Erythropoïétine et dopage

Mise au point
Érythropoïétine et dopage
M. Audran*, F. Lasne**, J. de Ceaurriz**
✎ L'administration d'érythropoïétine
humaine recombinante (r-HuEpo) stimule l'érythropoïèse, augmente le
taux d'hématocrite, la VO 2 max avec
ses conséquences d'amélioration de
la performance dans les épreuves
d'endurance ou l'exercice.
✎ L'homologie structurale est
presque parfaite entre la r-HuEpo et
l'EPO endogène rendant le dépistage du dopage à l'EPO difficile.
✎ Les méthodes indirectes évaluent
les conséquences d'un traitement par
r-HuEpo.
✎ Les paramètres étudiés sont hématocrite, hématocrite réticulocytaire,
volume globulaire moyen, dosage
sérique du récepteur soluble de la
transferrine et taux sérique d'EPO.
✎ Le ON model mesurant les cinq
paramètres permet de dépister la prise
de r-HuEpo pendant le traitement.
✎ Le OFF model ne mesurant que
trois de ces paramètres permet de
mettre en évidence un traitement par
L’
érythropoïétine humaine (EPO)
est une glycoprotéine de 30 kDa.
Elle est composée de 165 acides aminés et
de 4 chaînes latérales d’hydrates de carbo-
r-HuEpo sur une période s'étalant de
7 à 20 jours après l'arrêt du dopage.
✎ La méthode indirecte rapide et permettant de dépister la "mémoire" de
l'action de l'EPO a le double inconvénient de nécessiter une prise de sang
et de ne pas mettre en évidence la
nature du composé incriminé.
✎ Les méthodes directes s'effectuent
à l'inverse sur un prélèvement urinaire.
✎ L'analyse des profils isoélectriques de l'EPO urinaire permet de
différencier forme naturelle et forme
recombinante.
✎ La méthode urinaire directe permet de détecter le produit incriminé
mais est à la fois difficilement automatisable et nécessite une quantité
d'urine relativement importante.
✎ L'approche sanguine indirecte et
l'approche urinaire directe fournissent des réponses prometteuses à la
problématique du dépistage du
dopage par r-HuEpo.
ne. L’hypoxie tissulaire est le principal stimulus de sa synthèse. L’EPO maintient la
productivité des globules rouges en inhibant l’apoptose des progéniteurs érythro-
* Laboratoire de physique, faculté de pharmacie, Montpellier.
** Laboratoire national de dépistage du dopage, Chatenay-Malabry.
cytaires et en stimulant leur prolifération et
leur différenciation en normoblastes.
Produite par génie génétique depuis la fin
des années 80, cette molécule a transformé
la vie des malades souffrant d’insuffisance
rénale et d’anémie. Mais, très rapidement,
cette hormone a été utilisée par certains
athlètes pour accroître leur pouvoir aérobie,
augmentant ainsi leurs performances, en
particulier dans les épreuves d’endurance.
Après plusieurs années de recherche, le
dépistage de son utilisation illicite est à
présent possible et a été réalisé pour la première fois pendant les jeux Olympiques de
Sydney.
Intérêt dans le dopage
L’amélioration de la performance aérobie
procède d’un double effet à la fois sur le
système de transport de l’oxygène et sur le
potentiel oxydatif cellulaire. Ekblom et al.
(1) avaient déjà montré que la transfusion
sanguine, ou plus exactement la perfusion à
un athlète de ses propres globules rouges,
améliorait significativement la consommation maximale de l’oxygène (VO2 max),
ainsi que la performance dans les épreuves
de longue durée. Ce dopage sanguin augmentait la capacité de transport de l’oxygène vers le muscle, améliorant de ce fait la
performance aérobie. Théoriquement, l’administration de r-HuEpo, qui conduit à une
augmentation de l’hématocrite, devrait
avoir les mêmes effets que la perfusion des
hématies. Ekblom et Berglund ont été les
premiers à montrer l’intérêt de l’administration de r-HuEpo ( 20-40 UI/kg 3 fois par
semaine pendant 6 semaines) sur un groupe
de 24 sportifs hommes : l’augmentation du
taux d’hématocrite était en moyenne de
11,7 %, celle de la VO2 max de 8 % et le
nombre de battements cardiaques au cours
d’un exercice à 200 W était abaissé de 144
à 138/mn. Des résultats comparables ont
été obtenus par Audran et al. après administration de doses journalières de 50 UI/kg
de r-HuEpo à 10 athlètes pendant une pério-
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de de 4 semaines (augmentation de 10,8 %
pour l’hématocrite, 9,2 % pour la VO2 max
et un abaissement du nombre de battements
cardiaques de 177 à 168/mn) (2). En
conclusion, il ne fait aucun doute que l’administration de r-HuEpo présente un intérêt
concernant l’amélioration de la performance dans les épreuves d’endurance où l’exercice est en relation avec la VO2 max.
Dépistage de l’utilisation
de la r-HuEpo chez le sportif
Bien qu’inscrite sur la liste des substances
dopantes publiée par le ministère de la
Jeunesse et des Sports en juin 1989, elle
apparaît sur la liste du Comité international
olympique (CIO) en avril 1990 et sur celle
de l’Union cycliste internationale (UCI) en
1991. Le dopage à la r-HuEpo n’était alors
pas recherché, faute de méthode validée.
Le dépistage de l’utilisation illicite de cette
substance se heurte à plusieurs difficultés,
à savoir :
– la demi-vie très courte du composé ;
– l’absence de toute accumulation même
lors d’administrations itératives ;
– les effets durables, la polyglobulie subsistant plusieurs semaines après arrêt du
traitement ;
– l’homologie presque parfaite entre
r-HuEpo et EPO endogène.
Devant le danger que représentait la prise
de cette substance (des hématocrites supérieurs à 60 % ont été relevés chez des
cyclistes et des taux d’hémoglobine de 20 à
22 g/dl chez des skieurs de fond), deux
organismes internationaux, l’UCI et la
Fédération internationale de ski nordique,
avaient décidé de “mettre au repos”, mais
sans sanction, tout athlète pris soit avec un
hématocrite supérieur à 50 % pour le
cyclisme, soit avec un taux d’hémoglobine
supérieur à 18,5 g/dl pour les épreuves de
ski nordique. Fixer des critères de positivité n’est cependant pas une bonne solution,
d’une part, à cause de la grande variation
physiologique de ces paramètres qui
conduit à choisir des valeurs élevées,
d’autre part, parce qu’il est très facile pour
un athlète de faire baisser son taux d’hématocrite ou d’hémoglobine juste avant un
contrôle, par simple perfusion de sérum
physiologique.
Concernant le contrôle antidopage, il est
évident que la détermination du taux plasmatique ou urinaire de l’EPO, très variable
d’un sportif à l’autre et variant aussi selon
les circonstances, ne permet pas l’affirmation d’un dopage.
Pour dépister son utilisation illicite, deux
solutions ont été proposées : l’une, qui peut
être qualifiée de “méthode indirecte”, est
fondée sur la mise en évidence de modifications physiologiques spécifiques apparaissant pendant et après un traitement à la
r-HuEpo, l’autre, dite “méthode directe”,
consistant à différencier l’hormone recombinante de l’hormone physiologique.
Les méthodes indirectes
Un traitement à la r-HuEpo s’accompagne
d’une variation du nombre des réticulocytes (augmentation pendant le traitement,
chute en dessous des valeurs normales
quelques jours après l’arrêt), et d’une augmentation de l’hématocrite. D’autres paramètres biologiques sont également modifiés. Dès 1992, Beguin avait proposé le
dosage sérique du récepteur soluble de la
transferrine (sTfR), en tant que mesure
quantitative de l’érythropoïèse (3). Ce
récepteur est une forme tronquée du récepteur de la transferrine issue d’un clivage
protéolytique de son domaine extracellulaire. Quatre-vingts pour cent des récepteurs solubles proviennent de la moelle
osseuse où ils sont relâchés par les précurseurs érythroïdes et par les réticulocytes.
Le taux sérique du sTfR est modifié dans
deux circonstances : il augmente lors d’un
déficit en fer et il varie en fonction du
nombre de précurseurs érythroïdes en prolifération et différenciation.
On doit à Gareau et al. (4, 5) l’idée de l’utilisation de ce paramètre dans le dépistage
d’un dopage à la r-HuEpo. En effet, un
hématocrite élevé associé à un taux sérique
de sTfR élevé constitue un bon indicateur
de la prise de r-HuEpo chez un sportif, ce
dernier paramètre étant insensible à l’effort
physique et à l’effet de l’altitude. Toutefois, deux paramètres, biologiques de surcroît, ont été jugés insuffisants pour justifier un dopage à la r-HuEpo.
D’autre part, Casoni et al. (6) avaient noté
la présence de valeurs élevées de macrocytes (> 120 fl) hypochromes (< 28 pg)
chez plusieurs sujets recevant de la r-HuEpo.
Mais des résultats contradictoires, avec
diminution du VGM chez les patients anémiques hémodialysés (7) ou sans changement du VGM, lors d’administrations
concomitantes d’hormone recombinante et
de fer à des volontaires sains, ont été rapportés (8).
Lors d’une étude de deux mois, réalisée sur
10 sportifs de très bon niveau régional,
consistant en l’administration sous-cutanée
de doses journalières d’EPO (50 UI/kg) et
de fer per os (200 mg/j), et d’un suivi biologique jusqu’au retour aux valeurs de base
des paramètres hématologiques, Audran et
al. (2) ont confirmé l’intérêt de la mesure
de l’hématocrite, des réticulocytes, du taux
sérique du sTfR (ou du rapport sTfR/protéines) et de celui de l’EPO dans le contrôle d’un dopage à l’EPO. Une étude semblable, mais plus complète a été menée en
Australie par Parisotto et al. (9). Il s’agissait d’une étude en double aveugle, au
cours de laquelle était administré r-HuEpo
(50 UI/kg, en SC, 3 fois par semaine pendant 25 jours) ou de sérum physiologique,
accompagné de prise de fer soit par voie
IM (100 mg, une fois/semaine), soit per os
(105 mg/jour). Les paramètres étudiés
étaient : l’hématocrite, l’hématocrite réticulocytaire, le VGM et les taux sériques
d’EPO et de sTfR. Les sujets ont également été suivis 4 semaines après arrêt des
administrations. Les auteurs ont pu, sur la
base de leurs résultats, établir deux
modèles statistiques combinant ces différents marqueurs, et permettant de détecter
la prise de l’hormone recombinante. Le
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Mise au point
premier, ou ON model, regroupant l’ensemble des cinq paramètres et permettant
de conclure à la prise de r-HuEpo pendant
le traitement, le second, OFF model, permettant, à partir de trois paramètres, hématocrite élevé, hématocrite réticulocytaire et
taux plasmatique d’EPO abaissés, la mise
en évidence d’un traitement à la r-HuEpo,
jusqu’à 7 à 20 jours après arrêt de la prise
du médicament.
L’intérêt de cette méthode indirecte est
triple :
– elle est rapide ;
– les paramètres utilisés restent modifiés
alors que l’hormone a disparu, ce qui permet de mettre en évidence un dopage une à
deux semaines après arrêt du traitement ;
– elle est susceptible de permettre la détection d’autres moyens d’activation de l’érythropoïèse (faibles doses d’EPO administrées avec IL-3 et /ou GM-CSF, EPO
retard, peptides mimétiques…).
Elle présente deux inconvénients : elle nécessite une prise de sang et elle ne met pas en
évidence la nature du composé incriminé.
Les méthodes directes
Ces méthodes présentent les avantages,
d’une part, de mettre en évidence la substance incriminée et, d’autre part, de pouvoir être effectuées sur l’urine, milieu biologique traditionnellement utilisé dans le
contrôle antidopage.
Elles reposent sur les différences structurales observées entre EPO physiologique et
r-HuEpo et qui ont des conséquences sur
leurs mobilités élecrophorétiques.
La première de ces méthodes, proposée par
Wide (10), consiste à mesurer la charge
médiane des isoformes des molécules
d’EPO par électrophorèse en suspension
d’agarose suivie d’élution fractionnée et de
dosage radio-immunologique. Les isoformes de la r-HuEpo se différencient de
l’EPO naturelle par une mobilité électrophorétique médiane plus faible. Cette
méthode lui a permis de retrouver l’hormone recombinante dans les urines prélevées
24 à 48 heures après une administration de
20 UI/kg. Cependant, cette technique qui
est lourde à mettre en œuvre n’a jamais été
exploitée.
Plus récemment, une méthode a été développée par le Laboratoire national de dépistage du dopage (LNDD) français par Lasne
et de Ceaurriz (11). Elle repose sur l’analyse des profils isoélectriques de l’EPO urinaire qui permet de différencier la forme
naturelle de la forme recombinante.
Plusieurs étapes successives sont nécessaires à la mise en évidence de ces profils.
Les taux de l’EPO dans l’urine étant physiologiquement très faibles (inférieurs à
3 UI/l, soit 25 ng/l), l’urine est tout d’abord
préparée par un procédé d’ultra-filtration
permettant d’éliminer dans le filtrat une
partie des constituants urinaires de faible
poids moléculaire et de concentrer de 500 à
1 000 fois les protéines (dont l’EPO) de
plus haut poids moléculaire dans le rétentat. Ce dernier est ensuite soumis à une
focalisation isoélectrique (électrophorèse
dans un gradient de pH) qui permet de
séparer chacune des protéines présentes en
ses isoformes constitutives. L’EPO ne
représente qu’une très faible partie des protéines focalisées (rapport EPO/protéines
totales de l’ordre de 10-7). Aussi la révélation spécifique de l’EPO nécessite-t-elle la
mise en œuvre d’un procédé d’immunoblotting particulier appelé double-blotting
breveté par les Hospices civils de Lyon
(numéro 2 786 273) (12). Les profils isoélectriques sont enfin visualisés grâce à
une réaction de chimi-luminescence qui
provoque l’émission de lumière au niveau
de chacune des isoformes de l’EPO. Cette
émission de lumière est quantifiée au
moyen d’une caméra CCD et il est ainsi
possible d’évaluer les intensités relatives
de chacune des isoformes constitutives
d’un profil.
Il apparaît ainsi que les profils des EPO
recombinantes sont différents de celui de
l’EPO naturelle urinaire qui est constitué
d’une majorité d’isoformes plus acides.
Cette différence constatée au niveau des
profils isoélectriques peut être le reflet d’une
Isoformes acides
+
A
–
B
C
D
Isoformes basiques
Figure. Profils isoélectriques de l’EPO. A : EPO
recombinante (Époïétine a), B et C : EPO urinaire
de sujets témoins, D : EPO urinaire 24 heures
après une administration d’EPO recombinante. La
présence d’EPO recombinante dans l’urine se caractérise par la prédominance d’isoformes basiques
dans le profil isoélectrique.
divergence dans certaines modifications
post-traductionnelles de l’hormone lors de
la synthèse (en particulier au niveau de sa
sialoglycosylation) ou plus tardivement.
Lors d’administration d’EPO recombinante, le profil retrouvé dans l’urine prélevée dans les trois jours suivant l’injection,
correspond manifestement à celui de la
forme recombinante (figure).
L’intérêt de cette méthode urinaire directe
est d’apporter la signature d’une prise
d’EPO recombinante à partir d’un milieu
biologique usuel dans le cadre des
contrôles antidopage. Néanmoins, elle présente l’inconvénient d’être difficilement
automatisable et de nécessiter une quantité
d’urine relativement importante (10 à
20 ml).
Stratégie de dépistage
Les performances de la méthode sanguine
indirecte et de la méthode urinaire directe
ont été récemment examinées dans le cadre
d’une étude de validation conduite en
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aveugle sur des prélèvements provenant de
sujets ayant reçu ou non de l’EPO recombinante. L’influence de différents facteurs
individuels tels que le sexe, l’âge, l’origine
ethnique et de différentes situations stimulant l’érythropoïèse (séjours en altitude et
en chambre hypobare) a également été étudiée. Les résultats de ces travaux ont permis de définir des critères de positivité
pour chacune des deux méthodes.
L’examen critique d’une partie de ces
résultats a conduit le CIO à mettre conjointement en œuvre, aux jeux Olympiques de
Sydney, l’approche sanguine (ON model)
et l’approche urinaire qui correspondent à
des fenêtres de détection quasi identiques,
dans le cadre limité de contrôle antidopage
en dehors des compétitions, avec une exigence de double positivité pour toute
déclaration de cas de dopage.
Conclusion
Le détournement de l’EPO recombinante à
des fins de dopage en milieu sportif est resté
longtemps incontrôlable. L’approche sanguine indirecte et l’approche urinaire directe
sont des réponses prometteuses à la problématique du dépistage du recours à cette substance. On peut raisonnablement espérer que
les autorités internationales en charge de la
lutte antidopage disposeront rapidement
d’une information scientifique suffisante
pour officialiser une stratégie de dépistage et
mobiliser les logistiques techniques qui la
rendront effective à grande échelle.
Nous remercions les éditions Elsevier de
nous avoir autorisés à reproduire ce texte.
© Audran M, Lasne F, de Ceaurriz J. Érythropoïétine et dopage. Revue Française
des Laboratoires 2001 ; 331 : 37.
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