thèse - Université Bordeaux I
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thèse - Université Bordeaux I
N° d’ordre : 4494 UNIVERSITÉ BORDEAUX I Ecole doctorale : Sciences et Environnements THÈSE présentée par : M. Guillaume MEISTERHANS Pour obtenir le grade de docteur Spécialité : Biogéochimie et Ecosystèmes Dynamique de la structure génétique des communautés procaryotes en zone benthique côtière : caractérisation de la microflore des sédiments et des bivalves fouisseurs par empreintes moléculaires. Soutenue le : 8 Mars 2012 Devant la commission d'examen formée de : Antoine GREMARE, Professeur, Université Bordeaux 1 Président Robert DURAN, Professeur, Université de Pau et des Pays d’Adour Rapporteur Daniel GUIRAL, Directeur de recherche, IRD, Marseille Rapporteur Marc BALLY, Chargé de recherche, CNRS, Marseille Examinateur Frédéric GARABETIAN, Professeur, Université Bordeaux 1 Directeur de thèse Florence JUDE-LEMEILLEUR, Maître de Conférences, Université Bordeaux 1 Co-directrice de thèse Natalie RAYMOND, Maître de Conférences, Université Bordeaux 1 Co-encadrante de thèse REMERCIEMENTS A quelques jours de déposer mon manuscrit, au moment où mes chefs sont plongés dans leurs dernières relectures, je profite de quelques heures de répit pour me remémorer mes trois années de thèse. En trois ans, je suis passé de l’enthousiasme de commencer un nouveau projet, aux doutes et au découragement face aux nombreuses difficultés et à l’exigence de ce travail, à la satisfaction enfin de le voir progresser, et évoluer. En Janvier 2009 a débarqué à Arcachon un jeune étudiant timide, il en repartira en Mars prochain un jeune chercheur débutant beaucoup plus confiant en lui-même. Cette évolution est le fruit de nombreuses rencontres que je souhaite remercier ici pour toute l’aide, le soutien, les conseils qu’elles m’ont apportés ou tout simplement pour leur bonne humeur et leur joie de vivre qui ont fait de ces trois années, une aventure incroyable. Tout d’abord, je souhaite remercier le directeur de l’école doctorale Sciences et Environnements, le Professeur Richard Michalet et le directeur par intérim, le Professeur Pascal Murail. Ce travail a été réalisé au sein de l’UMR EPOC (Environnements et Paléoenvironnements Océaniques et Continentaux). Je souhaite remercier le directeur à mon arrivée en 2009, le Docteur Philippe Bertrand. Un grand remerciement à son successeur, le Professeur Antoine Grémare, ancien directeur de la station marine d’Arcachon et je l’espère futur directeur du POA, qui a également accepté de siéger à mon jury de thèse. Merci à vous Antoine d’avoir consacré du temps à éclaircir ma vision du traitement de données et de l’analyse statistique. Un grand merci à l’équipe ECOBIOC (ECOlogie et BIOgéochimie des systèmes Côtiers) qui m’a permis de partir compléter ma formation au Danemark au travers d’une école d’été en écologie microbienne et moléculaire. Par son soutien financier ECOBIOC m’a également permis d’aller présenter mes travaux de recherche au colloque européen « EUROLAG » au Portugal et également au colloque de l’AFEM, spécialisé en écologie microbienne. Merci de m’avoir permis de vivre ces expériences enrichissantes. Je souhaite en remercier les deux directeurs successifs le Docteur Guy Bachelet et le Docteur Xavier de Montaudouin. Merci également à vous Xavier de votre implication dans mes travaux sur les communautés bactériennes associées aux bivalves au travers de vos relectures, de votre analyse critique, de vos précieux conseils et de votre aide sur le terrain. Merci également de m’avoir fait découvrir la beauté du Banc d’Arguin et celle des côtes et vallées portugaises. J’adresse mes profonds remerciements au Professeur Robert Duran de l’Université de Pau et des Pays de l’Adour ainsi qu’au Docteur Daniel Guiral, directeur de recherche IRD à l’IMBE de Marseille, d’avoir accepté d’être rapporteurs de ma thèse et de bien avoir voulu évaluer ce travail dans les courts délais que nous avons sollicités. Merci également au Docteur Marc Bally de l’Université de Marseille d’avoir accepté d’évaluer la qualité de mon travail en tant qu’examinateur. Ce travail n’existerait pas sans la confiance qu’ils m’ont accordée, sans l’immense aide et soutien qu’ils m’ont apportés au cours de ces trois années. Je parle bien évidemment de mes trois directeurs de thèse Frédéric Garabetian, Florence Jude-Lemeilleur et Natalie Raymond. Tout d’abord un incommensurable merci à mon maître Jedi. J’espère ne pas avoir été un trop mauvais Padawan. Les débuts ont été durs, je me souviens des premières réunions au cours desquelles je ne comprenais qu’un mot sur cinq. Tu parlais dans un langage qui m’était complètement inconnu d’écotone, de déterminisme de la dynamique spatiale des communautés, de touchdown PCR. Au travers de nos heures de réunion, j’ai commencé à apprivoiser petit à petit ce dialecte si complexe de la science. Avec patience tu as réussi à me transmettre un peu de ta Force. Merci également de m’avoir sacrifié un certain nombre de tes soirées et week-end, de t’être transformé aussi bien en vasouilleur pour me prêter main forte sur le terrain, qu’en psychologue pour me faire relativiser certaines choses. Grâce à toi, je me sens plutôt bien armé pour partir vers de nouvelles aventures. Mille fois merci à toi Florence d’avoir été mon épaule au quotidien, dans la gestion des commandes, dans les casse-têtes des PCR qui marchent qui ne marchent plus et qui remarchent à nouveau, mais aussi dans les casse-têtes des résultats à interpréter. Mille fois car c’est au moins le nombre de fois où je suis venu te déranger pour te poser des questions en tout genre dont un grand nombre de questions bêtes. Tu as toujours su y répondre avec gentillesse et avec le sourire. Merci pour ton soutien et pour tes pdf comiques et toutes les histoires drôles transmises par mail qui m’ont offert quelques moments de détente dans ces longues heures de rédaction. Natalie, merci de t’être impliquée dans ce travail, de t’être toi aussi transformée en vasouilleuse pour ramener toutes ces palourdes. Qu’elles ont été nombreuses ces palourdes et ces heures durant lesquelles avec minutie tu les as toutes disséquées. Merci pour ce travail fastidieux et pour avoir pris le temps entre deux coups de scalpel de m’expliquer la physiologie de ces bébêtes. Merci également d’avoir partagé le bureau avec moi pendant un peu plus de deux ans et d’avoir supporté mes cultures mycéliennes sur milieu liquide caféine-sucrose. Merci enfin pour tes longues heures de relecture à éplucher entre autre mes listes de références biblio anarchiques au possible. Merci également à vous trois de m’avoir offert l’opportunité de faire mes premiers pas dans l’enseignement. Vous avoir tous les trois à mes côtés m’a permis d’apprendre énormément. Merci pour tout le temps que vous m’avez consacré. Les analyses d’abondance et de diversité procaryotes présentées dans ce manuscrit ont été réalisées en collaboration avec le Docteur Claude Courties de la plateforme Imagerie-Cytométrie de Banyuls sur mer et le Docteur Franck Salin de la plateforme Génome-Transcriptome de Pierroton. Je tenais donc à les remercier ainsi que leurs équipes pour m’avoir accueilli dans leur laboratoire et/ou réalisé ces analyses. Je remercie également le Docteur Christophe Lambert et son équipe pour avoir réalisé les mesures des paramètres hémocytaires présentés dans ce manuscrit et le Docteur Martin Plus de l’IFREMER d’Arcachon d’avoir fait fonctionner son modèle MARS 3D pour chacun des sites du Bassin d’Arcachon que j’ai étudié. Mes premiers traitements d’arisogrammes me prenaient près d’une semaine avant d’obtenir une matrice d’abondance relative. Puis ma route a croisé celle d’une ancienne Padawan, Emilie Lyautey (dont je tairai ici le surnom, que dis-je, le titre que lui a valu son implication dans IDFEC, par peur de croiser son regard noir qui tue !) et tout est devenu beaucoup plus simple. Merci Emilie de m’avoir transmis toutes ces petites astuces, ces petits programmes qui ont facilité mon quotidien. Je n’ai croisé personne d’autre qui manie aussi bien l’écouvillon à étron que la notion d’opéron ! Ni quelqu’un qui peut parler de diversité, les mains dans le lisier ! Je garderai de super souvenirs de notre excursion au point S, de notre virée nocturne sur le port d’Arcachon, et de cette gourmande soirée jurassienne. Le programme ORIQUART a beaucoup apporté à cette thèse. J’en remercie l’ensemble des participants et plus particulièrement Sophie Dubois, Hugues Blanchet et Nicolas Savoye. Sophie, merci pour l’organisation pratique des deux « cartos » et de m’avoir transmis un large jeu de données environnementales qui m’ont permis d’expliquer la structure des mes p’tites communautés procaryotes. Merci surtout d’avoir été présente durant ces trois années. Tu as beaucoup contribué à mon intégration au sein de la station marine. Plus qu’une collègue, tu es devenue une amie. Merci pour toutes les soirées que l’on a passées ensemble, pour nos longues discussions sur la plage arcachonnaise, pour nos pauses café défouloirs, nos craquages, nos batailles d’eau et de vase ; il y a bien trop de souvenirs pour que je puisse tout résumer ici en quelques lignes. A quelques semaines près, nous avons commencé ensemble, à quelques semaines près nous terminons ensemble. Courage pour ta dernière ligne droite ! Hugues, un grand merci pour tes conseils en analyse des communautés et en utilisation de Primer. Et un immense merci pour m’avoir apporté une aide financière qui m’a permis de ne pas restreindre mes travaux à l’analyse des communautés bactériennes mais d’accéder également aux communautés archéennes, ce qui contribue fortement à l’originalité de mes travaux sur les communautés procaryotes des sédiments. Nicolas, merci de m’avoir intégré à ce programme et de m’avoir permis de bénéficier des données sur la qualité de la MO. Merci également pour nos festifs et costumés nouvel an chez toi ainsi que pour nos soirées barbecue avec ou sans alarme déclenchée. Ces « cartos » n’auraient pu être sans une équipe de préleveurs de choc. A commencer par petit Benoit (i.e. Benoit Gouilleux), le vasouilleur de l’extrême. Merci à toi d’avoir, entre autre, passé quinze jours sous la pluie et dans la vase à remplir des sacs, des barquettes en alu et des carottes en plastique de sédiments. Merci également à Pascal Lebleu, Henri Bouillard, Christian Portier, pour leur aide précieuse sur l’eau, sur la vase et aussi sur terre avec plus de 400 seringues de 50mL sciées et limées et tout autant de seringues de 2mL. Merci également à Michel Parra et à Flora Salvo de s’être joints à cette équipe de vasouilleurs. Des kilos de mercis à Lilou/Marcellus pour tout autant de sédiments tamisés et de macro-invertébrés triés et identifiés. Une part importante des résultats sur les communautés bactériennes des bivalves présentés dans ce manuscrit, résulte de ma collaboration avec Ika Paul-Pont et Emilie Girault. Merci Ika de t’être investie dans ce travail et d’avoir tenu compte de la deadline qu’imposait la fin de ma thèse. Notre rencontre restera certainement gravée par ma vision « particulière » de ta façon « particulière » de manger un café liégeois ! Merci d’avoir supporté mes blagues ou gaffes toutes aussi « particulières » : mon « et toi Ika t’en penses quoi » chez Fanfan ou encore mon « Ika dans BucephaLus, phalus ca prend qu’un L sinon ce n’est pas le même ! ». Emilie, merci à toi la shbammeuse aquabikeuse, surnommée Miss Caca 2011 pour ton implication dans le projet IDFEC et IDFEColi (pour les curieux, il faut savoir que deux Miss ont déjà porté ce titre avant Emilie ; Miss Caca début 2010 apparait précédemment de manière « anonyme »), pour ton travail à la paillasse comme sur Primer qui m’a permis d’avancer sur l’analyse des déterminismes des communautés bactériennes de la palourde. Mon travail s’est également inscrit dans le programme BIOMIN, je souhaite en remercier le responsable Bruno Deflandre ainsi que Florian Cesbron pour m’avoir transmis des nombreuses données biogéochimiques sur les sites étudiés. J’espère que nous aurons l’opportunité de travailler ensemble pour valoriser ultérieurement ce travail. Le second étage de la station marine serait bien triste sans les deux techniciennes avec qui j’ai partagé un bureau pendant un an : Line Bourasseau et Sabrina Bichon. Merci Line de m’avoir aidé tout au long de ces trois années passées tant par la gestion du labo (je n’ose même pas compter le nombre de lave-vaisselles et d’autoclaves mis en route !) que par les heures passées à extraire et purifier de l’ADN. Merci également d’avoir sacrifié ton jean’s à la science lors de la campagne d’échantillonnage d’avril ! Sabrina, quelle prise de tête ce spectrofluo !!! On aura quand même réussi à le dompter. Merci de m’avoir aidé à mettre en place la manip de dosage d’ADN. Merci pour ta bonne humeur et pour tes histoires drôles du midi surtout celles sur tes filles. Les nombreux prélèvements de sédiments et de palourdes ont pu être réalisés grâce aux deux marins du Planula IV, Francis Prince et Laurent Letort. Merci à vous deux de m’avoir emmené aux quatre coins du Bassin sous le soleil comme sous la pluie et le vent. Je finis mes trois années de thèse avec une certaine sérénité grâce au Docteur Christine Michel du Freshwater Institute de l’Université de Winnipeg au Canada. Elle m’offre avant même que je n’ai remis ce manuscrit, un post-doctorat d’un an pour travailler sur les communautés procaryotes des glaces arctiques. Merci infiniment Christine de m’offrir cette opportunité et d’avoir accepté de m’attendre quelques mois le temps que je finisse ma thèse. Je ne peux finir mes remerciements sans remercier tous les stationmarinnes et les stationmarins, d’un jour ou de toujours, que j’ai côtoyés ces trois dernières années. Un immense merci à Isa d’avoir été présente dans mes moments de doutes et de craquages ; de m’avoir remonté le moral et encouragé à ne pas laisser tomber. Ton soutien a été précieux et je n’ai jamais eu l’occasion de te le dire et de t’en remercier. Je n’ai pas eu non plus l’occasion de te dire que tu avais été élue Miss Caca fin 2010, succédant et précédant à une Emilie et une autre Emilie. Un tout aussi grand merci à Christelle qui m’a permis de m’intégrer au groupe. Merci pour les nombreuses soirées chez toi, pour m’avoir conduit un peu partout, pour les sessions badminton, les cinés gratuits et j’en oublie. Je ne serais probablement plus là pour célébrer le mariage de Monsieur Teillet et Madame Patricia Barbé, tu penseras à m’envoyer quelques photos ! Un immense merci également à la plus addict des shbammeuses. Merci Cindy pour cette année passée ensemble, pour nos soirées belotes, pour nos excursions au sorbet d’amour, pour nos séances salle de sport-hammam, pour nos aprem crêpes, pour toutes les soirées et sorties que tu as organisées.... Et surtout merci d’avoir toujours le sourire et la bonne humeur. Bon courage pour la suite de ta thèse, d’ici peu il y aura peut être un Picornavirus biniasii . Il y a deux ans, je n’avais jamais entendu parler d’Intechmer et d’Intechmériens. J’ai eu la chance d’en croiser deux d’exceptions. Merci Deb et Loïc pour toutes ces soirées passées ensemble, pour tous nos fous rires et nos délires, nos batailles de sables et nos plongées en PMT. Je vous souhaite d’enfin trouver chacun un boulot qui vous plaise et pas loin l’un de l’autre. J’espère que nos routes se recroiseront bientôt. Un merci aussi à un autre intechmérien tout aussi déjanté, Germain, pour les quelques apéros plages passés ensemble. Une bonne continuation au plus touffu des thésards (faut dire que ce n’est pas moi qui vais lui faire concurrence) et à celle qui sera d’ici peu la seule thésarde es procaryote. Merci Fanfan et Cécile pour vos soirées vins fromages, pour les leçons de bad et de tennis, pour les blagues fanfounesques lors des apéros plages. Les stationmarinnes et les stationmarins sont nombreux, merci à vous tous : - Wioletta et Céline pour votre accueil souriant le matin et pour nous faciliter le quotidien, - Nico Lavesque et Guillaume B, merci pour vos conseils sur Primer et sur R - Cerise, tes boulets liégeois sont une merveille Val, merci pour les Nouvel an passés chez toi, pour tes conseils en stat à 4h du matin MC, merci de ne pas m’avoir laissé m’enliser dans les marécages de l’administration universitaire Merci à tous les autres et en particulier à tous les stagiaires qui m’ont donné un coup de main : Jenifer Garcia et Stéphanie Pasquier, Morganne, Pierre, les deux mini miss caca Manon et Mathide et tous ceux qui pour quelques semaines ou quelques mois ont contribué à l’ambiance de la station marine Mes derniers mots (avant les scientifiques), je les adresse à ma famille : mes parents, mes deux sœurs, mes deux nièces Emma et Malaury et mes deux neveux Erwan et Bryan. Merci à vous d’avoir supporté mon éloignement et mon peu de disponibilité au cours de ces trois dernières années. PLAN Avant-propos.......................................................................................... 1 CHAPITRE I: Synthèse bibliographique............................................ 7 1. La biodiversité...................................................................................................... 1.1 Définitions............................................................................................................ 1.2 Les indices de diversité et de similarité................................................................ 1.3 Le concept d’espèce............................................................................................. 2. Les techniques d’étude des communautés procaryotes.................................... 1.1 Généralités........................................................................................................... 1.2 Approches culturales............................................................................................ 1.3 Approches moléculaires....................................................................................... 9 9 11 13 15 15 16 17 1.3.1 1.3.2 Numération des procaryotes....................................................................................... 18 Analyse de la diversité................................................................................................ 19 1.3.2.1 Analyses a priori: approches «Top to Bottom ».......................................................................... 19 1.3.2.2 Analyses sans a priori.................................................................................................................. 1.3.2.2.1 Séquençage et métagénomique.................................................................................................. 1.3.2.2.2 Techniques d’empreintes moléculaires...................................................................................... 1.3.2.2.2.1 Automated Ribosomal Intergenic Spacer Analysis (ARISA)................................................ 1.3.2.2.2.2 Terminal-Restriction Fragment Length Polymorphism (T-RFLP)....................................... 1.3.2.2.2.3 Rapide aperçu d’autres techniques utilisées en écologie microbienne................................ 1.3.2.2.2.4 Choix des techniques pour la caractérisation de la structure génétique des communautés bactériennes et archéennes............................................................................. 1.3.2.2.2.5 Contraintes et limites des techniques moléculaires.............................................................. 3. Les théories expliquant la structuration des communautés procaryotes....... 4. Les communautés procaryotes des sédiments benthiques marins.................. 5. Les communautés bactériennes associées aux invertébrés marins benthiques............................................................................................................ 5.1 Généralités............................................................................................................ 5.2 Communautés bactériennes associées aux bivalves.............................................. 6 Les zones de transition: un modèle d’étude pertinent pour l’étude de la dynamique des patrons structuraux des communautés procaryotes............. 6.1 Généralités............................................................................................................ 6.2 Les communautés procaryotes des zones de transition......................................... 6.2.1 6.2.2 21 21 23 23 24 25 26 26 30 30 34 34 38 40 40 41 Généralités.................................................................................................................. 41 Principal modèle d’étude : les communautés procaryotes du Bassin d’Arcachon................................................................................................. 41 6.2.2.1 Présentation du Bassin d’Arcachon.............................................................................................. 43 6.2.2.2 Les procaryotes du Bassin d’Arcachon........................................................................................ 44 7 Références............................................................................................................. 47 CHAPITRE II: Patrons spatiaux de diversité génétique des communautés procaryotes du sédiment en zone littorale................... 63 1. Dynamique spatiale inter-habitat des procaryotes d’un sédiment de surface à l’échelle d’un écosystème, le Bassin d’Arcachon ............................ 2. Dynamique spatiale inter-écosystèmes.............................................................. 2.1 Introduction........................................................................................................... 2.2 Sites d’étude et méthodologies............................................................................. 2.2.1 67 103 103 103 Sites d’étude................................................................................................................ 103 2.2.1.1 La vasière Ouest-Gironde............................................................................................................. 103 2.2.1.2 L’estuaire de la Gironde............................................................................................................... 105 2.2.2 2.2.3 2.2.4 Echantillonnages......................................................................................................... 107 Analyse des communautés bactériennes..................................................................... 108 Analyses statistiques................................................................................................... 108 2.3 Résultats................................................................................................................ 109 2.3.1 Abondance et structure des communautés bactériennes du Bassin d’Arcachon.................................................................................................. 2.3.2 Abondance et structure des communautés bactériennes de la VOG............................ 2.3.3 Abondance et structure des communautés bactériennes de l’estuaire de la Gironde............................................................................................ 2.3.4 Comparaison des trois écosystèmes............................................................................ 109 109 110 112 2.4 Discussion............................................................................................................. 114 2.5 Références............................................................................................................. 119 CHAPITRE III: Diversité des procaryotes à l’échelle d’un organisme benthique : cas des bivalves fouisseurs.............................. 121 1. Diversité des procaryotes à l’échelle d’un individu.......................................... 2. Diversité des procaryotes à l’échelle d’un organe : déterminisme d’hôte ou d’habitat.......................................................................................................... 2.1 Introduction.................................................................................................. 2.2 Matériel et méthodes...................................................................................... 2.2.1 2.2.2 127 153 153 155 Les sites d’échantillonnage......................................................................................... 155 Dispositif experimental............................................................................................... 156 2.2.2.1 Etude de deux lots de palourdes dans leur habitat naturel........................................................... 156 2.2.2.2 Transplantation croisée................................................................................................................ 156 2.2.2.3 Echantillonnage de carottes de sédiment..................................................................................... 158 2.2.3 Traitement et analyses des échantillons..................................................................... 158 2.2.3.1 Echantillons de palourdes............................................................................................................. 2.2.3.1.1 mesures des indices de condition......................................................................................... 2.2.3.1.2 mesure du fractionnement isotopique.................................................................................. 2.2.3.1.3 mesures des paramètres hémocytaires................................................................................. 2.2.3.1.4 analyses de l’abondance et de la diversité des communautés bactériennes des palourdes........................................................................................................................ 2.2.3.1.4.1 extraction/purification et dosage de l’ADN total.................................................................. 158 158 159 159 160 161 2.2.3.1.4.2 diversité des communautés bactériennes par ARISA........................................................... 2.2.3.1.4.3 abondance des communautés bactériennes........................................................................... 2.2.3.2 Echantillons de sédiments............................................................................................................ 2.2.3.2.1 analyse de l’abondance et de la diversité des communautés bactériennes des sédiments......................................................................................................................... 2.2.3.2.1.1 extraction/purification et dosage d’ADN total...................................................................... 2.2.3.2.1.2 abondance des communautés bactériennes........................................................................... 2.2.3.2.1.3 diversité des communautés bactériennes par ARISA........................................................... 2.2.4 161 162 162 163 163 163 163 Traitement de données et analyse statistique.............................................................. 164 2.3 Résultats................................................................................................................ 165 Deux habitats contrastés : diversité β des communautés procaryotes des sédiments............................................................................................................... 165 2.3.2 Deux lots de palourdes différenciés: description des caractéristiques des individus................................................................................................................ 166 2.3.1 2.3.2.1 Indices de condition..................................................................................................................... 166 2.3.2.2 Fractionnement isotopique........................................................................................................... 167 2.3.2.3 Paramètres hémocytaires.............................................................................................................. 168 2.3.3 Caractérisation des communautés bactériennes des palourdes................................. 168 2.3.3.1 Etude des individus dans leur habitat naturel............................................................................... 2.3.3.1.1 comparaison entre les 2 lots de palourdes............................................................................ 2.3.3.1.2 comparaison des communautés bactériennes entre organes................................................ 2.3.3.1.3 comparaison des communautés bactériennes entre palourdes et sédiment........................ 2.3.3.2 Expérience de transplantation croisée.......................................................................................... 2.3.3.2.1 dépuration............................................................................................................................. 2.3.3.2.2 réimplantation/transplantation.............................................................................................. 2.3.3.2.2.1 comparaison des caractéristiques physiologiques des individus appartenant aux différents lots de palourdes............................................................................................ 2.3.3.2.2.2 comparaison des communautés bactériennes des individus transplantés (A/B et B/A) avec celles des individus réimplantés (A/A et B/B)............................................................. 2.4 Discussion.................................................................................................... 2.5 Conclusion................................................................................................... 2.6 Références............................................................................................................. 3. Diversité des procaryotes à l’échelle d’un organe : déterminisme d’espèce.. 168 168 169 169 170 170 171 171 173 177 180 181 185 CHAPITRE IV : Conclusion générale................................................. 219 Principales abréviations utilisées: ADN: Acide DésoxyriboNucléique ADNr: Acide DésoxyriboNucléique ribosomique ANOSIM: Analysis Of SIMilarity ARISA: Automated Ribosomal Intergenic Spacer Analysis ARN: Acide RiboNucléique ARNr: Acide RiboNucléique ribosomique Bm: Bucephalus minimus pB/Bp: paire de Base/ Base pair CBAB : Communautés Bactériennes Associées aux Bivalves CBC: Cockle Bacterial Community CBCA: Cockle Bacterial Community Abundance CBCD: Cockle Bacterial Community Density e.g.: ex gratis utilisé pour « exemple » EMNF : Eau de Mer Naturelle Filtrée et al. : et alii utilisé pour « et collaborateurs » FIL: Flesh and Intervalval Liquid IC/ CI: Indice de Condition/ Condition Index i.e.: id est utilisé pour « c'est-à-dire » ITS: Intergenic Transcribe Spacer MDS: non-Metric Dimensional Scale OTU: Operational Taxonomic Unit PCR: Polymerase Chain Reaction qPCR: quantitative Polymerase Chain Reaction THC: Total Hemocyte Count T-RFLP: Terminal-Restriction Fragment Length Polymorphism VOG : Vasière Ouest-Gironde Avant-propos Avant-propos Les travaux réalisés au cours de cette thèse s’inscrivent dans une thématique d’écologie microbienne et moléculaire et ont pour but la caractérisation de la structure génétique des communautés bactériennes et archéennes au sein de divers habitats benthiques, à travers la mise en place de méthodes expérimentales et d’analyses de données adaptées à l’étude de la diversité β via des approches de biologie moléculaire. Cette thèse a été principalement financée par le projet Région Aquitaine « Diagnostic de la qualité des milieux littoraux » (Responsable Antoine Grémare) et en particulier par le volet « Caractérisation des communautés bactériennes ». Elle a également bénéficié d’une implication dans un grand nombre de projets de recherche portés par le laboratoire, nous amenant à appliquer notre questionnement sur deux grands modèles d’habitat, le sédiment et les bivalves fouisseurs. Trois programmes s’intéressaient à la biogéochimie benthique : - le programme EC2CO-PNEC « ORIQUART » (Influence de l’ORIgine de la matière organique particulaire sur la QUAlité du pool nutritif et son devenir dans le Réseau Trophique d’un écosystème littoral semi fermé) porté par Nicolas Savoye. Ce programme s’inscrit dans la recherche de déterminants dans la relation biodiversité-fonctionnement à travers l’étude de l’impact d’une diversité de producteurs primaires sur le mode de fonctionnement des écosystèmes à l’aide d’une approche multiparamétrique combinant des analyses chimiques, biochimiques et isotopiques. Plus précisément il a pour but d’évaluer la qualité des milieux littoraux aquitains par la caractérisation de l’origine et la composition de la matière organique particulaire pélagique et benthique au sein d’un système de transition, le Bassin d’Arcachon. Notre intervention dans ce programme apporte une vision de la dynamique des communautés procaryotes au sein de cet écosystème en fonction de propriétés fonctionnelles des différents habitats qui le composent. Ce programme nous a permis de bénéficier d’une large campagne d’échantillonnage (29 sites, 2 périodes d’échantillonnages). Ainsi nous avons pu comparer la diversité génétique des communautés bactériennes et archéennes au niveau de ces sites hébergeant des communautés macrofaunistiques contrastées et 1 Avant-propos mettre ces résultats en relation avec les paramètres biogéochimiques mesurés en parallèle afin de mettre en évidence des facteurs environnementaux structurant ces communautés procaryotes. Cette étude fait l’objet d’une publication en préparation. - le programme LEFE CYBER « BIOMIN » (Étude in situ de l’impact de la diversité biologique sur la reminéralisation de la matière organique à l’interface eau / sédiment) porté par Antoine Grémare et Bruno Deflandre, qui s’intéresse aux liens entre la biodiversité/activité de la faune et la minéralisation de la matière organique à partir de situation écologique diversifiée (qualité de la MO et de la micro/macro faune) au niveau de divers écosystèmes modèles dont la Vasière Ouest-Gironde (VOG). Le groupe des bactéries étant l’un des principaux minéralisateurs de la matière organique, il s’agissait donc pour nous d’apporter une vision du lien entre la diversité des communautés bactériennes et la qualité de la matière organique, ainsi que d’étudier la dynamique des communautés bactériennes à deux échelles spatiales: (i) une échelle horizontale, le long des gradients de labilité de la matière organique et de peuplements benthiques et (ii) une échelle verticale en lien avec l’activité de bioturbation de ces peuplements benthiques mais également en fonction des profils de flux benthiques et en particulier de diffusion de l’oxygène le long de la colonne sédimentaire. - un programme porté par Hugues Blanchet dans le cadre de la thèse d’Aimé Roger NZigou, visant à modéliser la biogéochimie de l'estuaire de la Gironde à travers la caractérisation des principaux facteurs biotiques susceptibles d’influencer la production primaire et la respiration au niveau de vasières intertidales de l’estuaire de la Gironde. Notre intérêt était de caractériser la dynamique des communautés bactériennes, le long d’un gradient de salinité. Notre participation à ces trois programmes nous a permis d’accéder à l’échantillonnage de trois écosystèmes présentant de nombreuses similitudes environnementales. Tous trois sont situés en zone d’écotone du Golfe de Gascogne, sous influence océanique venant de l’Atlantique et composés de sédiment vaso-sableux à sableux. Nous avons pu également, à travers notre participation à ces programmes, acquérir de nombreux paramètres descripteurs de la biogéochimie des sédiments. L’ensemble nous a 2 Avant-propos permis alors de mener une réflexion sur la contribution de divers facteurs de contrôle des assemblages bactériens à différentes échelles géographiques. Deux autres programmes portaient sur l’état de santé et la dynamique de populations de bivalves fouisseurs : - le programme ANR Blanche « Multistress » porté par Xavier de Montaudouin. Ce projet s’intéressait aux effets cumulés de différents stress toxiques, parasitaires ou infectieux, sur des populations de bivalves d’intérêt économique (coques et palourdes). A travers une approche intégrée de leurs interactions sur la réponse génétique, protéique, cellulaire et populationnelle chez la coque Cerastoderma edule et la palourde japonaise Ruditapes philippinarum le but de ce programme était d’estimer la santé des populations (paramètres de dynamique de population), de la mettre en rapport avec les niveaux de base des stress subis (métaux, parasites) et d’évaluer les réponses adaptatives mises en place par les bivalves en terme de détoxication et de défenses immunitaires. Une des réponses au stress environnemental peut être une modification des communautés bactériennes associées ; c’est dans ce cadre que s’inscrivit notre intervention. Ce programme nous a permis de bénéficier d’une campagne d’échantillonnage réalisée en amont de cette thèse (janvier à octobre 2007) permettant une étude sur la dynamique des communautés bactériennes de coques infestées ou non par un parasite influant sur la fitness du bivalve ; étude publiée dans Microbial Ecology (Meisterhans et al., 2011). - le programme LITEAU 3 « REPAMEP » (Réponse de la palourde japonaise aux stress environnementaux, combinant métaux, efflorescences toxiques et pathogènes) porté par Xavier de Montaudouin, et en continuité scientifique du programme « Multistress ». Dans le cadre du volet « interaction palourdesbactéries-sédiment » notre objectif était de mieux comprendre le déterminisme de la diversité des communautés bactériennes associées aux palourdes ainsi que les interactions entre cette microflore et son hôte. Ce projet nous a permis de réaliser deux études portant sur le microbiote de bivalves fouisseurs, l’une s’interrogeant sur le lien entre le microbiote et l’état physiologique et/ou l’habitat de l’hôte, la 3 Avant-propos seconde sur la spécificité d’hôte du microbiote. Cette seconde étude est en cours de valorisation sous forme d’une publication soumis à FEMS Microbiology Ecology. A travers la participation à ces différents projets, nous nous sommes donc intéressés à caractériser les patrons des communautés procaryotes de l’habitat benthique via différentes études à plusieurs échelles. Ce projet s’est basé sur une analyse de la structure génétique des communautés bactériennes et/ou archéennes via l’utilisation de techniques de biologie moléculaire de type CE-fingerprinting (empreinte moléculaire à partir d’électrophorèse capillaire) permettant d’accéder à la diversité taxonomique des communautés à travers le concept d’espèce moléculaire ou OTU (Operational Taxonomic Unit). Une réflexion sur les techniques moléculaires utilisées en écologie microbienne, nous a conduit d’une part, vers l’ARISA (Automated Ribosomal Intergenic Spacer Analysis), méthode rapide et robuste pour accéder à la structure des communautés bactériennes, et d’autre part vers l’utilisation de la T-RFLP (Terminal-Restriction Fragment Length Polymorphism) pour caractériser les communautés archéennes, certains taxons archéens ne possédant pas d’intergène 16S-23S amplifiable. L’analyse de jeux de données complexes, générées par ces méthodes moléculaires, nous a conduit à nous interroger sur le poids des différentes OTU dans l’analyse de la diversité β: comment discriminer des OTU du bruit de fond ? Quelle est l’importance des OTU ubiquistes, des OTU groupes dépendantes ou encore des OTU rares au sein de profils d’empreinte moléculaire dont la complexification suit l’évolution des techniques de plus en plus résolutives ? Dans un premier temps, notre intérêt s’est porté sur l’habitat sédimentaire où les procaryotes représentent le groupe le plus diversifié, dominant aussi bien en terme d’abondance et de biomasse qu’en terme de richesses taxonomique et fonctionnelle. Nos travaux se sont intéressés à la diversité génétique bactérienne et/ou archéenne à différentes échelles spatiales, horizontale ou verticale, allant du centimètre à la centaine de kilomètres, afin de mettre en évidence, par une analyse des patrons d’OTU, des processus d’assemblage des communautés procaryotes habitat-dépendant à l’échelle intra-écosystème et/ou biogéographique entre écosystèmes. Nous nous sommes également intéressés aux communautés bactériennes d’un second habitat à travers l’étude de bivalves fouisseurs où la dynamique des communautés bactériennes s’avère plus complexe que dans le sédiment du fait du caractère « vivant » de cet 4 Avant-propos habitat. En effet, les communautés bactériennes des bivalves (CBAB) résultent à la fois des processus de transmission latérale par balnéation et filtration dans un habitat septique mais également des processus de transmission verticale et/ou horizontale laissant supposer une coévolution possible entre les CBAB et leur hôte. A travers une analyse de la diversité β, nous avons recherché quels pouvaient être les déterminismes des OTU au sein des CBAB et en particulier l’influence de l’habitat et des caractéristiques intrinsèques de l’hôte (appartenance à une espèce, compartimentation fonctionnelle des organes, état physiologique de l’individu). Ce manuscrit se structure donc en quatre grands chapitres : - le premier chapitre, basé sur un état de l’art bibliographique, s’attache à définir d’une part les concepts utilisés au cours de ces études et d’autre part présente la pertinence des modèles d’études et des méthodologies choisies. - le deuxième chapitre présente la caractérisation des communautés procaryotes de l’habitat sédimentaire et nous permet de discuter des règles d’assemblages des communautés à l’échelle locale et à l’échelle globale ainsi que de la mise en évidence des facteurs environnementaux structurant ces communautés - le troisième chapitre présente la caractérisation des communautés bactériennes des bivalves fouisseurs et discute du déterminisme des populations bactériennes au sein de ces CBAB. - enfin un quatrième chapitre présente un bilan de ces travaux sur l’analyse de la dynamique de la structure génétique des communautés procaryotes par l’approche moléculaire. 5 Avant-propos 6 CHAPITRE I: Synthèse bibliographique 7 8 Chapitre I: Synthèse bibliographique Les approches moléculaires ont offert la possibilité de caractériser les populations et communautés de micro-organismes avec des capacités de traitement compatibles avec les impératifs de réplication et de diversification de l’échantillonnage des systèmes naturels. Ces micro-organismes (micro-algues, bactéries, archées …) qui étaient jusque-là considérés comme des compartiments types « boites noires », apparaissent désormais comme des populations et communautés dont il convient d’appréhender la dynamique temporelle et les patrons de répartition spatiale au même titre que ceux des macro-organismes. L’implication de ces organismes dans des fonctions clés des écosystèmes (e.g. minéralisation de la matière organique) renforce l’acuité de ce questionnement. Ce chapitre a pour but de présenter au travers d’une revue des connaissances conceptuelles et techniques, l’analyse de la structure génétique des communautés bactériennes et archéennes. Il présente également un état de l’art des communautés procaryotes des deux modèles d’habitats étudiés au cours des différents travaux présentés dans ce manuscrit : les sédiments benthiques et les bivalves marins. 1. La biodiversité 1.1 Définitions Le terme de biodiversité est une contraction de diversité biologique (Magurran, 2004). Il fait donc référence à la variété du monde vivant mais décrit en réalité une notion plus complexe se déclinant en fonction de trois échelles d’intégration : (i) la biodiversité génétique décrivant la variété des gènes au sein des espèces (variété au sein de l’ensemble du vivant); (ii) la biodiversité spécifique c'est-à-dire l’ensemble des espèces existantes (variété entre espèces); et (ii) la biodiversité écosystémique décrivant l’ensemble des relations biotiques au sein des écosystèmes. De manière simple, la biodiversité représente le degré de variation du biote (i.e. biomasse totale du vivant) c'est-à-dire l’ensemble de la diversité génétique d’un écosystème ou plus largement de la biosphère. Ce degré de variation est dû à la capacité de spéciation de ce biote à l’échelle globale. La diversité taxonomique se définit comme la distribution des individus en taxons à un moment donné au sein d’un écosystème donné. Cette diversité est décrite par trois composantes: (i) la richesse taxonomique c'est-à-dire le nombre total de taxons présents, (ii) la composition taxonomique c'est-à-dire l’identification des taxons présents, et (ii) la distribution 9 Chapitre I: Synthèse bibliographique taxonomique c'est-à-dire l’abondance relative des taxons ou autrement dit comment se répartissent, de manière quantitative, les individus en taxons (Magurran, 2004). Dans la mesure de la biodiversité interviennent les échelles spatiale et temporelle. Ainsi, plusieurs niveaux de diversité sont décrits (Figure I.1). La diversité α correspond à la diversité locale c'est-à-dire à la diversité taxonomique d’un site donné. La diversité β s’attache à comparer la diversité taxonomique de deux sites et par extension de la définition première, de comparer la diversité taxonomique d’un même site à deux temps donnés différents. La diversité γ reflète la diversité taxonomique d’un écosystème intégrant la diversité des habitats le composant (Magurran 2004 ; Forney et al., 2004). γ α1 α3 β1 β2 α2 β3 Figure I.1 : Illustration des liens entre la diversité α (diversité d’un habitat), β (diversité comparative entre deux habitats) et γ (diversité d’un écosystème composé de plusieurs habitats) (D’après Jurasinski et al., 2009). Les différentes couleurs de croix représentent les différents taxons composant chaque communauté. En pratique, les informations concernant la composition ou la distribution taxonomique sont consignées sous forme de matrices croisant des échantillons et des taxons. Selon le niveau d’inventaire réalisé, il peut s’agir de matrices de présence - absence (composition) ou de matrices où figurent les abondances relatives (distribution taxonomique). Ces matrices sont traitées pour extraire et résumer l’information qu’elles contiennent sous forme d’indices de diversité ou de similarité. Comme nous le verrons, la spécificité des approches moléculaires de la diversité développées en écologie microbienne s’arrêtent à la constitution de ces matrices. En effet, une fois les unités taxonomiques opérationnelles (OTU) saisies sous forme 10 Chapitre I: Synthèse bibliographique de matrice, plus rien ne sépare la démarche adoptée pour les microorganismes de celle utilisée depuis très longtemps pour les macro-espèces. 1.2 Les indices de diversité et de similarité Le recours à des indices est une métrologie de la diversité permettant une simplification de l’information sous une forme plus aisément manipulable qu’une matrice complexe de plusieurs centaines de taxons par échantillon. Ainsi différents indices, correspondant aux différentes échelles de la diversité ont été définis : (i) les indices de diversité α synthétisent l’information de composition et/ou de diversité taxonomique d’un échantillon en une seule valeur descriptive de la dominance ou de l’équitabilité des taxons au sein de la communauté alors que (ii) l’indice de diversité β résume en une valeur la différence de composition et/ou de diversité taxonomique entre les communautés de deux échantillons. Quatre principaux indices de diversité permettent de caractériser la diversité α. Les indices de Fisher (Fisher et al., 1943) et de Margalef (Margalef, 1951) se basent uniquement sur la richesse taxonomique de la communauté (Krebs, 1998) et pour cette raison sont beaucoup moins utilisés. Ils peuvent cependant présenter un intérêt dans le cas où l’estimation de l’abondance relative s’avère peu fiable. Les indices de Simpson (Simpson, 1949) et de Shannon (Shannon and Weaver, 1963) sont les plus couramment utilisés (Tableau I.1). C’est le cas en écologie microbienne pour décrire la diversité bactérienne et archéenne quelle que soit la technique de génotypage utilisée (Hill et al., 2003). Bien qu’ils se basent tous deux sur le nombre et l’abondance relative des taxons présents au sein de la communauté étudiée, ils restent complémentaires puisque l’indice de Simpson retranscrit principalement les différences d’abondances relatives entre taxons au sein d’un échantillon alors que l’indice de Shannon est beaucoup plus sensible à la richesse taxonomique de la communauté et ne prend que peu en compte les taxons rares. La caractérisation de la diversité β nécessite, quand à elle, le recours à divers indices de similarité permettant de comparer les échantillons deux à deux en calculant le pourcentage de ressemblance entre les communautés. Certains indices comme l’indice de Jaccard (Jaccard, 1912) ou de Sorensen (Sorensen, 1948) se basent sur la comparaison des matrices de présence/absence de taxons dans les échantillons ; d’autres, comme l’indice de Bray-Curtis (Bray and Curtis, 1957) ou l’indice de Czekonowski (Czekonowski, 1909) se basent sur la comparaison des matrices d’abondance relative des taxons présents dans les échantillons (Tableau I.1). En écologie l’indice de Bray-Curtis est l’un des indices les plus utilisés car il 11 Chapitre I: Synthèse bibliographique présente l’avantage d’être indépendant (i) de l’unité de mesure, (ii) de l’inclusion et/ou de l’exclusion de taxons absents des deux échantillons, ainsi que (iii) de l’inclusion et/ou de l’exclusion d’autres échantillons. Cet indice est donc non sensible à la standardisation des données (Clarke and Warwick, 2001). Indice Formule Diversité minimale Diversité maximale Référence Simpson D = Σ (NS / NT)² 1 0 Simpson (1949) Shannon H = - Σ [(NS / NT) x log2 (NS / NT)] 0 ∞ Shannon and Weaver (1963) Fisher S = α ln (NT / α) 0 ∞ Fisher et al. (1943) Margalef d = (S - 1) / ln NT 0 ∞ Margalef (1951) Jaccard J = [c / (a+b-c)] 0 1 Jaccard (1912) Sorensen S = [2c / (a+b)] 0 1 Sorensen (1948) Bray-Curtis BC=100 x [1 – (Σ|OTUi,a – OTUi,b| / ΣOTUi,a + OTUi,b)] 0 1 Bray and Curtis (1957) Czekonowski C = [2a/(2a + b +c)] 0 1 Czekonowski (1909) Diversité α Diversité β Tableau I.1: Indices de diversité α et β. NS : nombre d’individus par taxon ; NT : nombre total d’individus; S : nombre de taxons ; a : nombre de taxons de la communauté A ; b : nombre de taxons de la communauté B ; c : nombre de taxons communs entre les communautés A et B Ces divers indices, souvent complémentaires sont donc des outils permettant d’estimer et de comparer les diversités entre échantillons à partir d’une matrice de présence/absence ou d’abondance relative de taxons. Comme nous le verrons dans les paragraphes suivants consacrés aux techniques de mesure elles-mêmes, le choix de l’un ou l’autre des indices dépend grandement de limites méthodologiques dues à l’appréciation des abondances relatives (cf biais d’amplification) ou au rapport entre la détection de taxons inédits et le nombre de réplicats possibles (cf notion d’espèces rares ou communes). De manière générale, appréhender la diversité taxonomique nécessite donc de définir l’unité taxonomique de base qui est dépendante du modèle biologique étudié et des techniques disponibles. 12 Chapitre I: Synthèse bibliographique 1.3 Le concept d’espèce L’espèce est un niveau fondamental d’organisation biologique. L’écologie des populations s’intéresse au nombre d’individus appartenant à une espèce, alors que l’écologie des communautés étudie le nombre d’espèces au sein d’un habitat. La définition la plus communément utilisée de nos jours est celle du concept d’espèce biologique défini par Mayr en 1963: deux individus sont considérés comme appartenant à la même espèce s’ils ont la capacité de se reproduire entre eux en donnant des descendants fertiles. L’incapacité d’interfécondité entre individus d’espèces différentes serait due à la présence de barrières postcopulatoires ou postzygotiques (Palumbi, 1994) empêchant la recombinaison génétique induisant l’isolement génétique et/ou reproductif des espèces. Bien qu’il existe plus de 20 définitions différentes du concept d’espèce et qu’aucune ne soit parfaitement satisfaisante pour l’ensemble des organismes pluricellulaires (Mayden, 1997), cette définition est relativement bien adaptée à la majorité de ces organismes. Cependant, le critère d’interfécondité, par définition, est inadapté à des organismes asexués comme les procaryotes (mais aussi quelques micro-organismes eucaryotes) qui se reproduisent par division cellulaire. Le concept d’espèce morphologique proposé par Cohn en 1972 est une des alternatives à la définition de l’espèce par Mayr (1963). Des individus sont alors considérés comme appartenant à la même espèce s‘ils possèdent un nombre suffisant de traits morphologiques communs qui les différencient d’autres individus. C’est sur cette définition que reposent les tables d’identification taxonomique des macro-organismes animaux et végétaux. Mais ce concept est lui aussi limité, d’une part par la plasticité morphologique de certaines espèces (différenciation morphologique en fonction de conditions environnantes) mais également dans le cas des procaryotes par la faible diversité morphologique existante (coques, bacilles …). Les critères morphologiques sont alors souvent couplés à d’autres traits phénotypiques (concept d’espèce phénotypique) et en particulier pour les micro-organismes, la capacité de métaboliser divers substrats (Rossello Mora and Amann, 2001). Cette approche nécessite de savoir cultiver ces micro-organismes ce qui n’est actuellement pas le cas pour la grande majorité des espèces : actuellement seuls 10% de ces micro-organismes sont cultivables (Torsvick et al., 1998). De plus, les procaryotes sont également capables de transferts génétiques horizontaux via des mécanismes de conjugaison, de transformation ou de transduction qui peuvent avoir lieu aussi bien entre individus d’une même espèce qu’entre individus d’espèces différentes, leur conférant ainsi une grande plasticité phénotypique intra- 13 Chapitre I: Synthèse bibliographique spécifique. Il est donc important de distinguer au sein d’un pan-génome, le génome cœur (core genome en anglais) qui est l’ensemble des gènes communs à toutes les souches du taxon, du génome accessoire (dispensable genome en anglais) qui est l’ensemble des gènes qui ne sont présents que chez une ou quelques souches du taxon. Le génome cœur soutient à la fois les aspects basiques de la vie biologique du taxon et ses traits phénotypiques. Il correspondrait donc aux gènes essentiels dans la plupart des circonstances et pourrait ainsi servir de base pour la définition de l’espèce puisqu’il maintient une cohérence génomique entre individus (de Bruijn, 2011). Le génome accessoire est formé de gènes codant pour des propriétés biochimiques supplémentaires (e.g. adaptation de l’espèce à des fluctuations des conditions environnementales, résistance aux antibiotiques …). Cet ensemble génomique permettrait à des individus d’une même espèce de coloniser des habitats différents et par conséquent est l’un des principaux arguments allant à l’encontre de l’espèce écologique de Cohan (2002) qui définit l’espèce comme un ensemble d’individus occupant une même niche écologique (de Bruijn, 2011). Nous voyons donc que le concept d’espèce est rendu complexe chez les procaryotes par l’absence de reproduction sexuée, les grandes plasticités phénotypiques (critères morphologiques et biochimiques) et génotypiques (notion de core et pangénome, transferts horizontaux de gènes) et la nécessité de recourir à la culture de spécimens pour en définir les principales caractéristiques. Par contre, le niveau taxonomique de l’espèce chez ces organismes peut être considéré à travers l’utilisation d’approches basées sur l’étude des acides nucléiques. Depuis les années 1970, la caractérisation des espèces procaryotes se base classiquement, sur la technique d’hybridation ADN/ADN. Des individus sont alors considérés comme appartenant à la même espèce phylogénétique ou « genomospecies » si leur génome s’hydride au moins à 70% ou si leurs séquences d’ADN ribosomal 16S présentent au moins 97 % de similarité. Ces valeurs arbitraires ont été choisies en s’appuyant sur la taxonomie phénotypique (Stackebrandt and Goebet, 1994). Couplant l’analyse phylogénétique aux analyses morphologique et phénotypique, la taxonomie polyphasique, définit l’espèce phylo-phénotypique comme un ensemble d’individus cohérents d’un point de vue génomique et présentant un fort dégré de similarité sur de nombreux caractères morphologiques et biochimiques (Vandamme et al., 1996). La taxonomie polyphasique, base des deux grands ouvrages de référence pour la classification des procaryotes, le « Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology » (Holt et al. 1994) et le « The Prokaryotes » (Dworkin et al., 2006), est l’actuelle référence pour la taxonomie des 14 Chapitre I: Synthèse bibliographique procaryotes. Pour être nommé en tant que nouvelle espèce, un genomospecies préalablement caractérisé par hybridation ADN/ADN doit être individualisé et présenter des caractères phénotypiques le distinguant des autres genomospecies. Cependant définir l’espèce par cette approche nécessite d’une part la capacité de cultiver les espèces, et d’autre part un travail onéreux et fastidieux. Cette approche est donc inadaptée à l’étude à grande échelle des communautés (assemblage d’espèces en interactions dans un même écosytème, milieu, habitat et/ou qui partagent une même fonction). En pratique, la majorité des études récentes sur les communautés procaryotes s’affranchit des techniques basées sur la culture des procaryotes afin d’accéder au mieux à la métacommunauté procaryote. Ces études sont basées sur la systématique moléculaire et utilisent soit des approches multi-locus (screening et phylogénie de plusieurs gènes), soit des approches de criblage et de phylogénie des gènes ribosomaux. De ces méthodes est né le concept d’espèce moléculaire ou OTU (Operational Taxonomic Unit) où les espèces se différencient par leur «empreinte moléculaire» basée sur le polymorphisme de taille ou de séquence de ces gènes ribosomaux. Cependant, du fait de la présence d’opérons ribosomiques multiples généralement entre 1 et 15 opérons (Klappenbach et al., 2000), une espèce phylophénotypique peut posséder plusieurs OTU et inversement, une même OTU peut se retrouver chez plusieurs espèces différentes (Kovacs et al., 2010; Ramette, 2009). L’OTU est donc un proxi pragmatique de l’espèce phylo-phénotypique, qui permet l’étude de la diversité des communautés procaryotes à travers des approches moléculaires. 2. Les techniques d’étude des communautés procaryotes 2.1 Généralités Les procaryotes forment le phylum dominant sur Terre aussi bien en terme de densité estimée à 4-6 x 1030 individus qu’en terme de biomasse évaluée à 350-550 1015 grammes de carbone (Whitman et al., 1998; Forney et al., 2004). Les procaryotes forment un groupe paraphylétique regroupant deux groupes monophylétiques les bactéries et les archées qui sont ubiquistes dans l’environnement. Si l’importance des bactéries dans l’environnement est connue depuis de nombreuses années, les archées, quant à elles, ont longtemps été perçues comme des organismes adaptés uniquement aux milieux extrêmes, hostiles aux eucaryotes et aux bactéries (Herfort et al., 2007). Mais depuis une vingtaine d’années le développement de méthodes d’analyses moléculaires a permis de démontrer la présence d’archées aussi bien 15 Chapitre I: Synthèse bibliographique dans les sols (Bintrin et al., 1997), dans les milieux aquatiques (Delong, 1992; Dumestre et al., 2002) que dans le tractus digestif animal (Janssen and Kirs, 2008) Les crenarchées constituent 20 à 30 % de l’abondance totale des procaryotes dans les zones aphotiques océaniques alors que les euryarchées semblent dominer dans les eaux de surface (Massana et al., 2000; Karner et al., 2001; Herndl et al., 2005). Il parait alors important de considérer à égalité les communautés archéennes et les communautés bactériennes lorsque l’on s’interroge sur la diversité des communautés procaryotes dans l’environnement. La diversité des communautés procaryotes peut être estimée à différents niveaux de résolution selon les outils et les techniques utilisées (Figure I.2). Figure I.2: Approches méthodologiques en écologie microbienne (Caron, 2005) 2.2 Approches culturales Comme nous l’avons vu précédemment, la discrimination des espèces bactériennes, selon le « Bergey’s Manual of Determination Bacteriology » (Holt et al. 1994) et le « The Prokaryotes » (Dworkin et al., 2006), repose en grande partie sur la mise en évidence de particularités phénotypiques. La recherche de ces caractères se base sur des approches culturales c'est-à-dire mimer in vitro des conditions proches de l’environnement des espèces afin de permettre le développement à partir d’une cellule d’une biomasse, génétiquement identique à celle-ci, aux mutations près (population clonale). Cette biomasse clonale rend 16 Chapitre I: Synthèse bibliographique alors possible l’étude des propriétés structurales (structure de la paroi), métaboliques et enzymatiques de l’espèce via différents outils comme la coloration différentielle de Gram, les tests biochimiques miniaturisés des galeries API, les tests de présence d’enzymes (e.g. oxydase, catalase). Ces tests fonctionnant sur le même principe que les classifications par dichotomie, sont encore très usités, en particulier pour des applications médicale et sanitaire dans l’identification des espèces présentes. Les approches culturales permettent également, par la méthode des dilutions successives utilisée en milieu gélosé ou en milieu liquide [méthode du nombre le plus probable (NPP) ou most probable number (MPN)] d’accéder à l’abondance totale de la fraction cultivable des communautés ainsi qu’à l’abondance de la fraction cultivable de certains taxons (Escherichia coli, Vibrio sp. …) ou groupes fonctionnels (bactéries sulfato-réductrices, halotolérantes, …) via l’utilisation de milieux spécifiques dits sélectifs. Cependant, une faible proportion d’espèces procaryotes et en particulier archéennes est actuellement cultivée, majoritairement due à la difficulté de reproduire aussi fidèlement que possible en laboratoire les ressources et les conditions physiques et chimiques auxquelles sont soumis les procaryotes dans leur environnement. Par exemple, les milieux de culture utilisés sont souvent trop riches par rapport au milieu marin oligotrophe et conduiraient donc à des stress nutritifs et osmotiques. L’absence d’éléments essentiels non déterminés est aussi une hypothèse forte. Pour tenir compte de ces particularités, des milieux de culture ont été développés à partir d’eau de mer naturelle, d’extrait de sédiments ou encore d’extrait de poissons ou de mollusques (Brisou, 1980). Les approches culturales s’avèrent donc peu adaptées à l’étude de la diversité des communautés hormis lorsqu’elles sont couplées à des techniques moléculaires dites alors culture-dépendantes (e.g. microbial source tracking, Scott et al., 2002). Ces approches restent cependant la clé de voûte de la biologie moléculaire à travers les collections de souches qui ont permis le développement des sondes taxonomiques et fonctionnelles. 2.3 Approches moléculaires Une alternative à la culture et à ses biais (sélection de moins de 10% des taxons présents) (Amann et al., 1995) est l’utilisation de techniques basées sur des approches moléculaires. En écologie microbienne, ces approches ont permis de révéler de nouveaux génomes associés à de nouvelles fonctions biogéochimiques (e.g. l’oxydation anaérobie de l’ammonium (annamox) des planctomycétales, Kuenen, 2008; chimiohétérotrophie de 17 Chapitre I: Synthèse bibliographique l’oxydation du CO des Roseobacter, Moran and Miller, 2007), ou bien même plus simplement des génomes constituant l’essentiel de la biomasse bactérienne et restés jusqu’alors cryptiques (e.g. Pelagibacter ubique, Morris et al., 2002). Le développement de la biologie moléculaire permet de prendre en compte la diversité structurale et fonctionnelle, afin d’aborder la question du « qui fait quoi ? » pour un compartiment biologique que l’on avait jusque là coutume de considérer comme une « boite noire », 2.3.1 Numération des procaryotes Les études des communautés procaryotes se sont longtemps limitées à la caractérisation de l’abondance des individus au sein des communautés via des approches culturales ou l’utilisation de la microscopie optique. Des méthodes de numération basées sur l’utilisation de marqueurs fluorescents appelés fluorochromes (acridine orange, DAPI, SYBR Green) permettent de déterminer le nombre total de procaryotes présents dans un échantillon. Ces marqueurs fluorescents en s’intercalant entre les bases des acides nucléiques (ADN, ARN) rendent fluorescentes les cellules sous l’effet d’une lumière incidente. Les fluorochromes excités émettent une fluorescence qui peut être détectée par plusieurs types d’instruments : (i) la microscopie à épifluorescence (MEF) ou (ii) la cytométrie en flux (CMF) qui est réputée permettre une mesure rapide et automatisée de l’abondance procaryote en particulier en milieu aquatique (Lemarchand et al., 2001 ; Marie et al., 2001 ; Lavrentyev et al; 2004). La CMF s’avère par conséquent adaptée à des études à grande échelle (Jacquet et al., 1998) qui génèrent un nombre important d’échantillons. Mais une adaptation de protocole est indispensable lorsque l’on travaille sur des communautés benthiques. En effet les procaryotes sont fixés sous forme de biofilm aux particules sédimentaires (Hall-Stoodley et al., 2004). Il est donc impératif de les désorber de cette matrice et de désagréger les éventuels agrégats cellulaires. Pour cela, des protocoles ont été développés, basés sur (i) l’extraction par une action physique comme la sonication (Danovaro et al., 2001), pouvant être couplée à l’action chimique d’un agent dispersant comme le sodium pyrophosphate (Weinbaueur et al., 1998 ; Klauth et al., 2004), puis sur (ii) la séparation des procaryotes de la matrice par décantation (Weinbaueur et al., 1998) , par centrifugation (Duhamel and Jacquet, 2006), ou par migration forcée sur un gradient de densité (e.g. gel de Nycodenz; Amalfitano and Fazi., 2008). Des méthodologies similaires ont été développées pour accéder à la microflore associée aux tissus de bivalves (Caro et al., 2009) mais ne s’avèrent efficaces que par la présence de 18 Chapitre I: Synthèse bibliographique globules de soufre élémentaire au sein des bactéries endosymbiontes des branchies qui en modifiant la densité cellulaire permettent la séparation entre les bactéries et les cellules animales. 2.3.2 Analyse de la diversité L’analyse de la diversité des espèces procaryotes est rendue possible grâce à l’utilisation de techniques ciblant les gènes ribosomaux (e.g. gènes de l’ARNr 16S chez les procaryotes, ITS chez les bactéries). Ces gènes, du fait du rôle fondamental des ribosomes dans la synthèse protéique, sont très conservés et partagés par l’ensemble des organismes vivants. D’autres molécules ont également été utilisées en tant que marqueur taxonomique comme la cytochrome c oxydase (Hebert et al., 2003), la ribulose diphosphate carboxylase (Mummenhoff and Koch 1994), ou l’ARN polymérase à facteur sigma (Mittenhuber, 2002). Mais l’utilisation de ces molécules restant très controversée, en particulier du fait de la non présence chez tous les organismes, le marqueur taxonomique de référence reste l’ARNr (Amann et al., 1995). Les techniques utilisant les séquences des gènes codants pour l’ARNr comme marqueur taxonomique sont nombreuses (FISH, DGGE, TGGE, RFLP, ARISA….)1 et permettent soit la recherche de taxons d’intérêts prédéfinis (Approches « Top to Bottom ») soit la caractérisation de la composition et/ou la structure de communautés. 2.3.2.1 Analyses a priori: approches «Top to Bottom » Des approches utilisant des sondes taxonomiques ou fonctionnelles ont été développées afin de quantifier l’abondance de groupes taxonomiques ou fonctionnels. La technique FISH est une de ces approches basée sur l’hybridation d’une sonde sélective au niveau des ARN ribosomiques. Cependant les ARNr ne sont abondants qu'en début de phase exponentielle de croissance. Cette technique est donc limitée par le taux de croissance des procaryotes, mais aussi par le nombre de copies d'opérons ARNr par cellule et par l'accessibilité de la sonde sur la séquence cible (Ferrari et al., 2006). Cette technique apparait donc assez peu adaptée à une détection des procaryotes de l’environnement (i.e. par 1 FISH: Fluorescence In Situ Hybridization ; DGGE : Denaturing Gradient Gel Electrophoresis; TGGE:Temperature Gradient Gel Electrophoresis; RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism; ARISA: Automated Ribosomal Intergenic Spacer Analysis. 19 Chapitre I: Synthèse bibliographique opposition aux procaryotes issus de cultures) et particulièrement des procaryotes aquatiques dont la taille et le faible taux de croissance entrainent fréquemment un signal de détection situé sous la limite du seuil de détection de cette technique. L'intensité de fluorescence étant l'un des principaux facteurs limitants, l'utilisation d'une méthode d'amplification de la fluorescence permet une estimation par MEF plus fiable. L'utilisation du CARD-FISH (Catalyzed Reporter Deposition-FISH) permet l'augmentation de l'intensité de fluorescence et du ratio signal/bruit de fond, grâce à l'amplification du signal par une sonde couplée à une peroxydase de type HRP (Horseradish peroxidase) et donc une meilleure détection des bactéries à faible taux d'ARNr (Lebaron et al., 1997; Pernthaler et al., 2002; Schönhuber et al., 1997). Une méthode équivalente mais automatisée est l’utilisation des biopuces. Elles permettent d’analyser rapidement l’expression de plusieurs milliers de gènes en un seul essai. Cette méthode consiste d’une part à fixer sur un support inerte des sondes de gènes d’intérêt taxonomique ou fonctionnel, sous forme de spots (plusieurs milliers) répartis de manière homogène sur le support. D’autre part l’ensemble des ARNm de l’échantillon sont rétrotranscrits en ADN complémentaire (ADNc) couplés à des fluorochromes de type cyanine (Cy3 ou Cy5). Les ADNc sont mis en contact avec la biopuce et vont pouvoir s’hybrider avec les sondes présentes. L’analyse de cette fluorescence sur chaque spot permet de déterminer le niveau d’expression des gènes d’intérêts recherchés. Cette technique relativement coûteuse est utilisée en écologie microbienne pour rechercher la présence simultanée de plusieurs taxons ou de différentes capacités métaboliques (Günther et al., 2006; Yergeau et al., 2007). Il est également possible d’estimer l’abondance d’un groupe taxonomique ou fonctionnel au travers de la quantification du nombre de copies de gène via la technique de quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR). Cette technique se base sur l’amplification d’une séquence d’ADN cible couplée à l’utilisation d’un marqueur fluorescent. L’intensité de la fluorescence à chaque cycle est directement proportionnelle à la quantité d’amplicons produite, elle-même directement proportionnelle à la quantité initiale d’ADN présente dans le milieu réactionnel (Brouwer et al., 2003). La valeur absolue du nombre de copies de gène est déterminée grâce à l’utilisation d’une gamme étalon d’un gène d’intérêt dont on connaît les concentrations initiales. 20 Chapitre I: Synthèse bibliographique 2.3.2.2 Analyses sans a priori Ces techniques se basent toutes sur l’amplification d’un marqueur taxonomique par PCR. Cette étape d’amplification est indispensable puisqu’elle permet à la fois de générer une quantité d’ADN nécessaire aux analyses mais également de discriminer le marqueur d’intérêt au sein du pool d’ADN métagénomique. Parmi ces techniques, on peut distinguer d’un côté les techniques adaptées à l’étude de la diversité α (clonage séquençage et métagénomique) dont l’utilisation permet d’accéder à la composition de la communauté (liste des espèces) et de l’autre, les techniques adaptées à l’étude de la diversité β, basée sur la comparaison de profils génomiques (empreintes moléculaires) reflétant les structures des communautés. 2.3.2.2.1 Séquençage et métagénomique La génomique et la métagénomique sont des approches basées sur le séquençage de l’ensemble des génomes d’un échantillon (Handelsman et al., 1998 ; Singh et al., 2008, Xu, 2006). Elles permettent d’avoir un aperçu complet de la diversité des communautés ainsi que de l’ensemble des fonctions métaboliques potentielles (Hugenholtz and Tyson, 2008). Ce n’est que depuis une dizaine d’années que l’évolution des techniques de séquençage a rendu possible le séquençage d’un mélange de molécules d’ADN. Avant cela il était nécessaire d’isoler et d’amplifier la séquence nucléique d’intérêt (principe du clonage/séquençage). Le clonage / séquençage est une approche très utilisée en écologie microbienne pour déterminer la diversité de communautés procaryotes (Olsen et al., 1986; Head et al., 1998). Cette méthode se base sur la création d’une banque de fragments d'ADNr 16S chacun cloné dans le génome d’une cellule compétente (en général Escherichia coli) qui une fois mise en culture sur gélose générera un grand nombre de copies du gène au sein de chaque colonie. Les différents clones seront alors analysés par séquençage de Sanger (Sanger et al., 1977). Une séquence se présente sous forme d’un électrophorégramme dont il est possible d’extraire une séquence en base ATGC sous format FASTA via des logiciels d’analyse dédiés (e.g. Chromas, Technelysium Pty Ltd). Une étape de correction par visualisation de l’électrophorégramme est souvent nécessaire afin d’éliminer les parties de séquence sur lesquelles subsistent un doute quand à l’assignement de la base. Les séquences corrigées sont ensuite alignées entre elles (i.e. calées les unes par rapport aux autres à partir de séquences 21 Chapitre I: Synthèse bibliographique conservées communes entre toutes les séquences) à l’aide d’un logiciel spécifique (e.g. CAP3 Sequence Assembly Program ; http://pbil.univ-lyon1.fr/cap3.php). Cette étape permet d’améliorer la fiabilité de la comparaison entre séquences (Grimont, 1995). A partir de ces séquences corrigées et alignées, des calculs de distances (e.g. neighbor-joining ; Saitou and Nei, 1987) sont réalisés afin de comparer les séquences. Les résultats se présentent principalement sous forme de dendrogramme ou arbre phylogénétique où la distance entre les branches représente la dissimilarité entre les séquences. Ces séquences peuvent également être comparées à des séquences de clones issues de base de données (e.g. Ribosomal Database Project, http://rdp.cme.msu.edu/; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi). Basic Il sera Local Alignment alors possible Search de Tool, situer phylogénétiquement l’organisme étudié. Cette technique permet donc d’identifier les espèces présentes, et de caractériser la composition des communautés procaryotes. Cependant, la diversité procaryote d’un échantillon étant généralement très importante, accéder à l’ensemble de la composition taxonomique requiert l’analyse d’un grand nombre de clones. Le prix et le coût en temps de l’analyse est donc important. Elle n’est par conséquent que très rarement utilisée pour l’analyse de la diversité β et γ d’un écosystème. De nouvelles techniques de séquençage massif, comme le pyroséquençage (Margulies et al., 2005) présentant d’importants avantages par rapport au séquençage de Sanger ont été développées. Parmi ces techniques, le pyroséquencage dont la technologie 454 (Life Sciences) est l’une des plus performantes et plus usitées, apparait comme un choix de méthode pertinent puisqu’il permet d’accéder à un nombre de séquence d’ADN plus important que le traditionnel séquencage par la technique de Sanger (Sogin et al., 2006). Il permet à la fois d’accéder à la diversité taxonomique et à la diversité fonctionnelle, avec une très haute résolution. En effet il s’agit d’un séquencage dit massif pouvant générer plus de 20 millions de paires de bases (soit 4-5 fois le génôme complet d’une espèce comme Escherichia coli) en 4h (Margulies et al., 2005; Binladen et al., 2007), Ce haut débit est possible grâce à un couplage de technologies de pointes dont l’utilisation de plaques en fibre optique picotitrées (i.e. billionième de litre), qui contient 1.6 millions de puits. L’amplification du marqueur est réalisée par PCR en émulsion (emPCR) à partir d’ADN génomique nébulisé, dans des microréacteurs (i.e. microgoutellettes) (300 000 réactions PCR en parallèle avec un jeu d’amorces variées). Contrairement aux techniques de PCR classique, les nucléotides ne sont pas ajoutés tous ensemble mais les uns après les autres. Lorsqu’un nucléotide est incorporé au brin de synthèse, il libère un pyrophosphate qui est alors transformé en ATP par une ATPsulfurylase contenu dans le milieu réactionnel. Ce milieu réactionnel contient également 22 Chapitre I: Synthèse bibliographique de la luciférase et de la luciférine. En présence d’ATP la luciférase transforme la luciférine en oxyluciférine ; réaction chimique produisant une émission de lumière. Les séquences sont obtenues à partir du traitement de profils de luminescence (Ronaghi et al., 1998). Pour permettre le traitement d’un grand nombre de profil en simultané, l’ensemble est couplé à des technologies informatiques de pointes pour l’acquisition, le traitement et l’analyse des images (Margulis et al., 2005). Le pyroséquencage est à l’heure actuelle une technique en plein essor en écologie microbienne. Il a entre autre permis de révéler un grand nombre d’espèces jusque là inconnues car appartenant à ce qui est appelée la « biosphère rare » c'est-à-dire formée d’espèces très peu abondantes dans l’environnement (Pedros-Alio, 2006 ; Galand et al., 2009). 2.3.2.2.2 Techniques d’empreintes moléculaires Contrairement aux autres techniques (séquençage, biopuce), les empreintes moléculaires permettent d’accéder rapidement à l’ensemble de la diversité des communautés d’un grand nombre d’échantillons. Ces méthodes sont les plus couramment utilisées pour faire des comparaisons de structure de communautés (diversité β). Elles se basent sur le polymorphisme de taille ou de composition de séquences nucléiques d’intérêt comme le gène codant pour l’ARNr 16S. Ces méthodes nécessitent le recours à des techniques de séparation des séquences par migration forcée appelées électrophorèse, soit sur un gel classique d’agarose ou d’acrylamide soit sur un gel en capillaire via un séquenceur. On parle alors de Capillary Electrophoresisfingerprinting (CE-fingerprinting). Les techniques en capillaire sont plus précises, plus reproductibles, moins coûteuses et plus rapides que les techniques sur gel (Hong et al., 2007; Hori et al., 2006). Cependant elles ne permettent pas de récupérer les bandes afin de les séquencer et ne permettent donc pas une identification taxonomique (Costa et al., 2006 ; Mohr and Tebbe, 2006; Schmalenberger and Tebbe, 2003). 2.3.2.2.2.1 Automated Ribosomal Intergenic Spacer Analysis (ARISA) L’ARISA est une méthode de CE-fingerprinting basée sur le polymorphisme de taille des séquences intergéniques ADNr 16S-23S appelées ITS (Intergenic Transcribed Spacer). L’ITS est considéré comme l’unité taxonomique opérationnelle (OTU) (Fisher and Triplett, 1999 ; Ranjard et al., 2000). Cette méthode consiste donc à amplifier les régions intergéniques 23 Chapitre I: Synthèse bibliographique des espèces présentes dans un échantillon à l’aide de deux amorces situées respectivement sur la partie aval de l’ADNr 16S et sur la partie amont de l’ADNr 23S. L’une des deux amorces (en général celle s’hybridant sur l’ADNr 16S) est couplée à un fluorochrome permettant la détection de l’amplicon par fluorimétrie. Les différents ITS, générés par amplification, sont séparés en fonction de leur taille par migration électrophorétique en capillaire via un séquenceur. Au niveau du séquenceur les différents fragments sont détectés lors de leur passage devant un photomultiplicateur, leur temps de migration est enregistré permettant d’estimer la taille des fragments grâce à une courbe étalon interne. Un profil de pics de fluorescence appelé arisogramme est alors généré où le nombre de pics représente la richesse taxonomique en OTU ; la taille du pic, la composition en OTU et l’intensité de fluorescence l’abondance relative des OTU présentes. Cependant l’absence d’ITS chez un grand nombre d’archées ou de planctomycètes par exemple restreint en écologie des procaryotes, l’utilisation de cette technique à l’étude de la diversité bactérienne. 2.3.2.2.2.2 Terminal-Restriction Fragment Length Polymorphism (T-RFLP) Comme l’ARISA, la T-RFLP est une méthode de CE-fingerprinting mais basée sur le polymorphisme de taille de séquences d’ADNr 16S après restriction enzymatique c'est-à-dire après coupure de la séquence d’ADN au niveau de motifs nucléiques particuliers dépendants du choix de l’enzyme (Avaniss-Aghajani et al., 1994 ; Liu et al., 1997). L’ADNr 16S est amplifié à l’aide d’un couple d’amorces situées de part et d’autre de l’ADNr 16S, et dont l’amorce amont est couplée à un fluorochrome permettant comme pour l’ARISA la détection des fragments par le séquenceur. Lors de la restriction enzymatique, les fragments d'ADN sont chacun clivés en plusieurs fragments de tailles différentes mais seul le fragment couplé au fluorochrome pourra être détecté d’où l’appellation « Terminal » de cette technique de RFLP. Le choix de l’enzyme de restriction est prépondérant car choisir l’enzyme qui permet de générer un maximum de fragments de tailles différentes, conditionne la diversité générée par cette technique et donc sa résolution. En général les enzymes à site de restriction tétramérique sont les plus utilisées. Les enzymes AluI, HaeIII et HhaI sont décrites comme les plus résolutives aussi bien pour l’étude de la diversité des communautés bactériennes qu’archéennes (Danovaro et al., 2009 ; Luna et al., 2009) 24 Chapitre I: Synthèse bibliographique 2.3.2.2.2.3 Rapide aperçu d’autres techniques utilisées en écologie microbienne Il existe de nombreuses autres techniques d’empreintes moléculaires se basant pour la plupart sur le polymorphisme de taille, de séquence ou de conformation d’un marqueur moléculaire. La SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) et son équivalent automatisé CE-SSCP est une technique de différenciation de l’ADN (en général ADNr 16S) selon les propriétés de conformation de cette molécule, c’est-à-dire sa structure secondaire, sous sa forme simple brin. Les fragments d'ADN de même taille mais de séquence différente sont séparés grâce aux différences de mobilité induites par les différences de structure secondaire (Hebenbrock et al., 1995, Lee et al., 1996). La DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) et la TGGE (Temperature Gradient Gel Electrophoresis) sont des méthodes basées sur la séparation électrophorétique sur gel d’acrylamide à gradient dénaturant (urée et formamide pour la DGGE, température pour la TGGE) (Myers et al., 1985 ; Muyzer and Smalla, 1998). Contrairement à la SSCP, ces techniques se basent sur le polymorphisme de composition en bases nucléiques d’un marqueur d’ADN double brin. Les séquences nucléiques double brin sont d’abord amplifiées par PCR. Puis ces séquences sont séparées par migration sur gel d’acrylamide en conditions dénaturantes. La séparation est basée sur la diminution de la mobilité électrophorétique de l’ADN lors du changement de conformation de la molécule double brin induit par une augmentation soit de la température (TGGE) soit de la concentration en un agent dénaturant (DGGE). Afin de maintenir une structure en double-brin, l’amplification est réalisée à l’aide d’une amorce clampée (possédant un motif GC répété entre 20 et 50 fois) permettant d’incorporer aux fragments d’ADN néosynthétisés un long motif très difficilement dénaturable. La dénaturation des brins (i.e. rupture des liaisons hydrogène entre les bases appariées des deux brins d’ADN) est dépendante de la composition en bases nucléiques de la séquence d’ADN et en particulier de son % GC mais également de la présence ou non d’une suite plus ou moins importante de bases GC. Cette technique basée sur l’utilisation de gels de polyacrylamide est limitée par les contraintes de reproductibilité mais présente l’avantage de pouvoir exciser certaines bandes d’ADN d’intérêt et les séquencer. 25 Chapitre I: Synthèse bibliographique 2.3.2.2.2.4 Choix des techniques pour la caractérisation de la structure génétique des communautés bactériennes et archéennes La T-RFLP et l’ARISA sont les deux méthodes les plus couramment utilisées en écologie du fait de leur robustesse et de leur grande capacité à révéler une large diversité (e.g. Fisher and Triplett, 1999 ; Ranjard et al., 2000; Fuhrman et al., 2008 ; Luna et al., 2009 ; Collins et al., 2010). L’ARISA est souvent préférée à la T-RFLP pour l’étude des communautés bactériennes car elle permet de détecter un plus grand nombre de taxons et ainsi de révéler une plus large diversité bactérienne (Danovaro et al., 2006). Cependant comme indiqué précédemment l’ARISA n’est pas adaptée à l’étude des communautés archéennes, d’une part par l’absence d’ITS chez certains taxons archéens et d’autre part par le faible nombre de données répertoriées sur les ITS archéens. Du fait de la richesse des bases de données sur l’ADNr 16S aussi bien bactérien qu’archéen, et de la plus grande sensibilité de cette méthode par rapport à la DGGE par exemple (Moeseneder et al., 1999), la T-RFLP apparait alors comme la technique la plus adaptée à l’étude de la structure des communautés archéennes. C’est donc logiquement pour ce choix de méthodes que nous avons opté pour caractériser les structures génétiques bactériennes et archéennes au cours des différents travaux présentés dans les chapitres II et III. 2.3.2.2.2.5 Contraintes et limites des techniques moléculaires Les techniques moléculaires pré-citées peuvent présenter des biais à différentes étapes (Tableau I.2) qu’il est important d’évaluer afin de mettre en place une méthodologie limitant leurs impacts. 26 Chapitre I: Synthèse bibliographique Avantages ARISA Inconvenients Permet de détecter de très légères Ne cible pas l'ensemble des taxons archéens différences de population bactérienne T-RFLP Hautement résolutive pour l'analyse de la diversité bacterienne et archéenne Moins résolutive que l'ARISA dans l'analyse des communautés bactériennes Biais du signal si restriction enzymatique incomplète DGGE/TGGE SSCP Séquencage Excision des bandes d'ADN permettant Moyennement résolutive le séquençage des gènes isolés Nécessite des amorces clampées par électrophorèse Biais de reproductibilité des conditions de migration électrophorétique Ne nécessite pas d'amorces clampées Signal biaisé par un taux élevé de réappariement des brins d'ADN Complexité des données à traiter nécessitant le recours à la bioinformatique Prend du temps si recours à une étape de clonage La plus haute résolution phylogénétique Permet d'identifier l'espèce Tableau I.2: Avantages et inconvénients des techniques moléculaires utilisées pour l’étude de la diversité microbienne. Tout d’abord la mesure de la diversité des communautés procaryotes à partir d’un même échantillon varie en fonction de la méthode d’extraction de l’ADN utilisée (Luna et al., 2009; Martin-Laurent et al., 2001; Stach et al., 2001 ; Tang et al., 2008). Pour limiter cet effet, il est possible de faire des réplicats d’extraction en utilisant des kits d’extraction/purification d’ADN différents mais les coûts financiers engendrés limitent cette possibilité. La majorité des études en écologie microbienne utilise un seul kit d’extraction/purification d’ADN, choisi en fonction de la nature de l’échantillon: eau (e.g. Newby et al., 2004), sol (e.g. Baniulyte et al., 2009), biofilm (e.g. Lyautey et al., 2005), tissu animal (e.g. Kellogg et al., 2009) ou végétal (e.g. Andreote et al., 2009). Afin d’améliorer le rendement d’extraction d’ADN (e.g. 83 % d’ADN supplémentaire extrait dans un sol (Bürgmann et al., 2001)), des méthodes de lyse mécanique (e.g. bead beating) sont souvent couplées à celles des lyses chimiques contenues dans les kits d’extraction/purification d’ADN (Bürgmann et al., 2001). Le choix des amorces PCR est également crucial car les amorces ciblées sont à l’origine de la sélection des espèces qui seront amplifiées (Zhu et al., 2002). Il est nécessaire que les amorces soient spécifiques afin de sélectionner un maximum d’espèces au sein de la communauté ciblée et un minimum d’espèces non-ciblées (Zhu et al., 2002). Cette technique peut conduire à des amplifications préférentielles, en particulier une meilleure amplification des fragments courts ou des fragments pour lesquels les amorces ont une meilleure affinité. 27 Chapitre I: Synthèse bibliographique Cependant ces biais de PCR semblent être d’autant moins importants que la communauté étudiée est diversifiée (Suzuki and Giovannoni, 1996). Comme nous l’avons vu précédemment les techniques de biologie moléculaire permettent de décrire la diversité des communautés procaryotes à travers des méthodes de (méta)génomique qui génèrent une liste de séquences nucléiques reflétant la composition en espèces ou à travers des techniques d’empreinte moléculaire mettant en évidence des variations de structure des communautés basées sur la comparaison des OTU présentes. Cependant, avec l’essor technologique, ces jeux de données deviennent de plus en plus complexes allant jusqu’à plusieurs centaines de milliers de séquences à analyser pour le pyroséquencage. Mais quel poids doit-on donner à chaque séquence, à chaque OTU lorsque l’on s’intéresse à la dynamique des patrons de diversité des communautés procaryotes ? Quelle fraction du signal doit-on considérer: la fraction dominante, la fraction rare, l’ensemble ? Quel seuil imposer pour discriminer une fraction dominante d’une fraction rare ? Ce sont ces questions que de récentes études soulèvent et qui sont l’enjeu actuel des développements méthodologiques pour le traitement de ces données. La présence d’OTU rares et leurs rôles en écologie microbienne sont très controversés, certains auteurs les considérant comme un artéfact du fait de leur caractère aléatoire (Kunin et al., 2010). D’autres auteurs au contraire soutiennent l’importance de cette biosphère rare pouvant potentiellement soutenir une fonction encore méconnue au sein des écosystèmes (Galand, 2009; Pedros Alio, 2006; Sogin et al., 2006). Cependant Gobet et al., (2011) ont montré par une approche « Multivariate Cutoff Level Analysis (MultiCoLA) » qu’en éliminant 35-40% des OTU rares, les patrons écologiques sont maintenus, montrant la robustesse des l’analyse de la diversité β à la présence ou non de ces OTUs rares. Si distinguer les OTU les plus abondantes ne présente pas de difficultés particulières, distinguer en revanche, les OTU minoritaires peut s’avérer plus complexe en particulier si la quantité d’ADN analysée est faible. En effet l’intensité de ces OTU peut se situer au niveau voire en dessous de la limite de détection de la méthode. Il est donc important d’avoir recours à une méthode de détermination de la ligne de base afin de ne pas induire d’artéfacts (bruit de fond) dans l’analyse des données. Trois grands types de calcul de la ligne de base sont utilisés pour des données issues des deux techniques d’empreintes moléculaires, l’ARISA et la T-RFLP. La première méthode discrimine le bruit de fond par un calcul basé sur un pourcentage de contribution constant (Sait et al., en 2003) où les pics (i.e. amplicons émettant une fluorescence proportionnelle à leur abondance) ayant une abondance relative inférieure à ce pourcentage sont éliminés. L’élimination du bruit de fond peut également être fondé sur un 28 Chapitre I: Synthèse bibliographique calcul basé sur une intensité de fluorescence minimale (Dunbar et al., 2000). Les pics présentant une intensité de fluorescence inférieure à cette valeur sont ainsi éliminés. Enfin Osborne et al. (2006) émettent l’hypothèse que le bruit de fond se traduit par une relation de proportionnalité entre le nombre d’amplicons et l’intensité de fluorescence totale. Ils proposent alors un calcul dérivé du calcul de Sait et al. (2003) où plusieurs valeurs de pourcentage de contribution (appelé « divisor ») sont testées a priori. Le « divisor » amenant à la plus faible relation de proportionnalité entre la fluorescence initiale et le nombre de pics restants est appelé « optimal divisor » et définit la valeur de la ligne de base. Enfin, pour prendre en compte la variabilité technique de l’assignation des tailles de pics due majoritairement aux variations entre analyses, un traitement de données appelé « binning » peut être appliqué. Le binning consiste à assigner au sein d’un profil de taille d’amplicon PCR, une même taille d’OTU à des amplicons présentant des tailles voisines; l’amplitude de la gamme de taille est appelée « window size» ou taille de fenêtre. Cette taille de fenêtre est estimée de trois manières dans la littérature : (i) de manière a priori, Brown et al. (2005) estiment la taille de la fenêtre à 3 bp pour des fragments de taille inférieure à 700bp, 5bp pour les fragments compris entre 700 et 100bp et 10 bp pour les fragments supérieurs à 1000bp; Hewson et al. (2006) se basent sur une fenêtre de 2 bp (ii) de manière empirique en analysant plusieurs réplicats d’un échantillon contrôle : Ramette en 2009 met en évidence une variation de taille d’amplicon d’une même souche contrôle de 1bp l’amenant à appliquer une valeur de fenêtre de 2bp ou (iii) in silico à l’aide d’un algorithme implémenté sur R (automatic binning, Ramette, 2009) qui détermine la valeur optimale de la fenêtre par un compromis entre une forte résolution de l’analyse (valeur de fenêtre faible, nombre d’OTU important) et une similarité élevée entre les profils étudiés (valeur de fenêtre large, nombre d’OTU plus faible). Si les corrections des données ont longtemps été réalisées « manuellement », le développement de script comme l’ « interactive binner » par Ramette (2009) permet d’automatiser le traitement de données. Aujourd’hui, le traitement des données de diversité génétique procaryote passe donc obligatoirement par une étape de traitement informatique plus ou moins complexe; les besoins en bioinformatique deviennent de plus en plus croissants avec le développement des techniques de séquençage massif. 29 Chapitre I: Synthèse bibliographique 3. Les théories expliquant la structuration des communautés procaryotes Différentes théories, dépendantes de l’échelle d’observation à laquelle on se place, ont été proposées afin d’expliquer la structure des communautés procaryotes. A l’échelle globale, la théorie du cosmopolitanisme (Delong and Pace, 2001) prône l’ubiquité des espèces procaryotes, du fait de leur fort taux de dispersion résultant du nombre important d’individus composant les populations et du court temps de génération individuel. La faible taille des procaryotes serait également un facteur facilitant les phénomènes de dispersion sur de longues distances. Les faibles taux d’extinction et de spéciation de ces organismes, limitant la diversification spécifique à l’échelle locale, viennent également renforcer la théorie du cosmopolitanisme. Le faible taux de spéciation s’expliquerait par l’importante plasticité génotypique et phénotypique des espèces ainsi que l’absence apparente de barrière de dispersion et par conséquent d’isolement géographique, source de spéciation. Cependant, selon les études de Horner-Devine et al. (2004) et de Ramette and Tiedje (2007) certains taxons procaryotes auraient une aire de distribution plus réduite du fait d’une capacité de dispersion moindre. Ces études mettraient ainsi en évidence une structuration spatiale de la biodiversité procaryote. A l’échelle locale, les assemblages des communautés procaryotes sont principalement expliqués par deux théories. D’un côté, la théorie neutre proposée par certains écologistes comme Hubell (2001) qui soutient que l’apparition, la migration, et l’extinction des espèces sont les principaux facteurs contrôlant la richesse spécifique au sein d’une communauté (Hubell, 2001; Zhou and Zhang 2008). D’autre part, la théorie de l’assemblage par la niche écologique définie par Beijerinck (1904) reprise plus tard par Baas-Becking (1918) affirme que seules des espèces utilisant des ressources différentes peuvent coexister au sein d’une communauté (de Wit and Bouvier, 2006). 4. Les communautés procaryotes des sédiments benthiques marins Au sein des écosystèmes marins, les sédiments constituent le réceptacle ultime de la plupart des apports de matières organiques terrigènes mais également d’une large proportion des flux de particules d’origine marine (Freese et al., 2008). Les particules organiques sédimentaires sont soumises à d’importants processus d’altération appelés diagenèse précoce (Figure I.3) diminuant la labilité de la matière organique le long de la colonne sédimentaire (Berner, 1980; Canfield et al., 2005 ; Middelburg, 1989; Middelburg et al., 1993 ; 30 Chapitre I: Synthèse bibliographique Sundby, 2006). Ces processus biogéochimiques sont contrôlés par la dégradation de la matière organique par les bactéries et les archées à partir de différents oxydants contenus dans les sédiments et/ou l’eau porale. Figure I.3: Profil diagénétique dans les sédiments : minéralisation de la matière organique (Emerson and Hedges, 2003). Le long de la colonne sédimentaire, les communautés procaryotes vont se répartir en fonction de i) de l’accepteur terminal d’électrons utilisé dans l’oxydation de la matière organique et ii) du rendement énergétique du métabolisme impliqué. Ainsi de la surface des sédiments vers le fond, un microprofil d’accepteurs d’électrons en zones dû à la distribution des métabolismes procaryotes mis en jeu dans l’oxydation complète de la matière organique peut-être décrit : en premier lieu l’oxygène puis la zone des nitrates, la zone des oxydes de manganèse puis de fer, la zone des sulfates et finalement la zone du dioxyde de carbone (Van Capellen and Wang, 1996). La minéralisation de la matière organique est l’un des principaux mécanismes par lequel les communautés procaryotes benthiques se développent (Middelburg and Meysman, 2007). De manière plus générale, les communautés procaryotes du sédiment jouent un rôle écologique et biogéochimique majeur dans les écosystèmes benthiques, du fait de leur forte abondance (>108 cell.g-1) (Montagna, 1982) et de leur grande variété métabolique. En plus de leur implication dans le turnover de la matière organique sédimentaire (Schmidt, 1998; Danovaro et al., 2002 ; Ikenaga et al., 2010), les communautés 31 Chapitre I: Synthèse bibliographique procaryotes forment l’un des principaux premiers échelons du réseau trophique en contribuant pour environ 50% de la production primaire (Benlloch et al., 1995). Appréhender la dynamique des communautés procaryotes et les facteurs qui la contrôlent apparait donc comme primordial pour comprendre le fonctionnement des écosystèmes benthiques. Pourtant ce n’est que récemment que des études se sont intéressées aux liens entre les patrons de diversité des communautés bactériennes et les paramètres environnementaux (Bertic and Ziebis, 2009; Boer et al., 2009; Hewson et al., 2007; Ikenaga et al., 2010; Lasher et al., 2009; Sapp et al., 2010). Et, à ce jour, excepté quelques études sur les sédiments abyssaux (Danovaro et al., 2009) ou sur des patrons de gènes d’activités particulières (e.g. ammonium mono-oxygénase) (Singh et al., 2010), les études sur les communautés archéennes du sédiment restent encore très succinctes. La diversité des communautés procaryotes des sédiments marins est décrite comme influencée par différents facteurs environnementaux comme les conditions physiques et chimiques du sédiment incluant la localisation géographique (Green and Bohannan, 2006), la taille des particules sédimentaires (Jackson and Weeks, 2008), la teneur en eau (Hewson et al., 2007), le pH et le potentiel d’oxydo-réduction (Edlund et al., 2008), la température (Pomeroy and Deibel, 1986), la pression (Kato et al., 1998) la salinité (Crump et al., 2004; Prieur et al.,1987) ; mais également des facteurs biotiques comme la concentration en chlorophylle a (Polymenakou et al., 2005), la disponibilité des ressources (Rowe et al., 1991; Torsvik et al., 2002) c'est-à-dire la quantité et/ou la qualité de la matière organique (Bissett et al., 2007, Cammen, 1982, Polymenakou et al., 2005) la teneur en nitrates et en phosphates inorganiques (Rubin and Leff, 2007; Ikenaga et al., 2010). Les procaryotes sont également soumis aux pressions trophiques comme la présence d’organismes brouteurs (Sherr and Sherr, 1994; Simek et al., 2001) ou de virus (Fuhrman, 1992; Fuhrman and Suttle, 1993; Hewson et al., 2003; Schwalbach et al., 2004; Winter et al., 2004) régulant les dynamiques des communautés procaryotes. La dynamique des communautés procaryotes peut également être modifiée par la présence d’invertébrés marins pouvant par exemple faciliter la colonisation des sédiments par les procaryotes via des mécanismes de pré digestion ou de concentration de la matière organique dans des pelotes fécales rejetées dans les sédiments (Hanson and Tenore, 1981; Hargrave, 1976). Mais ces invertébrés marins peuvent également controler la croissance procaryote soit par production de substances bactéricides soit en favorisant la croissance de certains procaryotes à activités bactéricides (Amade et al., 1987, Gonzales et al., 2007 ; Moriaty, 1990; Romanenko et al., 2008; Parisi et al., 2008; Wardlaw and Unkles, 1978). 32 Chapitre I: Synthèse bibliographique Parmis ces invertébrés marins, la présence d’organismes ingénieurs du sédiment comme le polychète terebellidae Melinna palmata ou le crustacé décapode thalassinidé Upogebia pusilla, peut également modifier les profils de diversité des communautés procaryotes benthiques à travers des mécanismes de remaniements sédimentaires. Le transport des particules (bioturbation) et les mouvements d’eau (bioirrigation) créent des patrons de zonations géochimiques entrainant des changements des conditions d’oxydo-réduction et la formation de microenvironnements (Emerson and Hedge, 2003). Ces mécanismes peuvent influer sur la diversité procaryote via (i) une modification de la biogéochimie des sédiments (bioirrigation, oxygénation, pH), (ii) une remise en suspension des procaryotes des sédiments ou (iii) un enfouissement des procaryotes dans des zones anoxiques du sédiment (Aller, 1994; Bertics and Ziebis, 2009; Kristensen and Kostka, 2005; Kogure and Wada, 2005; Lohner et al., 2007; Marinelli et al., 2002 ; Reichardt, 1989). D’une part, on peut distinguer l’activité des organismes de la macrofaune benthique dont les activités de ventilation et de forage peuvent affecter la minéralisation de la matière organique, les cycles des nutriments, les interactions biogéochimiques ainsi que les flux benthiques et pélagiques (Rhoads, 1974; Aller, 1982, 1988, 1994; Kristensen et al., 1991, 2000; Gilbert et al., 1998, 2003; Banta et al., 1999). Ces activités peuvent par exemple conduire à un transport de l’oxygène jusqu’à 80 cm de profondeur (Ziebis et al., 1996), alors que la pénétration de l’oxygène due à la diffusion moléculaire n’est que de quelques millimètres dans les sédiments côtiers non bioturbés (Revsbech et al., 1980; Glud et al., 1994). La construction de terriers augmente également la surface des zones d’interface eausédiment offrant des surfaces supplémentaires pour la colonisation et la diversification métabolique des procaryotes (Aller and Aller, 1986; Meyers et al., 1987; Reichardt, 1989; Grossman and Reichardt, 1991; Marinelli et al.,2002). D’autre part, la rhizosphère des plantes marines forme un réseau dense de racines et de rhizomes affectant fortement les processus biogéochimiques benthiques et par conséquent la diversité de la microflore des sédiments (Duarte and Chiscano 1999; Marbà et al., 2006). En effet une activité microbienne distincte a été observée au niveau des apex des racines à l’échelle micrométrique. Il a été également montré que les herbiers marins libéraient du carbone organique dissous pouvant influer de manière significative sur la composition et l’activité microbienne associées à la rhizosphère. De forts taux de fixation de l’azote, source de compétition entre procaryotes et plantes, ainsi qu’une augmentation des activités de sulfato-réduction, ont également été observés au niveau des rhizosphères. L’ensemble de ces observations mettent en évidence un lien étroit entre les communautés procaryotes et la 33 Chapitre I: Synthèse bibliographique rhizosphère à l’échelle micrométrique (Duarte et al., 2005 ; Kristensen et al. 2005 ; Larkum et al., 2006). Parmi les écosystèmes marins, les écosystèmes côtiers/littoraux présentent des particularités du fait de leur position à l’interface océan-continent. Les communautés procaryotes qui y vivent présentent donc des spécificités et sont soumis à des règles d’assemblages propres à ces écosystèmes. L’ensemble de ces particularités est developpé dans la partie 6 du chapitre I. 5. Les communautés bactériennes associées aux invertébrés marins benthiques 5.1 Généralités Les invertébrés marins sont les hôtes d’une flore procaryote abondante et diversifiée, formant un ensemble de communautés bactériennes et archéennes associées (Cavanaugh, 1994 ; Haygood et al., 1999). On peut distinguer trois voies d’acquisition de cette flore par les invertébrés (Figure 4) (Dubilier et al., 2008; Bright and Bulgheresi, 2010): (i) la transmission verticale c'est-à-dire la transmission des parents à la descendance qui se fait via l’incorporation des procaryotes à la surface ou au sein des gamètes ; (ii) la transmission horizontale par acquisition de procaryotes entre hôtes contemporains indépendamment des mécanismes de reproduction ; (iii) la transmission latérale c'est-à-dire l’acquisition de la flore directement via l’environnement à travers des mécanismes actifs de filtration ou d’enfouissement ou de manière passive par simple balnéation dans un environnement septique. 34 Chapitre I: Synthèse bibliographique Modes d’acquisition Les communautés procaryotes d’un invertébré marin Transmission latérale Transmission X verticale Transmission horizontale Autres tissus Interactions Tube digestif Commensalisme ou parasitisme bénin (Flore de transit) Relation trophique (Flore du bol alimentaire) Mutualisme, parasitisme (Flore résidente) Toutes interactions jusqu’à l’endosymbiose (Flore associée) Figure I.4 : Communautés procaryotes associées à un invertébré : mode de transmission et interaction flore associée/hôte L’habitat, et en particulier la voie trophique, pourraient représenter le principal déterminant de la composition des communautés procaryotes associées aux invertébrés marins benthiques. En effet, ceux-ci se nourrissent entre autres de microorganismes planctoniques et de microorganismes benthiques remis en suspension à l’interface sédiment - colonne d’eau par des mouvements hydrodynamiques. Au niveau du système digestif, les procaryotes ainsi ingérés peuvent être (i) lysés et absorbés (bol alimentaire), (ii) simplement transiter et être rejetés dans les sédiments via les fèces, après prolifération ou non dans le système digestif (bactéries allochtones) (ii) ou former une flore permanente et/ou intimement liée à l’épiderme appelée flore résidente (bactéries autochtones) (Harris, 1993; Romero et al., 2002). Au niveau des autres tissus, les communautés procaryotes associées sont formées d’un consortia de taxons présentant des interactions symbiotiques plus ou moins étroites (endo- ou ecto-symbiontes) et plus ou moins bénéfiques (mutualisme, commensalisme, parasitisme) susceptibles d’affecter la fitness de l’hôte (Cavanaugh 1994). Le terme « symbiotique » est utilisé dans le sens proposé par Taylor et al. (2007) et se réfère à deux ou plusieurs 35 Chapitre I: Synthèse bibliographique organismes associés vivant en sympatrie durant une longue période, sans impliquer de notions de bénéfice ou de nuisance les uns envers les autres. Ces interactions ne sont pas récentes puisqu’on estime la présence d’endosymbiontes chez les éponges dès leur apparition au Précambrien. Les micro-organismes les plus étroitement associés présentent donc une longue histoire évolutive commune avec leurs hôtes (Taylor et al., 2007). C’est l’une des raisons pour laquelle, les communautés procaryotes des éponges sont actuellement les plus étudiées. Au sein des éponges on dénombre en moyenne 108 à 1010 bactéries par gramme de tissu frais ce qui peut représenter jusqu’à 40 % de la biomasse totale de l’éponge conduisant certains chercheurs à parler de « bactériosponges » (Vacelet and Donadey, 1977; Henstchel et al., 2006). L’étude de ces organismes a permis la découverte d’un nouveau phylum bactérien baptisé « Poribacteria » signifiant étymologiquement bactéries des éponges (Fieseler et al., 2004). De nombreuses archées symbiontes des éponges marines ont également été caractérisées (Lee et al., 2003). Si les symbiontes acquis par transmission verticale comme Zooxanthella sont présents dès les premiers stades de l’évolution, une dynamique des patrons de diversité a également été mise en évidence par la présence de ribotypes distincts à chaque stade de l’évolution. En effet, les symbiontes transmis horizontalement ne sont souvent pas internalisés avant le développement complet de la planula (Apprill et al., 2009). Il est possible que ces symbiontes particuliers jouent un rôle important dans le recrutement benthique (Apprill et al., 2009). On aurait alors une succession de processus qui conduirait au remplacement graduel des symbiontes des juvéniles au profit des symbiontes des adultes. Le corail est également un modèle d’étude pertinent pour comprendre les interactions entre les invertébrés et leurs communautés procaryotes. L’étude de 3 espèces différentes de corail, révélant la présence de 6000 ribotypes associés, a montré l’extrême diversité des communautés procaryotes coralliennes (Rohwer et al., 2002). La plupart des espèces procaryotes associées au corail sont décrites comme appartenant à la biosphère rare (Sogin et al., 2006). De manière plus générale, aucun organisme marin n’a été décrit à ce jour comme ne présentant pas de communautés procaryotes associées. Les bryozoaires (Zimmer and Woollacott, 1983), les isopodes marines (Zimmer et al., 2001), les crabes (Rameshkumar et al., 2009), les crustacés (Meziti et al., 2010), les gorgones (Harder et al., 2003) sont quelques exemples déjà décrits illustrant la diversité des organismes qui hébergent une large diversité de procaryotes. Quelques chercheurs se sont penchés sur deux problématiques : (i) l’hôte est-il capable de réguler ces communautés associées, face aux variations de l’environnement ? (ii) Existe-il des 36 Chapitre I: Synthèse bibliographique procaryotes associés, hôtes dépendants ? La composition des communautés bactériennes du corail vivant serait différente de celle du corail mort mais également de celle de l’eau environnante suggérant une capacité de sélection de la part de l’hôte (Hansson et al., 2009). Certaines ribotypes bactériens ont été retrouvés chez une espèce hôte du Panama et chez la même espèce hôte présente aux Bermudes (Rohwer et al., 2002). Il a également été démontré chez le corail Lophelia pertusa la présence de bactéries tissus dépendantes, comme candidatus Mycoplasma corrallicola sur l’ectoderme des tentacules et quelques espèces endodermiques de la cavité gastrique (Neulinger et al., 2009). Ces observations suggèrent donc, chez certains invertébrés marins, un déterminisme d’hôte des communautés procaryotes associées. Mais il a également été observé que certains procaryotes associés à Lophelia pertusa variaient de manière dépendante de conditions environnementales régionales (Schöttner et al., 2009). Il existe également des ribotypes associés à une même espèce d’invertébré marin qui diffèrent selon la région géographique (Klaus et al., 2005; Littman et al., 2009). Ces observations suggèrent donc un déterminisme d’habitat pour certaines communautés procaryotes. D’un point de vue fonctionnel, les communautés procaryotes semblent participer à la digestion de la nourriture, comme montré chez la larve de l’huitre creuse Crassostrea gigas (Prieur et al., 1990) mais aussi semblent procurer des facteurs de croissance (vitamines, acides aminés) comme montré chez la palourde Calyptogena magnifica (Newton et al., 2008). Chez les éponges, les symbiontes interviendraient dans les cycles biogéochimiques, incluant (i) la fixation du carbone via la photosynthèse (cyanobactéries symbiotiques) (Wilkinson, 1983), (ii) la nitrification (Corredor et al., 1988 ; Diaz and Ward, 1997), (iii) la fixation de l’azote (Shieh and Lin, 1994 ; Wilkinsons et al., 1999), (iv) le métabolisme de l’azote secrété par l’éponge et ses autres symbiontes (Hoffmann et al., 2009) ainsi que (v) le métabolisme anaérobie comme l’anammox (Hoffmann et al., 2005). Certaines archées se transmettant par transmission verticale via les larves d’éponges (Sharp et al., 2007; Steger et al., 2008) seraient capables de réaliser l’oxydation de l’ammonium (Holmes and Blanch, 2007). C’est également grâce à la présence de leurs communautés procaryotes que des mollusques, vivant sur le bois, comme les tarets (ex : Teredo navalis) peuvent s’en nourrir. En effet, les bactéries endosymbiontes de leurs branchies possèdent des enzymes (cellulase, nitrogénase) permettant la digestion de la cellulose et la supplémentation du régime alimentaire de l’hôte, déficitaire en azote (Norman, 1977; Waterbury et al., 1983 ; Distel, 2003 ; Zurel et al., 2011). Le rôle fonctionnel des communautés procaryotes est particulièrement bien décrit chez le corail (Mouchka et al., 2010). Certaines bactéries symbiotiques associées au mucus fourniraient une 37 Chapitre I: Synthèse bibliographique protection contre les pathogènes au moyen de compétition interspécifique. En effet elles occuperaient de manière préférentielle des niches du fait de leur rapide taux de croissance empêchant ainsi l’installation d’autres bactéries (Mouchka et al., 2010). D’autres bactéries seraient capables de sécréter certains antibiotiques comme mécanismes de défenses contre les bactéries libres incluant les bactéries potentiellement pathogènes (Castro et al., 2002; Ritchies, 2006). Les bactéries associées au corail incluant celles dans les tissus auraient une fonction équivalente à celle du système immunitaire (hypothèse des bactéries probiotiques) (Reshef et al., 2006). Les changements de diversité bactérienne pourraient donc affecter la fitness du corail. En effet des phénomènes de blanchiment des éponges ont été observés dus à la perte partielle ou totale des cyanobactéries associées (Vicente, 1990; Gammill and Fenner, 2005). La perte des symbiontes est souvent en lien avec des changements de conditions environnementales comme la température (Webster et al., 2008). 5.2 Communautés bactériennes associées aux bivalves Parmi les invertébrés marins, les bivalves fouisseurs comme la coque (Cerastoderma edule) et la palourde (Ruditapes philippinarum) sont susceptibles d’avoir un impact important sur les communautés procaryotes benthiques, du fait de leur double compétence, la remise en suspension des sédiments par bioturbation et leur fort taux de filtration à l’interface eausédiment. En effet il a été démontré en écosystème lacustre, une augmentation de la diversité métabolique et de l’activité des micro-organismes par la présence de la moule zébrée Dreissena (Lohner et al., 2007) mais également une stimulation des activités bactériennes de nitrification, dénitrification ou de production d’ammonium en présence du bivalve Malcoma balthica (Henriksen et al., 1983). Par ailleurs une augmentation de la richesse taxonomique des biofilms estuariens est également observée en présence de récifs d’huîtres (Nocker et al., 2004). En tant que filtreurs, les bivalves marins sont également connus pour abriter une grande variété de micro-organismes (parasites, virus, champignons, bactéries), microorganismes largement étudiés car responsables de toxi-infection chez l’homme (Mason and McLean,1962) et d’altérations chez les bivalves (Farley, 1972; Alderman et Jones, 1969; Bricelj et al., 1992). Parmi ces micro-organismes, les bactéries ont été plus particulièrement étudiées. Ainsi, une abondante littérature rapporte l’occurrence de bactéries pathogènes pour l’homme chez les bivalves (e.g. Clostridium botulinum, Salmonella sp., Vibrio parahaemolyticus) mais également la présence de bactéries indicatrices de contamination 38 Chapitre I: Synthèse bibliographique fécale (e.g. Escherichia coli) chez l’huître (Perry and Bayliss, 1936 ; Perreira et al., 2006), la coque (Nicholson et al., 1989; Martinez et al., 2009) ou la palourde (Hood et al., 1983 ; Hayati Hamdan et al., 2008). La détection d’Escherichia coli dans des palourdes issues de sites contaminés et leur disparition quelques jours après la fin de l’épisode de contamination suggère une relation dynamique entre la microflore des palourdes et celle de leur environnement (Serais et al., 2010). Les bactéries sont également impliquées dans des épisodes de mortalité massive de bivalves à l’état de larves (McGladdery, 1999; Sindermann, 1990; Paillard et al., 2004) ou dans le développement de pathologies comme la nocardiose chez l’huître du Pacifique Crassostrea gigas (Friedman et al., 1998) et la maladie de l’Anneau Brun chez la palourde japonaise Ruditapes philippinarum (Paillard et al., 2004). Les bactéries impliquées sont le plus souvent des espèces à Gram négatif (Prieur et al., 1990). Le genre Vibrio est le plus impliqué dans les mortalités de palourdes (Paillard et al., 2004). Ces bactéries sont largement répandues dans les environnements aquatiques à travers le monde ; elles sont « communes » dans les eaux chaudes, particulièrement quand la température est proche de 17°C, et suivant les espèces, il existe une gamme de tolérance en salinité (Wright et al., 1996). Bien que la littérature soit riche de travaux portant sur l’étude des pathologies de mollusques et des agents infectieux associés pour les pathologies déclarées, il n’existe que très peu de travaux faisant état de connaissances sur l’abondance et/ou la diversité de la microflore procaryote (bactéries, archées) associée aux bivalves marins. Tanaka et al. (2004) ont montré que la flore intestinale de l’abalone était très diversifiée, variable selon le régime alimentaire et composée d’α, γ, et ε-Protéobactéries, de Fusobacteria et de Mollicutes. Si certaines espèces associées affectent négativement la fitness des bivalves comme les bactéries endoparasites qualifiées de « Mycoplasma-like » (Azevedo, 1993) et de « Rickettsia-like » (Carballal et al., 2001), d’autres au contraire ont co-évolué avec les bivalves à travers des relations bénéfiques. En effet, quelques études plus récentes montrent que des interactions bactéries – bivalve peuvent s’avérer bénéfiques pour les deux partenaires chez des espèces comme Codakia orbicularis et Myrtea sp. (Caro et al., 2007; Brissac et al., 2011) ou Solemya velum (Scott and Cavanaugh, 2007). Dans ces symbioses mutualistes, des bactéries chimioautotrophes proliférant dans des cellules de la branchie appelées bactériocytes, consommeraient les sulfures présents dans l'eau interstitielle du sédiment grâce à l’activité de filtration de l'animal. En retour, ce dernier se nourrirait, au moins partiellement, du carbone bactérien ainsi édifié en hydrolysant les bactéries du bactériocyte, et bénéficierait indirectement de l’activité de détoxification des sulfures liée à l’activité bactérienne (Caro et al., 2009). 39 Chapitre I: Synthèse bibliographique De manière générale, les interactions entre les bivalves et leurs communautés procaryotes associées semblent être diversifiées et complexes mais les connaissances sur la dynamique de ces communautés procaryotes, la nature des interactions et les mécanismes d’acquisition de ces communautés restent encore très sommaires. 6. Les zones de transition: un modèle d’étude pertinent pour l’étude de la dynamique des patrons structuraux des communautés procaryotes 6.1 Généralités Les zones de transition côtières sont des écosystèmes situés à l’interface océan-continent. Parmi ces zones, on peut distinguer d’une part les embouchures de fleuves soumises aux intrusions d’eau de mer liées aux phénomènes de marée et appelées estuaires; et d’autre part les lagunes, des étendues d'eau plus ou moins saumâtres généralement peu profondes séparées de la mer par un cordon littoral (Pérez-Ruzafa et al., 2011). L’hydrochimie des zones de transition est directement liée à l’importance de la contribution des apports des bassins versants et des apports océaniques. Ainsi s’établissent, des zones continentales vers les zones océaniques, de nombreux gradients physiques et chimiques, comme la salinité, la température des masses d’eau, les teneurs en sels nutritifs, en oxygène et en matière organique plus ou moins labile influant sur les assemblages des organismes y vivant (e.g. poissons, macroinvertébrés, procaryotes …) (Weinstein et al.,1980; Rakoconski et al., 1992 ; Giovannoni et al., 1990 ; Crump et al., 2004 ). Ces gradients peuvent générer une forte hétérogénéité spatiale et de ce fait une grande diversité γ et une forte diversité β entre les communautés au sein d’habitats contrastés. L’importance des vents dominants, associés à la circulation des masses d’eaux (marées, débit des affluents, courants transverses …) entraine un taux journalier de renouvellement des masses d’eau important, renforcé par les faibles hauteurs d’eau. Les taux de sédimentation et d’évaporation élevés, couplés aux courants tidaux entraînent une anoxie rapide des sédiments dès les premiers millimètres de profondeur (Danovoro and Pusceddu, 2007 ; Borin et al., 2009). Les faibles hauteurs d’eau ne permettent pas une minéralisation complète de la matière organique au sein de la colonne d’eau entrainant une accumulation importante de matière organique à la surface du sédiment qui constitue alors pour ces écosystèmes, le lieu prépondérant de la minéralisation de la matière organique et du recyclage des nutriments (Nedwell, 1984). Ces écosystèmes très productifs sont souvent dominés par 40 Chapitre I: Synthèse bibliographique des macrophytes (e.g. Spartina spp. and Zostera spp.) et des macroalgues (e.g. Ulva spp.) (Newell, 1982). La production primaire est excédentaire, et surpasse les capacités de consommation par les herbivores ; la matière organique produite par la production primaire devenant donc disponible pour les consommateurs. Lorsque les apports en matière organique vers les sédiments excèdent les capacités d’utilisation des consommateurs, ils sont accumulés dans les sédiments. Une grande partie de cette matière organique est réfractaire et donc non consommable directement par les consommateurs (Pusceddu et al., 2003). De ce fait elle doit être fragmentée pour entrer dans les hauts niveaux trophiques. Cette fonction clé est assurée par les procaryotes benthiques (Tibbles et al., 1992; Fiordelmondo et al., 2003; Manini et al., 2003). D’autres part, ces écosystèmes fournissent d’importants services: régulation des hauteurs d’eau limitant les inondations, stabilisation du littoral, rétention de nutriments et de sédiment, qualité des eaux, réservoirs de biomasses et de biodiversité, zones récréatives et touristiques (Levin et al., 2000; Moss, 2000). La valeur de leur potentiel économique a été estimée à au moins 22.000 US dollars ha-1 an-1 (Costanza et al., 1997). Mais de ce fait ces zones sont soumises à de nombreuses perturbations d’origine anthropique (Nogales et al., 2007) liées au développement de l’ensemble des activités économiques (tourisme, agriculture, industrie, pêche, urbanisation…). Ces perturbations peuvent être de différentes natures, (i) enrichissement en matière organique d’origine allochtone, (ii) apport de pollutions biochimiques (nitrates, nitrites, ammonium), (iii) apport de communautés allochtones (apports de procaryotes via le rejet des eaux usées) ou (iv) modification physique de l’habitat (e.g. endiguement, draguages). La dynamique des communautés procaryotes benthiques peut donc être influencée par ces différentes perturbations (ou ces différents apports abiotiques et/ou biotiques). 6.2 Les communautés procaryotes des zones de transition 6.2.1 Généralités Au sein de ces environnements, les procaryotes et en particulier les procaryotes benthiques jouent un rôle clé dans la reminéralisation de la matière organique permettant le recyclage des nutriments nécessaire à la production primaire et représentant une importante source trophique pour les brouteurs benthiques (Alongi, 1994). 41 Chapitre I: Synthèse bibliographique Comme nous venons de le voir, les écosystèmes de transition se caractérisent par une hydrodynamique importante et divers gradients biologique, physique et chimique. Il en résulte donc, d’une part, d’importants phénomènes de dispersion des micro-organismes selon la théorie du cosmopolitanisme ou « everything is everywhere » appliquée à l’échelle locale ; et d’autre part, une structuration par l’environnement des communautés microbiennes le long des gradients (de Wit, 2007). Aux communautés autochtones viennent s’ajouter de manière transitoire, des communautés allochtones issues des apports océaniques et continentaux. Ces communautés, bien qu’en conditions non-optimales, peuvent survivre voire se développer lentement au sein des zones de transition et de ce fait participer au fonctionnement biogéochimique de l’écosystème (Figure I.5). Figure I.5 : Représentation des assemblages microbiens en zone de transition (de Wit, 2007). Au sein de la colonne d’eau, les communautés procaryotes de ces écosystèmes estuariens, peuvent présenter des populations « niche-dépendant » mais également des populations capables de coloniser une large diversité d’habitats (e.g. plus ou moins saumâtres, plus ou moins anoxiques …) comme décrits par la théorie neutre (Giovannoni et al., 1990; Morris et al., 2002; 2004). En revanche au niveau de l’habitat sédimentaire, les connaissances se réduisent à certains groupes fonctionnels particuliers, les bactéries sulfato-réductrices (Devereux and Mundfrom, 1994) ou les réducteurs d’acides humiques (Coates et al., 1999) et à certains environnements particuliers comme les sédiments sulfidogéniques (Gray and Herwig, 1996), 42 Chapitre I: Synthèse bibliographique oxiques (Li et al., 1999) ou les vases des écosystèmes tropicaux (Madrid et al., 2001; Todorov et al., 2000). Dans ce type de zone de transition la diversité procaryote est fonction de la salinité et en particulier de la variation temporelle de ce paramètre (Prieur et al., 1987, Crump et al., 2004 ). Par exemple, Dale et al. (2009) ont montré que les bactéries réalisant l’oxydation anaérobie de l’ammonium (ANAMMOX) y étaient particulièrement sensibles : les bactéries du genre Scalindua présentent un caractère ubiquiste, et sont adaptées aux fortes comme aux faibles salinités et sont résistantes aux variations saisonnières. Au contraire celles du genre Brocadia et du genre Kuenenia ne semblent être adaptées qu’aux environnements dulçaquicoles à oligohalins pour le premier et qu’aux environnements salins pour le second. 6.2.2 Principal modèle d’étude : les communautés procaryotes du Bassin d’Arcachon 6.2.2.1 Présentation du Bassin d’Arcachon Bordant la côte atlantique française, le Bassin d’Arcachon est un écosystème lagunaire de régime macrotidal situé à l’interface océan-continent. Il est donc le lieu d’un important et permanent échange d’eau entre l’Océan Atlantique et le continent ; la circulation d’eau se faisant via un réseau de chenaux, « les passes », à une vitesse moyenne de 2m/s soit 130 millions à 400 millions de m3 d’eau échangés par marée. Le Bassin d’Arcachon est le réceptacle de 3,45 millions de m3 d’eau douce par jour apportés principalement par la Leyre un affluent localisé dans la partie sud-est du bassin. Ces flux d’eau ainsi que son hydrodynamique, entraînant un faible renouvellement de ses eaux internes, induisent la formation de gradients de température et de salinité au sein du bassin (Bouchet, 1968; Fenies, 1984; Gassiat,1989 ; Auby,1991; D’Elbee et Castel 1995; Plus et al., 2009). La zone intertidale de la lagune, représentant environ deux tiers de la surface totale (110 km2), est constituée de sédiments sableux à sablo-vaseux, principalement recouverts par un herbier à zostère naine, Zostera noltii, considéré comme l’un des plus vastes herbiers de phanérogames d’Europe avec une surface de près de 45,64 km2 en 2007 (Auby et al., 2011). Zostera noltii est une magnoliophyte largement répandue dans l'Atlantique Nord, de la Suède jusqu'à la Mauritanie. Cette angiosperme est l’un des principaux producteurs primaires de cet écosystème (Auby and Labourg, 1996), et est également décrite par Blanchet (2004) comme espèce structurant les communautés de macro-invertébrés. Les fonds des différents chenaux 43 Chapitre I: Synthèse bibliographique sont quant à eux tapissés par la zostère marine Zostera marina. Les herbiers sont importants puisqu’ils interviennent en tant que stabilisateur de leur substrat en réduisant les contraintes hydrodynamiques qui s’appliquent au niveau des sédiments et en limitant les effets de l’agitation de l’eau sur le taux de remise en suspension des particules fines (Fonseca 1996 ; Gacia and Duarte, 2001 ; Neumeier, 2007). Le Bassin d’Arcachon est également un écosystème très productif qui permet une exploitation de la ressource biologique, essentiellement orientée vers la conchyliculture (16600 tonnes d’huîtres cultivées en 2009). Par ailleurs, on trouve de nombreux bivalves d’intérêts économique et écologique dans le bassin : récifs d’huîtres sauvages (65177 tonnes en 2010), palourdes (5773 tonnes en 2010), coques (tonnage non répertorié), moules (790 tonnes en 2011) ou encore crépidules (318 tonnes en 2011). Ces caractéristiques font du Bassin d’Arcachon un site à fort intérêt socioéconomique, touristique et écologique. Il apparait donc comme un modèle d’étude pertinent pour étudier la qualité d’un tel écosystème ainsi que le fonctionnement biologique de l’habitat benthique et en particulier celui des communautés procaryotes y résidant. 6.2.2.2 Les procaryotes du Bassin d’Arcachon Les procaryotes du Bassin d’Arcachon ont fait l’objet d’études préalables en particulier dans le cadre de deux grands projets européens, le programme CLEAN (The Coastal Lagoon Eutrophication and ANaerobic processes research programme, 1991-1994, Responsable, P. Caumette) et le programme ROBUST (The ROle of BUffering capacities in STabilising coastal lagoon ecosystems, 1996-1999, Responsable, R. de Wit), qui se sont intéressés à la charge bactérienne des sédiments ainsi qu’à la diversité taxonomique et à la diversité fonctionnelle des communautés procaryotes de cet écosystème. Au sein de cet écosystème, il a pu donc être mis en évidence que la densité totale en bactéries est plus importante dans les sédiments des estrans nus que dans ceux des estrans colonisés par l’herbier à Zostera noltii. Cette différence de charge bactérienne pourrait être due à la compétition entre les bactéries et les zostères, pour les ressources en matière organique (Caumette, 1996). Une diminution progressive de la charge bactérienne en fonction de la profondeur a été observée, dans les sédiments nus, et expliquée par l’accumulation de matière organique provenant de la colonne d’eau à la surface des sédiments (Caumette, 1996). En revanche, les communautés bactériennes présentaient une abondance maximale dans la zone comprise entre 1 et 3 cm de profondeur, zone correspondant à la rhizosphère des 44 Chapitre I: Synthèse bibliographique herbiers. Les racines sont à la fois une source de matière organique labile et jouent également un rôle important dans le remaniement sédimentaire, favorisant la pénétration de la matière organique vers les couches plus profondes du sédiment (Caumette, 1996). La composition en espèces des procaryotes du sédiment, a également été caractérisée au niveau d’une zone centrale du Bassin d’Arcachon (Ile aux Oiseaux) colonisée par de l’herbier à Zostera noltii. D’une part, Benlloch et al. (1995) se sont intéressés à la diversité des bactéries cultivables via une méthode de clonage/séquençage à partir d’ADN issu de colonies isolées sur gélose nutritive marine. Ces auteurs ont mis en évidence la dominance des Cytophaga, des Flexibacter et des Bacteroides, groupes ayant un rôle important dans le turnover de la matière organique. Les α Protéobactéries étaient également très représentées. Les SAR11, marine group A de Fuhrman ainsi que des bactéries d’origine continentale (Gram+ et groupe de bactéries du sol nouvellement décrit par Liesch and Stockebrand en 1992) étaient également présentes bien que plus faiblement représentées. D’autre part, Cifuentes et al., (2000) par une méthode de clonage/séquençage à partir cette fois ci, d’un extrait d’ADN issu d’un échantillon de sédiment, ont mis en évidence huit grands taxons bactériens: les α, β, δ, ε, et γ Protéobactéries, les Cytophaga, les Spirochètes et les Gram+ à haut pourcentage GC. Contrairement à l’étude portant sur les bactéries cultivables de Benlloch et al. (1995), cette étude a montré la dominance des δ Protéobactéries (44% des clones) dont 36% présentaient la capacité de réduire les sulfates. Ces bactéries sulfatoréductrices (BSR) appartenaient aux genres ou espèces Desulfospina joergensenii, Desulfocapsa sulfoexigens, Desulfovibrio, Desulfobacter, Desulfobacula et Desulfobacterium. Les γ Protéobactéries dont des Pseudomonas, des Aeromonas et des Photobacterium, formaient le second groupe dominant (27% des clones). Parmi les quinze clones d’archées présents, cinq ont été identifiés comme des Crenarchées dont trois proches de Crenarchaeum symbiosum et deux proches de clones environnementaux des sources chaudes de Yellowstone (USA). Un intérêt a également été porté sur deux activités biogéochimiques clés dans le fonctionnement de cet écosystème, la sulfato-réduction et la fixation de l’azote, via l’utilisation de techniques culturales. Les BSR étaient abondantes aussi bien en présence qu’en absence d’herbier (2.107 bactéries par cm3 de sédiments), particulièrement dans les deux premiers centimètres qui hébergaient 90% des BSR totales. Les BSR sont les témoins de la richesse en matière organique du milieu. D’autres groupes ayant une implication dans le cycle du soufre étaient également représentés : (i) les colorless sulfur bacteria, très abondantes dans le milieu (109 bactéries par cm3 de sédiment) et majoritairement présentes dans les deux 45 Chapitre I: Synthèse bibliographique premiers centimètres du sédiment (99.5%), (ii) les phototrophic sulfur bacteria, faiblement représentées par rapport aux colorless sulfur bacteria et également majoritairement présentes dans les deux premiers centimètres des sédiments (90%) et (iii) les purple sulfur bacteria qui sont des bactéries phototrophes anoxygéniques. Plusieurs nouvelles espèces de bactéries pourpres comme Thiorhodococcus minus (Guyonaud et al., 1997) ou Roseospira marina (Guyonaud et al., 2003) ont d’ailleurs été découvertes et décrites pour la première fois, dans les sédiments anoxiques du Bassin d’Arcachon. Aucune green sulfur bacteria n’a été détectée. Ces bactéries ne supportant pas l’oxygène, leur développement pourrait être inhibé par des apports importants en oxygène via les mouvements tidaux (Caumette, 1996). La fixation de l’azote a également été étudiée au niveau de l’herbier du Bassin d’Arcachon. Elle est décrite comme faible (102 à 104 bactéries par mL de sédiments) par rapport aux autres écosystèmes côtiers colonisés par des phanérogames marines (>106 bactéries par mL de sédiments). Les BSR ont été décrites comme les principaux microorganismes responsables de la fixation de l’azote (plus de 75% de l’activité). La croissance limitée des bactéries fixatrices d’azote pourrait provenir (i) d’une faible épaisseur de la zone oxique dans les sédiments, (ii) d’une faible teneur en ammonium de l’eau surnageante, (iii) de la compétition pour l’ammonium entre les bactéries hétérotrophes et les micro-organismes phototrophes, (iv) de la compétition pour l’ammonium et pour l’oxygène avec les plantes marines (v) de l’hydrodynamisme et/ou de la bioturbation, qui remettent en suspension des bactéries ou les enfouissent dans des zones anoxiques du sédiment, et enfin (vi), de l’inhibition à basse mer de cette activité par les hautes températures et par la lumière (Caumette, 1996). Bien que ces projets apportent une première analyse du fonctionnement microbien de cet écosystème, l’état des connaissances sur les procaryotes du Bassin d’Arcachon reste toutefois succinct. En effet, la plupart des approches ne concernaient que la fraction bactérienne cultivée. De plus, aucune étude ne s’est pour le moment interrogée sur la structure des communautés procaryotes incluant les communautés archéennes à l’échelle de l’écosystème, bien que l’importance de comprendre les liens entre la diversité procaryote et le fonctionnement des écosystèmes de transition soit soulignée dans plusieurs études de Wit (2007; 2008). 46 Chapitre I: Synthèse bibliographique Andreote FD, Azevedo JL, Araujo WL (2009) Assessing the 7. Réferences diversity of bacterial communities associated with plants. Brazilian Journal of Microbiology 40:417-432. Alderman DJ, Gras P (1969) “Gill disease” of Portuguese Apprill A, Marlow HQ, Martindale MQ, Rappe MS oysters. Nature 224:616-617. (2009) The onset of microbial associations in Aller RC (1994) The sedimentary Mn cycle in Long the coral Pocillopora meandrina. 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Les procaryotes forment un groupe dominant sur Terre (Whitman et al., 1998; Forney et al., 2004), et soutiennent un grand nombre de processus écologiques : minéralisation de la matière organique, production primaire, par exemple (Bissett et al., 2007; Crump et al., 2004; Hewson et al., 2006 ; Ikenaga et al., 2010; Rubin and Leff, 2007). Pourtant les lois qui régissent la distribution des procaryotes sont encore peu connues et plusieurs théories généralisatrices sur les modalités d’assemblage des communautés s’affrontent (e.g. Langenheder and Szekely, 2011). Du fait de leur taille microscopique et de la spécificité de leur mode de prolifération (dynamique des populations, plasticité métabolique) mais également de leur appréhension, en écologie, comme des groupes fonctionnels (e.g. bactéries dénitrifiantes, bactéries sulfato-réductrices), les procaryotes ont longtemps été considérés comme des organismes à part. Les théories écologiques sur la distribution des macroorganismes ne pouvaient donc, pensait-on, s’appliquer aux procaryotes. Au début du XXème siècle, les travaux de Beijerinck (1911) repris par Baas-Becking (1930), aboutissent à un axiome toujours discuté « everything is everywhere but the environment selects » (de Wit and Bouvier, 2006). Cette affirmation postule que les procaryotes ont un effectif et une capacité de dispersion importante qui rend possible leur présence dans n’importe quel environnement, mais que les contraintes environnementales locales ne favorisent que certaines espèces. La sélection par l’environnement (species sorting) à l’échelle locale est communément admise (exemple de la colonne de Winogradsky). Mais le débat oppose d’une part, la théorie de l’assemblage par la niche qui soutient que des espèces ne peuvent vivre ensemble au sein d’une communauté que si elles diffèrent entre elles dans l’utilisation des ressources et d’autre part, la théorie neutre qui soutient que les assemblages relèvent d’un ensemble de phénomènes complexes (extinction, immigration, spéciation …) incluant également une composante aléatoire (Hubbell, 2001). En revanche, l’ubiquité des espèces à l’échelle globale (« everything is eveywhere ») repris par Delong et Pace en 2001 sous le nom de théorie cosmopolite, est beaucoup plus débattue. En effet, l’avènement de la biologie moléculaire a permis de relancer l’étude de la diversité procaryote avec une capacité analytique indéniablement plus adaptée (cultivables et non-cultivables, cadence de traitement des échantillons). Contredisant l’idée d’un cosmopolitisme des espèces procaryotes, des études suggèrent l’existence d’une biogéographie de ces espèces c'est-à-dire l’existence d’une dispersion des espèces soumises à des barrières géographiques conditionnant leur spéciation. Ce processus produisant une répartition inégale des espèces (ici les OTU) dans l’ensemble des 65 Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments biotopes est perceptible expérimentalement, par une augmentation de la dissimilarité des communautés procaryotes en fonction de la distance géographique notamment (Green and Bohannan, 2006; Fulthorpe et al., 2008). Une « aire de répartition » serait donc observée, bien que plus faible et plus difficile à mettre en évidence que chez les macro-organismes (Green and Bohannan, 2006). Cependant, les connaissances sur la biogéographie des communautés procaryotes est encore limitée et en particulier dans les sédiments benthiques côtiers. C’est dans ce contexte que nous avons développé les travaux présentés dans ce chapitre. Références Bissett A, Burke C, Cook PLM, Bowman JP (2007) Bacterial Hewson I, Steele JA, Capone DG, Fuhrman JA (2006) Temporal community shifts in organically perturbed sediments. and spatial scales of variation in bacterioplankton Environmental Microbiology 9: 46-60. assemblages of oligotrophic surface waters. Marine Crump BC, Hopkinson CS, Sogin ML, Hobbie JE (2004) Ecology Progress Series 311: 67-76. Microbial biogeography along an estuarine salinity Hubbell SP (2001) The unified neutral theory of biodiversity and gradient: combined influences of bacterial growth biogeography. Princeton Monographs in Population and residence time. Applied and Environmental Biology. Princeton University Press, Princeton, NJ, Microbiology 70: 1494-1505. 448 pp. DeLong EF, Pace NR (2001) Environmental diversity of bacteria Ikenaga M, Guevara R, Dean A, Pisani C, Boyer J (2010) and archaea systematic biology. 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En effet cet écosystème est une zone d’écotone entre les écosystèmes marins côtiers (Golfe de Gascogne) et les écosystèmes continentaux aquatiques et terrestres (bassins versants de ses affluents dont La Leyre). Cette zone d’interface océan-continent est géographiquement délimitée et orientée par l’entrée des masses d’eau marine sous l’influence du flux tidal à l’ouest, et une entrée principale d’eau continentale à l’est. On y décrit traditionnellement un gradient de confinement croissant d’ouest en est. C’est enfin une zone de sédimentation où les processus benthiques intègrent le fonctionnement hydrobiogéochimique de la lagune. Pour cette étude, nous avons saisi l’opportunité de coupler nos mesures à celles d’une étude visant à améliorer notre connaissance de l’origine et de la qualité de la matière organique au sein des sédiments de la lagune, cause attendue de la structuration des communautés que nous étudions. Ce travail est présenté sous forme d’un projet d’article en préparation pour publication. 67 Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments 68 Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments TITLE: Bacterial and archaeal diversity patterns in the Arcachon Bay’s surface sediments Author names: Guillaume Meisterhans1, Florence Jude-Lemeilleur1, Sophie Dubois1, Natalie Raymond1, Martin Plus2, Hugues Blanchet1, Antoine Grémare1, Nicolas Savoye1, Frédéric Garabetian1 1 Université de Bordeaux UMR 5805 EPOC Bordeaux F-33000 France. 2 IFREMER, LER/AR, Quai du Cdt Silhouette, 33120 Arcachon, France M. Plus2 ([email protected]) E-mail Addresses: G. Meisterhans1 ([email protected]), H. Blanchet1 ([email protected]) 1 F. Jude-Lemeilleur ([email protected]) A. Grémare1 ([email protected]) S. Dubois1 ([email protected]) N. Savoye1 ([email protected]) N. Raymond1 ([email protected]) F. Garabetian1 ([email protected] Abstract: Prokaryotic communities play a major ecological role in marine sediments but the drivers of diversity patterns at large spatial scale are yet poorly documented. In transitional waters both marked biogeochemical gradients (habitat hypothesis) and species dynamics within an ecotone (biogeographic hypothesis) could affect spatial diversity patterns. To address this question, triplicate sediment cores were collected on April and September 2009, in 29 stations distributed among the various habitats of a macrotidal lagoon located on the French Atlantic coast. Bacterial and archaeal assemblage compositions were assessed by Automated Ribosomal Intergenic Spacer Analysis (ARISA) and 16S rDNA based Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism (T-RFLP), respectively. Data were analyzed together with contextual environmental data using PRIMER 6 statistical software. This study highlights the low gamma diversity of prokaryotic communities in Arcachon Bay sediment that could be explained by the relative homogeneity of the habitat due to sediment reworking by hydrodynamics. Consequently, only two prokaryotic sub-communities were differentiated in April as in September by emersion frequency and granulometric parameters. A next step in these investigations would be to determine the metabolic activities associated with these different sub-communities. Keywords: microbial assemblages; benthic biocenosis; transient ecosystem; molecular diversity 69 Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments 70 Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments Introduction The ocean is the main organic carbon reservoir with more than 95% of total carbon on earth (Watson and Orr, 2003). Part of the available fraction of this organic matter (OM) is respired by bacteria (Robinson and Williams, 2005) which have long been assigned the role of OM remineralizers (Cho and Azam, 1988). Thanks to their ecological importance bacteria deserved special attention for studying the assemblages’ abundances, activity, and more recently, structure using 16S ADNr culture-independent tools (Nealson, 1997). As a distinct phylogenetic group archaea proved to share most oceanic biota with bacteria (e.g. De Long, 1992) and it is now admitted that bacteria and archaea form taxonomically diverse and metabolically complex assemblages in most marine biota (Karl, 2007). Considering the entire community dynamics and their drivers appears as an important key to understand the ecosystem functioning. Sediments are the ultimate receptacle of the oceanic organic matter fuelling a variety of ecological and biogeochemical processes (Middleburg and Meysman, 2007). Inside, bacterial and archaeal populations are the catalysts of various conversions forming assemblages which are seemingly structured by local drivers, mainly redox gradients, linked to organic matter diagenesis (Froelich et al. 1979; Berner 1980) and reshaped by bioturbation (Aller and Yingst, 1985; Bertics and Ziebis, 2009; Pischedda et al. 2011). This fits to the niche assembly theory which asserts that species live together in a community only when they differ from one another in resource uses. As an alternative to the niche assembly theory, Hubbell and other ecologists introduced a neutral model (Hubell, 2001; Zhou and Zhang 2008). They argued that the number of species in a community is controlled by species extinction and immigration or speciation of new species. Both species sorting and neutral processes affect the assembly of bacterial communities, the observation scale determining the respective contributions of the species assembly mechanisms (Langenheder and Szekely, 2011). Studies to assess the link between bacterial community diversity patterns in sediments and environmental parameters were conducted only few years ago (Bertics and Ziebis, 2009; Boer et al., 2009; Hewson et al., 2007; Ikenaga et al., 2010; Lasher et al., 2009; Sapp et al., 2010). However to date, archaeal community diversity patterns are still poorly documented (Singh et al., 2010, Danovaro et al., 2009). 71 Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments Due to high interactions between abiotic and biotic parameters, and the difficulty to quantify all of them the description of the prokaryotic habitat heterogeneity at large spatial or temporal scale turns out to be difficult. Transitional environments represent relevant models to question the influence of environmental parameters on prokaryotic community structure, since environmental gradients such as salinity, continental discharges, sedimentation - erosion zones, generate a high spatial heterogeneity (de Wit, 2007). Previous studies on estuarine bacterioplanktonic community showed not only the presence of niche dependent bacterial phylotypes but also phylotypes occurring in a broad range of habitat agreeing the neutral assembly theory of bacteria (Giovannoni et al., 1990; Morris et al., 2002; 2004). In estuarine sediments, previous studies focused on particular functional bacterial group (e.g. denitrifying bacterial communities) (Scala and Kerkhof, 2000; Burns et al., 2002; Bowman et al., 2005) or on particular environment (Madrid et al., 2001; Todorov et al., 2000) but few at a large spatial-scale (Hewson et al., 2007). In the Arcachon Bay, a temperate macrotidal lagoon on the French Atlantic coast, a low 16S rDNA bacterial clone diversity was reported in the plankton collected in single central site as compared to a Mediterranean lagoon (Benlloch et al., 1995). The clone library mainly included sequence related to Cytophaga, Flexibacter, Bacteroides and alpha Proteobacteria. In the sediments of the Arcachon Bay Zostera noltii meadow, a broad diversity of sulphate-reducing bacteria and the occurrence of archaeal clones was reported (Cifuentes et al., 2000). No study questionned the entire prokaryote community structure at the ecosystem-scale despite its importance for ecosystem functioning (de Wit, 2007; 2008). To address this question, bacterial and archaeal genetic diversity patterns were assessed using molecular fingerprinting approaches [Automated Ribosomal Intergenic Spacer Analysis (ARISA) and Terminal-Restriction Fragment Length Polymorphism (T-RFLP)], respectively, on 29 sites in the Arcachon Bay that were visited twice. Fifteen contextual environmental parameters were (i) to describe, at ecosystem-scale, the benthic bacterial and archaeal community patterns again contrasted benthic macro-invertebrate habitats and (ii) to assess the habitat specificity of prokaryotic communities linked with environmental factors known to control their patterns. 72 Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments Materials and methods Study site: Arcachon Bay The Arcachon Bay (44°40’N, 1°10’W) is a 180-km2 semi-sheltered macrotidal lagoon on the French Atlantic coast. This transitional ecosystem is strongly impacted by oceanic and continental inputs depending on season and/or location. Atlantic oceanic-water inputs are about 384 106 m3 for spring tide cycles and annual mean fresh-water inputs 3.2 106 m3.d-1 (Plus et al., 2009). The major tributary (85%) is the River Leyre forming an internal delta in the bay southern corner while 17 other tributaries form the remaining 25% of freshwater hydric flux (Plus et al., 2009). Hydraulic and hydrodynamics control the dynamics of nutrients (Rimmelin et al., 1998; Deborde et al., 2008) and sediments (Ganthy et al. in press), leading to the formation of various habitats (e.g. Bouchet 1995, Blanchet, 2004). At low tide a so-called intertidal area of 115 km2 is emerged and differenciated from the remaining 65 km2, forming the subtidal area. About 46 km2 of the 115 km2 intertidal area are covered by Zostera noltii meadow, a dominant primary producer in this ecosystem (Auby et al., 2011) that seasonnaly stabilizises surface sediments (Ganthy et al., 2011). Finally, depending on the spatial location, sediment composition can be affected by various factors like freshwater inputs or resuspension processes. Sampling design and operations In April and September 2009, sampling operations based on a 29-sites selection where conducted on board of R/V Planula IV by a multidisciplinary team aiming to study simultaneously the origin and composition of sediment organic matter (Dubois et al., 2011); the spatial patterns of Zostera noltii and benthic macrofauna biomasses (in prep) and the bacterial and archeal community dynamics (this study).Site selection aimed to investigate most of the habitats of the Arcachon Bay. Habitats were defined a priori based on a simplified cartography of the benthic macro-invertebrates communities from Blanchet (2004) (Figure 1A). 73 Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments A Intertidal Zostera noltii community Intertidal low-level muddy sand and sandy mud community Intertidal inner high-level sand community with reduced salinity Subtidal sandy mud and muddy sands community Subtidal muds and community Subtidal high-energy sand community B T V S GV GH H GS E N I F L Q P O R M A B CS K CV CH PHI D J X Y Z Figure 1: Choice of the 29 sampling sites in Arcachon Bay. A: Cartography of the benthic biocenoses drawn based on the structure of the benthic macro-invertebrates communities in Blanchet (2004). B: Localization of sites within the bay: black boxes indicate that the sites are in subtidal areas, white boxes in intertidal areas. The primary clustering factor was tide, discriminating subtidal communities (12 sites) and intertidal communities (17 sites). Subtidal communities were differentiated based on the sediment granulometry (i) the subtidal low-level muddy sand and sandy mud community (7 sites: B, CS, F, GS, I, J and L) (ii) the subtidal mud community (4 sites: A, D, E, and H) and (iii) subtidal high-energy sand community (1 site: K) (Figure 1B). The sediment type and the occurrence of seagrass meadow discriminated intertidal communities: (i) the intertidal inner high-level sand community with reduced salinity (2 sites: PHI and Z), (ii) the intertidal low-level muddy sand and sandy mud community (9 sites: CV, GV, O, S, R, T, V, X and Y) and (iii) the intertidal Zostera noltii community (6 sites: CH, GH, M, N, P and Q). The set of sampled sites covers most of the internal part of the lagoon. The distances between the closest 74 Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments and most far away sites are about 20 m (GH vs GV) and 14km (T vs Z), respectively. For Zostera noltii and macro-invertebrate biomass assessment, sediment samples were collected using a hand-core sampler (0.4 m2) or a Van Veen sampler (0.1 m²) for intertidal and subtidal sites respectively. For the microbiological analyses, the surface sediments (top 5mm) were sampled as triplicate cores (diameter = 28.6 mm) collected manually by foot (intertidal sites) or SCUBA diving (subtidal sites) within a 5m² area with truncated sterile 50 mL syringes. Set of environmental variables Different contextual environmental parameters were assessed (Table 1). The sediment granulometry (median particle grain-size, pelite content and Trask index), the sediment content in water or organic matter (sediment particulate organic carbon content (SOC), sediment particulate organic nitrogen content (SON), the sediment Chlorophyll a content (Chla) were analyzed by standard methods as described in Dubois et al. (2011). Accordingly, parameter ratios (SOC/Chl.a, C/N ratio) were calculated to assess qualitative aspect of the sediment organic matter. For Zostera noltii and macro-fauna, biomasses were determined as ash-free dry weight (afdw) after desiccation (60°C, 48h) and calcinations (550°C, 2h). Sediment oxic/reduce interface was determined by measuring with a graduated rulerthe depth of oxic layer in the sediment cores. Salinity, temperature, current speed and emersion percent data were outputs of the MARS (Model for Applications at Regional Scale) hydrodynamic model developed for Arcachon Bay by IFREMER (Plus et al., 2009). A detailed description of the model is provided in Lazure and Dumas (2008). In this model, cell dimensions are 235 x 235 m. Consequently each site is located in a different cell allowing the estimation of the different parameters’ annual medians for 2009. 75 Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments Table 1: Description of Arcachon Bay's sampling sites including GPS localization, hydrodynamical characterization, physico-chemical properties of surrounding water, sediment properties and abundances or biomasses of sediment living organisms. “afdw” was used for ash-free dry weight and “dw” for dry weight. Site Longitude Lambert Latitude Lambert Emersion Water current Salinity frequency velocity median median Water temperature median Annual Annual Annual Annual % m∙s-1 ‰ °C A 328721.659 1972211.34 0.0 0.15 29.14 16.59 B 327807.89 1970919.413 0.0 0.22 30.66 16.59 CH 329150.438 1969963.117 51.5 0.01 30.32 16.23 CS 327201.869 1969953.559 0.0 0.22 30.97 16.55 CV 328946.541 1970721.358 22.07 0.08 30.05 16.51 D 327429.82 1968659.983 0.0 0.18 29.86 16.54 E 323271.055 1975728.881 0.0 0.16 30.44 16.43 F 324072.462 1972866.398 0.0 0.24 31.13 16.57 GH 321663.704 1974767.367 27.7 0.09 31.45 16.47 GS 321833.31 1974064.179 0.0 0.15 31.35 16.48 GV 321619.416 1974841.691 5.7 0.11 31.36 16.60 H 326880.743 1974820.032 0.0 0.17 29.94 16.51 I 325612.308 1973315.858 0.0 0.24 30.42 16.57 J 324476.947 1968222.267 0.0 0.14 31.51 16.53 K 323122.852 1969836.762 0.0 0.39 32.56 16.46 L 319672.003 1970215.577 0.0 0.12 32.98 16.24 M 324955.526 1970605.123 18.7 0.12 32.01 16.54 N 324877.047 1974158.906 31.5 0.11 30.43 16.73 O 325468.442 1972338.172 26.0 0.10 30.67 16.62 P 327459.274 1973112.299 28.5 0.09 29.49 16.60 PHI 332895.843 1969780.966 28.5 0.06 20.44 16.26 Q 328965.908 1973354.427 31.6 0.10 28.59 16.54 R 322678.4 1971685.526 35.3 0.09 31.92 16.58 S 321893.505 1975766.182 33.6 0.12 31.25 16.53 T 323037.007 1976887.489 33.0 0.07 30.70 16.56 V 325521.876 1976573.328 29.8 0.09 29.54 16.45 X 326676.097 1968527.918 21.6 0.13 30.76 16.44 Y 328540.515 1968904.558 12.9 0.18 29.42 16.47 Z 331731.942 1966846.523 46.4 0.02 26.26 16.84 76 Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments Table 1(continued): Site SOC content SOC content /Chl a SON content C:N ratio April September April September April September April % % % ∙ µg-1 % ∙ µg-1 % % A 2.13 3.21 0.09 0.13 0.34 0.34 6.32 September Sediment oxic/reduce interphase April September cm cm 0.06 0.0 2.0 B 0.09 0.51 0.14 0.83 0.01 0.05 1.85 0.03 0.0 0.0 CH 0.57 1.04 0.04 0.07 0.06 0.11 5.18 11.10 2.0 2.5 CS 0.68 0.87 0.24 0.31 0.08 0.09 7.56 11.70 3.0 1.0 CV 1.23 1.04 0.13 0.11 0.13 0.11 11.18 11.40 3.0 2.5 D 0.21 0.08 0.10 0.04 0.02 0.01 26.71 0.00 4.5 0.0 E 0.54 0.26 0.16 0.08 0.06 0.02 21.61 0.00 2.5 3.5 F 0.17 0.14 0.06 0.05 0.02 0.01 11.95 0.00 1.0 3.0 GH 0.30 0.63 0.04 0.09 0.04 0.06 5.00 11.40 2.0 0.0 GS 0.44 1.07 0.14 0.35 0.05 0.12 3.67 12.20 5.0 0.0 GV 0.14 0.29 0.03 0.06 0.02 0.03 4.67 11.30 6.0 0.0 H 0.39 0.17 0.15 0.06 0.04 0.02 22.24 0.00 2.5 0.5 I 0.13 0.36 0.07 0.18 0.01 0.03 3.78 0.01 0.0 0.0 J 1.97 0.66 0.18 0.06 0.23 0.06 30.45 0.00 1.0 3.0 K 0.11 0.20 0.08 0.16 0.01 0.02 6.33 0.00 2.0 2.0 L 1.49 1.15 0.17 0.13 0.13 0.12 12.01 0.01 5.0 4.0 M 0.74 1.87 0.08 0.20 0.08 0.19 3.97 0.05 2.0 0.0 N 0.87 2.93 0.06 0.19 0.12 0.33 2.60 0.15 2.0 0.0 O 0.58 0.62 0.07 0.07 0.06 0.06 9.63 0.01 2.0 2.0 P 3.22 1.83 0.57 0.32 0.31 0.18 17.89 0.01 1.0 2.0 PHI 0.58 1.13 0.08 0.16 0.05 0.12 4.72 0.03 0.0 1.0 Q 1.78 2.83 0.31 0.49 0.20 0.30 5.95 0.06 2.0 2.5 R 0.63 1.93 0.09 0.29 0.07 0.23 2.74 0.10 0.0 0.0 S 3.58 3.56 0.06 0.06 0.39 0.39 9.15 0.05 4.0 3.0 T 1.85 2.37 0.12 0.16 0.21 0.26 7.00 0.04 3.0 2.5 V 3.34 3.97 0.42 0.50 0.36 0.40 8.28 0.06 0.0 0.0 X 0.42 0.22 0.04 0.02 0.05 0.02 17.52 0,00 0.0 0.0 Y 2.19 1.92 0.30 0.26 0.22 0.19 11.78 0.02 0.5 1.0 Z 3.43 1.73 0.13 0.07 0.37 0.18 19.47 0.01 5.5 3.5 77 Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments Table 1 (continued): Site Water content April September Particle grain-size median April September µm µm Trask index April September Pelite content April September % % A 0.80 0.67 18.1 16.8 2.41 2.33 0.81 0.84 B 0.06 0.36 462.8 25.9 1.27 3.25 0.01 0.68 CH 0.42 0.39 24.6 50.4 2.96 3.35 0.72 0.55 CS 0.38 0.39 19.6 110.8 2.63 3.61 0.77 0.4 CV 0.55 0.39 22,0 57.9 2.64 3.2 0.77 0.52 D 0.20 0.19 407.5 288.6 1.39 2.82 0.15 0.2 E 0.35 0.23 256.2 351.8 3.18 1.30 0.28 0.26 F 0.44 0.22 338,0 165.0 1.30 1.59 0.14 0.09 GH 0.3 0.30 112.2 150.8 2.75 2.44 0.35 0.19 GS 0.45 0.35 131.8 215.2 2.82 1.34 0.34 0.23 GV 0.23 0.24 145.1 393.2 2.97 4.64 0.32 0.12 H 0.30 0.22 429.4 258.0 1.39 1.36 0.18 0.31 I 0.09 0.38 320.9 13.3 1.26 2.48 0.03 0.15 J 0.48 0.67 12.6 311.0 2.08 1.25 0.91 0.83 K 0.09 0.21 276.3 105.4 1.19 2.79 0.02 0.03 L 0.72 0.51 14.2 94.4 2.65 3.08 0.81 0.36 M 0.17 0.58 21.7 33.6 3.03 3.82 0.72 0.4 N 0.36 0.56 20.3 118.5 2.94 3.10 0.73 0.59 O 0.40 0.40 83.8 19.9 3.13 2.93 0.43 0.36 P 0.76 0.44 18.2 19.3 2.36 2.78 0.82 0.74 PHI 0.25 0.33 25.7 21.7 3.46 2.88 0.67 0.76 Q 0.50 0.63 17.1 87.1 2.45 3.62 0.81 0.73 R 0.31 0.34 65.9 24.3 3.22 2.64 0.49 0.43 S 0.68 0.70 17.1 25.4 2.19 2.92 0.85 0.74 T 0.38 0.52 21.3 30.2 2.78 2.35 0.74 0.7 V 0.76 0.68 25,0 89.4 2.34 3.87 0.77 0.73 X 0.30 0.22 129.1 261.2 3.53 1.52 0.35 0.07 Y 0.47 0.57 17.7 19.5 2.31 2.52 0.83 0.8 Z 0.80 0.59 21.3 41.5 2.58 4.13 0.77 0.58 78 Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments Table 1 (continued): Site Macrofauna organism biomass Zostera noltii biomass April April -2 Prokaryotic abundance April September -2 g (afdw) ∙ m sediment mg (dw)∙ m sediment A 1.23 0 1.64 1.03 B 0.62 0 1.65 1.37 CH 14.78 14.5 2.57 2.03 CS 5.22 0 1.85 1.23 CV 15.11 0 3.41 2.49 D 12.19 0 1.93 2.69 E 9.82 0 4.2 2.07 F 5.53 0 3.22 2.42 GH 28.25 15.1 4.57 3.55 GS 7.67 0 2.44 1.44 GV 6.51 0 3.66 3.51 H 2.04 0 3.98 4.74 I 2.87 0 6.76 2.84 J 12.23 0 2.9 2.51 K 1.18 0 1.91 1.82 L 18.53 0 1.58 1.55 M 10.91 3.6 5.17 1.93 N 6.56 17.8 5.7 1.57 O 21.14 0 5.49 2.64 P 11.26 2.4 1.79 3.44 PHI 5.29 0 5.77 1.99 Q 113.15 25.1 3.07 1.98 R 16.9 0 5.3 6.24 S 2.28 0 4.22 1.67 T 1.46 0 4.21 4.2 V 7.31 0 5.17 2.49 X 1.35 0 1.64 2.14 Y 6.2 0 1.64 2.08 Z 12.4 0 2.88 1.5 79 8 -1 x 10 cell.g (dw) sediment Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments Bacterial and archaeal abundances Sample preparation for storage was conducted in the lab, within 6 h after sample collection. Triplicate 1 mL sediment samples taken from the top 5mm of the core were mixed with 1 mL of formalin (3.7% final) and stored at -80°C until analysis. From formalin preserved samples, prokaryotes were desorbed from sediment particles using a protocol modified from Duhamel and Jacquet (2006). Tween 80 (0.5% final) and sodium pyrophosphate (0.1% final) were mixed with the sample by gentle shaking (30 min, 720 rpm) the suspension was then sonicated (ultrasonic bath, 20 min). Finally cellular fractions containing prokaryotes were purified using a migration on Gentodenz density gradient (1.310 g.mL-1) according to Amalfitano and Fazi (2008). Cellular fractions were preserved in formalin (3.7% final) at -80°C until flow cytometry analysis in the Plateforme CytométrieImagerie (Observatoire Océanologique de Banyuls sur Mer, http://www.obs-banyuls.fr/pci/). Extemporaneously, cellular fractions were diluted in filtered seawater (1:100 v/v) and were stained during 10 min with SYBR® Green I (50 µl. mL-1; 25X, Molecular Probes, Invitrogen Cergy Pontoise, France). Then a standard 0.97 µm fluorescent bead suspension was added as internal reference to each sample before running, at low flow rate (10 µL.min-1), allowing a single-cell analysis (Amalfitano and Fazi, 2008). Data were acquired by CellQuest software (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ USA). Cytogram analysis provided event numbers, identified as prokaryotic cell numbers, during the count time (1 min). Counts were subsequently normalized to flow rate and to the mass of extracted sediment to calculate a density as number of prokaryotic cells per gram of sediment. Bacterial and archaeal fingerpinting ARISA and T-RFLP were used for assessing bacterial and archaeal diversity patterns respectively. ARISA is known to be more efficient than T-RFLP for the determination of bacterial diversity (Danovaro et al., 2006), but cannot be applied to archaea, as most of them are known to have no ITS region (Danovaro et al., 2009). Sample preparation for storage was conducted in the lab, within 6 h after sample collection. Triplicate1 mL sediment samples taken from the top 5mm of the core were mixed with 2.5 mL of preservative buffer (100 mM Tris-HCl [pH 8.0], 100 mM Na EDTA [pH 8.0], 1.5 M NaCl and 1% [wt/vol] cetyltrimethylammonium bromide) (Zhou et al., 1996). 80 Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments DNA was extracted from 700µL of preserved buffer samples, using a bead beating method (FastPrep and lysis matrix E; 5.5 m∙s-1; 30 s twice, MP Biomedicals, Illkirch, France) coupled to UltraClean® Soil DNA Isolation Kit (MO BIO Laboratories, Inc., Carlsbad, CA, USA). For each sample the amount of DNA was determined by spectrofluorimetry (LS 55, PerkinElmer, Courtaboeuf, France) using SYBR® Green I (Molecular Probes, Invitrogen, Cergy Pontoise, France), and quantified using DNA standard 1mg∙mL-1 solutions of calf thymus DNA (Sigma Aldrich, St. Quentin Fallavier, France). Sediment bacterial community diversity patterns were assessed using the PCR-based whole-community fingerprinting approach ARISA of bacterial DNA (Fisher and Triplett, 1999). ARISA amplifies the Intergenic Transcribed Spacers (ITS) between the 16S and 23S rRNA genes using a fluorescent primer and the ITS size represents the operational taxonomic unit (OTU). Results are displayed as the amount of different PCR products of specific fragment length (ITS size). For each sample, the ARISA amplification step was conducted in triplicates. The amplification was run according to Ranjard et al. (2000) using universal bacterial primers SDBact (5’-TGC GGC TGG ATC CCC TCC TT-3’ labelled at the 5’ end with the phosphoramidite dye 5-FAM fluorochrome) (Normand et al., 1996) and LDBact (5’-CCG GGT TTC CCC ATT CGG-3’) (Normand et al., 1996) (Molecular Probes Invitrogen Cergy Pontoise, France) with the following conditions: (i) 94°C for 5 min; (ii) 35 cycles of 94°C for 1 min, 55°C for 1 min, 72°C for 1 min, and then (iii) 72°C for 5 min. The 25 µLreaction mixtures contained 1 x PCR buffer, 1.5 mM MgCl2, 0.3 mg∙mL-1 of bovine serum albumin (MP Biomedicals, Illkirch, France), 5% of DMSO, 0.2 mM of each dNTP, 0.1 µM of each primer, 1U of Taq polymerase (Promega, Charbonnières-les-Bains, France) and 10 ng of template DNA. ARISA amplified products were purified using a QIAquick PCR Purification Kit (QIAgen, Courtaboeuf, France) and quantified by spectrofluorimetry as for extracted DNA. Sediment archaeal community diversity patterns were assessed using another PCRbased whole-community fingerprinting approach, the T-RFLP. T-RFLP amplifies partial 16S ribosomal RNA genes (16S rDNA) using a fluorescent primer. The amplified products were digested by restriction enzyme which generates T-RFs (Terminal - Restriction Fragments). The T-RFs size represents the operational taxonomic unit (OTU). For each sample, the T-RFLP amplification step was conducted in triplicates. The amplification was run according to Gantner et al. (2011) with modifications and using archaeal primers 340F (5′-CCCTAYGGGGYGCASCAG-3′ labelled at the 5’ end with the phosphoramidite dye 81 Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments 5-FAM fluorochrome) (Gantner et al. 2011) and 1000R (5′-GGCCATGCACYWCYTCTC-3′) (Gantner et al. 2011) (Molecular Probes Invitrogen Cergy Pontoise, France) with the following conditions: (i) 98°C for 2 min; (ii) 35 cycles of 95°C for 30 sec, 57°C for 30 sec, 72°C for 90 sec, and then (iii) 72°C for 7 min. The 25 µL-reaction mixtures contained 1 x PCR buffer, 2 mM MgCl2, 3.3 mg∙mL-1 of bovine serum albumin (MP Biomedicals, Illkirch, France), 0.8 mM of each dNTP, 0.5 µM of each primer, 0.8U of Taq polymerase (Promega, Charbonnières-les-Bains, France) and 100 ng of template DNA. About 50 ng of 16S rRNA gene amplicons from each of the three triplicate PCR were digested separately at 37°C for 4 h in a 20 µl reaction volume that contained 5 U of the restriction endonuclease AluI (Promega, Charbonnières-les-Bains, France), selected as Luna et al. (2009) demonstrated that it is highly efficient in assessing archaeal phylotype richness in benthic assemblages. Restriction digestions were stopped by incubation at 65°C for 20 min, and samples were then kept frozen at -20°C until analysis. Then, triplicates digested amplification products were pooled together and purified using a QIAquick Nucleotide Removal Kit (QIAgen, Courtaboeuf, France) and quantified by spectrofluorimetry as for extracted DNA. Ten ng of bacterial ARISA or 1µL of archaeal T-RFLP purified products from each sample were combined separately with 10 µL Hi Di formamide and an ARISA internal LIZ1200 or T-RFLP LIZ600 standard (Applied Biosystems Ltd, Courtaboeuf, France) before being heat treated (95°C, 5 min) and cooled on ice. ARISA or T-RFLP runs were performed on a 3730XL Capillary Genetic Analyser (Applied Biosystems Ltd, Courtaboeuf, France), using a 50 cm capillary and standard Genemapper protocol, which detects the relative abundance of different sized labelled PCR products (Plateforme Genome-Transcriptome Pierroton INRA, Bordeaux-Aquitaine, www.pierroton.inra.fr/biogeco/site_pole_agro/genoseq.html). Results were read using the ABI Peak scanner software provided by Applied Biosystems (Courtaboeuf, France) where each profile of peaks in an electrophoregram defines bacterial or archaeal diversity fingerprint. Fluorescence data (peak areas and peak sizes) were exported to Microsoft Excel to allow the data analysis. Peak size values were rounded to the nearest whole number and ARISA peaks with a size inferior to 200 bp and T-RFLP peaks with a size inferior to 35 bp were considered as noise and excluded for analysis. Data were also transformed to abundance matrix. 82 Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments Statistical analyses As bacterial and archaeal diversity analyses were performed on triplicate for each site, the three fluorescence intensities of each OTU per site were averaged to construct a bacterial and an archaeal OTU average relative abundance matrices. These 2 matrices were also laid end to end to generate a prokaryotic relative abundance matrix. From these matrices, Bray-Curtis similarities (BC) between sites were calculated from Primer software (PRIMER-E Ltd, Lutton, UK) according the following equation – – where OTUi,a is OTUi relative abundance in sample A and OTUi,b is OTUi relative abundance in sample B. Similarities were represented on non-multidimensional scaling (MDS) (Clarke and Warwick, 2001) On each MDS chart, every prokaryotic community was represented as one plot and the relative changes in community structure as the distances between the points. A stress value less than 0.2 indicates a good representation of the BC distances between samples. Agglomerative hierarchical clustering based on Bray-Curtis similarity matrix was performed using Primer software to generate dendrogram showing the similarity among samples and allowing the determination of non a priori groups of sites. Statistical differences between a priori groups were tested using ANalysis Of SIMilarity (ANOSIM) a random permutation tests (Monte-Carlo test, 100,000 permutations) performed from similarity matrix (Kropf et al., 2004). An accumulation curve and the associated regression curve based on MichaelisMenten equation was also designed a posteriori from the relative abundance matrix of all samples using Primer software. To estimate the diversity-level of each site, the Simpson indexes (D) were calculated as following: D = (SUM(NS/NT)2) where NS represents the relative abundance of one OTU and NT the total number of OTU of the site. To compare differences between group in term of prokaryotic abundance, OTU richness or environmental data, Mann-Whitney tests were used when the set of data were unpaired and Wilcoxon when the set of data were paired. Tests were performed using the macro-command Merlin on Microsoft Excel software. 83 Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments SIMPER analysis was used to identify the OTU that contributed to the discrimination of sites allowing cluster differentiation. The overall significance of the difference between clusters is assessed by ANOSIM. The Bray-Curtis similarity measure is implicit to SIMPER. BIOENV analyses were used to find the combination that ‘best explains’ the OTU community patterns from a set of environmental parameters. BIOENV is based on the multiple correlations of Bray-Curtis similarities of community data and Euclidean distances of environmental data. The correlations reveal a combination of environmental variables that is more correlated to community similarity matrix. The Spearman R correlation coefficient of this test illustrates the strength of relationship. This analysis requires excluding strongly correlated parameters (R > 0.95) and the normalization of environmental data. Therefore, Spearman correlations among environmental parameters were tested using the macrocommand Merlin on Microsoft Excel software in order to validate the environmental parameter selection prior to run the BIOENV analysis. Significance of tests and correlation was considered at 5% level i.e. p value ≤ 0.05. RESULTS The set of 29 sites selected in the inner part of Arcachon Bay provided contrasted subsets of physical and biogeochemical conditions regarding (Table 1): the emersion frequency, null for subtidal sites and ranging from 5.7 % (GV) to 51.5 % (CH) for intertidal sites ; median annual salinity ranging from 20.44 psu (PHI) to 32.98 psu (L) ; sediment granulometry e.g. median particle grain size ranging from 12,6 (J in April) to 462.8 (B on April) and the C:N ratio which is below detection limit for 7 sites and peak up to 30.5 (J in April). In April when data were avalaible, in intertidal area, 6 sites (CH, GH, M, N, P and Q) were colonized by Zostera noltii with densities ranging from 2.4 mg m-2 sediment at P to 25.1 mg m-2 sediment at Q. No R-value of Spearman correlation higher than 0.95 was found among the selected parameters; as a consequence all the parameters could be kept to implement the BIOENV analyses. Abundances of prokaryotic cells ranged from 1.6 (L) to 6.8 108 cell.g-1 (I) in April and were significantly higher than September abundances which ranged from 1.0 (A) to 6.2 (R) 108 cell.g-1 (Wilcoxon, p < 4 10-3) (Table 1). Neither significant difference of abundances was 84 Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments observed among benthic macro-invertebrate habitats described in Blanchet (2004), nor between bare and Zostera noltii colonized sediments (Mann-Whitney, p > 0.05). Considering the whole set of samples collected in the 29 sites on the two sampling occasions, a total of 739 prokaryotic OTU was found ranging from 200 to 1196 bp size and 33 to 649 bp size for bacteria and archaea, respectively. Among them, 440 bacterial and 258 archaeal OTU were detected in April and 356 bacterial and 244 archaeal OTU in September. While most of the OTU (76%) were detected on both sampling occasion, significant differences were found between April and September prokaryotic communities (ANOSIM, R = 0.731, p < 0.001%). April and September community data were considered as temporal duplicates and analyzed separately hereafter. Accumulation curves, based on Michaelis-Menten regression, showed that a mean sampling of 6 sites in triplicate permits to estimate more than 75 % of theoretical total OTU richness of this ecosystem except for archaeal communities in April which required the sampling of 8 sites (Figure 2). Numbers of different OTU observed 450 375 300 225 150 75 0 5 10 15 20 25 30 35 Numbers of replicate samples Figure 2: OTU-accumulation curves Triangles and boxes with error bars represent the averages and SD of observed bacterial and archaeal OTU respectively as the samples are accumulated. These averages were obtained from 100,000 permutations of 29 relative abundance matrices of OTU. Curves represent the curve regressions based on Michaelis-Menten equation. Black and gray symbols represent April and September data respectively. 85 Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments At site-scale, sediments harbored in April, a significant higher bacterial (S = 187 ± 27 OTU cm-3; D = 0.04 ± 0.01) than archaeal (S = 79 ± 18 OTU cm-3; D = 0.1 ± 0.09) OTU richness (S) and Simpson diversity (D) (Wilcoxon test, p < 0.05); in September too, with S values of 148 ± 25 and 98 ± 20 OTU cm-3 and D values of 0.04 ± 0.01 and 0.1 ± 0.07 for bacterial and archaeal communities respectively (Wilcoxon test, p < 0.05). So-called rare OTU occurring in less than 10% of the investigated sites have represented 28 % of the 698 prokaryotic OTU in April and 26% of the 600 prokaryotic OTU in September. Co-occurrences of OTU were investigated by searching for correlation among 698 OTU in April (600, in September). Significant correlation (Spearman, R value > 0.9) were only found for 432 out of 243253 possibilities (0,24%) in April and 521 out of 179700 (0,29%) in September indicating low levels of OTU co-occurrences on the two sampling occasions. Fourteen bacterial and 12 archaeal OTU occurred in all the sampling sites in April; 17 and 13 respectively in September. Among these OTU, 9 bacterial OTU (OTU# 266, 290, 320, 322, 352, 470, 482, 528 and 636) and 5 archaeal OTU (OTU # 99, 153, 197, 265 and 493) occurred in April as in September. Intra-site Bray Curtis similarity ranged from 35% at the site I in September to 82% at the site PHI in September too, with a mean of 62 ± 13 %, for bacterial communities, and ranged from 25 % at the site PHI in April to 92 % at the site GS in April with a mean of 68 ± 13 %, for archaeal communities. In April, no significant difference was observed (Wilcoxon test, p > 0.5) between bacterial and archaeal communities intra-site BC similarities while in September archaeal communities showed significantly higher (by a 1.2 fold) intrasite BC similarities (Wilcoxon test, p = 2.4 10-4) A priori analyses were performed to compare prokaryotic communities based on bacterial and archaeal relative abundance matrices, set end to end. Considering the 6 groups of sites defined based on benthic macro-invertebrate habitats described in Blanchet (2004), significant differences in the prokaryotic communities were recorded between groups in April (ANOSIM, R = 0.142, p = 0.042) and September (ANOSIM, R = 0.272, p = 0.002). More precisely, significant differences were found between intertidal and subtidal prokaryotic communities in April (ANOSIM, R = 0.2, p = 0.002) and 86 Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments September (ANOSIM, R = 0.5, p = 4 10-5) (Figure 3A). Simpson indexes were significantly higher for the prokaryotic communities of intertidal sites than for the prokaryotic communities of subtidal sites in April (D, 0.03 ± 0.01 vs 0.05 ± 0.03) and September (D, 0.02 ± 0.00 vs 0.05 ± 0.03) (Mann-Whitney, p < 0.02). In the 17 intertidal sites, bare and Zostera noltii colonized sediments did not harbored significantly different prokaryotic communities (ANOSIM, p > 0.8) (Figure 3B). Consistenly, no significant differences in the Simpson index value was found between the two intertidal prokaryotic communities (D = 0.03 ± 0.01; Mann-Whitney, p > 0.2). Bray-Curtis similarity (%) 100 Figure 3: Comparison of prokaryotic community structures from parameters described by Blanchet (2004) to structure the benthic macro-invertebrate communities. Light and dark gray histogram bars with error bars corresponded to intra-group similarities of prokaryotic communities; black histogram bars with error bars correspond to intergroup similarities of prokaryotic communities. Error bars represent standard deviation. Asterisks indicate statistical differences between intra-group and intergroup similarities when intra-group similarities were superior to inter-group similarities. A: Light gray: group of subtidal sites; dark gray: group of intertidal sites. B: Light gray: group of sites with Zostera noltii colonized sediment; dark gray: group of sites with bare sediment sites. A 75 50 25 0 April September 100 B 75 50 25 0 April September . Non a priori analyses were performed to compare prokaryotic communities based on bacterial and archaeal relative abundance matrices, set end to end. In April, a MDS plot of the BC similiraties calculated between the 29 prokaryotic communities allowed to distinguish two clusters of sites: cluster#1 included 10 sites (B, CS, D, GS, GV, H, I, K, L, X) with a mean BC similarity of 50.9 % ; cluster#2 included 17 sites (A, CH, CV, E, F, GH, J, N, O, P, PHI, Q, S, T, V, Y, Z) with an mean BC similarity of 56.9 %. Sites M and R were outliers; clusters exhibited a 45% BC similarity (Figure 4A). The Simpson index was significantly lower in Group 1 (0.05 ± 0.03) than in Group 2 (D, 0.03 ± 0.01) (Mann-Whitney, p < 0.03) especially due to the very low diversity in site B (D = 0.11) and CS (D = 0.8). 87 Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments Using Primer software a SIMPER analysis based on 698 OTU detected in April indicated that 6 bacterial and 14 archaeal OTU showed inter site variations in their relative abundances that explained 42% of the inter-group dissimilarity. Five bacterial and 8 archaeal OTU were ubiquitous. Among these, only one bacterial (# 322) and two archaeal OTU (#265 and #385) showed higher abundance in Group 1 than in Group 2. For instance, the archaeal OTU #265 exhibited a mean relative abundance of 29.3 % in Group 1 and 8.3 % in Group 2 and explained alone 10% of the inter-group dissimilarity. In september, a MDS plot of the BC similiraties calculated between the 29 prokaryotic communities allowed to distinguish two clusters of sites: cluster#3 included 10 sites (B, CS, D, E, F, GS, H, I, J, K) with a mean BC similarity of 58.0 % ; cluster#4 included 18 sites (A, CH, CV, GH, GV, L, M, N, O, P, PHI, Q, R S, T, V, Y, Z) with an mean BC similarity of 62.0 %. The site X was an outlier; clusters exhibited a 48.7% BC similarity (Figure 4B). The Simpson index was significantly lower in Group 3 (0.05 ± 0.03) than in Group 4 (D, 0.02 ± 0.00) (Mann-Whitney, p < 0.01). A SIMPER analysis based on 600 OTU detected in September indicated that 7 bacterial and 11 archaeal OTU showed inter site variations in their relative abundances that explained 46% of the inter-group dissimilarity. Six of the bacterial OTU out of 7 and 7 archaeal OTU out of 11 were ubiquitously found in September. Among these, 3 bacterial (#320, #322 and #636) and 5 archaeal OTU (#99, #153, #197, #265 and #493) occurred in April. Like in April, the archaeal OTU #265 exhibited a mean relative abundance of 36.2 % in Group 3 and 3.6% in Group 4, explaining a large part (16%) of the inter-group dissimilarity. 88 Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments 2D Stress: 0.17 A Figure 4: nMDS representation of prokaryotic communities patterns in April (A) and in September (B) based of Bray-Curtis similarity analyses and from all-OTU relative abundance matrices. Prokaryotic community of each site was represented by a plot. Gray diamonds represented sites of the Group 1; black diamonds, sites of the Group 2; gray circles, sites of Group 3 and black circles, sites of Group 4. Stress value indicates the relevance of graphic representation. 2D Stress: 0.15 B A BIOENV analysis was performed using Primer software to identify those of the studied environmental parameters that explained the differences between groups. In April, a combination of five of the studied environmental parameters partially explained the prokaryotic community structure (R = 0.434, p < 2%): emersion frequency, annual median salinity, median particle grain-size, C:N ratio and depth of oxic/reduce interface. All environmental parameters but depth of the oxic/reduce interface exhibited significantly different values between the previously identified clusters of sites (MannWhitney test). The sites of cluster #1 were characterized by the highest values of median annual salinity (31.1 ± 1.0 ‰), median particle grain size (233.7 ± 167.8 µm) and C:N ratio (5.5 ± 5.7) (Figure 5). 89 34 50 32 40 30 20 10 0 30 28 26 24 22 20 Group Group 11 Group Group 22 400 300 200 100 0 Group Group 1 1 Group Group 2 2 Group Group 11 Group Group 2 2 7 Sediment oxic/reduce interphase (cm) 20 15 C:N ratio 500 Particle grain-size median (µm) 60 Water salinity median Emersion frequency (%) Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments 10 5 0 6 5 4 3 2 1 0 Group Group11 Group Group 22 Group Group 11 Group Group 22 Figure 5: Comparison between groups of sites revealed in April, of environmental parameters shown by BIOENV analyses as structuring prokaryotic community patterns. For each chart, cross indicates the mean; bar, the median; the top of box, 75th percentile; the bottom of box, 25th percentile; top of tail, the highest value and the bottom of tail, the lowest values. Asterisks in superscript indicate statistical differences between groups at p = 0.05 level (Mann-Whitney). In September, a combination of five of the studied environmental parameters partially explained the prokaryotic community structure (R = 0.433, p < 2%): emersion frequency, median water current velocity, Trask index, water content and pelite content. All environmental parameters exhibited significantly different values between the previously identified clusters of sites (Mann-Whitney p < 0.05). The sites of cluster #3 were characterized by the highest values of emersion frequency (25.7 ± 1.4 %), median water current velocity (0.2 ± 0.1 m.s-1) and the lowest values of water (0.3 ± 0.1) and pelite content (0.3 ± 0.3 %) and Trask index (2.2 ± 0.9) (Figure 6). 90 Water current velocity-1 (m.s-1) Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments 0.50,5 Current speed median (m.s ) 50 50 0.40,4 Emersion frequency (%) 40 40 0.30,3 30 30 0.20,2 20 20 0.10,1 10 10 00 0 Group 4 Groupe 1 Group c Group 4 Group 3 33 Trask index Trask index Groupe 2 Group 3 0,8 0.8 content Water Water content 44 22 11 1.01 0.8 0,8 0,6 0.6 0,4 0.4 0.2 0,2 00 Group Group b 4 Group Group c 3 0,6 0.6 0.4 0,4 0,2 0.2 00 % pelite Group b Pelite (%) Emersion frequency (%) 60 60 00 Group Groupe 1 4 Group Groupe 2 3 Group Group b4 Group Group c3 Figure 6: Comparison between groups of sites revealed in September, of environmental parameters shown by BIOENV analyses as structuring prokaryotic community patterns. For each chart, cross indicates the mean; bar, the median; the top of box, 75th percentile; the bottom of box, 25th percentile; top of tail, the highest value and the bottom of tail, the lowest values. Asterisks in superscript indicate statistical differences between groups at p = 0.05 level (Mann-Whitney). To account for potential bias due to the randomness of rare OTU, similar complementary analyses were performed on matrices restricted to the subset of spatially ubiquitous OTU: 14 out of 440 bacterial and 12 out of 258 archaeal OTU in April and 17 out of 356 bacterial and 13 out of 244 archaeal OTU in September. Based on this dataset, April and September communities shared 8 out of 23 bacterial and 5 out of 20 archaeal OTU. Accordingly, prokaryotic communities showed significant differences in April and September (ANOSIM test, R = 0.948, p < 0.001%) (Figure 7). In April, the structure of the ubiquitous prokaryotic communities was explained by a combination of 5 environmental parameters (R= 0.474, p < 1%): emersion frequency, C:N ratio and the depth of oxic/reduce interface and these already explained the structure of the entire communities unlike longitude and SOC content. In September, emersion frequency, median water current velocity, Trask index, water content and pelite content explained the 91 Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments structure of ubiquitous prokaryotic communities (R= 0.489; p < 1%) fitting with the results of the analysis performed based on the whole prokaryotic communities. 2D Stress: 0.13 A Figure 7: nMDS representation of prokaryotic communities patterns in April (A) and in September (B) based of Bray-Curtis similarity analyses and from ubiquitous-OTU relative abundance matrices. Prokaryotic community of each site was represented by a plot. Gray diamonds represented sites of the Group 1; black diamonds, sites of the Group 2; gray circles, sites of Group 3 and black circles, sites of Group 4. Stress value indicates the relevance of graphic representation 2D Stress: 0.11 B Discussion In this study, one goal was to enlarge the knowledge of prokaryotic diversity at ecosystem-scale in the Arcachon Bay and that required handling a large number of samples. With this aim capillary electrophoresis coupled fingerprinting methods such as ARISA (Fisher and Triplett, 1999) and T-RFLP (Avaniss-Aghajani et al., 1994) are especially adapted methodologies. Both are currently used for estimating richness and community composition (Danovaro et al. 2009; Edlund et al., 2008) although the 16S – 23S intergenic transcribed spacer (ITS) size polymorphism that is assessed by ARISA is claimed to be the best fit to the bacterial species taxonomic level (Danovaro, 2005). In contrast archaeal diversity can hardly be approached by ARISA as some archaeal ITS possess no ITS (Leuko et al., 2007). For all this reasons bacterial and archaeal community structures were respectively assessed by ARISA and T-RFLP in the present study. Merging ARISA and T-RFLP OTU in a 92 Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments single matrix joined heterogeneous taxonomic proxies but intended to consider the entire prokaryotic communities in one attempt. The quite low percent of correlated OTU suggested an absence of redundancy of bacterial and archaeal taxa as a probable consequence of the specificity of the amplification protocols. There is no simple relationship between the occurrence of a bacterial or archaeal species and the number and types of retrieved OTU (Klappenbach et al., 2000). Consistent with the observation of Hewson and Fuhrman (2007), the quite low percent of correlated OTU (<0.3%) suggested that most of prokaryotic species found in this study did not have multiple operons. As a consequence, discussion about OTU richness and evenness turns out possible. In the Arcachon Bay marine phanerogams (25%), bay phytoplankton (20%) microphytobenthos (19%), river suspended particulate organic matter (19%) and macroalgae (17%) compose the sediment organic matter (SOM) (Dubois et al., 2011). At the ecosystem scale the SOM composition is homogeneous and contribution of continental inputs is limited to few subtidal stations (Dubois et al 2011). Accordingly our data demonstrated that prokaryotic communities investigated on the same sampling sites were only differentiated as subtidal and intertidal communities (percent of emersion). With the exception of one site (site P), sites located in the Zostera noltii meadow did not exhibited distinctive SOM composition (Dubois et al., 2011). Consistently prokaryotic communities of these sediments were not significantly differentiated. As for the SOM composition, this result is likely explained by hydrodynamics-controlled resuspension, mixing and redistribution of the particles at the bay scale. In the bay, seagrasses proved to control the temporal dynamics of intertidal sediment (Ganthy et al., in press) but we did not observed changes between bare and Zostera noltii colonized sediment prokaryotic communities on the two sampling occasions. Sediment granulometry explained the structure of prokaryotic communities in April (the particle grain-size median) and in September (the Trask index, the water content and the pelite content). These parameters were reported as determinant of bacterial community structure in soils (particle size; Kotani-Tanoi et al., 2010), riverine (particle size; Jackson and Weeks, 2008) and marine sediments (water content; Hewson and Fuhrman, 2007). For sediment microbial communities, ecological niche diversification acts at the millimeter scale (Priscu et al., 1998; Nam et al., 2008) and locally controls the benthic prokaryotic communities (Bertics and Ziebis, 2010) explaining the marked role of sediment granulometry on the prokaryotic communities structure. These and the high pelite likely explained the 93 Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments higher diversity (D’ = 0.03) of prokaryotic community cluster #2 and #4 in April and September respectively. The bacterial OTU richness represented more than 148 OTU per cm3 of surface sediment in each site of the Arcachon Bay on the two sampling occasions. This is consistent with the magnitude of OTU numbers reported elsewhere (e.g. Hewson and Fuhrman, 2007; Borin et al., 2009). Archaeal OTU exhibited significantly lower OTU richness in sediment. This could be related to their densities in the surface sediments where they were reported to be less abundant than bacterial cells (Molari et al., 2012). Accumulation curves, based on Michaelis-Menten equation showed that sampling 6 sites permitted to estimate 75 % of theorical total OTU richness, suggesting low gamma diversity within the 180 km2 of this ecosystem. According to Whittaker's multiplicative law, gamma diversity is the product of alpha and beta diversity (Jost, 2007). The low gamma diversity of Arcachon Bay can be explained by the low beta diversity observed due to the presence of only two prokaryotic subcommunities per sampling time. The prokaryotic communities were composed by an important part of rare OTU (>25%). These OTU and their role in microbial ecology is an actual and controversial subject especially with the expansion of next generation massive sequencer (Gobet et al., 2010). These OTU are randomly present and consequently can be considered as artefacts (Kunin et al., 2010). In fact, our results showed that if the analysis of beta diversity was performed based only on ubiquitous-OTU similarity matrix, the clustering pattern was the same that from analyze of all-OTU similarity matrix. We also observed a high correlation between ubiquitous-OTU similarity matrix and all-OTU similarity matrix, consistent with the SIMPER test between groups that revealed the preponderant role of ubiquitous OTU in the clustering discrimination. Moreover, the omission of rare OTU unveiled longitude as a factor controlling the ubiquitous prokaryotic community spatial pattern. But others authors support the importance of these rare OTU in microbial ecology defining them as the “rare biosphere” (Galand, 2009; Pedros Alio, 2006; Sogin et al., 2006). Analyses of these sub-communities revealed on the one hand the presence of ubiquitous OTU and the scarcity of group-dependent OTU which questioned about the presence of true habitat dependent-OTU and consequently to the selection of OTU by habitat. These results fitted to the cosmopolitan theory. On the other hand, the ubiquitous OTU abundances showed variations between the two habitats fitting to the niche assemble theory. Differences of environmental conditions could lead to a shift in the communities with the predominant development of the most competitive OTU 94 Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments within each habitat. Emersion percent, granulometric parameters and salinity were revealed as structuring the prokaryotic communities of the Arcachon Bay sediment in April as in September except for the salinity that appeared as a controlling factor only in April. This is consistent with the increased of the Leyre river inputs during this spring rainfall period which, by a higher contribution, could become both a significant source of allochtonous prokaryotes as an osmotic selection factor via a decreasing of surrounding water salinity (Crump et al., 2004; Prieur et al., 1987). This is especially true in the sediment of the site close to the Leyre mouth that showed a continental particulate organic matter isotopic signatures (Dubois et al. in press) and consequently could be one of the hypothesize explaining the low diversity of the site B (D = 0.11). In parallel of our study, identification and numeration of macroinvertebrate organisms were realized in the same sites on the same sampling occasions (not presented data, Dubois et al. pers. comm.). Bray-Curtis similarity matrices of macroinvertebrate and prokaryotic communities appeared to be correlated one with the other (RELATE, R = 0.267 in April; R = 0.41 in September; p < 0.02 %). These results highlighted the links between the two kinds of communities. Sharing the same habitat both communities could present (i) direct interactions as trophic relationship (e.g. worms ingesting the sediment and the associated prokaryotes and excreting pseudo-feces and associated prokaryotic microflora) or symbiosis interactions (commensalism, parasitism or mutualism) (Prieur, 1991) but also (ii) indirect interactions via the modification of sediment habitat by bioturbation, that could lead to a change in prokaryotic communities (Bertics and Ziebis, 2010). The interaction between prokaryotic communities, the macrofauna biocenosis and the characteristics of their biotope are extremely complex due to high diversified interactions among them, and the difficulty to quantify an important number of abiotic and biotic parameters describing the habitat. CONCLUSION This study intended to describe the bacterial and archaeal community diversity in a transient ecosystem and understand the environmental key parameters driving their patterns using molecular approaches. Our results showed that Arcachon Bay sediment harbored a low gamma diversity of prokaryotes, composed by two-third of bacteria and a third of archaea. 95 Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments This low gamma diversity could be explained by the relative homogeneity of the habitat due to sediment reworking by hydrodynamics. Consequently, only two prokaryotic sub-communities were differentiated in April as in September by emersion frequency and granulometric parameters. Despite their large distribution area and their high density covering the intertidal sediment, Zostera noltii did not appear as a driver of prokaryotic communities; their influence on microbial activity could be only localized around rhyzosphere at millimeter scale. Finally, prokaryotic community patterns appeared to be partially controlled by the same environmental parameters as benthic macrofauna organisms. Acknowledgements This work was performed within the scope of the scientific programs ORIQUART (EC2CO-PNEC). G. Meisterhans is funded by a doctoral fellowship of the Region Aquitaine. The authors are grateful to Franck Salin (INRA, Pierroton) for ARISA analysis, Claude Courties (Université Pierre et Marie Curie, Banyuls sur Mer) for cytometry analysis. We also thank the sailors Francis Prince and Laurent Letort, P. Lebleu, B. Gouilleux, A. Garcia, L. Bourrasseau, H. Bouillard, R. Parra, F. Salvo and C. Portier for help in field sampling and samples processing. 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Dynamique spatiale inter-écosystème 2.1 Introduction Nous constatons que même au sein d’un écosystème prétenduement stratifié (e.g. gradients continentaux, tidaux) comme le Bassin d’Arcachon, les assemblages répondent finalement à l’habitat au sens large et ne réagissent que très peu au gradient chimique. Qu’en est-il à l’inverse si l’on compare des habitats similaires (sédiments vaso-sableux structurés par des apports en matière organique continentale) au sein de différents hydrosystèmes. Dans ce contexte, et au moyen d’une analyse de la structure des communautés bactériennes des sédiments à différentes échelles spatiales horizontale ou verticale allant du centimètre à la centaine de kilomètres, nous avons recherché des différences habitatdépendant à l’échelle intra-écosystème et/ou entre écosystèmes. Afin de dissocier plus facilement le rôle des facteurs écologiques de celui de l’éloignement géographique, nous nous sommes basés sur une comparaison de trois écosystèmes (le Bassin d’Arcachon, la Vasière Ouest-Gironde, et l’estuaire de la Gironde). 2.2 Sites d’étude et méthodologies 2.2.1 Sites d’étude Au cours de ces travaux, nous nous sommes intéressés à trois écosystèmes situés dans le Golfe de Gascogne au sud-ouest de la France: le Bassin d’Arcachon décrit précédemment (chapitre I, partie 6.2 et chapitre II partie 1), la vasière Ouest-Gironde (VOG) et l’estuaire de la Gironde (4°20’ N, 0°45’W). 2.2.1.1 La Vasière Ouest-Gironde La VOG est une couche sédimentaire de 290 x 106 tonnes de dépôts majoritairement vasoargileux (> 75% ; Lesueur, 1992), s’étendant sur 420 km2 au niveau du plateau continental du Golfe de Gascogne (Figure II.1). Son épaisseur moyenne de 4 m (Lesueur, 1992) résulte des processus de sédimentation des apports terrigènes de l’estuaire de la Gironde estimé à 1.5 x 106 tonnes par an (Castaing and Jouanneau, 1987). Emportées par les courants, les matières en suspension terrigènes viennent s’accumuler dans la zone septentrionnale de la VOG. Puis environ 35% de la matière temporairement stockée (0.9 x 106 tonnes par an) est remise en suspension et se dispersent sous l’action de courants advectifs selon un gradient Nord-Est/ Sud-Ouest (Jouanneau et al., 1999). Il en résulte une différence de composition 103 Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments sédimentaire avec d’Ouest en Est une diminution de la teneur en particules fines au profit de la fraction sablo-vaseuse (Jouanneau et al., 1989). La teneur en carbone organique y est faible (0,8%), et la fraction labile, qui n’excède pas 10% du carbone organique total, proviendrait principalement de la biomasse en elle-même. En effet la part détritique sst rapidement incorporée dans le matériel vivant, et ne s’accumulerait donc pas (Relexans et al., 1992). Cependant un apport de matière fraîche (pic de chlorophylle a et de matière organique labile) au niveau de la zone occidentale de la VOG traduit la présence d’un gradient spatial Nord-Est/ Sud-Ouest de labilité de la matière organique pouvant structurer les peuplements benthiques (Relexans et al., 1992). Autres facteurs structurant les peuplements, les processus de remaniement sédimentaire (bioturbation/ hydrodynamique) sont à l’origine d’une absence de gradients physiques et chimiques verticaux sur plusieurs centimètres de profondeur ainsi que de la présence de chlorophylle a au niveau de strates inférieures à 10 cm (Relexans et al., 1992). Estuaire de la Gironde Stations V1 V3 V4 Profondeur (m) 35 55 67 Latitude N 45°46'035 44°44'979 45°35’808 Longitude O 1°40'274 1°41'560 1°51’918 Figure II.1 : La Vasière Ouest-Gironde (France):localisation des sites de prélevements V1, V3 et V4. 104 Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments 2.2.1.2 L’estuaire de la Gironde L’estuaire de la Gironde est le plus vaste estuaire français (Figure II.2), et le principal exutoire du Bassin Aquitain. Cet écosystème apparait comme un bon modèle d’étude des estuaires turbides par sa forte concentration en matières en suspension, pouvant dépasser les 1 g.L-1 (Glangeaud, 1938), limitant ainsi la production primaire autochtone (Goosen et al., 1999). Ce système apparait donc globalement hétérotrophe (Heip et al., 1995), la dégradation de la matière organique (respiration hétérotrophe) y étant favorisée. Inversement, les biomasses phytoplanctoniques y sont faibles en comparaison avec les autres estuaires Nord Européens (Lemaire et al., 2002), le microphytobenthos contribuerait donc majoritairement à la production primaire (Irigoien, 1997). La balance production primaire / respiration hétérotrophe influe sur la disponibilité en O2 et par conséquent sur les maillons trophiques supérieurs. Phare Richard Saint Christoly Lamarque Figure II.2: Estuaire de la Gironde : positionnement des sites d’échantillonnage en fonction des secteurs halins définis par Rince (1983). 105 Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments 2.2.2 Echantillonnages Vingt neufs sites ont été échantillonnés au niveau de Bassin d’Arcachon en Avril et Septembre 2009 et présentés précédemment (chapitre II-1) (Tableau II.1). Ecosystème Nombre de Nombre de Nombre stations carottes d'horizons Bassin d'Arcachon Vasière OuestGironde Estuaire de la Gironde Nombre de dates 29 3 1 2 3 3 7 1 3 3 2 1 Tableau II.1 : Nombre et répartition des échantillons au sein des trois écosystèmes étudiés. Trois stations de la Vasière Ouest Gironde (V1, V3 et V4) ont été échantillonnées en juillet 2010 à bord du navire océanique le Côte de la Manche, au cours de la campagne BIOMIN1 (Figure II.1). Les prélevements ont été réalisés le long d’un gradient spatial vertical entre l’interface colonne d’eau/sédiment et 10 centimètres de profondeur (7 horizons: 0-10 ; 10-20 ; 20-30 ; 30-50 ; 50-70 et 70-100 mm) et le long d’un gradient spatial horizontal de maturité de la matière organique. Les sédiments ont été échantillonnés en mars 2010 et juin 2011, au niveau de l’horizon de surface (0-5 mm) et au niveau d’un horizon plus profond (30-50 mm), sur trois sites soumis à des intrusions halines (Figure II.2) : (i) le site « Lamarque » situé dans le haut estuaire, au niveau de la zone oligohaline dont la salinité moyenne est comprise entre 0,5 et 5 PSU (ii) le site « Saint Christoly », situé dans l’estuaire médian, au niveau de la zone mésohaline dont la salinité moyenne est comprise entre 5 et 18 PSU (iii) le site « Phare Richard », situé dans le bas estuaire, au niveau de la zone polyhaline dont la salinité moyenne est comprise entre 18 et 30 PSU 106 Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments Sur chaque site, trois carottes ont été prélevées manuellement ou à l’aide de carottiers multitubes (échelle décimétrique) et traitées uniformément (triplicats d’échantillonnage). Pour chaque carotte, deux prélèvements de 1cm3 de sédiments ont été réalisés dans chaque horizon, préalablement homogénéisé puis conservés à -80°C soit dans un tampon de préservation de l’ADN pour des analyses de la diversité bactérienne en ARISA soit dans du formol-EMNF pour des analyses d’abondance bactérienne en cytométrie en flux (chapitre II.1). 2.2.3 Analyse des communautés bactériennes Pour chaque échantillon de sédiment, une mesure de l’abondance bactérienne a été réalisée par cytométrie en flux au sein de la plateforme Cytométrie-Imagerie de Banyuls sur mer (France) après purification de la fraction cellulaire sur gradient de Gentodenz® (chapitre II.1). De même, une analyse de la diversité des communautés bactériennes a été réalisée en collaboration avec la plateforme Genome-transcriptome de Pierroton (INRA de Bordeaux) après extraction et purification de l’ADN total (Chapitre II.1). 2.2.4 Analyses statistiques A partir des profils d’ARISA obtenus, un traitement de données a été réalisé (Chapitre II.1), permettant de déterminer un optimal divisor (Osborne et al., 2006) à 1/1000. (i.e. élimination des pics dont l’aire contribue pour moins de 1/1000ème de l’aire totale de l’ensemble des pics). Une procédure de binning selon Ramette (2009) via l’utilisation de l’algorithme « interactive binner » (http://www.ecology-research.com) sous le logiciel R (http://cran.r-project.org/) a également été appliquée. La valeur de fenêtre a été estimée à 2 ± 0.1 (WS : 2 ; Sh : 0.1). A partir de la matrice d’abondance relative obtenue, une matrice de similarité de Bray-Curtis a été calculée via le logiciel Primer 6.0 (PRIMER-E Ltd). La significativité et l’amplitude des différences de structure des communautés bactériennes de groupes d’échantillons définis a priori ont été déterminées par ANOSIM sous le logiciel Primer 6.0 (PRIMER-E Ltd). Les significativités des différences d’abondances bactériennes et de richesse en OTU des communautés bactériennes ont été déterminées (i) par ANOVA de Mann-Whitney lorsque 2 groupes d’échantillons non-appariés étaient comparés ou (ii) par ANOVA de Kruskall-Wallis 107 Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments ou de Friedman lorsque 2 groupes d’échantillons indépendants ou appariés étaient comparés. Ces tests ont été réalisés à l’aide de la macro-commande Merlin sur Excel 2007. Le seuil de significativité retenu était de 0.05 ; une valeur inférieure à 0.01 indiquant une significativité importante. 2.3 Résultats 2.3.1 Abondance et structure des communautés bactériennes du Bassin d’Arcachon Les principaux résultats de l’analyse des communautés bactériennes du Bassin d’Arcachon sont présentés au niveau du chapitre II.1. L’analyse de la structure génétique des communautés bactériennes des sédiments de surface a mis en évidence la présence de deux types de communautés bactériennes l’une peuplant les sédiments intertidaux vaso-sableux hétérogènes, la seconde peuplant les sédiments subtidaux sablo-vaseux homogènes. Ces deux communautés bactériennes ne présentent pas de différence significative d’abondance. 2.3.2 Abondance et structure des communautés bactériennes de la VOG Pour les 63 échantillons confondus, l’analyse de la diversité génétique bactérienne montre la présence de 295 OTU de taille variant de 200 à 1122 pb. Sur le site V1, 266 OTU ont été observées dont 3 % présentaient, indépendamment de l’horizon, un caractère constant (présentes dans tous les réplicats) et 24 % un caractère rare (c'est-à-dire présentes dans moins de 10% des réplicats). Sur le site V3, 194 OTU ont été observées dont 14 % d’OTU constantes et 64 % d’OTU rares. Sur le site V4, 224 OTU ont été observées dont 4 % d’OTU constantes et 54% d’OTU rares. Parmi elles, 166 OTU soit 56 % étaient présentes sur les trois sites échantillonnés dont seulement 2 OTU ubiquistes (OTU 308 et OTU 348) c'est-à-dire présentes dans tous les réplicats de toutes les stations. L’analyse des similarités de Bray-Curtis dont les différences sont représentées sur un MDS (Figure II.3), met en évidence une différence significative (2way-ANOSIM, R = 0.36 ; p < 0.01) de la structure des communautés bactériennes des trois sites avec une différence plus marquée pour le site V1 (Tableau II.2). Aucune différence significative de la structure 108 Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments des communautés bactériennes n’a été observée entre les horizons quelle que soit la station (2way-ANOSIM, p>0.05). 2D Stress: 0,12 Stress : 0.12 V1: + V4: × V3: Figure II.3 : Structure des communautés bactériennes de la VOG déterminée par ARISA : comparaison des similarités de Bray-Curtis représentées sur un MDS. Site V1 vs V3 V1 vs V4 V3 vs V4 Valeur du R de l'ANOSIM 0.37 0.39 0.41 Tableau II.2 : Valeur de R de l’ANOSIM (100000 permutations) basée sur la comparaison des similarités de Bray-Curtis entre les sites V1, V3 et V4 de la VOG. Les mesures ayant été réalisées en triplicat, pour chacun des 7 horizons par site, la variabilité moyenne intra-site a pu être calculée à partir de la matrice de similarité de BrayCurtis. Cette variabilité est significativement plus faible à V1 (40 ± 16 %) qu’à V3 (59 ± 11 %) et V4 (60 ± 17 %) (Mann-Whitney, p < 0.05). En parallèle l’abondance procaryotique a été mesurée par cytométrie en flux. La comparaison inter-site des abondances d’un même horizon, n’a pas mis en évidence de 109 Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments différence d’abondance entre les 3 sites (Friedman, p > 0.05). En revanche, une diminution significative de l’abondance, le long de la colonne sédimentaire a été observée, quelque soit le site avec une abondance moyenne de 39.107 ± 16.107 cell.g-1 de sédiment à l’interface eau/sédiment et de 9.107 ± 6.107 cell.g-1 sédiment au niveau de l’horizon 70-100 mm. 2.3.3 Abondance et structure des communautés bactériennes de l’estuaire de la Gironde A partir des profils d’ARISA, une analyse de la diversité génétique bactérienne a été réalisée pour les échantillons prélevés en mars 2010 et uniquement pour les sites Lamarque et Phare Richard. En effet aucun amplificon n’a pu être obtenu par PCR pour les échantillons des deux horizons du site Saint Christoly. L’analyse des similarités de Bray-Curtis a mis en évidence une différence significative (2way-ANOSIM, R = 0.463; p < 0.03) de la structure des communautés bactériennes des deux sites avec une différence plus marquée pour l’horizon 30-50 mm [ANOSIM, R = 0.852, p < 0.1, valeur non significative due au faible nombre de réplicats et par conséquent au nombre de permutations possibles (10)]. Le site Phare Richard a montré une structure de communautés bactériennes différente entre les horizons (ANOSIM, R= 0.63, p < 0.1), contrairement au site Lamarque (ANOSIM, R= 0.037, p = 0.7). Les abondances des procaryotes sur les 3 sites d’étude, ont été mesurées en mars 2010 et juin 2011. Les résultats sont présentés sous forme d’un histogramme (Figure II.4) différenciant les abondances procaryotes en cell.g-1 de sédiment en fonction des sites échantillonnées et des horizons étudiés. Lorsque l’on considère l’horizon sédimentaire, aucune différence significative d’abondance procaryote n’a été observée entre les deux dates échantillonnées, à l’exception du site Phare Richard dont l’horizon 30-50 mm présentait une abondance procaryote plus élevée en mars 2010 qu’en juin 2011 (0.68 ± 0.17 x 107 vs 0.20 ± 0.10 x 107 cell.g-1 de sédiment ; Mann-Whitney, p > 0.05). En mars 2010, seul le site Saint Christoly montre une variation spatiale verticale d’abondance procaryote, présentant avec une abondance significativement plus élevée dans l’horizon 0-5 mm que dans l’horizon 30-50 mm (Mann-Whitney, p < 0.05). Une variation 110 Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments spatiale horizontale a été observée au niveau de l’horizon 30-50, le site Lamarque hébergeant une plus forte abondance procaryote (1.2 ± 0.4 x 107 cell.g-1 de sédiment) que le site Phare Richard (0.68 ± 0.17 x 107 cell.g-1 de sédiment). Ce site hébergeait une plus forte abondance procaryote que le site Saint Christoly (0.070 ± 0.022 x 107 cell.g-1 de sédiment) (MannWhitney, p < 0.05). En revanche aucune variation d’abondance procaryote, entre site, n’a été observée pour l’horizon 0-5 mm (Kruskall-Wallis test, p > 0.05) avec une valeur d’abondance procaryote moyenne de 1.5 ± 0.7 x 107 cell.g-1 de sédiment. En juin 2011, les trois sites échantillonnés ont montré également une variation spatiale verticale d’abondance procaryote, l’horizon 0-5 mm présentant une abondance significativement plus élevée (1.3 ± 1.3 x 107 cell.g-1 de sédiment) que l’horizon 30-50 mm (0.27 ± 0.37 x 107 cell.g-1 de sédiment). Aucune différence significative d’abondance procaryote, n’a été observée entre le site le plus en amont (Lamarque) et celui le plus en aval (Phare Richard), pour les deux horizons étudiés (Mann-Whitney, p > 0.05). En revanche, le site médian, Saint Christoly, présentait des abondances procaryotes significativement plus faibles que les deux autres sites (Mann-Whitney, p < 0.05) aussi bien pour l’horizon 0-5 mm (0.49 ± 0.13 x 107 vs 1.7 ± 1.4 x 107 cell.g-1 de sédiment) que pour l’horizon 30-50 mm (0.064 ± 0.023 x 107 vs 0.037 ± 0.042 x 107 cell.g-1 de sédiment) (Figure II.4). 111 Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments Juin 2011 Ri St La 0,00E+00 1,00E+07 2,00E+07 3,00E+07 4,00E+07 5,00E+07 Mars 2011 Ri 0-5mm St 30-50mm La 0,0E+00 1,0E+07 2,0E+07 3,0E+07 4,0E+07 5,0E+07 Abondance procaryotes (cell.g-1 de sédiment) Figure II.4 : Abondance des procaryotes hétérotrophes en fonction des sites échantillonnés et des horizons étudiés. La : Lamarque, St : Saint Christoly, Ri : Phare Richard 2.3.4 Comparaison des trois écosystèmes L’ensemble des jeux de données correspondant aux trois systèmes étudiés ont été mis en commun afin de pouvoir analyser les patrons de diversité bactérienne le long d’un gradient de distance géographique. En préambule il faut noter que la disparité des jeux de données limite leurs interprétations. Le nombre d’échantillons par écosystème est très différent entre les trois écosystèmes étudiés (i.e. 174 échantillons pour le Bassin d’Arcachon vs 63 échantillons pour la VOG vs 18 échantillons pour l’estuaire de la Gironde). Aucun réplicat temporel n’a été réalisé, hormis pour le Bassin d’Arcachon (duplicat). De plus, si des descripteurs communs ont été analysés, les outils/méthodes utilisés pour les caractériser diffèrent entre les trois écosystèmes. 112 Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments L’analyse des similarités de Bray-Curtis entre l’ensemble des communautés bactériennes, dont les différences sont représentées par un MDS (Figure II.5), a mis en évidence une différence significative (ANOSIM, R = 0.508 ; p < 0.01) de la structure des communautés bactériennes des trois écosystèmes. Les comparaisons entre les écosystèmes deux à deux ont montré une différence plus marquée (i.e. valeur du R de l’ANOSIM plus grande) entre les communautés bactériennes de l’estuaire de la Gironde et celles des deux autres écosystèmes (Estuaire de la Gironde vs VOG : ANOSIM, R = 0.833 ; p <0.01 ; Estuaire de la Gironde vs Bassin d’Arcachon : ANOSIM, R = 0.767; p < 0.01) qu’entre celles de la VOG et du Bassin d’Arcachon (ANOSIM, R = 0.467; p < 0.01). Ces différences se traduisent également par la diminution de la similarité avec la distance géographique: la pente de la droite de régression est négative (-0.0935) (Figure II.6). Cette observation n’est pas valabe pour les sites Lamarques et Phare Richard, qui bien qu’étant séparés d’une distance de 63 Km, présentaient la même similarité que celle des échantillons distants d’un mètre (Kruskall-Wallis, p > 0.05). 2D Stress: 0,22 Stress : 0.22 VOG Bassin d’Arcachon Estuaire de la Gironde Figure II.5: MDS représentant les différences de structures des communautés bactériennes des sédiments des trois écosystèmes étudiés, basé sur l’analyse des similarités de Bray-Curtis. 113 Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments Similarité de Bray-Curtis (%) 100 Similarité de Bray-Curtis = -0,0935 distance géographique + 38 80 60 40 20 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Distance géographique (km) Figure II.6 : Relation « distance-decay » appliquée aux communautés bactériennes du Bassin d’Arcachon, de la VOG et de l’Estuaire de la Gironde 2.4 Discussion L’étude de ces trois écosystèmes nous a permis de comparer les patrons de diversité des communautés bactériennes à diverses échelles géographiques. L’analyse de 255 échantillons de sédiments provenant de 34 stations de trois écosystèmes, pose d’abord la question de la dominance/rareté des OTU au sein des communautés bactériennes. Les communautés bactériennes des trois écosystèmes étudiés sont composées d’une importante proportion d’OTU rares souvent supérieure à 50%. La présence systématique de quelques OTU avec de fortes abondances relatives au sein de chaque site, contribue jusqu’à 46 % de l’abondance totale. Ces OTU peuvent être qualifiées d’OTU dominantes au sein de leurs communautés respectives (Figure II.7). 114 Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments Abondance relative au sein d’un échantillon (%) 50 VOG OTU dominantes 40 Vasiere Bassin d’Arcachon Bassin d'arcachon estuaire Estuaire de la Gironde 30 20 OTU rares 10 0 1 10 100 1000 10000 100000 Nombre d’OTU Figure II.7: Dominance ou rareté des OTU au sein des communautés bactériennes Ce type de structure de communautés apparait comme classique et suit les modèles structuraux observés aussi bien chez les macro-organismes (Grime, 1997) que chez les microorganismes (Hughes et al., 2001; Zhou et al., 2002). Cependant cette diversité d’espèces (OTU) rares chez les micro-organismes est bien supérieure à celle observée chez les macroorganismes amenant Sogin et al. (2006) à introduire la notion de « biosphère rare ». La présence de ces OTU rares et leurs rôles potentiels sont très controversés. En effet Kunin et al. (2010) considèrent ces OTU comme un artéfact car elles présentent un caractère aléatoire. D’autres auteurs comme Galand (2009), Pedros Alio (2006) ou Sogin et al. (2006) soutiennent l’hypothèse que ces OTU assureraient une fonction encore méconnue au sein des écosystèmes. L’une de ces fonctions pourrait être liée à la capacité de résilience des écosystèmes (Grime, 1997; Sogin et al., 2006). Cependant, si la « biosphère rare » peut présenter un fort intérêt lorsque l’on s’intéresse à la diversité fonctionnelle d’une communauté, l’approche « Multivariate Cutoff Level Analysis (MultiCoLA) de Gobet et al. (2010) a montré qu’en éliminant 35-40% des OTU rares obtenus par pyroséquencage, les patrons écologiques sont maintenus, montrant la robustesse des approches de diversité β à la présence (ou non présence) de ces OTUs rares. Notre analyse par ARISA et T-RFLP de la dynamique spatiale des communautés procaryotes du Bassin d’Arcachon, nous amène également à la même conclusion. En effet l’analyse faite à partir des variations d’abondances relatives des 10-20 OTU ubiquistes au sein de l’écosystème, génère des patrons identiques à ceux obtenus à partir de l’analyse du jeu de données complet comportant 739 OTU. 115 Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments L’ensemble de ces résultats amène donc à réfléchir sur l’utilité de techniques de séquençage massif qui génèrent des jeux de données complexes à analyser, lorsque l’on s’intéresse uniquement à la diversité β des communautés procaryotes. A l’échelle locale, les paramètres influant sur la dynamique spatiale horizontale des communautés bactériennes apparaissent semblables pour les trois écosystèmes étudiés. La qualité de la matière organique est l’un de ces paramètres. En effet l’étude des similarités entre les communautés bactériennes des trois sites de la VOG montre que le site V1 se distingue fortement des sites V3 et V4. Les flux benthiques totaux mesurés en parallèle montrent une décroissance de V1 à V4 indiquant une dégradation de la matière organique provenant des rejets continentaux de la Gironde (Deflandre, 2011). Il en résulterait une diminution de la labilité de la matière organique disponible à la dégradation sur les sites V4 et V3 par rapport à V1. De plus la mesure du rapport chlorophylle a / (chlorophylle a + phéophytine a), descripteur de la qualité de la matière organique végétale, montre la présence de matière végétale plus labile à la station V1 qu’aux deux autres stations (Deflandre, 2011). La qualité de la matière organique disponible à l’assimilation par les bactéries pourrait alors être un facteur structurant les communautés bactériennes. La qualité de la matière organique (i.e. rapport C/N) est également l’un des facteurs structurant mis en évidence par l’analyse BIOENV au niveau du Bassin d’Arcachon en avril 2009. La granulométrie semble également jouer un rôle structurant au sein de ces écosystèmes. En effet, l’analyse BIOENV met également en évidence au niveau du Bassin d’Arcachon, la structuration des communautés procaryotes par la granulométrie sédimentaire, à travers l’indice de Trask qui traduit l’hétérogénéité de taille des particules, la médiane granulométrique mais aussi le pourcentage en pélite. Au niveau de la VOG et en particulier au site V1, la variabilité intrasite de la granulométrie (e.g. couche de sable de 0.5 mm d’épaisseur à la surface de certaines carottes de V1) (Deflandre, 2011) pourrait également expliquer la variabilité des communautés bactériennes qui y est observée. En effet les propriétés granulométriques des particules sédimentaires sont souvent décrites comme structurant les communautés bactériennes en milieu terrestre (Kotani-Tanoi et al., 2007) comme en milieu benthique (Jackson and Weeks, 2008). Un autre facteur structurant commun entre le Bassin d’Arcachon et la VOG, est la présence d’oxygène. Ce facteur explique partiellement la différence entre les deux souscommunautés procaryotes à Arcachon (limite oxique/réduit) et pourrait expliquer la forte 116 Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments variabilité intra-site observée sur le site V1 de la VOG. En effet, la distribution de l’O2 montre elle-aussi une forte variabilité sur le site V1 (Deflandre, 2011). La corrélation entre la composition des communautés bacteriennes et la stratification des composés redox est d’ailleurs largement démontrée aussi bien dans les sédiments marins que dans les sols (Pett-Ridge 2005 ; Edlund et al., 2008). D’autre part, il semblerait y avoir un lien fort entre la structure des communautés procaryotes et celle de la macrofaune benthique et cela pour les trois écosystèmes étudiés. D’un côté, nous avons montré au niveau du Bassin d’Arcachon une importante corrélation entre les matrices de ressemblance des deux types de communautés. D’un autre côté, l’estimation de l’importance des structures biologiques à l’aide d’un profileur d’images sédimentaires (SPI) qui permet de déterminer un indice BHQ (Benthic Habitat Quality index (Nilsson et Rosenberg, 1997) pour chaque site (Deflandre, 2011) et l’analyse des communautés bactériennes discriminent l’une comme l’autre le site V1 des sites V3 et V4. L’activité de bioturbation pourrait influer sur les communautés bactériennes en modifiant par exemple la structure de l’habitat sédimentaire (e.g. granulométrie) (Bertics and Ziebis, 2009). Les sites V3 et V4 montrent également une forte homogénéneité spatiale verticale qui s’expliquerait par la présence d’une abondante faune benthique dont la présence de plusieurs espèces bioturbatrices comme Labidoplax digitata et Callianassa subterranea sur le site V4 (Deflandre et al., 2011). Ces espèces bioturbatrices pourraient engendrer un remaniement sédimentaire conduisant à la fois à un brassage des espèces bactériennes en introduisant les espèces des couches supérieures vers les couches inférieures mais également à un brassage des composés chimiques (Bertics and Ziebis, 2009). Enfin au niveau de l’estuaire de la Gironde, les résultats mettent en évidence un lien étroit entre la respiration et l’abondance des procaryotes hétérotrophes à travers une équation corrélant l’activité de respiration à l’abondance des procaryotes de subsurface et à l’abondance de la macrofaune benthique (Delmares, 2011). A l’échelle locale, chaque système présenterait ses spécificités : structure des habitats définie par (i) la structure des communautés de macro-invertébrés (Bassin d’Arcachon), (ii) le gradient de matière organique (Vasière Ouest-Gironde) ou (iii) gradient halin (estuaire de la Gironde). Pour les communautés bactériennes des sédiments, des facteurs environnementaux attendus (qualité de la matière organique, O2, macrofaune) conditionnent les assemblages. Cependant ce type d’approche où les facteurs sont confondants, ne permet pas de conclure sur 117 Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments le rôle structurant de chaque facteur, mais met plutôt en évidence de manière générale une sélection des espèces (OTU) par l’environnement à l’échelle locale. Le but de cette comparaison des trois écosystèmes était également de s’intéresser à la structuration des communautés bactériennes à l’échelle globale. Si la distribution des bactéries a longtemps été soutenue par la théorie de la distribution cosmopolite, les récentes études basées sur des approches moléculaires révèlent une distribution biogéographique. L’étude de Cho et Tiedje (2000) est l’une des premières à mettre en évidence des patrons « distance-decay» en comparant des sites sur quatre continents par des approches d’empreinte moléculaire (BOX-PCR). Franklin and Mills (2003) ont montré cette même relation à plus faible échelle (2,5 cm à 11 m) tandis que Hillebrand et al. (2001) se sont attachés à montrer cette relation chez des eucaryotes unicellulaires à une échelle de 1 to 1000 km. Mettre en évidence une dynamique biogéographique des communautés procaryotes n’est pas évident puisqu’il est difficile de s’affranchir des facteurs environnementaux autres que la distance géographique. C’est une des limites actuelles majeures des études (Green and Bohannan, 2006). Nous nous sommes donc intéressés aux patrons de diversité des bactéries du sédiment de trois écosystèmes présentant des similitudes : trois écotones présentant une accumulation de matière particulaire fine et dont les apports océaniques ont la même origine, le Golfe de Gascogne. Notre approche par ARISA met en évidence une diminution de la similarité entre les communautés avec l’éloignement géographique des écosystèmes. Cependant bien que les deux sites de l’estuaire soient distants de plus de 60 km, ils montrent une similarité inter-site équivalente à la similarité intra-site. De même, au sein du Bassin d’Arcachon, la distance géographique entre les sites n’est pas un facteur explicatif de la structure des communautés, montrant alors, qu’au sein d’un système les facteurs environnementaux domineraient sur la distance géographique dans les processus régissant les assemblages bactériens. Une étude identique sur les sédiments prélevés entre Los Angeles et l’île Santa Catalana (environ 35 km) avait abouti à des conclusions identiques (Hewson et al., 2007). L’hypothèse de Baas-Becking « everything is everywhere, but, the environment selects » serait donc valable à cette échelle. 118 Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments 2.5 Réferences Bertics VJ, Ziebis W (2009) Biodiversity of benthic microbial Goosen, N.K., Kromkamp J, Peene J, Van Rijswijk P, Van communities in bioturbated coastal sediments is Breugel P, 1999. Bacterial and phytoplankton controlled by geochemical microniches. International production in the maximum turbidity zone of three Society of Microbial Ecology Journal 1-12. European estuaries: The Elbe, Westerschelde and Gironde. Journal of Marine Systems 22: 151-171. Castaing, P., Jouanneau, J.M., 1987. Les apports sédimentaires actuels d'origine continentale aux océans. 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La dynamique des communautés bactériennes associées à un hôte vivant est plus complexe que celle d’un habitat inerte comme le sédiment du fait du caractère « vivant » de cet hôte. En effet, les communautés bactériennes associées aux bivalves (CBAB) résultent à la fois de processus de transmission latérale par balnéation et filtration dans un habitat septique mais également de processus de transmission verticale et/ou horizontale c'est-à-dire directement entre hôtes. Les processus de transmission latérale impliquent que les CBAB sont potentiellement influencées par la dynamique spatiale et temporelle des communautés bactériennes de l’habitat des bivalves (eau et sédiment). Les processus de transmission verticale et/ou horizontale impliquent, eux, une co-évolution possible entre les CBAB et leur hôte. Ces modes de transmission peuvent suggérer un déterminisme des CBAB par l’habitat de l’hôte et par l’hôte lui-même (Figure III.A). Ce sont ces hypothèses qui ont été investiguées au cours de ce chapitre. Dans une première partie (Chapitre III.1) les CBAB ont été caractérisées à l’échelle d’un bivalve entier (la coque Cerastoderma edule), en lien avec son niveau d’infestation par un parasite trématode digène Bucephalus minimus. Cette caractérisation a été conduite sur des individus appartenant à une cohorte sur une durée de 10 mois. Comme pour l’habitat sédimentaire (Chapitre III), les CBAB étaient caractérisées par un nombre important d’OTU présentant un caractère aléatoire et peu abondant. De plus, aucune dynamique temporelle ni aucun effet de l’infestation parasitaire sur les CBAB à l’échelle de l’individu n’a été constaté. Il a été émis l’hypothèse que la forte similarité entre les communautés bactériennes d’individus physiologiquement différents pourrait être due à la dominance des communautés issues du tube digestif. Il nous est alors apparu important, pour les prochaines études, de non plus considérer les CBAB à l’échelle de l’individu entier mais à l’échelle plus fine de l’organe. Dans une deuxième partie (Chapitre III.2), notre intérêt s’est donc porté sur les CBAB d’un second modèle de bivalve marin, la palourde Ruditapes philippinarum, à l’échelle de trois organes: les branchies et le tube digestif considérés comme les sites primaires d’infection bactérienne car étant le plus en contact avec le milieu extérieur, et un pool d’organes internes 123 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves (dénommé reste) séparé de la contamination bactérienne du milieu extérieur par des barrières physiques et immunitaires. Afin d’investiguer la part du déterminisme d’habitat de celle du déterminisme d’hôte sur la structure des communautés bactériennes, notre étude s’est basée sur la comparaison des communautés bactériennes d’individus appartenant à deux lots de palourdes présentant un état physiologique différent et provenant d’habitats contrastés. La structure des communautés bactériennes a été caractérisée d’une part sur des individus de l’habitat naturel et d’autre part sur des individus ayant subi une expérience de transplantation croisée afin de mieux différencier la part des deux types de déterminisme. Les résultats de cette étude ont mis en évidence l’influence majoritaire de l’habitat sur les CBAB du tube digestif et des branchies alors que la structure des CBAB des tissus internes plus constante, suggérerait un déterminisme d’hôte. De plus la modification de l’état de santé par le changement d’habitat apparait également comme un facteur structurant les CBAB de l’ensemble des organes étudiés. Pour valider l’hypothèse d’un déterminisme d’hôte sur les CBAB des organes internes, la dernière partie de ce chapitre (Chapitre III.1) s’est intéressée à comparer les CBAB de deux espèces de bivalves fouisseurs vivant en sympatrie. Les CBAB de ces deux bivalves ont été analysées en distinguant d’une part les branchies et le tube digestif liés au milieu extérieur, de plusieurs organes internes et en particulier l’hémolymphe qui en tant que support de la capacité immunitaire peut être considérée comme le compartiment le plus interne et le plus contrôlé de l’hôte. D’autre part un intérêt particulier a été porté aux CBAB les plus étroitement associées à leur hôte. Pour cela des individus des deux espèces ont subi une étape de dépuration de 21 jours afin d’éliminer la flore transitoire la moins étroitement associée aux bivalves. La comparaison des CBAB des deux hôtes bivalves a révélé une spécificité d’hôte de l’ensemble des CBAB des organes étudiés excepté celles du tube digestif dont le déterminisme d’habitat resterait le plus contributif. L’expérience de dépuration a mis en évidence que la majorité des CBAB associées au tube digestif était composée de populations transitoires faiblement associées alors que les CBAB des branchies présentaient une forte proportion de populations plus étroitement associées. Finalement l’ensemble de ces études a permis de mettre en évidence deux compartiments modèles pour l’étude des CBAB, le tube digestif majoritairement lié à l’habitat et l’hémolymphe majoritairement liée à l’hôte. Le choix de ces deux modèles apparait donc pertinent pour de futures études sur les CBAB et en particulier pour une vision fonctionnelle de leur structure. 124 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves Espèce de l’hôte Habitat de l’hôte Transmission verticale et horizontale Transmission latérale Partie 1: Diversité bactérienne à l’échelle d’un individu Etat de santé de l’hôte CBAB d’un bivalve Partie 3: Diversité bactérienne à l’échelle de l’organe : déterminisme d’espèce Organes CBAB des organes internes Partie 2: Diversité bactérienne à l’échelle de l’ organe : déterminisme d’hôte ou d’habitat CBAB du tube digestif des branchies Partie 2: Diversité bactérienne à l’échelle d’un organe : déterminisme d’hôte ou d’habitat CBAB pour communautés bactériennes associées aux bivalves Figure III.A: Communautés bactériennes associées aux bivalves : mise en évidence d’un déterminisme d’hôte ou d’habitat 125 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves 126 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves 1. Diversité des procaryotes à l’échelle d’un individu Dynamics of Bacterial Communities in Cockles (Cerastoderma edule) with Respect to Trematode Parasite (Bucephalus minimus) Infestation. Author names: Guillaume Meisterhans1, Natalie Raymond1, Solène Lebreton1, Franck Salin2, Line Bourasseau1, Xavier de Montaudouin1, Frédéric Garabetian1, Florence Jude-Lemeilleur1 Affiliations and Addresses: G. Meisterhans1 ([email protected]), N. Raymond1 ([email protected]) S. Lebreton1 L. Bourasseau1 ([email protected]) X. de Montaudouin1 ([email protected]) F. Garabetian1 ([email protected]) F. Jude-Lemeilleur1 ( [email protected]) F. Salin2 ([email protected]) 1 Université de Bordeaux UMR 5805 EPOC Bordeaux F-33000 France. 2 Plateforme Génôme-transcriptôme de Pierroton UMR BIOGECO 1202 INRA - Université Bordeaux 2 Original manuscript submitted to Microbial Ecology on the 5th November, 2010. Revised manuscript submitted to Microbial Ecology on the 20th January, 2011 Accepted manuscript to Microbial Ecology on the 31St January, 2011 Correspondence to : F. Jude-Lemeilleur, Université de Bordeaux UMR 5805 EPOC, station marine d’Arcachon, 2 rue du Pr Jolyet F-33120 Arcachon, France. Phone: +33556223911; Fax : +33556835104 ; E-mail : [email protected] Short title: cockle bacterial communities 127 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves 128 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves Abstract: The bacterial communities associated with the cockle (Cerastoderma edule) were investigated at the individual level through a 10 month monitoring programme. Temporal changes and those changes associated with a common parasite of the cockle, Bucephalus minimus were investigated by monthly sampling of individuals, selected based on their shell length (cohort monitoring). Cockle bacterial community abundance (CBCA) and diversity (CBCD) were estimated by epifluorescence microscopy counts and ARISA (Automated Ribosomal Intergenic Spacer Analysis) respectively. CBCA showed a temporal pattern peaking at 30 x 106 cells per gram of cockle flesh and intervalval liquid in October and a significant 1.8 fold increase linked with B. minimus occurrence. CBCD was characterized by 112 ± 26 ITS (Intergenic Transcribed Spacer) per individual and showed a relative homology between individuals (52 ± 6 % , Jaccard similarity) in spite of more than 30% of rare ITS. Consistent with an undisturbed evolution of the condition index of the studied cohort individuals as an estimate of their physiological state, neither temporal nor parasite induced change in CBCA have been related to marked changes in CBCD. 129 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves Introduction Many types of close associations between marine invertebrates and microorganisms have been described [27]. Some microorganisms are reported to colonize the host tissues as intracellular endosymbionts [8] or endoparasites [2, 4] which can be acquired by vertical transmission from parent to offspring [9] or by bathing in a septic environment including horizontal transmission by contemporary hosts [31, 42]. Other associations between marine invertebrates and microorganisms occur in the digestive tract of the animals [39]. The gut microflora includes mutualistic resident bacteria, commensal or benign parasitic transient bacteria and, lysed and absorbed bacteria [27]; the latter represent preys in a trophic interaction sensu stricto. However literature dealing with the diversity and community dynamics of microorganisms in their host related to the dynamics of host populations remains scarce. Choosing the cockle (Cerastoderma edule, L.), a common European bivalve of many coastal ecosystems, as an example and considering that during their life individuals grow, mature, progressively change their trophic sources [49], harbour different trematode parasites [16] and face varied climatic situations [19], we can hypothesize that bacterial communities associated with cockles will also undergo variation in structure, and abundance. The cockle represents a good biological model due to its economic value [20] and its ecological relevance for ecosystem functioning (e.g. bioturbation) [26]. Also, previous studies reported the occurrence of food borne pathogens and fecal indicator bacteria [38] and the infection by mycoplasma-like bacteria [3] or rickettsia-like bacteria [7], or by numerous trematode species suggesting contrasted patterns of interaction among these different organisms [5, 44]. These studies questioned the link between bacteria, macroparasite occurrence and individual cockle fitness. To address this issue, our study aimed (i) to characterize the structure (density, molecular fingerprints) of cockle bacterial communities (CBC) at the individual scale including methodological settings needed for bacterial genotyping in such a matrix (ii) to assess the CBC dynamics in cockle individuals of a given cohort during 10 months; (iii) to estimate whether the occurrence of a trematode parasite in cockles may impair bacterial communities in terms of diversity and abundance. Bucephalus minimus was selected because 130 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves this species uses the cockle as a first intermediate host [13]. It means that the parasite reproduces asexually in the cockle, invades most of its tissues and that strong metabolic disturbance are expected. We monitored on a monthly basis the abundance (epifluorescence microscopy counts) and the genetic diversity (semi-nested ARISA fingerprinting) of bacterial communities associated with one individual cockle (CBC). Materials and Methods Sampling sites Cockles were sampled in the National Reserve of Banc d’Arguin situated in Arcachon Bay, a macrotidal lagoon along the French Atlantic coast (44°40’N, 1°10’W). At Banc d’Arguin, the habitat consists of moderately sheltered intertidal sand flats (median grain size = 350 µm). The water salinity and temperature ranges are 34 - 35 psu, and 9.5 - 21.0°C respectively. The benthic community biomass is dominated by cockles with abundance reaching 100 to 200 ind∙m-2 [17]. This population is characterized by high demographic fluctuations, fast individual growth and a relatively short lifespan [24]. Cockle characterization Cockles from the May 2006’s cohort were sampled monthly at low tide from January to October 2007. This age-class was identified by cohort analysis. Individuals were selectively sampled using the shell length. At each occasion, a minimum of one hundred buried cockles were collected by hand, measured to 1-mm precision with a calliper, and stored at 4°C during transport to the laboratory. Cockles located at the sediment surface were discarded due to poor condition as Blanchet et al. [5] suggested that this abnormal position was a prelude to cockles’ death [16]. Prior to analyses, samples were stored at -20°C less than 6 months. After thawing, cockles were washed with tap water, and opened under sterile conditions according to the French standards for bacteriological analyses of marine bivalves (AFNOR NF V 08-600 of October 2000). Individual shell mass and flesh and intervalval liquid (FIL) mass were weighed to 0.1 g precision. The wet FIL mass was converted to dry FIL mass using the following equation: dry FIL mass = 0.1259 x wet FIL mass (de Montaudouin, personal data). Condition index was measured as the ratio of the dry FIL mass (in mg) to the shell dry mass (in g) [51]. 131 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves B. minimus occurrence In order to note presence/absence of B. minimus (Bm+ versus Bm-) the foot of cockles was cut, squeezed between two sterile glass slides, and observed under a stereomicroscope (NIKON SMZ1500, HR plan Apo 1) [14]. The prevalence was defined as the percentage of parasitized cockles [6]. Then, FIL were shredded (blade OMNI TH) and stored in sterile flasks, at -20°C, for less than 2 years, until bacterial counts and diversity analyses were carried out. Bacterial counts Samples (shredded FIL) were thawed into a preservative buffer (Tris-HCl, 300 mM pH8; 0.1 M NaCl; 20 mM EDTA). Analyses were performed, for each month, on each FIL of between 2 and 5 Bm+ found and from each FIL of 3 Bm- cockles. An aliquot of 50 µL of each sample was labelled with a mixture containing two volumes of SYBR® Green I (25X, Molecular Probes, Invitrogen Cergy Pontoise, France) for one volume of propidium iodide (60µM, Molecular Probes, Invitrogen, Cergy Pontoise, France). This mixture is a modification of LIVE/DEAD® BacLightTM Bacterial Viability kit that is usually used to differentiate live from dead bacteria. It was applied to allow a better discrimination between bacteria and tissues of cockles. After fixation for 15 min at room temperature in darkness, samples were filtered onto 0.2-µm GTBP-pore-size, 25-mm diameter Isopore™ membrane filters (Millipore, Molsheim, France) under low vacuum pressure (200 mm Hg). The filters were removed from the filtering tower and mounted in non fluorescent immersion oil between a glass slide and cover slip, and stored at 4°C until counting with an epifluorescence microscope (Olympus BH2-RFCA, excitation filter BP490, magnification 1000) was carried out. Cockle bacterial community abundance (CBCA) was calculated using the following formula [CBCA=(FAxTN)/(SFxVxF)], with CBCA as number of cellular units per mL of sample; FA: effective Filtration Area of the membrane filter (here FA = 201 mm2); TN: Total Number of cellular units (here TN ranged between 150 to 250); SF: Surface of microscopic Field (0.02 mm2); V: filtered Volume (mL) and F: number of observation Fields investigated (here F = 50 minimum). The potential dilution of the FIL was taken into account for calculation of CBCA. The results were expressed as cell units per g of FIL. 132 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves Cockle bacterial community structure analysis by ARISA Changes in the cockle bacterial community diversity (CBCD) were assessed using the PCR-based whole-community fingerprinting approach ARISA (Automated Ribosomal Intergenic Spacer Analysis) of bacterial DNA [21]. ARISA amplifies the Intergenic Transcribed Spacers (ITS) between the 16S and 23S rRNA genes using a fluorescent primer and the ITS size represents the operational taxonomic unit (OTU). Results are displayed as the amount of different PCR products of specific fragment length (ITS size). For each cockle, DNA was extracted from 6 replicates of 25 mg of FIL, using a bead beating method (FastPrep and lysis matrix A; 6 m∙s-1; 40 s, MP Biomedicals, Illkirch, France) coupled to QIAamp DNA Mini Kit (QIAgen, Courtaboeuf, France). For each cockle, the pooled amount of DNA extracted from 150 mg (6 x 25 mg) of cockle FIL was determined by spectrofluorimetry (LS 55, PerkinElmer, Courtaboeuf, France) using SYBR® Green I (Molecular Probes, Invitrogen, Cergy Pontoise, France), and quantified using DNA standard 1mg∙mL-1 solutions of calf thymus DNA (Sigma Aldrich, St. Quentin Fallavier, France). The same amount of extracted DNA (10 ng) was used for each ARISA amplification assay. For each sample, the first ARISA amplification step was conducted in triplicates. The amplification was run according to Ranjard et al. [47] using universal bacterial primers SDBact (5’-TGC GGC TGG ATC CCC TCC TT-3’ labelled at the 5’ end with the phosphoramidite dye 5-FAM fluorochrome) [41] and LDBact (5’-CCG GGT TTC CCC ATT CGG-3’) [41] (Molecular Probes Invitrogen Cergy Pontoise, France) with the following conditions: (i) 94°C for 5 min; (ii) 35 cycles of 94°C for 1 min, 55°C for 1 min, 72°C for 1 min, and then (iii) 72°C for 5 min. The 25 µL-reaction mixtures contained 1 x PCR buffer, 1.5 mM MgCl2, 0.3 mg∙mL-1 of bovine serum albumin (MP Biomedicals, Illkirch, France), 5% of DMSO, 0.2 mM of each dNTP, 0.1 µM of each primer, 1U of Taq polymerase (Promega, Charbonnières-les-Bains, France) and 20 ng of template DNA. A second PCR amplification was performed on 1 µL of the pooled first step PCR amplicons using the same forward primer (SDBact) and the reverse primer ITSReub (5’-GCC AAG GCA TCC ACC-3’) [34] (Invitrogen, Cergy Pontoise, France) recommended in [35]. Nested (or semi-nested) ARISA, a two successive PCR amplification of the ITS, was shown to enhance the detection threshold of natural microbial communities originating from complex matrices that possibly contain PCR inhibitors such as humic acids [35]. The amplification conditions were: held at 95°C for 5 min, 35 cycles of 95°C for 30 s, 61°C for 30 s, and 72°C for 90 s and a final extension of 72°C for 10 min. Single-stage (i.e. first ARISA amplification step) and semi-nested PCR products were 133 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves purified using a QIAquick PCR Purification Kit (QIAgen, Courtaboeuf, France) and quantified by spectrofluorimetry as for extracted DNA. Two ng of purified products from each sample were combined with 10 µL Hi Di formamide and an internal LIZ1200 standard (Applied Biosystems Ltd, Courtaboeuf, France) before being heat treated (95°C, 5 min) and then cooled on ice. ARISA was performed on a 3730XL Capillary Genetic Analyser (Applied Biosystems Ltd, Courtaboeuf, France), using a 50 cm capillary and standard Genemapper protocol, which detects the relative abundance of different sized PCR products labelled with the fluorescent primers (Plateforme Genome-Transcriptome Pierroton INRA, BordeauxAquitaine, www.pierroton.inra.fr/biogeco/site_pole_agro/genoseq.html). Results were read using the ABI Peak scanner software provided by Applied Biosystems (Courtaboeuf, France) where each profile of peaks in an electrophoregram defines bacterial diversity fingerprint. Fluorescence data (peak areas and peak sizes) were exported to Microsoft Excel to allow the data analysis. Peak size values were rounded to the nearest whole number and peaks with a size inferior to 200 bp were considered as noise and excluded for analysis [35]. According to Osborne et al. [43] an optimal divisor (2500) was determined to eliminate the background fluorescence (data not shown). Moreover according to Ramette [46] data were binned (i.e. electrophoretic profiles alignement) using the interactive and automatic binning algorithms [their respective manuals and examples are available online (http://www.ecologyresearch.com)] implemented in the free, R programming language [The R Foundation for Statistical Computing (http://cran.r-project.org/)]. From Peakscanner output table, a custom R binning scripts [46] was applied (WS: 2; Sh: 0.1). All peaks with relative fluorescence intensity value inferior to 0,004 (1/optimal divisor) were not included in further analyses since they consisted of background peaks. Therefore, to consider a maximum of peaks while excluding background noise, only fragments with relative fluorescence intensity above a threshold of 0.4% and ranging between 200 and 1200 bp were considered as a true peak. Each true peak displayed represented one ITS and the peak area represented the relative abundance of the ITS present. Data were also transformed to abundance matrix. Similarity between profiles (presence/absence) was computed using Primer (PRIMER-E Ltd, Lutton, UK), from the Jaccard similarity index [J = 100 x c / (a + b - c)] where a is the number of ITS found only in sample A, b the number of ITS found only in sample B and c the number of ITS shared between samples A and B. Similarity between profiles (relative fluorescence) was computed from the Bray-Curtis similarity index [BC = 100 x (1 - sum (d-e))] where d is ITS relative abundance in sample D and e ITS relative abundance in sample E. A rarefaction curve based 134 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves on Michaelis-Menten equation was designed a posteriori from the presence /absence matrix of all samples using Primer (PRIMER-E Ltd, Lutton, UK). Statistical analyses Mann-Whitney and Kruskall-Wallis tests were used to compare CBCA and CBCD similarity indexes (Jaccard and Bray-Curtis) between different sampling times or parasitic states. Statistical differences between groups were tested using ANalysis Of SIMilarity (ANOSIM) a random permutation tests (Monte-Carlo test, 100,000 permutations) performed from similarity matrix [32]. Comparison of the ARISA profiles (presence/absence matrix) obtained after single-stage and semi-nested PCR was analysed by non-multidimensional scaling (MDS) [10]. On each MDS chart every bacterial community was represented as one plot and the relative changes in community structure as the distances between the points. The two MDS were superimposed and symetric procrustes rotation rotates one MDS to maximize similarity, with the other MDS minimizing the sum of squared differences between the plots. Statistical differences between presence/absence matrixes obtained by each method were tested by 1,001 permutation tests. All tests and correlations were considered significant statistically at p value ≤ 0.05. Results Cockle sampling set A total of 46 cockles was analysed between January and October 2007, including 16 cockles whose tissues where found to be parasitized by B. minimus (Bm+ cockle) (Table 1). Cockles were labelled using the sampling month number and a distinctive letter for each individual. Shell lengths ranged from 23 1 mm in January 2007 for 8-month old cockles to 34 1 mm in October 2007 for 17-month old cockles. As a consequence of the sampling strategy (2006’s cohort cockles were selected), no variation of the shell length was expected within the set of cockles analysed monthly. Individual FIL mass ranged from 1.12 to 5.79 g and varied monthly (p = 0.002, Kruskall-Wallis based on Bm- individuals). On June, July, August and September 2007, when the number of collected Bm+ individuals was sufficient, no differences in the cockles FIL mass were found between Bm+ and Bm- individuals (p > 0.05, Mann-Whitney). The condition index increased from 32 4 ‰ in January 2007 to 82 14 ‰ in June (p = 0.006, Kruskall-Wallis) with no significant difference found between 135 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves May and June. From July to October the monthly mean condition index reached a plateau around 87 5 ‰. From June to October, no significant difference in condition index was found between Bm- and Bm+ individuals (p = 1.00, Mann-Whitney) (Fig.1.a). Individual Date Shell length FIL mass Bucephalus minimus DNA extraction yield -1 1a 1b 1c 2a 2b 2c 3a 3b 3c 4a 4b 4c 5a 5b 5c 6a 6b 6c 6d 6e 7a 7b 7c 7d 7e 7f 7g 8a 8b 8c 8d 8e 8f 9a 9b 9c 9d 9e 9f 9g 9h 10a 10b 10c 10d 10e 04/01/2007 04/01/2007 04/01/2007 01/02/2007 01/02/2007 01/02/2007 08/03/2007 08/03/2007 08/03/2007 05/04/2007 05/04/2007 05/04/2007 03/05/2007 03/05/2007 03/05/2007 05/06/2007 05/06/2007 05/06/2007 05/06/2007 05/06/2007 04/07/2007 04/07/2007 04/07/2007 04/07/2007 04/07/2007 04/07/2007 04/07/2007 03/08/2007 03/08/2007 03/08/2007 03/08/2007 03/08/2007 03/08/2007 10/09/2007 10/09/2007 10/09/2007 10/09/2007 10/09/2007 10/09/2007 10/09/2007 10/09/2007 09/10/2007 09/10/2007 09/10/2007 09/10/2007 09/10/2007 mm g 26 23 23 26 24 26 26 25 24 26 27 26 27 28 28 29 29 29 29 29 32 32 32 32 32 32 32 33 33 33 33 33 33 33 33 33 33 33 33 33 33 34 34 34 34 34 1,58 1,12 1,23 1,80 1,66 1,75 1,73 1,55 1,32 2,12 2,28 2,04 2,18 2,84 2,54 1,88 3,36 2,54 3,39 5,11 4,96 3,94 5,42 3,25 4,41 4,00 5,03 3,08 4,63 5,38 3,39 3,02 3,97 3,53 4,27 5,79 4,54 4,44 2,60 4,85 4,66 4,46 4,34 4,08 2,96 5,39 µg DNA g [FIL] + + + + + + + + + + + + + + + + . 136 2,98 0,88 76,9 2,73 2,07 0,32 na na na 16,1 na 1,06 na na na 6,93 0,84 0,56 0,58 1,21 0,78 0,96 0,45 0,40 0,50 0,36 0,56 2,92 0,88 0,84 0,46 0,42 1,11 1,09 1,88 0,82 1,61 0,83 2,00 0,36 1,32 0,58 0,65 0,63 0,57 0,59 Table 1. Description of the individual 2006’s cockle cohort sampled at Banc d’Arguin (Arcachon Bay) in 2007. Detection in cockle tissues of Bucephalus minimus is noted “+”; no detection is noted “-”; na, not available; FIL, Flesh and Intervalval Liquid. Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves ARISA settings DNA extraction yields exhibited a high heterogeneity varying between 0.32 and 16.1 µg∙g-1 [FIL]. One sampled cockle, individual “1c”, displaying a totally out of range value (76.9 µg∙g-1 [FIL]), was excluded for further analyses. To analyse the CBCD, the ARISA were based on semi-nested PCR amplification of a fraction of the former amplicon. Indeed after a single-stage PCR, 21 samples out of 38 did not display an interpretable ARISA profile (no peak detected). For the remaining 17 individuals, the extent of amplification yields obtained by single-stage PCR varied from 0.73 to 237 ng∙ng1 [DNA template], mean SE = 27 8 ng∙ng-1 [DNA template] (Fig. 2). Semi-nested PCR amplification yields varied from 349 to 1,683 ng∙ng-1 [DNA template], mean = 817 45 ng∙ng-1 [DNA template]. One individual, cockle 9c, displaying a very low semi-nested PCR amplification yield (43 ng∙ng-1 [DNA template]), was excluded for further analyses. No correlation was found between single-stage PCR and semi-nested PCR amplification yields (p = 0.56, Spearman correlation). The CBCD profiles recovered from the two amplification strategies were compared using a procrustean rotation of the two non metric multidimensional scaling corresponding to either the samples amplified by single-stage or those amplified by semi-nested PCR (Fig. 3). Similar within-cluster plotting patterns were found between the two nMDS (p < 0.22, Procrustes correlation) indicating that semi-nested PCR amplification did not change the respective CBCD profiles obtained by single-stage PCR amplification. CBCD was consequently analysed by semi-nested-PCR ARISA on 37 cockles. Fig. 2. Comparison of DNA amplification yields between semi-nested PCR and single-stage PCR amplification of cockle bacterial communities using Ranjard et al. [47] and Lear and Lewis [35] amplification protocol for ARISA. 1500 1000 -1 (ng ng [DNA template] ) Semi-nested PCR amplifiation yield 2000 500 0 0 50 100 150 200 Single-stage PCR amplification yield (ng ng-1 [DNA template]) 137 250 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves 7d 7d 10e 10e 7d 7dSn 10eSn 10e 4a 4a 8c 8cSn 2a 2aSn 8e 8e 7g7g 2a 2a 8f 8f 9d 9d 8c8c 7a7a 8d 9a1a 8a 8a10d 8d 10d 9b 9b 7aSn 7a 9a 1a 8aSn 8a 7g 7gSn 9b 9bSn8dSn 8d 9dSn 9d 9aSn 1aSn 9a 1a 10dSn 10d 8e 8eSn 4a 4aSn 1bSn 1b 1b 1b 8fSn 8f Fig.3. Comparison of bacterial community profiles obtained by two different approaches (single-stage PCR and semi-nested PCR) on cockles sampled from January 2007 to October 2007 in Banc d’Arguin (Arcachon Bay). Plot is derived from nonmetric multi-dimensional scaling of ARISA using a Jaccard distance matrix similarity (ITS presence/absence matrix) (black box: single-stage PCR method, white box: semi-nested PCR method). Comparison was only realized on the bacterial communities of 17 cockle individuals which display an interpretable ARISA profile with single-stage PCR. Cockle bacterial community abundance (CBCA) The CBCA was measured on sampled Bm- cockle individuals from January to October 2007 (Fig. 1.b). During this period values of individual CBCA ranged from 1 x 106 to 30 x 106 cells∙g-1 [FIL] corresponding to 2 x 106 and 162 x 106 bacterial cells per individual, respectively. During the first 5 months of the monitoring (January to May 2007), monthly BmCBCA were not significantly different (p = 0.34, Kruskall-Wallis), with an average of 1.9 0.3 x 106 cells∙g-1 [FIL]. A marked and significant increase in the CBCA was observed between May and June, with a mean value of 12 1 x 106 cells∙g-1 [FIL] in June (p = 0.02, 138 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves Mann-Whitney). From August to October 2007, the monthly mean CBCA significantly increased (p = 0.03, Kruskall-Wallis), peaking at 30 x 106 cells∙g-1 [FIL] in October. Bm+ cockles were detected from June 2007 when the mean shell length was 29 mm (Table1). The temporal pattern of Bm+ CBCA was comparable to the pattern described for Bm- individuals; maximal values occurred in October, mean = 40 x 106 cells∙g-1 [FIL]. No significant difference in CBCA was found between Bm+ and Bm- individuals in June and July (p > 0.05, Mann-Whitney). Conversely, the cockle bacterial community abundance was 1.8 higher in Bm+ individuals than in Bm- individuals in August, September and October (p < 0.05, Mann-Whitney). (a) Bm- 140 Bm+ d d c,d d c,d c,d c,d c,d c,d c,d Condition index (‰) 105 c c 70 b b a 35 0 50 (b) d(2) Bacterial abundance cell * 106 g-1 [FIL] 40 d(3) d(5) 30 d(3) 20 b(3) c(3) b(3) b(4) b(2) b(3) 10 a(3) a(3) a(3) a(3) a(3) 0 Jan-07 Feb-07 Mar-07 Apr-07 May-07 Jun-07 Jul-07 139 Aug-07 Sep-07 Oct-07 Fig.1. Monthly mean condition index (a) and bacterial community abundances (b) of non parasitized (Bm-) or parasitized (Bm+) cockles sampled from January 2007 to October 2007 in Banc d’Arguin (Arcachon Bay). Number of replicates is between brackets. Error bars represent standard deviations (absence of error bars is due to a lack of replicates). Similar letters in superscript indicate no statistical differences among months at p=0.05 level (Mann-Whitney). Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves 251 273 273 227 375 251 227 295 295 259 257 253 351 200 201 777 385 259 253 369 433 431 235 291 279 307 341 333 401 347 389 387 349 407 437 327 225 275 301 293 429 353 583 285 807 377 233 379 243 775 365 357 569 343 579 383 207 231 283 331 501 513 339 257 401 275 433 385 375 200 431 285 407 225 293 383 201 369 351 777 569 365 367 377 235 231 333 279 291 555 233 343 329 341 583 209 211 307 389 579 379 489 241 249 271 281 501 207 217 327 429 399 483 491 140 oct-07 Sep-07 Aug-07 Jul-07 Jun-07 Oct-07 Sep-07 Aug-07 Jul-07 Jun-07 Apr-07 Feb-07 Jan-07 ITS size ITS size (b) (a) Fig.4. Frequency of bacterial ITS detected from individual cockles sampled from January 2007 to October 2007 in the Arcachon Bay, with a relative abundance higher than 1%.(a)Bm- individuals (b) Bm+ individuals. ITS monthly frequency is represented by a shade of grey where the color symbolizes the ITS frequency: white: not detected; light grey: 1 to 33 %; dark grey: 34 to 66 %; black: 67 to 100 % of analysed individuals. Open black boxes underline the presence of ITS only found in Bm- or Bm+ individuals Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves Cockle bacterial community diversity (CBCD) A total of 284 ITS, ranging from 200 to 909 bp in size, was detected by semi-nested PCR ARISA analysis of the bacterial community of 37 cockles. Among the detected ITS, 41 (14% of all ITS) were detected only in Bm- cockle set, 15 (5% of all ITS) were detected only in Bm+ cockle set whereas 228 ITS were shared by the two sets. Regarding temporal patterns in Bm- and Bm+ respectively, (i) 3 ITS (ITS# 227 ,251, 273) have been detected every month in every tested cockle; (ii) 77 ITS out of 269 (Bm-) and 91 ITS out of 243 (Bm+) have been detected every month and, (iii) 66 of these ITS were found in both Bm- and Bm+ cockles. Third of the detected ITS (93 out of 284) occurred in less than 10 % of individuals sampled during the monitoring. A focus on the 108 ITS contributing to more than 1% of total abundance was realized (Fig.4.). Regarding their temporal pattern in Bm- and Bm+ respectively, 9 ITS and 8 ITS have been detected every time ; among these ITS 5 were indistinctly found in Bm- and Bm+ cockles. Half of the detected ITS (51 out of 108) were only detected once or twice during the 10-month monthly monitoring. These ITS were moreover characterized by a rare occurrence being generally found in only 1 of the 3 replicate individuals. The high proportion of rare ITS (detected by the 2 discrimination methods) resulted in a low mean level (mostly < 50%) of Jaccard and Bray-Curtis similarities of CBC between individuals. CBC similarities of Bm- individuals collected at different times (e.g. two consecutive months Jaccard similarity = 49 ± 10 %, Fig. 5.a; Bray-Curtis similarity = 46 ± 14 %, Fig. 5.b) were not significantly lower than similarities recorded between individuals collected on the same date (Jaccard similarity = 52 ± 8 %, Fig. 5.a; Bray-Curtis similarity = 53 ± 14 %, Fig. 5.b) (p > 0.1, Mann-Whitney). As a consequence, no temporal pattern could be evidenced using presence / absence data and Jaccard index or peak relative intensity data and Bray-Curtis index. Moreover, comparison of CBCD among months when CBCA was low (January, February, April) to the ones when CBCA was significantly higher (June, July, August, September, October), using ANOSIM, showed no significant difference (p> 0.05). Consistently unlinked with the CBCA no significant difference in the CBCD was found among months from May to October. 141 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves (a) 100 Jaccards similarity (%) Within the same month Between two consecutive sampling times 80 60 40 20 0 (b) 1 2 3 4 5 6 7 8 Bray-Curtis similarity (%) 100 80 Fig. 5. Temporal dynamics of bacterial communities in individual cockles, sampled in Banc d’Arguin (Arcachon Bay) from January 2007 to October 2007, where no Bucephalus minimus was detected. Histogram bars with error bars corresponded to similarities of cockle bacterial communities within a month; black points with error bars correspond to similarities of cockle bacterial communities between two months. Error bars represent standard deviation (absence of error bars is due to a lack of replicates). (a): Similarity based on presence / absence of the ITS; (b): Similarity based on the relative abundance of ITS (peak relative fluorescence) 60 40 20 0 Jan-07 Feb-07 Apr-07 Jun-07 Jul-07 Aug-07 Sep-07 Oct-07 Regarding the CBCD of Bm- and Bm+ individuals, no significant difference was found in the number of ITS per individual between Bm+ and Bm- cockles (p = 0.8, MannWhitney), mean = 112 ± 26 ITS per individual. Amongst the 15 ITS out of 243 that were detected only in the Bm+ individuals, most of them had an occurrence lower than 25%. Globally rare ITS primarily accounted for differences in CBCD between Bm- and Bm+ individuals. Based on presence / absence of the ITS, Jaccard similarities between CBCD of Bm- (Jaccard = 50 ± 10 %) or Bm+ individuals (Jaccard = 50 ± 8 %,) were not significantly different from similarities calculated between individuals belonging to the same set (p > 0.05, Mann-Whitney) (Fig. 6.a). Bray-Curtis similarities based on peak relative intensity showed comparable results (Fig. 6.b). Similarities between CBCD of Bm- on one side (Bray-Curtis = 48 ± 14 %) and Bm+ on the other side (Bray-Curtis = 33 ± 15 %) were not significantly different of similarities between Bm- and Bm+ cockles (Bray-Curtis = 38 ± 15 %) (p > 0.05, Mann-Whitney) (Fig. 6.b). Comparison of CBCD among Bm- and Bm+ groups ANOSIM showed no significant difference between Bm- and Bm+ clusters (p = 0.46). 142 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves 100 Jaccards similarity (%) (a) 80 BmBm+ Between Bm- and Bm+ Fig. 6. Comparison of similarities between bacterial communities in cockles sampled in the Banc d’Arguin (Arcachon Bay) from June 2007 to October 2007 according to their parasitic state. Histogram bars with error bars (error bars represent SD) correspond to similarities of cockle bacterial communities between individuals sampled on the same month. Absence of error bars is due to a lack of replicates. (a): Similarity based on presence / absence of the ITS; (b): Similarity based on the relative abundance of ITS (peak relative fluorescence) 60 40 20 0 Bray-Curtis similarity (%) (b) 100 80 60 40 20 0 Jun-07 Jul-07 Aug-07 Sep-07 Oct-07 Discussion In this study we applied structural descriptors of bacterial communities to characterize the dynamics of the communities associated with cockles at the individual scale. This sought to document the link between bacteria, parasite occurrence and cockle age. To characterize cockle bacterial community diversity, a fingerprinting method (ARISA) was used. This culture independent approach assesses the genetic structure of a bacterial community based on 16S - 23S ITS size [21]. Since bacterial species have various numbers and types of ribosomic operon, there is no simple relationship between the occurrence of a bacterial species and the number and types of retrieved ITS [29]. It is nevertheless assumed that the ITS richness and composition realistically reflect the bacterial taxonomic diversity [23]. An attempt to assess the cultivable diversity of the same samples provided only 17 colonial morphotypes on marine agar (data not shown). Eight out of 17 could be closely related to members of the genus Bacillus, i.e. an endospore former, 143 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves suggesting that sample storage (no preservative such as glycerol added) affected the cultivable fraction. On the other hand, the 2-year long storage of cockle FIL samples at -20°C was unlikely to have affected the sample DNA quality [48]. Neither comparison between molecular and cultivable diversities nor phylogenetic assignment of the recovered ITS was therefore possible. Apart from ITS ascribing, ARISA fingerprinting is intrinsically adapted to assess β diversity (sensu Forney et al. [22]) i.e. pairwise comparisons of the composition (Jaccard similarity based on presence/absence of the ITS) or of the relative abundance (Bray Curtis similarity based on the relative fluorescence of the peaks) of bacterial communities. From the measured bacterial abundances (maximum 40 x 106 cells∙g-1 [FIL]) and taking an average individual bacterial mass of 9.5 x 10-13 g∙cell-1 [40] it could be estimated that bacterial biomasses have represented less than 0,1% of the biological material from which DNA was extracted, the remaining 99,9% being cockle tissues. Hence low quantities of bacterial DNA, and thus a low proportion of target DNA, were to be recovered in our samples. This could explain why single-stage PCR did not amplify enough DNA in numerous samples. Conversely, semi-nested PCR, known to enhance the sensitivity [35], proved not to distort the CBC diversity pattern and was therefore successfully adopted. The cockle population of Banc d’Arguin has been monitored monthly since 1999 and is representative of the species on its geographic distribution area [19]. More precisely, the studied 2006 cohort exhibited common temporal patterns of growth as attested by (i) Von Bertalanffy’s growth model parameters: L∞ = 36.75 mm, k = 1.33 yr-1 [25] and (ii) comparison of measured condition index (mean = 78 ± 24‰ , min = 30‰, max = 122‰) to the values mentioned in de Montaudouin et al. [15] (mean = 58‰, min = 49‰, max = 73‰). The patterns of CBC structure reported in the present study should thus be considered to represent typical features even for parasitized individuals. The maximum B. minimus prevalence recorded during this survey (5%) agreed with previous observations [16] suggesting that the studied set of individual cockles experienced the usual parasitic infection pressure. On average during the 10-month survey, B. minimus-free cockles presented a 14 ± 2 x 106 cells∙g-1 [FIL] bacterial load composed of a quite stable ITS number of 112 ± 26 ITS per individual. Given the typical range between culture-dependent and cultureindependent numerations of bacteria [11] our data agreed with bacterial densities up to 105 MPN∙g-1 [FIL] reported in Blanchet et al. [5]. Comparable operational taxonomic unit (OTU) richness was reported for lobster gut [39]. The inter-individual variability of CBCD 144 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves attested by Jaccard or Bray Curtis similarities averaging 53 ± 7% and 53± 12% respectively indicated a relative homology between bacterial communities of individuals sampled within a given month. This result was expected because cohort individuals were sampled on the same sampling site, were recruited on the same period (same age) and have thus experienced similar environmental conditions such as, for instance, being submitted to the same bacterial contamination events. Despite ITS binning, rare ITS (= ITS recorded in less than 10% of the studied cases) have represented 33% of the 284 detected ITS. The rare ITS marginally contributed to the ITS richness; hence the CBCD was satisfactorily described. That no distinctive temporal pattern could be evidenced even when higher bacterial abundances were found in cockles during the summer period suggested a relative stability of the bacterial taxa harboured by cockles (CBCD). Changes in cockles’ bacterial load (CBCA) during the summer period could be due to an increase in gut microflora caused by (i) enhanced seawater bacterioplankton densities during the productive period [1] or (ii) enhanced filtration rates linked to individual growth [12] or (iii) the reproductive life cycle affecting the FIL mass during the spawning period [12]. The gut microflora hypothesis is emphasized by the probable importance of gut bacterial numbers (e.g. 90% of the cultivable heterotrophic bacteria are in oyster gut, [33]). Considering the different organs (e.g. gut, gills, muscle) separately would allow this hypothesis to be tested in further studies. The cockle size is an important factor contributing to B. minimus infestation as B. minimus is known to parasitize cockles having reached at least a 16 mm shell length [16]. In the present study, B. minimus was first detected later than expected (in June) when cockles were 13 month old and had a shell length of 29 mm. The fact that parasitized and not parasitized cockles exhibited comparable condition indexes suggested that parasitized individuals were not affected physiologically [36]. However, the parasite flesh can represent more than 25% of the total flesh of the host-parasite system [18] and a similar condition index between parasitized and non-parasitized cockles can signify a deficit of host flesh in parasitized individuals. The only indication of an interaction between CBC and B. minimus infestation was the enhanced CBCA recorded in cockles parasitized by B. minimus during the summer period. It might indicate a secondary bacterial infection linked to bacterial invasive development in damaged cockle tissues (gonads, gills and digestive gland). Another indication of secondary infection is the change in the individual bacterial community composition as observed for coral by Sunagawa et al. [50] and Peirera de Castro et al. [45]. Lysis of the tissues due to the primary infestation may lead to development of new niches 145 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves (organic matter release, sites to be colonized) for saprophytic bacteria. These niches could be settled by exogenous and/or commensal opportunistic bacteria leading to changes in bacterial community composition. In the present study no change in CBCD between Bm- and Bm+ individuals could be evidenced by comparing Jaccard and Bray-Curtis similarity indexes. Given that no difference was found in the physiological state of the cockles (condition index) with respect to the parasitic state, the CBCA increase still needs to be explained. It could be hypothesized that sampled individuals were in an early stage of the secondary infection, when major changes in CBCD have not occurred yet. A rarefaction curve based on Michaelis-Menten equation was designed a posteriori from the CBC presence /absence matrix of all samples (Fig.7). According to Magurran [37] this curve tentatively documented the maximum ITS richness (Smax) and the sampling strategy (optimal number of replicates for an exhaustive diversity analysis). For Smax the best fit of the Michaelis-Menten equation indicated a 283 ITS per cockle value. The Smax value is probably an overestimation of the actual CBCD at the individual scale although it is likely to be an underestimate at the population scale. On the other hand, taxa-area relationships were shown for bacteria being mainly supported by the habitat heterogeneity [30]. Cockle tissues and particularly the gut could be possibly seen as diversified habitats for bacterial settlement. Accordingly, high bacterial diversity was reported in oyster gut, gills and gonads [28]. Moreover, comparable orders of magnitude (hundreds of OTUs) were reported in lobsters [39] and in corals [45]. For the sampling strategy, the a posteriori test indicated that working on three replicates allowed only 62% of the theoretical total CBCD to be taken into account. That may explain the high rate of rare ITS. According to our estimation 16 replicates would be required to base analyses from 90% of theoretical total CBCD. This is a challenge in such a field experiment since collecting 16 parasitized cockles could require collecting hundreds of cockles where cockle densities range from 100 to 200 ind∙m-2. Further studies should obviously consider a trade-off in the number of replicate individuals per condition for a more accurate analysis of the cockle bacterial community dynamics. 146 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves Fig. 7. Rarefaction curve Mean number of observed ITS Number of different ITS observed 300 Michaelis-Menten curve 250 200 150 Black points with error bars represent the averages and SD of observed ITS as the samples are accumulated. This average was obtained from 100,000 permutations of 37 presence/absence matrices of ITS. Gray curve represents the curve regression based on Michaelis-Menten equation (Number of ITS = (283 x number of replicates) / (1.8 + number of replicates). 100 50 0 10 20 30 40 Number of replicate samples Conclusion This study investigated the dynamics of the symbiotic bacterial communities during cockle growth or infestation by B. minimus. Some ITS (93 out of 284) occurred in less than 10 % of individuals sampled during the monitoring but bacterial community compositions of cockle individuals that had been submitted to the same bacterial contamination events were similar at a 52 ± 6 % level (mean Jaccard similarity). Further studies should consider the number of replicate individuals per condition and may take advantage of considering separately the different organs (e.g. gut, gills, muscle) for a more accurate analysis of the cockle bacterial community dynamics. In the present case study however, typical cockle growth patterns and parasite prevalence were observed. Apart from transient changes in cockle bacterial loads during summer, marked changes in the bacterial community composition were not linked to changes in individual physiological state (attested by condition index) during the 10-month cohort monitoring. Likewise, apart from enhancement of parasitized cockle bacterial loads during summer, B. minimus infestation of cockles did not affect the individual physiological state and bacterial community composition. These data suggested that bacterial community composition, in contrast with community abundances, could be consistently linked to cockle fitness descriptors highlighting the need to consider bacterial diversity when studying their association with marine invertebrates. 147 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves Acknowledgements This study is part of the project “Multistress” (Coordinator: Dr X de Montaudouin) funded by ANR (Agence Nationale pour la Recherche, France). G Meisterhans is funded by a doctoral fellowship of the Region Aquitaine. The authors thank SEPANSO for authorizing sampling in the National Reserve of Banc d’Arguin and Dr SC Culloty for editing the English writing of the manuscript. 148 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves 9. References Cary SC, Giovannoni SJ (1993) Transovarial inheritance of endosymbiotic bacteria in clams 1. 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Diversité des procaryotes à l’échelle d’un organe : déterminisme d’hôte ou d’habitat 2.1 Introduction Depuis des millions d’années, les invertébrés marins vivent en symbiose avec une flore bactérienne abondante, diversifiée et spécifique c'est-à-dire différente de celle de l’habitat environnant (Frischer et al., 2000; Rohwer et al., 2002 ; Gerce et al., 2011). Cette spécificité est liée en particulier au fait que l’habitat de cette microflore est un organisme vivant (Hansson et al., 2009). Une partie de cette microflore est acquise par transmission latérale c'est-à-dire via l’environnement à travers des mécanismes actifs de filtration ou d’enfouissement et des mécanismes passifs par simple balnéation dans un environnement septique (Dubilier et al., 2008 ; Bright and Bulgheresi, 2010). De ce fait, cette microflore est composée en partie de populations transitoires liées d’une part aux fluctuations de cet environnement (Tanaka et al., 2004 ; Serais et al., 2010) mais également à celles de l’état de santé de l’hôte et en particulier de l’efficacité de ses barrières comme l’intégrité de ses branchies (Dame, 1996) ou l’efficacité de son système immunitaire (Pruzzo et al., 2005 ; Antunes et al., 2010). Cette partie de la microflore est composée de bactéries allochtones (i.e. non spécifiques à l’hôte) (Romero et al., 2002), nommée dans le tube digestif, flore de transit par Harris (1993). Une autre part de cette microflore est acquise par transmission verticale c'est-à-dire par une transmission parentale via l’incorporation des bactéries à la surface ou au sein des gamètes ou par transmission horizontale par acquisition entre hôtes contemporains indépendamment des mécanismes de reproduction. Cette microflore plus étroitement associée présenterait une longue histoire évolutive commune avec ses hôtes, qui résulterait de pressions de sélections communes (Taylor et al., 2007; Zurel et al., 2011). Elle peut également présenter une dynamique influencée par des paramètres environnementaux comme la température (Schöttner et al., 2009), ou par l’état de santé de l’hôte (Hansson et al., 2009). Cette flore est qualifiée de résidente au niveau du tube digestif (Harris, 1993), et plus généralement de flore autochtone (Romero et al., 2002). 153 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves L’objectif de cette partie a été d’évaluer les déterminismes d’hôte et d’habitat des communautés bactériennes associées au bivalve (CBAB) au sein des différents organes de l’hôte plus ou moins en contact avec l’habitat. Pour répondre à cette question, nous nous sommes intéressés aux communautés bactériennes d’un modèle d’invertébré marin, la palourde japonaise Ruditapes philippinarum. Ce bivalve filtreur-fouisseur, originaire d’Asie, est de nos jours, une espèce commune et dominante des lagunes et estuaires depuis son introduction à travers le monde au début des années 1930 (Jensen et al., 2004) et présente un fort intérêt économique en tant que seconde espèce la plus exploitée au monde avec 3 millions de tonnes produites par an (FAO, 2007). Notre intérêt s’est porté sur trois types d’organes : d’un côté les branchies et le tube digestif considérés comme les sites primaires d’infection bactérienne car étant le plus en contact avec le milieu extérieur (Prieur et al., 1990) et de l’autre, le reste des tissus regroupant les organes plus internes (glande digestive, pied, manteau, gonade, cœur, hémolymphe) séparés du milieu extérieur par des barrières physiques et immunitaires et donc potentiellement moins en contact direct avec l’habitat environnant. Afin d’appréhender l’influence de l’état physiologique du bivalve sur les CBAB, deux lots de palourdes aux caractéristiques physiologiques différentes ont été étudiés. Ces deux lots provenaient de deux sites aux caractéristiques contrastées afin de pouvoir également s’interroger sur l’influence de l’habitat sur les CBAB. L’analyse a porté d’une part sur deux lots de palourdes échantillonnées dans leur habitat naturel et d’autre part sur des lots ayant subi une expérience de transplantation croisée (i.e. changement d’habitat). Les caractéristiques intrinsèques (longueur de coquille, indice de condition, paramètres hémocytaires …) des individus des différents lots ont été déterminées et une caractérisation des CBAB a été réalisée au travers d’une mesure de l’abondance bactérienne par PCR quantitative sur l’ADNr 16S bactérien et d’une analyse de la structure des communautés bactériennes par empreinte moléculaire (i.e. ARISA) sur l’intergene ribosomique16S-23S. En parallèle, une analyse de la structure des communautés bactériennes du biotope (sédiment) a été réalisée selon la même approche ARISA. L’abondance bactérienne a été mesurée par cytométrie en flux. 154 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves 2.2 Matériel et méthodes 2.2.1 Les sites d’échantillonnage Les échantillons analysés (palourdes et sédiments) ont été prélevés au niveau de deux sites de la zone intertidale du Bassin d'Arcachon, le site A et le site B (Figure III.1). Figure III.1 : Localisation des deux sites d’échantillonnage (site A et site B) dans le Bassin d’Arcachon (France) Le site A est localisé au niveau du Banc d’Arguin, un banc de sable localisé à l’entrée du Bassin d’Arcachon et préalablement décrit dans Meisterhans et al. (2011). Il se situe dans les eaux néritiques externes (ENE) (Bouchet, 1968), c'est-à-dire majoritairement sous influence des eaux océaniques (salinité : 34-35 PSU ; température : 9,5-21°C). Les palourdes sont enfouies dans un sédiment nu, de nature sablo-vaseuse (médiane granulométrique : 360µm), peu riche en matière organique (1%). En période d’immersion les bivalves sont recouverts d’une masse d’eau hébergeant des communautés phytoplanctoniques principalement composées de cyanobactéries (Données SOMLIT : Service d’Observation en Milieu LIToral, Responsable B. Sautour). Le site B (Station 11) est situé dans les eaux néritiques internes (ENI) (Bouchet, 1968). Ce site, sous influence continentale reçoit des apports d’eau douce provenant de la Leyre et par conséquent est soumis à des périodes de 155 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves dessalure (salinité : 22-32 PSU ; température : 1-25°C). Les bivalves sont enfouis dans un sédiment de nature vaso-sableuse (médiane granulométrique : 96 µm), plus riche en matière organique (5,44%) et recouvert d’un herbier à Zostera noltii (61%). En période d’immersion les bivalves sont recouverts d’une masse d’eau hébergeant des communautés phytoplanctoniques différentes de celles du site A et principalement composées de pico et nano-eucaryotes, de cryptophycées et de procaryotes hétérotrophes (Données SOMLIT). Les deux lots de palourdes proviennent donc de deux habitats contrastés tant par les caractéristiques physiques et chimiques des sédiments et de la colonne d’eau de ces habitats que par la composition des communautés planctoniques présentes. 2.2.2 Dispositif expérimental 2.2.2.1 Etude de deux lots de palourdes dans leur habitat naturel Une étude des individus des deux lots a été réalisée in situ. Sur chacun des deux sites, seize individus de taille adulte (30-50 mm) ont été prélevés en avril 2010 et en novembre 2010 c'est-à-dire à deux périodes différentes du cycle biologique des palourdes (avant/après ponte). - 6 individus à des fins de mesure de l’abondance bactérienne par qPCR et de la diversité bactérienne par ARISA mais également pour des mesures des paramètres hémocytaires [concentration totale en hémocytes (THC) ; taux de phagocytose] - 5 individus pour une mesure des longueurs coquillères et des indices de condition - 5 individus pour des mesures de la concentration en ATP, du niveau d’activité des acides malonedialdéhydes (MDA), et de leur signature isotopique (δ13C et δ15N). Les 10 derniers individus ont permis de décrire l’état physiologique de la population sur chacun des deux sites. 2.2.2.2 Transplantation croisée En parallèle, sur chacun des deux sites, 181 palourdes ont été prélevées en avril 2010. De manière à différencier les deux lots, un marquage a été réalisé sur les coquilles des 156 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves palourdes à l’aide de vernis selon un code couleur. Les individus de chaque lot ont ensuite subi une étape de dépuration pendant 6,5 jours afin d’homogénéiser leurs communautés bactériennes transitoires liées à la transmission latérale par balnéation dans un bassin à flux continu d’environ 25m2 d’eau déposée (Société CODIMER, Gujan Mestras, France) (Furfari, 1966). Puis ils ont été soit réimplantés sur leur site d’origine soit transplantés sur le second site (Figure III.2). Sur chaque site (A et B) et pour chacun des lots, 3 cages contenant chacune 55 individus ont été disposées afin de retrouver les individus dépurés parmi la population autochtone. Lot A Lot B Avril Réimplantation sur le site A Lot A/A Transplantation sur le site B Lot A/B Réimplantation sur le site B Lot B/B Transplantation sur le site A Lot B/A Mesure de l’abondance et de la diversité bactériennes T’0 Dépuration (6,5 jours) T’6 Figure III.2: Plan expérimental simplifié de l’expérience de transplantation croisée A la fin de la période de dépuration (T’0) et 6 mois (T’6) après la réimplantation/transplantation, 16 individus (5, 5 et 6 individus par cage) par lot ont été échantillonnés permettant les mêmes séries de mesures que celles réalisées lors de l’étude des deux lots de palourdes dans leur habitat naturel. Les individus vivants restant à T’6 ont été dénombrés afin de calculer un taux de survie des individus. 157 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves 2.2.2.3 Echantillonnage de carottes de sédiment Une mesure de la diversité bactérienne des sédiments a également été réalisée. Pour cela, début avril, fin avril, début juin, fin juillet, et début novembre 2010, six carottes de sédiment ont également été prélevées afin d’analyser les communautés procaryotes à l’interface eau-sédiment (0-0,5 cm). Trois carottes ont permis de mesurer l’abondance procaryote par cytométrie en flux ; les trois autres ont permis une analyse de la diversité bactérienne par ARISA. 2.2.3 Traitement et analyses des échantillons: 2.2.3.1 Echantillons de palourdes 2.2.3.1.1 mesures des indices de condition A chaque temps de prélèvement, les longueurs coquillères et les indices de condition (IC) ont été mesurés sur 5 individus par lots afin d’estimer le taux de remplissage moyen d’un individu pour chaque lot. Les longueurs, largeurs et hauteurs coquillères ont été mesurées au centimètre près, à l’aide d’un pied à coulisse. Le poids de l’individu entier a été également mesuré. Les individus ont ensuite été ouverts, leur chair égouttée, pesée afin de déterminer le poids frais de chair. Les chairs ont ensuite été placées 48 h dans une étuve (60°C) dans des coupelles d’aluminium, préalablement pesées et numérotées, afin de déterminer le poids sec de chair. Les coquilles séches ont été également pesées. L’ensemble de ces pesées a été réalisé au moyen d’une balance de précision (ABT 100-5M ; Kern and Sohn, Balingen-Frommern, Allemagne) avec une incertitude de 0,001g. A partir des mesures réalisées un IC a été calculé selon la formule définie par Walne and Mann (1975): IC (‰) = poids sec de chair (mg) / poids sec de coquille (g) 158 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves 2.2.3.1.2 mesure du fractionnement isotopique Une analyse des isotopes stables a été réalisée afin de comparer le régime alimentaire et le niveau trophique des palourdes appartenant aux 2 lots. Sur chaque individu, les muscles adducteurs postérieurs ont été prélevés afin de connaitre le fractionnement isotopique en δ13C et δ15N. Les prélèvements de muscles ont été placés dans des piluliers préalablement nettoyés dans un bain d’acide (HCl 1,2N) (Kennedy et al., 2005), rincés trois fois à l’eau MilliQ (Millipore Corporation), séchés dans une étuve à 60°C et enfin calcinés pendant 4h dans un four à 450°C. Les échantillons ont été conservés à -20°C jusqu’à analyse. Avant analyse, les échantillons ont été lyophilisés au minimum 4h puis réduits en poudre avant d’être remis au sec et à l’abri de la lumière dans les piluliers. Le δ13C et de δ15N ont été directement mesurés sur la poudre obtenue. Les valeurs de δ13C et de δ15N ont été mesurées à partir de 0,5 à 0,7 mg d’échantillon (préalablement pesé dans des nacelles en étain) à l’aide d’un analyseur élémentaire (EA; NC2500, CarloErba®) couplé à un spectromètre de masse de rapport isotopique (IRMS; Isoprime, GV Instruments®) selon le protocole décrit par Dang et al. (2009). La dérive journalière du spectromètre de masse a été corrigée à l’aide de standards (caséine et glycine). Les valeurs absolues ont été corrigées grâce à un standard certifié (acétanilide). 2.2.3.1.3 mesures des paramètres hémocytaires Sur chaque individu destiné à l’analyse de l’abondance et de la diversité des communautés bactériennes 0,5 à 1 mL d’hémolymphe a été prélevé à travers la charnière du bivalve préalablement nettoyée à l’alcool, dans le muscle adducteur postérieur à l’aide d’une seringue de 2 mL équipée d’une aiguille stérile (Terumo 25G, Louvain, Belgique). Le prélèvement a été immédiatement observé au microscope (grossissement x40 ; NIKON SMZ1500, HR plan Apo) pour vérifier la pureté du prélèvement (i.e.présence d’hémocytes uniquement). L’hémolymphe a ensuite été filtrée sur une maille de 80µm afin d’éliminer les particules de grandes tailles pouvant entrainer ultérieurement une obstruction du capillaire du cytomètre en flux, transférée dans un microtube stérile et conservée dans la glace avant d’être 159 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves aliquotée pour des mesures de concentration en hémocytes totaux ou THC (Total Hemocyte Count) et des taux de phagocytose. D’une part, afin de réaliser le dosage des hémocytes totaux, 50µL d’hémolymphe ont été dilués volume à volume dans de l’eau de mer naturelle filtrée (filtre 0,7µm de diamètre) et stérilisée (autoclave 121°C, 20 min) (EMNF), puis fixés par ajout d’un volume de formolEMNF (formol 37% filtré sur 0,22 µm et dilué au 1/5ème dans de l’EMNF) et enfin conservés moins d’une semaine, dans le noir et à 4°C jusqu’à l’analyse en cytométrie. D’autre part, afin de déterminer le taux de phagocytose, 20 µL d’une solution de billes fluorescentes (Fluoresbrite TM plain YG-2.0 µm microsphères 2.5% solids-latex. Polysciences, Inc, Warrington, PA 18976 ; diluée au 1/50ème) ont été ajoutés à un aliquot de 100 µL d’hémolymphe. L’ensemble a été incubé 2 heures dans un bain marie à 18°C afin de permettre aux hémocytes actifs de phagocyter les billes. Les échantillons ont ensuite été fixés et conservés selon le même protocole que pour les THC. Le THC et le pourcentage d’hémocytes ayant phagocyté au moins trois billes (pourcentage de phagocytose) par échantillon ont ensuite été déterminés par Christophe Lambert (IR CNRS, UMR 6539 LEMAR, Brest) en cytométrie en flux (Facscalibur, Becton Dickinson; 30 sec ; débit high) 2.2.3.1.4 analyses de l’abondance et de la diversité des communautés bactériennes des palourdes Après le prélèvement de l’hémolymphe, le bivalve a été ouvert. Les branchies (Br) ont été prélevées à l’aide de pinces et ciseaux stériles ; le tube digestif (TD) a été extrait sous loupe binoculaire (SMZ1500 ; Nikon, Champigny sur Marne, France) et le reste des tissus (Re) (i.e. glande digestive, pied, manteau, cœur …) a été poolé. Chaque organe a ensuite été pesé à 0,01 mg près. Puis chaque organe a été broyé à l’aide d’un homogénéisateur de tissus (blade OMNI TH) dans un volume de tampon de broyage (100mM Tris-HCl [pH 8.0], 100mM Na EDTA [pH 8.0]) spécifique pour chaque organe (3 mL pour la branchie, 1 mL pour le tube digestif, 30 mL pour le reste des tissus). 160 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves Après homogénéisation, 400µL de broyat ont été prélevés et additionnés d’1mL de tampon permettant la préservation de l’ADN (100mM Tris-HCl [pH 8.0], 100mM Na EDTA [pH 8.0], 1.5M NaCl and 1% [wt/vol] cetyltrimethylammonium bromide) (Zhou et al, 1996) puis congelés à -80°C jusqu’à l’extraction de l’ADN. 2.2.3.1.4.1 extraction/purification et dosage de l’ADN total A partir des échantillons conservés à -80°C, l’ADN total a été extrait et purifié selon le protocole décrit précédemment dans Meisterhans et al. (2011) (Chapitre III, partie 1). Ce protocole combine l’utilisation d’une méthode de lyse mécanique des cellules par « bead beating » (FastPrep et lysis matrix A; 6 m∙s-1; 40 s, MP Biomedicals, Illkirch, France) et d’une méthode de lyse chimique couplée à une purification sur colonne de silice grâce à un kit d’extraction / purification (QIAamp DNA Mini Kit ; QIAgen, Courtaboeuf, France). Les extractions et purifications de l’ADN total des échantillons de palourde ont été réalisées à partir d’un volume de chair broyée équivalent à 5 mg de tissu (poids frais) quelque soit l’organe. L’ADN extrait et purifié a été élué dans de l’eau ultra pure (Sigma Aldrich, St. Quentin Fallavier, France). L’ADN extrait a été dosé par spectrofluorimétrie (LS 55, PerkinElmer, Courtaboeuf, France) via l’utilisation de SYBR® Green I (Molecular Probes, Invitrogen, Cergy Pontoise, France), et d’une solution standard d’ADN (calf thymus DNA 1mg∙mL-1 ; Sigma Aldrich, St. Quentin Fallavier, France) selon le protocole décrit dans Meisterhans et al. (2011) (Chapitre III, partie 1). L’ADN extrait et dosé a ensuite été conservé à -80°C jusqu’à l’analyse de l’abondance et de la diversité bactériennes. 2.2.3.1.4.2 diversité des communautés bactériennes par ARISA La diversité des communautés bactériennes des palourdes a été analysée par ARISA. Pour chaque échantillon, trois amplifications indépendantes ont été réalisées à partir de la même quantité d’ADN (10 ng). Des amorces bactériennes universelles (Ranjard et al., 2000) ont été utilisées, SDBact : (5’-TGC GGC TGG ATC CCC TCC TT-3’), marquée à l’extrémité 5’ avec le fluorochrome 5-FAM phosphoramidite) et LDBact (5’-CCG GGT TTC CCC ATT CGG-3’) (Molecular Probes, Invitrogen) selon le protocole décrit dans Meisterhans et al. 161 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves (2011) (Chapitre III, partie 1). Les amplicons ont été purifiés via l’utilisation du kit QIAquick purification (QIAgen, Courtaboeuf, France). L’ARISA a été réalisée à partir de 2 ng d’amplicon purifié et d’un standard interne (LIZ1200 ; Applied Biosystems) sur un 3730XL Capillary Genetic Analyser (Applied Biosystems Ltd.) en collaboration avec la Plateforme Genome-Transcriptome de Pierroton (INRA, Bordeaux-Aquitaine). 2.2.3.1.4.3 abondance des communautés bactériennes A partir des extraits d’ADN totaux purifiés et dosés, le nombre de copies d’opérons ribosomiques 16S dans chaque échantillon a été estimé par PCR quantitative en temps réel, selon la méthode de Lopez-Gutierrez et al. (2004). Le couple d’amorces bactériennes 341f (5’-CCT ACG GGA GGC AGC AG-3’) et 515r (5’-ATT CCG CGG CTG GCA-3’) a été utilisé. Pour chaque échantillon, trois amplifications indépendantes ont été réalisées sur Mx3000P QPCR System (Stratagene) en utilisant le kit « Brillant SYBR® Green QPCR Master Mix » (Agilent Technologies) selon les conditions recommandées par le fabriquant (protocole « Mx3000P Instrument » du manuel d’utilisation): 95 °C pendant 10 min ; 45 cycles à (a) 95 °C pendant 30 sec, (b) 50 °C pendant 30 sec et (c) 72 °C pendant 30 sec ; 1 cycle à (a) 95 °C pendant 1 min, (b) 65 °C pendant 30 sec et (c) 95 °C pendant 30 sec. Trois courbes étalons par run ont été réalisées, simultanément à l’amplification des échantillons, à l’aide d’un plasmide contenant une copie de l’opéron ribosomique 16S d’Escherichia coli (plasmide pGEM®-T, Promega, Charbonnières-les-Bains, France). 2.2.3.2 Echantillons de sédiments Des mesures d’abondance procaryote et de diversité bactérienne ont également été réalisées au niveau des sédiments de chaque site. Pour chaque carotte, la couche de sédiment comprise entre 0 et 0,5 cm de profondeur (interface eau-sédiment) a été prélevée puis homogénéisée à l’aide d’une spatule dans une coupelle stérile. Un échantillon de 1cm3 de sédiments homogénéisés a été prélevé à l’aide d’une seringue de 2 mL tronquée (TERUMO). Les échantillons destinés à une mesure de l’abondance bactérienne par cytométrie en flux ont été conservés dans un 1mL de formol 7,4%-EMNF. Les échantillons destinés à une mesure de 162 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves la diversité des communautés bactériennes par ARISA ont été conservés dans un 2,5 mL de tampon de préservation de l’ADN comme décrit dans Meisterhans et al. in prep (Chapitre II, partie 1). L’ensemble des échantillons a été conservé à -80°C jusqu’à analyse. 2.2.3.2.1 analyse de l’abondance et de la diversité des communautés bactériennes des sédiments 2.2.3.2.1.1 extraction/purification et dosage d’ADN total La même démarche que celle utilisée pour les échantillons de palourdes a été utilisée pour extraire, purifier et doser l’ADN total des sédiments. L’extraction et la purification de l’ADN à partir d’une matrice sédimentaire requièrent toutefois l’utilisation de kits adaptés. L’extraction/purification a donc été réalisée sur un volume équivalent à 200 µL de sédiment à partir des kits FastPrep Lysing Matrix E (FastPrep System, MP biomedicals) et UltraClean® Soil DNA Isolation kit (MOBIO Laboratories Inc.). L’ADN extrait et purifié a été dosé par spectrofluorimétrie comme décrit précédemment puis conservé à -80°C. 2.2.3.2.1.2 abondance des communautés bactériennes A partir des échantillons conservés dans du formol-EMNF, stockés à - 80 °C, la fraction organique contenant les procaryotes a été purifiée par migration forcée sur un gradient de concentration (Gentodenz®) puis les procaryotes ont été dénombrés par cytométrie en flux (run de 1 min à faible débit) (Plateforme Cytométrie-Imagerie du Laboratoire Arago, Banyuls/Mer) selon le protocole décrit dans Meisterhans et al. in prep (Chapitre II, partie 1). 2.2.3.2.1.3 diversité des communautés bactériennes par ARISA A partir des échantillons conservés dans du tampon de préservation de l’ADN, stockés à - 80 °C, une mesure de la diversité des communautés bactériennes a été réalisée par ARISA selon le même protocole que celui décrit précédemment pour les échantillons de palourdes. 163 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves 2.2.4 Traitement de données et analyse statistique Afin d’analyser les données de diversité β mesurée par ARISA, un traitement de données issues des arisogrammes a été réalisé in silico. Ce traitement plus amplement détaillé dans Meisterhans et al. (2011) (Chapitre III, partie 1), consiste, d’abord en l’élimination du bruit de fond au moyen du calcul d’un optimal divisor (Osborne et al., 2006). Cet optimal divisor a été estimé à 1/750 pour les arisogrammes des échantillons de palourdes (i.e. élimination des pics dont l’aire contribue pour moins de 1/750ème de l’aire totale de l’ensemble des pics) et à 1/1000 pour les arisogrammes des échantillons de sédiments. Ce traitement est suivi par une procédure de binning selon Ramette (2009) via l’utilisation de l’algorithme « interactive binner » (http://www.ecology-research.com) sous le logiciel R (http://cran.r-project.org/). Le binning permet un alignement des arisogrammes par la détermination d’une valeur de fenêtre. Cette valeur de fenêtre a été estimée à 2 ± 0,1 (WS : 2 ; Sh : 0,1). A partir de la matrice d’abondance relative obtenue, une matrice de similarité de Bray-Curtis a été calculée via le logiciel Primer 6.0 (PRIMER-E Ltd). La significativité et l’amplitude des différences de structure des communautés bactériennes de groupes d’échantillons définis a priori ont été déterminées par ANOSIM sous le logiciel Primer V06 (PRIMER-E Ltd). La significativité des différences des données quantitatives (abondances bactériennes/procaryotes des palourdes et des sédiments, richesse et evenness des communautés bactériennes, caractéristiques physiologiques des palourdes) a été déterminée par des ANOVA non paramétriques (ANOVA de Mann-Whitney ou de Wilcoxon pour comparer 2 groupes d’échantillons indépendants ou appariés; ANOVA de KruskallWallis ou de Friedman pour comparer plus de 2 groupes d’échantillons indépendants ou appariés). Ces tests ont été réalisés à l’aide de la macro-commande Merlin sur Excel 2007. Le seuil de significativité retenu a été de 0,05 ; une valeur inférieure à 0,01 indiquant une significativité importante. 164 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves 2.3 Résultats 2.3.1 Deux habitats contrastés : diversité β des communautés procaryotes des sédiments A partir des prélèvements sédimentaires de l’horizon 0-0,5 cm réalisés d’avril à novembre 2010 (3x5 échantillons), les abondances en procaryotes mesurées par cytométrie en flux et les structures des communautés bactériennes déterminées par ARISA ont été comparées entre les deux sites A et B. Au cours de ce suivi, aucune différence d’abondance en procaryotes n’a été observée entre les deux sites (Mann-Whitney, p > 0,05), chaque site hébergeant en moyenne 7,1 ± 5,4 107 cell.g-1 de sédiment sec. En revanche, les communautés bactériennes des deux sites présentaient, indépendamment du temps, de fortes différences de structure (1way-ANOSIM, R = 0,847, p < 0,01) (Figure III.3) bien que plus faibles en novembre qu’en avril (similarité de BrayCurtis : 12,36 vs 33,39). Près de la moitié (48,4 %) de la dissimilarité entre les deux types de communautés bactériennes a pu être expliquée par les différences de contribution de quelques OTU entre les deux sites. Les abondances relatives des OTU #344, #510, #432, #502 et #383 étaient plus importantes sur le site A que sur le site B alors que les abondances relatives des OTU #266, #258, #278, #276 et #320 étaient plus fortes sur le site B que sur le site A. 165 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves 2D Stress: 0,11 Stress: 0,11 Figure III : MDS, basé sur l’analyse des similarités de Bray-Curtis, représentant les patrons des communautés bactériennes du sédiment à l’interface eau-sédiment des deux habitats (carrés noirs : site A, carrés blancs : site B). La valeur de stress indique la bonne qualité de la représentation de la matrice de similarité en 2 dimensions. 2.3.2 Deux lots de palourdes différenciés: description des caractéristiques des individus Les mesures d’ATP et de MDA n’ayant pas été réalisées à ce jour, aucun résultat ne sera présenté dans ce chapitre. 2.3.2.1 Indices de condition Les résultats prennent en compte les données en avril et en novembre. Les coquilles des individus prélevés sur le site A étaient significativement plus longues que celles des individus prélevés sur le site B (44,4 ± 0,8 mm vs 29,0 ± 0,9 mm ; Mann-Whitney p < 0,01) (Figure III.4). De même, les indices de condition des individus du lot A étaient significativement plus élevés que ceux du lot B (62,4 ± 4,4 ‰ vs 37,6 ± 3,7 ‰ ; Mann-Whitney, p < 0,01) (Figure III.4). 166 100 50 80 40 60 30 40 20 20 10 0 0 Avril T0 Longueur coquillère (mm) Indice de condition (‰) Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves Novembre T6 Figure III.4 : Indices de condition (histogrammes) et longueurs coquillères (carrés) des individus prélevés sur le site A (noir) et sur le site B (blanc). Les écarts types sont représentés sous forme de traits noirs. 2.3.2.2 Fractionnement isotopique Les individus des deux lots de palourdes présentaient un fractionnement isotopique en δ13C significativement différents (-17,2 ± 0,1 ‰ vs -18,5 ± 0,1 ‰ ; Mann-Whitney, p < 0,01) mais le même fractionnement isotopique en δ15N (8,3 ± 0,4 ‰ ; Mann-Whitney, p > 0,05) (Figure III.5). 9,2 δ15N (‰ ) 8,8 8,4 8,0 7,6 -16,0 -17,0 -18,0 -19,0 -20,0 δ13C (‰) Figure III.5 : Fractionnement isotopique (δ13C et δ53N) des muscles adducteurs postérieurs des individus du lot A (losanges noirs) et du lot B (losanges blancs). 167 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves 2.3.2.3 Paramètres hémocytaires En avril, la concentration en hémocytes totaux (THC) circulant dans l’hémolymphe (1,7± 1,2 105 cell.mL-1 d’hémolymphe) ainsi que le taux de phagocytose (50,2 ± 9,9 % de cellules actives) étaient identiques pour les deux lots d’individus (Mann-Whitney, p > 0,05). En revanche, en novembre, les individus du lot A présentaient une THC 20 fois supérieure à celle des individus du lot B (Mann-Whitney, p < 0,01), mais un taux de phagocytose 0,7 fois inférieure (Mann-Whitney, p < 0,01). 2.3.3 Caractérisation des communautés bactériennes des palourdes L’abondance bactérienne a été estimée par PCR quantitative en temps réel en avril et en novembre sur 6 individus par lot et sur 3 organes (Br, TD et Re) par individu. Cette abondance a été exprimée en nombre de copies d’ADNr 16S par gramme de tissu. 2.3.3.1 Etude des individus dans leur habitat naturel 2.3.3.1.1 comparaison entre les 2 lots de palourdes Quelque soit le temps d’échantillonage considéré, aucune différence significative d’abondance bactérienne par individu n’a été observée entre les deux lots de palourdes (Mann-Whitney, p > 0,05) avec en moyenne 2,4 ± 1,6 .109 copies d’ADNr 16S. ind-1. Cependant, le poids frais moyen de tissu des individus du lot A était environ 4 fois supérieur à celui des individus du lot B (5,7 ± 1,8 g vs 1,1 ± 0,2 g ; Mann-Whitney, p < 0,01). De ce fait, la concentration en bactéries (exprimée par gramme de tissu) était donc 4 fois supérieure pour les individus du lot B par rapport à ceux du lot A. Si en avril, l’analyse des similarités de Bray-Curtis a fait apparaitre une différence entre les communautés bactériennes du lot A et celles du lot B (2way-ANOSIM, R= 0,347, p < 0,01), aucune différence n’a été observée en novembre (2way-ANOSIM, p > 0,05). Plus précisément, seule une différence significative entre les deux lots de palourdes a été observée en avril pour les communautés bactériennes des branchies (1way-ANOSIM, R = 0,647, 168 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves p < 0,01) et du tube digestif (1way-ANOSIM, R = 0,385, p < 0,01) ; celles du reste ne présentant pas de différence (1way-ANOSIM, p > 0,05). En revanche, seules les communautés bactériennes associées au reste présentaient une différence significative de richesse taxonomique en avril entre les deux lots de palourdes (lot A : 70 ± 5 OTU vs lot B : 50 ± 11 OTU ; Mann-Whitney, p < 0,01). Aucune différence de l’indice de Simpson n’est observée entre les communautés bactériennes des deux lots palourdes quelque soit l’organe et le temps (Kruskall-Wallis, p > 0,05). 2.3.3.1.2 comparaison des communautés bactériennes entre organes Aucune différence significative d’abondance bactérienne n’a été observée entre les trois organes des individus du lot A (Friedman, p = 0,47) avec une abondance moyenne de 1,6 ± 2,9.1010 copies d’ADNr 16S. g-1 de tissu. En revanche, les individus du lot B présentaient une abondance bactérienne significativement plus élevée au niveau des branchies (2,3 ± 2,4.1011 copies d’ADNr 16S. g-1 de tissu) par rapport aux deux autres organes (4,8 ± 4,5.1010 copies d’ADNr 16S. g-1 de tissu) (Wilcoxon, p < 0,05). L’analyse des similarités de Bray-Curtis, tenant compte des deux temps d’échantillonnage (avril et novembre), a mis en évidence une différence entre les communautés bactériennes des trois organes. Cette différence était plus marquée pour les individus du lot A (2way-ANOSIM, R = 0,317, p < 0,01) que pour ceux du lot B (2wayANOSIM, R = 0,122, p <0,05). Quelque soit le lot, aucune différence de richesse taxonomique n’a été observée entre les organes (53 ± 16 OTU détectées par organe ; Friedman, p > 0,05). Seules les communautés bactériennes du lot A ont montré des différences « evenness » entre organes (Friedman, p < 0,05). En effet, l’indice de Simpson indiquait une diversité plus faible des communautés bactériennes associées au tube digestif (0,10 ± 0,07) par rapport à celles des branchies (0,08 ± 0,03) et du reste (0,06 ± 0,02). En revanche, les communautés bactériennes du lot B avaient un indice de Simpson constant entre organe (0,10 ± 0,07 ; Friedman, p > 0,05). 2.3.3.1.3 comparaison des communautés bactériennes entre palourdes et sédiment Les communautés bactériennes associées aux organes des palourdes étaient significativement différentes des communautés bactériennes du sédiment de leur habitat respectif (2way-ANOSIM, R = 0,827 p < 0,01) avec une dissimilarité de Bray-Curtis de 169 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves 81,4 %. (Figure III.6). Cette différence était plus importante pour les communautés associées au reste (2way-ANOSIM, R = 0,821 p < 0,01) que pour celles du tube digestif (2wayANOSIM, R = 0,781, p < 0,01) et des branchies (2way-ANOSIM, R = 0,774, p < 0,01). Les communautés bactériennes des sédiments se caractérisaient par une richesse taxonomique très supérieure à celle des palourdes (89 ± 19 OTU vs 53 ±16 OTU ; MannWhitney, p < 0,01) alors que ces deux types de communautés ont une « evenness » identique (indice de Simpson = 0,09 ± 0,05 ; Mann-Whitney, p >0,05). Cette comparaison a été effectuée à partir des résultats obtenus après une amplification sur la même quantité de matrice ADN. 2D Stress: 0,14 Stress : 0,14 matrice palourde sediment Figure III.6 : MDS, basé sur l’analyse des similarités de Bray-Curtis, représentant les patrons de diversité des communautés bactériennes du sédiment (carrés) et des palourdes (triangles) indépendamment du site. La valeur de stress indique la bonne qualité de la représentation de la matrice de similarité en deux dimensions. 2.3.3.2 Expérience de transplantation croisée 2.3.3.2.1 dépuration Après 6,5 jours de dépuration par balnéation dans une eau déposée, aucune modification significative (comparée à l’état initial en avril) de la longueur coquillère (lot A : 45,2 ± 2,2 mm ; lot B 29,4 ± 3,4 mm), de l’indice de condition (lot A : 65,3 ± 17,3 ‰; lot B : 25,8 ± 4,1 ‰;), de la THC (1,12 ± 0,9 105 cell.mL-1 d’hémolymphe) ni du pourcentage de 170 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves phagocytose (63 ± 12 % de cellules actives), n’a été observée pour le lot A comme pour le lot B (Mann-Whitney, p > 0,05) (Tableau III.1). De même, aucune diminution significative de l’abondance bactérienne n’a été observée et cela quelque soit le lot de palourdes. Les individus du lot B présentaient donc une abondance bactérienne par gramme de tissu environ 4 fois supérieure à celle des individus du lot A. D’autre part, la comparaison des similarités de Bray-Curtis a montré une réduction des différences entre les communautés bactériennes des individus des deux lots (2way-ANOSIM, R = 0,141, p < 0,05). Plus précisément, après dépuration seules les communautés bactériennes associées aux branchies conservent une différence entre les 2 lots de palourdes (1wayANOSIM, R = 0,263, p < 0,05). Les communautés du tube digestif ne présentaient plus de différence entre les 2 lots (ANOSIM, p > 0,05), et celles associées au reste conservaient leur similarité (ANOSIM, p > 0,05). Cette réduction des différences inter-lot s’est traduit également par une augmentation significative des similarités de Bray-Curtis des communautés bactériennes associées au reste (T0 : 43 ± 11% vs T’0: 69 ± 9 %). Aucune différence de richesse taxonomique ni d’« evenness » n’a été observée à l’échelle de l’organe entre les individus des deux lots (Mann-Whitney, p > 0,05). 2.3.3.2.2 réimplantation/transplantation 2.3.3.2.2.1 comparaison des caractéristiques physiologiques des individus appartenant aux différents lots de palourdes Après 6 mois, le taux de survie des individus du lot A réimplantés sur le site A (lot A/A) a été estimé à 100% alors que seulement 43% des individus du lot B réimplantés sur le site B (lot B/B) ont survécu. Les individus du lot A transplantés sur le site B (lot A/B) avaient un taux de survie moindre comparé à celui du lot A/A (95 % vs 100%). Au contraire, les individus du lot B transplantés sur le site A (lot B/A) présentaient un taux de survie plus important que celui des individus du lot B/B (63% vs 43 %). 171 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves Les individus des deux lots n’ont montré aucune croissance comme le prouve l’absence de différence significative des longueurs coquillères entre T’0 et T’6 (MannWhitney, p > 0,05). Les individus du lot A/A ont perdu en masse par rapport aux individus à T’0 (Mann-Whitney, p < 0,05) alors que les individus du lot B/B ne présentaient quand à eux aucune variation de leurs indices de conditions par rapport aux individus à T’0 (MannWhitney, p > 0,05). Les individus du lot A/B avaient un indice de condition significativement plus faible que celui des palourdes de même origine (lot A/A) (Mann-Whitney, p < 0,01) mais non différent de celui des individus partageant le même habitat (lot B/B) (Mann-Whitney, p > 0,05). En revanche les individus du lot B/A avaient un indice de condition significativement plus élevé que celui des palourdes de même origine (lot B/B) (MannWhitney, p < 0,01) mais non différent de celui des individus partageant le même habitat (lot A/A) (Mann-Whitney, p > 0,05). L’ensemble des valeurs d’indices de condition est présenté dans le tableau III.1. Lot A/A Lot B/B Lot A/B Lot B/A Longueur (mm) Indice de condition (‰) THC (cell.mL-1) Taux de phagocytose (%) T'0 T'6 T'0 T'6 T'0 T'6 T'0 T'6 Moyenne Ecart type Moyenne Ecart type Moyenne Ecart type Moyenne Ecart type Moyenne Ecart type Moyenne Ecart type Moyenne Ecart type Moyenne Ecart type 45,2 2,2 42,4 4,0 65,3 17,3 29,4 3,4 28,4 2,1 25,8 4,1 45,2 2,2 42,8 4,1 65,3 17,3 29,4 3,4 29,4 1,3 25,8 4,1 61 8 29 3 34 13 62 9 88204 87355 1005595 696532 64 12 29 11 135507 101074 163262 149889 62 11 43 14 88204 87355 183143 131205 64 12 55 12 135507 101074 837905 564317 62 11 27 7 Tableau III.1 : caractéristiques physiologiques des individus des lots réimplantés (A/A et B/B) et des lots transplantés (A/B et B/A). Les individus du lot A/A présentaient une THC 6 fois supérieure à celle des individus du lot B/B (Mann-Whitney, p < 0,01), mais le taux de phagocytose etait identique entre les deux lots de palourdes réimplantés (Mann-Whitney, p > 0,05). Les THC et les pourcentages de phagocytoses des individus transplantés étaient significativement différentes de ceux des 172 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves individus de même origine et identiques à ceux des individus partageant le même habitat (Mann-Whitney) (Tableau III.1). 2.3.3.2.2.2 comparaison des communautés bactériennes des individus transplantés (A/B et B/A) avec celles des individus réimplantés (A/A et B/B) Seules les communautés bactériennes associées aux branchies ont montré des différences d’abondances. En effet les abondances bactériennes au niveau de cet organe étaient identiques pour les lots A/B et B/B (3,6 ± 3,1 1010 copies.d’ADNr 16S g-1 de tissu, Mann-Whitney, p > 0,05) alors qu’elles diffèraient de celles du lot A/A (4,3 ± 6,2 109 copies.d’ADNr 16S g-1 de tissu, Mann-Whitney, p < 0,05). De même, ces abondances étaient identiques pour les lots B/A et A/A (5,9 ± 6,6 109 copies d’ADNr 16S. g-1 de tissu MannWhitney, p > 0,05) alors qu’elles diffèraient de celles du lot B/B (2,8 ± 2,0 1010 copies d’ADNr 16S. g-1 de tissu Mann-Whitney, p < 0,05). Pour les autres organes, aucune différence d’abondance des communautés bactériennes n’a été observée entre les lots (tube digestif : 1,4 ± 1,9 1010 copies d’ADNr 16S. g-1 de tissu ; reste: 2,2 ± 3,2 1010 copies d’ADNr Abondance bactérienne (nombre de copie d’ADNr 16S. g-1 de tissu) 16S. g-1 de tissu ; Mann-Whitney, p > 0,05) (Figure III.7). 1,20E+11 1.2 1011 8,00E+10 0.8 1011 0.4 1011 4,00E+10 0,00E+00 Lot A/A Lot A/B Lot B/A Lot B/B Figure III.7 : Abondances bactériennes associées aux organes d’individus appartenant aux lots de palourdes réimplantés (lot A/A et lot B/B) ou transplantés (lot A/B et B/A). Branchies: histogramme noir, tube digestif: histogramme gris et reste des organes: histogramme blanc. Les barres fines représentent les écarts-types. 173 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves A l’échelle de l’individu, l’analyse des similarités de Bray-Curtis a montré en premier lieu une différence significative entre les communautés bactériennes des lots de palourdes réimplantées dans leur habitat d’origine (A/A et B/B) et celles des palourdes transplantées dans un autre habitat (A/B et B/A) (2way-ANOSIM, R = 0,28 p < 0,01) (Figure III.8). La différence est expliquée à plus de 12 % par la contribution de l’OTU 286 qui présentait une abondance relative au niveau des branchies et des restes plus importante chez les individus des lots transplantés (A/B et B/A) que chez ceux des lots réimplantés (A/A et B/B). Cette même OTU 286 présentait une abondance relative plus importante au niveau du tube digestif des individus des lots réimplantés (A/A et B/B). 2D Stress: 0,16 Stress: 0,16 Figure III.8 : MDS, basé sur l’analyse des similarités de Bray-Curtis, représentant les patrons des communautés bactériennes des palourdes réimplantées sur leur site d’origine (A/A et B/B) (symboles noirs) ou transplantées (A/B et B/A) (symboles blancs). La valeur de stress indique la bonne qualité de la représentation de la matrice de similarité en deux dimensions. De manière plus détaillée, les communautés bactériennes associées aux branchies chez les individus transplantés (A/B ou B/A) étaient significativement différentes de celles des branchies de tous les individus réimplantés, qu’ils partagent le même habitat ou la même origine (1way-ANOSIM ; Tableau III.2). 174 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves Les communautés bactériennes associées au tube digestif chez les individus transplantés du lot A/B étaient significativement différentes de celles associées au tube digestif de tous les individus réimplantés, qu’ils partagent le même habitat ou la même origine (1way-ANOSIM ; Tableau III.2). En revanche les communautés bactériennes associées au tube digestif des individus transplantés du lot B/A étaient identiques uniquement à celles des individus réimplantés d’origine différente mais partageant le même habitat (lot A/A ; 1wayANOSIM p > 0,05). Elles diffèraient donc de celles des individus réimplantés de même origine mais ne partageant pas le même habitat (lot B/B ; 1way-ANOSIM, Tableau III.2). Les communautés bactériennes associées au reste chez les individus transplantés du lot A/B étaient significativement différentes de celles associées au reste de tous les individus réimplantés, qu’ils partagent le même habitat ou la même origine (1-way ANOSIM ; Tableau III.2). Celles associées au reste chez les individus transplantés du lot B/A étaient identiques uniquement à celles des individus réimplantés de même origine mais ne partageant pas le même habitat (lot B/B, 1way-ANOSIM, p > 0,05). Elles diffèraient donc de celles des individus réimplantés d’origine différente mais partageant le même habitat (lot A/A ; 1way- Reste Tube digestif Branchies ANOSIM, Tableau III.2) Lot A/B Lot B/A Lot A/A 0,546 0,511 Lot B/B 0,357 0,376 Lot A/A 0,544 NS Lot B/B 0,522 0,231 Lot A/A 0,651 0,501 Lot B/B NS NS Tableau III.2 : Comparaison des communautés bactériennes entre lots transplantés (A/B et B/A) et lots réimplantés (A/A et B/B): valeur des R des 1-way ANOSIM. Les différences non significatives sont indiquées par la mention NS. 175 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves 2.4 Discussion Cette étude a porté sur la caractérisation des communautés bactériennes associées à un bivalve marin fouisseur, la palourde japonaise Ruditapes philippinarum. Nous nous sommes plus particulièrement intéressés aux déterminismes de ces communautés à l’échelle de trois organes. Les branchies et le tube digestif, organes en contact direct avec l’environnement, sont susceptibles d’héberger une microflore largement acquise par transmission latérale (déterminisme d’habitat). Le reste des organes plus internes et isolés de l’extérieur par des barrières physiques et physiologiques sont eux plutôt susceptibles d’héberger une microflore plus autochtone (déterminisme d’hôte). Les palourdes échantillonnées sur le site A (lot A) affichent de meilleures caractéristiques physiologiques. En effet leur capacité de croissance (longueur de coquille = 44,4 ± 0,8 mm) et leur taux de remplissage (IC= 62,4 ± 4,4 ‰) sont supérieurs à ceux des palourdes échantillonnées sur le site B (lot B). Ces observations sont en accord avec celles effectuées par Dang et al. (2009) et valident le choix de ces deux lots pour cette étude. La signature isotopique en δ13C diffère également entre les deux lots d’individus. S’il ne peut être exclu que cette différence soit partiellement liée à la physiologie des individus, elle exprimerait majoritairement une différence de régime alimentaire (Dang et al., 2009). Ces résultat sont en accord avec ceux du suivi mensuel des communautés pico- et nanoplanctoniques (sources nutritives des bivalves), réalisé dans le cadre du réseau national d’observation en milieu littoral (SOMLIT). En effet, ce suivi réalisé depuis 2003, montre une dominance des cyanobactéries au site A alors que le site B est plus riche en pico- et nanoeucaryotes, en cryptophycées et en procaryotes hétérotrophes. D’autre part, nos résultats montrent une différence de structure des communautés bactériennes entre les sédiments des deux sites (1way-ANOSIM, R = 0,847, p < 0,01) bien que les abondances procaryotes soient similaires (7,1 ± 5,4 107 cell.g-1 de sédiment sec). Ces résultats valident nos choix de sites d’étude contrastés et de lots de palourdes différenciés. Les individus du lot A issus du site A peuvent être considérés, par leur caractéristiques physiologiques, comme des individus de référence présentant un « bon état de santé ». Nous nous sommes dans un premier temps interrogés sur la notion de communautés bactériennes spécifiques à la palourde par rapport à son environnement. Il est en effet connu que certains invertébrés marins comme les éponges ou les moules hébergent une flore bactérienne spécifique différente de celle de l’habitat environnant (Frischer et al., 2000; Gerce 176 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves et al., 2011). Cette spécificité serait liée au caractère vivant de l’organisme. Il a en effet été montré qu’un organisme corallien mort ne présente pas la même flore associée qu’un organisme corallien vivant (Hansson et al., 2009). Comme les éponges, les coraux et les moules, les palourdes hébergent des communautés bactériennes qui se distinguent de celles de leur environnement ou du moins des communautés bactériennes de l’horizon sédimentaire 00,5cm (2way-ANOSIM, R = 0,827 p < 0,01) qui constituent la source nutritive principale de ces bivalves (Pieri, 1895 ; Le Treut, 1986). Les organes en contact direct avec l’environnement sont susceptibles d’héberger via la transmission latérale, une proportion de bactéries allochtones transitoires plus importante que les organes internes. Les branchies constituent l’une des premières barrières physiques et fonctionnelles réalisant un tri des particules provenant de l’environnement avant passage dans le tube digestif (Dame, 1996) et sont par conséquent les plus en contact avec l’habitat. Le tube digestif accumule, quand à lui, une flore bactérienne déjà pré-triée (Harris, 1993 ; Dame, 1996). Les organes internes (i.e. le reste dans notre étude) sont irrigués par un système circulant d’hémolymphe dont la capacité à éliminer de manière sélective certaines populations bactériennes à travers des mécanismes de phagocytose a été mis en évidence chez d’autres especes de bivalves comme Anodonta cygnea ou Mytilus galloprovincialis (Pruzzo et al., 2005 ; Antunes et al., 2010). Nos résultats montrent un gradient de dissimilarité des communautés bactériennes associées aux organes en fonction du lien plus ou moins étroit de ces organes avec l’habitat. Les communautés bactériennes associées au reste sont en effet plus dissemblables des communautés du sédiment (2way-ANOSIM, R = 0,821 p < 0,01) que celles du tube digestif (2way-ANOSIM, R = 0,781, p < 0,01) et des branchies (2way-ANOSIM, R = 0,774, p < 0,01). La présence d’une structure de communautés bactériennes associées à la palourde différente de celle des communautés bactériennes du sédiment, renforcent l’idée de l’existence de communautés bactériennes spécifiques à la palourde. Nous nous sommes ensuite interrogés sur le déterminisme des communautés bactériennes associées à la palourde. Pour cela les communautés bactériennes associées à un organe ont été comparées entre individus appartenant à deux lots de palourdes physiologiquement différentes et provenant de deux habitats contrastés. Les communautés bactériennes associées aux organes internes étaient identiques en avril et en novembre entre les deux lots de palourdes. Ces résultats suggèrent que ces communautés bactériennes sont plus étroitement liées à l’espèce Ruditapes philippinarum et ce en dépit du fait que les deux lots de palourdes étaient constitués d’individus physiologiquement différents 177 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves et provenant de deux habitats contrastés. D’après le modèle d’acquisition des communautés bactériennes par les bivalves, les populations dominantes associées aux tissus internes seraient alors acquises plus particulièrement par transmission verticale ou horizontale et pourraient résulter d’une co-évolution (ou d’une pression de sélection) entre le bivalve et son microbiote (Zurel et al., 2011). Selon Romero et al. (2001) on peut plus simplement parler de populations autochtones car présentant un caractère permanent au sein du bivalve. En avril, les communautés associées aux branchies et celles associées au tube digestif diffèrent entre les individus des deux lots. Etant donné que les deux lots de palourdes étaient constitués d’individus physiologiquement différents et provenant de deux habitats contrastés, deux hypothèses peuvent être émises : (i) les communautés bactériennes associées aux branchies et au tube digestif sont déterminées par l’habitat, (ii) et/ou par l’état physiologique des individus hôtes. En novembre, ces mêmes communautés sont identiques entre les deux lots de palourdes. A cette période, les conditions environnementales sont plus similaires entre les deux habitats. En effet, les écarts de salinité de la colonne d’eau environnante sont réduits par rapport à avril (données SOMLIT) du fait des débits plus faibles de la Leyre (affluent majoritaire du Bassin d’Arcachon) (Bouchet, 1968). L’analyse des communautés bactériennes des sédiments montrent également une plus forte similarité en novembre qu’en avril entre les 2 sites. Les communautés bactériennes des branchies et du tube digestif, apparaissaient donc comme déterminées principalement par l’habitat et seraient majoritairement constituées de populations bactériennes transitoires (ou flore de transit). Cependant, on ne peut exclure l’influence de la physiologie du bivalve sur les communautés bactériennes associées à ces deux organes, puisque les individus des deux lots de palourdes présents dans les deux habitats contrastés étaient physiologiquement différents. Afin de mettre en évidence la part du déterminisme d’habitat et du déterminisme d’hôte sur les communautés bactériennes associées à la palourde, une expérience de transplantation croisée entre les deux lots de palourdes et les deux habitats contrastés a été réalisée. Au préalable, les palourdes ont subi une étape de dépuration de 6,5 jours. Dans cette expérimentation, la dépuration a été utilisée dans le but d’éliminer les populations allochtones bactériennes transitoires apportées par transmission latérale. Comme attendu, les populations allochtones bactériennes transitoires originaires des sites A (pour le lot A) ou B (pour le lot B) ont été remplacées par des populations allochtones bactériennes transitoires du bassin de dépuration conduisant à une augmentation des similarités entre les communautés bactériennes 178 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves associées aux 2 lots de palourdes. Ce résultat est en accord avec ceux observés lors des reparcages de bivalves à des fins sanitaires (d’une durée minimum de 2 jours) et dont le but est d’éliminer des espèces bactériennes allochtones potentiellement pathogènes pour l’homme accumulées lorsque l’habitat naturel présente de manière ponctuelle ou persistante une mauvaise qualité sanitaire (Furfari, 1966). La littérature fait également état d’expériences de dépuration plus longues. Caro et al. (2009) ont expérimenté une étape de dépuration sur une période de 4 mois. Leur but était d’éliminer toutes les bactéries faiblement associées aux branchies du bivalve Codakia orbicularis afin d’avoir accès aux bactéries les plus étroitement liées à leur hôte. Après l’étape de dépuration, les communautés bactériennes associées au tube digestif des deux lots de palourdes étaient devenues semblables. Celles des branchies présentaient une différence moindre par rapport à avant l’étape de dépuration validant le procédé par balnéation dans une eau déposée. La faible différence restante pourrait être dû à un temps de dépuration trop court Cependant, Serais et al. (2010) ont montré qu’une durée de 5 jours était suffisante pour éliminer une contamination par Escherichia coli. On ne peut donc exclure que les conditions de balnéation non optimale dans les bassins de dépuration aient induit une diminution du taux de filtration ralentissant l’élimination des bactéries allochtones. Le changement de qualité nutritive ou de turbidité du milieu sont des causes connues de variations des processus de ventilation branchiale (Le Treut, 1986). Finalement, les résultats observées à la suite de cette étape de dépuration renforcent l’hypothèse que les communautés bactériennes associées aux branchies et au tube digestif sont majoritairement déterminées par l’habitat. A la fin de l’expérience (T’6) les communautés bactériennes des individus transplantés et celles des individus réimplantés mais de même origine diffèrent, suggérant que le changement d’habitat entraine une modification des communautés bactériennes. Les branchies et le tube digestif apparaissent comme les organes les plus sensibles aux changements d’habitat puisque les communautés bactériennes des lots A/B et B/A diffèrent de celles des lots réimplantés de références. Ces résultats confortent l’hypothèse que les branchies et le tube digestif sont des sites primaires d’infection bactérienne allochtone. La structure des communautés des organes internes (i.e. le reste) n’évolue pas lorsque les individus sont réimplantés sur leur site d’origine ou transplantés sur l’autre site, sauf pour les individus du lot A/B transplantés sur un site moins favorable (indice de condition et taux de survie plus faible sur le site B). Ces résultats suggèrent donc que la structure des communautés bactériennes associées aux organes 179 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves internes est majoritairement liée à l’état physiologique des hôtes. En effet la transplantation des individus du lot A/B dans un environnement moins favorable a pu provoquer une détérioration de l’état de santé des individus, accompagnée par une diminution plus ou moins importante des barrières physiques et/ou physiologiques. 2.5 Conclusion A travers la comparaison des communautés bactériennes de deux lots de palourdes différenciées et provenant d’habitats contrastés, cette étude met en évidence une structure différente des communautés bactériennes à l’échelle de l’organe. Les communautés bactériennes associées au tube digestif qui est l’un des organes les plus en contact avec l’habitat et impliqués dans la fonction trophique apparaissent majoritairement déterminées par l’habitat alors que celles associées aux organes plus internes semblent majoritairement être déterminées par la position taxonomique de l’hôte. Les communautés bactériennes associées aux organes internes pourraient alors être le résultat d’un contrôle de l’hôte ou celui d’une coévolution entre l’hôte et sa microflore due à des pressions de sélections communes. Les communautés bactériennes associées aux branchies présentent un déterminisme qui semble plus complexe, ces communautés étant à la fois influencées par l’habitat et par l’hôte. Le changement d’habitat du bivalve entraine une modification de sa condition physiologique mais également une modification de la structure des communautés bactériennes des organes y compris des organes internes suggérant que l’état physiologique interviendrait dans le maintien des communautés bactériennes autochtones de la palourde. L’hypothèse d’un déterminisme d’hôte devrait pouvoir être confirmée en comparant les communautés bactériennes associées à deux espèces de bivalves vivant en sympatrie et présentant la même écologie (e.g. la coque Cerastoderma edule et la palourde Ruditapes philippinarum). Un intérêt plus particulier pourrait alors être porté sur les populations bactériennes autochtones, véritable microflore associée aux bivalves. L’étude de sa position exacte dans les tissus (ectoou endosymbiontique) par FISH par exemple pourrait permettre de mieux caractériser la nature de l’intéraction bactéries-bivalves. La caractérisation de la composition taxonomique de cette microflore associée par une approche de (méta)génomique ainsi que l’étude de ses capacités métaboliques permettrait en accédant à l’auto-écologie des populations bactériennes, de mieux comprendre les fonctions qu’elles assurent (e.g. épuratrice, immunitaire voire probiotique). 180 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves 2.6 Références Antunes F, Hinzmann M, Lopes-Lima M, Machado J, da Costa PM (2010) environmental Association microbiota and Mediterranean between Sponge Species. Microbial Ecology 61: 769-782. indigenous Frischer ME, Nierzwicki-Bauer SA, Parsons RH, bacteria found in hemolymph, extrapallial fluid Vathanodorn and mucus of Anodonta cygnea (Linnaeus, K, Waitkus KR (2000) Interactions between zebra mussels (Dreissena 1758). Microbial Ecology 60: 304-309. polymorpha) Bouchet JM (1968) Etude océanographique des chenaux and microbial communities. 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Diversité des procaryotes à l’échelle d’un organe : déterminisme d’espèce Evidence for specific tissue-dependent bivalve-associated bacteria in cockles (Cerastoderma edule) and clams (Ruditapes philippinarum) Ika Paul-Pont1,3, Guillaume Meisterhans Montaudouin 1,2, 1,2, , Natalie Raymond , Frédéric Garabetian 1,2, 1,2, , Florence Jude-Lemeilleur 1 Univ. Bordeaux, EPOC, UMR 5805, F-33120 Arcachon, France 2 CNRS, EPOC, UMR 5805, F-33120 Arcachon, France. 3 , Line Bourrasseau 1,2, 1,2, , Xavier de * Farm Animal and Veterinary Public Health, Faculty of Veterinary Science, The University of Sydney, 425 Werombi Road, Camden NSW 2570, Australia2 Soumis le 30 Janvier 2012 à FEMS Microbiology Ecology ; Manuscript ID: FEMSEC-12-01-0053 Key words: microbiota; bivalve; bacterial association; bacterial abundance; bacterial diversity; starvation Running title: Specific tissue-dependent bivalve-associated bacteria * Corresponding author Address :Station Marine d’Arcachon, 2 rue du Pr Jolyet, F-33120 Arcachon, France Phone : +33556223911 ; Fax : +33556835104 ; e-mail : [email protected] 185 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves 186 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves Abstract Research on the structure of microbial communities in marine bivalves presents some specific challenges as bivalves accumulate large numbers of microorganisms due to their lifestyle as siphon feeders and/or burrowing animals. In the present study, bacterial community abundance (BCA) and diversity (BCD) were estimated by epifluorescence microscopy and Automated Ribosomal Intergenic Spacer Analysis in cockles (Cerastoderma edule) and clams (Ruditapes philippinarum) before and after a 21-day starvation experiment to assess the shift from transient to resident host-associated bacterial communities within bivalve tissues. The gut of bivalves expectedly harboured the highest bacterial concentration whereas the lowest value was found in hemolymph, consistent with its role in innate immunity. Sympatric cockle and clam individuals exhibited significant differences in BCD in all tissues suggesting species-level control of bacterial communities in individuals experiencing the same contamination from the environment (2 wayANOSIM: R=0.739 p<0.001). A noticeable proportion of ITS (Intergenic Transcribed Spacer) (30% for both species) were tissue specific, suggesting specific tissue-dependent associations. Additionally, more than 50% of the ITS commonly found before the starvation (i.e. in more than 60% of individuals) remained common or constant in gills throughout the experiment, highlighting potential intimate bacterial associations with gill tissue. 187 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves 188 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves Introduction Marine bivalves host numerous bacteria and are able to survive in highly septic surroundings depending on the efficiency of their immune system (Antunes et al., 2010). Three main pathways for microflora acquisition by marine bivalves are described (Bright & Bulgheresi, 2010). In vertical transmission, bacteria shift from parents to offspring, through the incorporation of bacteria within or on gametes. In horizontal transmission, bacterial acquisition is independent of host reproduction and bacteria are taken up through spread between contemporary hosts. Lateral transmission concerns microflora being acquired directly from the environment, through the burrowing and filtration activities of bivalves (Dubilier et al., 2008). Interactions between microflora and their host can be diverse, from simple opportunistic interaction to parasitic or symbiotic relationships, and can influence bivalve fitness. While endosymbiosis (Kim et al., 1995; Caro et al., 2009) or intimate association with tissues (Romero et al., 2002) have been reported, little is known about the overall dynamics of the bacterial communities in bivalves. For instance, literature remains scarce on the diversity and the nature of bacterial communities in bivalves. Some studies suggested that specific bacterial assemblages interact with oysters (Hernández-Zárate, 2006; La Valley et al., 2009) and freshwater mussels (Frischer et al., 2000). On the other hand, the sanitary aspects of microbial contamination of shellfish (resources survey data, fish farming purification processes) suggest that bivalve-associated bacteria may be highly influenced by the bivalves’ environment, through lateral transmission. In French national sanitary surveys (e.g. French microbiological monitoring network for shellfish growing areas – REMI; http://envlit.ifremer.fr/surveillance/microbiologie_sanitaire) the whole shell content is analysed as ground flesh and intervalval liquid (FIL). Most of the fecal indicator bacteria that are found in shellfish inhabiting a contaminated area can easily be eliminated after a short period of purification in an adequate tank because they belong to the fraction of the bivalve-associated bacterial community that may simply be passing through the animal along with water and food, i.e. they are transient microorganisms acquired incidentally as a consequence of siphoning activity. If so it could be hypothesized that they are mainly associated with the gills and the gut. This particular case and a previous study on endosymbionts (Kim et al., 1995) ask the question: is there tissue-dependence of bivalve-associated bacteria (BAB)? In a previous study, Meisterhans et al. (2011) suggested to consider the different organs (e.g: gut, gills, muscle) separately as the important gut microflora may hide a specific microflora associated with other organs. 189 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves To address this question, bacterial communities were assessed in different bivalve tissues using molecular approaches. The cockle Cerastoderma edule and the clam Ruditapes philippinarum were selected for their ecological relevance. In European coastal zones, the latter is an introduced species while the former is a native species. Individuals of both species can live in sympatry, burrowing in the sediment and feeding on the suspended particles that accumulate at the watersediment interface. Sympatric individuals exhibiting the same lifestyle are subjected to the same lateral transmission events allowing comparison of the influence of this mechanism on the BAB. Finally, to unveil the resident microflora that may have been masked by the transient microflora acquired through feeding, a set of animals was analysed after 21 days starvation. The analyses were also performed at individual scale in several functional tissues: hemolymph, gills, gut, mantle and remaining tissues (including foot, gonad, heart, muscle and digestive gland) to identify tissuedependent associations. Materials and Methods Sampling sites Fifty cockles (36.0 ± 2.5 mm shell length, mean ± SD) and fifty Manila clams (46.4 ± 2.4 mm shell length, mean ± SD) were collected at Banc d’Arguin, a moderately sheltered inter-tidal sand flat (median grain size = 350 µm), in Arcachon Bay (France, 44°40’N 1°10’W). The water salinity and sediment temperature annually range from 31 – 35 psu and 0°C to 30°C, respectively (Dang et al. 2010). The benthic community in sand is dominated by cockles with adult abundance reaching 200 ind.m-2 while Manila clams are generally scarcer (<50 ind.m-2). Cockles population at Arguin is characterized by high demographic fluctuations, fast individual growth and a relatively short lifespan (Gam et al. 2010). Bivalve treatment The starvation experiment was conducted for 21 days in controlled laboratory conditions using glass aquaria 12x12x24 cm3 filled with 3L of sterile synthetic sea water (Instant Ocean, salinity = 30.2 ± 0.1 psu ; pH = 8.1 ± 0.3, mean ± SD), aerated by a diffuser system. Fifteen cockles and clams were separately introduced into six experimental units (EU) (five bivalves per EU) and were placed on a plastic grid at 6-cm height in order to easily eliminate faeces and pseudofaeces. No food or sand were added in order to minimize bacterial lateral contamination, as the organic matter associated with food or natural sand may stimulate bacterial development and bacteria may adsorb to the sediment surface. Water was renewed every two days. The temperature 190 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves was set to 15°C (± 0.7°C, mean ± SD) and the photoperiod 12:12 using a timer and artificial light sources. At the beginning (T0) and at the end (Tf) of the starvation experiment, five cockles and five clams were randomly sampled for analysis. Hemolymph (He) was withdrawn from the adductor muscle of each individual with a 25-gauge needle attached to a 1-mL sterile syringe (TERUMO). Each sample was observed under a stereomicroscope to verify the absence of disseminated neoplasia in relation to its strong negative impact on host physiology (Carballal et al., 2001). Bivalve foot was dissected and squeezed between two glass slides under a microscope (Nikon Eclipse E400) to check for the absence of the deleterious and proliferating parasitic trematode Bucephalus minimus. Gills (Gi), mantle (Ma), gut (Gu) and remaining tissues (Re) (including foot, gonad, heart, muscle, digestive gland) were dissected, weighed and shredded with a homogenizer (blade OMNI TH) in NaCl (30 g.L-1 ; final dilution 1/10). Each sample was dispensed as aliquots in formol (3.7%) – NaCl (30 g.L-1) for bacterial counts and in a preservative buffer (100 mM Tris-HCl [pH 8.0], 100 mM Na EDTA [pH 8.0], 1.5 M NaCl and 1% [wt/vol] cetyltrimethylammonium bromide) (Zhou et al., 1996) for diversity analyses. Total bacterial count An aliquot of 50 µL of each sample was used to determine the total bacterial count by using an epifluorescence microscope (Olympus BH2-RFCA, excitation filter BP490, magnification 1000) according to the protocol described by Meisterhans et al. (2011). Results were expressed as cell units per g of flesh (fresh weight). Bivalve bacterial community structure analysis by ARISA Changes in the bivalve bacterial community diversity (BCD) were assessed using the PCRbased whole-community fingerprinting approach ARISA (Automated Ribosomal Intergenic Spacer Analysis) of bacterial DNA (Fisher & Triplett, 1999). ARISA amplifies the Intergenic Transcribed Spacer (ITS) between the 16S and 23S rRNA genes using a fluorescent primer and the ITS size represents the operational taxonomic unit (OTU). Results are displayed as the amount of different PCR products of specific fragment length (ITS size). Even though several biases have been associated with the use of molecular based techniques such as ARISA in the analysis of bacterial communities, these biases can be assumed to affect all samples equally, if the samples have a common source and are similarly treated (Ramirez-Saad et al., 2003). DNA was extracted from subsamples of 25 mg of tissue, using a bead beating method (FastPrep and lysis matrix A; 6 m∙s -1; 191 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves 40 s, MP Biomedicals, Illkirch, France) coupled to QIAamp DNA Mini Kit (QIAgen, Courtaboeuf, France). The amount of extracted DNA was determined by spectrofluorimetry (LS 55, PerkinElmer, Courtaboeuf, France) using SYBR® Green I (Molecular Probes, Invitrogen, Cergy Pontoise, France), and quantified using DNA standard 1 mg mL-1 solutions of calf thymus DNA (Sigma Aldrich, St. Quentin Fallavier, France). The same amount of extracted DNA (10 ng) was used for each ARISA amplification assay. For each sample, the ARISA amplification step was conducted in triplicate. The amplification was run according to Ranjard et al. (2000) using universal bacterial primers SDBact (5’-TGC GGC TGG ATC CCC TCC TT- labelled at the end with the phosphoramidite dye 5-FAM fluorochrome) and LDBact (5’-CCG GGT TTC CCC ATT CGG-) (Normand et al., 1996) (Molecular Probes Invitrogen Cergy Pontoise, France) with the following conditions: (i) 94°C for 5 min; (ii) 35 cycles of 94°C for 1 min, 55°C for 1 min, 72°C for 1 min, and then (iii) 72°C for 5 min. The 25 µL-reaction mixtures contained 1 x PCR buffer, 1.5 mM MgCl2, 0.3 mg mL-1 of bovine serum albumin (MP Biomedicals, Illkirch, France), 5% of DMSO, 0.2 mM of each dNTP, 0.1 µM of each primer, 1U of Taq polymerase (Promega, Charbonnières-les-Bains, France) and 20 ng of template DNA. PCR products were purified using a QIAquick PCR Purification Kit (QIAgen, Courtaboeuf, France) and quantified by spectrofluorimetry as described before. Two ng of purified product from each sample were combined with 10 µL Hi Di formamide and an internal LIZ1200 standard (Applied Biosystems Ltd, Courtaboeuf, France) before being heat treated (95°C, 5 min) and then cooled on ice. ARISA was performed on a 3730XL Capillary Genetic Analyser (Applied Biosystems Ltd, Courtaboeuf, France), using a capillary and standard Genemapper protocol, which detects the relative abundance of different sized PCR products labelled with the fluorescent primers (Plateforme Genome-Transcriptome Pierroton INRA, Bordeaux-Aquitaine, www.pierroton.inra.fr/biogeco/site_pole_agro/genoseq.html). Results were read using the ABI Peak scanner software provided by Applied Biosystems (Courtaboeuf, France) where each profile of peaks in an electrophoregram defines the bacterial diversity fingerprint. Fluorescence data (peak areas and peak sizes) were exported to Microsoft Excel to allow data analysis. Peak size values were rounded to the nearest whole number and peaks with a size inferior to 200 bp were considered as noise and excluded from analysis (Lear & Lewis, 2009). According to Osborne et al. (2006), an optimal divisor (500) was determined to eliminate the background fluorescence (data not shown). Moreover, according to Ramette (2009) data were binned (i.e. electrophoretic profiles alignement) using the interactive and automatic binning algorithms [their respective manuals and examples are available online (http://www.ecology-research.com)] implemented in the free, R programming language [The R Foundation for Statistical Computing 192 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves (http://cran.r-project.org/)]. From Peak scanner output table, a custom R binning script (Ramette, 2009) was applied (WS: 2; Sh: 0.1). All peaks with relative fluorescence intensity value inferior to 0.002 (1/optimal divisor) were not included in further analyses since they consisted of background peaks. Therefore, to consider a maximum of peaks while excluding background noise, only fragments with relative fluorescence intensity above a threshold of 0.2% and ranging between 200 and 1500 bp were considered as a true peak. Each true peak displayed represented one ITS and the peak area represented the relative abundance of the ITS present. Data were also transformed to abundance matrix. From this matrix, Bray-Curtis similarities (BC) between samples were calculated from Primer software (PRIMER-E Ltd, Lutton, UK) according the following equation – – where OTUi,a is OTUi relative abundance in sample A and OTUi,b is OTUi relative abundance in sample B. Similarities were represented on non-multidimensional scaling (MDS) (Clarke & Warwick, 2001). On each MDS chart, every bacterial community was represented as one plot and the relative changes in community structure as the distances between the points. Statistical analyses A Mann–Whitney test and when possible an Analysis of Variance (ANOVA) were performed to compare BCA between different sampling times and bivalve species. Comparison of BCA among tissues within each species was assessed using the Friedman test for related samples. Statistical differences in BCD between groups (species, time, tissues) were tested using ANalysis Of SIMilarity (1 way-ANOSIM or 2 way-ANOSIM) a random permutation tests (Monte-Carlo test, 100,000 permutations) performed from Bray-Curtis similarity matrixes (Clarke & Warwick, 2001; Kropf et al., 2004). All tests and correlations were considered statistically significant at p value ≤ 0.05. 193 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves Results 1. Initial bacterial community structure in bivalves a. Bacterial community abundance (BCA) Clams were significantly bigger than cockles (4.8 ± 0.3 g vs. 2.9 ± 0.1 g, respectively) but no significant difference was observed in terms of total bacterial concentration (cell g-1) and bacterial content (cell matrix-1) between both bivalves at whole individual scale (Table 1). Bacterial concentrations in cockles and clams respectively reached 3.1 1010 ± 0.6 1010 and 3.2 1010 ± 0.3 1010 cells g-1 before the starvation experiment. Only slight differences in bacterial concentration appeared between bivalve species, namely the hemolymph, the gut and the remaining tissues of clams showed significantly higher bacterial concentrations than in cockles (Table 1). Despite these differences, cockles and clams displayed the same bacterial distribution between tissues. The gut harboured the highest bacterial concentration (1.7 1011 ± 0.1 1011 and 2.6 1011 ± 0.3 1011 cells g-1 in cockles and clams, respectively) followed by mantle, gills and remaining tissues holding similar bacterial concentrations (1.4 – 4.2 1010 cells g-1), whereas the lowest value was found in hemolymph (7.3 106 ± 0.4 106 and 9.7 106 ± 0.7 106 cells g-1 in cockles and clams, respectively) (Table 1). BCA were also expressed in cells matrix-1 in order to assess the distribution of the bacterial community between bivalve tissues according to their relative weights and functions (Table 1). In cockles, the relative bacterial content (cells matrix-1) showed a similar trend to that observed for bacterial concentration (cells g-1). More than 50% of the total bacterial content was found in the gut despite its relatively low weight, whereas the remaining tissue (Re) harbored only 30% of the total bacterial content, followed by the mantle (9%) and gills (5%) (Table 1). The bacterial content in hemolymph represented less than 0.01% of the total bacterial load in cockles. In clams only 15% of the total bacterial content was found in the gut whereas the remaining tissue and the mantle held more than 77% of the total bacterial load. The bacterial content in hemolymph of clams represented less than 0.01% of the total bacterial load, similar to what was observed in cockles (Table 1). 194 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves Table 1. Mean value (± standard error, SE, n=5) of tissue weight (g, fresh weight), bacterial concentration (cell g-1, fw) and content (cell matrix-1) in cockles and clams before the starvation experiment. A one way ANOVA was performed to assess difference between bivalve species. NS: no significant difference. -1 Tissue weight (g) Mean Cockle Clam 1.01 0.8 Hemolymph SE 0.01 0.11 Mean 0.33 1.32 Cockle Clam Cockle Clam 7.3E+06 9.7E+06 SE 0.03 0.13 Mean 0.28 0.48 3.8E+05 6.5E+05 2.5E+10 2.1E+10 2.5E+09 3.1E+09 1.4E+10 2.5E+10 0.05 0.04 Mean 0.27 0.09 Gut 4.7E+09 1.7E+11 2.6E+11 NS SE 0.12 0.01 Mean 1.03 2.12 0.09 0.15 Mean 2.93 4.83 1.4E+10 2.5E+10 3.0E+10 4.2E+10 0.14 0.32 p=0,009 1.2E+09 1.8E+11 4.2E+09 1.2E+10 NS 1.0E+09 3.4E+09 4.7E+10 2.3E+10 NS 2.1E+10 3.0E+09 3.1E+10 8.8E+10 p=0.063 2.2E+09 4.4E+09 3.1E+10 3.2E+10 p<0.001 SE 8.5E+09 1.9E+11 p=0.008 p<0.001 SE NS 3.6E+05 1.2E+06 NS 1.2E+09 p=0,014 3.2E+09 6.5E+09 9.1E+10 3.8E+11 NS 5.9E+09 195 2.7E+09 p value 7.8E+06 7.7E+06 NS p=0.017 SE p value p=0.011 p<0.001 Gills Whole individual Bacterial content (cell matrix ) NS Mantle Remaining tissues p value -1 Bacterial concentration (cell g ) NS 1.9E+10 2.1E+11 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves b. bacterial communities’diversity (BCD) cockles A total of 309 ITS, ranging from 200 to 1245 bp in size, was detected by ARISA analysis of the bacterial community of tissues of five cockles before the starvation experiment, with a mean value of 156 ± 12 ITS per individual (mean ± SE) (Table 2). Among the detected ITS, 179 (58%) were rare, being generally found in less than 20% of the studied samples (i.e. in one bivalve out of five analyzed) whereas only 15 ITS (5%) were considered as constant in cockles (i.e. in at least four bivalves out of five analyzed) (Table 3). The high proportion of rare ITS resulted in a low mean level (Mean ± standard deviation (SD): 20.6 ± 13.6%; Min-Max range: 0-83.2%) of Bray-Curtis similarities of cockle bacterial community among individuals. One third of the detected ITS (97 ITS) was tissue specific and 13% (41 ITS) were ubiquitously found in cockle tissues. In addition, most tissue-specific ITS were characterized as rare since more than 86% of them were only recorded in one of the five sampled cockles. Comparison of BCD among cockle tissues was performed by the 1 way-ANOSIM test and revealed significant differences (R=0.43; p<0.001) mainly due to discrepancies among bacterial communities in gills, hemolymph and mantle. In addition, due to the stochasticity and the low relevance of the rare ITS, the comparison of BCD among cockle tissues was also performed on the common /constant fraction of ITS (i.e. found in three or more bivalves out of five analyzed). In this case, the ANOSIM test confirmed the significant difference among cockle tissues (R=0.48; p <0.001). Clams ARISA analysis performed on clams revealed a total of 364 ITS, ranging from 199 to 1417 bp in size, with a mean value of 188 ± 8 ITS per individual (mean ± SE) (Table 2). Among the detected ITS, 213 (59%) were rare whereas only 3% (n=11 ITS) of the total detected ITS were constant in clams (Table 3). Tissue specific ITS representing 28% (n=104) of the detected ITS were mainly rare since more than 88 % of them were only recorded in one of the five sampled clams. Only 8% (n=28) of the detected ITS were found in all clam tissues. Comparison of BCD among clam tissues was performed by the ANOSIM test and revealed significant differences (R=0.24; p<0.005) mainly due to differences of bacterial community between gills and other tissues. Differences were emphasized when the ANOSIM test was performed on the common ITS fraction (R=0.29; p=0.002). 196 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves Table 2. Mean value (± standard error, SE, n=5) of ITS detected in cockle and clam tissue before the starvation experiment. Gills Hemolymph Mantle Clam Cockle Clam Cockle Clam Cockle Clam Cockle Clam Cockle Clam Mean 39 34 55 60 63 55 57 63 46 69 156 188 SE 7 7 8 10 12 5 6 6 10 12 12 8 Total 128 120 152 206 185 198 178 190 139 182 309 364 Cockle Remaining tissues Gut Whole individual Table 3. Constancy of the ITS detected in cockle and clam tissues before the starvation experiment (T0). Rare = ITS detected only in 1 of the 5 sampled individuals, Occasional = 2 / 5, Common = 3 / 5, Constant = 4-5 / 5. ITS-T0 Cockle Clam rare occasionnal common constant Total Hemolymph 88 28 21 15 152 Gills 91 20 9 8 128 Mantle 106 41 28 10 185 Gut 79 37 18 5 139 Remaining tissues 107 48 14 9 178 Whole individual 179 71 44 15 309 Hemolymph 135 56 9 6 206 Gills 86 22 6 6 120 Mantle 147 32 13 6 198 Gut 89 51 17 25 182 Remaining tissues 107 55 15 13 190 Whole individual 213 86 54 11 364 197 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves Cockles vs. clams Two different ANOSIM tests were performed to compare BCD between both sympatric bivalves. The first ANOSIM was performed at whole individual scale with all tissues pooled, whereas the second one was done on each tissue considered individually between both species. Despite the 275 ITS (69% of all ITS) shared by both bivalve species before the starvation experiment, ANOSIM results showed highly significant difference of total BCD between both bivalves at whole individual scale (2 way-ANOSIM: R=0.56 ; p<0.001) (Fig. 1) as well as for each organ, with the highest differences revealed in gills (1 way-ANOSIM: R=0.82; p=0.008) and remaining tissues (1 way-ANOSIM: R=0.61; p=0.008). The total ITS richness among tissues mostly differed between cockles and clams, the only similarity being found for gills exhibiting the lowest ITS richness in both species (Table 2). The high proportion of rare ITS in cockles (58%) and clams (59%) led to equivalent Bray-Curtis similarity indexes in both bivalves (Mean: 21 ± 14%; Min-Max range: 0-83% for cockles vs. Mean: 16 ± 6%; Min-Max range: 1-63% for clams). Finally, clams exhibited a slightly higher number of ITS per individual than cockles (188 ± 8 ITS vs. 156 ± 12 ITS per individual for the cockles) (p=0.055, ANOVA test). 2D Stress: 0.22 Stress: 0.22 Figure 1. Comparison of bacterial community patterns of two sympatric bivalve species, the cockle Cerastoderma edule (black boxes) and the clam Ruditapes philippinarum (black circles). MDS representation is based on Bray-Curtis similarity analyses. Stress value indicates the relevance of graphic representation. 198 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves 2. Bacterial community structure after starvation experiment a. Bacterial abundance Cockles No significant effect of the 21-day starvation was demonstrated on the total body weight of cockles, despite the fact that the weights of the hemolymph and digestive tube of starved cockles were significantly lower than those of cockles before the experiment (Table 4, Mann-Whitney test, p>0.05). To avoid any dilution effect of weight on bacterial concentration in cockle tissues, results were expressed as bacterial count (cells matrix-1) instead of bacterial concentration (cells g of tissue-1) to compare the BCA in bivalves before and after the starvation experiment. At whole individual scale, there was a significant reduction in cockle bacterial content after the starvation experiment (9.15 1010 ± 1.88 1010 vs. 1.74 1010 ± 2.56 109 cells ind-1, for initial and starved cockles, respectively). This decrease in bacterial content was significant in most tissues, except gills in which no significant difference appeared before and after the starvation (Mann-Whitney, p=0.06) (Table 4). Despite the decrease of tissue weight and bacterial content, the relative weight of each tissue was similar to what was observed before the starvation experiment as well as the relative bacterial concentration among each tissue at the end of the experiment. Namely, the gut harboured the highest bacterial concentration (7.74 1010 ± 4.9 109 cells g-1) followed by mantle, gills and remaining tissues holding similar bacterial concentrations (5.62 – 7.26 109 cells g-1), whereas the lowest value was found in the hemolymph (4.48 106 ± 3.66 105 cells g-1) (Friedman test, p<0.05, Table 4). Finally, in terms of relative bacterial abundances (cells matrix-1) the main difference concerned the gut which harbored less than 30% of the total bacterial content (instead of 50% before the starvation experiment) (Table 4). In compensation, gills, mantle and remaining tissues harbored a higher proportion of bacteria than at the beginning of the experiment (Table 4), whereas the bacterial content in hemolymph still represented less than 0.01% of the total bacterial load in cockles. 199 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves Table 4. Mean value (± standard error, SE, n=5) of tissue weight (g, fresh weight), bacterial concentration (cell g -1, fw) and content (cell matrix-1) in cockles before (T0) and after (Tf) the starvation experiment. A Mann-Whitney test was performed to assess difference in function of sampling time. NS: no significant difference. Tissue weight (g) Mean T0 Tf 1.01 0.91 Hemolymph SE 0.01 0.05 Mean 0.33 0.37 T0 Tf T0 Tf 7.3E+06 4.5E+06 7.8E+06 4.1E+06 3.8E+05 3.7E+05 3.6E+05 5.0E+05 2.5E+10 6.7E+09 8.5E+09 2.5E+09 2.5E+09 1.9E+08 1.2E+09 8.4E+07 1.4E+10 5.6E+09 4.2E+09 1.6E+09 1.2E+09 9.6E+08 1.0E+09 1.8E+08 1.7E+11 7.7E+10 4.7E+10 4.8E+09 1.4E+10 4.1E+09 2.1E+10 9.0E+08 3.0E+10 7.3E+09 3.1E+10 8.5E+09 2.2E+09 1.0E+09 3.2E+09 1.8E+09 3.1E+10 6.16E+09 9.1E+10 1.7E+10 5.9E+09 6.8E+08 1.9E+10 2.6E+09 -1 (cell matrix ) SE 0.03 0.02 Mean 0.28 0.30 NS NS SE 0.05 0.04 Mean 0.27 0.06 Gut p=0.012 p=0.047 SE 0.12 0.01 Mean 1.03 1.12 p=0.012 NS SE 0.09 0.11 Mean 2.93 2.77 p=0.012 NS SE 0.14 0.11 p value p=0.012 NS Gills Whole individual Bacterial content p=0.028 Mantle Remaining tissues p value Bacterial concentration -1 (cell g ) p=0.007 200 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves Clams No difference of total body weight was revealed after the starvation experiment, and a similar result was found even at the tissue level (Mann-Whitney test, p>0.05, Table 5). However, final bacterial contents of starved clams were significantly lower than those of the initial clams, at whole individual scale (3.80 1011 ± 0.21 1011 vs. 9.67 1010 ± 1.43 1010 bacteria ind-1 for initial and starved clams, respectively) and in most organs except gills (Table 5). The relative weights of each organ were also similar to what was observed before the starvation experiment. No significant difference of bacterial concentration among tissues was revealed at the end of the starvation experiment, except for the hemolymph, displaying the lowest bacterial concentration (Friedman test, p<0.05, Table 5). In terms of relative bacterial distribution, gills, mantle and remaining tissues harbored a higher proportion of bacteria than at the beginning of the experiment, at the expense of gut, whereas the bacterial content in hemolymph still represented less than 0.01% of the total bacterial load in clams (Table 5). Cockles vs. clams After the starvation experiment clams remained bigger than cockles (ANOVA test, p=0.001) and the difference of weight between both bivalves was also significant for gills (p=0.006), mantle (p=0.002) and remaining tissues (p<0.001) as it has been observed at T0 (Table 1). Comparison of bacterial concentrations revealed significantly higher values in clams than cockles at whole body scale (ANOVA test, p<0.001) as well as for hemolymph (p<0.001) and gills (p<0.001). In terms of bacterial content, significant differences between cockles and clams were also revealed at whole individual scale (p<0.001), as well as for all tissues except the gut (ANOVA test, p>0.05). Finally, clams tissues exhibited same trends as cockles in regard to the evolution of the relative bacterial distribution among tissues: gills, mantle and remaining tissues harbored a higher proportion of bacteria than in the beginning of the experiment, at the expense of gut, whereas the bacterial content in hemolymph still represented less than 0.01% of the total bacterial load in clams (Table 5). 201 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves Table 5. Mean value (± standard error, SE, n=5) of tissue weight (g, fresh weight), bacterial concentration (cell g -1, fw) and content (cell matrix-1) in clams before (T0) and after (Tf) the starvation experiment. A one-way ANOVA (when possible) and a Mann - Whitney test were performed to assess difference in function of sampling time. NS: no significant difference. Tissue weight (g) Mean T0 Tf 0.80 1.00 Hemolymph SE 0.11 0.02 Mean 1.32 1.32 T0 Tf T0 Tf 9.7E+06 1.1E+08 7.7E+06 1.1E+08 6.5E+05 1.9E+07 1.2E+06 2.3E+07 2.1E+10 9.6E+09 1.9E+11 1.3E+10 3.1E+09 2.6E+09 1.8E+10 4.3E+09 2.5E+10 4.8E+10 1.2E+10 2.6E+10 4.7E+09 1.1E+10 3.4E+09 3.8E+09 2.6E+11 1.3E+11 2.3E+10 8.1E+09 2.5E+10 9.4E+10 3.0E+09 4.2E+09 4.2E+10 1.8E+10 8.8E+10 4.2E+10 4.4E+09 6.6E+09 6.5E+09 1.5E+10 3.2E+10 1.8E+10 3.8E+11 9.7E+10 2.7E+09 2.9E+09 2.1E+11 1.4E+10 -1 (cell matrix ) SE 0.13 0.11 Mean 0.49 0.59 p=0.020 NS SE 0.04 0.07 Mean 0.09 0.09 Gut NS NS SE 0.01 0.01 Mean 2.12 2.32 p=0.047 NS SE 0.15 0.17 Mean 4.83 5.48 p=0.038 NS SE 0.32 0.33 p value p<0 .001 NS Gills Whole individual Bacterial content NS Mantle Remaining tissues p value Bacterial concentration -1 (cell g ) p=0.030 202 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves b. Bacterial diversity Cockles A total of 298 ITS, ranging from 199 to 1277 bp in size, was detected by ARISA analysis of the bacterial community of tissues of five cockles at the end of the starvation experiment (Table 67) with a mean value of 147 ± 11 ITS per individual. Among the detected ITS, 193 (65%) were rare being generally found in less than 20% of the studied samples, whereas only 5 ITS (less than 2% of the studied sample) were shared by almost all individuals (Table 6). Comparison of bacterial profile among individuals led to a low value of Bray-Curtis similarity index (Mean: 15 ± 7%; Min-Max range: 1-66%). Comparison of BCD among cockle tissues was performed by the ANOSIM test and revealed significant differences (1 way-ANOSIM: R=0.60; p<0.001) due to particular bacterial communities harbored by hemolymph and gills. Indeed, no significant difference of BCD appeared among mantle, gut and remaining tissues (ANOSIM, p>0.05). In terms of ITS tissue specificity, 37% of the detected ITS (111 ITS) were tissue specific and most of them (78%) were rare, i.e. only recorded in one of the five analyzed cockles. On contrary, 6% (19 ITS) of the detected ITS were ubiquitously found in all tissues of cockles. At the whole individual scale no significant difference was found in terms of average number of ITS exhibited per individual between T0 and Tf (156 ± 12 vs. 147 ± 11 ITS per individual (mean ± SE) at T0 and Tf, respectively, ANOVA test p=0.608, Table 7). Whatever the tissue, a significant difference of BCD was observed between T0 and Tf (2 way-ANOSIM: R=0.33; p<0.005) (Fig. 2A). Table 8 synthesized the global ITS richness in cockles, before and after the starvation experiment, as well as the number of ITS common between T0 and Tf and the number of new ITS highlighted at Tf only. Among the detected ITS at Tf, a variable proportion ranging from 47 to 69% of them, according to the tissue analyzed, were also present at T0 (“remaining ITS”). At whole individual scale this proportion of remaining ITS increased up to 81%. However, due to the high number, the randomness, and the low pertinence of the rare ITS (i.e. ITS detected only in one of the five bivalves analyzed for each time), a special focus was performed to assess the proportion of remaining ITS among the common / constant ITS detected at T0 (i.e. recorded in at least three bivalves out of five analyzed) (Table 9). Then, the proportion of remaining ITS was lower (17-19%), except in the gills (59%), and only concerned a maximal number of 10 particular ITS. The level of Bray-Curtis similarities of cockles bacterial community among individuals increased up to 19.2 ± 14% (mean ± SD, Min-Max range: 2-78%) of when the analysis was performed on those particular ITS. A similar assumption was performed to discriminate the relevant “new ITS” at 203 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves Tf. In this case, the focus was only set up on the proportion of new common / constant Tf-ITS (i.e. ITS detected in at least three of the five cockles analyzed at Tf). A range from 2 to 7 ITS corresponding to new common / constant ITS was then revealed at Tf, leading to a proportion comprised between 13 and 33% of the total common / constant ITS detected at the end of the experiment. Finally, an ANOSIM test was performed on the common / constant ITS revealed at Tf and highlighted strong differences of bacterial profile among cockles tissues (R=0.65; p<0.001). 2D Stress: 0,21 Stress: 0.21 A Figure 2. Comparison of bivalve bacterial community patterns before (black symbols) and after starvation experiment (white symbols). Comparison was performed for the cockle Cerastoderma edule bacterial community (boxes) (A) and for the clam Ruditapes philippinarum bacterial community (black circles) (B). MDS representation is based on BrayCurtis similarity analyses. Stress value indicates the relevance of graphic representation. 2D Stress: 0,22 Stress: 0.22 B 204 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves Table 6. Constancy of the ITS detected in clam and cockle tissues after the starvation experiment (Tf). Rare = ITS detected in 1 individual / 5, Occasional = 2 / 5, Common = 3 / 5, Constant = 4-5 / 5. ITS-Tf Cockle Clam rare occasionnal common constant Total Hemolymph 120 41 14 7 182 Gills 81 17 11 9 118 Mantle 69 42 16 7 134 Gut 66 19 7 6 98 Remaining tissues 92 26 6 8 132 Whole individual 193 67 33 5 298 Hemolymph 113 27 12 5 157 Gills 96 33 14 6 149 Mantle 115 34 9 6 164 Gut 113 40 11 8 172 Remaining tissues 97 25 4 6 132 Whole individual 244 60 34 8 346 Table 7. Mean value (± standard error, SE, n=5) of ITS detected in cockle and clam tissue after the starvation experiment. Gills Hemolymph Mantle Remaining tissues Gut Whole individual Cockles Clams Cockles Clams Cockles Clams Cockles Clams Cockles Clams Cockles Clams Mean 37 46 55 45 46 47 40 37 30 52 239 227 ES 10 7 4 6 5 8 7 4 4 8 18 12 205 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves Table 8. ITS richness in bivalve tissues as well as at whole individual scale during the starvation experiment. Total ITS richness corresponds to all detected ITS in cockles and clams during the experiment pooled over all times. Remaining ITS corresponds to ITS commonly found in bivalves at T0 and Tf (= [ITS-T0 + ITS-Tf] – [Total ITS richness]). The new ITS corresponds to ITS absent at T0 but present at Tf (= [ITS-Tf – Remaining ITS]). Total ITS richness Before starvation (T0) After starvation (Tf) Remaining ITS after starvation New ITS revealed after starvation Hemolymph 248 152 182 86 96 Gills 181 128 118 65 53 Mantle 226 185 134 93 41 Gut 188 139 98 49 49 Remaining tissues 230 178 132 80 52 Whole individual 366 309 298 241 57 Hemolymph 279 206 157 84 73 Gills 215 120 149 54 95 Mantle 277 198 164 85 79 Gut 253 182 172 101 71 Remaining tissues 256 190 132 66 66 Whole individual 427 364 345 282 63 Cockle Clam Table 9. Percentage of remaining ITS at the end of the starvation experiment among the proportion of common/constant ITS initially present (T0-ITS). Clam Cockle n % n % Hemolymph 4 27 7 19 Gills 6 50 10 59 Mantle 3 16 7 18 Gut 4 10 4 17 Remaining tissues 4 14 4 17 206 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves Clams ARISA analysis performed on clams revealed a total of 346 ITS, ranging from 207 to 1427 bp in size. Among the detected ITS, 244 were rare (Table 6) leading to a high proportion (70%) on contrary to the constant ITS (n=8) which represented only 2% of the total detected ITS. This high proportion of rare ITS resulted in a low mean level of Bray-Curtis similarities in regard with clams bacterial community among individuals (Mean: 22 ± 6%; Min-Max range: 1-84%). Comparison of BCD among clam tissues was performed by the ANOSIM test and revealed slight differences (1 way-ANOSIM: R=0.23; p<0.005) mainly due to differences of BCD between hemolymph and other tissues. Tissue specific ITS, representing 38 % (n=130) of the detected ITS, were mainly rare since more than 89 % of them were only recorded in one of the five sampled clams. Only 7 % (n=24) of the detected ITS were found in all clam tissues. At the end of the starvation experiment, clams exhibited a significantly lower average number of ITS per individual (188 ± 8 vs. 151 ± 10 ITS per individual (mean ± SE) at T0 and Tf, respectively, ANOVA test p=0.02). A modification of the BCD present in the starved individuals in comparison with the initial clams was also revealed by the ANOSIM test (2 way-ANOSIM: R=0.30; p<0.005) (Fig. 2B). The proportion of “remaining ITS” varied from 36 to 59%, according to the tissue analyzed, and this percentage increased up to 82% at whole individual scale (Table 8). However, this proportion of remaining ITS decreased up to 10% when the percentage was calculated only with the number of common / constant ITS (Table 9). As it has been observed in cockles, the level of Bray-Curtis similarities of clams bacterial community among individuals increased up to 31 ± 14% (mean ± SD, Min-Max range: 3-85%) when the analysis was performed on those particular ITS. The percentage of new common / constant ITS detected at Tf varied from 0% in remaining tissues to 47% in mantle of clams and involved a maximal number of 7 ITS (Table 10). 207 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves Table 10. Percentage of new existing common/constant ITS at the end of the starvation experiment. Clam Cockle n % n % Hemolymph 4 24 7 33 Gills 6 30 5 25 Mantle 7 47 3 13 Gut 2 11 3 23 Remaining tissues 0 0 2 14 Cockles vs. clams After the starvation experiment, 243 ITS (60% of all ITS) were shared by cockles and clams (instead of 275 ITS shared at T0). An ANOSIM was performed to assess the difference of BCD between the two sympatric bivalves. Results showed significant differences of total BCD between both bivalves at whole individual scale (2 way-ANOSIM: R=0.74 p<0.001) (Fig. 3) as well as for each tissue (R>0.30; p<0.05). The comparison of BCD between cockle and clams was also performed on the common /constant fraction of ITS harbored by both bivalves at the end of the experiment. In this case, the ANOSIM test also confirmed the significant difference between both species, at whole individual scale (R=0.49; p=0.001) as well as the tissue level (R>0.65; p<0.01). The total ITS richness among tissues strongly differed between cockles and clams, especially for the gut harboring the highest ITS richness in clams and the lowest value in cockles. Both sympatric species exhibited similar number of ITS per individual (147 ± 11 ITS vs. 151 ± 10 ITS for cockles and clams, respectively, ANOVA test p=0.70), as it was observed for the proportion of rare ITS (65 and 70%) leading to equivalent Bray-Curtis similarity index (13 ± 7% and 13 ± 6%, for cockles and clams, respectively). 208 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves Figure 3. Comparison of bacterial community patterns of two sympatric bivalve species, the cockle Cerastoderma edule (black boxes) and the clam Ruditapes philippinarum (black circles) after starvation experiment. MDS representation is based on Bray-Curtis similarity analyses. Stress value indicates the relevance of graphic representation. Discussion To our knowledge this is the first attempt to study bacterial structure (abundance and diversity) in fluids and tissues of the two marine bivalves Cerastoderma edule and Ruditapes philippinarum. A previous study was performed to assess BCA (bacterial community abundance) and BCD (bacterial community diversity) in cockles C.edule at the whole individual scale, i.e. in the total flesh and intervalval liquid (FIL), through a 10 month monitoring program (Meisterhans et al., 2011). Results showed significantly lower BCA values (1-30 106 cells g-1) than those reported in the present study for the same species sampled at the same site (1.9-4.6 1010 cells g-1). Although the use of similar techniques for total bacterial count could allow a direct comparison between both studies, the main difference concerned the level of observation: total FIL vs. tissue levels. It could be easily hypothesized that a significant part of the BCA may have been lost, hidden or diluted due to the bacterial counting protocol (tissue shredded in a buffer before being filtered on a 0.2 µm membrane filter) when analyses have been directly performed on the total FIL. Such results suggested that a 209 Str Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves more accurate analysis of the BCA could be obtained by separately considering the different tissues. Meisterhans et al. (2011) also analyzed the BCD with a similar fingerprint method (ARISA) and demonstrated a lower bacterial diversity, with only 284 ITS detected among the 37 sampled cockles. Even if the same hypothesis (i.e. a lower access to the cockle bacterial communities when analyzing BCD at the whole individual scale instead of at separate tissue levels) might be relevant to explain discrepancies with the present work, no direct comparison between studies can be made. Indeed, the nature of PCR methods (semi-nested vs. single stage) as well as threshold parameters used to analyze the ARISA data (optimal divisor and binning values) differed between studies and prevent any direct comparison of absolute ITS value. Notwithstanding, some similar features were revealed such as the high proportion of rare ITS, even when focusing on the more contributing ITS, leading to low Bray-Curtis similarities among cockles sampled at the same time (Meisterhans et al., 2011). They also demonstrated that these rare ITS primarily accounted for the difference in BCD among different batches of sampled cockles. In the present study, rare ITS also accounted for differences in BCD among bivalve species and among tissues within each species as was revealed by the results of Bray-Curtis similarity mean values (higher when Bray-Curtis analysis was performed only on common / constant ITS). A strong gap has been revealed in the cockle inter-individual variability of BCD between both studies, attested by higher Bray-Curtis similarity values calculated from data of the study of Meisterhans et al. (2011). Such results may suggest that (i) a greater BCD was assessed by separately considering the different tissues; (ii) tissues could possibly be seen as diversified habitats for bacterial settlement leading to strong differences between bacterial communities from one tissue to another. 1. Tissue-dependent bacterial communities? Evidence for tissue-associated microbial communities in invertebrates has been mostly related to sponge and terrestrial worm species (Egert et al., 2004 ; Gerce et al., 2011). The present study strongly supported the existence of tissue-dependent bacterial communities in bivalves as has been suggested already for some oyster and mussel species (Frischer et al., 1999 ; La Valley et al., 2009). The main differences in bacterial communities were revealed in gut, hemolymph and gills of bivalves. The gut of both bivalve species harbored the highest bacterial concentrations (cells g-1), due to its direct relation with the septic environment during feeding (Prieur et al., 1990). Some previous studies also reported the highest bacterial content (cell matrix-1) to be in the gut of marine bivalves (Al Jebouri & Trollope, 1981; Kueh & Chan, 1985) as was observed for cockles in the 210 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves present study. In contrast, the gut of clams exhibited a relatively low total bacterial content, despite a high bacterial concentration, probably due to the low weight of this tissue in comparison with mantle or remaining tissues (Table 1). This tissue also presented a low ITS richness in comparison with the other tissues (Table 2) in spite of it having the highest bacterial concentration in both bivalve species. This result may be due to the dominance of specific bacterial species in the gut of bivalves which might hide other bacterial species that are present in lower abundance. Indeed, two major sources of error that have been identified for molecular-based techniques concern (i) the probability for different species to display the same ribosome types or “ribotypes” that are considered as a unique band/peak, and (ii) a poor detection sensitivity of rare organisms (La Valley et al., 2009). In contrast, the hemolymph of cockles and clams displayed a high ITS richness associated with the lowest bacterial concentrations/contents; this could be strongly related to the role of hemolymph in the innate immunity of bivalves. The main line of invertebrate defense involves the hemolymph components, i.e., circulating hemocytes and soluble factors, which are able to trigger a wide range of defense mechanisms for bacterial elimination (Prieur et al., 1990). Antunes et al. (2010) demonstrated the ability of the freshwater bivalve Anodonta cygnea to filter and eliminate selectively some bacterial species (namely Escherichia coli and enterococci, present in the surrounding water) through an active phagocytotic process conducted by hemocytes. The low bacterial concentration found in bivalve hemolymph could be related to a higher selective pressure than in the gut, whereas the high ITS richness might be due to (i) a better balance in the abundance of bacterial species able to survive in this particular tissue, which leads to the detection of most species via molecular-based techniques; (ii) a possible infiltration of bacteria from connective tissues to the hemolymph as bivalves present a semi opened circulatory system. Hemolymph is pumped by the heart to the arteries which deliver the hemolymph directly to the conjunctive tissues around the organs allowing exchange of oxygen but also microbiota between hemolymph and tissues. Several studies have already demonstrated the presence of bacteria in hemolymph of healthy and sick organisms (Silverman et al., 1995; Antunes et al., 2000; Vaughn et al., 2008). As a consequence, persistence of some bacterial species in hemolymph without causing disease or mortality might be due to particular interactions between hemocytes and soluble hemolymph components (Pruzzo et al., 2005). The gill constitutes one of the first barriers to foreign particles and microorganisms due to its direct contact with the surrounding environment, and its role in water filtration for respiratory and nutritional purposes (Paul-Pont et al., 2010). In the present study, gills of both bivalve species presented the lowest ITS richness, and their ITS diversity differed markedly from all other tissues (ANOSIM analyses). These results suggest that gills play an important role as 211 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves a selective barrier as they are able to select/eliminate specific bacteria. Particularly, some selective processes in the uptake of bacteria by bivalves have been already demonstrated (Olafsen et al., 1993), as well as close relations between bacteria and gills in the cockle Cerastoderma edule (Carballal et al., 2001) and the cupped Pacific oyster Crassostrea gigas (Hernández-Zárate & Olmos Soto, 2006). Finally, the existence of tissue-dependent bacterial communities was borne out by the percentage of tissue-specific ITS, about 30% in both species, and the low proportion of ubiquitous ITS (8 and 13% for cockles and clams, respectively). The different tissues of bivalves may represent a wide range of habitats exhibiting different physico-chemical conditions and biological selective pressures due to their functions and/or relation with the surrounding environment. Consequently, these microenvironments may allow proliferation of bacterial species that specialize in these environments, thus inhibiting a part of the transient bacterial species inadvertently ingested during respiratory and feeding activities (La Valley et al., 2009). 2. Host-dependent bacterial communities? The finding of similar total bacterial counts and bacterial concentrations harbored by both bivalve species as well as the significant proportion of shared ITS (69%) at the beginning of the experiment illustrated the importance of environmental transmission from the surrounding water column/sediment in both bivalve species living in the same environment. However, the ANOSIM test performed to assess whether the initial BCD was homogeneous between the two species showed a difference in total BCD between species at whole individual scale (2 way-ANOSIM: R=0.56 ; p<0.001) as well as for tissues. However the BCD of the gut between species is smaller (1 wayANOSIM: R=0.38) than the ones of the others tissues (1 way-ANOSIM: mean R=0.61). Similarly, Brissac et al., 2010 showed significant differences in bivalve-associated bacteria between two bivalve species collected in the same area. The results of the present study suggested that two bivalve species exhibiting the same feeding pathway (i.e. burrowing filter-feeders) and living in sympatry may be able to partially regulate microbial assemblages in their tissues. This occurred in most tissues while they were particularly exposed to lateral contamination by their filter-feeding activities in a septic environment. The small significant difference among bacterial assemblages in the gut might be an indication of a lower selective pressure in this tissue, then reflecting more the bacterial community of the ambient environment than a tissue-specific assemblage. The hypothesis that most bacteria in the gut of invertebrates directly reflect the surrounding environment is supported by several studies which have highlighted strong similarity between the bacterial 212 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves community of this tissue and the ambient environment, i.e. water, sediment, etc. (Prieur et al., 1990; Egert et al., 2004). Cockles and clams seemed to be able to control, at least partly, their own bacterial communities, as suggested by the differences of BCD between both bivalves. Such an assertion entails that some intimate bacterial association may occur between bivalve tissues and specific bacteria. 3. Close interactions between bacteria and bivalve tissues? A 21-day starvation experiment was undertaken to investigate the dynamics of the bacterial communities hosted by two sympatric bivalve species. The depuration process is defined as a particular case of the feeding mechanism controlled by filtration efficiency, the pumping rate and intestinal transit, which themselves are influenced by environmental conditions such as temperature, salinity or the type of bacteria involved (Prieur et al., 1990). Such sources of variation create difficulty when comparing results from different depuration experiments. Furthermore, few data about total bivalve bacterial fauna before and/or after a depuration experiment are available in the literature, since most studies have been designed from a public health standpoint, with a narrow focus on pathogenic bacteria (Prieur et al., 1990; La Valley et al., 2009). At whole individual scale, almost a one log decrease in total bacterial count was observed in both bivalve species after the starvation experiment. In terms of relative BCA among tissues, the depuration was mainly revealed by the strong decrease observed in the gut of starved bivalves: from 50% to 30% for cockles, and from 15% to 9% for clams. As no food was added during the 21-day experiment, we could hypothesize that bacteria present in the gut were lysed as a nutritional resource for the starved bivalve (Harris, 1993; Caro et al., 2009). Part of the bacterial population was probably eliminated in faeces and pseudofaeces. The depuration experiment led to significant decreases of bacterial concentration and content at whole individual scale as well as for each organ, except the gills of both bivalve species (Table 4-5). This result is in contradiction with the study of Caro et al. (2009) which demonstrated a loss of one third of the gill-associated bacterial population each month during a long-term starvation experiment. However, the study only involved the endosymbiotic population of Codakia orbicularis in gills, and not the total bacterial population harbored by gills. As particular attention was undertaken to minimize water contamination during the experiment (sterilized synthetic seawater, plastic grid to eliminate faeces and pseudofaeces, renewal of the water every two days), the lack of any BCA decrease in gills after the depuration experiment still needed to be explained. This result may suggest intimate association of bacterial communities with gills of bivalves. Such an hypothesis needs to be confirmed by the analysis of BCD dynamics in gills 213 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves throughout a starvation experiment. Another hypothesis could be related to a diminution of filtration activity under stress conditions (starvation) leading to a lower depuration rate. Further experiments would need to be undertaken to specifically assess this question. The starvation experiment led to a decrease of ITS richness at whole individual scale as well as at tissue level (Table 8). This decrease was associated with marked differences in microbial assemblages over time, as suggested by the significant results of ANOSIM tests performed for each bivalve species. These results indicated that an important part of the bacterial population associated with bivalves might correspond to weakly-associated bacteria that were easily eliminated during starvation. More interestingly, the 21-day starvation experiment has highlighted the existence of persistent ITS in both species, ranging from 36 to 59%, according to the tissue analyzed, with a maximal value of 82% at whole individual scale (Table 8). Due to the high proportion of rare ITS (i.e. ITS detected only in one of the five bivalves analyzed at each time point), their randomness and consequently their low pertinence from an ecological point of view, a focus was the proportion of remaining ITS among the common / constant ITS. Then, the proportion of remaining ITS after the starvation experiment did not exceed 27% except for gill tissue in which the remaining common / constant ITS reached 50% in clams and about 60% in cockles (Table 9). Such results suggested that these ITS may correspond to bacteria more strongly associated with bivalve tissues, potentially being able to develop a symbiotic association, or at least close interaction, with bivalves, highlighting the concept of a core microbiota (Roeselers et al., 2011). The highest proportion of remaining common / constant ITS was found in gills of both bivalve species, which was in agreement with previous studies (Carballal et al., 2001; Hernández-Zárate & Olmos Soto, 2006). The existence of gill endosymbionts hosted in specialized cells called ‘bacteriocytes’ in several bivalves species such as Codakia orbicularis (Frenkiel & Moueza, 1995), Myrtea spinifera, Thyasira flexuosa (Brissac et al., 2011), Calyptogena soyoae (Kim et al., 1995) and a hydrothermal vent mussel (Distel et al., 1995) constituted additional evidence of the particular interaction existing between some bacteria species and the gills of molluscs. In the present study, the lowest percentages of the remaining common / constant ITS were found in the gut of both bivalves, and only concerned 4 ITS (Table 9). This low proportion may indicate that intestinal microbes in bivalves are food items (i.e. lysed/absorbed bacteria) rather than symbionts helping the digestion processes. Besides, the rather simple tubular morphology of the bivalve gut, lacking ‘fermentation chambers’ characteristic of the intestinal tract of organism harboring digestive symbionts, may also partly explain the dominance of trophic/transient bacteria (Egert et al., 2004). New ITS have been revealed by the starvation experiment, ranging from 18 to 64% of the Tf-detected ITS and from 0 to 47% of 214 Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves the common / constant Tf-detected ITS (Table 8, 10). The late detection of these particular ITS might be due to their relative abundance being too low to be detected with the threshold we chose before conducting the starvation experiment. The elimination of a large part of the microflora due to the depuration may have enhanced the proliferation and the settlement of non-dominant bacterial species by decreasing the spatial/food competition within the tissues, leading to their detection via molecular-based techniques. Overall, further investigations on the proportion of bacterial species being able to develop close association with bivalve tissues using standard microbiology (e.g. culture, staining, enzymatic assays) as well as molecular based techniques (16S RNA gene sequencing, SSH, FISH) would be needed to understand the nature and role of such microbiota in bivalves intimate ecology. Hemolymph and gills should be considered in further experiments on the particular bacterial-tissue associations highlighted in the present work, as these relations may play fundamental roles in bivalve physiology. Acknowledgements This work was carried out with the financial support of the project REPAMEP Liteau 3 (Manila clam response to environmental stress combining metals, toxic blooms and pathogens) (Coordinator: X de Montaudouin). The authors are grateful to sailors Francis Prince and Laurent Letort for their valuable help in the field, the SEPANSO for authorizing sampling in the National Reserve of Banc d’Arguin and Franck Salin (INRA, Pierroton) for ARISA analysis and Pr. R.J. Whittington for editing the English writing of the manuscript. References Al-Jebouri MM & Trollope DR (1981) The Escherichia coli content Azevedo C (1993) Occurrence of an unusual branchial mycoplasma- of Mytilus edulis from analysis of whole tissue or digestive tract. J like infection in cockle Cerastoderma edule (Mollusca, Bivalvia). Appl Bacteriol 51: 135-142. Dis Aquat Organ 16: 55-59. Antunes F, Hinzmann M, Lopes-Lima M, Machado J & da Costa PM Bright M & Bulgheresi S (2010) A complex journey: Transmission (2010) of microbial symbionts. Nature Rev Microbiol 8: 218-230. Association Between Environmental Microbiota and Indigenous Bacteria Found in Hemolymph, Extrapallial Fluid and Mucus of Anodonta cygnea (Linnaeus, 1758). 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Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves 218 CHAPITRE IV : Conclusion générale 219 220 Chapitre IV : Conclusion générale Ce travail a porté sur la caractérisation de la structure génétique des communautés bactériennes et archéennes de différents habitats (sédiments littoraux, bivalves fouisseurs), à diverses échelles (échelle centimétrique à kilométrique pour les communautés du sédiment ; échelle de l’individu ou de l’organe pour les communautés associées aux bivalves) par une approche d’empreintes moléculaires. Nos résultats sur les sédiments de trois écosystèmes (Bassin d’Arcachon, Vasière Ouest Gironde, Estuaire de la Gironde) ainsi que sur deux espèces de bivalves fouisseurs (Cerastoderma edule et Ruditapes philippinarum), mettent en évidence l’existence d’OTU procaryotes dites rares, par analogie avec les espèces rares des inventaires réalisés pour caractériser les communautés des macro-organismes. Au sein des communautés bactériennes et archéennes caractérisées, la dominance des OTU rares est observée de manière récurrente. L’importance et le rôle de ces OTU rares sont très controversés. Ces OTU peuvent en effet être considérées soit comme un artéfact (Kunin et al., 2010) soit comme le support d’une fonction méconnue au sein des écosystèmes (Galand, 2009). Ne disposant d’aucune information directe sur les propriétés fonctionnelles des communautés que nous avons étudiées, il nous est difficile de trancher. Pourtant, nos résultats montrent que les patrons de diversité sont identiques que les analyses soient réalisées à partir de la matrice des similarités faite sur l’ensemble des OTU ou sur les OTU ubiquistes seulement. Ce résultats est observé ainsi bien pour l’analyse des communautés procaryotes des sédiments benthiques que pour celle des communautés bactériennes associées aux bivalves fouisseurs (non présentéé dans ce manuscrit). Ces résultats confirment les résultats de Gobet et al. (2010) sur les communautés bactériennes des sédiments et mettent en évidence le faible pouvoir discriminant des OTU rares pour définir la diversité β. Si les OTU rares peuvent être négligées lorsque l’on compare la structure génétique de plusieurs communautés, il peut en être autrement lorsque l’on s’interroge sur la diversité des communautés au sens large. En effet la dominance ou la rareté d’un taxon n’est pas le seul critère pour juger de l’importance écologique de ce taxon au sein d’une communauté. Les taxons dominants présentent évidemment une dynamique particulière mais les espèces clés de voûte ne sont pas forcément les taxons les plus représentés au sein d’une communauté. Notre principal objectif était de s’interroger sur les processus d’assemblage des communautés procaryotes de deux grands types d’habitats, l’habitat sédimentaire et un habitat vivant, les bivalves filtreurs fouisseurs. 221 Chapitre IV : Conclusion générale Pour les sédiments, notre analyse des communautés bactériennes de trois écosystèmes situés en zone de transition (au sens de la définition qu’en donne la DCE 2000/60) a mis en évidence un effet de la distance géographique sur la similarité des structures génétiques des communautés bactériennes. Ces résultats pourraient s’inscrire dans la logique d’une hypothèse biogéographique de la distribution spatiale des taxons microbiens. En revanche à l’échelle intra-écosystème, il est observé, notament dans le Bassin d’Arcachon où une étude plus complète a été réalisée, un effet structurant des paramètres physiques et chimiques (en particulier le pourcentage d’émersion et la nature des particules sédimentaires) qui domine sur celui de la distance géographique dans les processus régissant les assemblages bactériens. Ce résultat est en accord avec l’hypothèse de Baas-Becking (1918) « everything is everywhere but the environment selects » (de Wit and Bouvier, 2006). Ces deux paramètres structurant les communautés bactériennes sont également les principaux facteurs structurant les communautés de macro-invertébrés de cet écosystème comme montré par Blanchet (2004), par Blanchet et al. (2005) et également par Dubois et al. (pers. comm.) lors d’une étude réalisée en parallèle de la nôtre. Ces résultats, ainsi que la corrélation observée entre la matrice de similarités des communautés procaryotes et celle des communautés de macroinvertébrés de Dubois et al., suggère que ces deux types de communautés peuvent être liées. Dans le Bassin d’Arcachon, un effort d’échantillonnage important (29 sites) a permis de mettre en évidence deux grands types de sous-communautés procaryotes dans les sédiments de surface de l’écosystème. L’hétérogénéité spatiale à l’échelle hectométrique des communautés procaryotes est donc faible et surtout partiellement découplée, contre toute attente, des gradients physiques et chimiques (vitesses de courants, températures, salinités de l’eau…) et biologiques (gradient de densité d’herbier, de composition de la matière organique, présence d’assemblages contrastés de macro-invertébrés, …) structurant ces habitats. Ce résultat est cohérent avec la distribution homogène de la composition de la matière organique sédimentaire observée au sein de cet écosystème par Dubois et al. (2011). Par conséquent, il est possible d’avancer que cet écosystème de transition n’est pas la simple image d’un milieu stratifié par l’affrontement entre les masses d’eaux continentales et marines mais présente bien un caractère spécifique se matérialisant par la présence d’une matière organique d’origine autochtone (Dubois et al., 2011) et par l’absence d’une dynamique des structures génétiques des communautés procaryotes liée à leur position géographique. Cette étude met en évidence que, pour un même effort d’échantillonnage, la multiplicité des 222 Chapitre IV : Conclusion générale réplicats intrasites présente un intérêt plus important que la multiplicité des sites pour l’analyse de la diversité procaryote au sein de cet écosystème. Cependant, nos travaux ont été réalisés à une échelle d’analyse centimétrique c'est-àdire intégrant et moyennant l’ensemble des processus ayant lieu sur les 0,5 premiers centimètres des sédiments de surface. Une diversité à l’échelle micrométrique existante serait alors masquée par notre approche à plus large échelle, comme nous le suggérons pour expliquer l’absence d’une mise en évidence de communautés procaryotes spécifiquement associées à la présence de Zostera noltii. En effet les herbiers sont connus pour relarguer du carbone organique dissous dans les premiers micromètres autour des rhizomes. Ce relargage est décrit comme modifiant la composition taxonomique et l’activité des communautés procaryotes de la rhizosphère (O'Donohue et al., 1991; Welsh et al., 1996 ; Larkum et al., 2006). Par exemple, la fixation de l’azote par les communautés microbiennes est accrue au niveau de la rhizosphère, tout comme les taux de réduction de l’acétylène et des sulfates (Welsh et al., 1997; Nielsen et al., 2001, Larkum et al., 2006). Il existe donc des interactions étroites entre les communautés bactériennes de la rhizosphère et l’herbier. De futures études pourraient alors compléter ces connaissances par une approche à plus fine échelle, milli- voire micro-métrique. Par exemple l’analyse de la structure génétique des communautés procaryotes le long d’un gradient de distance aux structures biologiques, pourrait mettre en évidence une dynamique des communautés en fonction de la distance aux rhizomes. Cette question est partiellement traitée dans le cadre du programme ANR IZOFLUX (Responsable, P. Anschutz) dont l’objectif est de caractériser les relations entre flux biogéochimiques et les processus benthiques dans les sédiments colonisés par les herbiers de Zostera noltii. Ce programme s’intéresse plus particulièrement à quantifier les processus microbiens conduisant à la production de N2 (e.g. dénitrification, anammox) à différentes échelles allant de la racine à l’écosystème. Coupler ces mesures de flux d’activités procaryotes à une mesure de la structure des communautés procaryotes par empreinte moléculaire et à une analyse de la composition de ces communautés permettraient d’appréhender le « qui fait quoi ? » au sein de ces communautés. En effet, l’approche par empreinte moléculaire seule ne procure pas d’information sur les fonctions assurées par les taxons mis en évidence. A l’instar des travaux réalisés en milieux terrestres (Bressan et al., 2009) identifier les populations bactériennes qui bénéficient des exsudats racinaires et déterminer l’impact de cette source de carbone sur la structure et les fonctions des communautés bactériennes du sédiment via l’utilisation de 223 Chapitre IV : Conclusion générale traceurs isotopiques (e.g. culture de plante sous 13 CO2) permettraient également de mieux percevoir les interactions procaryotes-herbier. Ces travaux nous donnent une vision des patrons spatiaux horizontaux de la structure génétique des communautés procaryotes du Bassin d’Arcachon. S’intéresser conjointement aux patrons spatiaux verticaux, le long de la colonne sédimentaire, permettrait de suivre la dynamique des communautés procaryotes en lien avec les processus de diagenèse précoce. Ce travail nécessiterait alors une approche alliant microbiologistes et biogéochimistes. En effet nous avons vu que pour expliquer la dynamique des communautés procaryotes, une large base de données descriptive de l’habitat était requise. Parmi ces données la quantification des flux d’accepteurs d’électrons présente un intérêt particulier puisque ces flux traduisent l’activité procaryote au sein des sédiments. La mise en relation entre les flux d’accepteurs d’électrons et la diversité des communautés procaryotes pourraient alors être une première étape dans la connaissance des interactions biodiversité-fonctionnement au sein de cet écosystème. Ces flux peuvent être modifiés par la présence d’organismes ingénieurs de l’écosystème, capables de remanier le sédiment (brassage des particules sédimentaires) ou encore de créer des structures biologiques (creusement des galeries ou terriers) (Matisoff 1995 ; Rhoads, 1974). Ces phénomènes, appelés bioturbation, sont décrits comme stimulant l’activité de minéralisation de la matière organique par les procaryotes (Hansen and Kristensen, 1998; Lohrer et al., 2004; Kogure and Wada, 2005). En particulier, la bioturbation entraine une introduction d’oxygène vers les couches plus profondes du sédiment, modifiant les limites entre zones oxique et anoxique dans le sédiment et pouvant entrainer localement une inhibition de la respiration anaérobie. Les phénomèmes de bioturbation apparaissent donc comme des facteurs importants de structuration des communautés procaryotes. Il semble donc important de s’attacher à comprendre les liens entre la diversité taxonomique et fonctionnelle des procaryotes et celle des organismes bioturbateurs. Y a-t-il un lien entre le niveau de complexité des communautés procaryotes et des communautés de bioturbateurs ? Cette réflexion pourra passer par la comparaison de l’effet de différents organismes bioturbateurs sur la diversité des procaryotes du sédiment ou encore sur la mise en évidence d’une dynamique des communautés procaryotes le long des structures biologiques comme les terriers de macro-invertébrés par exemple. Les futurs travaux devront donc approfondir les informations disponibles via (i) l’identification des souches dont l’auto-écologie pourra nous renseigner sur les potentialités fonctionnelles de l’assemblage, (ii) la quantification du niveau d’expression de certains gènes 224 Chapitre IV : Conclusion générale fonctionnels à l’échelle communautaire ou encore (iii) le suivi de la dynamique temporelle des deux sous communautés procaryotes mises en évidence. L’enjeu est de pouvoir acquérir ces informations à l’échelle écosystémique ce qui disqualifie certaines approches trop fastidieuses. L’acquisition de ces informations pourrait permettre de mieux comprendre le lien entre la diversité procaryote et le fonctionnement de l’écosystème et d’apporter un suppplément d’information aussi bien pour les modèles de gestion et de conservation de l’écosystème que dans le suivi à moyen et long terme de l’évolution de l’environnement comme celui mis en place dans le cadre du Service d’Observation en Milieu LITtoral. La seconde partie de nos travaux a porté sur les facteurs structurant les assemblages des communautés bactériennes associées aux bivalves fouisseurs. L’habitat et l’état de santé du bivalve ont plus particulièrement été regardés comme les facteurs de contrôle les plus évidents de la structure génétique des communautés bactériennes du bivalve. Selon l’organe considéré et sa fonction, en contact avec le milieu extérieur, les facteurs structurant les communautés bactériennes qui lui sont associées diffèrent. Si les communautés bactériennes du tube digestif et des branchies, organes les plus en contact avec le milieu extérieur et considérés comme des sites primaires d’infection bactérienne, sont majoritairement liées à l’habitat, celles des organes les plus internes comme le muscle, le pied ou l’hémolymphe semblent majoritairement liées à l’appartenance du bivalve à un taxon ainsi qu’à l’état de santé de celui-ci. Les communautés bactériennes du tube digestif d’un bivalve apparaissent donc comme de bons modèles pour décrire la dynamique de l’environnement dans lequel vit le bivalve, mais ils ne sont que peu le reflet des communautés bactériennes propres aux bivalves (i.e. flores symbiotiques, résidentes ou autochtones). En ce qui concerne les branchies, le déterminisme des communautés bactériennes qui leur sont associées semble plus complexe. C’est justement dans les branchies qu’ont été décrites les symbioses les plus étroites (bactériocytes branchiaux abritant des bactéries sulfo-oxydantes endosymbiotiques) chez certains bivalves (Lucinidae). Au contraire, les communautés bactériennes des organes plus internes comme l’hémolymphe apparaissent comme de bons modèles pour de futures études sur la dynamique des communautés bactériennes étroitement associées aux bivalves. Si cette étude a permis de mettre en évidence un déterminisme des communautés bactériennes différent en fonction des organes de l’hôte, elle ne génère, compte tenu de la méthodologie mise en place, aucune information sur le rôle fonctionnel de ces bactéries au 225 Chapitre IV : Conclusion générale sein de l’hôte. Mettre en évidence le rôle fonctionnel de ces communautés bactériennes au sein de l’hôte est l’un des futurs enjeux scientifiques dans la caractérisation des mécanismes d’interactions bactéries-bivalves. Il permettrait en particulier de préciser le lien entre les communautés bactériennes et l’état de santé de l’hôte. Par exemple, les bivalves hébergent-ils des taxons bactériens apparentés aux bactéries probiotiques décrites chez d’autres invertébrés marins ? Certaines bactéries impliquées dans les processus liés au cycle de l’azote ont montré un rôle épurateur chez d’autres mollusques marins, les coraux, participant ainsi à la bonne fitness de ces organismes. Existe-t-il de tels taxons au sein des communautés bactériennes des bivalves ? La réponse à ces questions requiert une étude de la composition de ces populations bactériennes et de leur auto-écologie. Une première approche par séquençage de l’ADNr 16S de souches pures isolées sur milieu de culture (réalisée en parallèle de ces travaux et non présentée dans ce manuscrit) et visant à déterminer la composition des communautés bactériennes associées aux bivalves met en évidence la dominance des γ-Protéobactéries, α-Protéobactéries, Actinobactéries, Bactéroïdes et Firmicutes. Déterminer les capacités de ces souches à métaboliser divers substrats à travers par exemple des systèmes comme le système BIOLOG Ecoplate© qui permet de suivre la croissance bactérienne à partir d’une trentaine de sources de carbone différentes, permettrait d’avoir une première vision de leur diversité fonctionnelle. De même, déterminer leur potentielle capacité à produire des substances antimicrobiennes serait un premier pas dans la mise en évidence d’un rôle probiotique des communautés bactériennes associées aux bivalves. De manière plus générale, une caractérisation de la composition et de la diversité fonctionnelle de la microflore associée aux bivalves, incluant les communautés archéennes non prises en compte dans nos travaux, apporterait une vision plus large et plus complète de la diversité des communautés procaryotes associées aux bivalves et de leur rôle fonctionnel. Cette caractérisation permettrait de révéler la présence d’éventuels taxons hôte-spécifiques, non présents dans l’habitat de l’hôte. Une telle étude sur la composition bactérienne des éponges a d’ailleurs été menée par Fieseler et al. (2004) et a permis de découvrir un nouveau phylum bactérien baptisé « Poribacteria ». La connaissance des capacités métaboliques et de l’activité des communautés procaryotes associées aux bivalves dans les processus liés au cycle de l’azote présente également un fort intérêt à la fois dans la compréhension des interactions procaryotes-bivalves mais également dans celles avec l’habitat. En effet d’une part il est connu que chez les éponges, certains symbiontes bactériens jouent un rôle important dans la transformation de l’azote secrété par l’éponge et ses autres symbiontes (Hoffmann et al., 2009). D’autre part, il est également connu que la présence de bivalves dans 226 Chapitre IV : Conclusion générale l’environnement stimule les activités bactériennes de nitrification, dénitrification ou de production d’ammonium dans l’environnement (Henriksen et al., 1983). Outre le rôle de l’activité de bioturbation du bivalve dans la stimulation des activités procaryotes de l’environnement, l’hypothèse d’une influence des communautés procaryotes associées aux bivalves sur celles de l’environnement pourrait également être envisagée. Une première étape d’identification de ce lien serait la caractérisation des activités liées au cycle de l’azote des procaryotes associées aux bivalves via par exemple une adaptation de la méthode de 15 N stable isotope pairing développée pour les sédiments par Dalsgaard et al. (2003). L’analyse de la composition taxonomique et de la diversité fonctionnelle est donc une des voies de recherche qui pourrait permettre d’améliorer la connaissance des interactions entre la flore de l’hôte et la flore de l’habitat. Ces connaissances devront également être élargies à d’autres modèles d’invertébrés marins qui permettront à la fois de généraliser les résultats obtenus sur des modèles de bivalves fouisseurs mais également d’affiner la caractérisation des déterminismes des communautés bactériennes associées. En effet, pour deux espèces de bivalves au même mode de vie (fouisseurs) les communautés bactériennes du tube digestif et des branchies sont majoritairement déterminées par l’habitat, mais quelle est la part de l’effet du mode de nutrition dans ce déterminisme. L’étude des communautés procaryotes de deux espèces sympatriques mais au mode de vie différent (e.g. bivalves filtreurs non fouisseurs et sessiles comme l’huître ou la moule vs bivalves filtreurs-fouisseurs comme la coque ou la palourde) pourraient permettre de répondre à cette question. De même, comparer les communautés procaryotes associées à un organe interne entre hôtes peuplant des habitats différents, le long de l’aire de répartition géographique de cet hôte, permettrait de mieux envisager la part de l’environnement et de la spécificité d’hôte dans la constitution de la microflore associée. Finalement, la caractérisation de la structure génétique des communautés procaryotes par empreinte moléculaire apparait comme une étape préliminaire mais indispensable dans l’analyse de la diversité des communautés. Elle permet en effet de discriminer un ou plusieurs types d’assemblages procaryotes au sein d’habitats complexes rendant ainsi possible l’analyse de la composition en espèces par des techniques basées sur de la métagénomique non applicables pour des études à large effort d’échantillonnage. Si au sein de communautés faiblement diversifiées et à faible taux de réarrangement, il est possible de reconstituer des génomes entiers d’espèces à partir des fragments d’ADN séquencés, cela reste encore un challenge lorsque les communautés sont complexes. Cependant, une haute résolution de 227 Chapitre IV : Conclusion générale séquencage génère une complexité dans les jeux de données nécessitant d’adapter les traitements de données et de faire évoluer les outils mathématiques et algorithmiques permettant l’analyse des séquences d’acides nucléiques. Les futures approches nécessiteront donc d’allier à la fois compétences en écologie microbienne et en bio-informatique pour caractériser les dynamiques des structures génétiques taxonomiques et fonctionnelles des communautés procaryotes. Réferences Blanchet H (2004) Structure et fonctionnement des Fieseler L, Horn M, Wagner M, Hentschel U (2004) peuplements benthiques du bassin d'Arcachon. Thèse Discovery of the novel candidate phylum "Poribacteria" d'Etat, Université de Bordeaux 1. in marine sponges. Applied and Environmental Microbiology 70: 3724-3732. 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Sur 29 sites des zones intertidale et subtidale du Bassin d’Arcachon, les communautés procaryotes présentaient des patrons de distribution spatiale corrélés à ceux de la macrofaune benthique mais représentaient une faible diversité cumulée par habitat. L’extension à des écosystèmes proches (Vasière Ouest Gironde, Estuaire de la Gironde) a mis en évidence une forte proportion d’OTU (Operational Taxonomic Unit) rares et une diminution de la similarité entre les communautés avec l’éloignement géographique des écosystèmes. Chez les bivalves, les communautés bactériennes ont été caractérisées successivement à l’échelle de l’individu, de l’organe isolé et de l’espèce. Le suivi d’une cohorte de coques n’a pas montré d’influence de la présence du parasite Bucephalus minimus sur la structure de ces communautés à l’échelle de l’individu. En revanche, prises à l’échelle de l’organe en comparant la coque à la palourde, les communautés bactériennes associées aux bivalves se sont différenciées en fonction des organes (e.g branchies, tube digestif, reste des tissus), de l’habitat et/ou de l’espèce. Mots clés: bactéries, archées, Ruditapes philippinarum, Cerastoderma edule, écosystème de transition, CE-fingerprinting, interactions bactéries-bivalve. ABSTRACT The structures of prokaryotic communities (β diversity) were characterized in sediments and burrowing bivalves. In the sediments, the bacterial and archaeal communities were analyzed by ARISA (Automated Ribosomal Intergenic Spacer Analysis) and 16S RNA gene T-RFLP (TerminalRestriction Fragment Length Polymorphism) respectively. In 29 subtidal and intertidal sites of the Arcachon Bay, the spatial patterns of prokaryotic and benthic macrofaunal communities were correlated whereas prokaryotic community species exhibited a low cumulated diversity per habitat. Extending to neighboring ecosystems (West-Gironde mud patch, Gironde estuary) revealed the occurrence of a high proportion of rare OTU (Operational Taxonomic Unit) and a decrease of community similarities with geographic distance among ecosystems. For the bivalves, the whole individual, the organ-scale and the species-scale were successively considered. A cockle cohort monitoring indicated no influence of the parasite Bucephalus minimus occurrence on bacterial community structure at the individual-scale. Comparing cockle and clam at the organ level demonstrated that bivalve associated bacterial communities could differ among organs (e.g. gills, digestive gut, others tissues), among habitats and/or between species. Keywords: bacteria, archaea, Ruditapes philippinarum, Cerastoderma edule, Transient ecosystem, CE-fingerprinting, Bacteria-bivalve interactions. 231