Fiches descriptives des Prémodules-Ateliers-Modules - gdr-Miv

Transcription

PREMODULES
PREMODULES
Pré-Modules (PM1 à PM6)
Samedi 4
13h30
14h30
15h00
13h30 - 15h00
PM2 : L'optique
pour les non
physiciens (deb.)
14h30-16h30
PM1 : La biologie
pour les non
biologistes
13h30 - 16h30
PM4 : Analyse des
images en
microscopie
Dimanche 5
Lundi 6
Mardi 7
Mercredi 8
13h30 - 15h30
PM5 : Métrologie
des systèmes
14h30-16h30
14h30-16h30
PM3 : Base de
PM6 : Détecteurs en
fluorescence et
microscopie
processus associés
14h30-16h30
PM3 : Base de fluorescence
et processus associés
(Restaurant)
PM4 : Script et
programmation graphique
sous Icy (Aramis)
14h30-16h30
PM2 : L'optique pour les
non physiciens
(Restaurant)
15h00 - 16h30
PM2 : L'optique
pour les non
physiciens (inter.)
16h30-18h30
PM1 : La biologie pour les
non biologistes
16h30
(Jai Ala)
21h30-23h30
21h30 -23h30
PM4 : Script et
programmation graphique
sous Icy
(d 'Artagnan)
21h30-23h30
PM5 : Métrologie
des systèmes
( Restaurant)
Les prémodules sont l'occasion d'acquérir et/ou de rafraîchir des notions essentielles qui sont
ensuite utilisées dans les cours (et qui ne sont pas reprécisées à cette occasion). Conçus en fonction du
point de départ des participants (origine Maths, Informatique, Physique, Chimie, Biologie), ils offrent
les connaissances interdisciplinaire de base pour suivre les modules durantMiFoBio.
- PM1 biologie : la biologie pour les non biologistes (14h30, Delphine Muriaux, Charlotte Mariani)
Ce prémodule permettra de présenter à un public non biologiste les différentes structures et les
grandes fonctions cellulaires. L'intervenant sera chargé d'essayer de balayer ces différents aspects
sans se concentrer sur une fonction particulière. Alternativement, nous proposons une inscription
anticipée au prémodule pour permettre éventuellement aux intervenants d'interroger les futurs
participants sur leurs attentes précises (par exemple un type de structure, un type de fonction
particulier) et éventuellement une information sur la préparation d'échantillons pour la microscopie.
La partie pratique se concentrerait sur la culture cellulaire et la transfection de plasmides (exprimant
les protéines d’intérêt fluorescentes).
Durée : 1h de théorie (D. Muriaux) et 1h de pratique
Ce prémodule est reproposé en cours de semaine.
- PM2 L'optique pour les non physiciens (13h30, Olivier Haeberlé)
Ce prémodule sera l'occasion d'aborder les différentes notions de bases nécessaires à la
compréhension des cours. Le microscope est un outil de routine en biologie dont l'utilisation est
simplifiée grâce à une ergonomie judicieusement conçue. Certains des élèves de MIFOBIO, tout en
utilisant régulièrement des techniques de microscopie (confocal, multiphoton, F-techniques) ont
besoin d'un rappel sur les bases physiques permettant la formation de l'image et sur la conception
Ecole thématique interdisciplinaire du CNRS : Microscopie Fonctionnelle en Biologie
MiFoBio, Seignosse, 3-10 octobre 2014
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PREMODULES
des microscopes modernes. Le public 2012 était important pour ce prémodule et nous proposons de
le scinder en deux, un module Niveau débutant (13h30) avec les notions "basiques" (structure d'un
microscope, trajet optiques, éléments, notion de résolution, aberrations, choix des objectifs,
fluorescence), un module niveau intermédiaire (15h) avec des notions plus avancées (optique de
Fourier, techniques de microscopie de fluorescence).
Durée : 1h30 de niveau débutant, 1h30 de niveau avancé. Possibilité de s’inscrire au seul niveau
avancé.
- PM3 : base de fluorescence et processus associés (14h30, Dominique Bourgeois)
Beaucoup de participants à l'école MIFOBIO utilisent la microscopie de fluorescence. Cependant, les
propriétés complexes des marqueurs fluorescents sont parfois méconnues. Ce prémodule propose
de faire un point sur les différents processus liés à la fluorescence et sur les propriétés des
fluorophores (spectres, IC, ISC, fluorescence, phosphorescence, états singulets, triplets, réactions
avec l'environnement, bleaching, blinking, coef. d'absorption molaire, section croisée, QE, brillance,
1p ou 2p, notion de flux de photon en microscopie de fluorescence WF, confocale ou 2p, durée de
vie). Nous donnerons aussi une ouverture sur les processus non fluorescents (SHG/THG par
exemple).
Durée : 2h
- PM4 : Analyse des images en microscopie (13h30, Alexandre Dufour, Fabrice de Chaumont)
La réalisation d’une expérience suit un ensemble d’étapes toutes aussi critiques que les autres. En
particulier, l’étape d’analyse, pour être correcte, suppose une connaissance du contenu informatif de
l’image et de sa conservation dans les différents formats de sauvegarde (dynamique, métadonnées).
Ce pré-module retracera ces problématiques et présentera les principaux outils de traitement des
images et d’identification des objets d’intérêt. Une première partie théorique sera suivie d’une
session pratique (insertion dans le planning à définir). Elle utilisera le logiciel support (Icy) qui sera
utilisé comme vecteur pour expliquer toute la richesse d'analyse que l'on peut retirer d'une image,
tout en expliquant et sensibilisant à l'utilisation des différentes représentations (colormaps, vues
2D,3D), ainsi que les formats d'images à utiliser, la création des ROIs et quelques petits algorithmes.
Durée : 1h de théorie (A. Dufour), 2h de pratique
La partie pratique (Icy) de ce prémodule est reproposée en cours de semaine sous la forme d’un
atelier.
- PM5 : Métrologie des systèmes (13h30, Groupe Métrologie RTmfm*)
La technicité des appareils utilisés pour l’observation du vivant, leur complexité, et la généralisation
des mesures quantitatives imposent un suivi rigoureux des appareils. Au cours de ce prémodule, une
introduction présentera les différents points de mesures sur un système de microscopie, une
présentation générale du fonctionnement des principaux capteurs : caméras (CCD, EM-CCD, sCMOS)
et détecteurs (PMT, GaAsp, HyD, APD, MCP), la fonction d’étalement (PSF), les différentes
aberrations rencontrées en microscopie et les différents étalons en métrologie. Les outils utilisés et
mis à disposition par le groupe de travail seront présentés (greffons permettant la génération de PSF
théorique ou l’analyse d’images de billes par le greffon MetroloJ). Ce cours s’adressera uniquement à
ceux qui débutent en métrologie. Au cours de ce Pré-Module le groupe de travail « Métrologie » du
RTmfm/MI fournira aux participants le matériel nécessaire (billes, milieu de montage, lames,
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PREMODULES
lamelles, …) pour la préparation de lames de billes pour la métrologie. C'est notamment avec ces
lames que tout un chacun pourra participer au « Challenge de la PSF » qui sera organisé durant
Mifobio.
* Groupe de travail Métrologie du RTmfm dont Damien Schapman, Aurélien Dauphin, Perrine Frère,
Fabrice Cordelières, Alain Dieterlen, Daniel Zaharia.
Durée : 2h
3 ateliers sur ce thème sont proposés par le groupe de travail en cours de semaine. Ce prémodule
pourra être reproposé en cours de semaine.
- PM6 : Détecteurs en microscopie (14h30, Sébastien Marais et Marc Tramier)
Les détecteurs sont les éléments clés qui conditionnent, en fonction de leur sensibilité ou des
résolutions spatiale et temporelle qu’ils autorisent, la qualité de l’image finale. Connaître le
fonctionnement, les performances et limites des différents capteurs est donc particulièrement utile
pour concevoir une expérience en biologie. Ce prémodule s’adresse aux utilisateurs et personnes
chargées de concevoir un poste de microscopie en fonction du besoin expérimental. Ce prémodule
présentera en introduction les propriétés communes de ces détecteurs (capacité, bruit, rendement,
dynamique, linéarité, types de gains). Puis, les caractéristiques et utilisations des capteurs pour les
approches champ plein seront abordées (capteurs matriciels de type CCD classiques, EM-CCD,
sCMOS). Les performances comparatives de ces capteurs seront analysées. Enfin, les propriétés des
différents capteurs utilisés dans les approches utilisant le balayage (confocal, multiphoton
monopoint simples, certaines F-techniques) tels que les PMT, HyD ou les photodiodes seront
présentés.
Durée : 2h
La participation à ce pré-module pourra être complétée par l’atelier proposé par Sébastien Marais sur
les tests simples autour de différentes caméras sur échantillons fixés et vivants. Ce prémodule sera
reproposé au cours de la semaine.
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ATELIERS
FICHES DESCRIPTIVES DES ATELIERS
Les ateliers sont l'occasion de mise en commun interdisciplinaire de maniére concréte.
L'organisation des ateliers de MiFoBio est un point particulièrement lourd dans la mise en place de
l'école.
Nous tenons à exprimer nos remerciements les plus chaleureux au groupe de planification et mise en
place des ateliers (Fabrice Cordelières, Sandrine Lécart et Christine Terryn), à Tristan Piolot pour la
coordination avec nos partenaires industriels, et à Cédric Matthews pour la mise en place des
contrats associés.
Merci aussi à Julien Savatier (tables optiques) et Christophe Chamot (salles informatiques).
Enfin, n'oublions pas Didier Décimo et Karine Monier pour la mise en place de l'infrastructure de
culture cellulaire et animale.
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A1 - 2D Single Particule Tracking
Intervenants
Christophe Klein, [email protected]
Valérie Nicolas, [email protected]
Objectifs
L’atelier, d’une durée de 2 heures, comporterait 3 phases :
1- Présentation générale (intervenants): Power point d’introduction des problématiques scientifiques
et méthodologiques.
2- Sur poste de travail individuel (stagiaires) :
Utilisation des outils de tracking 2D disponibles dans les logiciels Imaris (Bitplane) et ImageJ pour
l’obtention des coordonnées X, Y des trajectoires de n particules en fonction du temps. Calcul du
MSD via un tableau Excel. Caractérisation de la dynamique des particules pour différents cas de
figures : mouvements Browniens, confinés, orientés. Calcul du coefficient de diffusion.
3- Compilation des résultats et synthèse.
Description
L'objectif est de présenter des outils de suivi de particule unique (Single Particules Tracking : SPT)
ainsi que les méthodes d'analyse des trajectoires obtenues (calcul du Mean Square Displacement :
MSD) afin de caractériser le comportement dynamique d'objets (cellules, vésicules) et de le
comparer dans différentes conditions expérimentales.
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ATELIERS
A2 - Microscopie super-résolutive PALM associée à l'optique adaptative
Intervenants
Xavier Marques, [email protected]
Objectifs
L'atelier présentera les performances de la microscopie PALM associée à l'optique adaptative sur
cellules neuronales fixées (préparation de l'échantillon et optimisation du signal avec l'optique
adaptative). On s’intéressera plus particulièrement à la géphyrine, protéine présente dans les
synapses inhibitrices. Les synapses représentent les liaisons neuronales où se situe la transmission du
message nerveux par les neurotransmetteurs. La géphyrine va permettre l'ancrage des récepteurs à
la Glycine et GABA dans la synapse.
L'imagerie en super résolution et en trois dimensions des clusters de géphyrines permettra de mieux
comprendre sa structure, et ainsi son influence dans l'interaction avec les récepteurs inhibiteurs
intervenant dans la régulation des messages nerveux.
Description
Ces dernières années de nouvelles techniques super résolutives en microscopie, comme le PALM
(Photo-Activation Localization Microscopy), se sont développées et ont permis de surpasser la limite
de diffraction de la lumière. La microscopie PALM consiste à n'allumer qu'une fraction des molécules
de l'échantillon. Chaque tache de l'image, ne correspond qu'a une seule molécule, peut être localisée
en déterminant le centre de la tache de diffraction. Il s’avère que la précision de localisation de
chaque molécule détectée, déterminant la résolution de l'image, est inversement proportionnelle au
nombre de photons détectés. L'optique adaptative va permettre de récolter un maximum de
photons de chaque molécule en atténuant les aberrations optiques.
De plus, l'optique adaptative offre de nouvelle opportunité avec l'imagerie en trois dimensions. En
effet le système peut simuler une lentille cylindrique afin d’obtenir les coordonnées axiales des
molécules.
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A3 - dSTORM 3D à l’aide de l’émission « super critique »
Intervenants
Nicolas Bourg, [email protected]
Sandrine Lécart, [email protected]
Objectifs
Nous souhaitons établir deux niveaux d’expertises à nos différentes séances : débutant et confirmé.
1) Atelier pour les débutants (atelier plutôt axé sur l’utilisation d’un microscope dSTORM) :
Nous commencerons par une présentation (30 min environ) « powerpoint » qui rappellera :
- Le principe des différentes techniques de super-localisation
- Les différents algorithmes de localisation 2D(brièvement)
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ATELIERS
- Les techniques de super résolution 3D et les algorithmes associés (brièvement)
- Notre technique de super-résolution 3D avec les résolutions atteignables
- La composition des tampons efficaces et les fluorophores associés
- Les puissances laser nécessaire (avec et sans couplage par fibre) et les paramètres de localisation
(seuil, critère de diamètre des zones détectées, …)
Nous continuerons par des acquisitions sur différents échantillons et différents tampons dSTORM.
Nous comparerons en direct les différences d’efficacités entre les différents tampons et
fluorophores.
Nous finirons par des questions tout en laissant certains utilisateurs sur le microscope afin de mieux
comprendre la technique et ses difficultés.
Durée totale environ 2 h.
2) Atelier pour les confirmés (atelier plutôt axé sur le développement d’un microscope à superlocalisation 2D et 3D) :
Nous commencerons par une présentation (45 min environ) « powerpoint » qui rappellera les points
abordés lors de la séance d’initiation (principe des techniques de super localisation, algorithmes 2D
et 3D, composition des tampons dSTORM). Nous insisterons sur les points suivants :
- Notre technique de super-résolution 3D avec les précisions atteignables
- La calibration de notre système SAF
- Les puissances laser nécessaire (avec et sans couplage par fibre) et les paramètres de localisation
(seuil, critère de diamètre des zones détectées, algorithme de suppression du fond local afin
d’améliorer la détection)
- Les techniques pour inhiber ou contrôler les dérives dans les 3 dimensions
- Le développement d’un logiciel « maison » permettant d’observer la reconstruction en temps réel
avec la puissance d’ordinateur nécessaire
Nous continuerons par des acquisitions sur différents échantillons et différents tampons biologiques
dSTORM. Nous comparerons en direct les différences d’efficacités entre les différents tampons et
fluorophores.
Dans cette séance avancée, l’accent sera mis sur le développement instrumental et méthodologique
(microscope, optique, logiciel, traitement on line et protocoles d’acquisition)
Durée totale environ 2 h.
Description
Notre dispositif « home-made » allie les techniques de super-localisation (PALM, STORM, dSTORM) à
la détection de l’émission « super critique » (utilisation du module virtual SAF présenté par Thomas
Barroca lors de MiFoBio 2012). Ceci permet d’obtenir des résolutions de 20 nm dans les 3
dimensions.
Pendant l’atelier, nous rappellerons brièvement le principe et les différences entre les techniques de
super-localisation en insistant plus particulièrement sur la technique dSTORM. Nous aborderons tous
les principaux critères pour obtenir des images super-résolues (puissance laser avec couplage ou non
dans une fibre, dichroïque, filtres, algorithme de traitement pour la localisation online et offline,
contrôle de la dérive 3D, objectifs, lamelles, tampons dSTORMet fluorophores possibles).
Concernant le module 3D par détection du « super-critique », nous expliquerons le principe, les
avantages et les inconvénients de la technique ainsi qu’également tous les points clefs associés à son
bon fonctionnement.
Tout sera mis en place expérimentalement. Les participants pourront faire des acquisitions afin de
comprendre les paramètres importants pour obtenir des images super résolues.
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ATELIERS
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A4 - Imagerie de super-résolution par diffraction conique
Intervenants
Pierre Bourdoncle, [email protected]
Jean-Yves Tinevez, [email protected]
Objectifs
En parallèle d'une présentation sur la théorie de la diffraction conique, nous ferons plusieurs
acquisitions sur des échantillons type, dans le but de démontrer le pouvoir résolutif et la simplicité
d'utilisation du système.
Description
Utilisation pratique d'une nouvelle famille de super-résolution, par diffraction conique utilisant un
cristal biaxial mince.
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A5 - PALM STORM Démocratique
Intervenants
Béatrice Durel, [email protected]
Objectifs
En parallèle d'une présentation détaillant chaque étape, nous feront la démonstration sur différents
systèmes, soit sur des systèmes commerciaux dédiés (ELYRA GSD N-STORM) soit sur des microscopes
TIRF non dédiés que l'on customisera sur place.
Description
Rendre accessible au plus grand nombre les nouvelles techniques de super-résolution et plus
particulièrement les techniques de pointillisme.
Le but de l'atelier sera de détailler chaque étape d'une manipe type, du marquage à la reconstruction
d'image, en passant par l'acquisition. Ainsi montrer que la majorité des laboratoires peuvent
prétendre à de la super-résolution sur leur microscopes avec très peu d'investissement.
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ATELIERS
A6 - Mise en place du BALM : technique de microscopie à haute résolution nécessitant un
microscope confocal et des fluorochromes conventionnels.
Intervenants
Sophie Allart, [email protected]
Astrid Canivet, [email protected]
Objectifs
Le BALM est une technique qui utilise un ou plusieurs marqueurs organiques conventionnels (il n’y a
pas besoin de sondes photoconvertibles ou photoactivables) permettant d’obtenir une image avec
une résolution inférieure à la limite de résolution optique. Le procédé utilise la propriété de photoblanchiment intrinsèque des fluorophores pour les détecter et les séparer spatialement. Pour cela, il
est nécessaire d’acquérir une pile d’images et d’en soustraire à chaque image de la série l’image
précédente afin de détecter le photoblanchiment des fluorophores. Une fois la soustraction
effectuée, l’émission de fluorescence de fluorophores uniques est identifiée et leur localisation est
déterminée en ajustant la distribution d’intensité avec une Gaussienne théorique.
Pendant l’atelier, nous montrerons dans un premier temps comment réaliser l’acquisition d’une série
d’images BALM grâce à un microscope confocal conventionnel équipé d’un système de maintien de
focus. Dans un deuxième temps, nous utiliserons le logiciel ImageJ pour soustraire les images une à
une, puis le « plugin QuickPALM » d’ImageJ pour corriger la dérive latérale de l’échantillon et ajuster
la distribution d’intensité des molécules isolées, et enfin, reconstruire l’image 2D finale. Pour finir,
nous discuterons des avantages et inconvénients de la super-résolution BALM par comparaison avec
les autres techniques de super-résolution obtenue par pointillisme (PALM, STORM, dSTORM…)
Description
Mettre en place, sur un échantillon fixé standard avec des réactifs classiques, une expérience de
BALM (Bleaching/blinking Assisted Localization Microscopy), technique de super résolution
nécessitant seulement un microscope confocal équipé d'un système de maintien de focus. La
localisation et l'activation de la molécule d’adhésion LFA-1 sera investiguée à partir d’échantillons
fixés de co- culture cellulaire entre lymphocytes T cytotoxiques et cellules tumorales cibles, imunomarqués à l’aide d’un anticorps spécifique couplé à l’Alexa-555.
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ATELIERS
A7 - Ultrastructure of centrosomes.
Intervenants
Karine MONIER, [email protected]
Magali MONDIN, [email protected]
Objectifs
- présentation des approches dSTORM (théorique) et du système utilisé avec calibration pour 3D
- présentation du modèle biologique : déterminer la localisation d'une protéine centrosomale par
rapport à d'autres constituants déjà localisés (théorique)
- description de la préparation des échantillons : immunofluorescence, incubation des billes,
montage des lames avec milieu de réduction et twinsil (théorique et pratique)
- imagerie 2D en 2 couleurs de centrosomes (pratique)
- imagerie 3D en 1 et 2 couleurs de centrosomes marqués (pratique)
- reconstruction des images de super-résolution (pratique)
Description
Montrer l'intérêt de la technique dSTORM 2 couleurs pour analyser la localisation de différents
constituants centrosomaux.
Montrer l'intérêt de l'implémentation de la technique en 3D pour l'analyse de cette structure.
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A8 - 3D PALM sur plantes
Intervenants
Romain LE BARS, [email protected]
Laëtitia BESSE, [email protected]
Objectifs
Sur un modèle plante (Arabidopsis Thaliana) ou sur bactérie (Vibrio Cholerae ou E. Coli), nous nous
proposons d'observer la distribution et l'arrangement cellulaire de certaines protéines couplées à des
protéines photo-activables et photo-convertibles (MBD-MAP4, Calnéxine, MatP et FtsZ). Ces
acquisitions ont l'habitude d'être faites sur le système N-STORM de NIKON.
Durant cet atelier, nous détaillerons le fonctionnement du système utilisé, nous réaliserons les
acquisitions et présenterons les paramètres impliquées dans la reconstruction des images 2D et 3D.
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ATELIERS
Si le temps nous le permet, nous proposerons également la réalisation d'une séquence d'images pour
rendre compte de la dynamique des protéines en super-résolution.
Description
Adapter la super résolution sur plantes et bactéries et contourner les difficultés liées à ces modèles
en 2D et en 3D
Partager nos connaissances sur ces modèles à la communauté scientifique
Reconstruction des images en super-résolution 2D, 3D et PALM dynamique.
***
A9 - Utilisation de la super-résolution STORM pour définir l'architecture d'un compartiment
neuronal
Intervenants
Christophe Leterrier, [email protected]
Objectifs
- Présentation de la technique STORM
- Organisation périodique (180 nm) du complexe actine/spectrine dans l'axone
- Bandes de ßIV-spectrine dans le SIA (images acquises)
- Spécificité du STORM avec couple activateur-rapporteur
STORM 2 couleurs
- Cartographie des complexes moléculaires grâce au STORM 2-couleurs et aux anticorps contre
différents domaines de la même protéine
- Exemple de l'ankyrine G, partenaire de la ßIV-spectrine (images acquises)
Description
Démontrer comment l'utilisation de la microscopie de super résolution de type Stochastic Optical
Reconstruction Microscopy (STORM) permet d'accéder à l'organisation macromoléculaire de
compartiments cellulaires spécifiques, sur l'exemple du cytosquelette spécialisé présent au segment
initial de l'axone (SIA).
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ATELIERS
A10 - Microscopie super-resolution PALM/dSTORM 3D pour étudier la répartition des récepteurs
membranaires
Intervenants
Karen Uriot, [email protected]
Orestis Faklaris, [email protected]
Objectifs
La protéine membranaire étudiée est DCC (Deleted in Colorectal Cancer). Il s'agit d'un récepteur
membranaire enrichi au niveau des filopodes (structures riches en actine d'environ 800 nm de
diamètre) connu pour son rôle de récepteur de la Nétrine-1, impliquée dans le guidage axonale et
l'adhésion cellulaire. L'utilisation des techniques de PALM et dSTORM permet de localiser la
répartition des récepteurs membranaires avec une résolution latérale pouvant descendre à moins de
20nm et permet ainsi de séparer des signaux qui paraissent superposés lorsqu'ils sont observés en
microscopie classique. Grâce à l'apport de la 3D, il est possible d'obtenir une information sur la
distribution de ces récepteurs selon leur distance à la lamelle et donc selon leur éloignement des
sites d'adhésion avec une résolution axiale de 80nm. Le PALM et le dSTORM seront combinés afin
d'analyser la répartition et l'interaction de DCC et des filaments d'actine au sein des filopodes selon
que l'on se trouve au niveau basal ou à distance de la lamelle.
i) Préparation de l’échantillon
Pour l’imagerie PALM/dSTORM une préparation spéciale des échantillons est requise. Au sein de
l’atelier les échantillons seront montés sur les tampons spéciaux pour l’imagerie PALM/dSTORM et
leur influence sur l’acquisition de l’image sera expliquée. La synthèse des tampons sera faite sur
place, pour mettre en avant les avantages et les difficultés liés à cette étape.
ii) Acquisition
L’acquisition en 2 couleurs et 3D sera effectuée. Les paramètres jouant un rôle important sur le
rendu de l’acquisition seront expliqués : la puissance des lasers d’activation et d’excitation, le drift
latéral et axial, le temps d’acquisition par frame, le clignotement des sondes, la densité du marquage.
iii) Analyse des donnés
L’analyse des donnés et la construction de l’image finale super-résolue est un point fondamental de
ce type de microscopie. Cette analyse sera faite sur place, avec les donnés de l’acquisition prise sur
l’échantillon biologique. L’influence des paramètres sur la précision de la localisation finale, tout
comme le nombre des photons détectés sera étudiée. De plus, à partir des donnés expérimentales, il
sera possible de tester plusieurs logiciels de traitement des images PALM/dSTORM afin de les
comparer et définir leurs points forts.
Description
Cet atelier a pour but d'introduire l'utilisation de la microscopie à super-résolution multi-couleurs
(PALM + dSTORM) afin de répondre à une question biologique nécessitant l'accès à la 3D telle que
l'analyse de la répartition d'un récepteur membranaire et de son interaction avec le cytosquelette. Le
11
ATELIERS
principe de l'imagerie PALM/STORM en 3D sera exposé des mesures de calibration jusqu'à
l'acquisition des images sur échantillons biologiques. Par ailleurs, tous les paramètres critiques seront
décrits et expliqués : partant de la préparation de l'échantillon jusqu'à l'acquisition des images et leur
traitement.
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A11 - In celulo assessment of photophysical parameters of fluorescent proteins used as markers for
PALM microcopy
Intervenants
Dominique Bourgeois, [email protected]
Romain Berardozzi, [email protected]
Objectifs
A simulation software will first be presented to show the audience how photophysical parameters
influence PALM data quality. Then, we will experimentally measure the photobleaching,
photoblinking, and photoactivation quantum yields of two proteins commonly used for PALM
experiments: mEos2 and Dendra2. We will either use samples that we will bring (e.g. fixed HeLa cells
labeled with Dendra2-actin), or possibly samples brought by the audience. Pretty much standard
PALM data sets will be collected, and a lot of emphasis will be put on the data processing strategy
behind, allowing to retrieve the photophysical parameters. If time allows, the effect of additives on
modifying the photophysical parameters will be shown. During the practical, we will also describe
how the observed photophysics at the single molecule level connects with the three-dimensional
structure of the fluorescent protein markers. Thereby, we will sensitize super-resolution
microscopists to the importance of the precise mechanistic knowledge of the used probes.
Description
The goal of this practical will be to show that the photophysical behavior of fluorescent protein
markers used in PALM microscopy 1/ play a stringent role in the quality of the obtainable data,
particularly in terms of the quantitative evaluation of target protein copy number, oligomerization
state or clusterization, 2/ can be measured directly from PALM data collected in biological cells, 3/
differ from one marker to another, for a given sample, 4/ differ from one sample to another, for a
given marker.
***
12
ATELIERS
A12 - Atelier transversal : Comparaison des techniques de super résolution STED 3X et microscopie
STORM sur le localisation de protéines synaptiques
Intervenants
Christel Poujol, [email protected]
Daniel Zaharia, [email protected]
Objectifs
L'atelier se déroulera sur 2 systèmes simultanément: le microscope GSD et le STED 3X. Un échantillon
identique sera analysé sur les deux systèmes. Le groupe de participants sera découpé en 2 sousgroupes qui seront échangés à la moitié du temps.
La démo se déroulera avec:
1) un bref rappel du principe de la technique
2) une brève description de l'échantillon (immuno-marquage pour 2 protéines)
3) acquisition et représentations de l'image
Description
L'objectif de cet atelier est de vérifier la localisation de 2 protéines synaptiques dans des neurones en
culture en utilisant la microscopie STED et la microscopie STORM. Durant cet atelier nous évaluerons
la complémentarité des deux techniques, notamment en terme de résolution, de temps
d'acquisition, avantage de la 3D.
***
A13 - STED 3D multicouleurs cytosquelette et levure
Intervenants
Jim Dompierre, [email protected]
Objectifs
1° partie: description des caractéristiques techniques du système et des apports permettant
d'améliorer la résolution en z et d'étendre la faisabilité du STED à plusieurs couleurs.
2° partie: essai en multi-couleurs
3° partie: apport de l'amélioration de la résolution en z
4° partie: discussion sur les apports de la techniques et ses limites.
Description
L'objectif de cet atelier est de montrer comment, de façon pratique, il est possible de réaliser de
l'imagerie de superrésolution en x, y et z en STED sur des fluorophores couramment utilisés en
13
ATELIERS
biologie cellulaire. Nous montrerons au moyen de levures exprimant CFP, GFP et mCherry, la
faisabilité et l'apport de cette technique dans l'étude des remaniement du cytosquelette de la levure
au cours de la quiescence et discuterons des avantages et limites de cette imagerie comparées aux
autres techniques de superrésolution.
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A14 - Advanced dSTORM superresolution imaging through optimizations from sample preparation
to visualizations tips
Intervenants
Corey Butler, [email protected]
Objectifs
This workshop will show optimizations to all the aspects of dSTORM acquisitions improve the final
superresolution image quality and accuracy. Live 2D and 3D dSTORM acquisitions will be performed
on fixed cells using Nikon’s system with an Adaptive Optic module MicAO in the emission path
(microscope + software).
Specifically, we will discuss the importance of sample preparation (immunostaining and fixation
protocols) and dSTORM buffer composition in the accuracy of superresolution images. We will
demonstrate how an adaptive optics system can be used in order to correct for inherent aberrations
in the microscope, improving 2D, 3D imaging, as well as increasing depth of imaging with precise PSF
control compared to traditional cylindrical lens based systems. We will discuss the pros and cons of
the type of cameras used for acquisition (chips and sizes). We will demonstrate the characteristics of
a “strong” dSTORM signal and the tradeoffs in acquisition parameters (frame exposure time, gain
settings, laser power). We will discuss the analyzing and visualization tools in order to quantify
precisely the super resolved images. Lastly, we will demonstrate how all these small optimizations
can be combined to improve the quality of dSTORM superresolution images.
Description
The main objective is to demonstrate various optimizations to the standard dSTORM acquisition
protocol, specifically for users who already have a dSTORM system or who are interested in
superresolution imaging. This workshop will help current dSTORM users to better understand how
each aspect of the sample preparation, image acquisition, and image processing contribute to the
quality of the final image.
***
14
ATELIERS
A15 - Suivi des tensions mécaniques au niveau des jonctions cellules-cellules en utilisant des
biosenseurs FRET.
Intervenants
Gaetan Herbomel, [email protected]
Marc Tramier, [email protected]
Objectifs
Sur un système FLIM, suivre le FRET au cours du temps du biosenseurs EcadTSMod au niveau des
jonctions cellules-cellules d'un modèle défini (Cellules ou embryons). Analyse de différentes
constructions incluant les contrôles (FRET minimal et FRET maximal), et ainsi déterminer les forces
appliqués aux jonctions en condition normal. En fonction du modèle, suivi des variations de force
induites par des phénomènes naturelles (division, apoptose ...) ou induites par l'ajout de drogues
agissant sur le cytosquelette. Ainsi au cours de l'atelier il sera possible de voir l'aspect mesure de
force par FLIM/FRET en utilisant les biosenseurs, avec les contrôles nécessaires, ainsi que l'aspect
dynamique du phénomène de méchanotransduction.
Description
Etudier par FLIM/FRET les tension mécaniques au niveau des jonctions cellules-cellules en utilisant
des biosenseurs FRET tels que le "Cadherin tension sensor" (EcadTSMod) dans des modèles
d'épithélium (Cellules MDCK en culture, ou embryons).
Suivre spatio-temporellement les variations de force induite par différents phénomènes biologiques
(division, exclusion de cellules apoptotique, ...) in-vivo ou dans un modèle "épithélium-like"
***
A16 - Analyse dynamique des fibres de stress d’actine par photoconversion et nano-ablation.
Intervenants
Laetitia Kurzawa, [email protected]
Fabrice Senger, [email protected]
Objectifs
Nous procéderons à une brève introduction sur la composition et l’organisation des fibres de stress
au sein des cellules eucaryotes. Nous pourrons ainsi mettre l’accent sur l’importance de l’interaction
entre cellule et matrice extracellulaire notamment dans des processus de migration cellulaire et de
même introduire la notion de méchanotransduction impliquée, à titre d’exemple, dans la régulation
de l’expression des gènes.
Pour l’ensemble des expériences proposées nous disposons des outils d’analyse ainsi que de jeux de
données acquises au laboratoire. Cela nous permettra en cas de problème technique de présenter
les résultats que permettent d’obtenir les approches proposées.
15
ATELIERS
Nous aurons recours à des cellules vivantes RPE-1 exprimant une construction Actin-Dendra2
(molécule photoconvertible vert-rouge). Ces cellules seront déposées sur des micro-patrons afin de
contrôler leur géométrie et de générer ainsi des fibres de stress de manière reproductible.
En un premier temps nous procéderons à des expériences de photoconversion. Il s’agit de réaliser
des marques régulièrement espacées le long des fibres de stress puis de suivre l’évolution de ce
signal dans le temps.
Dans un deuxième temps, nous procéderons à des expériences de nanablation sur ces fibres de
stress, nous pourrons suivre par time-lapse la rétraction des fibres ainsi coupées. Finalement nous
allons combiner les deux approches afin de vérifier l’impact de la nano ablation sur la dynamique des
molécules d’actine photoconvertie au sein des deux portions de fibres.
Description
L’atelier à pour but de présenter deux techniques complémentaires permettant de caractériser des
aspects fondamentaux des fibres de stress. Les expériences de photoconversion permettent de
visualiser la dynamique de l’actine au sein des fibres de stress. Les expériences de nano-ablation
permettent de mettre en évidence l’accumulation de stress mécanique au sein de ces fibres. Il s’agit
en l’occurrence de suivre la relaxation de ces fibres suite à la nano- ablation.
La combinaison des deux techniques permet de visualiser l’impact du stress mécanique sur la
relocalisation de l’actine au sein des fibres.
***
A17 - Microfluidique en microscopie à fluorescence champ large et confocale.
Intervenants
Philippe Hulin, [email protected]
Ha Nedellec, [email protected]
Objectifs
L'atelier s'efforcera de démontrer l'intérêt de la microfluidique sur des systèmes biologiques.
Nous prévoyons de faire une expérience de rolling afin de montrer des phénomènes d'adhérences
sur matrice ou tapis cellulaire, une autre expérience visera à mettre en évidence la diapédèse en flux.
Nous pouvons également prévoir une expérience d'activation de cellules immunitaires (Lymphocyte
T) en associant des mesures de calcium (Fura-2) en présence de forces de cisaillement.
Description
Avantage de l'apport de la force de cisaillemnet sur le comportement cellulaire.
***
16
ATELIERS
A18 - Nouvelles sondes biocompatibles pour l’étude de la morphogenèse de l’embryon de
zebrafish par microscopie biphotonique.
Intervenants
Sylvia Bruneau, [email protected]
Marie-Thérèse Charreyre, [email protected]
Objectifs
L’atelier débutera par deux présentations synthétiques portant sur la synthèse des molécules
organiques et polymères synthétiques et la seconde portant sur leur utilisation in vivo (balnéation).
Ensuite, une démonstration pratique sera réalisée par microscopie biphotonique d’embryons de
zebrafish marqués.
Description
L’atelier a pour but de présenter, dans le cadre d’une recherche transdisciplinaire entre chimistes et
biologistes, de nouveaux marqueurs organiques pour la microscopie biphotonique dans des
embryons de zebrafish in vivo.
Dans le domaine de l’imagerie d’embryons in vivo, les marqueurs génétiques (xFPs) représentent la
famille de marqueurs les plus populaires en imagerie biologique. Cependant, il est nécessaire de
produire des lignées transgéniques pour obtenir l’expression stable de ces protéines fluorescentes.
Souvent, les premiers stades de développements ne sont pas accessibles car l’expression des
marqueurs génétiques nécessite l’activation du génome embryonnaire et la maturation des
protéines fluorescentes.
En alternative à la transgenèse, nous présenterons de nouvelles sondes biocompatibles (molécules
organiques et polymères synthétiques) excitables au-delà de 900nm pour assurer une plus grande
pénétration dans l’échantillon et émettant dans le proche infrarouge afin d’étudier la morphogenèse
d’embryons relativement épais tels que le zebrafish par microscopie biphotonique.
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A19 - Recording neuronal activity in Drosophila neurons using bi-photon microscopy and
genetically encoded calcium sensors
Intervenants
Abud Farca, [email protected]
Jean-Christophe Comte, [email protected]
Objectifs
One technique widely used to unravel spontaneous and sensory-evoked activity in populations of
neurons is using calcium imaging. The Drosophila model offers several advantages to study neuronal
circuits and their function due its short life cycle, easiness of manipulation and genetic tools
available. In the other hand, bi-photon microscopy is recently preferred for functional imaging due to
its sensitivity and less photo damage compared to other calcium imaging techniques.
17
ATELIERS
We will use the animal model Drosophila melanogaster to take advantage of the genetic tools
available and the readiness of the preparation. In specific, we will use the binary system Gal4/UAS to
express fluorescent genetically encoded calcium sensors (GCaMP) in all or specific groups of neurons.
An adult fly brain dissection would be performed in a petri dish to be observed under the bi-photon
microscope. The brain is firstly recorded in Ringer's solution as a physiological medium as baseline.
After that, neuronal depolarization would be elicited with KCl supplied in the drop of Ringer's
solution covering the brain. Changes in fluorescence of the calcium sensor due to calcium influx
would be recorded. Image sequences are analyzed by choosing a region of interest (ROI). Average
emission intensities from GCaMP are quantified for each image. Average intensities of a ROI outside
the labeled structure should be subtracted as background. The emission intensity (F) at the frames
immediately before KCl application is determined as F0, and ΔF/F0 is calculated for each image.
Description
The aim of this workshop is to facilitate basic knowledge to study neuronal function applying calcium
imaging using bi-photon microscopy in the central nervous system of Drosophila. The model is
advantageous for this aim since a test of principle can be taught in an easy and quick way.
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A20 - Utilisation de biosenseurs chez le poisson zèbre : comment rapporter une activité biologique
in vivo
Intervenants
Jérémie Teillon, [email protected]
Carole Gauron, [email protected]
Objectifs
L’atelier sera encadré par Jérémie Teillon, responsable de la plateforme d’imagerie du CIRB au
Collège de France, et par Carole Gauron, ingénieur d’étude sur la plateforme de transgénèse poisson
zèbre du CIRB au Collège de France.
1) Introduction théorique aux biosenseurs et à leur utilisation chez le poisson zèbre
2) Dispositif expérimental :
Préparation d’un embryon de zebrafish en vu d’une observation au microscope confocal (inclusion
dans un gel d’agarose et montage).
Réglage des paramètres d’acquisition du microscope en fonction du senseur (ex : utilisation du
senseur ratiométrique « Hyper » pour la mesure de la production de ROS)
3) Acquisition de stack-z, multi-canaux, dans le temps.
4) Traitement et analyse de l’image. Réalisation des images ratiométriques. Représentation des
résultats. Analyse au cours du temps.
Description
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ATELIERS
Le poisson zèbre, du fait de sa totale transparence aux stades embryonnaire et larvaire, est de ce fait
très adapté à l’imagerie et nous permet ainsi de tester de nombreux outils optogénétiques, tels que
les biosenseurs.
Ces biosenseurs génétiquement encodés permettent le suivi in vivo, de façon non invasive, de
processus biologiques importants survenant au cours du développement, ou à la suite de
perturbations.
Nous proposons donc dans cet atelier de suivre in vivo des phénomènes tels que la production de
radicaux libres (ROS), l’apoptose ou les variations de flux calciques avec des biosenseurs. L’objectif de
cet atelier sera de montrer l’intérêt de ces outils aussi bien dans l’étude du développement que pour
l’étude de pathologies.
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A21 - Etude de la repousse axonale chez la drosophile : protocoles d'acquisition et analyse
d'images
Intervenants
Caroline Medioni, [email protected]
Grégoire Malandain, [email protected]
Objectifs
L’atelier se déroulera en 3 phases.
1. Présentation du modèle biologique (10 minutes)
2. Montage des échantillons sous loupe binoculaire avec source de lumière fluorescente. Le montage
est réalisé par l’intervenante, les participants seront invités à observer à la loupe les différentes
étapes du montage. (15 minutes environ)
3. Acquisition des images avec un microscope 2-photons avec statif inversé. Discussion autour des
conditions d’imagerie et du réglage des paramètres du microscope afin de permettre une image
dynamique d’axones en croissance de bonne qualité (i.e. peu de blanchissement, bon rapport signalsur-bruit, etc.). Réalisation d’une acquisition rapide, et visualisation par le groupe des images sur la
console. (45 minutes)
4. Présentation des outils d’analyse d’images à base de diapositives, et de résultats obtenus sur une
séquence complète (i.e. suffisamment longue) acquise au préalable. Les étapes abordées seront nous
proposons :
a. correction du blanchissement
b. correction de la dérive
c. détection des terminaisons axonales
d. suivi des terminaisons axonales
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ATELIERS
e. post-traitement / sélection des suivis
Dans le cadre de l'atelier, nous approfondirons essentiellement des contributions originales à savoir
la correction de la dérive (un mélange du mouvement global de l'échantillon imagé mais aussi de ses
déformations liées à son évolution/croissance), et montrerons comment l'utilisation des co-recalages
des images de la séquence entière permet de mieux corriger cette dérive, la détection des
terminaisons axonales avec des processus ponctuels utilisant un modèle géométrique dédié, et enfin
le suivi de ces terminaisons vu comme un problème d'optimisation dans des graphes. (45 minutes)
Description
Présenter une méthodologie complète combinant acquisition et analyse des images, avec
focalisation sur un problème spécifique d'imagerie dynamique.
Proposer un système de montage stable pour l'imagerie dynamique en microscopies 2-photons et
confocale.
Présenter des méthodes originales d’analyse d’images 3D + temps, en particulier pour la correction
de la dérive.
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A22 - Correlative light and electron microscopy with Array tomography
Intervenants
Christel Genoud, [email protected]
Yannick Schwab, [email protected]
Objectifs
-les participants reçoivent des blocs de résine Avec des C.elegans ayant la trachée fluorescente
(mcherry).
-les participants préparent des coupes de microscopie électronique en série à l Aide d un Ultracut et
les déposent sur des lames de verre ou des waffers. ce sont des rubans de coupes.
-les coupes sont observées au microscope optique. les structures fluorescentes sont identifiées sur
chaque coupe sériée et leur coordonnées/localisation sont déterminées.. des Images sont acquise
pour chaque coupe.
-les même coupes sont placées dans le microscope à balayage .
-grâce aux coordonnées obtenues au microscope optique, la région d'intérêt est rapidement localisée
en microscopie électronique et des Images à haute résolution sont acquises pour Déterminer
l'ultrastructure de la trachée.
20
ATELIERS
Description
Observation/quantification d'une structure biologique à l'aide de la microscope optique puis
électronique. Des vers C. elegans préparés pour la microscopie électronique sont coupés en série de
coupes de 200 nm. L'identification de la structure d'intérêt se fait tout d'abord avec des microscopes
optiques à fluorescence permettant de localiser la structure sur des coupes en série. En second lieu,
les régions identifiées par microscopie optique sont visualisées dans un microscope électronique à
balayage pour en obtenir l'ultrastructure sur des coupes sériées.
***
A23 - Optimisation de la résolution axiale et de la pénétration dans l’échantillon : nouveaux
milieux de montage à haut index réfractaire.
Intervenants
Susanne Bolte, [email protected]
Jean-François Gilles, [email protected]
Objectifs
-Introduction théorique (notions d’aberration sphérique, influence de l’épaisseur de la lamelle, de l
‘huile d’immersion et du milieux de montage sur la résolution). Powerpoint, environ 20 minutes.
-Démonstration pratique de la préparation d’un échantillon biologique optimisée (coupes de cerveau
de souris fixées). Comment monter son échantillon, quelle lamelle, quel milieu, quelle huile. Environ
20 minutes.
-Exploitation de lames au confocal, acquisition de z-stacks sur des échantillons biologiques. Environ
50 minutes.
• Influence de la lamelle, influence du milieu de montage.
• Echantillon optimisé.
-Exemples d’application biologique en neurobiologie et application pour d’autres types d’imagerie.
Powerpoint, environ 15 minutes
Discussion/Questions, environ 15 minutes.
Description
La résolution latérale d’un système optique augmente de façon linéaire avec l’ouverture numérique
de l’objectif utilisé, tandis que la résolution axiale augmente de façon quadratique. C’est une des
raisons, pour laquelle on utilise des objectifs à haute ouverture numérique et donc à immersion huile
pour la microscopie confocale. Leur performance a été optimisée pour des systèmes d’immersion
idéales, c’est à dire pour travailler dans un indice de réfraction homogène et comparable à celui du
verre. Cependant, les milieux conventionnels que nous utilisons dans la pratique ont un indice de
réfraction entre 1,4 et 1,49 qui est légèrement en dessous du système d’immersion « objectif-huile
d’immersion-lamelle » avec 1,518. Ceci engendre des aberrations sphériques et par conséquent une
21
ATELIERS
perte de résolution axiale, d’énergie en profondeur de l’échantillon et une décalage du point focal
(Hell et al., 1993, Diaspro et al., 2002, Egner and Hell, 2006).
L’objectif de cet atelier est de montrer qu’une préparation optimisée d’échantillon permet d’éviter
les aberrations sphériques rencontrées en microscopie confocale. Nous montrerons premièrement
que la divergence entre le système d’immersion « objectif-huile d’immersion-lamelle », le milieu de
montage et l’échantillon induit une aberration sphérique non-négligeable. Ensuite, nous
comparerons des milieux de montage conventionnels avec de nouveaux milieux à haut index
réfractaire. Nous démontrerons l’amélioration de la résolution axiale et de la pénétration dans des
échantillons fixés épais (cerveau de souris, poisson zèbre) soit immuno-marqués ou portant des
protéines fluorescentes. De même, nous démontrerons l’influence des milieux de montage sur la
transparence des tissues.
***
A24 - Du microscope à l'analyse des neurones chez la souris: mosaïque et Imagerie 3D sur neurones
en culture et tissus en profondeur.
Intervenants
Lydia Danglot, [email protected]
Vincent Contremoulins, [email protected]
Objectifs
Bref rappel théorique avec diapos et/ou poster sur l'échantillonnage, la résolution optique, et les
calculs de correction d'inhomogénéité de champ.
Acquisition d'images sur un confocal (de préférence Leica avec si possible module 3Dx) sur des
cellules en cultures fixées (2D) et sur des coupes de tissus nerveux (3D).
Les coupes de cerveaux de souris transgéniques (non pathogènes) exprimant la CFP dans les
dendrites et épines nerveuses avec quadruples marquages fluorescents permettront de visualiser les
couches cellulaires (2-5mm), l'arbre dendritique
(100-200 microns) et les épines (1-3um) et d'appréhender ainsi les différentes échelles biologiques.
Ouverture et reconstruction des mosaïques sur ImageJ et Icy (logiciels gratuits).
Analyse d'épines dendritiques avec Matlab et Imaris : segmentation, tri sur critères morphologiques
(taille, diamètre, longueur), classement par catégories d'épines (filopodes, mushroom, stubby).
La quantification de la proportion d'epines dendritiques de type mushroom vs stubby est
biologiquement informative car elle est corrélée au processus de mémorisation (plasticité cérébrale)
couremment mesurée chez certains mutants.
Description
Mosaïque :
Maîtriser les notions d'échantillonnage, de résolution et Savoir réaliser une mosaïque d'images
confocales.
Réaliser des acquisitions avec lames type "Chroma" pour mesurer l'inhomogénéité.
Reconstruire les mosaïques (avec ImageJ et/ou Icy) et corriger l'inhomogénéité de fond (Shadding
correction).
22
ATELIERS
Analyse 3D :
Savoir réaliser une acquisition 3D sur tissus (ex: réseaux neuronaux et épines dendritiques).
Optimiser l'échantillonnage d'acquisition en fonction de l'objectif et de l'épaisseur de l'objet.
Savoir reconstruire, visualiser, quantifier et classer des objets 3D en fonction de paramètres
morphologiques (taille, longueur).
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A25 - Imagerie multiphotonique grand champ : application à l’étude de tumeurs dans leur contexte
tissulaire.
Intervenants
Marie Irondelle, [email protected]
François Waharte, [email protected]
Objectifs
Dans un contexte d’imagerie intravitale, nous étudierons la structure de tissus comportant des
tumeurs induites par injection in vivo de cellules fluorescentes sur un prototype de microscope grand
champ, permettant l’imagerie de fluorescence par excitation à deux photons et la génération de
seconde harmonique.
1) Présentation du système optique et de ses caractéristiques
2) Exploration des tissus préparés et fixés préalablement (prélèvement de souris) :
- Imagerie 3D en excitation à deux photons et SHG à différentes profondeurs,
- analyse de la structure de la matrice extracellulaire (collagène) dans différentes régions,
- comparaison de cette structure dans différents tissus pour voir l’influence des cellules tumorales
sur sa ré-organisation.
Description
imagerie de cellules fluorescentes et de la matrice extracellulaire par fluorescence à deux photons et
génération de seconde harmonique
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A26 - Microscopie à feuille de lumière sur échantillons végétaux (jeunes racines)
Intervenants
Houssam Hajjoul, [email protected]
Geneviève Conéjéro, [email protected]
Objectifs
Atelier limité à 8 personnes
Présentation du système
Protocoles de préparation des échantillons.
Montage des plantes dans la chambre.
Acquisitions des images
Traitement des images
23
ATELIERS
Description
Etudes des Relations structure-fonction chez la plante: visualisation en 3D de l'architecture cellulaire
et tissulaire de racine de jeune plantule (Arabidopsis thaliana, riz) et de marquages fluorescents
fonctionnels (plantes transformées GFP, YFP...).
Marquages de transporteurs d'ions, aquaporines et facteurs de transcriptions.
Suivi dans le temps de la croissance racinaire, émergence de racines secondaires (24-48h) en
conditions contrôlées: imagerie rapide.
Objectif: pouvoir comparer croissance wild-type et mutants en microscopie à feuille de lumière.
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A27 - Accéder au monde de la super-résolution sous illumination structurée (SR-SIM)
Intervenants
Yasmina Saoudi, [email protected]
Florence Appaix, [email protected]
Objectifs
Nous proposons de tester la microscopie super-résolutive par lumière structurée (SR-SIM) sur
différents échantillons biologiques et de comparer les images obtenues à celle déjà réalisées en
microscopie confocale.
De manière simple, l’atelier pourrait se dérouler de la manière suivante :
1) L’intervenant présentera un système cellulaire particulier : les cellules épendymaires différenciées
à partir d’astrocytes obtenues à partir d’hémisphères cérébraux d’embryons de souris. Ces cellules
présentent la particularité d’être recouvertes de cils motiles pour assurer la circulation du liquide
céphalorachidien dans le cerveau…Après mise en culture et expériences d’immunofluorescence (déjà
réalisées avant l’atelier), nous recherchons dans les structures ciliées d’un modèle de souris KO TTL
(Tubuline Tyrosine Ligase), les différences de composition en tubuline et cherchons à déterminer s’il
existe des défauts morphologiques entre les cellules WT & KO. Ces différences sont subtiles et
nécessitent une haute résolution en 3D. Effectivement, nous montrerons que ces échantillons sont à
la limite de la résolution de 300nm et nécessitent de dépasser la limite de diffraction.
Nous aimerions présenter la technique SR-SIM proposé par la société Zeiss car nous sommes déjà
familiarisées au système Elyra PS1 qui permet de voir l’ultrastructure en 3D.
2) Les utilisateurs pourront apporter des lames d’échantillons fixés marqués avec plusieurs
fluorochromes déjà observés en microscopie classique et découvrir sans préparation supplémentaire
la haute résolution atteinte par les techniques de microscopie en lumière structurée…
Description
Dépasser les limites de résolution de la microscopie confocale standard pour révéler des détails dans
l’échantillon jusqu’alors inaccessibles et visualiser l’ultrastructure 3D de l’échantillon d’intérêt en
microscopie optique.
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ATELIERS
A28 - L'imagerie de fluorescence haute résolution : du modèle murin au patient
Intervenants
Corinne LAPLACE-BUILHE, [email protected]
Valérie ROUFFIAC, [email protected]
Objectifs
EN PREAMBULE : L’expérimentation animale ne pouvant être réalisée que dans un établissement
agréé, la partie pratique de l’atelier (imagerie au Cellvizio) sera proposée sur des explants animaux
(déchets expérimentaux murins), issus de projets autorisés à Gustave Roussy-Villejuif.
L’atelier sera découpé en 3 parties (30 min/ 60 min/ 30 min):
• La première partie (30 min) sera réservée à la présentation théorique du panel d'outils nécessaires
à l'amélioration de l'imagerie haute résolution in vivo :
- Imageurs macroscopes et microscopes confocaux/ Multiphoton adaptés à l’imagerie du vivant
- Les sondes et marqueurs fluorescents pour le vivant : Peut-on facilement transposer l’ex vivo à l’in
vivo ?
- Présentation d'un exemple de développement issu du support du GDR 2588: Une nouvelle
génération de chambre dorsale pour l'imagerie haute résolution et multimodalité sur modèles
murins, in vivo.
• La deuxième partie (60min), sera consacrée à la prise en main par les participants d’un confocal
fibré dual band (488-660 nm), pour l’imagerie d’organes murins entiers. L’objectif de cette session
pratique sera de présenter sur les images obtenues les particularités de l'imagerie confocale fibrée et
d’aborder notamment la question récurrente : Comment comparer l'imagerie confocale fibrée avec
l'imagerie réalisée sur un confocal conventionnel.
• La troisième partie (30 min) propose d’ouvrir aux participants, l’expérience d’un transfert en
clinique de la microendoscopie et de réfléchir à l’établissement d’une feuille de route résumant les
points clés pour le transfert de cette technologie pour l’imagerie clinique per- opératoire.
Description
Cet atelier propose de faire découvrir les différents aspects ainsi que les contraintes techniques et les
défis de l’imagerie de fluorescence à haute résolution in vivo, en recherche biomédicale sur modèles
murins et en recherche clinique lors d’essais sur patients.
Cet atelier propose également d’étayer les points clés pour la mise en œuvre des technologies
photoniques in vivo en imagerie biomédicale.
Au travers de l’exemple de l’imagerie confocale fibrée, que les participants pourront utiliser sur
organes murins entiers, les participants seront invités à élaborer une feuille de route résumant les
éléments nécessaires pour le déploiement en clinique de cette technologie, à partir d’un cas concret
d’application clinique.
***
25
ATELIERS
A29 - Apport de l'endomicroscopie confocale (ECM) à l'étude des lésions inflammatoires
intestinales chez l'animal et l'homme
Intervenants
Jeremy Bregeon, [email protected]
Objectifs
Cet atelier sera illustré par des exemples acquis chez l'animal et l'homme et ayant donné lieu à des
publications.
Description
Cet atelier a deux objectifs principaux. D'une part, il vise à présenter les capacités de l'ECM à
caractériser in vivo les anomalies architecturales et fonctionnelles de la muqueuse digestive dans
différentes conditions pathologiques (inflammatoires et pré-cancéreux). Une deuxième partie sera
dédiées à la présentation d'outils d'analyse d'image permettant de quantifier ces atteintes.
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A30 - Test de dispositifs à feuille de lumière "open source"
Intervenants
Frédéric Brau, [email protected]
Damien Alcor, [email protected]
Objectifs
1) Description du projet global feuille de lumière : genèse, choix techniques, évolutions...
2) Présentation des 2 ou 3 solutions techniques (en fonction des évolutions jusqu'à Mifobio) sur
l'atelier.
3) Utilisation et configuration de Micro-manager sur ces systèmes
4) Contraintes de préparation des échantillons.
5) Test des systèmes avec des échantillons en 2 groupes.
6) Gestion des images.
Description
Diffuser des outils abordables pour réaliser de l'imagerie à feuille de lumière.
Démystifier la fabrication, la mise en oeuvre et l'utilisation de prototypes et systèmes d'imagerie à
feuille de lumière libres.
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26
ATELIERS
A31 - Application de la microscopie multiphotonique et de la technologie des capsules cellulaires à
l’imagerie des modèles tumoraux des mammifères
Intervenants
Vasily Gurchenkov, [email protected]
Objectifs
During this workshop we will first briefly describe the Cellular capsules technology and its application
to cancer research (20’). Secondly we will discuss different imaging methods, their application to
multicellular tumoral models, their advantages and drawbacks (20’). Finally we will demonstrate the
procedures of handling, mounting and multiphoton imaging of the cellular capsules (1h20’).
Description
There is now growing evidence that 3D cell cultures better mimic the functions of normal and
pathological tissues. In cancer biology, the development of 3D in vitro cell-based assays is further
motivated by the ethical pressure to reduce animal testing. Fundamental and therapeutic progress in
the field is thus conditioned by innovation in both 3D imaging and high throughput reproducible
preparation of 3D samples.
Mammalian cell aggregates, also referred to as multicellular spheroids (MCSs), have been recognized
as a relevant model of tumor growth and evolution in vitro. These model systems allow
recapitulating many tumor physiological features that are out of reach when cells are cultured in a
Petri dish as two-dimensional monolayers. However, despite considerable efforts in the field, the
production of MCSs as well as their manipulation and the imaging strategies are far from being
acknowledged as universally and routinely applicable.
Here, we present a novel method enabling mass production of MCSs of different cell types without a
requirement of natural propensity of cells to form aggregates. This material science based approach
relies on the encapsulation and growth of cells inside transparent, permeable, elastic, hollow microspheres (capsules).
We show that this technique considerably facilitates the imaging of MCSs using multiphoton
microscopy.
References:
Cellular capsules as a tool for multicellular spheroid production and for investigating the mechanics
of tumor progression in vitro. Alessandri K, Sarangi BR, Gurchenkov VV, Sinha B, Kießling TR, Fetler L,
Rico F, Scheuring S, Lamaze C, Simon A, Geraldo S, Vignjevic D, Doméjean H, Rolland L, Funfak A,
Bibette J, Bremond N, Nassoy P. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Sep 10;110(37):14843-8.
Light-sheet microscopy in thick media using scanned Bessel beams and two-photon fluorescence
excitation. Fahrbach FO, Gurchenkov V, Alessandri K, Nassoy P, Rohrbach A. Opt Express. 2013 Jun
3;21(11):13824-39.
27
ATELIERS
Live cell division dynamics monitoring in 3D large spheroid tumor models using light sheet
microscopy.Lorenzo C, Frongia C, Jorand R, Fehrenbach J, Weiss P, Maandhui A, Gay G, Ducommun B,
Lobjois V.Cell Div. 2011 Dec 12;6:22.
Quantitative 3D cell-based assay performed with cellular spheroids and fluorescence
microscopy.Ansari N, Müller S, Stelzer EH, Pampaloni F.
***
A32 - Apport de la microscopie multiphotonique pour l’imagerie en profondeur
Intervenants
Meriem Garfa Traore, [email protected]
Aude Jobart Malfait, [email protected]
Objectifs
Après un bref rappel théorique du principe de la microscopie multiphotonique nous présenterons le
protocole de préparation de l’échantillon ainsi que le principe de fonctionnement de l’agent de
clearing BABB.
Nous réaliserons des acquisitions en profondeur basées sur l’autofluorescence de l’échantillon à la
fois grâce à une excitation monophoton (excitation à 488nm, détection de l’autofluorescence entre
510 et 545nm) puis à une excitation biphotonique (laser IR accordé à 820nm, émission entre 510 et
545nm). Sur la base de ces acquisitions, nous discuterons de l’apport de l’excitation biphotonique
pour l’imagerie d’échantillons épais.
Dans une deuxième partie, nous réaliserons l’acquisition par excitation biphotonique d’un rein de
souris traité par l’agent de transparence BABB (excitation laser IR accordé à 820nm, émission entre
510 et 545nm). Nous comparerons les datas obtenues avec celles de l’échantillon non transparent
obtenues précédemment et discuterons des avantages et inconvénients d’un traitement par le BABB.
Discussion sur autres protocoles de transparence.
Enfin, nous comparerons et visualiserons en 3D les données obtenues sur Imaris.
Description
Montrer l’apport de la microscopie multiphotonique dans l’étude de la structure d’échantillon épais
en comparaison à la microscopie confocale classique
Montrer l’intérêt de l’utilisation d’agent de clearing de type BABB pour l’accès à la profondeur .
Comprendre et mettre en œuvre l’imagerie biphotonique sur du tissu rénal de souris non marqué
Connaitre et comprendre les protocoles permettant de rendre les échantillons transparents
***
28
ATELIERS
A33 - Ultramicroscope : Acquisition en feuille de lumière d’échantillons transparents fixés.
Intervenants
David Godefroy, [email protected]
Objectifs
L’atelier se déroulera en 5 points :
- Rappel sur le principe de la microscopie à feuille de lumière, les avantages et les inconvénients de
cette technique d’imagerie pour l’acquisition d'échantillons fixés avec une partie « présentation des
modèles disponibles, commerciaux ou fabriqués ».
- Principe de « transparisation » d’échantillons fixés pour acquisition en feuille de lumière. Ce point
présentera différentes techniques de « transparisation » d’échantillons (3Disco, Clarity, Scale, Cubic
…) avec une comparaison des différents protocoles répertoriant leurs avantages et leurs
inconvénients.
- Présentation des différents protocoles de marquage des échantillons (système nerveux central,
embryon) tels que les immunomarquages in toto ou les injections de traceurs fluorescents.
- Acquisition d’échantillons préalablement préparés sur un microscope à feuille de lumière piloté par
le logiciel dédié Imspector.
- Reconstruction en 3 dimensions des stacks d’images acquises avec une présentation des possibilités
d’analyses.
A la fin de cet atelier les stagiaires auront des notions sur les différentes étapes de préparation pour
des acquisitions et des reconstructions en trois dimensions d’échantillons entiers fixés. Des notions
sur les techniques de marquages avec les possibilités et les limites de celles-ci. Ils pourront assister à
la mise en place de l’échantillon et à l’acquisition de celui-ci directement sur un microscope à feuille
de lumière. Ils auront une idée de ce qu’apporte une visualisation en trois dimensions d’échantillons
fixés.
Description
Les acquisitions en feuille de lumière permettent d’imager rapidement, sans coupes préalables, des
échantillons transparents marqués par immunohistochimie. Le but est d’avoir une représentation la
plus fidèle possible, en trois dimensions, des structures acquises. Cette technique utilisée comme
outil d’imagerie dans la biologie du développement permet une imagerie précise d’échantillons
entiers comme par exemple les embryons ou le système nerveux central.
***
29
ATELIERS
A34 - Multiscale analysis of morphogenesis
Intervenants
Floris Bosveld, [email protected]
Yohanns Bellaiche, [email protected]
Objectifs
Shape is a conspicuous and fundamental property of living multicellular organisms. Questions such as
how embryonic development produces organisms with reproducible morphological patterns, how
tissue moves and which mechanisms underlie the diversity of organ shape have haunted
developmental biologists for decades. Novel imaging methods have changed our view of the complex
cellular dynamics underlying tissue morphogenesis. They illustrate that tissue morphogenesis is a
multi-scale process supported by the coordinated and collective dynamics of cells (such as cell shape
changes, cell rearrangements and cell divisions) that produce large-scale tissue changes. Cell
biological and physical approaches have greatly contributed to deciphering the subcellular processes
controlling cell shape changes and cell rearrangements. They show that cell shape changes and cell
rearrangement are triggered by the local regulation of actin-myosin dynamics that controls cell
junction mechanics. Accordingly, the regulation of cell junction tension has been implicated in
convergence extension movement, the physical separation of compartment boundaries, the
orientation of cell division and the establishment of planar cell polarity. A central question in tissue
morphogenesis is therefore to decipher how signalling pathways modulate and coordinate local cell
dynamics and mechanical properties to drive large-scale tissue movements.
The workshop will be focused around how the Drosophila pupa dorsal thorax epithelium can be used
as a model system to study the interplay between genetics and mechanics that control tissue
morphogenesis.
During the workshop I will explain why we study morphogenesis and why the Drosophila pupa dorsal
thorax epithelium is an excellent model system. I will demonstrate how the Drosophila pupa is
prepared for imaging, in which interested participants could participate. Furthermore, I will explain
how data from multiple individuals is prepared for analyses, how we can extract average maps of cell
and tissue scale dynamics and kinematics, and finally how using these average maps can be used to
study mutant conditions.
Outline
A) Brief introduction of tissue morphogenesis and the Drosophila dorsal thorax epithelium.
B) Demonstration of a dissection, mounting and imaging of a Drosophila pupa.
C) Using previously acquired movies/images I will illustrate how from raw data we:
1) Synchronize movies in space and in time.
2) Obtain skeletonized images.
3) Quantitatively describe cell/tissue dynamics and kinematics and create average maps.
4) Correlate average maps of cell/tissue dynamics and kinematics with protein polarization or gene
expression gradients.
30
ATELIERS
5) Extract differences in average maps of cell/tissue dynamics and kinematics between wild-type and
mutant conditions.
Description
How tissues adopt their shape is a central and fascinating question in biology. Advances in imaging,
cell biology, signal transduction and biophysics frame the study of tissue morphogenesis in terms of
cell dynamics and the interplay between biochemical and mechanical processes. Recently, we have
implemented a live-imaging method of observing a whole epithelial tissue in Drosophila pupa, from
the cell-scale to the tissue-scale. We can follow ~104 cells over several cell cycles with 5 min
resolution over 26 h of development and 0.32 μm resolution over the ~750x700 μm2 of tissue.
Furthermore, we have developed a multi-scale mathematical framework allowing the quantification
of cell dynamics (cell shape changes, cell division, cell rearrangement, apoptosis) in common units
and of the contribution of these processes to global tissue development. In addition, we have
developed tools to quantitatively analyze protein distributions and polarity, as well as gene
expression gradients. Currently, we are further extending this framework to quantify relative cell
pressures and edge tensions. Using these quantitative methodologies, we aim to study
morphogenesis in wild-type and mutant conditions to provide insights in the fundamental interplay
between genetics and mechanics that control tissue morphogenesis in metazoans.
***
A35 - Imagerie multi couleurs et multi échelles d’embryons de poisson zébré
Intervenants
Adeline Boyreau, [email protected]
Adeline Rausch, [email protected]
Objectifs
Cet atelier permettra de :
1. Préparer les échantillons biologiques fixés (sélection des spécimens en fonction de la qualité des
marquages fluorescents sous loupe binoculaire)
2. Montage des embryons fixés pour acquisition in toto au moyen de l’imagerie de deux moitiés
d’embryons. A priori sur microscope inversé.
3. Imagerie 3D spectrale pour la séparation d’au moins 5 fluorochromes
4. Imagerie STED de l’organisation des microfilaments et ou des microtubules dans l’epithelium de
l’embryon et le cortex de la cellule vitelline
4. Recalage, fusion et visualisation des différentes images d’un même specimen
5. Principe du recalage des images 3D sur une acquisition 3D+temps d’un specimen de zebrafish
vivant. Cette acquisition sera faite hors atelier pour que l’ensemble de l’atelier tienne dans un
créneau de 2h00
31
ATELIERS
Description
Marquage simultané de différentes structures (membranes cellulaires, noyaux, cytosquelette) en
générant de la diversité de couleur notamment et imagerie à différentes échelles (localisation
nano/micro/meso/macroscopique) sur des embryons de zebrafish fixés ou vivant. Acquisition de
données compatibles avec la reconstruction d’atlas 3D+temps d’expression génétique et d’activités
biologiques.
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A36 - Manipulation optogénétique et imagerie 3D et 3D+temps d’embryons de poisson zébré
trangéniques de type “rainbow” ou « photo »
Intervenants
Julien Dumont, [email protected]
Monique Frain, [email protected]
Objectifs
Cet atelier permettra de :
1. Présenter les conditions d’obtention de mosaiques de couleurs dans les embryons « rainbow » ou
« photo » (contrôle optogénétique de recombinaisons génétiques, photoconversion)
2. Sélectionner les specimens en fonction de l’intensité des marquages
3. Monter les embryons en fonction de la stratégie d’imagerie (MLMS, CLSM, SPIM, OT)
4. Définir les paramètres d'acquisition adéquats pour imager jusqu'à 4 couleurs.
5. Imager les spécimens vivants ou fixés
6. Analyser les images pour la reconstruction de l’histoire clonale des cellules.
Description
Explorer le potentiel de lignées de poissons trangéniques de type « rainbow » et « photo » pour la
reconstruction du lignage cellulaire et l’analyse de la diversité cellulaire clonale dans l’embryon.
Description, incluant les modalités pédagogiques et le déroulé de l'atelier *
Il s’agit d’utiliser des lignées de poissons transgéniques de type rainbow ou photo pour générer des
mosaiques de couleurs qui vont faciliter l’identification de populations cellulaires clonales. Nous
allons examiner : i) les possibilités de génération de ces mosaiques y compris au moyen de
manipulations optogénétiques, ii) leur conditions d’imagerie et iii) les informations apportées par les
images obtenues au moyen de stratégies d’analyse automatisées.
***
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ATELIERS
A37 - Real time visualization of MAP kinase ERK activity and localization dynamics in living cells
using multi-parameters FRET imaging.
Intervenants
François Sipieter, [email protected]
Franck Riquet, [email protected]
Objectifs
In this workshop, we will describe and illustrate:
- FRET biosensors and significant contributions to resolve spatiotemporal dynamics of signaling
networks in the special case of MAPK/ERK pathway.
- Frequency Domain (FD) FLIM/LIFA method using phase and modulation measurements for the
analysis of FRET signals.
- Calibration of FD FLIM system (references, controls, etc.)
- Real time multi-parameter imaging of MAPK/ERK activity, localization and interaction dynamics in
single living cells by combination of a FRET/FLIM approach and ratiometric imaging.
- Analysis of data obtained from cells expressing FRET biosensors and GFP-like-tagged MEK1-ERK2.
- Crucial factors to keep in mind to ensure the efficiency and reproducibility of FRET measurements.
Description
Live-cell microscopy is routinely used to monitor kinase activities with genetically encoded FRET
biosensors that are designed to detect and report biochemical events in living cells and tissues. We
focus on biosensors dedicated to kinase activity measurements of the MAPK/ERK signaling pathway.
Depending on cell type and stimulus, compartmentalized MAPK/ERK activity is able to mediate a
specific cellular response thus leading to unique spatio-temporal signatures.
While intensity-based ratiometric imaging methods are commonly used to monitor kinase activities,
we will use fluorescence lifetime imaging microscopy as an alternative method to determine
MAPK/ERK activation state upon a pro-survival and a pro-death signal. Multi-parameter imaging will
be performed quasi-simultaneously by combination of FRET/FLIM measurements and localization of
the kinase of interest. In the same way, in order to achieve quasi-simultaneously activation,
localization and interaction of MAPK/ERK in living cells, we could also propose to combine FRET/FLIM
imaging of the ERK biosensor and ratiometric imaging of MAPK/ERK2-MEK1 interaction in unique cell.
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33
ATELIERS
A38 - Illumination structurée pour manipulation optogénétique et photopatterning
Intervenants
Vincent Studer, [email protected]
Mathieu Coppey, [email protected]
Objectifs
Nous commencerons par décrire le fonctionnement et les propriétés des systèmes de micromiroirs,
ainsi que leur intégration dans un système de microscopie pour l'imagerie de cellules vivantes.
Ensuite, nous montrerons comment il est possible de contrôler à une échelle subcellulaire l'activité
de la cellule (par exemple en activant certaines voies de signalisation agissant sur la migration), grâce
à des outils optogénétiques. Enfin, nous montrerons comment il est possible de contrôler par la
lumière l'accrochage de protéines à la surface de lamelles de verre avec une résolution spatiale
inférieure au micron.
Description
Notre but est de montrer l'intérêt et le potentiel d'un système d'illumination structurée basée sur un
système de micromiroirs pour de nombreuses applications en biophysique, biologie cellulaire,
biochimie et biotechnologies. En particulier, nous montrerons comment il est possible de contrôler
l'activité à une échelle subcellulaire sur un grand nombre de cellules en parallèle par des outils
optogénétiques. Nous présenterons également des techniques de micropatterning contrôlées par la
lumière pour le greffage dynamique de protéines sur des surface et le contrôle de l'adhésion
cellulaire.
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A39 - Contrôle et visualisation de protéines in vitro par optogénétique
Intervenants
Marie-Noëlle Soler, [email protected]
Marine Scoazec, [email protected]
Objectifs
- s'initier aux méthodes de manipulation non invasive de fonctions cellulaires par des sondes
sensibles à la lumière qui seront codées génétiquement.
- apprendre à choisir sa modalité d’imagerie et à contrôler spatialement la lumière
Déroulé : Après une introduction sur les méthodes employées (support numérique), les échantillons
biologiques seront étudiés par imagerie plein champ, TIRF et spinning disk.
Description
Contrôler et suivre la localisation de protéines à l’échelle subcellulaire
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ATELIERS
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A40 - Optique adaptative et microscopie de fluctuations de fluorescence
Intervenants
Antoine Delon, [email protected]
Joseph Gallagher, Joseph Gallagher <[email protected]>
Objectifs
Deux alternatives :
1) adapter un miroir déformable sur un microscope biphoton fonctionnant en comptage de photons
2) manip de démo sur un bread board en confocal (pas de balayage, pas d'image)
Exposé des principes de l'OA en boucle ouverte
Mesure de la brillance en FCS
Démonstration de l'optimisation de la brillance
Description
Démontrer les principes de l'optique adaptative pour la microscopie en boucle ouverte, c'est à dire
sans mesure du front d'onde, mais en utilisant une métrique dont l'optimisation correspond à une
amélioration du front d'onde. En utilisant des échantillons contenant des molécules fluorescences
diffusant librement, montrer que le signal par molécule (ou brillance) mesuré par Fluorescence
Correlation Spectroscopy est une métrique adaptée, car équivalente au rapport de Strehl. Mettre en
œuvre ces principes dans des situations contrôlées (bague de correction mal réglée, lamelle inclinée,
désaccord d'indice de réfraction, chambre à flux, etc.)
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A41 - Mesure de concentrations surfaciques de molécules par spectroscopie à corrélation d'images
Intervenants
Antoine DELON, [email protected]
Objectifs
Les participants de l'atelier pourront venir avec leurs propres échantillons, dès lors que les molécules
à analyser sont déposées sur des substrats en verre, plastique, éventuellement recouverts de PDMS
ou autre polymère, compatible avec un microscope inversé travaillant avec un objectif de forte
ouverture numérique.
Nous ferons des acquisitions d'images confocales et montrerons comment l'utilisation d'un logiciel
développé sous ImageJ sur la plate-forme IBiSA de Grenoble permet de remonter à la concentration
surfacique absolue.
35
ATELIERS
Description
Les techniques de micro-fabrication et de fonctionnalisation des surfaces impliquent de connaître les
concentrations surfaciques d'équilibre des molécules adsorbées sur les substrats. Curieusement,
c'est un paramètre crucial très mal connu. Nus développons la spectroscopie à corrélation d'images
(ICS), qui est basée sur le calcul de l'autocorrelation des images (en général confocale). Lorsque
l'échantillon est constitué de molécules immobiles distribuées aléatoirement dans l'espace
(supposées se comporter comme des absorbeurs-émetteurs ponctuels), l'amplitude de la fonction
d'autocorrelation n'est autre que l'inverse du nombre de molécules dans le volume (ou dans la
surface) d'observation. Une méthodologie expérimentale et d'analyse des données appropriée
permet de remonter de façon fiable à la concentration absolue des molécules.
***
A42 - Microscopie multimodale (vidéo microscopie 4D, FRAP, TFM)
Intervenants
Philippe Ronde, [email protected]
Philippe Carl, [email protected]
Objectifs
Nous proposons un atelier de microscopie multimodale combinant des approches de
vidéomicroscopie rapide en mode plein champ, avec des mesures de coefficient de diffusion de
molécules en mode FRAP et suivies par de expériences de TFM (Traction Force Microscopy) afin de
corréler les mesures de FRAP aux forces d’adhésion des cellules à leur support. Nous analyserons les
paramètres critiques (rapport signal/bruit, vitesses d’acquisition) qui conditionnent l’obtention d’une
courbe de FRAP dans les différents modes d’acquisition. Et extrairont ensuite les forces de traction à
partir d’images de positionnement de billes imbriquées dans un gel de polyacrylamide avant et après
ajout de trypsine.
Description
La mesure des paramètres de diffusion des molécules en cellule vivante est aujourd’hui possible
grâce aux avancées de la microcopie. La technique de FRAP permet de déterminer les temps de
résidence d’une molécule au sein d’une structure donnée. Les expériences de FRAP (Fluorescence
Recovery After Photobleaching) consistent à photoblanchir une protéine fluorescente dans la
structure visée et à visualiser le retour de fluorescente qui provient des molécules fluorescentes
voisines non détruites qui diffusent vers la structure cible. Ceci nous permet d’estimer la mobilité
d’une molécule au sein d’une structure spécifique. Cette mobilité est largement influencée par les
interactions protéiques qui fixent la protéine dans une structure au lieu de diffuser librement.
D’un autre coté la technique de TFM (Traction Force Microscopy) permet d’extraire les forces de
traction que les cellules exercent sur un substrat en les cultivant sur des gels de polyacrylamide
contenant des billes fluorescentes. La position des billes est acquise en EPI-fluorescence avant et
après ajout de trypsine (qui permettra de décoller les cellules du support). La déformation du gel est
36
ATELIERS
ensuite calculée à partir du déplacement des billes entre le support au repos et avec la présence des
cellules en utilisant un algorithme de PIV (Particle Image Velocity). Et une fois la déformation du gel
calculée, les forces de traction sont déduites à partir de la valeur du module de Young du gel.
***
A43 - Analyse de la dynamique moléculaire par corrélation d’images de fluorescence
Intervenants
Perrine Gilloteaux, [email protected]
Objectifs
1) Présentation du principe théorique des différentes techniques et leurs applications (cours).
2) Mise en pratique sur des jeux de données simulées et expérimentales en utilisant un plugin ImageJ
dédié (TP)
3) Analyse critique des résultats et des limitations des différentes techniques (TPs)
Description
Comprendre et savoir utiliser les méthodes de corrélation d'images pour l’analyse de la dynamique
moléculaire:
- estimation de densité d'objet
- estimation de flux et de diffusion, de proportion de population immobile
- estimation de la corrélation de dynamique entre deux protéines
***
A44 - Analyse de la diversité des réponses calciques individuelles dans une population de cellules
non adhérentes par la méthode MAAACS (Methods for Automated and Accurate Analysis of Cell
Signals)
Intervenants
Yannick HAMON, [email protected]
Cyrille BILLAUDEAU, [email protected]
Objectifs
Cet atelier cherchera à sensibiliser les participants aux difficultés inhérentes à l’enregistrement en
video-microscopie en proposant une méthodologie appelée MAAACS (Salles,A. et al. PLoS Comput
Biol. 2013;9(9):e1003245).
Cette méthode intègre une réflexion sur le choix de sonde calciques, dans l’optique d’une simplicité
de mise en œuvre sur tout type de microscopie à fluorescence, d’une adequation du Kd des sondes
37
ATELIERS
aux concentrations intracellulaires calciques et d’une optimisation des conditions expérimentales
procuré par la stabilité des charges en indicateur calcique.
Dans un second temps, l’attention des participants sera attirée sur le tracking automatique des
cellules, notre approche utilisant un algorithme de suivi de particules uniques (Multiple Target
Tracing, Sergé, A. et al. Nat Methods. 2008 Aug;5(8):687-94.). L’exhausitivité de cette étape de
tracking sera évaluée par rapport à une approche de tracking manuel, et complétée par une routine
de reconnection intuitive des trajectoires avortées.
Enfin, à partir des tableaux excel de données affinées, nous présenterons une méthode de
quantification des signaux calciques (amplitude de fluorescence, fréquence de pics de fluorescence,
fraction réponse) entrainant une catégorisation des types de réponses (maintenue, oscillante,
unique) suivant le type de stimulus.
L’intérêt de cette approche réside dans le fait d’automatiser au maximum les processus d’analyses
permettant de réduire considérablement les temps d’analyse et la subjectivité des approches
manuelles
Nous reviendrons également sur les notions statistiques permettant de déterminer un seuil
d’activation objectif, par l’optimisation du rapport entre la probabilité de détection et la probabilité
de fausse alarme.
Nous étendrons in fine notre atelier aux autres paramètres quantifiables à partir d’enregistrements
vidéo (motilité, formes, par exemple) et conclurons par une confrontation des résultats que l’on peut
obtenir avec des approches similaires (cytométrie par exemple).
Description
L’objectif principal de cet atelier est de présenter un ensemble d’approches méthodologiques
permettant l’analyse quantitative de la diversité des signaux calciques au niveau d’une population de
cellules individuelles motiles (lymphocytes T CD4+, activés par différents types de stimuli, anticorps
immobilisés ou cellules présentatrices de l’antigène). Nous souhaitons aboutir à une discussion sur la
pertinence d’inducteurs solubles à déclencher une réponse calcique relevante quand le ligand
activateur naturel de ces cellules est exprimé à la surface de cellules stimulantes (dans le cadre de
contacts cellule-cellule).
***
A45 - Analyser la migration cellulaire au moyen de logiciels libres
Intervenants
Fabrice Cordelières, [email protected]
Daniel Zaharia, [email protected]
Objectifs
Au travers d'un atelier pratique, les participants sont invités à se familiariser à l'étude de la migration
cellulaire au moyen de logiciels libres. Deux greffons seront utilisés en fonction du type d'expérience
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ATELIERS
réalisée: KymoToolBox pour les essais de cicatrisation de blessure, Manual Tracking pour le pistage
manuel de cellules individuelles. Une alternative sera présentée pour le suivi automatique et
l'analyse des données: iTrack4U, un logiciel écrit en Java et utilisant ImageJ en tant que bibliothèque.
Déroulé:
-Manipulation sur plusieurs jeux de données des outils de pistage manuel, semi-automatique et
automatique
-Comparaison des 3 modes de suivi
-Optimisation des paramètres de pistage automatique
-Travail autour des données extraites et de leur mise en forme
Description
Connaitre les outils existant pour l'extraction des données de suivi de migration cellulaire en
contraste de phase et/ou fluorescence
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A46 - Image processing methods for the temporal analysis of moving particles.
Intervenants
Charles-Henri Kervrann, [email protected]
Thierry Pécot, [email protected]
Objectifs
Several methods developed by the Serpico team and accessible through a Mobyle web portal
(http://mobyle-serpico.rennes.inria.fr/) will be described. A few case examples will be provided to
the workshop participants so they can practice and better understand the methods. The participants
will also be invited to test their own image sequences, acquired potentially with the set-ups on site.
Description
To understand and practice image processing methods developed to analyze the dynamic content in
fluorescence video-microscopy.
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ATELIERS
A47 - Multiplex FRET : suivi simultané d’activités biochimiques par FLIM deux couleurs
Intervenants
Claire Déméautis, [email protected]
Objectifs
Nous montrerons notre méthodologie originale pour multiplexer les mesures de FRET sur un même
échantillon. Cette approche fait appel à deux couples de protéines bien choisies, les deux donneurs
seront excités simultanément à 440 nm et leur durée de vie sera mesuré simultanément par FLIM
deux couleurs sans artefact de fuite spectrale. Nous appliquerons cette méthode au suivi de deux
activités biochimiques simultanées à l’aide de deux biosenseurs FRET génétiquement encodés.
Description
Utiliser la méthodologie de FLIM pour mesurer le FRET de biosenseurs génétiquement encodés.
Etudier plusieurs activités biochimiques simultanément en cellules vivantes.
***
A48 - Comparaison de différentes méthodes de détermination des mouvements moléculaires dans
la cellules : Méthodes corrélatives et retour de fluorescence.
Intervenants
Cyril Favard, [email protected]
Delphine Muriaux, [email protected]
Objectifs
- Présentation théorique rapide des méthodes.
- Acquisitionde données à l'aide des différentes techniques sur des systèmes modèles simples.
- Acquisition de donnés sur des cellules en culture exprimant des protéines fluorescentes.
Description
- Pouvoir effectuer un choix d'expérience au regard de la complexité de l'objet à observer.
- Apprendre à réaliser ces expériences de façon simple.
En lien avec l'atelier traitement et simulation (P. Paul-Gilloteaux et F. Waharte) traite les données
acquises et mesurer les erreurs commises.
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40
ATELIERS
A49 - Dynamique de formation de nanotubes et transport transcellulaire dans un modèle neuronal
par imagerie à haute-résolution spatio-temporelle.
Intervenants
Meryem Tardivel, [email protected]
Objectifs
1- Acquisition d’images en temps réel sur des cellules transfectées et marquées avec un marqueur
vésiculaire :
nous chercherons à suivre la formation des nanotubes et à améliorer la résolution des images pour
résoudre ces fines structures dynamiques..
2- Analyse des données :
nous reprendrons les images acquises pendant la première session pour étudier et quantifier la
dynamique des nanotubes et des vésicules de transport par kymogrammes dynamiques et suivi de
vésicules (tracking).
Description
Étudier la formation de nanotubes membranaires et visualiser le transport vésiculaire à travers ces
structures pour mettre en évidence leurs implications dans la communication cellulaire.
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A50 - Mesure de la dynamique d’association de protéines sur les microtubules par combinaison
d’acquisition en spinning-disk FRAP et de tracking de particules.
Intervenants
Ludovic Leconte, [email protected]
Objectifs
1) Acquisition d'images en confocal rapide + FRAP (spinning-disk) :
Nous chercherons à acquérir des séquences d'images en fluorescence pour mesurer la dynamique
des protéines associées au microtubules par FRAP
2) Analyse des données :
Nous améliorerons la qualité des images à l'aide d'un algorithme de débruitage, puis nous suivrons
les régions photoblanchies par tracking et analyserons le retour de fluorescence sur ces régions.
L'utilisation d'un modèle théorique adapté permettra la quantification de la dynamique.
41
ATELIERS
Description
Mesurer la dynamique d’association de protéines sur les bouts + des microtubules en phase de
croissance
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A51 - FCS et FRET-FLIM : approche combinée en cellules vivantes, acquisition et analyse
Intervenants
Corentin Le Nézet, [email protected]
Mariano Gonzales Pisfil, [email protected]
Objectifs
L’atelier comportera à la fois la mise en œuvre pratique de la FCS et FRET-FLIM sur des échantillons,
et l’analyse des données collectées ainsi que leur interprétation. Lors du volet pratique nous
aborderons les aspects de mise en place, paramétrage du système, et collecte des données. Dans le
cadre de cet atelier nous étudierons la dynamique et les interactions de deux partenaires du
complexe P-TEFb qui est impliqué dans la régulation de la transcription.
Déroulement :
- Rappel rapide des principes de FCS, FRET-FLIM et des méthodes de mesure.
-Mise en œuvre pratique de ces deux techniques FCS et FRET-FLIM.
-Mise en œuvre des contrôles et références adaptés.
-Réalisation de mesures sur deux partenaires du complexe P-TEFb en cellule vivante (complexe de
régulation de la transcription)
-Analyse à l'aide de logiciels libres et des solutions développées dans l'équipe BCF-IRI (MAPI)
-Les choix des modèles pour l'analyse des dynamiques en FCS et d'interaction en FRET-FLIM seront
explicités, et discutés.
-Possibilité de faire des mesures sur d'autres couples de protéines si les plasmides sont disponibles.
Description
La rapidité du développement des protéines fluorescentes a permis l’essor de nouvelles techniques
portées sur l’étude de leur comportement in vivo. Les techniques de FCS (Fluorescence Correlation
Spectroscopy) permettent de mesurer la dynamique moléculaire en cellule vivante. Les techniques
de mesures de FRET (Föster Resonance Energy Transfer) par FLIM (Fluorescence-Lifetime Imaging
Microscocopy) permettent d'étudier le comportement de deux molécules en caractérisant de
potentielles interactions. L’approche combinée de ces deux techniques dont les résolutions spatiales
et temporelles sont différentes, nous permet de répondre à des problématiques biologiques
complexes en cellules vivantes. Le but de cette atelier sera 1) d'initier les participant à la mise en
42
ATELIERS
œuvre pratique de ces deux techniques ; 2) de mettre en œuvre les outils pour l'analyse FCS et FLIM ;
3) de démontrer que les techniques de FCS et FRET-FLIM sont complémentaires pour répondre à des
problématiques biologiques.
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A52 - Analyse des expériences de FLIM et de FRET in vivo par la distance de transport
Intervenants
Philippe Heinrich, [email protected]
Aymeric Leray, [email protected]
Objectifs
L'atelier se déroulera sur un système commercial. Il comporte un volet théorique suivi d'une
application pratique sur des échantillons de référence. Le TP débutera par la mise en place de
l'échantillon, la calibration du système, l'acquisition des données, et l'analyse des observations.
Déroulement :
1° Présentation des concepts de l'imagerie FLIM – TCSPC et de distance de transport
2° Application sur échantillons de référence et cellules
3° Analyse à l'aide des softs d'analyses (MAPI et TITAN) développés localement (distribuables)
Description
La microscopie de fluorescence est couramment utilisée dans nombre de laboratoires pour sonder le
micro-environnement local de molécules fluorescentes à l'échelle du nanomètre. Le phénomène de
FRET (Förster Resonance Energy Transfer) permet de mettre en évidence des interactions entre
molécules voisines ou encore des changements de conformation dans les cellules vivantes.
Le but de cet atelier est, dans un premier temps, de proposer une initiation aux mesure de FRET par
FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) avec un système TCSPC (Time Correlated Single
Photon Counting) commercial, puis dans un second temps d’analyser ces images FLIM avec des
stratégies innovantes telle que la distance dite « de transport » utilisée pour comparer et regrouper à
des fins quantitatives les pixels de l’image FLIM et finalement, de comparer ces nouvelles stratégies
avec les méthodes classiques d’analyse.
***
43
ATELIERS
A53 - Suivi comparatif de la dynamique et des interactions protéiques au niveau du cytoplasme par
microscopie de temps de vie de fluorescence (FLIM) et spectroscopie corrélative de fluorescence
(FCS)
Intervenants
Ludovic Richert, [email protected]
Pascal Kessler, [email protected]
Objectifs
Pour cette atelier, une étude comparative entre FLIM et FCS de 5 constructions de protéines
fluorescentes (eGFP / eGFP-mCherry / (eGFP)2 / (eGFP)4 et eGFP+mCherry).
L’atelier débutera par une présentation des principes et des modalités d’acquisition des données de
FLIM et FCS avec un échantillon cellulaire exprimant une proteine eGFP simple qui servira de
référence pour les mesures suivantes.
L’atelier se poursuivra par l’étude de la construction eGFP-mCherry, permettant de mettre en
évidence la diminution du temps de vie d’eGFP par FLIM, tandis que l’augmentation du temps de
diffusion (FCS) est à la limite de résolution de cette approche. L’observation de la construction
(eGFP)2 permettra de confirmer ces appréciations et introduira la notion de brillance. Cette
construction sera également utilisée pour indiquer l’effet de l’oligomérisation sur le temps de vie.
La mesure avec la construction (eGFP)4 permettra de mettre en évidence significative du rôle de la
taille de protéine sur le temps de diffusion contrairement à (eGFP)2.
Enfin, la coexpresion eGFP et mCherry servir de contrôle négatif.
Description
L'objectif principal de cet atelier est de montré les informations disponibles par les approches FLIM
et FCS pour le suivi des interactions et de dynamisme de protéines au sein de cellules vivantes. Pour
l'exploration de ces différentes techniques, comme support, une série d’expériences utilisant des
cellules expriment différentes construction de protéines fluorescentes, sera utilisés. L’accent sera mis
sur la complémentarité et la spécificité de ces deux techniques. Approches et problèmes de l'analyse
des données seront également discutées.
***
44
ATELIERS
A54 - Molecular interactions in vivo by 2 Photons fluctuation microscopy (Clerte/Fiche)
Intervenants
Caroline Clerte, [email protected]
Jean Bernard Fiche, [email protected]
Objectifs
Teaching methods will be based on interactivity and discussion with the group. We will provide
support text document for the theory and the practical course.
1- Starting with the standard/calibration sample to align and characterize the optical system.
Discussion around the factors/limitations/Artifacts that need to be considerated/known about the
optical system and the experimental approach (laser power, wavelength, excitation volume,
detection: bleed through, cross talk, sensitivity (S/N)…).
2- Standard samples (positive control and negative control) to validate the setup and the
experimental approach: Basic FCCS on a well characterized molecule in vitro.
3- In vivo Molecular interaction sample measurements (Positive and negative control + standard
controls (only one color samples)): Starting with Point FCCS measurements and
continuing on the laser scanning microscopy imaging technique and analysis of 2 colors cross
correlation measurements.
Description
The goal of the workshop would be to study in vivo molecular interactions using 2 colors Cross
Correlation Fluctuations microscopy, and to see the advantages of the 2 Photons laser scanning
excitation for this task.
Another goal could be to show that every laser scanning microscope can potentially acquire data that
contain information about molecular diffusion and time and space correlations.
***
A55 - Suivi en "live" de depolymerisation/repolymerisation de microtubules par changements
thermiques ultra rapides
Intervenants
Wallis Nahaboo, [email protected]
Objectifs
Nous cherchons à suivre les zones de croissance de microtubules lors de la mitose dans l’embryon
précoce de C. elegans. Une manière classique et utilisée dans d’autres organisme modèles, est
d’appliquer une drogue dépolymérisant les microtubules et d’ensuite de laver l’échantillons pour
observer la repolymérisation des microtubules. Or à cause de la coquille de l’embryon C. elegans il
est impossible d’utiliser ce protocole. C’est pourquoi nous voulons tester cette expérience à l’aide
45
ATELIERS
d’un système microfluidique contrôlant la température, CherryCell, en dépolymérisant les
microtubules par la froid (4°C) et les repolymérisant à température ambiante (25°C). La mitose de C.
elegans se déroule en quelques minutes seulement. Il est donc nécessaire de réaliser cette
expérience avec un système de contrôle ultra rapide de la température, comme proposé par le
système CherryCell.
Nous tenterons d’utiliser également ce système de contrôle précis de la température pour analyser
des mutations thermosensibles dans des protéines d’intérêts. Les échantillons seront maintenus à la
température restrictive de 16°C et passés à 25°C pour analyser les phénotypes de perte d’activité des
protéines à un moment précis du cycle cellulaire.
Description
Filmer la dépolymérisation et la repolymérisation des microtubules en temps réel.
***
A56 - Mobilité intracellulaire de protéines autofluorescentes dans un système de microscopie à
feuille de lumière
Intervenants
Jörg Langowski, [email protected]
Jan Krieger, [email protected]
Objectifs
En utilisant le système Zeiss à feuille de lumière, les participants vont enregistrer des séries d'images
dans des cellules HeLa exprimant des protéines autofluorescentes. Puis, ils utiliseront le programme
Quickfit, développé dans notre groupe, pour traiter ces séries d'images et générer des cartes de
mobilité. Par défaut, si le système Zeiss se démontre inadéquat à produire des série d'images pour
mesurer les mobilités, les participants vont travailler avec des données apportées par nous. Dans ce
cas, le système size sera est utilisé pour introduire la technique de microscopie à feuille de lumière
sur d'autres échantillons.
Description
Introduction à la microscopie à feuille de lumière
Concept de diffusion de protéines dans l'environnement dense de la cellule
Traitement de données de spectroscopie à corrélation de fluorescence: extraction de coefficients de
diffusion et des concentrations, génération de cartes bidimensionnelles de mobilité.
***
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ATELIERS
A57 - FRET : Quels écueils et comment les éviter ?
Intervenants
Laurent Gelman, [email protected]
Olivier Renaud, [email protected]
Objectifs
La première demi-heure de l’atelier sera consacrée aux aspects théoriques de la technique de FRET
(« sensitized emission FRET » et FRET par photo-blanchiment de l’accepteur) et donnera des
informations pratiques sur la préparation des échantillons et le choix des fluorophores donneur et
accepteur. Nous montrerons ensuite pas à pas comment paramétrer une acquisition de FRET sur un
microscope confocal en insistant sur les écueils majeurs de la démarche. En particulier, pour la
technique de photo-blanchiment, nous étudierons comment éviter de faux positifs dus à la photoconversion de l’accepteur ou à certains milieux de montage, ainsi que les faux négatifs dus au photoblanchiment du donneur pendant l’acquisition. Pour la technique de FRET par intensité (« sensitized
emission »), nous montrerons dans quel ordre les nombreux échantillons-contrôle doivent être
observés et en quoi chacun est utile pour le réglage du microscope préalable à l’expérience de FRET.
Durant les dernières 30 minutes de l’atelier, les images obtenues pendant la session seront
quantifiées avec Fiji/ImageJ et Excel. Nous montrerons que des plugins pour ImageJ ou une feuille de
calcul Excel bien organisée permettent une analyse rapide des images de FRET.
Après cet atelier, le stagiaire sera donc capable de réaliser une expérience de FRET par intensité ou
par photo-blanchiment en utilisant un microscope à balayage laser et d’analyser les résultats obtenus
grâce au logiciel open source ImageJ ou via Excel. Le but de l’atelier est de rendre accessible des
techniques avancées pour l’étude des interactions moléculaires sur des échantillons fixés et vivants.
Description
Rendre les utilisateurs familiers avec les réglages des microscopes confocaux pour une expérience de
FRET, et attirer leur attention sur les artéfacts engendrés par des échantillons ou des réglages non
adéquats.
***
A58 - Méthodes de marquage en fluorescence pour l'étude de la dynamique de la chromatine en
cellules vivantes
Intervenants
Sébastien Huet, [email protected]
Yann Cesbron, [email protected]
Objectifs
Au cours de cet atelier, nous présenterons deux approches permettant de marquer localement la
chromatine en fluorescence dans le but d'étudier sa dynamique. La première approche se fonde sur
l'utilisation de cellules exprimant un histone de coeur fusionné à une protéine photoconvertible. La
photoconversion locale des histones marqués à l'aide d'une irradiation à 405 nm permet alors de
47
ATELIERS
visualiser une région spécifique du noyau. Nous utiliserons cette approche pour mettre en évidence
les remodelages de la chromatine se déroulant au niveau des zones de dommages dans l'ADN. La
deuxième approche utilise quant à elle l'intégration de nucléotides fluorescents au sein de l'ADN.
Nous montrerons qu'elle permet d'accéder à des dynamiques spatiales plus fines que celles
observables via les histones photoconvertibles.
Description
Au sein du noyau des cellules eucaryotes, la fibre de chromatine s’organise suivant
une architecture complexe dont la dynamique reste mal caractérisée. Cette architecture joue
pourtant un rôle majeur dans la régulation de la transcription et de la réplication de l’ADN. L'atelier
que nous proposons a pour objectif de présenter plusieurs approches de marquage en fluorescence
de chromosomes individuels en cellules vivantes. L'observation de ces marquages par microscopie
confocale au cours du cycle cellulaire permettra de mettre en évidence l'intérêt de ces approches
pour caractériser quantitativement la dynamique de la chromatine différentes échelles
spatiotemporelles.
***
A59 - Imagerie rapide de foyers nucléaires sur cellules vivantes et quantification /dénombrement
de ces foyers automatisée Acquisition/Alignement/Analyse et Quantification
Intervenants :
Patricia Le Baccon, [email protected]
Sylvain Cantaloube, [email protected]
Objectifs
Acquisition de billes tetra marquées pour la mesure des décalages/déformations des images. Mise en
place des cellules sur le système (avec ou sans micro-fluidique). Mise au point des paramètres
d'acquisition. Visualisation de la dynamique des structures, mesure du bleaching. Comparaison des
images et visualisation du décalage. Traitement des données pour corriger les déformations et
explications du traitement. Les piles d’images de type hyperstack post-alignement seront analysées
avec différents outils développés. Tout d’abord avec le programme Qfoci : cet outil permet de
dénombrer les foyers dans les noyaux de levures et de quantifier l'intensité de chaque foyer. En
comparant différentes souches entre elles, il est ainsi possible de relever des différences, à la fois sur
le nombre de foyer par noyau mais aussi sur l'intensité de ces derniers. Un autre outil permet aussi
d'étudier la distribution spatiale des foyers dans le noyau et d'évaluer les distances des foyers entre
eux ou à la membrane nucléaire. Ces informations peuvent se révéler pertinentes dans la
compréhension de l'implication de certains gènes dans le noyau.
On profitera de l'atelier pour présenter des outils simples pour la segmentation ou la détection
Description
Sur des cellules vivantes (levures), réussir à faire des acquisitions 3D + 2 longueurs d'ondes + temps.
L'objectif est de montrer la difficulté d'imager une fluorescence faible dans de petites structures
48
ATELIERS
mobiles tout en limitant la toxicité et le bleaching. Le moyen le plus rapide étant l'utilisation d'un
microscope spinning disc équipé de deux caméras, un alignement/correction des images postacquisition est obligatoire. Les différentes déformations doivent être identifiées (shift x, y et z,
rotation mais aussi différence entre les capteurs) et un protocole de correction a été automatisé afin
d'analyser ensuite le nombre de signaux par noyau de façon automatisée. Cette analyse sur ces
acquisitions 3D+2couleurs, nous permet de segmenter automatiquement des signaux (foyers,
membrane nucléaire, nucléole…) en 2 et/ou 3 dimensions. A partir de de ces informations
dénombrer, localiser, mesurer (volume, intensité…) les objets et ce de façon complètement
automatisée et sans biais de l’utilisateur.
***
A60 - MitoDendra : une sonde fluorescente photoconvertible spécifiquement adaptée à l’étude de
la dynamique mitochondriale
Intervenants
Xavier Baudin, [email protected]
Arlette Pesty, [email protected]
Objectifs
L’atelier vise à présenter les possiblités expérimentales offertes par les protéines photoconvertibles.
Nous prendrons comme exemple la protéine photoconvertible Dendra2 adressée à la protéine coxVIII localisée dans la matrice mitochondriale, (mitoDendra) pour visualiser la fusion mitochondriale.
• Les caractéristiques générales de ces protéines seront exposées dans un PowerPoint, ainsi que le
dispositif nécessaire à la photoconversion (longueur d’onde d’excitation, miroir galvanométrique
pour cibler le site d’illumination).
• Nous ferons une description du matériel d’acquisition et de photoconversion qui seront utilisés.
• Nous utiliserons des cellules HeLa transfectées de façon stable avec mitoDendra (réseau de
mitochondries marqué en vert). Une brève irradiation laser permet le marquage sélectif (rouge) de
quelques mitochondries seulement. Dans un premier temps, le processus sera enregistré dans des
cellules en situation normale. Puis la fusion mitochondriale sera inhibée par la présence de CCCP qui
provoque la dissipation du potentiel de membrane et la modification du réseau vers une forme plus
fragmentée.
• Au cours de la manip de photoconversion, nous aborderons les précautions à prendre lors de
l’acquisition des données.
• Nous visualiserons les films enregistrés et nous traiterons les données de façon à quantifier et
comparer la répartition de la fluorescence dans les mitochondries photoactivées en situation
normale et de stress.
L’atelier devrait permettre à chacun des participants d’évaluer l’intérêt et la faisabilité de protocoles
utilisant une protéine photoconvertible comme Dendra2, appliqués à leur propre problématique.
49
ATELIERS
Description
L’objectif est de présenter l’intérêt des protéines photoconvertibles pour les études dynamiques.
Dendra2 servira d’exemple et sera appliqué à la visualisation spatio-temporelle de la dynamique
mitochondriale :
• La protéine fluorescente Dendra2 est convertie irréversiblement du vert au rouge quand elle est
activée par un laser proche violet.
• Le caractère monomérique de Dendra2 lui permet d’être facilement associée à une proteine
d’intérêt. Cette propriété permet aussi d’être rapidement exprimée dans la cellule transfectée.
• La distribution spatio-temporelle de la protéine d’intérêt photo-étiquetée par Dendra2 peut alors
être suivie de façon contrôlée à partir de l’instant précis où un pool limité de cette protéine a été
brièvement irradié par un laser violet.
• Un exemple d’application est donné ici avec mitoDendra où la sonde est adressée à une protéine
constitutive de la membrane mitochondriale (cox-VIII), dans le but d’étudier l’activité
mitochondriale. Des enregistrements seront faits sur des cellules en situation normale comparées à
des cellules en situation de stress.
***
A61 - Contrôle et imagerie de la température cellulaire
Intervenants
Guillaume Baffou, [email protected]
Julien Savatier, [email protected]
Objectifs
Les échantillons utilisés sont des boîtes de pétri dont le fond est recouvert d'un tapis uniforme de
nanoparticules d'or sur lequel des cellules vivantes ont été déposées. Sous illumination à leur
résonance plasmonique, les nanoparticules d'or absorbent efficacement la lumière incidente et se
transforment en nanosources de chaleur, capables de contrôler la température dans les cellules
avoisinantes. Le chauffage sera réalisé par illumination laser et la distribution de température
résultante sera mesurée grâce à un analyseur de front d'onde.
Description
- Aborder la problématique du chauffage local de cellules individuelles
- Aborder la problématique de l'imagerie thermique dans des cellules individuelles.
- Utiliser une nouvelle technique d'imagerie de température applicable en milieu biologique, et basée
sur l'utilisation d'un analyseur de front d'onde.
***
50
ATELIERS
A62 - Microscopie Multiphotonique Multimodale (TPEF / SHG-pSHG / THG / Mélange d'Ondes /
Photoablation)
Intervenants
Nicolas TISSOT, [email protected]
Thomas GUILBERT, [email protected]
Objectifs
30 min : présentation orale powerpoint de la MMP et des applications possibles avec les différents
contrastes disponibles en fonction de l'échantillon étudié.
1h30 : TP sur microscope multiphoton, passage de différents échantillons, de la cellule
(photoablation, TPEF, THG), au tissus biologique - muscle, tumeur en tranche – (TPEF, SHG-pSHG),
jusqu'à la drosophile.
Description
Présentation générale du principe de la microscopie multiphotonique (MMP) et de l'origine des
différentes sources de contrastes endogènes au sein des tissus biologiques.
Présentation des possibilités offertes par la MMP aux biologistes.
***
A63 - Tomographie par imagerie de phase incohérente et optique adaptative
Intervenants
Julien Savatier, [email protected]
Sherazade Aknoun, [email protected]
Objectifs
L'atelier se déroulera en plusieurs étapes :
- Comment faire de la tomographie en éclairage incohérent. Montrer la différence entre cohérent et
incohérent.
- Comment déconvoluer les images pour regagner du contraste perdu par l'éclairage incohérent.
- Constater que les images de phase deviennent plus floues avec la profondeur.
- Introduire dans le trajet optique un miroir déformable. Montrer qu'on change la qualité des images
en modifiant la forme du miroir et qu'en mettant une surface en aberration sphérique, on l'améliore.
- Calibrer la correction à différentes profondeurs, de façon manuelle puis automatique
- Synchroniser la correction avec le PIFOC afin de faire des images toujours nettes le plus profond
possible.
Description
Utiliser l'imagerie de phase sur des coupes de tissus biologiques d'une centaine de microns en
utilisant les propriétés de la lumière incohérente afin de définir des tranches optiques. Y adjoindre
51
ATELIERS
les possibilités données par l'optique adaptative pour conserver une qualité d'image optimale à
mesure qu'on descend en profondeur.
***
A64 - Optique adaptative grand publique : comment améliorer la PSF en maitrisant les paramètres
expérimentaux de base.
Intervenants
Orestis Faklaris, [email protected]
France Lam, [email protected]
Objectifs
Les paramètres pris en compte en vue de l'optimisation d'acquisition dans cet atelier sont : le choix
de la longueur d'onde d'émission, l'épaisseur de la lamelle, l'indice de réfraction de l'huile
d'immersion, la température et la profondeur de l'objet observé, pour un milieu de montage défini.
L'atelier sera composé d'acquisition d'image sur un système plein champ (de préférence un système
équipé avec une camera EMCCD, pour mieux voir les aberrations sur la PSF) et les acquisitions seront
effectuées avec un objectif de forte ouverture numérique, puis de l'analyse de ces images.
a) Dans la première partie, les mesures de métrologie et de l’influence des paramètres
expérimentaux sur la PSF seront faites sur des billes fluorescentes.
Présentation des échantillons et de leur préparation
- 1 lame avec des billes 4 couleurs de 170 nm de diamètre, montée au Vectashield --> Acquisition de
PSF --> Analyse sous MetroloJ --> différence des aberrations selon λ --> choix d'une seul λ pour régler
nos paramètres
- 1 lame avec des billes vertes de 170 nm de diamètre montée au Vectashield avec une lamelle
d’épaisseur 0,1mm, une autre lamelle d’épaisseur nominatif de 0,17mm et une lamelle 0,17mm de
haute précision (conseillé pour les techniques de super-resolution).
--> Acquisition PSF --> Analyse sous MetroloJ --> observation des aberrations et de la resolution
axiale selon le type de lamelle →Importance d'avoir la bonne épaisseur de lamelle adaptée à
l'objectif
d’épaisseur 0,17mm haute précision + une gamme d'huile d'indices différentes --> Acquisition PSF -->
Analyse sous ImageJ / MetroloJ --> Impact de l'indice de l'huile pour un objectif et un milieu de
montage donné → Importance du choix pour avoir la meilleur résolution et un maximum d'intensité
- 1 lame avec des billes vertes de 170 nm de diamètre montée dans du gel de polyacrylamide avec
une lamelle d’épaisseur 0,17mm haute précision + une gamme d'huile --> Acquisition PSF --> Analyse
sous MetroloJ --> Déformation de la PSF en fonction de la profondeur --> Correction possible par le
choix de l'huile
52
ATELIERS
d’épaisseur 0,17mm haute précision + chambre thermostatée à 37°C + huile d'indice n pour 23°C et
huile d'indice n pour 37°C --> Acquisition de PSF --> Analyse sous MetroloJ --> Changement de l'indice
de réfraction de l'huile en fonction de la température ; Impact sur la résolution
Cette première partie de l'atelier va se conclure par le choix des paramètres pour faire une
acquisition optimale avec un objectif, un milieu de montage et un échantillon biologique donné.
Nous utiliserons également le plugin PSF Generator sous ImageJ pour trouver les paramètres
optimaux et les comparer à ceux déterminés de manière expérimentale.
Cette comparaison va se faire sur l'analyse d'images de notre échantillon biologique prises avec nos
paramètres et ceux du plugin.
b) Dans la seconde partie, nous passons à la phase appliquée pour rendre compte de l'utilité de ces
mesures lors l'acquisition d'objets biologiques :
- Présentation de l'échantillon ; c'est un échantillon épais (pour rendre compte du paramètre
profondeur) avec un double marquage (pour la différence entre les deux λ) révélant une structure
filamentaire et une autre globulaire (pour voir l'impact de nos paramètres sur des objets de formes
différentes). Echantillon préparé à l’avance (fixé).
- Acquisition d'images avec les paramètres définies par les mesures expérimentales --> analyse de
l'image sous ImageJ --> mesure du ration signal/bruit + résolution
- Acquisition d'images avec les paramètres définies par le plugin PSF Generator --> analyse de l'image
sous ImageJ --> mesure du ratio signal/bruit + résolution
- Comparaison des résultats et Conclusion
- si le temps le permet et qu’un tel microscope est en place : Acquisition d'une image en superrésolution 3D-SIM avec les bons et les mauvais paramètres pour montrer que ces réglages sont
également (ou plutôt surtout) importants en super-résolution!
Description
Le but de cet atelier est de contrôler les paramètres qui jouent un rôle déterminant sur la résolution
et l’intensité de fluorescence obtenue d’un microscope optique inversé. Ces paramètres sont
souvent sous-estimés et comme résultat les images obtenues ne sont pas à l’hauteur des
performances attendues par les microscopes. Ces paramètres sont : la lamelle utilisée, l’huile
d'immersion, la température et la profondeur de l’objet étudié. L’objectif ici est la maitrise de
l’influence de ces paramètres sur la résolution et l’intensité du signal détecté et ensuite leur
adaptation par rapport à la problématique et l’échantillon étudié.
***
53
ATELIERS
A65 - Microscopie Raman Stimulée (CARS) : initiation à l'aspect source laser et instrumentation
Intervenants
Charles-Henri Hage, [email protected]
Objectifs
Les techniques d'imagerie Raman stimulée permettent, sans aucun marquage et avec une résolution
spatiale de quelques centaines de nm, d'identifier et de cartographier une liaison moléculaire
donnée au sein d'un échantillon. Un domaine d'applications grandissant est l'étude in vivo du
métabolisme des lipides. Ces techniques, développées depuis 1999, complètent les techniques de
fluorescence et peuvent être mises en œuvre simultanément à ces dernières. Le présent atelier a
pour but de présenter les concepts et potentialités de ces techniques. Il abordera plus précisément
les aspects de source et d'instrumentation existants et nécessaires à ce type d'imagerie, l'aspect
application à l'imagerie biologique étant l'objet d'un autre atelier.
Description
L'atelier se déroulera sur un système développé au laboratoire. Sa simplicité est pédagogique et
permettra de s'assurer d'un dispositif fonctionnel pour les ateliers et d'introduire les évolutions et
stratégies couramment utilisées. Déroulement :
- Présentation des concepts de l'imagerie Raman stimulée.
- application sur échantillons de référence et cellules pour illustrer ce type d'imagerie
- description de la source utilisée, et introduction du cahier des charges de la source nécessaire à ce
type d'imagerie.
- discussion sur les différentes possibilités technologiques de sources
- si le temps le permet, introduction d'autres fonctionnalités d'imagerie CARS/SRS et présentation
des sources nécessaires
***
A66 - Imagerie en flux
Intervenants
Chloé Guedj, [email protected]
Objectifs
L'Atelier se déroulera en deux parties. Une première partie se concentrera sur l'acquisition et la
description du cytomètre imageur. Puis dans un deuxième temps nous passerons sur une station
d'analyse dédiée, montrant les différents outils d'analyse et de quantifications.
54
ATELIERS
Nous prendrons comme exemple une analyse de la synapse immunologique entre des cellules APC et
T.
Description
Depuis quelques années des cytomètres imageurs (Imagestream de la société AMNIS) sont installés
dans des plates-formes de cytométrie et donc peu connu des plates-formes de microscopie
photonique. À l'utilisation on peut se rendre compte rapidement que le point critique de l'imagerie
en flux et le traitement d'images.
Ainsi l'atelier 'Imagerie en flux', expliquera la puissance des outils d'analyse et de quantification de
ces systèmes, rassemblant les avantages statistiques des cytomètres et les informations spatiales
d'un microscope plein champ.
***
A67 - Microscopie Raman Stimulée (CARS) : initiation à l'aspect imagerie biologique
Intervenants
Charles-Henri Hage, [email protected]
Objectifs
Les techniques d'imagerie Raman stimulée permettent, sans aucun marquage et avec une résolution
spatiale de quelques centaines de nm, d'identifier et de cartographier une liaison moléculaire
donnée au sein d'un échantillon. Un domaine d'applications grandissant est l'étude in vivo du
métabolisme des lipides. Ces techniques, développées depuis 1999, complètent les techniques de
fluorescence et peuvent être mises en œuvre simultanément à ces dernières. Le présent atelier a
pour but de présenter les concepts et potentialités de ces techniques. Il abordera plus précisément
les aspects d'application à l'imagerie de cellules et tissus, l'aspect technologique (source laser
notamment) étant l'objet d'un autre atelier.
Description
L'atelier se déroulera sur un système développé au laboratoire. Sa simplicité est pédagogique et
permettra de s'assurer d'un dispositif fonctionnel pour les ateliers et d'introduire les évolutions et
stratégies couramment utilisées. Déroulement :
- Présentation des concepts de l'imagerie Raman stimulée.
- application sur échantillons de référence et cellules
- prise en main technique du dispositif, mise en œuvre, discussions et échanges sur les aspects
techniques (source, détection...)
- Imagerie sur échantillons fluorescents : concept de l'imagerie multimodale et de ses potentialités
(CARS/SRS, fluorescence, SHG/THG/SFG...).
55
ATELIERS
- Possibilité de tester les échantillons amenés par les participants.
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A68 - Imagerie de l’ordre moléculaire orientationnel par fluorescence polarisée
Intervenants
Patrick Ferrand, [email protected]
Sophie Brasselet, [email protected]
Objectifs
Cet atelier présentera les aspects instrumentaux et méthodologiques de la technique.
Instrumentation : Comment agir sur la polarisation de la lumière, l’analyser de façon rigoureuse,
mettre en évidence et quantifier des distorsions de polarisation pouvant être induites par les
composants optiques, les compenser le cas échéant. Le système présenté sera suffisamment ouvert
pour permettre des manipulations.
Méthodologie : Quel est le rôle du fluorophore ? Quelles sont les grandeurs mesurées ? Comment
sont-elles obtenues ? Comment les interpréter avec des modèles géométriques simples. Des mesures
pourront être menées sur des échantillons types (solution, sondes lipidiques en membrane cellulaire,
etc.) ou amenés par les participants à l’atelier.
Description
L’imagerie de fluorescence polarisée permet, en sondant l’échantillon sous plusieurs polarisations
d’excitations, de remonter à des informations quantitatives sur l’ordre orientationnel de
fluorophores dans leur milieu. On peut ainsi cartographier l’orientation moyenne et le degré de
directionnalité des fluorophores dans des milieux où ceux-ci sont contraints comme des sondes
lipidiques dans la membrane cellulaire, des sondes associées à des protéines membranaires ou à des
fibres d’actines... Nous avons développé un mode opératoire basé sur une imagerie confocale rapide
de type spinnig disk, qui permet d’imager en cellule cette information orientationnelle de manière
dynamique, à une cadence de mesure de plusieurs images par seconde.
L’ordre orientationnel peut être relié à l’organisation du système biologique à l’échelle moléculaire
ou à sa morphologie sub-résolution, fournissant ainsi une information structurale complémentaire de
l’information morphologique plus traditionnelle.
Refs :
- Kress et al., Biphys. J 2013 : http://dx.doi.org/10.1016/j.bpj.2013.05.043
- Wang et al., Rev. Sci. Instrum 2013 : http://dx.doi.org/10.1063/1.4807318
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56
ATELIERS
A69 - Imagerie en lumière blanche : parce que le marquage fluorescent n'est pas la solution
systématique
Intervenants
Pierre Bon, [email protected]
Objectifs
Je propose d’utiliser un microscope standard en lumière blanche équipé de diverses modalités
d’imagerie de lumière blanche :
- Un montage de type Differential Interference Contrast (DIC)
- Un système d’imagerie de Phase quantitative
- Un montage d’imagerie de réflexion totale interne frustrée
L'atelier se déroulera en trois partie.
1) Cours/discussion autour des concepts d'interaction lumière/matière (diffraction, absorption...).
Bien comprendre qu'un contraste peut exister même si l'objet n'absorbe ou n'émet pas de lumière.
Aborder les notions de résolution, de spécificité d'imagerie en régime de diffraction et les différences
avec la fluorescence. Aborder les limitations de la fluorescence (photobleaching, viabilité des
échantillons...) et ce que la lumière blanche ne replace pas directement (ex : spécificité).
2) "MacGyver de la microscopie" ou comment s'amuser avec la lumière blanche d'un microscope
standard pour créer du contraste sur un échantillon biologique ; en transmission et en réflexion. Ex :
illumination oblique, jouer avec la focalisation, la cohérence de la lumière... Faire comprendre aux
participants par la manipulation du microscope que le repérage des objets d'intérêt peut se faire en
lumière blanche, évitant ainsi de bleacher les échantillons pour un simple repérage/comptage.
3) Techniques de microscopie de lumière blanche "avancées" : contraste de phase, DIC, phase
quantitative et réflexion totale interne frustrée (epi-Evanescent microscopy). Montrer que certaines
applications en biologie peuvent se passer de fluorescence (ex. suivi de cellules, comptage...).
Montrer que de nouvelles choses sont envisageables par ces techniques : mesure de la masse
cellulaire, tomographie de membrane cellulaire à résolution nanométrique par exemple.
Le TP se veut très ouvert en terme de tests d'échantillons et d'essais par les utilisateurs : les concepts
présentés dans ce TP, bien que souvent méconnus, sont simples à maitriser et pourront être testés
directement par les participants.
Description
Bien comprendre les intérêts et certains travers des marquage fluorescent, notamment par rapport à
la viabilité des échantillons biologiques et à la fragilité et au bruit.
Identifier lorsqu'une problématique ne nécessite pas ou peu de spécificité moléculaire et que les
techniques d'imagerie sans marquage peuvent y répondre.
(Re)découvrir les bases de l'imagerie microscopique sans marquage, de l’interaction simple de la
lumière avec la matière, et un certain nombre de "trucs" réalisables avec n'importe quel microscope.
57
ATELIERS
(Re)découvrir les récentes avancées en instrumentation sans marquage fournissant permettant de la
spécificité : imagerie de phase quantitative, imagerie membranaire super-résolue axialement...
***
A70 - Screening HCS, integration de la cytométrie par analyse d'images sur une plateforme mixte
cytométrie/Imagerie
Intervenants
Benoit Maury, [email protected]
Objectifs
- La microscopie HCS : présentation et apports
- Les différences entre FACS et HCS (acquisition)
- Les échantillons, possibilités, préparation et limites
- Automatisation des acquisitions, autofocus
- HCS et in vivo
- Récupération des données, notions de volume data
- Analyse d'image, Détection/tracking objets cellulaires et sub cellulaires, les apports du HCS
- Comparaison cytométrie/HCS (analyse)
Description
Montrer l’apport de la microscopie HCS sur une plateforme mixte cytométrie/imagerie sur
différentes applications. Les possibilités offertes par l’analyse HCS sur du matériel vivant en
vidéomicroscopie.
***
A71 - Scripts et programmation graphique sous Icy (level 2)
Intervenants
Fabrice de Chaumont, [email protected]
Objectifs
Initiation aux scripts en JavaScript
Initiation à l'écriture de protocoles
Comment créer des batchs
Comment créer des sorties de mesures sur mesures
Comment partager ses scripts et protocoles par mail ou sur le web.
Description
Permettre aux utilisateurs d'écrire leur propres scripts et protocoles ( programmation graphique )
Stephane Dallongeville, [email protected]
***
58
ATELIERS
A72 - Segmentation d'images microscopiques sous ImageJ
Intervenants
Yves USSON, [email protected]
Arnold FERTIN, [email protected]
Objectifs
Différents algorithmes de segmentation seront présentés et testés au travers d'exercices simples
sous ImageJ : segmentation de signaux de fluorescence en 2D et 3D, segmentation et/ou détection
de cellule ou d'organite en microcopie de phase et DIC.
La deuxième partie de l'atelier consistera à développer une stratégie de segmentation combinant
plusieurs des outils préalablement testés pour la résolution d'un problème complexe d'analyse
d'image microscopique.
Description
L'analyse d'image microscopique est une discipline transversale dans le cadre de la microscopie
fonctionnelle du vivant. L'objectif de cet atelier est de donner des éléments techniques en
segmentation d'image pour aider les utilisateurs a déterminer la stratégie adaptée à la résolution de
leurs problèmes d'analyse d'image en microscopie.
***
A73 - Déconvolution d'image 3D en microscopie de fluorescence
Intervenants
Alain Dieterlen, [email protected]
Bruno Colicchio, [email protected]
Objectifs
Cet atelier ne propose pas l'utilisation d'une méthode de déconvolution en particulier, mais plutôt
une sensibilisation sur les critères importants pour tout traitement de ce type. Par contre nous
n'aborderons pas la déconvolution aveugle (sans utilisation d'une réponse impulsionnelle fournie).
Ces techniques trouvent leurs places essentiellement en microscopie confocale et bi-photon.
Cependant certains des problèmes abordés restent valables.
Dans l'atelier, nous procéderons de la manière suivante :
1) Simulation d'un objet de synthèse (référence), et utilisation de mesures sur objets connus (billes)
2) Simulation de la réponse impulsionnelle du microscope, et utilisation de PSF mesurées dans des
conditions différentes.
3) Simulation de l'image obtenue à partir de l'objet de référence et des réponses du système optique
calculées et mesurées.
4) Application de différents types de déconvolution (direct ou itératif), avec différents paramètres.
5) Observation du résultat comparé à l'objet de référence.
59
ATELIERS
6) Changement des paramètres de l'image (bruit, saturation, échantillonnage) et reprise des points 3
à 6.
Description
À l'issue de l'atelier, les participants seront sensibilisés aux traitements d'image du type «
déconvolution » et sur l'importance des paramètres d'acquisition des images et du réglages des
paramètres demandés par ces algorithmes. Ils disposeront des éléments pour évaluer la pertinence
du résultats de tels traitements.
***
A74 - ImageJ macro programming for beginners
Intervenants
Volker Baecker, [email protected]
Elodie Jublanc
Objectifs
The basic concepts of macro programming:
- calculations and expressions
- the tools: macro editor, debugger and recorder
- string processing
- variables
- loops and conditions
- functions
- working with files, images, stacks
- working with the histogram
- interactive macros and user interfaces
- macro toolsets
For each topic there is a short presentation followed by a small exercise that has to be solved by the
participants.
Description
Learn how to write ImageJ macros for the automation of Image analysis tasks.
***
60
ATELIERS
A75 - Analyse conjointe d'images et de données sous Knime
Intervenants
David Rousseau, [email protected]
Carole Frindel, [email protected]
Objectifs
Nous introduisons le logiciel KNIME, ses bibliothèques d'analyse d'images et d'analyses statistiques et
les liens possibles avec des logiciels d'analyse d'images comme ImageJ ou d'analyses statistiques
comme R. Nous illustrons notre propos avec une étude de cas.
A l'issue de cet atelier, les stagiaires seront capables de :
1) générer des rapports automatiques avec Knime
2) traiter des images avec Knime
3) interagir avec R dans Knime
4) développer leurs propres projets dans Knime
Description
Dans cet atelier, nous présentons un logiciel libre d'introduction récente KNIME, qui permet de
réaliser dans le même environnement l'analyse d'images issues de bases de données et l'analyse
statistique des informations extraites des images et associées à ces images.
***
A76 - OMERO. An open source client-server software for visualization, management and analysis of
biological microscope images
Intervenants
Julio Mateos Langerak, [email protected]
Amelie Sarrazin, [email protected]
Objectifs
The main part of the course will be in the format of a guided tour through the basic functions of
OMERO. The attendees will be able to reproduce a number of routines on their laptops. There will be
a short theoretical introduction and concluding section where the most advanced features of OMERO
will be presented on a presentation.
INTRODUCTION (15’ theoretical presentation)
- Why care about a centralised scientific image database
- OMERO basic structure: client-server. RAW data and metadata, search engine, APIs, bio-formats,
open-source
- Basics on OMERO installation and configuration (OMERO will be already installed on the computers)
61
ATELIERS
IMPORTING IMAGES (15’ hands on guided tour)
- Opening OMERO.insight and logging in
- Selecting images and adding them to the import queue
- Selecting group
- Selecting / Creating Projects and Datasets
- Adding tags on import
- Raw data storage and integrity report
ORGANISING IMAGES (30’ hands on guided tour)
- Basic window layout: left, middle and right panels
- Projects and datasets, browsing data, moving data around
- Tagging
- Attaching files
- Searching and filtering
- Visualising metadata
- Downloading and exporting
VIEWING IMAGES (15’ hands on guided tour)
- Opening images
- Browsing through image dimensions (C, Z, T)
- Rendering settings
ANALYSING (15’ hands on guided tour)
- ROI creation
- Performing and exporting basic measurements (distances, sizes and pixel intensity)
SHARING (15’ hands on guided tour)
- Groups: structure and permissions
- Moving data between groups
- Publishing data
OVERVIEW OF ADVANCED FEATURES (15’ theoretical presentation)
- OMERO.editor
- Scripting service
- OMERO API’s: Java, C++, Python and Matlab. What does that mean
- Examples: Advanced web browser client, ImageJ, FLIMfit, CellProfiler, KNIME,…
- Extendibility. Not only for imaging data
QUESTIONS / REMARKS
Description
OMERO is a client-server software that handles scientific images in a secure central repository. It
allows to view, organize, analyze and share data from anywhere with Internet access, work with the
images from a desktop application (Windows, Mac or Linux), from the web or from 3rd party
software.
62
ATELIERS
In this workshop, we aim to teach the attendees, through a practical guided tour, to use the basic
functionalities of OMERO and learn about the potential that this application has as a framework to
store, share and analyze scientific microscopy data.
***
A77 - Métrologie des instruments d’imagerie : utilisation des différents éléments de valise
Métrologie
Intervenants
Raphaelle Desvaux, [email protected]
Perrine Frère
Jean-François Gilles, [email protected]
Objectifs
Pendant cet atelier, les tests métrologiques développés par le groupe Métrologie seront réalisés à
l'aide des outils de la valise Métrologie ainsi que le nouvel outil proposé par la société Argolight.
L’analyse et l’interprétation des données issues de ces tests seront effectués à l’aide du plugin
MetroloJ.
Description
Cet atelier vise à montrer l’utilisation de lames et d’outils de mesure disponibles actuellement pour
tester les équipements d’imagerie (microscope confocale et champ plein).
***
A78 - Quel type de caméra choisir pour quel type d'expérimentation : CCD, EMCCD ou sCMOS ?
Intervenants
Sébastien MARAIS, [email protected]
Objectifs
- Rappel sur le mode de fonctionnement des différentes caméras présentées
- Acquisitions sur différents types d'échantillons (fixés et vivants) avec différents paramètres sur les 3
types de caméras : CCD, EMCCD et sCMOS
- Analyse des résultats grâce à une routine ImageJ/Metamorph
- Tenter de trouver une réponse : quelle caméra pour quelle problématique ?
Description
L'arrivée de nouvelles caméras sCMOS performantes sur le marché depuis quelques années enrichie
l'offre de capteurs pour la microscopie plein champ jusqu'alors principalement occupée par les
caméras CCD et EMCCD.
63
ATELIERS
Le but de cet atelier est de tester ces différents types de détecteurs et de déterminer quel type de
caméra sera le plus adapté à différents types d'acquisitions et d'échantillons qui seront effectuées
pendant l'atelier, avec les participants.
Les données générées seront alors comparées et analysées grâce à une routine ImageJ/Metamorph
pour essayer de comprendre les différences entre les technologies proposées.
***
A79 - Etude quantitative des effets de phototoxicité des paramètres de l’éclairage en microscopie
de fluorescence
Intervenants
Julien Roul, [email protected]
Objectifs
En collaboration avec la société Photonlines, sur un banc test présentant différents types
d’éclairement (Lampe à mercure, LED, laser) et différentes modalités (continu, modulé, pulsé), nous
présenterons les différentes méthodes utilisées pour étudier la phototoxicité. Nous travaillerons en
culture de cellule, et caractériserons la phototoxicité par la mesure du potentiel de membrane
mitochondrial. Nous présenterons également nos résultats sur embryon de c-Elegans lors de ses
premières divisions en caractérisant la phototoxicité par la vitesse de division. Enfin, nous
présenterons nos travaux d’analyse statistique multivariée pour faire ressortir les modalités les
moins invasives.
Description
Présenter les différentes méthodes d’étude de phototoxicité.
Présenter les différents modes d’éclairement pour la microscopie.
Présenter une approche pour évaluer les différents effets phototoxiques.
***
A80 - Arduino1 : Introduction au pilotage de périphériques
Intervenants
Thierry Legou, [email protected]
Brice Detailleur, [email protected]
Objectifs
Les systèmes commerciaux clé-en-main aussi complets soient-ils, ne permettent pas toujours de
maîtriser exactement un design expérimental. Cet atelier permettra à ses participants de découvrir
des technologies libres, innovantes, simples d'utilisation et relativement peu coûteuses pour mettre
en oeuvre le trio périphérique- microcontrôleur- logiciel.
64
ATELIERS
- Introduction au microcontrôleur libre 'Arduino'. Principe; Description du matériel; Découverte du
logiciel de programmation; Programmation d'un exemple: pilotage d'un éclairage à LED.
- Introduction au logiciel de tracé 'TCI'. Exemple de la carte d'extension RT-mfm et de la platine de
support des capteurs de température.
- Communication par liaison série entre la station de travail et le microcontrôleur. Exemple avec le
logiciel Processing.
Démonstration et discussion autour de systèmes déjà réalisés ou de projets.
Cet atelier est la réalisation d'un projet proposé et édité par le groupe de travail Arduino
(électronique libre) du RT-mfm. Les fiches de réalisations de l'ensemble des projets du groupe seront
mises à disposition sur le site internet du RT-mfm.
Description
S'initier aux technologies de pilotage de périphériques simples pouvant s'insérer dans la conception
d'une expérience de microscopie du vivant.
***
A81 - Arduino 2: Réalisation d'un système de monitoring et contrôle de la température
Intervenants
Christian Rouviere, [email protected]
Jerome Mutterer, [email protected]
Objectifs
Réaliser en totalité un montage à base du microcontrôleur Arduino qui permet de contrôler
l'évolution de la température réelle à proximité de l'échantillon dans une expérience de microscopie
du vivant.
Description fonctionnelle : Relevé et log de la température à proximité directe de l'échantillon.
Détermination d'une plage de température attendue et avertissement par un signal lumineux (led
verte/rouge) en cas de dérive en dehors de cette plage. Activation de systèmes de compensation
(refroidissement ou chauffage) pour retour à la température de consigne).
Assemblage des composants sur la carte intégrée (pratique de la soudure).
Téléchargement du micro-logiciel sur la carte contrôleur (Arduino).
Connexion au logiciel de contrôle.
Test du bon fonctionnement
Modification pour évolution possible avec adjonction d'un refroidissement ou d'un chauffage.
Démonstration et discussion autour de systèmes déjà réalisés ou de projets.
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ATELIERS
Cet atelier est la réalisation d'un projet proposé et édité par le groupe de travail Arduino
(électronique libre) du RT-mfm. Les fiches de réalisations de l'ensemble des projets du groupe seront
mises à disposition sur le site internet du RT-mfm.
Description
Réalisation pratique d’un projet de fiche du groupe ‘Arduino’ du RT: Construire entièrement un
système de contrôle de la température dans l'environnement d'une manip de microscopie.
***
A82 - CAO et impression 3D
Intervenants
Brice Detailleur, [email protected]
Isabelle Gillot, [email protected]
Objectifs
L'atelier est structuré en 2 étapes, la première consiste à donner les éléments de base de dessin
industriel avec un logiciel libre de droit tel Inventor ou autre. La deuxième à faire imprimer le modèle
dessiné et évaluer les avantages et les limites de l'impression 3 D.
Une imprimante 3 D sera mise à disposition par une entreprise spécialisée du domaine
Description
donner accès à la communauté de l'imagerie à une nouvelle technologie qui permet de réaliser des
nouveaux supports (lames avec canaux, porte lamelle circulaire.....) et tout type d'objets dessinés par
CAO
***
A83 - Analyses haut-débit de l’architecture des biofilms bactériens grâce à l’acquisition assistée en
microscopie confocale.
Intervenants
Alexis CANETTE, [email protected]
Pierre ADENOT, [email protected]
Objectifs
- Rappel théorique sur les notions de biofilms et pertinence de l’utilisation de la microscopie
confocale dans leur analyse
- Rappel pratique sur la préparation adaptée à l’analyse des biofilms en routine (plaque 96 puits,
colorants type kit live/dead Invitrogen…)
- Acquisitions manuelles de stacks de biofilms
66
ATELIERS
- Acquisitions automatisées de stacks de biofilms (HCS SP8 Leica) : utilisation des outils
d’amélioration (autofocus, gestion du dispenseur du liquide d’immersion de l’objectif, design à façon
du support virtuel d’acquisition…)
- Analyses post-traitements pour reconstructions 3D et extractions de paramètres structuraux
chiffrés (biovolumes, épaisseurs…) grâce à des routines sur outils libres (FiJi, Icy) ou payants (Imaris)
Description
L’analyse de l’organisation en 4 dimensions (3D + temps) in situ et de manière non invasive est un
apport essentiel sur la compréhension du fonctionnement des communautés bactériennes
structurées.
Cet atelier montrera l’intérêt d’un travail assisté par une nouvelle solution logicielle d’un
constructeur, pour générer des données avec une amélioration qualitative et quantitative
(automatisation reproductible et gestion des données).
Cet atelier montrera que ce bond technologique offre la possibilité d’études en microbiologie à très
grande échelle : phénotypage de souches (grandes banques de mutants), interactions multi-espèces
et capacités de résistance face à l’action de biocides (larges chimiothèques).
***
A84 - CLEM sur MEB Haute résolution et sur MEB de table (Solution innovante alternative)
Intervenants
Etienne Gontier, [email protected]
Jennifer Petersen, [email protected]
Objectifs
Présentation théorique et pratique des différentes méthodes de préparation d'échantillon pour
permettre l'observation d'échantillon à la fois en microscopie par épi fluorescence et au microscope
électronique à Balayage
Mise en œuvre de l'acquisition d'image, d'échantillons préparés spécifiquement, sur l'équipement
qui possède à la fois un microscope à épi fluorescence dans la chambre.
Description
Mise en œuvre de la microscopie corrélative épi fluorescence - électronique à balayage dans un
même équipement afin de faciliter la corrélation des informations d'un même échantillon.
Déterminer les méthodes de préparation permettant de maximum l'utilisation des avantages de
chaque méthode d'observation.
***
67
ATELIERS
A85 - FigureJ sur imageJ : vos planches d'images en quelques clics !
Intervenants
Nicolas GOUDIN, [email protected]
Objectifs
Cet atelier se concentrera sur FigureJ. Il ne sera donc pas évoqué l'utilisation d'imageJ pour diverses
analyses.
Première étape : petit rappel des outils nécessaires : imageJ, Loci_tools, paramétrage de la mémoire
d'imageJ et création d'une image en composite.
Seconde étape : utilisation simple de FigureJ. Création d'une planche, merge d'images, implantation
d'une échelle, création de bordure sur chaque case et enregistrement.
Troisième étape : utilisation avancée de FigureJ. Mise en valeur des résultats avec effet de zoom et
échelle associée, amplification du signal, filtre pour le bruit, galerie d'images.
Quatrième étape : Réalisation de planche d'images pour l’intégration de screenshot provenant
d’autres logiciels d’analyses (Imaris etc) .
Dernière étape : discussion et questions
Description
Mise en valeur des résultats par la réalisation de planches d’images avec l’outil FigureJ.
***
A86 - Etude de la colocalisation en bio-imagerie
Intervenants
Thibault Lagache, [email protected]
Objectifs
L'atelier comportera un cours théorique présentant les enjeux quantitatifs et statistiques en
colocalisation, les différentes méthodes basées Intensité et Objet existantes avec leurs
avantages/inconvénients en fonction du type d'imagerie utilisée. Il s'agira ensuite de présenter les
différentes solutions open-source proposées. Enfin, nous proposerons d'accompagner les utilisateurs
pour traiter les données qu'ils auraient apportées.
Description
Les objectifs de cet atelier seront de
- présenter les différentes méthodes basées Intensité et Objet permettant d'analyser la colocalisation
de molécules en bio-imagerie
68
ATELIERS
- déterminer les méthodes les plus adaptées suivant le type de problème et la méthode d'imagerie
utilisée (microscopie confocale, super résolution, microscopie électronique...)
- présenter les outils disponibles sur les logiciels open-source (ImageJ-Fiji et Icy)
***
A87 - Microscopie corrélative : intégration d'un microscope à fluorescence, dans un microscope à
balayage
Intervenants
Isabelle Paintrand, [email protected]
Karine Monier, [email protected]
Objectifs
Montrer l'intérêt de la technique de microscopie corrélative utilisant l'intégration d'un microscope de
fluorescence dans un microscope à balayage pour l'analyse des nucléoles et des centrosomes.
Description
- Présentation du MEB intégré et de ses applications (théorie)
- description de la préparation des échantillons (théorie)
- Imagerie corrélative du nucléole et des centrosomes des cellules: fluorescence/MEB
***
A88 - Mesures mécaniques sur des tissus animaux et végétaux en croissance
Intervenants
Pascale Milani, [email protected]
Julien Chlasta, [email protected]
Objectifs
Montrer l'intérêt de la microscopie de force atomique pour déterminer les propriétés physique d'un
tissu biologique.
Description
- Présentation du principe de l'AFM (théorique) et de la méthode pour obtenir des données sur les
propriétés mécanique.
- Présentation des modèles biologiques utilisés : le méristème apical chez arabidopsis et le follicule
ovarien chez la drosophile.
- Mesures de force sur ces échantillons (pratique) et analyse des courbes de forces.
- Interprétation des données (théorique)
***
69
ATELIERS
A89 - FCS 2 couleurs pour l'atude des interactions protéine-protéine
Intervenants
Giulia Bertolin, [email protected]
Objectifs
Maitriser la mesure de cross-correlation deux couleurs pour les interactions protéine-protéine
Comprendre et maitriser les artefacts de mesure
Comprendre et maitriser les methodes pour supprimer l'artefact de fuite spectrale
Description
Sur un système Microtime de Picoquant, nous utiliserons la methode de PIE (Pulsed Interleaved
Excitation) pour mesurer la FCS deux couleurs sans artefact de fuite spectrale.
Nous utiliserons des tandems modèles pour mimer la co-diffusion de protéines fluorescentes des
deux couleurs.
***
A90 - Super-resolution scanning microscopy and spectroscopy -Time resolved STED –
Intervenants
Mathias Clausen, [email protected]
Objectifs
The principles and methodology of STED microscopy will be explained. The microscope setup will be
explained at the demo instrument. Proof-of-principle measurements on fluorescent beads, which are
used to quantify the resolution of the microscope, as well as differently labeled cells, fluorescent
molecules in different solvents, and model lipid membranes will be performed to demonstrate the
performance and capabilities of STED. Imaging as well as STED-FCS will be shown. The limitations,
advantages and disadvantages of the method will be elaborated.
All measurements are performed in time-resolved acquisition mode, and the advantages of time
resolved fluorescence microscopy will be emphasized in the on-line data analysis. Fluorescence
lifetimes will be measured in the test samples at high spatial resolution. In addition, time-resolved
data acquisition can be used to improve the resolution of STED by photon selection (gated STED or
fluorescence lifetime fitting).
The demo will be a mix from slide presentations and demo measurements
Description
Resolution of optical microscopy is limited to about 200 nm. That means that structures smaller than
this cannot be resolved. In biology and medicine, many of the most interesting structure are smaller
than this length scale and cannot be resolved. Super-resolution microscopy allows to discern small
structures, and infer biological function.
***
70
Lundi 6
TR-T-4 : Culture cellulaire : Préparations
de cellules, supports et chambres
d’incubations pour l’imagerie en temps
réel
MA-1-1 : Microscopie SIM aveugle (BlindMA-5-1 : Corrélation de fluorescence
SIM)
FCS/TICS
MA-2-1 : Aspect modélisation physique
21h30-23h30
TR-T-2 : Besoins et réalisations autour
et bio et interface surface
d’un Arduino dans les plateformes
TR : Création axe mécano
d’imagerie
Bio au GDR
16h30 - 18h30
TR-3-1 : stratégies de manipulation
d’organismes modèles pour l’imagerie in
vivo in toto multi échelles et
multimodale
Mardi 7
TR-T-5 : High Content Screening and
Analysis : intérêts pour les nouvelles
technologies de microscopie optique
TR-5-2 : Interaction moléculaire en
microscopie
TR-T-1 : Big data en imagerie : état des
lieux des softs de gestion du cycle de vie
des images et des bases de données
images ouvertes disponibles
MA-4-2 : Outils Chimiques pour la
photorégulation d’activités biologiques
MA-T-1 : Traitement du signal optique
robuste et interdisciplinarité en
biophysique, biologie ou biomédecine
MA-4-1 : Sondes et actuateurs encodés
génétiquement : approche optogénétique
intracellulaire et biosenseurs FRET
Mercredi 8
Modules Avancés (MA) et Tables Rondes (TR)
MA-3-1 : An integrative biology platform
TR-1-1 : Quelles références pour quelles
for the measurement and computational
mesures en métrologie, vers la
modeling of multicellular dynamics
métrologie de la super-résolution
from 3D+time in vivo imaging of animal
14h30 - 16h30
early embryogenesis
TR-T-3 : Plateforme, mutualisation
d'instruments scientifiques : création et
MA-7-1 : Microscopie corrélative: de
développement d'un service
l’optique à l’électronique
Dimanche 5
MA-6-2 : Imagerie du petit animal : de
l’imagerie multi échelle aux mesures
multiparamétriques ; quels outils
aujourd’hui ?
MA-2-2 : Descripteurs 3D avancés pour
l'analyse de la morphologie cellulaire
MA 5-3 : The analysis and simulation of
spatial trajectories of intracellular and
membrane proteins: methodological
aspects
MA-6-1 : Mesures quantitatives avec
optique adaptative
Jeudi 9
Modules Avancé et Tables Rondes
MODULES AVANCES / TABLES RONDES
Module Avancé ou Table Ronde- /-Numéro module associé ou Transversal-/-Numéro MA ou TR
71
A-1-1 : Microscopie SIM aveugle (Blind-SIM)
Hugues Giovaninni et Marc Allain
I. Microscopie de fluorescence : du SIM au Blind-SIM
a) Principe du SIM
b) Contrôle des illuminations et éclairements aléatoires
c) Statistiques du speckle
II. Reconstruction en Blind-SIM
a) Estimation au sens des moindres-carrés à illuminations connues et inconnues
b) Algorithme sous contrainte de positivité
c) Illustrations et perspectives
Ce module avancé décrit une stratégie de microscopie de fluorescence super-résolue basée sur la
technique des éclairements structurés (SIM). Cependant, contrairement aux techniques SIM standard
[1], la connaissance des illuminations n’est pas ici postulée, ce qui conduit à une technique SIM dite «
aveugle » (Blind-SIM).
Ce module avancé est structuré en deux temps.
Dans un premier temps, les éléments clés de la microscopie SIM standard seront rappelés,
notamment pour mettre en lumière les difficultés liées au contrôle de la grille de lumière au niveau
de l’échantillon. Le principe d’éclairements structurés par des figures de speckle sera introduit [2],
notamment pour souligner les simplifications permises du point de vu instrumental.
Dans un second temps, les aspects de reconstruction de la densité de fluorescence seront abordés.
La reconstruction à éclairements connus sera d’abord décrite pour souligner les difficultés induites
par des éclairements aléatoires (speckle). Nous aborderons ensuite l’ajout de contraintes adaptées
(homogénéité, positivité) pour résoudre le problème en Blind-SIM. Nous terminerons en donnant
quelques illustrations de reconstructions en Blind-SIM, et en précisant les limites actuelles de la
méthode.
[1] M. G. L. Gustafsson. Nonlinear structured-illumination microscopy: Wide-field fluorescence imaging with theoretically
unlimited resolution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 102(37):13081–
13086, 2005.
[2] E. Mudry, K. Belkebir, J. Girard, J. Savatier, E. Le Moal, C. Nicoletti, M. Allain, and A. Sentenac. Structured illumination
microscopy using unknown speckle patterns. Nature Photonics, 6(5):312– 315, 2012.
***
72
TR-1-1 : Quelles références pour quelles mesures en métrologie, vers la métrologie de la superrésolution
Animation : Damien Schapman, Aurélien Dauphin
Intervenants : Jean-Baptiste Sibarita et groupe de métrologie du RTmfm
La super-résolution contourne la limite de diffraction par différentes techniques qui brillent par le
concept autant que par le manque de méthode de mesure des améliorations qu'elle concède.
Cette table ronde, qui s'adresse aux spécialistes comme aux néophytes de la super-résolution et de la
métrologie abordera la résolution au travers de sa définition, de sa mesure, et de son amélioration
par les principales techniques de super-résolutions (STED, Palm, Storm, SIM, GSD...). Nous évaluerons
les éléments indispensables à ces techniques (objectifs, milieux de montage et d'immersion, scanner,
traitements d'image...) et leur adéquations avec les conditions d'étude biologique. Nous discuterons
des points de mesures et des références indispensables aux solutions de métrologie qui peuvent être
apportées.
Qu'est-ce que la résolution ?
Comment l'améliore-t-on avec le STED ?
Comment l'améliore-t-on avec le Palm ?
Solution apportées, quoi dans la valise de métro ?
***
MA-2-1 & TR : Aspect modélisation physique et bio et interface surface ; TR Création axe mécano
Bio au GDR"
Karine Anselme et René Marc Mége
Ce module avancé est combiné avec une table Ronde sur la création d’un axe mécano Bio dans le
GDR-MIV.
Une bonne compréhension des interactions entre les cellules et les biomatériaux est nécessaire pour
développer des implants ou des surfaces bioactives. La rigidité, la chimie et la topographie ont été
largement décrits comme des facteurs clés qui contrôlent le comportement des cellules sur les
matériaux. Nous avons récemment démontré que les cellules cancéreuses ont la capacité de
déformer leur noyau de façon considérable lorsqu’elles sont cultivées sur des surfaces polymères
présentant des piliers carrés de 7µm de côté et 6µm de profondeur [1] (Figure). Nous avons
démontré que ces déformations sont étroitement liées au type cellulaire et surtout à l’organisation
du cytosquelette [3]. De plus les acteurs moléculaires impliqués dans cette déformation ont été
étudiés et seront présentés. Ces fortes déformations des cellules et de leurs organites n'affectent ni
la viabilité ni la prolifération cellulaire ce qui permet d’établir une analogie avec le processus
métastatique. Ce modèle de déformation sur surfaces micro-structurées pourrait donc devenir un
outil d’étude pertinent de la plasticité nucléaire des cellules cancéreuses.
Cellule d’ostéosarcome SaOs-2 déformée sur une surface
avec micro-piliers. Bleu: ADN, Rouge: microfilaments
d’actine, vert: marquage de la protéine Sun1 du nucléosquelette.
[1] Davidson P. et al., Adv. Mater. (2009),21:3586-3590
[2] Badique F. et al., Biomaterials (2013), 34(12), 2991-3001
73
Mechanosensing of living cells: from single cell response to substrate rigidity to collective cell
migration
Formation of living organisms results from mechanical processes that first affect its basic
components, tissue cells. As opposed to passive materials, living cells actively respond to the
mechanical perturbations occurring in their environment. Cell adhesion and migration require the
ability of cells to generate active forces. We will first present physical concepts of single cell adhesion
and the unexpected cellular responses to mechanical cues such as stiffness sensing. We will present
how the development of microfabricated substrates of defined stiffness and topology as well as
microcaptor force arrays and cell confinement within patterned adhesive extracellular matrix has
allowed probing single cell response to mechanical cues. We will discuss how probing of single
molecule mechanical properties have allowed identifying molecular mechanosensors at work at cell
adhesion sites.
Besides the mode of single cell mechanosensing and migration, detailed knowledge obtained over
the past 30 years indicates that an additional mechanism is important for cell cohesion and migration
within tissues: the establishment of intercellular junctions and the cell to cell transmission of
mechanical forces. In particular we will focus on the movement of cell groups consisting of multiple
cells connected by cell–cell junctions. This collective cell behaviour plays a pivotal role in regulating
various processes such as gastrulation, morphogenesis and tissue organization. By combining
experimental approaches and numerical modelling, we can study how physical constraints modulate
collective behaviours of epithelial cell sheets. We will discuss how these approaches can be used to
probe the mechanical properties of epithelial tissues.
***
74
MA-2-2 : Descripteurs 3D avancés pour l'analyse de la morphologie cellulaire
Alexandre Dufour
La morphologie cellulaire et sa dynamique sont des témoins essentiels de l'état de la cellule et sont
impliqués dans de nombreux processus tels que la migration, la division, la différentiation ou encore
les interactions cellule-cellule et hôte-pathogène. Les mécanismes de déformation et de migration
cellulaire sont encore aujourd'hui peu établis (notamment dans leur environnement 3D natif) et
génèrent des besoins d'analyse quantitative robuste et systématique (notamment par le biais de la
bioimagerie) afin de déterminer les paramètres permettant de discriminer diverses conditions
expérimentales. Ce module donnera un aperçu des différents problèmes et outils liés à l'analyse
quantitative de la morphologie cellulaire en 3D, ainsi que leur exploitation dans un cadre
d'apprentissage par ordinateur. Dans ce module nous prendrons l'exemple concret de la migration
amiboïde, typiquement caractérisée par l'émission de protrusions globulaires à la surface de la
cellule et particulièrement impliquée dans différents processus biologiques tels que l'invasion
parasitaire, la réponse immunitaire et le développement métastatique.
Techniques abordées dans le module:
- Analyse de forme 3D
- Traitement de signal par harmoniques et ondelettes sphériques
- Classification supervisée et parcimonieuse
***
MA-3-1 : An integrative biology platform for the measurement and computational modeling of
multicellular dynamics from 3D+time in vivo imaging of animal early embryogenesis
René Doursat, Barbara Rizzi
The BioEmergences platform supports the automated analysis and reconstruction of collective cell
movements based on time-lapse microscopy of organism development [1-3]. It offers biologists
advanced software tools capable of handling large amounts of 4D data through a workflow of image
processing algorithms. Raw voxel-based movies of embryos (such as zebrafish or sea urchin),
engineered to highlight cell membranes and nuclei with fluorescent proteins, are filtered by an edgepreserving smoothing method, then cell positions are extracted from the local maxima of these
images and passed on to shape segmentation and cell-tracking modules. The output is a cell lineage
tree annotated with various quantitative measurements.
This data reconstruction stage can be followed by agent-based modeling and simulation with the
MecaGen platform [4]. Embryogenesis is viewed here as an emergent, self-organized phenomenon
based on the individual behavior of a large number of cells, via their genetically regulated, and
regulating, biomechanical behavior. Cells’ mechanical properties (such as division rate, adhesion
strength, or intrinsic motility) are closely correlated with their spatial location and temporal state of
genetic and molecular dynamics (such as internal protein and external ligand concentrations) and
affect each other concurrently. We apply MecaGen to the exploration of the different morphogenetic
episodes occuring through the first 10 hours of the zebrafish development: cell segmentation,
enveloping layer formation, epiboly, internalization and convergence-extension.
[1] Olivier, N., Luengo-Oroz, M. A., Duloquin, L., Faure, E., Savy, T., Veilleux, I., Solinas, X., Débarre, D., Bourgine, P., Santos,
A., Peyriéras, N. & Beaurepaire, E. (2010) Cell lineage reconstruction of early zebrafish embryos using label-free nonlinear
microscopy. Science 329: 967-971.
[2] Zanella, C., Campana, M., Rizzi, B., Melani, C., Sanguinetti, G., Bourgine, P., Mikula, K., Peyriéras, N. & Sarti, A. (2010)
Cells segmentation from 3-D confocal images of early zebrafish embryogenesis. IEEE Transactions on Image Processing
19(3): 770-781.
[3] Castro-González, C., Luengo-Oroz, M. A., Duloquin, L., Savy, T., Rizzi, B., Desnoulez, S., Doursat, R., Kergosien, Y. L.,
Ledesma-Carbayo, M. J., Bourgine, P., Peyriéras, N. & Santos, A. (2014) A digital framework to build, visualize and analyze a
75
gene expression atlas with cellular resolution in zebrafish early embryogenesis. PLoS Computational Biology 10(6):
e1003670.
[4] Delile, J., Doursat, R. & Peyriéras, N. (2013) Chapter 16: Computational modeling and simulation of animal early
embryogenesis with the MecaGen platform. In Computational Systems Biology, 2nd edition, A. Kriete & R. Eils, eds.: pp.
359-405. Academic Press, Elsevier, ISBN 978-0-124-05926-9.
***
TR-3-1 : stratégies de manipulation d’organismes modèles pour l’imagerie in vivo in toto multi
échelles et multimodale
Alex Mc Dougall, Willy Suppato, Nadine Peyriéras
L'imagerie in vivo voir in toto d'organismes modèles pose des problèmes spécifiques à chaque
espèce. Nous discuterons principalement la question de l'acquisition de données 3D+temps
d'organismes en développement, animaux ou végétaux.
- comment transposer sous un microscope optique les conditions de culture d'un organisme
- conditions de montage
- possibilités de marquages et d'introduction de biosenseurs
- modalités d'imagerie
- stockage et analyse des données
***
MA-5-1 : Exploring biomolecular dynamics with single-pair FRET
Jorg Langowski Biophysics of Macromolecules, German Cancer Research Center
The observation and characterization of single fluorescent molecules in confocal optics has become a
centrally important method in biophysics. This lecture will review the principles of single molecule
fluorescence observation, with special emphasis on Förster resonance energy transfer (FRET)
measurements on single fluorophore pairs. Examples of spFRET setups will be given and methods for
data analysis discussed. Finally, recent results from our own research on nucleosome dynamics will
be presented
***
TR-5-2 : Interaction moléculaire par microscopie
Marc Tramier, Simon Ameg Beeg
Depuis une vingtaine d’années la microscopie photonique permet suivre le devenir de protéines dans
une cellule par le biais des protéines fluorescentes mais aussi d’exploiter le transfert d’énergie de
fluorescence ou FRET pour mesurer les interactions moléculaires par des techniques de mesure
d’intensité ou de durée de vie de fluorescence (FLIM). Simultanément à ces techniques, les mesures
de diffusion sous microscope par corrélation (FCS) se sont développées et permettent également
d’évaluer les interactions moléculaires (FCCS). Les méthodes de corrélation d'images (ICS) sont aussi
capables d'étudier la co-diffusion des protéines. Ces outils se sont démocratisés et sont disponibles
76
maintenant sur les microscopes commerciaux. Au travers de cette table ronde, nous aborderons ces
méthodes et échangerons sur leur mise en œuvre, leurs avantages et leurs inconvénients.
***
MA-5-3: The analysis and simulation of spatial trajectories of intracellular and membrane proteins:
methodological aspects
C. Kervrann & H. Berry
This course, focused on the trajectories of proteins in the intracellular or membrane spaces, will
consist of two subtopics.
1. In the first part of the class, we will give an overview of the main difficulties encountered when
estimating the diffusion or directed transport of proteins from their trajectories in microscopy
images. We will present the commonly-used tracking methods that can generate sets of imperfect
trajectories. The central question we will address is related to the exploitation of MSD for diffusiontype motion classification. The trajectories are generally corrupted by different sources of errors and
we will discuss the limits of MSD and possible extensions.
2. Once the movement of the proteins has been correctly estimated and described, the major
question becomes: "what are the microscopic phenomena responsible for the observed type of
movement (diffusion, obstruction, trapping, caging, directed transport...)?". In the second part of the
class, we want to describe how to carry out Monte-Carlo simulations to investigate this question. We
will show how to simulate the main types of protein movements described in the literature:
Facilitated diffusion, Brownian motion, obstructed diffusion, Continuous-time random walks, or
fractional Brownian motion with their possible position-dependent variants and possible
subordinations. We will illustrate how those simulations can be used for estimating the parameters
describing the movement. Finally, if time allows, we will evoke recent results suggesting that in many
practical case, understanding the observed movement necessitates to use quantifiers beyond the
MSD.
***
MA-4-1 : Sondes et actuateurs encodés génétiquement : approche optogénétique intracellulaire et
biosenseurs FRET
Mathieu Coppey et Martial Balland
La plupart des processus cellulaires impliquent de nombreux acteurs moléculaires dont la
coordination aux multiples échelles reste encore à élucider. L’imagerie passive n’est souvent pas
suffisante pour discerner l’origine des phénomènes biologiques et il est nécessaire de pouvoir
perturber les systèmes biologiques avec un contrôle suffisant de la perturbation pour rester dans des
conditions physiologiques. Parmi les techniques émergentes allant dans cette direction,
l’optogénétique est particulièrement prometteuse. Initialement réservée à la neurobiologie, le terme
a été récemment étendu à la biologie cellulaire. Le principe est d’utiliser des constructions
moléculaires encodées génétiquement qui vont être sensible à la lumière, à l’instar de la GFP, mais
qui vont être capable d’actionner un processus. Au cours de ce module avancé, nous discuterons :
1. les différents systèmes moléculaires optogénétique et leurs limites intrinsèques (résolution
spatiale et temporelle, niveau basal à l’état « noir », réversibilité, limite système biologique, etc.)
2. les modalités de microscopie permettant de faire de l’optogénétique (DMD, FRAP,…)
3. les applications possibles (telles que la localisation subcellulaire de protéine, l’activation de voie de
signalisation intracellulaire, la séquestration de protéine dans un compartiment cellulaire, ou encore
la formation de cluster)
4. le couplage actuation/observation à l’aide des sondes encodées génétiquement (FRET,
biosenseurs, bande limité du spectre, etc.)
77
***
MA-4-2 Outils Chimiques pour la photorégulation d’activités biologiques
Alexandre SPECHT
La lumière est un excellent stimulus qui permet d’obtenir un contrôle précis, dans le temps et dans
l’espace, d’un phénomène biologique (Phototriggers). Deux approches chimiques sont utilisées afin
de photo-réguler une activité biologique.
- Soit par l’utilisation d’une réaction de photo-isomérisation permettant par exemple, de photoréguler une interaction ligand-récepteur (concept d’optogénétique chimique).
- Soit par l’utilisation d’une réaction photolytique (concept des ligands « cagées »).
Dans ce cas, des analogues de biomolécules, dont la fonctionnalité et l’activité ont été masquées par
un groupement photolabile, sont utilisés. Ils rendent possible la libération rapide d’un ligand
biologique sous l’action de la lumière, ce qui permet un contrôle spatio-temporel de la réponse
biologique induites.
Lors de cet exposé dans un premier temps, les structures, les synthèses et les propriétés
photochimiques (mécanisme, cinétique, sensibilité à l’excitation mono et bi-photonique...)
respectivement des groupements photolabiles et photoisomérisables utilisés dans ces deux
approches seront présentés. Puis différents exemples d’applications, principalement dans le domaine
des neurosciences, seront exposés.
***
MA-6-1 : Mesures quantitatives avec optique adaptative
Antoine Delon
Les applications de l'optique adaptative et de la manipulation du front d'onde sont surtout connues
en microscopie à travers l'imagerie (e.g. non linéaire et super-résolution/localisation) et les pinces
optiques holographiques. Il existe cependant un autre domaine d'applications qui est celui de la
microscopie à fluctuations de fluorescence. Il s'agit là de tout un ensemble de méthodes d'acquisition
et d'analyse, le plus souvent associées à une imagerie confocale, qui visent à mesurer des
concentrations et des mobilités absolues de molécules. D'une part ces méthodes sont limitées en
terme de vitesse d'acquisition et d'autre part elles sont très sensibles / fragiles vis à vis des
ajustements optiques, des aberrations, voire de la diffusion de la lumière. Nous montrerons :
i) comment la manipulation de front d'onde permet (et dans quelles limites) de multiplexer les
acquisitions
ii) l'impact des aberrations d'origines divers sur les mesures quantitatives de concentration et de
mobilité, ainsi que les moyens d'y remédier
iii) enfin, la question de la diffusion de la lumière sera aussi abordée. Nous discuterons aussi des
composants optiques utilisés pour contrôler le front d'onde qui sont en général, soit des miroirs
déformables, soit des modulateurs spatiaux de lumière. Nous présenterons leurs caractéristiques,
ainsi que les avantages/inconvénients, en fonction des applications.
***
MA-6-2 : Imagerie du Petit Animal : de l’imagerie multi échelle aux mesures multiparamétriques ;
quels outils aujourd’hui ?
Corinne LAPLACE-BUILHE, Stéphanie LERONDEL et Valérie ROUFFIAC
Objectifs pédagogiques : Appréhender dans son ensemble l’approche imagerie petit animal et
orienter les choix technologiques en relation avec le questionnement biologique.
78
Description : Les ressources de l’imagerie in vivo chez la souris sont de plus en plus sollicitées pour la
compréhension des mécanismes physiologiques et pathologiques ainsi que pour l’évaluation de
l’activité de nouvelles molécules thérapeutiques. Toutes les modalités d’imagerie médicale sont
aujourd’hui accessibles à l’exploration de modèles murins. Il s’agit principalement de l’IRM (Imagerie
par Résonance Magnétique), la Tomoscintigraphie (TEMP), la Tomographie d’Emission de Positons
(TEP), l’échographie ou encore la Tomodensitométrie X (TDM X ou scanner X). Les modalités en
imagerie optique plus spécifiques à la recherche, ont également considérablement évolué ces
dernières années avec notamment la tomographie optique corps entier (bioluminescence,
fluorescence), l’imagerie non linéaire des organes in vivo à haute résolution et l’utilisation des «
chambres optiques », ou encore la photoacoustique pour n’en citer que quelques-unes. La
disponibilité d’équipements qui permettent d’étudier le rongeur avec des performances en termes
de sensibilité/spécificité équivalentes aux appareils cliniques a largement contribué à l’émergence du
concept de "recherche translationnelle". Celui-ci vise à accélérer les phases de recherche
précliniques en mettant en œuvre l’imagerie dans des modèles pathologiques murins avec les
mêmes modalités et la même démarche que pour le suivi des patients atteints de la maladie
correspondante.
Par son caractère totalement indolore et minimalement invasif, l’imagerie in vivo constitue une
avancée reconnue pour l’éthique dans l’expérimentation animale. Elle permet en effet un suivi
individuel et longitudinal des animaux, et la précision des modalités d’imagerie quantitative conduit à
une réduction très significative du nombre des animaux devant être inclus dans les études.
Ce module articulé en 2 parties proposera dans un premier temps un état de l’art approfondi des
solutions techniques existantes en imagerie corps entier et en imagerie non linéaire haute résolution
par utilisation des chambres optiques. Cette présentation sera suivie de plusieurs tables rondes
axées sur les thèmes suivants :
- Le positionnement des principales modalités d’imagerie du petit animal en fonction du
questionnement biologique,
- L’environnement spécifique nécessaire à l’imagerie in vivo : contraintes d’exploitation
(environnement de travail en fonction des différentes modalités (radioprotection), réglementation
éthique, etc…),
- Les limites de la quantification, et de la sensibilité,
- La reproductibilité in vivo, et la gestion du nombre d’animaux,
- Les spécificités de l’imagerie photonique haute résolution, in vivo,
- Le rapprochement des données multimodalités.
***
MA-7-1 Microscopie corrélative: de l’optique à l’électronique (Correlative light to electron
microscopy)
Yohanns Bellaïche et Xavier Heiligenstein
La microscopie corrélative est un concept ancien, mais ses applications sont encore récentes et il est
préférable d’utiliser cette approche pour apporter une conclusion à un projet plutôt que pour
l’initier.
Dans ce module avancé sur la CLEM, nous aborderons rapidement les principes de la microscopie
corrélative et ferons un état des lieux des solutions proposées aujourd’hui selon les niveaux de CLEM
requis.
Nous présenterons les techniques les plus abouties à ce jour et les contraintes expérimentales
qu’elles imposent, puis nous présenterons l’approche que nous avons sélectionnée pour étudier la
relation entre polarité apical-basale et division cellulaire dans l’épithélium de drosophile.
Les cellules épithéliales présentent la particularité d’être polarisées selon l’axe apico-basal. Cette
polarité est essentielle à leur fonction et à l’intégrité du tissu épithélial. Il est donc important de
79
comprendre comment elle est maintenue lors des nombreuses divisions cellulaires dans les
épithéliums en développement. S’appuyant sur nos travaux récents sur l’orientation du fuseau
mitotique et de formation des jonctions adhérentes dans l’épithélium de Drosophile (Herszterg et al.,
Dev Cell ; Bardert et al., Dev Cell ; Bosveld et al ;, Science et Bosveld et al, non publié), nous utilisons
la CLEM (collaboration avec G. Raposo, X, Heiligenstein et F. Marsens) pour mieux comprendre
comment les jonctions cellulaires sont organisées et modifiées au cours des divisions. L’ensemble de
ces travaux devrait apporter une vision nouvelle sur les mécanismes de division cellulaire au sein des
tissus.
Enfin nous terminerons sur les problématiques et difficultés que nous anticipons pour ce projet pour
amorcer les discussions et la table ronde.
***
TR-T-1 Big data en imagerie : état des lieux des softs de gestion du cycle de vie des images et des
bases de données images ouvertes disponibles
Animation : Perrine Paul-Gilloteaux
Intervenants : Nadine Peyrieras, Perrine Paul-Gilloteaux, Fabrice de Chaumont, Charles Kervrann,
Jean-Baptiste Sibarita, Victor Racine, Julio Mateos Langerak, Cédric Matthews
La biologie profite aujourd'hui des avancées en résolution spatiales, temporelles et fonctionnelles de
la microscopie mais est confrontée par conséquence à la production de données massives. La gestion
du stockage des images, de leurs traitements, de leur analyse et de leur intégration avec d’autres
types de données sont des questions auxquelles les plateformes doivent répondre.
Dans cette table ronde, nous chercherons tout d'abord à définir les attentes des différents acteurs
dans ce domaine, à la fois du point de vue gestion par les plateformes ou les services informatiques,
ou pour le partage de données publiques à des fins d'enseignement ou de réutilisation des données
pour la recherche. La table ronde se déroulera en deux temps:
- dans un premier temps de courtes présentations permettront aux différents intervenants de
donner un retour d'expérience et de parcourir les éléments constituants d'une solution de gestion de
données images et les solutions technologiques aussi bien logicielles que hardware.
- Le deuxième temps doit permettre d'échanger et de confronter les points de vue sur les besoins, les
difficultés et la mutualisation de ce type d'infrastructure, et l'adéquation des bases ouvertes (ex. the
Cell) aux besoins des différents acteurs. Des questions telles que la gestion de la sécurité, de la
propriété, de l'exploitation des données et de leur intégration multimodale seront discutées.
***
TR-T-2 : Besoins et réalisations autour d’un Arduino dans les plateformes d’imagerie
Animation : Christian Rouvière, Jérome Mutterer.
Le groupe “Arduino / prototypage autour de la microscopie” du RTMFM propose cette table ronde,
ouverte à toute personne intéressée par la possibilité de développer de petits périphériques utiles
dans l’environnement de travail du microscopiste. Les responsables et les utilisateurs des
plateformes de microscopie ont parfois des besoins simples pour contrôler ou mesurer
l’environnement proche du microscope (température, manipulation d’un obturateur, d’un
interrupteur qui déclenchera une injection, un flash etc.). De plus en plus de solutions techniques
abordables en termes de coût et de complexité sont disponibles et permettent d’envisager des
réalisations originales. La carte à micro-contrôleur Arduino est un exemple bon marché de matériel
libre (open source hardware) pour lequel une très grande quantité de documentation est disponible
et qui peut être interfacé facilement avec les différents éléments d’une station de microscopie via un
port série, une commande TTL ou la lecture d’un signal analogique. Au programme de cette table
ronde: présentation du groupe de travail du RT et de ses réalisations et projets en cours; discussion
80
autour d’idées de développement apportées par le groupe ou les participants; description des
matériels et logiciels pouvant être mis en œuvre pour réaliser nos objectifs; questions-réponses.
Cette table ronde est complémentaire aux ateliers proposés lors de cette session de MiFoBio.
***
TR-T-3 : Plateforme, mutualisation d'instruments scientifiques : création et développement d'un
service
Animation : Cédric Matthews
La mutualisation d'un ensemble d'instruments scientifiques au sein d'un service commun requiert de
connaitre les méthodes adéquates de suivi de performance et de structuration de l'environnement
de conception et d'exploitation. Le but de cette table ronde est de faire un état des lieux et un
partage des méthodes et des outils actuellement disponibles. Les points suivants seront abordés en
prenant comme fil conducteur l’apparition d’un besoin technologique au sein d’un institut de
recherche.
- Mettre en place une structure d'accueil pour la mutualisation d'un équipement (réservation,
évaluation du coût et facturation, lien avec les fournisseurs)
- Décrire les marchés publics
- Acheter un équipement : évaluer le besoin, l'exprimer dans le cadre d'un cahier des charges
techniques et structurer le choix
-Développer un instrument
- Evaluer l'équipement dans le cadre de la mise en place d'une démarche qualité tout au long de son
exploitation : méthodes statistiques, contrôle métrologie pour le suivi de performance et traçabilité
pour la mutualisation
- Mettre en place un diagramme de Gant pour la planification temporelle du service
- Utiliser des outils de type mind mapping pour la cartographie du suivi de qualité
- Garantir la satisfaction des utilisateurs, s'adapter au besoin.
Cette table ronde sera aussi le point de départ de la mise en place d’un groupe de réflexion qui
pourrait rédiger un document prospectif sur l’évolution des plateformes à l’horizon 2020.
***
TR-T-4 culture cellulaire : Préparations de cellules, supports et chambres d’incubations pour
l’imagerie en temps réel
Animation : Frédérique Gaits-Iacovoni et Loïc Dupré
Intervenants : Béatrice Carrié pour la Société Biovalley, Tina Freisinger pour Ibidi et un représentant
de CherryBiotech (10 diapositives maximum pour présenter leurs systèmes)
Les points suivants seront abordés :
- Comment obtenir des cellules (primaires ou lignées) en parfait état pour la vidéo microscopie ?
Choix du milieu de culture et d’observation (différents milieux sans rouge phénol), choix de la
méthode de décollement cellulaire (accutase = mélange de collagénases de chez PAA ; chélation du
calcium par EDTA)
- Chambres d’incubation de dernière génération : stabilité = fiabilité et reproductibilité de vos
observations : intérêt des petites chambres d’incubation versus encagement total du système
(chambres IBIDI) et micro-chambres pour changement de la température en quelques secondes
(système CherryTemp)
81
- Les différents supports de culture pour l’imagerie en temps réel : le compromis est la clé de la
réussite : intégration entre différents systèmes (aspects du repérage sur lamelle entre échantillons
vivants pour l’imagerie en temps réel, puis fixation pour passer à la super-résolution sur la même
zone), intérêt des lamelles calibrées (épaisseur, tatouage)
***
TR-T-5 HCS/HCA : High Content Screening and Analysis : Intérêts pour les nouvelles technologies de
microscopie optique
Animation : Anne Beghin
Le HCS/HCA est une méthode basée sur l’imagerie cellulaire pour le criblage de librairies de
molécules (chimiques, siRNA, shRNA,...).
La table ronde se décomposera en 3 parties :
1/ Définitions et description de la miniaturisation des tests cellulaires en plaques multipuits en vue
d’un criblage, tour d'horizon des équipements disponibles.
2/ Description de l’analyse automatique d’images et du traitement des données obtenues. Tour
d'horizon des logiciels disponibles (open-sources et propriétaires).
3/ Intérêt pour les nouvelles technologies de microscopie. Exemple du spot PALM
***
MA-T-1 : Traitement du signal optique robuste et interdisciplinarité en biophysique, biologie ou
biomédecine
Jean-Claude André
L’interdisciplinarité est un processus dans lequel on développe une capacité d’analyse et de synthèse
à partir des perspectives de plusieurs disciplines pour traiter une problématique dans son ensemble
avec de nombreuses questions : Les recherches communes doivent faire l’objet de quelles réponses
et sous quelles formes ? Quelles légitimités auront les connaissances produites ? Quel doit être le
rôle de chaque discipline ? Comment chaque chercheur va acquérir/s’enrichir de la culture des
autres? Etc. Les questions sont donc légion… dans une grande diversité des pratiques
interdisciplinaires. L’objet est de définir le contexte des connaissances «appropriées» s’adaptant
«bien» à une situation dans un environnement donné, en examinant comment, en créant des îlots de
rationalité, il est possible d’aller «plus loin» avec des savoirs plutôt disjoints. Les informations sont
des données, des interprétations, des remises en causes, vues comme une connaissance émergeant
des interactions cognitives d’un groupe.
Nous traiterons ce sujet par la résolution d’un problème concret : interactions entre deux molécules,
par des méthodes photo-physiques résolues dans le temps. Le fil conducteur expérimental se veut
marqué par le «bon» dosage issu des négociations entre partenaires scientifiques, il replace les
outils/instruments utilisant la lumière au cœur de la recherche pour en évaluer la pertinence. Dans
ce cadre, les instruments optiques doivent :
• S’appuyer sur une représentation de l’approche scientifique de l’applicateur (principe de
démonstration) ;
• Permettre d’analyser les conséquences des décisions et d’autoriser des apprentissages
partagés ;
• Permettre d’identifier les propriétés émergentes des systèmes complexes afin de proposer
des modes de gestion optimaux du projet scientifique.
Les instruments et les méthodes associées sont donc des «outils de négociation» entre les différents
partenaires parce qu’apportant des éléments de robustesse à la confrontation des points de vue.
82
Une quantité suffisante de données, résultant d’une approche expérimentale précise, permet, en
principe, de bâtir des modèles fiables pour autant que chacune des disciplines se pose les bonnes
questions sans faire trop confiance aux autres. La connaissance des modèles physiques déjà publiés
est également une condition indispensable à une approche scientifique crédible.
Le programme provisoire est défini ci-après :
• Durée : 2 heures (comprenant une présentation permettant d’entamer une large
discussion)
• Instrumentation optique/photo-physique pour la recherche : rappel de bases, intérêts et
limites.
• Formes classiques de traitement de l’information et exemples réels : couplage transportréactivité (diffusion couplée à des transferts d’énergie à longue distance avec des potentialités
d’application en photothérapie dynamique pour le traitement de cancers).
• Comment échanger entre physique, chimie, biologie, sciences de l’ingénieur ?
• Quelle confiance peut-on avoir dans les résultats ? Dans leur robustesse ? Dans leur
perception ? Dans les recherches nouvelles à mener ?
• Y-a-t-il une boîte à outils à proposer ou de simples recommandations ?
• Possibilités de généralisation et conclusions.
83

Fiches descriptives des Prémodules-Ateliers-Modules - gdr-Miv

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