La mucopolysaccharidose de type I

abc
pratique quotidienne
Ann Biol Clin 2007 ; 65 (2) : 175-9
La mucopolysaccharidose de type I :
stratégie diagnostique en Tunisie
Diagnostic strategy of mucopolysaccharidosis type I in Tunisia
Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 78.47.27.170 le 08/02/2017.
L.
S.
S.
S.
A.
D.
A.
R.
H.
M.
R.
I.
A.
Chkioua1
Ferchichi1
Khedhiri1
Laradi1
Bibi2
Amira1
Dandana1
Ben Mansour1
Ben Limam1
Chaabouni3
Froissart4
Maire4
Miled1
1
Laboratoire de biochimie,
Hôpital Farhat Hached de Sousse,
Tunisie
<[email protected]>
2
Laboratoire de biochimie clinique,
Hôpital d’enfants de Tunis, Tunisie
3
Service de pédiatrie,
Hôpital Hedi Chaker de Sfax, Tunisie
4
Laboratoire de biochimie pédiatrique,
Hôpital Débrousse Lyon, France
Résumé. Nous avons recruté un malade supposé atteint d’une mucopolysaccharidose chez qui nous avons effectué une analyse biochimique qui comprend
une étude quantitative et qualitative des glycosaminoglycanes (GAG) urinaires
suivie par la détermination de l’activité enzymatique de l’a-L-iduronidase.
L’analyse moléculaire a concerné la recherche des mutations les plus fréquentes (p.Gln 70 X, p.Trp 402 X, p.Pro 533 Arg). Le profil électrophorétique sur
plaque d’acétate de cellulose était en faveur de MPS I ou MPS II. L’activité de
l’a-L-iduronidase était effondrée chez le cas index ce qui a confirmé le phénotype de MPS I observé. L’étude moléculaire a montré la présence de la mutation p.Pro 533 Arg à l’état homozygote chez le cas index et à l’état hétérozygote chez ses parents.
Mots clés : mucopolysaccharidose, glycosaminoglycanes, iduronidase
Abstract. A Tunisian patient affected by mucopolysaccharidosis (MPS) was
investigated for a biological analysis (quantitative and qualitative glycosaminoglycans (GAG) screening). We have also done an enzymatic determination of
a-L-iduronidase activity (IDUA). The most common mutation (p.Gln 70 X,
p.Trp 402X and p.Pro 533 Arg) were researched by an enzymatic restriction
and sequencing of the IDUA gene. Enzymatic and urinary diagnostics suggested a MPS I phenotype. The patient investigated had the mutation p.Pro 533
Arg in the homozygous status, whereas his parents were heterozygous for this
mutation.
Key words: mucoloysaccharidosis, glycosaminoglycan, iduronidase
doi: 10.1684/abc.2007.0048
Article reçu le 26 mai 2006,
accepté le 20 décembre 2006
Les mucopolysaccharidoses (MPS) sont des maladies de
surcharge lysosomale. Elles sont dues à un déficit enzymatique, aboutissant à une accumulation intralysosomale de
glycosaminoglycanes (GAG) anciennement appelés mucopolysaccharides acides. Cette surcharge entraîne une excrétion accrue des GAG dans les urines [1]. Une grande hétérogénéité clinique et biologique caractérise les
mucopolysaccharidoses, ce qui rend leur diagnostic difficile ; 11 types et sous-types ont été décrits en fonction du
déficit enzymatique. En Tunisie, la prévalence de ces
mucopolysaccharidoses varie de 0,013 ‰ pour la MPS VI
à 0,1 ‰ pour la MPS III [2]. Cette prévalence est sousAnn Biol Clin, vol. 65, n° 2, mars-avril 2007
estimée vu l’existence de certains tableaux cliniques peu
dysmorphiques.
Ces mucopolysaccharidoses constituent dans leur ensemble un réel problème de santé publique du fait de la fréquence élevée des mariages consanguins (qui représentent
plus de 30 % des unions). Le traitement de ces maladies
handicapantes est essentiellement symptomatique, il est
onéreux car il nécessite l’intervention de différentes unités
de plusieurs spécialistes : psychologues, pédiatres, chirurgiens orthopédistes, orthophonistes, kinésithérapeutes,
cardiologues, odontologistes et biologistes. De plus, les
patients tunisiens sont insuffisamment pris en charge.
175
pratique quotidienne
Le présent travail est une étude biologique (phénotypique
et moléculaire) d’une famille ayant un enfant atteint d’une
mucopolysaccharidose. Pour étudier ce cas, notre laboratoire a choisi une démarche diagnostique qui repose sur
les données cliniques, l’utilisation de plusieurs techniques
d’investigation biochimique et l’étude moléculaire.
Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 78.47.27.170 le 08/02/2017.
Patients
une méthode colorimétrique en utilisant le substrat
synthétique : le phényl-a-L-iduronide (Sigma Aldrich).
L’activité de la N-acétyl-b-D-glucosaminidase a été
déterminée par fluorimétrie en utilisant comme substrat
le 4-méthyl–umbelliféryl-N-acétyl–b-D-glucopyranoside
(Sigma Aldrich), elle servira d’activité témoin pour valider la qualité du prélèvement.
Analyse moléculaire
Il s’agit d’une étude portant sur un patient atteint d’une
mucopolysaccharidose et ses deux parents. Le patient a
été recruté dans le service de pédiatrie de l’hôpital Hedi
Chaker de Sfax. À l’examen clinique, le sujet âgé de
10 ans a présenté un retard staturo pondéral [-3 DS], un
syndrome dysmorphique facial avec un faciès grossier,
une macroglossie, des lèvres épaisses avec des petites
dents. Les cheveux étaient abondants avec des sourcils
épais. La déformation ostéoarticulaire (dysostoses multiples) est associée à une hépatomégalie. L’examen ophtalmologique a confirmé la présence des opacités cornéennes
surtout en périphérie avec une rétinite pigmentaire. Les
deux parents sont phénotypiquement sains.
Seules les 3 mutations du gène IDUA les plus fréquentes
dans la population française : p.Gln 70 X (CAA → TAA),
p.Trp 402 X (TGG → TGA) et p.Pro 533 Arg (CCG →
CGG) ont été recherchées [2].
L’ADN génomique a été extrait par la méthode
phénol/chloroforme à partir des cellules sanguines des
parents et de l’enfant malade, puis précipité par l’alcool
saturé et solubilisé dans l’eau distillée.
Les exons où se situent ces mutations ont été amplifiés par
la technique de PCR (polymerase chain reaction) en utilisant la GoTaq polymérase (Promega, Madison, WI). Les
amorces qui encadrent l’exon investigué (exon II (p.Gln
70 X), exon IX (p.Trp 402 X), exon XI (p.Pro 533 Arg))
sont présentées dans le tableau 1.
Méthodes
Amplification de l’ADN
Les échantillons d’ADN ont été dénaturés 5 minutes à
94 °C, puis soumis à 40 cycles d’amplification. Chaque
cycle a compris une étape de dénaturation de 30 secondes
à 94 °C. L’étape d’hybridation a été spécifique pour chaque fragment, les différentes températures d’hybridation
et le temps correspondant ont varié en fonction des amorces utilisées (tableau 1). L’étape d’élongation a été faite à
72 °C pendant 30 secondes. L’extension terminale a duré
7 minutes à 72 °C.
Analyse phénotypique
Analyse hématologique
L’analyse hématologique a montré la présence de cellules
de Gasser dans le sang périphérique du patient.
Screening urinaire
Le screening urinaire a permis l’évaluation qualitative et
quantitative des GAG urinaires [3]. Dix millilitres d’urines
issues du patient et de ses parents amenées à pH 5-6, ont
été additionnées de 200 lL de chlorure de cétyl pyridinium à 5 %. Le précipité final obtenu est redissout dans
100 lL de chlorure de sodium 0,6 M. Cette solution servira au dosage des acides hexuroniques grâce à leur coloration à l’harmine et les résultats sont exprimés en mg
d’acide glucuronique/g de créatinine. L’évaluation qualitative des GAG urinaires se fait par électrophorèse monodimensionnelle sur gel d’acétate de cellulose en tampon
acétate de baryum 0,05 M. Les bandes sont colorées par le
bleu 1-9 de diméthylméthylène à 0,02 %. En parallèle
une chromatographie des oligosaccharides urinaires est
réalisée [4].
Activité enzymatique
Les leucocytes ont été isolés à partir de 10 mL de sang
recueilli sur EDTA. Les protéines ont été dosées par la
méthode de Hartree [5], la détermination de l’activité
enzymatique de l’a-L-iduronidase (IDUA) a été faite par
176
Digestion enzymatique
Les produits PCR ont été digérés par des endonucléases de
restriction : AvaII (p.Gln 70 X), BfaI (p.Trp 402 X), MspI
(p.Pro 533 Arg) (Promega, Madison, WI). Les différentes
bandes ont été séparées sur un gel de polyacrylamide à
5 %, puis visualisées sous UV après coloration au bromure d’éthiduim (BET).
Séquençage
Les produits d’amplification obtenus en présence du couple d’amorces IDUA10/12 (+) et IDUA 10/12 (-) ont été
purifiés en utilisant le kit Quiaquick gel-extraction
(Qiagen Inc, Valencia, CA, États-Unis), puis séquencés en
utilisant un kit de séquençage (Perkin-Elmer-Cetus
Norwalk, CT, États-Unis) et un séquenceur automatique
(ABI Prism 3700 capillary Array Sequencer, PE
Biosystems).
Ann Biol Clin, vol. 65, n° 2, mars-avril 2007
Mucopolysaccharidose de type I
Tableau 1. Couples d’amorces et enzymes de restriction utilisés.
Exons
Mutations
Amorces
Séquences
Position de
nucléotides
Taille
en pb
Tm
en °C
II
p.Gln 70 X
IDUA2 (+)
5’S :GAACGTGTGTGTGTCAGCCG3’
1236-1253a
304
62
IX
p.Trp 402 X
IDUA2 (-)
IDUA9 (+)
5’A/S :ACAAGGGGTCTTCCGAGC3’
5’S : TCCTTCACCAAGGGGAGG3’
1539-1522
2442-2459b
400
62
IDUA9 (-)
2841-2824
IDUA10/12(+)
5’A/S :
CTGACACTCAGGCCTCGG3’
5’S : GTGTGGGTGGGAGGTGGA3’
3055-3072b
466
62
IDUA10/12 (-)
5’A/S :GTGACCGCATGGGTGAAG3’
3520-3503
Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 78.47.27.170 le 08/02/2017.
XI+XII
p. Pro 533 Arg
E enzyme
de restriction + taille
de fragment en pb
(-) AvaII
N : 137 + 135
M : 304
(+) BfaI
N : 400
M : 281 + 119
(+) MspI
N : 51+20+31+84+259+17
M : 51+20+31+22+62+259+17
(-) : abolition d’un site de restriction ; (+) : création d’un site de restriction ; N : normal ; M : muté ; a : les amorces ont été choisies selon les données du
Genbank database entry m95739 [9] ; b : les amorces ont été choisies selon les données du Genbank database entry m95740 [9].
Résultats
Diagnostic phénotypique
Chez le patient, le profil électrophorétique sur plaque
d’acétate de cellulose a révélé la présence de deux bandes
anormales qui correspondent au dermatane sulfate (DS) et
à l’héparane sulfate (HS) (figure 1). Le dosage des GAG
urinaires a montré une excrétion accrue estimée à 46 mg
d’acide glucuronique/g de créatinine. La chromatographie
des oligosaccharides urinaires a montré un profil perturbé.
L’association des données cliniques à ces résultats biologiques nous a permis de typer la mucopolysaccharidose :
MPS I.
La mise en évidence de déficit enzymatique de l’a-Liduronidase dans les leucocytes du patient (0,01 lKat/kg)
a confirmé le diagnostic de la MPS I et ceci par comparaison à l’activité d’un témoin normal (2,8 lKat/kg). Les
activités enzymatiques des parents étaient respectivement
de 1,5 et 1,6 lKat/kg. L’activité des hexosaminidases totales était normale ce qui rend compte de la validité du
prélèvement et du dosage.
– la mutation p.Pro 533 Arg qui a créé un site de restriction pour MspI, est présente dans notre étude (tableau 1).
L’enfant malade a montré le profil d’un état homozygote
p.Pro 533 Arg/p.Pro 533 Arg. Les parents étaient hétérozygotes pour la mutation p.Pro 533 Arg (p.Pro 533
Arg/normal).
Séquençage
Dans le but de confirmer la lésion moléculaire p.Pro 533
Arg révélée par la digestion enzymatique, nous avons procédé au séquençage de l’exon XI. La mutation p.Pro 533
Arg a été confirmée à l’état homozygote chez l’enfant
malade (figure 2A) et à l’état hétérozygote chez les deux
parents (figure 2B).
1
2
3
4
CS
DS
HS
Analyse moléculaire
Dépôt
Digestions enzymatiques
L’étude des produits de PCR de notre famille par la digestion enzymatique (par rapport à la migration d’un témoin
non digéré) a montré que :
– l’absence d’abolition du site AvaII indique que la mutation p.Gln 70 X au niveau de l’exon II est absente dans la
famille ;
– l’enzyme BfaI n’a pas digéré les produits PCR de l’exon
IX, ce qui affirme l’absence de la mutation p.Trp 402 X ;
Ann Biol Clin, vol. 65, n° 2, mars-avril 2007
Figure 1. Profil électrophorétique des GAG urinaires sur une
plaque d’acétate de cellulose. 1 : malade ; 2 : témoin MPS III ; 3 :
père ; 4 : mère ; DS : dermatane sulfate ; HS : héparane sulfate ;
CS : chondroïtine sulfate.
177
pratique quotidienne
Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 78.47.27.170 le 08/02/2017.
Discussion
dans la MPS I, toutefois ce caractère peut être absent chez
les patients MPS I [6].
La MPS I est une maladie de surcharge lysosomale,
qui résulte d’un déficit en a-L-iduronidase (IDUA)
[E C 3.3.1.76], enzyme indispensable à la dégradation du
dermatane sulfate et d’héparane sulfate [1]. Trois soustypes ont été décrits, la forme sévère de la maladie (Hurler) est caractérisée par un syndrome dysmorphique, des
déformations squelettiques, des opacités cornéennes, une
hépatosplénomégalie, un retard mental et statural. La
forme modérée (Scheie) se distingue par l’absence du
retard mental. Le syndrome de Hurler/Scheie est de gravité intermédiaire entre la maladie de Hurler et la maladie
de Scheie.
Les données cliniques peuvent nous orienter vers le type
et nous permettent généralement la distinction entre la
MPS I et la MPS II. L’examen ophtalmologique révèle
l’existence d’opacités cornéennes bilatérales uniquement
Le screening urinaire constitue un diagnostic d’orientation
biologique d’une grande utilité puisqu’il est reproductible,
fiable et facile à mettre au point [4]. Dans notre étude,
l’utilisation de la méthode colorimétrique pour déterminer
l’activité enzymatique est reproductible et nous permet de
diagnostiquer les cas déficitaires [7]. En revanche, l’utilisation d’un substrat fluorogénique (dérivé 4 méthylumbelliféryl) est possible, elle est plus sensible et applicable au
diagnostic prénatal [8].
Nous avons réussi à identifier la mutation p.Pro 533 Arg
chez ce patient grâce à la combinaison de différentes techniques de biologie moléculaire (enzyme de restriction,
séquençage). Cette lésion moléculaire au niveau du gène
IDUA est à l’origine d’une activité enzymatique résiduelle
qui est corrélée généralement à un phénotype modéré.
A
T
G
C
G
G
T
C
T
G
C
C
N:
CGG
Arg 531
CTG
Leu 532
CCG
Pro 533
TCG
Ser 534
M:
CGG
Arg 531
CTG
Leu 532
CGG
Arg 533
TCG
Ser 534
G
B
G
T
C
G
Figure 2. Profil de la séquence au niveau de l’exon XI du gène IDUA montrant la mutation p.Pro 533 Arg (C > G) à la position 1598 sur
l’ADNca. A : chez le malade (p.Pro 533 Arg/ p.Pro 533 Arg). B : chez le père ou la mère (p.Pro 533 Arg / N). a : séquence d’ADNc selon
NCBI (IDUA NM-000203) avec +1 correspond au nucléotide A du codon initiateur ATG (nt 88).
178
Ann Biol Clin, vol. 65, n° 2, mars-avril 2007
Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 78.47.27.170 le 08/02/2017.
Mucopolysaccharidose de type I
Cette mutation faux sens est non conservative, elle est le
résultat de la substitution d’une proline par une arginine à
la position 533 de la protéine [9]. Elle est considérée
comme la mutation la plus fréquente dans la population
marocaine avec une fréquence de 92 % de l’ensemble des
allèles testés, cette fréquence est de 11 % dans la population italienne et elle n’est que de 3 % dans la population
européenne [10].
Puisque c’est une maladie autosomique récessive, la
recherche d’un cas index est d’une grande utilité, surtout
si nous connaissons la fréquence de la mutation dans certaines populations.
La mise au point d’une stratégie diagnostique anténatale
est possible dans notre laboratoire, la mutation p.Pro 533
Arg étant fréquente dans la population maghrébine [10].
Cette fréquence est en rapport direct avec les mariages
consanguins entre apparentés [11]. Le dépistage des hétérozygotes dans la famille constitue un outil pour faciliter
la réalisation d’un éventuel diagnostic prénatal.
À côté de la mutation p.Pro 533 Arg retrouvée à l’état
homozygote chez ce patient et à l’état hétérozygote chez
les parents, les deux autres mutations fréquemment
recherchées (p.Gln 70 X et p.Trp 402 X) étaient absentes.
Ces deux dernières ont toujours été recherchées en première intention dans la population européenne. Elles sont
décrites comme des allèles nuls avec des fréquences qui
sont variables en fonction de la population étudiée [10].
L’étude moléculaire constitue une approche plus fiable
que l’analyse biochimique pour étudier les hétérozygotes
puisqu’il existe des mutations qui sont plus fréquentes que
d’autres en fonction des populations. Par conséquent,
connaître le spectre mutationnel nous permet d’effectuer
une étude épidémiologique de la maladie.
Le diagnostic prénatal est plus fiable par étude moléculaire que par la détermination de l’activité enzymatique
qui est parfois mise en défaut [8].
ratoire, nous avons mis au point une stratégie diagnostique
qui associe le screening urinaire à l’étude moléculaire
pour le dépistage de la mutation P533R supposée la plus
fréquente en Tunisie.
La caractérisation de la ou (des) mutation(s) nous permettra de préciser les corrélations génotype/phénotype, afin
d’améliorer la qualité du conseil génétique, qui reste notre
seul espoir, vu que l’enzymothérapie substitutive (appliquée pour la maladie de Hurler) est onéreuse. La création
d’un centre multidisciplinaire pour la prise en charge de
ces maladies permettra d’améliorer la qualité de vie de ces
malades.
Références
1. Neufeld EF, Muenzer J. The mucopolysaccharidoses. In : Scriver CR,
Beaudet AL, Sly WS, Valle D, et al., eds. The metabolic and molecular
bases of inherited disease.. 8e édition. New York : McGraw-Hill, 2001 :
3421-52.
2. Laradi S, Monastiri K, Ferchichi S, et al. Étude clinico-biologique et
moléculaire des mucopolysaccharidoses en Tunisie du centre et de sud.
Ann Biol Clin (Paris) 2001 ; 59 : 100-4.
3. Stone JE. Urine analysis in the diagnosis of mucopoysaccharide disorders. Ann Clin Biochem 1998 ; 35 : 207-25.
4. Piraud M, Boyer S, Mathieu M, Maire I. Diagnosis of mucopolysaccharidoses in a clinically selected population by urinary glycosaminoglycan analysis : a study of 2,000 urine samples. Clin Chim Acta 1993 ;
221 : 171-81.
5. Hartree EF. Determination of protein : a modification of the Lowry
method that gives a linear photometric response. Anal Biochem 1972 ;
48 : 422-7.
6. Gardner RJ, Hay JR. Letter : Hurler’s syndrome with clear corneas.
Lancet 1974 ; 2 : 845.
7. Maire I. Diagnostic biologique et moléculaire des maladies de surcharge lysosomale. Rev Fr Lab 1998 ; 303 : 37-40.
8. Young EP. Prenatal diagnosis of Hurler disease by analysis of alphaiduronidase in chorionic villi. J Inherit Metab Dis 1992 ; 15 : 224-30.
9. Scott HS, Guo XH, Hopwood JJ, Morris CP. Structure and sequence
of the human alpha-L-iduronidase gene. Genomics 1992 ; 13 : 1311-3.
Conclusion
Les maladies de surcharge lysosomale, en particulier les
mucopolysaccharidoses, présentent une grande variabilité
clinique, ce qui complique le diagnostic. Dans notre labo-
10. Alif N, Hess K, Straczek J, et al. Mucopolysaccharidose de type I au
Maroc : manifestations cliniques et profile génétique. Arch Pediatr
2000 ; 7 : 597-604.
11. Ben L, M’rad S. Le choix matrimonial en Tunisie est-il transmissible ? Antropo 2004 ; 7 : 31-7.
Nouveau
Retrouver les Annales de biologie clinique
sur www.revue-abc.com
Ann Biol Clin, vol. 65, n° 2, mars-avril 2007
179