Chromatographie Liquide Haute Performance

CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE
HAUTE PERFORMANCE
HPLC
TECHNIQUE DE SEPARATION DES COMPOSES
EN SOLUTION.
INTERET
- TECHNIQUE NON DESTRUCTIVE
/ PERMET D'ISOLER, DE PURIFIER
DES PRODUITS.
/ ANALYSE DE COMPOSES:
- FORTEMENT POLAIRES
- P.M. ELEVE
- SYSTEME SOUVENT FACILEMENT
AUTOMATISABLE
LIMITE
-SENSIBILITE DES DETECTEURS
SAUF SI COUPLAGE AVEC LA
SPECTROMETRIE DE MASSE.
CERTAINEMENT LA PLUS ANCIENNE DES
TECHNIQUES CHROMATOGRAPHIQUES.
- COLONNE : SIMPLE TUBE (L: 15 A 30 cm,
D.I. : 1 A 4 cm).
NON REUTILISABLE
GENERALITES
LES COMPOSES A SEPARER SONT REPARTIS
ENTRE 2 PHASES.
-UNE PHASE DITE STATIONNAIRE
CONSTITUEE PAR UN ‘’LIT’’ DE MATERIAUX.
- UNE PHASE DITE ’’MOBILE’’ QUI S’INFILTRE
AU TRAVERS DE LA PREMIERE.
LE PROCESSUS CHROMATOGRAPHIQUE
PHENOMENES D’ADSORPTIONS ET DE
DESORPTIONS REPETES.
CLHP
- COLONNE : FAIBLE D.I. : 1 A 5 mm
REUTILISABLE
- PHASE STATIONNAIRE : SPECIALEMENT MISE
AU POINT; PARTICULES (3 A 10 µm)
- PHASE STATIONNAIRE : PARTICULES
IRREGULIERES DE SILICE (50
A 300 µm ).
-PRESSION EN TETE DE COLONNE : 100 A 400 bar
- DEBIT : PAR SIMPLE GRAVITE.
- INTRODUCTION DE L’ECHANTILLON :VANNE
TRES PRECISE.
- RECUEIL DES COMPOSANTS D’UN
ECHANTILLON PAR FRACTIONS
SUCCESSIVES.
- DETECTEURS SPECIAUX
A PERMIS LA SEPARATION ET/OU LA
PURIFICATION DE NOMBREUSES
SUBSTANCES NATURELLES.
- DEBIT : PARFAITEMENT REGULE
RESOLUTION ELEVEE
RAPIDITE DES ANALYSES
APPAREILS AUTOMATISABLES
SYSTEME D ’INJECTION
APPAREILLAGE
ETAPE 1
SYSTEME ISOCRATIQUE
PHASE MOBILE
1
POMPE
INJECTEUR
POMPE
2
6
3
COLONNE
COLONNE
INJECTION
5
4
DETECTEUR
TRAITEMENT DES DONNEES
SYSTEME A GRADIENT D’ELUTION
PHASE MOBILE A
PHASE MOBILE B
BOUCLE
POMPE A
POMPE B
PROGRAMMATION
DU GRADIENT
CHAMBRE DE MELANGE
INJECTEUR
SYSTEME D ’INJECTION
PHASE MOBILE
ETAPE 2
1
POMPE
2
6
3
COLONNE
RÔLE ACTIF DANS LE MECANISME DE
SEPARATION
SON CHOIX DEPEND :
- DU TYPE DE CHROMATOGRAPHIE
5
4
- DE LA POLARITE DES COMPOSES ETUDIES
- DU TYPE DE DETECTEUR UTILISE
- CONSTITUEE PAR UN OU PLUSIEURS ELEMENTS
BOUCLE
- COMPOSITION :
/FIXE : SYSTEME ISOCRATIQUE
/MODIFIEE EN FONCTION DU TEMPS :
SYSTEME A GRADIENT D’ELUTION.
PHASE STATIONNAIRE
SON CHOIX DEPEND DE LA TECHNIQUE
CHROMATOGRAPHIQUE UTILISEE.
NOTIONS THEORIQUES
A-) TEMPS DE RETENTION (T.R.)
- SEPARATION DES COMPOSES EN FONCTION
DU TEMPS
tR
- LE PLUS SOUVENT PARTICULES
/ DE SILICE SEULES
/ DE SILICE ’’GREFFEES’’
t'R
tM
- IMPORTANCE DE LA GRANULOMETRIE
(’’FINESSE’’) DES PARTICULES.
A DEBIT IDENTIQUE DES PARTICULES PLUS
’’FINES’’ LA RESOLUTION ET LE SEUIL
DE DETECTION.
Produit
non retenu
temps
Inj.
LE T.R. PEUT-ÊTRE DIVISE EN DEUX TERMES tM
ET t'R.
t'R = tR - tM
t'R = T.R. REDUIT = TEMPS DE SEJOUR D'UN
COMPOSE DANS LA PHASE STATIONNAIRE.
tM = TEMPS DE SEJOUR DANS LA PHASE MOBILE
C - CARACTERISTIQUES D’UN PIC -NOTION
DE PLATEAUX THEORIQUES tR
B - FACTEUR DE CAPACITE
δ
° PERMET D’EXPRIMER LE TEMPS DE
“FIXATION” “D’ADSORPTION”, SUR LA PHASE
STATIONNAIRE, DES DIFFERENTS COMPOSES
D’UN MELANGE.
k'=
t ' R tR − tM
=
tM
tM
EN PRATIQUE :
1 < k’ <10
ω
ω : LARGEUR DU PIC A LA BASE
δ : LARGEUR DU PIC A MI-HAUTEUR
° NOMBRE DE PLATEAUX THEORIQUES :
⎛ tR ⎞
n = 16⎜ ⎟
⎝ω⎠
2
OU
⎛ tR ⎞
n = 5,545⎜ ⎟
⎝δ⎠
° UN PIC PEUT - ÊTRE CARACTERISE
/ PAR SON T.R.
/ PAR SA SURFACE
/ PAR SA HAUTEUR
2
2-) RESOLUTION
D -SEPARATION
° LA SEPARATION DE DEUX PICS ADJACENTS
PEUT-ÊTRE CARACTERISEE PAR DEUX
PARAMETRES :
- SEPARATION REELLE DES PICS.
- NOTION DE “FINESSE” DES PICS ET
D’EFFICACITE DE LA COLONNE.
POUR UN FACTEUR DE SELECTIVITE IDENTIQUE
LA RESOLUTION PEUT - ÊTRE DIFFERENTE :
- FACTEUR DE SELECTIVITE (α)
- RESOLUTION (R)
∆t
1)- FACTEUR DE SELECTIVITE
Inj.
t'R(B)
t'R(A)
tM
B
Inj.
produit
non retenu
Inj.
α=
t ' R( B) k ' B
=
t ' R ( A) k ' A
TECHNIQUES C.L.H.P.
LES PLUS UTILISEES
EN PHARMACOCINETIQUE
-CHROMATOGRAPHIE D'ADSORPTION.
1
2
1
2
produit
non retenu
produit
non retenu
temps
Inj.
2
produit
non retenu
∆t
A
1
ω1
R=
ω2
temps
2 ∆t
∆t
=
(ω 1 + ω 2) 2 ω 1 + ω 2
CHROMATOGRAPHIE
D'ADSORPTION
PHASES STATIONNAIRES AYANT DES
PROPRIETES ADSORBANTES :
- GELS DE SILICE
" D'ALUMINE
- CHROMATOGRAPHIE DE PARTAGE.
-CHROMATOGRAPHIE D'ECHANGE D'IONS.
- CHROMATOGRAPHIE PAR APPARIEMENT
D'IONS.
SEPARATION DE COMPOSES DE
POLARITE FAIBLE OU MOYENNE.
AVEC LES COMPOSES POLAIRES OU
TRES POLAIRES L'ADSORPTION EST
SOUVENT IRREVERSIBLE.
STRUCTURE DES GELS DE SILICE
MECANISME
SILICE = DIOXYDE DE SILICIUM QUI SE
° SUITE DE PROCESSUS D’ADSORPTION-DESORPTION
PRESENTE SOUS DIFFERENTES FORMES :
S(P.M.) + M(a)
Si
O
OH
O
Si
Si
SILANOLS LIBRES
S = SOLUTE , M = PHASE MOBILE
H
H
OH
O
O
EXEMPLE :
Si
SILANOLS LIES
Si
OH
O
H
O
H
O
Si
O
S(a) + M(P.M.)
O
Si
H
Si
H
O
Si
SILANOLS LIBRES
HYDRATES
H
O
H
O
H
H
O
Si
O
H
H
H
H
O
O
CH3
O
C
(P.M.)
CH3
O
Si
PONT SILOXANE
H
O
Si
H2 N
R
(S)
- L’ECHANTILLON (S) ADSORBE SUR UN Si-OH EST
HEURTE EN CONTINU PAR LES MOLECULES DE
PHASE MOBILE (P.M.) .
L’ENERGIE A FOURNIR DOIT-ÊTRE SUFFISANTE
POUR DELOGER L’ECHANTILLON ADSORBE ET
L’ENTRAINER JUSQU’A UN GROUPEMENT Si-OH
VOISIN.............
SILANOLS FORTEMENT HYDRATES
- (S) DOIT AVOIR UNE POLARITE VOISINE DE CELLE
DE (P.M.) .
PHASE MOBILE
-SOLVANTS APOLAIRES
/ HEXANE
/ ISO-OCTANE
/ CYCLOHEXANE........EN MELANGE
AVEC DES SOLVANTS:
- ACCEPTEURS DE PROTONS
/ ETHER n-BUTYLIQUE
/
"
ISOPROPYLIQUE
- DONNEURS DE PROTONS
/ CHLOROFORME
/ FLUOROALCOOLS
- DONNANT DES INTERACTIONS DIPOLAIRES
/ DICHLOROMETHANE
/ DICHLORO-1,2 ETHANE
SOLVANTS UTILISES EN MELANGES BINAIRES
OU TERNAIRES AVEC UNE FAIBLE PROPORTION
DE SOLVANTS POLAIRES : METHANOL ,
ACETONITRILE
POLARITE DES SOLVANTS SELON ROHRSCHNEIDER
SOLVANT
POLARITE
n-HEXANE
ISO-OCTANE
CYCLOHEXANE
TRIETHYLAMINE
ETHER n-BUTYLIQUE
ETHER ISOPROPYLIQUE
TOLUENE
BENZENE
ETHER ETHYLIQUE
CHLORURE DE METHYLENE
n-OCTANOL
n-BUTANOL
n-PROPANOL
ISOPROPANOL
TETRAHYDROFURANNE
CHLOROFORME
ETHANOL
ACETATE D'ETHYLE
METHYLETHYLCETONE
DIOXANNE
ACETONE
METHANOL
PYRIDINE
ACETONITRILE
N,N-DIMETHYLACETAMIDE
ETHYLENEGLYCOL
FORMAMIDE
EAU
0,1
0,1
0,2
1,9
2,1
2,4
2,4
2,7
2,8
3,1
3,4
3,9
3,9
3,9
4
4,1
4,3
4,4
4,7
4,8
5,1
5,1
5,3
5,8
6,5
6,9
9,6
10,2
CHOIX D'UNE PHASE MOBILE
EXEMPLE :
° SEPARATION DE 7 DERIVES DE LA
PHENOTHIAZINE.
H
N
EXEMPLE :
SOLVANT
NON POLAIRE
SOLVANT DE
POLARITE MOYENNE
SOLVANT
POLAIRE
-HEXANE
-ACETATE D'ETHYLE
-METHANOL
50%
50%
50%
50%
MELANGE PRIMAIRE
SOLVANT B
MELANGE PRIMAIRE
SOLVANT A
ACETATE D'ETHYLE
+
METHANOL
HEXANE
+
ACETATE D'ETHYLE
O
- PHASE MOBILE:
/ SOLVANT A = 65% [ISO-OCTANE (50%) +
ETHER ISOPROPYLIQUE (50%) +
TRIETHYLAMINE 0,2 %]
/ SOLVANT B = 35% [ETHER ISOPROPYLIQUE
(50%) + METHANOL (50%) +
TRIETHYLAMINE 0,2%]
-COLONNE : SILICE TYPE SPHEROSIL 6-7 um
(L:15 cm x DI:0,6 cm), DEBIT: 1 ml/min.
MELANGE TERNAIRE
(FORCE ELUANTE VARIABLE)
HEXANE / ACETATE D’ETHYLE / METANOL
DOSAGE DU 5-FU.
° DOSAGE DU 5-FU.
O
H
O
O
F
N
H
N
O
H
- PHASE MOBILE:
/ SOLVANT A = 75% [HEXANE] + AMMONIAQUE: 1%
/ SOLVANT B = 25% [ETHANOL] + AMMONIAQUE:1%
-COLONNE : SILICE TYPE µPORASIL 10 µm
(L:30 cm x DI:0,39 cm), DEBIT: 1 ml/min.
INJECTION : 1 µg
A
6.44 7.48
5-BrU
F
N
N
H
- PHASE MOBILE:
/ SOLVANT A = 21% [HEXANE
(50%) + ETHER ISOPROPYLIQUE (50%)
+ TRIETHYLAMINE 0,05 %]
/ SOLVANT B = 79% [ETHER
ISOPROPYLIQUE (50%) + METHANOL
(50%) + TRIETHYLAMINE 0,05%]
-COLONNE : SILICE TYPE
LICHROSPHER Si 60 5µm (L:25 cm x DI:0,4
cm), DEBIT: 1 ml/min.
INJECTION : 50 ng
B
5-FU
8.79
5-BrU
5-FU
PHASE STATIONNAIRE
CHROMATOGRAPHIE
DE PARTAGE
- PHASES NORMALES
O
O
Si
;
Si NH 2
ON DISTINGUE :
- LA CHROMATOGRAPHIE DE PARTAGE "NORMALE "
AVEC PHASE STATIONNAIRE POLAIRE ET PHASE
MOBILE APOLAIRE OU PEU POLAIRE.
O
Si C
O
O
N
Si
;
O
(CH 2)3
C
O
OH
CH 2 CH CH
OH
Si C18H37
O
OCTADECYLE
PHASE STATIONNAIRE INVERSEE
O
Si
Si C8H17
O
O
O
+
(CH 2)3
O
;
O
O
/ SOLVANTS APOLAIRES :
- HEXANE, ISO-OCTANE.......
Si
O
Si C8 H17
Si NH2
- PHASE MOBILE
;
- PHASES INVERSEES
O
...............
N
O
OCTYLE
PHASE STATIONNAIRE “NORMALE”
Si
;
O
O
- LA CHROMATOGRAPHIE DE PARTAGE A POLARITE DE
PHASE STATIONNAIRE INVERSEE (APOLAIRE) ET PHASE
MOBILE POLAIRE.
NH 2
O
O
LA SEPARATION DEPEND DES DIFFERENCES DE
SOLUBILITE DES SOLUTES DANS LA PHASE MOBILE
ET DES DIFFERENTES INTERACTIONS DES SOLUTES
AVEC LES GROUPEMENTS ORGANIQUES GREFFES SUR
LA PHASE STATIONNAIRE.
O
(CH 2)3
O
;
Si C18H37
O
- PHASE STATIONNAIRE APOLAIRE
- PHASE MOBILE POLAIRE
° ‘’SOLVATATION’’ DES CHAINES ALKYLE DE LA
PHASE STATIONNAIRE PAR LE SOLVANT
ORGANIQUE DE LA PHASE MOBILE :
⇒⇒ UN LIQUIDE VISQUEUX DANS LEQUEL
LES SOLUTES PEUVENT DIFFUSER.
/ SOLVANTS PEU POLAIRES OU POLAIRES:
- CHCl3, CH2Cl2, THF, ETHANOL, METHANOL
ACETONITRILE......
SOLVANTS POLAIRES = MODIFICATEURS POLAIRES
° LES SOLUTES PEUVENT INTERAGIR:
-AVEC LE SOLVANT ORGANIQUE DE LA
PHASE MOBILE,
-AVEC LES CHAINES ALKYLE DE LA
PHASE STATIONNAIRE.
° LE T.R. ⇓ LORSQUE LE % EN SOLVANT POLAIRE ⇑ .
/ SOLUTES APOLAIRES, SURTOUT, EN INTERACTION
AVEC LES CHAINES ALKYLE.
° L’ORDRE D’ELUTION DEPEND DE LA POLARITE DES
SOLUTES:
LE T.R. ⇑ AVEC UNE ⇑ DE LA POLARITE
DU PRODUIT ETUDIE.
/ SOLUTES POLAIRES, PLUTÔT, EN INTERACTION
AVEC LE SOLVANT ORGANIQUE DE LA PHASE
MOBILE.
MECANISME
EXEMPLE:
- PHASE STATIONNAIRE: C18
- PHASE MOBILE: H2O/MeOH
- SOLUTE:
/ SOLUTE PLUTÔT APOLAIRE SURTOUT EN
INTERACTION AVEC LES CHAINES C18.
- ⇑ DU % EN MeOH DONNE ⇑ DE LA
SOLUBILITE DANS LA PHASE MOBILE,
DONC ⇑ DES INTERACTIONS AVEC LE
SOLVANT ORGANIQUE CE QUI CONDUIT A
UNE ⇓ DU T.R.
- INVERSEMENT UNE ⇑ DU % EN H2O
CONDUIT A UNE ⇑ DU T.R.
D’OU :
- RÔLE DE LA PHASE STATIONNAIRE
° LE T.R. ET LE k’⇑ AVEC LE NOMBRE DE
CHAÎNES ALKYLE GREFFEES.
° VARIATION LINEAIRE DU T.R. ET DE k’ AVEC
LA LONGUEUR DE LA CHAÎNE.
- RÔLE DE LA PHASE MOBILE
° GENERALEMENT : MELANGES H2O OU
TAMPON / MeOH, CH3CN, ETHANOL.....
° PARFOIS : AJOUT, EN FAIBLE PROPORTION,
D’UN 3ème SOLVANT, LE PLUS SOUVENT, DU
T.H.F. :
⇒⇒FORTE INTERACTION AVEC LES CHAÎNES
ALKYLE - MODIFICATION DE LA FORCE
D’ELUTION -.
COMPOSES POLAIRES ELUES AVANT
COMPOSES APOLAIRES.
RÔLE DU THF
EXEMPLE:
SEPARATION DU PHENOL ET DE L’ALCOOL
BENZYLIQUE.
-COLONNE :C18 (30 cm x DI 0,4 cm), 10 µm
-PHASE MOBILE : H2O/MeOH (60%/40%) + THF
EN PROPORTION VARIABLE
° PLUS LE SOLUTE EST IONISE PLUS LE T.R.
EST FAIBLE (FORTE SOLUBILITE DANS H2O).
° NECESSITE DE CONTROLER LE pH DE LA
PHASE MOBILE SI LES COMPOSES ETUDIES
POSSEDENT DES GROUPEMENTS ACIDES OU
BASIQUES .
/ UN COMPOSE ACIDE SERA ANALYSE A
UN pH = pKa - 2
/ UN COMPOSE BASIQUE SERA ANALYSE A
UN pH = pKa + 2
NOUVELLES COLONNES PHASE INVERSE
UTILISABLES:
- AVEC 100 % D ’EAU ET/OU UN pH
TRES ACIDE OU TRES BASIQUE
°CHROMATOGRAPHIE DE COMPOSES BASIQUES
‘’TRAINEES’’ EN SORTIE DE PICS, LE PLUS SOUVENT, A CAUSE
D’INTERACTIONS AVEC LES SILANOLS RESIDUELS DES
PHASES STATIONNAIRES.
POUR REDUIRE LE PHENOMENE :
Pol
Si
Si
-AGIR SUR LE pH DE LA PHASE MOBILE
(3,5 < pH <5,5) – (SELS DE POTASSIUM 0,01- 0,1 m).
O
Si
Si
O
Si
O
Si(CH3)3
-UTILISER UN MODIFICATEUR TEL QUE
LA DIETHYL OU LA TRIETHYLAMINE (0,05-0,1 M).
O
Pol
Si
Si
Si
O
OH
° EXEMPLE :
MELANGE : o-TOLUIDINE (1)
m-TOLUIDINE (2)
p- TOLUIDINE (3)
a-PHASE MOBILE: H2O/MeOH (40v/60v)
b-PHASE MOBILE :
“
“
“
+
TRIETHYLAMINE 1%
° GRADIENT D’ELUTION
- POUR LES MELANGES COMPLEXES (SOLUTES
DE POLARITE TRES DIFFERENTE) ON UTILISERA
UN GRADIENT EN DIMINUANT PROGRESSIVEMENT
LA POLARITE DE LA PHASE MOBILE.
EXEMPLE DE GRADIENTS :
MELANGE H2O/MeOH
(%) MeOH
(%) MeOH
80%
80%
10%
10%
minutes
minut
8
2
10
10
(%) MeOH
80%
10%
minutes
2
8
10
14
16
APPLICATIONS
TRES NOMBREUSES.
LA SIMPLICITE DES PHASES MOBILE
(POLAIRES) UTILISEES ET LA QUALITE DES
SEPARATIONS EXPLIQUENT LE SUCCES DE LA
CLHP AVEC PHASE STATIONNAIRES INVERSEES
C8, C18.
EXEMPLE :
DOSAGE DU DIPYRIDAMOLE
(TRAITEMENT DE CERTAINES AFFECTIONS
CARDIAQUES).
H2C
N
N
H2C
CH2
OH
H2C
C
H2
N
N
N
HO
HO
-COLONNE : C 8 TYPE LICHROSORB RP8 10µm
(L: 15 cm x ID : 0,48 cm)
OH
CH2
N
N
H2
C
-PHASE MOBILE:
H 2O [TAMPON pH 7,4 (0,01M)]/CH 3CN
(60v/40v)
CH2
N
- DETERMINATION DIRECTE A PARTIR DU
PLASMA.
-TEMPS D’ANALYSE COURT: COLONNE C8
-ETALON INTERNE : NAPHTOL
-DETECTION : FLUORIMETRIE
CHROMATOGRAPHIE
D'ECHANGE D'IONS
- PHASE
STATIONNAIRE :
POLYMERES DE HAUTE MASSE MOLAIRE OU
GEL DE SILICE SUR LESQUELS SONT GREFFES
DES GROUPEMENTS IONIQUES.
PRINCIPE
- LA PHASE STATIONNAIRE EST UN ECHANGEUR
D'IONS CONSTITUE PAR DES ELEMENTS
PORTANT DES CHARGES EXCEDENTAIRES
POSITIVES OU NEGATIVES.
° CES CHARGES SONT COMPENSEES PAR DES
IONS DE POLARITE OPPOSEE:
IONS - COMPENSATEURS
(APPORTES PAR LA PHASE MOBILE).
° CES IONS PEUVENT ÊTRE REMPLACES PAR
DES MOLECULES DE SOLUTE DE MÊME
CHARGE.
° ECHANGEURS DE CATIONS
/ GROUPEMENTS ACIDE SULFONIQUE
(ECHANGEUR FORT)
/ GROUPEMENTS ACIDE CARBOXYLIQUE
( ECHANGEUR FAIBLE)
° ECHANGEURS D’ANIONS
/ GROUPEMENTS AMMONIUM QUATERNAIRE
MECANISME
ECHANGEUR DE CATIONS
ECHANGEUR D’ANIONS
H3C CH
COOH
-
OH
+
NH3
SOLUTE
Si
CH2 CH2
Si
CH2
H3C
CH3
CH2 CH2 N +
SO3
Na+ -OOCH
TAMPON ACIDE
pH≠4
SOLUTE
CH2
TAMPON BASIQUE
pH≠8
CH3COO- +NH4
ION COMPENSATEUR
ION COMPENSATEUR
EXEMPLE :
EXTRATION DE GLUCURONOCONJUGUES
(FONCTION COOH)
URINE (O,1-1 ml)
LAVAGE ETHER
ETHYLIQUE
CHROMATOGRAPHIE DE
PAIRES IONS
(OU D'INTERACTIONS D'IONS)
PHASE AQUEUSE
RESINE ANIONIQUE
COLONNE (5 x 20 mm)
FIXATION
ACIDE FORMIQUE (0,01N)
LAVAGES : CHCl3, H2O, ETHER ETHYLIQUE
ELUTION
CH3COOH (0,3M) DANS METHANOL
EVAPORATION
RESIDU
CLHP
ASSOCIATION DE DEUX IONS DE CHARGE OPPOSEE
DUE :
- A DES INTERACTIONS ELECTROSTATIQUES .
- A DES EFFETS HYDROPHOBES
DES IONS ORGANIQUES DE GRANDE TAILLE
COMPORTANT UNE PARTIE APOLAIRE ET UN
GROUPEMENT IONIQUE S'ASSOCIENT EN
''PAIRES D'IONS'' EN SOLUTION AQUEUSE
° UTILISEE POUR CHROMATOGRAPHIER DES
SUBSTANCES IONISEES OU IONISABLES.
PRINCIPE
EXEMPLE :
-PHASE STATIONNAIRE :
O
O
Si C8H17
Si C18H37
;
O
O
OCTYLE
OCTADECYLE
A pH 6 - 7 L’ANION D’UN ACIDE CARBOXYLIQUE
RCOO- EN PRESENCE D’UN CATION AMMONIUM
QUATERNAIRE, TETRABUTYL AMMONIUM PAR
EXEMPLE
H3C
CH2 CH2 CH2
4
N+
CONDUIT A LA FORMATION DE “PAIRES D’IONS”
EN PHASE AQUEUSE EN RAISON DU CARACTERE
HYDROPHOBE DU CATION AMMONIUM.
- PHASE MOBILE :
MELANGE :
/ TAMPON (pH APPROPRIE) / MeOH,
ACETONITRILE.......
+
+
RCOOe- + Bu4Ne
RCOO- +NBu4
RCOO- +NBu4
e
a
e = PHASE AQUEUSE
a = PHASE ORGANIQUE
CONTRE - IONS = ION ORGANIQUE
COMPORTANT UNE OU PLUSIEURS
CHAÎNES HYDROPHOBES.
ACTUELLEMENT ON S’ACCORDE POUR DIRE QU’IL Y
AURAIT FORMATION D’UNE DOUBLE COUCHE
ELECTRIQUE A L’INTERFACE PHASE STATIONNAIRE PHASE MOBILE.
MECANISME
ON A D’ABORD PENSE QUE LE SOLUTE ET LE
CONTRE - IONS FORMAIENT UNE ‘’PAIRE D’IONS’’
ADSORBEE A LA SURFACE DE LA PHASE STATIONNAIRE
APOLAIRE.
PHASE MOBILE
CONTRE - IONS
SOLUTE
+
-
-
+
+
CONTRE - IONS
+ -
R
CHAINE ALKYLE C8 OU C18
+
-
+
-
+
COUCHE
DIFFUSE
+
-
R
SOLUTE CO - ION
° PHENOMENE D’INTERACTION D’IONS PLUTOT QUE DE
PAIRE D’IONS.
- INTERACTION D’AUTANT PLUS IMPORTANTE QUE
LE CONTRE - ION ET LE SOLUTE SONT PLUS
HYDROPHOBE ET LA PHASE MOBILE PLUS
HYDROPHILE.
RÔLE :
DE LA PHASE MOBILE, DU CONTRE-IONS,
DE LA PHASE STATIONNAIRE
RÔLE DU pH
° LE T.R. DONC LE FACTEUR DE CAPACITE (k’) :
- AUGMENTE ,
/ AVEC LA CONCENTRATION DU CONTRE -IONS .
/ AVEC LA LONGUEUR DE LA CHAÎNE ALKYLE
DU CONTRE - IONS.
/ AVEC LA LONGUEUR DE LA CHAÎNE ALKYLE
DE LA PHASE STATIONNAIRE.
- EST D’AUTANT PLUS ELEVE QUE LE SOLUTE EST
PLUS HYDROPHOBE.
° POUR UN COMPOSE ACIDE ON OBTIENDRA LE T.R.
MAXIMUM EN TRAVAILLANT A UN :
pH ≥ pKa + 2
° POUR UN COMPOSE BASIQUE ON OBTIENDRA LE T.R
MAXIMUM EN TRAVAILLANT A UN :
pH ≤ pKa - 2
- DIMINUE AVEC UNE AUGMENTATION DU % EN
SOLVANT ORGANIQUE.
EXEMPLE :
IONS COMPENSATEURS LES PLUS UTILISES
- COMPOSES BASIQUES ANALYSES A L’AIDE DE
SELS SODIQUES D’ALCOYLSULFONATE.
EXEMPLE :
° HEPTANE SULFONATE DE SODIUM
DOSAGE DE GLUCURONOCONJUGUES DE
BENZODIAZEPINES (METABOLITES DE PHASE II).
STRUCTURES :
CH3
O
N
O
COOH
C7H15SO3- Na+
Cl
N
H3C CH2 CH2 CH2 4 N
OH
OH
O
COOH
H2
C O
NO3-
HO
H2C
Cl
OH
OH
O
N
° CONCENTRATION EN IONS COMPENSATEURS DE
0,003 M A 0,05 M.
HO
A
- COMPOSES ACIDES ETUDIES AVEC DES
PHOSPHATES OU DES NITRATES D’AMMONIUM
TETRABUTYLE.
EXEMPLE :
° TETRABUTYLAMMONIUM NITRATE
+
O
N
F
B
° CHROMATOGRAPHIE D’APPARIEMENT D’IONS
° CHROMATOGRAPHIE DE PARTAGE
- PHASE MOBILE:
H2O (TAMPON pH 4,6 [NaH2PO4 (0,025 M)]/MeOH
(60v/40v).
-COLONNE : C18 TYPE µBONDAPAK 10 µm
(L:25 cm x DI:0,46 cm), DEBIT: 1 ml/min.
EXTRACTION A PARTIR DE 2 ml D’URINE
- PHASE MOBILE:
H2O (TAMPON pH 4,6 [NaH2PO4 (0,025 M) + CONTRE
IONS : TBAN (0,0025M)]/MeOH
(60v/40v).
-COLONNE : C18 TYPE µBONDAPAK 10 µm
(L:25 cm x DI:0,46 cm), DEBIT: 1 ml/min.
EXTRACTION A PARTIR DE 2 ml D’URINE
B
A + B + impuretés
A
ANALYSE QUANTITATIVE
EN CLHP
° RESULTATS PLUS REPRODUCTIBLES :
- SI ELUTION EN REGIME ISOCRATIQUE.
°ESSENTIELLEMENT PAR ETALONNAGE INTERNE
- ELUTION PAR GRADIENT PRESENTE SOUVENT
LES INCONVENIENTS SUIVANTS :
/ DERIVE DE LA LIGNE DE BASE.
° PRECAUTIONS:
- LE SOLVANT D’INJECTION DOIT ASSURER UNE
SOLUBILISATION TOTALE DE L’ECHANTILLON.
- LA SOLUTION INJECTEE
/ DOIT ÊTRE LIMPIDE
/ DOIT ÊTRE COMPATIBLE AVEC LA
PHASE STATIONNAIRE ET LA PHASE
MOBILE.
/ APPARITION DE PICS PARASITES DUS AUX
SOLVANTS ET/OU A L’EXTRACTIF.
/ NECESSITE UN REEQUILIBRAGE DE LA
COLONNE AVANT CHAQU’ANALYSE.
- IL EST IMPORTANT DE SELECTIONNER DES
COLONNES MECANIQUEMENT TRES
RESISTANTES ET STABLES DANS LE TEMPS.
STABILITE ET RESISTANCE ⇑ PAR AJOUT D’UNE
PRECOLONNE.
- IL EST PREFERABLE DE SOLUBILISER
L’ECHANTILLON DANS LA PHASE MOBILE
AVANT INJECTION.
ANALYSE DES TRACES
° UNE BONNE STABILITE DE LA PHASE MOBILE EST
INDISPENSABLE .
- TOUTE VARIATION DU DEBIT OU DE LA
COMPOSITION DE LA PHASE MOBILE
ENTRAINE UNE MODIFICATION DU T.R. ET DE
LA FORME DES PICS.
/ VARIATION DANS LA COMPOSITION DE LA
PHASE MOBILE A CAUSE :
- DE LA VOLATILITE D’UN SOLVANT
- DE LA NON-REPRODUCTIBILITE D’UN
GRADIENT D’ELUTION.
QUANTITES ALLANT DE 1 µg/ml A QUELQUES pg/ml.
A CE NIVEAU PROBLEMES DUS :
- A LA DETECTION
- A L’ISOLEMENT DES COMPOSES (EXTRACTION)
- AUX INTERFERENCES ( PRODUITS ENDOGENES....)
LA QUANTITE MINIMALE DETECTABLE DEPEND :
- DE LA SENSIBILITE DU DETECTEUR
- DE LA DILUTION APPORTEE PAR LA COLONNE
CONDITIONS IDEALES :
- T.R. FAIBLE AVEC UNE COLONNE
/ COURTE
/ DE FAIBLE DI
/ UNE PHASE A GRANULOMETRIE FINE (3 µm)
- TRAVAILLER AVEC UNE COLONNE CAPILLAIRE.
(A) PERCOLATION
S
I
- AMELIORATION DE LA SENSIBILITE
° ANALYSE AVEC DE GRANDS VOLUMES:
INJECTION DE GRANDS VOLUMES SI
SOLVANT DE FORCE ELUANTE > A
CELLE DE LA PHASE MOBILE
(B) LAVAGE
SOLVANT
DE
LAVAGE
ECHANTILLON
+
IMPURETES
SS
II
SS
CARTOUCHE
C18 PAR EXEMPLE
⇒⇒ MINIMISE LA DILUTION APPORTEE
PAR LA COLONNE.
II
(C) ELUTION
° PRECONCENTRATION DU SOLUTE
SOLVANT
D ’ELUTION
ECHANTILLON EN SOLUTION DANS UN
SOLVANT DE TRES FAIBLE FORCE
ELUANTE QUI DONNE DES T.R. ELEVES.
( H2O SI ON TRAVAILLE EN PARTAGE)
SS