interactions acide folique-vitamine b12-méthionine

Transcription

AURELIE PREYNAT
INTERACTIONS ACIDE FOLIQUE-VITAMINE B12MÉTHIONINE : EFFETS SUR LE MÉTABOLISME
HÉPATIQUE ET LA PRODUCTIVITÉ DES VACHES
LAITIÈRES
Thèse de doctorat présentée
à la Faculté des études supérieures de l’Université Laval
dans le cadre du programme de doctorat en Sciences animales
pour l’obtention du grade de Philosophiae Doctor (Ph.D.)
DÉPARTEMENT DES SCIENCES ANIMALES
FACULTÉ DES SCIENCES DE L’AGRICULTURE ET DE L’ALIMENTATION
UNIVERSITÉ LAVAL
QUÉBEC
2009
© Aurélie Preynat, 2009
II
A Matt,
A
mes parents,
III
RÉSUMÉ
Le but du présent travail était de déterminer si les effets d’une
supplémentation en acide folique sur les performances de lactation étaient dus à une
amélioration de la méthylnéogénèse et si l’apport en vitamine B12 pouvait interférer
avec cette voie métabolique. Dans cette éventualité, la supplémentation en
méthionine, une importante source de groupements méthyles préformés, devrait
réduire les besoins en ces vitamines. Soixante vaches multipares recevaient soit une
alimentation calculée pour couvrir 76% des besoins en méthionine (M-) soit la même
alimentation supplémentée avec 18g de méthionine protégée de la dégradation
ruminale (M+). À l’intérieur de chaque niveau de méthionine, les vaches recevaient
soit aucun supplément vitaminique (B9-B12-), soit des injections intramusculaires
hebdomadaires de 160mg d’acide folique seules (B9+B12-) ou combinées avec 10mg
de vitamine B12 (B9+B12+), de 3 semaines avant jusqu’à 16 semaines après le vêlage.
À 12 semaines de lactation, des cinétiques de glucose et de méthionine ont été
mesurées par dilution d’isotopes en infusant du D-[U13-C]glucose, [13C]NaHCO3 et de
la L-[1-13C, 2H3]méthionine à 24 vaches des traitements M-B9-B12-, M-B9+B12+, M+
B9-B12- et M+B9+B12+. Des échantillons de lait, de sang et de foie ont été collectés
pour mesurer les performances de lactation, différents métabolites et l’expression
génique d’enzymes clés du métabolisme énergétique et du cycle des méthylations.
Parallèlement à une augmentation des concentrations en folates et en vitamine B12
dans le lait, le plasma et le foie, l’administration conjointe de ces vitamines
augmentait la production laitière. Les suppléments de méthionine ont modifié
l’abondance en ARNm d’enzymes clés du cycle des méthylations alors que la
supplémentation en acide folique diminuait les concentrations plasmatiques
d'homocystéine sans effet sur les performances des animaux. Le supplément d’acide
folique et de vitamine B12 augmentait les flux corporels de glucose d’une amplitude
quantitativement similaire à l’augmentation du rendement en lactose ainsi que
l’expression du gène de la méthylmalonyl-CoA mutase, une enzyme essentielle pour
l’entrée du propionate dans le cycle de Krebs. Les effets du supplément d'acide
folique et vitamine B12 sur les performances de lactation étaient probablement dus à
IV
une augmentation de l’efficacité du métabolisme du glucose plutôt qu’à un effet sur la
méthylnéogénèse.
Mots-clés : vache laitière, acide folique, vitamine B12, méthionine protégée de la
dégradation ruminale
V
ABSTRACT
The aim of the present study was to determine if the effects of supplementary
folic acid on lactational performance were due to improved methylneogenesis and if
the supply in vitamin B12 could interfere with this metabolic pathway. In this
eventuality, supplementary methionine, a major source of preformed methyl groups,
should reduce the requirement for these vitamins. Sixty multiparous cows were fed
either a diet calculated to supply 76% of methionine requirement (M-) or the same
diet supplemented with 18 g of rumen-protected methionine (M+). Within each level
of methionine, cows received either no vitamin supplement (B9-B12-), weekly
intramuscular injections of 160 mg of folic acid alone (B9+B12-) or combined with 10
mg of vitamin B12 (B9+B12+), from 3 wk before to 16 wk after calving. At 12 week of
lactation, glucose and methionine kinetics were measured by isotope dilution using
infusions of D-[U13C]glucose, [13C]NaHCO3 and L-[1-13C, 2H3]methionine on 24
cows in treatments M-B9-B12-, M-B9+B12+, M+ B9-B12- et M+B9+B12+. Milk, blood
and liver samples were collected to measure lactational performance, different
metabolites and gene expression of key enzymes of energy metabolism and
methylation cycle. The results showed that, in parallel with an increase in folates and
vitamin B12 concentrations in milk, plasma and liver, administration of folic acid and
vitamin B12 together increased milk production. The supplements of methionine
affected methylation cycle by acting on mRNA abundance of key enzymes of this
cycle whereas supplementary folic acid decreased plasma concentrations of
homocysteine without any effect on animal performance. Intramuscular injections of
folic acid and vitamin B12 increased whole body flux of glucose with a similar
quantitative magnitude as the observed increment in milk lactose yield. Vitamin
supplements increased also gene expression of the methylmalonyl-CoA mutase, an
essential enzyme for the entry of propionate in the Krebs cycle. These results indicate
that the effects of the combined supplements of folic acid and vitamin B12 on
lactational performance are probably due to an improved efficiency of glucose
metabolism rather than an effect on methylneogenesis.
Key words: dairy cow, folic acid, vitamin B12, rumen-protected methionine
VI
AVANT-PROPOS
Je
tiens à exprimer mes plus sincères remerciements à
Madame Christiane Girard qui m’a accueillie au sein de
son équipe et encadrée durant ces années. Elle a su faire
preuve de disponibilité et d’une profonde gentillesse au
quotidien, et sa culture scientifique a permis de
répondre à mes nombreuses questions. Je lui suis
profondément reconnaissante pour la formation à la
recherche qu’elle m’a apportée, sa bonne humeur, la
confiance qu’elle m’a accordée et surtout son soutien et
ces encouragements constants qui m’ont permis de réaliser
cette thèse. Merci infiniment…
Je tiens à remercier sincèrement les membres du jury de
cette thèse :
Professeur Michel Lefrançois qui me fait l’honneur de
présider ce jury,
Docteurs Mesdames Carole Thivierge, Antonella Baldi et
Christiane Girard ainsi qu’aux docteurs Messieurs
Benoît Graulet et Jean Bernier qui ont acceptés de
participer à ce jury,
Je leur suis très reconnaissante pour le temps et
l’énergie consacrés à l’évaluation de ce travail.
J’adresse aussi mes sincères remerciements à tous les coauteurs impliqués dans la réalisation de cette thèse :
A Hélène Lapierre, merci beaucoup de m’avoir donné
l’opportunité de travailler avec toi, pour le temps que
tu m’as consacré et nos nombreuses discussions.
A Carole Thivierge, Marie-France Palin et Jacques
Matte, pour le temps que vous avez consacré à chaque
réunion, pour vos conseils et pour avoir répondu à mes
questions.
A André Desrochers.
Je remercie aussi tout le personnel du centre de
recherche sur le bovin laitier et le porc de Lennoxville,
scientifiques, personnels techniques des laboratoires et
de
l’étable
ainsi
que
l’administration
pour
leur
gentillesse et tous les bons moments agréables passés
ensemble.
VII
Un merci particulier aux personnes du laboratoire 218 :
A Chrystiane Plante et Véronique Roy, qui m’ont
beaucoup aidée pour les nombreux dosages et les diverses
mises au point grâce à leur efficacité et leur rigueur
scientifique,
A Michelle Guillette et Isabelle Audet, pour leur bonne
humeur
quotidienne
et
leurs
précieux
conseils
artistiques,
A Debora Santschi et Alexandre Castellano, avec qui
nous avons partagés de bons moments au café, les midis…
Enfin un immense merci à mes parents, qui n’ont cessé de
m’encourager et valoriser mon travail durant toutes ces
années et à mon frère et Bryonie, qui m’ont aidée dans la
relecture de mes articles.
Et puis, merci à Matt pour m’avoir soutenue, pour ta
patience et pour chaque jour passé avec toi…
VIII
SOMMAIRE
RÉSUMÉ ..............................................................................................................................III
ABSTRACT ...........................................................................................................................V
AVANT-PROPOS ................................................................................................................. VI
SOMMAIRE .......................................................................................................................VIII
TABLE DES ILLUSTRATIONS............................................................................................. XIV
LISTE DES ABRÉVIATIONS .............................................................................................XVIII
CHAPITRE I : INTRODUCTION
1
CHAPITRE II : REVUE DES TRAVAUX ANTÈRIEURS
6
II-1
LE GLUCOSE...................................................................................................................7
II-1.1 Absorption intestinale ..........................................................................................7
II-1.2 La néoglucogenèse:...............................................................................................7
II-1.2.1 Réactions enzymatiques................................................................................8
II-1.2.2 Contrôle à court et moyen termes .................................................................8
II-1.2.3 Les substrats néoglucoformateurs...............................................................10
II-1.2.4 Adaptation du métabolisme lors de la période péripartum .........................13
II-1.2.5 Méthodologies de mesure de la néoglucogenèse........................................14
II-1.2.5.1 Méthodes in vitro et in vivo ................................................................... 14
II-1.2.5.2 Définition des concepts pour les mesures de métabolisme.................... 15
II-1.2.5.3 Les différents types d’infusion .............................................................. 16
II-1.2.5.4 Choix de la méthode d’analyse et de l’isotope ...................................... 17
II-1.3 Utilisation du glucose : ......................................................................................18
II-1.3.1 Source de glycérol et d’énergie ..................................................................19
II-1.3.2 La synthèse de lactose.................................................................................19
II-2 LES LIPIDES .................................................................................................................20
II-2.1 Métabolisme des lipides......................................................................................20
II-2.1.1 Origine des acides gras ................................................................................20
II-2.1.1.1 La synthèse de novo............................................................................... 21
II-2.1.1.2 Les lipoprotéines.................................................................................... 22
II-2.1.2 La synthèse et l’hydrolyse des triglycérides ...............................................24
II-2.1.3 L’importance du glucose ............................................................................26
IX
......................................................................................................................................27
II-2.2 Pathologies liées au métabolisme des lipides ....................................................27
II-2.2.1 La cétogenèse..............................................................................................28
II-2.2.2 La stéatose hépatique ..................................................................................28
II-3 LES PROTÉINES.............................................................................................................30
II-3.1 Métabolisme des acides aminés..........................................................................30
II-3.1.1 Rôles des acides aminés...............................................................................30
..................................................................................................................................32
II-3.1.2 Contrôle du métabolisme des acides aminés au niveau des tissus
périphériques.............................................................................................................32
II-3.2 « Turnover » protéique ......................................................................................33
II-3.2.1 Une plasticité métabolique...........................................................................33
II-3.2.2 Équilibre entre synthèse et dégradation protéique.......................................35
II-3.2.3 Mesure du dynamisme protéique................................................................36
II-4 VITAMINES DU COMPLEXE B ........................................................................................38
II-4.1 Synthèse dans le rumen et absorption intestinale ...............................................38
II-4.2 Implication dans les grandes voies métaboliques ...............................................38
II-4.3 Définition des besoins.........................................................................................40
II-5 ACIDE FOLIQUE, VITAMINE B12 ET MÉTHIONINE ...........................................................42
II-5.1 Acide folique.......................................................................................................42
II-5.1.1 Structure et définition ..................................................................................42
II-5.1.2 Données nutritionnelles : sources alimentaires et besoins...........................44
II-5.1.3 Biodisponibilité et métabolisme : absorption intestinale,
distribution, transport, stockage et excrétion ............................................................44
II-5.1.3.1 Absorption intestinale (Figure 15) :........................................................ 44
II-5.1.3.2 Folates sanguins (Figure 15) :................................................................. 45
II-5.1.3.3 Transport et distribution tissulaire (Figure 15) :..................................... 45
II-5.1.3.4 Excrétion :............................................................................................... 46
II-5.1.4 Métabolisme cellulaire.................................................................................46
II-5.2 Vitamine B12 .......................................................................................................51
II-5.2.2 Données nutritionnelles : sources alimentaires, besoins, carences..............52
II-5.2.3 Métabolisme : absorption intestinale, distribution, transport,
stockage et excrétion.................................................................................................53
II-5.2.3.1 Absorption intestinale ............................................................................. 53
II-5.2.3.2 Transport sanguin ................................................................................... 55
II-5.2.3.3 Entrée et distribution tissulaire ............................................................... 55
II-5.2.3.4 Excrétion................................................................................................. 57
II-5.2.4 Métabolisme cellulaire.................................................................................57
II-5.3 Méthionine ..........................................................................................................58
II-5.3.2 Méthionine dans la synthèse protéique........................................................59
II-5.3.3 S-adénosylméthionine et les réactions de méthylation ................................60
X
II-5.3.4 Le métabolisme de la méthionine ................................................................61
II-5.3.4.1 Les voies métaboliques........................................................................... 61
II-5.3.4.2 Les régulations........................................................................................ 62
II-6 CAS PARTICULIER DE LA VACHE LAITIÈRE ....................................................................64
II-6.1 Caractéristiques du cycle des méthylations ........................................................64
II-6.2 Effet d’apports en acide folique et vitamine B12.................................................65
II-7 HYPOTHÈSES DE TRAVAIL ET OBJECTIFS ......................................................................69
II-8 RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES .................................................................................71
CHAPITRE III : LACTATIONAL PERFORMANCE OF DAIRY COWS
ACCORDING TO FOLIC ACID AND VITAMIN B12 SUPPLY AND
METHIONINE PROVISION
83
III-1 RÉSUMÉ ......................................................................................................................84
III-2 ABSTRACT ..................................................................................................................85
III-3 INTRODUCTION ...........................................................................................................86
III-4 MATERIALS AND METHODS .........................................................................................87
III-4.1 Cows and treatments..........................................................................................87
III-4.2 Sampling procedures .........................................................................................88
III-4.2.1 Feed ............................................................................................................88
III-4.2.2 Body weight................................................................................................88
III-4.2.3 Milk ............................................................................................................89
III-4.2.4 Blood ..........................................................................................................89
III-4.3 Laboratory analyses...........................................................................................89
III-4.3.1 Folates and vitamin B12 ..............................................................................89
III-4.3.2 Plasma biotin and vitamin B6 .....................................................................90
III-4.3.3 Plasma urea, NEFA, glucose and BHB ......................................................90
III-4.3.4 Total homocysteine, total cysteine and methionine in plasma ...................90
III-4.3.5 Amino acids in plasma ..............................................................................91
III-4.4 Statistical analyses.............................................................................................91
III-5 RESULTS .....................................................................................................................91
III-4.5.1 Lactational performance .............................................................................91
III-4.5.2 Plasma variables .........................................................................................93
III-4.5.2.1 B-vitamins ............................................................................................. 93
III-4.5.2.2 Glucose, NEFA, BHBA and Urea......................................................... 94
III-4.5.2.3 Amino acids........................................................................................... 94
XI
III-6 DISCUSSION ................................................................................................................95
III-7 CONCLUSION ..............................................................................................................98
III-8 ACKNOWLEDGMENTS .................................................................................................99
III-9 REFERENCES .............................................................................................................109
CHAPITRE IV : EFFECTS OF SUPPLEMENTS OF FOLIC ACID,
VITAMIN
B12 AND
RUMEN-PROTECTED
METHIONINE
ON
WHOLE BODY METABOLISM OF METHIONINE AND GLUCOSE IN
LACTATING DAIRY COWS
112
IV-1 RÉSUMÉ ...................................................................................................................113
IV-2 ABSTRACT ................................................................................................................114
IV-3 INTRODUCTION .........................................................................................................115
IV-4 MATERIALS AND METHODS ......................................................................................116
IV-4.1 Cows and Treatments ......................................................................................116
IV-4.2 Forage and milk analyses ................................................................................117
IV-4.3 Blood sampling procedure ..............................................................................118
IV-4.4 Blood plasma analyses ....................................................................................119
IV-4.4.1 Folates and vitamin B12 ............................................................................119
IV-4.4.2 Urea, NEFA, Glucose and BHBA............................................................119
IV-4.4.3 Amino acids..............................................................................................119
IV-4.5 Kinetic measurements .....................................................................................120
IV-4.5.1 Infusion and blood sampling ....................................................................120
IV-4.5.2 Isotopic enrichment analyses ...................................................................121
IV-4.5.3 Calculations..............................................................................................122
IV-4.6 Statistical analyses...........................................................................................124
IV-5 RESULTS ...................................................................................................................124
IV-5.1 Production data................................................................................................124
IV-5.2 Plasma variables..............................................................................................125
IV-5.3 Whole body kinetics........................................................................................126
IV-6 DISCUSSION ..............................................................................................................127
IV-6.1 Glucose kinetics ..............................................................................................128
IV-6.2 Methionine kinetics .........................................................................................130
IV-7 CONCLUSION ............................................................................................................132
XII
IV-8 ACKNOWLEDGMENTS ...............................................................................................133
IV-9 REFERENCES .............................................................................................................144
CHAPITRE V : HEPATIC METABOLISM OF DAIRY COWS
ACCORDING TO FOLIC ACID AND VITAMIN B12 SUPPLY AND
METHIONINE PROVISION.
148
V-1 RÉSUMÉ .....................................................................................................................149
V-2 ABSTRACT .................................................................................................................150
V-3 INTRODUCTION ..........................................................................................................151
V-4 MATERIALS AND METHODS ........................................................................................152
V-4.1 Animals, diets and experimental design ...........................................................152
V-4.2 Sampling procedure..........................................................................................153
V-4.3 Laboratory analyses..........................................................................................153
V-4.3.1 Folates and vitamin B12 .............................................................................153
V-4.3.2 Biotin .........................................................................................................153
V-4.3.3 Lipid fractions (cholesterol ester, triglycerides, diglycerides,
cholesterol, phosphatidylethanolamine and phosphatidylcholine) in liver.............154
V-4.3.4 RNA extraction and cDNA synthesis........................................................154
V-4.3.5 Cloning and Sequencing of 5,10-Methylene-tetrahydrofolate
Reductase, Betaïne Homocysteine Methyltransferase and Methionine
Synthase Reductase Bovine Genes .........................................................................155
V-4.3.6 5’- and 3’- RACE of MTHFR, BHMT, MTRR and Methionine
Synthase Bovine Genes. .........................................................................................156
V-4.3.7 Selected bovine genes mRNA levels.........................................................156
V-4.3.8 Liver incubations .......................................................................................157
V-4.4 Statistical analyses............................................................................................159
V-5 RESULTS ....................................................................................................................159
V-5.1 B-vitamins ........................................................................................................159
V-5.2 Lipids ................................................................................................................160
V-5.3 Gene expression of BHMT, GNMT, MS, MTHFR, MTP, MTRR,
MMCoA and PEMT ...................................................................................................160
V-5.4 Gluconeogenesis and protein synthesis ............................................................161
V-6 DISCUSSION ...............................................................................................................162
V-6.1 B-vitamin status................................................................................................162
V-6.2 The methylation cycle ......................................................................................162
V-6.3 Gluconeogenesis, energy and protein metabolism ...........................................166
XIII
V-7 CONCLUSION .............................................................................................................169
V-8 ACKNOWLEDGMENTS ................................................................................................170
V-9 REFERENCES ..............................................................................................................180
CHAPITRE VI : DISCUSSION ET CONCLUSION GÉNÉRALE
184
VI-1 DISCUSSION ..............................................................................................................185
VI-2 CONCLUSION GÉNÉRALE ..........................................................................................187
VI-3 RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES .............................................................................187
XIV
TABLE DES ILLUSTRATIONS
Les figures :
Figure 1 : Évolution du rendement en lait, de la prise alimentaire et de l’énergie
nette de lactation de 1980 à 2003 (Adapté d’Eastridge, 2006).
3
Figure 2 : Production laitière, ingestion nette d’énergie et bilan énergétique des
vaches laitières pendant la lactation (Adapté de Bauman et Currie, 1980).
3
Figure 3 : Réactions enzymatiques de la néoglucogenèse et de la glycolyse
(Adapté des notes de cours « Nutrition et physiologie des ruminants » de
Yvan Chouinard).
9
Figure 4 : Voie métabolique empruntée par le propionate pour permettre la
synthèse de glucose via la néoglucogenèse (Tiré de Voet et Voet, 1998).
11
Figure 5 : Utilisation du glucose dans la voie des pentoses-phosphates permettant
de fournir du NADPH (Tiré de Voet et Voet, 1998).
19
Figure 6 : Utilisation du glucose dans la glande mammaire bovine (Adapté des
valeurs tirées de Chaiyabutr et al., 1980).
20
Figure 7 : Les mécanismes de la lipogenèse (Voet et Voet, 1998)
23
Figure 8 : Métabolisme hépatique des acides gras chez les ruminants (Adapté de
Vernon, 2005).
24
Figure 9 : Représention schématique du système carnitine permettant le transfert
des acides gras à longue chaîne dans la matrice mitochondriale (Tiré de
Zammit, 1990).
25
Figure 10 : Étapes clés de l’utilisation du glucose dans la synthèse des acides gras
(Tiré de Neville et Picciano, 1997).
27
Figure 11 : Intermédiaires glucogéniques et cétogéniques produits suite au
catabolisme des acides aminés dans le foie (Tiré de Voet et Voet, 1998).
32
Figure 12 : Pourcentage de contribution de différents tissus à la masse protéique,
la synthèse protéique et à l’utilisation nette d’oxygène indicateur de
l’énergie utilisée au niveau corporel chez le bouvillon (Adapté de Lobley,
2003).
35
Figure 13 : Fonctions métaboliques des vitamines B (Adapté de Le Grusse et
Watier, 1993).
40
XV
Figure 14 : Structure chimique de l’acide folique (ou acide ptéroylglutamique)
43
Figure 15 : Absorption, métabolisme, stockage et excrétion des folates.
47
Figure 16 : Métabolisme des unités monocarbonées dépendant de l’acide folique
(Adapté de Lucock, 2000).
50
Figure 17 : Structure chimique de la vitamine B12.
52
Figure 18 : Mécanismes d’absorption de la vitamine B12 (Tiré de Le Grusse et
Watier, 1993).
54
Figure 19 : Implication des protéines de transport de la vitamine B12 dans les
mécanismes d’absorption intestinale et d’entrée de la vitamine dans les
cellules (Adapté de Seetharam et al., 1999).
56
Figure 20 : Métabolisme cellulaire de la vitamine B12 (Adapté de Le Grusse et
Watier, 1993).
58
Figure 21 : Structures chimiques de la méthionine et de son dérivé : la SAdénosylméthionine.
59
Figure 22 : Le métabolisme de la méthionine (d’après Brosnan et al., 2007).
65
Figure 23 : Voies métaboliques impliquant l’acide folique et la vitamine B12 et
leurs régulations.
67
Figure 24. Effects of intramuscular injections of folic acid (B9) and vitamin B12
(B12) given to dairy cows from 3 wk before calving to 16 wk of lactation on
milk production.
106
milk protein yields.
107
plasma concentrations of folates.
108
Figure 27. A schematic pathway of L-[1-13C,2H3]methionine with its
components: transmethylation (TM), remethylation (RM) and
transsulfuration (TS) (adapted from Mercier et al., 2006).
142
Figure 28. Effects of dietary supplements of rumen-protected methionine (M)
and intramuscular injections of folic acid (B9) and vitamin B12 (B12) given to
dairy cows from 3 wk before calving to 12 wk of lactation on plasma
concentration of cysteine and methionine oxidation on wk 12 of lactation.
143
XVI
Figure 29. Folate and vitamin B12-dependent pathways and methylation cycle.
176
dairy cows from 3 wk before calving to 16 wk of lactation on liver
concentrations of folates.
178
dairy cows from 3 wk before calving to 16 wk of lactation on GNMT
relative mRNA abundance.
179
Les tableaux :
Tableau 1 : Bilan des apports (synthèse ruminale et alimentation) et besoins
corporels estimés (tissus et production laitière) en vitamines B chez une
vache laitière de 650 kg produisant 35 kg de lait par jour (Tiré de NRC,
2001).
41
Tableau 2 : Principaux folates ayant une activité biologique (selon Bollheimer et
al., 2005).
43
Tableau 3. Ingredients and nutrient composition of the diets fed to dairy cows
100
Tableau 4. Effects of dietary supplements of rumen-protected Met (M) and
intramuscular injections of folic acid (B9) and vitamin B12 (B12) given to
dairy cows from 3 wk before calving to 16 wk of lactation on dry matter
intake, milk production and composition.
102
dairy cows from 3 wk before calving to 16 wk of lactation on plasma
concentrations of some B-vitamins, glucose, urea, NEFA, BHBA and AA.
104
Tableau 6. Ingredients and nutrient composition of the diets fed to dairy cows.
134
Tableau 7. Binary gradient mobile phase composition used to analyze plasma AA
by HPLC.
136
Tableau 8. Effects of dietary supplements of rumen-protected methionine (M)
dairy cows on production variables at 12 wk of lactation.
137
XVII
dairy cows on plasma variables at 12 wk of lactation.
138
dairy cows on whole body glucose kinetics at 12 wk of lactation.
140
dairy cows on whole body Met kinetics at 12 wk of lactation.
141
Tableau 12. Primer sequences and optimal conditions for PCR of bovine selected
genes.
171
Tableau 13. Effects of dietary supplements of rumen-protected methionine (M)
dairy cows from 3 wk before calving to 16 wk of lactation on liver
concentrations of B vitamins, lipid fractions and relative mRNA abundance
of selected genes.
173
Tableau 14. In vitro estimation of the capacity of cow liver for gluconeogenesis
by the conversion of [2-14C]-propionate to glucose and protein synthesis by
incorporation of [35S]-cysteine according to Met (M), folic acid (B9) and
vitamin B12 (B12) supplements given from 3 wk before calving to 16 wk of
lactation.
175
XVIII
LISTE DES ABRÉVIATIONS
(FRANÇAISES ET ANGLAISES)
AA
ACP
ADF
AICAR
apABG
ape
Apo B
Amino acid(s)
Acyl carrier protein
Acid detergent fiber
Aminoimidazol-4-carboxamide ribonucléotide
Acétamidobenzoylglutamate
Atom pourcent excess
Apolipoprotein B
BCAA
BHBA
BHMT
B9-B12B9+B12B9+B12+
Branched-chain amino acid(s)
Beta-hydroxybutyrate
Bétaïne homocystéine méthyltransférase
Aucun supplément vitaminique
Injections intramusculaires d’acide folique seul
Injections intramusculaires d’acide folique et de vitamine B12
CH2
CH3
CP
CPT
Cys
Méthylène
Méthyle
Crude protein
Carnitine palmitoyltransférase
Cystéine
DHF
DMI
dTMP
dUTP
Dihydrofolate
Dry matter intake
Désoxythymidylate
Désoxyuridylate
EAA
Essential amino acid(s)
FADP
FBP
FMN
FO
Fatty acid binding protein
Folate binding protein
Flavine mononucléotide
Fractional rate of oxidation
GCPIV
GAMT
GAR
GC-MS
γGH
Gly
GNMT
GPAT
Glutamate carboxypeptidase IV
Guanidinoacetate N-méthyltransférase
Glycinamide ribonucléotide
Gaz chromatography-mass spectrometry
γ-glutamyl hydrolase
Glycine
Glycine N-méthyltransférase
Glycérol-3-phosphate déshydrogénase
XIX
Hcy
Homocystéine
IDL
IGF-1
ILR
IE
Intermediary density lipoprotein
Insulin-like growth factor-1
Irreversible loss rate
Isotopic enrichment
LDL
Low density lipoprotein
MM+
Met
MMCoA
MS
MTHFR
Pas de supplément de méthionine
Supplément alimentaire de méthionine
Méthionine
Méthylmalonyl-CoA mutase
Méthionine synthase
Méthylène tétrahydrofolate réductase
NADPH
NDF
NEAA
NEFA
Nicotinamide adénine dinucléotide phosphate
Neutral detergent fiber
Non essential amino acids
Non-esterified fatty acids
PABA
pABG(n)
PC
PE
PEMT
PEPCK
Acide p-aminobenzoïque
Para-aminobenzoylpoly(ou mono)glutamate
Phosphatidylcholine
Phosphatidyléthanolamine
Phosphatidyléthanolamine méthyltransférase
Phosphoénolpyruvate carboxykinase
RFC
RM
RPM
Reduced folate carrier
Reméthylation
Rumen-protected methionine
SAH
SAM
Ser
SHMT
S-adénosylhomocystéine
S-adénosylméthionine
Sérine
Sérine hydroxyméthyltransférase
TAA
THF
TM
TMR
TS
Total amino acid(s)
Tétrahydrofolate
Transméthylation
Total mixed ration
Transsulfuration
U-glucose
Glucose uniformément marqué
VLDL
Very low density lipoprotein
XX
5-MTHF
5-méthyl-tétrahydrofolate
CHAPITRE I
INTRODUCTION
2
Il y a 100 ans, les vaches produisaient assez de lait pour nourrir un veau, c’est-à-dire un
maximum de 2 à 10 litres par jour. Aujourd’hui, le nombre et la demande des consommateurs
ayant augmenté, la recherche de rentabilité et de la diminution de la charge de travail des
producteurs ont poussé les efforts en direction de la sélection génétique pour augmenter la
production par vache. Ainsi une vache laitière moderne produit beaucoup plus suite à une
sélection génétique et une modification des pratiques d’élevage (alimentation et gestion).
Veerkamp et al. (1998) rapportent que cette sélection génétique pour l’amélioration du rendement
en lait est corrélée à une augmentation de la prise alimentaire (coefficient de corrélation = 0.46 à
0,65). Cependant, ces auteurs soulignent que les corrélations génétiques entre le bilan énergétique
et le rendement en lait sont toujours très négatives (-0,70). Ainsi, l’amélioration du potentiel
génétique accentue le problème de déficit énergétique rencontré pendant la période critique
entourant le vêlage. Avec l’augmentation des performances des vaches laitières (+ 35% pour la
production laitière en 23 ans) et une prise alimentaire limitée (augmentation de seulement 19% de
1980 à 2003) (Figure 1), la densité énergétique des rations est augmentée afin de soutenir cette
hausse de production (l’énergie nette de lactation d’une ration a évolué, en moyenne, de 1,23 à
1,36 Mcal/kg de matière sèche ingérée) (Eastridge, 2006). De plus, de nombreuses études ces
dernières années ont cherché à optimiser la qualité de l’alimentation en équilibrant les rations
entre les fractions de protéines non dégradables et dégradables au rumen. Une attention
particulière a également été portée sur les sources de protéines afin, si besoin est, d’enrichir
l’alimentation en acides aminés essentiels, particulièrement, la méthionine et la lysine.
Même si la prise alimentaire augmente en début de lactation, elle atteint son maximum
après le pic de la production de lait. Face à l’incapacité d’ajuster assez vite leur métabolisme pour
subvenir à leurs besoins, les vaches se retrouvent donc en bilan d’énergie négatif pendant les
premiers mois après la parturition (Figure 2). Le bilan énergétique peut-être défini comme la
différence entre l’entrée d’énergie nette moins la dépense de cette énergie nette pour l’entretien et
la production laitière (Van Knelgsel et al., 2005). En d’autres termes, les animaux ne mangent pas
suffisamment pour pallier à cette demande énergétique, caractéristique des 15 semaines qui
suivent le vêlage (Coppock et al., 1974) alors que le pic de lactation se produit 4 à 8 semaines
après le vêlage.
3
Prise alimentaire, kg/jour
Energie nette de lactation, Mcal/jour
Rendement en lait,
kg/lactation
Années
Figure 1 : Évolution du rendement en lait ( ), de la prise alimentaire ( ) et de l’énergie nette de
lactation ( ) de 1980 à 2003 (Adapté d’Eastridge, 2006).
kg/jour
Mcal/jour
Mcal/jour
40
30
Production laitière
Ingestion nette d’énergie
Bilan énergétique
20
10
0
-10
0
4
8 12 16 20 24 28 32 36 40 44
Semaines postpartum
Figure 2 : Production laitière, ingestion nette d’énergie et bilan énergétique des vaches laitières
pendant la lactation (Adapté de Bauman et Currie, 1980).
4
Durant le premier mois de lactation, un tiers des besoins énergétiques de la vache sont
fournis par les réserves adipeuses : pour chaque kilo de poids vif mobilisé, l’énergie disponible
permet la production de 7 kg de lait (Moe et al., 1971). Drackley et al. (2001) font également état
d’une activité métabolique du tissu hépatique doublée après la parturition qui accentuerait les
besoins énergétiques.
Même si les changements dans la condition corporelle durant la lactation sont normaux
chez les mammifères (Robinson, 1986), l’adaptation de leur métabolisme général et l’utilisation
de leurs réserves en début de lactation rendent les vaches plus susceptibles aux diverses maladies
métaboliques et à des problèmes de reproduction et fertilité (Butler et Smith, 1989). Des études
ont mis en évidence plusieurs relations significatives entre le bilan énergétique négatif, dû aux
rendements en lait élevés, et diverses pathologies : fourbures, problèmes de pattes, mammites et
désordres métaboliques tels que acétonémie, acidose ruminale ou déplacement de l’abomasum
(Collard et al., 2000).
Bauman et Currie (1980) insistent sur l’importance des lipides corporels pour améliorer
l’efficacité d’adaptation du métabolisme énergétique des ruminants pendant cette période où les
apports sont faibles et les exigences de production élevées. Par contre, ils soulignent également le
rôle clé des nutriments suivants : glucose, protéines et minéraux. L’implication des vitamines,
notamment des vitamines B9 et B12, dans le métabolisme énergétique se révèle aussi essentielle
car une supplémentation permettrait d’augmenter la production laitière (d’environ 10%) et
améliorerait l’efficacité d’utilisation des nutriments chez les vaches multipares (Girard et Matte,
1998; Girard et Matte, 2005a; Girard et al., 2005).
Face aux nouvelles exigences de production, les besoins en nutriments majeurs des vaches
laitières ont donc été révisés au cours des années (NRC, 1944 à 2001) tandis que ceux pour les
nutriments mineurs, tels que les vitamines, n’ont été que peu actualisés. Dans sa revue, Eastridge
(2006) rapporte que les principales recherches sur le rôle bénéfique des vitamines chez la vache
laitière depuis les années 1980 portent, pour la majorité, sur les vitamines E et D pour leur
implication dans les métabolismes du sélénium et du calcium respectivement et leur relation avec
les mammites (pour la vitamine E) et la fièvre du lait (pour la vitamine D). Les bénéfices d’une
supplémentation en bêta-carotène dans les phénomènes de reproduction ont été mitigés. Et enfin,
les études sur les vitamines hydrosolubles ont mis l’accent surtout sur la niacine, qui préviendrait
5
l’acétonémie, et la biotine, qui améliorerait la santé des sabots et la production laitière (Majee et
al., 2003). Bien que ne répondant pas à la définition stricte des vitamines, la choline est
considérée comme une quasi-vitamine (Comb, 1998). D’ailleurs, de nombreux travaux, utilisant
de la choline protégée de la dégradation ruminale, rapportent qu’une supplémentation pourrait
augmenter la production laitière, améliorer le transport des lipides et réduire l’incidence de
acétonémie (Piepenbrink et Overton, 2003; Baldi and Pinotti, 2006; Janovick Guretzky et al.,
2006). Mais peu de recherches se sont intéressées aux besoins en acide folique et vitamine B12
pour les vaches laitières hautes productrices.
Le but de la présente thèse a été d’apporter de nouvelles informations sur les effets, d’une
part, d’un apport en vitamine B9 sur les performances de lactation chez la vache laitière en début
de lactation et, d’autre part, d’identifier les voies métaboliques impliquées en modifiant les
apports en vitamine B12 et méthionine.
La revue bibliographique présentée dans ce rapport décrit les grandes voies des
métabolismes du glucose, des lipides et des protéines pouvant être régulées directement ou non
par l’acide folique et la vitamine B12. Elle souligne aussi les interactions entre ces vitamines B et
la méthionine chez la vache laitière. Le protocole d’étude suivi au cours de cette thèse ainsi que
les résultats obtenus sont présentés sous forme de trois publications. Enfin, les conclusions tirées
de ces travaux sont rassemblées sous la forme d’une discussion générale.
6
CHAPITRE II
REVUE DES TRAVAUX ANTÉRIEURS
7
II-1
LE GLUCOSE
II-1.1 Absorption intestinale
L’absorption du glucose est limitée chez les ruminants (moins de 10% des besoins). Ces
animaux doivent donc produire 90% du glucose qui leur est nécessaire via la néoglucogenèse au
niveau hépatique (Young, 1977).
En effet, seulement 20% de l’amidon atteint intact le duodénum où il va être absorbé
principalement sous forme de glucose (Nocek et Tamminga, 1991). Seulement 35% de la
disparition intestinale de l’amidon peut être expliquée par une absorption nette sous forme de
glucose (Kreikemeier et al., 1991). De plus, l’utilisation par les entérocytes d’environ 50% du
glucose absorbé comme source d’énergie (Britton et Krehbiel, 1993; Lozano et al., 2000)
contribue à restreindre la quantité de glucose apparaissant dans le sang portal. Par contre, selon
Judson et al. (1968), le pourcentage de glucose, synthétisé à partir du propionate ruminal,
diminuerait de 46 à 27% avec l’augmentation des proportions d’amidon alimentaire dans la
ration. Avec des rations riches en grains, une certaine quantité d’amidon, échappant à la
dégradation ruminale, se traduirait par une augmentation de l’absorption intestinale de glucose
qui, par conséquent, réduirait la néoglucogenèse hépatique à partir du propionate. Cette
observation a été confirmée plus récemment (Freetly et Klindt, 1996) et serait régulée suite à une
sécrétion d’insuline (Eisemann et al., 1994) et due à des changements métaboliques induits par
une réorientation des précurseurs néoglucogéniques vers la synthèse des lipides (Thompson et al.,
1975).
II-1.2 La néoglucogenèse:
La néoglucogenèse consiste en une série de réactions biochimiques visant à la synthèse de
glucose à partir de composés non-glucidiques. Les substrats néoglucoformateurs les plus
importants sont le propionate, le lactate, le glycérol et certains acides aminés. La majeure partie
du glucose néoformé (85-90%) est synthétisée dans le foie et les 10-15% restants dans les reins.
Cette voie métabolique est très importante chez les ruminants car les glucides de l’alimentation
sont intensément dégradés par les microorganismes du rumen et leur taux d’absorption intestinal
est faible. Elle assure donc la production de 2 à 2,5 kg de glucose/jour (Danfaer et al., 1995).
8
II-1.2.1 Réactions enzymatiques
La voie principale de la néoglucogenèse est essentiellement l’inverse de la glycolyse sauf
au niveau de trois réactions de la glycolyse qui sont irréversibles : la glucokinase, la
phosphofructokinase et la pyruvate kinase. Pour contourner ces difficultés, la cellule hépatique va
donc faire appel à d’autres réactions thermodynamiquement plus favorables avec la coopération
des mitochondries. En effet, dans les mitochondries, une enzyme, la pyruvate carboxylase, peut,
en présence d’ATP, de CO2 et de biotine, carboxyler le pyruvate en oxaloacétate. Ce dernier va
soit sortir de la mitochondrie en étant réduit en malate, soit suivre le cycle de Krebs.
L’oxaloacétate cytosolique va être successivement transformé en phosphoénolpyruvate,
phosphoglycérate, glycéraldéhyde et fructose-1,6-bisphosphate par des enzymes communes aux
voies glycolytique et de la néoglucogenèse (réactions réversibles). A ce niveau la fructose-1,6bisphophatase, enzyme spécifique de la néoglucogenèse, catalyse la conversion du fructose-1,6bisphosphate en fructose-6-phosphate qui est ensuite isomérisé en glucose-6-phosphate. Enfin, la
déphosphorylation du glucose-6-phosphate en glucose fait intervenir une troisième enzyme
spécifique : glucose-6-phosphatase (Figure 3).
II-1.2.2 Contrôle à court et moyen termes
La glycolyse et la néoglucogenèse sont deux voies essentielles dans l’homéostasie de la
glycémie, il n’est donc pas étonnant que ces deux voies soient étroitement régulées de telle sorte
que l’une est inhibée lorsque l’autre est active et vice versa (Voet et Voet, 1998). Elles font donc
l’objet de régulations hormonales à court terme (biodisponibilité en substrat, effecteurs
allostériques et changement de l’état de phosphorylation) et à plus long terme (changement dans
l’expression des gènes codants pour les différents enzymes) (Pilkis et Claus, 1991).
9
Pi
Glucose
ATP
H2O
Glucose-6-P
ADP
Glucose-6-Phosphatase
Glucokinase
Fructose-6-P
Pi
Fructose-1,6-Bisphosphatase
ATP
Phosphofructokinase
Fructose
-1,6-BP
H2O
ADP
Glycéraldéhyde-3-P
NAD+
Dihydroxyacétone-P
NADH+H
NADH+H+
NAD+
Glycérol-3-P
ADP
Glycérokinase
ATP
1,3-bisphosphoglycérate
ADP
ATP
3-phosphoglycérate
Glycérol
2-phosphoglycérate
Phosphoénolpyruvate
carboxykinase
phosphoénolpyruvate
ADP
GTP
GDP+CO2
Pyruvate kinase
ATP
Pyruvate
NADH+H+ NAD
Oxaloacétate
NADH+H
Pyruvate
ATP + CO2
+
B8 / Mg+2
NAD+
NAD+
Malate
Lactate, acides amines (alanine)
+
NADH+H+
Oxaloacétate
CYTOSOL
Fumarate
Acétyl-CoA
Acides amines : aspartate
Acétyl-CoA
Cycle
de
Krebs
Malate
Acides aminés :
phénylalanine,
tyrosine
Pyruvate carboxylase
ADP + Pi
α-cétoglutarate
Succinyl-CoA
MITOCHONDRIE
Acides amines : glutamate
Propionate
Acides aminés : isoleucine,
méthionine, valine
Figure 3 : Réactions enzymatiques de la néoglucogenèse (à gauche et en rouge) et de la glycolyse
(à droite et en bleu). La flèche hachurée indiquant une activation de l’enzyme (Adapté des notes
de cours « Nutrition et physiologie des ruminants » de Yvan Chouinard).
10
Le contrôle hormonal de l’homéostasie du glucose a fait l’objet de nombreuses études
(Bassett, 1978; Trenkle, 1981; McDowell, 1983; Drackley et al., 2001) où il ressort que le rapport
insuline/glucagon joue un rôle primordial alors que les autres hormones, telles que l’hormone de
croissance, les catécholamines et les glucocorticoïdes, interviendraient indirectement en modulant
les concentrations d’insuline et de glucagon. Il est bien connu que ces hormones inhibent la
néoglucogenèse pour l’insuline alors que le glucagon a l’effet contraire en agissant sur la
transcription des gènes codants pour les enzymes impliquées dans ces phénomènes, en améliorant
la stabilité des messagers et/ou l’efficacité de traduction des ARNm (Lemaigre et Rousseau,
1994). Des études comparatives ont montré que l’activité des enzymes néoglucogéniques du foie
de ruminants répondaient différemment à celles mesurées chez les non-ruminants (Filsell et al.,
1969). Chez les ruminants, la régulation hormonale du métabolisme du glucose a été beaucoup
moins documentée que chez les monogastriques et se restreint à l’analyse de la pyruvate
carboxylase (PC) et de la phosphoénolpyruvate carboxykinase (PEPCK) (Taylor et al., 1971; She
et al., 1999; Greenfield et al., 2000; Williams et al., 2006). Globalement chez les bovins, il y
aurait peu d’adaptation de l’expression de ces enzymes à différentes conditions physiologiques
(jeûne, alimentation basée sur les concentrés ou seulement avec du foin) (Young et al., 1969).
Young (1977) suggère alors que la nécessité de maintenir une activité néoglucogénique
importante, pour répondre aux besoins constants en glucose de ces animaux, leur évite de
développer des stratégies pour faire fluctuer l’activité de ces enzymes impliquées dans le
processus de la néoglucogenèse.
II-1.2.3 Les substrats néoglucoformateurs
Tous les composants du cycle de Krebs ont un potentiel néoglucogénique. Pour évaluer ce
potentiel, la plupart des études utilisent les techniques in vivo d’infusion de composés marqués au
niveau ruminal ou intraveineux (Danfaer et al., 1995).
Le propionate :
Dans le cas du propionate, il doit tout d’abord être activé en propionyl-CoA grâce à une
thiokinase. Par la suite le propionyl-CoA est carboxylé pour former le D-méthylmalonyl-CoA en
présence de l’enzyme propionyl-CoA carboxylase, de la biotine et de l’ATP. Le D-
11
méthylmalonyl-CoA est transformé en son stéréoisomère, le L-méthylmalonyl-CoA avant son
isomérisation finale en succinyl-CoA. Cette dernière réaction requiert la vitamine B12 comme
coenzyme dont une carence peut entraîner une excrétion accrue de méthylmalonate. Le succinylCoA entre dans le cycle de Krebs pour finalement former du glucose via la néoglucogenèse
(Bergman, 1990; Figure 4).
Figure 4 : Voie métabolique empruntée par le propionate pour permettre la synthèse de glucose
via la néoglucogenèse (Tiré de Voet et Voet, 1998).
La plupart des études, qui ont estimé la contribution du propionate à la synthèse de
glucose, ont utilisé la technique de transfert isotopique de composés marqués au
14
C. Cette
technique a été critiquée car la conversion du propionate en glucose serait sous-estimée. En effet,
dans le foie, le propionate est métabolisé en oxaloacétate qui ne formera pas seulement du
glucose mais peut être oxydé dans le cycle de Krebs. Une fois dans le cycle, l’oxaloacétate se
combine avec l’acétyl-CoA pour former du citrate qui va perdre deux carbones sous forme de
CO2 pour régénérer l’oxaloacétate. Les
14
C perdus sous forme de CO2 peuvent être remplacés
12
par des C en fonction du nombre de « tours » que les intermédiaires vont faire dans le cycle de
Krebs. Le suivi des carbones marqué est donc complexe du fait d’un possible effet de dilution de
l'isotope (Wiltrout et Satter, 1972). C’est pourquoi, des études plus récentes rapportent, qu’après
correction de cette sous-estimation, le propionate pourrait produire jusqu’à 75% des besoins en
glucose chez les ruminants (Bergman, 1990).
12
Le lactate :
Le lactate dérive des fermentations ruminales, du métabolisme des parois du tractus
digestif et du métabolisme musculaire. Il est premièrement transformé en pyruvate dans le
cytosol. Ce dernier pénètre dans la mitochondrie où il est carboxylé en oxaloacétate.
L’oxaloacétate suit toutes les transformations indiquées lors de la néoglucogenèse jusqu’à sa
transformation finale en glucose. Malgré un nombre limité d’études, il apparaîtrait que le
pourcentage de contribution du lactate au flux de glucose serait de l’ordre de 10 à 20% (Danfaer
et al., 1995) et plus faible en début de lactation qu’en fin de gestation (Baird et al., 1983).
Les acides aminés :
Après transamination ou désamination, les acides aminés glucoformateurs forment soit du
pyruvate, soit des composés du cycle de Krebs. Mais la contribution des acides aminés à la
néoglucogenèse varie de 11 à 30% selon le statut nutritionnel et physiologique de l’animal (Wolff
et Bergman, 1972). Reilly et Ford (1971), ayant infusé, en intraveineux, un mélange d’acides
aminés marqués au C14, ont observé que la production de glucose est directement corrélée avec
l’ingestion des protéines alimentaires et le taux d’apport des acides aminés au foie. En accord
avec ces résultats, Bell (1995) rapporte que le muscle squelettique peut servir de réserves
d’acides aminés qui sont mobilisés et acheminés jusqu’au foie pour supporter la néoglucogenèse
lorsque celle-ci est augmentée, par exemple, en début de lactation chez la vache laitière. Le
pouvoir glucoformateur diffère d’un acide aminé à l’autre : l’alanine, le glutamate, l’aspartate et
la glycine se révèlent être les plus efficaces (Wolff et Bergman, 1972) alors que la lysine et la
leucine sont les seuls acides aminés à n’avoir aucun potentiel néoglucogénique.
Le glycérol :
Enfin, lorsque les animaux sont à jeun ou durant une carence énergétique, l’activité
néoglucogénique du glycérol devient importante car celui-ci est libéré à partir des réserves
lipidiques. Le glycérol est d’abord activé en glycérol-3-phosphate par une glycérokinase et de
l’ATP. Le glycérol-3-phosphate est ensuite oxydé en dihydroxyacétone-phosphate qui réagit avec
le
glycéraldéhyde-3-phosphate
pour
former
le
fructose-1,6-bisphosphate,
lequel
sera
éventuellement transformé en glucose. Le glycérol peut fournir, s’il est utilisé en totalité pour la
13
néoglucogenèse, 15 à 20% de la demande en glucose dans la période péri-vêlage (Bell, 1995). Il
est évident que l’apport et le potentiel néoglucogénique du glycérol sont dépendants de la
quantité de tissu adipeux mobilisé.
Le lactate, le glycérol et les acides aminés contribuent pour un plus grand pourcentage à
la synthèse de glucose par la néoglucogenèse quand la prise alimentaire ou la disponibilité du
propionate diminuent (Lomax et Baird, 1983; Greenfield et al., 2000). En effet, Overton et al.
(1999) ont montré que le métabolisme énergétique réagissait à ces situations de stress en
augmentant le potentiel néoglucoformateur des acides aminés et notamment de l’alanine
d’environ 60%. Cette étude a été réalisée en utilisant comme modèle des béliers castrés injectés
avec de la phlorizine pour mimer la forte demande en glucose en début de lactation (Overton et
al., 1998). L’utilisation hépatique de ces précurseurs de glucose est plus influencée par le
glucagon et l’insuline que ne l’est le propionate (Bell et Bauman, 1997).
II-1.2.4 Adaptation du métabolisme lors de la période péripartum
Chez la brebis, l’initiation de la lactation augmente la néoglucogenèse hépatique à partir
du propionate de 60% (Wilson et al., 1983). La demande estimée en glucose pour les vaches
Holstein est de 1000 à 1100 g/jour durant les 21 derniers jours de gestation mais augmente à
environ 2500 g/jour à 21 jours post-partum (Drackley et al., 2001). L’initiation de la lactation
augmente non seulement la demande pour la néoglucogenèse mais aussi l’épargne du glucose en
diminuant son oxydation et en favorisant l’utilisation d’autres composés pour satisfaire les
besoins énergétiques. En période pré-vêlage, 34% du glucose sont oxydés en CO2, alors qu’à 7
jours de lactation, l’oxydation de ce nutriment est réduite à seulement 8 à 9% (Bennink et al.,
1972) car le flux de glucose est principalement orienté vers la glande mammaire pour la
production de lait. De plus, l’oxydation dans les tissus tels que les reins, le cœur et les muscles
squelettiques de l’acétate, dérivé de la fermentation ruminale, et du 3-hydroxybutyrate, produit de
l’hydroxylation du butyrate dans l’épithélium ruminal, permet d’épargner du glucose. Ces
produits de fermentation sont également des sources importantes de carbone et de NADPH (par
la voie de l’isocitrate déshydrogénase extra-mitochondriale) pour la lipogenèse dans le tissu
adipeux et la glande mammaire (Bergman, 1990; Lindsay, 1979).
14
En général, l’augmentation de la prise alimentaire augmente la disponibilité des substrats
néoglucoformateurs qui, à leur tour, stimulent la néoglucogenèse (Danfaer et al., 1995). Le
décalage, existant entre l’apport et la demande en nutriments au début de la lactation
particulièrement chez les vaches laitières (Bell, 1995), ne permet pas une synthèse ruminale
suffisante en propionate, substrat majoritaire pour la néoglucogenèse. Il est donc évident que pour
soutenir cette forte demande métabolique en glucose, la contribution des acides aminés (10 à
30%), du lactate (environ 15%) et du glycérol est essentiel (Drackley et al., 2001). Il est
intéressant de noter que le lactate et le glycérol, d’origine endogène, sont dérivés du glucose donc
leur contribution pour la néoglucogenèse ne représente pas un apport net de glucose. Ce qui
signifie que, dans les situations de déficit énergétique prolongé où la prise alimentaire est limitée,
comme en début de lactation, les vaches vont utiliser majoritairement les acides aminés,
mobilisés des protéines corporelles, pour augmenter leur production nette de glucose (Danfaer et
al., 1995).
II-1.2.5 Méthodologies de mesure de la néoglucogenèse
II-1.2.5.1 Méthodes in vitro et in vivo
Le processus de néoglucogenèse a été étudié in vitro à différents niveaux : enzymatique,
cellulaire, tissulaire et corporel. Les techniques de biopsies tissulaires à l’aide d’un trocart se sont
largement développées et, maintenant, guidées par échographie, présentent peu de risque pour
l’animal. Les biopsies deviennent alors avantageuses car elles permettent de réaliser des
prélèvements en série à différents temps sur un même animal sans avoir à le sacrifier quoique les
quantités d’échantillon pouvant être prélevées soient limitées. La culture in vitro des tissus
prélevés a été développée (Donkin et Armentano, 1993) en ajoutant au milieu d’incubation des
composés radioactifs (propionate, lactate, acides aminés) permettant ainsi de mesurer leur
contribution dans la synthèse de glucose (Overton et al., 1999; Williams et al., 2006). Toutefois,
cette méthode reste variable du fait de l’hétérogénéité des biopsies hépatiques extraites et les
nombreux intermédiaires formés entre les composés radioactifs initiaux et le glucose pourraient
être un biais à l’estimation de la néoglucogenèse à cause d’une perte potentielle de notre
marquage.
15
Les méthodes, permettant de quantifier in vivo la néoglucogenèse, requièrent l’utilisation
de glucose ou différents précurseurs néoglucogéniques (propionate, acides aminés, lactate)
possédant un ou plusieurs isotopes, radioactifs ou stables (Coggan, 1999). Selon le type
d’isotopes utilisés, la quantification se fait différemment (Wolfe, 1992). Dans le cas des isotopes
stables, qui sont les plus couramment utilisés, différents paramètres sont à déterminer :
-
le type d’infusion
-
l’isotope à suivre et sa position sur la molécule d’intérêt
-
l’intervalle entre chaque prélèvement sanguin
-
et enfin, l’analyse pour calculer l’enrichissement isotopique qui correspond à la différence
entre l’abondance isotopique engendrée par la perfusion et l’abondance isotopique de base
définie avant le début de la perfusion (Wolfe, 1992).
Il est important de noter que chaque modèle de cinétique du glucose incorpore des postulats
spécifiques qui sont liés au marquage de la molécule et de l’objectif spécifique des cinétiques
investiguées.
II-1.2.5.2 Définition des concepts pour les mesures de métabolisme
Quels que soient les paramètres choisis, certaines conditions idéales devraient être
respectées. En premier lieu, le glucose ou autres molécules traceurs ne doivent pas être
biologiquement discriminées de la substance tracée ni affecter le métabolisme de cette dernière
(Wolfe, 1992). Également, le maintien d’un état métabolique stable, c’est-à-dire que la taille
du(des) compartiment(s) choisi(s) ainsi que le taux d’entrée et de sortie demeurent constants
durant la période de mesure, est essentiel pour la validité de cette méthode. Cet état peut être
atteint en alimentant les animaux régulièrement toutes les heures (Waterlow et al., 1978). Le
traceur ne doit pas être recyclé durant la période expérimentale. La durée de la perfusion est
critique. Une durée moyenne inférieure à six heures minimise la réintroduction du traceur dans le
compartiment étudié (Wolfe, 1992), dépendemment du taux de perfusion utilisé ainsi que du
marquage isotopique sélectioné. Enfin, les sites d’infusion et d’échantillonnage doivent être
situés de façon à refléter l’enrichissement isotopique suivant un mélange parfait « traceur-tracé ».
Un compartiment d’un nutriment de petite taille permet l’atteinte rapide de l’équilibre isotopique
(Waterlow et al., 1978). Bien que ne remplissant pas complètement ces conditions, le sang et le
16
plasma sont souvent utilisés comme voie d’accès au « compartiment central » à cause de leur
accessibilité et de leur représentativité du métabolisme de l’organisme entier, i.e. la somme de
tous les tissus de l’organisme.
Cette méthode, par laquelle le métabolisme du glucose est calculé à partir de la dilution
du métabolite marqué, repose sur le concept des pertes irréversibles (Waterlow et al., 1978). Les
pertes irréversibles représentent la somme de toutes les voies de disparition du traceur du
compartiment plasmatique, soit les pertes oxydatives (incluant la formation de métabolites
dérivés du glucose), la glycolyse et la synthèse de divers produits dont le lactose. Ces pertes sont
aussi égales à la somme de toutes les voies d’entrée dans le compartiment : l’absorption, la
dégradation du glycogène et la néoglucogenèse (Wolfe, 1992).
L’approche méthodologique de perfusion continue lors d’un métabolisme stable permet le
prélèvement d’échantillons de façon répétée sans nécessiter l’abattage des animaux. Par contre la
quantité de traceur nécessaire peut rendre cette méthode onéreuse pour les animaux de grande
taille.
II-1.2.5.3 Les différents types d’infusion
Les pertes irréversibles du glucose se déterminent par la mesure de la dilution isotopique
dans le compartiment plasmatique du glucose traceur, qui peut être administré par injection
unique d’une dose ou par infusion constante précédée ou non par une dose d’amorçage
(Waterlow et al., 1978).
Avec une injection unique, la disparition du glucose traceur du compartiment plasmatique
suit plusieurs fonctions exponentielles dont la description doit se faire de façon précise (Wolfe,
1992) afin de calculer les pertes irréversibles du traceur. Cette technique requiert donc le
prélèvement de nombreux échantillons de sang jusqu’au moment où le traceur injecté ait
totalement disparu. Ces mesures répétées permettent d’intégrer l’aire sous la courbe de
l’enrichissement isotopique (Waterlow et al., 1978). Les pertes irréversibles du glucose sont
calculées en divisant la quantité de traceur injecté par l’intégration de l’aire sous la courbe
(Waterlow et al., 1978). Ce mode d’administration permet de recueillir des informations relatives
au volume de distribution, au nombre de compartiments et de la valeur k « rate transfer ».
Contrairement aux infusions continues, les calculs requis sont complexes et l’oxydation du
glucose ne peut être estimée (Wolfe, 1992).
17
La méthode d’infusion constante de glucose traceur par voie intraveineuse est
fréquemment préférée pour sa simplicité technique et mathématique. Ce mode d’administration
permet l’atteinte d’un équilibre isotopique quasi-stable dans le compartiment étudié (central ou
tissulaire). La vitesse d’atteinte de ce plateau est fonction du taux de renouvellement et de la taille
du compartiment et peut être accélérée par l’injection d’une dose d’amorçage (Wolfe, 1992). La
valeur d’enrichissement isotopique atteinte à l’équilibre n’est pas affectée par la dose d’amorçage
administrée (Wolfe, 1992). A l’équilibre, la quantité de glucose marqué quittant le compartiment
de façon irréversible est égale à la quantité entrant (quantité de traceur infusé). Une fois cette
condition remplie, des échantillons sanguins sont prélevés à intervalle fixe pour déterminer
l’enrichissement isotopique permettant, en final, de calculer les pertes irréversibles du glucose.
Celles-ci sont calculées en divisant le taux d’infusion par l’enrichissement isotopique (Wolfe,
1992).
II-1.2.5.4 Choix de la méthode d’analyse et de l’isotope
Dans sa revue Young (1977) insiste sur le fait que le choix de la méthode d’administration
s’effectue en fonction des variables à évaluer. En effet, White et al. (1969) soulignent, qu’à partir
des données issues d’injections uniques, il est possible d’estimer, à 2 ou 3, le nombre de
compartiments dans lesquels se répartit notre métabolite d’intérêt.
Un autre facteur à prendre en compte concerne le type de marquage isotopique utilisé. Le
marquage du glucose offre des possibilités multiples. Des isotopes stables (13C, 2H,
18
O) ou
radioactifs (14C, 3H) peuvent être utilisés, et ce, en différentes positions (Coggan, 1999). Le choix
de la molécule marquée à infuser se fait en fonction des objectifs spécifiques du projet de
recherche (et des fonds disponibles). En effet, ces différentes options sont aussi porteuses de
problèmes majeurs auxquels nous sommes confrontés soit :
-
le recyclage des carbones marqués dans les composés à trois carbones et la fixation de
13
CO2 dans les intermédiaires du cycle de Krebs et qui peuvent revenir sous forme de
glucose par la voie de la néoglucogenèse.
-
et les pertes/échanges de deutériums/hydrogènes au cours des processus de
néoglucogenèse et de glycolyse.
18
Les sites, où les pertes de 2H ou 3H sont les plus importantes, se situent au niveau de la
phosphoglucose isomérase (glucose-6-phosphate en fructose-6-phosphate), l’aldolase (fructose1,6-biphosphate en glycéraldéhyde-3-phosphate et dihydroacétone phosphate), la pyruvate
carboxylase (pyruvate en oxaloacétate) et dans le cycle de Krebs (malate en fumarate) (Wolfe,
1992). Donc l’utilisation de glucose uniformément marqué avec des carbones treize ([U13
C]glucose) est une alternative plus coûteuse mais permet de réduire certains de ces problèmes
de dilution isotopique tout en mesurant les pertes irréversibles et certaines voies métaboliques du
glucose dont la néoglucogenèse. Comme illustré et détaillé dans le chapitre III, une des difficultés
avec ce type de marquage, c’est que l’activité métabolique suite à une infusion de [U13
C]glucose, enrichi de 6 unités de masse (M+6) par rapport au glucose naturel, conduit à la
formation de glucose de masses isotopiques variées allant de M+1 à M+6 (Wolfe, 1992). Les
isotopomères allant de M+1 à M+5 sont utilisés dans le modèle pour estimer la néoglucogenèse
mais leurs enrichissements isotopiques faibles rendent souvent impossible l’estimation de cette
voie métabolique. L’approche pour réduire la perte de précision de la mesure de la
néoglucogenèse est d’utiliser un taux de perfusion plus élevé afin d’éviter des faibles
enrichissements isotopiques des masses M+1 à M+5, qui peuvent atteindre des valeurs près du
seuil de détection des GC-MS si le taux de perfusion est inadéquat (Haymond et Sunehag, 2000).
Par contre, lorsque des perfusions de traceurs sont pratiquées à des taux élevés pour atteindre des
enrichissements isotopiques supérieurs dans les isotopomères, le postulat de perfusion à des doses
traces est compromis et la pharmacodynamique du nutriment peut être altérée par
l’administration de l’isotope.
II-1.3 Utilisation du glucose :
L’importance de la néoglucogenèse hépatique est indéniable. Chez les vaches laitières
hautes productrices en gestation, les besoins en glucose sont 4 fois plus importants que chez leurs
analogues non-gestantes (Bell et Bauman, 1997) et ces besoins sont encore multipliés par 2,5
quelques jours après le vêlage (Bell, 1995). Ces impératifs mènent à une évolution du
métabolisme du glucose dans les différents tissus de l’organisme qui régulent et réorientent
l’apport et l’utilisation de ce nutriment vers le fœtus et la glande mammaire (Bell et Bauman,
1997).
19
II-1.3.1 Source de glycérol et d’énergie
A la différence des monogastriques (Balmain et al., 1954), le glucose n’est pas le substrat
préférentiel pour la lipogenèse chez les ruminants même si, comme le souligne Smith (1971), le
glucose est une source de glycérol et, suite à son oxydation par la voie des pentoses-phosphates,
peut fournir une partie des NADPH nécessaires pour la synthèse des acides gras (Figure 5).
G-6-P DH
G-6-P
6-Pgluconate
DH
Glucunolactonase
6-P-gluconolactose
6-P-gluconate
Ru-5-P
Figure 5 : Utilisation du glucose dans la voie des pentoses-phosphates permettant de fournir du
NADPH (G-6-P, glucose-6-phosphate; 6-P-glucolactone, 6-phospho-glucolactone; 6-P-gluconate,
6-phospho-gluconate; Ru-5-P, Ribulose-5-phosphate) (Tiré de Voet et Voet, 1998).
Le glucose reste une source d’énergie cellulaire indispensable pour le système nerveux et les
érythocytes via son oxydation (Lindsay, 1979; Figure 3).
II-1.3.2 La synthèse de lactose
La lactation est probablement l’activité physiologique ayant besoin de l’apport le plus
élevé en glucose, la synthèse de lactose étant responsable de l’utilisation d’environ 60% du
glucose disponible. Le lactose est le soluté osmorégulateur le plus important du lait donc la
quantité de lactose va déterminer le volume de lait sécrété en attirant l’eau dans le lait (Linzell,
1972). Le reste forme le glycérol des triglycérides ou est oxydé en CO2 (Lindsay, 1971). Les
besoins de glucose pour la production de lait peuvent être évalués selon une captation nette par la
glande mammaire de 0,35-0,40 moles de glucose par kilogramme de lait produit (Danfaer et al.,
1995). Danfaer et al. (1995) ont analysé la relation entre la production laitière (kg/jour) et le flux
de glucose (moles/jour) à partir de 11 études tirées de la littérature. L’analyse par régression
20
reflète une étroite relation linéaire (R2 = 0,95) selon l’équation suivante : y = (x – 1,64) / 0,396 où
y et x représentent la production laitière et le flux de glucose, respectivement.
L’utilisation mammaire du glucose a été démontrée dans une étude in vivo sur des chèvres
(Chaiyabutr et al., 1980). Des 83% du [U-14C]glucose, pris par la glande mammaire, 75% ont été
utilisés pour la synthèse de lactose. Les auteurs quantifient d’autres utilisations métaboliques du
glucose : 4.5% pour la synthèse du glycérol et 4% sont oxydés en CO2. Ils estiment également
qu’un tiers du NADPH, nécessaire à la synthèse de novo des acides gras dans la glande
mammaire, provient de la dégradation du glucose via la voie des pentoses-phosphates (Figure 6).
3% pour la génération d’énergie
4,5% pour la synthèse de glycérol
20 à 30% pour la voie
des pentoses-phosphate
60 à 70% pour la
synthèse de lactose
Figure 6 : Utilisation du glucose dans la glande mammaire bovine (Adapté des valeurs tirées de
Chaiyabutr et al., 1980).
II-2 LES LIPIDES
II-2.1 Métabolisme des lipides
II-2.1.1 Origine des acides gras
Les principaux sites de métabolisme des acides gras durant la lactation sont le foie, le
tissu adipeux et la glande mammaire. Les acides gras non-estérifiés plasmatiques peuvent être
soit issus d’une synthèse de novo, soit d’une mobilisation des réserves lipidiques et transportés
par l’albumine ou circulants dans les lipoprotéines (Bauman et Griinari, 2003).
21
II-2.1.1.1 La synthèse de novo
Cette biosynthèse nécessite deux éléments : une source d’acétyl-CoA et un pouvoir
réducteur sous forme de NADPH. Contrairement aux monogastriques, le principal précurseur
d’acétyl-CoA, chez les ruminants, n’est pas le glucose mais l’acétate ou le β-hydroxybutyrate
(Neville et Picciano, 1997; Bauman et Griinari, 2003).
L’importance de la contribution des corps cétoniques, acétoacétate et β-hydroxybutyrate,
au métabolisme reste une spécificité des ruminants. Ces corps cétoniques peuvent être soit
produits au niveau de l’épithélium ruminal (butyrate → β-hydroxybutyrate et acétate →
acétoacétate) (Weigand et al., 1975), soit au niveau hépatique à partir de l’acétyl-CoA dérivé de
la β-oxydation des acides gras (acides gras → acétyl-CoA → acétoacétate → β-hydroxybutyrate)
(Heitmann et al., 1987; Zammit, 1990). De la même façon que l’acétate, 87% des corps
cétoniques utilisés sont oxydés en CO2 par de nombreux tissus permettant ainsi d’épargner du
glucose (Pethick et Lindsay, 1982). Mais dès les années 1940, des chercheurs ont découvert
l’existence d’une différence artério-veineuse de β-hydroxybutyrate à travers la glande mammaire
lors de la lactation chez la vache (2,49 mg / 100 mL de plasma; Shaw et Knodt, 1941) et la
chèvre (3,72 mg / 100 mL de plasma; Barry et al., 1963). Linzell et al. (1967) a démontré que le
β-hydroxybutyrate et l’acétate sont captés par la glande mammaire et utilisés comme précurseurs
pour la synthèse des acides gras à chaîne courte du lait (Kumar et al., 1965). Selon ces derniers
auteurs, près de 60% des 4 carbones du β-hydroxybutyrate seraient directement incorporés dans
les acides gras C4, C8 et C12. Tandis que les 40% restants seraient scindés en unités à 2 carbones
qui seraient utilisées de la même façon que l’acétate avec une préférence pour l’extrémité
carboxyl selon Kumar et al. (1959) (Popjak et al., 1951; Palmquist et al., 1969). A partir de cette
« amorce », l’élongation peut commencer grâce à l’apport de NADPH (provenant du cycle des
pentoses-phosphate), à l’acétyl-CoA carboxylase et l’acide gras synthétase (Vernon, 2005; Figure
7). La première enzyme catalyse la carboxylation de l’acétyl-CoA en malonyl-CoA. Cette étape
est limitante dans la synthèse des acides gras d’où le fait que l’acétyl-CoA carboxylase soit
hautement régulée à différents niveaux : transcriptionnel, traductionnel et par phosphorylation
(Kim, 1997; Tong, 2005). Après la formation de malonyl-CoA, l’acide gras synthétase condense
entre elles les unités à deux carbones jusqu’à l’obtention de chaînes à 16 atomes de carbone. Le
complexe enzymatique de l’acide gras synthase possède une déacylase, thioestérase I, qui termine
l’élongation de la chaîne d’acides gras à 16 carbones en coupant le lien thioester entre l’acide
22
gras et l’ACP (Acyl Carrier Protein). Chez les ruminants, la glande mammaire possède une
deuxième thioestérase, thioestérase II, ayant la capacité de libérer des acides gras à chaîne courte
ou moyenne (Neville et Picciano, 1997). Cette enzyme est responsable de la capacité de la glande
mammaire à synthétiser des acides gras à courtes et moyennes chaînes (4 à 14 carbones)
caractéristiques du gras du lait (Dils, 1986).
Mellenberger et al. (1973) ont démontré que dans le tissu mammaire de vache en période
péripartum, la synthèse d’acides gras à partir de l’acétate augmente avec la lactation. En effet, ils
notent une amélioration de 26, 9 et 35% de l’activité de l’acétyl-CoA synthétase, l’acétyl-CoA
carboxylase et de l’acide gras synthétase entre -7 et +7 jours de lactation respectivement. Ces
mêmes auteurs ont également constaté que dans le profil d’acides gras du lait, les acides gras à
chaîne courte-moyenne (C6 à C12), issus de la synthèse de novo, augmentent significativement
pendant la même période alors que les acides gras à longue chaîne (C14 à C18), d’origine
alimentaire, diminuent.
II-2.1.1.2 Les lipoprotéines
Le transport des lipides aux différents tissus de l’organisme se fait comme chez les
monogastriques grâce aux différentes lipoprotéines. Les chylomicrons et les VLDL (Very Low
Density Lipoprotein) sont des particules riches en triglycérides qui doivent transporter les lipides
alimentaires aux tissus périphériques. La répartition des lipides dans l'une ou l'autre de ces
lipoprotéines varie selon le degré d'insaturation des acides gras présents dans l'alimentation
(Bauchart et al., 1996).
Ces particules sont rapidement métabolisées par la lipoprotéine lipase, enzyme qui est
accrochée à la surface de la membrane cellulaire des capillaires et de nombreux autres tissus.
L’hydrolyse des triglycérides génère des acides gras libres qui vont alors être disponibles pour
différents tissus : tissu adipeux, pour le stockage des lipides, glande mammaire, pour la
production des gras du lait ou les muscles squelettiques, pour la production d’énergie suite à
l’oxydation des lipides. Les VLDL deviennent des IDL (Intermediary Density Lipoprotein) puis
des LDL (Low Density Lipoprotein) au fur et à mesure qu’ils perdent des triglycérides et
s’enrichissent en phospholipides et ester de cholestérol.
23
Les caractéristiques des ruminants concernant ces lipoprotéines ont été très bien
expliquées par Bauchart (1993). En effet, la capacité des bovins à sécréter les VLDL est 5 fois
plus faible que chez l’homme. In vitro, en utilisant des hépatocytes de rat et de chèvre en culture,
il a été démontré que la synthèse des triglycérides était identique chez les deux espèces.
Cependant, le taux de sécrétion des triglycérides par les hépatocytes de la chèvre était 25 fois plus
faible que celui des hépatocytes de rat (Kleppe et al., 1988). La biosynthèse et la disponibilité des
constituants des VLDL pour l’assemblage de ces particules seraient probablement la cause du
déficit de production en VLDL plutôt qu’un problème au niveau de la sécrétion, selon Bauchart
(Bauchart, 1993; Bauchart et al., 1996; Gruffat et al., 1996).
Figure 7 : Les mécanismes de la lipogenèse (Voet et Voet, 1998)
24
II-2.1.2 La synthèse et l’hydrolyse des triglycérides
Le foie a un rôle plus complexe dans le métabolisme des lipides que les tissus adipeux ou
mammaire. Il prend en charge les acides gras non-estérifiés plasmatiques et soit les oxyde en CO2
ou corps cétoniques qui sont ensuite libérés dans le sang, soit les estérifie sur un glycérol pour
former des triglycérides (Figure 8).
Le devenir des acides gras entre oxydation et estérification va dépendre largement des
enzymes glycéro-3-phosphate déshydrogénase (GPAT) et carnitine palmitoyl-transférase-1 (CPT1). GPAT catalyse l’étape initiale de l’estérification des acides gras, alors que CPT-1 est une
enzyme localisée dans la membrane externe de la mitochondrie qui régule le transport des acides
gras dans la mitochondrie où a lieu la β-oxydation (Vernon, 2005).
2
Acides gras
Acétate
1
Acétyl
Malonyl-CoA ACC
CoA
TG-VLDL
LPL
AcylCoA
CPT-1 4
GPAT
DAG
VLDL
3
TAG
(stockage)
Acylcarnitine
AcétylCoA
Propionate
TAG
Mitochondrie
MéthylmalonylCoA
CO2
Acétoacétate
Glucose
CO2
Acétoacétate
Β-hydroxybutyrate
Figure 8 : Métabolisme hépatique des acides gras chez les ruminants. 1- synthèse des acides gras
de novo; 2- captation d'acides gras préformés venant de la circulation; 3- estérification des acides
gras; 4- β-oxydation.
ACC, acetyl CoA carboxylase ; GPAT, glycérol-3-phosphate
déshydrogénase ; CPT-1, carnitine palmitoyl transférase 1 ; DAG, diacylglycérol ; TAG,
triacylglycérol. Les lignes continues indiquent les voies métaboliques et les lignes en pointillés
indiquent les inhibitions allostériques (Adapté de Vernon, 2005).
Il existe deux sites d’oxydation différents : dans les péroxysomes où les acides gras
subissent une oxydation partielle et peuvent ensuite gagner les mitochondries dans lesquelles a
lieu la β-oxydation (Hocquette et Bauchart, 1999).
25
Les acides gras à courte et moyenne chaîne sont activés en ester CoA dans la matrice
mitochondriale alors que les acides gras à longue chaîne, sous forme d’acyl-CoA, traversent la
membrane externe de la mitochondrie où ils doivent ensuite être pris en charge par un système de
transport dépendant de la carnitine : CPT-1 (Zammit, 1990). Le rôle de cette enzyme est de
catalyser la formation d’acyl-carnitine et de CoA à partir d’acyl-CoA et de L-carnitine libre. Le
CoA est libéré dans le cytoplasme et redevient disponible pour d’autres réactions métaboliques.
L’acyl-carnitine est transportée à travers la membrane interne de la mitochondrie grâce à une
acyl-carnitine translocase en échange de carnitine libre. L’acyl-carnitine est ensuite converti en
acyl-CoA dans la matrice mitochondriale grâce à la CPT-2 localisée au niveau de la membrane
interne (Brady et al., 1993; Hocquette et Bauchart, 1999; Zammit, 1990; Figure 9).
MATRICE
MITOCHONDRIALE
CYTOSOL
MEMBRANE
MITOCHONDRIALE
EXTERNE
MEMBRANE
MITOCHONDRIALE
INTERNE
Carnitine
Carnitine
Acylcarnitine
translocase
Acide grasCarnitine
Malonyl-CoA
-
Coenzyme A
CPT-1
Méthylmalonyl-CoA
Carnitine
Acide grasCoenzyme A
Acyl-CoA
synthétase
Acide gras à
longue
Acide grasCarnitine
Acide gras à
longue chaîne
CPT2
Coenzyme A
Carnitine
Acide grasCoenzyme A
Oxydation
Figure 9 : Représention schématique du système carnitine permettant le transfert des acides gras à
longue chaîne dans la matrice mitochondriale; CPT, carnitine palmitoyltransférase (Tiré de
Zammit, 1990).
26
Selon ces auteurs, l’activité de la CPT-1 constitue l’étape limitante de l’oxydation des
acides gras. La CPT-1 est en effet inhibée par le malonyl-CoA (McGarry et Foster, 1980),
premier intermédiaire formé dans la synthèse des gras, et par le méthylmalonyl-CoA,
intermédiaire dans le métabolisme du propionate, dans le foie des ruminants (Brindle et al.,
1985). Cette découverte montre que les changements hormonaux qui accompagnent certaines
conditions physiologiques (déficit énergétique en début de lactation avec une hypoinsulinémie et
une perte d’appétit) peuvent, d’une part, diminuer l’activité de l’acétyl-CoA carboxylase et, par
conséquent, les taux de malonyl-CoA. D’autre part, la perte d’appétit diminue le taux de
production du propionate au niveau ruminal ce qui baisse l’inhibition via le méthylmalonyl-CoA
et mène à une accélération de l’oxydation des acides gras et de la cétogenèse (Zammit, 1990;
Kim, 1997; Hocquette et Bauchart, 1999; Vernon, 2005).
Il est important de noter que, par la formation d’acétyl-CoA suite à la β-oxydation, les
acides gras favorisent indirectement la néoglucogenèse par un apport suffisant d’acétyl-CoA qui
va permettre au pyruvate d’être orienté principalement vers la néoglucogenèse plutôt que d’être
utilisé dans le processus d’oxydation (Herdt et Emery, 1992).
II-2.1.3 L’importance du glucose
Le glucose est un substrat majeur dans la synthèse des acides gras. Une fois à l’intérieur
des cellules alvéolaires mammaires ou adipeuses, le glucose peut avoir 4 destinées (Neville et
Picciano, 1997; Figure 10) :
1- il peut être converti en acétyl CoA à partir du pyruvate et synthétiser du citrate,
fournissant des unités carbonées pour la synthèse des acides gras via le malonyl-CoA.
2- Il peut être converti en ribulose-5-phosphate en suivant la voie métabolique des pentosesphosphates, pouvant ainsi générer une partie des NADPH nécessaires pour la synthèse des
acides gras en tant qu’unités réductrices.
3- Le glycéraldéhyde-3-phosphate, issu de la glycolyse peut-être converti en glycérol-3phosphate et utilisé pour la formation des triglycérides.
4- Finalement, le glucose peut-être entièrement oxydé en CO2 en empruntant successivement
la glycolyse et le cycle de Krebs (8 et 30 ATP respectivement / molécule de glucose) et
ainsi fournir l’énergie nécessaire à la synthèse des acides gras.
27
Glycerol
Glucose
Glucose
NADPH
2
Ribulose-5-P
Acide gras
Glycerol
Hexokinase
G-6-P
Glycerol-3-P
F-6-P
PFK-1
F-1,6-BP
3
+
Acyl CoA
Triglycerides
Acide gras
AGS
Malonyl CoA
Acetyl CoA carboxylase
Glyceraldehyde-3-P
Acetyl CoA
Acetate
ATP citrate liase
Citrate
Pyruvate
Pyruvate
Acetate
Pyruvate
deshydrogenase
1
Citrate
Acetyl CoA
Krebs
4
Énergie
Figure 10 : Étapes clés de l’utilisation du glucose dans la synthèse des acides gras. G-6-P,
Glucose-6-phosphate ; F-6-P, Fructose-6-phosphate ; PFK-1, phosphofructokinase-1 ; F-1,6-BP,
fructose-1,6-biphosphate ; AGS, acide gras synthase ; CoA, coenzyme A. (Tiré de Neville et
Picciano, 1997).
II-2.2 Pathologies liées au métabolisme des lipides
Dans la période péripartum où les vaches laitières sont en déficit énergétique, les acides
gras se révèlent être la principale source d’énergie pour la plupart des tissus. Cependant, dans
certaines circonstances, ils peuvent avoir des effets pathologiques qui peuvent réduire la
production laitière, altérer la santé ou l'efficacité reproductive.
28
II-2.2.1 La cétogenèse
Chez plusieurs espèces de non-ruminants, la conversion hépatique des acides gras nonestérifiés en corps cétoniques est considérée comme étant une stratégie d’économie du glucose
pendant les périodes de jeûne pour fournir de l’énergie (Voet et Voet, 1998). Le même
phénomène adaptatif se produit chez les vaches laitières pendant la période de transition pour
diminuer l’oxydation du glucose même si ce taux d’oxydation est déjà faible par rapport aux
animaux non-ruminants (Herdt et Emery, 1992). La cétogenèse se produit dans les mitochondries
des hépatocytes et consiste à la formation d’acétoacétate et β-hydroxybutyrate à partir de deux
acétyl-CoA, issus de la β-oxydation des acides gras (Voet et Voet, 1998). Les corps cétoniques
peuvent être utilisés comme source d’énergie par un grand nombre de tissus chez les ruminants
(le cœur, les reins, le muscle squelettique, la glande mammaire et le tractus gastro-intestinal) en
étant oxydés (Heitmann et al., 1987; Herdt et Emery, 1992) et peuvent servir de substrats pour la
synthèse mammaire d’acides gras.
Herdt et Emery (1992) ont décrit les stratégies adoptées par l’organisme pour réguler
conjointement la cétogenèse et la néoglucogenèse. Cette régulation peut être de deux natures : les
substrats eux-mêmes (corps cétoniques et glucose) et les hormones (insuline et glucagon). Un
dérèglement de ces voies de régulation conduit à une surproduction de corps cétoniques et une
incapacité à maintenir le glucose sanguin menant alors la vache dans un état pathologique appelé
acétonémie. Même si les mécanismes restent à clarifier (Drackley et al., 2001), il se pourrait que
l’excès en corps cétoniques cause l’hypoglycémie suite à une inhibition de la néoglucogenèse
(Mills et al., 1986). Cette réduction de la néoglucogenèse serait due à un manque d’apport en
substrats carbonés permettant la synthèse d’oxaloacétate par les cycles anaplérotiques.
II-2.2.2 La stéatose hépatique
La stéatose ou « foie gras » des vaches laitières se développe, en début de lactation, quand
la concentration plasmatique en acides gras non-estérifiés est élevée à cause d’une réduction de la
prise alimentaire et du tissu adipeux dont l’activité est majoritairement catalytique (Grummer,
1993; Bobe et al., 2004; Ohgi et al., 2005). Dans le foie, les acides gras sont soit oxydés en CO2
ou corps cétoniques, soit estérifiés en triglycérides qui peuvent alors être stockés dans le
cytoplasme des hépatocytes ou sécrétés via les VLDL (Drackley et al., 2001; Vernon, 2005).
29
Mais le taux de synthèse et de sécrétion des VLDL par le foie étant beaucoup plus faible chez les
ruminants que chez les non-ruminants (Graulet et al., 1998; Pullen et al., 1990), cela explique
pourquoi ces animaux accumulent les lipides au niveau hépatique (Drackley et al., 2001;
Grummer, 1993). Pour faire face à cette pathologie qui touche un tiers des vaches laitières hautes
productrices dans la période péripartum (Bobe et al., 2004), les deux grandes stratégies mises en
place sont :
-
Une diminution de la mobilisation des acides gras du tissu adipeux principalement en
apportant des suppléments alimentaires de niacine ou de propylène glycol, précurseur de
glucose (Grummer, 1993).
-
Une augmentation de l’exportation des triglycérides hépatiques via les VLDL.
Ce dernier point fait l’objet de nombreuses recherches car plusieurs hypothèses ont été avancées
pour expliquer la lenteur de l’exportation des VLDL (Gruffat et al., 1996; Grummer, 1993).
Bauchart (1993) explique ce phénomène par un défaut dans l’assemblage de ces particules
(Bauchart et al, 1996). En effet, il est possible que la microsomal transfer protein, qui catalyse le
transport des triglycérides au site d’assemblage des VLDL, ait une faible activité chez les bovins.
La grosse et la petite sous-unité de cette protéine sont 10 et 2 fois moins concentrées
respectivement dans le foie de veaux que dans celui de rat (Graulet et al., 2004). Une diminution
de la concentration plasmatique et de l’ARNm de l’apoB, apolipoprotéine permettant une bonne
fonctionnalité des VLDL, a été corrélée avec une augmentation de la teneur des triglycérides dans
le foie (Marcos et al., 1990). L’ajout 2,6 g de méthionine / kg de matière sèche à la ration de
veaux pré-ruminants a un impact positif sur l’exportation des VLDL (Auboiron et al., 1995). La
méthionine serait impliquée dans la synthèse des apoprotéines et comme donneur de groupements
méthyles permettant la synthèse de phosphatidylcholine, composant essentiel de l’enveloppe
hydrophile des VLDL (Shibano et Kawamura, 2006). Une dernière stratégie nutritionnelle pour
prévenir et réduire la stéatose hépatique serait l’utilisation de choline protégée de la dégradation
ruminale (Janovick Guretzky et al., 2006) en améliorant notamment le métabolisme des
groupements méthyles (Baldi et Pinotti, 2006).
30
II-3 LES PROTÉINES
II-3.1 Métabolisme des acides aminés
II-3.1.1 Rôles des acides aminés
Lors de leur absorption, 39 et 62% des acides aminés essentiels et non essentiels
respectivement sont utilisés pour le métabolisme gastrointestinal (Berthiaume et al., 2001).
Cependant il existe une grande variation entre les acides aminés quant à leur utilisation au niveau
de l’intestin. En effet la leucine, la lysine et la méthionine sont oxydées par le tube digestif mais
pas la phénylalanine, ni la thréonine (Lobley et Lapierre, 2003). Les acides aminés catabolisés
vont servir de source d’énergie pour le métabolisme du tube digestif mais aussi pour la synthèse
des protéines constitutives de l’intestin qui ont un « turnover » rapide et celles présentes dans les
différentes sécrétions du tube digestif (salive, bile, sécrétions gastrique et pancréatique).
Les acides aminés, absorbés et non métabolisés dans l’épithélium intestinal, circulent sous
forme libre dans le plasma jusqu’au foie et ceux, libérés par cet organe, vont pouvoir être
acheminés vers les tissus périphériques. Les acides aminés peuvent être utilisés pour la synthèse
des protéines (renouvellement protéique ou protéines sécrétées lors de la digestion ou dans le
lait), être catabolisés ou utiliser pour la synthèse de produits spécialisés (neurotransmetteurs,
carnitine,…).
Pour la synthèse protéique, des recommandations, issues du NRC (2001), ont été faites
seulement pour deux acides aminés, la méthionine et la lysine, qui sont fréquemment limitants
pour la production des protéines du lait chez la vache laitière (Schwab et al, 1992; Rulquin et al.,
1993). L’examen des résultats d’essais d’administration postruminale de méthionine et de lysine
montre que les effets sur la production et la composition du lait sont très variables selon la nature
des suppléments d’acides aminés utilisés, le type de régime alimentaire ainsi que son niveau
azoté et enfin du stade de lactation et du niveau de production des animaux (Rulquin, 1992).
Deux études plus récentes supplémentent une ration basée sur de l’ensilage de maïs (17% de
protéines brutes) avec en moyenne 10 g / j de méthionine et de lysine par infusion au duodénum
(Pisulewski et al., 1996) ou dans l’alimentation, protégée de la dégradation ruminale (Socha et
al., 2005) chez la vache laitière. Elles observent une amélioration significative de la teneur en
31
protéines du lait d’environ 4,5% et du rendement de 7 et 4% pour les vaches en début et milieu de
lactation, respectivement.
Le catabolisme des acides aminés peut se produire dans une large gamme de tissus : par
exemple, la leucine peut-être oxydée dans la glande mammaire (Thivierge et al., 2002), à travers
l’intestin (Lapierre et al., 2002), dans les reins, le tissu adipeux et dans le muscle squelettique
(Bergen et al., 1988). Pourtant le foie reste le principal site de catabolisme des acides aminés car
il possède les enzymes oxydatives nécessaires. Dans cet organe, ce catabolisme se traduit par une
déamination des acides aminés en excès suivie par un catabolisme du squelette carboné.
L’ammoniac, issu de la déamination, va permettre la synthèse d’urée alors que le squelette
carboné va fournir des intermédiaires glucogéniques (pyruvate, succinate, α-cétoglutarate,…) ou
cétogéniques (acétyl-CoA ou acétoacétate) et, ainsi, servir aussi de source d’énergie (Chalupa,
1984; Figure 11). Les acides aminés fournissent aussi des groupes amines et méthyles nécessaires
pour les réactions de transamination et transméthylation, respectivement. Ce dernier rôle sera
développé plus en profondeur lors de l’étude de la méthionine dans le métabolisme des unités
monocarbonées (chapitre II-5.3.3).
II-3.1.2 Contrôle du métabolisme des acides aminés au niveau des tissus
périphériques
Le foie est un organe vital dans le maintien de l’homéostasie des acides aminés en
assurant des fonctions duelles encore peu claires. En effet, il serait capable d’extraire et
cataboliser les acides aminés en excès pour éviter les problèmes de toxicité, tout en fournissant
les acides aminés (sous forme d’acides aminés libres ou de protéines exportées, comme
l’albumine) nécessaires pour supporter l’anabolisme au niveau des tissus périphériques. Il n’est
pas encore bien compris comment et par quels mécanismes le foie est capable de réguler ces
actions partagées entre catabolisme et anabolisme. Deux hypothèses ont alors été émises : le foie
pourrait réguler le gain protéique des tissus périphériques en tant que premier organe traversé par
les acides aminés absorbés ou inversement, l’anabolisme des tissus périphériques constituerait un
signal pour le foie (Lapierre et al., 2005).
32
Alanine
Cystéine
Glycine
Sérine
Thréonine
Tryptophane
Pyruvate
CO2
Isoleucine
Leucine
Thréonine
Acétoacétate
Acétyl-CoA
Glucose
Asparagine
Aspartate
Citrate
Oxaloacétate
Phénylalanine
Tyrosine
Isoleucine
Méthionine
Valine
Fumarate
Cycle de
l’acide
citrique
Leucine
Lysine
Phénylalanine
Tryptophane
Tyrosine
Isocitrate
CO2
Succinyl-CoA
α-Cétoglutarate
Arginine
Glutamate
Glutamine
CO2
Histidine
Proline
Figure 11 : Intermédiaires glucogéniques (dans les carrés) et cétogéniques (dans les cercles)
produits suite au catabolisme des acides aminés dans le foie (Tiré de Voet et Voet, 1998).
D’après de récentes données, le foie n’agirait pas comme un régulateur actif de
l’extraction et du catabolisme des acides aminés mais répondrait plutôt au flux d’acides aminés
qu’il reçoit et cataboliserait les acides aminés non-utilisés par les tissus périphériques (Lobley et
Lapierre, 2003). Cette dernière hypothèse s’appuie sur le fait que le foie reçoit des acides
aminés de deux sources différentes, la veine porte et l’artère hépatique, c’est-à-dire ce qui est
33
absorbé ou recyclé dans le sang périphérique et qui vient de la dégradation des protéines
tissulaires. Le sang ou le plasma sont reconnus pour être les principaux sites de transport des
acides aminés à travers les tissus splanchniques (Lobley et al., 1996). Ce concept a été mis en
évidence dans une étude chez le mouton où les auteurs ont établi que l’extraction des acides
aminés par le foie serait fonction du flux hépatique afférent (absorbé + recyclé) (Lobley et al.,
2001). Donc, selon cette idée, les acides aminés subiraient de multiples passages à travers le foie
avec seulement des petites quantités extraites par cet organe à chaque passage de l’ordre de 1 à
20% des apports hépatiques afférents (Lobley et al, 2001). Le taux d’extraction hépatique de la
plupart des acides aminés reste constant pour un acide aminé donné mais diffère entre les acides
aminés. Par exemple, la méthionine, la phénylalanine, l’histidine, l’alanine, l’arginine, la sérine et
la tyrosine ont les taux d’extraction les plus élevés (entre 35 et 50% de l’absorption portale)
tandis que la lysine et les acides aminés à chaîne ramifiées (leucine, valine et isoleucine) sont très
peu retenus par le foie (Lobley et al., 2001; Lapierre et al., 2005).
II-3.2 « Turnover » protéique
II-3.2.1 Une plasticité métabolique
Chez une vache laitière en fin de lactation produisant moins de 20 kg de lait, 880 g / jour
de protéines sont sécrétées dans le lait et retenues dans les tissus alors que la quantité totale de
protéines produites et dégradées par l’organisme est de 3,5 et 2,6 kg / jour, respectivement
(Lapierre, et al. 2002; Lobley, 2003). Un tel constat pour démontrer que les protéines sont une
composante dynamique de l’organisme. Ainsi le concept du « renouvellement des protéines
corporelles » implique le remplacement d’une quantité de protéines par une quantité équivalente
du même matériel nouvellement synthétisée à partir de précurseurs ou de composés venant de
l’alimentation (Lobley et Lapierre, 2003).
Les principales voies responsables du maintien des protéines corporelles et de
l’homéostasie des acides aminés sont la synthèse protéique, la dégradation protéique, l’oxydation
des acides aminés et la synthèse de novo des acides aminés non-essentiels (Young et Margini,
1990). Les variations dans l’importance de ces voies métaboliques permettent l’ajustement du
dépôt des protéines en fonction de l’état nutritionnel, physiologique ou pathologique de l’animal.
Ce continuel renouvellement des tissus est un processus vital qui permet notamment l’élongation
34
des fibres musculaires de l’utérus durant la gestation ou le développement, la fonctionnalité et
plus tard la régression de la glande mammaire durant le cycle de lactation (Lobley, 2003). Mais
cette plasticité prend toute son importance en début de lactation où la forte demande de la glande
mammaire chez les vaches laitières va être supportée en mobilisant en moyenne 1 kg de protéines
tissulaires par jour (pour les 7 à 10 premiers jours après le vêlage) (Bell et al., 2000). A l’inverse
une accrétion protéique de -69 g à +794 g se produit dans les tissus de brebis en fin de gestation
(110 à 140 jours de gestation) recevant un régime faible (80 g/kg de matière sèche) ou riche (160
g/kg de matière sèche) en protéines (McNeill et al., 1997).
Pour maintenir cette plasticité métabolique, il apparaît nécessaire d’avoir une fraction du
réservoir de protéines qui serait mobile. Dans une expérience avec une phase de déplétion des
protéines labiles suivie d’une ration de réplétion, Botts et al. (1979) ont estimé que la vache
laitière disposait d’une réserve de protéines labiles correspondant à environ 26% des protéines
corporelles. Comme illustré dans la figure tirée de Lobley (2003) (Figure 12) et discuté dans la
revue de Swick et Benevenga (1977), les muscles et la peau sont les principales réserves de
protéines chez les bovins. La mobilisation des protéines constituant ce réservoir est limité. Dans
une étude comparant différents niveaux de protéines métabolisables chez des vaches Holstein en
lactation recevant une alimentation isoazotée et isoénergétique, l’étude de la cinétique de leucine
montre que cet acide aminé est non seulement moins bien retenu dans les tissus (3,4 contre 4,3
mmol/h, respectivement) mais aussi que son oxydation est supérieure de 8,9 mmol/h chez les
vaches avec la ration riche en protéines métabolisables (Lapierre et al., 2002). Il est maintenant
bien admis qu’un excès de protéines alimentaires, donné en début de lactation pour anticiper la
forte demande en nutriments, ne permet pas d’augmenter les réserves mais augmente plutôt
l’oxydation et l’excrétion protéique (Swick et Benevenga, 1977).
35
Muscles
50
Peau
20
15-20
8-16
25-30
15-20
Foie
2
4-15
25
5-7
32-45
3
35-45
23
Intestin
% masse protéique
% synthèse protéique
% utilisation d’oxygène
7-14
Glande
mammaire
Figure 12 : Pourcentage de contribution de différents tissus à la masse protéique, la synthèse
protéique et à l’utilisation nette d’oxygène indicateur de l’énergie utilisée au niveau corporel chez
le bouvillon (Adapté de Lobley, 2003).
II-3.2.2 Équilibre entre synthèse et dégradation protéique
Les acides aminés nécessaires pour subvenir à la synthèse protéique excèdent les
quantités fournies par l’alimentation. Donc la plupart des acides aminés utilisés viennent de la
dégradation des protéines endogènes (environ 60%). Dans sa revue, Lobley (2003) note qu’une
vache laitière consomme 2 kg de protéines digestibles alors qu’elle en synthétise 4 kg / jour.
La synthèse protéique :
La synthèse protéique au niveau corporel est la somme de la synthèse des protéines au
niveau de tous les tissus et organes.
Lobley (2003) reprend de nombreux chiffres tirés de la littérature pour montrer la
contribution majoritaire du tissu gastro-intestinal et du foie à la synthèse corporelle de protéines
(25 à 45% chez la vache laitière, Lapierre et al., 2002), suivi par le tissu mammaire à la hauteur
36
de 35 à 45% (Thivierge et al., 2002) et enfin la synthèse protéique au niveau musculaire qui
représente 15 à 20% chez un animal en croissance (Figure 12). Même si le tube digestif et le foie
peuvent apparaître moins efficaces parce qu’ils ne contribuent pas à former un produit particulier
comme le lait ou la fibre musculaire, ces organes sont néanmoins très actifs car ils synthétisent
des protéines qui sont sécrétées et utilisés dans l’organisme entier : enzymes excrétées pour la
digestion, protéines du système immunitaire ou encore l’albumine et pour assurer le
renouvellement rapide des cellules du tractus gastrointestinal (Lobley, 2003).
La dégradation protéique :
Contrairement à la synthèse protéique qui s’effectue dans le noyau et le cytoplasme des
cellules, la dégradation protéique peut se produire dans différentes composantes cellulaires selon
la voie choisie : lysosomal, majoritairement au niveau hépatique, ou cytoplasmique (système
dépendant du calcium ou système ATP-ubiquitine, principalement au niveau musculaire). Ce
processus permet de fournir des substrats à la synthèse protéique, de maintenir un pool restreint
d’acides aminés libres plasmatiques, l’intégrité enzymatique et de renouveler les protéines
vieillissantes dont les fonctions métaboliques sont affaiblies.
En début de lactation, les vaches laitières sont dans un état de bilan énergétique très
négatif qui impose une forte mobilisation, en priorité, des protéines musculaires pour augmenter
la quantité d’acides aminés libres. Ces acides aminés vont être impliqués dans plusieurs voies
permettant de répondre aux besoins de la glande mammaire et à l’adaptation métabolique exigée.
Tout d’abord ces acides aminés seront utilisés pour la synthèse de glucose via la néoglucogenèse,
pour la synthèse des protéines du lait et enfin comme source d’énergie afin d’épargner le glucose
(Bell et al., 2000). Ces derniers auteurs soulignent par ailleurs que cette mobilisation extrême
serait liée d’une part à une forte diminution de la synthèse protéique et d’autre part à une
augmentation de la dégradation. Ce phénomène pourrait être régulé par des changements
endocrines (IGF-1, insuline et hormone de croissance) (Bell et al., 2000).
II-3.2.3 Mesure du dynamisme protéique
La méthodologie élaborée pour mesurer le dynamisme protéique repose sur l’utilisation
de molécules marquées, appelées « traceurs ». Comme nous l’avons déjà expliqué dans le
37
chapitre II-1.2.5., ces traceurs sont des molécules marquées par un isotope radioactif ou stable qui
doit remplir un certain nombre de conditions et qui permet de suivre et quantifier les voies
métaboliques de divers composés (acides aminés, glucose). Des acides aminés marqués sont
habituellement utilisé pour estimer le métabolisme protéique. Tout comme pour le glucose, les
pertes irréversibles totales (PIT) somment les voies de sorties qui, à l’équilibre, égalent les voies
d’entrée.
Pour un acide aminé essentiel, d’une façon générale, les compartiments suivant sont
utilisés :
PIT = entrée : absorption + AA dérivé de la dégradation protéique
= sortie : oxydation + synthèse protéique
De plus, pour un acide aminé soufré comme la méthionine, en plus des isotopes mentionnés pour
le glucose, les isotopes suivants peuvent aussi être utilisés :
15
N (stable) et
35
S (radioactif).
Encore une fois, le choix du traceur se fait en fonction des objectifs particuliers du protocole de
recherche. Aussi, pour la méthionine, à cause du cycle de reméthylation à partir de
l’homocystéine (voir paragraphe II-5.3.4), le PIT peut-être défini de la façon suivante :
PIT = entrée : absorption + AA dérivé de la dégradation protéique + reméthylation
= sortie : oxydation + synthèse protéique + formation de SAM*
* SAM = S-Adénosyl Méthionine ; le métabolite actif de la méthionine
L’infusion de méthionine marquée avec une combinaison de deux isotopes va permettre
de générer des enrichissements isotopiques de plusieurs masses qui permettront de suivre cet
acide aminé dans ces différentes voies métaboliques. Ce dernier exemple est détaillée dans le
chapitre IV où l’étude du métabolisme de la méthionine a été suivie suite à l’infusion de L-[113
C,2H3]méthionine.
38
II-4 VITAMINES DU COMPLEXE B
II-4.1 Synthèse dans le rumen et absorption intestinale
Jusqu'à présent, il est établi que les ruminants adultes n'ont pas besoin de suppléments
alimentaires de vitamines B grâce à la présence des nombreuses bactéries peuplant leur
rumen. En effet, il a été démontré depuis longtemps que ces microorganismes sont
capables de synthétiser ces composés (Bechdel, 1928). Les ruminants reçoivent donc une
double source de vitamines B: une venant de l'alimentation et l'autre de la synthèse endogène
bactérienne. D’ailleurs Santschi et al. (2005a) a démontré que cette fraction vitaminique, issue
du métabolisme ruminal, est non négligeable. Suite à une étude chez 4 vaches en lactation,
équipées de canules ruminale, duodénale et iléale, une synthèse ruminale apparente de 2213, 21
et 73 mg / jour de niacine totale, folates et vitamine B12 respectivement a été mise en évidence
(Santschi et al., 2005a). Toutefois il a été démontré que cette synthèse endogène variait selon la
composition de la ration (Santschi et al., 2005b; Schwab et al., 2006).
Les travaux de Santschi et al. (2005a) ont permis également de montrer que, malgré une
intense dégradation de ces vitamines, provenant de suppléments alimentaires, par les bactéries du
rumen (de 41 à 99% pour la vitamine B6 et la riboflavine, respectivement), les taux d’absorption
intestinaux sont globalement améliorés par la supplémentation mais sont différents d’une
vitamine à l’autre allant d’environ 15 à 84% pour la vitamine B12 et la niacine totale.
II-4.2 Implication dans les grandes voies métaboliques
Les vitamines B sont impliquées dans deux grands types de fonctions métaboliques : le
transfert de protons et d’électrons et la fonction coenzymatique. De telles fonctions rendent ces
vitamines indispensables pour le bon fonctionnement des métabolismes énergétiques (glucidique
et lipidique) et protéique (Figure 13).
La riboflavine et la niacine sont d’importants co-facteurs dans les réactions d’oxydoréductions suite à leur interconversion entre différentes formes : FMN-FMNH-FMNH2 ou FADFADH-FADH2, pour la ribofavine et NAD+-NADH ou NADP+-NADPH, pour la niacine
(Combs, 1998). Ces co-facteurs sont très impliqués dans les voies métaboliques fournissant
l’énergie à l’animal : glycolyse, cycle de Krebs, synthèse et oxydation des acides gras et certains
39
acides aminés ainsi que dans la chaîne respiratoire mitochondriale (Voet et Voet, 1998). L’acide
pantothénique joue aussi un rôle de transfert notamment dans le métabolisme des acides gras car
il est responsable de l’oxydation du coenzyme A.
La fonction coenzymatique est assurée par toutes les vitamines du groupe B. La thiamine
diphosphate est une coenzyme de 3 complexes enzymatiques qui catalyse les réactions de
décarboxylation : la pyruvate déshydrogénase dans le métabolisme des glucides, l’α-cétoglutarate
déshydrogénase dans le cycle de Krebs et la déshydrogénase impliquée dans le métabolisme des
acides aminés à chaîne ramifiée. C’est aussi une coenzyme pour les transcétolases présentes dans
la voie des pentoses phosphates. Sous leurs formes NAD(H)-NADP(H) et FMN-FAD, la niacine
et la riboflavine sont des coenzymes pour un grand nombre de réactions dans les métabolismes
des glucides, lipides et protéines. L’acide pantothénique est le précurseur de la coenzyme A et de
l’ACP qui participent aux réactions du cycle de Krebs, de la synthèse et oxydation des acides
gras, la synthèse de cholestérol et les réactions d’acétylation (Voet et Voet, 1998). La vitamine B6
intervient dans le métabolisme des acides aminés et spécialement dans les réactions de
transamination et de décarboxylation. La biotine est elle essentielle dans l’activation de 4
carboxylases : β-crotonyl-CoA carboxylase (impliquée dans le catabolisme de la leucine),
l’acétyl-CoA carboxylase (intervenant dans la synthèse des acides gras), la propionyl-CoA
carboxylase et la pyruvate carboxylase qui autorisent l’entrée du propionate, d’acides gras à
nombre impair de carbones et certains acides aminés (valine, isoleucine, méthionine et
thréonine), pour la première enzyme, et d’acide lactique et d’acides aminés (alanine, glycine),
pour la seconde, dans le cycle de Krebs. Enfin nous détaillerons plus tard (chapitres II-5.1 et II5.2) les fonctions métaboliques de l’acide folique, en tant que donneur d’unités à un carbone, et
de la vitamine B12 dont 3 enzymes sont dépendantes : la méthionine synthase, la méthylmalonylCoA mutase et la leucine aminomutase (Combs, 1998; Voet et Voet, 1998).
40
PROTEINES
GLUCIDES
B12
B9
Pentoses
phosphates
Acides aminés
B9
B1
B3
B6
Propionyl-CoA
B1
B3
B8
B1
B2
Acétyl-CoA
B8
B9
B5
Acide pyruvique
B5
B5
B3
B8
Cholestérol
B12
Cycle de
Krebs
B6
B1
ATP
Urée
Glycogène Glycérol Acides gras
Glucose
B6
B8
B1
Purines
Pyrimidines
LIPIDES
CO2
B2
B3
Acides gras à
chaîne impair de
carbones
B5
B8
PropionylCoA B5
B2
2 x 2H
CHAINE
RESPIRATOIRE
ATP
H2O
Figure 13 : Fonctions métaboliques des vitamines B (Adapté de Le Grusse et Watier, 1993).
II-4.3 Définition des besoins
Selon les estimations faites par le NRC (2001), seuls l’acide folique et l’acide
pantothénique seraient limitants et nécessiteraient une supplémentation chez la vache laitière
(Tableau 1). Ces conclusions sont à interpréter avec précaution car, d’une part, les besoins
tissulaires sont évalués à partir de recommandations émises pour une truie en lactation de 175 kg
et réajustées pour une vache laitière de 650 kg produisant 35 kg de lait par jour. Et d’autre part,
les valeurs de la synthèse ruminale et de la quantité de vitamines B du régime échappant aux
dégradations ruminales dérivent d’une étude réalisée sur de jeunes bœufs nourris principalement
de céréales.
Comme nous l’avons déjà mentionné précédemment, les besoins en vitamines B chez la
vache laitière haute productrice sont assurés par une importante synthèse ruminale qui pallie à
l’apparition de signes cliniques de carence. Cependant ces besoins varient beaucoup selon le
stade physiologique, augmentant dans les situations de stress tels que la croissance, la gestation et
41
la lactation. Or dans ces conditions, les niveaux nécessaires en ces vitamines pour optimiser la
santé et la production des animaux pourraient excéder les quantités fabriquées dans le rumen. En
effet, dans les premières semaines de lactation où l’exigence en énergie est haute et la prise
alimentaire limitée, les 3 enzymes dépendantes de la biotine et impliquées dans la
néoglucogenèse sont très actives et augmenteraient les besoins en cette vitamine (Majee et al.,
2003).
Tableau 1 : Bilan des apports (synthèse ruminale et alimentation) et besoins corporels estimés
(tissus et production laitière) en vitamines B chez une vache laitière de 650 kg produisant 35 kg
de lait par jour (Tiré de NRC, 2001).
Estimation des besoins quotidiens
Vitamines
Synthèse
ruminale
(mg/jour)3
Vitamine B du
régime échappant à
la dégradation
ruminale (%)3
52
1
6
tissu
lait
total
1
2
(mg/jour) (mg/jour) (mg/jour)
thiamine
26
15
41
143
riboflavine
95
61
156
261
niacine
256
33
289
1804
acide
304
121
425
38
22
pantothénique
vitamine B6
26
22
48
96
100
biotine
5
1
6
14
100
acide folique
33
2
35
7
3
vitamine B12
0,4
0,2
0,6
70
10
1
basé sur des besoins d’une truie de 175 kg et ajusté pour une vache laitière de 650 kg.
2
adapté de Jennes (1985) et ajusté pour une production laitière de 35 kg / jour.
3
adapté de Miller et al. (1986) et Zinn et al. (1987).
De même, Girard et Matte (1989) ont montré que les folates sériques diminuaient de 40%
entre 2 mois postpartum et la parturition suivante. Ces auteurs ont aussi constaté que les vaches
supplémentées en acide folique avaient, en début de lactation, un faible statut en vitamine B12 qui
pourrait interférer sur le métabolisme de l’acide folique. Ces résultats laissent également
suspecter un besoin additionnel en vitamine B12 chez ces animaux dans cette période critique
(Girard et Matte, 1999).
Même si les ruminants ont la capacité de synthétiser suffisamment de ces nutriments, des
carences marginales en vitamines B peuvent se produire lorsque les besoins en vitamines B sont
élevés ou que la synthèse microbienne est moins efficace particulièrement chez les vaches
42
laitières hautes productrices. En général, les concentrations plasmatiques sont les premières à
diminuer, suivie par une déplétion des réserves tissulaires. Les organes vitaux (comme le cerveau
et le foie) sont les derniers à perdre leur réserve (Bailey, 1990).
II-5 ACIDE FOLIQUE, VITAMINE B12 ET MÉTHIONINE
II-5.1 Acide folique
II-5.1.1 Structure et définition
L’acide folique a été isolé pour la première fois en 1941 à partir de feuilles d’épinard
(Cossins, 2000). Il est composé d’une base ptéridine, d’une molécule d’acide p-aminobenzoïque
(PABA) et d’une chaîne, plus ou moins longue, formée d’une succession de molécules d’acide
glutamique liées par des liaisons peptidiques, jusqu’à huit résidus glutamate ont été dénombrés
dans cette chaîne (McDowell, 2000; Figure 14).
Le noyau ptéridinique des folates peut exister sous 3 états d’oxydation : totalement oxydé
ou sous les formes réduites 7,8-dihydro (DHF) ou 5,6,7,8-tétrahydrofolate (THF). Les
tétrahydrofolates,
sous
leurs
formes
polyglutamates,
sont
biologiquement
actifs,
et
majoritairement présents dans la cellule sous la forme pentaglutamate (Bollheimer et al., 2005).
L’unique fonction biochimique de l'acide folique chez les mammifères est d'accepter puis de
libérer des unités monocarbonées. Donc les formes cellulaires des folates peuvent être
différentes selon le type d'unité à un carbone qu'ils transportent sur les atomes d’azote
numérotés 5 et 10 : 5-formyl-THF, 10-formyl-THF, 5,10-méthényl-THF, 5-méthyl-THF
(principale forme circulante) ou 5,10-méthylène-THF (Tableau 2). Ainsi, les différentes
fonctions physiologiques des folates vont découler de cette diversité (Smulders et Stehouwer,
2005).
43
R
O
H
N
4
3
2 1
N
H2N
COOH
N
4a 5
CH2
6
8 7
9
8a N
5’ 6’
4’
1’
3’ 2’
N
10
H
CO
NH
CH
CH2
CH2
X
C
Y
O
2-amino-4-oxo-6-méthylène-ptéridine
Acide para-aminobenzoïque
Acide L-glutamique
Acide para-amino-benzoylglutamique
Acide ptéroïque
Acide folique
Figure 14 : Structure chimique de l’acide folique (ou acide ptéroylglutamique) (voir le tableau 2
pour la signification de R, X et Y).
N
5
CH2
6
8 7
N
Nom
R
X
H
-H sur N
10
-CH3 sur N10
-CHO sur N10
N
5
6
8 7
N
H
CH2
H
H
N
5
6
8 7
N
H
H
H
H
H
-CH3 sur N5
Acide 5-méthyl-DHF
(5-CH3-DHF)
-H sur N10
5,6,7,8-tétrahydrofolate
(THF)
-CH3 sur N5
5-méthyl-THF
(5-CH3-THF)
-CHO sur N5
5-formyl-THF
(5-CHO-THF)
-CHO sur N
CH- sur N5 N10
-CH2- sur N5 N10
monoglutamate
10-formyl-AF
(10-CHO-AF)
Acide 7,8-dihydrofolique (DHF)
10
-OH
10-méthyl-AF
(10-CH3-AF)
-H sur N10
CH2
Y
Acide folique (AF)
10-formyl-THF (10CHO-THF)
5,10-méthényl-THF
(5,10-CH+-THF)
5,10-méthylène-THF
(5,10-CH2-THF)
COOH
NH
CH
CH2
CH2
COOH
diglutamate
COOH
NH
CH
CH2
COOH
CH2
C
NH
O
CH
CH2
CH2
COOH
polyglutamate
(non diglutamate)
1 < m< 6
Tableau 2 : Principaux folates ayant une activité biologique (selon Bollheimer et al., 2005).
44
II-5.1.2 Données nutritionnelles : sources alimentaires et besoins
La plupart des folates, présents dans les aliments, sont sous forme de THF réduits pouvant
porter différents groupes monocarbonés et liés à une chaîne de polyglutamates. Les folates
alimentaires se retrouvent principalement dans les végétaux (épinards, salades, luzerne, grains de
maïs et ses dérivés), les fruits (orange), dans le foie des animaux et dans certaines préparations de
levures ou de bactéries (McDowell, 2000). Nous avons vu que, chez les ruminants, une synthèse
de folates se produit dans le rumen et pourrait ne pas être suffisante dans des conditions
physiologiques particulières telles que la gestation et la lactation qui augmentent les besoins en
cette vitamine (Girard et al., 1995; Girard et Matte, 1998). Mais jusqu’à présent, aucune
recommandation chiffrée n’a été établie pour les ruminants.
II-5.1.3 Biodisponibilité et métabolisme : absorption intestinale, distribution,
transport, stockage et excrétion
Le terme de biodisponibilité est utilisé pour décrire l’efficacité globale de l’utilisation des
folates lors de leur absorption intestinale, transport, métabolisme et excrétion.
II-5.1.3.1 Absorption intestinale (Figure 15) :
Les folates polyglutamates, qui constituent les formes naturellement présentes dans les
aliments, doivent être hydrolysés en leurs formes monoglutamates avant leur absorption par la
muqueuse intestinale (McDowell, 2000; Smulders and Stehouwer, 2005). Cette hydrolyse peutêtre catalysée par 2 types de conjugases, l’une issue des sécrétions pancréatiques (γ-glutamyl
hydrolase, γGH) et l’autre associée à la membrane de la bordure en brosse jéjunale (glutamate
carboxypeptidase IV, GCPIV) (Gregory, 2001). L’absorption des folates monoglutamates se
produit dans le jéjunum (Girard et Remond, 2003) par 2 processus distincts : l’un actif et
saturable à un pH optimum acide (Gregory, 2001) et l’autre par diffusion passive lorsque les
concentrations en acide folique deviennent supérieures à 10 µM (Blair et al., 1974). Une fois
absorbés dans la cellule intestinale et avant d’être libérés dans la veine porte, les folates
monoglutamates sont réduits grâce à la dihydrofolate réductase en THF, et subissent une
45
méthylation (5-méthyltétrahydrofolate, 5-MTHF) ou une formylation (Le Grusse et Watier, 1993;
Smulders and Stehouwer, 2005).
II-5.1.3.2 Folates sanguins (Figure 15) :
La forme 5-MTHF monoglutamate de la vitamine est sa forme plasmatique chez l’humain
(Lucock, 2000) et chez la vache (données non publiées). Les folates plasmatiques peuvent être
liés à des protéines de faible affinité, principalement l’albumine, ou à une protéine à affinité
élevée, la Folate Binding Protein pouvant être liée à la membrane cytoplasmique de différents
tissus ou soluble dans différents fluides (plasma, lait) (Henderson, 1990). Selon une étude récente
chez l’homme (Lin et al., 2004), bien que le rôle des folates dans le processus d’hématopoïèse est
non négligeable car les folates érythrocytaires constituent la principale forme de stockage de cette
vitamine, seulement 0,25% des folates plasmatiques sont destinés à la moelle osseuse alors que
98,5% sont captés par les viscères. Les folates sont alors amenés au foie, puis redistribués aux
tissus périphériques sous la forme de 5-MTHF monoglutamates ou encore recyclés en suivant le
cycle entérohépatique (Steinberg, 1984).
II-5.1.3.3 Transport et distribution tissulaire (Figure 15) :
Les folates sont transportés à travers les membranes cellulaires sous leur forme
monoglutamates. Plusieurs systèmes sont impliqués; parmi les mieux caractérisés, il y a le
transporteur des folates réduits (RFC, Reduced Folate Carrier) qui assure un transport facilité et
bidirectionnel des folates et les récepteurs des folates qui permettent l’entrée des folates dans la
cellule par endocytose (Matherly et Goldman, 2003). Les folates se retrouvent majoritairement
dans le foie et les globules rouges sous leurs formes polyglutamates, synthétisées à partir des
formes monoglutamates grâce à la folylpolyglutamate synthétase (Lucock, 2000; Smulders and
Stehouwer, 2005), et c’est sous cette forme qu’ils sont actifs comme coenzymes. La régulation
métabolique des folates dépend de deux processus physiologiques importants : la capacité de
captation du tissu et la rétention des folates tissulaires (Steinberg, 1984). La capacité de captation
des tissus varie en fonction de la présence des récepteurs des folates et de RFC membranaires
alors que la rétention des folates par les tissus est contrôlée par la « polyglutamylation » des
46
folates. L’ajout de résidus glutamate permet à la cellule de retenir les folates en limitant leur
sortie (Shane et Stokstad, 1985).
II-5.1.3.4 Excrétion :
Le fait que seulement 1 à 2% des folates alimentaires soient excrétés sous forme intacte
dans les urines suggère que la majorité des folates sont catabolisés avant leur excrétion urinaire.
La première étape de ce catabolisme est le clivage de la liaison du carbone 9 et de l’azote 10 des
folates polyglutamates intracellulaires, conduisant à la production de ptéridines et de paraaminobenzoylpolyglutamates (pABGn). Ces derniers sont ensuite hydrolysés en monoglutamate
(pABG) puis N-acétylés en acétamidobenzoylglutamate (apABG) au niveau hépatique avant leur
élimination (Caudill et al., 1998). Chez la femme, le catabolisme des folates est connu pour être
augmenté pendant la grossesse. Selon les travaux de Higgins et al. (2000), l’apABG augmente de
70% durant le premier trimestre de la grossesse.
L’excrétion biliaire de folates est très importante mais la plupart de ces folates seront
réabsorbés au niveau de l’intestin grêle (cycle entérohépatique), une faible proportion seulement
se retrouve dans les fèces (McDowell, 2000).
II-5.1.4 Métabolisme cellulaire
Au niveau cellulaire, les folates sont localisés dans le cytosol et la mitochondrie, et les
formes présentes dans chacun des deux compartiments sont différentes (Lucock, 2000). Par
exemple, dans le cytoplasme des cellules du foie de rat, 45% des folates réduits sont sous forme
de méthyle-THF, 30% sous forme de formyle-THF et 25% sous forme non-substituée. Le
métabolisme mitochondrial des unités monocarbonées fournit des groupements monocarbonés au
métabolisme cytoplasmique, notamment par l’intermédiaire du formate (Appling, 1991).
47
RFC
FR
pABG
Reins
Urine
Figure 15 : Absorption, métabolisme, stockage et excrétion des folates (FBP, Folate Binding
Protein ; MBBI, Membrane de la Bordure en Brosse Intestinale ; MG, MonoGlutamate ; PG,
PolyGlutamate ; FPGS, FolylPolyGlutamate Synthétase ; γ-GH, γ-Glutamyl Hydrolase ; GCPIV,
Glutamate CarboxyPeptidase IV ; AF, Acide Folique ; DHF, DiHydroFolate ; THF,
TétraHydroFolate ; 5-CH3-THF, 5-méthyl-THF ; pABG, p-AminoBenzoylGlutamate ; RFC,
Reduced Folate Carrier ; FR, Folate Recepteur).
48
Dans la cellule, les folates sont des cofacteurs importants de plusieurs voies métaboliques
(Bässler, 1997). Le 5-MTHF, absorbé par la cellule, étant un pauvre substrat pour la
folylpolyglutamate synthétase, il sera préalablement déméthylé par la méthionine synthase (MS)
qui est une enzyme dépendante de la vitamine B12 (Smulders and Stehouwer, 2005). L’ajout des
résidus glutamate, en plus d’augmenter la rétention des folates dans la cellule (Lucock,
2000), améliore l’affinité des folates pour les différentes enzymes (Bässler, 1997).
Le THF, produit par la MS ou issu de la réduction de l’acide folique en dihydrofolate
(DHF) puis THF sous l’action de la dihydrofolate réductase, agit comme transporteur d’unités
monocarbonées pour de multiples réactions (synthèse des bases purine et pyrimidine, régénération
de la méthionine, catabolisme d'acides aminés) (Bässler, 1997). La source principale de
groupements carbonés est la sérine qui réagit avec le THF pour former le 5,10-méthylène-THF et
de la glycine grâce à la sérine hydroxyméthyltransférase (SHMT), enzyme dépendante de la
vitamine B6. La glycine, via le « glycine cleavage system », ainsi que le catabolisme de la choline
et l’histidine, par la voie de la forminoglutamate, fournissent des sources alternatives d’unités à
un carbone (Lucock, 2000).
Le 5,10-méthylène-THF va ensuite pouvoir être métabolisé selon trois voies métaboliques
différentes (Shane et Stokstad, 1985; Smulders and Stehouwer, 2005; Figure 16) :
- La première voie implique la thymidylate synthase qui catalyse la formation du
déoxythymidylate (dTMP) à partir de la déoxyuridylate (dUMP). Cette réaction, en plus de
synthétiser des bases pyrimidines, produit également du DHF, lequel devra être réduit par la
dihydrofolate réductase en THF pour être de nouveau métaboliquement actif (Lucock, 2000).
- La deuxième voie métabolique permet la formation du 10-formyl-THF suite à deux
réactions réversibles : la 5,10-méthylène déshydrogénase et la 5,10-méthényl cyclohydrolase. Le
10-formyl-THF peut aussi être synthétisé à partir du THF et de l’acide formique par la 10-formylTHF synthétase. La glycinamide ribonucléotide (GAR) et l’aminoimidazole-4-carboxamide
ribonucléotide (AICAR) vont recevoir une unité carbonée du 10-formyl-THF leur permettant de
développer l’anneau purine (Lucock, 2000).
- La troisième voie consiste à fournir les groupements méthyles nécessaires à la
reméthylation de l’homocystéine, par le biais de la MS-vitamine B12 dépendante, qui conduit à la
synthèse de méthionine et aboutit à la formation de S-adénosylméthionine (SAM), le principal
49
agent méthylant impliqué dans plus d’une centaine de réactions de transméthylation (développée
dans le chapitre II-5.3.4). Dans ce cas, la 5,10-méthylène-THF est réduite en 5-MTHF par une
flavoprotéine, la 5,10-méthylène-THF réductase (MTHFR) (Green et al., 1988). Le donneur
d’électron impliqué dans cette réaction est le Flavine Adénine Dinucléotide Réduit (FADH2), un
coenzyme issu de la vitamine B2 (riboflavine). Cette réaction est irréversible en condition
physiologique.
Le métabolisme des groupements méthyles et des autres unités monocarbonées est
hautement régulé (Shane et Stokstad, 1985; Bailey et Gregory, 1999). Le transfert de carbones de
la sérine vers le THF par la SHMT est inhibé par 5-MTHF et le 5-formyl-THF. Un autre
mécanisme de régulation résulte de l’inhibition de la MTHFR par la SAM, ce qui empêche la
production de 5-MTHF. Ainsi, lorsque la concentration intracellulaire en groupements méthyles
devient importante, comme c’est le cas lors d’un apport élevé en méthionine ou en choline, la
SAM exerce un rétrocontrôle négatif sur la MTHFR, ce qui aboutit à une diminution de l’apport
de nouveaux groupements méthyles via 5-MTHF (Bailey et Gregory, 1999; Smulders and
Stehouwer, 2005).
Il ne faut pas non plus oublier qu’une carence sévère en folates peut conduire à un type
spécifique d’anémie chez l’homme, l’anémie mégaloblastique. Cette situation apparaît à cause
d’une altération de la division cellulaire qui est en relation avec le rôle joué par les folates dans
la synthèse des acides nucléiques (Bailey et Gregory, 1999; Lucock, 2000). De même, de par ses
fonctions dans les voies métaboliques, il n’est pas étonnant de constater l’importance des folates
dans les phénomènes de conception, gestation et croissance (Piedrahita et al., 1999; Burgoon et
al., 2002).
Vu l’implication des folates dans la synthèse des acides nucléiques et indirectement (par
l’intermédiaire de la SAM) dans la méthylation de l’ADN, ce composé pourrait jouer un rôle
crucial dans le maintien de la stabilité et la structure de l’ADN ainsi qu’au niveau de la régulation
transcriptionnelle (Kim, 1999; Choi et Mason, 2000; Duthie et al., 2002; Bollheimer et al., 2005).
50
HCY
5-méthyl-THF
MET
THF
MS, B12
FPG
Glun
SAM
Sérine
THFn
SHMT, B6
Glycine
5,10-méthylène-THF
MTHFR, B2
5-MTHF
GCS
MTD
5,10-méthényl-THF
THF
FTS
HCOO
MTCH
10-formyl-THF
GAR
Déoxyuridylate
Thymidylate synthase
AICAR
Déoxythymidylate
Purines
Purines
THFn
Dihydrofolate réductase
DHFn
Figure 16 : Métabolisme des unités monocarbonées dépendant de l’acide folique. AICAR,
aminoimidazole-4-carboxamide ribonucléotide ; DHFn, dihydrofolate ; HCOOH, acide formique ;
FPG, folypolyglutamate synthétase ; FTS, 10-Formyl-THF Synthétase ; GAR, glycinamide
ribonucléotide ; GCS, glycine cleavage system ; Glun, glutamate ; HCY, homocystéine ; MET,
méthionine ; MS, méthionine synthase ; MTD, 5,10-méthylène-THF déshydrogénase ; MTCH,
5,10-méthényl-THF cyclohydrolase ; MTHFR, 5,10-méthylène-tétrahydrofolate réductase ;
SAM, S-adénosylméthionine ; SHMT, sérine hydroxyméthyltransférase ; THFn, tétrahydrofolate
(Adapté de Lucock, 2000).
En effet, une carence en folates diminue la formation de dTMP. Le niveau bas de dTMP
va nuire à la synthèse et à la réparation de l’ADN tandis que l’accumulation de dUMP va
conduire à l’incorporation anormale d’uracile dans l’ADN. Ce phénomène est mutagénique
puisque l’uracile peut s’apparier avec la guanine et générer une mutation ponctuelle (Li et al.,
2003). Mais l’incorporation d’uracile dans l’ADN peut aussi conduire à une instabilité génétique
par un autre mécanisme. Plusieurs enzymes (endonucléases et glycosylases) sont capables
d’exciser l’uracile anormalement incorporée en créant ainsi des cassures simples brins. Ces
cassures, si la carence en folates est durable et si deux uraciles sur des brins opposés sont
51
excisées, peuvent conduire à l’apparition de cassures double brins, puis à des dommages
chromosomiques contribuant à la carcinogenèse (Li et al., 2003). Par ailleurs, en diminuant la
production
de
dTMP,
la
carence
en
folates
altère
le
pool
intracellulaire
des
désoxyribonucléotides, et par conséquent, la réparation de l’ADN.
De plus, la SAM est capable de méthyler les cytosines des séquences palindromiques
CpG de l’ADN, en particulier au niveau des promoteurs des gènes. Or la méthylation de l’ADN
est un déterminant épigénétique important dans la transcription des gènes, dans le maintien de
l’intégrité et de la stabilité de l’ADN, dans les modifications de la chromatine et dans l’apparition
de mutations (Jones et Baylin, 2002). Une carence en 5-MTHF peut donc conduire à une
hypométhylation de l’ADN qui est associée à une augmentation de l’expression des gènes
(Duthie et al., 2002).
II-5.2 Vitamine B12
La vitamine B12 ou cobalamine a été la dernière vitamine à être découverte en 1948 car
elle ne se trouve pas dans les végétaux mais est uniquement synthétisée par les microorganismes.
La cobalamine est une macromolécule composée d'un noyau tétrapyrrolique qui renferme en son
centre un atome de cobalt auquel sont reliés différents groupements permettant de répertorier
quatre formes actives de vitamine B12: cyanocobalamine, hydroxocobalamine (formes
oxydées et stables), méthylcobalamine et adénosylcobalamine (deux coenzymes réduits
présents chez les mammifères) (Le Grusse et Watier, 1993; Figure 17).
52
R = CN ; cyanocobalamine
R= OH ; hydroxycobalamine
R = CH3 ; méthylcobalamine
R = 5-désoxyadénosyl ; adénosylcobalamine
Figure 17 : Structure chimique de la vitamine B12.
Cette structure comprend également un nucléotide : le 5,6-diméthylbenzimidazole dont le
groupe imidazole est relié au cobalt et le phosphate a l’un des noyaux pyrrols (McDowell, 2000).
Ce nucléotide peut être remplacé par du benzimidazole ou de l’imidazole et alors former des
analogues de la vitamine B12 qui conservent donc une structure similaire tout en étant dépourvus
d’activité vitaminique. Parmi eux, on peut nommer la cobinamide méthyl phosphate qui agirait
comme inhibiteur compétitif en bloquant le système de transport des formes actives de la
vitamine B12 (Ishida et al., 1994). Il se pourrait aussi que certains de ces analogues soient formés
lors d’une étape intermédiaire de la biosynthèse de la vitamine B12 et soient alors des formes
inachevées de la vitamine (McDowell, 2000).
II-5.2.2 Données nutritionnelles : sources alimentaires, besoins, carences
Plusieurs espèces bactériennes présentes dans le tractus digestif et le rumen sont capables
de synthétiser la vitamine B12. Une telle synthèse a une importance considérable pour les
animaux coprophages et les ruminants qui, si l’apport en cobalt est adéquat (0,1 à 0,2 mg/kg pour
ces derniers), sont totalement indépendants des sources externes de vitamine B12 contrairement à
l’homme. Les aliments d’origine animale sont une bonne source de vitamine B12 notamment le
foie et le lait (542 et 54 µg/kg respectivement chez la vache laitière) (McDowell, 2000). Girard et
53
Matte (2005b) ont montré qu’un apport de 10 mg de vitamine B12, par injection intramusculaire, à
des vaches Holstein en lactation permet d’améliorer significativement les quantités retrouvées
dans le lait.
Chez les ruminants, seul un apport insuffisant en cobalt, pourrait faire apparaître des
signes de carence. Par contre, Sutton et Elliot (1972) soulignent également que le type de régime
alimentaire pourrait influencer la synthèse et l’utilisation de cette vitamine, notamment en
augmentant la production d’analogues de la vitamine B12 avec une alimentation riche en
concentrés. D’après le NRC (2001), les besoins en vitamine B12 pour les bovins laitiers devraient
se situer entre 0,34 et 0,68 µg/kg de poids corporel. Chez l’homme, l’absence ou une diminution
de synthèse du facteur intrinsèque (protéine intervenant lors de l’absorption intestinale de la
vitamine B12) peut entraîner une carence suite à une malabsorption de la vitamine. Le résultat
d’une carence en vitamine B12 chez l’homme est une anémie pernicieuse accompagnée d’autres
signes cliniques aussi observés chez l’animal : lésions neurologiques, perte d’appétit et de
croissance, faiblesse musculaire pour les principaux (McDowell, 2000).
II-5.2.3 Métabolisme : absorption intestinale, distribution, transport,
stockage et excrétion
II-5.2.3.1 Absorption intestinale
Dans les aliments, la vitamine B12 reste attachée sur les protéines alimentaires. Le
processus d'absorption de cette vitamine est complexe car il va nécessiter l’intervention de
plusieurs composés capable de lier la vitamine.
Tout d'abord les sécrétions acides de l'estomac libèrent la cobalamine des protéines
alimentaires. Dans le milieu acide qu’est l’estomac, cette dernière va alors préférentiellement se lier
à une protéine anciennement appelée « protéine R », l’haptocorrine, d'origine salivaire et
gastrique, jusqu'à ce que les enzymes pancréatiques la détruisent (Russell-Jones et Alpers, 1999).
De nouveau libre dans un environnement plus alcalin, la vitamine B12 va pouvoir se complexer au
facteur intrinsèque (Nicolas et Guéant, 1994). Le facteur intrinsèque est une glycoprotéine
(mucoprotéine) sécrétée par les cellules pariétales de l'estomac, qui va permettre à la cobalamine
de franchir la barrière intestinale au niveau iléal (Ganesan et al., 2002). Il est sécrété en grande
quantité par rapport aux besoins de liaison avec la vitamine B12; seulement 1% du facteur
54
intrinsèque total est utilisé. En se liant à la vitamine B12, le facteur intrinsèque se dimérise ce qui
lui confère une meilleure résistance à la protéolyse et en même temps protège la vitamine B12 du
catabolisme
par
les
bactéries
intestinales
(Combs,
1998).
Le
complexe
facteur
intrinsèque/vitamine B12 va se fixer sur un récepteur spécifique de la bordure en brosse des
cellules épithéliales de l’iléon : la cubiline. Ce récepteur possède deux sites de liaison : l’un est
spécifique à la partie protéique du facteur intrinsèque et l’autre spécifique à la cobalamine
(Nicolas et Guéant, 1994). Une fois fixée au récepteur, le complexe va traverser la paroi du tube
digestif par endocytose et le facteur intrinsèque est dégradé dans l’entérocyte libérant ainsi la
vitamine B12 dans le sang sous une forme liée à une protéine : la transcobalamine II (Seetharam
et al., 1999; Seetharam et Li, 2000; Figures 18 et 19).
Vitamine B12
Protéine Alimentaire
(cobalophiline)
Protéine R
(Haptocorrine)
Facteur Intrinsèque
Cubiline
SANG
ESTOMAC
PANCREAS
ILEON
Figure 18 : Mécanismes d’absorption de la vitamine B12 (Tiré de Le Grusse et Watier, 1993).
Donc les patients ayant une diminution de sécrétion d’acide gastrique, un
dysfonctionnement du pancréas ou une atrophie du fundus, où est produit le facteur intrinsèque,
vont absorber faiblement la vitamine B12 (Allen et al., 1978; Behrns et al., 1994; Cohen et al.,
55
2000). Vu la complexité des mécanismes d’absorption, l’absorption de la vitamine B12 est lente
(pic de concentration sanguine entre 6 et 8 heures après ingestion) et limitée (l’absorption est
saturée au-delà de 0,7 à 1,1 nmol) (Combs, 1998).
A des plus fortes concentrations, il existe aussi un mécanisme d’absorption passive
indépendant du facteur intrinsèque mais dont l’efficacité est faible (1% de la dose ingérée) (Le
Grusse et Watier, 1993). Chez les ruminants, 3% du cobalt ingéré va être converti en vitamine B12
dans le rumen et seulement 1 à 3% de cette vitamine produite va être absorbée (McDowell, 2000).
II-5.2.3.2 Transport sanguin
Dans le sang, la vitamine B12 est toujours liée à des protéines de transport spécifiques, les
transcobalamines ou l’haptocorrine sérique, qui assurent l’internalisation dans les cellules grâce à
un phénomène d’endocytose qui s’opère au niveau des récepteurs membranaires (Seetharam et
al., 1999; Figure 19).
Il existe trois types de transcobalamines : la transcobalamine I est impliquée dans le
stockage de la cobalamine, la transcobalamine II a un rôle dans le transport intracellulaire de la
vitamine B12 et enfin la transcobalamine III, dont les fonctions encore inconnues, semblerait
participer à la captation de la vitamine B12 par les hépatocytes (McDowell, 2000). La
transcobalamine de type II est la plus étudiée car elle facilite le transfert dans le sang portal de la
vitamine B12 (Quadros et al., 1999) et que le dosage de cette protéine plasmatique saturée en
cobalamine (holo-transcobalamine) serait un marqueur sensible d’une carence en cette vitamine
(Herrmann et Geisel, 2002; Nexo et al., 2000).
II-5.2.3.3 Entrée et distribution tissulaire
Le complexe vitamine B12-transcobalamine II, présent dans le sang portal, se combine
aux récepteurs spécifiques présents dans les membranes cellulaires de nombreux tissus (Figure
19). Ce récepteur existe sous deux configurations : monomérique, forme minoritaire et inactive,
ou dimérique qui prédomine et permettrait d’assurer sa fonction d’importation de la vitamine B12
dans la cellule (Bose et Seetharam, 1997). Cette dimérisation du récepteur nécessite la présence
de cholestérol présent dans la bicouche lipidique constituant la membrane cellulaire, sinon il
56
reste sous forme de monomère (Bose et al., 1996). L’entrée dans la cellule de la vitamine B12 se
fait par endocytose et dans le cytoplasme, les vésicules d’endocytose fusionnent avec des
lysosomes. Après la dégradation lysosomale de la protéine de transport, la cobalamine libre est
essentielle soit pour sa rétention intracellulaire ou son utilisation en tant que coenzyme
(Seetharam et al., 1999; Figure 19).
Lumière
intestinale
IF-Cbl
IF-R/Cubiline
IF-Cbl
Synthèse
endogène
TCII
Méthionine
synthase
Dégradation TCII
IF-Cbl
TCII
TCII-Cbl
TCII
MeCbl
Cbl
AdoCbl
Lysosomes
IF-Cbl
TCII-Cbl
Me-MalonylCoA
mutase
TCII-Cbl
Dégradation IF
dans lysosomes
Cholestérol
TCII-R
TCII-Cbl
Circulation
sanguine
TCII-Cbl
Figure 19 : Implication des protéines de transport de la vitamine B12 dans les mécanismes
d’absorption intestinale (figure de gauche) et d’entrée de la vitamine dans les cellules (figure de
droite). Les flèches en pointillés représentent les voies encore inconnues. (Cbl, Cobalamine ;
MeCbl, méthylcobalamine ; AdoCbl, Adénosylcobalamine ; IF, facteur intrinsèque ; MeMalonylCoA mutase, méthylmalonylCoA mutase ; TCII, transcobalamine II) (Adapté de
Seetharam et al., 1999).
La vitamine B12 est stockée en quantité significative dans les différents organes dont
approximativement 60% dans le foie humain (Le Grusse et Watier, 1993). Des travaux chez la
vache laitière suggèrent que le foie apparaît aussi comme un organe central dans le stockage et le
métabolisme de la vitamine B12. Après l’ingestion de 500 mg de cyanocobalamine, Girard et al.
(2001) ont montré que 27% de la cyanocobalamine est retrouvée dans le sang portal et 46% de la
vitamine libérée dans le sang portal serait extraite par le foie.
57
II-5.2.3.4 Excrétion
Au total, l’élimination quotidienne de la vitamine B12 est de 2 à 5 µg chez l’homme
(McDowell, 2000). La cobalamine, non utilisée par l’organisme, est éliminée dans la bile, par
voie fécale ou dans les urines mais cette dernière voie est minimale (< 0,25 µg/jour) (Le Grusse
et Watier, 1993).
La majorité de la vitamine B12 excrétée par la bile dans l’intestin est réabsorbée au niveau
iléal (environ 65 à 75%) selon le mécanisme d’absorption actif impliquant le facteur intrinsèque
(McDowell, 2000). Ce cycle entérohépatique constitue un moyen très efficace de conservation
de la vitamine B12.
II-5.2.4 Métabolisme cellulaire
Dans les tissus périphériques, les formes actives de la vitamine B12 sont
l'adénosylcobalamine, au niveau mitochondrial, qui sert de coenzyme à la méthylmalonyl-CoA
mutase et la leucine-2,3-aminomutase (première étape dans la dégradation de cet acide aminé)
et la méthylcobalamine, dans le cytoplasme, qui est indispensable au bon fonctionnement de la
MS (McDowell, 2000; Figure 20). Chez l’homme, la méthylcobalamine constitue 60 à 80% de la
cobalamine plasmatique, pendant que l’adénosylcobalamine est majoritaire dans toutes les
cellules des différents tissus (60 à 70% dans le foie) (McDowell, 2000).
Au niveau cytoplasmique, la réaction de transméthylation dépendante de la
méthylcobalamine explique pourquoi cette vitamine joue un rôle fondamental (Krautler, 2005)
dans les tissus à renouvellement rapide (THF est impliqué dans la synthèse de l’ADN, voir
chapitre II-5.1.4) ou ayant un métabolisme protéique intense (régénération de la méthionine)
(McDowell, 2000). En effet, les relations étroites entre la vitamine B12 et le métabolisme des
folates sont mises en évidence avec l’hypothèse du « methyl trap ». La MS, avec son coenzyme,
enlève le groupe méthyle du 5-MTHF et permet la régénération de la méthionine à partir
d’homocystéine et du THF, accepteur de groupements monocarbonés et impliqué entre autre dans
la synthèse des acides nucléiques. Mais avec une carence en vitamine B12, la MS ne déméthyle
pas efficacement le 5-MTHF qui va alors s’accumuler dans le plasma (augmentation de 50 à
100% chez le mouton) car il n’est pas bien retenu par les tissus (Smith et Osborne-White, 1973).
De telles conditions entraînent alors une carence fonctionnelle en folates qui empêche la synthèse
58
d’ADN et la régénération de la méthionine, ce qui peut entraver le cycle des méthylations (Shane
et Stokstad, 1985).
MITOCHONDRIE
CYTOPLASME
Méthylmalonyl-CoA
Succinyl-CoA
AdCbl
MéthylmalonylCoA mutase
Cbl
TCII
TCII-Cbl
Méthionine
synthase
Cbl
Homocystéine
MeCbl
5-mTHF
Méthionine
THF
Figure 20 : Métabolisme cellulaire de la vitamine B12. AdCbl, adénosylcobalamine ; Cbl,
cobalamine ; CoA, coenzyme A ; MeCbl, méthylcobalamine ; TCII, transcobalamine II ; 5mTHF, 5-méthyltétrahydrofolate, THF ; tétrahydrofolate (Adapté de Le Grusse et Watier, 1993).
L’adénosylcobalamine intervient dans une réaction d’isomérisation qui permet la
conversion du méthylmalonyl-CoA en succinyl-CoA (Krautler, 2005) qui pourra entrer dans le
cycle de Krebs et participer à la néoglucogenèse. Le méthylmalonyl-CoA peut être issu du
propionate (d’origine métabolique ou alimentaire), d’acides gras à nombre impair de carbones ou
encore du catabolisme de 4 acides aminés (isoleucine, valine, thréonine et méthionine). Le blocage
de la méthylmalonyl-CoA mutase, consécutif à un déficit en cobalamine, se traduit par une
accumulation d’acide méthylmalonique qui sera éliminé par voie urinaire (Combs, 1998).
II-5.3 Méthionine
La méthionine est un acide aminé essentiel, dont les apports sont souvent limitants pour
la productivité des vaches laitières (Schwab et al., 1992 ; Rulquin et al., 1993). La présence d’un
59
atome de soufre dans la molécule de méthionine la rend très hydrophobe, conférant ainsi des
propriétés particulières aux protéines qui la contient (Figure 21 A). En plus de son rôle comme
acide aminé constitutif des protéines corporelles, la méthionine joue également un rôle clé dans
les voies de transméthylation et transsulfuration (Finkelstein et Martin, 1986 ; Brosnan et
Brosnan, 2006 ; Brosnan et al. 2007).
COOH
H
C CH2 CH2 S CH3
NH2
A)
S
B)
Figure 21 : Structures chimiques A) de la méthionine B) et de son dérivé : la SAdénosylméthionine.
II-5.3.2 Méthionine dans la synthèse protéique
Alors que certains acides aminés sont uniquement impliqués dans la fonctionnalité des
protéines en maintenant une structure spatiale adéquate, la méthionine intervient aussi dans
l’initiation de la traduction. En effet, c’est l’acide aminé initiateur de la synthèse de toutes les
protéines eucaryotes. Lors de ce phénomène, l’ARNt spécifique de la méthionine (portant
l’anticodon : CAU), accompagné de plusieurs facteurs de traduction (notamment eIF-2 et de
GTP), de la sous-unité 40S du ribosome et d’ARNm, va pouvoir fixer la méthionine sur le codon
initiateur : AUG pour initier la synthèse protéique. Drabkin et RajBhandary (1998) suggèrent que
c’est la nature hydrophobe de la méthionine qui favorise la liaison entre l’ARNt et eIF-2. Avec
une double mutation dans le codon et l’anticodon, ils ont été capable de montrer que la valine,
acide aminé hydrophobe, pourrait initier la traduction dans les cellules des mammifères de
manière plus efficace que la glutamine de nature polaire.
L’hydrophobicité de la méthionine place l’acide aminé dans le cœur hydrophobe défini
par la structure tertiaire de la protéine mais elle pourrait aussi se trouver à la surface des protéines
60
(Levine et al., 1996). Brosnan et Brosnan (2006) précisent également que c’est un acide aminé
souvent retrouvé dans la bicouche lipidique des membranes. Tous les acides aminés sont victimes
des attaques de divers agents oxydants mais les plus sensibles à l’oxydation sont les acides
aminés aromatiques et soufrés (Stadtman, 1993). Et ainsi exposée, la méthionine peut donc être
oxydée en méthionine sulfoxide par diverses espèces oxygénées réactives. Néanmoins, ces
modifications oxidatives peuvent être réparées grâce à la présence de méthionine sulfoxide
réductase. De récentes études suggèrent que la méthionine dans les protéines pourrait constituer
un système endogène de défense antioxydant grâce à son cycle d’oxydation et de réduction
(Levine et al., 1996; Moskovitz, 2005). Les fonctions des protéines peuvent être affectées par
l’oxydation de certains de leur résidu méthionine, créant des changements de conformation dans
les protéines du fait du remplacement de résidus hydrophobes (méthionine) par d’autres plus
hydrophiles (méthionine sulfoxide) (Moskovitz, 2005). Donc il apparaît que plusieurs protéines
pourraient être régulées selon le statut de leurs résidus méthionine (oxydé ou réduit).
II-5.3.3 S-adénosylméthionine et les réactions de méthylation
Le métabolite actif de la méthionine est la S-adénosylméthionine (SAM) qui est un
composé biologique important (Brosnan et al., 2007; Figure 21 B) car c’est le second substrat
enzymatique après l’ATP (Fontecave et al., 2004). La SAM est synthétisée lors d’une
réaction entre la méthionine et l’ATP catalysée par une méthionine adénosyltransférase
(Finkelstein, 1990).
L’utilité primordiale de la SAM est de donner son groupement méthyle à une grande
variété d’accepteurs (acide aminés, lipides, protéines, ADN, ARN,…). Ces réactions sont
catalysées par des méthyltransférases dont la propriété commune est d’être inhibées par
leur produit, la S-adénosylhomocystéine (SAH) (Brosnan et al. 2007; Williams et
Schalinske, 2007). Chez l’homme, il a été estimé que la guanidinoacétate Nméthyltransférase
(GAMT,
responsable
de
la
synthèse
de
créatine)
et
la
phosphatidyléthanolamine N-méthyltransférase (PEMT, synthèse de phosphatidylcholine)
sont les réactions de méthylation majeures utilisant la SAM (Stead et al., 2006).
Récemment, Mudd et al. (2007) soulignent également l’importance de la glycine N-
61
méthyltransférase (GNMT, synthèse de sarcosine) pour éliminer les excès de groupements
méthyles.
Selon Stead et al. (2006), la PEMT serait la méthyltransférase qui consomme la
majorité des groupes méthyles fournit par la SAM; cette réaction a un impact important sur
le métabolisme des lipides hépatiques. Cette enzyme catalyse une série de réactions par
lesquelles trois groupements méthyles sont donnés par la SAM pour transformer la
phosphatidyléthanolamine (PE) en phosphatidylcholine (PC) contribuant ainsi à former
trois molécules d’homocystéine (Ridgway et Vance, 1988). Chez l’homme, cette voie
métabolique serait responsable d’un tiers de la production de PC, le reste serait synthétisé à
partir de la choline par la voie CDP-choline (Williams et Schalinske, 2007). Ces deux voies
produisent différents types de PC: à partir de la choline, les principales espèces formées
contiennent des acides gras saturés à chaine moyenne alors que la PEMT forme de la PC
avec des acides gras polyinsaturés à longues chaines (DeLong et al., 1999). En utilisant des
souris « knockout » pour le gène PEMT, Noga et al. (2002) ont montré que la PC formée
par cette voie est préférenciellement utilisée pour la synthèse des VLDL où il représente le
lipide majoritaire. En effet, les souris PEMT -/- de cette étude voient leur production de PC
diminuer ainsi que la sécrétion des VLDL, menant à une accumulation de lipides dans le
foie et à une stéatose. De plus, il est intéresant de noter qu’une inhibition de la PEMT va
modifier les compositions en acides gras du plasma et des membranes. Or le ratio PC/PE
est un marqueur de la fluidité membranaire et par conséquent, la méthylation de ces
phospholipides va jouer un rôle important dans la transduction des signaux à travers des
récepteurs membranaires (Sugden, 2006).
II-5.3.4 Le métabolisme de la méthionine
II-5.3.4.1 Les voies métaboliques
Le métabolisme de cet acide aminé est subdivisé en transméthylation, reméthylation et
transsulfuration (Scott, 1999; Selhub, 1999; Mason, 2003; Brosnan et Brosnan, 2006; Brosnan et
al., 2007; Figure 22). La transméthylation implique l’activation de la méthionine en SAM par une
méthionine adénosyltranférase, suivie par un transfert du groupement méthyle de SAM par une
62
méthyltransférase. La transméthylation est complétée par une hydrolyse réversible de SAH en
homocystéine et adénosyle.
L'homocystéine se retrouve à l'intersection de deux voies métaboliques : la reméthylation
et la transsulfuration. La MS reméthyle l’homocystéine en méthionine en conservant ainsi le
squelette carboné de cet acide aminé. La MS utilise le 5-MTHF, produit par la MTHFR, comme
donneur de groupements méthyle. La MTHFR, en générant ainsi de nouveaux groupements
méthyles à partir du pool d’unités monocarbonés (méthylnéogénèse), joue un rôle métabolique
primordial car elle protège l’organisme des situations où les apports alimentaires en
groupements méthyles (méthionine, bétaine ou choline) seraient limitants. Les tissus hépatiques
et rénaux ont une alternative pour la reméthylation de l’homocystéine via la bétaine
homocystéine méthyltransférase (BHMT) dépendante du zinc (Melse-Boonstra et al., 2005).
Elle emploie la bétaine comme donneur de groupements méthyles.
Le catabolisme de la méthionine se fait par la voie de transsulfuration, une séquence de
réactions irréversibles catalysées par deux enzymes et qui aboutit à la production de cystéine à
partir de l'homocystéine. La condensation de la sérine avec l’homocystéine produit la
cystathionine grâce à la cystathionine bêta-synthase. La cystathionine est ensuite hydrolysée en
cystéine, alpha-kétobutyrate et ammoniac et cette réaction est catalysée par la cystathionine
gamma-lyase. Ainsi, la méthionine permet la synthèse de cystéine, un acide aminé non essentiel,
nécessaire non seulement à la synthèse protéique mais aussi pour la synthèse de glutathion. Par
ailleurs, après le passage par de nombreux intermédiaires, l’alpha-kétobutyrate peut permettre la
formation de succinyl-CoA, substrat du cycle de Krebs, pouvant, par la suite, mener à une
production de glucose via la néoglucogenèse. Cette voie dépend de la vitamine B12 au niveau de
la méthylmalonyl CoA mutase (MUT). Il est aussi important de souligner que cette même voie,
impliquant la MUT, est essentielle pour le métabolisme du propionate, des acides gras à nombre
impair de carbones et certains acide aminés : l’isoleucine, la valine, la thréonine et, comme décrit
ci-haut, la méthionine.
II-5.3.4.2 Les régulations
Vu l'importance de ces voies métaboliques, il n'est pas étonnant que de nombreux
chercheurs se soient intéressés à leur régulation (Selhub, 1999; Lucock, 2000; Rowling et al.,
63
2002; Brosnan et Brosnan, 2006). Le contrôle du métabolisme de la méthionine est complexe.
L’équilibre de l’homocystéine entre reméthylation et transsulfuration serait déterminé par la
disponibilité en groupements méthyles (Mudd et Poole, 1975). Chez l’homme, quand les
apports en groupements méthyles sont importants, le besoin de reméthylation est plus faible
donc l’homocystéine est majoritairement catabolisée. Dans le foie, il apparaît que cet équilibre
est régulé par les niveaux cellulaires en SAM par des mécanismes allostériques. La méthionine
adénosyltransférase est activée par son produit et, ainsi, les concentrations hépatiques de SAM
seraient élevées lors d’apports importants en méthionine. La SAM agit comme activateur de la
cystathionine bêta-synthase, stimulant ainsi la transsulfuration mais aussi comme inhibiteur de
la MTHFR, réduisant simultanément, la disponibilité des groupements méthyles pour la
reméthylation.
En plus, la GNMT, enzyme qui utilise la SAM pour méthyler la glycine et produire de la
sarcosine, est moins sensible à l’inhibition par la SAH qu’à l’inhibition allostérique du 5-MTHF
(Wagner et al., 1985; Luka et al., 2007). Ce système de régulation permet d’une part, aux
groupements méthyles d’être conservés pour des réactions de méthylation d’importance
biologique et, d’autre part, la formation de la sarcosine, un composé non toxique, qui n’a pas
d’utilité biologique connue hormis qu’elle peut être oxydée dans la mitochondrie pour générer
de la glycine, et donc permettre, si besoin est, le réapprovisionnement du pool des unités
monocarbonées. Cette réaction s’avère importante pour l’organisme car elle permet de réguler le
ratio SAM/SAH, considéré comme un indicateur de la capacité de méthylation dans la cellule
(Williams et Schalinske, 2007).
En résumé, quand l’apport en méthionine est suffisant, la SAM est produite en grande
quantité. Une fois les besoins majeurs de méthylation comblés, l’accumulation de la SAM va alors
inhiber la MTHFR, la synthèse de 5-MTHF ne s’avérant plus nécessaire et activer la dégradation de
l’homocystéine. Au contraire, avec un apport limité en méthionine, il y a moins de SAM formée
d’où une moindre inhibition de la MTHFR. Le 5-MTHF synthétisé est alors disponible pour la
formation de méthionine via la reméthylation de l’homocystéine et contribue à inhiber la GNMT,
dirigeant l’utilisation de la méthionine disponible vers les réactions essentielles de méthylation.
L’importante caractéristique du métabolisme de la méthionine est sa dépendance vis-àvis du statut en 4 vitamines B. L’acide folique, en tant que 5-MTHF, est accepteur et donneur
64
de groupements méthyles pour la MS. Le 5-MTHF est produit par la MTHFR qui contient du
FAD, un dérivé de la riboflavine (vitamine B2). L’activité de la MS dépend aussi de la vitamine
B12 qui agit comme coenzyme. Enfin le pyridoxal phosphate (vitamine B6) est le coenzyme pour la
cystathionine bêta-synthase et la cystathionine gamma-lyase. Par conséquent, puisque ces
vitamines sont impliquées dans les voies de reméthylation et transsulfuration, il n’est pas
surprenant que des carences en ces vitamines induisent des changements dans les niveaux
d’homocystéine (Strain et al., 2004).
II-6 CAS PARTICULIER DE LA VACHE LAITIERE
II-6.1 Caractéristiques du cycle des méthylations
Chez les animaux monogastriques, les principales sources alimentaires de
groupements méthyles sont la méthionine, la choline et la créatine. Par contre chez les
ruminants, l'alimentation est pauvre en créatine et méthionine, tandis que la choline est
détruite par la microflore ruminale (Dawson et al., 1981; Baldi et Pinotti, 2006) d'où la nécessité
pour ces animaux de développer des mécanismes adaptés. Le métabolisme des groupements
méthyles est généralement conservateur avec un taux relativement faible de catabolisme des
unités à un carbone (notamment de la choline) et un taux élevé de synthèse de novo des
groupements via la voie du THF (Snoswell et Xue, 1987; Pinotti et al., 2002). Les
précurseurs néoglucogéniques, principalement la sérine et la glycine, sont les principales
sources de ces nouveaux groupements méthyles. Par contre, dépendant de l’équilibre
énergétique et du stade physiologique, ces précurseurs peuvent être insuffisants chez le
ruminant. En effet, l’étude du métabolisme des groupes méthyles chez des brebis a mis en
évidence une augmentation de l’activité de la phospholipide méthyltransférase (PEMT) et
de la MS de 33 et 34% respectivement (Xue et Snoswell, 1985). Ainsi, en début de lactation
chez la vache laitière, la demande en groupements méthyles est élevée alors que la pression
pour la synthèse de glucose est augmentée pour supporter la production laitière et les
besoins
énergétiques
croissants
créant
une
compétition entre
néoglucogenèse
méthylnéogenèse pour les mêmes précurseurs (Armentano, 1994 ; Girard et Matte, 2005a).
et
65
Protéines
alimentaires
Protéines
corporelles
ADP+Pi
ATP
SHMT
Méthionine
THF
5,10CH2THF
DMG
MS
MTHFR
Bétaine
H2O
CBS
Glycine
GNMT
Sarcosine
X-CH3
SAHH
Homocystéine
Sérine
X
MT
Choline
BHMT
5-MTHF
SAM
MAT
Adenosine
SAH
H 2O
Cystathionine
H2O
CGL
NH4+ + alpha-ketobutyrate
Cystéine
Glutathion
Oxydation
Figure 22 : Le métabolisme de la méthionine. CBS, Cystathionine β-synthase; CGL,
Cystathionine γ-lyase; BHMT, Bétaine méthyltransférase; DMG, Diméthylglycine; GNMT,
Glycine N-méthyltransférase; MAT, Méthionine adénosyltransférase; MS, Méthionine synthase;
MT, Méthyltransférase; MTHFR, Méthylènetétrahydrofolate réductase; Pi, phosphate; SAH, Sadénosylhomocystéine;
SAHH,
S-adénosylhomocystéine
hydrolase;
SAM,
Sadénosylméthionine; SHMT, Sérine hydroxyméthyltransférase; THF, Tétrahydrofolate; 5MTHF, 5-méthylTHF; 5,10-CH2THF, 5,10-méthylèneTHF (d’après Brosnan et al., 2007).
II-6.2 Effet d’apports en acide folique et vitamine B12
Le métabolisme des groupements monocarbonés est un réseau de réactions biochimiques
interreliées qui aboutit non seulement à la production de groupements méthyles mais aussi de
cystéine et dont les éléments clés sont l'acide folique, la vitamine B12 et la méthionine (Le Grusse
et Watier, 1993; Figure 23). De plus la vitamine B12 est étroitement liée au métabolisme de
66
l’énergie et de la néoglucogenèse. En début de lactation, les besoins en groupements méthyles
ainsi qu'en glucose de la vache laitière sont très importants. Une compétition entre ces deux
métabolismes va rendre déterminants les apports en acide folique et vitamine B 12 pour la
vache laitière afin d'optimiser ces voies métaboliques.
Sous certaines conditions, les apports en acide folique peuvent être limitants pour la vache
laitière (Girard et al., 1995; Girard et Matte, 1998).
Dans une première expérience, ces auteurs rapportent que des injections intramusculaires
de 160 mg d'acide folique par semaine à des vaches laitières, ont permis d'augmenter la
production laitière, le transfert des folates dans le lait et enfin la teneur en protéines du lait
pendant la dernière moitié de la lactation. Après le vêlage, les suppléments d'acide folique ont
augmenté les concentrations des protéines du lait de 32,3 à 35,1 g/kg pour les vaches
multipares mais n’ont eu aucun effet chez les vaches primipares (Girard et al., 1995).
Des résultats similaires ont été mis en évidence dans une deuxième expérience (Girard et Matte,
1998) où les auteurs ont donné des suppléments alimentaires de 0, 2 ou 4 mg d'acide folique par
kilogramme de poids corporel à des vaches laitières pendant 4 semaines avant le vêlage et jusqu'à
305 jours de lactation. Ces supplémentations augmentent les folates dans le sérum et dans le lait.
Là encore, seule la production laitière des vaches multipares a augmenté linéairement avec les
quantités d'acide folique ingérées pendant les 305 jours de lactation. L’intensité de cette
réponse variait selon le stade de lactation: une augmentation de 6% de lait pour les vaches
multipares recevant 4 mg d'acide folique pendant les 100 premiers jours, de 10% entre 100 et
200 jours de lactation, et aucun effet pendant les 100 derniers jours. De plus une diminution de
l'azote non-protéique dans le lait, mise en évidence chez les vaches multipares nourries avec un
supplément en acide folique, indique que l'azote serait utilisé plus efficacement (Girard et Matte,
1998).
67
5-MTHF
Cystathionine
synthase
Cystathionine
Αlpha-ketobutyrate
SAM
Propionyl-coA
Sérine
SAH
Homocystéine
D-méthylmalonylCoA
Méthyl
malonylCoA
mutase
5-MTHFR
Méthionine
synthase
Cycle de reméthylation
Cycle de transsulfuration
Synthèse
ADN
THF
Formate
SAM
10-formylTHF
Cycle de Krebs
Cycle de l’acide folique
Méthionine
Sérine
Glycine
5,10MéthylèneTHF
L-méthylmalonylCoA
succinylCoA
SAM
B12
Propionate
5-MéthylTHF
B12
Substrat
CH3-substrat
Cystéine
Glucose
Activation
Inhibition
Figure 23 : Voies métaboliques impliquant l’acide folique et la vitamine B12 et leurs régulations
(BHMT, Bétaine Homocystéine MéthylTransférase; CBS, Cystathionine β Synthase; DMG,
DiMéthylGlycine; GC, γ Cystathioninase; GCL, Glutamate Cystéine Ligase; GNMT, Glycine NMéthylTransférase; GSH, Glutathion réduit; GSS, GSH Syntéthase; MAT, Méthionine
AdénosylTransférase; MMCM, MéthylMalonyl-CoA Mutase; MS, Méthionine Synthase;
MTHFR, 5,10-CH2-THF Réductase; SAH, S-AdénosylHomocystéine;
SAM, SAdénosylMéthionine; SHMT, Sérine HydroxyMéthylTransférase; THF, Tétrahydrofolate).
Dans ces deux expériences, les vaches ont reçu un régime alimentaire dont les apports
calculés en méthionine étaient inférieurs aux recommandations du NRC (2001). Donc les effets
obtenus pourraient avoir été en partie médiés par une amélioration de la capacité de
régénération de la méthionine et une amélioration du cycle des méthylations. De plus, malgré un
apport adéquat en cobalt, les teneurs plasmatiques en vitamine B12 étaient basses en début de
lactation mais remontaient à partir de 8 à 12 semaines de lactation. Ceci pourrait venir d'une prise
alimentaire qui, en début de lactation, n'est pas à son maximum ce qui en plus pourrait favoriser
68
la synthèse, par les microorganismes du rumen, d'analogues de la vitamine B12 au détriment
des formes biologiquement actives (Girard et Matte, 1999).
Ces mêmes auteurs ont donc entrepris une troisième étude afin d’éclaircir les interactions
entre des suppléments alimentaires d’acide folique et de méthionine protégée de la dégradation
ruminale sur les performances de lactation et le métabolisme des folates chez des vaches laitières
multipares durant 305 jours de lactation. Toutes les vaches ont reçu une alimentation de base
couvrant 70% des besoins en méthionine mais pour la moitié d’entre elles, de la méthionine
protégée de la dégradation ruminale a été ajoutée à la ration de base. A l’intérieur de chaque niveau
de méthionine, 0, 3 ou 6 mg d’acide folique par kg de poids corporel ont été distribués. La
production laitière et le rendement en composantes du lait n’ont pas été affectés par les
suppléments mais seules les vaches, recevant les apports supplémentaires en méthionine, ont eu
une augmentation des concentrations en protéines du lait. Néanmoins les concentrations de
vitamine B12 plasmatiques sont restées faibles pendant toute la lactation même si ces
concentrations ont évolué au cours de la lactation de façon similaire à celles décrites
antérieurement. Il est donc possible que, malgré un apport adéquat en cobalt, le faible statut en
vitamine B12 surtout en début de lactation ait interféré avec le métabolisme des folates lors de cette
expérience (Girard et al., 2005).
C’est pourquoi leurs travaux se sont orientés vers une nouvelle étude dans laquelle les
vaches laitières primipares, recevant la même ration de base que l’expérience précédente (Girard
et al., 2005), additionnée de méthionine protégée de la dégradation ruminale et de suppléments
alimentaires journaliers d'acide folique (4 mg / kg de poids corporel), ont reçu ou non des
injections intramusculaires hebdomadaires de vitamine B12 de la 4e à la 18e semaine de lactation.
Ces injections ont eu tendance à augmenter la production laitière et ont augmenté le rendement
de ses composantes: solides totaux, gras, lactose et vitamine B12 (Girard et Matte, 2005b). En
plus, l’augmentation de l’hémoglobine sanguine observée avec les suppléments d’acide folique et
de vitamine B12 se reflète par une amélioration de la synthèse d’ADN. Un tel résultat, combiné à
la diminution des concentrations plasmatiques en acide méthylmalonique chez les vaches
injectées avec la vitamine B12 supportent l’hypothèse, qu’en début de lactation, la vitamine B12
n’était pas optimale et limitait les performances des vaches laitières.
69
Graulet et al. (2007) ont étudié les effets de suppléments alimentaires d’acide folique (0
ou 2.6 g/jour) seuls ou en combinaison avec de la vitamine B12 (0 ou 0.5 g/jour) donnés de 3
semaines pré-vêlage jusqu’à 8 semaines post-vêlage sur les performances de lactation et le
métabolisme de vaches Holstein multipares. La production laitière et le rendement en protéines du
lait pendant les 8 premières semaines de lactation ont été augmentés chez les vaches recevant les
suppléments d’acide folique, seuls ou combinés aux suppléments de vitamine B12 sans toutefois
que la prise alimentaire ait été modifiée. Les suppléments de vitamine B12 n’ont eu aucun effet.
Par contre, chez les vaches ne recevant que le supplément d’acide folique seul, il y a eu une
augmentation des concentrations de lipides hépatiques (totaux, triglycérides, cholestérol) et une
diminution des concentrations plasmatiques de glucose par rapport aux vaches recevant le
supplément combiné d’acide folique et vitamine B12. Il semblerait donc que le supplément
combiné de ces deux vitamines améliore l’efficacité métabolique des vaches laitières.
II-7 HYPOTHÈSES DE TRAVAIL ET OBJECTIFS
En début de lactation, l’augmentation importante des besoins en nutriments impose aux
vaches laitières une réorganisation de leur métabolisme afin de s’adapter et fournir l’énergie, le
glucose et les acides aminés nécessaires pour répondre aux besoins de la glande mammaire. Les
travaux antérieurs ont démontré que l'apport en acide folique et vitamine B12 n'est pas toujours
suffisant pour maximiser la santé et la productivité des vaches laitières.
Considérant les rôles connus de l’acide folique, les effets rapportés suite à une
augmentation des apports en cette vitamine sur les performances de lactation pourraient être liée
à une action sur la synthèse de l’ADN et/ou le cycle des méthylations. Or l’élément clé du cycle
des méthylations est la SAM. Ces concentrations cellulaires dépendent de la disponibilité en
groupements méthyles qui peuvent être fournis pré-formés par la méthionine, la bétaïne et la
choline ou synthétisés de novo via le métabolisme des folates. Ainsi, si les effets de la
supplémentation en acide folique sur la productivité des vaches laitières sont médiés par une
amélioration du cycle des méthylations, des suppléments en méthionine devrait réduire les
besoins en acide folique et vitamine B12.
De plus, l’acide folique et la vitamine B12 agissent comme coenzymes dans plusieurs
réactions des grandes voies métaboliques de l’énergie et des protéines. Ces deux vitamines
70
pourraient aussi jouer un rôle important dans la régulation de ces voies métaboliques. Ainsi, les
suppléments en acide folique et vitamine B12 amélioreraient les performances de lactation des
vaches laitières en augmentant l’efficacité métabolique des métabolismes du glucose et des
protéines.
Les objectifs de cette thèse sont donc :
1. Déterminer les effets d’une augmentation des apports en acide folique et vitamine B12
pendant la période critique entourant le vêlage et le premier tiers de la lactation sur la
production et la composition du lait en fonction des apports en méthionine.
2. Préciser l’effet et le mode d’action de ces vitamines B sur les voies des métabolismes
énergétique et protéique.
Pour répondre à ces objectifs, la consommation, la production laitière et un certain nombre
de paramètres plasmatiques ont été suivis sur 60 vaches Holstein de 3 semaines pré-vêlage à 16
semaines de lactation. Pour comprendre les effets de l’acide folique, de la vitamine B12 et de la
méthionine, rapportés dans le chapitre III, sur les variables de production, les métabolismes du
glucose et de la méthionine ont été étudiés plus spécifiquement à l’aide d’infusions continues
avec des isotopes stables. Les résultats, présentés dans le chapitre IV, ont été renforcés par une
analyse en RT-PCR de l’expression de gènes impliqués dans ces voies métaboliques (chapitre V).
Cette étude constitue un pas supplémentaire vers l’évaluation des besoins en vitamines du
complexe B des vaches hautes productrices en début de lactation et vers des
recommandations précises pour leur inclusion dans les rations pour vaches laitières, si besoin est.
71
II-8 RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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83
CHAPITRE III
LACTATIONAL PERFORMANCE OF DAIRY COWS
ACCORDING TO FOLIC ACID AND VITAMIN B12 SUPPLY
AND METHIONINE PROVISION
Ce chapitre a été accepté avec corrections mineures pour publication dans la revue “Journal of
Dairy Science” le 14 août 2008 sous la référence de A. Preynat, H. Lapierre, M.C. Thivierge,
M.F. Palin, J.J. Matte, A. Desrochers and C. L. Girard. 2009. Lactational Performance of Dairy
Cows According to Folic Acid and Vitamin B12 Supply and Methionine Provision,. J. Dairy Sci.
xx : xx-xx et une version révisée sera publiée sous le titre “Influence of Methionine Supply on the
Response of Lactational Performance of Dairy Cows to Supplementary Folic Acid and Vitamin
B12 “.
84
III-1 RÉSUMÉ
Durant les 16 premières semaines de lactation, les injections intramusculaires d'acide
folique et vitamine B12 tendaient à augmenter la production laitière de 1,4 kg/jour aussi bien que
les rendements en lactose, protéines brutes et solides totaux, en début de lactation. La
supplémentation en méthionine protégée de la dégradation ruminale augmentait la concentration
des protéines du lait. Les vitamines B tendaient à diminuer les concentrations plasmatiques
d’homocystéine de 5,51 avec aucun supplément vitaminique à 4,54 et 4,77 ± 0,37 µM pour
l’acide folique seul ou combiné avec la vitamine B12, respectivement. Les résultats de la présente
étude suggèrent que les effets des suppléments combinés d’acide folique et de vitamine B12 sur
les performances de lactation des vaches laitières n’étaient pas dus à une augmentation de
l’apport en groupements méthyles puisque les suppléments de méthionine, une source de
groupements méthyles préformés, n’ont pas altéré la réponse des vaches aux suppléments
vitaminiques.
Mots-clés : vache laitière, acide folique, vitamine B12, méthionine protégée de la dégradation
ruminale
85
III-2 ABSTRACT
The present experiment was undertaken to determine if the effects of supplementary folic
acid on lactational performance were due to an improved methylneogenesis and if the supply in
vitamin B12 could affect with this metabolic pathway. In this eventuality, supplementary Met, a
major source of preformed methyl groups, should reduce the requirements for these vitamins.
Sixty multiparous Holstein cows were assigned to 10 blocks of 6 cows each according to their
previous milk production. Within each block, 3 cows were fed a diet estimated to supply Met as
1.83% metabolizable protein whereas the 3 other cows were fed the same diet supplemented with
18 g of rumen-protected methionine (RPM), to supply Met as 2.23% metabolizable protein.
Within each level of Met, cows received either no vitamin supplement, weekly intramuscular
injections of 160 mg of folic acid alone or combined with 10 mg of vitamin B12, from 3 wk
before to 16 wk after calving. There was no treatment effect on DMI during pre- and post-calving
periods, 13.4 ± 0.4 and 21.8 ± 0.4 kg/d, respectively. Milk production was not affected by RPM.
Folic acid and vitamin B12 given together tended to increase milk production during the 16 wk of
lactation. This effect was more pronounced during the first 4 wk of lactation, 37.5, 37.7 and 40.3
± 0.9 kg/d for cows receiving no vitamin supplement, folic acid alone or combined with vitamin
B12, respectively. Milk fat yield was not affected by treatments. Lactose, crude protein and total
solid yields were greater, in early lactation, in cows injected with folic acid and vitamin B12
together but this effect faded out as lactation progressed. Intramuscular injections of folic acid
alone or combined with vitamin B12 tended to decrease plasma concentrations of homocysteine
from 5.51 with no vitamin supplement to 4.54 and 4.77 ± 0.37 µM, respectively. Results of the
present experiment suggest that the effects of the combined supplement of folic acid and vitamin
B12 on lactational performance of dairy cows were not due to an improvement in methyl groups
supply as RPM supplement, a source of preformed methyl groups, did not alter the cow
responsiveness to vitamin supplements.
86
III-3 INTRODUCTION
Previous experiments (see review, Girard and Matte, 2005a), showed that supplementary
folic acid could increase milk and milk protein yields in dairy cows but responses to the vitamin
supplement were variable. The unique role of folic acid is the transfer of one-carbon units and it
is essential to two metabolic pathways: DNA synthesis and the methylation cycle.
Tetrahydrofolate (THF) accepts one-carbon units from donors such as Ser, Gly, His or formate
and transfers them for purine and pyrimidine synthesis for DNA synthesis. Reactions in this
pathway are reversible. Tetrahydrofolate, after being reversibly converted to 5,10-methyleneTHF could also become involved in the methylation cycle after its irreversible conversion to 5methyl-THF. The major function of the methylation cycle is to provide S-adenosylmethionine
(SAM), which is the major donor of methyl groups in mammals. After having given its methyl
group, SAM becomes S-adenosylhomocysteine and then, homocysteine (Hcy). Hcy, a nonstructural AA, could be catabolized through the transsulfuration pathway or remethylated to Met.
Remethylation of Hcy uses 5-methyl-THF as a source of de novo methyl groups. This reaction is
mediated by an enzyme, methionine synthase for which vitamin B12 is a coenzyme (Lucock,
2000). As the production of 5-methyl-THF is irreversible and as this form of folates can not be
retained in the cells, a deficiency of vitamin B12 can trap folic acid under its methylated form, 5methyl-THF, and reduces its cellular utilization (Scott and Weir, 1981; Bässler, 1997).
A parenteral supplement of vitamin B12, given to cows fed a basal diet supplemented with
folic acid and Met, increased milk component yields as compared to cows only supplemented
with Met and folic acid (Girard and Matte, 2005b). However, in cows fed a diet providing a low
Met supply, dietary supplements of folic acid, given alone or in combination with vitamin B12,
increased milk and milk protein yields (Graulet et al., 2007). It is noteworthy that, in this last
study, the two vitamins given together seem to improve metabolic efficiency by increasing
plasma glucose and decreasing accumulation of hepatic lipids as compared to folic acid alone
(Graulet et al, 2007). However, the mode of action of supplementary folic acid is fully not
elucidated.
Given the metabolic roles of folic acid, the effects of supplementary folic acid on
lactational performance could be related to its action on DNA synthesis and/or the methylation
cycle. Cellular concentration of SAM is function of the availability of methyl groups which are
87
provided as preformed labile methyl groups by Met, betaine and choline or from de novo
synthesis from folate metabolism as described above. If the effects of supplementary folic acid on
lactational performance of dairy cows are mediated through the methylation cycle, then
supplementary Met, a major source of preformed methyl groups for SAM synthesis, should
reduce the requirements for folic acid and vitamin B12. Therefore, given the importance of
vitamin B12 to prevent functional deficiency of folates and the role of Met, as a source of methyl
groups, the present experiment was undertaken to elucidate the metabolic pathways explaining
the effects of supplementary folic acid on lactational performance described previously.
III-4 MATERIALS AND METHODS
III-4.1 Cows and treatments
Sixty Holstein multiparous cows from the herd at the Agriculture and Agri-Food Canada
Research Centre (Sherbrooke, QC, Canada) were kept in a tie-stall barn under 16 h of light per
day (0630 to 2230 h) and were milked twice daily at 12 h intervals. Care of cows followed the
recommended code of practice of Agriculture Canada (1990) and the guidelines of the Canadian
Council of Animal Care (1993). The experimental period began 3 wk before the expected time of
calving and lasted until 16 wk after calving. Cows were fed a close-up diet for 3 wk before the
expected time of calving until calving and then a basal lactation diet (Tableau 3). Cows had free
access to water and were fed ad libitum allowing 10% of refusals. The TMR was served once
daily before calving, at 0800 h and twice daily after calving, at 0800 h and 1600 h. Long hay was
given at 0730 h during all the experimental period. The amount of feed served was recorded
every day whereas refusals were weighed daily at 0700 h, 5 d per wk. DMI was calculated per
week for each cow as follows: average amount of feed served per day (7 d/wk) minus average
amount of orts per day (5 d/wk).
Cows were assigned to 10 blocks of 6 cows each according to their average milk
production in the previous lactation (27.8 ± 0.5 kg/d). Treatments were tested according to a 2 ×
3 factorial arrangement. Within each block, 3 cows were fed the basal diet estimated (NRC,
2001) to supply Met as 1.83% of metabolizable protein (MP) supply (M-) whereas the three
other cows were fed the same diet supplemented daily with rumen-protected Met (RPM; M+: 9
88
and 18 g Mepron-85/d, Degussa AG, Hanau, Germany, pre and post-calving respectively). With a
net Met concentration of 85%, 73% of rumen by-pass protection and 82% of intestinal
digestibility (Berthiaume et al., 2001), the product used in the present experiment was estimated
to provide 9.2 g/d of Met after calving and to increase the estimated Met supply to 2.23% of MP
(NRC, 2001). Within each level of Met (M+ or M-), cows received either no vitamin supplement
(B9-B12-), weekly intramuscular injections of 160 mg of folic acid alone (pteroylmonoglutamic
acid, ICN Biochemicals inc., Cleveland, Ohio, USA; B9+B12-) or in combination with 10 mg of
vitamin B12 (cyanocobalamin, 5 000 µg/mL, Vetoquinol, Lavaltrie, Québec, Canada; B9+B12+).
The amounts of vitamin supplemented were selected according to previous experiments (Girard
et al., 1995; Girard and Matte, 2005b). The parenteral route was chosen, instead of dietary
supplementation, in order to isolate the effects of vitamins on cow metabolism and to rule out any
possible effect on ruminal microflora.
III-4.2 Sampling procedures
III-4.2.1 Feed
Forage samples were collected twice a week. A subsample was immediately analysed by
near infrared reflectance spectrometry, to adjust, when necessary, the amounts of energy and
protein supplements to maintain similar concentrations of energy and degradable and
undegradable proteins throughout the experimental period. Another subsample was frozen at 20°C for further analyses: DM, CP, ash, ether extract (AOAC, 1990), ADF, NDF, and aciddetergent lignin (Ankom200 fiber analyzer, Ankom Technology Corp., Fairport, NY) and
minerals by inductively coupled plasma emission spectrometry (Agri-Food Laboratories, Guelph,
ON, Canada).
III-4.2.2 Body weight
Body weight was recorded at 1300 h at 22 ± 4.6 d pre-calving and 14 ± 1.7, 28 ± 1.7, 56 ±
1.7, 84 ± 1.7, and 112 ± 1.9 d after calving.
.
89
III-4.2.3 Milk
Milk production was recorded at each milking. Milk samples were collected during 4
consecutive milkings at 13 ± 2, 27 ± 2, 55 ± 2, 83 ± 2 and 111 ± 2 d of lactation. Milk
composition (fat, protein, lactose and urea) was determined with near infrared reflectance
spectroscopy method (Valacta, Sainte-Anne-de-Bellevue, QC, Canada).
III-4.2.4 Blood
After the distribution of the morning meal, blood samples were collected at 24 ± 5 d precalving and 14 ± 2, 28 ± 2, 56 ± 2, 84 ± 2 and 112 ± 2 d after calving by caudal venipuncture,
using a Vacutainer® system (Becton, Dickinson and Co., Franklin Lakes, NJ). Tubes containing
EDTA were used for analyses of folates, vitamin B12, vitamin B6, biotin, BHBA and NEFA,
whereas tubes with heparin were used for AA, glucose and urea determinations. Blood was
centrifuged 20 min within one hour after sampling at 1,854 × g at 4oC. For amino acid analysis,
400 µL of plasma were mixed with 400 µL of Met sulfone (0.4 mM, internal standard, Sigma,
Oakville, ON, Canada). Plasma was kept frozen at -20oC until assayed.
III-4.3 Laboratory analyses
III-4.3.1 Folates and vitamin B12
Folates and vitamin B12 were determined in duplicate by radioassay using a commercial
kit designed for human plasma (Quantaphase folates II/vitamin B12, Bio-Rad Laboratories
Canada Ltd, Mississauga, ON, Canada) as described for plasma folates and vitamin B12 by Girard
and Matte (1988), milk folates by Girard and Matte (1998) and milk vitamin B12 by Preynat et al.
(2009, Chapitre IV). The interassay coefficients of variation were 4.2 and 4.8% for folates and
4.1 and 6.3% for vitamin B12 in plasma and milk, respectively.
90
III-4.3.2 Plasma biotin and vitamin B6
Biotin was determined using an ELISA test developed and validated for bovine plasma
(Santschi et al., 2005).
Plasma vitamin B6 was determined by a fluorimetric method adapted from Srivastava and
Beutler (1973) and Petidier et al. (1986). Five hundred microliters of plasma were diluted with
175 µL ultrapure water and vortexed. Seventy five microliters of 0.7 M Na2HPO4 and 125 µL of
0.2 M semicarbazide-HCl were added to tubes, vortexed and covered with aluminium foil. The
tubes were placed in boiling water for 5 min, rapidly cooled on ice, and 500 µL 12 % HClO4
were added. The tubes were centrifuged at 2,306 x g for 20 min at 4°C. A volume of 500 µL of
supernatant was taken and mixed with 2.5 mL of 0.1 M Na3PO4 just before measuring the
fluorescence (lambda excitation and emission were 360 and 460 nm, respectively). The interassay coefficient of variation was 1.2%.
III-4.3.3 Plasma urea, NEFA, glucose and BHB
Plasma urea, NEFA, glucose and BHBA were determined using commercial kits:
Diagnostic Chemicals Limited UREA ASSAY, BioPacific Diagnostic Inc., Charlottetown, PE,
Canada; NEFA-C from Wako Chemicals GmbH, Neuss, Germany; Roche Diagnostics Glucose
GmbH, Mannheim, Germany and Pointe Scientific Inc., β-hydroxybutyrate Reagent Set, Canton,
MI, respectively.
III-4.3.4 Total homocysteine, total cysteine and methionine in plasma
Total Hcy, total Cys and Met concentrations were determined in plasma by a modification
of the HPLC methods of Malinow et al. (1989) described in Girard et al. (2005). Further changes
are reported in Preynat et al. (2009, Chapitre IV).
91
III-4.3.5 Amino acids in plasma
Plasma concentrations of the other AA were determined by HPLC as described by
Preynat et al. (2009, Chapitre IV).
III-4.4 Statistical analyses
Two levels of Met supplementation (0 or 18 g of RPM) and 3 supplements of B-vitamins
(none, folic acid alone or both folic acid and vitamin B12) were used in a 2 × 3 factorial
arrangement in a 10 randomized complete block design. All variables were analyzed using the
MIXED procedure of SAS (2004) according to a complete block design with treatments as main
effects, repeated measures in time and block as random effect. As the time intervals were
different, the six following covariance structures were compared: SP(POW), SP(GAU),
SP(EXP), SP(LIN), SP(LINL) and SP(SPH). For each variable, the statistical analysis retained
was the one with the smallest fit statistic values. Results are reported as least square means and
standard errors of the means. Means were assumed to be different at P ≤ 0.05 and tended to differ
at 0.05 < P ≤ 0.10. When the vitamin effect reached a level of significance of 90%, differences
between means were compared using an adjusted Tukey test. When the Met × vitamin interaction
reached a level of significant of 90%, the SLICE option in the LSMEANS statement was used to
help interpretation (SAS Institute, 2004).
III-5 RESULTS
III-4.5.1 Lactational performance
At the beginning of the experiment, 3 wk before the expected time of calving, BW
was similar among treatments (702 ± 7; P ≥ 0.7; Tableau 4). However, during lactation, BW of
M+ cows decreased slightly more from 2 to 4 wk of lactation than for M- cows with 623, 609,
609, 623 and 620 ± 9 kg vs 626, 620, 620, 624 and 626 ± 9 kg, respectively at 2, 4, 8, 12 and 16
wk of lactation (Met × time interaction, P = 0.05).
92
There was no treatment effect on DMI during the pre- and post-calving periods,
averaging 13.4 ± 0.4 and 21.8 ± 0.4 kg/d, respectively (P ≥ 0.13; Tableau 4).
Milk production was not affected by RPM (P = 0.8; Tableau 4). Folic acid and vitamin
B12, supplied both together, tended to increase milk production (vitamin, P = 0.08, Tableau 4 and
vitamin × time interaction, P = 0.10, Figure 24). On average, during the 16 wk of lactation, milk
production of B9+B12+ cows was 1.4 and 2 kg/d higher than for B9-B12- (P = 0.12) and B9+B12(P = 0.03) cows, respectively. Average milk productions of B9-B12- and B9+B12- cows were not
different (P = 0.5). The response in milk production for B9+B12+ cows was more marked during
the first 4 wk of lactation when milk production averaged 37.5, 37.7 and 40.3 ± 0.9 kg/d for B9B12-, B9+B12- and B9+B12+ respectively (P = 0.04). Gross efficiency (milk yield/DMI) is affected
differently by vitamin supplements according to Met supply (Met × vitamin interaction, P = 0.01;
Tableau 4). Globally, in M- cows, although gross efficiency of B9+B12- cows was numerically
lower, there was no statistically significant effect of vitamin supplementation (P = 0.73).
However, in M+ cows, gross efficiency was higher for B9+B12+ than for B9-B12- (P = 0.01) and
B9+B12- (P = 0.0001); moreover, it was lower (P = 0.03) for B9+B12- than B9-B12-.
Milk fat and total solids concentrations did not differ among treatments (P ≥ 0.2; Tableau
4). RPM increased milk crude protein concentrations from 29.4 to 30.5 ± 0.3 g/kg for M- and
M+, respectively (P = 0.001; Tableau 4). Response of lactose concentrations to vitamin
supplements differed according to Met supply (Met × vitamin interaction, P = 0.01; Tableau 4);
there was no effect of B-vitamin supply in M- cows (P = 0.66) but it changed milk concentrations
of lactose in M+ cows (P = 0.0001). In M+ cows, milk lactose concentrations were similar (P =
0.86) for B9-B12- and B9+B12- cows but lower for B9+B12+ (P = 0.001).
Milk fat yield was not affected by treatments (P ≥ 0.2; Tableau 4). Milk yields of lactose,
crude proteins and total solids were greater in early lactation in cows injected with folic acid and
vitamin B12 together but this effect faded out as lactation progressed (vitamin × time interaction,
P ≤ 0.05; Figure 25).
Milk concentrations of urea tended to be altered by vitamin supplements (P = 0.10;
Tableau 4), being higher for B9+B12+ cows than for cows receiving no vitamin supplement (P =
0.04) or folic acid alone (P = 0.002); 12.3, 12.1 and 12.9 ± 0.3 mg/dL for B9-B12-, B9+B12- and
B9+B12+ respectively. Milk urea also tended to change during the first 16 wk of lactation
according to Met supplementation (Met × time interaction, P = 0.06). At 2, 4, 8, 12 and 16 wk of
93
lactation, milk urea concentrations averaged 11.9, 12.3, 12.8, 13.3 and 12.8 for M- and 12.4,
12.0, 11.3, 12.8 and 12.7 ± 0.4 mg/dL for M+ cows, respectively.
There was no effect of vitamin supplements on average milk concentrations of folates
during the first 16 wk of lactation (P > 0.2; Tableau 4). However, the amount of folates secreted
in milk daily increased with the combined supplements of folic acid and vitamin B12 compared to
the other treatments (P ≤ 0.05), averaging 2.38, 2.36 and 2.67 ± 0.11 mg/d for B9-B12-, B9+B12and B9+B12+, respectively. Concentrations and amounts of vitamin B12 secreted in milk were
increased by intramuscular injections of vitamin B12 (P = 0.001; Tableau 4).
III-4.5.2 Plasma variables
III-4.5.2.1 B-vitamins
At the beginning of the experiment, 3 wk before the expected time of calving, plasma
folates (7.4 ± 0.6 ng/mL) and vitamin B12 (231 ± 10 pg/mL) were similar among treatments (P ≥
0.3). On average, after calving, cows fed RPM tended to have lower plasma concentrations of
folates than M- cows (P = 0.09; Tableau 5) with, 15.2 vs 16.6 ± 0.7 ng/mL for M+ and M-,
respectively. The effect of vitamin supplementation on plasma folates changed during lactation
(vitamin × time interaction, P = 0.03; Figure 26). Plasma concentrations of folates in B9-B12- and
B9+B12+ cows increased to reach a plateau at 4 wk of lactation whereas in B9+B12- cows, plasma
folates increased until 8 wk after calving and decreased thereafter to reach a plateau at 12 wk of
lactation.
Plasma concentrations of vitamin B12 were increased by vitamin B12 supplements (P =
0.001; Tableau 5); 189, 187 and 365 ± 15 pg/mL for B9-B12-, B9+B12- and B9+B12+, respectively.
Nevertheless, Met supply tended to modify the response to vitamin supplementation (Met ×
vitamin interaction, P = 0.1). In cows injected with folic acid and vitamin B12 together, plasma
concentrations of vitamin B12 were higher (P = 0.04) in M+ than M- cows whereas there was no
such effect in B9-B12- (P = 0.5) and B9+B12- (P = 0.3).
Overall, the lowest plasma
concentrations of vitamin B12 were observed 4 and 8 wk after calving but increased thereafter
(time, P = 0.06) with ; 259, 219, 218, 262 and 278 ± 18 pg/mL at 2, 4, 8, 12 and 16 wk of
lactation, respectively.
94
Plasma concentrations of biotin and vitamin B6 were not affected by treatments (P ≥ 0.3;
Tableau 5) but, for the two vitamins, the lowest concentration was observed 2 wk after calving
(time, P ≤ 0.001). At 2, 4, 8, 12 and 16 wk of lactation, plasma concentrations of vitamin B6 and
biotin were 177, 186, 184, 188 and 181 ± 5 ng/mL and 911, 978.9, 979, 1054 and 1052 ± 17.7
pg/mL, respectively.
III-4.5.2.2 Glucose, NEFA, BHBA and Urea
Dietary supplements of RPM decreased plasma concentrations of glucose from 3.63 to
3.55 ± 0.03 μM (P = 0.05; Tableau 5). The lowest concentration was observed 2 wk after calving
with, 3.45, 3.55, 3.71, 3.63 and 3.61 ± 0.04 μM at 2, 4, 8, 12 and 16 wk of lactation, respectively
(time, P = 0.001).
Plasma concentrations of NEFA decreased during the experimental period (time, P =
0.001) with, 757, 549, 326, 192 and 159 ± 30 μM at 2, 4, 8, 12 and 16 wk of lactation but did not
differ among treatments (P ≥ 0.2).
The response of plasma concentrations of BHBA to vitamin supplements tended to differ
according to Met supply (Met × vitamin interaction, P = 0.06; Tableau 5); cows fed RPM had
higher (P = 0.02) BHBA concentrations than M- cows when not supplemented with vitamins
whereas there was no effect (P ≥ 0.3) of Met supply on plasma BHBA in B9+B12- and B9+B12+
cows. Plasma concentrations of BHBA decreased as lactation progressed (time, P = 0.02) from
0.70, 0.70, 0.61, 0.57 and 0.52 ± 0.04 mM at 2, 4, 8, 12 and 16 wk of lactation, respectively.
Plasma concentrations of urea were not different among treatments (P ≥ 0.2; Tableau 5)
but increased throughout the experimental period (time, P = 0.001), 3.8, 4.6, 5.0, 5.7 and 5.8 ±
0.1 mM, at 2, 4, 8, 12 and 16 wk of lactation, respectively.
III-4.5.2.3 Amino acids
Dietary supplements of RPM increased plasma concentrations of Met from 21 to 24 ± 1
μM (P = 0.01) but decreased plasma concentrations of Tyr (P = 0.05; Tableau 5) and Ser (P =
0.10; Tableau 5).
95
Plasma concentrations of Ser (P = 0.04), Asp (P = 0.03) and Hcy (P = 0.08) changed
according to vitamin supplementation (Tableau 5). Folic acid and vitamin B12 given together
tended to increase plasma concentrations of Ser as compared to the two other treatments (P ≤
0.07), 111, 114 and 120 ± 3 μM for B9-B12-, B9+B12- and B9+B12+, respectively. Plasma Asp was
higher (P = 0.02) in B9+B12- (7.4 ± 0.5 μM) than in B9-B12- (5.5 ± 0.5 μM) but did not differ (P =
0.6) from B9+B12+ cows (6.6 ± 0.5 μM). Intramuscular injections of folic acid alone (P = 0.03) or
combined with vitamin B12 (P = 0.09) tended to decrease plasma concentrations of Hcy, from
5.51 to 4.54 and 4.77 ± 0.37 μM in B9-B12-, B9+B12- and B9+B12+ cows, respectively (P = 0.08;
Tableau 5).
The responses of plasma concentrations of Ala, Arg, His, Ile, Leu, Lys, Pro, Val,
branched-chain AA, essential AA and total AA to vitamin injections differed according to the
level of Met supplementation (Met × vitamin interaction, P ≤ 0.07; Tableau 5). In M- cows,
plasma concentrations of these AA were higher (P ≤ 0.04) in B9+B12+ cows as compared to the
others treatments while the vitamin supplements had no such effect in M+ cows (P ≥ 0.05). An
opposite trend was observed for plasma Thr (Met × vitamin interaction, P ≤ 0.01).
Globally, plasma concentrations of Ala, Arg, Cys, His, Hcy, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Val,
branched-chain AA and essential AA increased throughout the experimental period toward a
plateau at the end of the experimental period (time, P ≤ 0.002, data not shown). Plasma
concentrations of Asp, Thr and Tyr increased from 2 to 8 wk of lactation but decreased thereafter
(time, P ≤ 0.01). Plasma Gly, Glu and non-essential AA decreased as the lactation progressed
(time, P ≤ 0.001) whereas there was no effect of time (P ≥ 0.12) on plasma Ile, Met and total AA.
III-6 DISCUSSION
Based on changes in milk and plasma concentrations of vitamin B12, intramuscular
injections of vitamin B12 increased the supply of this vitamin to dairy cows as observed by Girard
and Matte (2005b). However, the increase in plasma vitamin B12 was smaller in M- cows than
M+ cows, suggesting a difference in tissue utilization of the vitamin according to Met supply.
Milk concentrations of folates were not affected by folic acid injections although the
amount of folates secreted in milk daily were higher in B9+B12+ cows. The absence of response
96
of plasma concentrations of folates, determined 7 d after the weekly intramuscular injections of
folic acid, could be due to the rapid plasma clearance of folic acid after intramuscular injections
of this vitamin (Girard et al., 1989). Similarly, regardless of parity, a single intramuscular
injection of folic acid failed to increase plasma and milk concentrations of folates in early
lactation (Girard et al., 1989). However, weekly intramuscular injections of 160 mg of folic acid
given for at least 30 wk before calving increased plasma folates from 14 to 17 ng/mL during the
first 6 wk of lactation but had no effect on milk concentrations of folates (Girard et al., 1995).
Nevertheless, independent of vitamin supply, plasma folates decreased when Met supply
increased as also reported in rat (Gawthorne and Stokstad, 1971; Thenen and Stokstad, 1973) and
human (Connor et al., 1978). This is probably due to S-adenosylmethionine (SAM) intracellular
concentrations rising in parallel to Met supply and acting as an allosteric inhibitor of
methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR)(Lucock, 2000). The latter is the enzyme
promoting the conversion of 5,10-methylene-THF to 5-methyl-THF, the major form of folates in
human (Selhub, 1999) and cow (unpublished) plasma.
In the present experiment, supplementary folic acid alone had no effect on milk
production or milk component yields of multiparous cows but in M+ cows, it decreased gross
efficiency, calculated as milk yield/DMI. Supplementation of folic acid plus vitamin B12 tended
to increase milk production and milk component yields (crude protein, lactose and total solids),
the effect being greater during the first 4 wk of lactation. Indeed, the effects of supplementary
folic acid on lactational performance of dairy cows reported in the literature are variable. In early
lactation, milk production was either unchanged or depressed following folic acid
supplementation in primiparous cows, whereas in cows at their second or more lactation, milk
production was increased (Girard et al., 1995, Girard and Matte, 1998). However, Girard et al.
(2005) observed no effect of folic acid supplements on milk and milk component yields in
multiparous cows, fed a basal diet, supplemented or not with Met. Nevertheless, intramuscular
injections of vitamin B12 improved milk and milk component yields of primiparous cows fed the
same basal diet than in the study of Girard et al. (2005) supplemented with RPM and folic acid
(Girard and Matte, 2005b). Graulet et al. (2007) observed that dietary supplements of folic acid,
given alone or combined with vitamin B12, increased milk and milk protein yields to the same
extent whereas feeding the two vitamins together increased metabolic efficiency. However, in
that study, supplementary vitamin B12 alone had no effect on lactational performance.
97
Even if milk component yields tended to be increased by the combined supplement of
folic acid and vitamin B12 without increasing DMI, especially in early lactation, there was no
increment in plasma concentrations of NEFA and BHBA, indicating a possible improvement in
metabolic efficiency when folic acid and vitamin B12 were given together. These observations are
supported by the results from a study conducted on a sub-group of cows from the present
experiment where whole-body glucose and Met fluxes were measured at 12 wk of lactation
(Preynat et al., 2009, chapitre IV). In this study, supplementary folic acid and vitamin B12 given
together increased glucose whole body flux, probably due to an increase in gluconeogenesis. In
the same line, Graulet et al. (2007) observed that, even if milk production was similar for cows
fed supplementary folic acid, alone or combined with vitamin B12, plasma concentration of
glucose was higher in cows fed the two vitamins together. Vitamin B12 is a coenzyme for
methylmalonylCoA mutase, a mitochondrial enzyme essential to the entry of propionate in the
Krebs cycle, propionate being the major glucose precursor in ruminants (Kennedy et al., 1990;
Taoka et al., 1994). However, even if folates are not known to participate in the
methylmalonylCoA pathway, Graulet et al. (2007) reported that the affinity of the enzyme for
vitamin B12 was increased in liver of cows fed folic acid and vitamin B12 together as compared to
no vitamin supplements or the two vitamins given separately. Similarly, Selhub et al. (2007)
observed that both metabolic pathways involving vitamin B12-dependent enzymes, methionine
synthase and methylmalonylCoA mutase, are affected by folic acid supply. According to these
authors, when vitamin B12 supply is adequate, increasing folate status improves the efficiency of
the two vitamin B12-dependent enzymes whereas when vitamin B12 status is low, increasing
folate supply worsens the two enzymatic functions. Such effect needs to be further investigated.
Biotin, another B vitamin, is a coenzyme for the enzyme propionyl-CoA carboxylase, a
reaction preceding the action of methylmalonyl-CoA mutase in the metabolic pathway for the
entry of propionate in the Krebs cycle (Combs, 1998). Plasma concentrations of biotin were not
affected by treatments giving an indication that, even if efficiency of this metabolic pathway was
improved by vitamin supplements, biotin supply did not seem to be limiting.
Plasma concentrations of Hcy were decreased by injections of folic acid, alone or
combined with vitamin B12, independently of Met supply. Within cells, especially hepatic cells,
the metabolic fates of Hcy are catabolism through the transsulfuration pathway or remethylation.
In the latter pathway, Hcy accepts a methyl group from 5-methyl-THF to form Met via a vitamin
98
B12 dependent-enzyme, methionine synthase (Selhub, 1999). Excess of Hcy is exported out of the
cells to maintain low intracellular concentrations of this cytotoxic AA (Selhub, 1999), explaining
the small concentrations of Hcy normally present in plasma. As observed in humans (Mangum et
al., 1969; Stam et al., 2005), supplements of folic acid, with or without vitamin B12, probably
reduced plasma concentrations of Hcy through an enhancement of methionine synthase activity.
The impact of treatments on the transsulfuration pathway was limited as they had no effect on
plasma concentrations of Cys or vitamin B6, a coenzyme for two enzymes of this pathway.
The supplement of RPM, used in the present experiment, increased plasma concentrations
of Met as previously reported (Overton et al., 1996; Overton et al. 1998). It also increased crude
protein concentrations in milk which is the effect the most frequently reported in the literature
(NRC, 2001; Leonardi et al., 2003; Socha et al., 2005) but had no effect on milk crude protein
yield. Although in the current experiment, feeding RPM slightly decreased glucose
concentrations by 2% and tended to increase plasma concentrations of BHBA by 30% in cows
fed no vitamin supplement, glucose concentrations were within normal physiological range (Ohgi
et al., 2005) and BHBA concentrations were below the limit for ketosis (1 mM; Gröhn et al.,
1983). These observations are consistent with a slight increase in body reserve mobilization in
cows fed RPM based on an average lost of 14 kg BW between the 2nd and 4th wk of lactation.
The effects of vitamin supplements on milk component yields did not differ according to
Met supply. However, intramuscular injections of the two vitamins together increased plasma
concentrations of Ala, Arg, His, Ile, Leu, Lys, Val, branched-chain AA, total AA and essential
AA in M- cows whereas there was no such effect in M+ cows. This observation suggests a
change in whole body protein metabolism with folic acid and vitamin B12 injections when Met
supply was low. In a sub-group of cows from the present experiment, it was observed that the
combined supplement of folic acid and vitamin B12 increased protein synthesis through possibly
increased protein turnover when Met supply was low and through decreased Met oxidation when
RPM was fed (Preynat et al., 2009, chapitre IV).
III-7 CONCLUSION
In the present experiment, in spite of the observation that plasma Hcy was decreased by
supplementary folic acid, alone or combined with vitamin B12, folic acid supplements alone had
99
no positive effect on milk and milk component yields. Moreover as supplying preformed labile
methyl groups as RPM had no effect either on milk and milk component yields, it is unlikely that
the effect of the combined supplement of vitamins on lactational performance during the first
weeks of lactation, when plasma concentrations of vitamin B12 were the lowest, were due to an
improvement in methyl group supply through methylneogenesis. The effects of RPM on plasma
folates as well as differences in response to RPM of plasma concentrations of vitamin B12 and
several AA according to vitamin supplements suggest that Met supply affected tissue utilization
of these vitamins and whole body protein metabolism. Folic acid and vitamin B12 given together
increased milk and milk component yields during the first weeks of lactation without effect on
DMI or plasma NEFA. Given the experimental design used, it is not possible to conclude if these
effects were due to the combination of the two vitamins or to vitamin B12 itself.
III-8 ACKNOWLEDGMENTS
The authors are grateful to Guylaine Fortin, Michel Poitras and Jean Vallières for animal
care, to Chrystiane Plante, Véronique Roy, Linda Marier and Micheline Gingras for technical
assistance and Steve Méthot for statistical advices. Thanks are also extended to the financial
support of the Action Concertée Fonds NOVALAIT inc.– FQRNT - MAPAQ – Agriculture et
Agroalimentaire Canada.
100
Close-up diet
Lactation diet
Grass hay
Legume-grass silage3
33.01
11.0
8.22
23.4
Corn silage4
14.5
23.1
Cracked corn
16.9
28.5
Ingredients, %
Soybean meal 49%
9.6
Beet pulp
13.3
Micronized soybean
3.9
2.0
Distiller's grain (wheat)
1.3
0.7
Distiller's grain (corn)
2.2
1.1
Canola meal
1.3
0.7
Mineral and vitamin premix
Calcium carbonate
1.65
1.0
1.86
0.8
CP, %
12.8
17.3
RDP, %7
7.9
10.6
RUP, %7
4.9
6.7
ADF, %
26.5
19.2
NDF, %
45.2
30.4
NEl, Mcal/kg DM8
1.55
1.58
MP, g/day8
1,055
2,341
Methionine, % MP8
Lysine, % MP8
1.85
6.18
1.83
6.3
K, %
1.27
1.55
Ca, %
0.69
0.87
P, %
0.52
0.44
Mg, %
0.39
0.29
S, %
0.25
0.26
Nutrient composition
101
Cl, %
1
0.43
0.34
7.8 ± 1.1% CP, 0.8 ± 0.1% soluble protein, 34.2 ± 5.8% ADF, 58.9 ± 7.0% NDF, 5.6 ± 0.6% lignin, (n =
3).
2
10.9 ± 1.7% CP, 2.4 ± 0.1% soluble protein, 31.9 ± 1.8% ADF, 55.1 ± 4.2% NDF, 4.4 ± 0.5% lignin (n =
5).
3
11).
4
10).
5
Contains per kg, 30 g Ca, 120 g P, 120 g Mg, 69 g Na, 106 g Cl, 15 g K, 20 g S, 4,343 mg Fe, 6,566 mg
Mn, 6,465 mg Zn, 1,616 mg Cu, 202 mg I, 121 mg Co, 40 mg Se (25% organic selenium), 732,323 IU
vitamin A, 247,475 IU vitamin D and 7,576 IU vitamin E.
6
Contains per kg, 95 g Ca, 55 g P, 55 g Mg, 130 g Na, 150 g Cl, 14 g K, 21 g S, 2,745 mg Fe, 2,065 mg
Mn, 3,000 mg Zn, 495 mg Cu, 69 mg I, 33 mg Co, 20 mg Se (25% organic selenium), 501,859 IU
vitamin A, 65,000 IU vitamin D and 2,600 IU vitamin E.
7
Calculated according to National Research Council model (2001).
8
Calculated according to National Research Council (2001) from average DMI of control cows (M-B9-B12) during the close-up (12.6 kg/d) and lactation (21.8 kg/d) periods.
102
Tableau 4. Effects of dietary supplements of rumen-protected Met (M) and intramuscular injections of folic acid (B9) and vitamin B12
(B12) given to dairy cows from 3 wk before calving to 16 wk of lactation on dry matter intake, milk production and composition
P values
Treatments1
M+
n
B9-B1210
M-
B9+B12- B9+B12+
10
10
B9-B1210
B9+B12- B9+B12+ SEM2
10
10
met
vit
met*vit
BW, kg
3 wk before calving
post-calving3
DMI, kg/d
pre-calving4
post-calving4
Milk production, kg/d 5
Milk yield/DMI4
703
616
693
617
704
618
716
624
705
622
694
624
17
15
0.71
0.61
0.76
0.99
0.74
0.99
13.7
21.4
37.3
1.76
13.4
22.3
36.9
1.70
13.4
21.1
38.8
1.81
12.6
21.8
37.7
1.76
13.3
21.7
36.8
1.72
13.8
22.5
38.9
1.75
0.4
0.6
1.1
0.04
0.31
0.36
0.83
0.26
0.50
0.75
0.08
0.004
0.13
0.19
0.97
0.01
Milk composition
Fat, g/kg4
Crude protein, g/kg4
Lactose, g/kg4
Total solids, g/kg4, 7
Urea, mg/dL3
Folates, ng/mL4
Vitamin B12, pg/mL4
37.3
30.8
46.5
114.5
12.2
65.4
4800
37.1
30.4
46.3
113.6
12.0
61.6
4996
37.1
30.1
45.1
112.3
12.5
69.7
7359
36.9
29.5
46.6
113.1
12.4
62.7
4781
36.3
29.5
46.5
112.4
12.2
66.8
4976
35.7
29.1
46.3
111.1
13.2
68.5
6816
0.9
0.3
0.3
1.3
0.4
3.8
270
0.23 0.72
0.001 0.15
0.001 0.001
0.19 0.23
0.20 0.10
0.87 0.23
0.33 0.001
0.80
0.78
0.01
0.99
0.81
0.46
0.48
Milk yields
103
Fat, kg/d4
Crude protein, kg/d5
Lactose, kg/d5
Total solids, kg/d5, 7
Folates, mg/d6
Vitamin B12, μg/d
1
1.38
1.14
1.73
4.26
2.41
175
1.37
1.12
1.70
4.19
2.26
179
1.44
1.17
1.75
4.35
2.67
282
1.38
1.11
1.76
4.25
2.36
178
1.33
1.08
1.71
4.13
2.45
182
1.38
1.13
1.80
4.32
2.65
262
0.04
0.03
0.05
0.11
0.14
9
0.32
0.16
0.35
0.65
0.75
0.47
0.23
0.29
0.23
0.16
0.05
0.001
0.71
0.99
0.87
0.96
0.61
0.32
M-: basal diet –; M+: basal diet + rumen-protected Met; B9-B12-: no vitamin supplement; B9+B12-: 160 mg folic acid/wk; B9+B12+: 160
mg folic acid/wk + 10 mg cyanocobalamin/wk.
2
SEM = standard error of the mean.
3
Met × time, P ≤ 0.06.
4
Time effect, P = 0.0001.
5
Vitamin × time, P ≤ 0.10.
6
Met × vitamin × time, P = 0.08.
7
Total solids = fat + proteins + lactose.
104
Tableau 5. Effects of dietary supplements of rumen-protected Met (M) and intramuscular injections of folic acid (B9) and vitamin B12 (B12)
given to dairy cows from 3 wk before calving to 16 wk of lactation on plasma concentrations of some B-vitamins, glucose, urea, NEFA,
BHBA and AA
Treatments1
P values
M+
M-
met
vit
met*vit
1.1
0.09
0.32
0.99
337
20
0.31
0.001
0.10
185
188
7
0.30
0.99
0.77
998
1001
981
23
0.83
0.85
0.70
3.54
3.66
3.63
3.6
0.05
0.05
0.77
0.82
370
391
401
367
401
35
0.58
0.19
0.61
0.74
0.58
0.62
0.57
0.51
0.70
0.05
0.21
0.04
0.06
4.87
4.69
5.03
4.95
5.04
5.07
0.16
0.18
0.43
0.47
B9-B12-
B9+B12-
B9+B12+
B9-B12-
B9+B12-
B9+B12+
10
10
10
10
10
10
14.5
15.0
16.1
15.9
16.5
17.4
Vitamin B12, pg/mL
198
174
394
181
200
4
183
181
179
183
1006
985
1000
3.55
3.57
450
n
SEM2
Vitamins
Folates, ng/mL3
4
Vitamin B6, ng/mL
Biotin, pg/mL
Glucose, μM4
4
NEFA, μM
BHBA, mM
4
Urea, mM
4
4
AA, μM
Ala4
293.4
286.4
277.4
274.2
279.3
304.9
11.1
0.96
0.68
0.07
4
80.8
82.2
81.0
77.7
84.8
91.6
3.0
0.11
0.03
0.03
4
5.1
7.6
6.9
5.9
7.3
6.2
0.7
0.89
0.03
0.53
4
108.5
108.5
105.5
105.1
108.3
111.0
4.4
0.83
0.90
0.49
Arg
Asp
Cys
105
Glu4
62.8
60.4
58.3
58.1
57.7
57.6
2.3
0.11
0.47
0.62
Gly
437.7
388.6
424.7
402.8
398.1
405.9
18.2
0.31
0.27
0.45
His4
46.5
43.0
42.2
43.6
48.8
54.4
2.8
0.02
0.45
0.02
Hcy
5.96
4.46
4.71
5.06
4.61
4.83
0.48
0.56
0.08
0.41
Ile
Leu4
140.5
218.9
137.2
212.1
135.5
198.5
135.1
216.9
133.1
208.5
156.6
244.1
5.6
9.1
0.25
0.07
0.18
0.44
0.01
0.01
Lys4
90.6
88.3
82.8
90.3
84.9
103.7
3.3
0.03
0.12
0.0003
Met
4
4
23.7
23.5
23.3
21.3
20.7
21.8
1.2
0.01
0.90
0.84
4
53.4
53.2
50.4
55.5
51.6
56.8
2.4
0.19
0.62
0.18
4
124.4
134.6
117.6
126.3
127.4
142.3
5.5
0.08
0.42
0.002
4
108.9
109.1
120.2
113.9
118.4
119.7
3.6
0.1
0.04
0.36
4
149.8
152.2
132.9
150.7
142.3
157.1
5.7
0.27
0.64
0.01
4
71.9
83.1
78.3
81.7
81.0
85.6
3.3
0.05
0.14
0.11
4
326.5
325.0
300.0
320.9
331.5
369.3
11.4
0.01
0.62
0.002
682
674
631
673
673
762
25
0.04
0.58
0.004
2229
1023
1185
2184
1010
1152
2120
937
1163
2172
1013
1141
2177
1001
1154
2369
1135
1213
53
30
31
0.12
0.01
0.92
0.40
0.56
0.45
0.003
0.0002
0.26
Phe
Pro
Ser
Thr
Tyr
Val
BCAA4, 5
6
TAA
EAA4, 7
NEAA4, 8
1
M-: basal diet –; M+: basal diet + rumen-protected Met; B9-B12-: no vitamin supplement; B9+B12-: 160 mg folic acid/wk; B9+B12+: 160
2
3
Vitamin × time, P < 0.09.
4
Time effect, P < 0.01.
5
BCAA, branched-chain amino acids = Ile + Leu + Val.
6
TAA, total amino acids.
7
EAA, essentials amino acids = His + Ile + Leu + Met + Lys + Phe + Thr + Val.
8
NEAA, non essentials amino acids = Ala + Arg + Asp + Cys + Glu + Gly + Pro + Ser + Tyr.
Figure 24. Effects of intramuscular injections of folic acid (B9) and vitamin B12 (B12)
given to dairy cows from 3 wk before calving to 16 wk of lactation on milk production.
B9-B12- (_ _ ▲_ _) = no vitamin supplement; B9+B12- (□) = 160 mg of folic
acid/wk; B9+B12+ (■) = 160 mg of folic acid/wk + 10 mg of vitamin B12/wk
(SEM = 1.0; vitamin × time interaction, P = 0.10)
44
Milk yield (kg/d)
42
40
38
36
34
32
30
0
2
4
6
8
10
12
Time after calving (wk)
14
16
18
given to dairy cows from 3 wk before calving to 16 wk of lactation on milk protein
yields. B9-B12- (_ _ ▲_ _) = no vitamin supplement; B9+B12- (□) = 160 mg of folic
acid/wk; B9+B12+ (■) = 160 mg of folic acid/wk + 10 mg of vitamin B12/wk
(SEM = 33.1; vitamin × time interaction, P = 0.04)
1300
1250
Milk protein yield (g/d)
1200
1150
1100
1050
1000
950
900
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
given to dairy cows from 3 wk before calving to 16 wk of lactation on plasma
concentrations of folates. B9-B12- (_ _ ▲_ _) = no vitamin supplement; B9+B12- (□)
= 160 mg of folic acid/wk; B9+B12+ (■) = 160 mg of folic acid/wk + 10 mg of
vitamin B12/wk (SEM = 1.0; vitamin × time interaction, P = 0.03)
19
Plasma folates (ng/mL)
18
17
16
15
14
13
12
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
III-9 REFERENCES
Agriculture Canada. 1990. Recommended Code of Practice for Care and Handling of Dairy Cattle. Publ.
No. 1853/E. Agric. Can., Ottawa, Ontario.
Association of Official Analytical Chemists. 1990. Official Methods of Analysis. 15th ed. AOAC,
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disappearance and mesenteric and portal appearance of amino acids in dairy cows fed ruminally
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uptake by rat liver. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 136:42-46.
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CHAPITRE IV
EFFECTS OF SUPPLEMENTS OF FOLIC ACID,
VITAMIN B12 AND RUMEN-PROTECTED
METHIONINE ON WHOLE BODY METABOLISM
OF METHIONINE AND GLUCOSE IN LACTATING
DAIRY COWS
Ce chapitre a été soumis pour publication dans la revue “Journal of Dairy Science ”
sous la référence de A. Preynat, H. Lapierre, M.C. Thivierge, M.F. Palin, J.J. Matte, A.
Desrochers and C. L. Girard. 2009. Effects of Supplements of Folic Acid, Vitamin B12
and Rumen-Protected Methionine on Whole Body Metabolism of Methionine and
Glucose in Lactating Dairy Cows. J. Dairy Sci. 92 : 677-689.
IV-1 RÉSUMÉ
À 12 semaines de lactation, des cinétiques de glucose et de méthionine ont été
mesurées en infusant du D-[U13-C]glucose et de la L-[1-13C, 2H3] méthionine. Le
supplément de vitamines augmentait les concentrations d’acide folique et de vitamine
B12 dans le lait et le plasma, la production laitière de 34,7 à 38,9 ± 1,0 kg/jour ainsi que
les rendements en lactose, protéines et solides totaux du lait. Les flux corporels de
glucose tendaient à augmenter avec la supplémentation vitaminique d’une amplitude
quantitativement similaire à l’augmentation du rendement en lactose. Le supplément de
vitamines augmentait l'utilisation de la méthionine pour la synthèse protéique via un
accroissement du turnover protéique lorsque l'apport en méthionine était faible et via
une diminution de l’oxydation de la méthionine lorsque un supplément de méthionine
était apporté. Donc, ces vitamines B agiraient sur les performances de lactation en
améliorant l’efficacité des métabolismes du glucose et de la méthionine.
Mots-clés : vache laitière, méthionine protégée de la dégradation ruminale, vitamines B,
cinétiques du glucose et de la méthionine
IV-2 ABSTRACT
The present experiment was undertaken to determine the effects of dietary
supplements of rumen-protected methionine and intramuscular injections of folic acid
and vitamin B12, given 3 wk before to 16 wk after calving, on glucose and methionine
metabolism of lactating dairy cows. Twenty-four multiparous Holstein cows were
assigned to 6 blocks of 4 cows each according to their previous milk production. Within
each block, 2 cows were fed a diet estimated to supply methionine as 1.83%
metabolizable protein, equivalent to 76% of methionine requirement, whereas the 2
other cows were fed the same diet supplemented daily with 18 g of rumen-protected
methionine. Within each diet, the cows were administrated either no vitamin
supplement or weekly intramuscular injections of 160 mg of folic acid plus 10 mg of
vitamin B12. To investigate metabolic changes at 12 wk of lactation, glucose and
methionine kinetics were measured by isotope dilution using infusions of D[U13
C]glucose,
[13C]NaHCO3
and
L[1-13C,2H3]methionine.
Milk
and
plasma
concentrations of folic acid and vitamin B12 increased with vitamin injections.
Supplementary B-vitamins increased milk production from 34.7 to 38.9 ± 1.0 kg/d as
well as milk lactose, protein and total solid yields. Whole body glucose flux tended to
increase with the vitamin supplementation with a similar quantitative magnitude as the
milk lactose yield increment. Vitamin supplementation increased Met utilization for
protein synthesis through possibly increased protein turnover when methionine was
deficient and through decreased methionine oxidation when rumen-protected
methionine was fed. Vitamin supplementation decreased plasma concentrations of
homocysteine independently of rumen-protected methionine feeding, although no effect
of vitamin was measured on methionine remethylation, but this could be due to the
limitation of the technique used. Therefore, the effects of these B-vitamins on
lactational performance were not mainly explained by Met economy due to a more
efficient methylneogenesis but rather by an improvement in efficiency of glucose and
Met metabolism.
Key words: dairy cow, folic acid, vitamin B12, methionine and glucose kinetics
IV-3 INTRODUCTION
In the latest NRC edition (2001), recommendations were made for two AA, Lys
and Met, based on works of Rulquin et al. (1993) and Schwab (1996), according to
which, under intensive dairy systems, these AA may be limiting in certain diets. Under
such circumstances, increasing Met supply through feeding rumen-protected Met
(RPM) has the potential to augment milk protein and fat concentrations and yields in
high-producing dairy cows, probably through increased protein synthesis (NRC, 2001).
Met is not only an AA involved in the structure per se of proteins but it also plays a
unique role as the initiating AA for the synthesis of proteins (Brosnan et al., 2007). In
addition to these roles in protein synthesis, Met, as a source of preformed labile methyl
groups, is a key player in transmethylation reactions and lactation has been
demonstrated to increase the demand for methylated compounds (Xue and Snoswell,
1985). The NRC (2001) requirement for Met was based on the relationship between
Met supply and milk protein yield, but very little information is available on Met
requirements for methyl group transfer in high-yielding cows.
Methyl group transfer occurs through the activation of Met in Sadenosylmethionine (SAM), which is the most important methyl group donor to a wide
range of acceptors (Finkelstein, 1990). After the transfer of its methyl group, SAM
becomes S-adenosylhomocysteine (SAH), which is hydrolyzed to homocysteine (Hcy)
and adenosine. The former can be remethylated into Met by the vitamin B12-dependent
enzyme, methionine synthase which mediates the transfer of the methyl group from 5methyltetrahydrofolate, a folate co-factor (Bässler, 1997). Therefore, both folic acid and
vitamin B12 are essential for remethylation of Hcy to Met. A major function of this
cycle is to ensure that the cells always have an adequate supply of SAM, even when
intake of preformed labile methyl groups such as Met, betaine or choline is low. Hcy
can also be catabolized via the transulfuration pathway (cystathionine synthase) which
leads to Cys synthesis (Finkelstein, 1990).
Vitamin B12 also relates to energy metabolism as a coenzyme for the
methylmalonyl-CoA mutase, an enzyme crucial to propionate entry into the Krebs cycle
and subsequent gluconeogenesis (McDowell, 2000). During lactation in dairy cattle,
large amounts of glucose are required for lactose synthesis and as an energy source. As
very limited amounts of glucose are absorbed from intestinal digestion of starch, the
dairy cow relies heavily on gluconeogenesis for glucose supply (Reynolds, 2006). In
high-yielding dairy cows, propionate is the major glucose precursor, followed by
glycerol, lactate and AA, such as Ala, Glu, Gly or Ser (Danfaer et al., 1995).
Milk secretion requires important supplies of both glucose and AA. Given the
roles of folic acid and vitamin B12 in protein and energy metabolism, these two Bvitamins should play an important role in the regulation of these metabolic pathways in
lactating dairy cows. In addition, due to their direct link with the regeneration of Met
from Hcy, their metabolic effect and subsequent response on animal performance might
depend on Met supply. Thus, it was hypothesized that supplements of folic acid plus
vitamin B12 would affect lactational performance 1) through the methylation cycle and
would that be the case, this effect would be more important when Met supply is limited
and 2) by improving gluconeogenesis due to the role of vitamin B12 in this metabolic
pathway. The present study was therefore undertaken to determine the effects of RPM
and folic acid plus vitamin B12 supplementation and their potential interaction on whole
body kinetics of Met and glucose in lactating dairy cows at 12 wk of lactation.
IV-4 MATERIALS AND METHODS
IV-4.1 Cows and Treatments
For the purpose of the current study, twenty-four multiparous lactating Holstein
cows from the herd at the Agriculture and Agri-Food Canada Research Centre
(Sherbrooke, QC, Canada) were selected from a larger study. The cows were kept in a
tie-stall barn under 16 h light cycle per d (0630 to 2230 h) and were milked twice daily
at 12 h intervals. Care of cows followed the recommended Code of Practice of
Agriculture Canada (1990) and the guidelines of the Canadian Council on Animal Care
(1993). The experimental period began 3 wk before calving and lasted until 16 wk after
calving. All cows were fed a close-up diet for 3 wk before the expected date of calving
until calving and then a basal lactation diet (Tableau 6). For the larger study, cows had
free access to water and were fed ad libitum allowing 10% of refusals. They were fed
once daily before calving and twice daily during lactation. Long grass hay was given at
0730 h and the mixed ration was served at 0800 and 1300 h.
Cows were assigned to 6 blocks of 4 cows each according to milk production of
their previous lactation. Within each block, 2 cows were fed the basal diet calculated
(NRC, 2001) to provide Met at 1.83% of metabolizable protein (MP) supply (M-),
equivalent to 76% of the Met requirement (NRC, 2001) whereas the other 2 cows were
fed the same diet supplemented daily with RPM (M+: 9 and 18 g Mepron-85/d,
Degussa AG, Hanau, Germany; pre and post-calving, respectively). With a net Met
content of 85%, 73% of rumen by-pass protection and 82% of intestinal digestibility
(Berthiaume et al. 2001), the product used in the present experiment was estimated to
provide 9.2 g/d of Met after calving and increased the estimated Met supply to 2.23% of
MP, equivalent to 93% of the Met requirement (NRC, 2001). Within each level of Met
supplementation (M+ or M-), the cows received either no vitamin supplement (B9-B12-)
or weekly intramuscular injections of vitamins (B9+B12+): 160 mg of folic acid
(pteroylmonoglutamic acid, ICN Biochemicals inc., Cleveland, Ohio) plus 10 mg of
vitamin B12 (cyanocobalamin, 5 000 µg/mL, Vetoquinol, Lavaltrie, QC, Canada). These
levels of supplementation were chosen according to previous experiments (Girard et al.,
1995; Girard and Matte, 2005). The parenteral route was chosen, instead of dietary
supplementation, to rule out any possible effects of vitamins on ruminal microflora.
The larger study was conducted up to 16 wk of lactation, but the measurements
currently reported were conducted during the 12th wk of lactation. This stage of
lactation was selected based on previous results obtained in dairy cows supplemented
with folic acid alone (Girard and Matte, 1998). Measurements of whole body
irreversible loss rate (ILR) of Met and glucose were conducted during steady state
achieved through 2 h feeding in 12 equal meals per d using automated feeders (Ankom,
Fairport, NY); the latter started 3 d before the onset of tracer infusions. Rumenprotected Met was also given with the meals in 12 equal servings of 1.5 g. Long hay
was given once a d (0730 h). During the 2 h feeding period, cows were fed 95% of ad
libitum DMI measured during the 2 previous wk to avoid refusals.
IV-4.2 Forage and milk analyses
Forage samples were analyzed for DM, CP, ash, ether extract (AOAC, 2000),
ADF, NDF, and acid-detergent lignin (Ankom200 fiber analyzer, Ankom technology
corp., Fairport, NY), minerals by inductively coupled plasma emission spectrometry
(AOAC, 2000) (Agri-Food Laboratories, Guelph, On, Canada).
Milk production was recorded at each milking. Milk samples were collected at 4
consecutive milkings at 82.7 ± 1.9 d of lactation. Milk composition (fat, protein, lactose
and urea) was determined by near infrared reflectance spectroscopy method (Valacta,
Sainte-Anne-de-Bellevue, QC, Canada).
Vitamins in milk:
Milk folates were determined by radioassay (interassay CV = 4.8%) with a commercial
kit designed for human plasma (Quantaphase Folates II, Bio-Rad Laboratories (Canada)
Ltd, Mississauga, ON, Canada) after preparation as described by Girard and Matte
(1998).
Samples for determination of vitamin B12 in milk were prepared as follows: 10
mL of milk, 2 mL of 0.2 N HCl and 100 µL of 1.0 mM NaCN were placed in a 50 mL
tube (Sarstedt inc, Newton, NC), corked and vortexed. The tubes were placed in boiling
water for 15 min, rapidly cooled on ice and transferred in 15-mL polycarbonate tubes
for centrifugation at 51,520 x g for 20 min at 4°C. The supernatants were filtered
(Whatman filter 42, 9 mm of diameter, Fisher Scientific, Ottawa, ON, Canada) in
weighed tubes of 50 mL, weighed again and the amount of supernatant was obtained by
difference. The pH was adjusted to 6.5 with 3.3 N NaOH. The tubes were then filled to
20 mL with distilled water, vortexed and stored at -20°C or used immediately. Vitamin
B12 was determined in duplicate for each hydrolysis using a radioassay (Quantaphase
B12, Bio-Rad Laboratories (Canada) Ltd, Mississauga, ON, Canada). The interassay CV
was 6.3% and recovery of a known amount of cyanocobalamin was 103.0%.
IV-4.3 Blood sampling procedure
At 83.9 ± 1.7 d after calving, after distribution of the morning meal, blood
samples were collected by venipuncture of the caudal vein, using a Vacutainer® system
(Becton, Dickinson and Co., Franklin Lakes, NJ) using tubes with EDTA for folates,
vitamin B12, BHBA and NEFA analyses. Tubes with heparin were used for AA, glucose
and urea determinations. Immediately after collection, the tubes were placed on ice and
within 1 h after sampling, blood was centrifuged 20 min at 1,854 x g at 4°C. For AA
analysis, 400 µL of plasma was mixed with 400 µL of Met sulfone (0.4 mM, internal
standard, Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada). Plasma was frozen at -20oC until
assays.
IV-4.4 Blood plasma analyses
IV-4.4.1 Folates and vitamin B12
Folates and vitamin B12 in plasma were determined in duplicate using a
radioassay (Quantaphase Folate II and Quantaphase B12, Bio-Rad Laboratories (Canada)
Ltd) as described by Girard and Matte (1988). Interassay CV were 4.2 and 4.1% for
folates and vitamin B12, respectively.
IV-4.4.2 Urea, NEFA, Glucose and BHBA
Plasma urea, NEFA, glucose and BHBA were determined using commercial kits
(Diagnostic Chemicals Limited UREA ASSAY, BioPacific Diagnostic Inc.,
Charlottetown, PE, Canada; NEFA-C, Wako Chemicals GmbH, Neuss, Germany;
Roche Diagnostics Glucose GmbH, Mannheim, Germany and Pointe Scientific Inc., βhydroxybutyrate Reagent Set, Canton, MI, respectively).
IV-4.4.3 Amino acids
Total Hcy and total Cys concentrations were determined in plasma by a
modification of the HPLC method of Malinow et al. (1989) described in Girard et al.
(2005). Two further changes were made: the mobile phase was a mixture of 50 mM
sodium phosphate monobasic, 1.0 mM 1-octanesulfonic acid (Sigma Ultra) and 2%
acetonitrile and the solvent was pumped through the analytic column (4.6 × 150 MCM)
at 2 mL/min. Met concentration was measured by isotope dilution using gas
chromatography-mass spectrometry (GC-MS; Hewlett Packard, Model CG6890MS5973, Agilent Technologies, Willmington, DE) as previously described (Calder et
al., 1999).
Plasma concentrations of other AA were determined by HPLC with precolumn
derivatization according to the Pico-Tag procedure (Waters, Mississauga, ON, Canada)
and using a method adapted from White et al. (1986). Processed plasma, with Met
sulfone added as an internal standard, was filtered through a 10,000 molecular weight
filter and centrifuged for 30 min at 31,000 x g at 4°C. A Pico-Tag column was used for
separation of physiological AA (3.9 × 300 mm) maintained at 46ºC in a column heater.
The mobile phase consisted of 2 eluents labeled A (0.07 M sodium acetate trihydrate
buffer containing 350 µL of 10 mg/mL ethylenediamine tetraacetic, adjusted to pH 6.45
with glacial acetic acid, filtered on 0.45 µm nylon membrane filters and mixed with
25.65 mL acetonitrile) and B (methanol, water and acetonitrile; 15:40:45, v/v) used
according to a gradient elution program (Tableau 7). AA standards 18 H (Pierce,
Rockford, IL) were dissolved in water using serial dilutions: 160, 240, 320 and 400 μM
and injected at the beginning of each week.
IV-4.5 Kinetic measurements
IV-4.5.1 Infusion and blood sampling
The tracer infusions began on average on 87 ± 7 d of lactation. The day before
the beginning of the infusion period, two catheters were inserted into two jugular veins,
one to perform infusions and the other to collect blood. Tracers were dissolved in sterile
saline and were administrated as follows: L-[1-13C,2H3]Met (13C, 99% and methyl-2H3,
98%, Cambridge Isotope Laboratories, Andover, MA) on d 1, [13C]sodium bicarbonate
(Cambridge Isotope Laboratories) on d 2 and D[U13-C]glucose (13C6, 99%, Cambridge
Isotope Laboratories) on d 3. On each of these days, 4 blood samples were collected
before onset of the infusion to determine the natural abundance of the infused
metabolite and of CO2. All daily infusions started with a priming dose of either 0.96, 2.5
or 3.3 mmol followed by a 4h constant infusion performed at the rate of 0.96, 1.8 or 5.5
mmol/h for Met, bicarbonate and glucose, respectively.
Starting 2 h after the initiation of the infusion, 5 jugular blood samples were
taken every 30 min into heparinized syringes. On each sampling day, immediately after
collection, three 1.5-mL portions were placed into evacuated Vacutainer® tubes
(Becton, Dickison and Co.) containing 1 mL of frozen lactic acid and reacted
immediately for measurement of CO2 enrichment on the same d. On d 1 and 3, the
remaining blood (10 mL) was distributed into heparinized Vacutainer® tubes, kept on
ice and centrifuged within 30 min after sampling at 1,854 x g for 15 min at 4°C. Plasma
samples were stored at -20ºC until measurement of isotopic enrichment (IE) of Met (d
1) and glucose (d 3).
IV-4.5.2 Isotopic enrichment analyses
The CO2 released from reaction of whole blood with lactic acid was analyzed for
[13C] IE for m/z ions 44, 45 and 46 on a triple collector isotopic ratio mass spectrometer
(Sira 12, VG Masslab, Manchester, UK).
For Met IE, after deproteinisation of 1 mL of plasma with 250 µL of 38 %
sulfosalicylic acid, samples were vortexed and centrifuged at 18,516 x g for 10 min at
4°C. Supernatants were transferred on a poly-prep chromatography column containing 1
cm of AG 50W-X8 100-200 mesh hydrogen form resin (BIO-RAD Laboratories,
Hercules, CA). The resin was rinsed twice with 2 mL of ultrapure water, then Met was
extracted with 2 mL of 2 N NH4OH and, rinsed with 1 mL of ultrapure water and
collected into 7-mL glass tubes covered with paraffin and placed at -80ºC. Once frozen,
the samples were freeze-dried overnight. The samples were then dissolved with 250 µL
of ultra-pure water, transferred into reacti-vials and dried at 90ºC under nitrogen
atmosphere. Following cooling, the samples were derivatized with 50 µL of MTBSTFA
(N-(Tert-Butyldimethylsilyl)-N-methyltrifluoroacetamide, Sigma-Aldrich):MF (N,NDimethylformamide, Sigma-Aldrich) (1:1) at 120ºC for 30 min.
The IE of plasma Met was determined by GC-MS (Agilent Technologies). The
chromatography was performed at a helium flow rate of 0.8 mL/min using a 30-metre
column (HP–5MS 19091S-433, Agilent technologies) with a 0.25 µm thickness and
0.25 mm in diameter. One microlitre of each sample was injected according to the split
injection system (7673, Agilent technologies) set as follows: injector temperature of
280°C and pressure of 10.89 psi. The initial oven temperature was held at 170°C for 5
min, then raised to the final temperature of 300°C at 15°C/min and held at 300°C for 8
min. The mass spectrometry was operated in electrical impact mode under vacuum at a
source temperature of 250°C. Infusion of L[1-13C,2H3]Met was associated with two
plasma species of labelled Met: the original molecule and L[1-13C]Met, formed from
remethylation of [1-13C]Hcy obtained after transmethylation of L[1-13C,2H3]Met. The
abundance of specific ions was determined by selected ion monitoring at the following
m/z ions: 292:295 for [1-13C,2H3]Met (m+4; this fragment did not include the labelled
C) and 320:321 for [1-13C]Met (m+1). A stock solution of Met, containing both 1.08616
µmol of L[1-13C,2H3]methionine (Cambridge Isotope Laboratories) and 31 µmol of
unlabelled Met was prepared in ultrapure water. The theorical IE of the solution was
3.35 atom percent excess (ape). A constant volume of this L[1-13C,2H3]methionine
solution was added to graded concentration of unlabelled Met to generate a standard
curve (62, 46.5, 31, 24.8, 15.5 and 9.3 µM). The graded IE of the curve was 2.53, 2.35,
2.23, 2.14, 2.12 and 2.08 ape. The standard curve was plotted with area under the curve
of Met (m/z 292) against the ratio of observed ape (m/z 295) on theorical ape (ape =
3.35). This curve was used to correct the measured IE of L[1-13C,2H3]methionine
according to the concentration of the sample.
Glucose IE was analyzed by GC-MS (Agilent Technologies) using the
pentaacetate derivative (Haymond and Sunehag, 2000). Fifty microlitres of plasma were
put into 1.5-mL microcentrifuge tubes along with 200 µL of cold acetone (Fisher
Scientific). The samples were vortexed and refrigerated for 10 min prior to
centrifugation at 3 000 x g for 10 min at 4°C. Supernatant was decanted into 2-mL subsample vials and evaporated thoroughly under nitrogen. Dried samples were dissolved
with 50 µL of 98% acetic anhydride: 99.8% pyridine (2:1) (Sigma-Aldrich Chemical
Co.) and, after sealing vials very tightly with Teflon caps, vortexed. Samples were
derivatized overnight at room temperature. Infusates were analyzed using a similar
procedure, but using 100 µL of the mixture 2:1 of acetic anhydride (98%): pyridine
(99.8%). After overnight derivatization, samples were dried under nitrogen and
reconstituted in 300 µL of ethyl acetate (Sigma-Aldrich Chemical Co.), which can also
be used to dilute samples if needed. Samples were analyzed by GC-MS with a HP1701
column (30 m x 0.25 mm ID, 0.25 µm phase thickness) in split-less mode of injection
(HP GC:6890-MS:5973; Agilent Technologies Canada inc., QC, Canada). Gas
chromatography conditions were as follows: 70°C for 1 min and then ramp at 30°C/min
to 280°C for 5 min. Injector and detector were set to at 250 and 280°C respectively with
6 psi of helium pressure. The gas chromatograph was coupled to a quadrupole mass
spectrometer with mass selective detector operating in the positive chemical ionisation
mode. Isotopic enrichments were measured by monitoring ions at m/z 331, 332, 333,
334 and 337 to quantify the IE of m+1, m+2, m+3 and m+6 of glucose isotopomers,
respectively; isotopic enrichments on m+4 and m+5 isotopomers were undetectable.
IV-4.5.3 Calculations
The IE of the Met, glucose and CO2 are expressed as mole percent excess (mpe)
and were calculated as follows, correcting for background abundance:
IE = (Ri – Ro) / ((1 + (Ri – Ro)) × 100
where Ri and Ro corresponded to the ratio of peak area of m + n / m + 0 of the enriched
(Ri) and background (Ro) samples. Whole body Met, glucose and CO2 ILR (mmol/h)
were calculated as follows:
ILR = INF / IE
where INF was the rate of infusion of labelled Met, glucose or bicarbonate infusion and
IE, the IE of plasma Met, glucose or blood CO2. The infusion rate was not removed
from the ILR because, in further calculations, we could not assume that the dose of
labelled Met infused was completely oxidized. Therefore, to have a better appraisal of
the oxidation relative to whole body ILR, the rate of infusion was not removed from
either term.
Met kinetics were calculated according to the model described in Figure 27.
Whole body Met-methyl flux rate (ILR M), calculated with the IE of (m+4)Met,
estimated the loss rate of Met as soon as the methyl group was transferred to SAM,
producing a labelled [1-13C]Hcy. Remethylation of this labelled Hcy generated [113
C]Met, considering null the probability of incorporation of a labelled methyl group to
a labelled Hcy. The estimation of whole body Met-carboxyl flux rate (ILR C), using the
sum of IE of m+4 and m+1, yielded the ILR of Met excluding remethylation. The
difference between ILR-M and ILR-C represents a minimal estimate of remethylation
because if a (m+1)Met re-entered the transmethylation-remethylation cycle, the Met
molecule was not further altered and therefore, this fraction was not accounted for in the
calculation. The whole body fractional rate of oxidation (FO, %) of Met was calculated
using the following equation:
FO = [(IECO2-Met × ILR-CO2-bic) / INF] x 100
where IECO2-Met was the IE of CO2 measured during the infusion of the labelled Met,
ILR-CO2-bic represented CO2 production estimated during the bicarbonate infusion and
INF was the rate of infusion of labelled Met. Whole-body Met oxidation (Ox, mmol/h)
was then calculated as follows:
Ox = FO × ILR
= [(IECO2 × ILR-CO2-bic) / INF] × (INF / IEm+4)
= (IECO2 × ILR-CO2-bic) / IEm+4
Met used for whole body protein synthesis was calculated as the difference between
whole body ILR-C and Met oxidation. Transmethylation was the sum of remethylation
and Met oxidation (Figure 27).
Uniformly labelled glucose was infused in this study to assess the feasibility of
measuring gluconeogenesis using mass isotopomer distribution analysis (m+1, m+2,
m+3 and m+6). However, the IE of glucose species m+1, m+2 and m+3 were below
detection specification of the GC-MS for more than half of the cows. Therefore, only
whole body glucose ILR is reported using m+6 isotopomer. The FO of glucose was
calculated similarly to Met FO with the exception that the infusion rate was multiplied
by 6 to account for the 6 labelled carbons per molecule of glucose.
IV-4.6 Statistical analyses
Supplementations of Met (0 or 18 g of RPM) and B-vitamins (0 or both folic
acid and vitamin B12) were tested as the main factors in a 2 × 2 factorial arrangement
with 6 randomized complete blocks. Milk production and composition as well as DMI
were averaged for the whole 12th wk. All variables were analyzed using the MIXED
procedure of SAS (2004) with supplementations of Met and vitamins as the main
factors. Orthogonal contrasts were used to determine the effect of Met and vitamin
supplementations and their interaction. Results were reported as least square means with
standard errors. The significance level was defined at P ≤ 0.05 and trends toward
significance were considered at 0.05 < P ≤ 0.15. The SLICE option was used to
compare vitamin effect within each level of Met supplementation when the Met by
vitamin interaction reached a P value < 0.15.
IV-5 RESULTS
IV-5.1 Production data
Body weight and DMI averaged 624 ± 17 kg and 23 ± 1 kg/d, respectively and
did not differ between treatments (P > 0.55, Tableau 8).
Milk production, however, increased (P = 0.01) by approximately 12% with the
administration of folic acid plus vitamin B12, from 34.8 ± 1.0 to 38.9 ± 1.0 kg/d. Milk
concentrations of total solids, fat and lactose did not differ among treatments (P > 0.29)
whereas milk crude protein concentrations tended to increase by 1.3 g/kg in M+ cows
(P = 0.14, Tableau 8). Milk yields of protein, lactose and total solids increased (P <
0.05) with vitamin supplements and averaged 1.03 ± 0.03 vs 1.11 ± 0.03 kg/d, 1.62 ±
0.05 vs 1.79 ± 0.05 kg/d and 3.85 ± 0.11 vs 4.22 ± 0.11 kg/d for B9-B12- vs B9+B12+,
respectively (Tableau 8). Milk fat yield only tended to increase (P = 0.09) with vitamin
supplements, 1.20 ± 0.05 vs 1.31 ± 0.05 kg/d for B9-B12- vs B9+B12+, respectively.
Increased vitamin supply tended to be associated with an increase in milk urea
concentrations (P = 0.08, 124.8 ± 6.5 vs 137.3 ± 6.6 g/kg for B9-B12- vs B9+B12+
respectively, Tableau 8). Milk concentrations of vitamin B12 were higher in cows
injected with B vitamins (P = 0.02) whereas concentrations of folates were not affected
(P > 0.25, Tableau 8). Nevertheless, supplementary folic acid plus vitamin B12
increased the amounts of these vitamins secreted daily in milk: 173.2 ± 20.9 vs 266.6 ±
21.7 µg/d for vitamin B12 (P = 0.002; Tableau 8) and 2.59 ± 0.37 vs 3.27 ± 0.38 mg/d
for folates (P = 0.07; Tableau 8) for B9-B12- vs B9+B12+, respectively.
IV-5.2 Plasma variables
Plasma concentration of vitamin B12 increased by 72% with vitamin injections
(236.7 ± 32.0 vs 407.0 ± 35.1 for B9-B12- vs B9+B12+, P = 0.002; Tableau 9) but this
increase tended to be greater in cows fed no RPM supplement (Met × vitamin
interaction, P = 0.13). Plasma concentrations of folates also tended to vary according to
vitamin and Met supplementation (Met × vitamin interaction, P = 0.10; Tableau 9);
indeed, B-vitamin injections increased plasma concentrations of folates in cows fed
RPM (P = 0.02) whereas no difference was observed in M- cows (P = 0.99).
The response of plasma concentrations of urea to vitamin injections tended to
differ within each level of Met supplementation (Met × vitamin interaction, P = 0.07,
Tableau 9). Injections of folic acid plus vitamin B12 had no effect in cows fed
supplementary Met (P = 0.90) but increased plasma urea in M- cows (P = 0.01). Plasma
concentrations of glucose, BHBA and NEFA did not vary among treatments (P > 0.34;
Tableau 9).
Cows injected with folic acid plus vitamin B12 supplements had lower (P = 0.03)
Hcy concentrations than the control cows, 6.50 ± 0.64 vs 4.88 ± 0.69 µM but higher (P
= 0.04) plasma concentrations of Arg, 92.9 ± 4.8 vs 105.0 ± 5.0 µM, for B9-B12- vs
B9+B12+, respectively (Tableau 9).
Dietary supplement of RPM decreased plasma concentrations of Ile, from 159.4
± 9.1 to 137.6 ± 8.8 µM (P = 0.07), Leu, from 253.6 ± 16.1 to 208.3 ± 15.5 µM (P =
0.03), Val, from 373.2 ± 17.3 to 314.9 ± 17.3 µM (P = 0.02) and consequently,
branched-chain amino acids (BCAA), from 786.1 ± 41.7 to 660.7 ± 40.3 µM (P = 0.03).
RPM also decreased plasma Tyr, from 87.9 ± 4.8 to 76.2 ± 4.6 µM (P = 0.10) and EAA
(P = 0.03) from 1202 ± 55 to 1041 ± 53 µM, for M- and M+ cows, respectively
(Tableau 9).
Folic acid plus vitamin B12 administration increased plasma concentrations of
Lys and Met in cows fed no supplementary Met (P < 0.05), whereas they had no effect
(P ≥ 0.77) when the cows received RPM (Met × vitamin interaction, P = 0.06 and 0.10
for Lys and Met, respectively, Tableau 9). In M+ cows, plasma concentrations of Cys
decreased with B-vitamin supply (P = 0.01) whereas in M- cows, vitamins had no effect
on Cys concentrations (P = 0.47; Met × vitamin interaction, P = 0.02, Figure 28). A
similar trend was observed for plasma Phe (Met × vitamin interaction, P = 0.09,
Tableau 9) notwithstanding that plasma Phe was higher for M- than M+ cows, 68.6 ±
5.0 to 54.7 ± 4.9 µM, respectively (P = 0.01). The response of Gly and Ser to vitamin
injections tended to differ within each level of Met supplementation (Met × vitamin
interaction, P = 0.06, Tableau 9); injections of folic acid plus vitamin B12 had no effect
in cows not supplemented with Met (P ≥ 0.24) but they tended to increase
concentrations of these two AA in cows fed RPM (P = 0.07). Plasma concentrations of
Ala, Asp, Glu, His, Pro, Thr, total NEAA and TAA were not affected by treatments (P ≥
0.19).
IV-5.3 Whole body kinetics
Glucose ILR tended to increase with administration of folic acid plus vitamin
B12 (802 ± 16 vs 838 ± 17 mmol/h for B9-B12- vs B9+B12+ respectively; P = 0.11,
Tableau 10). On average, 23% of glucose ILR was oxidized whereas 50% was used for
lactose milk production but these variables were not affected by treatments (P > 0.49,
Tableau 10).
Results on whole body Met kinetics are reported in Tableau 11. Dietary
supplements of Met increased ILR-M from 20.0 ± 0.9 to 24.5 ± 0.9 mmol/h (P = 0.003).
The Met-carboxyl flux (ILR-C) rate was also higher (P = 0.003) in M+ than M- cows,
averaging 17.9 ± 0.7 vs 21.4 ± 0.7 mmol/h for M- vs M+, respectively. The effects of
vitamin supplements on the ILR-M and ILR-C, however tended to differ according to
the level of dietary Met (Met × vitamin interaction, P = 0.11 and 0.09, respectively).
Supplementary folic acid plus vitamin B12 increased the ILR-M and ILR-C by
approximately 20% in M- cows (P = 0.07 and 0.04 for ILR-M and ILR-C) but had no
effect on M+ cows (P > 0.69).
Folic acid plus vitamin B12 supplements decreased Met entry in the
transmethylation pathway (TM, Figure 27) in cows fed RPM (P = 0.002), whereas it
had no effect (P = 0.45) when the cows did not receive Met supplementation (Met ×
vitamin interaction, P = 0.01, Tableau 11). The entry of Met into the transmethylation
pathway relative to ILR-M followed the same pattern except that the interaction was
only a tendency (P = 0.10). A similar tendency was observed for Met oxidation (Met ×
vitamin interaction, P = 0.06, Figure 28), whereas fractional oxidation of Met did not
reach significance (P > 0.16).
The rate of Met going to Hcy and remethylated (RM, Figure 27) was higher in
M+ cows (P = 0.04), but the ratio of remethylation on ILR-M was not affected by
treatments (P > 0.20), averaging 12% of ILR-M. Met used for protein synthesis
increased from 14.5 ± 0.8 to 17.9 ± 0.8 mmol/h with RPM supplements (P = 0.01) and
tended to increase (P = 0.06), from 15.1 ± 0.86 to 17.3 ± 0.8 mmol/h with vitamin
supplements.
IV-6 DISCUSSION
In the present experiment, intramuscular injections of folic acid plus vitamin B12
successfully increased vitamin supply to dairy cows. Indeed, as previously observed
with intramuscular injections (Girard et al., 1995; Girard and Matte, 2005),
supplementary vitamin B12, and to a lesser extent, folic acid increased secretion of
folates and vitamin B12 in milk and their plasma concentrations.
The increase in milk production and milk component yields following
administration of a combined supplement of folic acid and vitamin B12 observed in the
present experiment is in agreement with observations from previous experiments.
Intramuscular injections of vitamin B12, given to cows fed a basal diet supplemented
with folic acid and Met, increased milk component yields as compared to cows only
supplemented with Met and folic acid (Girard and Matte, 2005). Graulet et al. (2007)
also observed that in cows fed a diet providing a low Met supply, dietary supplements
of folic acid, given alone or in combination with vitamin B12, increased milk and milk
protein yields as compared to unsupplemented cows and in addition, the two vitamins
given together increased plasma glucose and decreased accumulation of hepatic lipids
as compared to folic acid alone.
IV-6.1 Glucose kinetics
In the current study, whole body glucose ILR was higher than previously
reported in dairy cows infused uniformly labelled glucose (Clark et al., 1977; Hammon
et al., 2008) but DMI and milk production of cows in these previous studies were lower
than in the current experiment. Nevertheless, the ratio of milk lactose to whole body
glucose ILR averaged 51% in the current study, as reported for this stage of lactation
(Clark et al., 1977; Bruckental et al., 1980; Rigout et al., 2002). Glucose oxidation was
not altered by the treatments and averaged 23% of ILR, a value higher than previously
reported in dairy cows (17%, Bauman et al., 1988; 14%, Hammon et al., 2008). The
oxidation rate, measured through the recovery of glucose carbons in CO2, is a minimum
estimate as it only accounted for the carbons of uniformly labelled glucose that were
recovered in CO2, omitting other carbons of glucose that were incorporated into
intermediate products.
Administration of folic acid plus vitamin B12 increased glucose ILR by 160 g/d
compared with control cows and was associated with a similar increment in milk lactose
secretion. Glucose is the primary precursor for mammary lactose synthesis. Therefore,
the amount of glucose available may have an impact on milk production because lactose
is the major osmoregulator for mammary uptake of water (Linzell, 1972) and a close
relationship between whole body glucose flux and milk volume has been proposed
(Danfaer et al., 1995). The increased milk production of 4 kg/d observed with the folic
acid plus vitamin B12 supplements may reflect an increase of the quantity of glucose
available. However, it has been recently reported that the increment in whole body ILR
of glucose induced by infusions of either glucose, a mixture of 5 gluconeogenic NEAA
in the duodenum or propionate in the rumen of mid-lactation dairy cows was not
paralleled by changes in lactose yields (Lemosquet et al., 2005). Therefore, glucose ILR
might be important but not the sole driver of milk and lactose yields.
Whole body glucose ILR, as the rate of appearance, represents the sum of
glucose available from portal absorption, glycogenolysis and gluconeogenesis. In the
current study, it is unlikely that the portal absorption of glucose or glucose precursors
differed between treatments because DMI of the same basal diet was similar between
treatments. Glucose turnover from the glycogen pool could not be evaluated with this
model, but there is no data available from the literature indicating that supplementary
folic acid or vitamin B12 would modify glycogen kinetics. Therefore, it is likely that the
increase in whole body ILR of glucose observed in cows supplemented with folic acid
plus vitamin B12 was due to enhanced gluconeogenesis. In fed ruminants, 50-60% of
gluconeogenesis is provided by propionate (Danfaer et al., 1995). Propionate,
originating from rumen fermentation of carbohydrates, provides propionyl-CoA which
is carboxylated to methylmalonyl-CoA by propionyl-CoA carboxylase, a biotindependent enzyme. This pathway can also include catabolism of some AA (Ile, Val,
Thr, Met). Methylmalonyl-CoA is then isomerized in succinyl-CoA in a reaction
including the vitamin B12-dependent enzyme, methylmalonyl-CoA mutase (Le Grusse
and Watier, 1993). Succinyl-CoA finally enters into the Krebs cycle where it can be
used for gluconeogenesis. Bergman (1990) emphasizes that the methylmalonyl-CoA
mutase step becomes limiting when vitamin B12 supply is low. Graulet et al. (2007)
observed a decrease of the Km for adenosylcobalamin of methylmalonyl-CoA mutase in
liver of cows supplemented with folic acid plus vitamin B12, indicating an increased
affinity of this enzyme for its coenzyme, thus improving the efficiency of this metabolic
pathway. In addition, the cows in the present study were selected from a larger study for
which gene expression of methylmalonyl-CoA mutase in liver increased by 15% when
the cows were injected with folic acid plus vitamin B12 as compared with control cows
(Preynat et al., Chapitre V). Therefore, supplementary folic acid plus vitamin B12 may
improve the efficiency of utilization of glucose precursors for gluconeogenesis, thus
allowing positive effects of these B-vitamins on glucose availability and subsequently
milk yield.
The increased milk protein yield in cows injected with folic acid plus vitamin
B12, also reported by Graulet et al. (2007), could result from the improvement of
glucose supply observed with the vitamin treatment discussed above. Such hypothesis is
in agreement with previous studies which showed that an increased supply of energy
increases the amounts of proteins secreted in milk (Rulquin and Delaby, 1997; Rulquin
et al., 2004; Raggio et al., 2006). The enhanced availability of specific energy sources
could explain the milk protein increase by a sparing effect on gluconeogenic AA, the
spared AA being available at mammary level for the synthesis of milk protein. This
effect may also be due to an increase of mammary blood flow favouring AA uptake as
already seen with postruminally glucose infusion (Rulquin et al., 2004).
IV-6.2 Methionine kinetics
Whole body Met fluxes in M-B9-B12- cows are in the range of those previously
reported in human; around 30 and 25 µmol.kg-1.h-1 for ILR-M and ILR-C, respectively
(Storch et al., 1990; Mercier et al., 2006) and similar to those observed in sheep fed a
diet in which Met was calculated to be the first limiting AA (Lobley et al, 1996). The
major outlets for Met are its incorporation into newly synthesized proteins and
formation of SAM, through the transmethylation pathway. These outlets are in
equilibrium with Met entry rate, the sum of Met absorbed, Met arising from protein
degradation and Met coming from Hcy methylation. Storch et al. (1988) measured the
Met kinetics with [methyl-2H3] and [1-13C]Met in humans. They pointed out that,
whatever the supply in dietary Met (deficiency or not), the major part of Met (77%) was
used for protein synthesis whereas a smaller proportion (23%) entered in the
transmethylation pathway. This partition was also observed in the current study with, on
average, 73% of ILR-M directed towards protein synthesis of which approximately 53%
were secreted in milk protein.
As previously observed in humans fed a diet supplemented with Met and Cys
(Storch et al., 1990; Fukagawa et al., 1998; DiBuono et al., 2003), both ILR-M and
ILR-C also increased with Met supplementation in dairy cows, with a concomitant
increment in whole body protein synthesis. However, Met supplementation only tended
to increase milk protein concentration (+ 0.13 g/100g). As there was no effect of
supplementary Met on milk protein yield and assuming no effect of Met on N retention,
it is likely that a general stimulation of protein turnover occurred with RPM.
In M- cows, intramuscular injections of folic acid plus vitamin B12 increased
ILR-M and ILR-C by approximately 20% whereas oxidation of Met tended to decrease
with vitamin supplementation in M+ cows. Altogether, this resulted in increased
utilization of Met for protein synthesis with vitamin supplementation, independent of
the level of Met supply. It still remains unclear, however, if the positive effect of
vitamin supplementation on protein synthesis observed in this study was related to an
effect on protein synthesis itself, or was a consequence of the positive effect of the
vitamin supplements on glucose availability, but is certainly linked with the increased
milk protein yield induced by vitamin supplementation.
In M- cows, intramuscular injections of vitamins increased plasma
concentrations of Met, Lys and BCAA. Coupled with the observation that vitamin
supplementation increased Met ILR in M- cows, this suggested that vitamin
supplementation in M- cows increased protein turnover, which might increase
circulating concentrations of AA not extracted by the liver as Lys and the BCAA
(Lapierre et al., 2005). On the other hand, Graulet et al. (2007) also observed that
supplements of folic acid, alone or combined with vitamin B12, tended to increase
plasma concentrations of Met. In this last experiment also, milk protein yield was
increased by these vitamin supplements.
In the transmethylation pathway, Met is transformed in SAM, the major donor
of methyl group, which after giving its methyl group, will form SAH and finally,
provide the carbon skeleton of Hcy. Hcy could be either remethylated in Met, using
folates (5-methyl-tetrahydrofolate) as one-carbon unit donor and vitamin B12 as
coenzyme for the enzyme, methionine synthase or, alternatively catabolized through the
transsulfuration pathway. In this last pathway, Hcy undergoes a condensation reaction
with serine via cystathionine synthase to form cystathionine, the direct precursor of Cys
(Selhub, 1999). Cys sulfur is derived from Met whereas the carbon and nitrogen are
derived from Ser.
According to the metabolic pathways described above, weekly intramuscular
injections of both folic acid plus vitamin B12 decreased by 33% the plasma
concentrations of Hcy. These results are in agreement with previous observations in
cows (Girard et al., 2005) and growing-finishing pigs (Giguère et al., 2008) reporting a
decrease in plasma concentrations of Hcy with a dietary supplement of folic acid,
irrespective of the level of Met added to the diet. These observations would suggest
increased remethylation of Hcy with vitamin supplementation. In humans, Met
regeneration through Hcy remethylation is decreased by folate deficiency (Cuskelly et
al., 2001), whereas a supplement of folic acid given to healthy adults improved by 59%
the remethylation and reduced plasma Hcy by 18% (Stam et al., 2005). In farm animals,
the fate of Hcy between transsulfuration or remethylation has been studied only by
Lobley et al. (1996) who observed that, in sheep, the provision of the major methylated
products (creatine and choline) reduced the need for remethylation. In humans,
remethylation is primarily regulated by the need for methyl groups (Brosnan et al.,
2007; Mudd et al., 2007). Methyl groups are provided directly by dietary Met, choline
or betaine or from methylneogenesis through the folate pathway (Stead et al., 2006).
Therefore, in humans, when the intake of preformed labile methyl groups, as Met,
decreases, methylneogenesis prevails. Surprisingly, in the present experiment,
calculated value of RM increased with the intake of Met (M+). In humans, Mudd and
Poole (1975) demonstrated that even with diets providing an adequate supply of Met,
the homocysteinyl moiety cycled more than once between Met and Hcy, the number of
cycles increasing when the intake of methyl groups decreased. Recycling of Hcy also
increased in liver of rats when Met supply decreased (Eloranta et al., 1990). Moreover,
these authors observed that the capacity of the skeletal muscle for Met catabolism,
through the transsulfuration pathway, is limited and, consequently, there is a continuous
flow of Met from extrahepatic tissues to liver (Eloranta et al., 1990). Within the limit of
the methods used, calculated RM values are likely to represent only the flux of
remethylated Hcy released in the plasma pool and cannot detect if the same molecule
has made more than one cycle. If the number of cycles of the homocysteinyl moiety was
higher within hepatic cells of cows fed no supplementary RPM or fed supplementary
folic acid plus vitamin B12, then the limitation of the method used would not allow for
detection of these differences.
Met molecules that enter the transmethylation pathway, transformed into Hcy
and not remethylated to Met, are going through the transulfuration pathway and
oxidation. In the present experiment, supplementation with vitamins of M+ cows
decreased Met oxidation, with simultaneous increment in plasma concentrations of Ser
and decrease of plasma concentrations of Cys, all suggesting a real decreased oxidation
under this treatment. No explanation can actually be offered to explain this unexpected
interaction, the decrease of Met oxidation with vitamin supplementation only with RPM
feeding.
IV-7 CONCLUSION
In the current study, folic acid plus vitamin B12 supplementation increased both
milk lactose and protein yields. These increases were related to the positive effect of
vitamins on glucose ILR and Met ILR, the later being mostly due to an increase of Met
directed towards protein synthesis. Milk protein yield was not modified by
supplementary Met, despite an increment in Met ILR and the use of Met for protein
synthesis, suggesting that Met increased protein turnover. In conclusion, the effects of
the supplements of folic acid and vitamin B12 on lactational performance were not
mainly explained by Met economy through a more efficient methylneogenesis as
hypothesized but rather to an improvement in the efficiency of glucose and Met
metabolism.
IV-8 ACKNOWLEDGMENTS
The authors are grateful to dairy barn staff for animal care, to Chrystiane Plante,
Mario Leonard, Jocelyne and Micheline Gingras for technical assistance, and Steve
Methot for statistical advices. Thanks are also extended to the financial support of the
Action Concertée NOVALAIT– FQRNT - MAPAQ – Agriculture and Agri-Food
Canada.
Close-up cows
Lactation cows
Long grass hay
Legume-grass silage3
33.01
11.0
8.22
23.4
Corn silage4
14.5
23.1
Cracked corn
16.9
28.5
Ingredients, %
Soybean meal 49%
9.6
Beet pulp
13.3
Micronized soybean
3.9
2.0
Distiller's grain (wheat)
1.3
0.7
Distiller's grain (corn)
2.2
1.1
Canola meal
1.3
0.7
5
1.6
1.0
1.86
0.8
12.8
17.3
7.9
10.6
4.9
6.7
26.5
19.2
45.2
30.4
1.55
1.58
1,055
2,341
Methionine, % MP
Lysine, % MP8
1.85
6.18
1.83
6.3
K, %
1.27
1.55
Ca, %
0.69
0.87
P, %
0.52
0.44
Mg, %
0.39
0.29
S, %
0.25
0.26
Cl, %)
0.43
0.34
Mineral and vitamin premix
Calcium carbonate
Nutrient composition
CP, %
RDP, %
7
RUP, %
7
ADF, %
NDF, %
NEl, Mcal/kg DM
MP, g/d
8
8
8
1
7.8 ± 1.1 % CP, 0.8 ± 0.1 % soluble proteins, 34.2 ± 5.8 % ADF, 58.9 ± 7.0 % NDF, 5.6 ± 0.6
% lignin, (n = 3).
2
10.9 ± 1.7 % CP, 2.4 ± 0.1 % soluble proteins, 31.9 ± 1.8 % ADF, 55.1 ± 4.2 % NDF, 4.4 ±
0.5 % lignin (n = 5).
3
% lignin (n = 11).
4
% lignin (n = 10).
5
Contains per kg, 30 g Ca, 120 g P, 120 g Mg, 69 g Na, 106 g Cl, 15 g K, 20 g S, 4,343 mg Fe,
6,566 mg Mn, 6,465 mg Zn, 1,616 mg Cu, 202 mg I, 121 mg Co, 40 mg Se (25 % organic
selenium), 732,323 IU vitamin A, 247,475 IU vitamin D and 7,576 IU vitamin E.
6
Contains per kg, 95 g Ca, 55 g P, 55 g Mg, 130 g Na, 150 g Cl, 14 g K, 21 g S, 2,745 mg Fe,
2,065 mg Mn, 3,000 mg Zn, 495 mg Cu, 69 mg I, 33 mg Co, 20 mg Se (25 % organic
selenium), 501,859 IU vitamin A, 65,000 IU vitamin D and 2,600 IU vitamin E.
7
Calculated according to National Research Council model (2001).
8
Calculated according to National Research Council (2001) from average DMI of control cows
(M-B9-B12-) during the close-up (12.6 kg/d) and lactation (21.8 kg/d) periods.
Tableau 7. Binary gradient mobile phase composition used to analyze plasma AA by
HPLC
Time,
min
Percent eluent, %
1
2
Curve
Flow-rate,
mL/min
A
B
0
100
14
97
3
11
1
25
94
6
8
1
30
91
9
5
1
55
72
28
5
1
65
60
40
6
1
70
0
100
6
1
75
0
100
1
1
76
100
0
1
1
1
Eluent A, 0.07 M sodium acetate trihydrate buffer containing 350 µL of 10 mg/mL
ethylenediamine tetraacetic, ajusted at pH 6.45 with glacial acetic acid, filtered on 0.45
µm nylon membrane filters and mixed with 25.65 mL acetonitrile.
2
Eluent B, methanol, water and acetonitrile (15:40:45, v/v).
137
Tableau 8. Effects of dietary supplements of rumen-protected methionine (M) and intramuscular injections of folic acid (B9) and vitamin B12
(B12) given to dairy cows on production variables at 12 wk of lactation
Treatments1
M+
Body weight, kg
DMI, kg/d
Milk production, kg/d
Fat, g/kg
Protein, g/kg
Lactose, g/kg
Urea, g/kg
Total solids, g/kg
Folates, ng/mL
Vitamin B12, pg/mL
Fat, kg/d
Protein, kg/d
Lactose, kg/d
Total solids, kg/d
Folates, mg/d
Vitamin B12, µg/d
1
B9-B12(n = 6)
613
± 17
23.7
± 1.0
34.1
± 1.4
34.5
± 1.5
30.0
± 0.8
46.7
± 0.7
123.5 ± 7.9
111.2 ± 2.2
81.4 ± 10.5
5422 ± 758
1.18 ± 0.06
1.02 ± 0.04
1.59 ± 0.07
3.79 ± 0.15
2.78 ± 0.44
182.1 ± 26.7
B9+B12+
(n = 6)
644
± 17
23.1
± 1.0
39.2
± 1.4
34.3
± 1.5
29.4
± 0.8
45.7
± 0.7
130.7 ± 7.9
109.4 ± 2.2
81.4 ± 10.5
6600 ± 758
1.34 ± 0.06
1.15 ± 0.04
1.79 ± 0.07
4.29 ± 0.15
3.20 ± 0.44
256.7 ± 26.7
P values
M-
B9-B12B9+B12+
(n = 6)
(n = 5)
619
± 17
619
± 19
23.0 ± 1.0 23.5 ± 1.1
35.4 ± 1.4 38.6 ± 1.5
34.5 ± 1.5 33.3 ± 1.6
29.0 ± 0.8 27.9 ± 0.9
46.8 ± 0.7 46.2 ± 0.8
126.1 ± 7.9 144.0 ± 8.5
110.3 ± 2.2 107.4 ± 2.4
69.1 ± 10.5 85.9 ± 11.1
4666 ± 758 7287 ± 828
1.22 ± 0.06 1.27 ± 0.07
1.03 ± 0.04 1.07 ± 0.05
1.65 ± 0.07 1.78 ± 0.08
3.90 ± 0.15 4.14 ± 0.17
2.40 ± 0.44 3.35 ± 0.47
164.3 ± 26.7 276.5 ± 29.0
met
vit
met*vit
0.55
0.86
0.82
0.71
0.14
0.69
0,25
0.53
0.59
0.96
0.81
0.40
0.70
0.90
0.74
0.97
0.47
0.98
0.01
0.62
0.31
0.29
0,08
0.32
0.25
0.02
0.09
0.05
0.04
0.03
0.07
0.002
0.36
0.56
0.52
0.71
0.74
0.77
0,43
0.81
0.25
0.34
0.35
0.32
0.66
0.41
0.45
0.45
M- and M+: basal diet – or + rumen-protected Met; B9-B12-: no vitamin supplement; B9+B12+: 160 mg folic acid/wk + 10 mg
cyanocobalamin/wk.
138
given to dairy cows on plasma variables at 12 wk of lactation
Treatments1
M+
Folates, ng/mL
Vitamin B12, pg/mL
Glucose, µM
Urea, mM
BHBA, mM
NEFA, µM
Amino acids, µM
Ala
Arg
Asp
Cys
Glu
Gly
His
Hcy
Ile
Leu
Lys
Met
Phe
Pro
Ser
Thr
Tyr
P values
M-
B9-B12(n=6)
12.4
± 1.5
269.6 ± 44.2
3.57 ± 0.12
5.93 ± 0.39
0.68 ± 0.11
171.7 ± 55.0
B9+B12+
(n=6)
17.8
± 1.5
364.8 ± 44.2
3.54 ± 0.12
5.99 ± 0.39
0.65 ± 0.11
200.4 ± 55.0
B9-B12B9+B12+
(n=6)
(n=5)
16.9 ± 1.5 16.8 ± 1.6
203.8 ± 44.2 443.8 ± 48.4
3.62 ± 0.12 3.47 ± 1.07
5.64 ± 0.39 7.01 ± 0.43
0.56 ± 0.11 0.71 ± 0.12
160.3 ± 55.0 242.2 ± 60.2
met
vit
met*vit
0.25
0.88
0.94
0.29
0.79
0.79
0.10
0.002
0.45
0.06
0.55
0.34
0.10
0.13
0.61
0.07
0.39
0.64
297
93.8
4.88
119.9
53.4
314.3
54.5
7.12
139.0
215.1
99.7
25.1
59.9
127.9
99.5
147.6
74.4
313
100.3
6.55
101.5
52.9
377.3
52.7
5.08
136.1
201.5
97.8
24.5
49.5
133.8
116.9
151.1
78.0
291
92.0
5.46
109.5
54.8
340.8
59.4
5.87
147.9
233.2
98.8
20.5
65.9
138.8
114.5
149.4
84.7
0.44
0.47
0.92
0.80
0.71
0.29
0.19
0.23
0.07
0.03
0.07
0.24
0.01
0.24
0.73
0.90
0.10
0.68
0.04
0.36
0.15
0.40
0.78
0.87
0.03
0.36
0.50
0.09
0.21
0.58
0.43
0.47
0.80
0.46
0.65
0.30
0.73
0.02
0.48
0.06
0.62
0.53
0.28
0.18
0.06
0.10
0.09
0.72
0.06
0.97
0.83
± 24
± 6.0
± 1.25
± 5.0
± 4.1
± 32.9
± 6.5
± 0.78
± 11.5
± 20.4
± 7.8
± 1.5
± 5.7
± 13.4
± 6.1
± 11.8
± 6.5
± 24
± 6.0
± 1.25
± 5.4
± 4.1
± 32.9
± 6.5
± 0.84
± 11.5
± 20.4
± 7.8
± 1.5
± 5.7
± 13.4
± 6.1
± 11.8
± 6.5
± 24
± 6.0
± 1.3
± 5.0
± 4.1
± 32.9
± 6.5
± 0.78
± 11.5
± 20.4
± 7.8
± 1.5
± 5.7
± 13.4
± 6.1
± 11.8
± 6.5
291
109.7
6.24
114.2
48.3
293.1
63.2
4.68
170.9
274.1
126.7
25.3
71.4
153.7
106.4
152.2
91.2
± 25
± 6.5
± 1.37
± 5.4
± 4.5
± 35.4
± 7.1
± 0.84
± 12.6
± 22.3
± 8.4
± 1.7
± 6.1
± 14.6
± 6.7
± 13.0
± 7.1
139
Val
BCAA2
EAA3
NEAA4
TAA5
1
328.0
682.1
1069
1185
2254
± 22.7
± 53.7
± 69
± 65
± 122
301.9
639.2
1013
1277
2300
± 22.7
± 53.7
± 70
± 70
± 132
351.3 ± 22.7 395.2 ± 24.8
732.3 ± 53.7 839.9 ± 58.7
1126 ± 69 1278 ± 70
1232 ± 65 1214 ± 70
2358 ± 122 2493 ± 132
0.02
0.03
0.03
0.87
0.19
0.70
0.55
0.48
0.49
0.42
0.14
0.17
0.13
0.30
0.68
cyanocobalamin/wk.
2
BCAA, branched-chain amino acids = Ile + Leu + Val
3
EAA, essential amino acids = His + Ile + Leu + Val + Lys + Phe + Thr + Met
4
NEAA, non-essential amino acids = Ala + Arg + Asp + Glu + Gly + Pro + Ser + Tyr + cys
5
TAA, total amino acids
140
given to dairy cows on whole body glucose kinetics at 12 wk of lactation
Treatments1
M+
B9-B12(n=6)
Glucose kinetics (mmol/h)
ILR
Ox2
FO (%)3
817
190
23.2
± 22
± 19
± 2.0
MB9+B12+
(n=6)
843
182
21.5
± 22
± 19
± 2.0
B9-B12(n=6)
787
183
23.1
± 22
± 19
± 2.0
met
P values
vit
met*vit
B9+B12+
(n=5)
833
197
23.3
± 24
± 20
± 2.1
0.36
0.81
0.55
0.11
0.81
0.63
0.63
0.49
0.54
Milk lactose / glucose ILR4
0.47 ± 0.02 0.52 ± 0.02
0.51 ± 0.02 0.52 ± 0.02
0.38 0.22
0.48
1
cyanocobalamin/wk.
2
Ox = oxidation = FO * ILR glucose
3
FO = fractional oxidation
4
Milk lactose-/glucose ILR = [(ILR glucose – Ox glucose) / 2] / ILR glucose
141
given to dairy cows on whole body Met kinetics at 12 wk of lactation
Treatments1
P values
M+
B9-B12(n=6)
Met kinetics (mmol/h)
ILR-M2
ILR-C3
RM4
Ox5
FO (%)6
TM7
PS8
24.8
21.6
3.2
4.5
18.6
7.7
17.1
± 1.2
± 1.0
± 0.4
± 0.6
± 2.5
± 0.6
± 1.1
MB9+B12+
(n=6)
24.1
21.3
2.8
2.6
11.1
5.4
18.7
± 1.2
± 1.0
± 0.4
± 0.6
± 2.5
± 0.6
± 1.1
B9-B12(n=6)
18.3
16.2
2.0
3.1
16.7
5.2
13.1
± 1.2
± 1.0
± 0.4
± 0.6
± 2.5
± 0.6
± 1.1
B9+B12+
(n=5)
21.8
19.5
2.3
3.6
16.5
5.7
15.9
± 1.3
± 1.1
± 0.4
± 0.6
± 2.7
± 0.6
± 1.1
met
vit
met*vit
0.003
0.003
0.04
0.74
0.50
0.02
0.01
0.27
0.15
0.84
0.22
0.16
0.06
0.06
0.11
0.09
0.42
0.06
0.18
0.01
0.59
Ox / ILR-M
0.19 ± 0.03 0.11 ± 0.03
0.17 ± 0.03 0.17 ± 0.03
0.50 0.16
0.18
RM / ILR-M
0.13 ± 0.01 0.12 ± 0.01
0.11 ± 0.01 0.10 ± 0.01
0.21 0.52
0.81
Ox / TM
0.58 ± 0.06 0.48 ± 0.06
0.61 ± 0.06 0.63 ± 0.07
0.20 0.24
0.23
RM / TM
0.42 ± 0.06 0.56 ± 0.06
0.41 ± 0.06 0.39 ± 0.07
0.20 0.34
0.23
TM / ILR-M
0.31 ± 0.02 0.23 ± 0.02
0.28 ± 0.02 0.27 ± 0.02
0.98 0.05
0.10
1
cyanocobalamin/wk.
One cow in M+B9+B12+ group has been removed for Ox, FO, transmethylation and protein synthesis calculation.
2
ILR-M = Met-methyl flux; irreversible loss rate of 3D3 labelled Met, and it corresponds to the sum of protein synthesis, oxidation and
remethylation.
3
ILR-C = Met -carboxyl flux; irreversible loss rate of 13C labelled Met and it corresponds to the sum of protein synthesis and oxidation.
4
RM = remethylation cycle = ILR-M – ILR-C
5
Ox = oxidation = FO × ILR-M
6
FO = fractional oxidation
7
TM = transmethylation = RM + Ox
8
PS = protein synthesis = ILR-M – RM – Ox = ILR-C – Ox
142
Figure 27. A schematic pathway of L-[1-13C,2H3]methionine with its components:
transmethylation (TM), remethylation (RM) and transsulfuration (TS); CH3-THF, methyltetrahydrofolate, THF, tetrahydrofolate. If methionine is labelled on the methyl group and the
carboxyl group, the methyl label will be lost during TM while homocysteine RM will produce
methionine labelled only on the carboxyl group. The carboxyl label will be lost during TS, which
correspond to methionine oxidation, and will appear in CO2 (adapted from Mercier et al., 2006)
Protein synthesis
Methionine
C H3 – S – (CH2)2 – CH
THF
Vitamin
B12
RM
TM
Homocysteine
CH3-THF
C OOH
NH2
HS – (CH2)2 – CH
TS
Cysteine
HS – CH2 – CH
C H3
C OOH
NH2
C O2
COOH
NH2
143
Figure 28. Effects of dietary supplements of rumen-protected methionine (M) and intramuscular
injections of folic acid (B9) and vitamin B12 (B12) given to dairy cows from 3 wk before calving
to 12 wk of lactation on A) plasma concentration of cysteine (methionine x vitamins; P = 0.02)
and B) methionine oxidation (methionine x vitamins; P = 0.06) on wk 12 of lactation
Plasma concentrations of cysteine, uM
A)
130
125
120
115
110
105
100
M+B9-B12-
M+B9+B12+
M-B9-B12-
M-B9+B12+
M+B9+B12+
M-B9-B12-
M-B9+B12+
B)
Methionine oxidation, mmol/h
5,5
5
4,5
4
3,5
3
2,5
2
M+B9-B12-
144
IV-9 REFERENCES
Agriculture Canada. 1990. Recommended Code of Practice for Care and Handling of Dairy Cattle. Publ. No. 1853/E.
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147
148
CHAPITRE V
HEPATIC METABOLISM OF DAIRY COWS ACCORDING
TO FOLIC ACID AND VITAMIN B12 SUPPLY AND
METHIONINE PROVISION.
Ce chapitre sera soumis pour publication dans la revue “Journal of Dairy Science ” sous la
référence de A. Preynat, H. Lapierre, M.C. Thivierge, M.F. Palin, J.J. Matte, A. Desrochers and
C. L. Girard. 2009. Hepatic Metabolism of Dairy Cows According to Folic Acid and Vitamin B12
Supply and Methionine Provision. J. Dairy Sci. xx : xx-xx.
149
V-1 RÉSUMÉ
De -3 à +16 semaines de lactation, les suppléments de méthionine protégée de la
dégradation ruminale affectent l’efficacité du cycle des méthylations. Les concentrations
hépatiques de folates et de vitamine B12 étaient augmentées en réponse à leur supplément
respectif mais cette réponse variait en fonction des apports de méthionine. Les expressions
géniques de la 5, 10-méthylène-tétrahydrofolate réductase et de la méthylmalonylCoA mutase
étaient augmentées par les injections combinées d’acide folique et de vitamine B12. La
méthylmalonylCoA mutase, une enzyme dépendante de la vitamine B12, est essentielle pour
l’utilisation du propionate pour la néoglucogenèse. Ces résultats suggèrent qu'une augmentation
des apports de groupements méthyles, préformés ou via la méthylnéogenèse, affectait
l'expression de plusieurs gènes liés au cycle des méthylations mais n'avait qu'un effet limité sur
les performances zootechniques. Cependant, les effets des suppléments vitaminiques sur les
performances de lactation des vaches laitières résultaient probablement d'une amélioration du
métabolisme du glucose en début de lactation.
Mots-clés : vache laitière, acide folique, vitamine B12, méthionine protégée de la dégradation
ruminale
150
V-2 ABSTRACT
The present experiment was undertaken to study the interactions between dietary
supplements of rumen-protected methionine (RPM) and intramuscular injections of folic acid and
vitamin B12, given from 3 wk before calving to 16 wk of lactation, on hepatic metabolism of
lactating dairy cows. Sixty multiparous Holstein cows were assigned to 10 blocks of 6 cows each
according to their previous milk production. Within each block, 3 cows were fed a diet calculated
to supply Met as 1.83% metabolizable protein, equivalent to 76% of Met requirement, whereas
the 3 other cows were fed the same diet supplemented with 18 g of RPM. Within each level of
Met, the cows received either no vitamin supplement, weekly intramuscular injections of 160 mg
of folic acid alone or combined with 10 mg of vitamin B12. Liver biopsies were taken at 2, 4, 8
and 16 wk of lactation. Liver concentrations of folates and vitamin B12 were increased by their
respective supplements but this response to vitamin supplements was altered by methionine
supply. Concentrations of triglycerides increased in liver of cows fed RPM whereas
concentrations of cholesterol ester, cholesterol, diglycerides and phosphatidylcholine were not
affected. Folic acid and vitamin B12 given together increased hepatic concentrations of
phosphatidylethanolamine only in cows fed RPM. Gene expressions of 5,10-methylenetetrahydrofolate
reductase,
microsomal
transfer
protein
and
phosphatidylethanolamine
methyltransferase were higher in liver of cows fed RPM supplements. The relative mRNA
abundance of 5,10-methylene-tetrahydrofolate reductase and methylmalonylCoA mutase were
increased by the combined injections of folic acid and vitamin B12, whereas those of methionine
synthase and methionine synthase reductase were not affected by treatments. These data suggest
that increasing supply of methyl groups, as preformed labile methyl groups or through
methylneogenesis, affected the expression of several genes linked to the methylation cycle but
had a limited impact on dairy cow performance. However, the observed effects of the combined
supplement of folic acid and vitamin B12 on lactational performance of dairy cows probably
result from an improvement of glucose metabolism during early lactation.
151
V-3 INTRODUCTION
Folic acid, vitamin B12 and Met roles are closely interrelated in the methylation cycle
(Figure 29). Folic acid deficiency reduces the activity of the methylation cycle by decreasing
methylneogenesis. Vitamin B12 is the coenzyme of methionine synthase, the enzyme essential for
the transfer of a methyl group from 5-methyl-tetrahydrofolate to homocysteine (Hcy) for
regeneration of Met, the precursor of S-adenosylmethionine (SAM), a major donor of methyl
groups.
A vitamin B12 deficiency blocks the transfer of a methyl group from 5-methyl-
tetrahydrofolate leading to a secondary folate deficiency by interfering with folate utilization in
cells (Scott, 1999). Met supply, due to its role as donor of preformed labile methyl groups, affects
the needs for methylneogenesis (Bailey and Gregory, 1999) and consequently, for these two
vitamins.
Besides their roles in the methylation cycle, folic acid is involved in purine and
pyrimidine synthesis, and consequently, DNA synthesis and cell division; vitamin B12 plays a
major role for the entry of propionate in the Krebs cycle and gluconeogenesis, through the
vitamin B12-dependent enzyme, methylmalonyl-CoA mutase (MUT) (McDowell, 2000) and Met
has an important role in protein synthesis (Brosnan et al., 2007).
Recent studies demonstrated that, under some circumstances, supplementary folic acid
and vitamin B12 improved lactational performance of dairy cows without altering DMI (Girard
and Matte, 2005; Graulet et al., 2007). However, given the intricate metabolic pathways
dependent of these two vitamins, it is not clear if these effects were mediated through changes in
DNA synthesis, methylneogenesis or gluconeogenesis. Girard and Matte (2005) observed that
administration of vitamin B12 to dairy cows fed a diet supplemented with rumen-protected Met
(RPM) and folic acid increased lactational performance and blood hemoglobin concentrations
but decreased plasma concentrations of methylmalonic acid. The results suggest that low vitamin
B12 supply interfered with the vitamin B12-dependent enzyme, MUT as well as with folate
metabolism because folic acid deficiency, through its role in DNA synthesis, affects
hematopoiesis (Bills et al., 1992). However, Graulet et al. (2007) reported that supplementary
folic acid, given alone or in combination with vitamin B12, increased milk and milk protein yields
without affecting DMI suggesting that these responses were not dependent of vitamin B12 supply.
However, in this last study, when vitamin B12 was given with folic acid, changes in
152
concentrations of plasma glucose and hepatic lipids suggested an improvement in metabolic
efficiency. These effects were probably related to improved gluconeogenesis efficiency due to an
increased affinity of MUT for its cofactor, vitamin B12, in hepatocytes of cows fed
simultaneously folic acid and vitamin B12 supplements.
Given the close interaction of folic acid and vitamin B12 in methylation cycle and glucose
metabolism, these two vitamins should play an important role in the regulation of these metabolic
pathways in lactating dairy cows. In addition, as the liver plays a key role in the coordination of
nutrient fluxes to support lactation, it was hypothesized that supplements of these two vitamins
would improve metabolic efficiency at the hepatic level. In an attempt to further delineate the
modes of action of folic acid and vitamin B12 on hepatic metabolism, different metabolites and
expression of genes closely related to the roles described above of these three nutrients have been
studied. In addition, in vitro capacity of gluconeogenesis and protein synthesis was measured on
liver tissues obtained by biopsy from the cows used in Preynat et al. (2009a, Chapitre III).
V-4 MATERIALS AND METHODS
V-4.1 Animals, diets and experimental design
Sixty multiparous Holstein cows from the herd at the Agriculture and Agri-Food Canada
Research Centre (Sherbrooke, PQ, Canada) were assigned to 10 blocks of 6 cows each according
to their previous milk production; treatments were tested according to a 2 x 3 factorial
arrangement. Within each block, 3 cows were fed the basal diet calculated to supply Met as
1.83% of metabolisable protein (MP), equivalent to 76% of the Met requirement (NRC, 2001)
(M-). The three other cows were fed the same diet supplemented daily with RPM (M+: 9 and 18
g Mepron-85/d, Degussa AG, Hanau, Germany, pre and post-calving) to bring the estimated Met
supply to 2.23% of MP in the lactation diet, equivalent to 93% of the Met requirement (NRC,
2001). Within each level of Met (M+ or M-), the cows received either no vitamin supplement
(B9-B12-), weekly intramuscular injections of 160 mg of folic acid alone (B9+B12-;
pteroylmonoglutamic acid, ICN Biochemicals inc., Cleveland, Ohio, USA) or in combination
with 10 mg of vitamin B12 (B9+B12+; cyanocobalamin, 5 000 µg/mL, Vetoquinol, Lavaltrie,
Québec, Canada).
153
The experimental period began 3 wk before the expected date of calving and lasted until
16 wk after calving. Cow management and diet composition are described in Preynat et al.
(2009a, Chapitre III).
V-4.2 Sampling procedure
Liver biopsies were performed at 13.9 ± 1.3, 27.8 ± 1.4, 55.8 ± 1.4 and 112.1 ± 1.8 d after
calving under local anaesthesia and ultrasound guidance to minimize the hemorrhagic risks as
described by Graulet et al. (2007). The procedure was approved by the Institutional Committee
on Animal Care of the Sherbrooke Research Centre in accordance with the guidelines of the
Canadian Council of Animal Care (1993). Liver tissue was immediately blotted to remove blood
and an average of 0.610 ± 0.017 g of fresh tissue was transported to the laboratory in ice-cold
transport media (RPMI 1640 media without phenol red; pH 7.2, filtered to 0.22 µm and kept
under sterile conditions) and used immediately to determine hepatic capacity for protein synthesis
and gluconeogenesis using an in vitro metabolic system. The remaining tissue (approximately 2.4
± 0.5 g) was immediately frozen into liquid nitrogen and stored at -80°C until used.
V-4.3 Laboratory analyses
V-4.3.1 Folates and vitamin B12
Concentrations of folates and vitamin B12 in liver were determined in duplicate by
radioassay using a commercial kit designed for human plasma (Quantaphase FolatesII/vitamin
B12, Bio-Rad Laboratories (Canada) Ltd, Mississauga, ON, Canada) as described by Graulet et al.
(2007). The interassay coefficients of variation were 4.4 and 2.0% for folates and vitamin B12,
respectively.
V-4.3.2 Biotin
Concentration of biotin in liver was determined using a method described by Santschi and
Girard (2007) for analysis in digesta. Approximately 50 mg of liver tissue were homogenized in a
glass grinder tube with 10 mL of ultrapure water for 1 min. Homogenates were transferred to 50
154
mL tubes. Glass tubes and grinders were rinsed with 10 mL ultrapure water to recover the total
amount of homogenates. One gram of dried pancreas (pancreas acetone powder, bovine; Sigma,
Oakville, ON, Canada) was added and the volume was completed to 30 mL with ultrapure water.
The tubes were mixed carefully, incubated in an ultra-sound bath for 15 min and then, in a water
bath at 37°C for 18 h. Following incubation, the samples were autoclaved for 10 min at 121°C to
stop all enzymatic activity. After cooling, the volume was completed at 50 mL with ultrapure
water and the tubes were centrifuged for 12 min at 1,538 x g and 4°C. Samples were then diluted
1:70 in PBS to achieve a final dilution of 1:3,500. This preparation was used in the ELISA assay
as described by Santschi and Girard (2007).
V-4.3.3 Lipid fractions (cholesterol ester, triglycerides, diglycerides,
cholesterol, phosphatidylethanolamine and phosphatidylcholine) in liver
Lipids in hepatic tissue were extracted according to the method described by Folch et al.
(1957) and quantified using a HPLC method adapted from Homan and Anderson (1998). The dry
lipid extracts were dissolved in 5 mL of isooctan/tetrahydrofuran (9/1) (Sigma) and stored at 20ºC until HPLC analysis. The HPLC system components were from Kontron Instruments
(Zürich, Switzerland) and consisted of a P325 pump, a 360 autosampler and vacuum degasser
200 (PerkinElmer, Courtaboeuf, France). All components were controlled by the Kromasystem
2000 software. A 150 x 4.6 mm column containing silica 5 μm (Sunfire Silica 5 μm, Waters,
Guyancourt, France) and equipped with a 0.2 μm column prefilter (Waters) was heated to 40ºC in
a column thermostat 482 (Kontron Instruments). Lipids were detected with a SEDEX 85
evaporative light scattering detector (Sedere S.A., Alfortville, France), equipped with nitrogen
generator (Parker Balston® N2-04, Parker Hannifin, La Chaussee Saint Victor, France), set to
50% of maximum gain, a drift tube temperature of 45ºC and a nitrogen pressure of 3.5 bar.
V-4.3.4 RNA extraction and cDNA synthesis
Total RNA was extracted from liver biopsies using TRIzol reagent (Gibco BRL,
Burlington, ON, Canada) according to the manufacturer’s instructions. Total RNA was dissolved
in water and quantified spectrophotometrically at 260 nm and an aliquot was run on 1% agarose
155
gel to verify its integrity. Total RNA was reverse transcripted to cDNA in a PTC-200 Peltier
Programmable Thermal Cycler (MJ Research, Foster City, CA). Five µg of total RNA were
treated with three units of DNase I (amplification grade; Gibco BRL) to remove contaminating
genomic DNA. First-strand cDNA was synthesized using a superscript II preamplification system
(Gibco BRL) and 500 ng of oligo(dT)12-18 as primer (Amersham Pharmacia Biotech, Baie d’Urfé,
QC, Canada) in 50 μL of total reaction volume.
.
V-4.3.5 Cloning and Sequencing of 5,10-Methylene-tetrahydrofolate
Reductase, Betaïne Homocysteine Methyltransferase and Methionine
Synthase Reductase Bovine Genes
To determine the bovine specific sequence of 5,10-methylene-tetrahydrofolate reductase
(MTHFR), betaine homocysteine methyltransferase (BHMT) and methionine synthase reductase
(MTRR), degenerate primers (Tableau 6) were designed based on homology between human
(Genbank accession no. NM_005957, BC012616 and AF025794, respectively) and mouse
(Genbank accession no. NM_010840, AF033381 and BC025942, respectively) sequences.
PCR amplifications were performed under the following conditions: the 50-μL PCR
reaction contained 200 μM dNTPs, 300 nM of each primer, 1.5 mM MgCL2, 1 unit of Taq
polymerase (Clontech a Takara Company, Mountain View, CA) in 1 x Taq polymerase buffer.
The PCR profile consisted of an initial denaturation step at 94ºC for 1 min followed by 35 cycles
of 94ºC for 30 sec, 50ºC for 30 sec, 68ºC for 1 min, and a final extension at 68ºC for 5 min. This
amplification generated one fragment of 612, 489 and 516 bp for MTHFR, BHMT and MTRR,
respectively (Tableau 6). The nucleotide sequence of the amplified fragment was determined by
cycle sequencing in both directions a total of three independent amplifications. Sequence
determination was performed using the Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reactions
(PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) according to manufacturer’s instructions and
run on an ABI 377 DNA sequencer (PE Applied Biosystems).
156
V-4.3.6 5’- and 3’- RACE of MTHFR, BHMT, MTRR and Methionine
Synthase Bovine Genes.
To obtain the complete coding sequence of bovine MTHFR, BHMT, MTRR and
methionine synthase (MS), 5’ and 3’ rapid amplification of the cDNA ends (RACE) was
performed using the MarathonTM cDNA amplification kit (Clontech). Poly A+ RNA was isolated
using the Nucleotrap mRNA purification kit (Clontech). One µg of poly A+ RNA from bovine
liver tissue was reverse-transcribed using the Marathon cDNA synthesis primer. Second strand of
cDNA was synthesized and a Marathon cDNA adaptor (Clontech) was then ligated to it. The 3’
and 5’ end amplification of bovine selected genes was performed using gene-specific primers,
defined in Tableau 6. Both 5’ and 3’ end fragments were sequenced as described above and were
assembled using the AutoAssembler 2.0 software (PE Applied Biosystems) to determine the
complete bovine specific MTHFR, BHMT, MTRR and MS coding sequences.
V-4.3.7 Selected bovine genes mRNA levels
The cDNA of cells obtained by liver biopsy was analyzed for actin-beta (ACTB), BHMT,
cyclophiline (CYCLO), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), glucuronidasebeta (GUSB), glycine N-methyltransferase (GNMT), MS, MTHFR, microsomal transfer protein
(MTP), MTRR, MUT and phosphatidylethanolamine methyltransferase (PEMT) mRNA levels
using real-time PCR amplification. Gene-specific primers (Tableau 6) were designed and selected
using the Primer Express Software (PE Applied Biosystem). Real-time PCR amplifications were
performed in 25-μL reaction volume consisting of 300 nM forward and reverse primers, 1 μL of
cDNA, 0.25 AmpErase (PE Applied Biosystem) and 1 x SYBRGreen Master Mix (PE Applied
Biosystem). Cycling conditions were 2 min at 50ºC, followed by 10 min at 95ºC, then 40 cycles
of 15 sec at 95ºC and 1 min at annealing temperature (Tableau 6). Amplification, detection, and
analysis were performed with an ABI Prism 7700 Sequence Detector (PE Applied Biosystem). A
correction for each plate was realized by dividing the threshold cycle value of samples by the
smallest threshold cycle value of the plate. Then samples were normalized using a housekeeping
gene. The expression of an “ideal” housekeeping gene should not vary with treatments or
physiological state in the studied tissue (Bustin, 2000, 2002). However, Rhoads et al. (2003) and
Janovick-Guretzky et al. (2007) observed that, during the peripartum period in dairy cows,
157
expression of many genes frequently used as housekeeping genes varied. In order to circumvent
this problem, an alternative methodology had been tested, using the best combination of 3
housekeeping genes (ACTB, CYCLO and GUSB), chosen according to Vandesompele et al.
(2002) to form the “bestkeeper” gene. However, as the bestkeeper gene was significantly affected
by the studied treatments (Met × vitamins interaction, P < 0.0001), the samples were normalized
using gene expression of GAPDH which did not significantly (P ≥ 0.08) differed among
treatments.
All real-time PCR reactions were performed in triplicate and standard curves were
established in duplicate for each gene. A pool of cDNA obtained from different liver biopsies
was used to create a standard curve for quantification of the transcripts using the relative standard
curve method as described by Applied Biosystem (User Bulletin #2, 1997). Standard curve
arbitrary units were made using 2 µL, 1.5 µL, 1 µL and then serial dilutions corresponding to
0.75, 0.50, 0.25, 0.10, 0.05, 0.025 and 0.005 µL of cDNA. For each sample, the amount of each
target gene mRNA relative to endogenous GAPDH was determined from their respective
standard curves. Relative quantity ratios were obtained by dividing the relative quantity unit of
each target gene by the one of GAPDH. The specificity of the amplified fragments was verified
on a 3.5% agarose gel and with melting curve analysis using the Dissociation Curves v1.0
software (PE Applied Biosystem).
V-4.3.8 Liver incubations
Less than 1 h after the biopsy, liver tissue was sliced in section of 1 mm thickness (20
mg). An average amount of 101.4 ± 2.6 mg of fresh tissue was placed on sterile stainless steel
grids above the central well of BD FalconTM cell culture dishes (B.D. Labware, Franklin Lakes)
and covered with 0.9 mL of incubation medium. The incubation medium used to evaluate
gluconeogenesis had the same composition than the transport medium plus 0.3 mM of Hcy
(Sigma), 63.8 mg/L of Cys (Sigma), 10 mL/L of an the antibiotic-antimycotic mixture (10,000
U/mL of penicillin (Sigma), 10 mg/mL of sulphate streptomycin (Sigma), 25 µg/mL of
amphotericin (Sigma)) and 2.5 mM of [2-14C]-propionate (MP Biomedicals, Inc., Irvine, CA).
The incubation procedures to measure protein synthesis were similar to those described above for
gluconeogenesis except that the 63.8 mg/mL of Cys were replaced by 31.9 mg/L of cold Cys
158
(Sigma) and 31.9 mg/L of [35S]-cysteine (Amersham Biosciences Corp., Baie d’Urfé, QC,
Canada). For each biopsy, liver tissue was divided between two BD FalconTM cell culture dishes
for each set of experimental condition. Water was added in the peripheral well to maintain
humidity during incubation and BD FalconTM cell culture dishes were capped and gassed for 3-4
min with 95% O2:5% CO2 and placed in incubator (Scientific Products Ultra-Tech NJ 701T, Cie
Baxter, Asheville, NC) at 37°C for 2 h. At the end of the incubation period, the labelled medium
was removed and the slices of liver were homogenized with a dounce homogenizer in 1 mL of
the following solution: Tris 25 mM (Sigma), NaCl 50 mM (Fisher, Ottawa, ON, Canada; pH 8.0)
and proteases inhibitors (5 mg/mL of leupeptin (Sigma), 1 mM of benzamidin (Sigma), 100
µg/µL of phenylMethylSulfonyl Fluorid (Sigma) and 1 mg/mL of pepstatin A (Sigma)).
For determination of the capacity of the liver tissue for gluconeogenesis, 600 µL of cold
0.4 M HClO4 (Fisher) were mixed to 600 µL of incubation medium or cell homogenate,
incubated for 20 min on ice and centrifuged at 3,000 × g for 20 min at 4°C. One millilitre of
supernatant was removed and deproteinized after incubation on ice for 20 min with 135 µL of
15% KOH. Tubes were centrifuged at 3,000 × g for 20 min at 4°C and again 1 mL of supernatant
was removed and the pH was adjusted between 7.0 to 7.4 with 6.0 N HCl (Fisher). The
radiolabelled glucose, synthesized from [2-14C]-propionate, was separated by placing a volume of
300 µL of supernatant on an anion exchange resin (AG 1-X8 100-200 mesh acetate form; BioRad, Hercules, CA). The resin was rinsed with 500 µL of ultrapure water and the eluate was
collected in a scintillation vial. This operation was repeated 7 times. Each vial was then filled
with 4 mL of scintillation cocktail (Ready Solv HP Beckman Coulter inc., Fullerton, CA), capped
and vortexed. Radioactivity was measured by liquid scintillation counting (Packard tri-carb 2900
TR, Packard Instrument Cie, Meriden, CT). The rate of gluconeogenesis, expressed as nmol of
precursor converted to glucose per gram of fresh liver per hour, was calculated as explained by
Williams et al. (2006).
Protein synthesis was measured as previously described by Gruffat-Mouty et al. (1999).
The rate of protein synthesis was calculated from the specific radioactivity of the precursor,
corrected according the time, and nmol of product formed per hour per g of fresh liver.
159
V-4.4 Statistical analyses
Two levels of Met (0 or 18 g of RPM) and 3 levels of B-vitamin (none, folic acid alone or
in combination with vitamin B12) supplements were used in a 2 x 3 factorial arrangement in a 10
randomized complete blocks design. All variables were analyzed using the MIXED procedure of
SAS (2004) according to a complete block design with treatments as main effects, repeated
measures in time and block as random effect. As the time intervals were different, the six
following covariance structures were compared: SP(POW), SP(GAU), SP(EXP), SP(LIN),
SP(LINL) and SP(SPH). For each variable, the statistical analysis retained was the one with the
smallest fit statistic values. Results are reported as least square means and standard errors of the
means. Means were assumed to be different at P ≤ 0.05 and tended to differ at 0.05 < P ≤ 0.10.
When the vitamin effect reached a level of significance of 90%, differences between means were
compared using an adjusted Tukey test. When the Met × vitamin interaction or a treatment × time
interaction reached a level of significant of 90%, the SLICE option in the LSMEANS statement
was used to help interpretation (SAS Institute, 2004).
V-5 RESULTS
V-5.1 B-vitamins
Hepatic concentrations of folates were increased (P = 0.001) by intramuscular injections
of folic acid alone or combined with vitamin B12; 6.7, 10.3 and 10.4 ± 0.28 μg/g of fresh tissue
for B9-B12-, B9+B12- and B9+B12+ cows, respectively (Tableau 7). RPM decreased folates
concentrations from 9.4 to 8.9 ± 0.25 µg/g of fresh tissue (P = 0.03; Tableau 7). The effect of Bvitamins and Met supplementation on liver folates also changed during lactation (Met × vitamin
× time interaction, P = 0.002; Figure 30). Hepatic concentrations of folates generally increased
from 2 wk after calving to reach a plateau at 8 wk of lactation, except for M-B9+B12+ cows, for
which a plateau was reached earlier, at 4 wk of lactation.
Hepatic concentrations of vitamin B12 were increased by vitamin B12 supplements; 0.94,
0.90 and 1.10 ± 0.02 μg/g of fresh tissue for B9-B12-, B9+B12- and B9+B12+ cows, respectively (P
= 0.001; Tableau 7). Nevertheless, Met supply modified the response to vitamin supplementation
(Met × vitamin interaction, P = 0.03; Tableau 7). For control cows (P = 0.02) and cows injected
160
with folic acid and vitamin B12 together (P = 0.002), liver concentrations of vitamin B12 were
higher in M- than M+ cows whereas there was no such effect in cows treated with B9+B12- (P =
0.63).
Biotin concentrations in liver tended to change according to vitamin supplementation (P =
0.07; Tableau 7). Hepatic concentrations of biotin tended to be higher (P = 0.08) for B9+B12(16.2 ± 0.15 µg/g fresh tissue) than for B9+B12+ (15.8 ± 0.15 µg/g fresh tissue) but did not differ
(P = 0.19) from B9-B12- (15.9 ± 0.15 µg/g fresh tissue).
V-5.2 Lipids
Hepatic concentrations of total lipids decreased as lactation progressed (time, P < 0.0001),
from 7.52, 5.76, 3.78 to 3.23 ± 0.31 g/100 g of fresh tissue at 2, 4, 8 and 16 wk of lactation,
respectively. Hepatic concentrations of CE, TG, DG, Ch and PE followed a similar pattern (time,
P < 0.0002), only PC concentrations in liver tended to increase during the experimental period
(time, P = 0.07, data not shown).
Dietary supplements of RPM increased liver concentrations of TG from 1.81 to 2.63 ±
0.32 g/100 g of fresh tissue (P = 0.02, Tableau 7). The response in liver concentrations of PE to
vitamin injections differed according to the level of Met supplementation (Met × vitamin, P =
0.009; Tableau 7). Indeed, B-vitamin injections, as folic acid alone or with vitamin B12, increased
(P = 0.007) concentrations of PE in liver of cows fed RPM but had no effect (P = 0.6) in Mcows. Liver concentrations of CE, DG (fractions 1 and 2), Ch, PC and total lipids were not
affected by treatments (P > 0.2; Tableau 7).
V-5.3 Gene expression of BHMT, GNMT, MS, MTHFR, MTP, MTRR, MMCoA
and PEMT
Vitamin supplements affected gene expressions of MTHFR (0.84, 0.92 and 1.03 ± 0.07, P
= 0.02) and MUT (1.02, 1.12 and 1.17 ± 0.08, P = 0.01; Tableau 7) for B9-B12-, B9+B12- and
B9+B12+ cows, respectively. The relative mRNA abundance of MTHFR gene was higher for
B9+B12+ than for B9-B12- (P = 0.006) and B9+B12- cows (P = 0.1) but the last two treatments
were not different (P = 0.3). Compared to control cows, supplementary folic acid combined with
161
vitamin B12 increased (P = 0.004) MUT relative mRNA abundance whereas supplementary folic
acid given alone only tended to increase it (P = 0.06).
In M- cows, expressions of MTHFR, MTP and PEMT transcripts were lower by 13 (P =
0.02), 8 (P = 0.05) and 6 (P = 0.10) % compared with cows fed the basal diet supplemented with
RPM (Tableau 7). The relative mRNA abundance of MS and MTRR genes was not affected by
treatments (P > 0.2; Tableau 7).
Ingestion of RPM modified the relative mRNA abundance of MTP, MTHFR and BHMT
genes according to the stage of lactation (Met × time interaction, P < 0.10 for MTP and MTHFR
and P = 0.03 for BHMT). Overall, the transcript abundance of these genes decreased throughout
the experimental period but was lower at 2 and 16 wk of lactation for M- cows. GNMT mRNA
levels tended to change with time according to vitamin supply (vitamin × time interaction, P =
0.06; Figure 31). There was no effect (P ≥ 0.5) of vitamin supplementation on the GNMT relative
mRNA abundance in liver at 2, 4 and 8 wk of lactation but it increased (P = 0.002) at 16 wk of
lactation in cows injected with vitamins, especially in B9+B12+ cows.
The relative mRNA abundance of PEMT gene decreased throughout the experimental
period (time, P < 0.0001), whereas MS gene transcripts increased moderately from 2 to 8 wk of
lactation but decreased thereafter (time, P = 0.0003). There was no variation of MTRR and MUT
transcript abundance throughout the experimental period (P > 0.11).
V-5.4 Gluconeogenesis and protein synthesis
The capacity of liver slices to convert [2-14C]-propionate in glucose was not modified by
treatments (P > 0.5; Tableau 8) but it decreased throughout the studied period (P = 0.03); 1,003.6
± 26.4, 947.4 ± 25.0, 925.7 ± 25.3 and 902.4 ± 25.5 nmol/(g wet weight × h) at 2, 4, 8 and 16 wk
of lactation, respectively.
The incorporation of [35S]-cysteine into total precipitate cellular and medium proteins
tended to be altered by vitamin supplementation differently according to time after calving
(vitamin × time interaction, P = 0.07; Tableau 8). Two wk after calving, protein synthesis was
higher in cows injected with folic acid and vitamin B12 (P = 0.05) but this difference disappeared
later in lactation (P ≥ 0.18). The rate of protein synthesis, in nmol/(g fresh tissue × h), was 51.6,
58.7, 51.7 and 66.5 ± 4.3 for B9-B12-, 55.1, 48.6, 44.5 and 57.4 ± 4.3 for B9+B12- and 65.7, 50.0,
48.5 and 59.8 ± 4.4 for B9+B12+, at 2, 4, 8 and 16 wk of lactation, respectively.
162
V-6 DISCUSSION
V-6.1 B-vitamin status
In the present experiment, as previously observed by Graulet et al. (2007), folic acid and
vitamin B12 supplements increased concentrations of these vitamins in liver of dairy cows.
Nevertheless, independent of vitamin supply and as previously observed in steers (Lambert et al.,
2002), hepatic concentrations of folates decreased with Met supplementation. Similarly, while
studying the effect of vitamin B12 severe deficiency in sheep, Smith et al. (1974) observed that in
pair-fed sheep not deficient in vitamin B12, supplementary Met decreased hepatic concentrations
of folates, especially the 5-methyl-tetrahydrofolate.
In the present experiment, in cows injected with folic acid and vitamin B12 together,
hepatic concentrations of vitamin B12 tended to be higher in M- than M+ cows whereas plasma
vitamin B12 followed the opposite pattern (Preynat et al., 2009a, Chapitre III). In cells, vitamin
B12 is bound to proteins, the two vitamin B12-dependent enzymes, MS and MUT (Combs, 1998).
These observations indicate an increased cellular retention of vitamin B12 in the liver when the
supply in preformed labile methyl groups was limited possibly linked to an increased need for
Hcy remethylation as MS activity is regulated by vitamin B12 (Oltean and Banerjee, 2003 and
2004).
Another B-vitamin, biotin, also acts as a coenzyme for two gluconeogenic enzymes:
pyruvate carboxylase and propionylCoA carboxylase (Combs, 1998). Greenfield et al. (2000)
observed that the activity of the pyruvate carboxylase enzyme increased in the liver of dairy cows
in early lactation. One can suspect that such change should increase the cow requirement for
biotin. However, if this is the case, it was not reflected in the current experiment, neither for
plasma (Preynat et al., 2009a, Chapitre III) nor hepatic concentrations of biotin, which did not
change from 2 to 16 wk of lactation. The injections of folic acid alone tended to increase liver
concentrations of biotin by 2% but the physiological significance of such change is not clear.
V-6.2 The methylation cycle
The role of the methylation cycle is to ensure a constant supply in SAM which is a methyl
donor in numerous metabolic reactions, such as formation of PC, creatine and DNA methylation
163
(Scott, 1999). In this cycle, the role of folate coenzymes is to provide one-carbon units for de
novo formation of methyl groups. Consequently, tetrahydrofolate (THF) can accept one-carbon
units and form 5,10-methylene-THF which, under the action of MTHFR, will be irreversibly
converted into 5-methyl-THF (Bailey and Gregory, 1999). MTHFR is allosterically inhibited by
the product of the methylation cycle, SAM (Jencks and Matthews, 1987; Yamada et al., 2005).
Consequently, conditions increasing methyl group supply should inhibit the enzyme activity.
However, in the current experiment, increasing the supply of preformed labile methyl groups,
such as Met, or folic acid and vitamin B12 supply, essential for methylneogenesis, increased the
mRNA abundance of MTHFR. There are few studies on nutritional factors affecting mRNA
levels of MTHFR. Only the study from Tchantchou et al. (2006) reported that both mRNA
concentration and enzymatic activity of MTHFR in brain cells were increased in response to
folate deprivation in mice. Accordingly, the current observations suggest the following
hypotheses that either gene expression and activity of this enzyme are negatively correlated in
cows or that, under our experimental conditions, intracellular concentrations of SAM were not
sufficient to inhibit MTHFR gene expression and, possibly activity, even in animals
supplemented with Met and/or vitamins.
The second reaction related to the methylation cycle involves the enzyme, MS. In this
reaction, the 5-methyl-THF resulting from the MTHFR reaction transfers its methyl group to
vitamin B12 coenzyme which acts as an intermediary transporter to transfer this group to Hcy,
thus forming Met. In the present experiment, neither vitamin supplements nor RPM affected gene
expression of MS. In dairy cows, Graulet et al. (2007) also did not observe changes in mRNA
abundance and activity of MS in response to dietary supplements of folic and vitamin B12, given
alone or in combination. This is in agreement with observations from Gulati et al. (1999) who
demonstrated that regulation of MS activity is not a function of changes in mRNA abundance or
conversion of the apoenzyme into holoenzyme. The regulation of MS rather occurs through an
improved translational efficiency modulated by vitamin B12 as also recently reported by Oltean
and Banerjee (2003 and 2004).
A functional deficiency in MS can also occur. Indeed, as described previously, MS
catalyzes the transfer of the methyl group from 5-methyl-THF to the vitamin B12 cofactor and
then, to Hcy for regeneration of Met and THF. The vitamin B12 cofactor is under the form of
cob(I)alamin but, after successive cyclings, it may be oxidized in cob(II)alamin causing the
164
inactivation of MS. Regeneration of the enzyme activity requires a reductive methylation which
is catalyzed by MTRR and is using SAM as a methyl group donor (Olteanu and Banerjee, 2001).
In the present study, the observed stable expression of MTRR possibly indicates that oxidation of
cob(I)alamin did not differ among treatments and time after calving and suggests that availability
of this enzyme was not limiting the functionality of MS during the experimental period.
Remethylation of Hcy can also occur through BHMT, a methyltransferase which
catalyzes the transfer of a methyl group from betaine, a product of choline oxidation, to Hcy for
Met regeneration. An in vitro study suggests that, in rat liver, MS and BHMT contributed equally
to the remethylation of Hcy (Finkelstein and Martin, 1984). In rat liver, the response of BHMT
activity to Met restriction and dietary supply of other methyl donors is due to changes in gene
expression of the enzyme (Park and Garrow, 1999). Nevertheless, in ruminants, regulation of
BHMT activity differs markedly from non-ruminants. In dairy ruminants, availability of choline
from dietary supply is low due to its extensive degradation in rumen (Sharma et Erdman, 1989)
while the output of methylated compounds to milk is particularly high. Xue and Snoswell (1986)
demonstrated that the activity of BHMT is more than 5 times lower in liver of sheep than rats.
Moreover, the activity of this enzyme is not increased during lactation in ewes in spite of the
increased demand for methyl groups (Xue and Snoswell, 1985). Similarly, there was no recovery
of labelled-choline in the Met pool in lactating goats, indicating that in ruminants, the role of
BHMT would be negligible for Hcy remethylation (Emmanuel and Kennelly, 1984). In growing
steers, BHMT activity changed quadratically with an increased Met supply, the higher activity
being observed with the lowest and the highest Met supply (Lambert et al., 2002). In the present
experiment, gene expression of BHMT was not influenced markedly by treatments although it
was higher in cows fed RPM, at 2 and 16 wk after calving. Even assuming that changes in gene
expression of the enzyme is directly related to its activity in cows, given that plasma
concentrations of Hcy were not affected by RPM (Preynat et al., 2009a, Chapitre III) and the
limited role of BHMT in the transmethylation pathway in ruminants, the physiological
significance of these changes is difficult to estimate.
In non-ruminants, the major reactions of methylations are synthesis of PC through PEMT,
creatine through guanidinoacetate N-methyltransferase and sarcosine through GNMT (Mudd et
al., 2007). Utilization of methyl groups by the former two methyltransferases is limited by the
physiological need for their product but it is not the case for GNMT which acts as a “safety
165
valve” to avoid methyl group excess (Luka et al. 2007). In the present experiment, in order to
study the impact of increasing provision of preformed labile methyl groups or promoting
methylneogenesis by folic acid and vitamin B12 supply, gene expression of PEMT and GNMT
were studied.
Through 3 successive methylations, PEMT allows PE to form PC (Vance et al., 2007). PC
is essential for the structural integrity of cell membranes, is secreted into bile and is a constituent
of plasma lipoproteins (Jacobs et al., 2005), this last function being important in lactating
ruminants, due to the increased demand for milk fat synthesis (Emmanuel and Kennelly, 1984).
In the present study, the level of PEMT mRNA tended to increase with Met supplements. Jacobs
et al. (2005) reported that Met supply affects PEMT gene expression and activity. In addition, it
appears that an increased gene expression of PEMT is associated with an increase in protein
abundance and enzyme activity (Resseguie et al., 2007). However, in the current study, even if
the trends of RPM to increase gene expression of PEMT could have been associated with changes
in the enzyme activity, hepatic concentrations of PC were not affected by supplementary Met.
Nevertheless, we cannot rule out that this lack of effect was due to an increased exportation of PC
from the liver. B-vitamin supplements had no effect on gene expression of PEMT or hepatic
concentrations of PC. However, vitamin supplements increased hepatic concentrations of PE in
cows fed RPM while they had no effect in M- cows. It could then be hypothesized that the
increased concentrations of PE in liver of M+ cows injected with folic acid, with or without
vitamin B12, were due to an increased rate of formation of PE rather than a decrease in
methylation of PC. In rats, choline deficiency delayed PE synthesis (Lyman et al., 1973). Such
result could be explained by the fact that PE in cells can be formed from phosphatidylserine
which is synthesized by base-exchange reaction from either PC or PE. The enzyme using PC as
substrate is more widely expressed in murine tissues than the one using PE (Vance and Vance,
2004). In ruminants, the turnover rate of the choline moiety of PC is generally low as an
adaptation mechanism to poor methyl supply (Snoswell and Xue, 1987). However, it can be
hypothesized that, under conditions increasing methyl group supply, such as Met, folic acid and
vitamin B12 supplementations, the increase in PE concentrations could be due to an increased
turnover rate of PC, which promotes formation of phosphatidylserine and then, of PE.
The role of GNMT is to maintain a constant SAM:S-adenosylhomocysteine (SAH) ratio.
When methyl group supply is low, GNMT is inhibited to conserve methyl groups for
166
metabolically important methylation reactions (Finkelstein, 1990). Sarcosine has no known
metabolic function but it can be rapidly metabolized to provide an one-carbon unit to form 5,10methylene-THF (Brosnan and Brosnan, 2006). Indeed, in liver, Met availability, both from the
diet and the folate dependent one-carbon pool, modulates GNMT activity directly via SAM
(Rowling et al., 2002) and indirectly, through 5-methyl-THF (Balaghi et al., 1993; Luka et al.,
2007). In ewes, lactation increases PEMT activity while decreasing GNMT activity (Xue and
Snoswell, 1985) although the later probably has less physiological importance in ruminants due
to the low dietary supply in methyl groups. Indeed, GNMT activity in sheep liver is less than
0.5% of its activity in rat liver (Xue and Snoswell, 1986). Nieman et al. (2006) showed that
mRNA and protein abundance of GNMT were related with its enzymatic activity. Therefore, the
increase of GNMT mRNA abundance observed in cows receiving folic acid with or without
vitamin B12 at the end of the studied period could be due to an increased SAM:SAH ratio.
Nevertheless, in the present experiment, in spite of some effects of RPM supplements on
gene expression of enzymes involved in the methylation cycle, such as MTHFR, BHMT and
PEMT, increasing Met supply had no effect on plasma concentrations of Hcy or lactational
performance as reported by Preynat et al. (2009a, Chapitre III). However, the decrease in plasma
concentrations of Hcy induced by injections of folic acid alone or combined with vitamin B12,
irrespective of the level of Met added to the diet (Preynat et al., 2009a, Chapitre III) indicated
that folic acid supply altered the efficiency of the methylation cycle. As supplementary vitamin
B12 had no additional effect on plasma Hcy, supply of this vitamin in the current study was likely
sufficient not to negatively interfere with this metabolic pathway. Nevertheless, in cows used in
the present experiment, RPM and folic acid supplements alone had no effect on milk and milk
component yields (Preynat et al., 2009a, Chapitre III). Consequently, it seems that the effects of
Met supply and supplementary folic acid on the methylation cycle did not have a significant
effect on lactational performance of dairy cows.
V-6.3 Gluconeogenesis, energy and protein metabolism
A previous study showed that in early lactation, supplementary folic acid, given alone or
in combination with vitamin B12, increased milk and milk protein yields without any effect on
DMI (Graulet et al., 2007). However, surprisingly, cows fed supplementary folic acid alone had
higher hepatic concentrations of lipids than those fed folic acid and vitamin B12 together. The
167
authors hypothesized that this effect could be related to the other vitamin B12-dependent enzyme,
MUT. This enzyme isomerizes methylmalonyl-CoA (MMCoA) in succinyl-CoA and is essential
for the entry of propionate in the Krebs cycle and its utilization for gluconeogenesis (Le Grusse
and Watier, 1993). Moreover, MMCoA acts as an interface in the regulation of gluconeogenesis
and β-oxidation (Zammit, 1990). However, when vitamin B12 supply is not sufficient,
isomerisation of MMCoA is reduced leading to its accumulation and inhibition of β-oxidation of
fatty acids, even if gluconeogenesis is reduced. Indeed, in early lactation, the increased energy
requirements for maintenance and lactation, simultaneously to underfeeding, contribute to an
intensive body fat mobilization, which increased hepatic concentrations of total lipids and TG
(Bobe et al., 2004). In contrast to Graulet et al. (2007), in the present experiment, supplementary
folic acid had no effect on hepatic concentrations of TG or total lipids as well as no effect on milk
and milk component yields (Preynat et al., 2009a, Chapitre III).
Another contributing factor to the accumulation of TG in dairy cow liver is the slow rate
of TG export as very low density lipoprotein (VLDL). The limited VLDL secretion by bovine
liver could be due to a limiting step in VLDL assembly (Graulet et al., 1998) or, as hypothesized
by Bauchart (1993), by a lack of availability of VLDL constituents. Met could be a limiting
nutrient for hepatic metabolism of fatty acids during the periparturient period as a limiting AA for
apolipoprotein synthesis or as a methyl donor for PC synthesis, an essential component of VLDL
particles (Grummer, 1993; Noga et al., 2002; Shibano and Kawamura, 2005). As stated by
Bernabucci et al. (2004), synthesis of VLDL requires TG, PL, Ch, CE, apolipoprotein (B100, C
and E) and an enzyme, MTP which plays a fundamental role in coordinating the assembly of
VLDL. Although, in the present experiment, supplementary Met increased gene expression of
MTP and hepatic TG, these changes should be interpreted with caution because in periparturient
cows developing fatty liver, the increase of MTP mRNA was not correlated with liver TG,
plasma NEFA or VLDL particles and MTP protein and activity (Bremmer et al., 2000;
Bernabucci et al., 2004).
In the present study, supplementary Met also increased hepatic concentrations of TG.
However, the extent of this increase was somewhat limited as hepatic concentrations of 6.2 and
3.8 g of TG per 100 g of fresh tissue were measured in M+ cows, at 2 and 4 wk of lactation
respectively, which correspond to a mild fatty liver (Bobe et al., 2004). Moreover, from 8 wk
after calving, liver TG concentrations decreased below 1 g of TG per 100 g of fresh tissue, (0.6
168
and 0.3 g of TG per 100 g of fresh tissue at 8 and 16 wk of lactation, respectively in cows fed
RPM), considered the limit for normal liver (Bobe et al., 2004). The slightly higher accumulation
of fatty acids in liver of M+ cows is in accordance with a small loss of BW in early lactation and
the decrease in plasma glucose (Preynat et al., 2009a, Chapitre III).
The in vitro capacity of liver tissue for conversion of [2-14C]-propionate to glucose was
greater, 2 wk after calving and was not affected by Met supply. Therefore, it seems that the level
of TG infiltration in liver observed in early lactation in cows fed RPM and in spite of effects on
plasma glucose (Preynat et al., 2009a, Chapitre III), was not sufficient to impair significantly
gluconeogenic capacity of hepatic cells as previously reported (Cadorniga-Valino et al., 1997;
Piepenbrink et al., 2004).
In the present experiment, gene expression of MUT was increased by B-vitamin
supplements as compared to unsupplemented cows and this increase was greater in cows injected
with the two vitamins together although no effect of vitamin injections on in vitro capacity of
liver tissue for gluconeogenesis was detected. However, at 12 wk of lactation, whole body flux of
glucose tended to be higher in cows injected with folic acid and vitamin B12 together as compared
to the control cows, this increase being of a similar quantitative magnitude as the observed
increment in milk lactose yield (Preynat et al., 2009b, Chapitre IV). Although folic acid is not
known to participate in the MUT pathway, Graulet et al. (2007) observed no effect of
supplementary folic acid and/or vitamin B12 on gene expression of MUT or its activity but the
requirement of the enzyme for the cofactor, vitamin B12, decreased in cow liver when the two
vitamins were given together, improving the efficiency of this metabolic reaction. Selhub et al.
(2007) also observed in humans that when the supply in vitamin B12 is considered adequate,
plasma concentrations of methylmalonic acid are inversely proportional to folate supply. In cell
culture, inactivation of MS reduces MUT holoactivity by decreasing cellular concentrations of
adenosylcobalamin, the vitamin B12 cofactor for MUT (Riedel et al., 1999). These observations
indicate that the effect of folic acid supply on MUT was possibly linked to a coordination of the
distribution of cobalamin cofactor between cytosol (MS) and mitochondria (MUT). Although in
the present experiment, the effects of vitamin B12 given alone were not studied, the observed
effects of supplementary folic acid and vitamin B12 given together on mRNA abundance of MUT
as well as on whole body flux of glucose at 12 wk of lactation (Preynat et al., 2009b, Chapitre
169
IV) indicate that administration of the two vitamins together could improve gluconeogenesis
efficiency.
In vitro protein synthesis was higher in liver tissue of cows injected with the two vitamins
together at 2 wk of lactation although this effect was not apparent later in lactation. This is in
agreement with observations from Preynat et al. (2009a, Chapitre III) who reported an increased
milk protein yield with the combined injections of the two vitamins, especially during the first
wks following calving.
V-7 CONCLUSION
In the current study, gene expressions of hepatic enzymes closely involved in the
methylation cycle were modified by Met supply. Cellular utilization of folates and vitamin B12 in
liver was also modified when the supply in labile preformed methyl groups was limited.
Simultaneous administration of folic acid and vitamin B12 also affect MUT, a gene linked to
gluconeogenesis.
On the cows studied in the present experiment, Preynat et al. (2009a, Chapitre III)
observed that the cellular effects of supplementary folic acid translated by a decrease in plasma
concentrations of Hcy although there was no effect of RPM or folic acid, when given alone on
lactational performance. These observations combined with those of the present experiment
indicate that an increase in methyl group supply, preformed or from methylneogenesis, affect the
efficiency of the methylation cycle but had by themselves a limited impact on milk component
yields. Therefore, the increased milk production and milk component yields reported in cows
supplemented with folic acid and vitamin B12 together (Preynat et al., 2009a, Chapitre III) seem
to be rather related to the effect of the vitamins on the increased gene expression of MUT. This
observation is further supported by the increased whole body fluxes of glucose observed in cows
supplemented with folic acid and vitamin B12 together as compared to unsupplemented cows
(Preynat et al., 2009b, Chapitre IV). Therefore, it seems that the effects of the combined
supplement of vitamins on lactational performance were due to an improved efficiency of glucose
metabolism rather than an effect on methylneogenesis.
170
V-8 ACKNOWLEDGMENTS
The authors thank Dominique Bauchart (Institut National de la Recherche Agronomique,
Theix, France) who welcomed A. Preynat in his laboratory and provided expertise for hepatic
lipid analysis. We are also grateful to Eric Martineau, DMV, who performed liver biopsies;
Guylaine Fortin, Michel Poitras and Jean Vallières for animal care, Chrystiane Plante, Véronique
Roy, Linda Marier and Danielle Beaudry for technical assistance, and to Steve Méthot for
statistical advices. Thanks are also extended to the financial support of the Action Concertée
Fonds NOVALAIT inc.– FQRNT - MAPAQ – Agriculture et Agroalimentaire Canada.
171
Tableau 12. Primer sequences and optimal conditions for PCR of bovine selected genes
Primer
Primer sequences (5'-3' )3
name 1
Cloning2
BHMT-F
CAGTTCGYCAGCTTCATCGRGAG
BHMT-R
GGCAGTTCACRCCRAYRATGGAKG
MTHFR-F TGGARACCATCCTGCAYATGA
MTHFR-R CGCGGTTGAGGGTRTAGAAG
MTRR-F
GTKCCAATTTCAAARGCMRTT
MTRR-R
TTTAGGAAGRTGYTCSAGCAG
Race
BHMT-5'
ATGCTTTCAAGGCTTCAACTGCC
BHMT-3'
CATGCAGACCTTCACCTTCTATG
MS-5'
TTCCTGTCTGGAGAGAGATGTCC
MS-3'
CGGCACAAGCTGAGTGAAGAAGA
MTHFR-5' TTGCGGATGGCAGCATCATTGT
MTHFR-3' CTGGAGGTGCCACAGCAGATCA
MTRR-5'
CTGCTGCACAGCTCCTGCAGCC
MTRR-3'
GTGACGATTAAGGCAGACACGAG
Real-Time PCR2
ACTB-F
GCGTGGCTACAGCTTCACC
ACTB-R
TTGATGTCACGGACGATTTC
BHMT-F
TGTCAAGAAGGGCATCCTAGAAC
BHMT-R
AAAGACAAACCCTCCGTCTCC
CYCLO-F GAGCACTGGAGAGAAAGGATTTG
CYCLO-R GGCACATAAATCCCGGAATTATT
GAPDH-F TGACCCCTTCATTGACCTTCA
GAPDH-R AACTTGCCGTGGGTGGAAT
GNMT-F
GTGACAAGATGCTGAAGTATGCTCTC
GNMT-R
CCACTTGTCAAAGGCAGGGT
GUSB-F
ATCGGCAGCGCCCACTACT
GUSB-R
CCCTCGTGCTCTAACACATGGAC
MUT-F
CGAATTGCCAGGAACACACA
MUT-R
CCCAAGGATCAGCCACTTTG
MS-F
CAAATCCATAAGGAGTACCTCCTAGC
MS-R
GGGCAATAGAAGTGCTGCTGA
MTHFR-F CATCATCACCCAGCTATTCTTTGA
MTHFR-R GGTAATGCCTATCTCGGAGCAA
MTP-F
GGTCCGTCAAGTTCTGAAGGAA
MTP-R
GAGGAGGACCCACTCTTGGAG
MTRR-F
TCTTCTGATAGAGTTGGACATCTCGA
MTRR-R
TGTTGGGACAGATCACGTTGA
PEMT-F
GCTGTCCTTGCCATTGTCTTC
PEMT-R
TCGGGTCTTGTGTTCCCATC
1
Primer
position (nt)
GenBank
accession no.
Length
(bp)
Annealing
T (ºC)
218-240
706-683
553-573
1164-1145
831-851
1346-1326
AY854632
489
50
AY854631
612
50
DQ084520
516
50
AY854632
583
1602
433
3685
1075
1593
1225
1121
583-561
264-286
433-411
148-170 nt
1075-1054
1008-1029
1225-1204
1032-1054
624-642
677-658
78-100
147-127
124-146
194-172
66-86
131-113
263-288
333-314
414-432
478-456
1392-1411
1461-1442
259-284
334-313
860-883
935-914
1757-1778
1825-1805
884-909
963-943
513-533
581-562
DQ084519
AY854631
DQ084520
AY141970
54
60
AY854632
70
58
AF228021
71
60
BTU85042
66
60
XM_618409
71
59
NM_001083436
65
60
NM_173939
70
59
DQ084519
76
59
AY854631
76
59
BRTMTP1
69
59
DQ084520
80
59
NM_182989
69
58
ACTB, actin beta; BHMT, betaine homocysteine methyltransferase; CYCLO, cyclophiline;
GAPDH, glyceraldehyde-3-phosphate deshydrogenase; GNMT, glycine N-methyltransferase;
GUSB, beta-glucuronidase; MUT, methylmalonyl-CoA mutase; MS, methionine synthase;
MTHFR, 5,10-methylene-tetrahydrofolate reductase; MTP, microsomal transfer protein; MTRR,
methionine synthase reductase and PEMT, phosphatidylethanolamine methyltransferase
172
2
3
F = forward primer; R = reverse primer
Degerated primers where M= A or C, R= A or G, Y= C or T, K= T or G, S= C or G
173
Tableau 13. Effects of dietary supplements of rumen-protected methionine (M) and intramuscular injections of folic acid (B9) and vitamin
B12 (B12) given to dairy cows from 3 wk before calving to 16 wk of lactation on liver concentrations of B vitamins, lipid fractions and
relative mRNA abundance of selected genes
Treatments1
M+
n
P values
M-
B9-B12-
B9+B12-
B9+B12+
B9-B12-
B9+B12-
B9+B12+
10
10
10
10
10
10
SEM2
met
vit
met*vit
Vitamins, μg/g fresh tissue
Folates3
6.4
10.2
10.0
7.0
10.5
10.8
0.4
0.03
0.001
0.63
Vitamin B12
0.91
0.91
1.05
0.98
0.89
1.15
0.03
0.004
0.001
0.03
Biotin
15.8
16.1
16.0
15.9
16.4
15.5
0.21
0.99
0.07
0.27
Lipids, g/100 g fresh tissue4
CE5
0.112
5
TG
3.08
5
DG1
0.080
5
DG2
0.481
Ch5
0.179
PE5
0.518
5
PC
1.88
5
Total lipids
5.34
0.113
1.96
0.077
0.434
0.190
0.578
1.79
4.86
0.125
2.86
0.090
0.480
0.194
0.620
1.76
4.64
0.111
1.53
0.080
0.470
0.192
0.526
1.80
5.22
0.096
1.88
0.073
0.467
0.173
0.517
1.83
4.36
0.112
2.02
0.090
0.477
0.181
0.487
1.75
6.02
0.012
0.49
0.010
0.028
0.009
0.0261
0.08
0.52
0.21
0.02
0.86
0.77
0.42
0.001
0.83
0.54
0.27
0.46
0.18
0.51
0.79
0.33
0.61
0.29
0.61
0.24
0.95
0.68
0.11
0.009
0.74
0.16
Relative mRNA abundance6
BHMT7
0.98
8
GNMT
0.48
MS5
0.84
0.97
0.75
0.89
1.07
0.73
0.96
0.86
0.55
0.81
0.97
0.70
0.92
0.94
0.70
0.78
0.09
0.15
0.07
0.17
0.99
0.26
0.52
0.19
0.45
0.61
0.87
0.23
174
MTHFR7
MTP7
MTRR
MUT
PEMT5
1
0.95
1.2
0.96
1.1
1.15
0.96
1.16
1.02
1.12
1.19
1.08
1.24
1.03
1.16
1.17
0.73
1.03
0.9
0.93
1.05
0.88
1.16
0.94
1.12
1.14
0.98
1.12
0.98
1.18
1.12
0.08
0.11
0.10
0.09
0.07
0.02
0.05
0.19
0.20
0.10
0.02
0.60
0.44
0.01
0.48
0.47
0.35
0.98
0.16
0.83
M-: basal diet; M+: basal diet with rumen-protected Met; B9-B12-: no vitamin supplement; B9+B12-: 160 mg folic acid/wk; B9+B12+: 160
mg mg folic acid/wk + 10 mg cyanocobalamin/wk.
2
3
Methionine x vitamin x time, P = 0.002.
4
CE: cholesterol ester, TG: triglycerides, DG: diglycerides, fractions 1 and 2, Ch: cholesterol, PE: phosphatidylethanolamine, PC:
phosphatidylcholine.
5
Time effect (2, 4, 8 and 16 wk of lactation), P ≤ 0.07.
6
Relative mRNA abundance of selected genes normalized with GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate deshydrogenase) as housekeeping
gene. BHMT, betaïne homocysteine methyltransferase; GNMT, glycine N-methyltransferase; MUT, methylmalonyl-CoA mutase; MS,
methionine synthase; MTHFR, 5,10-methylene-tetrahydrofolate reductase; MTP, microsomal transfer protein; MTRR, methionine synthase
reductase and PEMT, phosphatidylethanolamine methyltransferase.
7
Methionine x time, P ≤ 0.10.
8
Vitamin x time, P ≤ 0.06.
175
Tableau 14. In vitro estimation of the capacity of cow liver for gluconeogenesis by the conversion of [2-14C]-propionate to glucose and
protein synthesis by incorporation of [35S]-cysteine according to Met (M), folic acid (B9) and vitamin B12 (B12) supplements given from 3 wk
before calving to 16 wk of lactation
Treatments1
P values
M+
M-
B9-B12-
B9+B12-
B9+B12+
B9-B12-
B9+B12-
B9+B12+
10
10
10
9
9
10
946.7
938.4
933.2
916.2
991.8
942.3
± 34.5
Protein synthesis3,
nmol/(g wet weight × h)
± 33.9
± 35.4
± 36.1
± 35.8
± 34.9
58.0
53.9
54.1
56.2
48.9
57.9
± 3.4
± 3.4
± 3.4
± 3.5
± 3.5
± 3.4
n
met
vit
met×vit
0.71
0.59
0.49
0.71
0.17
0.38
Gluconeogenesis2,
nmol/(g wet weight × h)
1
M-: basal diet; M+: basal diet with rumen-protected Met; B9-B12-: no vitamin supplement; B9+B12-: 160 mg folic acid/wk; B9+B12+: 160
2
Time effect (2, 4, 8 and 16 wk of lactation), P = 0.03.
3
Vitamin x time, P = 0.07.
176
Figure 29. Folate and vitamin B12-dependent pathways and methylation cycle.
Ket enzymes :
1- Methionine adenosyltransferase
2- Phosphatidylcholine methyltransferase
3- Glycine N-methyltransferase
4- S-Adenosylhomocysteine hydrolase
5- Methionine synthase
6- Methionine synthase reductase
7- 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase
8- Betaïne methyltransferase
9- Cystathionine beta-synthase
10- Cystathionine beta-lyase
11- Methylmalonyl-CoA mutase
177
protéines
ATP
1
méthionine
SAM
Sarcosine
5-MTHF MS-B12(III)-CH3
7
5,10-CH2THF
THF
Sérine
Diméthyll i
6
MS-B12(II) 5
Glycine
3
PS
Sarcosine
PE
8
2
MS-B12(I)
bétaïne
homocysté
éine
PC
4
SAH
DAG
CDP-choline
9
Cystathionine
10 α-ketobutyrate
Cystéine
PC
Propionyl-CoA
11
Choline
Méthylmalonyl-CoA
Succinyl-CoA
Cycle de Krebs
CTP
178
Figure 30. Effects of dietary supplements of rumen-protected methionine (M) and
intramuscular injections of folic acid (B9) and vitamin B12 (B12) given to dairy cows from 3
wk before calving to 16 wk of lactation on liver concentrations of folates. The solid lines
represent cows fed 18 g of RPM (M+) and the dotted lines represent cows without Met
supplements (M-). B9-B12- (▲) = no vitamin supplement; B9+B12- (●) = 160 mg of folic
acid/wk; B9+B12+ (□) = 160 mg of folic acid/wk + 10 mg of vitamin B12/wk (SE = 0.55; Met
× vitamin × time, P = 0.002)
13
Liver folates (µg/g fresh tissue)
12
11
10
9
8
7
6
5
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
179
GNMT relative mRNA abundance
Figure 31. Effects of dietary supplements of rumen-protected methionine (M) and
intramuscular injections of folic acid (B9) and vitamin B12 (B12) given to dairy cows from 3
wk before calving to 16 wk of lactation on GNMT relative mRNA abundance. Gene
expression ratio normalized with GAPDH. B9-B12- (▲) = no vitamin supplement; B9+B12(●) = 160 mg of folic acid/wk; B9+B12+ (□) = 160 mg of folic acid/wk + 10 mg of vitamin
B12/wk (SEM = 0.14; vitamin × time, P = 0.06)
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
180
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184
CHAPITRE VI
DISCUSSION ET CONCLUSION GÉNÉRALE
185
VI-1 DISCUSSION
L’objectif de ce travail était de déterminer si les effets d’une supplémentation en
acide folique sur les performances pendant la période critique entourant le vêlage et le
premier tiers de la lactation étaient dus à une amélioration de la méthylnéogénèse et si
l’apport en vitamine B12 pourrait affecter cette voie métabolique. Dans cette éventualité, la
supplémentation en méthionine, une importante source de groupements méthyles préformés,
devrait réduire les besoins en ces vitamines.
Cette étude a montré que, parallèlement à une amélioration des statuts en folates et
vitamine B12 dans le lait, le plasma et le foie, la supplémentation conjointe en ces vitamines B
augmentait la production laitière et ceci de façon plus marquée pendant les 4 semaines
suivant le vêlage. Cette amélioration des performances de lactation pourrait résulter soit d’un
apport en groupements méthyles plus important car ces groupements sont souvent limitants
chez la vache laitière (Girard et Matte, 2005) soit d’une amélioration de l’efficacité des voies
métaboliques de l’énergie et de la protéine, comme proposé par Graulet et al. (2007).
Les concentrations d’homocystéine plasmatique diminuaient en réponse aux
injections d’acide folique seules ou combinées avec la vitamine B12. Il est probable que cette
diminution résulterait d’une amélioration de l’activité de la méthionine synthase, comme
observé chez l’homme (Mangum et al., 1969 ; Stam et al., 2005). Malheureusement, seule
l’expression génique de la méthionine synthase a été mesurée dans ce travail et les niveaux
d’ARNm de cette enzyme n’ont pas été affectés par nos traitements. En parallèle,
l’estimation de l’importance de cette voie de reméthylation, grâce à l’infusion de la
méthionine doublement marquée, reste imprécise du fait des limites imposées par notre
méthode. Toutefois, il est important de noter que le statut en vitamine B12 semble suffisant
pour ne pas interférer négativement dans cette voie métabolique car aucun effet additionnel
de cette vitamine sur l’homocystéine plasmatique n’a été observé. Le catabolisme de
l’homocystéine à travers la voie de transsulfuration pourrait aussi expliquer la réduction des
concentrations de cet acide aminé dans le plasma. Par contre, à 12 semaines de lactation, nos
résultats ont montré que cette voie était diminuée chez les vaches recevant les suppléments
combinés de méthionine, d’acide folique et de vitamine B12. Même si des effets des
suppléments de méthionine ont été rapportés sur les taux d’ARNm de plusieurs enzymes du
cycle de méthylation (MTHFR, BHMT et PEMT), l’ajout de méthionine protégée de la
dégradation ruminale à la ration n’a eu aucun effet sur les concentrations plasmatiques en
homocystéine ou sur les performances de lactation. De la même façon, les apports en acide
186
folique seul n’ont eu aucun effet sur les rendements en lait et ses composantes. Ces
observations indiqueraient que les effets d’un apport en groupements méthyles, préformés ou
provenant de la méthylnéogénèse, sur le cycle de méthylation aurait un impact limité sur le
rendement en lait et ses composantes. Il est donc peu probable que les effets positifs d’une
supplémentation en acide folique et vitamine B12 sur les performances de lactation des
vaches laitières aient été causés par une augmentation de l’apport en groupements méthyles
via la méthylnéogénèse. Des études complémentaires à ce travail consisteraient à mesurer
l’activité et les niveaux en ARNm et protéine des enzymes clés du cycle de méthylation.
L’augmentation des pertes irréversibles de glucose, observée chez les vaches recevant
les injections d’acide folique et de vitamine B12 ensemble, était d’une amplitude
quantitativement similaire à celle du rendement en lactose dans le lait. Le volume de lait
sécrété et les flux corporels de glucose étant généralement considérés comme étroitement liés
(Danfaer et al., 1995), ces observations suggèrent fortement que la production laitière,
augmentée par les suppléments combinés d’acide folique et de vitamine B12, sans effets sur la
prise alimentaire ou les concentrations plasmatiques des acides gras libres et du βhydroxybutyrate, reflète une efficacité accrue du métabolisme du glucose. En effet, il est
possible que la production de glucose ait été augmentée grâce à une meilleure utilisation des
précurseurs néoglucogéniques à travers la voie de la méthylmalonylCoA mutase. Cette
hypothèse est supportée par l’augmentation de l’expression du gène de la méthylmalonylCoA
mutase en réponse aux suppléments combinés en acide folique et vitamine B12. Cette enzyme
est une étape limitante dans l’entrée du propionate dans le cycle de Krebs et son utilisation
pour la néoglucogenèse car elle est dépendante de son coenzyme, la vitamine B12 (Bergman,
1990). L’étude des flux corporels de méthionine montrent que le supplément combiné
d’acide folique et de vitamine B12 améliorerait l’utilisation de la méthionine pour la synthèse
protéique soit en augmentant le turnover protéique chez les vaches ne recevant pas de
suppléments alimentaires en méthionine, soit en diminuant l’oxydation de la méthionine chez
les vaches nourries avec le régime supplémenté en méthionine.
Au vu de ces résultats, l’effet d’un apport combiné en acide folique et en vitamine B12
sur les performances de lactation de vaches laitières hautes productrices résulterait plutôt
d’une amélioration de l’efficacité du métabolisme du glucose suite à une augmentation de
leur capacité de néoglucogenèse plutôt qu’un effet sur la méthylnéogénèse. Des études
futures viseraient à préciser la nature de ces mécanismes et de leur régulation.
187
VI-2 CONCLUSION GÉNÉRALE
Les résultats obtenus ont permis de montrer que :
-
les apports en acide folique et vitamine B12 seraient insuffisants chez la vache laitière
haute productrice en début de lactation car une supplémentation en ces deux
vitamines améliore non seulement les performances de lactation mais aussi leurs
statuts et l’efficacité des voies métabolismes du glucose et de la méthionine.
-
L'expression de plusieurs gènes liés au cycle des méthylations serait affecté par les
apports en groupements méthyles, préformés (méthionine) ou provenant de la
méthylnéogénèse (acide folique).
-
L’acide folique et la vitamine B12 agiraient conjointement sur les métabolismes du
glucose et des protéines par une amélioration de l’efficacité de la voie de la
méthylmalonylCoA mutase et une redirection préférentielle de la méthionine vers la
synthèse protéique, respectivement.
-
L’augmentation de la production laitière et des rendements des composantes du lait,
rapportée chez les vaches recevant les injections intramusculaires d’acide folique et
de vitamine B12, serait probablement reliée aux effets de ces vitamines sur le
métabolisme du glucose plutôt qu’aux effets sur la méthylnéogénèse.
VI-3 RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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interactions acide folique-vitamine b12-méthionine

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