Virus de l`hépatite B : quels outils virologiques pour le clinicien
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Virus de l`hépatite B : quels outils virologiques pour le clinicien
Dossier thématique D ossier thématique Virus de l’hépatite B : quels outils virologiques pour le clinicien ? Hepatitis B virus: which virologic tools are useful for clinical practice? IP S. Chevaliez, J.M. Pawlotsky* Points forts Les marqueurs virologiques utiles pour le diagnostic et la prise en charge des infections par le VHB sont : l’antigène HBs, les anticorps anti-HBc totaux et les IgM anti-HBc, les anticorps anti-HBs, l’antigène HBe et les anticorps anti-HBe, la détection et la quantification de l’ADN du VHB. Les techniques de PCR en temps réel remplaceront progressivement les techniques classiques de quantification de l’ADN du VHB, apportant une plus grande sensibilité et un plus large éventail de valeurs quantifiables. Le diagnostic de l’hépatite B aiguë repose exclusivement sur les tests sérologiques. La quantification de l’ADN du VHB est un des éléments clés de la décision thérapeutique, mais pas le seul paramètre considéré, au cours des hépatites chroniques B. La surveillance de l’efficacité du traitement des hépatites chroniques B par les molécules antivirales repose sur la quantification régulière de l’ADN du VHB. La recherche de mutations de résistance par technique moléculaire pourrait devenir utile lorsque de plus nombreuses molécules seront utilisées et lorsque des algorithmes décisionnels consensuels auront été établis. Mots-clés : Virus de l’hépatite B – Diagnostic – Sérologie – PCR – ADN-VHB. Keywords: Hepatitis B virus – Diagnosis – Serologic markers – PCR – HBV-DNA. L e diagnostic et le suivi des hépatites virales B se fondent sur deux types de tests virologiques : des tests permettant la mise en évidence du virus ou de l’un de ses composants, antigène ou génome viral (diagnostic direct), et d’autres permettant la mise en évidence des anticorps sériques témoignant d’un contact du malade avec le virus (diagnostic indirect). Les tests virologiques jouent un rôle clé dans le diagnostic de l’infection par le virus de l’hépatite B (VHB), la décision de mise en place d’un traitement * Centre national de référence des hépatites virales B, C et delta, Laboratoire de virologie et Inserm U635, hôpital Henri-Mondor, université Paris-XII, Créteil. 184 antiviral, le choix du schéma thérapeutique le mieux adapté et le suivi de la réponse virologique au traitement (1). outils du diagnostic virologique en 2006 Le tableau I résume l’ensemble des marqueurs virologiques aujourd’hui disponibles pour les infections par le VHB. Tableau I. Marqueurs virologiques disponibles pour le dépistage, le diagnostic et le suivi virologiques des hépatites virales B. Diagnostic direct Antigènes Antigène HBs Antigène HBe Diagnostic indirect Génome viral Anticorps totaux ou IgG ADN du VHB IgM Anticorps anti-HBs Anticorps anti-HBe Anticorps anti-HBc IgM anti-HBc Techniques immuno-enzymatiques pour la détection des antigènes viraux et des anticorps spécifiques Les méthodes de type ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) sont utilisées pour détecter et, parfois, quantifier les antigènes viraux ou les anticorps spécifiques dans les liquides biologiques. Le résultat est exprimé par un ratio, par rapport à un témoin. Les techniques ELISA sont faciles à utiliser, automatisables et permettent de tester un grand nombre d’échantillons. Elles sont, en outre, relativement peu coûteuses. En pratique, les tests ELISA sont utilisés pour la détection de l’antigène HBs et de l’antigène HBe (tests directs), et pour celle des anticorps anti-HBs, des anticorps anti-HBc totaux et de type IgM, et des anticorps anti-HBe (tests indirects). Techniques moléculaires pour la détection et la quantification de l’ADN du VHB La quantification de l’ADN du VHB dans le sang périphérique permet de mesurer le niveau de la réplication virale. On individualise deux catégories de techniques qui permettent de détecter et de quantifier l’ADN du VHB : les techniques d’amplification de la cible, essentiellement la polymerase chain reaction (PCR), et les techniques d’amplification du signal, fondées sur l’utilisation de la capture d’hybrides ou sur celle des ADN branchés (2). Le principe de la PCR consiste à synthétiser un grand nombre de copies du génome viral (ou amplicons) au cours de réacLa Lettre de l’Hépato-gastroentérologue - Vol. IX - n° 4 - septembre 2006 tions enzymatiques cycliques dont le nombre est variable (25 à 40 cycles) et qui utilisent plusieurs températures et une enzyme thermostable, la Taq polymérase. Les copies du génome viral sont des ADN double brins qui peuvent être détectés et quantifiés par différentes méthodes. Dans les techniques de PCR classiques, “compétitives”, la quantification est fondée sur l’amplification compétitive d’une séquence témoin ajoutée à chaque échantillon en quantité connue. Les quantités relatives de produits amplifiés à partir de l’ADN du VHB et à partir du témoin sont mesurées à la fin de la réaction et les résultats sont établis à l’aide d’une courbe d’étalonnage établie en parallèle au cours de la réaction. Roche Molecular Systems (Pleasanton, Californie) commercialise la technique Amplicor HBV Monitor®, manuelle, et la technique Cobas Amplicor HBV Monitor®, semi-automatisée grâce à l’utilisation de l’automate Cobas Amplicor® (tableau II, p. 186). Le principe des techniques d’amplification du signal est la capture des génomes viraux sur un support solide et l’hybridation de l’acide nucléique viral à plusieurs sondes liées à des molécules “signal”, afin d’augmenter le signal d’amplification, c’est-à-dire la sensibilité analytique de la technique (2). L’émission du signal en fin de réaction est directement proportionnelle à la quantité de génomes présents dans l’échantillon et comparée à une courbe d’étalonnage générée simultanément à partir de témoins ADN en quantités connues. La technique HPV Digene Hybrid Capture II™ et sa version Ultrasensitive HPV Digene Hybrid Capture II™ (Digene Corporation, Gaithersburg, Maryland) sont fondées sur le principe de la capture d’hybrides en milieu liquide (tableau II). La technique des ADN branchés, Versant™ HBV DNA 3.0 Assay (Bayer Healthcare, Tarrytown, New York) s’appuie, quant à elle, sur l’utilisation d’ADN branchés (tableau II). Les techniques classiques de détection et quantification de l’ADN du VHB sont actuellement progressivement remplacées dans les laboratoires de virologie par les techniques de PCR “en temps réel”, dont le principe est de détecter la synthèse des produits d’amplification au cours de la réaction de PCR, à l’intérieur du tube fermé, plutôt qu’à la fin de celle-ci comme c’est le cas au cours des techniques classiques de PCR (2). La PCR en temps réel est beaucoup plus sensible et plus rapide que les techniques classiques d’amplification et elle diminue considérablement le risque de contamination. Ses performances sont en cours d’optimisation et l’automatisation de la technique ainsi que son applicabilité à une large échelle en feront la technique de choix dans le futur proche pour la quantification de l’ADN du VHB. Deux techniques de PCR en temps réel sont d’ores et déjà disponibles pour la détection et la quantification de l’ADN du VHB : Cobas Taqman® HBV et la version de ce test disposant d’une extraction automatique de l’ADN du VHB, Cobas Ampliprep®-Cobas Taqman® HBV, ou CAP-CTM® HBV (Roche Molecular Systems) et Real-Art® HBV PCR Assay (Artus-Biotech, Qiagen, Hambourg, Allemagne). Un nouveau kit commercialisé par Abbott Diagnostic sera bientôt disponible (tableau II). Techniques moléculaires pour l’analyse des séquences virales L’analyse des séquences génomiques virales permet de classer les souches virales au sein des différents génotypes du VHB La Lettre de l’Hépato-gastroentérologue - Vol. IX - n° 4 - septembre 2006 (A à H), d’identifier des substitutions nucléotidiques d’importance physiopathologique, comme les mutations dans la région pré-C et dans la région promotrice du core, ou d’identifier des substitutions amino-acidiques associées à la résistance du VHB aux molécules antivirales (3). Le séquençage direct des produits obtenus par amplification en PCR est la technique de référence pour l’analyse de la séquence des génomes viraux. Elle permet de déterminer la séquence nucléotidique et de déduire la séquence en acides aminés du fragment amplifié. L’examen de cette séquence à la recherche de substitutions connues permet d’identifier les souches virales résistantes aux antiviraux, tandis que l’analyse phylogénique des séquences obtenues, par comparaison aux séquences de souches prototypes disponibles dans les banques, est la méthode de référence permettant la détermination des génotypes. Des techniques rapides d’analyse de la séquence des génomes viraux ont également été développées. La plus utilisée est l’hybridation inverse des produits de PCR à des sondes oligonucléotidiques fixées sur un support solide (membrane de nitrocellulose), telle que la technique du line probe assay (Inno-LIPA, Innogenetics, Gand, Belgique). Cette technique peut être utilisée pour l’identification du génotype du VHB, pour la mise en évidence de mutations de la région pré-C et de mutations dans la région promotrice du core, et pour la mise en évidence de mutations associées à la résistance du VHB aux antiviraux (2, 3). Dossier thématique D ossier thématique Indications et utilisation pratique des tests virologiques au cours des infections par le VHB Dépistage des hépatites B Le dépistage des marqueurs d’infection par le VHB est obligatoire chez les donneurs de sang, d’organes, de tissus ou de cellules. Il est recommandé chez les sujets avec des facteurs de risque d’infection. En pratique, trois marqueurs sérologiques doivent être recherchés par la technique ELISA : l’antigène HBs, les anticorps anti-HBc totaux et les anticorps anti-HBs. La présence de l’antigène HBs signe le portage du VHB. En présence d’anticorps anti-HBc et d’anticorps anti-HBs, on peut affirmer que le sujet a guéri d’une hépatite B aiguë dans le passé. La présence d’anticorps anti-HBc isolés doit conduire à la recherche de l’ADN du VHB par une technique moléculaire, car 10 à 30 % de ces sujets sont en fait porteurs chroniques du VHB. La seule présence d’anticorps anti-HBs témoigne d’une vaccination efficace contre le VHB. Diagnostic de l’hépatite aiguë B La figure, p. 186 montre la cinétique d’évolution des marqueurs virologiques au cours de l’hépatite aiguë B. En pratique, les quatre marqueurs suivants, antigène HBs, anticorps anti-HBc totaux, IgM anti-HBc et anticorps anti-HBs, doivent être recherchés en première intention devant toute suspicion d’hépatite aiguë B. La mise en évidence de l’ADN du VHB n’est pas utile pour le diagnostic d’infection aiguë. 185 Dossier thématique D ossier thématique Tableau II. Tests de détection et quantification de l’ADN du VHB (UI : unité internationale). Test Fabricant Méthode Seuil inférieur de détection Intervalle de quantification HPV Digene Hybrid Capture II™ Digene Corp., Gaithersburg, Maryland Capture d’hybrides (amplification du signal) 142 000 copies/ml 142 000-1 700 000 000 copies/ml Ultrasensitive HPV Digene Hybrid Capture II™ Digene Corp., Gaithersburg, Maryland Capture d’hybrides (amplification du signal) 4 700 copies/ml 4 700-57 000 000 copies/ml Amplicor HBV Monitor TM Roche Molecular Systems, Pleasanton, Californie PCR compétitive manuelle 1 000 copies/ml ou 180 UI/ml 1 000-4 000 000 copies/ml ou 180-715 000 UI/ml Cobas Amplicor HBV Monitor TM Roche Molecular Systems, Pleasanton, Californie PCR compétitive semi-automatisée 200 copies/ml ou 35 UI/ml 200-200 000 copies/ml ou 35-35 700 UI/ml Versant™ HBV DNA 3.0 Assay Bayer Healthcare, Diagnostics Division Tarrytown, New York AND branches (amplification du signal) 357 UI/ml 357-17 857 000 UI/ml Cobas Taqman™ HBV Roche Molecular Systems, Pleasanton, Californie PCR en temps réel avec extraction automatique Ampliprep 12 UI/ml 54-110 000 000 UI/ml Real-Art® HBV PCR Assay Qiagen, Hambourg, Allemagne PCR en temps réel 4 UI/ml 9-4 100 000 000 UI/ml Diagnostic de l’hépatite chronique B Anticorps anti-HBc totaux Antigène HBs IgM anti-HBc Anticorps anti-HBs ADN du VHB 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 52 100 Semaines après l'infection Figure. Cinétiques des marqueurs virologiques du VHB au cours de l’hépatite aiguë B. En cas de présence certaine ou possible d’antigène HBs, une nouvelle détermination doit être réalisée sur un deuxième prélèvement, différent du premier (Journal officiel, 12 août 1997). La présence simultanée d’antigène HBs et d’IgM antiHBc dans un contexte d’hépatite aiguë signe avec certitude le diagnostic d’hépatite aiguë B. La présence d’anticorps anti-HBc totaux en l’absence d’antigène HBs et d’anticorps anti-HBs est possible lors de la phase de convalescence qui précède la guérison sérologique. Dans ce cas, la présence d’IgM anti-HBc permet le diagnostic, confirmé par l’apparition ultérieure des anticorps anti-HBs. Toutefois, des IgM anti-HBc sont parfois décelables, le plus souvent à un faible titre, chez les patients souffrant d’une infection chronique (4). Le diagnostic différentiel dépend alors de l’anamnèse et des données cliniques. La disparition de l’antigène HBs est le critère sérologique de guérison d’une hépatite aiguë B. Elle est habituellement suivie, après 2 à 4 mois, par l’apparition des anticorps anti-HBs (séroconversion HBs). La persistance de l’AgHBs au-delà de 6 mois caractérise l’évolution vers l’infection chronique. 186 Devant des signes cliniques (asthénie, ictère, etc.) ou biologiques (élévation de l’activité sérique des transaminases, parfois cholestase) d’hépatite chronique, les tests sérologiques renseignent sur le statut virologique de l’infection, mais ne permettent pas d’évaluer la gravité de la maladie. Seule la ponction-biopsie hépatique (PBH) ou les tests non invasifs d’évaluation de la fibrose permettent de mesurer la gravité de l’atteinte hépatique et de poser les indications du traitement antiviral. En cas de suspicion d’hépatite chronique B, la recherche de l’antigène HBs, des anticorps anti-HBs et des anticorps anti-HBc doit être réalisée en première intention. Le portage chronique du VHB est caractérisé par la persistance depuis plus de 6 mois de l’antigène HBs en l’absence d’anticorps anti-HBs. Les anticorps anti-HBc sont également présents. La recherche quantitative de l’ADN du VHB par méthode moléculaire doit alors être systématiquement réalisée. Les malades avec une réplication virale et un antigène HBe présent en l’absence d’anticorps anti-HBe sont infectés par un VHB dit “sauvage”. Lorsque l’antigène HBe est absent en présence d’anticorps anti-HBe, le malade est infecté par un VHB dit “mutant de la région pré-C”, c’est-à-dire présentant une substitution nucléotidique dans la région pré-C qui empêche la production de la protéine non structurale HBe. Chez les malades avec une hépatite chronique B, la décision thérapeutique est fondée sur l’évaluation de multiples paramètres cliniques, biologiques et pronostiques, dont les plus importants sont le niveau de l’activité sérique des aminotransférases, la charge virale et la sévérité de l’atteinte hépatique. Suivi des hépatites chroniques B non traitées Le traitement n’est habituellement pas recommandé lorsque l’ADN viral est indétectable ou la charge virale basse (inférieure à 103-104 unités internationales [UI]/ml, selon que les malades sont porteurs d’une infection par un VHB sauvage ou mutant de la région pré-C). Une surveillance régulière est alors conseillée. Elle comprend la La Lettre de l’Hépato-gastroentérologue - Vol. IX - n° 4 - septembre 2006 surveillance biologique de l’activité des aminotransférases sériques (associée, chez les patients atteints de cirrhose, à la mesure du taux de prothrombine, et à la surveillance de la survenue du carcinome hépatocellulaire par échographie et dosage de l’alphafœtoprotéine). La répétition de la quantification de l’ADN du VHB est utile à la prise d’une éventuelle décision thérapeutique si celle-ci augmente. Décision thérapeutique et suivi virologique de la réponse Les porteurs chroniques du VHB dits “réplicants” – avec un ADN du VHB présent à un titre significatif (supérieur à 103104 UI/ml) – sont éligibles pour un traitement antiviral. On peut aujourd’hui administrer deux types de traitement aux malades souffrant d’une hépatite B chronique : l’interféron alpha pégylé et des inhibiteurs spécifiques de la réplication du VHB (lamivudine et adéfovir-dipivoxil qui disposent d’une autorisation de mise sur le marché [AMM] dans cette indication, entécavir qui devrait la recevoir très bientôt, enfin ténofovir et la combinaison ténofoviremtricitabine ou FTC qui sont disponibles pour le traitement des infections par le virus de l’immunodéficience humaine) [5]. Il n’existe pas actuellement de consensus sur le traitement de première intention de l’infection chronique par le VHB. Un taux sérique de l’alanine aminotransférase élevé, la présence d’antigène HBe et une charge virale modérée sont de bons arguments en faveur d’une réponse prolongée à l’interféron alpha. Si le génotype A du VHB semble celui qui répond le mieux au traitement par l’interféron pégylé, le génotype D est celui associé au plus faible taux de réponse. Néanmoins, aucune étude n’a à ce jour validé la valeur de la détermination du génotype avant de commencer le traitement afin d’orienter le choix thérapeutique. La détermination du génotype du VHB n’a donc, pour l’instant, aucune indication en pratique clinique. Chez les malades présentant des facteurs de réponse à l’interféron alpha, l’efficacité du traitement est attestée par la perte de l’antigène HBe, suivie de la séroconversion HBe (apparition des anticorps anti-HBe) dans un contexte de diminution importante de l’ADN du VHB qui devient indétectable (6, 7). Une faible proportion de ces malades développe ultérieurement une séroconversion HBs, avec disparition de l’antigène HBs et apparition des anticorps anti-HBs. Les malades avec un antigène HBe présent, des transaminases faiblement élevées et une charge virale forte, ainsi que la majorité des sujets infectés par un VHB mutant de la région pré-C (donc antigène HBe négatifs) sont candidats à un traitement prolongé (à vie pour certains d’entre eux) par un ou plusieurs inhibiteurs spécifiques du VHB. Le suivi de l’efficacité thérapeutique repose alors sur la quantification de l’ADN du VHB tous les 3 à 6 mois en fonction du pronostic naturel de l’infection. Dans tous les cas, lorsqu’une réponse initiale au traitement par un inhibiteur spécifique a été observée (réduction significative de la charge virale) et qu’elle est suivie d’une rechute (réascension de celle-ci), on doit suspecter une résistance virale au médicament, après vérification de la bonne observance du traitement. La résistance, fréquente avec la lamivudine, plus rare avec les autres molécules ou en cas d’utilisation d’une combinaison thérapeutique, est caractérisée par la sélection de virus présentant des changements amino-acidiques La Lettre de l’Hépato-gastroentérologue - Vol. IX - n° 4 - septembre 2006 au sein du gène de l’ADN polymérase qui confèrent la résistance à l’action antivirale du médicament. On peut mettre ces mutations en évidence par séquençage direct du génome viral ou par hybridation inverse après PCR. Ces techniques n’ont pas d’indication en routine aujourd’hui, mais pourraient devenir utiles dans un avenir proche pour guider la prescription thérapeutique lorsque de plus nombreuses molécules seront présentes sur le marché et, surtout, lorsque des algorithmes décisionnels consensuels auront été établis, permettant la prise de décision en fonction des résultats des tests de mise en évidence de la résistance (8). Dossier thématique D ossier thématique Conclusion et perspectives L’utilisation et la bonne interprétation des tests virologiques sont aujourd’hui indispensables au diagnostic et à la prise en charge thérapeutique des malades infectés par le VHB. Les techniques de quantification de la charge virale ont été améliorées et continueront de l’être dans le futur. Leur sensibilité analytique toujours plus grande devrait permettre de détecter l’ADN du VHB chez pratiquement tous les porteurs de l’antigène HBs ainsi que de mettre en évidence des niveaux de réplication très faibles chez des sujets qui répondent de façon appropriée aux traitements antiviraux. C’est pourquoi l’interprétation des résultats de ces tests ne devra plus se faire sur la base de la “présence” ou de l’ “absence” de l’ADN du VHB, mais sur la base de seuils de charge virale ayant une valeur diagnostique, pronostique ou thérapeutique, qui restent à déterminer. Si la détermination du génotype et l’identification des mutations de la région pré-C et de la région promotrice du core n’ont pas, aujourd’hui, d’utilité en pratique courante, elles devront être utilisées pour établir seuils et algorithmes décisionnels à l’intérieur de populations homogènes de malades, ces seuils et algorithmes pouvant varier d’une population à l’autre. Enfin, l’arrivée prochaine sur le marché de nombreuses nouvelles molécules pour le traitement de l’hépatite chronique B pourrait justifier l’emploi des tests d’identification des mutations associées à la résistance aux antiviraux pour l’adaptation du traitement au long cours. n R éférences bibliographiques 1. Hodinka RL. Laboratory diagnosis of viral hepatitis. In Viral Hepatitis: dia- gnosis, therapy and prevention. S. Spector, Ed. Humana Press, Totowa, New Jersey, 1999:193-249. 2. Pawlotsky JM. Molecular diagnosis of viral hepatitis. Gastroenterology 2002;122:1554-68. 3. Pawlotsky JM. Hepatitis B virus (HBV) DNA Assays (methods and practical use) and viral kinetics. J Hepatol 2003;39(Suppl. 1):S31-5. 4. Senecal D, Pichon E, Dubois F et al. Acute hepatitis B after autologous stem cell transplantation in a man previously infected by hepatitis B virus. Bone Marrow Transplant 1999;24:1243-4. 5. Zoulim F. Antiviral therapy of chronic hepatitis B. Antiviral Res 2006;71:206-15. 6. Marcellin P. Advances in therapy for chronic hepatitis B. Semin Liver Dis 2002; 22(Suppl. 1):33-6. 7. Ganem D, Prince AM. Hepatitis B virus infection: natural history and clinical consequences. N Engl J Med 2004;350:1118-29. 8. Locarnini S, Hatzakis A, Heathcote J et al. Management of antiviral resistance in patients with chronic hepatitis B. Antivir Ther 2004;9:679-93. 187