotropy (aaFRET)
and shows significant promise in simplicity and speed. aaFRET provides a direct readout of interaction with a good dynamic range and also permits elimination of false
positives linked to direct excitation of the acceptor14. In this session, I will show that
this analysis method is comparable to FLIM for quantification of protein-protein
interactions by FRET – and offers significant advantages in terms of speed and
dynamic range at typically observed FRET efficiencies.
1
2
3
4
5
6
7
8
Jares-Erijman, E. A. & Jovin, T. M. FRET imaging. Nat Biotechnol 21, 1387-1395 (2003).
Förster, T. Intermolecular energy migration and fluorescence. Ann. Physik. 2, 55 (1948).
Stryer, L. Fluorescence Energy Transfer as a spectroscopic ruler. Ann. Rev. Biochem. 47, 819-846
(1978).
Ng, T. et al. Imaging protein kinase Ca activation in cells. Science 283, 2085-2089 (1999).
Ng, T. et al. PKCa regulates b1 integrin-dependent cell motility through association and control of
integrin traffic. Embo J 18, 3909-3923 (1999).
Parsons, M. et al. Spatially distinct binding of Cdc42 to PAK1 and N-WASP in breast carcinoma cells.
Mol Cell Biol 25, 1680-1695 (2005).
Peter, M. et al. Multiphoton-FLIM quantification of the EGFP-mRFP1 FRET pair for localization of
membrane receptor-kinase interactions. Biophys J 88, 1224-1237 (2005).
Duncan, R. R., Bergmann, A., Cousin, M. A., Apps, D. K. & Shipston, M. J. Multi-dimensional timecorrelated single photon counting (TCSPC) fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) to
detect FRET in cells. Journal of Microscopy 215, 1-12 (2004).
37
MODULES
9
10
11
12
13
14
Levitt, J. A., Matthews, D. R., Ameer-Beg, S. M. & Suhling, K. Fluorescence lifetime and polarizationresolved imaging in cell biology. Current Opinion in Biotechnology 20, 28-36, doi:DOI
10.1016/j.copbio.2009.01.004 (2009).
Treanor, B. et al. Microclusters of inhibitory killer immunoglobulin-like receptor signaling at natural
killer cell immunological synapses. J Cell Biol 174, 153-161 (2006).
Ganesan, S., Ameer-beg, S. M., Ng, T. T. C., Vojnovic, B. & Wouters, F. S. A dark yellow fluorescent
protein (YFP)-based Resonance Energy-Accepting Chromoprotein (REACh) for Forster resonance
energy transfer with GFP. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of
America 103, 4089-4094, doi:DOI 10.1073/pnas.0509922103 (2006).
Morris, J. R. et al. The SUMO modification pathway is involved in the BRCA1 response to genotoxic
stress. Nature 462, 886-U877, doi:Doi 10.1038/Nature08593 (2009).
Matthews, D. R. et al. A multi-functional imaging approach to high-content protein interaction
screening. PLoS One 7, e33231 (2012).
Rizzo, M. A. & Piston, D. W. High-contrast imaging of fluorescent protein FRET by fluorescence
polarization microscopy. Biophysical Journal 88, L14-L16, doi:DOI 10.1529/biophysj.104.055442
(2005).
***
Location, location, location: the importance of space for intracellular cell
biochemistry
Hugues Berry,
INRIA - équipe BEAGLE, Lyon
Because the molecules in cells interact only when they meet, the way by which they
actually move may have deep impact on the inner life of the cell. More often than
not, we neglect this issue by considering that cell biochemical and signaling pathways
are static objects with no real spatial extent. Experimental as well as most modeling
approaches thus rely on mean-field equations (“mass-action laws”) which assume
that intracellular spaces are diluted, perfectly stirred and spatially homogeneous.
However, single-cell (and sometimes single tracker) experiments consistently report
that diffusion in most intracellular compartments (membranes, cytoplasm, nucleus)
is anomalous (i.e. not Brownian) because of macromolecular crowding and spatial
inhomogeneity (i.e. motion properties depend on the location). During this class, I
will present investigations of the effects of spatial properties on two examples: the
ligand-receptor binding equilibrium and intracellular protein aggregation. Those
works indicate that, even in bacteria, the spatial organisation of the properties of
molecular motion can be a crucial regulator of intracellular dynamics.
***
38
MODULES
Modeling, simulation and analysis of molecular dynamics in cell biology
David Holcman,
ENS Paris - Département de biologie - Paris
1-I will introduce and summarize methods for extracting data from live cell imaging,
Single Particle Tracking, Superresolution trajectories and electrophysiology.
2-We will discuss physical and mathematical models of diffusion, trafficking and
transport as well as classical theory such as narrow escape, normal and anormal
diffusion and how to design rationally stochastic simulations to answer relevant
questions in molecular and cellular biology.
***
Protein interaction and transport maps of live cell nuclei using a single plane
illumination microscope with fluorescence correlation spectroscopy
Jen Krieger,
Biophysics of Macromolecules (DKFZ)
Proteins acting on DNA need to penetrate a dense network of chromatin and
associated macromolecules in the cell nucleus to access their target sites.
Intracellular mobility of proteins is characterized by diffusion coefficients of the
order of 1-100 μm2/s, leading to millisecond time scales for movement on the
submicrometer scale.
Here we show results from single plane illumination microscopy based fluorescence
correlation spectroscopy (SPIM-FCS), a new method that combines the fast time
resolution of FCS with the possibility of acquiring the mobility data in parallel on an
entire two-dimensional cross-section. This will then provide diffusion coefficients,
flow velocities and concentrations in an imaging mode.
Extending this technique to two-color fluorescence cross-correlation spectroscopy
(SPIM-FCCS) also allows measuring molecular interactions in an imaging mode. A
new avalanche diode array detector allows acquisition of 512*128 pixel images at
150000 frames per second, opening the way to direct imaging of the diffusion of
small proteins and ligands.
As a model system for protein-protein interactions and DNA binding we studied cEcole thématique interdisciplinaire du CNRS : Microscopie Fonctionnelle en Biologie
39
MODULES
Fos and c-Jun, two components of the AP-1 transcription factor, which form a
heterodimer and whose interaction and diffusion behavior we had studied earlier by
point-focus FCS. We obtained mobility maps of c-Fos-EGFP and c-Jun-mRFP fusion
proteins in HeLa cells, and simultaneously recorded interaction maps that show
heterodimer formation. We find that the regions of the cell nucleus where the
proteins show strong dimerization strongly correlate with the regions of
immobilization, i.e. DNA binding. This shows that dimerization is a prerequisite for
target binding and that most of the dimerized transcription factor is also bound to
DNA.
In a second example, we investigated the dynamical changes in binding and mobility
of the retinoid acid receptor (RAR-RXR) upon activation by ligand binding. Activation
shifts the population of the fluorescently labeled receptor into a slower-moving
state, both increasing the fraction of the receptor population in this state and
decreasing its diffusion coefficient.
***
Investigating molecular interactions through the Number and Brightness
approaches
Emmanuel Margeat
Centre de Biochimie Structurale, UMR 5048 CNRS, U1054 INSERM, Universités de
Montpellier, France
In fluorescence fluctuation microscopies, while the autocorrelation function
describes the temporal fluctuation of the fluorescence signal, several other methods
rely on the analysis of the amplitude of these fluctuations. These analysis procedures
allow extracting from the fluorescence fluctuation data the average number N and
the molecular brightness  of the molecule in the observation volume, related to
each other through the relation:

where k
k
N
is the average number of photon counts per unit of time, and is
expressed as the mean count rate per molecule.
I will review here different methods that have been developed to extract the number
and brightness values from fluorescence fluctuation data in static or imaging mode,
such as the PCH (photon counting histograms) or the N&B methods. I will also cover
40
MODULES
how they can be extended to multicolour detection to investigate molecular
interactions, and provide several examples of biological applications.
***
Exploring biomolecular dynamics with single pair FRET
MA-5-1
Interaction moléculaire en microscopie
MA-5-2
The analysis and simulation of spatial trajectories of intracellular and
membrane proteins: methodological aspects
MA-5-3
Ateliers
 A1 - 2D Single Particule Tracking
 A16 - Analyse dynamique des fibres de stress d’actine par photoconversion
et nano-ablation
 A21 - Etude de la repousse axonale chez la drosophile : protocoles
d'acquisition et analyse d'images
 A37 - Real time visualization of MAP kinase ERK activity and localization
dynamics in living cells using multi-parameters FRET imaging
 A40 - Optique adaptative et microscopie de fluctuations de fluorescence
 A41 - Mesure de concentrations surfaciques de molécules par spectroscopie
à corrélation d'images
 A43 - Analyse de la dynamique moléculaire par corrélation d’images de
fluorescence
 A44 - Analyse de la diversité des réponses calciques individuelles dans une
population de cellules non adhérentes par la méthode MAAACS (Methods
for Automated and Accurate Analysis of Cell Signals)
 A45 - Analyser la migration cellulaire au moyen de logiciels libres
 A46 - Image processing methods for the temporal analysis of moving
particles
 A47 - Multiplex FRET : suivi simultané d’activités biochimiques par FLIM deux
couleurs
41
MODULES
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

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
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



A48 - Comparaison de différentes méthodes de détermination des
mouvements moléculaires dans la cellules : Méthodes corrélatives et retour
de fluorescence
A49 - Dynamique de formation de nanotubes et transport transcellulaire
dans un modèle neuronal par imagerie à haute-résolution spatio-temporelle
A50 - Mesure de la dynamique d’association de protéines sur les
microtubules par combinaison d’acquisition en spinning-disk FRAP et de
tracking de particules
A51 - FCS et FRET-FLIM : approche combinée en cellules vivantes, acquisition
et analyse
A52 - Analyse des expériences de FLIM et de FRET in vivo par la distance de
transport
A53 - Suivi comparatif de la dynamique et des interactions protéiques au
niveau du cytoplasme par microscopie de temps de vie de fluorescence
(FLIM) et spectroscopie corrélative de fluorescence (FCS)
A54 - Molecular interactions in vivo by 2 Photons fluctuation microscopy
A55 - Suivi en "live" de depolymerisation/repolymerisation de microtubules
par changements thermiques ultra rapides
A56 - Mobilité intracellulaire de protéines autofluorescentes dans un
système de microscopie à feuille de lumière
A57 - FRET : Quels écueils et comment les éviter ?
A58 - Méthodes de marquage en fluorescence pour l'étude de la dynamique
de la chromatine en cellules vivantes
A59 - Imagerie rapide de foyers nucléaires sur cellules vivantes et
quantification/dénombrement
de
ces
foyers
automatisée
Acquisition/Alignement/Analyse et Quantification
A60 - MitoDendra : une sonde fluorescente photoconvertible
spécifiquement adaptée à l’étude de la dynamique mitochondriale
42
MODULES
MODULE 6 : CONTROLE DES ONDES POUR L'IMAGERIE DU VIVANT – GDR ONDES
Jeudi 9 octobre - 08h30
Coordination : Sophie Brasselet et Serge Monneret
Adaptive optics for microscopy
Delphine Débarre,
Laboratoire Interdiciplaire de Physique, Grenoble
Optical microscopy is an essential tool for imaging cells and tissues, but its
penetration within tissues is often limited to a few tens or hundreds of microns in
depth. Indeed, biological samples are usually very heterogeneous and quickly distort
the image as one focusses deeper into a sample. Over the past ten years, adaptive
optics has become a promissing tool to compensate for this deformation and
increase the penetration depth within complex samples.
I will describe the basic principle of adaptive optics and present some examples of
application to tissue imaging. I will then discuss the situations where adaptive optics
is best suited and the current limitations of the method. Finally I will conclude with
recent and ongoing developments and their perspectives.
***
Coupling optics and acoustics for biologial tissue sensing and imaging
Emmanuel Bossy,
Institut Langevin – ESPCI, Paris
The combination of optics and acoustics in the context of biomedical research has
led in recent years to the development of several multi-wave approaches for tissue
characterization. The rationale for combining optics and acoustics for tissue
characterization are various, such as to compensate limitations of single-modality
approaches or to provide physical parameters of complementary nature. After a
brief comparative introduction to the basics of light and sound propagation in tissue,
this presention will discuss several examples of multi-wave imaging modalities
coupling light and sound, such as photoacoustic and acousto-optic imaging.
43
MODULES
***
Contrôle de front d'onde appliqué à l'imagerie en milieux complexe
Silvain Gigan,
Institut Langevin – ESPCI, Paris
La diffusion de la lumière en milieu complexe, en particulier dans les milieux
biologiques, est une des limites majeures à l'imagerie en profondeur. Dans les tissus,
la lumière ballistique peut être utilisée pour la microscopie (OCT, Microscopie
multiphotonique ou confocale) mais s'atténue exponentiellement avec la
profondeur, limitant aux couches superficielles. Au delà, la lumière est
multidiffusée.
Ces dernières années, le contrôle de front d'onde a émergé comme une technique
très puissante, permettant de concentrer la lumière diffusée sur une tache de
diffraction, le balayer, ou reconstruire une image. Ces techniques permettent donc
de concentrer la lumière en profondeur. Je présenterai les différentes techniques
utilisées (conjugaison de phase, optimisation du front d'onde, matrice de
transmission), utilisées pour former une image soit à travers un milieu diffusant, soit
à travers une fibre multimode (permettant alors de l'utiliser comme un endoscope
très compact). Je présenterai également les différents challenges et les progrès
récents vers l'imagerie biologique en profondeur.
***
Micro-endoscopie sans marquage – Label free micro-endoscopy
Hervé Rigneault,
Institut Fresnel, Marseille
Optical microscopy imaging depth is bounded to few hundreds of microns in tissues
due to light scattering and absorption. Bringing the panel of ‘functional microscopy’
techniques (Fluo, FLIM, FRAP, Raman, 2-Photon, SHG, THG, CARS…) at the end of an
optical fiber that could penetrate deep in tissues, appears as a key challenge for the
next decade. I will review the problems arising when light is delivered at a fiber end
and signal is collected by the same to perform biomolecular analysis. Then, I will
44
MODULES
propose some strategies to overcome these limitations and show our recent efforts
results to put FCS, Raman, TPEF, SHG and CARS in endoscopes.
***
Elastographie : une technique de tomographie des propriétés mécaniques des
tissus mous
Stefan Catheline,
LabTAU, Lyon
L’élastographie, encore appelée sismologie du corps humain, est une modalité
d’imagerie médicale récemment implémentée sur les échographes commerciaux. La
fusion de deux thématiques de recherche fondamentales et appliquées que sont
l’élastographie et le retournement temporel a profité aux deux parties : on
s’attachera donc à montrer d’une part, ce que l’élastographie, technique d’imagerie
médicale a pu apporter dans la compréhension des mécanismes à l’œuvre dans une
expérience de retournement temporel dans les solides [1] et d’autre part, comment
le retournement temporel peut être employé pour dresser des tomographies de
l’élasticité du corps humain [2],[3]. En effet, le champ élastique permanent qui existe
dans le corps humain à cause d’activités musculaires recèle des informations sur les
paramètres mécaniques (élasticité, viscosité) du corps humain. La clé pour extraire
ces informations de ce champ physiologique complexe, diffus, réverbéré, est le
retournement temporel. Cette technique est connue en sismologie sous le nom de
corrélation de bruit sismique.
***
Opto-acoustique pour sonder les propriétés mécaniques d'une cellule
Bertrand Audoin,
Département d’Acoustique Physique, I2M, UMR CNRS 5295, Université de Bordeaux,
Les ondes élastiques sont utilisées couramment pour imager le vivant et mesurer les
propriétés mécaniques de tissus. Typiquement, dans un échographe médical, les
fréquences acoustiques sont de l’ordre du MHZ et la résolution est submillimétrique. Or l’opto-acoustique permet d’accéder à des fréquences beaucoup
45
MODULES
plus élevées et donc de sonder les propriétés mécaniques (élasticité, adhésion) d’un
milieu biologique à une échelle sub-cellulaire.
L'acoustique picoseconde est une technique pompe-sonde résolue en temps qui
utilise des impulsions laser courtes (qq.100 fs) pour la génération et la détection de
phonons cohérents de fréquences dans la gamme GHz-THz Les développements de
la technique ont été initiés par des recherches en physique du solide et les
principales applications industrielles se trouvent dans le domaine de la
microélectronique. Nous avons développé les premières applications de la technique
d’acoustique picoseconde à la biologie pour accéder aux propriétés mécaniques de
la cellule à une échelle sub-cellulaire et pour, à terme, les imager [1]. La conversion
photo acoustique résulte de l'absorption des impulsions lumineuses par un matériau
transducteur, par exemple métallique. Le champ de déformation transitoire induit
des perturbations de l’indice de réfraction du milieu qui sont détectées par la mesure
de la trace temporelle du changement relatif de réflectivité.
Pour des milieux de propagation suffisamment transparents la technique
d’acoustique picoseconde permet de détecter dans le domaine temporel des
oscillations, résultant de l’interaction Brillouin, qui donnent accès à la célérité des
ondes acoustiques, laquelle est liée à la compressibilité du milieu [2]. De façon
complémentaire, la technique permet de mesurer la réflexion des ondes acoustiques
à une interface entre une couche mince et une cellule. Nous sondons alors avec une
résolution limitée par l’optique, donc micronique, l’adhésion inhomogène d’une
cellule sur un biomatériau [3].
[1] C. Rossignol, N. Chigarev, M. Ducousso, B. Audoin, G. Forget, F. Guillemot, M.-C. Durrieu, In Vitro
picosecond ultrasonics in a single cell, Appl. Phys. Lett. 93, 123901 (2008).
[2] O. Zouani, T. Dehoux, M.-C. Durrieu and B. Audoin, Universality of the network-dynamics of the cell
nucleus at high frequencies, Soft Matter, (à paraître).
[3] M. Abi Ghanem, T. Dehoux, O. F. Zouani, A. Gadalla, M.-C. Durrieu and B. Audoin, Remote optoacoustic probing of single-cell adhesion on metallic surfaces, J. Biophotonics 7(6), 453 (2014).
***
46
MODULES
Mesures quantitatives avec optique adaptative
MA-6-1
Imagerie du Petit Animal : mesures en profondeur et mesures
multiparamétriques : quels outils aujourd’hui ?
MA-6-2
Ateliers
 A40 - Optique adaptative et microscopie de fluctuations de fluorescence
 A61 - Contrôle et imagerie de la température cellulaire
 A62 - Microscopie Multiphotonique Multimodale (TPEF / SHG-pSHG / THG /
Mélange d'Ondes / Photoablation)
 A63 - Tomographie par imagerie de phase incohérente et optique adaptative
 A64 - Optique adaptative grand publique : comment améliorer la PSF en
maitrisant les paramètres expérimentaux de base
 A65 - Microscopie Raman Stimulée (CARS) : initiation à l'aspect source laser
et instrumentation
47
MODULES
MODULE 7 : NOUVELLES IMAGERIES ET MICROSCOPIES MUTLIMODALES
Vendredi 10 octobre - 08h00
Coordination : Frederic Bolze et Laurent Héliot
Imaging with Coherent anti-Stokes Raman Scattering (CARS) microscopy
Andreas Zumbusch,
Department Chemie, Universität Konstanz, Germany Salle Atlantique – Cours plénier
Fluorescence microscopy is one of the most important tools in biophysics. Most
prominent among the various techniques is. It is a very widespread technique with
which sensitivities down to the single molecule detection can be accomplished. The
necessity to label the samples and inevitable photobleaching, however, limits the
scope of fluorescence microscopy in many applications.
CARS microscopy as a label free approach1 is an attractive alternative. While it does
not feature the high sensitivity of fluorescence microscopy, its contrast generation
based on vibrational molecular spectra circumvents both the labeling and the
photobleaching problem. This talk will present the principles of CARS microscopy and
highlight examples for biomedical, biological and material scientific applications of
CARS microscopy. In some more detail, the application of CARS microscopy to studies
of intracellular dynamics of lipid droplets will be described. 2,3 Lipid droplets have
only recently been recognized as organelles with an intricate internal structure and
rich dynamics both with respect to their localization as well as to their size. CARS
microscopy is an ideal tool for studying lipid droplets in live cells and animals as it
allows long term high resolution microscopy on the same sample over many days.
Our results allow a quantitative description of lipid droplet fusion and show that lipid
droplet fusion is a slow and regulated process.
1
M. Müller, A. Zumbusch "Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) microscopy"
ChemPhysChem, 8 (2007) 2156-2169
2 C. Jüngst, M. Klein, A. Zumbusch “Long-term live cell microscopy studies of lipid droplet fusion
dynamics in adipocytes” J. Lipid Res. 2013 54:(12) 3419-3429.
3 M. Paar, C. Jüngst, N.A. Steiner, C. Magnes, F. Sinner, D. Kolb, A. Lass, R. Zimmermann, A. Zumbusch,
S.D. Kohlwein, and H. Wolinski “Remodeling Of lipid droplets during lipolysis and growth in
adipocytes” J. Biol. Chem., 287 (2012) 11164-11173.
48
MODULES
Multimodal non-linear optical microscopy of a lesion in a spinal cord of a rat. Left: Top view
on a 20 μm cryosection. The CARS signal (red) shows the distribution of lipid, the two photon
fluorescence signal (green) is observed from phagocytic microglia, and the second harmonic
signal (blue) is generated by collagen fibers. The image was created by stitching of multiple
z-stacks. Scale bar: 5 mm. Right: Close-up view of one z-slice. Scale bar: 1 mm.
***
Structural imaging in cells and tissues by polarized fluorescence and nonlinear
microscopy
Sophie Brasselet,
Institut Fresnel, Marseille France - [email protected]
Multimodal optical imaging is reaching today a mature stage, using the combination
of fluorescence and nonlinear coherent optical contrasts to reveal morphological
features in biological tissues from fixed samples to in vivo studies. While imaging can
guide interpretation through morphological observation at the optical diffraction
scale, providing more refined information, for instance on the structural architecture
of bio-molecular assemblies, requires challenging instrumentation developments.
Reporting molecular organization in crystals, proteins aggregates or lipid membranes
down to the nano scale is fortunately made possible using polarization resolved
optical microscopy, taking advantage of the orientation-sensitive coupling between
optical excitation fields and transition dipole moments [1]. In this presentation, we
will describe how this approach can be implemented and exploited to monitor
molecular angular behavior and access sub-diffraction scale structural information.
We will illustrate the use of polarization resolved fluorescence in live cell membranes
and proteins assemblies [2-4]. We will also show that polarized nonlinear signals
such as two-photon fluorescence [5] and third order nonlinear signals such as Four
49
MODULES
Wave Mixing (FWM) and Coherent Anti Stokes Raman Scattering (CARS) [6] bring a
superior level of detail in the organization of lipids in cells and tissues without
labeling.
References
[1] S. Brasselet, Advances in Optics and Photonics 3, 205 (2011)
[2] A. Kress, Xiao Wang, H. Ranchon, J. Savatier, H. Rigneault, P. Ferrand, S. Brasselet, Biophys. J. 105,
127 (2013)
[3] A. Gasecka, P. Tauc, A. Bentley, S. Brasselet, Phys Rev Lett 108, 263901 (2012)
[4] J. Duboisset, P. Ferrand, H. Wei, X. Wang, H. Rigneault, S. Brasselet, J. Phys. Chem. B, 117 (3), 784
(2013)
[5] P. Ferrand, P. Gasecka, A. Kress, X. Wang, F.-Z. Bioud, J. Duboisset, S. Brasselet, Biophys. J. (2014)
DOI: 10.1016/j.bpj.2014.04.011
[6] F.-Z. Bioud, P. Gasecka, P. Ferrand, H. Rigneault, J. Duboisset, and S. Brasselet, Phys. Rev. A 89,
013836 (2014).
***
Correlative Light and Electron Microscopy
Yannick Schwab,
EMBL, Heidelberg
Depuis de nombreuses années, d’importants efforts ont été déployés pour visualiser
un même échantillon à différentes échelles et selon différentes modalités afin
d’associer données structurales et fonctionnelles. Les microscopies corrélatives,
combinant les imageries photoniques et électroniques connaissent aujourd’hui un
essor particulier, car elles permettent de répondre à un nombre croissant de
questions biologiques.
D’une manière générale, la difficulté des analyses morpho-fonctionnelles réside dans
l’hétérogénéité des échantillons étudiés, un obstacle que les CLEM permettent de
franchir car elles offrent la possibilité d’étudier l’ultrastructure de sous-populations
cellulaires dument sélectionnées. Une palette de méthodes ont été développées
pour des modèles biologiques in vitro (cultures cellulaires) et sont utilisées de façon
routinière dans de nombreux laboratoires pour corréler « live cell imaging » et
microscopie électronique. Elles reposent pour la plupart sur l’utilisation de systèmes
de coordonnées permettant de conserver la position des mêmes cellules lors du
passage d’une imagerie à l’autre. Lorsque l’échantillon biologique est plus complexe,
par exemple lorsqu’il s’agit d’organismes modèles (nématodes, drosophiles, poisson
zebre, souris, …), la corrélation est plus difficile, mais rendue possible par l’utilisation
50
MODULES
d’informations spatiales (anatomiques par exemple). Grace à l’imagerie 3D (en
microscopie photonique et électronique), la corrélation des volumes permet une
approche subcellulaire ciblée à l’échelle des organismes modèles.
De nombreux développements sont en cours pour pousser encore plus loin les
limites actuelles de ces techniques, et ce dans plusieurs directions. Améliorer la
résolution temporelle est un défi majeur, qui repose essentiellement sur les
techniques de fixation. La précision spatiale dans la corrélation est un autre domaine
d’intenses développements qui permettent d’assigner une identité moléculaire (par
l’utilisation de sondes fluorescentes) à des structures de plus en plus définis (cellules,
organites, complexes macro-moléculaires). Enfin, d’importants efforts sont mis en
œuvre pour améliorer les rendements dans la corrélation, tant du côté des
industriels que des laboratoires de recherches, car là réside la possibilité d’avoir des
enregistrements significatifs, à l’échelle des populations ou sous-populations
cellulaires données.
***
Microscopie multi-modale avec 3View
Cristel Genoud,
Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research, Bâle
La technique de "serial block-face imaging" dans un microscope à balayage est en
constant développement. Originellement développée pour le domaine scientifique
de la "connectomic", cette technique est maintenant utile dans de nombreux
domaines scientifiques. L'arrivée sur le marché de nouveaux microscopes à balayage
optimalisés pour des bas voltages (low kV) et des hauts courants de faisceau (beam
current) permet une amélioration de la technique : d'une part, le balayage peut se
faire de manière plus rapide (high scanning speed) dans la fourchette de fréquence
allant de 2 à 20 MhZ et, d'autre part, le "signal to noise ratio" est nettement
amélioré. Ces développements permettent l'acquisition de données à haute
résolution (4nm pixel size) et/ou l'acquisition de volumes couvrant des régions plus
grandes. Dans la perspective de mettre ces acquisition faites en 3D microscopie
électronique dans leur contexte biologique, il est nécessaire de pouvoir superposer
les images de microscopie électronique avec des images provenant d'autres
modalités comme la microscopie biphotonique in vivo, la microscopie électronique
à transmission ou encore la technique de "array tomography". L'analyse conjointe
51
MODULES
de ces données nécessitent le développement de software pour la visualisation et
l'analyse de ces données en 3 dimensions et en diverses modalités.
***
Studying cell mechanics during early stages of infection using Atomic Force
Microscopy and correlative microscopy techniques
Frank Lafont
BioImaging Center of Lille - BiCeL,
Cellular Microbiology and Physics of Infection - CNRS UMR8204 – INSERM U1019 –
Institut Pasteur de Lille – Univ. Lille
Regulation of cell signalling response to cell mechanics perturbation has attracted
attention over the last years. Infection induces strong signalling response either to
the benefit of the host or of the pathogen. However, the role of cell mechanics in
that context remains under investigated. Deciphering the molecular basis of the cell
response to infection can lead to new therapeutic approaches circumventing the
antibiotic resistance by focusing more on molecular pathways of the host. In order
to better analyse the interaction between the pathogen and the host, several
techniques can be applied. Atomic force microscopy allows to perform
multiparametric measurements such as stiffness, interaction forces, receptor
mapping, viscosity at very high resolution. We will discuss how to apply AFM to living
cells including in the context of infection. We will further envision the possibilities
now emerging to couple AFM to light and electron microscopies and the new
avenues they open.
***
52
MODULES
Méthodes de recalage d'images pour l'imagerie multimodale
Grégoire Malandain,
INRIA / Morphologie et Images, Nice/Sophia Antipolis
Indépendamment des techniques d'acquisition, qui peuvent permettre d'obtenir des
images multimodales nativement alignées, les algorithmes de recalage d'images sont
un élément important pour permettre d'exploiter pleinement les données
multimodales. Les méthodes de recalage d'image sont généralement construites
autour de 3 briques fondamentales : le choix d'une classe de transformation, le choix
d'un algorithme d'optimisation et le choix d'une mesure de qualité. Nous discuterons
le choix des mesures de qualité, et des transformations, au regard de différents
problèmes de recalage. Nous montrerons des exemples d'applications de
l'alignement des images pour la correction de mouvement, ou pour la reconstruction
de données mieux résolues.
***
Microscopie corrélative: de l’optique à l’électronique (Correlative light to
MA-7-1
electron microscopy)
Ateliers
 A3 - dSTORM 3D à l’aide de l’émission « super critique »
 A4 - Imagerie de super-résolution par diffraction conique
 A22 - Correlative light and electron microscopy with Array tomography
 A41 - Mesure de concentrations surfaciques de molécules par spectroscopie
à corrélation d'images
 A61 - Contrôle et imagerie de la température cellulaire
 A62 - Microscopie Multiphotonique Multimodale (TPEF / SHG-pSHG / THG /
Mélange d'Ondes / Photoablation)
 A66 - Imagerie en flux
53
MODULES




A67 - Microscopie Raman Stimulée (CARS) : initiation à l'aspect imagerie
biologique
A68 - Imagerie de l’ordre moléculaire orientationnel par fluorescence
polarisée
A69 - Imagerie en lumière blanche : parce que le marquage fluorescent n'est
pas la solution systématique
A70 - Screening HCS, integration de la cytométrie par analyse d'images sur
une plateforme mixte cytométrie/Imagerie
54
SEMINAIRES
SEMINAIRES
S1 - Nonlinear imaging of developing tissues
Emmanuel Beaurepaire,
Lab for optics and biosciences, Ecole Polytechnique - CNRS - Inserm, Palaiseau
Modern issues in systems biology require tissue-scale measurements of multiple cell
parameters. Multiphoton fluorescence microscopy has proven invaluable for tissue
studies with its ability to provide subcellular resolution in thick/live samples.
However established methods are still limited in terms of their speed, depth,
innocuity, and ability to simultaneously probe multiple parameters.
We will discuss recent advances including efficient combination of fluorescence with
coherent contrasts [1], multicolor two-photon imaging [2,3], high-speed two-photon
imaging using light-sheet excitation [4,5] and wavefront control. We will illustrate
the benefit of these strategies for high-information content imaging of developing
tissues and embryos.
References:
[1] Olivier et al, Science (2010)
[2] Mahou et al, Nat Methods (2012)
[3] Loulier et al, Neuron (2014)
[4] Truong et al, Nat Methods (2011)
[5] Mahou et al, Nat Methods (2014)
***
S2 - Local Energy produced by Glycolysis: On-board ATP fueling of intracellular
trafficking
Diana Zala,
Institut Curie, Orsay
Fast axonal transport (FAT) requires consistent energy over long distances to fuel the
molecular motors that transport vesicles. We demonstrate that glycolysis provides
ATP for the FAT of vesicles. Although inhibiting ATP production from mitochondria
did not affect vesicles motility, pharmacological or genetic inhibition of the glycolytic
enzyme GAPDH reduced transport in cultured neurons and in Drosophila larvae.
GAPDH localizes on vesicles via a huntingtin-dependent mechanism and is
transported on fast-moving vesicles within axons. Purified motile vesicles showed
GAPDH enzymatic activity and produced ATP. Finally, we show that vesicular GAPDH
is necessary and sufficient to provide on- board energy for fast vesicular transport.
Although detaching GAPDH from vesicles reduced transport, targeting GAPDH to
55
SEMINAIRES
vesicles was sufficient to promote FAT in GAPDH deficient neurons. This specifically
localized glycolytic machinery may supply constant energy, independent of
mitochondria, for the processive movement of vesicles over long distances in axons.
[1] M.-V. Hinckelmann, D. Zala, and F. Saudou, “Releasing the brake: restoring fast axonal transport in
neurodegenerative disorders.,” Trends Cell Biol., vol. 23, no. 12, pp. 634–643, Sep. 2013.
[2] D. Zala, M.-V. Hinckelmann, and F. Saudou, “Huntingtin’s Function in Axonal Transport Is Conserved
in Drosophila melanogaster,” PLoS One, vol. 8, no. 3, p. e60162, Mar. 2013.
[3] D. Zala, M.-V. Hinckelmann, H. Yu, M. Menezes Lyra da Cunha, G. Liot, F. P. Cordelières, S. Marco,
and F. Saudou, “Vesicular Glycolysis Provides On-board Energy for Fast Axonal Transport,” Cell, vol. 152,
no. 3, pp. 479–491a, 2013.
***
S3 - Détecter l’ADN chromosomique en microscopie de fluorescence dans des
cellules fixées et vivantes: nouveaux outils, nouvelles approches
Christophe Escudé
"Structure et Instabilité des Génomes" - UMR7196 MNHN-CNRS, U565 INSERM Muséum National d'Histoire Naturelle
La microscopie de fluorescence est un outil de choix pour l’étude des différents
processus se déroulant dans le noyau de la cellule et permet de répondre à des
questions concernant l’organisation du génome dans sa globalité, sa dynamique au
cours du cycle cellulaire ainsi que la dynamique des interactions moléculaires à des
échelles de temps très courtes. Néanmoins, l’introduction des marqueurs
fluorescents nécessaires à ce type d’étude, en particulier pour la détection de l’ADN,
peut représenter un défi pour l’expérimentateur. Nous présenterons d’une part de
nouvelles approches d’analyse d’image à haut débit permettant l’étude précise du
positionnement de loci génomiques sur des cellules fixées, d’autre part de nouveaux
outils permettant de repérer des loci génomiques dans des cellules vivantes et des
exemples d’applications de ce type d’approche.
***
S4 - Imaging Life at High Spatiotemporal Resolution
Eric Betzig,
Janelia Farm Research Campus, HHMI
Fluorescence microscopy of biological systems involves inevitable tradeoffs of spatial
resolution, speed, non-invasiveness, and imaging depth. I will describe four
technologies that address different points in the application space defined by these
metrics: 3D localization microscopy at ultra-high molecular density; live cell
structured illumination microscopy at 50-80 nm; lattice light sheet microscopy for
imaging rapid 3D dynamic processes in vivo over hundreds of time points; and
56
SEMINAIRES
adaptive optics to recover optimal resolution from deep within optically
heterogeneous specimens.
***
S5 - Mesoscopic origins of cell behaviors during tissue morphogenesis
Pierre-François Lenne,
Institut de Biologie du Développement de Marseille, CNRS & Aix-Marseille Université
Force transmission in tissues requires adhesion between cells. Using quantitative
imaging and force measurements in vivo, we study how cell-cell contacts are
organized and how subcellular tensile forces are transmitted at adhesive clusters to
shape cells in tissues. We will present how local contractile forces produce local and
global cell shape changes during morphogenesis of early epithelia.
***
S6 - Pourquoi l’imagerie optique non-linéaire est devenue un outil indispensable
pour les neurosciences
Laurent Bourdieu,
ENS Paris - Département de biologie, Paris
Le développement des techniques d’imagerie non-linéaire, en particulier la
microscopie de fluorescence à deux photons, a révolutionné les neurosciences ces
vingt dernières années, de la neurophysiologie cellulaire aux neurosciences
intégratives. D’abord limitées aux études sur des tranches de cerveau, ces
techniques d’imagerie ont par la suite été utilisées sur des animaux anesthésiés puis
éveillés, maintenus tête fixée. Récemment, la conception de microscopes
miniaturisés et fibrés a ouvert la possibilité d’effectuer des expériences sur des
animaux libres de se mouvoir.
Je présenterai ici à la fois les apports principaux de la microscopie non-linéaire aux
neurosciences et les enjeux méthodologiques actuels en imagerie non-linéaire in
vivo. En particulier, je montrerai que l’imagerie fonctionnelle pose de nombreux
défis, que ce soit en termes de sensibilité, de résolution temporelle, de profondeur
d’imagerie ou de combinaison avec des informations anatomiques obtenues grâce
aux outils génétiques ou avec des stimulations opto-génétiques.
***
57
SEMINAIRES
S7 - Repenser les écoles doctorales à l’ère de l’épistémè numérique
Bernard Stiegler
Institut de recherche et d'innovation-IRI, Paris
La technologie numérique constitue le nouveau milieu du savoir : c’est une
technologie intellectuelle au sens que Jack Goody donnait à ce mot, qui reconfigure
la vie de l’intellect lui-même, et donc le devenir des disciplines.
Comme l’écriture alphabétique constitue la condition de possibilité de la géométrie
démonstrative selon Husserl, le numérique comme nouvelle forme de l’écriture
constitue un nouvel âge des savoirs sous toutes leurs formes. L’avènement de la
technologie numérique constitue en cela une nouvelle épistémè marquée par un «
tournant computationnel », comme l’a appelé David Berry (Understanding digital
humanities).
Il est inconcevable que les universités aussi bien que les grands organismes de
recherche ne mettent pas la métamorphose numérique des savoirs et de leurs
enseignements au cœur de leurs préoccupations et au premier rang de leurs
priorités : comme dans toutes les dimensions de l’existence humaine, le
déploiement dans toutes les disciplines de ce que Clarisse Herrenschmidt a appelé
l’écriture réticulaire constitue évidemment l’enjeu majeur du savoir au XXIème
siècle.
Dans les mêmes thématiques :
Le big data en imagerie : état des lieux des softs de gestion du cycle
de vie des images et des bases de données images ouvertes
disponibles
TR-T-1
Besoins et réalisations autour d’un arduino dans les plateformes
d’imagerie
TR-T-2
Savoir-faire de la création de service de mutualisation d'équipements
TR-T-3
scientifiques
Descripteurs 3D
MA-2-2
TR culture cellulaire
TR-T-4
HCS/HCA
TR-T-5
58
MODULES AVANCES / TABLES RONDES
Modules Avancés (MA) et Tables Rondes (TR)
Dimanche 5
Lundi 6
MA-3-1 : An integrative biology platform
TR-1-1 : Quelles références pour quelles
for the measurement and computational
mesures en métrologie, vers la
modeling of multicellular dynamics
métrologie de la super-résolution
from 3D+time in vivo imaging of animal
(Salle Atlantique)
early embryogenesis
14h30 - 16h30
(Restaurant)
TR-T-3 : Plateforme, mutualisation
d'instruments scientifiques : création et
MA-7-1 : Microscopie corrélative: de
développement d'un service
l’optique à l’électronique
(Restaurant)
(Salle Atlantique)
TR-3-1 : stratégies de manipulation
d’organismes modèles pour l’imagerie in
vivo in toto multi échelles et
multimodale
(Restaurant)
16h30 - 18h30
TR-T-4 : Culture cellulaire : Préparations
de cellules, supports et chambres
d’incubations pour l’imagerie en temps
réel
(Salle Atlantique)
MA-1-1 : Microscopie SIM aveugle (BlindSIM)
(Salle Atlantique)
21h30-23h30
MA-2-1 : Aspect modélisation physique
et bio et interface surface
TR : Création axe mécano
Bio au GDR
(Restaurant)
Mardi 7
Mercredi 8
Jeudi 9
MA-4-1 : Sondes et actuateurs encodés
génétiquement : approche optogénétique
intracellulaire et biosenseurs FRET
(Salle Atlantique)
MA-6-1 : Mesures quantitatives avec
optique adaptative
(Restaurant)
MA-T-1 : Traitement du signal optique
robuste et interdisciplinarité en
biophysique, biologie ou biomédecine
(Restaurant)
MA 5-3 : The analysis and simulation of
spatial trajectories of intracellular and
membrane proteins: methodological
aspects
(Salle Atlantique)
MA-4-2 : Outils Chimiques pour la
photorégulation d’activités biologiques
(Salle Atlantique)
MA-2-2 : Descripteurs 3D avancés pour
l'analyse de la morphologie cellulaire
(Restaurant)
TR-T-1 : Big data en imagerie : état des
lieux des softs de gestion du cycle de vie
des images et des bases de données
images ouvertes disponibles
(Restaurant)
MA-6-2 : Imagerie du petit animal : de
l’imagerie multi échelle aux mesures
multiparamétriques ; quels outils
aujourd’hui ?
(Salle Atlantique)
MA-5-1 : Exploring biomolecular
dynamics with single pair FRET
(Salle Atlantique)
TR-5-2 : Interaction moléculaire en
microscopie
(Salle Atlantique)
TR-T-2 : Besoins et réalisations autour
d’un Arduino dans les plateformes
d’imagerie
(Restaurant)
TR-T-5 : High Content Screening and
Analysis : intérêts pour les nouvelles
technologies de microscopie optique
(Restaurant)
Module Avancé ou Table Ronde- /-Numéro module associé ou Transversal-/-Numéro MA ou TR
59
MA-1-1 : Microscopie SIM aveugle (Blind-SIM)
Hugues Giovannini et Marc Allain
I. Microscopie de fluorescence : du SIM au Blind-SIM
a) Principe du SIM
b) Contrôle des illuminations et éclairements aléatoires
c) Statistiques du speckle
II. Reconstruction en Blind-SIM
a) Estimation au sens des moindres-carrés à illuminations connues et inconnues
b) Algorithme sous contrainte de positivité
c) Illustrations et perspectives
Ce module avancé décrit une stratégie de microscopie de fluorescence super-résolue
basée sur la technique des éclairements structurés (SIM). Cependant, contrairement
aux techniques SIM standard [1], la connaissance des illuminations n’est pas ici
postulée, ce qui conduit à une technique SIM dite « aveugle » (Blind-SIM).
Ce module avancé est structuré en deux temps.
Dans un premier temps, les éléments clés de la microscopie SIM standard seront
rappelés, notamment pour mettre en lumière les difficultés liées au contrôle de la
grille de lumière au niveau de l’échantillon. Le principe d’éclairements structurés par
des figures de speckle sera introduit [2], notamment pour souligner les
simplifications permises du point de vu instrumental.
Dans un second temps, les aspects de reconstruction de la densité de fluorescence
seront abordés. La reconstruction à éclairements connus sera d’abord décrite pour
souligner les difficultés induites par des éclairements aléatoires (speckle). Nous
aborderons ensuite l’ajout de contraintes adaptées (homogénéité, positivité) pour
résoudre le problème en Blind-SIM. Nous terminerons en donnant quelques
illustrations de reconstructions en Blind-SIM, et en précisant les limites actuelles de
la méthode.
[1] M. G. L. Gustafsson. Nonlinear structured-illumination microscopy: Wide-field fluorescence imaging
with theoretically unlimited resolution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United
States of America, 102(37):13081–13086, 2005.
[2] E. Mudry, K. Belkebir, J. Girard, J. Savatier, E. Le Moal, C. Nicoletti, M. Allain, and A. Sentenac.
Structured illumination microscopy using unknown speckle patterns. Nature Photonics, 6(5):312– 315,
2012.
***
60
TR-1-1 : Quelles références pour quelles mesures en métrologie, vers la métrologie
de la super-résolution
Animation : Damien Schapman, Aurélien Dauphin
Intervenants : Jean-Baptiste Sibarita et groupe de métrologie du RTmfm
La super-résolution contourne la limite de diffraction par différentes techniques qui
brillent par le concept autant que par le manque de méthode de mesure des
améliorations qu'elle concède.
Cette table ronde, qui s'adresse aux spécialistes comme aux néophytes de la superrésolution et de la métrologie abordera la résolution au travers de sa définition, de
sa mesure, et de son amélioration par les principales techniques de superrésolutions (STED, Palm, Storm, SIM, GSD...). Nous évaluerons les éléments
indispensables à ces techniques (objectifs, milieux de montage et d'immersion,
scanner, traitements d'image...) et leur adéquations avec les conditions d'étude
biologique. Nous discuterons des points de mesures et des références indispensables
aux solutions de métrologie qui peuvent être apportées.
Qu'est-ce que la résolution ?
Comment l'améliore-t-on avec le STED ?
Comment l'améliore-t-on avec le Palm ?
Solution apportées, quoi dans la valise de métro ?
***
MA-2-1 & TR : Aspect modélisation physique et bio et interface surface ; TR
Création axe mécano Bio au GDR"
Karine Anselme et René Marc Mége
Ce module avancé est combiné avec une Table Ronde sur la création d’un axe mécano
Bio dans le GDR-MIV.
Une bonne compréhension des interactions entre les cellules et les biomatériaux est
nécessaire pour développer des implants ou des surfaces bioactives. La rigidité, la
chimie et la topographie ont été largement décrits comme des facteurs clés qui
contrôlent le comportement des cellules sur les matériaux. Nous avons récemment
démontré que les cellules cancéreuses ont la capacité de déformer leur noyau de
façon considérable lorsqu’elles sont cultivées sur des surfaces polymères présentant
des piliers carrés de 7µm de côté et 6µm de profondeur [1] (Figure). Nous avons
démontré que ces déformations sont étroitement liées au type cellulaire et surtout
à l’organisation du cytosquelette [3]. De plus les acteurs moléculaires impliqués dans
cette déformation ont été étudiés et seront présentés. Ces fortes déformations des
cellules et de leurs organites n'affectent ni la viabilité ni la prolifération cellulaire ce
qui permet d’établir une analogie avec le processus métastatique. Ce modèle de
déformation sur surfaces micro-structurées pourrait donc devenir un outil d’étude
pertinent de la plasticité nucléaire des cellules cancéreuses.
61
Cellule d’ostéosarcome SaOs-2 déformée
sur une surface avec micro-piliers. Bleu:
ADN, Rouge: microfilaments d’actine,
vert: marquage de la protéine Sun1 du
nucléo-squelette.
[1] Davidson P. et al., Adv. Mater.
(2009),21:3586-3590
[2] Badique F. et al., Biomaterials (2013),
34(12), 2991-3001
TR : Mechanosensing of living cells: from single cell response to substrate rigidity
to collective cell migration
Formation of living organisms results from mechanical processes that first affect its
basic components, tissue cells. As opposed to passive materials, living cells actively
respond to the mechanical perturbations occurring in their environment. Cell
adhesion and migration require the ability of cells to generate active forces. We will
first present physical concepts of single cell adhesion and the unexpected cellular
responses to mechanical cues such as stiffness sensing. We will present how the
development of microfabricated substrates of defined stiffness and topology as well
as microcaptor force arrays and cell confinement within patterned adhesive
extracellular matrix has allowed probing single cell response to mechanical cues. We
will discuss how probing of single molecule mechanical properties have allowed
identifying molecular mechanosensors at work at cell adhesion sites.
Besides the mode of single cell mechanosensing and migration, detailed knowledge
obtained over the past 30 years indicates that an additional mechanism is important
for cell cohesion and migration within tissues: the establishment of intercellular
junctions and the cell to cell transmission of mechanical forces. In particular we will
focus on the movement of cell groups consisting of multiple cells connected by cell–
cell junctions. This collective cell behaviour plays a pivotal role in regulating various
processes such as gastrulation, morphogenesis and tissue organization. By
combining experimental approaches and numerical modelling, we can study how
physical constraints modulate collective behaviours of epithelial cell sheets. We will
discuss how these approaches can be used to probe the mechanical properties of
epithelial tissues.
***
62
MA-2-2 : Descripteurs 3D avancés pour l'analyse de la morphologie cellulaire
Alexandre Dufour
La morphologie cellulaire et sa dynamique sont des témoins essentiels de l'état de la
cellule et sont impliqués dans de nombreux processus tels que la migration, la
division, la différentiation ou encore les interactions cellule-cellule et hôtepathogène. Les mécanismes de déformation et de migration cellulaire sont encore
aujourd'hui peu établis (notamment dans leur environnement 3D natif) et génèrent
des besoins d'analyse quantitative robuste et systématique (notamment par le biais
de la bioimagerie) afin de déterminer les paramètres permettant de discriminer
diverses conditions expérimentales. Ce module donnera un aperçu des différents
problèmes et outils liés à l'analyse quantitative de la morphologie cellulaire en 3D,
ainsi que leur exploitation dans un cadre d'apprentissage par ordinateur. Dans ce
module nous prendrons l'exemple concret de la migration amiboïde, typiquement
caractérisée par l'émission de protrusions globulaires à la surface de la cellule et
particulièrement impliquée dans différents processus biologiques tels que l'invasion
parasitaire, la réponse immunitaire et le développement métastatique.
Techniques abordées dans le module:
- Analyse de forme 3D
- Traitement de signal par harmoniques et ondelettes sphériques
- Classification supervisée et parcimonieuse
***
MA-3-1 : An integrative biology platform for the measurement and computational
modeling of multicellular dynamics from 3D+time in vivo imaging of animal early
embryogenesis
René Doursat, Barbara Rizzi
The BioEmergences platform supports the automated analysis and reconstruction of
collective cell movements based on time-lapse microscopy of organism development
[1-3]. It offers biologists advanced software tools capable of handling large amounts
of 4D data through a workflow of image processing algorithms. Raw voxel-based
movies of embryos (such as zebrafish or sea urchin), engineered to highlight cell
membranes and nuclei with fluorescent proteins, are filtered by an edge-preserving
smoothing method, then cell positions are extracted from the local maxima of these
images and passed on to shape segmentation and cell-tracking modules. The output
is a cell lineage tree annotated with various quantitative measurements.
This data reconstruction stage can be followed by agent-based modeling and
simulation with the MecaGen platform [4]. Embryogenesis is viewed here as an
emergent, self-organized phenomenon based on the individual behavior of a large
number of cells, via their genetically regulated, and regulating, biomechanical
behavior. Cells’ mechanical properties (such as division rate, adhesion strength, or
intrinsic motility) are closely correlated with their spatial location and temporal state
63
of genetic and molecular dynamics (such as internal protein and external ligand
concentrations) and affect each other concurrently. We apply MecaGen to the
exploration of the different morphogenetic episodes occuring through the first 10
hours of the zebrafish development: cell segmentation, enveloping layer formation,
epiboly, internalization and convergence-extension.
[1] Olivier, N., Luengo-Oroz, M. A., Duloquin, L., Faure, E., Savy, T., Veilleux, I., Solinas, X., Débarre, D.,
Bourgine, P., Santos, A., Peyriéras, N. & Beaurepaire, E. (2010) Cell lineage reconstruction of early
zebrafish embryos using label-free nonlinear microscopy. Science 329: 967-971.
[2] Zanella, C., Campana, M., Rizzi, B., Melani, C., Sanguinetti, G., Bourgine, P., Mikula, K., Peyriéras, N.
& Sarti, A. (2010) Cells segmentation from 3-D confocal images of early zebrafish embryogenesis. IEEE
Transactions on Image Processing 19(3): 770-781.
[3] Castro-González, C., Luengo-Oroz, M. A., Duloquin, L., Savy, T., Rizzi, B., Desnoulez, S., Doursat, R.,
Kergosien, Y. L., Ledesma-Carbayo, M. J., Bourgine, P., Peyriéras, N. & Santos, A. (2014) A digital
framework to build, visualize and analyze a gene expression atlas with cellular resolution in zebrafish
early embryogenesis. PLoS Computational Biology 10(6): e1003670.
[4] Delile, J., Doursat, R. & Peyriéras, N. (2013) Chapter 16: Computational modeling and simulation of
animal early embryogenesis with the MecaGen platform. In Computational Systems Biology, 2nd
edition, A. Kriete & R. Eils, eds.: pp. 359-405. Academic Press, Elsevier, ISBN 978-0-124-05926-9.
***
TR-3-1 : stratégies de manipulation d’organismes modèles pour l’imagerie in vivo
in toto multi échelles et multimodale
Alex Mc Dougall, Willy Suppato, Nadine Peyriéras
L'imagerie in vivo voir in toto d'organismes modèles pose des problèmes spécifiques
à chaque espèce. Nous discuterons principalement la question de l'acquisition de
données 3D+temps d'organismes en développement, animaux ou végétaux.
- comment transposer sous un microscope optique les conditions de culture d'un
organisme
- conditions de montage
- possibilités de marquages et d'introduction de biosenseurs
- modalités d'imagerie
- stockage et analyse des données
***
MA-5-1 : Exploring biomolecular dynamics with single-pair FRET
Jorg Langowski Biophysics of Macromolecules, German Cancer Research Center
The observation and characterization of single fluorescent molecules in confocal
optics has become a centrally important method in biophysics. This lecture will
review the principles of single molecule fluorescence observation, with special
emphasis on Förster resonance energy transfer (FRET) measurements on single
64
fluorophore pairs. Examples of spFRET setups will be given and methods for data
analysis discussed. Finally, recent results from our own research on nucleosome
dynamics will be presented
***
TR-5-2 : Interaction moléculaire par microscopie
Marc Tramier, Simon Amer Beeg
Depuis une vingtaine d’années la microscopie photonique permet suivre le devenir
de protéines dans une cellule par le biais des protéines fluorescentes mais aussi
d’exploiter le transfert d’énergie de fluorescence ou FRET pour mesurer les
interactions moléculaires par des techniques de mesure d’intensité ou de durée de
vie de fluorescence (FLIM). Simultanément à ces techniques, les mesures de diffusion
sous microscope par corrélation (FCS) se sont développées et permettent également
d’évaluer les interactions moléculaires (FCCS). Les méthodes de corrélation d'images
(ICS) sont aussi capables d'étudier la co-diffusion des protéines. Ces outils se sont
démocratisés et sont disponibles maintenant sur les microscopes commerciaux. Au
travers de cette table ronde, nous aborderons ces méthodes et échangerons sur leur
mise en œuvre, leurs avantages et leurs inconvénients.
***
MA-5-3: The analysis and simulation of spatial trajectories of intracellular and
membrane proteins: methodological aspects
C. Kervrann & H. Berry
This course, focused on the trajectories of proteins in the intracellular or membrane
spaces, will consist of two subtopics.
1. In the first part of the class, we will give an overview of the main difficulties
encountered when estimating the diffusion or directed transport of proteins from
their trajectories in microscopy images. We will present the commonly-used tracking
methods that can generate sets of imperfect trajectories. The central question we
will address is related to the exploitation of MSD for diffusion-type motion
classification. The trajectories are generally corrupted by different sources of errors
and we will discuss the limits of MSD and possible extensions.
2. Once the movement of the proteins has been correctly estimated and described,
the major question becomes: "what are the microscopic phenomena responsible for
the observed type of movement (diffusion, obstruction, trapping, caging, directed
transport...)?". In the second part of the class, we want to describe how to carry out
Monte-Carlo simulations to investigate this question. We will show how to simulate
the main types of protein movements described in the literature:
Facilitated diffusion, Brownian motion, obstructed diffusion, Continuous-time
random walks, or fractional Brownian motion with their possible position-dependent
65
variants and possible subordinations. We will illustrate how those simulations can be
used for estimating the parameters describing the movement. Finally, if time allows,
we will evoke recent results suggesting that in many practical case, understanding
the observed movement necessitates to use quantifiers beyond the MSD.
***
MA-4-1 : Sondes et actuateurs encodés génétiquement : approche optogénétique
intracellulaire et biosenseurs FRET
Mathieu Coppey et Martial Balland
La plupart des processus cellulaires impliquent de nombreux acteurs moléculaires
dont la coordination aux multiples échelles reste encore à élucider. L’imagerie
passive n’est souvent pas suffisante pour discerner l’origine des phénomènes
biologiques et il est nécessaire de pouvoir perturber les systèmes biologiques avec
un contrôle suffisant de la perturbation pour rester dans des conditions
physiologiques. Parmi les techniques émergentes allant dans cette direction,
l’optogénétique est particulièrement prometteuse. Initialement réservée à la
neurobiologie, le terme a été récemment étendu à la biologie cellulaire. Le principe
est d’utiliser des constructions moléculaires encodées génétiquement qui vont être
sensible à la lumière, à l’instar de la GFP, mais qui vont être capable d’actionner un
processus. Au cours de ce module avancé, nous discuterons :
1. les différents systèmes moléculaires optogénétique et leurs limites intrinsèques
(résolution spatiale et temporelle, niveau basal à l’état « noir », réversibilité, limite
système biologique, etc.)
2. les modalités de microscopie permettant de faire de l’optogénétique (DMD,
FRAP,…)
3. les applications possibles (telles que la localisation subcellulaire de protéine,
l’activation de voie de signalisation intracellulaire, la séquestration de protéine dans
un compartiment cellulaire, ou encore la formation de cluster)
4. le couplage actuation/observation à l’aide des sondes encodées génétiquement
(FRET, biosenseurs, bande limité du spectre, etc.)
***
MA-4-2 Outils Chimiques pour la photorégulation d’activités biologiques
Alexandre SPECHT
La lumière est un excellent stimulus qui permet d’obtenir un contrôle précis, dans le
temps et dans l’espace, d’un phénomène biologique (Phototriggers). Deux
approches chimiques sont utilisées afin de photo-réguler une activité biologique.
- Soit par l’utilisation d’une réaction de photo-isomérisation permettant par
exemple, de photo-réguler une interaction ligand-récepteur (concept
d’optogénétique chimique).
66
- Soit par l’utilisation d’une réaction photolytique (concept des ligands « cagées »).
Dans ce cas, des analogues de biomolécules, dont la fonctionnalité et l’activité ont
été masquées par un groupement photolabile, sont utilisés. Ils rendent possible la
libération rapide d’un ligand biologique sous l’action de la lumière, ce qui permet un
contrôle spatio-temporel de la réponse biologique induites.
Lors de cet exposé dans un premier temps, les structures, les synthèses et les
propriétés photochimiques (mécanisme, cinétique, sensibilité à l’excitation mono et
bi-photonique...)
respectivement
des
groupements
photolabiles
et
photoisomérisables utilisés dans ces deux approches seront présentés. Puis
différents exemples d’applications, principalement dans le domaine des
neurosciences, seront exposés.
***
MA-6-1 : Mesures quantitatives avec optique adaptative
Antoine Delon
Les applications de l'optique adaptative et de la manipulation du front d'onde sont
surtout connues en microscopie à travers l'imagerie (e.g. non linéaire et superrésolution/localisation) et les pinces optiques holographiques. Il existe cependant un
autre domaine d'applications qui est celui de la microscopie à fluctuations de
fluorescence. Il s'agit là de tout un ensemble de méthodes d'acquisition et d'analyse,
le plus souvent associées à une imagerie confocale, qui visent à mesurer des
concentrations et des mobilités absolues de molécules. D'une part ces méthodes
sont limitées en terme de vitesse d'acquisition et d'autre part elles sont très
sensibles / fragiles vis à vis des ajustements optiques, des aberrations, voire de la
diffusion de la lumière. Nous montrerons :
i) comment la manipulation de front d'onde permet (et dans quelles limites) de
multiplexer les acquisitions
ii) l'impact des aberrations d'origines divers sur les mesures quantitatives de
concentration et de mobilité, ainsi que les moyens d'y remédier
iii) enfin, la question de la diffusion de la lumière sera aussi abordée. Nous
discuterons aussi des composants optiques utilisés pour contrôler le front d'onde qui
sont en général, soit des miroirs déformables, soit des modulateurs spatiaux de
lumière. Nous présenterons leurs caractéristiques, ainsi que les
avantages/inconvénients, en fonction des applications.
***
67
MA-6-2 : Imagerie du Petit Animal : de l’imagerie multi échelle aux mesures
multiparamétriques ; quels outils aujourd’hui ?
Corinne LAPLACE-BUILHE, Stéphanie LERONDEL et Valérie ROUFFIAC
Objectifs pédagogiques : Appréhender dans son ensemble l’approche imagerie petit
animal et orienter les choix technologiques en relation avec le questionnement
biologique.
Description : Les ressources de l’imagerie in vivo chez la souris sont de plus en plus
sollicitées pour la compréhension des mécanismes physiologiques et pathologiques
ainsi que pour l’évaluation de l’activité de nouvelles molécules thérapeutiques.
Toutes les modalités d’imagerie médicale sont aujourd’hui accessibles à l’exploration
de modèles murins. Il s’agit principalement de l’IRM (Imagerie par Résonance
Magnétique), la Tomoscintigraphie (TEMP), la Tomographie d’Emission de Positons
(TEP), l’échographie ou encore la Tomodensitométrie X (TDM X ou scanner X). Les
modalités en imagerie optique plus spécifiques à la recherche, ont également
considérablement évolué ces dernières années avec notamment la tomographie
optique corps entier (bioluminescence, fluorescence), l’imagerie non linéaire des
organes in vivo à haute résolution et l’utilisation des « chambres optiques », ou
encore la photoacoustique pour n’en citer que quelques-unes. La disponibilité
d’équipements qui permettent d’étudier le rongeur avec des performances en
termes de sensibilité/spécificité équivalentes aux appareils cliniques a largement
contribué à l’émergence du concept de "recherche translationnelle". Celui-ci vise à
accélérer les phases de recherche précliniques en mettant en œuvre l’imagerie dans
des modèles pathologiques murins avec les mêmes modalités et la même démarche
que pour le suivi des patients atteints de la maladie correspondante.
Par son caractère totalement indolore et minimalement invasif, l’imagerie in vivo
constitue une avancée reconnue pour l’éthique dans l’expérimentation animale. Elle
permet en effet un suivi individuel et longitudinal des animaux, et la précision des
modalités d’imagerie quantitative conduit à une réduction très significative du
nombre des animaux devant être inclus dans les études.
Ce module articulé en 2 parties proposera dans un premier temps un état de l’art
approfondi des solutions techniques existantes en imagerie corps entier et en
imagerie non linéaire haute résolution par utilisation des chambres optiques. Cette
présentation sera suivie de plusieurs tables rondes axées sur les thèmes suivants :
- Le positionnement des principales modalités d’imagerie du petit animal en fonction
du questionnement biologique,
- L’environnement spécifique nécessaire à l’imagerie in vivo : contraintes
d’exploitation (environnement de travail en fonction des différentes modalités
(radioprotection), réglementation éthique, etc…),
- Les limites de la quantification, et de la sensibilité,
- La reproductibilité in vivo, et la gestion du nombre d’animaux,
- Les spécificités de l’imagerie photonique haute résolution, in vivo,
- Le rapprochement des données multimodalités.
68
***
MA-7-1 Microscopie corrélative: de l’optique à l’électronique (Correlative light to
electron microscopy)
Yohanns Bellaïche et Xavier Heiligenstein
La microscopie corrélative est un concept ancien, mais ses applications sont encore
récentes et il est préférable d’utiliser cette approche pour apporter une conclusion
à un projet plutôt que pour l’initier.
Dans ce module avancé sur la CLEM, nous aborderons rapidement les principes de la
microscopie corrélative et ferons un état des lieux des solutions proposées
aujourd’hui selon les niveaux de CLEM requis.
Nous présenterons les techniques les plus abouties à ce jour et les contraintes
expérimentales qu’elles imposent, puis nous présenterons l’approche que nous
avons sélectionnée pour étudier la relation entre polarité apical-basale et division
cellulaire dans l’épithélium de drosophile.
Les cellules épithéliales présentent la particularité d’être polarisées selon l’axe apicobasal. Cette polarité est essentielle à leur fonction et à l’intégrité du tissu épithélial.
Il est donc important de comprendre comment elle est maintenue lors des
nombreuses divisions cellulaires dans les épithéliums en développement.
S’appuyant sur nos travaux récents sur l’orientation du fuseau mitotique et de
formation des jonctions adhérentes dans l’épithélium de Drosophile (Herszterg et
al., Dev Cell ; Bardert et al., Dev Cell ; Bosveld et al ;, Science et Bosveld et al, non
publié), nous utilisons la CLEM (collaboration avec G. Raposo, X, Heiligenstein et F.
Marsens) pour mieux comprendre comment les jonctions cellulaires sont organisées
et modifiées au cours des divisions. L’ensemble de ces travaux devrait apporter une
vision nouvelle sur les mécanismes de division cellulaire au sein des tissus.
Enfin nous terminerons sur les problématiques et difficultés que nous anticipons
pour ce projet pour amorcer les discussions et la table ronde.
***
TR-T-1 Big data en imagerie : état des lieux des softs de gestion du cycle de vie des
images et des bases de données images ouvertes disponibles
Animation : Perrine Paul-Gilloteaux
Intervenants : Nadine Peyrieras, Perrine Paul-Gilloteaux, Fabrice de Chaumont,
Charles Kervrann, Jean-Baptiste Sibarita, Victor Racine, Julio Mateos Langerak, Cédric
Matthews
La biologie profite aujourd'hui des avancées en résolution spatiales, temporelles et
fonctionnelles de la microscopie mais est confrontée par conséquence à la
production de données massives. La gestion du stockage des images, de leurs
traitements, de leur analyse et de leur intégration avec d’autres types de données
sont des questions auxquelles les plateformes doivent répondre.
69
Dans cette table ronde, nous chercherons tout d'abord à définir les attentes des
différents acteurs dans ce domaine, à la fois du point de vue gestion par les
plateformes ou les services informatiques, ou pour le partage de données publiques
à des fins d'enseignement ou de réutilisation des données pour la recherche. La table
ronde se déroulera en deux temps:
- dans un premier temps de courtes présentations permettront aux différents
intervenants de donner un retour d'expérience et de parcourir les éléments
constituants d'une solution de gestion de données images et les solutions
technologiques aussi bien logicielles que hardware.
- Le deuxième temps doit permettre d'échanger et de confronter les points de vue
sur les besoins, les difficultés et la mutualisation de ce type d'infrastructure, et
l'adéquation des bases ouvertes (ex. the Cell) aux besoins des différents acteurs. Des
questions telles que la gestion de la sécurité, de la propriété, de l'exploitation des
données et de leur intégration multimodale seront discutées.
***
TR-T-2 : Besoins et réalisations autour d’un Arduino dans les plateformes
d’imagerie
Animation : Christian Rouvière, Jérome Mutterer.
Le groupe “Arduino / prototypage autour de la microscopie” du RTMFM propose
cette table ronde, ouverte à toute personne intéressée par la possibilité de
développer de petits périphériques utiles dans l’environnement de travail du
microscopiste. Les responsables et les utilisateurs des plateformes de microscopie
ont parfois des besoins simples pour contrôler ou mesurer l’environnement proche
du microscope (température, manipulation d’un obturateur, d’un interrupteur qui
déclenchera une injection, un flash etc.). De plus en plus de solutions techniques
abordables en termes de coût et de complexité sont disponibles et permettent
d’envisager des réalisations originales. La carte à micro-contrôleur Arduino est un
exemple bon marché de matériel libre (open source hardware) pour lequel une très
grande quantité de documentation est disponible et qui peut être interfacé
facilement avec les différents éléments d’une station de microscopie via un port
série, une commande TTL ou la lecture d’un signal analogique. Au programme de
cette table ronde: présentation du groupe de travail du RT et de ses réalisations et
projets en cours; discussion autour d’idées de développement apportées par le
groupe ou les participants; description des matériels et logiciels pouvant être mis en
œuvre pour réaliser nos objectifs; questions-réponses.
Cette table ronde est complémentaire aux ateliers proposés lors de cette session de
MiFoBio.
***
70
TR-T-3 : Plateforme, mutualisation d'instruments scientifiques : création et
développement d'un service
Animation : Cédric Matthews
La mutualisation d'un ensemble d'instruments scientifiques au sein d'un service
commun requiert de connaitre les méthodes adéquates de suivi de performance et
de structuration de l'environnement de conception et d'exploitation. Le but de cette
table ronde est de faire un état des lieux et un partage des méthodes et des outils
actuellement disponibles. Les points suivants seront abordés en prenant comme fil
conducteur l’apparition d’un besoin technologique au sein d’un institut de
recherche.
- Mettre en place une structure d'accueil pour la mutualisation d'un équipement
(réservation, évaluation du coût et facturation, lien avec les fournisseurs)
- Décrire les marchés publics
- Acheter un équipement : évaluer le besoin, l'exprimer dans le cadre d'un cahier des
charges techniques et structurer le choix
-Développer un instrument
- Evaluer l'équipement dans le cadre de la mise en place d'une démarche qualité tout
au long de son exploitation : méthodes statistiques, contrôle métrologie pour le suivi
de performance et traçabilité pour la mutualisation
- Mettre en place un diagramme de Gant pour la planification temporelle du service
- Utiliser des outils de type mind mapping pour la cartographie du suivi de qualité
- Garantir la satisfaction des utilisateurs, s'adapter au besoin.
Cette table ronde sera aussi le point de départ de la mise en place d’un groupe de
réflexion qui pourrait rédiger un document prospectif sur l’évolution des plateformes
à l’horizon 2020.
***
TR-T-4 culture cellulaire : Préparations de cellules, supports et chambres
d’incubations pour l’imagerie en temps réel
Animation : Frédérique Gaits-Iacovoni et Loïc Dupré
Intervenants : Béatrice Carrié pour la Société Biovalley, Tina Freisinger pour Ibidi et
un représentant de CherryBiotech (10 diapositives maximum pour présenter leurs
systèmes)
Les points suivants seront abordés :
- Comment obtenir des cellules (primaires ou lignées) en parfait état pour la vidéo
microscopie ? Choix du milieu de culture et d’observation (différents milieux sans
rouge phénol), choix de la méthode de décollement cellulaire (accutase = mélange
de collagénases de chez PAA ; chélation du calcium par EDTA)
71
- Chambres d’incubation de dernière génération : stabilité = fiabilité et
reproductibilité de vos observations : intérêt des petites chambres d’incubation
versus encagement total du système (chambres IBIDI) et micro-chambres pour
changement de la température en quelques secondes (système CherryTemp)
- Les différents supports de culture pour l’imagerie en temps réel : le compromis est
la clé de la réussite : intégration entre différents systèmes (aspects du repérage sur
lamelle entre échantillons vivants pour l’imagerie en temps réel, puis fixation pour
passer à la super-résolution sur la même zone), intérêt des lamelles calibrées
(épaisseur, tatouage)
***
TR-T-5 HCS/HCA : High Content Screening and Analysis : Intérêts pour les
nouvelles technologies de microscopie optique
Animation : Anne Beghin
Le HCS/HCA est une méthode basée sur l’imagerie cellulaire pour le criblage de
librairies de molécules (chimiques, siRNA, shRNA,...).
La table ronde se décomposera en 3 parties :
1/ Définitions et description de la miniaturisation des tests cellulaires en plaques
multipuits en vue d’un criblage, tour d'horizon des équipements disponibles.
2/ Description de l’analyse automatique d’images et du traitement des données
obtenues. Tour d'horizon des logiciels disponibles (open-sources et propriétaires).
3/ Intérêt pour les nouvelles technologies de microscopie. Exemple du spot PALM
***
MA-T-1 : Traitement du signal optique robuste et interdisciplinarité en
biophysique, biologie ou biomédecine
Jean-Claude André
L’interdisciplinarité est un processus dans lequel on développe une capacité
d’analyse et de synthèse à partir des perspectives de plusieurs disciplines pour traiter
une problématique dans son ensemble avec de nombreuses questions : Les
recherches communes doivent faire l’objet de quelles réponses et sous quelles
formes ? Quelles légitimités auront les connaissances produites ? Quel doit être le
rôle de chaque discipline ? Comment chaque chercheur va acquérir/s’enrichir de la
culture des autres? Etc. Les questions sont donc légion… dans une grande diversité
des pratiques interdisciplinaires. L’objet est de définir le contexte des connaissances
«appropriées» s’adaptant «bien» à une situation dans un environnement donné, en
examinant comment, en créant des îlots de rationalité, il est possible d’aller «plus
loin» avec des savoirs plutôt disjoints. Les informations sont des données, des
72
interprétations, des remises en causes, vues comme une connaissance émergeant
des interactions cognitives d’un groupe.
Nous traiterons ce sujet par la résolution d’un problème concret : interactions entre
deux molécules, par des méthodes photo-physiques résolues dans le temps. Le fil
conducteur expérimental se veut marqué par le «bon» dosage issu des négociations
entre partenaires scientifiques, il replace les outils/instruments utilisant la lumière
au cœur de la recherche pour en évaluer la pertinence. Dans ce cadre, les
instruments optiques doivent :
• S’appuyer sur une représentation de l’approche scientifique de l’applicateur
(principe de démonstration) ;
• Permettre d’analyser les conséquences des décisions et d’autoriser des
apprentissages partagés ;
• Permettre d’identifier les propriétés émergentes des systèmes complexes afin de
proposer des modes de gestion optimaux du projet scientifique.
Les instruments et les méthodes associées sont donc des «outils de négociation»
entre les différents partenaires parce qu’apportant des éléments de robustesse à la
confrontation des points de vue. Une quantité suffisante de données, résultant
d’une approche expérimentale précise, permet, en principe, de bâtir des modèles
fiables pour autant que chacune des disciplines se pose les bonnes questions sans
faire trop confiance aux autres. La connaissance des modèles physiques déjà publiés
est également une condition indispensable à une approche scientifique crédible.
Le programme provisoire est défini ci-après :
• Durée : 2 heures (comprenant une présentation permettant d’entamer une
large discussion)
• Instrumentation optique/photo-physique pour la recherche : rappel de bases,
intérêts et limites.
• Formes classiques de traitement de l’information et exemples réels : couplage
transport-réactivité (diffusion couplée à des transferts d’énergie à longue
distance avec des potentialités d’application en photothérapie dynamique pour
le traitement de cancers).
• Comment échanger entre physique, chimie, biologie, sciences de l’ingénieur ?
• Quelle confiance peut-on avoir dans les résultats ? Dans leur robustesse ? Dans
leur perception ? Dans les recherches nouvelles à mener ?
• Y-a-t-il une boîte à outils à proposer ou de simples recommandations ?
• Possibilités de généralisation et conclusions.
73
74
ATELIERS
ATELIERS
75
ATELIERS
PLANNING ATELIERS
Dimanche
AM1 Soir
Titre
A1 - 2D Single Particule Tracking (Klein/Nicolas)
A2 - Microscopie super-résolutive PALM associée à
l'optique adaptative (Marques)
A3 - dSTORM 3D à l’aide de l’émission « super
critique » (Bourg/Lécart)
A4 - Imagerie de super-résolution par diffraction
conique (Bourdoncle/Tinevez)
A5 - PALM STORM Démocratique
(Bourdoncle/Durel)
A6 - Mise en place du BALM : technique de
microscopie à haute résolution nécessitant un
microscope confocal et des fluorochromes
conventionnels. (Allart/Canivet)
A7 - Ultrastructure of centrosomes.
(Monier/Mondin)
A8 - 3D PALM sur plantes (Le Bars/Besse)
A9 - Utilisation de la super-résolution STORM pour
définir l'architecture d'un compartiment neuronal
(Leterrier)
A10 - Microscopie super-resolution PALM/dSTORM
3D pour étudier la répartition des récepteurs
membranaires (Uriot/Faklaris)
Lundi
Mercredi
AM1 AM2 Soir AM1 AM2 Soir
Inf
Inf
Ram
Ram
Gou
Ram
Gou
REG
REG
Pal
Ram
Pal
Ram
Tri
Tri
Ram
Tri
Jeudi
AM1 AM2
Pal
Pal
Ram
Ram
Ram
Ram
Tri
AM1: 14h30-16h30, AM2: 16h30-18h30, Soir: 21h00-00h00 - Ara: Aramis, Ath: Athos, BAI: Bar à images, Chi: Chistera, Dar: D’Artagnan, Gal: Galipot,
Gou: Gouffy, Pal: Pala, Ram: Ramutcho, REG: Resto entrée gauche, Sou: Soulé, Tri: Trinquet
76
ATELIERS
Dimanche
Titre
AM1
A11 - In celulo assessment of photophysical
parameters of fluorescent proteins used as markers
for PALM microcopy (Bourgeois/Berardozzi)
A12 - Atelier transversal : Comparaison des
techniques de super résolution STED 3X et
microscopie STORM sur le localisation de protéines
synaptiques (Poujol/Zaharia)
(Dompierre)
A15 - Suivi des tensions mécaniques au niveau des
jonctions cellules-cellules en utilisant des
biosenseurs FRET. (Herbomel/Tramier)
A16 - Analyse dynamique des fibres de stress
d’actine par photoconversion et nano-ablation.
(Kurzawa/Senger)
A17 - Microfluidique en microscopie à fluorescence
champ large et confocale. (Hulin/Nedellec)
A18 - Nouvelles sondes biocompatibles pour l’étude
de la morphogenèse de l’embryon de zebrafish par
microscopie biphotonique. (Bruneau/Charreyre)
A19 - Recording neuronal activity in Drosophila
neurons using bi-photon microscopy and genetically
encoded calcium sensors (Farca/Comte)
Soir
Lundi
AM1 AM2
Mercredi
Soir AM1 AM2
Tri
Jeudi
Soir
AM1 AM2
Tri
Pal
Pal
Pal
Ath
Ath
Sou
Sou
Pal
Gou
Gou
Sou
Sou
Sou
Sou
77
ATELIERS
Titre
Dimanche
AM1
A20 - Utilisation de biosenseurs chez le poisson
zèbre : comment rapporter une activité biologique
in vivo (Teillon/Gauron)
A21 - Etude de la repousse axonale chez la
drosophile : protocoles d'acquisition et analyse
d'images (Medioni/Malandain)
A22 - Correlative light and electron microscopy with
Array tomography (Genoud/Schwab)
A23 - Optimisation de la résolution axiale et de la
pénétration dans l’échantillon : nouveaux milieux de
montage à haut index réfractaire. (Bolte/Gilles)
A24 - Du microscope à l'analyse des neurones chez
la souris: mosaïque et Imagerie 3D sur neurones en
culture et tissus en profondeur.
(Danglot/Contremoulins)
A25 - Imagerie multiphotonique grand champ :
application à l’étude de tumeurs dans leur contexte Ram
tissulaire. (Irondelle/Waharte)
A26 - Microscopie à feuille de lumière sur
échantillons végétaux (jeunes racines)
(Hajjoul/Conéjéro)
A27 - Accéder au monde de la super-résolution sous
illumination structurée (SR-SIM) (Saoudi/Appaix)
Soir
Lundi
AM1 AM2
Mercredi
Soir AM1 AM2
Ram
Jeudi
Soir
AM1 AM2
Ram
Chi
Tri
Tri
Tri
Tri
Pal
Pal
Ram
Tri
Tri
Tri
Tri
78
ATELIERS
Dimanche
Titre
AM1
A28 - L'imagerie de fluorescence haute résolution :
du modèle murin au patient (LaplaceBuilhe/Rouffiac)
A29 - Apport de l'endomicroscopie confocale (ECM)
à l'étude des lésions inflammatoires intestinales
chez l'animal et l'homme (Bregeon)
A30 - Test de dispositifs à feuille de lumière "open
source" (Brau/Alcor)
A31 - Application de la microscopie
multiphotonique et de la technologie des capsules
cellulaires à l’imagerie des modèles tumoraux des
mammifères (Gurchenkov)
A32 - Apport de la microscopie multiphotonique
pour l’imagerie en profondeur (Garfa Traore/Jobart
Malfait)
A33 - Ultramicroscope : Acquisition en feuille de
lumière d’échantillons transparents fixés.
(Godefroy)
(Bosveld/Bellaiche)
A35 - Imagerie multi couleurs et multi échelles
d’embryons de poisson zébré (Boyreau/Rausch)
Soir
Lundi
AM1 AM2
Mercredi
Soir AM1 AM2
REG
Jeudi
Soir
REG
REG
REG
Tri
Tri
Chi
Chi
Sou
Sou
REG
AM1 AM2
Sou
Sou
REG
Pal
79
ATELIERS
Titre
Dimanche
AM1
A36 - Manipulation optogénétique et imagerie 3D et
3D+temps d’embryons de poisson zébré
trangéniques de type “rainbow” ou « photo »
(Dumont/Frain)
A37 - Real time visualization of MAP kinase ERK
activity and localization dynamics in living cells using
multi-parameters FRET imaging. (Sipieter/Riquet)
A38 - Illumination structurée pour manipulation
optogénétique et photopatterning (Studer/Coppey)
A39 - Contrôle et visualisation de protéines in vitro
par optogénétique (Soler/Scoazec)
A40 - Optique adaptative et microscopie de
Gou
fluctuations de fluorescence (Delon/Gallagher)
A41 - Mesure de concentrations surfaciques de
molécules par spectroscopie à corrélation d'images
(Delon)
A42 - Microscopie multimodale (vidéo microscopie
Chi
4D, FRAP, TFM) (Ronde/Carl)
Sou
A43 - Analyse de la dynamique moléculaire par
corrélation d’images de fluorescence
(Waharte/Gilloteaux)
Soir
Lundi
AM1 AM2
Mercredi
Soir AM1 AM2
Jeudi
Soir
Sou
AM1 AM2
Sou
Ath
Ath
Gou
Gou
Sou
Gou
Sou
Gou
Pal
Pal
Chi
Sou
Inf
Inf
80
ATELIERS
Dimanche
Titre
AM1
A44 - Analyse de la diversité des réponses calciques
individuelles dans une population de cellules non
adhérentes par la méthode MAAACS (Methods for
Automated and Accurate Analysis of Cell Signals)
(Hamon/Billaudeau)
A45 - Analyser la migration cellulaire au moyen de
logiciels libres (Cordelières/Zaharia)
A46 - Image processing methods for the temporal
analysis of moving particles. (Kervrann/Pécot)
A47 - Multiplex FRET : suivi simultané d’activités
biochimiques par FLIM deux couleurs
(Déméautis/Tramier)
A48 - Comparaison de différentes méthodes de
détermination des mouvements moléculaires dans
la cellule : Méthodes corrélatives et retour de
fluorescence. (Favard/Muriaux)
A49 - Dynamique de formation de nanotubes et
transport transcellulaire dans un modèle neuronal
par imagerie à haute-résolution spatio-temporelle.
(Tardivel/Waharte)
Soir
Lundi
AM1 AM2
Mercredi
Soir AM1 AM2
Jeudi
Soir
AM1 AM2
Tri
Inf
Tri
Inf
Inf
Inf
Ath
Ath
Tri
Tri
REG
REG
81
ATELIERS
Dimanche
Titre
AM1
A50 - Mesure de la dynamique d’association de
protéines sur les microtubules par combinaison
d’acquisition en spinning-disk FRAP et de tracking
de particules. (Leconte/Waharte)
A51 - FCS et FRET-FLIM : approche combinée en
cellules vivantes, acquisition et analyse (Le
Nézet/Gonzales Pisfil)
A52 - Analyse des expériences de FLIM et de FRET in
vivo par la distance de transport (Heinrich/Leray)
A53 - Suivi comparatif de la dynamique et des
interactions protéiques au niveau du cytoplasme
par microscopie de temps de vie de fluorescence
(FLIM) et spectroscopie corrélative de fluorescence
(FCS) (Richert/Kessler)
A54 - Molecular interactions in vivo by 2 Photons
fluctuation microscopy. (Clerte/Fiche)
A55 - Suivi en "live" de
depolymerisation/repolymerisation de microtubules
par changements thermiques ultra rapides
(Nahaboo)
A56 - Mobilité intracellulaire de protéines
autofluorescentes dans un système de microscopie
à feuille de lumière (Langowski/Krieger)
Soir
Lundi
AM1 AM2
Mercredi
Soir AM1 AM2
Sou
Jeudi
Soir
AM1 AM2
Sou
Pal
Sou
Pal
Sou
Sou
Pal
Pal
Pal
Pal
Pal
Gou
Ath
Tri
Gou
Ath
Tri
82
ATELIERS
Dimanche
Titre
AM1
(Gelman/Renaud)
A58 - Méthodes de marquage en fluorescence pour
l'étude de la dynamique de la chromatine en
cellules vivantes (Huet/Cesbron)
A59 - Imagerie rapide de foyers nucléaires sur
cellules vivantes et quantification/dénombrement
de ces foyers automatisée
Acquisition/Alignement/Analyse et Quantification
(Le Baccon/Cantaloube)
A60 - MitoDendra : une sonde fluorescente
photoconvertible spécifiquement adaptée à l’étude
de la dynamique mitochondriale (Baudin/Pesty)
A61 - Contrôle et imagerie de la température
cellulaire (Baffou/Savatier)
A62 - Microscopie Multiphotonique Multimodale
(TPEF / SHG-pSHG / THG / Mélange d'Ondes /
Photoablation) (Tissot/Guilbert)
A63 - Tomographie par imagerie de phase
incohérente et optique adaptative
(Savatier/Aknoun)
Soir
Lundi
AM1 AM2
Mercredi
Soir AM1 AM2
Tri
Jeudi
Soir
AM1 AM2
Tri
Sou
Sou
Ath
Ath
Chi
Chi
Gou
Gou
Chi
Chi
Gou
Gou
83
ATELIERS
Dimanche
Titre
AM1
A64 - Optique adaptative grand publique : comment
améliorer la PSF en maitrisant les paramètres
expérimentaux de base. (Faklaris/Lam)
A65 - Microscopie Raman Stimulée (CARS) :
initiation à l'aspect source laser et instrumentation
(Hage)
A66 - Imagerie en flux (Bourdoncle/Guedj)
A67 - Microscopie Raman Stimulée (CARS) :
initiation à l'aspect imagerie biologique
(Leray/Hage)
A68 - Imagerie de l’ordre moléculaire orientationnel
par fluorescence polarisée (Ferrand/Brasselet)
A69 - Imagerie en lumière blanche : parce que le
marquage fluorescent n'est pas la solution
systématique (Bon)
A70 - Screening HCS, integration de la cytométrie
par analyse d'images sur une plateforme mixte
cytométrie/Imagerie (Maury)
A71 - Scripts et programmation graphique sous Icy
(level 2) (De Chaumont/Dallongeville)
A72 - Segmentation d'images microscopiques sous
ImageJ (Usson/Fertin)
Soir
Lundi
AM1 AM2
Mercredi
Soir AM1 AM2
Jeudi
Soir
Tri
AM1 AM2
Tri
Gou
REG
Gou
REG
Gou
REG
Gou
Gou
Gou
Ram
Ram
Chi
Inf
Inf
Inf
Inf
Gou
Chi
84
ATELIERS
Dimanche
Titre
AM1
A73 - Déconvolution d'image 3D en microscopie de
fluorescence (Dieterlen/Colicchio)
A74 - ImageJ macro programming for beginners
(Baecker/Jublanc)
A75 - Analyse conjointe d'images et de données
sous Knime (Rousseau/Frindel)
A76 - OMERO. An open source client-server
software for visualization, management and analysis
of biological microscope images (Mateos
Langerak/Sarrazin)
A77 - Métrologie des instruments d’imagerie :
utilisation des différents éléments de valise
Métrologie (Desvaux/Gilles)
A78 - Quel type de caméra choisir pour quel type
d'expérimentation : CCD, EMCCD ou sCMOS ?
(Marais)
A79 - Etude quantitative des effets de phototoxicité
des paramètres de l’éclairage en microscopie de
fluorescence (Roul/Tramier)
A80 - Arduino1 : Introduction au pilotage de
périphériques (Legou/Detailleur)
Soir
Lundi
AM1 AM2
Mercredi
Soir AM1 AM2
Jeudi
Soir
AM1 AM2
Inf
Inf
Inf
Inf
Inf
Inf
Inf
Pal
Pal
Pal
Ath
Gal
Inf
Pal
Ath
Gal
85
ATELIERS
Titre
Dimanche
AM1
A81 - Arduino 2: Réalisation d'un système de
monitoring et contrôle de la température
(Rouviere/Mutterer)
A82 - CAO et impression 3D (Detailleur/Gillot)
REG
A83 - Analyses haut-débit de l’architecture des
Pal
biofilms bactériens grâce à l’acquisition assistée en
Chi
microscopie confocale. (Canette/Adenot)
A84 - CLEM sur MEB Haute résolution et sur MEB de
table (Solution innovante alternative)
(Gontier/Petersen)
A85 - FigureJ sur imageJ : vos planches d'images en
BAI
quelques clics ! (Goudin)
A86 - Etude de la colocalisation en bio-imagerie
(Lagache)
A87 - Microscopie corrélative : intégration d'un
microscope à fluorescence, dans un microscope à
balayage (Paintrand/Monier)
A88 - Mesures mécaniques sur des tissus animaux et
végétaux en croissance (Milani/Chlasta)
A89 - FCS 2 couleurs pour l'atude des interactions
Sou
protéine-protéine (Tramier/Bertolin)
Soir
Lundi
AM1 AM2
Gal
Mercredi
Soir AM1 AM2
Jeudi
Soir
AM1 AM2
Gal
REG
REG
Pal
Chi
Tri
Tri
BAI
BAI
BAI
Tri
Tri
Ath
Ath
Sou
86
ATELIERS
FICHES DESCRIPTIVES DES ATELIERS
L'organisation des ateliers de MiFoBio est un point particulièrement lourd dans la mise en
place de l'école.
Nous tenons à exprimer nos remerciements les plus chaleureux au groupe de planification
et mise en place des ateliers (Fabrice Cordelières, Sandrine Lécart et Christine Terryn), à
Tristan Piolot pour la coordination avec nos partenaires industriels, et à Cédric Matthews
pour la mise en place des contrats associés.
Merci aussi à Julien Savatier (tables optiques) et Christophe Chamot (salles informatiques).
Enfin, n'oublions pas Didier Décimo et Karine Monier pour la mise en place de
l'infrastructure de culture cellulaire et animale.
A1 - 2D Single Particule Tracking
Intervenants
Christophe Klein, [email protected]
Valérie Nicolas, [email protected]
Objectifs
L’atelier, d’une durée de 2 heures, comporterait 3 phases :
1- Présentation générale (intervenants): Power point d’introduction des problématiques
scientifiques et méthodologiques.
2- Sur poste de travail individuel (stagiaires) :
Utilisation des outils de tracking 2D disponibles dans les logiciels Imaris (Bitplane) et ImageJ
pour l’obtention des coordonnées X, Y des trajectoires de n particules en fonction du
temps. Calcul du MSD via un tableau Excel. Caractérisation de la dynamique des particules
pour différents cas de figures : mouvements Browniens, confinés, orientés. Calcul du
coefficient de diffusion.
3- Compilation des résultats et synthèse.
87
ATELIERS
Description
L'objectif est de présenter des outils de suivi de particule unique (Single Particules
Tracking : SPT) ainsi que les méthodes d'analyse des trajectoires obtenues (calcul du Mean
Square Displacement : MSD) afin de caractériser le comportement dynamique d'objets
(cellules, vésicules) et de le comparer dans différentes conditions expérimentales.
***
A2 - Microscopie super-résolutive PALM associée à l'optique adaptative
Intervenants
Xavier Marques, [email protected]
Objectifs
L'atelier présentera les performances de la microscopie PALM associée à l'optique
adaptative sur cellules neuronales fixées (préparation de l'échantillon et optimisation du
signal avec l'optique adaptative). On s’intéressera plus particulièrement à la géphyrine,
protéine présente dans les synapses inhibitrices. Les synapses représentent les liaisons
neuronales où se situe la transmission du message nerveux par les neurotransmetteurs. La
géphyrine va permettre l'ancrage des récepteurs à la Glycine et GABA dans la synapse.
L'imagerie en super résolution et en trois dimensions des clusters de géphyrines permettra
de mieux comprendre sa structure, et ainsi son influence dans l'interaction avec les
récepteurs inhibiteurs intervenant dans la régulation des messages nerveux.
Description
Ces dernières années de nouvelles techniques super résolutives en microscopie, comme le
PALM (Photo-Activation Localization Microscopy), se sont développées et ont permis de
surpasser la limite de diffraction de la lumière. La microscopie PALM consiste à n'allumer
qu'une fraction des molécules de l'échantillon. Chaque tache de l'image, ne correspond
qu'a une seule molécule, peut être localisée en déterminant le centre de la tache de
diffraction. Il s’avère que la précision de localisation de chaque molécule détectée,
déterminant la résolution de l'image, est inversement proportionnelle au nombre de
photons détectés. L'optique adaptative va permettre de récolter un maximum de photons
de chaque molécule en atténuant les aberrations optiques.
De plus, l'optique adaptative offre de nouvelle opportunité avec l'imagerie en trois
dimensions. En effet le système peut simuler une lentille cylindrique afin d’obtenir les
coordonnées axiales des molécules.
88
ATELIERS
***
A3 - dSTORM 3D à l’aide de l’émission « super critique »
Intervenants
Nicolas Bourg, [email protected]
Sandrine Lécart, [email protected]
Objectifs
Nous souhaitons établir deux niveaux d’expertises à nos différentes séances : débutant et
confirmé.
1) Atelier pour les débutants (atelier plutôt axé sur l’utilisation d’un microscope dSTORM)
:
Nous commencerons par une présentation (30 min environ) « powerpoint » qui rappellera :
- Le principe des différentes techniques de super-localisation
- Les différents algorithmes de localisation 2D(brièvement)
- Les techniques de super résolution 3D et les algorithmes associés (brièvement)
- Notre technique de super-résolution 3D avec les résolutions atteignables
- La composition des tampons efficaces et les fluorophores associés
- Les puissances laser nécessaire (avec et sans couplage par fibre) et les paramètres de
localisation (seuil, critère de diamètre des zones détectées, …)
Nous continuerons par des acquisitions sur différents échantillons et différents tampons
dSTORM. Nous comparerons en direct les différences d’efficacités entre les différents
tampons et fluorophores.
Nous finirons par des questions tout en laissant certains utilisateurs sur le microscope afin
de mieux comprendre la technique et ses difficultés.
Durée totale environ 2 h.
2) Atelier pour les confirmés (atelier plutôt axé sur le développement d’un microscope à
super-localisation 2D et 3D) :
89
ATELIERS
Nous commencerons par une présentation (45 min environ) « powerpoint » qui rappellera
les points abordés lors de la séance d’initiation (principe des techniques de super
localisation, algorithmes 2D et 3D, composition des tampons dSTORM). Nous insisterons
sur les points suivants :
- Notre technique de super-résolution 3D avec les précisions atteignables
- La calibration de notre système SAF
- Les puissances laser nécessaire (avec et sans couplage par fibre) et les paramètres de
localisation (seuil, critère de diamètre des zones détectées, algorithme de suppression du
fond local afin d’améliorer la détection)
- Les techniques pour inhiber ou contrôler les dérives dans les 3 dimensions
- Le développement d’un logiciel « maison » permettant d’observer la reconstruction en
temps réel avec la puissance d’ordinateur nécessaire
Nous continuerons par des acquisitions sur différents échantillons et différents tampons
biologiques dSTORM. Nous comparerons en direct les différences d’efficacités entre les
différents tampons et fluorophores.
Dans cette séance avancée, l’accent sera mis sur le développement instrumental et
méthodologique (microscope, optique, logiciel, traitement on line et protocoles
d’acquisition)
Durée totale environ 2 h.
Description
Notre dispositif « home-made » allie les techniques de super-localisation (PALM, STORM,
dSTORM) à la détection de l’émission « super critique » (utilisation du module virtual SAF
présenté par Thomas Barroca lors de MiFoBio 2012). Ceci permet d’obtenir des résolutions
de 20 nm dans les 3 dimensions.
Pendant l’atelier, nous rappellerons brièvement le principe et les différences entre les
techniques de super-localisation en insistant plus particulièrement sur la technique
dSTORM. Nous aborderons tous les principaux critères pour obtenir des images superrésolues (puissance laser avec couplage ou non dans une fibre, dichroïque, filtres,
algorithme de traitement pour la localisation online et offline, contrôle de la dérive 3D,
objectifs, lamelles, tampons dSTORMet fluorophores possibles).
90
ATELIERS
Concernant le module 3D par détection du « super-critique », nous expliquerons le
principe, les avantages et les inconvénients de la technique ainsi qu’également tous les
points clefs associés à son bon fonctionnement.
Tout sera mis en place expérimentalement. Les participants pourront faire des acquisitions
afin de comprendre les paramètres importants pour obtenir des images super résolues.
***
A4 - Imagerie de super-résolution par diffraction conique
Intervenants
Pierre Bourdoncle, [email protected]
Jean-Yves Tinevez, [email protected]
Objectifs
En parallèle d'une présentation sur la théorie de la diffraction conique, nous ferons
plusieurs acquisitions sur des échantillons type, dans le but de démontrer le pouvoir
résolutif et la simplicité d'utilisation du système.
Description
Utilisation pratique d'une nouvelle famille de super-résolution, par diffraction conique
utilisant un cristal biaxial mince.
***
A5 - PALM STORM Démocratique
Intervenants
Béatrice Durel, [email protected]
Objectifs
En parallèle d'une présentation détaillant chaque étape, nous feront la démonstration sur
différents systèmes, soit sur des systèmes commerciaux dédiés (ELYRA GSD N-STORM) soit
sur des microscopes TIRF non dédiés que l'on customisera sur place.
91
ATELIERS
Description
Rendre accessible au plus grand nombre les nouvelles techniques de super-résolution et
plus particulièrement les techniques de pointillisme.
Le but de l'atelier sera de détailler chaque étape d'une manipe type, du marquage à la
reconstruction d'image, en passant par l'acquisition. Ainsi montrer que la majorité des
laboratoires peuvent prétendre à de la super-résolution sur leur microscopes avec très peu
d'investissement.
***
A6 - Mise en place du BALM : technique de microscopie à haute résolution nécessitant
un microscope confocal et des fluorochromes conventionnels.
Intervenants
Sophie Allart, [email protected]
Astrid Canivet, [email protected]
Objectifs
Le BALM est une technique qui utilise un ou plusieurs marqueurs organiques
conventionnels (il n’y a pas besoin de sondes photoconvertibles ou photoactivables)
permettant d’obtenir une image avec une résolution inférieure à la limite de résolution
optique. Le procédé utilise la propriété de photo-blanchiment intrinsèque des fluorophores
pour les détecter et les séparer spatialement. Pour cela, il est nécessaire d’acquérir une
pile d’images et d’en soustraire à chaque image de la série l’image précédente afin de
détecter le photoblanchiment des fluorophores. Une fois la soustraction effectuée,
l’émission de fluorescence de fluorophores uniques est identifiée et leur localisation est
déterminée en ajustant la distribution d’intensité avec une Gaussienne théorique.
Pendant l’atelier, nous montrerons dans un premier temps comment réaliser l’acquisition
d’une série d’images BALM grâce à un microscope confocal conventionnel équipé d’un
système de maintien de focus. Dans un deuxième temps, nous utiliserons le logiciel ImageJ
pour soustraire les images une à une, puis le « plugin QuickPALM » d’ImageJ pour corriger
la dérive latérale de l’échantillon et ajuster la distribution d’intensité des molécules isolées,
et enfin, reconstruire l’image 2D finale. Pour finir, nous discuterons des avantages et
inconvénients de la super-résolution BALM par comparaison avec les autres techniques de
super-résolution obtenue par pointillisme (PALM, STORM, dSTORM…)
Description
92
ATELIERS
Mettre en place, sur un échantillon fixé standard avec des réactifs classiques, une
expérience de BALM (Bleaching/blinking Assisted Localization Microscopy), technique de
super résolution nécessitant seulement un microscope confocal équipé d'un système de
maintien de focus. La localisation et l'activation de la molécule d’adhésion LFA-1 sera
investiguée à partir d’échantillons fixés de co- culture cellulaire entre lymphocytes T
cytotoxiques et cellules tumorales cibles, imuno-marqués à l’aide d’un anticorps spécifique
couplé à l’Alexa-555.
***
A7 - Ultrastructure of centrosomes.
Intervenants
Karine MONIER, [email protected]
Magali MONDIN, [email protected]
Objectifs
- présentation des approches dSTORM (théorique) et du système utilisé avec calibration
pour 3D
- présentation du modèle biologique : déterminer la localisation d'une protéine
centrosomale par rapport à d'autres constituants déjà localisés (théorique)
- description de la préparation des échantillons : immunofluorescence, incubation des
billes, montage des lames avec milieu de réduction et twinsil (théorique et pratique)
- imagerie 2D en 2 couleurs de centrosomes (pratique)
- imagerie 3D en 1 et 2 couleurs de centrosomes marqués (pratique)
- reconstruction des images de super-résolution (pratique)
Description
Montrer l'intérêt de la technique dSTORM 2 couleurs pour analyser la localisation de
différents constituants centrosomaux.
Montrer l'intérêt de l'implémentation de la technique en 3D pour l'analyse de cette
structure.
***
93
ATELIERS
A8 - 3D PALM sur plantes
Intervenants
Romain LE BARS, [email protected]
Laëtitia BESSE, [email protected]
Objectifs
Sur un modèle plante (Arabidopsis Thaliana) ou sur bactérie (Vibrio Cholerae ou E. Coli),
nous nous proposons d'observer la distribution et l'arrangement cellulaire de certaines
protéines couplées à des protéines photo-activables et photo-convertibles (MBD-MAP4,
Calnéxine, MatP et FtsZ). Ces acquisitions ont l'habitude d'être faites sur le système NSTORM de NIKON.
Durant cet atelier, nous détaillerons le fonctionnement du système utilisé, nous réaliserons
les acquisitions et présenterons les paramètres impliquées dans la reconstruction des
images 2D et 3D. Si le temps nous le permet, nous proposerons également la réalisation
d'une séquence d'images pour rendre compte de la dynamique des protéines en superrésolution.
Description
Adapter la super résolution sur plantes et bactéries et contourner les difficultés liées à ces
modèles en 2D et en 3D
Partager nos connaissances sur ces modèles à la communauté scientifique
Reconstruction des images en super-résolution 2D, 3D et PALM dynamique.
***
A9 - Utilisation de la super-résolution STORM pour définir l'architecture d'un
compartiment neuronal
Intervenants
Christophe Leterrier, [email protected]
Objectifs
- Présentation de la technique STORM
- Organisation périodique (180 nm) du complexe actine/spectrine dans l'axone
94
ATELIERS
- Bandes de ßIV-spectrine dans le SIA (images acquises)
- Spécificité du STORM avec couple activateur-rapporteur
STORM 2 couleurs
- Cartographie des complexes moléculaires grâce au STORM 2-couleurs et aux anticorps
contre différents domaines de la même protéine
- Exemple de l'ankyrine G, partenaire de la ßIV-spectrine (images acquises)
Description
Démontrer comment l'utilisation de la microscopie de super résolution de type Stochastic
Optical Reconstruction Microscopy (STORM) permet d'accéder à l'organisation
macromoléculaire de compartiments cellulaires spécifiques, sur l'exemple du
cytosquelette spécialisé présent au segment initial de l'axone (SIA).
***
A10 - Microscopie super-resolution PALM/dSTORM 3D pour étudier la répartition des
récepteurs membranaires
Intervenants
Karen Uriot, [email protected]
Orestis Faklaris, [email protected]
Objectifs
La protéine membranaire étudiée est DCC (Deleted in Colorectal Cancer). Il s'agit d'un
récepteur membranaire enrichi au niveau des filopodes (structures riches en actine
d'environ 800 nm de diamètre) connu pour son rôle de récepteur de la Nétrine-1, impliquée
dans le guidage axonale et l'adhésion cellulaire. L'utilisation des techniques de PALM et
dSTORM permet de localiser la répartition des récepteurs membranaires avec une
résolution latérale pouvant descendre à moins de 20nm et permet ainsi de séparer des
signaux qui paraissent superposés lorsqu'ils sont observés en microscopie classique. Grâce
à l'apport de la 3D, il est possible d'obtenir une information sur la distribution de ces
récepteurs selon leur distance à la lamelle et donc selon leur éloignement des sites
d'adhésion avec une résolution axiale de 80nm. Le PALM et le dSTORM seront combinés
afin d'analyser la répartition et l'interaction de DCC et des filaments d'actine au sein des
filopodes selon que l'on se trouve au niveau basal ou à distance de la lamelle.
95
ATELIERS
i) Préparation de l’échantillon
Pour l’imagerie PALM/dSTORM une préparation spéciale des échantillons est requise. Au
sein de l’atelier les échantillons seront montés sur les tampons spéciaux pour l’imagerie
PALM/dSTORM et leur influence sur l’acquisition de l’image sera expliquée. La synthèse
des tampons sera faite sur place, pour mettre en avant les avantages et les difficultés liés
à cette étape.
ii) Acquisition
L’acquisition en 2 couleurs et 3D sera effectuée. Les paramètres jouant un rôle important
sur le rendu de l’acquisition seront expliqués : la puissance des lasers d’activation et
d’excitation, le drift latéral et axial, le temps d’acquisition par frame, le clignotement des
sondes, la densité du marquage.
iii) Analyse des donnés
L’analyse des donnés et la construction de l’image finale super-résolue est un point
fondamental de ce type de microscopie. Cette analyse sera faite sur place, avec les donnés
de l’acquisition prise sur l’échantillon biologique. L’influence des paramètres sur la
précision de la localisation finale, tout comme le nombre des photons détectés sera
étudiée. De plus, à partir des donnés expérimentales, il sera possible de tester plusieurs
logiciels de traitement des images PALM/dSTORM afin de les comparer et définir leurs
points forts.
Description
Cet atelier a pour but d'introduire l'utilisation de la microscopie à super-résolution multicouleurs (PALM + dSTORM) afin de répondre à une question biologique nécessitant l'accès
à la 3D telle que l'analyse de la répartition d'un récepteur membranaire et de son
interaction avec le cytosquelette. Le principe de l'imagerie PALM/STORM en 3D sera
exposé des mesures de calibration jusqu'à l'acquisition des images sur échantillons
biologiques. Par ailleurs, tous les paramètres critiques seront décrits et expliqués : partant
de la préparation de l'échantillon jusqu'à l'acquisition des images et leur traitement.
***
96
ATELIERS
A11 - In celulo assessment of photophysical parameters of fluorescent proteins used as
markers for PALM microcopy
Intervenants
Dominique Bourgeois, [email protected]
Romain Berardozzi, [email protected]
Objectifs
A simulation software will first be presented to show the audience how photophysical
parameters influence PALM data quality. Then, we will experimentally measure the
photobleaching, photoblinking, and photoactivation quantum yields of two proteins
commonly used for PALM experiments: mEos2 and Dendra2. We will either use samples
that we will bring (e.g. fixed HeLa cells labeled with Dendra2-actin), or possibly samples
brought by the audience. Pretty much standard PALM data sets will be collected, and a lot
of emphasis will be put on the data processing strategy behind, allowing to retrieve the
photophysical parameters. If time allows, the effect of additives on modifying the
photophysical parameters will be shown. During the practical, we will also describe how
the observed photophysics at the single molecule level connects with the threedimensional structure of the fluorescent protein markers. Thereby, we will sensitize superresolution microscopists to the importance of the precise mechanistic knowledge of the
used probes.
Description
The goal of this practical will be to show that the photophysical behavior of fluorescent
protein markers used in PALM microscopy 1/ play a stringent role in the quality of the
obtainable data, particularly in terms of the quantitative evaluation of target protein copy
number, oligomerization state or clusterization, 2/ can be measured directly from PALM
data collected in biological cells, 3/ differ from one marker to another, for a given sample,
4/ differ from one sample to another, for a given marker.
***
A12 - Atelier transversal : Comparaison des techniques de super résolution STED 3X et
microscopie STORM sur le localisation de protéines synaptiques
Intervenants
Christel Poujol, [email protected]
Daniel Zaharia, [email protected]
97
ATELIERS
Objectifs
L'atelier se déroulera sur 2 systèmes simultanément: le microscope GSD et le STED 3X. Un
échantillon identique sera analysé sur les deux systèmes. Le groupe de participants sera
découpé en 2 sous-groupes qui seront échangés à la moitié du temps.
La démo se déroulera avec:
1) un bref rappel du principe de la technique
2) une brève description de l'échantillon (immuno-marquage pour 2 protéines)
3) acquisition et représentations de l'image
Description
L'objectif de cet atelier est de vérifier la localisation de 2 protéines synaptiques dans des
neurones en culture en utilisant la microscopie STED et la microscopie STORM. Durant cet
atelier nous évaluerons la complémentarité des deux techniques, notamment en terme de
résolution, de temps d'acquisition, avantage de la 3D.
***
Intervenants
Jim Dompierre, [email protected]
Objectifs
1° partie: description des caractéristiques techniques du système et des apports
permettant d'améliorer la résolution en z et d'étendre la faisabilité du STED à plusieurs
couleurs.
2° partie: essai en multi-couleurs
3° partie: apport de l'amélioration de la résolution en z
4° partie: discussion sur les apports de la techniques et ses limites.
Description
L'objectif de cet atelier est de montrer comment, de façon pratique, il est possible de
réaliser de l'imagerie de superrésolution en x, y et z en STED sur des fluorophores
98
ATELIERS
couramment utilisés en biologie cellulaire. Nous montrerons au moyen de levures
exprimant CFP, GFP et mCherry, la faisabilité et l'apport de cette technique dans l'étude
des remaniement du cytosquelette de la levure au cours de la quiescence et discuterons
des avantages et limites de cette imagerie comparées aux autres techniques de
superrésolution.
***
A15 - Suivi des tensions mécaniques au niveau des jonctions cellules-cellules en utilisant
des biosenseurs FRET.
Intervenants
Gaetan Herbomel, [email protected]
Marc Tramier, [email protected]
Objectifs
Sur un système FLIM, suivre le FRET au cours du temps du biosenseurs EcadTSMod au
niveau des jonctions cellules-cellules d'un modèle défini (Cellules ou embryons). Analyse
de différentes constructions incluant les contrôles (FRET minimal et FRET maximal), et ainsi
déterminer les forces appliqués aux jonctions en condition normal. En fonction du modèle,
suivi des variations de force induites par des phénomènes naturelles (division, apoptose ...)
ou induites par l'ajout de drogues agissant sur le cytosquelette. Ainsi au cours de l'atelier il
sera possible de voir l'aspect mesure de force par FLIM/FRET en utilisant les biosenseurs,
avec les contrôles nécessaires, ainsi que l'aspect dynamique du phénomène de
méchanotransduction.
Description
Etudier par FLIM/FRET les tension mécaniques au niveau des jonctions cellules-cellules en
utilisant des biosenseurs FRET tels que le "Cadherin tension sensor" (EcadTSMod) dans des
modèles d'épithélium (Cellules MDCK en culture, ou embryons).
Suivre spatio-temporellement les variations de force induite par différents phénomènes
biologiques (division, exclusion de cellules apoptotique, ...) in-vivo ou dans un modèle
"épithélium-like"
***
99
ATELIERS
A16 - Analyse dynamique des fibres de stress d’actine par photoconversion et nanoablation.
Intervenants
Laetitia Kurzawa, [email protected]
Fabrice Senger, [email protected]
Objectifs
Nous procéderons à une brève introduction sur la composition et l’organisation des fibres
de stress au sein des cellules eucaryotes. Nous pourrons ainsi mettre l’accent sur
l’importance de l’interaction entre cellule et matrice extracellulaire notamment dans des
processus de migration cellulaire et de même introduire la notion de méchanotransduction
impliquée, à titre d’exemple, dans la régulation de l’expression des gènes.
Pour l’ensemble des expériences proposées nous disposons des outils d’analyse ainsi que
de jeux de données acquises au laboratoire. Cela nous permettra en cas de problème
technique de présenter les résultats que permettent d’obtenir les approches proposées.
Nous aurons recours à des cellules vivantes RPE-1 exprimant une construction ActinDendra2 (molécule photoconvertible vert-rouge). Ces cellules seront déposées sur des
micro-patrons afin de contrôler leur géométrie et de générer ainsi des fibres de stress de
manière reproductible.
En un premier temps nous procéderons à des expériences de photoconversion. Il s’agit de
réaliser des marques régulièrement espacées le long des fibres de stress puis de suivre
l’évolution de ce signal dans le temps.
Dans un deuxième temps, nous procéderons à des expériences de nanablation sur ces
fibres de stress, nous pourrons suivre par time-lapse la rétraction des fibres ainsi coupées.
Finalement nous allons combiner les deux approches afin de vérifier l’impact de la nano
ablation sur la dynamique des molécules d’actine photoconvertie au sein des deux portions
de fibres.
Description
L’atelier à pour but de présenter deux techniques complémentaires permettant de
caractériser des aspects fondamentaux des fibres de stress. Les expériences de
photoconversion permettent de visualiser la dynamique de l’actine au sein des fibres de
stress. Les expériences de nano-ablation permettent de mettre en évidence l’accumulation
de stress mécanique au sein de ces fibres. Il s’agit en l’occurrence de suivre la relaxation de
ces fibres suite à la nano- ablation.
100
ATELIERS
La combinaison des deux techniques permet de visualiser l’impact du stress mécanique sur
la relocalisation de l’actine au sein des fibres.
***
A17 - Microfluidique en microscopie à fluorescence champ large et confocale.
Intervenants
Philippe Hulin, [email protected]
Ha Nedellec, [email protected]
Objectifs
L'atelier s'efforcera de démontrer l'intérêt de la microfluidique sur des systèmes
biologiques.
Nous prévoyons de faire une expérience de rolling afin de montrer des phénomènes
d'adhérences sur matrice ou tapis cellulaire, une autre expérience visera à mettre en
évidence la diapédèse en flux.
Nous pouvons également prévoir une expérience d'activation de cellules immunitaires
(Lymphocyte T) en associant des mesures de calcium (Fura-2) en présence de forces de
cisaillement.
Description
Avantage de l'apport de la force de cisaillemnet sur le comportement cellulaire.
***
A18 - Nouvelles sondes biocompatibles pour l’étude de la morphogenèse de l’embryon
de zebrafish par microscopie biphotonique.
Intervenants
Sylvia Bruneau, [email protected]
Marie-Thérèse Charreyre, [email protected]
Objectifs
L’atelier débutera par deux présentations synthétiques portant sur la synthèse des
molécules organiques et polymères synthétiques et la seconde portant sur leur utilisation
in vivo (balnéation). Ensuite, une démonstration pratique sera réalisée par microscopie
biphotonique d’embryons de zebrafish marqués.
101
ATELIERS
Description
L’atelier a pour but de présenter, dans le cadre d’une recherche transdisciplinaire entre
chimistes et biologistes, de nouveaux marqueurs organiques pour la microscopie
biphotonique dans des embryons de zebrafish in vivo.
Dans le domaine de l’imagerie d’embryons in vivo, les marqueurs génétiques (xFPs)
représentent la famille de marqueurs les plus populaires en imagerie biologique.
Cependant, il est nécessaire de produire des lignées transgéniques pour obtenir
l’expression stable de ces protéines fluorescentes. Souvent, les premiers stades de
développements ne sont pas accessibles car l’expression des marqueurs génétiques
nécessite l’activation du génome embryonnaire et la maturation des protéines
fluorescentes.
En alternative à la transgenèse, nous présenterons de nouvelles sondes biocompatibles
(molécules organiques et polymères synthétiques) excitables au-delà de 900nm pour
assurer une plus grande pénétration dans l’échantillon et émettant dans le proche
infrarouge afin d’étudier la morphogenèse d’embryons relativement épais tels que le
zebrafish par microscopie biphotonique.
***
A19 - Recording neuronal activity in Drosophila neurons using bi-photon microscopy
and genetically encoded calcium sensors
Intervenants
Abud Farca, [email protected]
Jean-Christophe Comte, [email protected]
Objectifs
One technique widely used to unravel spontaneous and sensory-evoked activity in
populations of neurons is using calcium imaging. The Drosophila model offers several
advantages to study neuronal circuits and their function due its short life cycle, easiness of
manipulation and genetic tools available. In the other hand, bi-photon microscopy is
recently preferred for functional imaging due to its sensitivity and less photo damage
compared to other calcium imaging techniques.
We will use the animal model Drosophila melanogaster to take advantage of the genetic
tools available and the readiness of the preparation. In specific, we will use the binary
system Gal4/UAS to express fluorescent genetically encoded calcium sensors (GCaMP) in
all or specific groups of neurons. An adult fly brain dissection would be performed in a petri
102
ATELIERS
dish to be observed under the bi-photon microscope. The brain is firstly recorded in
Ringer's solution as a physiological medium as baseline. After that, neuronal depolarization
would be elicited with KCl supplied in the drop of Ringer's solution covering the brain.
Changes in fluorescence of the calcium sensor due to calcium influx would be recorded.
Image sequences are analyzed by choosing a region of interest (ROI). Average emission
intensities from GCaMP are quantified for each image. Average intensities of a ROI outside
the labeled structure should be subtracted as background. The emission intensity (F) at the
frames immediately before KCl application is determined as F0, and ΔF/F0 is calculated for
each image.
Description
The aim of this workshop is to facilitate basic knowledge to study neuronal function
applying calcium imaging using bi-photon microscopy in the central nervous system of
Drosophila. The model is advantageous for this aim since a test of principle can be taught
in an easy and quick way.
***
A20 - Utilisation de biosenseurs chez le poisson zèbre : comment rapporter une activité
biologique in vivo
Intervenants
Jérémie Teillon, [email protected]
Carole Gauron, [email protected]
Objectifs
L’atelier sera encadré par Jérémie Teillon, responsable de la plateforme d’imagerie du CIRB
au Collège de France, et par Carole Gauron, ingénieur d’étude sur la plateforme de
transgénèse poisson zèbre du CIRB au Collège de France.
1) Introduction théorique aux biosenseurs et à leur utilisation chez le poisson zèbre
2) Dispositif expérimental :
Préparation d’un embryon de zebrafish en vu d’une observation au microscope confocal
(inclusion dans un gel d’agarose et montage).
Réglage des paramètres d’acquisition du microscope en fonction du senseur (ex : utilisation
du senseur ratiométrique « Hyper » pour la mesure de la production de ROS)
3) Acquisition de stack-z, multi-canaux, dans le temps.
103
ATELIERS
4) Traitement et analyse de l’image. Réalisation des images ratiométriques. Représentation
des résultats. Analyse au cours du temps.
Description
Le poisson zèbre, du fait de sa totale transparence aux stades embryonnaire et larvaire, est
de ce fait très adapté à l’imagerie et nous permet ainsi de tester de nombreux outils
optogénétiques, tels que les biosenseurs.
Ces biosenseurs génétiquement encodés permettent le suivi in vivo, de façon non invasive,
de processus biologiques importants survenant au cours du développement, ou à la suite
de perturbations.
Nous proposons donc dans cet atelier de suivre in vivo des phénomènes tels que la
production de radicaux libres (ROS), l’apoptose ou les variations de flux calciques avec des
biosenseurs. L’objectif de cet atelier sera de montrer l’intérêt de ces outils aussi bien dans
l’étude du développement que pour l’étude de pathologies.
***
A21 - Etude de la repousse axonale chez la drosophile : protocoles d'acquisition et
analyse d'images
Intervenants
Caroline Medioni, [email protected]
Grégoire Malandain, [email protected]
Objectifs
L’atelier se déroulera en 3 phases.
1. Présentation du modèle biologique (10 minutes)
2. Montage des échantillons sous loupe binoculaire avec source de lumière fluorescente.
Le montage est réalisé par l’intervenante, les participants seront invités à observer à la
loupe les différentes étapes du montage. (15 minutes environ)
3. Acquisition des images avec un microscope 2-photons avec statif inversé. Discussion
autour des conditions d’imagerie et du réglage des paramètres du microscope afin de
permettre une image dynamique d’axones en croissance de bonne qualité (i.e. peu de
blanchissement, bon rapport signal-sur-bruit, etc.). Réalisation d’une acquisition rapide, et
visualisation par le groupe des images sur la console. (45 minutes)
104
ATELIERS
4. Présentation des outils d’analyse d’images à base de diapositives, et de résultats obtenus
sur une séquence complète (i.e. suffisamment longue) acquise au préalable. Les étapes
abordées seront nous proposons :
a. correction du blanchissement
b. correction de la dérive
c. détection des terminaisons axonales
d. suivi des terminaisons axonales
e. post-traitement / sélection des suivis
Dans le cadre de l'atelier, nous approfondirons essentiellement des contributions originales
à savoir la correction de la dérive (un mélange du mouvement global de l'échantillon imagé
mais aussi de ses déformations liées à son évolution/croissance), et montrerons comment
l'utilisation des co-recalages des images de la séquence entière permet de mieux corriger
cette dérive, la détection des terminaisons axonales avec des processus ponctuels utilisant
un modèle géométrique dédié, et enfin le suivi de ces terminaisons vu comme un problème
d'optimisation dans des graphes. (45 minutes)
Description
Présenter une méthodologie complète combinant acquisition et analyse des images, avec
focalisation sur un problème spécifique d'imagerie dynamique.
Proposer un système de montage stable pour l'imagerie dynamique en microscopies 2photons et confocale.
Présenter des méthodes originales d’analyse d’images 3D + temps, en particulier pour la
correction de la dérive.
***
A22 - Correlative light and electron microscopy with Array tomography
Intervenants
Christel Genoud, [email protected]
Yannick Schwab, [email protected]
Objectifs
-les participants reçoivent des blocs de résine Avec des C.elegans ayant la trachée
fluorescente (mcherry).
105
ATELIERS
-les participants préparent des coupes de microscopie électronique en série à l Aide d un
Ultracut et les déposent sur des lames de verre ou des waffers. ce sont des rubans de
coupes.
-les coupes sont observées au microscope optique. les structures fluorescentes sont
identifiées sur chaque coupe sériée et leur coordonnées/localisation sont déterminées..
des Images sont acquise pour chaque coupe.
-les même coupes sont placées dans le microscope à balayage .
-grâce aux coordonnées obtenues au microscope optique, la région d'intérêt est
rapidement localisée en microscopie électronique et des Images à haute résolution sont
acquises pour Déterminer l'ultrastructure de la trachée.
Description
Observation/quantification d'une structure biologique à l'aide de la microscope optique
puis électronique. Des vers C. elegans préparés pour la microscopie électronique sont
coupés en série de coupes de 200 nm. L'identification de la structure d'intérêt se fait tout
d'abord avec des microscopes optiques à fluorescence permettant de localiser la structure
sur des coupes en série. En second lieu, les régions identifiées par microscopie optique sont
visualisées dans un microscope électronique à balayage pour en obtenir l'ultrastructure sur
des coupes sériées.
***
A23 - Optimisation de la résolution axiale et de la pénétration dans l’échantillon :
nouveaux milieux de montage à haut index réfractaire.
Intervenants
Susanne Bolte, [email protected]
Jean-François Gilles, [email protected]
Objectifs
-Introduction théorique (notions d’aberration sphérique, influence de l’épaisseur de la
lamelle, de l ‘huile d’immersion et du milieux de montage sur la résolution). Powerpoint,
environ 20 minutes.
-Démonstration pratique de la préparation d’un échantillon biologique optimisée (coupes
de cerveau de souris fixées). Comment monter son échantillon, quelle lamelle, quel milieu,
quelle huile. Environ 20 minutes.
106
ATELIERS
-Exploitation de lames au confocal, acquisition de z-stacks sur des échantillons biologiques.
Environ 50 minutes.
• Influence de la lamelle, influence du milieu de montage.
• Echantillon optimisé.
-Exemples d’application biologique en neurobiologie et application pour d’autres types
d’imagerie. Powerpoint, environ 15 minutes
Discussion/Questions, environ 15 minutes.
Description
La résolution latérale d’un système optique augmente de façon linéaire avec l’ouverture
numérique de l’objectif utilisé, tandis que la résolution axiale augmente de façon
quadratique. C’est une des raisons, pour laquelle on utilise des objectifs à haute ouverture
numérique et donc à immersion huile pour la microscopie confocale. Leur performance a
été optimisée pour des systèmes d’immersion idéales, c’est à dire pour travailler dans un
indice de réfraction homogène et comparable à celui du verre. Cependant, les milieux
conventionnels que nous utilisons dans la pratique ont un indice de réfraction entre 1,4 et
1,49 qui est légèrement en dessous du système d’immersion « objectif-huile d’immersionlamelle » avec 1,518. Ceci engendre des aberrations sphériques et par conséquent une
perte de résolution axiale, d’énergie en profondeur de l’échantillon et une décalage du
point focal (Hell et al., 1993, Diaspro et al., 2002, Egner and Hell, 2006).
L’objectif de cet atelier est de montrer qu’une préparation optimisée d’échantillon permet
d’éviter les aberrations sphériques rencontrées en microscopie confocale. Nous
montrerons premièrement que la divergence entre le système d’immersion « objectif-huile
d’immersion-lamelle », le milieu de montage et l’échantillon induit une aberration
sphérique non-négligeable. Ensuite, nous comparerons des milieux de montage
conventionnels avec de nouveaux milieux à haut index réfractaire. Nous démontrerons
l’amélioration de la résolution axiale et de la pénétration dans des échantillons fixés épais
(cerveau de souris, poisson zèbre) soit immuno-marqués ou portant des protéines
fluorescentes. De même, nous démontrerons l’influence des milieux de montage sur la
transparence des tissues.
***
107
ATELIERS
A24 - Du microscope à l'analyse des neurones chez la souris: mosaïque et Imagerie 3D
sur neurones en culture et tissus en profondeur.
Intervenants
Lydia Danglot, [email protected]
Vincent Contremoulins, [email protected]
Objectifs
Bref rappel théorique avec diapos et/ou poster sur l'échantillonnage, la résolution optique,
et les calculs de correction d'inhomogénéité de champ.
Acquisition d'images sur un confocal (de préférence Leica avec si possible module 3Dx) sur
des cellules en cultures fixées (2D) et sur des coupes de tissus nerveux (3D).
Les coupes de cerveaux de souris transgéniques (non pathogènes) exprimant la CFP dans
les dendrites et épines nerveuses avec quadruples marquages fluorescents permettront de
visualiser les couches cellulaires (2-5mm), l'arbre dendritique
(100-200 microns) et les épines (1-3um) et d'appréhender ainsi les différentes échelles
biologiques.
Ouverture et reconstruction des mosaïques sur ImageJ et Icy (logiciels gratuits).
Analyse d'épines dendritiques avec Matlab et Imaris : segmentation, tri sur critères
morphologiques (taille, diamètre, longueur), classement par catégories d'épines (filopodes,
mushroom, stubby).
La quantification de la proportion d'epines dendritiques de type mushroom vs stubby est
biologiquement informative car elle est corrélée au processus de mémorisation (plasticité
cérébrale) couremment mesurée chez certains mutants.
Description
Mosaïque :
Maîtriser les notions d'échantillonnage, de résolution et Savoir réaliser une mosaïque
d'images confocales.
Réaliser des acquisitions avec lames type "Chroma" pour mesurer l'inhomogénéité.
Reconstruire les mosaïques (avec ImageJ et/ou Icy) et corriger l'inhomogénéité de fond
(Shadding correction).
Analyse 3D :
Savoir réaliser une acquisition 3D sur tissus (ex: réseaux neuronaux et épines dendritiques).
Optimiser l'échantillonnage d'acquisition en fonction de l'objectif et de l'épaisseur de
l'objet.
Savoir reconstruire, visualiser, quantifier et classer des objets 3D en fonction de paramètres
morphologiques (taille, longueur).
***
108
ATELIERS
A25 - Imagerie multiphotonique grand champ : application à l’étude de tumeurs dans
leur contexte tissulaire.
Intervenants
Marie Irondelle, [email protected]
François Waharte, [email protected]
Objectifs
Dans un contexte d’imagerie intravitale, nous étudierons la structure de tissus comportant
des tumeurs induites par injection in vivo de cellules fluorescentes sur un prototype de
microscope grand champ, permettant l’imagerie de fluorescence par excitation à deux
photons et la génération de seconde harmonique.
1) Présentation du système optique et de ses caractéristiques
2) Exploration des tissus préparés et fixés préalablement (prélèvement de souris) :
- Imagerie 3D en excitation à deux photons et SHG à différentes profondeurs,
- analyse de la structure de la matrice extracellulaire (collagène) dans différentes régions,
- comparaison de cette structure dans différents tissus pour voir l’influence des cellules
tumorales sur sa ré-organisation.
Description
imagerie de cellules fluorescentes et de la matrice extracellulaire par fluorescence à deux
photons et génération de seconde harmonique
***
A26 - Microscopie à feuille de lumière sur échantillons végétaux (jeunes racines)
Intervenants
Houssam Hajjoul, [email protected]
Geneviève Conéjéro, [email protected]
Objectifs
Atelier limité à 8 personnes
Présentation du système
Protocoles de préparation des échantillons.
Montage des plantes dans la chambre.
Acquisitions des images
Traitement des images
109
ATELIERS
Description
Etudes des Relations structure-fonction chez la plante: visualisation en 3D de l'architecture
cellulaire et tissulaire de racine de jeune plantule (Arabidopsis thaliana, riz) et de
marquages fluorescents fonctionnels (plantes transformées GFP, YFP...).
Marquages de transporteurs d'ions, aquaporines et facteurs de transcriptions.
Suivi dans le temps de la croissance racinaire, émergence de racines secondaires (24-48h)
en conditions contrôlées: imagerie rapide.
Objectif: pouvoir comparer croissance wild-type et mutants en microscopie à feuille de
lumière.
***
A27 - Accéder au monde de la super-résolution sous illumination structurée (SR-SIM)
Intervenants
Yasmina Saoudi, [email protected]
Florence Appaix, [email protected]
Objectifs
Nous proposons de tester la microscopie super-résolutive par lumière structurée (SR-SIM)
sur différents échantillons biologiques et de comparer les images obtenues à celle déjà
réalisées en microscopie confocale.
De manière simple, l’atelier pourrait se dérouler de la manière suivante :
1) L’intervenant présentera un système cellulaire particulier : les cellules épendymaires
différenciées à partir d’astrocytes obtenues à partir d’hémisphères cérébraux d’embryons
de souris. Ces cellules présentent la particularité d’être recouvertes de cils motiles pour
assurer la circulation du liquide céphalorachidien dans le cerveau…Après mise en culture
et expériences d’immunofluorescence (déjà réalisées avant l’atelier), nous recherchons
dans les structures ciliées d’un modèle de souris KO TTL (Tubuline Tyrosine Ligase), les
différences de composition en tubuline et cherchons à déterminer s’il existe des défauts
morphologiques entre les cellules WT & KO. Ces différences sont subtiles et nécessitent
une haute résolution en 3D. Effectivement, nous montrerons que ces échantillons sont à la
limite de la résolution de 300nm et nécessitent de dépasser la limite de diffraction.
Nous aimerions présenter la technique SR-SIM proposé par la société Zeiss car nous
sommes déjà familiarisées au système Elyra PS1 qui permet de voir l’ultrastructure en 3D.
2) Les utilisateurs pourront apporter des lames d’échantillons fixés marqués avec plusieurs
fluorochromes déjà observés en microscopie classique et découvrir sans préparation
supplémentaire la haute résolution atteinte par les techniques de microscopie en lumière
structurée…
110
ATELIERS
Description
Dépasser les limites de résolution de la microscopie confocale standard pour révéler des
détails dans l’échantillon jusqu’alors inaccessibles et visualiser l’ultrastructure 3D de
l’échantillon d’intérêt en microscopie optique.
***
A28 - L'imagerie de fluorescence haute résolution : du modèle murin au patient
Intervenants
Corinne LAPLACE-BUILHE, [email protected]
Valérie ROUFFIAC, [email protected]
Objectifs
EN PREAMBULE : L’expérimentation animale ne pouvant être réalisée que dans un
établissement agréé, la partie pratique de l’atelier (imagerie au Cellvizio) sera proposée sur
des explants animaux (déchets expérimentaux murins), issus de projets autorisés à Gustave
Roussy-Villejuif.
L’atelier sera découpé en 3 parties (30 min/ 60 min/ 30 min):
• La première partie (30 min) sera réservée à la présentation théorique du panel d'outils
nécessaires à l'amélioration de l'imagerie haute résolution in vivo :
- Imageurs macroscopes et microscopes confocaux/ Multiphoton adaptés à l’imagerie du
vivant
- Les sondes et marqueurs fluorescents pour le vivant : Peut-on facilement transposer l’ex
vivo à l’in vivo ?
- Présentation d'un exemple de développement issu du support du GDR 2588: Une nouvelle
génération de chambre dorsale pour l'imagerie haute résolution et multimodalité sur
modèles murins, in vivo.
• La deuxième partie (60min), sera consacrée à la prise en main par les participants d’un
confocal fibré dual band (488-660 nm), pour l’imagerie d’organes murins entiers. L’objectif
de cette session pratique sera de présenter sur les images obtenues les particularités de
l'imagerie confocale fibrée et d’aborder notamment la question récurrente : Comment
comparer l'imagerie confocale fibrée avec l'imagerie réalisée sur un confocal
conventionnel.
• La troisième partie (30 min) propose d’ouvrir aux participants, l’expérience d’un transfert
en clinique de la microendoscopie et de réfléchir à l’établissement d’une feuille de route
résumant les points clés pour le transfert de cette technologie pour l’imagerie clinique peropératoire.
111
ATELIERS
Description
Cet atelier propose de faire découvrir les différents aspects ainsi que les contraintes
techniques et les défis de l’imagerie de fluorescence à haute résolution in vivo, en
recherche biomédicale sur modèles murins et en recherche clinique lors d’essais sur
patients.
Cet atelier propose également d’étayer les points clés pour la mise en œuvre des
technologies photoniques in vivo en imagerie biomédicale.
Au travers de l’exemple de l’imagerie confocale fibrée, que les participants pourront utiliser
sur organes murins entiers, les participants seront invités à élaborer une feuille de route
résumant les éléments nécessaires pour le déploiement en clinique de cette technologie,
à partir d’un cas concret d’application clinique.
***
A29 - Apport de l'endomicroscopie confocale (ECM) à l'étude des lésions inflammatoires
intestinales chez l'animal et l'homme
Intervenants
Jeremy Bregeon, [email protected]
Objectifs
Cet atelier sera illustré par des exemples acquis chez l'animal et l'homme et ayant donné
lieu à des publications.
Description
Cet atelier a deux objectifs principaux. D'une part, il vise à présenter les capacités de l'ECM
à caractériser in vivo les anomalies architecturales et fonctionnelles de la muqueuse
digestive dans différentes conditions pathologiques (inflammatoires et pré-cancéreux).
Une deuxième partie sera dédiées à la présentation d'outils d'analyse d'image permettant
de quantifier ces atteintes.
***
A30 - Test de dispositifs à feuille de lumière "open source"
Intervenants
Frédéric Brau, [email protected]
Damien Alcor, [email protected]
112
ATELIERS
Objectifs
1) Description du projet global feuille de lumière : genèse, choix techniques, évolutions...
2) Présentation des 2 ou 3 solutions techniques (en fonction des évolutions jusqu'à
Mifobio) sur l'atelier.
3) Utilisation et configuration de Micro-manager sur ces systèmes
4) Contraintes de préparation des échantillons.
5) Test des systèmes avec des échantillons en 2 groupes.
6) Gestion des images.
Description
Diffuser des outils abordables pour réaliser de l'imagerie à feuille de lumière.
Démystifier la fabrication, la mise en oeuvre et l'utilisation de prototypes et systèmes
d'imagerie à feuille de lumière libres.
***
A31 - Application de la microscopie multiphotonique et de la technologie des capsules
cellulaires à l’imagerie des modèles tumoraux des mammifères
Intervenants
Vasily Gurchenkov, [email protected]
Objectifs
During this workshop we will first briefly describe the Cellular capsules technology and its
application to cancer research (20’). Secondly we will discuss different imaging methods,
their application to multicellular tumoral models, their advantages and drawbacks (20’).
Finally we will demonstrate the procedures of handling, mounting and multiphoton
imaging of the cellular capsules (1h20’).
Description
There is now growing evidence that 3D cell cultures better mimic the functions of normal
and pathological tissues. In cancer biology, the development of 3D in vitro cell-based assays
is further motivated by the ethical pressure to reduce animal testing. Fundamental and
113
ATELIERS
therapeutic progress in the field is thus conditioned by innovation in both 3D imaging and
high throughput reproducible preparation of 3D samples.
Mammalian cell aggregates, also referred to as multicellular spheroids (MCSs), have been
recognized as a relevant model of tumor growth and evolution in vitro. These model
systems allow recapitulating many tumor physiological features that are out of reach when
cells are cultured in a Petri dish as two-dimensional monolayers. However, despite
considerable efforts in the field, the production of MCSs as well as their manipulation and
the imaging strategies are far from being acknowledged as universally and routinely
applicable.
Here, we present a novel method enabling mass production of MCSs of different cell types
without a requirement of natural propensity of cells to form aggregates. This material
science based approach relies on the encapsulation and growth of cells inside transparent,
permeable, elastic, hollow micro-spheres (capsules).
We show that this technique considerably facilitates the imaging of MCSs using
multiphoton microscopy.
References:
Cellular capsules as a tool for multicellular spheroid production and for investigating the
mechanics of tumor progression in vitro. Alessandri K, Sarangi BR, Gurchenkov VV, Sinha B,
Kießling TR, Fetler L, Rico F, Scheuring S, Lamaze C, Simon A, Geraldo S, Vignjevic D,
Doméjean H, Rolland L, Funfak A, Bibette J, Bremond N, Nassoy P. Proc Natl Acad Sci U S A.
2013 Sep 10;110(37):14843-8.
Light-sheet microscopy in thick media using scanned Bessel beams and two-photon
fluorescence excitation. Fahrbach FO, Gurchenkov V, Alessandri K, Nassoy P, Rohrbach A.
Opt Express. 2013 Jun 3;21(11):13824-39.
Live cell division dynamics monitoring in 3D large spheroid tumor models using light sheet
microscopy.Lorenzo C, Frongia C, Jorand R, Fehrenbach J, Weiss P, Maandhui A, Gay G,
Ducommun B, Lobjois V.Cell Div. 2011 Dec 12;6:22.
Quantitative 3D cell-based assay performed with cellular spheroids and fluorescence
microscopy.Ansari N, Müller S, Stelzer EH, Pampaloni F.
***
114
ATELIERS
A32 - Apport de la microscopie multiphotonique pour l’imagerie en profondeur
Intervenants
Meriem Garfa Traore, [email protected]
Aude Jobart Malfait, [email protected]
Objectifs
Après un bref rappel théorique du principe de la microscopie multiphotonique nous
présenterons le protocole de préparation de l’échantillon ainsi que le principe de
fonctionnement de l’agent de clearing BABB.
Nous réaliserons des acquisitions en profondeur basées sur l’autofluorescence de
l’échantillon à la fois grâce à une excitation monophoton (excitation à 488nm, détection de
l’autofluorescence entre 510 et 545nm) puis à une excitation biphotonique (laser IR
accordé à 820nm, émission entre 510 et 545nm). Sur la base de ces acquisitions, nous
discuterons de l’apport de l’excitation biphotonique pour l’imagerie d’échantillons épais.
Dans une deuxième partie, nous réaliserons l’acquisition par excitation biphotonique d’un
rein de souris traité par l’agent de transparence BABB (excitation laser IR accordé à 820nm,
émission entre 510 et 545nm). Nous comparerons les datas obtenues avec celles de
l’échantillon non transparent obtenues précédemment et discuterons des avantages et
inconvénients d’un traitement par le BABB. Discussion sur autres protocoles de
transparence.
Enfin, nous comparerons et visualiserons en 3D les données obtenues sur Imaris.
Description
Montrer l’apport de la microscopie multiphotonique dans l’étude de la structure
d’échantillon épais en comparaison à la microscopie confocale classique
Montrer l’intérêt de l’utilisation d’agent de clearing de type BABB pour l’accès à la
profondeur .
Comprendre et mettre en œuvre l’imagerie biphotonique sur du tissu rénal de souris non
marqué
Connaitre et comprendre les protocoles permettant de rendre les échantillons
transparents
***
115
ATELIERS
A33 - Ultramicroscope : Acquisition en feuille de lumière d’échantillons transparents
fixés.
Intervenants
David Godefroy, [email protected]
Objectifs
L’atelier se déroulera en 5 points :
- Rappel sur le principe de la microscopie à feuille de lumière, les avantages et les
inconvénients de cette technique d’imagerie pour l’acquisition d'échantillons fixés avec
une partie « présentation des modèles disponibles, commerciaux ou fabriqués ».
- Principe de « transparisation » d’échantillons fixés pour acquisition en feuille de lumière.
Ce point présentera différentes techniques de « transparisation » d’échantillons (3Disco,
Clarity, Scale, Cubic …) avec une comparaison des différents protocoles répertoriant leurs
avantages et leurs inconvénients.
- Présentation des différents protocoles de marquage des échantillons (système nerveux
central, embryon) tels que les immunomarquages in toto ou les injections de traceurs
fluorescents.
- Acquisition d’échantillons préalablement préparés sur un microscope à feuille de lumière
piloté par le logiciel dédié Imspector.
- Reconstruction en 3 dimensions des stacks d’images acquises avec une présentation des
possibilités d’analyses.
A la fin de cet atelier les stagiaires auront des notions sur les différentes étapes de
préparation pour des acquisitions et des reconstructions en trois dimensions d’échantillons
entiers fixés. Des notions sur les techniques de marquages avec les possibilités et les limites
de celles-ci. Ils pourront assister à la mise en place de l’échantillon et à l’acquisition de
celui-ci directement sur un microscope à feuille de lumière. Ils auront une idée de ce
qu’apporte une visualisation en trois dimensions d’échantillons fixés.
Description
Les acquisitions en feuille de lumière permettent d’imager rapidement, sans coupes
préalables, des échantillons transparents marqués par immunohistochimie. Le but est
d’avoir une représentation la plus fidèle possible, en trois dimensions, des structures
acquises. Cette technique utilisée comme outil d’imagerie dans la biologie du
développement permet une imagerie précise d’échantillons entiers comme par exemple
les embryons ou le système nerveux central.
***
116
ATELIERS
Intervenants
Floris Bosveld, [email protected]
Yohanns Bellaiche, [email protected]
Objectifs
Shape is a conspicuous and fundamental property of living multicellular organisms.
Questions such as how embryonic development produces organisms with reproducible
morphological patterns, how tissue moves and which mechanisms underlie the diversity of
organ shape have haunted developmental biologists for decades. Novel imaging methods
have changed our view of the complex cellular dynamics underlying tissue morphogenesis.
They illustrate that tissue morphogenesis is a multi-scale process supported by the
coordinated and collective dynamics of cells (such as cell shape changes, cell
rearrangements and cell divisions) that produce large-scale tissue changes. Cell biological
and physical approaches have greatly contributed to deciphering the subcellular processes
controlling cell shape changes and cell rearrangements. They show that cell shape changes
and cell rearrangement are triggered by the local regulation of actin-myosin dynamics that
controls cell junction mechanics. Accordingly, the regulation of cell junction tension has
been implicated in convergence extension movement, the physical separation of
compartment boundaries, the orientation of cell division and the establishment of planar
cell polarity. A central question in tissue morphogenesis is therefore to decipher how
signalling pathways modulate and coordinate local cell dynamics and mechanical
properties to drive large-scale tissue movements.
The workshop will be focused around how the Drosophila pupa dorsal thorax epithelium
can be used as a model system to study the interplay between genetics and mechanics that
control tissue morphogenesis.
During the workshop I will explain why we study morphogenesis and why the Drosophila
pupa dorsal thorax epithelium is an excellent model system. I will demonstrate how the
Drosophila pupa is prepared for imaging, in which interested participants could participate.
Furthermore, I will explain how data from multiple individuals is prepared for analyses, how
we can extract average maps of cell and tissue scale dynamics and kinematics, and finally
how using these average maps can be used to study mutant conditions.
Outline
A) Brief introduction of tissue morphogenesis and the Drosophila dorsal thorax epithelium.
B) Demonstration of a dissection, mounting and imaging of a Drosophila pupa.
C) Using previously acquired movies/images I will illustrate how from raw data we:
117
ATELIERS
1) Synchronize movies in space and in time.
2) Obtain skeletonized images.
3) Quantitatively describe cell/tissue dynamics and kinematics and create average maps.
4) Correlate average maps of cell/tissue dynamics and kinematics with protein polarization
or gene expression gradients.
5) Extract differences in average maps of cell/tissue dynamics and kinematics between
wild-type and mutant conditions.
Description
How tissues adopt their shape is a central and fascinating question in biology. Advances in
imaging, cell biology, signal transduction and biophysics frame the study of tissue
morphogenesis in terms of cell dynamics and the interplay between biochemical and
mechanical processes. Recently, we have implemented a live-imaging method of observing
a whole epithelial tissue in Drosophila pupa, from the cell-scale to the tissue-scale. We can
follow ~104 cells over several cell cycles with 5 min resolution over 26 h of development
and 0.32 μm resolution over the ~750x700 μm2 of tissue. Furthermore, we have developed
a multi-scale mathematical framework allowing the quantification of cell dynamics (cell
shape changes, cell division, cell rearrangement, apoptosis) in common units and of the
contribution of these processes to global tissue development. In addition, we have
developed tools to quantitatively analyze protein distributions and polarity, as well as gene
expression gradients. Currently, we are further extending this framework to quantify
relative cell pressures and edge tensions. Using these quantitative methodologies, we aim
to study morphogenesis in wild-type and mutant conditions to provide insights in the
fundamental interplay between genetics and mechanics that control tissue morphogenesis
in metazoans.
***
A35 - Imagerie multi couleurs et multi échelles d’embryons de poisson zébré
Intervenants
Adeline Boyreau, [email protected]
Adeline Rausch, [email protected]
Objectifs
Cet atelier permettra de :
1. Préparer les échantillons biologiques fixés (sélection des spécimens en fonction de la
qualité des marquages fluorescents sous loupe binoculaire)
118
ATELIERS
2. Montage des embryons fixés pour acquisition in toto au moyen de l’imagerie de deux
moitiés d’embryons. A priori sur microscope inversé.
3. Imagerie 3D spectrale pour la séparation d’au moins 5 fluorochromes
4. Imagerie STED de l’organisation des microfilaments et ou des microtubules dans
l’epithelium de l’embryon et le cortex de la cellule vitelline
4. Recalage, fusion et visualisation des différentes images d’un même specimen
5. Principe du recalage des images 3D sur une acquisition 3D+temps d’un specimen de
zebrafish vivant. Cette acquisition sera faite hors atelier pour que l’ensemble de l’atelier
tienne dans un créneau de 2h00
Description
Marquage simultané de différentes structures (membranes cellulaires, noyaux,
cytosquelette) en générant de la diversité de couleur notamment et imagerie à différentes
échelles (localisation nano/micro/meso/macroscopique) sur des embryons de zebrafish
fixés ou vivant. Acquisition de données compatibles avec la reconstruction d’atlas
3D+temps d’expression génétique et d’activités biologiques.
***
A36 - Manipulation optogénétique et imagerie 3D et 3D+temps d’embryons de poisson
zébré trangéniques de type “rainbow” ou « photo »
Intervenants
Julien Dumont, [email protected]
Monique Frain, [email protected]
Objectifs
Cet atelier permettra de :
1. Présenter les conditions d’obtention de mosaiques de couleurs dans les embryons «
rainbow » ou « photo » (contrôle optogénétique de recombinaisons génétiques,
photoconversion)
2. Sélectionner les specimens en fonction de l’intensité des marquages
3. Monter les embryons en fonction de la stratégie d’imagerie (MLMS, CLSM, SPIM, OT)
4. Définir les paramètres d'acquisition adéquats pour imager jusqu'à 4 couleurs.
5. Imager les spécimens vivants ou fixés
119
ATELIERS
6. Analyser les images pour la reconstruction de l’histoire clonale des cellules.
Description
Explorer le potentiel de lignées de poissons trangéniques de type « rainbow » et « photo »
pour la reconstruction du lignage cellulaire et l’analyse de la diversité cellulaire clonale dans
l’embryon.
Description, incluant les modalités pédagogiques et le déroulé de l'atelier *
Il s’agit d’utiliser des lignées de poissons transgéniques de type rainbow ou photo pour
générer des mosaiques de couleurs qui vont faciliter l’identification de populations
cellulaires clonales. Nous allons examiner : i) les possibilités de génération de ces
mosaiques y compris au moyen de manipulations optogénétiques, ii) leur conditions
d’imagerie et iii) les informations apportées par les images obtenues au moyen de
stratégies d’analyse automatisées.
***
A37 - Real time visualization of MAP kinase ERK activity and localization dynamics in
living cells using multi-parameters FRET imaging.
Intervenants
François Sipieter, [email protected]
Franck Riquet, [email protected]
Objectifs
In this workshop, we will describe and illustrate:
- FRET biosensors and significant contributions to resolve spatiotemporal dynamics of
signaling networks in the special case of MAPK/ERK pathway.
- Frequency Domain (FD) FLIM/LIFA method using phase and modulation measurements
for the analysis of FRET signals.
- Calibration of FD FLIM system (references, controls, etc.)
- Real time multi-parameter imaging of MAPK/ERK activity, localization and interaction
dynamics in single living cells by combination of a FRET/FLIM approach and ratiometric
imaging.
- Analysis of data obtained from cells expressing FRET biosensors and GFP-like-tagged
MEK1-ERK2.
- Crucial factors to keep in mind to ensure the efficiency and reproducibility of FRET
measurements.
120
ATELIERS
Description
Live-cell microscopy is routinely used to monitor kinase activities with genetically encoded
FRET biosensors that are designed to detect and report biochemical events in living cells
and tissues. We focus on biosensors dedicated to kinase activity measurements of the
MAPK/ERK signaling pathway. Depending on cell type and stimulus, compartmentalized
MAPK/ERK activity is able to mediate a specific cellular response thus leading to unique
spatio-temporal signatures.
While intensity-based ratiometric imaging methods are commonly used to monitor kinase
activities, we will use fluorescence lifetime imaging microscopy as an alternative method
to determine MAPK/ERK activation state upon a pro-survival and a pro-death signal. Multiparameter imaging will be performed quasi-simultaneously by combination of FRET/FLIM
measurements and localization of the kinase of interest. In the same way, in order to
achieve quasi-simultaneously activation, localization and interaction of MAPK/ERK in living
cells, we could also propose to combine FRET/FLIM imaging of the ERK biosensor and
ratiometric imaging of MAPK/ERK2-MEK1 interaction in unique cell.
***
A38 - Illumination structurée pour manipulation optogénétique et photopatterning
Intervenants
Vincent Studer, [email protected]
Mathieu Coppey, [email protected]
Objectifs
Nous commencerons par décrire le fonctionnement et les propriétés des systèmes de
micromiroirs, ainsi que leur intégration dans un système de microscopie pour l'imagerie de
cellules vivantes. Ensuite, nous montrerons comment il est possible de contrôler à une
échelle subcellulaire l'activité de la cellule (par exemple en activant certaines voies de
signalisation agissant sur la migration), grâce à des outils optogénétiques. Enfin, nous
montrerons comment il est possible de contrôler par la lumière l'accrochage de protéines
à la surface de lamelles de verre avec une résolution spatiale inférieure au micron.
Description
Notre but est de montrer l'intérêt et le potentiel d'un système d'illumination structurée
basée sur un système de micromiroirs pour de nombreuses applications en biophysique,
biologie cellulaire, biochimie et biotechnologies. En particulier, nous montrerons comment
il est possible de contrôler l'activité à une échelle subcellulaire sur un grand nombre de
121
ATELIERS
cellules en parallèle par des outils optogénétiques. Nous présenterons également des
techniques de micropatterning contrôlées par la lumière pour le greffage dynamique de
protéines sur des surface et le contrôle de l'adhésion cellulaire.
***
A39 - Contrôle et visualisation de protéines in vitro par optogénétique
Intervenants
Marie-Noëlle Soler, [email protected]
Marine Scoazec, [email protected]
Objectifs
- s'initier aux méthodes de manipulation non invasive de fonctions cellulaires par des
sondes sensibles à la lumière qui seront codées génétiquement.
- apprendre à choisir sa modalité d’imagerie et à contrôler spatialement la lumière
Déroulé : Après une introduction sur les méthodes employées (support numérique), les
échantillons biologiques seront étudiés par imagerie plein champ, TIRF et spinning disk.
Description
Contrôler et suivre la localisation de protéines à l’échelle subcellulaire
***
A40 - Optique adaptative et microscopie de fluctuations de fluorescence
Intervenants
Antoine Delon, [email protected]
Joseph Gallagher, Joseph Gallagher <[email protected]>
Objectifs
Deux alternatives :
1) adapter un miroir déformable sur un microscope biphoton fonctionnant en comptage
de photons
2) manip de démo sur un bread board en confocal (pas de balayage, pas d'image)
Exposé des principes de l'OA en boucle ouverte
122
ATELIERS
Mesure de la brillance en FCS
Démonstration de l'optimisation de la brillance
Description
Démontrer les principes de l'optique adaptative pour la microscopie en boucle ouverte,
c'est à dire sans mesure du front d'onde, mais en utilisant une métrique dont l'optimisation
correspond à une amélioration du front d'onde. En utilisant des échantillons contenant des
molécules fluorescences diffusant librement, montrer que le signal par molécule (ou
brillance) mesuré par Fluorescence Correlation Spectroscopy est une métrique adaptée,
car équivalente au rapport de Strehl. Mettre en œuvre ces principes dans des situations
contrôlées (bague de correction mal réglée, lamelle inclinée, désaccord d'indice de
réfraction, chambre à flux, etc.)
***
A41 - Mesure de concentrations surfaciques de molécules par spectroscopie à
corrélation d'images
Intervenants
Antoine DELON, [email protected]
Objectifs
Les participants de l'atelier pourront venir avec leurs propres échantillons, dès lors que les
molécules à analyser sont déposées sur des substrats en verre, plastique, éventuellement
recouverts de PDMS ou autre polymère, compatible avec un microscope inversé travaillant
avec un objectif de forte ouverture numérique.
Nous ferons des acquisitions d'images confocales et montrerons comment l'utilisation d'un
logiciel développé sous ImageJ sur la plate-forme IBiSA de Grenoble permet de remonter à
la concentration surfacique absolue.
Description
Les techniques de micro-fabrication et de fonctionnalisation des surfaces impliquent de
connaître les concentrations surfaciques d'équilibre des molécules adsorbées sur les
substrats. Curieusement, c'est un paramètre crucial très mal connu. Nus développons la
spectroscopie à corrélation d'images (ICS), qui est basée sur le calcul de l'autocorrelation
des images (en général confocale). Lorsque l'échantillon est constitué de molécules
immobiles distribuées aléatoirement dans l'espace (supposées se comporter comme des
absorbeurs-émetteurs ponctuels), l'amplitude de la fonction d'autocorrelation n'est autre
123
ATELIERS
que l'inverse du nombre de molécules dans le volume (ou dans la surface) d'observation.
Une méthodologie expérimentale et d'analyse des données appropriée permet de
remonter de façon fiable à la concentration absolue des molécules.
***
A42 - Microscopie multimodale (vidéo microscopie 4D, FRAP, TFM)
Intervenants
Philippe Ronde, [email protected]
Philippe Carl, [email protected]
Objectifs
Nous proposons un atelier de microscopie multimodale combinant des approches de
vidéomicroscopie rapide en mode plein champ, avec des mesures de coefficient de
diffusion de molécules en mode FRAP et suivies par de expériences de TFM (Traction Force
Microscopy) afin de corréler les mesures de FRAP aux forces d’adhésion des cellules à leur
support. Nous analyserons les paramètres critiques (rapport signal/bruit, vitesses
d’acquisition) qui conditionnent l’obtention d’une courbe de FRAP dans les différents
modes d’acquisition. Et extrairont ensuite les forces de traction à partir d’images de
positionnement de billes imbriquées dans un gel de polyacrylamide avant et après ajout de
trypsine.
Description
La mesure des paramètres de diffusion des molécules en cellule vivante est aujourd’hui
possible grâce aux avancées de la microcopie. La technique de FRAP permet de déterminer
les temps de résidence d’une molécule au sein d’une structure donnée. Les expériences de
FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) consistent à photoblanchir une
protéine fluorescente dans la structure visée et à visualiser le retour de fluorescente qui
provient des molécules fluorescentes voisines non détruites qui diffusent vers la structure
cible. Ceci nous permet d’estimer la mobilité d’une molécule au sein d’une structure
spécifique. Cette mobilité est largement influencée par les interactions protéiques qui
fixent la protéine dans une structure au lieu de diffuser librement.
D’un autre coté la technique de TFM (Traction Force Microscopy) permet d’extraire les
forces de traction que les cellules exercent sur un substrat en les cultivant sur des gels de
polyacrylamide contenant des billes fluorescentes. La position des billes est acquise en EPIfluorescence avant et après ajout de trypsine (qui permettra de décoller les cellules du
support). La déformation du gel est ensuite calculée à partir du déplacement des billes
124
ATELIERS
entre le support au repos et avec la présence des cellules en utilisant un algorithme de PIV
(Particle Image Velocity). Et une fois la déformation du gel calculée, les forces de traction
sont déduites à partir de la valeur du module de Young du gel.
***
A43 - Analyse de la dynamique moléculaire par corrélation d’images de fluorescence
Intervenants
Perrine Gilloteaux, [email protected]
Objectifs
1) Présentation du principe théorique des différentes techniques et leurs applications
(cours).
2) Mise en pratique sur des jeux de données simulées et expérimentales en utilisant un
plugin ImageJ dédié (TP)
3) Analyse critique des résultats et des limitations des différentes techniques (TPs)
Description
Comprendre et savoir utiliser les méthodes de corrélation d'images pour l’analyse de la
dynamique moléculaire:
- estimation de densité d'objet
- estimation de flux et de diffusion, de proportion de population immobile
- estimation de la corrélation de dynamique entre deux protéines
***
A44 - Analyse de la diversité des réponses calciques individuelles dans une population
de cellules non adhérentes par la méthode MAAACS (Methods for Automated and
Accurate Analysis of Cell Signals)
Intervenants
Yannick HAMON, [email protected]
Cyrille BILLAUDEAU, [email protected]
125
ATELIERS
Objectifs
Cet atelier cherchera à sensibiliser les participants aux difficultés inhérentes à
l’enregistrement en video-microscopie en proposant une méthodologie appelée MAAACS
(Salles,A. et al. PLoS Comput Biol. 2013;9(9):e1003245).
Cette méthode intègre une réflexion sur le choix de sonde calciques, dans l’optique d’une
simplicité de mise en œuvre sur tout type de microscopie à fluorescence, d’une adequation
du Kd des sondes aux concentrations intracellulaires calciques et d’une optimisation des
conditions expérimentales procuré par la stabilité des charges en indicateur calcique.
Dans un second temps, l’attention des participants sera attirée sur le tracking automatique
des cellules, notre approche utilisant un algorithme de suivi de particules uniques (Multiple
Target Tracing, Sergé, A. et al. Nat Methods. 2008 Aug;5(8):687-94.). L’exhausitivité de
cette étape de tracking sera évaluée par rapport à une approche de tracking manuel, et
complétée par une routine de reconnection intuitive des trajectoires avortées.
Enfin, à partir des tableaux excel de données affinées, nous présenterons une méthode de
quantification des signaux calciques (amplitude de fluorescence, fréquence de pics de
fluorescence, fraction réponse) entrainant une catégorisation des types de réponses
(maintenue, oscillante, unique) suivant le type de stimulus.
L’intérêt de cette approche réside dans le fait d’automatiser au maximum les processus
d’analyses permettant de réduire considérablement les temps d’analyse et la subjectivité
des approches manuelles
Nous reviendrons également sur les notions statistiques permettant de déterminer un seuil
d’activation objectif, par l’optimisation du rapport entre la probabilité de détection et la
probabilité de fausse alarme.
Nous étendrons in fine notre atelier aux autres paramètres quantifiables à partir
d’enregistrements vidéo (motilité, formes, par exemple) et conclurons par une
confrontation des résultats que l’on peut obtenir avec des approches similaires (cytométrie
par exemple).
Description
L’objectif principal de cet atelier est de présenter un ensemble d’approches
méthodologiques permettant l’analyse quantitative de la diversité des signaux calciques au
niveau d’une population de cellules individuelles motiles (lymphocytes T CD4+, activés par
différents types de stimuli, anticorps immobilisés ou cellules présentatrices de l’antigène).
Nous souhaitons aboutir à une discussion sur la pertinence d’inducteurs solubles à
126
ATELIERS
déclencher une réponse calcique relevante quand le ligand activateur naturel de ces
cellules est exprimé à la surface de cellules stimulantes (dans le cadre de contacts cellulecellule).
***
A45 - Analyser la migration cellulaire au moyen de logiciels libres
Intervenants
Fabrice Cordelières, [email protected]
Daniel Zaharia, [email protected]
Objectifs
Au travers d'un atelier pratique, les participants sont invités à se familiariser à l'étude de la
migration cellulaire au moyen de logiciels libres. Deux greffons seront utilisés en fonction
du type d'expérience réalisée: KymoToolBox pour les essais de cicatrisation de blessure,
Manual Tracking pour le pistage manuel de cellules individuelles. Une alternative sera
présentée pour le suivi automatique et l'analyse des données: iTrack4U, un logiciel écrit en
Java et utilisant ImageJ en tant que bibliothèque.
Déroulé:
-Manipulation sur plusieurs jeux de données des outils de pistage manuel, semiautomatique et automatique
-Comparaison des 3 modes de suivi
-Optimisation des paramètres de pistage automatique
-Travail autour des données extraites et de leur mise en forme
Description
Connaitre les outils existant pour l'extraction des données de suivi de migration cellulaire
en contraste de phase et/ou fluorescence
***
127
ATELIERS
A46 - Image processing methods for the temporal analysis of moving particles.
Intervenants
Charles-Henri Kervrann, [email protected]
Thierry Pécot, [email protected]
Objectifs
Several methods developed by the Serpico team and accessible through a Mobyle web
portal (http://mobyle-serpico.rennes.inria.fr/) will be described. A few case examples will
be provided to the workshop participants so they can practice and better understand the
methods. The participants will also be invited to test their own image sequences, acquired
potentially with the set-ups on site.
Description
To understand and practice image processing methods developed to analyze the dynamic
content in fluorescence video-microscopy.
***
A47 - Multiplex FRET : suivi simultané d’activités biochimiques par FLIM deux couleurs
Intervenants
Claire Déméautis, [email protected]
Objectifs
Nous montrerons notre méthodologie originale pour multiplexer les mesures de FRET sur
un même échantillon. Cette approche fait appel à deux couples de protéines bien choisies,
les deux donneurs seront excités simultanément à 440 nm et leur durée de vie sera mesuré
simultanément par FLIM deux couleurs sans artefact de fuite spectrale. Nous appliquerons
cette méthode au suivi de deux activités biochimiques simultanées à l’aide de deux
biosenseurs FRET génétiquement encodés.
Description
Utiliser la méthodologie de FLIM pour mesurer le FRET de biosenseurs génétiquement
encodés.
Etudier plusieurs activités biochimiques simultanément en cellules vivantes.
128
ATELIERS
***
A48 - Comparaison de différentes méthodes de détermination des mouvements
moléculaires dans la cellules : Méthodes corrélatives et retour de fluorescence.
Intervenants
Cyril Favard, [email protected]
Delphine Muriaux, [email protected]
Objectifs
- Présentation théorique rapide des méthodes.
- Acquisitionde données à l'aide des différentes techniques sur des systèmes modèles
simples.
- Acquisition de donnés sur des cellules en culture exprimant des protéines fluorescentes.
Description
- Pouvoir effectuer un choix d'expérience au regard de la complexité de l'objet à observer.
- Apprendre à réaliser ces expériences de façon simple.
En lien avec l'atelier traitement et simulation (P. Paul-Gilloteaux et F. Waharte) traite les
données acquises et mesurer les erreurs commises.
***
A49 - Dynamique de formation de nanotubes et transport transcellulaire dans un
modèle neuronal par imagerie à haute-résolution spatio-temporelle.
Intervenants
Meryem Tardivel, [email protected]
Objectifs
1- Acquisition d’images en temps réel sur des cellules transfectées et marquées avec un
marqueur vésiculaire :
nous chercherons à suivre la formation des nanotubes et à améliorer la résolution des
images pour résoudre ces fines structures dynamiques..
129
ATELIERS
2- Analyse des données :
nous reprendrons les images acquises pendant la première session pour étudier et
quantifier la dynamique des nanotubes et des vésicules de transport par kymogrammes
dynamiques et suivi de vésicules (tracking).
Description
Étudier la formation de nanotubes membranaires et visualiser le transport vésiculaire à
travers ces structures pour mettre en évidence leurs implications dans la communication
cellulaire.
***
A50 - Mesure de la dynamique d’association de protéines sur les microtubules par
combinaison d’acquisition en spinning-disk FRAP et de tracking de particules.
Intervenants
Ludovic Leconte, [email protected]
Objectifs
1) Acquisition d'images en confocal rapide + FRAP (spinning-disk) :
Nous chercherons à acquérir des séquences d'images en fluorescence pour mesurer la
dynamique des protéines associées au microtubules par FRAP
2) Analyse des données :
Nous améliorerons la qualité des images à l'aide d'un algorithme de débruitage, puis nous
suivrons les régions photoblanchies par tracking et analyserons le retour de fluorescence
sur ces régions. L'utilisation d'un modèle théorique adapté permettra la quantification de
la dynamique.
Description
Mesurer la dynamique d’association de protéines sur les bouts + des microtubules en phase
de croissance
***
130
ATELIERS
A51 - FCS et FRET-FLIM : approche combinée en cellules vivantes, acquisition et analyse
Intervenants
Corentin Le Nézet, [email protected]
Mariano Gonzales Pisfil, [email protected]
Objectifs
L’atelier comportera à la fois la mise en œuvre pratique de la FCS et FRET-FLIM sur des
échantillons, et l’analyse des données collectées ainsi que leur interprétation. Lors du volet
pratique nous aborderons les aspects de mise en place, paramétrage du système, et
collecte des données. Dans le cadre de cet atelier nous étudierons la dynamique et les
interactions de deux partenaires du complexe P-TEFb qui est impliqué dans la régulation
de la transcription.
Déroulement :
- Rappel rapide des principes de FCS, FRET-FLIM et des méthodes de mesure.
-Mise en œuvre pratique de ces deux techniques FCS et FRET-FLIM.
-Mise en œuvre des contrôles et références adaptés.
-Réalisation de mesures sur deux partenaires du complexe P-TEFb en cellule vivante
(complexe de régulation de la transcription)
-Analyse à l'aide de logiciels libres et des solutions développées dans l'équipe BCF-IRI
(MAPI)
-Les choix des modèles pour l'analyse des dynamiques en FCS et d'interaction en FRET-FLIM
seront explicités, et discutés.
-Possibilité de faire des mesures sur d'autres couples de protéines si les plasmides sont
disponibles.
Description
La rapidité du développement des protéines fluorescentes a permis l’essor de nouvelles
techniques portées sur l’étude de leur comportement in vivo. Les techniques de FCS
(Fluorescence Correlation Spectroscopy) permettent de mesurer la dynamique moléculaire
en cellule vivante. Les techniques de mesures de FRET (Föster Resonance Energy Transfer)
par FLIM (Fluorescence-Lifetime Imaging Microscocopy) permettent d'étudier le
comportement de deux molécules en caractérisant de potentielles interactions.
L’approche combinée de ces deux techniques dont les résolutions spatiales et temporelles
sont différentes, nous permet de répondre à des problématiques biologiques complexes
131
ATELIERS
en cellules vivantes. Le but de cette atelier sera 1) d'initier les participant à la mise en
œuvre pratique de ces deux techniques ; 2) de mettre en œuvre les outils pour l'analyse
FCS et FLIM ; 3) de démontrer que les techniques de FCS et FRET-FLIM sont
complémentaires pour répondre à des problématiques biologiques.
***
A52 - Analyse des expériences de FLIM et de FRET in vivo par la distance de transport
Intervenants
Philippe Heinrich, [email protected]
Aymeric Leray, [email protected]
Objectifs
L'atelier se déroulera sur un système commercial. Il comporte un volet théorique suivi
d'une application pratique sur des échantillons de référence. Le TP débutera par la mise en
place de l'échantillon, la calibration du système, l'acquisition des données, et l'analyse des
observations.
Déroulement :
1° Présentation des concepts de l'imagerie FLIM – TCSPC et de distance de transport
2° Application sur échantillons de référence et cellules
3° Analyse à l'aide des softs d'analyses (MAPI et TITAN) développés localement
(distribuables)
Description
La microscopie de fluorescence est couramment utilisée dans nombre de laboratoires pour
sonder le micro-environnement local de molécules fluorescentes à l'échelle du nanomètre.
Le phénomène de FRET (Förster Resonance Energy Transfer) permet de mettre en évidence
des interactions entre molécules voisines ou encore des changements de conformation
dans les cellules vivantes.
Le but de cet atelier est, dans un premier temps, de proposer une initiation aux mesure de
FRET par FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) avec un système TCSPC (Time
Correlated Single Photon Counting) commercial, puis dans un second temps d’analyser ces
images FLIM avec des stratégies innovantes telle que la distance dite « de transport »
utilisée pour comparer et regrouper à des fins quantitatives les pixels de l’image FLIM et
finalement, de comparer ces nouvelles stratégies avec les méthodes classiques d’analyse.
132
ATELIERS
***
A53 - Suivi comparatif de la dynamique et des interactions protéiques au niveau du
cytoplasme par microscopie de temps de vie de fluorescence (FLIM) et spectroscopie
corrélative de fluorescence (FCS)
Intervenants
Ludovic Richert, [email protected]
Pascal Kessler, [email protected]
Objectifs
Pour cette atelier, une étude comparative entre FLIM et FCS de 5 constructions de
protéines fluorescentes (eGFP / eGFP-mCherry / (eGFP)2 / (eGFP)4 et eGFP+mCherry).
L’atelier débutera par une présentation des principes et des modalités d’acquisition des
données de FLIM et FCS avec un échantillon cellulaire exprimant une proteine eGFP simple
qui servira de référence pour les mesures suivantes.
L’atelier se poursuivra par l’étude de la construction eGFP-mCherry, permettant de mettre
en évidence la diminution du temps de vie d’eGFP par FLIM, tandis que l’augmentation du
temps de diffusion (FCS) est à la limite de résolution de cette approche. L’observation de
la construction (eGFP)2 permettra de confirmer ces appréciations et introduira la notion
de brillance. Cette construction sera également utilisée pour indiquer l’effet de
l’oligomérisation sur le temps de vie.
La mesure avec la construction (eGFP)4 permettra de mettre en évidence significative du
rôle de la taille de protéine sur le temps de diffusion contrairement à (eGFP)2.
Enfin, la coexpresion eGFP et mCherry servir de contrôle négatif.
Description
L'objectif principal de cet atelier est de montré les informations disponibles par les
approches FLIM et FCS pour le suivi des interactions et de dynamisme de protéines au sein
de cellules vivantes. Pour l'exploration de ces différentes techniques, comme support, une
série d’expériences utilisant des cellules expriment différentes construction de protéines
fluorescentes, sera utilisés. L’accent sera mis sur la complémentarité et la spécificité de ces
deux techniques. Approches et problèmes de l'analyse des données seront également
discutées.
***
133
ATELIERS
A54 - Molecular interactions in vivo by 2 Photons fluctuation microscopy (Clerte/Fiche)
Intervenants
Caroline Clerte, [email protected]
Jean Bernard Fiche, [email protected]
Objectifs
Teaching methods will be based on interactivity and discussion with the group. We will
provide support text document for the theory and the practical course.
1- Starting with the standard/calibration sample to align and characterize the optical
system. Discussion around the factors/limitations/Artifacts that need to be
considerated/known about the optical system and the experimental approach (laser
power, wavelength, excitation volume, detection: bleed through, cross talk, sensitivity
(S/N)…).
2- Standard samples (positive control and negative control) to validate the setup and the
experimental approach: Basic FCCS on a well characterized molecule in vitro.
3- In vivo Molecular interaction sample measurements (Positive and negative control +
standard controls (only one color samples)): Starting with Point FCCS measurements and
continuing on the laser scanning microscopy imaging technique and analysis of 2 colors
cross correlation measurements.
Description
The goal of the workshop would be to study in vivo molecular interactions using 2 colors
Cross Correlation Fluctuations microscopy, and to see the advantages of the 2 Photons
laser scanning excitation for this task.
Another goal could be to show that every laser scanning microscope can potentially acquire
data that contain information about molecular diffusion and time and space correlations.
***
A55 - Suivi en "live" de depolymerisation/repolymerisation de microtubules par
changements thermiques ultra rapides
Intervenants
Wallis Nahaboo, [email protected]
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ATELIERS
Objectifs
Nous cherchons à suivre les zones de croissance de microtubules lors de la mitose dans
l’embryon précoce de C. elegans. Une manière classique et utilisée dans d’autres
organisme modèles, est d’appliquer une drogue dépolymérisant les microtubules et
d’ensuite de laver l’échantillons pour observer la repolymérisation des microtubules. Or à
cause de la coquille de l’embryon C. elegans il est impossible d’utiliser ce protocole. C’est
pourquoi nous voulons tester cette expérience à l’aide d’un système microfluidique
contrôlant la température, CherryCell, en dépolymérisant les microtubules par la froid (4°C)
et les repolymérisant à température ambiante (25°C). La mitose de C. elegans se déroule
en quelques minutes seulement. Il est donc nécessaire de réaliser cette expérience avec un
système de contrôle ultra rapide de la température, comme proposé par le système
CherryCell.
Nous tenterons d’utiliser également ce système de contrôle précis de la température pour
analyser des mutations thermosensibles dans des protéines d’intérêts. Les échantillons
seront maintenus à la température restrictive de 16°C et passés à 25°C pour analyser les
phénotypes de perte d’activité des protéines à un moment précis du cycle cellulaire.
Description
Filmer la dépolymérisation et la repolymérisation des microtubules en temps réel.
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A56 - Mobilité intracellulaire de protéines autofluorescentes dans un système de
microscopie à feuille de lumière
Intervenants
Jörg Langowski, [email protected]
Jan Krieger, [email protected]
Objectifs
En utilisant le système Zeiss à feuille de lumière, les participants vont enregistrer des séries
d'images dans des cellules HeLa exprimant des protéines autofluorescentes. Puis, ils
utiliseront le programme Quickfit, développé dans notre groupe, pour traiter ces séries
d'images et générer des cartes de mobilité. Par défaut, si le système Zeiss se démontre
inadéquat à produire des série d'images pour mesurer les mobilités, les participants vont
travailler avec des données apportées par nous. Dans ce cas, le système size sera est utilisé
pour introduire la technique de microscopie à feuille de lumière sur d'autres échantillons.
135
ATELIERS
Description
Introduction à la microscopie à feuille de lumière
Concept de diffusion de protéines dans l'environnement dense de la cellule
Traitement de données de spectroscopie à corrélation de fluorescence: extraction de
coefficients de diffusion et des concentrations, génération de cartes bidimensionnelles de
mobilité.
***
Intervenants
Laurent Gelman, [email protected]
Olivier Renaud, [email protected]
Objectifs
La première demi-heure de l’atelier sera consacrée aux aspects théoriques de la technique
de FRET (« sensitized emission FRET » et FRET par photo-blanchiment de l’accepteur) et
donnera des informations pratiques sur la préparation des échantillons et le choix des
fluorophores donneur et accepteur. Nous montrerons ensuite pas à pas comment
paramétrer une acquisition de FRET sur un microscope confocal en insistant sur les écueils
majeurs de la démarche. En particulier, pour la technique de photo-blanchiment, nous
étudierons comment éviter de faux positifs dus à la photo-conversion de l’accepteur ou à
certains milieux de montage, ainsi que les faux négatifs dus au photo-blanchiment du
donneur pendant l’acquisition. Pour la technique de FRET par intensité (« sensitized
emission »), nous montrerons dans quel ordre les nombreux échantillons-contrôle doivent
être observés et en quoi chacun est utile pour le réglage du microscope préalable à
l’expérience de FRET. Durant les dernières 30 minutes de l’atelier, les images obtenues
pendant la session seront quantifiées avec Fiji/ImageJ et Excel. Nous montrerons que des
plugins pour ImageJ ou une feuille de calcul Excel bien organisée permettent une analyse
rapide des images de FRET.
Après cet atelier, le stagiaire sera donc capable de réaliser une expérience de FRET par
intensité ou par photo-blanchiment en utilisant un microscope à balayage laser et
d’analyser les résultats obtenus grâce au logiciel open source ImageJ ou via Excel. Le but
de l’atelier est de rendre accessible des techniques avancées pour l’étude des interactions
moléculaires sur des échantillons fixés et vivants.
136
ATELIERS
Description
Rendre les utilisateurs familiers avec les réglages des microscopes confocaux pour une
expérience de FRET, et attirer leur attention sur les artéfacts engendrés par des
échantillons ou des réglages non adéquats.
***
A58 - Méthodes de marquage en fluorescence pour l'étude de la dynamique de la
chromatine en cellules vivantes
Intervenants
Sébastien Huet, [email protected]
Yann Cesbron, [email protected]
Objectifs
Au cours de cet atelier, nous présenterons deux approches permettant de marquer
localement la chromatine en fluorescence dans le but d'étudier sa dynamique. La première
approche se fonde sur l'utilisation de cellules exprimant un histone de coeur fusionné à
une protéine photoconvertible. La photoconversion locale des histones marqués à l'aide
d'une irradiation à 405 nm permet alors de visualiser une région spécifique du noyau. Nous
utiliserons cette approche pour mettre en évidence les remodelages de la chromatine se
déroulant au niveau des zones de dommages dans l'ADN. La deuxième approche utilise
quant à elle l'intégration de nucléotides fluorescents au sein de l'ADN. Nous montrerons
qu'elle permet d'accéder à des dynamiques spatiales plus fines que celles observables via
les histones photoconvertibles.
Description
Au sein du noyau des cellules eucaryotes, la fibre de chromatine s’organise suivant
une architecture complexe dont la dynamique reste mal caractérisée. Cette architecture
joue pourtant un rôle majeur dans la régulation de la transcription et de la réplication de
l’ADN. L'atelier que nous proposons a pour objectif de présenter plusieurs approches de
marquage en fluorescence de chromosomes individuels en cellules vivantes. L'observation
de ces marquages par microscopie confocale au cours du cycle cellulaire permettra de
mettre en évidence l'intérêt de ces approches pour caractériser quantitativement la
dynamique de la chromatine différentes échelles spatiotemporelles.
***
137
ATELIERS
A59 - Imagerie rapide de foyers nucléaires sur cellules vivantes et quantification
/dénombrement de ces foyers automatisée Acquisition/Alignement/Analyse et
Quantification
Intervenants :
Patricia Le Baccon, [email protected]
Sylvain Cantaloube, [email protected]
Objectifs
Acquisition de billes tetra marquées pour la mesure des décalages/déformations des
images. Mise en place des cellules sur le système (avec ou sans micro-fluidique). Mise au
point des paramètres d'acquisition. Visualisation de la dynamique des structures, mesure
du bleaching. Comparaison des images et visualisation du décalage. Traitement des
données pour corriger les déformations et explications du traitement. Les piles d’images
de type hyperstack post-alignement seront analysées avec différents outils développés.
Tout d’abord avec le programme Qfoci : cet outil permet de dénombrer les foyers dans les
noyaux de levures et de quantifier l'intensité de chaque foyer. En comparant différentes
souches entre elles, il est ainsi possible de relever des différences, à la fois sur le nombre
de foyer par noyau mais aussi sur l'intensité de ces derniers. Un autre outil permet aussi
d'étudier la distribution spatiale des foyers dans le noyau et d'évaluer les distances des
foyers entre eux ou à la membrane nucléaire. Ces informations peuvent se révéler
pertinentes dans la compréhension de l'implication de certains gènes dans le noyau.
On profitera de l'atelier pour présenter des outils simples pour la segmentation ou la
détection
Description
Sur des cellules vivantes (levures), réussir à faire des acquisitions 3D + 2 longueurs d'ondes
+ temps. L'objectif est de montrer la difficulté d'imager une fluorescence faible dans de
petites structures mobiles tout en limitant la toxicité et le bleaching. Le moyen le plus
rapide étant l'utilisation d'un microscope spinning disc équipé de deux caméras, un
alignement/correction des images post-acquisition est obligatoire. Les différentes
déformations doivent être identifiées (shift x, y et z, rotation mais aussi différence entre
les capteurs) et un protocole de correction a été automatisé afin d'analyser ensuite le
nombre de signaux par noyau de façon automatisée. Cette analyse sur ces acquisitions
3D+2couleurs, nous permet de segmenter automatiquement des signaux (foyers,
membrane nucléaire, nucléole…) en 2 et/ou 3 dimensions. A partir de de ces informations
dénombrer, localiser, mesurer (volume, intensité…) les objets et ce de façon complètement
automatisée et sans biais de l’utilisateur.
138
ATELIERS
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A60 - MitoDendra : une sonde fluorescente photoconvertible spécifiquement adaptée à
l’étude de la dynamique mitochondriale
Intervenants
Xavier Baudin, [email protected]
Arlette Pesty, [email protected]
Objectifs
L’atelier vise à présenter les possiblités expérimentales offertes par les protéines
photoconvertibles. Nous prendrons comme exemple la protéine photoconvertible Dendra2
adressée à la protéine cox-VIII localisée dans la matrice mitochondriale, (mitoDendra) pour
visualiser la fusion mitochondriale.
• Les caractéristiques générales de ces protéines seront exposées dans un PowerPoint,
ainsi que le dispositif nécessaire à la photoconversion (longueur d’onde d’excitation, miroir
galvanométrique pour cibler le site d’illumination).
• Nous ferons une description du matériel d’acquisition et de photoconversion qui seront
utilisés.
• Nous utiliserons des cellules HeLa transfectées de façon stable avec mitoDendra (réseau
de mitochondries marqué en vert). Une brève irradiation laser permet le marquage sélectif
(rouge) de quelques mitochondries seulement. Dans un premier temps, le processus sera
enregistré dans des cellules en situation normale. Puis la fusion mitochondriale sera
inhibée par la présence de CCCP qui provoque la dissipation du potentiel de membrane et
la modification du réseau vers une forme plus fragmentée.
• Au cours de la manip de photoconversion, nous aborderons les précautions à prendre
lors de l’acquisition des données.
• Nous visualiserons les films enregistrés et nous traiterons les données de façon à
quantifier et comparer la répartition de la fluorescence dans les mitochondries
photoactivées en situation normale et de stress.
L’atelier devrait permettre à chacun des participants d’évaluer l’intérêt et la faisabilité de
protocoles utilisant une protéine photoconvertible comme Dendra2, appliqués à leur
propre problématique.
139
ATELIERS
Description
L’objectif est de présenter l’intérêt des protéines photoconvertibles pour les études
dynamiques. Dendra2 servira d’exemple et sera appliqué à la visualisation spatiotemporelle de la dynamique mitochondriale :
• La protéine fluorescente Dendra2 est convertie irréversiblement du vert au rouge quand
elle est activée par un laser proche violet.
• Le caractère monomérique de Dendra2 lui permet d’être facilement associée à une
proteine d’intérêt. Cette propriété permet aussi d’être rapidement exprimée dans la cellule
transfectée.
• La distribution spatio-temporelle de la protéine d’intérêt photo-étiquetée par Dendra2
peut alors être suivie de façon contrôlée à partir de l’instant précis où un pool limité de
cette protéine a été brièvement irradié par un laser violet.
• Un exemple d’application est donné ici avec mitoDendra où la sonde est adressée à une
protéine constitutive de la membrane mitochondriale (cox-VIII), dans le but d’étudier
l’activité mitochondriale. Des enregistrements seront faits sur des cellules en situation
normale comparées à des cellules en situation de stress.
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A61 - Contrôle et imagerie de la température cellulaire
Intervenants
Guillaume Baffou, [email protected]
Julien Savatier, [email protected]
Objectifs
Les échantillons utilisés sont des boîtes de pétri dont le fond est recouvert d'un tapis
uniforme de nanoparticules d'or sur lequel des cellules vivantes ont été déposées. Sous
illumination à leur résonance plasmonique, les nanoparticules d'or absorbent efficacement
la lumière incidente et se transforment en nanosources de chaleur, capables de contrôler
la température dans les cellules avoisinantes. Le chauffage sera réalisé par illumination
laser et la distribution de température résultante sera mesurée grâce à un analyseur de
front d'onde.
Description
- Aborder la problématique du chauffage local de cellules individuelles
140
ATELIERS
- Aborder la problématique de l'imagerie thermique dans des cellules individuelles.
- Utiliser une nouvelle technique d'imagerie de température applicable en milieu
biologique, et basée sur l'utilisation d'un analyseur de front d'onde.
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A62 - Microscopie Multiphotonique Multimodale (TPEF / SHG-pSHG / THG / Mélange
d'Ondes / Photoablation)
Intervenants
Nicolas TISSOT, [email protected]
Thomas GUILBERT, [email protected]
Objectifs
30 min : présentation orale powerpoint de la MMP et des applications possibles avec les
différents contrastes disponibles en fonction de l'échantillon étudié.
1h30 : TP sur microscope multiphoton, passage de différents échantillons, de la cellule
(photoablation, TPEF, THG), au tissus biologique - muscle, tumeur en tranche – (TPEF, SHGpSHG), jusqu'à la drosophile.
Description
Présentation générale du principe de la microscopie multiphotonique (MMP) et de l'origine
des différentes sources de contrastes endogènes au sein des tissus biologiques.
Présentation des possibilités offertes par la MMP aux biologistes.
***
A63 - Tomographie par imagerie de phase incohérente et optique adaptative
Intervenants
Julien Savatier, [email protected]
Sherazade Aknoun, [email protected]
Objectifs
L'atelier se déroulera en plusieurs étapes :
- Comment faire de la tomographie en éclairage incohérent. Montrer la différence entre
cohérent et incohérent.
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ATELIERS
- Comment déconvoluer les images pour regagner du contraste perdu par l'éclairage
incohérent.
- Constater que les images de phase deviennent plus floues avec la profondeur.
- Introduire dans le trajet optique un miroir déformable. Montrer qu'on change la qualité
des images en modifiant la forme du miroir et qu'en mettant une surface en aberration
sphérique, on l'améliore.
- Calibrer la correction à différentes profondeurs, de façon manuelle puis automatique
- Synchroniser la correction avec le PIFOC afin de faire des images toujours nettes le plus
profond possible.
Description
Utiliser l'imagerie de phase sur des coupes de tissus biologiques d'une centaine de microns
en utilisant les propriétés de la lumière incohérente afin de définir des tranches optiques.
Y adjoindre les possibilités données par l'optique adaptative pour conserver une qualité
d'image optimale à mesure qu'on descend en profondeur.
***
A64 - Optique adaptative grand publique : comment améliorer la PSF en maitrisant les
paramètres expérimentaux de base.
Intervenants
Orestis Faklaris, [email protected]
France Lam, [email protected]
Objectifs
Les paramètres pris en compte en vue de l'optimisation d'acquisition dans cet atelier sont :
le choix de la longueur d'onde d'émission, l'épaisseur de la lamelle, l'indice de réfraction
de l'huile d'immersion, la température et la profondeur de l'objet observé, pour un milieu
de montage défini.
L'atelier sera composé d'acquisition d'image sur un système plein champ (de préférence
un système équipé avec une camera EMCCD, pour mieux voir les aberrations sur la PSF) et
les acquisitions seront effectuées avec un objectif de forte ouverture numérique, puis de
l'analyse de ces images.
a) Dans la première partie, les mesures de métrologie et de l’influence des paramètres
expérimentaux sur la PSF seront faites sur des billes fluorescentes.
Présentation des échantillons et de leur préparation
142
ATELIERS
- 1 lame avec des billes 4 couleurs de 170 nm de diamètre, montée au Vectashield -->
Acquisition de PSF --> Analyse sous MetroloJ --> différence des aberrations selon λ --> choix
d'une seul λ pour régler nos paramètres
- 1 lame avec des billes vertes de 170 nm de diamètre montée au Vectashield avec une
lamelle d’épaisseur 0,1mm, une autre lamelle d’épaisseur nominatif de 0,17mm et une
lamelle 0,17mm de haute précision (conseillé pour les techniques de super-resolution).
--> Acquisition PSF --> Analyse sous MetroloJ --> observation des aberrations et de la
resolution axiale selon le type de lamelle →Importance d'avoir la bonne épaisseur de
lamelle adaptée à l'objectif
lamelle d’épaisseur 0,17mm haute précision + une gamme d'huile d'indices différentes -->
Acquisition PSF --> Analyse sous ImageJ / MetroloJ --> Impact de l'indice de l'huile pour un
objectif et un milieu de montage donné → Importance du choix pour avoir la meilleur
résolution et un maximum d'intensité
- 1 lame avec des billes vertes de 170 nm de diamètre montée dans du gel de
polyacrylamide avec une lamelle d’épaisseur 0,17mm haute précision + une gamme d'huile
--> Acquisition PSF --> Analyse sous MetroloJ --> Déformation de la PSF en fonction de la
profondeur --> Correction possible par le choix de l'huile
lamelle d’épaisseur 0,17mm haute précision + chambre thermostatée à 37°C + huile
d'indice n pour 23°C et huile d'indice n pour 37°C --> Acquisition de PSF --> Analyse sous
MetroloJ --> Changement de l'indice de réfraction de l'huile en fonction de la température
; Impact sur la résolution
Cette première partie de l'atelier va se conclure par le choix des paramètres pour faire une
acquisition optimale avec un objectif, un milieu de montage et un échantillon biologique
donné. Nous utiliserons également le plugin PSF Generator sous ImageJ pour trouver les
paramètres optimaux et les comparer à ceux déterminés de manière expérimentale.
Cette comparaison va se faire sur l'analyse d'images de notre échantillon biologique prises
avec nos paramètres et ceux du plugin.
b) Dans la seconde partie, nous passons à la phase appliquée pour rendre compte de
l'utilité de ces mesures lors l'acquisition d'objets biologiques :
- Présentation de l'échantillon ; c'est un échantillon épais (pour rendre compte du
paramètre profondeur) avec un double marquage (pour la différence entre les deux λ)
143
ATELIERS
révélant une structure filamentaire et une autre globulaire (pour voir l'impact de nos
paramètres sur des objets de formes différentes). Echantillon préparé à l’avance (fixé).
- Acquisition d'images avec les paramètres définies par les mesures expérimentales -->
analyse de l'image sous ImageJ --> mesure du ration signal/bruit + résolution
- Acquisition d'images avec les paramètres définies par le plugin PSF Generator --> analyse
de l'image sous ImageJ --> mesure du ratio signal/bruit + résolution
- Comparaison des résultats et Conclusion
- si le temps le permet et qu’un tel microscope est en place : Acquisition d'une image en
super-résolution 3D-SIM avec les bons et les mauvais paramètres pour montrer que ces
réglages sont également (ou plutôt surtout) importants en super-résolution!
Description
Le but de cet atelier est de contrôler les paramètres qui jouent un rôle déterminant sur la
résolution et l’intensité de fluorescence obtenue d’un microscope optique inversé. Ces
paramètres sont souvent sous-estimés et comme résultat les images obtenues ne sont pas
à l’hauteur des performances attendues par les microscopes. Ces paramètres sont : la
lamelle utilisée, l’huile d'immersion, la température et la profondeur de l’objet étudié.
L’objectif ici est la maitrise de l’influence de ces paramètres sur la résolution et l’intensité
du signal détecté et ensuite leur adaptation par rapport à la problématique et l’échantillon
étudié.
***
A65 - Microscopie Raman Stimulée (CARS) : initiation à l'aspect source laser et
instrumentation
Intervenants
Charles-Henri Hage, [email protected]
Objectifs
Les techniques d'imagerie Raman stimulée permettent, sans aucun marquage et avec une
résolution spatiale de quelques centaines de nm, d'identifier et de cartographier une
liaison moléculaire donnée au sein d'un échantillon. Un domaine d'applications grandissant
est l'étude in vivo du métabolisme des lipides. Ces techniques, développées depuis 1999,
complètent les techniques de fluorescence et peuvent être mises en œuvre simultanément
144
ATELIERS
à ces dernières. Le présent atelier a pour but de présenter les concepts et potentialités de
ces techniques. Il abordera plus précisément les aspects de source et d'instrumentation
existants et nécessaires à ce type d'imagerie, l'aspect application à l'imagerie biologique
étant l'objet d'un autre atelier.
Description
L'atelier se déroulera sur un système développé au laboratoire. Sa simplicité est
pédagogique et permettra de s'assurer d'un dispositif fonctionnel pour les ateliers et
d'introduire les évolutions et stratégies couramment utilisées. Déroulement :
- Présentation des concepts de l'imagerie Raman stimulée.
- application sur échantillons de référence et cellules pour illustrer ce type d'imagerie
- description de la source utilisée, et introduction du cahier des charges de la source
nécessaire à ce type d'imagerie.
- discussion sur les différentes possibilités technologiques de sources
- si le temps le permet, introduction d'autres fonctionnalités d'imagerie CARS/SRS et
présentation des sources nécessaires
***
A66 - Imagerie en flux
Intervenants
Chloé Guedj, [email protected]
Objectifs
L'Atelier se déroulera en deux parties. Une première partie se concentrera sur l'acquisition
et la description du cytomètre imageur. Puis dans un deuxième temps nous passerons sur
une station d'analyse dédiée, montrant les différents outils d'analyse et de quantifications.
Nous prendrons comme exemple une analyse de la synapse immunologique entre des
cellules APC et T.
Description
Depuis quelques années des cytomètres imageurs (Imagestream de la société AMNIS) sont
installés dans des plates-formes de cytométrie et donc peu connu des plates-formes de
145
ATELIERS
microscopie photonique. À l'utilisation on peut se rendre compte rapidement que le point
critique de l'imagerie en flux et le traitement d'images.
Ainsi l'atelier 'Imagerie en flux', expliquera la puissance des outils d'analyse et de
quantification de ces systèmes, rassemblant les avantages statistiques des cytomètres et
les informations spatiales d'un microscope plein champ.
***
A67 - Microscopie Raman Stimulée (CARS) : initiation à l'aspect imagerie biologique
Intervenants
Charles-Henri Hage, [email protected]
Objectifs
Les techniques d'imagerie Raman stimulée permettent, sans aucun marquage et avec une
résolution spatiale de quelques centaines de nm, d'identifier et de cartographier une
liaison moléculaire donnée au sein d'un échantillon. Un domaine d'applications grandissant
est l'étude in vivo du métabolisme des lipides. Ces techniques, développées depuis 1999,
complètent les techniques de fluorescence et peuvent être mises en œuvre simultanément
à ces dernières. Le présent atelier a pour but de présenter les concepts et potentialités de
ces techniques. Il abordera plus précisément les aspects d'application à l'imagerie de
cellules et tissus, l'aspect technologique (source laser notamment) étant l'objet d'un autre
atelier.
Description
L'atelier se déroulera sur un système développé au laboratoire. Sa simplicité est
pédagogique et permettra de s'assurer d'un dispositif fonctionnel pour les ateliers et
d'introduire les évolutions et stratégies couramment utilisées. Déroulement :
- Présentation des concepts de l'imagerie Raman stimulée.
- application sur échantillons de référence et cellules
- prise en main technique du dispositif, mise en œuvre, discussions et échanges sur les
aspects techniques (source, détection...)
- Imagerie sur échantillons fluorescents : concept de l'imagerie multimodale et de ses
potentialités (CARS/SRS, fluorescence, SHG/THG/SFG...).
146
ATELIERS
- Possibilité de tester les échantillons amenés par les participants.
***
A68 - Imagerie de l’ordre moléculaire orientationnel par fluorescence polarisée
Intervenants
Patrick Ferrand, [email protected]
Sophie Brasselet, [email protected]
Objectifs
Cet atelier présentera les aspects instrumentaux et méthodologiques de la technique.
Instrumentation : Comment agir sur la polarisation de la lumière, l’analyser de façon
rigoureuse, mettre en évidence et quantifier des distorsions de polarisation pouvant être
induites par les composants optiques, les compenser le cas échéant. Le système présenté
sera suffisamment ouvert pour permettre des manipulations.
Méthodologie : Quel est le rôle du fluorophore ? Quelles sont les grandeurs mesurées ?
Comment sont-elles obtenues ? Comment les interpréter avec des modèles géométriques
simples. Des mesures pourront être menées sur des échantillons types (solution, sondes
lipidiques en membrane cellulaire, etc.) ou amenés par les participants à l’atelier.
Description
L’imagerie de fluorescence polarisée permet, en sondant l’échantillon sous plusieurs
polarisations d’excitations, de remonter à des informations quantitatives sur l’ordre
orientationnel de fluorophores dans leur milieu. On peut ainsi cartographier l’orientation
moyenne et le degré de directionnalité des fluorophores dans des milieux où ceux-ci sont
contraints comme des sondes lipidiques dans la membrane cellulaire, des sondes associées
à des protéines membranaires ou à des fibres d’actines... Nous avons développé un mode
opératoire basé sur une imagerie confocale rapide de type spinnig disk, qui permet
d’imager en cellule cette information orientationnelle de manière dynamique, à une
cadence de mesure de plusieurs images par seconde.
L’ordre orientationnel peut être relié à l’organisation du système biologique à l’échelle
moléculaire ou à sa morphologie sub-résolution, fournissant ainsi une information
structurale complémentaire de l’information morphologique plus traditionnelle.
Refs :
- Kress et al., Biphys. J 2013 : http://dx.doi.org/10.1016/j.bpj.2013.05.043
- Wang et al., Rev. Sci. Instrum 2013 : http://dx.doi.org/10.1063/1.4807318
147
ATELIERS
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A69 - Imagerie en lumière blanche : parce que le marquage fluorescent n'est pas la
solution systématique
Intervenants
Pierre Bon, [email protected]
Objectifs
Je propose d’utiliser un microscope standard en lumière blanche équipé de diverses
modalités d’imagerie de lumière blanche :
- Un montage de type Differential Interference Contrast (DIC)
- Un système d’imagerie de Phase quantitative
- Un montage d’imagerie de réflexion totale interne frustrée
L'atelier se déroulera en trois partie.
1) Cours/discussion autour des concepts d'interaction lumière/matière (diffraction,
absorption...). Bien comprendre qu'un contraste peut exister même si l'objet n'absorbe ou
n'émet pas de lumière. Aborder les notions de résolution, de spécificité d'imagerie en
régime de diffraction et les différences avec la fluorescence. Aborder les limitations de la
fluorescence (photobleaching, viabilité des échantillons...) et ce que la lumière blanche ne
replace pas directement (ex : spécificité).
2) "MacGyver de la microscopie" ou comment s'amuser avec la lumière blanche d'un
microscope standard pour créer du contraste sur un échantillon biologique ; en
transmission et en réflexion. Ex : illumination oblique, jouer avec la focalisation, la
cohérence de la lumière... Faire comprendre aux participants par la manipulation du
microscope que le repérage des objets d'intérêt peut se faire en lumière blanche, évitant
ainsi de bleacher les échantillons pour un simple repérage/comptage.
3) Techniques de microscopie de lumière blanche "avancées" : contraste de phase, DIC,
phase quantitative et réflexion totale interne frustrée (epi-Evanescent microscopy).
Montrer que certaines applications en biologie peuvent se passer de fluorescence (ex. suivi
de cellules, comptage...). Montrer que de nouvelles choses sont envisageables par ces
techniques : mesure de la masse cellulaire, tomographie de membrane cellulaire à
résolution nanométrique par exemple.
Le TP se veut très ouvert en terme de tests d'échantillons et d'essais par les utilisateurs :
les concepts présentés dans ce TP, bien que souvent méconnus, sont simples à maitriser et
pourront être testés directement par les participants.
148
ATELIERS
Description
Bien comprendre les intérêts et certains travers des marquage fluorescent, notamment par
rapport à la viabilité des échantillons biologiques et à la fragilité et au bruit.
Identifier lorsqu'une problématique ne nécessite pas ou peu de spécificité moléculaire et
que les techniques d'imagerie sans marquage peuvent y répondre.
(Re)découvrir les bases de l'imagerie microscopique sans marquage, de l’interaction simple
de la lumière avec la matière, et un certain nombre de "trucs" réalisables avec n'importe
quel microscope.
(Re)découvrir les récentes avancées en instrumentation sans marquage fournissant
permettant de la spécificité : imagerie de phase quantitative, imagerie membranaire superrésolue axialement...
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A70 - Screening HCS, integration de la cytométrie par analyse d'images sur une
plateforme mixte cytométrie/Imagerie
Intervenants
Benoit Maury, [email protected]
Objectifs
- La microscopie HCS : présentation et apports
- Les différences entre FACS et HCS (acquisition)
- Les échantillons, possibilités, préparation et limites
- Automatisation des acquisitions, autofocus
- HCS et in vivo
- Récupération des données, notions de volume data
- Analyse d'image, Détection/tracking objets cellulaires et sub cellulaires, les apports du
HCS
- Comparaison cytométrie/HCS (analyse)
Description
Montrer l’apport de la microscopie HCS sur une plateforme mixte cytométrie/imagerie sur
différentes applications. Les possibilités offertes par l’analyse HCS sur du matériel vivant
en vidéomicroscopie.
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149
ATELIERS
A71 - Scripts et programmation graphique sous Icy (level 2)
Intervenants
Fabrice de Chaumont, [email protected]
Objectifs
Initiation aux scripts en JavaScript
Initiation à l'écriture de protocoles
Comment créer des batchs
Comment créer des sorties de mesures sur mesures
Comment partager ses scripts et protocoles par mail ou sur le web.
Description
Permettre aux utilisateurs d'écrire leur propres scripts et protocoles ( programmation
graphique )
Stephane Dallongeville, [email protected]
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A72 - Segmentation d'images microscopiques sous ImageJ
Intervenants
Yves USSON, [email protected]
Arnold FERTIN, [email protected]
Objectifs
Différents algorithmes de segmentation seront présentés et testés au travers d'exercices
simples sous ImageJ : segmentation de signaux de fluorescence en 2D et 3D, segmentation
et/ou détection de cellule ou d'organite en microcopie de phase et DIC.
La deuxième partie de l'atelier consistera à développer une stratégie de segmentation
combinant plusieurs des outils préalablement testés pour la résolution d'un problème
complexe d'analyse d'image microscopique.
150
ATELIERS
Description
L'analyse d'image microscopique est une discipline transversale dans le cadre de la
microscopie fonctionnelle du vivant. L'objectif de cet atelier est de donner des éléments
techniques en segmentation d'image pour aider les utilisateurs a déterminer la stratégie
adaptée à la résolution de leurs problèmes d'analyse d'image en microscopie.
***
A73 - Déconvolution d'image 3D en microscopie de fluorescence
Intervenants
Alain Dieterlen, [email protected]
Bruno Colicchio, [email protected]
Objectifs
Cet atelier ne propose pas l'utilisation d'une méthode de déconvolution en particulier, mais
plutôt une sensibilisation sur les critères importants pour tout traitement de ce type. Par
contre nous n'aborderons pas la déconvolution aveugle (sans utilisation d'une réponse
impulsionnelle fournie). Ces techniques trouvent leurs places essentiellement en
microscopie confocale et bi-photon. Cependant certains des problèmes abordés restent
valables.
Dans l'atelier, nous procéderons de la manière suivante :
1) Simulation d'un objet de synthèse (référence), et utilisation de mesures sur objets
connus (billes)
2) Simulation de la réponse impulsionnelle du microscope, et utilisation de PSF mesurées
dans des conditions différentes.
3) Simulation de l'image obtenue à partir de l'objet de référence et des réponses du
système optique calculées et mesurées.
4) Application de différents types de déconvolution (direct ou itératif), avec différents
paramètres.
5) Observation du résultat comparé à l'objet de référence.
6) Changement des paramètres de l'image (bruit, saturation, échantillonnage) et reprise
des points 3 à 6.
Description
À l'issue de l'atelier, les participants seront sensibilisés aux traitements d'image du type «
déconvolution » et sur l'importance des paramètres d'acquisition des images et du réglages
des paramètres demandés par ces algorithmes. Ils disposeront des éléments pour évaluer
la pertinence du résultats de tels traitements.
151
ATELIERS
***
A74 - ImageJ macro programming for beginners
Intervenants
Volker Baecker, [email protected]
Elodie Jublanc
Objectifs
The basic concepts of macro programming:
- calculations and expressions
- the tools: macro editor, debugger and recorder
- string processing
- variables
- loops and conditions
- functions
- working with files, images, stacks
- working with the histogram
- interactive macros and user interfaces
- macro toolsets
For each topic there is a short presentation followed by a small exercise that has to be
solved by the participants.
Description
Learn how to write ImageJ macros for the automation of Image analysis tasks.
***
152
ATELIERS
A75 - Analyse conjointe d'images et de données sous Knime
Intervenants
David Rousseau, [email protected]
Carole Frindel, [email protected]
Objectifs
Nous introduisons le logiciel KNIME, ses bibliothèques d'analyse d'images et d'analyses
statistiques et les liens possibles avec des logiciels d'analyse d'images comme ImageJ ou
d'analyses statistiques comme R. Nous illustrons notre propos avec une étude de cas.
A l'issue de cet atelier, les stagiaires seront capables de :
1) générer des rapports automatiques avec Knime
2) traiter des images avec Knime
3) interagir avec R dans Knime
4) développer leurs propres projets dans Knime
Description
Dans cet atelier, nous présentons un logiciel libre d'introduction récente KNIME, qui
permet de réaliser dans le même environnement l'analyse d'images issues de bases de
données et l'analyse statistique des informations extraites des images et associées à ces
images.
***
A76 - OMERO. An open source client-server software for visualization, management
and analysis of biological microscope images
Intervenants
Julio Mateos Langerak, [email protected]
Amelie Sarrazin, [email protected]
Objectifs
The main part of the course will be in the format of a guided tour through the basic
functions of OMERO. The attendees will be able to reproduce a number of routines on their
153
ATELIERS
laptops. There will be a short theoretical introduction and concluding section where the
most advanced features of OMERO will be presented on a presentation.
INTRODUCTION (15’ theoretical presentation)
- Why care about a centralised scientific image database
- OMERO basic structure: client-server. RAW data and metadata, search engine, APIs, bioformats, open-source
- Basics on OMERO installation and configuration (OMERO will be already installed on the
computers)
IMPORTING IMAGES (15’ hands on guided tour)
- Opening OMERO.insight and logging in
- Selecting images and adding them to the import queue
- Selecting group
- Selecting / Creating Projects and Datasets
- Adding tags on import
- Raw data storage and integrity report
ORGANISING IMAGES (30’ hands on guided tour)
- Basic window layout: left, middle and right panels
- Projects and datasets, browsing data, moving data around
- Tagging
- Attaching files
- Searching and filtering
- Visualising metadata
- Downloading and exporting
VIEWING IMAGES (15’ hands on guided tour)
- Opening images
- Browsing through image dimensions (C, Z, T)
- Rendering settings
ANALYSING (15’ hands on guided tour)
- ROI creation
- Performing and exporting basic measurements (distances, sizes and pixel intensity)
SHARING (15’ hands on guided tour)
- Groups: structure and permissions
- Moving data between groups
- Publishing data
154
ATELIERS
OVERVIEW OF ADVANCED FEATURES (15’ theoretical presentation)
- OMERO.editor
- Scripting service
- OMERO API’s: Java, C++, Python and Matlab. What does that mean
- Examples: Advanced web browser client, ImageJ, FLIMfit, CellProfiler, KNIME,…
- Extendibility. Not only for imaging data
QUESTIONS / REMARKS
Description
OMERO is a client-server software that handles scientific images in a secure central
repository. It allows to view, organize, analyze and share data from anywhere with Internet
access, work with the images from a desktop application (Windows, Mac or Linux), from
the web or from 3rd party software.
In this workshop, we aim to teach the attendees, through a practical guided tour, to use
the basic functionalities of OMERO and learn about the potential that this application has
as a framework to store, share and analyze scientific microscopy data.
***
A77 - Métrologie des instruments d’imagerie : utilisation des différents éléments de
valise Métrologie
Intervenants
Raphaelle Desvaux, [email protected]
Perrine Frère
Jean-François Gilles, [email protected]
Objectifs
Pendant cet atelier, les tests métrologiques développés par le groupe Métrologie seront
réalisés à l'aide des outils de la valise Métrologie ainsi que le nouvel outil proposé par la
société Argolight. L’analyse et l’interprétation des données issues de ces tests seront
effectués à l’aide du plugin MetroloJ.
Description
Cet atelier vise à montrer l’utilisation de lames et d’outils de mesure disponibles
actuellement pour tester les équipements d’imagerie (microscope confocale et champ
plein).
155
ATELIERS
***
A78 - Quel type de caméra choisir pour quel type d'expérimentation : CCD, EMCCD ou
sCMOS ?
Intervenants
Sébastien MARAIS, [email protected]
Objectifs
- Rappel sur le mode de fonctionnement des différentes caméras présentées
- Acquisitions sur différents types d'échantillons (fixés et vivants) avec différents
paramètres sur les 3 types de caméras : CCD, EMCCD et sCMOS
- Analyse des résultats grâce à une routine ImageJ/Metamorph
- Tenter de trouver une réponse : quelle caméra pour quelle problématique ?
Description
L'arrivée de nouvelles caméras sCMOS performantes sur le marché depuis quelques années
enrichie l'offre de capteurs pour la microscopie plein champ jusqu'alors principalement
occupée par les caméras CCD et EMCCD.
Le but de cet atelier est de tester ces différents types de détecteurs et de déterminer quel
type de caméra sera le plus adapté à différents types d'acquisitions et d'échantillons qui
seront effectuées pendant l'atelier, avec les participants.
Les données générées seront alors comparées et analysées grâce à une routine
ImageJ/Metamorph pour essayer de comprendre les différences entre les technologies
proposées.
***
A79 - Etude quantitative des effets de phototoxicité des paramètres de l’éclairage en
microscopie de fluorescence
Intervenants
Julien Roul, [email protected]
Objectifs
En collaboration avec la société Photonlines, sur un banc test présentant différents types
d’éclairement (Lampe à mercure, LED, laser) et différentes modalités (continu, modulé,
156
ATELIERS
pulsé), nous présenterons les différentes méthodes utilisées pour étudier la phototoxicité.
Nous travaillerons en culture de cellule, et caractériserons la phototoxicité par la mesure
du potentiel de membrane mitochondrial. Nous présenterons également nos résultats sur
embryon de c-Elegans lors de ses premières divisions en caractérisant la phototoxicité par
la vitesse de division. Enfin, nous présenterons nos travaux d’analyse statistique
multivariée pour faire ressortir les modalités les moins invasives.
Description
Présenter les différentes méthodes d’étude de phototoxicité.
Présenter les différents modes d’éclairement pour la microscopie.
Présenter une approche pour évaluer les différents effets phototoxiques.
***
A80 - Arduino1 : Introduction au pilotage de périphériques
Intervenants
Thierry Legou, [email protected]
Brice Detailleur, [email protected]
Objectifs
Les systèmes commerciaux clé-en-main aussi complets soient-ils, ne permettent pas
toujours de maîtriser exactement un design expérimental. Cet atelier permettra à ses
participants de découvrir des technologies libres, innovantes, simples d'utilisation et
relativement peu coûteuses pour mettre en oeuvre le trio périphérique- microcontrôleurlogiciel.
- Introduction au microcontrôleur libre 'Arduino'. Principe; Description du matériel;
Découverte du logiciel de programmation; Programmation d'un exemple: pilotage d'un
éclairage à LED.
- Introduction au logiciel de tracé 'TCI'. Exemple de la carte d'extension RT-mfm et de la
platine de support des capteurs de température.
- Communication par liaison série entre la station de travail et le microcontrôleur. Exemple
avec le logiciel Processing.
Démonstration et discussion autour de systèmes déjà réalisés ou de projets.
157
ATELIERS
Cet atelier est la réalisation d'un projet proposé et édité par le groupe de travail Arduino
(électronique libre) du RT-mfm. Les fiches de réalisations de l'ensemble des projets du
groupe seront mises à disposition sur le site internet du RT-mfm.
Description
S'initier aux technologies de pilotage de périphériques simples pouvant s'insérer dans la
conception d'une expérience de microscopie du vivant.
***
A81 - Arduino 2: Réalisation d'un système de monitoring et contrôle de la température
Intervenants
Christian Rouviere, [email protected]
Jerome Mutterer, [email protected]
Objectifs
Réaliser en totalité un montage à base du microcontrôleur Arduino qui permet de contrôler
l'évolution de la température réelle à proximité de l'échantillon dans une expérience de
microscopie du vivant.
Description fonctionnelle : Relevé et log de la température à proximité directe de
l'échantillon. Détermination d'une plage de température attendue et avertissement par un
signal lumineux (led verte/rouge) en cas de dérive en dehors de cette plage. Activation de
systèmes de compensation (refroidissement ou chauffage) pour retour à la température
de consigne).
Assemblage des composants sur la carte intégrée (pratique de la soudure).
Téléchargement du micro-logiciel sur la carte contrôleur (Arduino).
Connexion au logiciel de contrôle.
Test du bon fonctionnement
Modification pour évolution possible avec adjonction d'un refroidissement ou d'un
chauffage.
Démonstration et discussion autour de systèmes déjà réalisés ou de projets.
158
ATELIERS
Cet atelier est la réalisation d'un projet proposé et édité par le groupe de travail Arduino
(électronique libre) du RT-mfm. Les fiches de réalisations de l'ensemble des projets du
groupe seront mises à disposition sur le site internet du RT-mfm.
Description
Réalisation pratique d’un projet de fiche du groupe ‘Arduino’ du RT: Construire
entièrement un système de contrôle de la température dans l'environnement d'une manip
de microscopie.
***
A82 - CAO et impression 3D
Intervenants
Brice Detailleur, [email protected]
Isabelle Gillot, [email protected]
Objectifs
L'atelier est structuré en 2 étapes, la première consiste à donner les éléments de base de
dessin industriel avec un logiciel libre de droit tel Inventor ou autre. La deuxième à faire
imprimer le modèle dessiné et évaluer les avantages et les limites de l'impression 3 D.
Une imprimante 3 D sera mise à disposition par une entreprise spécialisée du domaine
Description
donner accès à la communauté de l'imagerie à une nouvelle technologie qui permet de
réaliser des nouveaux supports (lames avec canaux, porte lamelle circulaire.....) et tout type
d'objets dessinés par CAO
***
A83 - Analyses haut-débit de l’architecture des biofilms bactériens grâce à l’acquisition
assistée en microscopie confocale.
Intervenants
Alexis CANETTE, [email protected]
Pierre ADENOT, [email protected]
159
ATELIERS
Objectifs
- Rappel théorique sur les notions de biofilms et pertinence de l’utilisation de la
microscopie confocale dans leur analyse
- Rappel pratique sur la préparation adaptée à l’analyse des biofilms en routine (plaque 96
puits, colorants type kit live/dead Invitrogen…)
- Acquisitions manuelles de stacks de biofilms
- Acquisitions automatisées de stacks de biofilms (HCS SP8 Leica) : utilisation des outils
d’amélioration (autofocus, gestion du dispenseur du liquide d’immersion de l’objectif,
design à façon du support virtuel d’acquisition…)
- Analyses post-traitements pour reconstructions 3D et extractions de paramètres
structuraux chiffrés (biovolumes, épaisseurs…) grâce à des routines sur outils libres (FiJi,
Icy) ou payants (Imaris)
Description
L’analyse de l’organisation en 4 dimensions (3D + temps) in situ et de manière non invasive
est un apport essentiel sur la compréhension du fonctionnement des communautés
bactériennes structurées.
Cet atelier montrera l’intérêt d’un travail assisté par une nouvelle solution logicielle d’un
constructeur, pour générer des données avec une amélioration qualitative et quantitative
(automatisation reproductible et gestion des données).
Cet atelier montrera que ce bond technologique offre la possibilité d’études en
microbiologie à très grande échelle : phénotypage de souches (grandes banques de
mutants), interactions multi-espèces et capacités de résistance face à l’action de biocides
(larges chimiothèques).
***
A84 - CLEM sur MEB Haute résolution et sur MEB de table (Solution innovante
alternative)
Intervenants
Etienne Gontier, [email protected]
Jennifer Petersen, [email protected]
Objectifs
160
ATELIERS
Présentation théorique et pratique des différentes méthodes de préparation d'échantillon
pour permettre l'observation d'échantillon à la fois en microscopie par épi fluorescence et
au microscope électronique à Balayage
Mise en œuvre de l'acquisition d'image, d'échantillons préparés spécifiquement, sur
l'équipement qui possède à la fois un microscope à épi fluorescence dans la chambre.
Description
Mise en œuvre de la microscopie corrélative épi fluorescence - électronique à balayage
dans un même équipement afin de faciliter la corrélation des informations d'un même
échantillon.
Déterminer les méthodes de préparation permettant de maximum l'utilisation des
avantages de chaque méthode d'observation.
***
A85 - FigureJ sur imageJ : vos planches d'images en quelques clics !
Intervenants
Nicolas GOUDIN, [email protected]
Objectifs
Cet atelier se concentrera sur FigureJ. Il ne sera donc pas évoqué l'utilisation d'imageJ pour
diverses analyses.
Première étape : petit rappel des outils nécessaires : imageJ, Loci_tools, paramétrage de la
mémoire d'imageJ et création d'une image en composite.
Seconde étape : utilisation simple de FigureJ. Création d'une planche, merge d'images,
implantation d'une échelle, création de bordure sur chaque case et enregistrement.
Troisième étape : utilisation avancée de FigureJ. Mise en valeur des résultats avec effet de
zoom et échelle associée, amplification du signal, filtre pour le bruit, galerie d'images.
Quatrième étape : Réalisation de planche d'images pour l’intégration de screenshot
provenant d’autres logiciels d’analyses (Imaris etc) .
Dernière étape : discussion et questions
161
ATELIERS
Description
Mise en valeur des résultats par la réalisation de planches d’images avec l’outil FigureJ.
***
A86 - Etude de la colocalisation en bio-imagerie
Intervenants
Thibault Lagache, [email protected]
Objectifs
L'atelier comportera un cours théorique présentant les enjeux quantitatifs et statistiques
en colocalisation, les différentes méthodes basées Intensité et Objet existantes avec leurs
avantages/inconvénients en fonction du type d'imagerie utilisée. Il s'agira ensuite de
présenter les différentes solutions open-source proposées. Enfin, nous proposerons
d'accompagner les utilisateurs pour traiter les données qu'ils auraient apportées.
Description
Les objectifs de cet atelier seront de
- présenter les différentes méthodes basées Intensité et Objet permettant d'analyser la
colocalisation de molécules en bio-imagerie
- déterminer les méthodes les plus adaptées suivant le type de problème et la méthode
d'imagerie utilisée (microscopie confocale, super résolution, microscopie électronique...)
- présenter les outils disponibles sur les logiciels open-source (ImageJ-Fiji et Icy)
***
A87 - Microscopie corrélative : intégration d'un microscope à fluorescence, dans un
microscope à balayage
Intervenants
Isabelle Paintrand, [email protected]
Karine Monier, [email protected]
162
ATELIERS
Objectifs
Montrer l'intérêt de la technique de microscopie corrélative utilisant l'intégration d'un
microscope de fluorescence dans un microscope à balayage pour l'analyse des nucléoles et
des centrosomes.
Description
- Présentation du MEB intégré et de ses applications (théorie)
- description de la préparation des échantillons (théorie)
- Imagerie corrélative du nucléole et des centrosomes des cellules: fluorescence/MEB
***
A88 - Mesures mécaniques sur des tissus animaux et végétaux en croissance
Intervenants
Pascale Milani, [email protected]
Julien Chlasta, [email protected]
Objectifs
Montrer l'intérêt de la microscopie de force atomique pour déterminer les propriétés
physique d'un tissu biologique.
Description
- Présentation du principe de l'AFM (théorique) et de la méthode pour obtenir des données
sur les propriétés mécanique.
- Présentation des modèles biologiques utilisés : le méristème apical chez arabidopsis et le
follicule ovarien chez la drosophile.
- Mesures de force sur ces échantillons (pratique) et analyse des courbes de forces.
- Interprétation des données (théorique)
***
163
ATELIERS
A89 - FCS 2 couleurs pour l'atude des interactions protéine-protéine
Intervenants
Giulia Bertolin, [email protected]
Objectifs
Maitriser la mesure de cross-correlation deux couleurs pour les interactions protéineprotéine
Comprendre et maitriser les artefacts de mesure
Comprendre et maitriser les methodes pour supprimer l'artefact de fuite spectrale
Description
Sur un système Microtime de Picoquant, nous utiliserons la methode de PIE (Pulsed
Interleaved Excitation) pour mesurer la FCS deux couleurs sans artefact de fuite spectrale.
Nous utiliserons des tandems modèles pour mimer la co-diffusion de protéines
fluorescentes des deux couleurs.
***
164
SPONSORS
SPONSORS
Equipement et consommables
http://www.dutscher.com/frontoffice/home
Marianne MARCEAU
[email protected]
33(0)4.78.43.85.05
33(0)6.23.38.97.86
http://www.eppendorf.fr/int/?l=5
Olivier MBAREK
[email protected]
33(0)1 30 15 67 45
33 (0)6 24 64 69 25
http://www.lifetechnologies.com
Clara STREIFF
[email protected]
33(0)6 32 28 75 00
Arielle FAURE
33(0)6 08 28 30 60
http://www.thermoscientific.com
Nathalie BOUVOT
[email protected]
33(0)6 29 66 86 41
http://www.ozyme.fr/
Isabelle AUFORT
[email protected]
33(0)1 30 85 92 92
33(0)6 75 01 40 77
Olivier VARET
[email protected]
33(0)1 34 60 24 24
33(0)6 07 03 10 20
http://ibidi.com/
Tina FREISINGER
[email protected]
49 - 89 / 520 4617 0
http://www.biovalley.fr/
Jean-Christophe POCCESCHI
[email protected]
33(0)1 60 07 20 20
165
SPONSORS
Equipement
http://www.noroitlabo.com/index.htm
Gilles MAHE
[email protected]
33(0)2.40.50.12.77
Consommables
http://www.paredes.fr/
Hervé PREVOT
[email protected]
33(06) 87 80 63 33
Prix
http://www.lvmhrecherche.com
http://www.nikon.fr/fr_FR/
Sandrine Batard
Sales administration & Marketing Manager
DDI : +33(0)1 45 16 45 29
Mob : +33(0)6 85 59 47 48
[email protected]
191 rue du marché rollay
94504 Champigny/Marne Cedex – France
www.nikon.fr
http://www.olympus.fr/
Philippe Rouhier, Directeur Bio-industrie France
et Benelux
[email protected]
74 rue Arcueil – SILIC 165
94533 Rungis – France
Tel : 01 45 60 23 46
www.olympus.fr
http://www.belambra.fr/
166
PARTENAIRES
PARTENAIRES
ALPAO
Vincent Hardy - Sales manager
Tel : +33 6 24 59 77 41
[email protected]
AMPLITUDE SYSTEMES
Parc Scientifique Unitec 2
351 Cours de la Libération
33400 Talence – France
Tel : 05 40 00 34 47
www.amplitude-systemes.com
ANDOR TECNOLOGY PLC
Christophe Dos Santos
14 avenue de Paris
78000 Versailles
Tel : 06 24 38 38 75
[email protected]
www.andor-tech.com
ARGOLIGHT
Dr. Gautier PAPON - Co-Founder & CEO
Tel : +33 (0)6 31 64 26 67
Argolight, A Precision Company
www.argolight.com
BIOAXIAL
William Amoyal, Directeur Commercial
Paris Biotech Santé
24 rue du Faubourg Saint-Jacques
75014 Paris, FRANCE
Tel : +33 (0)6 52 01 76 49
[email protected]
www.bioaxial.com
BRUKER NANO SURFACES DIVISION
Marie-Lise Perrault - EMEA Marketing and
communication Coordinator
7 rue de la Croix Martre
91120 Palaiseau, France
Tel : +33 1 72 86 61 04
[email protected]
www.bruker.com/nano
CHERRY BIOTECH
Solange Arnaud - Co-founder & CEO
+33 624 840 005
[email protected]
www.cherrybiotech.com
167
PARTENAIRES
EDEN INTRUMENTS
Stephane Aguy
66, Bis Avenue De Verdun
33 610 CESTATS France
GSM: +336 08 067 081
[email protected]
www.eden-instruments.com
COHERENT FRANCE
Jean-Luc TAPIÉ - Directeur Commercial,
Coherent Francetel : +33 1 80 38 10 11
portable: +33 6 09 17 40 72
Dom. Techno. de Saclay – Bat. Azur
4 rue Rene Razel, 91892 Orsay Cedex – France
[email protected]
www.coherent.com
DELMIC
Sander den Hoedt, MSc, MLL
DELMIC BV
(e) [email protected]
(t) +31646979161
(w) delmic.com
HAMAMATSU PHOTONICS FRANCE
Quynh-nhu trinh-xuan
8, Rue du Saule Trapu
Parc du Moulin de Massy,
91882 Massy Cédex – France
Tel : 01 69 53 71 00
[email protected]
www.hamamatsu.fr
IMAGINE-OPTIC
18 rue Charles de Gaulle
Orsay France 91400
Tel : 01 64 86 15 60
[email protected]
http://www.imagine-optic.com/
ISS
Beniamino Barbieri
1602 Newton Drive
Champaign, illinois 61822
217 359 8681 EXT 11
[email protected]
www.ISS.COM
JPK INSTRUMENTS FRANCE
Dr Anne Duprat
37-39 Avenue Ledru Rollin, CS1123775570
Paris Cedex 12, France
Tel : +33 (0) 1 56 95 16 32
[email protected]
www.jpk.com
168
PARTENAIRES
LAVISION BIOTEC GmbH
Christian Feuillet - Technico commercial
TEl : 07 85 27 81 15
LaVision BioTec GmbH, Astastr. 14, 33617 Bielefeld
Tel : 00 49 521 915139-0
[email protected]
www.lavisionbiotec.com
LIFE SCIENCES SOLUTIONS
THERMO FISHER SCIENTIFIC
Arielle FAURE- PhD - Senior Key Account Manager
Route de l’Orme des Merisiers - Immeuble Le
Discovery – Parc Technologique
91190 SAINT AUBIN - France
Mobile : +33 (0)6 08283060
[email protected]
LEICA MICROSYSTEMS
Stéphane GUEGUEN
Tel : 06.11.29.37.42
[email protected]
86, avenue du 18 Juin 1940
92563 Rueil-Malmaison – France
Tel : 01 47 32 85 32
www.leica-microsystems.com
LORDIL-SUD
Roland Poquet
54, Chemin des Vignes
83560 Vinon sur Verdon
Mobile : 06 32 85 96 44
[email protected]
www.lordil.fr
MAUNA KEA TECHNOLOGIES
Aymeric Blanc, Applications Specialist
Mauna Kea Technologies 75010 Paris
Tel : + 33 1 80 18 27 31
Email : [email protected]
www.maunakeatech.com
NEWPORT SPECTRAPHYSICS
Sabrina Pfeffer
[email protected]
Spectra-Physics
9, rue du Bois Sauvage
91055 Évry Cedex - France
Office Tel: +33-1-60-91-68-68
www.spectra-physics.com
169
PARTENAIRES
NIKON FRANCE S.A.S
Sandrine Batard
Sales administration & Marketing Manager
DDI : +33(0)1 45 16 45 29
Mob : +33(0)6 85 59 47 48
[email protected]
191 rue du marché rollay
94504 Champigny/Marne Cédex – France.
www.nikon.fr
NKT Photonics
Thomas Ferhat - Sales Engineer - France
NKT Photonics France (Bordeaux)
Phone: +33 (0) 6 48 98 39 76
Fax: +49 221 99511-650
[email protected]
www.nktphotonics.com
OLYMPUS France
Philippe Rouhier, Directeur Bio-industrie France et
Benelux
[email protected]
74 rue Arcueil – SILIC 165
94533 Rungis – France
Tel : 01 45 60 23 46
www.olympus.fr
OPTON LASER INTERNATIONAL
Grégoire Saget
Parc Club Orsay Université
29, rue Jean Rostand
91893 ORSAY Cedex - FRANCE
Tel : +33-(0)1.69.41.04.05
[email protected]
www.optonlaser.com
OXFORD INSTRUMENTS
Julien Lopez
77 za de Montvoisin 91400 Gometz -la - Ville
Tel : 06 66 67 73 32
[email protected]
http://www.oxford-instruments.com/
PERKIN ELMER
Evelyne de Bouteiller, Marcom Specialist France
[email protected]
Phone : +33 (0)1 69 59 84 60
Mobile : +33 (0)6 89 52 37 25
ZA Courtaboeuf, 16 Avenue du Québec, Bât Lys,
91140 Villebon sur Yvette, France
www.perkinelmer.com
170
PARTENAIRES
PHASICS
Lucie de Laulanié
[email protected]
XTEC BAT 404
Campus de l’Ecole Polytechnique 91128 Palaiseau
Tel : +33 1 69 33 89 93
PHOTON LINES
Thomas Gelot
[email protected]
30 av de l’Amiral Lemonnier BP 51
78164 Marly le Roy Cedex
Tel: 01 30 08 99 00
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PI FRANCE SAS
Stéphane Bussa, Président / CEO
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T. +33 1 55 22 60 00
M. +33 6 74 45 97 01
244 bis, Avenue Marx Dormoy
92120 Montrouge - France
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12489 Berlin - Germany
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Fax: +49-(0)30-6392-6561
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06 88 05 84 99
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91017 EVRY Cedex – France
Tel : 01 60 86 03 65
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171
PARTENAIRES
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Tel-B : 01 64 46 24 00
VIB&TEC
Benjamin Maffe
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F-68220 – HESINGUE – France
Tel : + 33(0)3 89 69 11 90
Cell : + 33(0)6 71 25 31 33
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CARL ZEISS S.A.S
Fabrice Schmitt
Phone: +33 1 34 80 20 49
Mobile: +33 6 82 84 35 56
mailto:[email protected]
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60, route de Sartrouville
78230 LE PECQ – France
Tel: 01 34 80 20 49
www.zeiss.fr
172
LISTE DES PARTICIPANTS
M. Soroush ABBASIZARGALEH
[email protected]
Laboratoire Aimé Cotton - Cachan
Mme. Nelly BARDET
[email protected]
Institut Fresnel - Marseille
Mlle. Sophie ABÉLANET
[email protected]
Génétique et biologie des cancers - Paris
M. Pierre ADENOT
[email protected]
Biologie du Développement et Reproduction
Jouy en Josas
M. Jean-Charles BARITAUX
[email protected]
CEA Leti - Grenoble
M. Pierre AFFATICATI
[email protected]
INAF - Gif sur Yvette
Mlle. Sherazade AKNOUN
[email protected]
M. Damien ALCOR
[email protected]
Centre Méditerranéen de Médecine Moléculaire
Nice
M. Marc ALLAIN
[email protected]
Mme. Sophie ALLART
[email protected]
Imagerie cellulaire - - Toulouse
M. Leonid ANDRONOV
[email protected]
IGBMC - Strasbourg
Mme. Karine ANSELME
[email protected]
Institut de Science des Matériaux - Mulhouse
Mlle. Florence APPAIX
[email protected]
Institut des Neurosciences - Grenoble
Mme. Claude-Marie BACHELET
[email protected]
Plate-forme Imagerie Pitié-Salpêtrière - Paris
M. Volker BAECKER
[email protected]
Montpellier Rio Imaging - Montpellier
M. Guillaume BAFFOU
[email protected]
M. Xavier BAUDIN
[email protected]
Institut Jacques Monod - Paris
Mme. Sarah BECK-CORMIER
[email protected]
Ingénierie Ostéo-Articulaire et Dentaire - Nantes
Mlle. Anne BEGHIN
[email protected]
Institut interdisciplinaire de Neurosciences - Bordeaux
M. Julien BELLIS
[email protected]
Mlle. Christine BENISTANT
[email protected]
Centre de Biochime Structurale - Montpellier
Mme. Sandrine BENITSKI
[email protected]
INSTITUT ALBERT BONNIOT - Grenoble
M. Romain BERARDOZZI
[email protected]
INSTITUT DE BIOLOGIE STRUCTURALE – Grenoble
M. Francesco BERGAMI
[email protected]
IBMC – Strasbourg
Mlle. Adeline BERGER
[email protected]
Observatoire du Végétal – Versailles
Mlle. Giulia BERTOLIN
[email protected]
Institut de Génétique et Développement de Rennes
Rennes
Mlle. Laëtitia BESSE
[email protected]
Plateforme IMAGIF - Gif sur Yvette
M. Sébastien BESSON
[email protected]
College of Life Sciences - Dundee
173
Mlle. Marlena BETZNER
[email protected]
Modélisation, Intelligence, Processus et Systèmes
Mulhouse
M. Cyrille BILLAUDEAU
[email protected]
Institut Curie - Paris
M. Olivier BLANC
[email protected]
Institut jacques Monod - paris
Mme. Sylvie BOISSEAU
[email protected]
Institut des Neurosciences - Grenoble
Mme. Susanne BOLTE
[email protected]
Institut de Biologie Paris-Seine - Paris
M. Frédéric BOLZE
[email protected]
Laboratoire de Conception et Application des
Molécules Bioactives - Strasbourg
Mlle. Nina BON
[email protected]
Ingénierie Ostéo-Articulaire et Dentaire - Nantes
M. Pierre BON
[email protected]
Institut des Sciences Moléculaires d'Orsay - Orsay
M. Nicolas BORGHI
[email protected]
M. Bertrand BOSON
[email protected]
Centre International de Recherche en Infectiologie
Lyon
M. Floris BOSVELD
[email protected]
Biologie du Développement - Paris
M. Pierre BOURDONCLE
[email protected]
Institut Cochin - Paris 5
M. Nicolas BOURG
[email protected]
Institut des Sciences Moléculaire d'Orsay - Orsay
Mme. Tatiana BOURGADE
[email protected]
M. Dominique BOURGEOIS
[email protected]
Institut de Biologie Structurale - GRENOBLE
Mlle. Adeline BOYREAU
[email protected]
Neurobiologie et Développement - Gif sur Yvette
M. Frédéric BRAU
[email protected]
Institut de Pharmacologie Moléculaire et Cellulaire
Nice
M. Jeremy BREGEON
[email protected]
Neuropathies du système nerveux entérique et
pathologies digestives
Mme. Sylvia BRUNEAU
[email protected]
UMS AMAGEN - Gif-sur-Yvette
Mlle. Sophie BRUSTLEIN
[email protected]
Centre d'Immunologie - CIML - Marseille
Mme. Beatrice BURDIN
[email protected]
Lyon BioImage – Lyon
M. Corey BUTLER
[email protected]
Institut Interdisciplinaire de Neurosciences
Bordeaux
Mlle. Hélène CABANAS
[email protected]
Signalisation et transports ioniques membranaires
Poitiers
M. Alexis CANETTE
[email protected]
plate-forme de microscopie MIMA2 – INRA
MASSY
Mlle. Astrid CANIVET
[email protected]
Centre de Physiopathologie - Toulouse
M. Sylvain CANTALOUBE
[email protected]
Institut Curie – Paris
Mme. Anne CANTEREAU-BECQ
[email protected]
Signalisation et transports ioniques membranaires
Poitiers
M. Benjamin CAPPE
[email protected]
Molecular Signaling and Cell Death – Ghent
(Zwijnaarde)
M. Philippe CARL
[email protected]
Laboratoire de Biophotonique et Pharmacologie
Strasbourg
174
M. Julien CAU
[email protected]
Institut de Génétique Humaine - Montpellier
M. Yann CESBRON
[email protected]
Institut de Génétique et de Développement de
Rennes
M. Christophe CHAMOT
[email protected]
Lyon BioImage – Lyon
Mme. Marie-Thérèse CHARREYRE
[email protected]
Laboratoire Joliot-Curie - Lyon
M. Arnaud CHASTANET
[email protected]
MICALIS - Jouy-en-Josas
M. Julien CHLASTA
[email protected]
Centre de Génétique et de Physiologie Moléculaire
et Cellulaire - Lyon
Mlle. Caroline CLERTE
[email protected]
Centre de Biochimie Structurale - Montpellier
M. Bruno COLICCHIO
[email protected]
Mulhouse
M. Sébastien COLIN
[email protected]
Station Biologique de Roscoff - ROSCOFF
Mlle. Nathalie COLOMBIÉ
[email protected]
Laboratoire de Biologie Cellulaire et Moléculaire
du Contrôle de la Prolifération - Toulouse
M. Jean-Christophe COMTE
[email protected]
Centre de Recherche en Neurosciences - Lyon
Mme. Geneviève CONEJERO
[email protected]
M. Vincent CONTREMOULINS
[email protected]
M. Mathieu COPPEY
[email protected]
Institut Curie - paris
M. Fabrice CORDELIÈRES
[email protected]
Bordeaux Imaging Center - Bordeaux
Mlle. Angele CORTIAL
[email protected]
Laboratoire d'Automatique et de Génie des Procédés
Lyon
Mme. Marie-Pierre COURAGEOT
[email protected]
Matrice Extracellulaire et DYnamique Cellulaire
Reims
M. Zsolt CSABA
[email protected]
Neuroprotection du cerveau en développement
Paris
M. Stephane DALLONGEVILLE
[email protected]
Institut Pasteur - Paris
Mlle. Lydia DANGLOT
[email protected]
Institut Jacques Monod - Paris 7
M. Aurélien DAUPHIN
[email protected]
Institut du Cerveau et de la Moelle épinière - Paris 7
Mme. Stéphanie DAUVILLIER
[email protected]
Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale
Toulouse
M. Matthieu DEBAILLEUL
[email protected]
Mulhouse
M. Simon DEBECO
[email protected]
M. Fabrice DECHAUMONT
[email protected]
M. Didier DECIMO
[email protected]
Centre International de Recherche en Infectiologie
Lyon
M. Théophile DÉJARDIN
[email protected]
Mlle. Elodie DEJOB
[email protected]
M. Antoine DELON
[email protected]
Laboratoire Interdisciplinaire de Physique
Grenoble
175
Mlle. Claire DÉMÉAUTIS
[email protected]
Institut de Génétique et de Développement de
Rennes
Mme. Maud DESAINT-JEAN
[email protected]
Institut Pharmacologique Moléculaire et Cellulaire
Nice
Mlle. Raphaelle DESVAUX
[email protected]
Plateforme d'Imagerie Cellulaire - Necker - Paris 5
M. Brice DETAILLEUR
[email protected]
Institut de Biologie du Développement - Marseille
Mme. Vicky DIAKOU
[email protected]
M. Pascal DIDIER
[email protected]
Strasbourg
M. Alain DIETERLEN
[email protected]
Mulhouse
M. Jim DOMPIERRE
[email protected]
Institut de Biochimie et Génétique Cellulaires
Bordeaux cedex
M. Joël EYER
[email protected]
Laboratoire Neurobiologie et Transgénèse - Angers
Mlle. Roxane FABRE
[email protected]
M. Dimitri FABRÈGES
[email protected]
BioEmergences - Gif-sur-Yvette
M. Orestis FAKLARIS
[email protected]
M. Abud FARCA-LUNA
[email protected]
Centre de Recherche en Neurosciences - Lyon
M. Guillaume FARGIER
[email protected]
Laboratoire de Tribologie et dynamique des Systèmes
Ecully
M. Jean-Daniel FAUNY
[email protected]
Immunopathologie et Chimie Thérapeutique
Strasbourg
M. Cyril FAVARD
[email protected]
CPBS - Montpellier
M. Antoine FEDERICI
[email protected]
Laboratoire Charles Fabry - Palaiseau
Mme. Laurence DUBREIL
[email protected]
Plateforme APEX - Nantes
M. Patrick FERRAND
[email protected]
M. Alexandre DUFOUR
[email protected]
M. Arnold FERTIN
[email protected]
TIMC-IMAG - Grenoble
M. Julien DUMONT
[email protected]
INAF - Gif-sur-Yvette
M. Loic DUPRE
[email protected]
Centre de Physiopathologie de Toulouse Purpan Toulouse
M. Jean-Bernard FICHE
[email protected]
M. Guillaume DUPUIS
[email protected]
Centre de Photonique Biomédicale - Orsay
Mlle. Béatrice DUREL
[email protected]
M. Abdelmounaim ERRACHID
[email protected]
Université Catholique de Louvain - Bruxelles
Mme. Monique FRAIN
[email protected]
Neurobiologie et Développement - Gif-sur-Yvette
Mlle. Perrine FRERE
[email protected]
UPMC - Paris
Mme. Carole FRINDEL
[email protected]
CREATIS - Lyon
M. Jérémie GAILLARD
[email protected]
Laboratoire de physiologie cellulaire et végétale
Grenoble
176
Mme. Frédérique GAITS-IACOVONI
[email protected]
Institut des maladies métaboliques et
cardiovasculaires - Toulouse
M. Joseph GALLAGHER
[email protected]
Laboratoire Interdisciplinaire de Physique
Grenoble
Mme. Meriem GARFA TRAORE
[email protected]
Plateforme d'Imagerie Cellulaire – Necker
Paris 5
Mlle. Paulina GASECKA
[email protected]
Mlle. Carole GAURON
[email protected]
Collège de France - Paris
Mlle. Charlène GAYRARD
[email protected]
M. Laurent GELMAN
[email protected]
Facility for Advanced Imaging and Microscopy
Basel
M. Pierre GEMAYEL
[email protected]
Mulhouse
Mlle. Maéva GESSON
[email protected]
M. Gregory GIANNONE
[email protected]
Bordeaux
M. Lionel GISSOT
[email protected]
Observatoire du Végétal - Versailles
M. David GODEFROY
[email protected]
Institut de la vision – Paris
Mlle. Isabelle GOIFFON
[email protected]
Laboratoire de Biologie Moléculaire Eucaryote
Toulouse
M. Mariano GONZALEZ PISFIL
[email protected]
Institut de Recherche Interdisciplinaire - Lille
M. Nicolas GOUDIN
[email protected]
Plateforme d'Imagerie Cellulaire - Necker - Paris 5
M. Alexei GRICHINE
[email protected]
Institut Albert Bonniot - Grenoble
Mlle. Marianne GROGNOT
[email protected]
Laboratoire d'Optique et Biosciences - Palaiseau
Mlle. Chloé GUEDJ
[email protected]
Institut Cochin - Paris
Mme. Claire GUÉNÉ
[email protected]
M. Christophe GUÉRIN
[email protected]
Laboratoire de Physiologie Cellulaire et Végétale
Grenoble
M. David GUET
[email protected]
Hôpital Saint-Louis - Paris
M. Jean-François GILLES
[email protected]
Institue Biologie Paris-Seine - Paris
M. Thomas GUILBERT
[email protected]
Mme. Isabelle GILLOT
[email protected]
Génétique de la détermination du sexe et de la
fertilité - Nice
M. Vasily GURCHENKOV
[email protected]
Mme. Perrine GILLOTEAUX
[email protected]
M. Olivier HAEBERLE
[email protected]
Mulhouse
M. Hugues GIOVANNINI
[email protected]
M. Charles-Henri HAGE
[email protected]
177
M. Houssam HAJJOUL
[email protected]
M. Charles KERVRANN
[email protected]
Centre de Recherche Inria - Rennes
M. Yannick HAMON
[email protected]
Mlle. Emilie HANGEN
[email protected]
Bordeaux
M. Pascal KESSLER
[email protected]
Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire
et Cellulaire - Strasbourg
M. Simon HAZIZA
[email protected]
Laboratoire Aimé Cotton - Orsay
M. Xavier HEILIGENSTEIN
[email protected]
M. Philippe HEINRICH
[email protected]
Laboratoire de Mathématiques Paul Painlevé - Lille
M. Laurent HÉLIOT
[email protected]
Mlle. Mélanie HENRY
[email protected]
M. Gaëtan HERBOMEL
[email protected]
Institut de Génétique et de Développement
Rennes
M. Christophe KLEIN
[email protected]
Centre de Recherche des Cordeliers - Paris 5
M. Andrey KLYMCHENKO
[email protected]
Strasbourg
M. Jan Wolfgang KRIEGER
[email protected]
German Cancer Research Center - Heidelberg
Mlle. Chrystel LAFONT
[email protected]
Institut de Génomique Fonctionnelle - Montpellier
M. Thibault LAGACHE
[email protected]
Mlle. France LAM
[email protected]
M. Cedric LANDMANN
[email protected]
Institut Européen de Chimie et de Biologie - Bordeaux
M. Niko HILDEBRANDT
[email protected]
IEF / Nano Bio Photonics – Orsay
Mme. Christelle LANGEVIN
[email protected]
Infection et Immunité des Poissons - Jouy en Josas
M. Philippe HULIN
[email protected]
Plateforme MicroPICell – Nantes
Mme. Corinne LAPLACE-BUILHE
[email protected]
PLATE-FORME IMAGERIE ET CYTOMETRIE – Villejuif
M. Paul IMBERT
[email protected]
Institut de Biologie et Chimie des Protéines Lyon
M. Remi LASSERRE
[email protected]
Centre d'Immunologie - CIML – Marseille
Mlle. Marie IRONDELLE
[email protected]
Mlle. Patricia LEBACCON
[email protected]
Mme. Aude JOBART-MALFAIT
[email protected]
Institut Jacques Monod - Paris 7
M. Romain LEBARS
[email protected]
Plateforme IMAGIF - Gif-sur-Yvette
M. Jean-Stéphane JOLY
[email protected]
Mme. Corinne LEBRETON
[email protected]
Hôpital Necker - Paris 5
Mme. Milene JUAN
[email protected]
LVMH Recherche - Saint Jean de Braye
Mme. Sandrine LÉCART
[email protected]
Centre de Photonique BioMédicale – Orsay
178
M. Ludovic LECONTE
[email protected]
M. Thierry LEGOU
[email protected]
Parole et Langage - Aix en Provence
Mme. Delphine LEGUILLOU
[email protected]
Laboratoire d'Imagerie Biomédicale - UPMC
Paris
M. Corentin LENEZET
[email protected]
M. Aymeric LERAY
[email protected]
Laboratoire interdisciplinaire Carnot de Bourgogne
Dijon
M. Christophe LETERRIER
[email protected]
Centre de Recherche en Neurobiologie et
Neurophysiologie - Marseille
Mme. Sandrine LÉVÊQUE-FORT
[email protected]
Institut des Sciences Moléculaires d'Orsay - Orsay
M. Fabrice LICATA
[email protected]
Plateforme IUH – Paris
Mlle. Claire LOVO
[email protected]
Plateforme d'imagerie cellulaire - Pitié-Salpêtrière
Paris
M. Quentin LUBART
[email protected]
Laboratoire des Matériaux et du Génie Physique
Grenoble
Mme. Camilla LUCCARDINI
[email protected]
Centre de Génétique et de Physiologie Moléculaire
et Cellulaire - Lyon
M. Pierre MAHOU
[email protected]
Laser Analytics Group - Cambridge
M. Sébastien MAILFERT
[email protected]
M. Grégoire MALANDAIN
[email protected]
INRIA / Morphologie et Images
Nice/Sophia Antipolis
M. Thomas MANGEAT
[email protected]
Laboratoire de biologie cellulaire et moléculaire
du contrôle de la prolifération - Toulouse
M. Sébastien MARAIS
[email protected]
Bordeaux Imaging Center – Bordeaux
Mlle. Charlotte MARIANI
[email protected]
CPBS – Montpellier
M. Xavier MARQUES
[email protected]
Institut de Biologie - ENS – Paris
Mlle. Cristina MARTINEZ TORRES
[email protected]
Laboratoire de Physique - ENS – Lyon
M. Julio MATEOS LANGERAK
[email protected]
Institut de Génétique Humaine – Montpellier
M. Benjamin MATHIEU
[email protected]
plate-forme IMACHEM – Paris
M. Cédric MATTHEWS
[email protected]
Institut de Biologie du Développement – Marseille
M. Benoit MAURY
[email protected]
Plateforme CYMAGES - Saint-Quentin en Yvelines
Mlle. Céline MAYET
[email protected]
Service d'Immuno-Virologie - CEA - Fontenay-aux-Roses
Mme. Vannary MEAS-YEDID
[email protected]
Institut Pasteur – Paris
Mme. Caroline MEDIONI
[email protected]
Institut de Biologie de Valrose – Nice
Mlle. Marjolijn MERTZ
[email protected]
Plateforme PRISM – Nice
M. Guillaume MICOUIN
[email protected]
Laboratoire de chimie - ENS - Lyon
M. Mayeul MILIEN
[email protected]
Plateau d'Imagerie Cellulaire - Angers
Mlle. Magali MONDIN
[email protected]
Institut de Biologie de Valrose - Nice
179
Mlle. Karine MONIER
[email protected]
Laboratoire Joliot Curie – Lyon
M. Serge MONNERET
[email protected]
Institut Fresnel – Marseille
M. Benjamin MORGA
[email protected]
Laboratoire de génétique et pathologie des
mollusques marins - La Tremblade
Mme. Delphine MURIAUX
[email protected]
CPBS – Montpellier
M. Jérôme MUTTERER
[email protected]
Institut de Biologie Moléculaire des Plantes
Strasbourg
Mlle. Wallis NAHABOO
[email protected]
Laboratoire de Biologie Moléculaire de la Cellule
Lyon
M. Steven NEDELLEC
[email protected]
Plateforme MicroPICell – Nantes
Mme. Valérie NICOLAS
[email protected]
Institut Paris Sud d'Innovation Thérapeutique
Châtenay-Malabry
Mlle. Elodie NOIROT
[email protected]
Plateforme Dimacell
Dijon
M. Stéphane ORY
[email protected]
Institut des Neurosciences Cellulaires et Intégratives
Strasbourg
Mme. Isabelle PAINTRAND
[email protected]
Laboratoire des Matériaux et du Génie Physique
Grenoble
M. Thierry PÉCOT
[email protected]
Serpico – Rennes
M. David PECQUEUR
[email protected]
Observatoire Océanologique - Banyuls sur Mer
Mlle. Mélanie PEDRAZZANI
[email protected]
Laboratoire Aimé Cotton – Orsay
M. Antonio PEIXOTO
[email protected]
Institut de Pharmacologie et Biologie Structurale
Toulouse
Mme. Arlette PESTY
[email protected]
Mlle. Jennifer PETERSEN
[email protected]
Mlle. Mylene PEZET
[email protected]
Institut Albert Bonniot - Grenoble
M. Sébastien PIANT
[email protected]
Molécules Bioactives – Strasbourg
M. Laurent PIEUCHOT
[email protected]
M. Tristan PIOLOT
[email protected]
M. Renaud POINCLOUX
[email protected]
Institut de Pharmacologie et Biologie Structurale
Toulouse
Mme. Christel POUJOL
[email protected]
Mlle. Morgane RABINEAU
[email protected]
Biomatériaux et Bioingénierie - Strasbourg
M. Damien RAMEL
[email protected]
Laboratoire de Biologie Cellulaire et Contrôle de la
Prolifération - Toulouse
Mlle. Adeline RAUSCH
[email protected]
Neurobiologie et Développement - Gif sur Yvette
Mlle. Gaëlle RECHER
[email protected]
Department of Physiology, Development and
Neuroscience
Cambridge
M. Olivier RENAUD
[email protected]
M. Denis RESSNIKOFF
[email protected]
Centre d'Imagerie Quantitative - Lyon
180
M. Javier REY-BARROSO
[email protected]
Imagerie Cellulaire - Centre de Physiopathologie
Toulouse
Mlle. Lina RIACHY
[email protected]
Laboratoire de Nanotechnologie et d'Instrumentation
Optique
Troyes
Mme. Anne-Cécile RIBOU
[email protected]
Institut de modélisation et d'analyse en géoenvironnement et santé
Perpignan
Mlle. Elodie RICHARD
[email protected]
Bio Imaging Center Lille - Lille
M. Ludovic RICHERT
[email protected]
Strasbourg
M. Franck RIQUET
[email protected]
Molecular Signaling and Cell Death - Ghent
(Zwijnaarde)
Mlle. Barbara RIZZI
[email protected]
M. Philippe RONDÉ
[email protected]
Strasbourg
Mlle. Valérie ROUFFIAC
[email protected]
PLATE-FORME IMAGERIE ET CYTOMETRIE
Villejuif
M. Julien ROUL
[email protected]
Rennes
M. David ROUSSEAU
[email protected]
Lyon BioImage - Lyon
M. Christian ROUVIERE
[email protected]
Biologie du développement - Villefranche sur mer
M. Jean SALAMERO
[email protected]
Mlle. Audrey SALLES
[email protected]
M. Aubin SAMACOITS
[email protected]
Mme. Yasmina SAOUDI
[email protected]
Institut des Neurosciences – Grenoble
Mlle. Amélie SARRAZIN
[email protected]
Institut de génétique humaine - Montpellier
M. Julien SAVATIER
[email protected]
Institut Frenel – Marseille
M. Philippe SCHAEFFER
[email protected]
LVMH Recherche - St Jean de Braye
M. Damien SCHAPMAN
[email protected]
PRIMACEN – Rouen
M. Sébastien SCHAUB
[email protected]
Institut de Biologie de Valrose – Nice
M. Emmanuel SCHAUB
[email protected]
Institut de Physique de Rennes - Rennes
Mme. Sonia SCHOTT-ROUX
[email protected]
Laboratoire de Biologie Cellulaire et Moléculaire
du Contrôle de la Prolifération - Toulouse
Mme. Marine SCOAZEC
[email protected]
Plateforme d'Imagerie Cellulaire et Tissulaire - Orsay
Mlle. Cynthia SEILER
[email protected]
Mlle. Hafida SELLOU
[email protected]
Rennes
M. Fabrice SENGER
[email protected]
Laboratoire de Physiologie Cellulaire et Végétale
Grenoble
M. Jean-Baptiste SIBARITA
[email protected]
Bordeaux
M. William SIGNAC
[email protected]
Institut Européen de Chimie et Biologie
Bordeaux
181
M. Bertrand SIMON
[email protected]
Mulhouse
M. François SIPIETER
[email protected]
Mme. Marie-Noëlle SOLER
[email protected]
Plateforme d'Imagerie Cellulaire et Tissulaire - Orsay
M. Frédéric SOR
[email protected]
CNRS-INSB - Paris
M. Ferréol SOULEZ
[email protected]
Centre de Recherche Astrophysique - Lyon
M. Alexandre SPECHT
[email protected]
Molécules Bioactives - Strasbourg
Mme. Angélique STÉPHANOU
[email protected]
M. Vincent STUDER
[email protected]
Bordeaux
Mlle. Astou TANGARA
[email protected]
Plateforme IMACHEM - Paris
Mlle. Meryem TARDIVEL SAFI
[email protected]
Bio Imaging Center Lille - Lille
M. Patrick TAUC
[email protected]
Laboratoire de Biotechnologie et de Pharmacologie
Appliquée - CACHAN
M. Jérémie TEILLON
[email protected]
Collège de France – Paris
Mme. Christine TERRYN
[email protected]
Plateau technique en Imagerie Cellulaire et
Tissulaire - REIMS
Mlle. Claire TEULON
[email protected]
Laboratoire d'Optique et Biosciences - Palaiseau
M. Jean-Yves TINEVEZ
[email protected]
M. Nicolas TISSOT
[email protected]
M. Marc TRAMIER
[email protected]
Rennes
M. Olivier TRASSARD
[email protected]
Institut Biomédical de Bicêtre - Paris
M. Thomas TRESSARD
[email protected]
Neurobiologie - INMED - Marseille
Mme. Sabine TRICOT
[email protected]
Service d'Immuno-Virologie - CEA - Fontenay Aux Roses
Mlle. Karen URIOT
[email protected]
M. Yves USSON
[email protected]
Mlle. Caroline VACHIAS
[email protected]
Laboratoire GReD - Clermont-fd
M. Romain VAUCHELLES
[email protected]
Strasbourg
M. François WAHARTE
[email protected]
Mme. Irène WANG
[email protected]
Laboratoire Interdisciplinaire de Physique - Grenoble
Mlle. Elisabeth WERKMEISTER
[email protected]
Bio Imaging Center Lille - LILLE
Mlle. Pascale WINCKLER
[email protected]
Plateforme Dimacell - Dijon
Mme. Luciane ZABIJAK
[email protected]
Plate forme ICAP - Amiens
M. Daniel ZAHARIA
[email protected]
Mlle. Xuan ZHAO
[email protected]
Laboratoire Photonique et Nanostructures Marcoussis
182
LISTE DES INTERVENANTS
Simon AMER BEG
[email protected]
King's College London - Londres
Christophe ESCUDE
[email protected]
Structure et Instabilité des Génomes - MNHN - Paris
Bertrand AUDOIN
[email protected]
BioingénierieTissulaire - INSERM - Bordeaux
Emmanuel FARGE
[email protected]
Martial BALLAND
mailto:[email protected]
Laboratoire interdisciplinaire de Physique
Saint Martin d'Hères
Christoph GEBHARDT
[email protected]
Neuronal Circuit Development Group / Institut Curie
Paris
Emmanuel BEAUREPAIRE
[email protected]
Lab for optics and biosciences - Palaiseau
Christel GENOUD
[email protected]
Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research
Bâle
Yohanns BELLAICHE
[email protected]
Génétique et biologie du développement
Sylvain GIGAN
[email protected]
Institut Langevin - ESPCI - Paris
Huges BERRY
[email protected]
INRIA - équipe BEAGLE - Lyon
Stefan GRILL
[email protected]
Biotechnology Center TU Dresden - Dresden
Eric BETZIG
[email protected]
Janelia Farm Research Campus - HHMI
Laurent GROC
[email protected]
Interdisciplinary Institute for Neuroscience - Bordeaux
Emmanuel BOSSY
[email protected]
Institut Langevin - ESPCI - Paris
Mike HEILEMANN
[email protected]
Institute for Physical and Theoretical Chemistry
Frankfurt
Laurent BOURDIEUX
[email protected]
Sophie BRASSELET
[email protected]
Institut Fresnel - MOSAIC - Marseille
Stefan CATHELINE
[email protected]
LabTAU - Lyon
Mathieu COPPEY
[email protected]
Maxime DAHAN
[email protected]
Unité Physico-Chimie / Institut Curie - Paris
Delphine DÉBARRE
[email protected]
Laboratoire Interdiciplaire de Physique
Grenoble
David HOLCMAN
[email protected]
Kees JALINK
[email protected]
The Netherlands Cancer Institute - Amsterdam
Ludvic JULIEN
[email protected]
ENS Paris - Département de Chimie - Paris
Jen KRIGER
[email protected]
Biophysics of Macromolecules (DKFZ) - Heidelberg
Laëtitia KURZAWA
[email protected]
Institute of Life Science Research and Technology
Grenoble
183
Benoit LADOUX
[email protected]
Frank LAFONT
[email protected]
Institut Pasteur de Lille - Lille
Jorg LANGOWSKI
[email protected]
German Cancer Research Center (DKFZ)
Heidelberg
Pierre-François LENNE
[email protected]
Institut de Biologie du Développement
Marseille
Grégoire MALANDAIN
[email protected]
INRIA / Morphologie et Images
Nice/Sophia Antipolis
Suliana MANLEY
[email protected]
EPFL - Laboratoire de biophysique expérimentale
Lausanne
Emmanuel MARGEAT
[email protected]
Alex MC. DOUGALL
[email protected]
UMPC - Cell Cycle In Eggs And Embryos Group
Villefranche-sur-mer
René-Marc MÈGE
[email protected]
Gael MONERON
[email protected]
May MORRIS
[email protected]
Institut des Biomolécules Max Mousseron (IBMM)
Montpellier
Nadine PEYRERAS
[email protected]
Institut de Neurobiologie Alfred Fessard
Gif sur Yvette
Hervé RIGNEAULT
[email protected]
Olivier ROSSIER
[email protected]
Institut Interdisciplinaire de Neuroscience
Bordeaux
Klemens ROTTNER
[email protected]
Institute of Genetics - Bonn
Lothar SCHERMELLEH
[email protected]
Université d'Oxford, biochemistry Dpt - Oxford
Yannick SCHWAB
[email protected]
EMBL - Heidelberg
Bernard STIEGER
[email protected]
Institut de recherche et d’innovation - Paris
Willy SUPATTO
[email protected]
Laboratoire Optique et Biosciences - Palaiseau
Grégoire VANDECASTEELE
[email protected]
Laboratoire de Signalisation et Physiopathologie
Cardiaque - Chatenay-Malabry
Julien VERMOT
[email protected]
IGBMC - Institut de Génétique et de Biologie
Moléculaire et Cellulaire - Illkirch
Paul WISEMAN
[email protected]
Departments of Physics and Chemistry McGill
University - Montréal
Diana ZALA
[email protected]
Institut Curie - Orsay
Andreas ZUMBUSCH
[email protected]
Université de Konstanz - Konstanz
184
185
Planning Général MIFOBIO 2014 Octobre 2014
Samedi 4
8h30
10h30
Dimanche 5
Lundi 6
Mardi 7
Mercredi 8
Module 1 : Organisation moléculaire du vivant et nanoscopie
Module 3 : Microscopie aux différentes échelles du vivant pour une biologie intégrative de la molécule à l’organisme
Module 4 :
Optogénétique et biosenseurs
Module 5 :
Dynamique et interaction moléculaire en cellules vivantes
Accueil
Jeudi 9
Vendredi 10
8H00
Module 6 :
Module 7 :
Contrôle des ondes pour l’imagerie du Nouvelles imageries vivant et microscopies multimodales
pause‐café (15')
10h45
2x2 Cours
11h45
2x2 Cours 2x2 Cours 2x2 Cours 2x2 Cours 2x2 Cours 12h45
Déjeuner
12h45 ‐ 14h30
14h30
15h30
dès 13h30
Pré‐Modules
(PM1 à PM6)
Ateliers
Ateliers
Table‐rondes
Table‐rondes
Modules avancés Modules avancés
intro 15'
Module 2 : Mécano‐biologie Ateliers
cellulaire et Table‐rondes
tissulaire : expérimentation et Modules avancés
modélisation
____________
18h45
Ateliers
Ateliers
Table‐rondes
Table‐rondes
pause‐café (15')
16h30
16h45
Libre
Panier repas
Départ Navettes
12h30
Séminaires
S1 ‐ E. Beaurepaire S2 ‐ D. Zala
S3 ‐ C. Escude
2x2 Cours Libre
18h30 : AG GDR
19h30 : Histoire de Séminaire
S4 ‐ E. Betzig
la microscopie
J‐M. Lago
Ateliers
Ateliers
Table‐rondes
Table‐rondes
Séminaire
S5 ‐ PF. Lenne
Séminaire
S6 ‐ L. Bourdieu
Diner
20h00
21h30
Session
POSTER
Ateliers
Ateliers
Table‐rondes
Table‐rondes
23h30
Soirée
Dansante
Ateliers
Table‐rondes
Modules avancés
Séminaire
S7 ‐ B. Stiegler
BILAN
Libre
Modules (M) et Séminaires (S) : Salle Atlantique ‐ Cours : Salles Atlantique et Galipot ‐ Session Poster : Hall
Détails Pré‐Modules (PM), Ateliers (A), Tables‐Rondes (TR) et Modules Avancés (MA) : voir planning

il était une fois mifobio..... - gdr-Miv

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