1 Usage prévu 2 Description de la méthode employée 3
Transcription
1 Usage prévu 2 Description de la méthode employée 3
CAND v.3 1 Usage prévu 5 Stabilité et stockage RealCycler CAND est un kit de réactifs qui permet la détection qualitative par PCR en temps réel de l'ADN de Candida sp. en échantillons cliniques, en utilisant l’appareil SmartCycler® (Cepheid®). Tous les composants du kit RealCycler CAND doivent être stockés à -20 °C. Le kit est stable à -20 °C jusqu'à la date limite d' utilisation qui est inclus dans l'étiquette extérieure. Le système inclut un contrôle interne d'amplification pour prévenir les faux négatifs dus à l'inhibition de la réaction. 6 Matériel et équipement additionnel requis et non-fourni 2 Description de la méthode employée - Appareil de PCR en temps réel SmartCycler® (Cepheid®). - Micro centrifugeuse pour tubes SmartCycler®. - Support de tubes SmartCycler®. - Système de purification d'ADN. - Gants jetables. - Pipettes calibrées. - Pointes de pipettes à filtre. - Congélateur (-20 °C). La réaction en chaîne de la polymérase (PCR) est basée sur l'amplification d'une région spécifique de l'ADN/ARN en utilisant des amorces complémentaires de la séquence cible. La PCR en temps réel utilise des marqueurs fluorescents qui émettent une fluorescence dans le cas de l'amplification. Le cycle de la PCR dans lequel apparaît une fluorescence importante est proportionnelle à la quantité d'ADN/ARN présent dans l'échantillon. Cette valeur est appelée Cycle Treshold (Ct) ou Cycle Quantification (Cq). 7 Avertissement et précautions L'amplification de Candida sp. se détecte dans le canal correspondant an fluorophore FAM et celle du contrôle interne dans le canal correspondant an fluorophore Alx532. - Tous les composants du kit doivent être maintenus à faible température pendant qu'ils sont utilisés. - Après avoir ajouté l'ADN, mettez en marche immédiatement le programme d'amplification. - Les tubes contenant le mélange de réaction ne doivent pas être exposés trop longtemps à la lumière. - Décongeler et recongeler plusieurs fois les réactifs peut diminuer la sensibilité du kit. - Utiliser des gants jetables. - Utiliser des pipettes calibrées et des pointes de pipettes à filtre. - Les essais doivent être menés par du personnel qualifié et respectant les bons protocoles de laboratoire. - Il est recommandé de réaliser un contrôle positif et un contrôle négatif à chaque fois qu'une analyse est réalisée. - Il est recommandé de réchauffer les tubes pendant 5 minutes à température ambiante avant de les ouvrir. Dans le cas contraire, le bouchon pourrait se casser. - N'utiliser pas le kit après la date limite d'utilisation. - Usage pour le diagnostic in vitro. - Cepheid® et SmartCycler® son des marques déposées de Cepheid Corporation. - QIAamp est une marque déposée de QIAGEN Group. - Maxwell® est une marque déposée de Promega Corporation. - NucliSENS® easyMAG® est une marque déposée de bioMérieux. 3 Spécifications techniques Sensibilité Candida sp.: 100 copies/µL. La sensibilité analytique a été déterminée par la méthode de dilution limite. La sensibilité a été obtenue lors d'essais répétitifs avec une reproductibilité supérieure à 95%. Spécificité Candida sp.: Internal Transcribed Spacer Regions. La validation de la spécificité a été réalisée par des essais expérimentaux et l'analyse BLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast). 4 Composition RealCycler CAND inclut le mélange de réaction AmpliMix dans des tubes d'amplification et un Contrôle Positif ADN C. albicans. 8 Echantillons cliniques Tous les réactifs sont prêts à être utilisés sans avoir à ajouter ou reconstituer aucun composant. Composant Nombre Volume AmpliMix 24 18,5 µL Contrôle Positif 1 60 µL - Récolter les échantillons dans des tubes stériles. - Stocker-les et transporter-les congelés à -20 °C jusqu'à utilisation. 9 Procédure a) Purification des acides nucléiques L'ADN doit être purifié à partir d'échantillons cliniques utilisant une procédure appropriée. Il existe sur le marché de nombreux systèmes de purification d'acides nucléiques. Veuillez réaliser la procédure de purification en suivant les instructions recommandés par le fabricant et a partir du volume d’echantillon recommandé. 1 2 Ce kit a été validé en utilisant les systèmes de purification suivant: e) Example de résultat ● Maxwell® 16 Cell LEV DNA Purification Kit (référence AS1140). Promega Corporation. ● QIAamp DNA Blood Mini Kit (références 51104, 51106). QIAGEN. Ce kit peut être utilisé en combinaison avec les systèmes de purification suivants: ● BioRobot EZ1.QIAGEN. ● QIAcube. QIAGEN. ● NucliSENS® easyMAG®. bioMérieux. b) Protocole Programme le protocole d'amplification “CAND” selon les spécifications suivantes: Graphique 1 (Chaîne FAM: Candida sp.): Résultat obtenu en amplifiant un contrôle négatif et un contrôle positif. Contrôle négatif (A7 en bleu): absence de signal. Contrôle positif (A8 en gris): on observe un signal avec Ct=29,64. c) Préparation de la réaction - Décongeler les tubes AmpliMix nécessaires pour l'amplification des échantillons et le Contrôle positif. - Ajouter 9 µL de l'ADN de chaque échantillon ou contrôle à chaque tube. - Centrifuger les tubes pour que la réaction aille dans la zone optique du tube. Vérifier qu'il ne se forme pas de bulles dans la-dite zone. - Mettre les tubes dans l’appareil. - Create run > Dye set > FATA25. - Add/Remove Sites: assigner le protocole “CAND” aux positions correspondantes aux échantillons et aux contrôles. - Start Run: mettre en marche le programme d'amplification. Graphique 2 (Chaîne Alx532: contrôle interne): Résultat obtenu en amplifiant un contrôle négatif et un contrôle positif. Contrôle négatif (A7 en bleu): on observe un signal avec Ct=32,41. Contrôle positif (A8 en gris): on observe un signal avec Ct=32,44. d) Interprétation des résultats Afin de valider les résultats, les valeurs Ct obtenues lors du contrôle positif et des contrôles internes doivent être dans les rangs spécificités dans l'étiquette interne du kit. Interpréter le résultat obtenu sur chaque échantillon par rapport à la combinaison des signaux indiqué dans le tableau suivant: FAM Std/Res Canaux Alx532 Std/Res Alx532 Ct POS Indifférent Indifférent POSITIF Candida sp. NEG POS Ct dans les limites NE SE DÉTECTE PAS NEG POS Ct hors des limites INVALIDE NEG NEG 0,00 INVALIDE 10 Contrôle de qualité Chaque lot du kit RealCycler CAND a été testé selon les spécifications de la PCR en temps réel en utilisant l’appareil SmartCycler® (Cepheid®). Interprétation Date de publication: Juillet, 2013. 3 4