BCR-ABL - Association des Etudiants en Médecine de Marseille

Explorations complémentaires en
Hématologie Cellulaire
L3 Médecine
4 Octobre 2012
Dr Marina Lafage-Pochitaloff
MCU-PH en Hématologie
Laboratoire de Cytogénétique Onco-Hématologique
Département de Génétique (Pr Lévy)
CHU Timone Enfants Marseille
Aix-Marseille Université
[email protected]
Suspicion d’hémopathie maligne :
signes cliniques et biologiques diversement associés
Signes d’insuffisance médullaire :
Anémie
Syndrome infectieux
Syndrome hémorragique
Signes tumoraux :
douleurs osseuses
splénomégalie
adénomégalie
hépatomégalie
Hémogramme
(NFS avec réticulocytes)
Anémie arégénérative
Neutropénie
Thrombopénie
Hyperleucocytose
( si blastes circulants ou
si myélémie)
Suspicion d’hémopathie maligne :
exploration de la moelle osseuse
•
Myélogramme (frottis)
•
Immunophénotypage (EDTA)
•
Cytogénétique (Héparine)
Caryotype, FISH
•
Biologie moléculaire (EDTA)
transcrits anormaux , mutations , …
Explorations complémentaires dans le cadre
d’une hémopathie maligne
Exemple de deux hémopathies malignes :
Leucémie myéloide chronique (LMC)
Leucémie aigüe lymphoblastique (LAL)
Modèle de la Leucémie Myéloïde Chronique (LMC) (1)

Hémopathie maligne

Pathologie de la souche hématopoiétique

Syndrome myéloprolifératif chronique (SMP)
ou néoplasies myéloprolifératives de l’OMS

Evolution naturelle en 3 phases :
Phase chronique
Phase d’accélération
Phase aiguë : transformation en leucémie aiguë
Hématopoièse
CMP = CFU-GEMM ; GMP = CFU-GM ; EMP = CFU-EMK
Modèle de la Leucémie Myéloïde Chronique (LMC) (2)

Présence du chromosome Philadelphie (Ph)

Présence du transcrit BCR-ABL

Traitement ciblé anti-tyrosine kinase (ATK)
Leucémie Myéloïde Chronique (LMC)
Epidémiologie :
 Incidence = 10 nouveaux cas/ an / million d’habitants
 Prévalence : en augmentation car diminution du taux
de mortalité (progrès thérapeutiques : traitement ciblé
anti-tyrosine kinase)
Facteurs risque : benzène, radiations

Age moyen au diagnostic : 54 ans
Très rare chez l’enfant, exceptionnel avant 5 ans

Sex ratio : 1,4 homme pour 1 femme
Leucémie Myéloïde Chronique (LMC) : clinique
Circonstances de découverte :
Asthénie
Hémogramme systématique +++
Examen clinique :
Le plus souvent : normal
Parfois :
signes tumoraux : splénomégalie
signes liés à l’hyperleucocytose : thromboses
veineuses ou artérielles
Leucémie myéloïde chronique (LMC) au diagnostic :
frottis de sang , objectif 20
Majorité de PN et de myélocytes
Hyperleucocytose (100G/L) : polynucléose neutrophile et
myélémie
LMC AU DIAGNOSTIC / : HEMOGRAMME
Globules rouges 5,5 T/L
Hémoglobine 15,5 g/dL
Teneur Corpusculaire Moyenne en Hémoglobine 30 pg
Volume Globulaire Moyen 90 microns cube
Globules blancs 64 G/L
Polynucléaires neutrophiles 58 % soit 37G/L
Polynucléaires éosinophiles 2 % soit 1,3 G/L
Polynucléaires basophiles 4 % soit 2,6 G/L
Monocytes 2 % soit 1,3 G/L
Lymphocytes 6 % soit 3,8 G/L
Myéloblastes 1 % soit 0,6 G/L
Promyélocytes 3 % soit 1,9 G/L
Myélocytes 18 % soit 11,5 G/L
Métamyélocytes 6 % soit 3,8 G/L
Plaquettes : 510 G/L
LMC : pathologie de la cellule souche
avec prolifération et différenciation à la phase chronique
Suspicion de LMC :
exploration de la moelle osseuse et du sang
•
•
•
Myélogramme (frottis)
Cytogénétique sur moelle
(voire sur sang car myélémie)
Caryotype (+/- FISH)
Biologie moléculaire sur sang
RQ-PCR
LMC phase chronique : myélogramme obj 20
*
*
*
Moelle très riche , polymorphisme (maturation conservée)
*petits mgc à noyau non segmenté
Myélogramme:
importance du % de myéloblastes
Phase chronique : myeloblastes <10%
Phase accélérée : 10%<ou = myeloblastes <20%
Phase acutisée en LAM : myeloblastes >ou =20% (TA)
LMC phase chronique : myélogramme
Richesse : très riche, en nappe
Mégacaryocytes : nombreux et de petite
taille
Lignée granuleuse : 88 %
Myéloblastes : 2 %
Promyélocytes : 3 %
Myélocytes neutrophiles : 20 %
Myélocytes éosinophiles : 3 %
Métamyélocytes neutrophiles : 27 %
Métamyélocytes éosinophiles : 3 %
Polynucléaires neutrophiles : 26 %
Polynucléaires éosinophiles : 4 %
Polynucléaires basophiles : 2 %
Lignée érythroblastique : 10%
Proerythroblastes : 0 %
Erythroblastes basophiles : 2 %
Erythroblastes polychromatophiles : 4 %
Erythroblastes acidophiles : 4 %
Monocytes: 1 %
Lymphocytes: 1%
Hyperplasie medullaire globale à prédominance granuleuse évocatrice d’un
syndrome myéloprolifératif .
Dystrophie mégacaryocytaire typique de LMC
Conclusion : LMC en phase chronique
Philadelphie , 1960 : caryotype sur sang de LMC
« A minute chromosome
in human chronic granulocytic leukemia »
1960
Nowell and Hungerford, Science, 1960
• Description du chromosome Philadelphie (Ph1 ou Ph)
•1ère anomalie chromosomique acquise caractéristique d’une tumeur
maligne
Caryotype hématologique : technique (1)
Prélèvement (stérile) :
Moelle osseuse , Sang (si cellules
anormales)
Sur héparine (sans conservateur
toxique)
Transport (cellules vivantes)
rapide
température ambiante
Mise en culture
Hotte stérile
Flacon de culture
milieu de culture avec
ATB
+/- mitogène (facteurs de
croissance, …)
d’après N Nadal, CHU St Etienne
Caryotype hématologique : technique (2)
culture cellulaire
étuve à CO2 à 37°C
durée : 1 à 3 jours
arrêt de la culture en métaphase :
synchronisation des cultures
(blocage en phases S puis déblocage)
colchicine (poison du fuseau mitotique)
d’après N Nadal, CHU St Etienne
Caryotype hématologique : technique (3)
Transvasement des flacons de culture pour :
Centrifugations
Choc hypotonique
Fixations
Étalement des préparations
chromosomiques
Vérification au microscope à
contraste de phase : présence de
cellules en métaphase (mitoses)
Caryotype hématologique : technique (4)
Traitement chimique des lames :
dénaturation des protéines
chromosomiques
Trypsine : bandes G
Chaleur+acide : bandes R
Coloration Giemsa
bandes G
bandes R
Observation des métaphases
Saisie des métaphases
puis classement des chromosomes (caryotype)
d’après N Nadal, CHU St Etienne
Caryotype humain
Bandes G (à gauche) / Bandes R (à droite)
ISCN, Cytogenet Cell Genet, 21, 6, 1978
1973 : Janet Rowley identifie l’anomalie Ph comme une translocation
t(9;22)(q34;q11)
CARYOTYPE
Indication : LMC au diagnostic
Caryotype sur : Moelle
Conditions de culture : 48h avec synchronisation
Marquage chromosomique: RHG
Nombre de mitoses photographiées et analysées : 20
Résultats :
Toutes les mitoses sont Philadelphie (Ph) positives sous forme de la
translocation classique, t(9;22)(q34;q11).
Il n’a pas été décelé d’anomalie clonale surajoutée.
Formule chromosomique :
46, XY, t(9;22)(q34;q11) [20]
Conclusion : LMC Ph positive
Philadelphia chromosome (Ph) :
• translocation de abl sur le 22 (Bartram C et al., Nature ,1983)
• fusion de abl avec bcr (Shtivelman E et al, Nature,1985) :
gène et transcrit chimérique BCR-ABL
BCR
ABL
BCR-ABL
Transcrits chimériques BCR-ABL dans la LMC : MBCR majoritaire
NB : Nomenclature bcr b2=e13 ; b3=e14
PCR en Hématologie : généralités (1)
PCR ( polymerase chain reaction) :
réaction de polymérase en chaine
Utilisée depuis 1990
Très sensible : détecte 1 cellule
sur 1 million
Risque d’échec si ARN dégradé
PCR BCR-ABL
sur la lignée de
LMC K562
Prélèvements pour PCR
Sang le plus souvent ( 1 à 2 tubes EDTA)
Moelle osseuse
Ganglion (lymphome)
Extraction de l’ADN et/ou de l’ARN à partir des cellules nucléées
1 ml de sang normal contient :
10 millions de cellules nucléées ( NFS : nbre de GB = 10G/L)
soit:
30 à 50 µg d’ADN : PCR génomique
et
1 à 10 µg ARN : RT-PCR (analyse des transcrits)
Transcription de l’ADN vs Reverse transcription (RT) de l’ARNm
PCR ( Polymerase Chain Reaction) : Réaction de polymérase en chaine
30 à 50 cycles :
2 30 copies soit 10 9 copies
A chaque cycle, 3 phases:
•
Dénaturation : 95°C
•
Hybridation : 50 à 60°C
Amorces (primers) :
oligonucléotides 5’ et 3’
specifiques de la séquence à
amplifier
•
Elongation : 72°C
Taq polymérase : enzyme de
la bactérie Thermophilus
aquaticus, ADN polymerase
resistante à haute
température (95°C)
PCR sur gel
Puits 1: marqueur de PM
Puits 2 : contrôle négatif (eau)
Puits 3 : produit d’amplification
RQ-PCR en Hématologie :
RQ-PCR (real-time quantitative PCR):
Utilisée depuis 2000 en Hématologie
Très sensible : détecte 1 cellule sur 1million
Permet de quantifier et donc d’apprécier le taux
de maladie résiduelle après traitement (MRD)
Risque d’échec si ARN dégradé
Real-time quantitative PCR (RQ-PCR)
Deux technologies similaires :
Taqman
Light cycler
Sonde oligonucléotidique interne
fluorescente
Détection de l ’émission de
fluorescence en temps réel
(PCR en temps réel)
Mesure du Ct (cycle threshold),
nombre de cycles nécessaires
pour atteindre un seuil de
fluorescence.
Ct proportionnel à la quantité de
« cible » présente dans
l ’échantillon
RQ-PCR /LMC : amorces (F et R) et sonde (P) EAC
(Europe against cancer program, Gabert et al.,Leukemia, 17, 2003)
RQ-PCR : Technologie Taqman
RQ-PCR
Taqman
967700
puits
Plaque
96 puits
pour: plaque
Taqman
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A
B
C
D
E
F
G
H
Transcrit recherché
Transcrit controle
Amplification MBCR-ABL
Patient
Plasmide 105
Plasmide 104
Amplification transcrit contrôle (GUS ou ABL )
Patient
Plasmide 105
Plasmide 104
RQ-PCR et LMC
Calibrateur : plasmide avec un insert Mbcr
Expression des résultats :
Rapport nombre de copies BCR-ABL / nombre
de copies du gène de contrôle : nombre de
copies normalisé (NCN)
Suivi :
NCN suivi/ NCN diagnostic
cinétique au cours de l ’évolution ++
RQ-PCR
Indication : LMC au diagnostic
Prélèvement : Sang
Résultats :
Recherche du transcrit MBCR-ABL positive.
Qualité de l’ARN : très bonne (Ct ABL: 24)
Nombre de copies du transcrit MBCR-ABL pour 104 copies du transcrit contrôle (ABL) :
7564
Valeur de référence (médiane) au diagnostic des LMC en phase chronique : 8709 (100% qui
servira de reference pour le suivi de la maladie residuelle )
Chromosome Philadelphie (Ph) et LMC au diagnostic (2)
Ph absent dans 10% des cas de LMC au diagnostic :
5% des cas : BCR-ABL positif en PCR
5% des cas : BCR-ABL négatif en PCR
Compléter le caryotype et la PCR
par FISH BCR-ABL (sur le prelevement du caryotype)
Caryotype
= Cytogénétique conventionnelle
Caryotype : analyse globale du génome
•
1 caryotype hématologique : 500 bandes
•
1 bande = 5 à 10.106 pb = 5 à 10.000 kb
•
Rappel :
• 1 gène : 100 à 1000 kb
• génome : 3.109 pb = 3.106 kb
Philadelphia chromosome (Ph) :
• translocation de abl sur le 22 (Bartram C et al., Nature ,1983)
• fusion de abl avec bcr (Shtivelman E et al, Nature,1985)
BCR
ABL
BCR-ABL
5’ BCR- 3’ABL FISH probe
technique FISH
Sonde spécifique
fluorescente
ADN cible
BCR-ABL
Traitement des lames
Co dénaturation
Hybridation
Rinçages posthybridation
Contrecoloration
Analyse au
microscope et
analyseur
d’images
d’après N Nadal, CHU St Etienne
sonde FISH 5’ BCR- 3’ABL
LMC: t(9;22)
FISH sur chromosomes (FISH métaphasique)
LMC Ph + , Sonde 5’ BCR- 3’ABL
Sonde 5’ BCR- 3’ABL
FISH sur noyaux (FISH interphasique)
Donneur sain
Patient LMC
2R2V
Cytospins de cellules de moelle triées CD34+
1R1V1F
LMC Ph negative, BCR-ABL positive
Sonde 5’ BCR - 3’ABL : insertion (22;9)
22
9
der(22)
der(9)
5’ BCR- 3’ABL FISH probe :
insertion de séquences ABL dans BCR
chr 9
chr 22
LMC au diagnostic : si absence de Ph au caryotype
(10% des cas)
Le plus souvent : BCR-ABL positif (en PCR et en FISH)
Ph masqué ou cryptique dû à une insertion submicroscopique
( visible uniquement en FISH ) :
insertion de 9 dans le 22
ou
insertion de 22 dans le 9
pour créer un gène chimérique BCR-ABL
répond au traitement ciblé par Imatinib
Plus rarement : BCR-ABL négatif (en PCR et en FISH)
LMC atypique, forme frontière SMP/SMD
ne répond pas au traitement ciblé par Imatinib
Syndromes myéloprolifératifs chroniques (SMP)
ou Néoplasies myéloprolifératives
Pathologies de la cellule souche hématopoiétique
Prolifération et différenciation de la lignée myéloide
Plusieurs entités (OMS) :
SMP de type LMC (Ph et/ou BCR-ABL positive)
SMP non LMC (Ph et BCR-ABL négatifs)
TE
MFP
PV
SMP /SMD (Ph et BCR-ABL négatifs)
LMMC
LMC atypiques
Classification and diagnosis of myeloproliferative neoplasms : The 2008 World Health Organization criteria and
point care diagnostic algorythms. Tefferi A and Vardiman JW, Leukemia 2008;22:14-22
Role oncogénique de BCR-ABL
Daley GQ et al,
Science,1990
Protéines Tyrosine Kinases
Protéines ABL et P210 BCR-ABL
(Goldman and Melo, NEJM, 2003)
(Goldman J and Melo JV, NEJM, 2003)
Traitement de la LMC en phase chronique :
Traitement
Tolérance
Efficacité
Hydréa (hydroxyurée)
+++
+/-
Allogreffe
+/- - (GVH)
++++ (guérison)
Interféron
+/-
++
ATK Imatinib (Glivec)
++
+++
ATK 2ème génération
++
++++
(Gleevec, Glivec, Novartis)
STI571
Active
Inactive
BCR-ABL Inactive
Activée par l’ATP
Inactive inhibée par IM
Suivi des LMC par cytogénétique : critères
d ’évaluation
Kantarjian et al., NEJM, 1997 modifié en février 2002
Réponse cytogénétique majeure :
Réponse cytogénétique complète : 0% Ph
Réponse cytogénétique partielle : 1-35% Ph
Réponse cytogénétique mineure : 36-65% Ph
Réponse cytogénétique minime : 66-95% Ph
Absence de réponse cytogénétique : 96-100% Ph
NB : Caryotype médullaire avec analyse d’au moins 20
métaphases
Patient MBCR : suivi
Patient
Plasmide 102
Plasmide 101
RQ-PCR MBCR-ABL
Indication : LMC Mbcr positive traitée par Glivec depuis 1 an
Prélèvement : Sang
Résultats :
Qualité de l’ARN : bonne (transcrit contrôle :ABL)
Recherche du transcrit MBCR-ABL positive.
Nombre de copies du transcrit MBCR-ABL pour 104 copies du transcrit contrôle : 4
Valeur de référence au diagnostic : 8709
Taux de maladie résiduelle (local) = 4/8709= 0.0005 =0.05%= 0.5x10-3
Facteur de conversion du laboratoire pour standardisation internationale = 0.8
Taux de maladie résiduelle (international ): TMR = 0.05% x 0.8 = 0.04%=0.4x10-3
Conclusion : Réponse moléculaire majeure (RMM car TMR <10-3 soit 0.1%)
LMC : Niveaux de maladie résiduelle
(European Leukemia Net , Baccarani et al, Blood, 2006)
Evaluation des LMC au diagnostic
Recommandations de l’ELN : Baccarani et al , JCO, dec 2009
clinique et NFS :
Age
Taille de la rate
Taux de plaquettes
Taux de blastes
Basophiles
Eosinophiles
Myelogramme :
% de myeloblastes
caryotype sur moelle :
Anomalies clonales surajoutées au Ph (CCA/Ph+)
FISH BCR-ABL :
Si Ph masqué (pour compléter le caryotype)
Si echec de caryotype
RQ-PCR sur sang
Evaluation des LMC au suivi
Recommandations de l’ELN : Baccarani et al , JCO, dec 2009
NFS : tous les 15j jusqu’à RHC : réponse hématologique complète
(rate non palpable, GB<10G/L, plaq<450,pas de myelemie,
basophiles < 5%)
RQ-PCR sur sang
tous les 3 mois si traitement par Glivec jusqu’à RMM (réponse
moléculaire majeure)
Tous les mois dans le suivi précoce des allogreffes (6 premiers
mois) , puis plus espacé (tous les ans après 2 ans post-allo)
Caryotype moelle:
1ère année à 3 mois (ELN 2010),6 mois, puis tous les 6 mois
jusqu’à RCC (réponse cytogénétique complète) confirmée par
un caryotype 6 mois après , puis tous les ans si pas de RQPCR possible
Toujours si échec de traitement (resistance 1aire ou 2aire) ou
cytopénie inexpliquée
FISH BCR-ABL :
Si Ph masqué (pour compléter le caryotype)
Si echec de caryotype
Évaluation de la réponse à l’Imatinib : ELN 2009 ( Baccarani et al, JCO,2009)
Réponse
Optimale
Suboptimale
Echec
Vigilance
diagnostic
NA
NA
NA
Risque élevé;
ACA dans Ph+
à 3 mois
RHC
et au moins
RCg mineure
(Ph ≤ 65%)
Pas de RCg
(Ph > 95%)
pas de RHC
NA
à 6 mois
≥ RCgP
(Ph ≤ 35%)
< RCgP
(Ph > 35%)
Pas de RCg
(Ph > 95%)
NA
à 12 mois
RCgC
< RCgC
< RCgP
(Ph > 35%)
< RMM
à 18 mois
RMM
< RMM
< RCgC
NA
perte de RMM
Mutations S à
Imatinib
ACA dans Ph+
perte RHC ou
perte RCgC
Mutations R à
Imatinib
Augmentation
du transcrit
ACC dans Ph-
À tt
moment
RMM stable ou
en amélioration
Dr N Nadal, CHU St Etienne
Leucémie Myéloïde Chronique (LMC)
Evolution naturelle en 3 phases :
Phase chronique
Phase d’accélération
Phase aiguë (crise blastique ou phase
blastique) :
leucémie aigue myéloïde (2/3 cas)
leucémie aigue lymphoïde (1/3 cas) : type B
LMC en phase chronique :
LMC en transformation aigue :
prolifération et différenciation
blocage de la différenciation
Moelle osseuse (myelogramme) :
plus de 20% de myeloblastes / blastes
dans la moelle osseuse
moins de 10% de myeloblastes
dans la moelle osseuse
clichés Drs S. Laibe et D. Sainty, IPC Marseille
TA de LMC en LAL ou LAM :
blocage de la différenciation
Leucémie Myéloïde Chronique (LMC) et caryotype

Phase chronique :
 Ph isolé

Phase d’accélération et phase d’acutisation (LA):
 Ph et anomalies chromosomiques clonales
additionnelles (ACA)
47,XY,t(3;18)(q11;p11),+8,t(9;22)(q34;q11)
ACA /Ph: iso 17q : perte du 17p donc deletion du gène p53
46,XY,t(9;22)(q34;q11),i(17)(q10)
ACA /Ph: translocation (3;21) créant un géne chimérique AML1-EVI1
46,XY,t(3;21)(q26;q22),t(9;22)(q34;q11)
Anomalies chromosomiques clonales surajoutées au Ph

Anomalies de nombre :
trisomie 8
trisomie19

Anomalies de structure :
Isochromosome 17q : i(17)(q10) ou idic(17)(p11)
isoPh : ider(22)t(9;22)(q34;q11)
t(3;21)(q26;q22) : evi1-aml1

Anomalie de nombre et de structure :
duplication du Ph : +der(22)t(9;22)
Genes associated with CML progression
Radich J P et al. PNAS 2006;103:2794-2799
©2006 by National Academy of Sciences
Gènes impliqués dans la
transformation des LMC
Junia V. Melo & David J. Barnes
Nature Reviews Cancer , 2007
Cooperativity hypothesis in acute myeloid leukemias (AML)
Gilliland, D; Gary PhD, MD
Current Opinion in Hematology. 8(4):189-191, July 2001.
3
Chronic myeloid leukaemia as a
model of disease evolution
in human cancer
Junia V. Melo & David J. Barnes
Nature Reviews Cancer 7, 441-453 (June 2007)
Caractéristiques de la Leucémie Myéloïde Chronique (LMC)

Hémopathie maligne

Pathologie de la souche hématopoiétique

Syndrome myéloprolifératif chronique (SMP)
ou néoplasies myéloprolifératives de l’OMS

Présence du chromosome Philadelphie (Ph)

Présence du transcrit BCR-ABL

Traitement ciblé anti-tyrosine kinase (ATK)
Conclusion : Historique de LMC : avancées tous les 10 ans






1960 : Nowell et Hungerford, chercheurs à Philadelphie mettent
en évidence la même anomalie chromosomique dans toutes les
cellules de plusieurs cas de leucémie myéloïde chronique (LMC) :
le chromosome Philadelphie (Ph)
1973 : Janet Rowley identifie l’anomalie Ph comme une
t(9;22)(q34;q11)
1985 : Traitement de la LMC par alpha-interféron : surveillance
cytogénétique
1990 : Clonage de la t(9;22) : fusion des gènes BCR et ABL :
diagnostic moléculaire et mise en évidence de l’activité
oncogénique de BCR-ABL
2000 : Traitement par Imatinib (Glivec), inhibiteur de l’activité
tyrosine-kinase de BCR-ABL :surveillance cytogénétique et
moléculaire (PCR quantitative)
2005 : ATK de 2ème génération (Dasatinib et Nilotinib) chez les
patients resistants au Glivec très actifs (sauf si mutation T315 :
allogreffe proposée ).
Explorations complémentaires dans le cadre
d’une hémopathie maligne
2ème exemple d’hémopathie maligne :
Leucémie aigüe lymphoblastique (LAL)
Leucémie aigue lymphoblastique (LAL) (1)
Hémopathie maligne aigue (prolifération mais pas de différenciation)
Pathologie des progéniteurs lymphoides B ou T (lymphoblastes):
LAL B : 75% des cas ; LAL T : 25 % des cas
Leucémie aigue lymphoblastique (LAL) (2)
Rare mais la plus fréquente des néoplasies malignes
de l’enfant
Urgence diagnostique et thérapeutique
Thérapeutique adaptée dépend des explorations
complémentaire
Suspicion d’hémopathie maligne aigue :
signes cliniques et biologiques
Signes d’insuffisance médullaire :
Anémie
Syndrome infectieux
Syndrome hémorragique
Signes tumoraux :
douleurs osseuses
splénomégalie
adénomégalie
hépatomégalie
Hémogramme urgent
Anémie (arégénérative)
Neutropénie
Thrombopénie
Hyperleucocytose
( si blastes circulants )
Suspicion d’hémopathie maligne aigue :
hospitalisation en urgence pour exploration de la moelle osseuse
Myélogramme (frottis)
Résultat à J0
Immunophénotypage (CMF)
Résultat à J0-J1
Cytogénétique : Caryotype, FISH…
Résultats à J2-J5
Biologie moléculaire : transcrits , IG-TCR
Résultat à J5-J30
w
LAL :
Children
Répartition enfant /adulte
Entités cytogénétiques
spécifiques de lignée
B ou T (sauf rares exceptions)
Anomalies cytogénétiques
de nombre ou de structure
(Pui CH et al., NEJM, 350;15, 2004)
Adults
Valeur pronostique de la cytogénétique
dans les LAL de l’enfant
Survie sans événement (EFS) des LAL de l’enfant du St Jude’s Children
Hospital de 1991 à 1999 : 3 protocoles successifs, 467 enfants
Pui CH et al., NEJM, 350;15, 2004
LAL
Children
Répartition enfant
/adulte
des entités
cytogénétiques
Survie à 5 ans sans événement
(EFS)
Enfants : 80%
Adultes : 40%
(Pui CH et al., NEJM, 350;15, 2004)
Adults
Typage des blastes : prélèvement pour CMF
Acheminement rapide : 2-3h
Température ambiante
Sang, moelle osseuse, liquides biologiques
Anticoagulant : EDTA, Héparine
Tissu solide : ganglion
milieu humidifié
Sous la direction des anatomo pathologistes
C. Fossat, CHU Marseille
MARQUAGE CELLULAIRE pour CMF :
membranaire, cytoplasmique, nucléaire
Ac mono ou polyclonaux : 350 CD (cluster de différenciation)
Plusieurs clones/ CD
Un épitope antigènique/clone
Ig G1, Ig G2, Ig M : Origine murine
Lyophilisés, liquides, purs ou marqués
D’après C. Fossat, CHU Marseille
Principaux marqueurs de lignée lymphoide
Lignée B
CD10
CD79a
CD19
CD20
CD22
CD24
CD138
Lignée T
CD3
CD5
CD2
CD4
CD8
CD1A
CD2
CD7
D’après C. Fossat, CHU Marseille
Les fluorochromes utilisés en CMF
PE
FITC
Vert à 525 nm.
Orange : 590 nm
PC5
ECD
Rouge à 620 nm.
Rouge profond: 667 nm
C. Fossat, CHU Marseille
Cytomètre en flux
C. Fossat, CHU Marseille
Cytométrie en flux
Laser
FSC
Miroirs
dichroïques
PMT
SSC
PMT
FL5
FL2
FL6
FL4
FL3
FL6
Filtres
FL1
PMT
C. Fossat, CHU Marseille
Différenciation hématopoïèse
Granulocytes
Monocytes
Lymphocytes
C. Fossat, CHU Marseille
GTLLF, 2006
Moelle « normale »
Expression CD45, CD11b, CD14, CD16,
C. Fossat, CHU Marseille
Acquisition en CMF : 5 105 évènements
Absence de bruit de fond
en FITC, PE, …
CD 45+
CD 19+
C. Fossat, CHU Marseille
Nature de la prolifération
pathologique d’après le profil en CMF
Immaturité
HLA Dr, CD34, TdT, CD10
Lymphoïde B
cytCD79a, cytCD22, CD19
Lymphoïde T
cytCD3
Myélo-Mono
MPO, cytCD13, CD13, CD33, CD117, CD14,
CD4
Plaquettaire
CD41, CD42, CD61
Erythroïde
Glycophorine A, CD36, CD71
C. Fossat, CHU Marseille
LAL B : profil antigénique associé à la leucémie
« LAP » (leukemia associated profile)
Intensité d’expression :
CD45, CD10, CD 38, CD19
100%
Asynchronisme de maturation :
CD10/CD22,
CD34/CD22,
50%
Infidélité de lignée :
20%
CD13, CD33, CD7, CD2,...
Evolution du clone :
Plusieurs combinaisons
C. Fossat, CHU Marseille
20%
« LAP » : LAL B
Lymphocytes
Hématogones
Blastes
C. Fossat, CHU Marseille
« LAP » des LAL T
Intensité d’expression :
cCD3, CD99
100%
Asynchronisme de maturation :
TdT/cCD3,
CD1a/TcR,
50%
Infidélité de lignée :
CD13, CD33, CD15,
20%
Evolution du clone :
Plusieurs combinaisons
10%
C. Fossat, CHU Marseille
Classification EGIL
LAL B : cCD79a, cCD22
BI
ProB
Tdt+,
CD10-
BII
B Commune
Tdt+,
CD10+
BIII
Pre B
Tdt+/-,
CD10+,
BIV
B Mature
Tdt-,
CD10+/-, mc+,Igs+
C. Fossat, CHU Marseille
mc+
Classification immunologique
LAL T : cCD3
TI
TII
ProT
PreT
CD7+, CD2+
CD5+/-, CD8+/-
TIII
TIV
Cortical
Mature
CD4+ ou CD8+ ,CD1a+
CD1a-, TcRa/b ou g/d
C. Fossat, CHU Marseille
Leucémie aigüe lymphoblastique (LAL) :
Entités les plus fréquentes
LAL B:
Adulte : LAL Ph
Enfant : Hyperdiploidie et t(12;21)
LAL-B :
anomalies de structure
Children
LAL Ph / t(9;22) / BCR-ABL
Enfant :
3 % des LAL
Adults
Adulte : 25% des LAL
LAL-B : t(9;22)(q34;q11) / Ph / BCR- ABL
LAL-BII (CD10 +) avec souvent marqueurs myéloïdes
Caryotype : t(9;22)(q34;q11)
FISH : sonde BCR-ABL
9
22
RT-PCR : 2/3 mBCR, 1/3 MBCR suivi moléculaire ++++
5’-
m
M
Sonde BCR-ABL extra-signal :
Aspect de type M-BCR : 1F, 1V, 2R
Si m-BCR : 2F,1R,1V
LAL Ph :
Pronostic défavorable ( indication classique d’allogreffe)
en nette amélioration depuis l’adjonction des ITK
(Imatinib, Dasatinib)
LAL Ph : apport de l’Imatinib : protocole pédiatrique POG
AALL0031 (Schultz K R et al. JCO 2009)
LAL-B : t(9;22)(q34;q11) / Ph / BCR-ABL
Caryotype :
Anomalies clonales additionelles (ACA) :
60% des cas
ACA de type déséquilibrées :
Gains
hyperdiploidie >50 (trisomie2)
duplication du Ph
trisomie 8
Pertes :
monosomie 7, deletion 7p :
pronostic plus défavorable
Deletion Ikaros /IKZF1 en 7p12
58,XY,+X,+2,+3,+5,+6,+8,t(9;22)(q34;q11),
+13,+14,+15,+17,+21,+der(22)t(9;22)
E Delabesse, CHU Toulouse
E Delabesse, CHU Toulouse
E Delabesse, CHU Toulouse
E Delabesse, CHU Toulouse
E Delabesse, CHU Toulouse
E Delabesse, CHU Toulouse
E Delabesse, CHU Toulouse
E Delabesse, CHU Toulouse
LAL-B
Children
Hyperdiploidie >50
( 51-65 chr )
Enfant : 25% des LAL
Adults
Adulte :
7% des LAL
LAL-B : Hyperdiploidie 51-65 chromosomes
LAL-B II (CD10+)
Profil chromosomique non aléatoire:
+X, +4, +6, +10, +14, +17, +18, +21,+21
Index d’ADN > ou = 1.16 (soit nombre modal >ou = 53)
(Raimondi S, Blood, 1993)
Très bon pronostic (sauf si Ph associé) :
EFS à 5 ans :
Enfant : 85% (Pui CH, NEJM, 2004)
Adulte : 50 % (Moorman AV, Blood,
2007)
56,XX,+X,+4,+6,+9,+10,+14,+17,+18,+21,+21
LAL-B :
Children
t(12;21)(p13;q22)/TEL-AML1 (ETV6-RUNX1)
enfant : 22 à 27 % des LAL-B
Adults
adulte : 3 à 5 % des LAL-B
très rare après 25 ans
LAL-B : t(12;21)(p13;q22)/TEL-AML1 (ETV6-RUNX1)
Phénotype : LAL-BII, souvent CD13+
Caryotype : le plus souvent anormal
mais
la t(12;21)(p13;q22) est invisible au
caryotype (anomalie cryptique)
FISH : sonde TEL / AML1 ES (extrasignal AML1)
RT-PCR : transcrit TEL-AML1
Pronostic très favorable :
EFS à 5 ans : 86%
12p13
21q22
LAL-B :
anomalies de structure
Children
LAL 11q23/MLL
Myeloid Lymphoid Leukemia
Enfant : 8 % des LAL-B
80 % des LAL du nourrisson <1 an
«infant leukemia »
Adults
Adulte : 10% des LAL-B
Valeur pronostique de la cytogénétique dans les LAL de l’enfant
Survie sans événement (EFS) des LAL de l’enfant du St Jude’s Children
Hospital de 1991 à 1999 : 3 protocoles successifs, 467 enfants
Pui CH et al., NEJM, 350;15, 2004
LAL-B : t(4;11)(q21;q23)/ MLL-AF4
Phénotype : B-I , proB (CD10 neg )
avec souvent marqueurs myéloïdes
4
FISH : sonde MLL
RT-PCR : transcrit chimérique MLLAF4
Pronostic défavorable avec variation
selon l’âge:
très défavorable (indication
d’allogreffe) si :
nourrisson < 6mois
adulte
der11
der4
MLL 5’V/3’R
11
Sondes FISH pour déceler les anomalies de structure :
Sondes bicolores :
-Signal de fusion
-Signal de séparation
(break-apart)
From Van den Burg, Leukemia, 2004
LAL-B : t(4;11)(q21;q23)/ MLL-AF4
4
der11
der4
MLL 5’V/3’R
11
Leucémies aiguës lymphoblastiques (LAL) :
Valeur pronostique de la maladie résiduelle
Maladie residuelle minime (MRD pour minimal residual disease) :
maladie détectable en dessous du seuil de la cytologie
(5% de blastes residuels )
Recherchée après chaque phase de chimiothérapie
induction soit J30 post diagnostic
1ère consolidation soit J60
2ème consolidation soit J90
MRD moléculaire : valeur pronostique défavorable si
Présence du transcrit bcr-abl dans les LAL Ph
Niveau Ig-TCR >ou = 10-2 après induction dans les LAL de
l’enfant
MRD par CMF : validée aux USA, en cours d’évaluation en Europe
Niveau de sensibilité des techniques de suivi de la maladie résiduelle dans les LA
D’après E. Delabesse et al;, Transfusion clin et bio,10,2003
Apport de la CMF dans le suivi de la maladie :
Etude de la maladie résiduelle
Profil phénotypique associé
à la leucémie : « LAP »
Infidélité de lignée
Asynchronisme de maturation
Intensité d’expression
C. Fossat, CHU Marseille
MRD par CMF : exemple d’une LAL de
l’enfant
LAL B II (Mars 2002) – Georgie
Mai 2004 : pris en charge au CHU Timone, pour greffe
allogénique intrafamiliale
C. Fossat, CHU Marseille
MRD-CMF à l’entrée - Moelle
MRD-CMF =30%
C. Fossat, CHU Marseille
MRD-CMF Pré Greffe - Moelle
25/08/05
MRD-CMF =0.35%
C. Fossat, CHU Marseille
MRD-CMF M6 Post greffe - Moelle
MRD-CMF <0.01%
C. Fossat, CHU Marseille
MRD-CMF M10 Post greffe - Moelle
MRD-CMF =0.7%
C. Fossat, CHU Marseille
MRD-CMF M12 Post greffe - Moelle
MRD-CMF = 5.2%
C. Fossat, CHU Marseille
MRD-CMF M14 Post greffe - Moelle
MRD-CMF = 16%
Rechute
C. Fossat, CHU Marseille
Survie sans rechute LAL : MRD/CMF moelle J21
<10-3
1,0
10-1< <10-2
,8
,6
> 10-1
,4
,2
0,0
0
12
24
36
48
60
p = 0.03
Temps (mois)
C. Fossat, CHU Marseille
LAL : suivi des patients par IG-TCR
Rearrangement Ig-TCR : existence d’un rearrangement monoclonal
spécifique dans plus de 95 % des LAL
Identification par séquençage au diagnostic
puis PCR spécifique pour le suivi de la maldie résiduelle
D’après E. Delabesse et al;, Transfusion clin et bio,10,2003
E Delabesse, CHU Toulouse
E Delabesse, CHU Toulouse
E Delabesse, CHU Toulouse
E Delabesse, CHU Toulouse
E Delabesse, CHU Toulouse
E Delabesse, CHU Toulouse
Bilan cytogénétique, immunophénotypique et moléculaire
au diagnostic (1)
Anomalies cytogénétiques et/ou moléculaires acquises présentes
dans toutes les hémopathies malignes
Valeur diagnostique des anomalies de type primaire (exemple du Ph)
La majorité de ces anomalies a une valeur pronostique indépendante :
anomalies de type primaire : TEL-AML1 versus BCR-ABL dans LAL
anomalies de type secondaire : ACA dans LMC et LAL Ph, deletion Ikaros
dans les LAL
Prise en compte dans les protocoles thérapeutiques ( décision d’
intensification , allogreffe dans les LAL, …)
Bilan cytogénétique, immunophénotypique et moléculaire
au diagnostic (2)
Marqueurs de clonalité à établir au diagnostic pour le suivi des
patients (maladie résiduelle ou MRD)
Suivi cytogénétique : LMC
Suivi moléculaire : LMC et LA (leucémies aigues)
Suivi par CMF : LA
Complémentarité des techniques :
Analyse globale du génome :
caryotype (résolution 10 000kb)
Analyses ciblées :
FISH (resolution : 50 à 100kb) ,
PCR (transcrits chimériques) ,
séquençage des gènes d’Ig et TCR dans LAL
Suspicion d’hémopathie maligne :
signes cliniques et biologiques diversement associés
Signes d’insuffisance médullaire :
Anémie
Syndrome infectieux
Syndrome hémorragique
Signes tumoraux :
douleurs osseuses
splénomégalie
adénomégalie
hépatomégalie
Hémogramme
(NFS avec réticulocytes)
Anémie arégénérative
Neutropénie
Thrombopénie
Hyperleucocytose
( si blastes circulants ou
si myélémie)
Suspicion d’hémopathie maligne :
exploration de la moelle osseuse
•
Myélogramme (frottis)
•
Immunophénotypage (EDTA)
•
Cytogénétique (Héparine)
Caryotype, FISH
•
Biologie moléculaire (EDTA)
transcrits anormaux , mutations , …