Modification des protéines de structure d`ADN de levure_De

Modification des protéines de structure d’ADN de levure
Rédigé par Glenn DE LANGE
Collège Calvin
Tuteur : Benjamin ALBERT, postdoc
Directeur du laboratoire : David SHORE
Université de Genève, Sciences III
Résumé :
On cherche à étudier une façon plus avantageuse de dégrader des nucléosomes.
On commence par vérifier si le tag est présent dans nos plasmides, on continue
ensuite en reproduisant notre séquence tag exponentiellement, on l’intègre aux
levures, on ajoute des enzymes qui vont faire dégrader les nucléosomes, et on
regarde l’évolution de la quantité d’histones en fonction du temps.
Introduction :
L’ADN est l’endroit où tout le matériel génétique de l’individu est stocké. Il se situe
dans le noyau des cellules et a une structure assez particulière. En effet, il est
composé de deux brins complémentaires en double hélice. Ce long filament va
ensuite s’enrouler autour de structures nommées nucléosomes, qui vont rendre
l’ADN plus stable. Ces structures sont elles-mêmes composées de plusieurs
protéines nommées histones, au nombre de 8. Il y a 4 histones différents, et donc 4
paires de protéines : H2A, H2B, H3 et H4. Ce projet va étudier la vitesse de
dégradation de ces histones. En effet, il est possible de dégrader les histones dans
les nucléosomes en rajoutant un élément particulier à leur séquence. Cet élément
est reconnu par une enzyme qui dégrade l’histone en question ce qui cause la
déstabilisation des nucléosomes affectés. Cette déstabilisation des nucléosomes
prend en moyenne 6 heures et nous cherchons à voir s’il existe une manière plus
rapide.
Matériel et méthodes :
1) Vérification de la présence du tag
Nous allons analyser pour commencer si les plasmides que nous avons
commandé possèdent le tag (séquence d’ADN cible) nommé AID.
 Un programme sur l’ordinateur nous indique quelles enzymes utiliser
pour couper stratégiquement notre plasmide. Nous notons la longueur
en paire de bases de notre séquence cible, et nous vérifions que les
enzymes ne vont pas couper un autre bout de la même taille.
 On prépare nos solutions : un premier tube avec 3 µl de plasmide, 2 µl
de tampon (qui va régler le pH dans la solution afin d’accélérer le
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processus de découpage), 1 µl d’enzymes nécessaires, et 14 µl d’eau.
Un deuxième tube servira de contrôle positif, pour voir quand arrêter la
réaction.
On les met à 37°, température optimale pour l’action des enzymes.
On fait ensuite une électrophorèse, c’est-à-dire un processus qui va
faire migrer dans un gel les différentes séquences en fonction de leur
taille. On ajoute 5 µl de tampon de charge dans les deux tubes afin de
pouvoir suivre leur migration (tampon coloré). On place ensuite 10 µl
de chaque solution dans deux puits du gel. On remplit aussi un puit
avec une échelle moléculaire, qui va nous permettre de savoir jusqu’à
où migrent les différentes tailles d’ADN (les plus petits ADN migrent
plus loin que les ADN les plus grands). On attend ensuite une heure,
pour laisser migrer les bouts d’ADN.
On compare ensuite nos valeurs expérimentales et théoriques, et si
nous obtenons une grosse partie d’éléments dans la région de
migration des séquences de la bonne taille, on sait que le plasmide
contient le tag AID.
2) Obtention du tag AID en masse
Pour pouvoir intégrer plus tard nos séquences à des génomes de levures
vivantes, il nous faut beaucoup de tags. C’est pourquoi nous allons effectuer
une PCR (Polymerase Chain Reaction), méthode qui va servir à recopier
exponentiellement une séquence d’ADN.
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La méthode pour effectuer une PCR est un peu plus compliquée. Il faut tout
d’abord préparer le mélange suivant : 302µl d’eau, 80µl de tampon, 8µl de
dNTP (mélange comportant les bases nécessaires pour la transcription), 2µl
de chaque oligo (les oligos vont changer car on va faire plusieurs essais avec
différents oligos, pour essayer d’insérer le tag sur différents histones), 2µl du
plasmide contenant le tag AID, et 4µl d’enzyme (polymérases qui vont
synthétiser les brins). On va soumettre ce mélange à des chocs thermiques
dans un cycleur thermique avec le cycle suivant: un pré-cycle de 30’’ à 98° où
aura lieu une grosse dénaturation des brins d’ADN, ensuite une première
étape de dénaturation (10’’ à 98°), une étape d’hybridation (adhésion des
oligos aux parties correspondantes, 30’’ à 52°), puis une étape d’élongation
(les polymérases vont synthétiser les brins, 60’’ à 72°). Ces trois étapes vont
être répétées 10 fois. Il nous suffit maintenant de suivre le protocole suivant,
fourni avec du matériel commandé, pour purifier notre produit :
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3) Intégration des tags dans les levures
Nous voulons être certains de choisir une histone qui, lorsqu’on lui rajoute le
tag AID, arrive encore à fonctionner correctement. Nous avons pour cela
changé les oligos afin de pouvoir intégrer le tag sur les histones H3 et H4.
L’intégration est un processus très simple: on met des levures dans un milieu
qui va affaiblir leur membrane cellulaire et elles vont intégrer les séquences
présentes dans le milieu, c’est-à-dire absorber l’ADN pour ensuite exprimer le
ou les gênes qu’il contient. Nous avons fait le test de croissance suivant :
Nous voyons que lorsqu’on ajoute le tag sur la protéine H3, la croissance est
fortement réduite comparé à une souche sauvage. Nous allons donc intégrer
en masse des tags AID sur les histones H4 dans des cellules de levure.
4) Étude de la dégradation des histones
On prélève un échantillon du milieu contenant les levures taguées à t = 0
minutes. On rajoute ensuite de l’Auxine, une enzyme qui va détecter le tag
AID et va dégrader la molécule attachée, donc l’histone H3. On prélève des
échantillons à t = 15 minutes, t = 30 minutes et t = 45 minutes. On va ensuite
casser les cellules: on place des petites billes dans les échantillons et on fait
agiter vigoureusement. Toutes les membranes sont cassées, il ne reste plus
qu’un amas de molécules. On procède ensuite à une purification du produit
en suivant un protocole de laboratoire, pour n’obtenir que des protéines. On
va ensuite effectuer un western blot, un processus qui va faire migrer les
protéines sur un gel. On ajoute des anticorps primaires qui reconnaissent les
protéines d’intérêt et des anticorps secondaires qui vont se lier aux anticorps
primaires afin de les rendre luminescents. On ajoute du tampon de charge
aux échantillons, et on laisse migrer les protéines quelques heures.
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Résultats :
Après exposition dans un détecteur de lumière, les protéines luminescentes
vont apparaître. Plus la tâche est grosse, plus il y a de protéines.
Discussion :
Sur la photo des résultats que nous avons obtenu à l’analyse de la quantité
d’histones H4-AID présentes en fonction du temps dans les levures, on voit
clairement une diminution entre t = 0 minutes et t = 45minutes. Il faudrait
refaire l’expérience et noter un plus grand nombre d’intervalles de temps pour
voir où se produit la plus grosse chute de quantité d’histones et analyser
ensuite le comportement des levures à ce moment précis. Nos études ont
donc bien montré que la technique qui consiste à ajouter le tag AID a marché
pour la dégradation des histones et nous voyons aussi que la quantité de
protéines a presque diminué de moitié en 45 minutes (il faudrait quantifier les
données pour plus de précision), mais nous voyons que le rythme est bien
plus élevé que les 6 heures de décomposition qu’on obtenait avant.
Références :
Je n’ai pas employé de livres durant mon projet, toutes les connaissances
m’ont été transmises par mon tuteur ou par le cursus scolaire du collège
Calvin.
Remerciements :
Je tiens à remercier Benjamin Albert et Luca Cerato qui m’ont suivi et soutenu
tout au long de la semaine ainsi que les autres membres du laboratoire de
biologie moléculaire qui m’ont aidé et expliqué leur travail. Je tiens à remercier
la fondation SJF et l’UNIGE d’avoir rendu possible cette semaine. Je tiens
aussi à remercier le collège Calvin qui m’a autorisé à participer à ce camp de
biologie très intéressant et instructif.
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