Rapport de stage Stage en animalerie de laboratoire à l

Master 1 Semestre 2, pharmacologie professionnel
Année universitaire 2008/2009
Mathieu SCHMITT
Rapport de stage
Stage en animalerie de laboratoire
à l’Institut de Physiologie et de Chimie
Biologique(IPCB)
Au sein de l’Institut des Neurosciences Cellulaires et Intégratives (INCI) CNRS UPR 3212
Unité d’enseignement :
Expérimentation animale
Souris CD-1
Tuteurs :
Mr ------ ------------Mr ---------- ---------
Chercheur CNRS (CR1), responsable de l’animalerie
Technicien en gestion d’élevage expérimental
À Mr ----------- ; responsable de l’UE
Remerciements
Souris C57BL/6
À Mr ------- ---------, chercheur CNRS, pour nous avoir accueillis au sein de l’animalerie et de
son équipe.
À Mr --------- --------, Technicien en gestion d’élevage expérimental, pour nous avoir montré
la technicité de son travail, l’organisation de l’animalerie, et pour ses conseils et son aide
pour accomplir ce stage.
Aux directeurs et chargés de recherche, doctorants et stagiaires, pour leurs explications sur
les études menées dans leurs instituts.
A tous, pour le temps qu’ils nous ont accordé.
IPCB (Institut de Physiologie et de Chimie Biologique)
Rapport de stage : animalerie de laboratoire
Sommaire
Pages
Introduction…………………………………………………………………………… 1
I.
Planning du stage et tâches réalisées………………………………………1
II. L’animalerie............................................................................................................ 2
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Présentation de l’animalerie…………………………………………. 2
Aspect législatif……………………………………………………… 2
Infrastructure………………………………………………………….2
Personnel…...........................................................................................3
Organisation d’une semaine de travail………………………………. 3
Budget………………………………………………………………... 3
Responsabilités, maintenance et travail de l’animalier……………….3
Hygiène et sécurité…………………………………………………... 4
8.1. Hygiène………………………………………………... 4
8.1.1. Habitude hygiéniste…………………………...4
8.1.2. Vétérinaire…………………………………… 4
8.1.3. Traitement de l’air……………………………. 4
8.1.4. Laverie……………………………………….. 4
8.2. Sécurité…………………………………………………….. 4
9.
Animaux……………………………………………………………... 5
9.1. Espèces…………………………………………………... 5
9.1.1 Rats…………………………………………….. 5
9.1.2. Souris………………………………………….. 5
9.1.3. Xenopus Laevis………………………………… 5
9.2. Fournisseur………………………………………………. 5
9.3. Condition d’hébergement………………………………... 6
9.3.1. Cages…………………………………………...6
9.3.2. Litière et biberons…………………………........ 6
9.3.3. Nourritures……………………………………. 6
9.4. Stabulation des rongeurs…………………………………. 7
Equipes et thèmes de recherche………………………………………. 7
10.1. Equipes et rongeurs…………………………………….. 7
10.2. Recherche et modèles utilisés………………………….. 7
10.
III.
Fiches de procédure....................................................................................... 8
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Sexage des rats et souris……………………………………………...
8
Baguage……………………………………………………………....8
Reproduction………………………………………………………….
8
Euthanasie des animaux………………………………………………
8
Gestion des déchets…...........................................................................
8
Registre des mouvements d’animaux et registre des visites.................
9
Génotypage ……………………………………………………....…..
9
Rapport de stage : animalerie de laboratoire
8. PCR…...................................................................................................
9. Souris transgénique …………………………………………………..
9
10
Conclusion……………………………………………………………………………........ 10
Annexe
Introduction
L’unité d’enseignement d’expérimentation animale, nous a donné l’opportunité d’effectuer un stage au sein de
l’animalerie de l’IPCB (Institut de Physiologie et de Chimie Biologique). Une animalerie est un bâtiment ou une
partie d’un bâtiment spécialement aménagé pour recevoir ou héberger des animaux dans les conditions optimums à
chaque espèce. C’est un lieu qui permet l’expérimentation animale dans les meilleures conditions pour l’animal, le
personnel et l’expérimentateur. Nous verrons dans ce rapport comment mettre en relation cette définition au travers
des différents points abordés tels que l’organisation, le travail effectué par l’animalier, les espèces ainsi que leurs
méthodes d’entretien et les équipes et ses thèmes de recherche.
I.
Planning du stage et tâches réalisées
Description heure par heure des tâches effectuées pendant la semaine de stage du 20 avril jusqu’au 24 avril. On
observe que certaines de nos taches sont répétitives comme le lavage et change des cages et le remplacement des
biberons vides mais d’autres le sont moins comme la technique génotypage et de reproduction des souris et des rats.
Lundi 20 avril :
8h30 - 9h00 : visite de l’animalerie.
9h00 - 9h20 : présentation de la technique et de l’organisation de la reproduction des rats Sprague-Dawley.
9h30 - 9h40 : préparation des biberons pour les rats en reproduction.
9h40 - 11h30 : lavage des cages et séchage (entrecouper par les autres tâches suivantes).
9h40 - 10h15 : fin de la présentation de la reproduction des rats et change des cages.
10h15 - 10h45 : pause café, mise au point technique de Mr -------- avec Mr -------- sur la mise en conformité du
confinement des souris transgéniques pour le nouvel agrément (demande de bas de porte pour éviter que des souris
ne s’échappent) et discussion sur la mise en place d’un minuteur électrique
10h45 - 11h00 : vidage des cages dans la poubelle et dépôt des poubelles à la benne
10h55 - 11h30 : présentation de la reproduction et de l’organisation des souris transgéniques
11h30 - 12h00 : explications techniques sur la généalogie des souches pour éviter la consanguinité
Mardi 21 avril
8h30 - 8h50 : préparation des biberons pour les rats et les souris neuropathiques
8h50 - 9h30 : change des cages des rats de la salle de rat d’expérience de recherche
9h00 - 12h00 : lavage de ces cages
9h30 - 10h10 : Préparation des cages, remplissage de sciure
10h10 - 10h30 : pause café et discussion sur la mise en place des cages
10h30 - 11h00 : mise en place des rats avec la nourriture de composition inconnue
11h00 - 11h30 : discussion avec Viviane PALLAGE sur ses techniques de recherche et sur l’animalerie
11h30 - 11h45 : visite de la salle de télémétrie
12h00 - 13h00 : pause déjeuner
13h00 - 15h00 : euthanasie de souris aux CO2, explication et bagage des souris, explication et préparation sur le
génotypage, coupe de queue pour futur extraction de l’ADN
15h00 - 15h30 : lavage des cages
15h30 - 16h00 : explication sur le budget et financement de l’animalerie, des différentes unités de recherche de
l’IPCB affilié à l’animalerie
Mercredi 22 avril
8h30 - 9h30 : change des cages et des biberons des souris de la salle de reproduction
9h30 - 10h30 : démonstration et explication de la technique de Von Frey par l’équipe de MR -------10h30 – 11h30 : remplissage des cages des souris
11h30 – 12h00 : reproduction des souris et discussion sur la technique.
Jeudi 23 avril
8h30 - 9h30 : lavage des cages de la salle de reproduction des rats
Rapport de stage : animalerie de laboratoire
1
9h30 - 10h30 : extraction de l’ADN de la queue de souris sevrées en reproduction pour le génotypage
10h30 - 10h45 : préparation des conteneurs à cadavre des souris et rats congelés pour la récupération par la société
SITAL.
10h45 - 11h00 : vérification des naissances des souris en reproduction
11h00 - 11h30 : préparation et lancement de la PCR (réaction de polymérisation en chaine) de l’ADN extrait
11h30 - 12h00 : préparation des cages, remplissage de sciure
Vendredi 24 avril
9h00 - 9h30 : changement des cages des rats des salles utilisés en travaux pratique et de recherche
1
9h30 - 10h00 : lavage des cages des rats
10h00 - 10h20 : pause café
10h20 - 11h00 : préparation à partir des échantillons de PCR et lancement du Southern Blot pour le génotypage
11h00 - 11h30 : préparation des cages, remplissage de sciure et nettoyage de la laverie
11h30 - 12h00 : dernière mise au point sur le fonctionnement d’une animalerie et analyses des gels de génotypage
II.
L’animalerie
1. Présentation de l’animalerie
L’animalerie de l’IPCB est une animalerie agréée par les services vétérinaires du Bas-Rhin ainsi que par le
ministère. Elle est sous la direction de l’INCI (Institut de Neurosciences Cellulaires et Intégratives) dont la directrice
est Mme Marie-France Bader. Seul le département Nociception et Douleur de l’IPCB utilise l’animalerie, ce
département est sous la responsabilité de Mr ----------. L’animalerie est quant à elle sous la responsabilité de Mr -----------. Nous avons travaillé avec Mr -----------, le technicien en gestion d’élevage expérimental (figure 1 :
organigramme).
2. Aspect législatif
La pratique de l’expérimentation animale est encadrée par diverses dispositions légales relatives au mode
d’agrément des expérimentateurs, à la formation des personnels et la provenance des animaux. L’agrément est donné
après visite par la direction des services vétérinaires du département d’implantation du laboratoire, accompagnée
d’un représentant d’un ministère de tutelle. La validité de l’agrément est de 5 ans et pour des espèces données. Ils
vérifient que l’installation est conçue de manière à assurer un environnement approprié aux espèces qui y sont logés.
Il veille a ce que tout soit conforme à la législation ; séparation des espèces animales, matériaux de l’infrastructure,
salle d’expérimentation, taille des cages, méthode d’élimination des cadavres, etc (Textes réglementaires : décret
2001-131 du 6 février 2001 adopté à Strasbourg le 18 mars 1986).
Il est aussi souhaitable que l’aspect éthique fasse l’objet d’une attention particulière de la part de
l’expérimentateur comme éviter simplement le langage particulier, gestes, photos qui peuvent choquer. Il faut veiller
à faire attention à l’origine, les conditions de transport et les hébergements des animaux ainsi que les méthodes
d’euthanasies.
La animalerie est classé en niveau A1 c'est-à-dire qu’elle est conventionnelle avec des dispositifs empêchant
la dissémination des animaux dans l’environnement selon l’espèce concernée et que les animaux sont simplement
éliminés en fin d’expériences.
3. Infrastructure (voir annexe plan figure 2 plan de l’animalerie)
L’animalerie se situe au sous-sol de l’IPCB, elle se compose de 17 salles et 2 couloirs.
-
-
Bureau ( figure 3)
Salle de laverie des blouses, du système de traitement de l’air et de l’eau et un congélateur pour les cadavres
Salle de travaux pratiques ; chirurgie et euthanasie (figure 4)
Salle d’hébergement de souris en cycle inversé
Salle d’hébergement de souris neuropathiques (figure 5)
2 salles d’expérimentation avec l’hébergement de rats (figure 6) + 1 salle d’expérimentation de télémétrie +
1 salle d’expérimentation de plaques chaudes +1 salle d’expérimentation pour la technique de Von Frey
1 salle de reproduction des rats + 1 salle de reproduction des souris transgéniques (figure7)
1 salle de lavage des cages et biberon avec des emplacements de cages sale (figure 8), des éviers (figure 9)
pour le remplissage des biberons et une machine à laver + 1 salle propre avec des portoir à cage pour le
séchage (figure 10), de stockage des cages et grille (figure 11) et comportant le bac à sciure
1 couloir sale et 1 couloir propre
Rapport de stage : animalerie de laboratoire
- Salle d’hébergement des Xenopus laevis de Mr Philippe CARBON
Les salles sont bien séparées les une des autres pour éviter que les odeurs des souris perturbent les rats et
inversement. Le bruit doit être atténué au maximum grâce à des murs insonorisés et des portes fermé pour éviter de
troubler les animaux.
4. Personnel
2
Le personnel de l’animalerie est seulement constitué de Mr --------------, technicien en gestion d’élevage
expérimentale. Il assure à lui seul toutes les taches de changes des cages, de maintenance et de nettoyage de
l’animalerie. Il détient une habilitation de niveau 2 qui lui permet de participer directement aux expériences. Mais la
charge de travail que nécessite la gestion de l’animalerie, l’empêche de participer actuellement aux expérimentations.
Il manque pour le moment du personnel puisque l’agent principal en animalerie est actuellement en arrêt maladie
mais cela va être résolu sous peu. Il est donc nécessaire d’avoir au moins 2 personnes pour s’occuper de cette
animalerie.
Les chercheurs, ingénieurs et techniciens doivent être titulaires d’une autorisation nominative d’expérimenter
sur l’animal de niveau 2 (ou niveau 1) ou doivent pratiquer l’expérimentation sous la direction et le contrôle d’une
personne elle-même titulaire
5. Organisation d’une semaine de travail
Le planning de l’animalier est assez semblable chaque semaine comme nous pouvons le voir ci-dessous,
néanmoins le génotypage est fait selon la charge de travail. Le travail débute à 7 heures du matin pour se terminer à
16 heures entrecoupé d’une pose déjeuner d’une heure.
Matin
Apresmidi
Lundi
Mardi
Mercredi
Jeudi
Change cages des
rats de la salle de
reproduction
Change cages
des rats de
travaux pratiques
et de recherche
Changes cages
des souris
transgéniques en
reproduction
Change cages des
rats de la salle de
reproduction
Selon
les
jours
Vendredi
Change cages
des rats de
travaux pratiques
et de recherche
Nettoyage de la
laverie
Comptage des
animaux
Lavage des cages et séchage sur le portoir
Remplissage des cages sèches et remise dans leurs pièces respectives
Préparation éventuelles des nouveaux arrivages
Préparation éventuels des nouveaux arrivages
Vérification des naissances et décès des souriceaux et ratons des salles de reproduction
Sevrage des souris suivant le planning et notification sur le registre entrées-sorties, marquage
Génotypage des souris sevrées, extraction de l’ADN, PCR et Sourthern- Blot
Les rats sont changés 2 fois par semaine alors que les souris ne sont changées qu’une fois par semaine.
6. Budget
Le budget annuel moyen de l’animalerie est d’environ 15000 euros par an. Il comprend entre autre l’achat
pour 6000 euros de litière et de nourriture, de 4600 euros d’équipements, 3750 euros pour les réparations, le
chauffage et l’entretien (gant, produit nettoyant pour la machine à laver…).
Les animaux sont payés par les équipes de recherche ainsi que les animaux de TP qui sont payés par l’UDS. Chaque
équipe doit payer l’entretien de ses rongeurs et afin de mieux déterminer ce coût, chaque semaine le nombre
d’animaux est compté pour faire une moyenne annuelle. Le financement de l’animalerie est donc supporté par le
CNRS puisque l’INCI en fait partie. Le personnel est quant à lui directement payé par le CNRS.
L’entretien d’une souris vaut 1 euro/semaine et un rat 1,3 euro semaine. Il est nécessaire de calculer le coût
de l’entretien. Cela permet de rendre compte qu’il vaut mieux éviter de faire trop de reproduction. La commande de
rongeurs coute souvent moins chère que l’élevage.
7. Responsabilité, maintenance et travail de l’animalier
Rapport de stage : animalerie de laboratoire
L’animalier est responsable de la maintenance et suivi des populations d’animaux, du suivi de la
reproduction des différentes souches. Il s’occupe du suivi sanitaire des animaux et des soins à leurs apporter. Il tient
les registres pour la gestion des flux d’entrée et sortie. Il entretien le matériel (cages, biberons) et les locaux,
renouvelle les litières, la nourriture et la boisson. Il doit surveiller les paramètres environnementaux (température et
hygrométrie), les stocks des produits (aliments, litière et produits de nettoyage) et les déchets. Il doit être en mesure
de fournir la traçabilité des animaux et de savoir effectuer le génotypage et l’euthanasie.
8. Hygiène et sécurité
8.1. Hygiène
8.1.1. Habitude hygiéniste
3
L’hygiène d’une animalerie doit être irréprochable. C’est pour cela qu’il y a de nombreuses règles : porter une
blouse, se laver souvent les mains, utiliser des gants lors des manipulations et le changement de cages et ne pas
manger, ni boire dans l’animalerie. Le masque et les surchaussures sont optionnels mais conseillés.
Il faut désinfecter l’animalerie une fois par semaine en nettoyant les sols, les étagères à cage et les différents
équipements. Les sols sont en vinyle (lés plastique) pour la majeure partie des pièces d’expérimentation. Le couloir
sale et la laverie sont carrelés. Ces revêtements permettent un bon nettoyage et une bonne désinfection. Certains
murs des salles d’expérimentation sont nouvellement peints et les angles sont à gorge arrondie pour un meilleur
nettoyage
La désignation d’un couloir propre (figure 12) et sale (figure 13) permet d’éviter le transport de germe au sein
des salles d’expérimentation et il est nécessaire d’appliquer la bonne pratique des passages. De plus, l’entré par
badge ne se fait que par le couloir propre, ceci évite que des personnes passent par le couloir sale.
8.1.2. Vétérinaire
L’animalerie a un vétérinaire référent Sophie REIBEL travaillant pour l’animalerie du centre de neurochimie.
Elle intervient en cas de problème d’infection de souris mais cela semble plutôt rare. Depuis l’arriver de Mr ------------, il y a un peu moins de 5 ans, aucun cas d’infection n’a été constatée. Néanmoins, elle peut mettre en place un rat
sentinelle qui permet de vérifier de temps en temps qu’il n’y a pas de germes.
8.1.3. Traitement de l’air
L’air est constamment renouvelé (8 à 20 le volume d’air par heure) par le système de climatisation (figure 14), ce qui
permet d’obtenir une température optimale, de filtrer l’air pour éviter que des agents pathogènes ne rentrent dans
l’animalerie, de réduire les odeurs, les gaz toxiques et les poussières. Deux bouches d’aération sont situées dans
chaque salle, une pour l’extraction et une pour l’arrivée d’air, positionnées d’un côté et de l’autre de la pièce. Cette
disposition permet une meilleure circulation de l’air que celle avec une simple bouche d’aération.
De plus, deux humidificateurs reliés aux systèmes de traitement de l’air permettent de maintenir une humidité de
l’air optimale.
Les locaux sont en surpression grâce au système de traitement de l’air. La surpression permet de créer un
flux d’air constant vers l’extérieur. Cela évite que l’air rentre quand une porte est ouverte ou par le manque
d’étanchéité des locaux qui est nécessaire afin que des germes pathogènes ne puissent pas contaminer les rongeurs. Il
est indispensable que les portes de l’animalerie restent fermées pour maintenir la surpression.
8.1.4. Laverie
La machine à laver (figure 15) utilise des produits désinfectants et lave à l’eau à 90°C ce qui permet de
détruire des germes pathogènes des cages, des biberons et des grilles des cages. La laverie est considérée comme sale
et est séparée de la salle propre. Les déchets des cages sont jetés dans la poubelle située dans la laverie. La salle
propre comporte des portoirs de séchage à cage, un bac à sciure et un stockage des cages, grilles, portoirs à étiquette
et etc.
8.2. Sécurité
La disposition d’accès sélectifs et leur maintient est essentielle malgré les contraintes qu’elle engendre. La
première sécurité sont les portes métalliques pour éviter les effractions. Ensuite, il y a un système à badge
électronique (figure 16) qu’il faut avoir pour passer les portes métalliques ainsi que les portes qui mènent à chaque
Rapport de stage : animalerie de laboratoire
salle d’expérimentation et de reproduction. Seul le personnel habilité (animaliers, chercheurs, doctorants….) est
autorisé à pénétrer dans l’animalerie. De plus, Mr -------- peut connaitre grâce aux badges toutes les entrées dans
l’animalerie ce qui peut être utile en cas de problème (disparation de rongeur ou matériel).
Des détecteurs de fumé et des extincteurs sont disposés à divers endroits dans l’animalerie pour éviter les
incendies.
Il faut aussi connaitre les consignes de sécurité, d’évacuation et de
conduite à tenir en cas d’accident.
9. Animaux
9.1. Espèces
9.1.1. Rats
L’animalerie héberge en moyenne environ 300 rats qui pèsent environ
250 à 300 grammes avec une espérance de vie 3,5 ans. Leur fertilité est de 350 à
440 jours et ils sont fertiles au bout de 65 jours à 110 jours (La maturité chez le
male est de 5 semaines et chez la femelle de 6 à 8 semaines), la gestation dure de
20 à 22 jours avec un sevrage de 21 jours. Les portées (figure 17) sont en
moyenne de 10 ratons. Il faut compter en moyenne 5- 6g/100g/jour de nourriture
Les souches de l’animalerie sont :
Wistar : recherche et travaux pratiques
Sprague-Dawley: reproduction(figure 18)
9.1.2. Souris
Classification classique : rat
Règne 4
Sous-règne
Embranchement
Sous-embr.
Classe
Sous-classe
Infra-classe
Ordre
Sous-ordre
Famille
Sous-famille
Genre
Animalia
Metazoa
Chordata
Vertebrata
Mammalia
Theria
Eutheria
Rodentia
Myomorpha
Muridae
Murinae
Rattus
Classification classique : souris
L’animalerie héberge en moyenne 800 souris qui pèsent environ 20 à 40
grammes, mesurent de 14,5 à 18,5 cm (queue de longueur de 7-9 cm) avec une
espérance de vie de 18 mois à 3 ans. Leur fertilité est de 7 à 12 mois et elles
sont fertiles au bout de 50 jours, la gestation dure 19 à 21 jours avec un sevrage
entre 21 à 28 jours. Les portées sont en moyenne de 11 souriceaux (jusqu'à 15
souriceaux) pour l’espèce de CD1 de type albinos et en moyenne 6 pour l’espèce
C57BL/6 (figure 19) de pelage noir. Il faut compter en moyenne 3 -5g/jour de
nourriture.
La barbering (figure 20) est un phénomène souvent observé chez les
souris. La souris épile le museau ou le dos de sa congénère, à ne pas confondre
avec un problème sanitaire.
Règne
Embranchement
Animalia
Chordata
Sous-embr.
Classe
Cohorte
Ordre
Vertebrata
Mammalia
Euarchontoglires
Rodentia
Sous-ordre
Myomorpha
Famille
Muridae
Sous-famille
Murinae
Genre
Mus
Sous-genre
Mus (Mus)
Les souches sauvages sont les CD1 et C57BL/6
Les souches transgéniques :
 C57B/6 CrelacZ exprimant le gène de la beta-galactosidase : -Dont Storm avec une expression de base faible
-Dont Yin avec une expression de base forte
 C57BL/6 knock-out(KO) de pour le récepteur β2-nicotinique
 C57BL/6 knock-out(KO) de pour le récepteur β2-adrénergique
 C57BL/6 knock-out(KO) de pour le récepteur delta(Δ) au opioïde
 C57BL/6 knock-out(KO) de pour le récepteur mu(µ) au opioïde
 C57BL/6 ayant une mutation de leptine et sont déficiente : souche obèse (Ob-/Ob-) (figure 21)
 C57BL/6 ayant une mutation pour le récepteur à la leptine : souche diabétique de type de 2 (Db-/Db-)
 C57BL/6 ayant l’acétylcholinestérase est couplé à la GFP, CHAT-GFP
 CD1 floxed pour le BDNF (facteur neurotrophique dérivé du cerveau), a un rôle dans la plasticité neuronale
Les souris obèses (Ob-/Ob-) et les souris diabétiques (Db-/Db-) nécessitent un changement de la cage en plus
puisqu’elles sont sales beaucoup plus vite. Les souris obèses à cause de leurs excrétions abondantes et les souris
diabétiques à cause de leurs urines.
Les souris transgénique sont classées en niveau 1, ce sont des animaux abritant un gène ne leur conférant aucun
effet nuisible connu pour l’homme ou l’environnement.
9.1.3. Xenopus laevis (figure 22)
Rapport de stage : animalerie de laboratoire
Nous décrirons sommairement cette espèce puisqu’elle n’est pas sous la responsabilité de l’animalier mais
sous celle de Mr philippe CARBON (professeur de l’UDS). Ce sont des grenouilles d’origine africaine dit Xenope
du Cap utilisées essentiellement pour les travaux pratiques des étudiants.
9.2. Fournisseurs
Les commandes d’animaux se font auprès de fournisseurs agréés comme l’élevage Janvier ou l’élevage
Charle River Laboratories. Les rongeurs commandés sont transportés par camion climatisé et partent la veille pour
arriver le jour suivant. Ils sont conditionnés dans une boite en carton (figure 23) avec de la nourriture et de l’eau sous
forme de gel (figure 24). Il faut savoir qu’une souris CD1 vaut environ 2,80 euro et C57B6 vaut environ 11,6 euros,
la différence de prix est peut être une raison importante dans le choix du modèle (voir thème de recherche).
Concernant les souris transgéniques, elles proviennent de l’IGBMC.
9.3. Condition de d’hébergement
5
9.3.1. Cages (figure 25)
La cage est en plastique transparent (polyéthylène) pour mieux observer les animaux en cas de problème
(problème de comportement, mort d’un rongeur, etc). Elle est surmontée d’une grille métallique ayant un à deux
réceptacles à biberon et un réceptacle à nourriture. La législation impose une surface minimale par espèce/poids qui
est à respecter voir ci-dessous
Surface des cages de l’animalerie
Espèce
Rat
Rat en
Taille cage
individuelle
groupe
Hauteur (cm)
19
20,5
Souris
13
Longueur (cm)
37
45
27
Largeur (cm)
21
34
16
Surface (cm²)
Nombre d’animaux
par cage
780
1530
430
/
4 maximun
5 maximun
Surface minimale par animal que prévoit la
législation
Souris
Rat
Hauteur : 12cm
Hauteur : 18cm
< 20g
60cm²
< 200g
200cm²
20-25g
70cm²
200-300g
250cm²
25-30g
80cm²
300-400g
350cm²
>30g
100cm²
400-600g
450cm²
> 600g
600cm²
Il faut faire attention à ne pas dépasser le nombre d’animaux prévu par la législation, la cage pour les rats en
groupe permet par exemple d’en avoir 6 d’environ 250g. Les rats dépassent rarement les 400g, ce qui permet
d’avoir 4 rats par cage, l’animalerie est en conformité avec la législation. Concernant les cages individuelles, dans
tous les cas l’animalerie est en conformité avec la législation puisque cette cage dispose de 780cm² et un rat de 600g
doit avoir 600cm². Pour les cages des souris, elles permettent par exemple d’avoir 4 souris de maximum de 30g ou 6
souris d’un maximum de 25g ce qui est la moyenne d’une souris. L’animalerie est donc en conformité.
9.3.2. Litière et biberons (figure 26)
Macronutriment
Protéine
Acide gras (a.g)
Fibre
Energie
métabolisable
Calories des
protéines
Rapport de stage : animalerie de laboratoire
2018
18.8%
6.0%
3.8%
3.3 kcal/g
13.7 MJ/kg
2019
19.2%
9.0%
2.8%
3.4 kcal/g
14.7 MJ/kg
23%
20%
La litière est commandée par l’animalerie de la
neurochimie. C’est une litière d’épicéa dépoussiérée pour
éviter des problèmes respiratoires aux animaux et elle est aussi
plus hygiénique, elle provient du fournisseur SAFE.
Calories des a.g
Calories des
carbohydrates
17%
23%
60%
57%
Les biberons ont une contenance d’environ 500 mL pour les rats et d’environ 250 mL pour les souris. Ils sont
remplacés, nettoyés et remplis avec de l’eau qui a été filtrée surtout pour éliminer le calcaire. Cela est fait une fois
par semaine en même temps que le changement de cage. Ils y a 2 biberons par cage quand il y a plus de 2 rats sinon
la présence d’un biberon suffit. Concernant les souris, il y a toujours un seul biberon.
9.3.3. Nourritures
La nourriture est commandée chez HARLAN et est fabriquée à partir de farine de blé, de soja, d’huile de
soja supplémentée en acides aminés, minéraux et vitamines. Elle se présente sous forme de cylindres secs (pellet) et
il utilise deux types de compositions différentes de nourriture. La nourriture de référence 2018 est utilisée pour
l’entretien normal des rongeurs et la référence 2019 pour les souris en reproduction. La référence 2019 a une
concentration en protéine plus importante. Les souris en reproduction sont sensibles au taux de protéine, souvent les
femelles mangent leurs souriceaux pour récupérer des protéines qui leurs sont essentielles (il semblerait aussi que les
femelles trop jeunes ne comprennent pas que c’est leur progéniture). Cette nourriture riche est aussi nécessaire pour
la gestation, la lactation et la croissance. La nourriture est stockée dans des conteneurs (figure 27) avec un
récupérateur de poussière ce qui évite aussi de rajouter des poussières dans les cages. Deux autres nourritures sont
utilisées pour des expériences mais on ne connait pas la composition (figure 28 et 29).
Tableau de la composition générale, pour plus d’information voir :
Référence 2019 :
http://www.harlan.com/research_models_and_services/laboratory_animal_diets/teklad_global_diets/global_rodent_diets/teklad_global_19_protein_rodent_diet_
2019.hl
Référence 2018 :
http://www.harlan.com/research_models_and_services/laboratory_animal_diets/teklad_global_diets/global_rodent_diets/teklad_global_18_protein_rodent_diet_
6
2018.hl
9.4. Stabulation des rongeurs
Les rongeurs ont un cycle nycthéméral de 12h de jours/12 heures de nuit. Les rongeurs sont surtout actifs la nuit et
dorment la journée. La lumière artificielle s’allume à 7 heures pour s’éteindre à 19 heures.
La température pour le confort optimal des rongeurs se situe entre 20 et 24°C. L’humidité doit être maintenue 55%
plus ou moins 10 % (figure 30).
10. Equipes et thèmes de recherche
10.1. Equipes et rongeurs
Le principal département de l’INCI utilisant les locaux est celui de la nociception et douleur comportant les équipes :
Equipe de Mme Marie-José FREUND-MERCIER, approche anatomo-fonctionnelle de la douleur chronique et
son traitement :
Quantité d’animaux : 629 souris transgéniques (souche C57BL/6), KO DOR, KO MOR, Db-/Db-, Ob-/Ob-…etc
Equipe de Mr Rémy SCHLICHTER, signalisation nociceptive dans la moelle épinière:
Quantité d’animaux : Rat en reproduction 68 rats (Sprague-dawley) et 95 souris CHAT-GFP (souche C57BL/6),
utilisation des ratons et souriceaux.
C’est pour cela qu’il n’est parfois pas possible de commander malgré un coût moins élevé mais nécessite la
reproduction de rat pour le prélèvement des ratons à quelques semaines.
Equipe de Pierrick POISBEAU, exploration fonctionnelle douleur :
Quantité d’animaux : 57 rats et 148 souris, rats Wistar et souris C57BL/6 avec un Cuff (voir suite)
Les travaux pratiques des étudiants nécessitent en moyenne 12 rats de souche Wistar.
10.2. Recherche et exemples modèles utilisés
La douleur neuropathique est une douleur chronique qui résulte d’un dommage ou d’un dysfonctionnement
du système nerveux. Les cliniciens utilisent en première ligne de traitement des antidépresseurs ou des
Rapport de stage : animalerie de laboratoire
anticonvulsivants, efficaces en traitement chronique mais dont le délai d’action thérapeutique nécessite plusieurs
jours de traitement. Ce phénomène suggère que l’action de ces drogues implique une plasticité du système
nociceptif. Ils travaillent à modéliser et étudier les interrelations entre douleur et troubles de l’humeur et les
mécanismes d'action par lesquels les traitements actuels de la douleur neuropathique exercent leur effet
thérapeutique. Nous avons pu observer et discuter avec quelques chercheurs de leurs études menées et leurs
techniques utilisées au sein de l’animalerie.
Le stagiaire de master 2 Eric SALVAT travaille sur les souris C57B6. Ils isolent le nerf sciatique et place un
manchon de silicone (Cuff) ce qui induit une neuropathie. La neuropathie est une douleur consécutive à lésion
somato-senrorielle. Elle est souvent due à un traumatisme, à l’obésité, au diabète ou à une chimiothérapie. Ils ont
donc aussi choisi des souris obèses (souche Ob-/Ob-), des souris diabétiques (Db-/Db-) et des souris sous
chimiothérapie. Ces souris présentent aussi des neuropathies. Ils injectent des anticonvulsivants, des antiinflammatoires et des anesthésiques et regardent leurs effets sur les douleurs neuropathiques. Pour cela, ils utilisent
la technique de Von Frey.
La doctorante Nada CHOUCAIR-JAAFAR étudie l’effet de β-mimétique dans l’allodynie neuropathique.
L’étude de substances pharmacologiques (paroxetine ; inhibiteur de la recapture de la sérotonine, reboxetine ;
inhibiteur de la recapture de la noradrénaline) a permis de mettre en évidence l’importance du récepteur β2 dans
l’allodynie neuropathique. L’antagoniste de ces récepteurs, le salbutamol (Ventoline®), serait envisagé comme
traitement à la place de la nortryptiline qui a plus des effets secondaires. Pour avoir ces résultats, elle a utilisé la
technique de Von Frey et grâce au souris KO pour le récepteur β2-adrénergique. Elle va aussi commencer les études
avec la technique de plaque chaude
La doctorante Marie PREVOT a pour but de remplacement la souche de souris C57BL/6 par la souche de
souris de CD1 qui a un coût d’achat moins élevé. Elle procède aux mêmes études de neuropathie que les autres
chercheurs sur cette souche en comparaison au C57BL/6 pour ainsi vérifier le modèle.
La technique Von Frey demande un jeu de 20 filaments de diamètres différents qui sont
7 appliquées contre la
patte avec un angle droit. La force d'application augmente tant que le chercheur poursuit le mouvement de pression,
jusqu'à ce que le filament fléchisse. La poursuite du mouvement de pression augmente la flexion mais pas la force
d'application. Plus l’allodynie de la neuropathie est élevée, plus vite la souris retirera la patte à des forces de pression
faible exercées par le filament de Von Frey. On pourra déterminer si les molécules induisent donc une baisse de
l’allodynie.
III.
Fiches de procédure
1. Sexage rats et souris
Le sexage consiste à déterminer le sexe de chaque raton et souris. On peut faire la différence avant même que
les petits soient séparés de leur mère. Dès les jours qui suivent la naissance, il est possible de déterminer le sexe des
bébés.
Pour ce faire, il est judicieux de prendre les ratons et les souris deux par deux, afin de comparer visuellement
les distances uro-génitales et de déterminer le sexe. Si l'espace est grand, il s'agit d'un mâle. Ceci devient cependant
plus facile après la première semaine. Chez les femelles, la distance entre l'anus et le vagin qui est placés en dessous
de l'urètre est plus courte (figure 31, 32, 33, 34).
2. Baguage
Ceci consiste en une fixation d’une bague numéroté (figure 35) dans l’oreille de l’animal. La bague est fixe
dans le cartilage afin d’éviter qu’elle ne tombe ou que l’animal l’attrape et ne puisse l’arrache. Le baguage se fait à 3
semaines suite au sevrage, et ceci permet alors une identification simple et rapide de l’animal. Le baguage se fait en
même temps que le génotypage.
3. Reproduction
Chez les rats
La saison de reproduction dure toute l'année. La maturité sexuelle est atteinte à 5 semaines chez les mâles, 6
à 8 semaines chez les femelles. Dans une cage on place 1 ou 2 mâles et 2 ou 3 femelles ceci pendant plusieurs jours,
par la suite la femelle est isolée.
Rapport de stage : animalerie de laboratoire
Après une gestation de 21 à 24 jours, la mère donne naissance à un nombre moyen de 6 à 14 petits (2 à 18 possible)
qui ouvriront les yeux à 15 jours et qui seront sevrés vers 21 jours. Les rates sont mises en reproduction au maximum
3 fois puis elles seront euthanasiées.
Chez les souris
La saison de reproduction dure également toute l’année. La maturité sexuelle est atteinte à 6 semaines. Dans
la cage on place un mâle hétérozygote et une femelle hétérozygote mais le couple d’animaux reste ensemble même
lorsque la femelle a mis bas. Cela nous permet d’avoir des animaux de souche sauvage qui seront euthanasié, des
hétérozygotes pour la reproduction et des males homozygotes pour les expériences. Les femelles homozygotes sont
euthanasiées. La période de gestation dure de 18 à 21 jours et une portée peut donner de 5 à12 petits. Le sevrage à
lieu 4 semaines après la mise bas, la souris peut de nouveau être fécondée toutes les 6 semaines. Il faut éviter la
consanguinité dans la reproduction grâce à des tableaux de généalogie.
4. Euthanasie des animaux
Les souris et les rats sont euthanasiés par asphyxie. On met dans une cage en plexiglas 5 à 6 animaux, on
pose sur la cage une plaque transparentes qui comporte un orifice dans lequel on insert un tuyau. Le CO2 est alors
libéré dans la cage ce qui provoque une diminution en O2 dans l’air, les animaux meurent alors d’asphyxie.
L’avantage de ce procédé est que les animaux ne soufrent pas, c’est rapide, propre et peu couteux. La deuxième
technique utilisée souvent dans le cas de souris malades consiste à une élongation des cervicales par maintient de la
nuque et en tirant la queue.
5. Gestion des déchets
Les cadavres d’animaux sont stockés dans un congélateur. Une fois remplis la société SITAL passe récupérer
les containers pour détruire ces déchets pas crémation.
Le décret n°97 du 6 novembre 1997 sur les déchets d’activité à risque infectieux et assimilés oblige à stocker les
animaux euthanasiés entre 0° et 5°C et de les éliminer sous 8 jours ou alors de les congeler et de les évacuer
régulièrement.
6. Registre des mouvements d’animaux et registre des visites
8
Avant l’ouverture d’une animalerie, le registre de l’animalerie doit être visé par le Commissaire de Police ou
le Préfet. En tête du registre il doit figurer le nom de l’établissement, la nature des activités exercées, le nom du
directeur de l’établissement, le nom et la qualification de la personne assurant la responsabilité de l’entretien des
animaux hébergés. Tout événement de sortie ou d’entrée d’animaux doit être inscrit dans le registre afin que les
autorités compétentes (service vétérinaire) et le vétérinaire référent puissent les vérifier.
Il existe aussi un registre des visites pour y noter les blessures, mortalité anormale, les pannes diverses et les
traitements apportés aux animaux.
7. Génotypage
C’est une technique qui consiste à déterminer l’identité génétique d’un animal. Ce procédé a lieu après le
sevrage c’est-à-dire à 21 jours. Pour cela on récupère un fragment de queue de 0,5cm, afin d’extraire de l’ADN des
cellules puis l’ADN sera isolé et amplifier par PCR. L’ADN extrait va migrer sous l’action d’un champ électrique
pour séparer les molécules en fonction de leur taille et ceci afin de vérifier la présence de gènes modifiés.
Protocole expérimental -Tampon nécessaire TENS : solution de digestion
-Tris-HCL 1M (pH 8,5)
-EDTA 0,5M (pH 8)
-NaCl 5M
-SDS 10%
-H20
: 50mM
: 5mM
: 200mM
: 0,5%
:
Pour 10ml
0,5ml
0,1ml
0,4ml
0,5ml
8,5ml
Pour 50ml
2,5ml
0,5ml
2 ml
2,5ml
42,5ml
Nb:
1) Toutes les solutions sont
filtrées et autoclavées
2) La présence de SDS augmente
l’activité de la protéinase K.
La présence de tween 20 dans la
PCR est censée inhiber l’activité
du SDS.
- Préparer la protéinase K : faire une solution mère à 10µg/µl et ajouter 20µl dans chacun des tubes de 500µl.
- Prélever l’extrémité des queues de souris (0.5 cm) et les déposer dans un tube ependorff de 1,5ml puis ajouter
500µl de TENS + 20l ProtK et placer tous les tubes dans un incubateur à 55°C toute la nuit.
Rapport de stage : animalerie de laboratoire
- Le matin ajouter 500µl de phénol chloroforme puis vortexer brièvement les tubes avant de les placer sur l’agitateur
(37°C et 1400rpm) pendant 5min. Puis centrifuger à 10 000g pendant 10 min.
- Prélever environ 400µl du surnageant et le placer dans un nouveau tube ependorff puis ajouter 1ml d’éthanol
(ETOH) pur froid. Retourner le tube afin de mélanger les deux phases : on doit voir précipiter l’ADN.
- Centrifuger à 10 000g pendant 10 minutes à 4°C puis aspirer le surnageant et ajouter 500µl d’ETOH 100%. Puis
centrifuger pendant 5 minutes à 10 000g et aspirer doucement le maximum de surnageant.
- Laisser sécher sous une cloche à vide jusqu’à disparition de l’ETOH pendant environ 10 minutes et ajouter 40µl
de TE [Tris à 10mM, EDTA à 1mM] puis les placer sur un agitateur à 68°C. Enfin prélever 1,5 µl de solution de
chaque tube pour la PCR.
8. PCR
Pour les différentes souches transgéniques le protocole expérimental de la PCR change, nous avons décidé de n’en
présenter qu’un.
1. CreLacZ et Beta2-Nicotinique KO :
Mix :
H20
10xPCR
MgCL2
d NTP
DMSO
:
:
:
:
:
31µl
5µl [tampon Euromedex]
3µl à 50mM
1µl à 25mM
2,5µl
Oligos
p10 : 1,5µl [oligos sont à 15pM/µl]
p11 : 1,5µl
p12 : 1,5µl
p13 : 1,5µl
Taq Pol
: 0,5µl
Préparer un mix pour 10 à 15 tubes et répartir 49µl par tube puis ajouter 1.5 µl d’ADN.
Deux contrôles au moins sont nécessaires : un tube sans DNA et un tube avec DNA génomique.
Cycle:
1
KI 1:
x
30 x
1 x
3’ at 94°C
1’ at 94°C
2’ at 62°C
3’ at 72°C
5’ at 72°C
Stop at 10°C
9
Préparation des gels :
- préparer 1000ml d’H2O et 20ml TAE 50X (tampon de migration)
- peser 1 g d’agarose et rajouter 80 ml de TAE dilué
- mettre sur plaque chauffante 250°C + agitateur et surveiller jusqu’à dissolution
- refroidir doucement sous l’eau
- rajouter 8μl de BET (agent intercalant) et mettre sous agitateur sans chauffer
- Verser dans les bacs de gel et laisser refroidir
Dépôt :
- mettre dans chaque tube ependorff 1,2 μl de bleu concentré et 7 μl d’échantillon de PCR
- déposer chaque mélange dans un puits distinct
- déposer un témoin positif et un témoin négatif
- faire migrer 25 mn environ à 100 Volts, du pôle positif vers le pôle négatif (figure 36)
- mettre le gel sous UV, enregistrer et analyser le résultat (figure 37, 38 et 39)
9.
Souris transgéniques
Le terme souris transgénique est utilisé pour toutes les souris ayant subies une intervention par génie
génétique au niveau de leur ADN. L’agrément préalable de la Commission du génie génétique est obligatoire pour
acheter, recevoir, transporter, élever et utiliser de tels animaux. Il est attribué pour une utilisation confiné c'est-à-dire
que l’on doit respecter à tout moment l’objectif de ne pas diffuser la séquence clonée (=le transgéne) hors du
Rapport de stage : animalerie de laboratoire
laboratoire ou de l’animalerie. Il existe différents modes obtention de souris transgénique, le plus utilisé est la
méthode de micro-injection d’ADN dans des ovocytes fécondés :
L’animalerie dispose de quelques souches de souris transgéniques dont :
-Les souris CreLacZ : Ce sont 2 lignées transgéniques distinctes dans lesquelles un gène rapporté a été
introduit, le β-galactosidase, dans les 2 cas les sites d’insertion sont inconnus. La lignée Storm dans laquelle
l’expression de β-galactosidase est très faible, et la lignée Yin dont l’expression en β-galactosidase est plus élevée. Le
génotypage a pour but de s’assurer de la présence du gène LacZ.
-β2-Nicotinique : ce sont des souris knock-out, car un gène β2-Nicotinique est interrompu par l’introduction
du gène LacZ.
-Récepteur delta aux opiacés et récepteur Mu aux opiacés: Il s’agit de souris « knock-out » à ces récepteurs,
ils ont été rendu inactifs après interruption de leurs séquences par le gène néomycine.
-Souris Db-/Db- : Ce sont des souris diabétiques qui ont une mutation monogénique récessive qui atteint le
gène du récepteur à la leptine au niveau du chromosome 4
-Souris Ob-/Ob- : Ces souris ont une mutation récessive du gène Lep codant pour la leptine, porté par le
chromosome 6.
CONCLUSION
Le stage effectué en animalerie nous a permis de mieux comprendre son fonctionnement. En effet nous
avons pu constater que l’animalier n’est pas seulement responsable de l’entretien des animaux mais aussi du
sexage, du baguage, il s’occupe également du génotypage, du croisement des souches et du maintien de la lignée si
elle est nécessaire aux manipulations.
Ce stage nous a également permis de nous familiariser avec la manipulation des rats et des souris, des différents
modes de contention, et de l’identification des animaux transgéniques par des techniques de biologie moléculaire.
Cependant 20 heures de stage n’est pas suffisant pour pouvoir assister à l’ensemble des manipulations expérimentale
pratiquées par les chercheurs.
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