Techniques en instrumentation – Culture des cellules animales

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Techniques en instrumentation – Culture des cellules animales
Objectifs:
1. Se familiariser avec la technique
de transfection transitoire des
cellules
animales
pour
l’expression et la purification
de protéines recombinantes.
2. Utilisation
de
protéines
fluorescentes pour l’évaluation
de l’efficacité de transfection et
des dynamiques de co-transfection. Familiarisation avec la technique de
cytofluorométrie.
3. Évaluation d’un système inductible en transfection transitoire et analyse de
l’effet du niveau d’expression du répresseur et de la concentration de l’agent
inducteur sur l’expression d’une protéine rapporteur.
4. Comparaison du glycérol et DMSO (diméthylsulfoxide) et de certains
paramètres de congélation sur la survie des cellules animales.
Parcours expérimental:
1.
Expression et purification de la protéine fluorescente DsRed
La production de protéine recombinante est essentielle à l’industrie ainsi qu’à la
recherche scientifique. Les besoins pour des procédés rapides, abordables et
applicables à l’échelle industrielle font de la transfection des cellules animales une
technologie avantageuse.
Des cellules HEK293T seront transfectées avec un vecteur d’expression codant
pour la protéine d’intérêt et le polyéthylenimine (PEI) 25 kDa branché sera utilisé comme
agent de transfection. Pour cette expérience, vous aurez besoin d’un flacon de culture
de 125 mL avec 25 mL de culture à une densité initiale de 1,0 X 106 cellules/mL. Le
mélange de transfection est simple et est constitué de milieu de base (DMEM ;
Dulbecco's Modified Eagle Medium) sans sérum, du plasmide (1 g par mL de culture à
transfecter) et de PEI (3 g par mL de culture à transfecter). Une fois constitué, le
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mélange de transfection est mélangé puis incubé à température ambiante pour 15
minutes avant d’être ajouté aux cellules (jour 1).
Au jour 2, l’efficacité de votre transfection pourra être évaluée (visualisée) au
microscope à fluorescence.
Au jour 4, le milieu de culture sera retiré; les cellules rincées délicatement au PBS puis
lysées dans du tampon phosphate contenant 0.5% de détergent non-ionique (Thesit ou
Triton X-100). Le lysat ainsi obtenu sera centrifugé de façon à éliminer les débris
cellulaires. Le surnageant clarifié obtenu après centrifugation pourra être appliqué
directement sur la colonne de chromatographie d’affinité préalablement équilibrée dans
le tampon ayant servi à la lyse. L’étiquette de 8 histidines en C-terminal de la protéine
permet sa purification par IMAC (immobilized metal affinity chromatography). La résine
utilisée est le FractogelTM EMD chelate de la compagnie Merck préalablement chargée
avec des ions cobalt. La capacité de fixation a été évaluée à environ 5-7 mg
protéines/mL de résine. Le cobalt pourrait être substitué à d’autres ions métalliques
(cuivre, zinc et nickel) mais une meilleure spécificité est obtenue, dans les conditions
utilisées avec ce premier. Une fois l’échantillon passé, la colonne est lavée avec le
tampon phosphate contenant 0,5% de Thesit puis avec du tampon de lavage (contenant
25 mM imidazole). Par la suite, la protéine est éluée avec le tampon d’élution (contenant
300 mM d’imidazole). Le tampon d’élution doit être ajouté 0,5 mL à la fois et chacune
des fractions doivent être récoltées séparément dans des tubes eppendorf. A la fin de
l’étape d’élution, un aliquot de chacune des fractions est soumis à un dosage protéique
qualitatif par la méthode de Bradford. Les fractions contenant le plus de protéines seront
rassemblées et la fraction finale sera dessalée par tamis moléculaire (SEC; size
exclusion chromatography). Finalement, une analyse quantitative du contenu en
protéine sera effectuée à nouveau par la méthode de Bradford en utilisant une courbe
étalon de BSA. Dans la même journée, les échantillons récoltés aux différentes étapes
de la purification seront analysés par SDS-PAGE. Une fois colorés et décolorés, les gels
d’acrylamide seront numérisés. La pureté de la protéine et les pertes encourues au
cours du processus de purification pourront ainsi être déterminées qualitativement.
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2. Évaluation du taux de transfection et analyses cytofluorométriques
Pour cette expérience, vous aurez besoin de trois flacons T-25 (5mL de culture
chacun) contenant des cellules HEK293T. Les trois flacons seront transfectés
différemment, soit avec 100% du vecteur pTT codant pour la protéine fluorescente GFP
ou la protéine fluorescente DsRed, soit avec un mélange 50-50 des plasmides codant
pour la GFP et la DsRed. Au jour 2, vous serez en mesure d’apprécier l’efficacité de vos
transfections par microscopie à fluorescence. Au jour 3, les cultures seront analysées
par cytofluorométrie afin de déterminer les efficacités de transfection (% de cellules
exprimant les transgènes) et les proportions de cellules exprimant l’un ou l’autre ou les
deux protéines recombinantes. La démonstration de cytofluorométrie durera 55
minutes/équipe et s’effectuera à l’IRIC (Local 1402, Responsable : Mme Danièle
Gagné).
3. Système inductible et rapporteur
Dans plusieurs contextes, moduler les niveaux d’expression d’une protéine peut
s’avérer essentiel. Le système utilisé devrait offrir une bonne amplitude d’expression et,
que ce soit par toxicité du produit ou pour des études fonctionnelles, un niveau
d’expression de base très faible, idéalement inexistant. Dans cette expérience, deux
plasmides seront transfectés. Le premier code pour la protéine rapporteur (SEAP) et
contient deux opérateurs entre la région promotrice et le gène d’intérêt. Le deuxième
code pour une protéine appelée Tet-répresseur. Cette dernière est constituée de deux
parties fonctionnelles, soit un domaine de liaison à l’ADN et un domaine de liaison à la
tétracycline. Le domaine de liaison à l’ADN reconnaît spécifiquement les deux
opérateurs situés sur le plasmide codant pour la protéine rapporteur. En absence de
tétracycline, le répresseur prévient la transcription du gène rapporteur. Lorsqu’associé à
la tétracycline, le répresseur change de conformation et perd son affinité pour les
opérateurs. Il n’y a donc plus de répression et le gène rapporteur est transcrit et la
protéine est produite.
Dans cette expérience, trois concentrations de plasmide codant pour le
répresseur ainsi que 7 concentrations différentes d’inducteur (la tétracycline) seront
testées
sur
l’expression
de
la
protéine
rapporteur
SEAP
(secreted
alkaline
phosphatase). Le plasmide rapporteur pTO2-SEAP, qui contient les 2 opérateurs à la
tétracycline en 3’ du promoteur CMV, sera gardé constant dans chacun des puits et
constituera 50% de l’ADN contenu dans les mélanges de transfection. L’autre 50% sera
constitué du plasmide codant pour le répresseur (pTT5-TetR). Selon le cas, de l’ADN de
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‘remplissage’, soit de l’ADN de sperme de saumon (ADNss) sera utilisé pour compléter
les préparations d’ADN. Dû au fait que l’efficacité de transfection est dépendante du
ratio ADN-PEI et de la quantité de polyplexes (complexes ADN-PEI) ajouté par cellule, il
est essentiel d’avoir la même quantité d’ADN par puit dans une analyse comparative, de
là l’utilisation de l’ADN de remplissage. Les cellules (100 µL/puits à une densité de 0,5 X
106) seront préalablement ensemencées dans une plaque à 96 puits. Aux puits seront
ajoutés 10 µL des mélanges de transfection suivants:
Tube
DMEM
pTO2-SEAP
pTT5-TetR
ADNss
PEI
1
500 L
50%: 2,5 g
5%: 0,25 g
45%: 2,25 g
7,5 g
2
500 L
50%: 2,5 g
15%: 0,75 g
35%: 1,75 g
7,5 g
3
500 L
50%: 2,5 g
50%: 2,5 g
0%
7,5 g
L’ajout des mélanges de transfection aux cellules devra se faire selon le schéma
ci-bas :
Tétracycline
(g/mL):
1
0,5
0,25
0,125
0,062
0,0312
5% répresseur
15% répresseur
50% répresseur
Puits contrôles
0,01562
0
Au jour 2, 10 L d’une solution de tétracycline diluée dans du PBS seront ajoutés aux
puits pour obtenir les concentrations finales indiquées sur le schéma. L’ajout se fera à
l’aide de la pipette à canaux multiples. L’expression de SEAP sera déterminée au jour 4
en mesurant l’activité phosphatase sur un substrat colorimétrique, le pNPP (paranitrophényl phosphate) dilué dans un tampon réactif à pH 9,8. Pour ce faire, une autre
plaque à 96 puits sera utilisée. 40 L d’eau distillée devront d’abord être ajouté aux puits
de la nouvelle plaque. 10 l de surnageant de chacun des puits expérimentaux devront
être transférés et dilués dans les puits correspondants contenant l’eau (dilution 1/5 des
5
échantillons). 50 L de substrat seront ensuite ajoutés à chacun des puits et la plaque
sera immédiatement lue par un spectrophotomètre à 405 nm à intervalles réguliers (30
secondes) pendant 3 minutes. L’augmentation de l’absorbance avec le temps donne la
vitesse de réaction et est proportionnelle à la quantité de SEAP dans le surnageant des
différents points expérimentaux.
4. Comparaison du glycérol et DMSO (diméthyl sulfoxide), de la
température et de la vitesse de congélation sur la survie des
cellules animales
Pour cette partie, des cellules cultivées en suspension et maintenues dans un milieu
sans sérum seront utilisées. Au jour 1, des cellules HEK293-6E seront prélevées de la
culture mère et seront diluées à 0,4 X 106/mL et cultivées dans un flacon CellBindTM T75 (10 mL). Au jour 2, les cellules seront détachées du flacon et la culture sera répartie
dans 2 tubes de 15 mL (5 mL/tube). Les tubes seront centrifugés (centrifugeuse
clinique) et les culots cellulaires délicatement resuspendus dans les 2 différents milieux
de congélation: 90% milieu sans sérum, et 10% d’agent cryoprotecteur (glycérol ou
DMSO); 4 mL par milieu sont nécessaires. Les suspensions seront alors réparties dans
des tubes pour congélation cellulaire (cryovials) adéquatement identifiés (1 mL/tube, 3
tubes/agent). Pour chacun des agents, 1 tube sera rapidement mis à congeler à -20°C,
l’autre à -70°C et le dernier aussi à -70°C préalablement incubé sur glace durant 60
minutes. Au jour 3, les différents tubes seront décongelés rapidement dans un bain à
37°C. Une fois décongelé, le contenu de chacune des cryovials sera ajouté à 4 mL de
milieu de culture dans un tube de 15 mL, de façon à diluer rapidement le glycérol ou le
DMSO. Les tubes seront ensuite centrifugés (centrifugeuse clinique) et le culot cellulaire
repris dans 1 mL de milieu de culture. La viabilité cellulaire de chacun des échantillons
sera déterminée par le test d’exclusion au bleu de trypan, à l’aide de l’hémacymètre.
5. Détermination du taux de croissance cellulaire () et du temps de
doublement (td)
Pour cette partie de l’expérience, des cellules HEK293-6E poussant en suspension
seront cultivées dans des erlenmeyers de 250 mL sous agitation (120 rpm) dans un
incubateur à 37°C/5% CO2. Au jour 1, un volume de 40 mL de culture à une densité
cellulaire de 0,25 X 106/mL sera requis. Quotidiennement, un aliquot de la culture sera
prélevé stérilement (1 mL) et la densité cellulaire estimée en utilisant deux méthodes:
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-Méthode conventionnelle à l’hémacymètre et bleu de trypan
-Méthode au Crystal violet pour le dénombrement des noyaux (voir section suivante).
Au jour 4, vous aurez obtenus assez de points pour déterminer le taux de croissance de
votre culture. N’oubliez pas:

ln X 2  ln X 1
t 2  t1
et
td = ln 2/
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Jour 1
Flacon mère
Transfections:
DsRed
25 mL
10 x 10
6
1) GFP
2) DsRed
3) GFP+DsRed
4 x 106
3 x 5 mL
40 mL
(Td)
10 mL
Congélation
Tet operateur/Répresseur
Jour 2
Tétracycline
Congélation
Compte cellulaire
GFP/GFP-DsRed
Jour 3
Décongélation
Compte cellulaire
Cytofluorométrie
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Jour 4
Spectrophotométrie
SDS-PAGE
IMAC
Compte cellulaire
Protocole détaillé
Jour 1
Ensemencement des cellules
La densité cellulaire de la culture initiale des cellules cultivées en suspension doit être
évaluée.

Prélèvement d’un échantillon de façon stérile: Pipeter entre 0,5 et 1 ml de la
culture. Garder l’échantillon dans un eppendorf ou un tube à essai.

Dans un autre tube, diluez 100 l d’échantillon cellulaire à 300 l de bleu de
trypan (0,1% dans PBS).

Comptez les cellules viables et non-viables (bleues) à l’aide d’un hémacymètre
(voir la section utilisation de l’hémacymètre à la page suivante).
o
Chaque région encerclée équivaut à un volume de 0,1 L; le total des 4
régions équivaut donc à 0,4 L. N’oubliez pas de tenir compte de la
dilution initiale dans la solution de bleu de trypan.

Remplissez et comptez les 2 chambres de l’hémacymètre pour avoir un
duplicata.
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Utilisation de l’Hémacymètre
Qu’on le nomme hemocytometer, hematocytometer, hemacytometer, cell counting chamber ou
chambre de Neubauer, il est composé de 2 chambres identiques, subdivisées en 9 carrés de 1 mm
chacun, contenant du liquide sur une hauteur de .1mm, soit un carré de 1 mm2. Son utilisation qui,
à priori, servait au comptage de cellules sanguines et de spermatozoïdes, nous permet de
déterminer la concentration de cellules dans un liquide (par mL).
Il est bien important qu’au moment de prélever l’échantillon, votre mélange soit bien homogène et
représentatif.
1. Déposer la lamelle sur les chambres, à cheval sur les rebords en verre.
2. Déposer le liquide, environ 15ul, dans l’encavure en V, soit à l’aide d’un embout ou d’une
pipette pasteur. La goutte entrera par capillarité et doit tout recouvrir la chambre sans
pour autant qu’elle ne déborde. Prenez garde que la lamelle demeure immobile durant la
lecture.
Les cellules marquées d’un trait dans le champ suivant ne doivent pas être comptées 
L’ajout de bleu de trypan 0.1% sert à calculer le % de viabilité en colorant les cellules
mortes.
L’ajout de crystal violet 0.1% permet la coloration des noyaux.
Dans les deux cas, le calcul est réajusté en fonction de la dilution utilisée.
Exemple : Un volume de cellules pour un volume de bleu de trypan.



FORMULE :
(Nbres de cellules/4) X 104 X facteur de dilution = Nombre cellules par mL 
Répétez le compte en utilisant cette fois la solution de crystal violet (crystal violet
0,05% (P/V), triton X-100 0,1% (V/V) et acide citrique 0,1 M) à la même dilution
qu’avec le bleu de trypan.
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o Les cellules cultivées en suspension ont parfois tendance à s’agréger, ce
qui rend les comptages assez laborieux. La solution de Crystal violet
contient du détergent qui solubilise les membranes, détruis les agrégats,
et libère les noyaux qui sont colorés par le Crystal violet. Cette méthode
ne permet pas d’évaluer la viabilité cellulaire, mais permet un comptage
total plus précis.
Évaluation du volume de cellules nécessaire à l’ensemencement de
l’erlenmeyer et du T-75:
A partir de maintenant, toutes les étapes doivent être effectuées en environnement
stérile, que ce soit dans une hotte à flux laminaire ou à la flamme. Les étapes
d’ensemencement devraient être effectuées dans la hotte.
Une fois que vous aurez déterminé la densité cellulaire de la culture mère, vous
serez en mesure de déterminer le volume nécessaire pour effectuer les deux
expériences:

Test de congélation: 1 x T-75 = 10 mL @ 0,4 million/mL

Évaluation du taux de croissance: Erlenmeyer, 40 mL @ 0,25 million/mL
Au total: 14 millions de cellules nécessaires.
 15 millions de cellules vous seront attribuées (volume à déterminer en
fonction de la densité cellulaire initiale).
 Pour ces expériences, les cellules ne nécessitent qu’une simple dilution. Il suffit
de prélever le bon volume de la culture mère et d’y ajouter du milieu F17 sans
sérum frais pour obtenir la concentration cellulaire voulue:
T-75: 10 mL total, 4 millions de cellules (densité @ 0,4 X 106)
Erlenmeyer: 40 mL total, 10 millions de cellules (densité @ 0,25 X 106/mL)

Une fois les dilutions effectuées, rangez les flacons dans leur incubateur
respectif.
o
L’erlenmeyer doit être hermétiquement fermé (bouchon vissable). Le
flacon T-75 doit avoir son bouchon légèrement dévissé (1/4 de tour) afin
d’y laisser passer l’air et le CO2 de l’incubateur. Attention de ne pas
envoyer du liquide dans le bouchon, c’est la porte d’entrée des
contaminations.
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
Pour les expériences impliquant une transfection, des cellules adhérentes
maintenues dans un milieu de culture commercial DMEM contenant 10% de FBS
(fœtal bovine serum) (appelé DMEM avec sérum) seront préalablement
ensemencées pour vous à une densité de 0,5 X 106/mL.
Système inductible

Pour cette expérience, l’ajout du mélange de transfection est ajouté aux cellules
à l’aide d’une pipette à canaux multiples.

Bien que vous ayez besoin d’environ 240 L par mélange de transfection, vous
en préparerez 2 mL de façon à faciliter l’utilisation de la pipette à canaux
multiples.

Les mélanges de transfection doivent être préalablement effectués comme décrit
dans le tableau ci-bas.
o

Cette étape peut être effectuée à la flamme.
Dans 3 tubes de 15 mL stériles, ajoutez 2 mL de milieu de transfection DMEM
sans sérum et, en fonction des concentrations d’ADN des différents plasmides,
le volume des préparations plasmidiques nécessaires pour obtenir les quantités
suivantes:

Tube
pTO2-SEAP
pTT5-TetR
ADNss
1 (5% rep)
10 g
1 g
9 g
2 (15% rep)
10 g
3 g
7 g
3 (50% rep)
10 g
10 g
---
Une fois les ADNs distribués dans les tubes, vous êtes prêt à ajouter le PEI pour
la formation des complexes.
o
Les mélanges d’ADN peuvent être effectués à l’avance, le compte à
rebours est initié par l’ajout du PEI.

La solution de PEI est à une concentration de 1 mg/mL. Vous aurez donc besoin
de 30 L (30 g) par mélange de transfection (1,5 g de PEI/g d’ADN à
transfecter). Ajoutez le PEI en utilisant une pipette P200 (Gilson) et des embouts
stériles.

Une fois ajouté, la solution doit être immédiatement vortexée pendant 3X3
secondes puis incubée durant 15 minutes à température ambiante.
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
À la fin de la période d’incubation, vous êtes prêt à transférer les mélanges de
transfection à la plaque 96 puits contenant les cellules. Pour ce faire, videz le
contenu du tube contenant le mélange de transfection dans un réservoir à réactif
stérile et utilisez la pipette à canaux multiples (10 L/puit). Idéalement, cette
étape est effectuée sous la hotte. Essayez de respecter la distribution telle que
prescrite dans le schéma ci-dessous. Changez de réservoir et d’embouts
lorsque vous passerez d’un mélange de transfection à l’autre.
Tétracycline
(g/mL):
1
0,5
0,25
0,125
0,062
0,0312
5% répresseur
15% répresseur
50% répresseur
Puits contrôles
0,01562
0
Production de protéines recombinantes
Il reste maintenant à effectuer les transfections du T-175 (purification de la DsRed) et
des 3 T-25 (analyses de cytofluorométrie). Ces flacons seront préalablement
ensemencés pour vous avant la séance de laboratoire.

Pour le flacon de 125 mL (25 mL) (cellules en suspension), préparer le mélange
de transfection dans 2,5 mL de F17 sans sérum (1/10 du volume à transfecter,
tube de 15 mL stérile).

Ajouter 25 g du plasmide pTTSH8Q1-DsRed.
o
Vous devrez déterminer le volume à utiliser en fonction de la
concentration de l’ADN plasmidique qui vous sera fournie (voir démo).

Une fois l’ADN dilué, le PEI peut être ajouté. Considérant que le ratio optimal
d’ADN/PEI est de 1 pour 35, ajoutez 75 g d’agent de transfection.

La solution doit être immédiatement vortexée pour 3X3 secondes après l’ajout du
PEI.

Incubez le mélange de transfection pour 15 minutes à la température ambiante

Ajouter ce mélange à la culture en suspension.
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
Remettre le flacon dans l’incubateur en s’assurant que le bouchon est bien vissé
et que l’agitation est à 100 RPM.
Cytofluorométrie

Pour les T-25, vous aurez besoin de 500 L de DMEM sans sérum par mélange
de transfection et de 5 g d’ADN par flacon.

Préparer 3 eppendorfs stériles sous la hotte et ajouter les ADN respectifs
suivant :
o
un des T-25 est transfecté avec le vecteur pTT-GFP (5 g),
o
un autre avec le vecteur pTTSH8Q1-DsRed (5 g)
o
le dernier : un mélange 50-50 des plasmides pTT-GFP et pTTSH8Q1DsRed (2,5 g chacun).
o
Il sera à vous de déterminer les volumes à prélever d’ADN plasmidique
pour obtenir ces quantités.

Une fois les ADNs ajoutés, incorporer le PEI aux mélanges (7,5 g par
transfection).

Les mélanges sont ensuite vortexés (3X3 sec) et incubés 15 minutes à
température ambiante avant d’être ajoutés aux cultures.
o

Procédez comme vous l’avez fait pour la transfection du T-175.
Remettre les T-25 dans l’incubateur en s’assurant que les bouchons sont
légèrement dévissés.
Jour 2
Congélation des cellules

Les cellules du T-75 ensemencées à 0,4 x 106/mL sont récoltées.
o
Ces manipulations peuvent êtes exécutées à la flamme dans le
laboratoire d’enseignement.

Détacher les cellules du flacon ; il ne suffit que d’une légère tape sur l’un de ses
côtés, tout en le maintenant à l’horizontale.

Une fois les cellules détachées, répartir la culture dans 2 tubes de 15 mL (5 mL
chaque) et centrifuger les tubes à 200g pour 5 minutes (centrifugeuse clinique).

Décanter le surnageant et resuspendre le culot dans 4 mL de milieu de
congélation contenant du DMSO (tube 1) ou du glycérol (tube 2). Pour chaque
14
tube,
1
mL
de
la
suspension
est
distribuée
dans
3
tubes
à
congélation adéquatement identifiés.

De ces trois tubes, 1 sera immédiatement congelé à -20°C, un à -70°C et le
dernier sera incubé sur glace 1 heure avant la congélation à -70°C.
Évaluation des efficacités de transfection
Les cellules ayant été transfectées avec la GFP et la DsRed (T-25) seront amenées à la
salle de microscopie du département (B-301). Une plage horaire de 2 heures nous est
octroyée, entre 13h00 et 15h00. Calculez environ 15-20 minutes avec Mme Monique
Vasseur, responsable de la microscopie au département.

Essayez de déterminer, à l’oeil, le pourcentage de cellules transfectées.
o
Vous pourrez comparer vos estimations aux valeurs réelles après
analyse par cytofluorométrie.
Système inductible et rapporteur
Vous devez maintenant initier l’expression de la protéine rapporteur SEAP en ajoutant la
tétracycline aux cellules transfectées en plaque de la veille.
 Pour ce faire vous devrez d’abord diluer la tétracycline, dont la concentration
initiale est de 5 mg/mL (P/V), dans du PBS.
o
Ces dilutions peuvent être effectuées à la flamme dans le
laboratoire d’enseignement.
La concentration finale maximale que vous devez obtenir est 1 g/mL. Étant donné que
le volume de culture est de 100 L par puit et que vous devrez ajouter un volume de 10
L de tétracycline diluée, votre concentration initiale devrait être dix fois plus concentrée,
soit 10 g/mL. Pour obtenir les autres concentrations nécessaires, il vous suffira de faire
des dilutions en série 1 dans 2 à partir de votre tube le plus concentré, donc :

Identifiez 8 tubes de 15 mL stérile en y inscrivant la concentration de tétracycline
qui s’y trouvera.

Au tube qui contiendra la concentration la plus élevée (10 g/mL), ajoutez 5 mL
de PBS stérile.

À tous les autres tubes, ajoutez 2,5 mL de PBS.

Après l’ajout de la tétracycline au tube le plus concentré, procédez aux dilutions
sériées en procédant comme suit :
15
2,5 mL 2,5 mL
Tetracycline:
10
g/mL
5
g/mL
2,5 mL
2,5
g/mL
2,5 mL
1,25
g/mL
2,5 mL 2,5 mL
0,625
g/mL
0,3125 0,15625
g/mL g/mL
0
g/mL
*Il est important de bien vortexer les solutions entre les dilutions
Une fois les dilutions terminées, vous êtes prêt à les ajouter à votre plaque 96 puits.
Cette étape devrait se faire sous la hotte.

Procédez en ajoutant d’abord la solution contenant la concentration la moins
élevée (0 g/mL) en transvasant le contenu du tube de 15 mL dans un récipient
à réactif (bateau) stérile et en utilisant la pipette à canaux multiples.

Ajoutez 10 L/puits des différentes dilutions, comme indiqué sur le schéma de
plaque à la section précédente (page 19).

Une fois le premier ajout effectué, videz le contenu résiduel du récipient à réactif
dans un bécher à déchet liquide et réutilisez-le pour les autres dilutions, en
procédant de la solution la moins concentrée à celle la plus concentrée.
o
Il n’est pas nécessaire non plus de changer les embouts de la pipette
entre les dilutions. Soyez particulièrement attentif à ne rien contaminer.

Une fois terminé, remettez la plaque 96 puits à l’incubateur.
Détermination du taux de croissance cellulaire () et du temps de
doublement (td)

Comptez les cellules dans votre flacon de 250 mL.
o
Procédez comme précédemment en utilisant les solutions de bleu de
trypan et de Crystal violet. Comptez les 2 chambres de l’hémacymètre
pour avoir des duplicatas.

Notez bien les résultats.
16
Jour 3
Cytofluorométrie
Par groupe de 2 équipes vous devrez vous rendre à l’IRIC avec vos transfections GFP,
DsRed et GFP/DsRed.

Vous devrez transférer les cellules des T-25 dans des tubes de 15 mL juste
avant l’analyse des cultures. Voici comment procéder pour un flacon T-25:
o
Retirer le milieu de culture du flacon T-25.
o
Laver les cellules avec 10 mL de PBS.
o
Décoller les cellules à l’aide de la trypsine (1 mL) en incubant 5-10
minutes à 37°C.

o
Resuspendre les cellules dans 5 mL de PBS 2% sérum.
o
Transférer dans un tube de 15 mL préalablement identifié.
o
Répéter ces étapes pour les 2 autres flacons T-25.
Chaque groupe aura 55 minutes pour les analyses. Plus de détails vous seront
donnés (horaire, local...) en début de laboratoire par le démonstrateur.
Décongélation des cellules:
Ces étapes ne requièrent pas de manipulations en environnement stérile.

Les différents tubes congelés la veille seront décongelés rapidement dans un
bain à 37°C.

Une fois décongelé, le contenu de chacune des cryovials est transféré dans un
tube de 15 mL contenant 4 mL de milieu de culture DMEM avec sérum, de façon
à diluer rapidement le glycérol ou DMSO.

Les tubes sont ensuite centrifugés (centrifugeuse clinique) pour 5 minutes à
200g et le culot cellulaire repris dans 1 mL de milieu de culture DMEM avec
sérum.

La viabilité cellulaire de chacun des échantillons est ensuite déterminée par le
test d’exclusion au bleu de trypan, à l’aide de l’hémacymètre, tel que décrit
précédemment.
17
Préparation des solutions pour la purification de la DsRed
Les solutions de lavage et d’élution pour la chromatographie d’affinité doivent être
préparées par vous. Un volume de 50 mL de chacune des solutions est suffisant.
Lavage#1 : 150 mM NaCl, 50 mM NaH2PO4 pH 7.0, 0.5% Thesit
(ou Triton X-
100)
Lavage#2: 300 mM NaCl, 25 mM imidazole, 50 mM NaH2PO4, pH 7.0
Élution: 300 mM NaCl, 500 mM imidazole, 50 mM NaH2PO4, pH 7.0
Les solutions pourront être préparées dans des tubes en plastique de 50 mL.

Vous devez également vous assurez que la colonne de Fractogel est
préalablement chargée à l’aide d’une solution à 200 mM de CoCl2. Pour ce faire,
vous devez conditionner la colonne en déposant de 20 mL de solution CoCl2., soit
5 fois le volume de résine Fractogel (5 mL).
Détermination du taux de croissance cellulaire () et du temps de
doublement (td)

Comptez les cellules dans votre flacon de 250 mL.
o
Procédez comme précédemment en utilisant les solutions de bleu de
trypan et de crystal violet. Comptez les 2 chambres de l’hémacymètre
pour avoir des duplicatas.

Notez bien les résultats.
Jour 4
Extraction et purification de la DsRed
Ces étapes ne se font pas en environnement stérile.
La protéine DsRed est très résistante à la protéolyse et peut être donc purifiée sans
l’ajout d’inhibiteurs de protéases et à température ambiante.
 Pour la récolte des cellules du flacon, le milieu de culture doit être préalablement
retiré et les cellules sont centrifugées à 200g pendant 5 minutes.

Retirez ensuite le surnageant puis ajoutez 10 mL de tampon de lyse (Lavage#1)
au culot de cellules. Le détergent solubilisera les membranes et libèrera la
DsRed.
18
o
La solution devrait apparaître légèrement rosée, dû à la présence de la
DsRed.
 Le lysat cellulaire est centrifugé à 20 000g pour 20 minutes (centrifugeuse à
déterminer)
o
N’oubliez pas d’équilibrer les tubes !
 Après centrifugation, la coloration rosée devrait se retrouver dans le surnageant
et non dans le culot.
 Transférez le surnageant dans un tube de 15 mL, notez le volume.
 Prélevez un aliquot (500 L) dans un eppendorf et conservez-le sur glace.
o
Cet échantillon servira à déterminer qualitativement la quantité de
matériel de départ par SDS-PAGE.
Chromatographie d’affinité
La colonne contient 5 mL de résine FractogelTM EMD chelate de la compagnie Merck
préalablement chargée au cobalt à l’aide d’une solution à 200 mM de CoCl2.

Assurez-vous de faire passer une dizaine de mL de tampon Lavage#1 dans la
colonne avant d’appliquer l’échantillon, de façon à laver le plus possible le cobalt
non-fixé et d’équilibrer la colonne pour recevoir l’échantillon.

Transvidez l’échantillon dans la colonne fixée à un statif par une pince.

Récoltez le filtrat dans un tube de 15 mL propre. La coloration rosée (DsRed)
devrait être retenue sur la colonne et le filtrat devrait être incolore.

Une fois l’échantillon passé, conservez le filtrat sur glace, pour l’expérience
d’électrophorèse.

Passez maintenant la solution de lavage#1, puis la solution de lavage#2 (à
raison de 10 ml chacune).

Afin de s’assurer que toutes les protéines contaminantes sont sorties de la
colonne, prélevez 20 L de filtrat à la sortie de la colonne lors du passage des
derniers mL du dernier lavage.

Dans une plaque à 96 puits, déposez vos 20 L dans un puit et ajoutez y 200 L
du réactif de Bradford préalablement dilué 1/5 avec de l’eau.

Comparez la couleur de ce puit avec un autre dans lequel vous n’aurez ajouté
que le réactif de Bradford. Si la coloration obtenue est légèrement plus bleutée,
poursuivez le lavage de la colonne avec le tampon #2.
19

Répétez le processus jusqu’à ce que la coloration de votre échantillon soit la
même que le réactif de Bradford seul.

Conservez tout le volume des lavages dans des tubes de 50 mL et mettezles sur glace.

Pour l’élution, assurez-vous qu’il ne reste plus de tampon de lavage au dessus
de la résine.

Appliquez à coup de 500 L la solution d’élution en prenant soin de récolter
chacun des 500 L dans des eppendorfs séparés et numérotés.

Suivez la présence de protéines dans chacune des fractions de l’éluat en
procédant comme lors du lavage, avec le réactif de Bradford.

Lorsque l’élution sera terminée, choisissez les 3 fractions contenant le plus de
protéines; vous devriez alors avoir un volume de 1,5 mL.

Procédez ensuite au dessalage de votre échantillon. Les échantillons concentrés
en sels migrent très mal en SDS-PAGE. L’étape de dessalage assurera une
belle migration de votre protéine purifiée.
o
Pour ce faire, vous utiliserez une colonne jetable de dessalage PD-10 de
la compagnie GE Healthcare. Celles-ci contiennent un gel Sephadex G25 qui permet de séparer les substances de haut poids moléculaire (>
5000 Da) des substances de faible poids moléculaire (<1000 Da). (Voir
graphique explicatif sur l’autre page).
o
Il faut d’abord équilibrer la colonne avec le tampon dans lequel nous
voulons avoir notre échantillon. Pour ce faire, vous devrez passer 25 mL
de PBS sur la colonne avant d’appliquer votre échantillon. Assurez-vous
que votre échantillon fait bien 2,5 mL; la limite de capacité de la colonne
est de 2,5 mL.
o
Une fois la colonne équilibrée, appliquez les 2,5 mL d’échantillon et
laissez les pénétrer complètement dans la colonne.
o
Eluez avec 3,5 mL de PBS en vous assurant maintenant de récolter le
liquide à la sortie de la colonne ; c’est votre fraction finale ! Placez-la sur
la glace.
20
Profil d’élution de la colonne de dessalage PD-10 de la compagnie GE Healthcare
Vous devez maintenant estimer la quantité de protéine que vous avez purifiée. Pour ce
faire, vous utiliserez 2 méthodes:

Coefficient d’extinction molaire de la protéine avec lecture d’absorbance à
280 nm.

Dosage par la méthode de Bradford avec BSA comme standard (1,4
mg/mL)
Coefficient d’extinction molaire et absorbance à 280 nm
Pour la détermination de la quantité en g/L, vous utiliserez le coefficient d’extinction
molaire de la protéine DsRed, qui est de 41 370 M-1
Utilisez la formule suivante : A =  c l
A - absorbance à 280 nm
- coefficient d’extinction molaire
c – concentration (M)
l- épaisseur de la cuvette (cm)
Le poids moléculaire théorique de la DsRed monomérique est d’environ 28,5 kDa.
21
Dosage des protéines par la méthode de Bradford avec la trousse
Bio-Rad
Cette section est en partie tirée du protocole des travaux pratiques de biochimie, BCM
3531H. Le dosage des protéines à l’aide de la trousse Bio-Rad est basé sur la
procédure de Bradford qui mesure l’intensité de la coloration du bleu de Coomassie
brillant G-250 en présence de différentes concentrations de protéine. Le colorant
interagit avec les acides aminés basiques (surtout l’arginine) et aromatiques. La
méthode détecte des concentrations de protéine variant de 2 μg/mL à 12 μg/mL.
Le tableau suivant résume la procédure à suivre :
H2 O
Etalon
(1.4 mg/mL)
μL
μL
Quantité de
protéine
par tube
μg
1
800.0
0
0
2
798.6
1.4
2
3
797.1
2.9
4
4
795.7
4.3
6
5
794.3
5.7
8
6
792.9
7.1
10
7
791.4
8.6
12
795
795
790
790
5
5
10
10
?
?
?
?
Tube
Echantillon
Test :

Ajouter 200 μL de réactif concentré (pas le même que lors des tests qualitatifs
précédents).

Agiter ou mélanger doucement par inversion du tube.

Attendre au moins 5 min (la densité optique varie en fonction du temps)

Lire la densité optique à 595 nm à l’aide du spectrophotomètre Shimadzu.
22

Tracez ensuite un graphique le l’absorbance à 595 nm en fonction de la quantité
de protéine pour les valeurs obtenues avec le BSA.

Déterminez la concentration de votre échantillon et du même coup, la quantité
totale de protéine purifiée.
Électrophorèse SDS-PAGE


Déposez-vos différentes fractions (5) dans des tubes eppendorf différents.
Chaque groupe doit préparer 0.4 mL de chaque fraction de la façon suivante
-
0,2 mL de l'échantillon;
0,2 mL du mélange Laemmli-Bleu ci-dessous (Laemmli 2X + bleu de
bromophénol)
Mélange Laemmli-Bleu :
Mélangez 2 mL de tampon Laemmli 2X avec 400 μL de bleu de bromophénol
0,05%.
o
Le bleu de bromophénol est un colorant dont la charge est négative
au pH de l'électrophorèse. Migrant plus vite que toute protéine, il sert
de traceur qui nous dépeint la progression de l'électrophorèse.

Chauffez vos échantillons à 100°C (bain sec) pour 5 minutes.

Vous êtes prêt à charger votre gel.
Le gel que vous allez utiliser sont des ‘Ready Gel’ à 10 puits de la compagnie Bio-Rad.
Ce sont des gels conventionnels (Tris-HCl) constitués d’un gel de concentration à 4%
d’acrylamide et d’un gradient allant de 4 à 15% en acrylamide pour le gel de séparation.
Les conditions d’électrophorèse sont les mêmes que vous avez utilisées dans d’autres
laboratoires. Vous utiliserez une cuve d’électrophorèse par 2 équipes.
Comment charger votre gel:
Comme mentionné plus haut, les échantillons contenant une forte teneur en sels ont
tendances à migrer de façon aberrante. Les fractions 1 (lysat total), 2 (filtrat) et 3
(lavage) seront donc isolées par des puits vides de façon à ce qu’elles n’altèrent pas la
migration de votre protéine purifiée:
23
Puit :
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Echantillon :
Lysat total
Vide
Filtrat
Lavage#1
Lavage#2
vide
Elution
Elution
Elution
Standard de poids
moléculaire
Volume (L)
10
--10
20
20
--10
20
30
15
Le standard de poids moléculaire utilisé est celui de Bio-Rad :
Le tampon de migration est constitué de glycine (192 mM), de Tris (25 mM) et SDS
(0.1%) à pH 8,3.

Faites migrer les protéines sous un courant de 200V pour la durée de
l'électrophorèse (environ 30 minutes).

Coupez le courant lorsque le bleu de bromophénol arrive près de l'extrémité
inférieure du gel de séparation.

Pour colorer le gel, placez le pendant 20 min dans une solution de Coomassie
Brillant Blue R-250 0.1% (P/V) dans de l'acide acétique 10% (V/V) et isopropanol
25% (V/V) (filtrée sur Whatman 1).
24

Transférez par la suite le gel traité au Coomassie Brillant Blue dans une solution
d'acide acétique 10%, isopropanol 10% dans le but de le décolorer, le fixer et le
conserver. Faites une première décoloration pendant 30 min.

Remplacez la solution et incubez toute la nuit avec agitation.

Une copie numérisée de votre gel vous sera remise le lendemain.

En tenant compte des volumes de chacune des fractions et de l’intensité relative
de la bande correspondant à la DsRed (environ 28,5 kDa), essayez d’estimer les
pertes encourues au cours du processus de purification.
Système inductible/rapporteur
À cette expérience ne reste qu’à doser l’activité SEAP de chacun des points
expérimentaux.

Pour ce faire, une autre plaque à 96 puits sera utilisée dans laquelle 40 L d’eau
distillée devront d’abord être ajouté aux puits de la nouvelle plaque à l’aide de la
pipette à canaux multiples.

Transférer 10 L de surnageant de chacun des puits expérimentaux devront et
dilués dans les puits correspondants (reproduire la plaque originale) contenant
les 40 L d’eau (dilution 1/5 des échantillons).

Ajouter ensuite 50 L de la solution contenant le substrat p-NPP (paranitrophenyl phosphate 20 mM, diethanolamine 1M, MgCl2 1 mM, pH 9,8) à
chacun des puits.

La plaque est immédiatement lue par un lecteur de plaque (Spectramax) à 405
nm à intervalles réguliers (30 secondes) pendant 3 minutes.
o
L’augmentation de l’absorbance avec le temps donne la vitesse de
réaction et est proportionnelle à la quantité de SEAP dans le surnageant
des différents points expérimentaux. Un fichier Excel contenant toute les
lectures d’absorbance aux différents temps vous sera remis (courriel ou
clé USB).

Tracer les graphiques de l’activité SEAP en fonction de la quantité de répresseur
transfecté et de la concentration d’inducteur (tétracycline) utilisée.
25
Détermination du taux de croissance cellulaire () et du temps de
doublement (td)

Comptez les cellules dans votre flacon de 250 mL.
o
Procédez comme précédemment en utilisant les solutions de bleu de
trypan et de Crystal violet. Comptez les 2 chambres de l’hémacymètre
pour avoir des duplicatas.

Notez bien les résultats.
Annexe Cartographie des plasmides utilisés en laboratoire
26