réplication 1 LES MECANISMES DE LA

réplication 1
LES MECANISMES DE LA REPLICATION
Le mécanisme de réplication est basé sur le fait que l'ADN est constitué d'une double hélice et que
chaque brin est complémentaire de l'autre. La transmission de l’information génétique se fait au
moment de la mitose, mais la réplication proprement dite se fait avant. Dans le cycle cellulaire des
eucaryotes, on peut distinguer les trois phases: G1, S, et G2. La réplication de l'ADN nucléaire a lieu
lors de la phase S. Cet événement est repérable en soumettant la population de cellules (en tissus, ou en
culture) à un marquage court avec de la 3H thymidine et en suivant, par autoradiographie, le devenir de
ces cellules.
1) Découverte de l'ADN en tant que matériel génétique
* Expérience de Griffith (1912) puis d’Avery (1944) avec Pneumococcus
Griffith a utilisé deux souches de pneumococces: la première souche est sauvage, ce sont des
pneumococces vivants et virulent c'est à dire qui tuent la souris. Ces pneumococces peuvent être
inactivés en les tuant par la chaleur, dans ce cas l'injection ne tue pas par la souris. La deuxième souche
de pneumococces sont des mutants qui ont perdu une paroi de polysaccharides et de ce fait sont
détruits par la souris, cette souche est avirulente. Si on mélange la souche inactivée par la chaleur (qui
ne tue pas) à la souche avirulente (qui ne tue pas non plus) on observe la mortalité de la souris
Conclusion de l'expérience: il existe un principe transformant dans la souche inactivée par la chaleur qui
transforme la souche avirulente en souche virulente. Ce principe transformant provient de la souche
mutante.
* Avery a recherché le principe transformant. Il a séparé les différents composants de la souche
inactivée et fait l'expérience précédente avec les composants de la bactérie. Il en est arrivé à la
conclusion que le principe transformant est de l'ADN.
Définition : la transformation d'une bactérie corespond à l'introduction d'un fragment d'ADN qui lui
confère une nouvelle propriétée L'entrée d'ADN dans une cellule eucaryoteest appelé transfection
simplement parce que les premier essais qui ont été effectués utilisait des virus recombinants,
transfection vient d'infection. Le terme de transformation d'une cellule eucaryote était déjà utilisé, c’est
la conversion de la cellule en un état de croissance non restreint en culture, ce qui ressemble ou est
identique à un état tumoral.
* Expérience de Hershey et Chase (1952) avec le phage T2 (un phage est un virus de bactérie).
Ils ont infecté des bactéries avec des phages comportant de l'ADN marqué au 32P et des protéines
marquées aus 35S. En séparant les bactéries du milieu, on s'appercoit que les bactéries sont marquées au
32
P et que le 35S reste dans le milieu. L'ADN rentre dans les bactéries et non les protéines. Lorsque les
phages se développent et lysent les cellules, l'ADN marqué est relargué dans le milieu. Conclusion :
l'ADN assure la descendance.
L'ADN est donc responsable de l'information génétique.
* En 1940 Linus Pauling et Max Delbrüch proposent que la duplication des gènes implique la synthèse
de molécules complémentaires
réplication 2
Cette hypothèse a été testée par Meselson et Stahl (1958)
Ils ont utilisé la technique de centrifugation isopycnique pour séparer des molécules en fonction de
leurs densité, pour séparer des molécules
denses, des molécules moins denses. En
cultivant E. coli en présence de 15N
(isotope lourd de l'azote), la totalité de
l'ADN incorpore du 15N qui est plus dense
que celui avec 14N. En conséquence,
l'ADN est lui même plus dense. En
centrifugation isopycnique sur gradient de
chlorure de césium, l’ADN migre jusqu'à
sa densité. On observe une bande, si on
1
2
3
4
charge un mélange de deux ADN,
provenant de bactéries cultivées en
1 : bactéries cultivées en présence de 14N
présence de 15N et de 14N, on obtient deux
2 : bactéries cultivées en présence de 15N
3 : bactéries cultivées en présence de 15N et une génération en présence de 14N
bandes.
4 : bactéries cultivées en présence de 15N et deux générations en présence de 14N
Si on transfère les bactéries ayant poussé
sur 15N sur un milieu 14N, on obtient à la première génération de l'ADN qui migre à une position
intermédiaire.
A la deuxième génération on obtient deux bandes correspondant à la bande légère et à la bande
intermédiaire.
L'information génétique est donc contenue dans l'ADN et la réplication est semi-conservative. Il restait
alors à montrer comment une molécule peut se répliquer. Pour ce faire il fallait avoir une idée de la
structure de l'ADN.
* En 1930 des physicochimistes suedois démontrent que l'ADN est un polymère de 20 Å d'épaisseur.
* En 1951 Edwing Chargaff remarque que la composition en bases de l'ADN varie selon les espèces. De
plus il remarque que A = T et G=C (règle de Chargaff).
* En 1950 le physicien Maurice Wilkins obtient un cliché aux rayons X identique à celui d'un cristal :
l'ADN a donc une structure régulière
* Rosalind Franklin obtient par la suite un cliché en croix caractéristique d'une structure en forme
d'hélice. Mais le diamêtre de l'hélice (20Å était trop grand pour une seule chaine).
* En 1953 Francis Crick et James Watson construisent un modèle sur les données de Rosalind Franklin:
Ils en concluent que l'ADN est double brin:
c'est une hélice, ce qui est en accord avec les résultats de Maurice Wilkins et Rosalind Franklin, la régle
de chargaff est respectée, il y a possibilité de synthèse à partir d'une molécule complémentaire ce qui est
en accord avec l'hypothèse de Pauling et Delbrüch.
réplication 3
conclusion : l'ADN est le support de l'hérédité. Explication de l'expérience de transformation de
Griffith et Avery
3) Initiation de la réplication
Chez les bactéries comme chez les mammifères, les fourches de réplication vont par paires et avancent
le plus souvent en direction opposée pour former ce que l’on appelle l'oeil de réplication. Le démarrage
de la réplication se situe au niveau d'une séquence appelé: origine de réplication.
Parmi les éléments importants dans la réplication, on peut considérer les éléments en cis, ceux qui sont
au niveau ou à proximité du site d’initiation et les éléments en trans qui viennent d’ailleurs dans le
génome. Chez E. coli, les éléments en cis sont représentés par une séquence de 250 bp qui est appelée
origine de réplication du chromosome ou ori C. Les éléments en trans sont des protéines qui se lient à
cette séquence. La première est la Dna A, 10-12 Dna A reconnaîssent une séquence sur l’origine de
réplication (Dna A box) et cette liaison ouvre partiellement les deux brins. Deux autres protéines Dna B
et Dna C, peuvent alors se lier sur l’origine, continuer à ouvrire les deux brins et permettre à une
primase d’initier la réplication en synthétisant un petit ARN qui servira d’amorce à une DNA
polymérase.
La réplication d’un plasmide utilise les éléments en trans produits par le chromosome. Comment
délimiter l’origine de réplication sur un plasmide ? on effectue des délétions progressives in vitro, puis
on transforme des bactéries. Si le plasmide se réplique c’est qu’on a toujours une origine de réplication
fonctionnelle, s'il ne se propage plus, on a éliminé une séquence importante dans la réplication. On
défini ainsi la séquence minimum pour que le plasmide se maintienne dans la bactérie.
Il faut associer un marqueur au plasmide pour différentier les bactéries transformées des non
transformées. On utilise un gène de résistance aux antibiotiques, si après transformation, les colonies
bactériennes se développent sur un milieu avec antibiotique, le gène de résistance est transcrit et traduit,
donc le plasmide s’est répliqué.
Comme les origines de réplication sont reconnue par des protéines d'initiation. Il y a donc une certaine
spécificité, par exemple, une origine de réplication de bactérie n'est pas reconnue par la protéine
d'initiation d'eucaryote. Donc si on introduit un plasmide bactérien dans une cellule eucaryote, il ne se
réplique pas et se perd lors des division cellulaires
réplication 4
Chez les eucaryotes, il doit exister des séquences spécifiques pour les origines de réplication. Elles ne
sont connues que chez la levure (Saccharomyces cerevisiae)
Ura3
ARS
chez qui il existe des équivalent des plasmides bactériens. Les
Amp
origines de réplication sont appelées: séquences ARS
ori
(Autonomous Replication Sequence) . Elles font 100 bp et génome de levure fragmenté
sont composées de copies de 11 nucléotides:
R
(A ou T)TTTAT(A ou G)TTT(A ou R)
Pour les mettre en évidence on suit le même principe que pour
les origines de réplication des plasmides. On utilise une levure
mutante par exemple incapable de synthétiser l'uracile. Cette
levure ne peut pas pousser sur un milieu dépourvu en uracile.
On transforme ces levures à l'aide d'un plasmide contenant le
gène manquant (URA3) chez le mutant et un morceau d'ADN
de la levure. Si la levure pousse on récupère le plasmide dans
E. coli et on regarde ce qu'il y a dans le morceau d'ADN de
levure, dans l'insertion. C'est un exemple de clonage par
complémentation.
construction
tansformation d’une levure déficiente
en Ura3
ARS
Sélection du plasmide portant l’ARS
Les unités de réplication
Ils existe une seule unité de réplication chez les bactéries et plusieurs unités de réplication chez les
eucaryotes. Chez les eucaryotes, s'il n'y avait qu'une seule origine de réplication par chromosome, huit
heures, la durée de la phase S, serait un temps trop court. En effet, la DNA polymérase eucaryote
polymérise 50 nucléotides à la seconde.
1 Chr = 150 x 106 bp (en moyenne) / 50 = 3 x 10 6 s = 800 heures
Il y a donc au moins une centaine origines de réplication, espacées de 30000 à 300000 pb.
Pour qu’il y ait synthèse d’ADN, comme la réplication est semi conservative, il faut tout d’abord
séparer les deux brins. Mais la double hélice est extrêmement stable, il faut la chauffer à une
température d’environ 90°C pour séparer les brins ce qui n’est pas possible sans altérer les autres
composant de la cellule. Lorsqu’on rencontre un tel problème, il y a une protéine. C’est l'ADN hélicase
qui se fixe sur l a protéine d'initiation. Les ADN hélicases ont besoin d’énergie pour séparer les deux
brins. Elles trouvent cette énergie en métabolisant de l’ATP, ce sont donc des ATPases. Elles se
déplacent le long de la chaîne d'ADN monocaténaire et déroulent la double hélice.
réplication 5
L’ADN se retrouve sous forme simple brin. Si sur le même brin, il y a des structures
autocomplémentaires, capables de
s’apparier (de s’hybrider), l’ADN va
former des structures doubles brins, des
structures en tige et boucle (hairpin
loop). Pour éviter ce problème, il y a des
protéines qui stabilisent l’ADN simple
- SSB protéines
brin qui sont appelées les SSB protéines
pour single-strand DNA-binding (SSB)
proteins ou protéines de déstabilisation
de l'hélice. Les SSB protéines ne
recouvrent pas les bases donc
n'empêchent pas le passage des DNA+ SSB protéines
polymérases.
La synthèse d'ADN est due à une ADN polymérase, mais cette dernière a besoin d’une amorce. Ce
n'est pas le cas des ARN polymérase. Dans la transcription, l'ARN polymérase se fixe sur l'ADN sur un
site qui dans ce cas est appelé promoteur, elle ne nécessite pas d'amorce. Un moyen de fabriquer une
amorce est donc d’utiliser une RNA polymérase. De même dans la fourche de réplication, il existe une
ARN primase qui catalyse de courtes amorces d'ARN (primer en anglais = amorce). Cette amorce est
d’environ 10 nucléotides.
A ce niveau, tout est prêt pour synthétiser l’ADN. Cette synthèse est due à une DNA polymérase qui
catalyse le formation de liaisons entre le groupement OH en 3' du désoxyribose de l’amorce ou la
chaîne en élongation et le phosphate a fixé sur le carbone 5' du dNTP. Il y a libération d'un
pyrophosphate PPi qui est immédiatement hydrolysé (la polymérase ne peut donc pas désassembler et
reformer dNTP). La polymérisation est donc unidirectionnelle (sens 5' vers 3').
La polymérase doit donner lieu à une réplication très fidèle (une erreur pour 109 copies de paires de
base). Cette fidélité est assurer par le fait que la polymérisation nécessite une amorce. La polymérase ne
peut pas assembler des dNTP si le dernier nucléotide à l’extrémité 3'-OH n’est pas apparié. En cas
d’erreur, la polymérisation est bloquée, jusqu’à ce qu’une DNAse enlève le nucléotide non apparié.
Ces DNAses qui digèrent l’ADN à partir de l’extrémité sont appelées des exonucléases. Cette activité
exonucléase est portée par la polymérase, comme l’activité 3'5' exonucléase est plus faible que l’activité
polymérase, la polymérisation l’emporte si il n’y a pas d’erreur. Par contre si la polymérisation est
bloquée par une erreur, l’activité exonucléase l’emporte. C'est le premier mécanisme de correction
pendant la réplication
Cette action de correction explique le sens de la polymérisation de 5' vers 3'. L’énergie est donnée par
les nucléotides triphosphates, dans l’autres sens de 3’ vers 5’, l’énergie serait donnée par le dernier
nucléotide en 5’ de la chaîne en cours d’élongation. En cas d’erreur, l’excision du dernier nucléotide
incorporé libérerait un 5’ monophosphate, et il n’y aurait plus d’énergie disponible pour continuer la
polymérisation..
La polymérisation est très rapide (500 nucléotides/sec chez les bactéries - 50 nucl./s chez les
mammifères). Les eucaryotes n'ont pas à répliquer que leur ADN mais aussi à synthétiser les protéines
qui lui sont associées. Chez les eucaryotes, il y a aussi assemblage des protéines chromosomiques pour
former la chromatine ce qui explique pourquoi la fourche progresse à 50 nucléotides par seconde.
réplication 6
Les ADN polymérases, le primosome (primase et hélicase) et les SSB protéines forment une seule
grande unité qui se déplace le long de l'ADN, permettant la synthèse de l'ADN sur les deux branches de
la fourche d'une façon coordonnée et efficace.
4) L'élongation
On appelle fourche de réplication l'endroit où les deux brins parentaux se séparent. Du fait que la
polymérisatrion s'effectue dans le sens
5'>3', elle est asymétrique. On distingue la
chaîne précoce ou brin principal de la
3’
5’
3’
chaîne tardive ou brin secondaire. Dans
5’
brin tardif
la chaîne précoce, le brin 5' vers 3' est
5’
polymérisé de façon continue, il n’y a pas
5’
de de problème, par contre la
3’
5’
polymérisation de la chaine tardive est
DNA polymérase
discontinue, il y a formation de fragments
5’
d'Okasaki (nom du biochimiste).
3’
La polymérisation de la chaîne tardive
requiert plusieurs enzymes :
- une DNA polymérase (différente de la
DNA polymérase agissant sur le brin
précoce)
- une RNAse H ou une activité
exonucléase
primase
5’
5’
Elimination
de l’ARN
5’
3’ ARN
3’
5’
DNA polymérase
5’
3’
5’
ligase
5’
Les brins d'ARN provenant de la
3’
5’
primase sont enlevés soit par une
activité 5'3' exonucléase de la
polymérase soit par une RNAse (dans ce cas il s'agit d'une RNAse H) qui est capable de dégrader
l'ARN lorsqu'il est hybridé à de l'ADN.
- une ADN ligase pour liguer le fragment néosynthétisé et le fragment précédent.
La topoïsomérase I
Elle empêchent l'ADN de s'emmêler au cours de la réplication.
Pour que la fourche avance, il faudrait ou bien dérouler la double hélice à la vitesse de la polymérase
(500 nucléotides/sec chez les bactéries comme il y a 10 nucléotides par tour d’hélice, il faudrait faire 50
tours par seconde) mais ceci nécessiterait beaucoup trop d'énergie), ou bien faire une coupure
transitoire d'un brin juste en aval de la fourche pour relacher de la tension. Dans ce cas, les 2 morceaux
du brin, de part et d'autre de la coupure, pivotent librement l'un par rapport à l'autre. Ensuite une
soudure doit avoir lieu avant la dissociation des deux brins dans la fourche de réplication. C'est le travail
de la topoisomérase I qui fait unecoupure moncaténaire.
Dans le site actif de cette enzyme, il y a une tyrosine qui se lie de façon covalente avec un phosphate
de l'ADN et de ce fait romps la liaison phosphodiester. Elle retient l'énergie de cette liaison de sorte que
la réaction réversible de soudure ne demande pas d'énergie.
Réplication et transcription
réplication 7
Qu'arrive t-il lorsque la polymérase rencontre un ARN polymérase engagée dans la transcription d'un
gène ? Une fourche de réplication avance environ 10 fois plus vite que la RNA polymérase.
Si elles vont dans le même sens soit la DNA polymérase attend soit elle déplace la RNA polymérase
arrêtant la transcription du même coup.
Si elles vont dans des sens opposés le conflit est plus sérieux et il semble qu'il n'ait pas été bien résolu
au moins chez E. coli. Le génome des bactéries est répliqué à partir d'une seule origine et la réplication
est bidirectionnelle. Presque tout les transcrits sont dans le sens de la fourche de réplication, toute les
exceptions comprennent des transcrits rares et courts.
5) Fin de la réplication
Il existe des endroits dans les génomes ou la réplication est ralentie, Ces ralentissement ont pour but de
gérer les conflits entre la réplication et la transcription. D’autre part ces endroits sont souvent des sites
préférentiels de recombinaison.
terC
terB
terA
terD
Chez les bactéries, pour le chromosome comme pour les
plasmides, la réplication s'arrête à un endroit situé à l'opposé de
l'origine. Deux régions ont été identifiées sur le chromosome d’E.
coli, terD, terA et terC, terB situé à environ 100 bp de chaque coté
du point de rencontre. Elles marchent chacune dans un seul sens.
Cet arrangement constitue une sorte de piège, si un fourche est
retardée, elle est bloquée par ces séquences de terminaison.
ori
De nombreux génomes sont linéaires et
en particulier le génome des cellules
eucaryotes. Comment la réplication se
5’
termine au bout du chromosome,
?
amorce
5’
3’
comment s'initie la réplication sur le brin
5’
tardif pour se faire jusqu'au bout ? Le 3’
3’
brin tardif a besoin d'une amorce
fabriquée par l'ARN primase. Cette
amorce a elle même besoin d'une
matrice. Au bout du chromosome il y aurait à chaque génération une perte de quelques nucléotides
Quatre solutions différentes ont été adoptées pour résoudre ce problème.
1- Convertir l'ADN linéaire en une molécule circulaire. C'est le cas du phage λ
3’
5’
réplication 8
2 - Au lieu d'être bien défini, l'extrémité du
génome est variable, composées d'unité répétées
5’
d’une dizaine de bases, ajoutées par une
télomérase qui rajoute des courtes séquences en
3
3'. C'est le cas adopté par les chromosomes
eucaryotes. La réplication ne s’effectue pas
jusqu’au bout mais ces répétitions n’ont pas
d’importance, ne sont pas codantes, et sont
rajoutées par la suite par la télomérase.
5’
3- L'ADN peut former une structure inhabituelle,
3
une boucle (hairpin) au bout reliant les derniers
nucléotides si bien qu'il n'y a en fait pas de bout.
C'est le cas par exemple du génome mitochondrial des paramécies (qui est linéaire)
4 - Une protéine est liée à l'extrémité du génome et rend possible l'initiation au dernier nucléotide. Ce
cas a été trouvé chez le phage φ29 ou l'adenovirus.
Il y a aussi un problème avec les génomes circulaires, il faut séparer les deux ADN qui se retrouvent
enlacés comme des anneaux. La topoïsomérase II fait une coupure bicaténaire .
6) Les corrections et la réparation de l'ADN
Comment l'information génétique se transmet elle fidèlement?
Comment y a til les quelques erreurs qui permettent l'évolution?
Correction des épreuves.
En plus de la première correction due à l’activité exonucléasique 3’5’de l’ADN polymérase, il existe
une deuxième correction dite la correction sur épreuve. En effet, il reste des erreurs qui sont corrigées
après la polymérisation
Le système de correction des épreuves reconnaît une
protubérance sur les brins d'ADN et est due à des
endonucléases. La correction ne doit pas être faite sur le
brin matrice, mais uniquement sur le brin en cours de
polymérisation. Chez E. coli, il y a méthylation de tous
les résidus A des séquences GATC. Cette méthylation
n'a pas lieu immédiatement de sorte que le brin qui
vient d'être synthétisé et qui doit être corrigé, est
reconnu parce qu'il n'est pas méthylé.
Il peut y avoir aussi des modifications de l'ADN après
la réplication. le taux de ces modifications peut être
augmenté par des agents qui sont alors appelés
mutagènes. En effet si elles ne sont pas réparées ces
modifications entraînent des mutations.
Me
GATC
CTAG
T
C
Me
GATC
CTAG
7) Une réplication particulière : le rolling circle
Ce mode de réplication existe par exemple chez le phage λ et le phage M13
T
A
réplication 9
La réplication d'un seul brin est utilisée pour générer des copies de certaines molécules circulaires. Un
nick ouvre un brin ce qui produit une extrémité 3'OH. La polymérisation commence à cette extrémité 3'
et le nouveau brin déplace le brin parental. Cette réplication est appelée "rolling circle" parce que la
polymérisation peut se dérouler indéfiniment en tournant autour du brin matrice.
La forme linéaire peut être soit maintenue sous forme simple brin (cas de M13) soit convertie en double
brin par la synthèse du brin complémentaire (comme dans le phage λ par exemple)
exemple du phage M13
C'est un bactériophage de 6.4 kb, ADN simple brin, qui contient une dizaine de gènes. Il infecte
seulement les bactéries qui expriment le pilus sexuel codé par le facteur F, il pénètre par le pilus, la
capside est retirée et l'ADN est transféré dans le corps principal de la bactérie. Ce brin d'ADN (appelé
brin +) est alors converti en double brin circulaire appelé RF DNA (forme replicative). Cette conversion
est due à des enzymes bactériens, une RNA polymérase initie la réplication qui est effectuée par une
DNA polymérase. La transcription des gènes viraux peut alors avoir lieu. La protéine produit du gène II
introduit un nick à un site spécifique du brin +, plus il y a de formes réplicative, plus il y a de protéine
produit du gène II, si bien qu'à partir d'une certaine quantité de plasmide, ils sont tous ouverts. Une
DNA polymérase ajoute des nucléotides en 3' en déplaçant le brin + originel. Une fois qu'un tour a été
fait, le produit du gène II coupe au même endroit, libérant un brin linéaire qui est alors recircularisé.
+
forme réplicative
Protéine V
(SSB protein)
5’
Réplication
protéine II
(DNAse)
nick
3’
5’
réplication 10
Au début de l'infection ce brin est de nouveau transformé en forme réplicative mais lorsqu'il y a
beaucoup de forme réplicative, le produit du gène V (SSB single strand binding protein) s'accumule. Il y
a production presque uniquement de forme simple brin. La balance entre les deux formes, double brin
et simple brin dépend donc de la concentration en ADN double brin du phage, qui par transcription
produit la protéine II responsable du nick à l'origine de la réplication en rolling circle et produit les SSB
protéines qui stabilisent le simple brin empêchant la synthèse du brin complémentaire.
Le DNA n'est pas encapsidé dans une structure préformée comme les autres bactériophages. Ils sont
simplement couverts des protéines de la capside lorsqu'il sort de la bactérie. Ceci implique qu'il n'y a pas
de limitation dans la taille de l'ADN simple brin. Il n'y a pas de lyse de la bactérie si bien qu'elle continue
à pousser (plus doucement) en produisant des phages qui atteigne le nombre de 10 12 par ml de culture.
Le phage λ
phage λ
cos
cos
C'est un virus à ADN double brin, linéaire de
50 kb avec à ses deux extrémités 12
nucléotides simple brin complémentaires
(extrémité cohésives ou cos). Il se fixe sur le
récepteur lamB qui permet l'absorption de
maltose par la bactérie, seul l'ADN rentre
dans la bactérie. A l'entrée dans la bactérie,
les extrémités cohésives s'hybrident et l'ADN
est ligé par une ligase d' E. coli. Là, il y a
deux possibilités soit un cycle lysogénique
avec intégration de l'ADN du phage dans le
génome soit un cycle lytique.. Il y a tout
d'abord réplication bidirectionnelle (forme
θ) ce qui augmente la quantité de DNA dans
la bactérie puis la réplication devient
unidirectionnelle (rolling circle) produisant
un ADN linéaire ou les phages se suivent.
L'ADN linéaire est empaqueté dans la tête
du phage et est coupé au niveau des
extrémités cos. Ensuite la queue du phage
est assemblée.
injection dans la bactérie
circularisation
cycle
lysogénique
att
litique
réplication
génome bactérien
cos
encapsidation
réplication 11
Ce mode de réplication est utilisé pour les ADN circulaire comme par exemple les phages. Mais il est
aussi utilisé dans les génomes eucaryotes comme par exemple pour amplifier l'ADN ribosomique de
l'ovocyte du xénope, les gènes codant pour l'ARN ribosomique sont organisés en répétitions. Une unité
est convertie en rolling circle, le brin néoformé est converti en double brin et les deux extrémités sont
jointes pour générer un grand cercle d'ADN amplifié.
8) Régulation de la réplication. Exemple de la régulation du nombre de copies de plasmides
Cette régulation est liée au phénomène d'incompatibilité. Certains plasmides sont incapables de
coexister dans une bactérie, on dit qu'ils appartiennent au même groupe de compatibilité. Le contrôle
du nombre de copies est due à la synthèse d'un répresseur qui mesure la concentration d'origine de
réplication.
Le système d'incompatibilité le mieux connu est celui du plasmide ColE1, qui est maintenu au niveau
de 20 copies par cellules chez E. Coli. La réplication démarre avec la transcription d'un ARN qui
démarre à 555 bp en amont de l'origine de réplication et la transcription continue à travers l'origine de
réplication. Une RNAse coupe le transcript à l'origine libérant une extrémité 3' libre hybridée à l'ADN.
Cette extrémité 3' est utilisée par l'ADN polymérase comme amorce.
Le système de régulation implique une hybridation ARN/ARN. L'ARN est une molécule de 108 bases
codée par le brin complémentaire de l'ARN servant d'amorce. L'hybridation de cet ARN avec l'ARN
amorce inhibe la coupure par la RNAse H vraissemblablement en changeant la structure secondaire de
l'ARN amorce. Comme le
petit ARN agit sur tout les
début de la réplication
plasmides, il régule la
quantité de plasmide présent
début de la transcription
dans la bactérie.
transcription d’un ARN régulateur
On considère ici que le grand
ARN est un régulateur positif
et le petit un régulateur
négatif comme dans le cas de
l'atténuation de la
transcription.
Réplication
RNAse H
ou
pas de réplication
De plus le système de
régulation implique une
protéine. L'hybridation des
deux ARN est influencée par
une protéine, la protéine
Rom. Cette protéine favorise
l'hybridation des deux ARN
et donc régule négativement
la réplication .
ARN
RNAse H
hybridation