ELISA PeliClass human IgG subclass kit REF M1551

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M1551/ November 2007
ELISA
PeliClass human IgG subclass kit
−
REF
M1551
Kit ELISA pour la détermination quantitative des sous-classes d'IgG humaine dans le sérum (fr)
fr
Ab
Anticorps contre
fr
DIL
Dilution
fr
RED
Rouge
fr
WASH
Lavage
BLACK
Noir
GREEN
Vert
BUF
HRP
HUM
Humain
HRP
SEALS
Scellés pour plaque
STOCK
Solution mère
WELL
STOP
Arrêt
Jaune
1
1
2
2
1
1
1
1
1
1
1
6
12x8
12x8
0.1 mL
0.1 mL
0.1 mL
50 mL
60 mL
5 mL
1.0 mL
0.5 mL
20 mL
CONJ
Conjugué
CONTROL
Contrôle
H2O2
Peroxyde d'hydrogène
MOU
Souris
SUB
Sous-classes
SUBS
Substrat
≥-≤
Limite de confiance
YELLOW
Puits
REF
M1800
M1801
M1802
M1803
M1804
M1805
M1806
M1808
M1810
M1809
M1807
-
CAL
Calibrateur
Tampon
ELISA
PeliClass ELISA kit
WELL
a-IgG1, a-IgG2
RED
BLACK
WELL
a-IgG3, a-IgG4 YELLOW GREEN
CAL
CONTROL
HRP
MOU Ab HUM IgG CONJ
BUF
WASH STOCK 1:20
BUF
DIL
STOCK 1:10
BUF
SUBS STOCK 1:10
ABTS STOCK 1:50
H2O2
STOCK 1:100
BUF
STOP
SEALS
1
fr
I.
INTRODUCTION
Les IgG humaines comprennent quatre sous-classes : IgG1, IgG2, IgG3 et IgG4. La littérature a largement décrit les caractéristiques
biochimiques de ces sous-classes d'IgG (1-5). Les différences se reflètent dans plusieurs fonctions biologiquement importantes telles que
la reconnaissance antigénique, l'activation du complément et la fixation sur les récepteurs présents à la surface des cellules. De
nombreuses études ont révélé que des anomalies des taux sériques des sous-classes d'IgG peuvent être associées à diverses situations
de maladie. En particulier, l’association d’une carence sélective de sous-classe IgG2 à une susceptibilité accrue aux infections virales ou
bactériennes (4,5) a amplement été documentée. Des taux sériques faibles d'IgG2 ou d'IgG3 ont été constatés chez des patients
souffrant d'infections récurrentes des tractus respiratoires inférieur et supérieur. Chez d'autres patients, une relation a été établie entre
des concentrations sériques d'IgG4 très faibles et des infections récurrentes sinopulmonaires (6). Des anomalies des taux sériques de
sous-classes d'IgG ont également été observées au cours de maladies auto-immunes, de troubles neurologiques et d'infections par le VIH
(4).
II.
PRINCIPE DU PROCÉDÉ
Le kit ELISA PeliClass de détermination des sous-classes d’IgG humaine est un immuno-essai enzymatique de type « sandwich ». Le kit
contient des barrettes de micropuits revêtue d’anticorps monoclonaux de haute avidité; chaque barrette est dirigée spécifiquement
contre l’une des sous-classes d’IgG humaine. Les échantillons d’essai et les sérums de calibrateur et de contrôle sont incubés dans les
puits respectifs. La sous-classe d’IgG à déterminer se fixe à la phase solide et l’IgG non-fixée est éliminée par lavage. L’antisérum antiIgG humaine conjugué à la peroxydase est ensuite ajouté à chaque puits et le conjugué non fixé est éliminé par lavage. Après incubation
avec une solution de substrat (ABTS) et de peroxyde d’hydrogène, la réaction est arrêtée à l’aide d’un tampon acide. La densité optique
du produit de réaction de couleur verte est mesurée et la concentration de la sous-classe d’IgG de l’échantillon d’essai est calculée par
comparaison aux valeurs obtenues avec une courbe de calibrage.
Le dosage du sérum de contrôle des sous-classes d’IgG est effectué afin de déterminer la validité des courbes de calibrage et la précision
des déterminations de sous-classes d'IgG.
Les taux de sous-classes d'IgG du (des) sérum(s) calibrateur ont été déterminés au moyen d'un calibrateur dérivé de la préparation de
référence 67/97 de l’OMS. Les valeurs cibles recommandées ont été utilisées, c’est-à-dire 5,0 g/L pour l'IgG1, 2,6 g/L pour l'IgG2, 0,4
g/L pour l'IgG3 et 0,5 g/L pour l'IgG4 (7).
III.
CONSERVATION ET STABILITÉ
Le kit ELISA PeliClass de détermination des sous-classes d’IgG humaine doit être conservé debout, à 2-8 °C. Il peut être utilisée jusqu’à
la date de péremption indiquée sur l’étiquette.
La stabilité après ouverture est d’une semaine pour tous les composants, lorsqu’ils sont conservés à 2-8 °C.
Les conditions de transport peuvent diverger des conditions de conservation.
IV.
CONTENU DU KIT
Voir le tableau au début de cette notice.
Le kit ELISA PeliClass de détermination des sous-classes d'IgG humaine contient suffisamment de réactifs pour effectuer 48 dosages de
chaque sous-classe, y compris sérums calibrateur, contrôles positifs et blanc.
Les anticorps monoclonaux ont été purifiés, à partir de milieu de culture tissulaire, par chromatographie sur colonnes (chromatographie
par échange d’ions et chromatographie d’affinité). Les sérums de calibrateur et de contrôle sont des sérums humains liquides.
V.
−
−
−
−
−
−
MATÉRIEL SUPPLÉMENTAIRE REQUIS
Eau distillée pour la dilution des tampons de lavage, de dilution et de substrat.
Dispositif pour pipetter fournissant des volumes précis.
Incubateur (37 ± 2 °C).
Laveur ELISA ou pissette en plastique de 500 mL pour le lavage automatique ou manuel des barrettes de micropuits.
Lecteur ELISA standard pour la mesure de la densité optique à 414 ou à 405 nm.
Papier semi-log.
VI.
TRAITEMENT DES ÉCHANTILLONS DU TEST
Ce test est uniquement destiné à l’analyse d’échantillons sériques. Les échantillons doivent être aussi frais que possible ou avoir été
conservés congelés.
Les échantillons doivent être dilués manuellement avant d'être utilisés (voir VII MÉTHODE D’ANALYSE).
VII.
MÉTHODE D’ANALYSE
−
Laisser tous les réactifs atteindre la température ambiante (18-25 ºC) et bien les homogénéiser. Éviter la formation de bulles ou de
mousse.
−
Il est recommandé d’effectuer le dosage de tous les échantillons et des sérums de calibrateur et de contrôle en double.
1. MICROPLAQUE
Le kit ELISA PeliClass de détermination des sous-classes d’IgG offre la flexibilité de pouvoir utiliser des parties de plaque à des moments
différents.
Avant d’ouvrir la pochette en plastique, déterminer le nombre de barrettes nécessaires pour effectuer le dosage du nombre désiré
d’échantillons et y ajouter 14 puits pour les calibrateurs et les contrôles positifs et blanc en double. Retirer les barrettes qui ne seront
pas utilisées du châssis de la microplaque et les réemballer dans la pochette en plastique contenant le dessiccant et conserver à 2-8 °C.
2. PRÉPARATION DES TAMPONS
Tampon de lavage: Préparer le tampon de lavage en ajoutant le contenu entier de la bouteille de concentré de tampon de lavage à 950
mL d’eau distillée. Le tampon de lavage dilué doit être conservé à 2-8 °C et reste stable pendant 1 semaine.
Remarque: Le tampon concentré peut contenir des cristaux de sel. Avant de préparer le tampon de travail, chauffer la solution
concentrée BRIÈVEMENT à 37 °C afin de dissoudre les cristaux.
Tampon de dilution : Calculer la quantité de tampon de dilution nécessaire (environ 2 mL de tampon non dilué par barrette de puits) et
préparer la solution de travail en diluant 10 fois le tampon dans de l’eau distillée.
2
3. PRÉPARATION DES SERUMS DE CALIBRATEUR ET DE CONTRÔLE
Pour les concentrations, voir les tableaux 2 et 3 de la notice incluse dans le kit.
Calibrateur: (Voir le tableau 1 de la notice incluse dans le kit) Étiqueter un tube de 10 mL avec « 1:500 » et huit tubes de 3 mL avec
respectivement « Cal1 » à « Cal8 ».
À l’aide d’une pipette, transférer 4,99 mL de tampon de dilution dans le tube de 10 mL et y ajouter 10 µL de calibrateur (dilution initiale
1:500). À l’aide d’une pipette, transférer 1,9 mL de tampon de dilution dans le tube étiqueté « Cal1» et 1,0 mL dans les tubes étiquetés «
Cal2 » à « Cal8 ».
À l’aide d’une pipette, transférer 100 µL de calibrateur dilué 1:500 dans le tube « Cal1 » et effectuer à partir de ce tube sept dilutions en
série de facteur 2 en ajoutant 1,0 mL de la dilution précédente dans le tube « Cal » suivant. Sélectionner pour chaque sous-classe d’IgG
la série appropriée de dilutions du calibrateur: IgG1 1:80 000 -1:1 280 000 ; IgG2, IgG3 et IgG4 1:10 000 -1:160 000.
Contrôle : Étiqueter un tube avec « 1:500 » et deux tubes de 3 mL avec respectivement « 1:30 000 » (pour IgG2, 3, 4) et « 1:240 000
» (pour IgG1).
À l’aide d’une pipette, transférer dans le tube étiqueté 1:500 : 4,99 mL de tampon de dilution et 10 µL de sérum d’étalonnage.
À l’aide d’une pipette, transférer dans le tube étiqueté 1:30 000 : 885 µL de tampon de dilution et 15 µL de dilution 1:500.
À l’aide d’une pipette, transférer dans le tube étiqueté 1:240 000 : 875 µL de tampon de dilution et 125 µL de dilution 1:30 000.
Préparer un tube de 3 mL avec 1 mL de solution de dilution en tant que blanc.
4. PRÉPARATION DES ÉCHANTILLONS
Diluer les échantillons d’essai avec le tampon de dilution, conformément à la méthode utilisée pour le sérum d’étalonnage. Lorsque les
résultats se situent en dehors de la plage des valeurs données (se reporter au Tableau 1 de la notice incluse dans le kit), le dosage doit
être répété avec un échantillon dilué différemment.
5. PREMIER LAVAGE
Avec le tampon de lavage, laver quatre fois les puits nécessaires placés dans le châssis de la microplaque. Pour un lavage manuel,
remplir entièrement les puits (> 300 µL) de tampon de lavage, puis les vider ; répéter trois fois cette procédure. Les puits doivent
finalement être complètement vides. Le réactif suivant doit être ajouté immédiatement, ne pas laisser les puits à sec pendant une période
de temps prolongée.
6. PREMIÈRE INCUBATION
Transférer 100 µL des solutions diluées de calibrateur, de contrôles positifs, d’échantillons et de blancs dans les puits appropriés.
Recouvrir la microplaque d’un film adhésif, l’agiter doucement en la tapotant pendant quelques secondes sur les rebords afin de
mélanger le contenu de chaque puits.
Laisser incuber pendant 1 heure à 37 °C.
Juste avant le lavage, préparer le réactif pour l’incubation suivante, conformément aux instructions du point 8.
7. DEUXIÈME LAVAGE
Aspirer le surnageant hors des puits et laver la microplaque comme indiqué au point 5.
8. INCUBATION AVEC L’ANTICORPS ANTI-IGG HUMAINE CONJUGUÉ À LA PEROXYDASE DE RAIFORT
Diluer le conjugué 1:500 en transférant avec une pipette 30 µLl de conjugué dans 14,97 mL de tampon de dilution. Diluer ensuite le
conjugué comme suit:
1:3000 par transfert de 1,2 mL de dilution 1:500 dans 6,0 mL de tampon de dilution.
1:2000 par transfert de 2,0 mL de dilution 1:500 dans 6,0 mL de tampon de dilution.
1:1000 par transfert de 3,5 mL de dilution 1:500 dans 3,5 mL de tampon de dilution.
Ajouter: 100 µL de dilution 1:500 aux barrettes anti-IgG1;
100 µL de dilution 1:3000 aux barrettes anti-IgG2;
100 µL de dilution 1:2000 aux barrettes anti-IgG3;
100 µL de dilution 1:1000 aux barrettes anti-IgG4.
Recouvrir la microplaque d’un film adhésif, l’agiter doucement en la tapotant pendant quelques secondes sur les rebords afin de
mélanger le contenu de chaque puits.
Laisser incuber pendant 1 heure à 37 °C.
Juste avant le lavage, préparer le réactif pour l’incubation suivante, conformément aux instructions du point 10.
9. TROISIÈME LAVAGE
Aspirer le surnageant hors des puits et laver la microplaque comme indiqué au point 5.
10. INCUBATION AVEC LE SUBSTRAT ABTS
Calculer la quantité de solution de substrat nécessaire (environ 0,9 mL par barrette de puits).
Ajouter l’équivalent de 200 µL de solution stock de peroxyde d’hydrogène et de 400 µL de solution stock d’ABTS à 20 mL de tampon de
substrat de travail (2 mL de solution stock de substrat + 18 mL d’eau distillée).
Ajouter 100 µL de solution de substrat à tous les puits.
L’agiter doucement en la tapotant pendant quelques secondes sur les rebords afin de mélanger le contenu de chaque puits.
Laisser incuber pendant 30 minutes à température ambiante (18-25 ºC).
11. ARRÊT DE LA RÉACTION ENZYMATIQUE
Ajouter 50 µL de solution d’arrêt à tous les puits.
12. LECTURE DE LA MICROPLAQUE
Lire la microplaque dans un délai de 1 heure à 414 nm (de préférence) ou à 405 nm à l’aide d’un lecteur ELISA.
VIII.
RÉSULTATS ET INTERPRÉTATION DES DONNÉES
−
Enregistrer la densité optique à 414 nm (de préférence) ou à 405 nm dans chaque puits et calculer la moyenne des valeurs doubles.
−
Pour chaque échantillon, les doubles ne devront pas diverger de plus de 15 % de la valeur moyenne. Si la divergence est supérieure,
le dosage devra être répété.
−
Sur papier semi-log, représenter graphiquement les valeurs de densité optique obtenues pour les calibrateurs (axe des ordonnées) en
fonction de la concentration en sous-classe correspondante en ng/mL (axe des abscisses) et tracer la droite de régression.
−
Les taux de sous-classes d'IgG dans le sérum de contrôle doivent se situer dans la (les) plage(s) de valeurs données dans le tableau
3 de la notice incluse dans le kit.
−
Sur la courbe de calibrage, interpoler les valeurs moyennes de densité optique obtenues pour chaque échantillon.
−
Les échantillons qui présentent une densité optique moyenne se trouvant en dehors de la plage des dilutions de la courbe de
calibrage doivent être dilués de façon appropriée.
−
Pour évaluer les concentrations de sous-classes d'IgG pouvant être présentes dans un échantillon, comparer les taux déterminés
avec les valeurs normales de sous-classes d’IgG (voir X PLAGE DES VALEURS DE RÉFÉRENCE).
3
IX.
PLAGE DES VALEURS POUR L'ANALYSE
Consulter le tableau 1 de la notice incluse pour obtenir les plages de valeurs spécifiques au kit.
X.
PLAGES DES VALEURS DE RÉFÉRENCE
Plages des valeurs de références (g/L) des sous-classes d'IgG dans des échantillons sériques provenant d'individus sains de type
caucasien (8). Des valeurs de référence différentes doivent être prises en compte pour les autres types de population.
Âge
0
1
4
6
1
1½
2
3
4
6
9
12
XI.
a
b
>
1
4
6
12
1½
2
3
4
6
9
12
18
18
mois
mois
mois
mois
ans
ans
ans
ans
ans
ans
ans
ans
ans
2,4
1,8
1,8
2,0
2,5
2,9
3,2
3,5
3,7
4,0
4,0
3,7
4,9
IgG1
– 10,6
– 6,7
– 7,0
– 7,7
– 8,2
– 8,5
– 9,0
– 9,4
– 10,0
– 10,8
– 11,5
– 12,8
– 11,4
IgG2
0,87 – 4,1
0,38 – 2,1
0,34 – 2,1
0,34 – 2,3
0,38 – 2,4
0,45 – 2,6
0,52 – 2,8
0,63 – 3,0
0,72 – 3,4
0,85 – 4,1
0,98 – 4,8
1,06 – 6,1
1,50 – 6,4
IgG3
0,14 – 0,55
0,14 – 0,70
0,15 – 0,80
0,15 – 0,97
0,15 – 1,07
0,15 – 1,13
0,14 – 1,20
0,13 – 1,26
0,13 – 1,33
0,13 – 1,42
0,15 – 1,49
0,18 – 1,63
0,20 – 1,10
IgG4
0,04 – 0,56
<0,03 – 0,36
<0,03 – 0,23
<0,03 – 0,43
<0,03 – 0,62
<0,03 – 0,79
<0,03 – 1,06
<0,03 – 1,27
<0,03 – 1,58
<0,03 – 1,89
0,03 – 2,10
0,04 – 2,30
0,08 – 1,40
CARACTÉRISTIQUES SPÉCIFIQUES DES PERFORMANCES
Reproductibilité
Concentration en sous-classe
d'IgG
IgG1
IgG2
IgG3
IgG4
Variation intra-analyse (%)
4
3
4
2
Variation inter-analyse (%)
2
2
7
7
Comparaison du kit PeliClass de détermination des sous-classes d'IgG humaine avec la technique de Mancini
Les concentrations sériques d’IgG1, d’IgG2, d’IgG3 et d’IgG4 ont été déterminées par ELISA et comparées aux valeurs
correspondantes, déterminées par la technique de Mancini. Les corrélations suivantes ont été établies :
Sous-classe
d'IgG
régression linéaire
corrélation
IgG1
Y = 0,90X – 0,29
0,97
IgG2
Y = 1,01X – 0,17
0,93
IgG3
Y = 0,91X + 0,00
0,99
IgG4
Y = 0,96X - 0,03
0,98
Remarque :
Les valeurs mentionnées pour les caractéristiques spécifiques de performance du test, représentent des résultats typiques et ne doivent
pas être considérées comme des spécifications propres à ce kit.
XII.
LIMITES
1. L'utilisateur doit être entraîné et familiarisé avec les dosages ELISA et les procédures de test.
2. Les échantillons extrêmement hémolytiques ou lipémiques ne doivent pas être utilisés. Les échantillons contenant le facteur
rhumatoïde, de fortes concentrations de bilirubine ou d'autres complexes immuns circulants peuvent donner des résultats
inattendus. Il convient d'analyser ces échantillons avec d'autres méthodes.
3. Les échantillons hors plage, par exemple en cas de présence de paraprotéines, doivent être réanalysés en utilisant d'autres dilutions.
4. La découverte d'un taux diminué de l'une des sous-classes d'IgG ne peut en aucun cas amener à établir un diagnostic définitif, mais
doit plutôt être considérée comme l’indication d’un trouble du système immunitaire, requérant un examen diagnostic
supplémentaire.
5. Le sérum de contrôle doit toujours être utilisé afin de vérifier la validité des courbes de calibrage. Lorsque le contrôle est hors plage,
les résultats du dosage ne sont pas fiables. Le dosage doit être répété.
6. Les réactifs provenant de différents lots ne sont pas interchangeables.
7. Les résidus de réactifs (par exemple un volume mort) ne doivent pas être mélangés avec le contenu de flacons récemment ouverts.
8. Les bouchons et les flacons ne sont pas interchangeables. Les bouchons doivent être replacés sur les flacons correspondants.
9. Bien que le calibrateur humain et que les sérums de contrôle aient été testés quant à la présence de marqueurs d'agents
transmetteurs de maladies spécifiques, conformément aux directives en vigueur de l’UE en matière de BPF, et reconnus non
réactifs, tous les composants d'origine humaine doivent être considérés comme potentiellement infectieux.
10. Agents de conservation: Thiomersal® 0,001 %.
11. Utiliser un nouveau film plastic pour chaque étape d’incubation/fixation de l’ELISA afin d’éviter une contamination croisée. Ne pas
utiliser de film aluminium.
12. Utiliser des embouts de pipettes à usage unique pour chaque transfert afin d’éviter une contamination croisée.
13. À chaque fois que le kit est utilisé, préparer des dilutions fraîches de calibrateur, de conjugué et de tampons.
14. Ne pas utiliser d’autres réactifs et d’autres barrettes de microplaque que ceux fournis avec le kit.
15. L’azide de sodium inactive la peroxydase de raifort (HRP); ne pas utiliser de solutions contenant de l’azide de sodium et ne pas
ajouter d’azide de sodium aux tampons fournis.
16. L’élimination des déchets doit être effectuée conformément aux réglementations en vigueur dans votre laboratoire.
4
XIII.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
BIBLIOGRAPHIE
Shakib, F. (Editeur), Monograph in Allergy, Karger A.G., 19 (1986).
Shakib, F. (Editeur), The human IgG subclass, Pergamon Press (1990).
Vlug, A. et al., Eur. Clin. lab., 8:26 (1989).
Jefferis, R. et al Clin.Exp.Immunol. 81:357 (1990).
Hamilton, R.C., Clin. Chem., 33:1707 (1987).
Beck, C.S. and Heiner, D.C., Am. Rev. Respir. Dis., 124:94 (1981).
Klein, F et al., Clin. Chem. Acta., 150 119 (1985)
Vlug, A. et al., Ann. Biol. Clin. 52:561-67 (1994).
5