universite rene descartes (paris 5)

PHARMACOGNOSIE
GUIDE DE TRAVAUX PRATIQUES
3ème ANNÉE
Enseignants 2013/2014
A. Blond, S. Boutefnouchet, X. Cachet,
K. Cottet, G. Genta-Jouve, R. Grougnet,
M. Kritsanida, F.-H. Porée
www.pharmacognosie-parisdescartes.fr
TABLE DES MATIERES
Page
Introduction
2
Examen microscopique d'une drogue végétale
2
Représentation conventionnelle des tissus
3
Réactions d'identification de métabolites secondaires
4
Contrôle d'une drogue végétale (Monographie)
6
Perte à la dessiccation et teneur en eau des drogues végétales
7
Drogues à hétérosides anthraquinoniques
8
Drogues à hétérosides flavoniques
10
Drogues à huile essentielle
12
Drogues à alcaloïdes
14
Hémisynthèse de la raubasine
17
Liste limitative des échantillons à reconnaître
19
1
NOTIONS ABORDÉES AU COURS DES TRAVAUX PRATIQUES DE PHARMACOGNOSIE
Description d'une drogue végétale (aspects macro- et microscopiques) : quinquina, bourdaine,
sophora et menthe poivrée.
Screening phytochimique.
Extraction sélective.
Quantification de substances actives : alcaloïdes du quinquina, hétérosides de la bourdaine,
flavonoïdes du sophora, terpènes de la menthe poivrée.
Hémisynthèse : la raubasine.
ANALYSE D'UNE DROGUE VÉGÉTALE
L'analyse d'une drogue végétale débute par l'essai botanique qui consiste à décrire la drogue végétale
sur le plan macroscopique (parties de plante utilisées, aspect, couleur, taille …) et sur le plan microscopique
(étude de la coupe transversale, étude de la poudre avec recherche d'éléments caractéristiques). Les résultats
des observations microscopiques seront retranscrits sous la forme de schémas.
De plus, dans le cadre des Travaux Pratiques de Pharmacognosie, un " screening phytochimique" sera
réalisé. Il repose sur la détection de certaines familles de métabolites secondaires : alcaloïdes, hétérosides
anthraquinoniques et flavonoïdes. Ces tests n'ont qu'une valeur indicative et une étude physico-chimique dite
de caractérisation sera ensuite mise en œuvre. Elle consiste à réaliser une chromatographie sur couche mince
(CCM) en présence de témoins appropriés et permet ainsi d'identifier une ou plusieurs substance(s) active(s)
(étude qualitative).
Pour certaines drogues (quinquina, bourdaine et sophora), un dosage de substances actives sera
entrepris.
Ces différents points sont repris dans la monographie générale "Drogue végétale" de la Pharmacopée
Européenne et sont appliqués dans le cadre du "contrôle d'une drogue végétale"
EXAMEN MICROSCOPIQUE D'UNE POUDRE VÉGÉTALE
Technique : "Montage" d'une poudre.
1) Sur une lame porte-objet déposer une goutte d'eau. Avec la pointe d'un scalpel ou d'une spatule,
prélever une petite quantité de poudre et la délayer dans l'eau, sur la lame, jusqu'à ce que la poudre soit
mouillée. Recouvrir d'une lamelle en appuyant légèrement avec le doigt.
2) Sur une deuxième lame faire un montage analogue en remplaçant l'eau par une solution
aqueuse d'hydroxyde de sodium ou de potassium à 5 p. cent m/V. Attendre quelques minutes, le
milieu "éclaircit" les préparations en détruisant totalement ou partiellement certains éléments végétaux
(amidon) inclus ou non dans les cellules de parenchymes. Les parois cellulaires sont plus nettes et plus faciles
à observer, en particulier les éléments sclérifiés, cellules ou fibres et les cuticules.
Les résultats de l'observation sont relevés sous la forme d'un dessin des éléments caractéristiques.
2
REPRÉSENTATION CONVENTIONNELLE DES TISSUS
Les coupes transversales sont colorées par la technique de la double coloration vert d'iode – carmin
aluné.
Principe
Sur une coupe aussi fine que possible, on fait agir successivement des solutions d'hypochlorite de
sodium et d'hydroxyde de sodium diluées. Les contenus cellulaires sont détruits, les parois cellulaires sont
respectées. En faisant agir simultanément ou successivement vert d'iode et carmin aluné, les parois
cellulosiques se colorent en rose, les parois lignifiées ou sclérifiées apparaissent en vert.
Observations et dessins des coupes
L'observation microscopique des coupes se fait à 2 grossissements : faible puis gros. Le faible
grossissement renseigne sur la structure générale de la préparation. Le fort grossissement permet d'observer
plus en détail des régions limitées de la préparation.
Les résultats de l'observation sont relevés sous la forme d'un schéma d'ensemble réalisé avec les
signes conventionnels donnés ci-dessous.
3
RÉACTIONS D'IDENTIFICATION DE MÉTABOLITES SECONDAIRES
Les essais préliminaires sur une drogue végétale représentent toujours la première étape de son
étude chimique et permettent d'orienter les recherches ultérieures.
Les techniques de détection utilisables pour un "screening" des substances actives doivent être
rapides, simples, reproductibles et sensibles afin de ne mettre en œuvre qu'une faible quantité de matière
végétale. Ces méthodes sont donc limitées à la détection de quelques groupes chimiques. Elles n'ont d'ailleurs
qu'une valeur indicative, et une confirmation ultérieure par des méthodes plus précises et plus sélectives est
indispensable.
Les différents métabolites recherchés au cours des travaux pratiques sont les flavonoïdes, les
hétérosides anthraquinoniques et les alcaloïdes.
Recherche des flavonoïdes
Les flavonoïdes donnent une coloration rouge caractéristique en présence d'hydrogène naissant en
milieu acide (réaction de la "cyanidine").
Manipulation
Introduire dans un tube à essai 100 mg environ de poudre végétale. Ajouter 5 mL d'éthanol absolu.
Chauffer à ébullition 2 min et filtrer dans un tube à essai. Ajouter 5 mL d'une solution d'alcool chlorhydrique
et un petit fragment de tournure de magnésium. Il se développe une coloration rouge groseille.
Attention : La réaction est exothermique. Ajouter très peu de magnésium. Diriger le tube à essai vers le mur.
Recherche des hétérosides anthraquinoniques
La réaction fondamentale de caractérisation des hétérosides anthraquinoniques est due à Bornträger.
Elle est basée sur la coloration intense que fournissent les quinones lorsqu'elles sont en milieu fortement
alcalin. Plus précisément, le traitement des 1,8-dihydroanthraquinones (génines libres oxydées) par une base
forte (KOH, NaOH) conduit aux phénates correspondants de couleur rouge par effet bathochrome.
Manipulation
Introduire dans un tube à essai 200 mg environ de poudre végétale. Ajoutez 5 mL d'acide sulfurique à
10 %. Chauffez à ébullition au bain-marie pendant 2 min. Filtrez rapidement dans un tube à essai. Refroidir.
Ajouter 5 mL d'acétate d'éthyle. Agitez pendant 2 min. Laisser décanter et récupérer la phase organique dans
un tube à essai. Ajouter 2 mL d'une solution d'ammoniaque à 10 % ; il se développe une coloration rouge
dans la phase aqueuse.
Recherche des alcaloïdes
Les alcaloïdes sont des bases organiques azotées, souvent hétérocycliques, principalement d'origine
végétale et de distribution restreinte. Ils présentent des réactions de coloration et de précipitation communes
et nombre d'entre eux possèdent, à faible dose, des propriétés pharmacodynamiques marquées.
4
La propriété générale des alcaloïdes la plus utilisée pour leur caractérisation est la formation de
précipités colorés en milieu aqueux acide avec certains sels de métaux lourds et divers complexes iodés.
En pratique, sont utilisées :
- la solution neutre de mercuritétraiodure de potassium (réactif de MAYER) qui donne avec les
alcaloïdes un précipité blanc,
- la solution iodo-iodurée (réactif de BOUCHARDAT) qui produit un précipité brun,
- la solution acide d'iodobismuthate de potassium ou de sodium (réactif de
DRAGENDORFF) qui provoque l'apparition d'un précipité rouge à orangé,
- la solution acide d'iodoplatinate de potassium qui provoque l'apparition d'un précipité gris
ardoisé à brun rouge.
Manipulation
Introduire dans un tube à essai 1 g environ de poudre végétale. Ajouter 10 mL d'acide sulfurique à 10
%. Agiter énergiquement pendant 2 min et filtrer. Partager le filtrat en trois tubes. . Dans le 1 er tube, ajouter
deux gouttes de réactif de MAYER, dans le 2ème, deux gouttes de réactif de DRAGENDORFF, dans le 3ème,
deux gouttes de réactif de iodoplatinate de potassium.
5
CONTRÔLE D'UNE DROGUE VÉGÉTALE
(d'après la monographie générale "Drogues végétales"de la Pharmacopée Européenne)
IDENTIFICATION
1 ) Examen botanique
Morphologie
Caractères organoleptiques
Examen microscopique de la coupe (si l'échantillon le permet) et de la poudre
2 ) Réactions colorées
Identification par des réactions générales de groupe et par des réactions spécifiques d'un ou plusieurs
principes actifs. Ces réactions sont effectuées après une extraction préalable.
3 ) Chromatographie sur couche mince
Identification de l'un ou de plusieurs principes actifs (alcaloïdes, hétérosides, quinones, flavonoïdes,
tanins) à partir de la solution à examiner.
ESSAI
Pureté de la drogue végétale (Recherche des éléments étrangers, recherche d’éventuelles
falsifications, de dégradations).
- perte à la dessiccation et teneur en eau
- teneur en cendres totales ou cendres insolubles dans HCl
- essais spécifiques, essais limites
- contamination microbiologique
DOSAGE
1 ) extraction
2 ) purification de la liqueur extractive
3 ) dosage proprement dit, par des méthodes gravimétriques, volumétriques, spectrophotométriques (U.V. et
visible), densitométriques (après chromatographie ou électrophorèse) ou encore chromatographiques (CPGFID, CLHP-UV...).
6
PERTE À LA DESSICCATION ET TENEUR EN EAU
DES DROGUES VÉGÉTALES (Ph. Eur.)
La teneur en eau des plantes fraîches varie de 5 à 95 p. cent suivant les organes. Cette teneur est
d'environ 5 à 15 p. cent pour les drogues végétales.
Le dosage de l'eau dans les drogues végétales permet de vérifier leur bonne conservation. Il faut en
outre tenir compte de la teneur en eau dans les dosages de principes actifs (rapportée à la matière sèche).
On utilise couramment deux méthodes :
- gravimétrique : perte à la dessiccation (2.2.32), limitée aux drogues ne contenant pas de
principes volatils ;
- volumétrique : détermination de l’eau par entraînement azéotropique au toluène ( 2.2.13),
utilisable pour les drogues à huiles essentielles.
Perte a la dessiccation 2.2.32 : Dessiccation à l’étuve
Chauffées pendant un temps suffisant à 100-105°C, les drogues convenablement divisées subissent une perte
de masse qui correspond sensiblement à la quantité d'eau qu'elles contenaient.
Cette méthode n'est, bien entendu, pas applicable aux drogues renfermant des principes volatils.
Technique
Introduire dans un cristallisoir préalablement séché à l'étuve (voir salle des balances), refroidi dans un
dessiccateur et taré, 2,000 g (ou 1,000 g suivant monographie) environ de drogue pulvérisée exactement
pesée. Porter à l'étuve à 100-105°C pendant une nuit. Laisser refroidir dans un dessiccateur et peser. Répéter
l'opération jusqu'à l'obtention d'une masse constante. Calculer alors la teneur en eau pour 100 g de drogue.
Méthode volumétrique 2.2.13 : détermination de l’eau par entraînement
L'eau contenue dans une prise d'essai connue de drogue est entraînée par la vapeur d'un Eluant non
miscible (toluène) avec lequel elle forme un mélange azéotropique. Après condensation, le mélange se sépare
et le volume d'eau recueillie est mesuré. Le dosage se fait dans un appareil normalisé.
Cette méthode est utilisée pour les drogues à huiles essentielles.
7
DROGUES À HÉTÉROSIDES ANTHRAQUINONIQUES
Drogue étudiée :
- Bourdaine (Rhamnus frangula L., Rhamnaceae), écorces de tiges
Présence de dérivés anthracéniques polyhydroxylés qui sont les substances actives : anthraquinones
libres
(émodol,
chrysophanol…),
hétérosides
anthraquinoniques
(franguloside,
glucofranguloside
et
bisglucofranguloside de la bourdaine), hétérosides d'anthranols et d'anthrones (frangularoside de la
bourdaine, casanthranol du cascara…) hétérosides de génines dianthroniques (sennosides du séné).
La génine de nature anthracénique peut exister à deux états d'oxydation différents : anthrone (forme
"réduite") en équilibre tautomère avec la forme anthranol et anthraquinone (forme "oxydée").
OH OH OH
R2
OH O
R1
OH
OH
R2
R1
O
OH
R2
R1
O
Anthranol
Anthrone
Anthraquinone
R1 : CH3, CH2OH, CHO, COOH, COOCH3
R2 : H OH, OCH3
Examen botanique
1 ) Caractères macroscopiques
Fragments d'écorce cintrés ou plats, de faible épaisseur ; surface externe brun grisâtre portant de
nombreuses lenticelles blanchâtres allongées transversalement ; surface interne rouge orangé à brun rouge ;
cassure fibreuse.
2 ) Caractères microscopiques de la coupe transversale
Suber épais contenant un pigment rouge brun et traversé par des lenticelles ; phelloderme
collenchymateux ; liber en forme de cônes larges avec des rayons intra-libériens uni à trisériés ; présence de
fibres péricycliques et libériennes sclérifiées ; mâcles et prismes d'oxalate de calcium dans les divers
parenchymes.
3 ) Caractères microscopiques de la poudre
Paquets de fibres très abondants accompagnés de tubes oxalifères avec prismes d'oxalate de calcium
très réguliers (aspect en pavage), fragments de parenchyme cortical renfermant des mâcles d'oxalate de
calcium, fragments de suber avec cellules imprégnées d'un tanoïde brun-rouge.
Chromatographie sur couche mince
1 ) Solution à examiner
Placer 0,5 g de poudre dans un tube à essai. Ajouter 5 mL d'alcool à 70 p. cent V/V. Chauffer jusqu'à
ébullition au bain-marie. Refroidir. Filtrer sur papier.
8
2 ) Chromatographie
- Eluant Bourdaine : acétate d'éthyle - méthanol - eau : 50 - 8,5 - 6,5 (V/V)
- Dépôts :
- solution extractive : 10 l
- solution témoin Bourdaine : (indicateur de Rf) barbaloïne à 0,2 % dans de l'alcool
à 70 p. cent V/V : dépôt : 10 l
3 ) Détection
Après développement du chromatogramme, la plaque séchée sous hotte ventilée est examinée en
lumière ultra-violette à 254 puis 366 nm et révélée par pulvérisation sous hotte ventilée d'une solution de
potasse méthanolique à 10 % m/V.
Dosage des hétérosides de la Bourdaine
Principe : Dosage colorimétrique des dérivés hydroxyanthracéniques totaux
1 ) Extraction des hétérosides
Introduire dans un ballon rodé de 100 mL, environ 0,250 g exactement pesés de poudre de
bourdaine. Ajouter 45 mL de méthanol à 70 % (V/V). Surmonter le ballon d'un réfrigérant à reflux. Chauffer
15 minutes au bain-marie bouillant. Refroidir et filtrer sur une fiole jaugée de 50 mL. Ajuster au volume.
Prélever 5,0 mL de solution méthanolique, les introduire dans un ballon à col rodé de 250 mL et ajouter 100
mL d'eau distillée.
2 ) Hydrolyse acide des hétérosides (génines libres)
A la solution préparée ci-dessus ajouter 5 mL d'acide chlorhydrique concentré. Mélanger. Placer le
réfrigérant et chauffer 40 minutes à reflux.
3 ) Extraction des génines par un éluant organique
Après refroidissement, transférer quantitativement dans une ampoule à décantation. Extraire par 20,
puis 15, 10, 10 mL... de dichlorométhane jusqu'à extraction totale. Sécher les solutions organiques réunies
sur sulfate de sodium anhydre. Filtrer sur une fiole jaugée de 100 mL (si le volume de dichlorométhane utilisé
est supérieur à 100 mL, concentrer la solution à l'évaporateur rotatif). La solution organique est ajustée à
100,0 mL.
4 ) Dosage colorimétrique des hydroxy-anthraquinones
Transférer 20,0 mL de solution organique dans un ballon d'évaporateur rotatif. Evaporer à sec.
Dissoudre le résidu dans 10,0 mL d'une solution méthanolique d'acétate de magnésium à 0,5 % m/V.
Mesurer l'absorbance à 515 nm en utilisant du méthanol comme Eluant de compensation. Calculer la
teneur en dérivés hydroxy-anthracéniques totaux exprimés en glucofranguline A. L’absorbance spécifique
(A1%1cm) de la glucofranguline A à 515 nm est égale à 204.
Selon la méthode de dosage utilisée aux Travaux Pratiques, les écorces de bourdaine renferment au minimum
7,0 p. cent de dérivés hydroxy-anthracéniques totaux, exprimés en glucofranguline A, calculé par rapport à la
drogue desséchée.
9
HÉTÉROSIDES FLAVONIQUES
Drogue étudiée :
- Sophora (Sophora japonica L., Fabaceae), boutons floraux
Le sophora constitue l'une des sources industrielles d'extraction du rutoside (3-O--rutinose de
quercétol), un hétéroside de flavonol. Les boutons floraux peuvent contenir jusqu'à 20 % de rutoside.
Les hétérosides flavoniques résultent de la combinaison d'un ou plusieurs oses avec une génine
polyphénolique dérivant de la 2-phényl-chromone.
OH
OH
O
HO
2-Phénylchromone
OH
O
O
O
OO
O
OH O
HO
HO
OH
OH
Rutoside
3-O--rutinose de quercétol
OH
Examen botanique
1 ) Caractères macroscopiques
Bouton de fleur, ovoïde à ellipsoïde ; calice présentant des stries longitudinales à la base ; pétales
blanc jaunâtre non épanouies dépassant du calice ; pédicelles courts et minces.
2 ) Caractères microscopiques de la poudre
poudre vert-jaunâtre ; grains de pollen arrondis ou triangulaires à trois pores ; fragments de pétales
et de sépales présentant des stomates anomocytiques à 4-8 cellules annexes et portant des poils tecteurs.
Chromatographie sur couche mince
1 ) Solution à examiner
Placer 0,5 g de poudre dans un tube à essai. Ajouter 5 mL d'alcool à 70 p. cent V/V ou méthanol.
Chauffer jusqu'à ébullition au bain-marie. Refroidir. Filtrer.
2 ) Chromatographie
- Eluant Sophora : acétate d'éthyle - acide acétique - eau : 8 -1- 1 (V/V)
- Dépots :
- solution témoin de rutoside à 0,1 % (m/V) : 15 l
- solution témoin de quercétol à 0,1 % (m/V) : 15 l
- Solution à examiner
3 ) Détection
Après séchage de la plaque sous hotte ventilée, examiner en lumière visible, puis sous UV à 254 nm
et 366 nm avant et après pulvérisation d’une solution d’AlCl 3 à 2 % (m/V) dans l’éthanol.
10
Dosage des flavonoïdes du Sophora
Principe : Dosage colorimétrique des flavonoïdes totaux
1 ) Préparation de la solution mère
Introduire dans un ballon rodé de 250 mL environ 1,00 g exactement pesé de poudre de sophora.
Verser 90 mL de méthanol, placer le réfrigérant et chauffer à reflux pendant 50 min. Laisser refroidir et filtrer
la solution dans une fiole jaugée de 100 mL. Rincer le ballon d'extraction avec du méthanol et compléter à
100 mL. Prélever 10,0 mL de cette solution et compléter à 100 mL avec de l'eau. Agiter énergiquement. Cette
solution constitue la solution mère.
2 ) Dosage colorimétrique des flavonoïdes totaux
-Blanc (solution de compensation) : Prélever 10,0 mL de la solution mère et compléter à 20,0 mL
avec du méthanol.
-Solution à examiner : Prélever 10,0 mL de la solution mère et compléter à 20,0 mL avec une solution
méthanolique de chlorure d'aluminium à 20 g/L. Après 15 min, mesurer l'absorbance de cette solution à 425
nm par rapport à la solution de compensation.
Calculer la teneur en flavonoïdes totaux exprimés en rutoside. L’absorbance spécifique (A 1%1cm) du
rutoside à 425 nm est égale à 370.
Selon la méthode de dosage utilisée aux Travaux Pratiques, les boutons floraux du sophora renferment au
minimum 16 p. cent de flavonoïdes totaux exprimés en rutoside, calculé par rapport à la drogue desséchée.
11
DROGUES A HUILE ESSENTIELLE
Drogue étudiée :
- Menthe poivrée (Mentha X piperita L., Lamiaceae), feuille
Les huiles essentielles (HE) sont des mélanges, parfois complexes, de composés volatils et
odorants (odeur aromatique). Elles sont entrainables par la vapeur d'eau, mais sont non miscibles à l'eau.
Selon leur composition chimique, deux groupes sont distingués : HE à terpènes et HE à composés
aromatiques.
Examen botanique
1 ) Caractères macroscopiques
feuille entière, brisée ou coupée, mince, cassante et fréquemment froissée ; limbe ovale ou lancéolé,
acuminé au sommet, bordé de dents aiguës, de base asymétrique ; nervation pennée, proéminente sur la
face inférieure, face inférieure légèrement pubescente ; poils sécréteurs visibles à la loupe (× 6) en points
jaunâtres et brillants.
2 ) Caractères microscopiques de la coupe transversale
Feuille banale ; nervure saillante sur la face inférieure ; arc libéro-ligneux.
3 ) Caractères microscopiques de la poudre
fragments d’épidermes portant des poils tecteurs et sécréteurs ; poils sécréteurs sont de 2 sortes :
a) à pied unicellulaire et petite tête unicellulaire et b) à pied unicellulaire et tête renflée, ovale composée de 8
cellules rayonnantes ; poils tecteurs généralement sectionnés, effilés, unisériés, de 3-8 cellules, à cuticule
striée ; poils tecteurs coniques, courts, unicellulaires ou bicellulaires ; présence de stomates diacytiques ;
possibilité de cristaux jaunâtres de menthol sous la cuticule des cellules sécrétrices.
Chromatographie sur couche mince
1 ) Solution à examiner
Voir Partie Dosage pour l'obtention de la solution à examiner.
2 ) Chromatographie
- Support : gel de silice F254
- Eluant : toluène - acétate d'éthyle : 47,5- -2,5 (v/v)
- Dépots :
- solution témoin menthol : 5 l
- solution témoin menthone : 5 l
- solution témoin acétate de menthyle : 5 l
- solution témoin cinéole : 5 l
- solution témoin HE de menthe poivrée : 5 l
- solution à examiner
3 ) Détection
Après séchage de la plaque sous hotte ventilée, examiner en lumière visible, puis sous UV à 254 nm
et 366 nm et la plaque CCM est révélée par pulvérisation d’une solution de vanilline sulfurique puis chauffée à
150°C.
12
Dosage
Principe : Hydrodistillation ou entrainement à la vapeur d'eau (Ph. Eur.)
Mode opératoire
Introduire (avec l'aide d'un entonnoir à poudre) dans un ballon rodé de 1 L environ 20,0 g
exactement pesés de feuilles séchées de menthe poivrée, préalablement contusées. Verser 300 mL d'eau et
adapter l'appareil normalisé sur le col du ballon. Par la tubulure latérale, introduire la quantité d'eau
nécessaire pour remplir le tube gradué et la tubulure intermédiaire. Chauffer modérément et maintenir la
distillation pendant 2 h. Lire le volume d'huile essentielle recueille dans la tubulure graduée.
Récupérer l'échantillon après dilution dans l'acétate d'éthyle (voir avec l'enseignant).
Appareil normalisé (Ph. Eur.)
Selon la méthode de dosage utilisée aux Travaux Pratiques, la feuille de menthe poivrée contient au
minimum 12 mL/kg d’huile essentielle dans la drogue entière et au minimum 9 mL/kg d’huile essentielle dans
la drogue coupée.
L'étude qualitative par chromatographie sur couche mince (CCM) est complétée par une analyse par
chromatographie en phase gazeuse (CPG) (renvoi aux Travaux Pratiques de Chimie Analytique).
O
OH
(-) menthol
OCOCH3
(-) acétate de
menthyle
O
(-) menthone
O
(+) isomenthone
O
1,8-cinéole
(+) pulégone
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DROGUES À ALCALOIDES
Drogue étudiée
Quinquina (Cinchona pubescens Vahl., Rubiaceae), écorce
Les alcaloïdes sont des bases organiques azotées, souvent hétérocycliques, principalement d'origine
végétale et de distribution restreinte. Ils présentent des réactions de coloration et de précipitation communes
et nombre d'entre eux possèdent, à faible dose, des propriétés pharmacologiques marquées.
R3
N
R2
HX
R1
OH
R3
H
R
N 1
R2
Examen botanique
1 ) Caractères macroscopiques
Ecorces de tiges ou de racines épaisses de 2 à 6 mm, plates ou roulées ; surface externe, grisbrunâtre, terne, rugueuse et fissurée ; surface interne brun-rougeâtre, cassure courte dans les couches
extérieures et fibreuse dans les couches inférieures.
2 ) Caractères microscopiques de la coupe transversale
Important suber brun ; phelloderme réduit ; parenchyme cortical comprenant des cellules sécrétrices
(à gommes-résines et à tanins) ; cônes libériens étroits, comprenant des fibres isolées ou très rarement
groupées, à lumen étroit et à section polygonale ; rayons libériens étroits.
3 ) Caractères microscopiques de la poudre
Fibres libériennes longues et épaisses, jaunâtres, fusiformes, à lumen présentant des canalicules très
apparents, élargis à la base (aspect en "aiguillon de rosier") ; débris de parenchyme contenant des cellules à
sable.
Chromatographie sur couche mince
1 ) Solution à examiner
Dans un tube à essai contenant 0,10 g (quinquina) ou 0,25 g (ipéca) de drogue pulvérisée, ajouter
sous hotte 0,1 mL d'ammoniaque concentrée et 5 mL de CH2Cl2. Agitez énergiquement à plusieurs reprises
pendant 30 min et filtrez. Evaporez le filtrat au bain-marie à sec et reprenez le résidu dans 1 mL d’éthanol R.
Effectuez un essai à la touche sur 5 ou 10 l.
2 ) Chromatographie
- Support : gel de silice F 254
- Eluant : diéthylamine - acétate d'éthyle - toluène : 10 - 20 - 70 (V/V)
- Dépôts :
solution témoin Quinquina : solution de quinine / quinidine / cinchonine / cinchonidine
aux concentrations respectives de 0,35 / 0,05 / 0,2 et 0,2% (m/V) dans l'éthanol : 10 l, en bande
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solution témoin Ipéca : solution de chlorhydrate d'émétine et de céphéline dans du
méthanol.
solution extractive : volume à déposer en fonction de l'intensité de "l'essai à la
touche".
3 ) Détection
Après développement du chromatogramme, sécher la plaque sous hotte ventilée, pulvériser de l'acide
formique anhydre et laisser sécher à l'air, puis l'examiner en lumière ultraviolette à 365 nm. Dans un
deuxième temps, révéler la plaque par le réactif à l'iodoplatinate.
Dosage des alcaloïdes du Quinquina
Les principes actifs du quinquina sont des alcaloïdes à noyau quinoléique relié par un groupement
carbinol à un système quinuclidique porteur d'une chaîne vinyle: quinine et quinidine, cinchonine et
cinchonidine ; deux à deux diastéréoisomères.
HO
H
R
N
N
HO
R : OCH3, Quinine
R : H, Cinchonidine
H
R
N
R : OCH3, Quinidine
R : H, Cinchonine
N
Principe : Dosage des alcaloïdes type quinine et type cinchonine par spectrophotométrie à deux longueurs
d’onde (316 et 348 nm).
1 ) Extraction
Peser avec précision une prise d'essai m voisine de 1,000 g d’écorce de quinquina préalablement
pulvérisée. Transférer quantitativement dans un ballon à col rodé de 250 mL. Humecter avec une quantité
suffisante d’une solution d’hydroxyde de sodium à 10 % (m/V) en triturant doucement à l’aide d’un agitateur.
Ajouter environ 70 mL de CH2Cl2. Placer le réfrigérant et chauffer au bain-marie pendant 4 h. Après
refroidissement, filtrer en recueillant la solution extractive dans une fiole jaugée de 100 mL. Compléter au
trait de jauge avec du CH2Cl2.
2 ) Purification
Mesurer exactement 50,0 mL de cette solution à l’aide d’une fiole jaugée et les transférer de manière
quantitative dans une ampoule à décanter. Extraire par au moins 5 fractions successives de 15 mL de solution
d’acide chlorhydrique 0,1 M. Recueillir les phases aqueuses dans une fiole jaugée de 200 mL. Vérifier, à l’aide
du réactif au mercuritétraiodure de potassium (réactif de Mayer), que 2 mL de la dernière solution extractive
ne contiennent plus d’alcaloïdes.
3 ) Dosage
Compléter les solutions aqueuses acides réunies à 200,0 mL avec le même Eluant. Transférer 10,0 mL
de cette solution dans une fiole jaugée et ajuster à 50,0 mL avec la solution d’HCl 0,1 M. Mesurer
l’absorbance de cette solution à 316 nm et 348 nm (notées respectivement A316 et A348).
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4 ) Calculs
A une longueur d’onde donnée, l’absorbance d’une solution de plusieurs substances est égale à la
somme des absorbances partielles produites par ses différents constituants. Connaissant, à deux longueurs
d’onde différentes ( = 316 nm et ’ = 348 nm), les absorbances mesurées A316 et A348 de la solution à doser
et les coefficients d’absorbance spécifique A 1%1cm de la quinine (A316q, A348q) et de la cinchonine (A316c,
A348c), et donc des alcaloïdes de type quinine et de type cinchonine, on déduit que :
A316 = (A316q x Q) + (A316c x C) et A348 = (A348q x Q) + (A348c x C)
où Q et C désignent les concentrations respectives d’alcaloïdes du type quinine et du type cinchonine
exprimées en g/100 mL dans la solution à doser avec A316q = 99, A316c = 148, A348q = 124, A348c = 14.
Calculer la teneur en alcaloïdes totaux dans la drogue végétale desséchée et déduire la teneur en
alcaloïdes du type quinine et du type cinchonine.
Selon la méthode de dosage utilisée aux Travaux Pratiques, la drogue doit contenir au minimum 6,5 pour cent
d'alcaloïdes totaux dont 30 à 60 pour cent sont constitués par des alcaloïdes du type quinine (drogue
desséchée).
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Extraction des alcaloides totaux de la pervenche tropicale
et Hémisynthèse de la Raubasine
L'extraction est ici effectuée à partir des racines de la pervenche tropicale : Catharanthus roseus (L.)
G. Don - Apocynaceae. Les racines contiennent des alcaloïdes indolomonoterpéniques monomères. Les deux
principaux
sont
la serpentine et la raubasine (= ajmalicine). Ils appartiennent au groupe de
l'hétéroyohimbane.
N
H
[H-]
O
N
H
H3CO2C
N
H
N H
H
H
H3CO2C
Serpentine
O
Raubasine
1 ) Extraction des alcaloïdes totaux
Les alcaloïdes à extraire étant composés de bases tertiaires et quaternaires, l'éluant d'extraction choisi
dans ce cas est un mélange à parties égales de dichlorométhane et de méthanol.
Technique
Dans une fiole conique de 250 mL, faire macérer 20 g de poudre de racines de Catharanthus roseus
dans 100 mL d'un mélange à parties égales (v/v) de dichlorométhane-méthanol. Boucher avec un bouchon de
liège, agiter et abandonner jusqu'au lendemain.
- Décanter la solution extractive en la filtrant sur un filtre de papier plissé surmontant un ballon
d'évaporateur rotatif de 250 mL préalablement taré. Evaporer à sec.
- Extraire une seconde fois le marc par 100 mL de mélange dichlorométhane-méthanol à parties
égales (v/v), pendant 1 h à température ambiante. Décanter et filtrer de nouveau sur le même ballon
d'évaporateur rotatif. Conserver 1 mL du filtrat dans un tube à hémolyse étiqueté A pour effectuer
ultérieurement une CCM. Evaporer à sec. Le résidu sec est pesé après refroidissement. Calculer le rendement
en extrait brut.
Sur le filtrat A effectuer un "essai à la touche" pour vérifier la présence d'alcaloïdes dans la solution
extractive.
2 ) Hémisynthèse de la raubasine
La raubasine est aisément obtenue à partir de la serpentine par réduction par le borohydrure de
sodium ou de potassium dans le méthanol. Cette réaction de réduction est effectuée sur l'ensemble des
alcaloïdes totaux obtenus précédemment.
Technique
Verser 10 mL de méthanol dans le ballon contenant le résidu sec d'alcaloïdes totaux.
Fixer le ballon avec une pince en bois et placer le dans un "bain de glace" (mélange glace et chlorure
de sodium) placé sous une hotte.
Ajouter 500 mg de borohydrure de sodium (NaBH 4) par petites fractions en agitant doucement.
Observer le dégagement gazeux. Laisser la réaction jusqu'au lendemain.
Diluer le milieu réactionnel à l'eau jusqu'à obtention d'un volume d'environ 80 mL. Vérifier que le pH
est alcalin (bandelette papier pH).
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Extraire les alcaloïdes par des fractions de 2 x 20 mL puis 6 x 10 mL de dichlorométhane (total de 100
mL).
Réunir les phases organiques, les sécher sur sulfate de sodium anhydre puis les filtrer sur un ballon
d'évaporateur rotatif de 250 mL préalablement taré. Conserver 1 mL de cette solution extractive dans un tube
à hémolyse étiqueté B. Evaporer à sec la solution extractive, sous pression réduite.
Peser après refroidissement et calculer le rendement en alcaloïdes réduits.
3 ) Isolement et purification de la raubasine
Les alcaloïdes totaux réduits sont purifiés par chromatographie sur colonne de gel de silice. Il faut
séparer la raubasine de la tetrahydroalstonine moins polaire. La raubasine base ainsi isolée sera ensuite
cristallisée dans le méthanol.
Technique : Montage de la colonne de gel de silice :
Les conditions de montage de la colonne et d'élution des alcaloïdes seront précisées au cours
des travaux pratiques (démonstration).
- colonne de verre de diamètre 1,5 cm,
- support : silice 70 -230 mesh (masse : 30 à 40 fois la masse d'alcaloïdes réduits obtenus (soit 8 g
environ de silice),
- Eluant colonne : dichlorométhane-méthanol 100-1 v/v dans une fiole conique bouchée.
Recueillir les fractions dans des tubes à essais selon les recommandations. Suivre l'élution de la
raubasine par chromatographie couche mince en comparaison avec un témoin. Poursuivre jusqu'à élution
totale de la raubasine (environ 20 tubes).
CCM : support : gel de silice F 254.
Eluant de migration : dichlorométhane-méthanol : 95-5 (v/v)
Témoin : raubasine solution à 0,1 % dans le méthanol : 5L.
Dépôts : chaque tube : q.s. (voir sous U.V.)
Révélateur : réactif de Dragendorff
Réunir les tubes contenant de la raubasine pure dans un ballon d'évaporateur rotatif de 250 mL
préalablement taré. Evaporer à sec. Peser après refroidissement. Calculer le rendement.
4 ) Cristallisation de la raubasine : (voir avec l'enseignant)
Reprendre le résidu par le minimum de méthanol chaud et transférer quantitativement, à l'aide d'une
pipette Pasteur munie d'une tétine de caoutchouc, dans un tube à cristalliser. Concentrer la solution au bainmarie en régularisant l'ébullition à l'aide d'un agitateur. Abandonner une nuit au réfrigérateur.
Recueillir les cristaux obtenus sur une rondelle de papier filtre déposée sur un entonnoir de HIRSCH. Si
nécessaire, rincer avec du méthanol froid. Laisser sécher les cristaux et calculer le rendement.
Effectuer une CCM récapitulative (éluant de migration : dichlorométhane-méthanol : 95-5 v/v)
- Dépôts : solutions extractives A, B, et C (un cristal dans 0,2 mL de méthanol),
- Témoin : raubasine, solution à 0,1 % dans le méthanol : 5l.
- Révélation : examen en UV et pulvérisation du réactif de Dragendorff.
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LISTE LIMITATIVE DES ECHANTILLONS A RECONNAITRE
ALOES DU CAP, Aloe ferox Miller - Liliaceae.
Suc concentré provenant des feuilles - Ph. Eur.- Masses brun foncé à reflets verdâtres, à cassure brillante Odeur forte - Saveur très amère et désagréable (hétérosides anthracéniques).
AUBEPINE, Crataegus laevigata. (Poiret) D.C. (C. oxyacantha L.), C. monogyna (Lindm.) Jacq. - Rosaceae.
Sommités fleuries - Ph. Eur. Fleurs blanchâtres en petits corymbes accompagnées de fragments de feuilles et
de tiges.
BADIANE DE CHINE, Illicium verum Hook. - Magnoliaceae. (Anis étoilé).
Fruits - Ph. Eur. - Fruit formé de 8 à 12 follicules insérés en étoile sur un pédoncule central, la columelle Couleur brun-rougeâtre - Aspect dur et rugueux. Odeur agréable anisée - Saveur sucrée. (huile essentielle à
anéthole).
BELLADONE, Atropa belladona L. - Solanaceae
Feuilles - Ph. Eur. - Feuilles accompagnées ou non des sommités florifères et fructifères (baie noire).
BIGARADIER, Citrus aurantium L. ssp. amara Engl.- Rutaceae. (Oranger amer). (liste plantes méd. Ph. Fr.
Xè éd).
Feuilles - Feuilles assez grandes, à limbe ovale, entier, coriace, à pétiole ailé.
BOLDO, Peumus boldus Molina. - Monimiaceae. Feuilles - Ph. Eur.
Feuilles ovales, vert grisâtre, épaisses, rigides, cassantes – Surface rugueuse - Odeur camphrée. Saveur
aromatique (alcaloïdes : boldine...; huile essentielle).
BOURDAINE, Rhamnus frangula L. – Rhamnaceae.
Ecorces - Ph. Eur. (cf p 9).
CAMOMILLE ROMAINE, Chamaemelum nobile L. All.- Asteraceae.
Capitules floraux - Ph. Eur. - Capitules floraux hémisphériques, formés de ligules blanc jaunâtre, ternes et
lancéolées - Diamètre de 1 à 2 cm – Odeur agréable - Saveur amère et aromatique.
CASCARA, Rhamnus purshianus D.C. (Frangula purshiana (D.C.) A. Gray ex J.C. Cooper )- Rhamnaceae.
Ecorces - Ph. Eur. (cf p 9).
COLCHIQUE, Colchicum autumnale L. - Liliaceae. (liste plantes méd. Ph. Fr. Xè éd.)
Graines - Petites graines brun foncé à surface ponctuée, dures et cornées. Diamètre 2 mm. (alcaloïdes :
colchicine...).
DATURA (STRAMOINE), Datura stramonium L. - Solanaceae.
Feuilles - Ph. Eur. Feuilles et sommités florifères, parfois fruits. Feuilles entières, profondément découpées en
5 à 7 lobes, de 8 à 25 cm de long sur 7 à 15 de large. Couleur vert sombre. Odeur vireuse. Saveur amère.
Sommités florifères à tiges plus ou moins ramifiées donnant à maturité une capsule épineuse.
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DIGITALE POURPREE, Digitalis purpurea L. - Scrofulariaceae.
Feuilles – Ph. Eur. - Grandes feuilles ovales oblongues à pétiole ailé, de 10 à 30 cm de long sur 4 à 15 de
large. Limbe irrégulièrement crénelé sur les bords - Face inférieure pubescente, blanchâtre, à nervures
proéminentes (aspect gaufré). (hétérosides cardiotoniques).
ERGOT DE SEIGLE , Claviceps purpurea (Fries) Tul. - Hypocreaceae. (liste plantes méd. Ph. Fr. Xè éd.)
Sclérote - Sclérote subcylindrique arqué, obtus ouaminci à ses extrémités de 1 à 4 cm de long. Surface noir
violacé. Cassure nette et blanchâtre à l'intérieur. Odeur désagréable. (alcaloïdes : ergotamine...).
EUCALYPTUS, Eucalyptus globulus Labill. - Myrtaceae.
Feuilles - Ph. Eur. - Longues feuilles falciformes de 25 cm de long sur 2 à 5 de large, à pétiole court, à limbe
coriace et étroit. Couleur vert grisâtre sur les deux faces. Odeur forte et balsamique. (huile essentielle :
eucalyptol).
GINSENG, Panax ginseng C.A. Meyer - Araliaceae.
Racines - Ph. Eur. - Racines pivotantes fusiformes ou cylindriques plus ou moins ramifiées, de faible densité 10 à 25 cm de long - couleur blanc jaunâtre. Saveur âcre et amère. (saponosides : ginsénosides).
GOMME ADRAGANTE, Astragalus gummifer Labill. - Fabaceae.
Exsudat naturel ou provoqué par incision, du tronc ou des branches - Ph. Eur. - Rubans minces et aplatis à
surface striée - Aspect translucide et corné. Couleur blanc à jaunâtre - Inodore, pratiquement insipide.
GOMME ARABIQUE, Acacia senegal (L.) Willd. - Mimosaceae.
Exsudat naturel ou
provoqué par incision, du tronc ou des branches - Ph. Eur. - Masses arrondies,
transparentes, jaune pâle à ambre. Cassure nette. Insipide, inodore.
GOMME DE STERCULIA, Sterculia tomentosa Guill. et Perr., Sterculia urens Roxb. - Sterculiaceae.
Exsudat naturel ou provoqué par incision, du tronc et des branches - Ph. fr. Xè éd. - Morceaux irréguliers,
translucides, jaunâtre à rose. Odeur acétique, saveur lègèrement acide.
HAMAMELIS, Hamamelis virginiana L. - Hamamelidaceae.
Feuilles - Ph. Eur. - Grandes feuilles de 4 à 15 cm de long sur 3 à 10 de large, rougeâtres à limbe ovale,
asymétriques à la base et sinuées sur les bords - Pétiole court - Saveur astringente. (tanins).
IPECACUANHA, Cephaelis acuminata Karsten , Cephaelis ipecacuanha (Brot.) A. Rich.- Rubiaceae.
Racines ou rhizomes et racines - Ph. Eur. (cf p 17)
JABORANDI, Pilocarpus jaborandi Holmes - Rutaceae. (liste plantes méd. Ph. Fr.Xè éd.).
Folioles - Folioles ovales de 2 à 5 cm de long sur 1 à 3 de large nettement échancrées au sommet - Couleur
vert brunâtre. (alcaloïdes : pilocarpine...).
KOLA, Cola acuminata (P. Beauv.) Schott et Endl. - Cola nitida (Vent. ) Schott et Endl. - Sterculiaceae.
Graines privées de téguments - Ph. Eur. - Cotylédons tétraédriques, brun - acajou, lisses, durs - 3 à 5 cm de
long sur 2 à 3 de large. (alcaloïdes : caféine).
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MENTHE POIVREE, Mentha X piperita L. - Lamiaceae
Feuille - Ph. Eur. - Feuilles entières ou coupée. Odeur aromatique marquée liée à la présence d'une huile
essentielle.
NOIX VOMIQUE, Strychnos nux vomica L. - Loganiaceae - Ph. fr. Xe éd.
Graines discoïdes très dures, à bords renflés, tégument externe grisâtre et satiné - 2 cm de diamètre - Aspect
dit "en bouton". Très toxique (alcaloïdes indoliques : strychnine...).
PAVOT, Papaver somniferum L. - Papaveraceae. (liste plantes méd. Ph. Fr.Xè éd.)
Capsules - Capsules ovoïdes ou sphériques, divisées en loges incomplètes à l'intérieur. Couleur gris jaunâtre à
jaune paille. (alcaloïdes : morphine, codéine...).
QUINQUINA, Cinchona ssp. - Rubiaceae
Ecorce - Ph. Eur. (cf p 17)
REGLISSE, Glycyrrhiza glabra L. - Fabaceae.
Racines et stolons - Ph. Eur. - "Batons" de 10 à 15 cm de long sur 0,5 à 2 cm de diamètre, à écorce grisjaunâtre à brun, striés longitudinalement - Cassure jaune et fibreuse - Odeur agréable - Saveur sucrée.
(saponosides : glycyrrhizine).
RICIN, Ricinus communis L. - Euphorbiaceae. (liste plantes méd. Ph.Fr. Xè éd.).
Graines - Graines ovoïdes à tégument marbré et brillant - couleur variable - 10 à 12 mm de long. (Huile;
Tourteaux toxiques : protéines).
SCILLE, Drimia maritima (L.) Stearn - Liliaceae. . (liste plantes méd. Ph. Fr. Xè éd.).
Ecailles de bulbe dites squames - Squames coupées en lanières aplaties et recourbées. Aspect translucide Couleur jaune pâle ou rosée. (hétérosides cardiotoniques).
SENE, Cassia senna L. (Séné de Khartoum ou d'Alexandrie) - Cassia angustifolia Vahl (Séné de l'Inde ou de
Tinnevelly) Fabaceae
Folioles et gousses - Ph. Eur. (cf p 17)
TILLEUL, Tilia cordata Miller. - Tilia platyphyllos Scop. - Tilia x vulgaris Heyne - Tiliaceae.
Inflorescences munies de leurs bractées - Ph. Eur. - Aspect et odeur caractéristiques.
VALERIANE, Valeriana officinalis L. - Valerianaceae.
Rhizomes, racines et stolons - Ph. Eur. - Parties souterraines beige à gris-brun - Le rhizome porte de
nombreuses racines plus ou moins fasciculées - Forte odeur désagréable. (iridoïdes : valépotriates...).
VERVEINE ODORANTE, Aloysia triphylla (L'Hér.) Britt. (Lippia citriodora H.B.K.) - Verbenaceae.
Feuilles - Ph. fr. Xè éd. - Feuilles à bord enroulé, à limbe mince, à nervure centrale saillante, à nervures
secondaires parallèles - Couleur vert pâle – Odeur aromatique caractéristique citronnée. (huile essentielle).
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