Validation des méthodes d`analyse

Validation des méthodes
d'analyse
Journées Qualité et Chimie 2010
Une démarche qualité au service de la chimie
Autrans - 14 octobre 2010
Marie-Dominique Blanchin
Laboratoire de Chimie Analytique
Référentiels
 ISO 5725 : 1994 - Exactitude et fidélité d'une
méthode de mesure
 ISO 17025 : 2005 - Prescriptions générales
concernant la compétence des laboratoires d'essai
et d'étalonnage
Compétences management de la qualité
 Compétences techniques
 mdb - 14 octobre 2010
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Référentiels/Industrie Pharmaceutique
 ICH : International Conférence on Harmonisation
  Pharmacopée américaine, USP33-NF28
  <1225> Validation of compendial methods
FDA guidance for industry.
  Q2(R1) 2005 : validation of analytical procedures
test and methodology
Analytical procedures and method validation
Eurachem
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ICH /Définitions
 Méthode d'analyse
Document écrit
 "Moyen de réaliser l'analyse"
 "Description détaillée des différentes opérations
nécessaires pour effectuer l'analyse de la
substance à examiner"
 mdb - 14 octobre 2010
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ICH / Définitions
 Validation
  "Le but de la validation d'une méthode d'analyse
est de démontrer qu'elle correspond à l'usage
pour lequel elle est prévue"
Ensemble des opérations nécessaires pour
prouver que le protocole est suffisamment exacte
et fiable pour avoir confiance dans les résultats
fournis et ceci pour un usage déterminé
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Définitions
 Validation
 Application déterminée
  Niveau de la validation
  Fonction de l'application
Objectif clairement déterminé
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Critères de validation
Spécificité
 Linéarité
 Exactitude
 Fidélité
 Intervalle d'application
 Limite de détection
 Limite de quantification
 Robustesse
 Stabilité des solutions
 mdb - 14 octobre 2010
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Spécificité
 Specificity
"Capacité de la méthode de permettre une
évaluation non équivoque de l'analyte en
présence de composants qui sont susceptibles
d'être présents"
   Capacité de faire la discrimination analyte /substances
interférentes
Garantir que le résultat de l'analyse  analyte
Absence d'interférences
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Spécificité
 Specificity
Impuretés
   Ajouts dosés impuretés disponibles sur composé ou
formulation
Comparaison avec résultats obtenus sur des
échantillons contenant des impuretés ou des
produits dégradation (lumière, t°, humidité, hydrolyse
acide ou alcaline, oxydation)
Profil impuretés
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Spécificité
 Specificity
Si méthode CLHP, vérifiée par
 Injection
     placebo analytique = matrice (dégradé, non dégradé)
composés interférents potentiels, produits de décomposition,
intermédiaires, précurseurs de synthèse
échantillons dégradés (lumière, t°, acide, alcalin, oxydant)
Observation des chromatogrammes obtenus
Vérification homogénéité des pics
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Linéarité
 Linearity
"Capacité dans un intervalle donné d'obtenir des
résultats de dosage directement proportionnels
à la concentration ou à la quantité d'analyte
dans l'échantillon"
 Relation linéaire signal - concentration
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Linéarité
 Linearity
Exemple méthode CLHP, vérifiée par injection de
  solutions étalons d’analyte : linéarité de la gamme
d'étalonnage
Solutions  échantillons reconstitués concentrations
d'analyte différentes : linéarité de la méthode
n ≥ 5 concentrations
n ≥ 3 répétitions de chaque niveau
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Linéarité
   Linearity
Intervalle de linéarité fonction de
 Analyte (impureté, principe actif, conservateur,…)
 Application (formulation, test de dissolution,…)
Vérifiée : examen de la courbe, analyse de variance
Exprimée : Équation de la droite avec intervalle de
confiance sur pente, ordonnée à l’origine, coefficient
de détermination r2
Si linéarité + ordonnée origine =0 : 1 seul point étalon
en routine
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Exactitude
(justesse)
Accuracy
 "Etroitesse d’accord entre la valeur trouvée et la valeur acceptée
soit comme valeur conventionnellement vraie soit comme valeur
de référence"
 ISO 5725
 Exactitude : étroitesse d'accord entre la résultat d'essai et la
valeur de référence acceptée
 Justesse : étroitesse d’accord entre la valeur moyenne obtenue à
partir de larges séries d'essais et une valeur de référence
acceptée
écart d'une valeur obtenue / valeur considérée comme exacte
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Exactitude
Exact, non fidèle
Exact, fidèle
(justesse)
Accuracy
Inexact, non fidèle
Inexact, fidèle
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Exactitude
 (justesse)
Accuracy
Exactitude  erreur systématique (biais) d'une
valeur obtenue / valeur considérée comme exacte
 Vérifiée par comparaison
   méthode de référence
préparation échantillons reconstitués (matrice + quantité
connue d’analyte) et étalons
n ≥ 3 x 3 concentrations différentes en analyte
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Exactitude
(justesse)
Accuracy
Tracé droite qté trouvée - qté ajoutée
(= théorique ou vraie)
  Méthode exacte si
   Tracé droites réponse-qté ajoutée et réponsequantité étalons
  pente=1
ordonnée origine =0
Méthode exacte si pente et ordonnée origine =0
identiques
Taux de recouvrement ou erreur relative %
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Fidélité
Precision
 " Etroitesse d’accord entre une série de
mesures obtenues dans des conditions
prescrites à partir de prises d’essais multiples
provenant d’une même échantillon
homogène"
 ou degré de dispersion des résultats
ou écart aléatoire de valeurs / valeur moyenne
 mdb - 14 octobre 2010
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Fidélité
Precision
Fidèle, inexact
Non fidèle, inexact
Fidèle, exact
Non fidèle, exact
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Fidélité
 Fidélité
Precision
 erreurs aléatoires
Répétabilité
 Fidélité intermédiaire
 Reproductibilité
 mdb - 14 octobre 2010
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Fidélité, répétabilité
Repeatability
 "La
répétabilité exprime la fidélité évaluée dans
des conditions opératoires identiques et dans un
court intervalle de temps"
Déterminée à partir d'un même échantillon, évaluée
dans des conditions opératoires identiques (même
analyste, même équipement, même laboratoire,…) et
dans un court intervalle de temps
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Fidélité, répétabilité
Repeatability
Répétabilité de la mesure : n ≥ 6 même
échantillon
 Répétabilité de la méthode : n ≥ 6 ou n ≥ 3x3
 mdb - 14 octobre 2010
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Fidélité, fidélité intermédiaire
Intermediate precision
 "La fidélité intermédiaire exprime la variabilité
intra-laboratoire : jours différents, analystes
différents, équipements différents, etc… "
Détermination à partir d'un même échantillon
→ bien spécifier les conditions
→ plan expériences
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Fidélité, reproductibilité
Reproductibility
 " La reproductibilité exprime la variabilité inter
laboratoires (études collaboratives)
habituellement appliquées à la standardisation
de la méthodologie"
 Déterminations à partir d’un même échantillon
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Fidélité, expression
Precision
Écart-type s (standard deviation)
 Variance s2
 Coefficient de variation, s/m*100 ( relative
standard deviation) %
 mdb - 14 octobre 2010
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Intervalle de validité
 Range
"Intervalle compris entre la concentration
(quantité ) la plus élevée et la plus faible de
l'échantillon dans lequel il a été démontré
que la méthode d'analyse présente une
fidélité, une exactitude et une linéarité
satisfaisante."
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Limite de détection
Detection Limit
 " La limite de détection d'une méthode d'analyse
est la plus petite quantité d’analyte qui peut être
détectée mais pas nécessairement quantifiée
comme une valeur exacte"
 Exprimée en quantité injectée ng, µg
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Limite de détection
Detection Limit
Évaluation visuelle
 Évaluation  signal/bruit
 Évaluation  pente et écart-type
 mdb - 14 octobre 2010
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Limite de détection
 Detection Limit
Exemple méthode CLHP
Masse ou concentration d’analyte qui donne un
rapport S/B = 3
 Bruit pic à pic
 Vérifiée dans matrice par injection à la
concentration retenue comme LD
 mdb - 14 octobre 2010
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Limite de quantification
Quantification Limit
 "Quantité la plus faible d’analyte dans un
échantillon qui peut être déterminée
quantitativement avec une fidélité et une
exactitude appropriée"
 Exprimée en ng ou µg
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Limite de quantification
Quantification Limit
Évaluation visuelle
 Évaluation  signal/bruit
 Évaluation  pente et écart-type
 mdb - 14 octobre 2010
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Limite de quantification
Quantification Limit
Évaluée : quantité ou concentration d’analyte S/
B = 10
 Vérifiée en injectant des solutions de conc. =LQ
 mdb - 14 octobre 2010
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Robustesse
Robustness
 "Capacité du protocole de rester non affectée par des
variations faibles mais délibérément introduites dans
les paramètres de la méthode; fournit une indication
sur sa fiabilité dans des conditions normales
d’utilisation"
 Variations faibles : modifications contrôlées des
conditions d'application (changements délibérés mais
limités  facteurs indépendants)
 étude de l'effet de chaque facteur sur le résultat de
l'analyse
 mdb - 14 octobre 2010
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Robustesse
Robustness
 Vérifiée par approche multivariée ou univariée (plan
d'expériences)
 Permet de fixer les limites des tests de conformité
Donne une idée sur variations entre jours, entre
laboratoires  étape préliminaire avant de transférer les
méthodes, avant les études collaboratives
 mdb - 14 octobre 2010
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Robustesse
 Exemples de facteurs
   Temps d'extraction
Temps d' agitation
CLHP
      Robustness
pH de la phase mobile
Composition de la phase mobile
Débit
Colonne
Température ….
Permet de fixer les limites des tests de
conformité
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Stabilité des solutions
Vérifiée sur solutions étalons et échantillons
 Vérifiée par comparaison des facteurs de
réponse
  Exemple méthode CLHP
Solution « vieillie »
 Solution « fraîche »
 Temps > 16h (injecteur automatique)
 mdb - 14 octobre 2010
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Conclusion
 Validation initiale
Pas de règles
 Recommandations; lignes directrices
 Pas de protocole figé
 Adaptation à l'usage, aux exigences
 mdb - 14 octobre 2010
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Conclusion
 Routine
  Validation in situ : confirmation validation initiale
applicable ( suivi des paramètres, CQ,…)
Tests de conformité HPLC
  Paramètres chromatographiques Tr, Rs, N
Répétabilité injections successives (n = 6)
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TEST
PARAMETRE
CRITERE D’ ACCEPTATION
Identification
Spécificité
Test garantissant l’identité de l’analyte
Tests quantitatifs
majeurs
Exactitude/TR
Répétabilité
Fidélité intermédiaire
Linéarité
Spécificité
95 à 105 % qté théorique
Doit être prouvée
RSD ≤ 3 %
R2 ≥ 0,98 ou R ≥ 0,99
Rs satisfaisante entre les pics PA et pdts de
dégradation connus; évaluation de l’interférence du
placebo
Robustesse
Doit être démontrée
Exactitude/TR
Répétabilité
Linéarité
Spécificité
70 à 130 % de la qté tolérée
RSD ≤ 10 %
R2 ≥ 0,95 ou R ≥ 0,97
Rs satisfaisante entre pics PA et pdts de
dégradation connus; évaluation de l’interférence du
placebo
Pour tests limites uniquement
Doit être démontrée
Dosage de faibles
conc. (pdts de
dégradation,
impuretés)
LD
LQ
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Quelques livres
      Validation and Qualification in Analytical Laboratories – L. Huber
– Interpharm / CRC 1999
L'assurance qualité dans les laboratoires agro-alimentaires et
pharmaceutiques – M. Feinberg, coordonnateur – Ed TEC&DOC
2001
Analytical method validation and instrument performance
verification – Ed Chung Chow Chan, H. Lam, Y.C. Lee, X.M.
Zhang – John Wiley&Sons, 2004
Validation of chromatography data systems – Meeting business
and regulatory requirements – R.D. McDowall – Ed Royal
Society of Chemistry, 2005
Method validation in pharmaceutical analysis – a guide to best
practice – Ed J. Ermer and J.H. McB. Miller – Wiley- VCH, 2005
……
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