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UNIVERSITÉ DE NANTES
UFR DE MÉDECINE
________________
ÉCOLE DOCTORALE BIOLOGIE-SANTÉ
Année 2013
N° attribué par la bibliothèque
2 2
Etude du système bêta-adrénergique dans deux
modèles d’insuffisance cardiaque : la
cardiomyopathie du choc septique et l’insuffisance
cardiaque à fraction d’éjection préservée
________
THÈSE DE DOCTORAT
Discipline : Biologie
Spécialité : Physiologie et Physiopathologie Cardiovasculaire
Présentée
et soutenue publiquement par
David ROUL
Le 28 octobre 2013, devant le jury ci-dessous
Président
M. LETOURNEAU Thierry, PU-PH  Université de Nantes
Rapporteurs
M. MULDER Paul, PU  Université de Rouen
M. VANDECASTEELE Grégoire, DR2  Université Paris Sud
Examinateurs
M. GHALEH-MARZBAN Bijan, PU-PH  Université Paris Est Créteil
Directeurs de thèse
Mme GAUTHIER Chantal, PU  Université de Nantes
M. ROZEC Bertrand, PH  Université de Nantes
Ithaka
As you set out for Ithaka
hope your road is a long one,
full of adventure, full of discovery.
Laistrygonians, Cyclops,
angry Poseidon - don't be afraid of them:
you'll never find things like that one on your way
as long as you keep your thoughts raised high,
as long as a rare excitement
stirs your spirit and your body.
Laistrygonians, Cyclops,
wild Poseidon - you won't encounter them
unless you bring them along inside your soul,
unless your soul sets them up in front of you.
Hope your road is a long one.
May there be many summer mornings when,
with what pleasure, what joy,
you enter harbours you're seeing for the first time;
may you stop at Phoenician trading stations
to buy fine things,
mother of pearl and coral, amber and ebony,
sensual perfumes of every kind as many sensual perfumes as you can;
and may you visit many Egyptian cities
to learn and go on learning from their scholars.
Keep Ithaka always in your mind.
Arriving there is what you're destined for.
But don't hurry the journey at all.
Better if it lasts for years,
so you're old by the time you reach the island,
wealthy with all you've gained on the way,
not expecting Ithaka to make you rich.
Ithaka gave you the marvellous journey.
Without her you wouldn't have set out.
She has nothing left to give you now.
And if you find her poor, Ithaka won't have fooled you.
Wise as you will have become, so full of experience,
you'll have understood by then what these Ithakas mean
Constantine P. Cavafy
REMERCIEMENTS
Je tiens tout d’abord à remercier Chantal Gauthier qui m’a accueillie dans son équipe dès la L3 et
qui m’a encadré tout au long de mon master ainsi que de ma thèse. Je la remercie pour la confiance qu’elle
m’a accordé tout ce temps aussi bien au laboratoire que lors de mes enseignements à la faculté des Sciences.
Je lui suis très reconnaissant de m’avoir permis de partir à de nombreuses reprises en congrès et d’avoir
toujours compris et supporté mes choix professionnels comme personnels. Je la remercie enfin d’avoir passé
du temps à corrigé ce manuscrit (encore désolé pour les fautes d’orthographes).
Je tiens également à remercier Bertrand Rozec qui aura également été présent dès la L3. Merci pour
tout l’aide qu’il m’aura apporté pendant ces années. Merci pour son soutien dans les moments plus difficiles.
Merci pour sa disponibilité même lors de lendemains de garde compliqués. Merci d’avoir emprunté du
matériel à l’hopital afin de me faciliter la vie au laboratoire. Merci également pour ses conseils toujours
pertinents et pour sa patience. Merci enfin pour le temps passé à la relecture de ce travail.
Je remercie Hervé Le Marec et Pierre Pacaud de m’avoir permis de réaliser ma thèse au sein de
l’institut du thorax.
Je remercie Paul Mulder et Grégoire Vandecasteele d’avoir accepté d’être rapporteurs de mon
mémoire de thèse. Je les remercie d’avoir relu ce manuscrit dans des délais très courts et m’en excuse encore.
Je remercie Bijan Ghaleh et Thierry Le Tourneau d’avoir accepté de faire partie de mon jury de
thèse. Egalement un grand merci à eux deux d’avoir accepté de suivre l’avancée de mes recherches lors de mes
deux comités de suivi de thèse. Merci pour les conseils et encouragements lors de ces comités.
J’adresse un remerciement tout particulier à Ben qui aura été de grands conseils et soutiens au cours
des deux dernières années que ce soit au laboratoire, en enseignement ou dans la gestion de mon projet
professionnel. Merci de m’avoir permis de participer à de nombreux congrès et de rentabiliser au maximum
ces derniers. Merci pour ta disponibilité et ta bonne humeur quotidienne. Merci enfin de m’avoir appris la
technique du cœur travaillant. Je suis d’accord avec toi c’est quand même autre chose que de la bioch.
Je remercie très chaleureusement Mortéza et Amadandine pour leur grande implication dans les
projets menés au cours de cette thèse. Merci pour votre disponibilité ainsi que votre rigueur technique
indispensable. Désolé Amandine pour les semaines parfois surchargées que j’ai pu t’imposer par une gestion
des reproductions parfois hasardeuse.
i
Un grand merci à Nolwenn qui aura été là dès la licence. Merci pour ton aide et tes conseils plus
que nécessaire aussi bien au laboratoire qu’en enseignement. Merci pour tous les bons moments passés avec
toi au laboratoire comme en dehors. Je te souhaite toute la réussite que tu mérites dans ta carrière
professionnelle.
Je tiens à remercier et à féliciter le néo cardiologue Damien qui aura été un collègue très précieux
pendant les 6 mois de son M2. Merci pour ta bonne humeur et pour ton aide indispensable au
développement des lignées et au lancement des élevages de rats transgéniques. Quand tu veux pour une
revanche au poker.
Je remercie l’ensemble des membres, anciens et actuels, de l’équipe β3-AR : Sophie, Angélique, Julie,
Boris, Emmanuel, Emilie, Murielle, Sabine, Thuy …
Un merci plus particulier à Vridginie pour sa bonne humeur communicative (merci aussi à Nathalie
pour ça) et pour son aide précieuse en TP. N’oublie pas la danse du fragment d’intestin et la chanson d’Alice
ça glisse puisque tu insistes. Salut Paoutrone !!
Je remercie Valentine et Marine pour les bons moments partagés. Je leur souhaite tout le courage et
la réussite qu’elles méritent pour la suite bien que je ne me fasse pas trop de soucis pour elles. Occupez vous
bien des petits rats !!
Un grand merci aux secrétaires anciennes et actuelles et surtout à Corinne, pour leurs précieuses
aides dans la paperasse administrative. Désolé d’avoir oublié de trop nombreuses fois de te ramener les bons
de commandes. Merci également à Aurélie pour l’énorme réserve de bonbons du mois d’Aout qui aura rendu
la rédaction un peu moins laborieuse.
Je remercie l’ensemble du personnel de l’UTE, et plus particulièrement Stéphanie Lemarchand, pour
le soin apporté aux animaux ainsi que pour leur gentillesse.
Merci beaucoup à Severine Menoret pour sa patience, sa pédagogie et sa disponibilité dans la
génération des lignées de rats trasngéniques.
Merci à l’ensemble des collègues enseignants qui n’ont pas été précedemment cités : Patrick, Angéla,
Michael, Xavier. Un merci plus particulier aux autres doctorants moniteurs Delphine, Fayal et Fabien.
Merci Delphine d’avoir été une collègue toujours de bonne humeur. On a une revanche à la belote à prendre
avec Ben (ou l’inverse je ne me souviens plus trop). Merci Fayal pour ton non stress assez contagieux. Merci
Fabien pour l’ensemble de ton œuvre que je ne détaillerai pas ici par manque de place et de temps.
ii
Merci aux thésards actuels et passés que j’ai eu la chance de rencontré au cours de ces années:
Jérôme (grand merci pour la formation à l’histo et à filemaker), Damien, Yassine, Lucile, … et plus
particulièrement aux thésards de 3ème année : Fayal, Vincent (« Hey les filles je vous ramène »), JMB, Njaka
et Malorie. Un grand merci à Gwennan et Gigia avec qui j’aurai vécu en quasi colocation durant ces 4
derniers mois. Merci d’avoir partagé ces moments aussi bien joyeux que déprimants. Merci Gigia pour ton
accent et pour m’avoir fait sourire dès l’évocation de tes 22 ans. Merci Gwennan pour ton italien naturel
qui m’aura beaucoup fait rire. Merci pour les bons moments passés à LA West Coast avec ton chef qui est
un enfant dans un magasin de bonbons lorsqu’on le laisse tout seul dans un Apple Store. Merci également
d’avoir partagé avant même le début de cette thèse le stress des bourses et notamment l’oral du GRRC.
Super visite du Quai Branly. Félicitation par avance à vous deux.
Merci à tous les potes : Jojo, RB, Corky, Léo, Hélène(s) B et R, la Blonde, Chiron, Toff, Marion,
ChaudaPierre, Quentin, Rémoche, Mathilde, Tiphaine, aux potes de la bug et plus particulièrement à la
colline : Alan, Jyff, Romain, Yannick et Géraldine (et Léo), Steven, Gaëlle, Nibur et Anthony. Vous
m’aurez permis de penser à autre chose qu’au labo durant ces 4 dernières années. Merci également à
Gandalff et Macaron. Vous me faites quand même bien marrer et ce n’était pas du luxe ces 4 derniers mois.
Egalement un grand merci à Thérèse, Paul, Virgine et Hughes, Gwenn et Ju, Alan, Audrey et
Clara. Merci pour votre soutient et d’avoir fait de ce 24 Aout un jour très spécial. Merci Gwenn (ma guide
touristique préférée) et Ju pour ces vacances de folie à l’autre bout du monde. A bientôt j’espère autour
d’une petite manta.
Enfin, je tiens à dire un grand merci à ma famille. Mes parents tout d’abord qui m’auront laissé
choisir ma voie sans jamais ne s’y opposer. Merci également à Manu et Catherine, Anne-So, Benoît, Zélie et
Nino, Cécile, Xavier, Marceau et Eloi et Samuel et Noémie. Merci à tous pour vos encouragements et votre
soutien. Concernant le concours des fautes d’orthographes la bouteille revient aux parents. Encore merci.
Pour finir merci du fond du cœur à Chloé qui aura été là depuis le début. Merci d’avoir toujours cru
en moi et d’avoir accepté cette situation pas toujours facile pour toi. Merci d’avoir pris soin de moi ces
derniers mois. Merci enfin d’accepter de me suivre les yeux fermés peu importe où l’avenir va nous mener.
Merci à tous
iii
AVANT-PROPOS
Mon intérêt pour la recherche biomédicale et notamment la recherche dans le domaine
cardiovasculaire remonte à mon 1er stage en laboratoire effectué au sein de l‟équipe du
professeur Chantal Gauthier, anciennement située au 4ème et 5ème étages de la faculté de
médecine. Au cours de ce stage volontaire, réalisé durant ma troisième année de licence, j‟ai
eu l‟opportunité de découvrir non seulement un ensemble de techniques en rapport avec la
physiologie cardiovasculaire (échocardiographie, Langendorff, ligature coronaire gauche,
boucles pression-volume, cuves à organes isolés, …) mais également de découvrir
l‟organisation et le fonctionnement d‟un laboratoire de recherche avec ses diverses
composantes professionnelles et institutionnelles. J‟ai également eu la chance au cours de ce
stage de me familiariser plus particulièrement avec la technique des anneaux d‟aorte en cuves
à organes isolés ainsi qu‟avec la contention des rongeurs de laboratoires.
L‟intérêt de l‟équipe de Chantal Gauthier, au sein de l‟institut du thorax, est de mieux
comprendre la régulation adrénergique des fonctions cardiaques et vasculaires. Jusqu‟au
milieu des années 1990, seuls deux sous-types de récepteurs β-adrénergiques (β-AR) avaient
été caractérisés dans le myocarde humain : les récepteurs β1- et β2-AR. En 1996, l‟équipe de
Chantal Gauthier montre que le récepteur β3-AR est présent et fonctionnel dans le myocarde
humain et que sa stimulation induit, de façon surprenante, une diminution de la contractilité
via la voie du monoxyde d‟azote. Cette découverte a été le point de départ d‟études
physiologiques et physiopathologiques. L‟arrivée au sein de l‟équipe en 1999 de Bertrand
Rozec, anesthésiste réanimateur, a orienté une partie des recherches de l‟équipe vers l‟étude
du système β-AR dans la pathologie du choc septique.
C‟est au sein de ce projet que mes travaux de stages de première et deuxième année de
master ont été menés. La conduite de ces deux projets, respectivement nommés, "Effets du
Nébivolol sur la dysfonction endothéliale au cours du choc endotoxémique" et "Effets
cardiovasculaire du remplissage par hydroxyéthylamidons associé ou non à un agoniste β-AR
dans le traitement du choc endotoxémique chez le rat" a continué d‟accroitre mon intérêt pour
le monde de la recherche me décidant alors à réaliser une thèse.
L‟objectif premier de ma thèse aura été la caractérisation d‟un modèle de rat
transgénique surexprimant le récepteur β3-AR humain à la membrane des cellules
endothéliale. Une première caractérisation de ce modèle réalisée par le cardiologue Nicolas
iv
Piriou lors de son stage de M2 avait permis de mettre en évidence l‟apparition avec l‟âge chez
ces animaux d‟un phénotype pathologique proche de l‟insuffisance cardiaque à fraction
d‟éjection préservée. L‟objectif était à l‟origine de finir la caractérisation de ce modèle,
d‟évaluer le remodelage du système β-AR dans ce dernier et de le soumettre par la suite à
divers stress (tachycardie, augmentation de la précharge, …) afin d‟évaluer sa pertinence.
Malheureusement, le déménagement du laboratoire vers l‟IRS-UN à l‟été 2009 aura conduit à
un retard d‟environ 2 ans et demi sur ce projet après divers problèmes d‟animalerie et de
maintien des lignées. La caractérisation de ce modèle est à l‟heure actuelle en cours de
finalisation et a notamment permis l‟obtention en juin 2013 d‟une Allocation Nationale de
Recherche de 4 ans sur ce projet. Ce projet m‟aura notamment permis d‟apprendre la gestion
d‟un élevage transgénique avec toutes les difficultés que cela comporte (problèmes de
reproduction, de mosaïsme des lignées développées ou encore de coût) et d‟appréhender la
technique des boucles pression-volume ainsi que les bases de l‟histologie.
Dans ce contexte indépendant de notre volonté, ma thèse s‟est alors focalisée sur un
second objectif qui aura été d‟évaluer le remodelage du système β-AR au niveau vasculaire
puis cardiaque dans la pathologie du choc septique. Ces travaux m‟auront permis
d‟appréhender de nombreuses techniques de physiologie dont la contractilité des muscles
papillaires ou le cœur isolé perfusé en mode travaillant, pour lequel j‟ai participé à la mise en
place au laboratoire sous la supervision de Benjamin Lauzier. L‟ensemble de ces travaux sur
le choc septique font l‟objet de 2 articles en soumission et en rédaction qui sont présentés
dans la partie 4.1 de ce manuscrit "Remodelage β-adrénergique cardiovasculaire au cours du
choc endotoxémique chez le rat".
En parallèle de mon travail de recherche au sein de l‟équipe de Chantal Gauthier, j‟ai
eu l‟opportunité de réaliser des enseignements au sein du service de physiologie animale du
département de physiologie de la Faculté des Sciences et Techniques de Nantes. Ces
enseignements ont consisté en l‟encadrement de travaux pratiques d‟étudiants en deuxième et
en troisième années de licence. Cela m‟aura permis, en plus de développer un grand intérêt
pour l‟enseignement, d‟expérimenter les difficultés que peut rencontrer le monde universitaire
français par un manque de moyens, de reconnaissance ou encore d‟effectifs. En cela, je tiens
donc à féliciter l‟ensemble des collègues enseignants avec qui j‟ai eu la chance d‟interagir et
qui, avec les moyens qui leurs sont donnés, proposent un enseignement d‟une grande qualité.
v
TABLE DES MATIÈRES
REMERCIEMENTS ............................................................................. i
TABLE DES MATIÈRES ................................................................... vi
LISTE DES ABRÉVIATIONS ............................................................ x
LISTE DES FIGURES...................................................................... xiv
LISTE DES TABLEAUX .................................................................. xvi
I-INTRODUCTION ............................................................................ 1
1.1. Physiologie cardiovasculaire .................................................................... 2
1.1.1. Physiologie cardiaque ............................................................................................ 2
1.1.1.1. Structure cardiaque ............................................................................................ 2
1.1.1.2. Structure du cardiomyocyte .............................................................................. 2
1.1.1.3. Contraction cardiaque ....................................................................................... 5
a- Mécanisme du couplage excitation-contraction ..................................................... 6
b- Diminution de la concentration intracellulaire en calcium .................................... 8
c- Relation force-fréquence ........................................................................................ 8
1.1.1.4. Cycle cardiaque ................................................................................................. 8
1.1.2. Physiologie vasculaire .......................................................................................... 10
1.1.2.1. Contraction des cellules musculaires lisses ..................................................... 10
1.1.2.2. Relaxation des cellules musculaires lisses ...................................................... 12
1.2. Régulation de la fonction cardiovasculaire .......................................... 14
1.2.1. Les nucléotides cycliques ..................................................................................... 14
1.2.1.1. Adénosine monophosphate cyclique ............................................................... 14
1.2.1.2. Guanosine monophosphate cyclique ............................................................... 15
1.2.1.3. Compartimentalisation des nucléotides cycliques ........................................... 16
a- Au niveau cardiaque ............................................................................................. 17
b- Au niveau vasculaire ............................................................................................ 17
1.2.2. Le système β-adrénergique .................................................................................. 18
1.2.2.1. Structure des récepteurs β-adrénergiques ........................................................ 18
1.2.2.2. Pharmacologie des récepteurs β-adrénergiques .............................................. 20
1.2.2.3. Désensibilisation des récepteurs β-AR ............................................................ 22
1.2.2.3. Régulation β-AR de la fonction cardiaque ...................................................... 23
a- Voies de signalisation et effets cardiaques du récepteur β1-AR .......................... 23
b- Voies de signalisation et effets cardiaques du récepteur β2-AR .......................... 28
c- Voies de signalisation et effets cardiaques du récepteur β3-AR .......................... 29
1.2.2.4. Régulation de la vasomotricité ........................................................................ 29
a- Voies de signalisation et effets vasculaires des récepteurs β1- et β2-AR ............. 30
b- Voies de signalisation et effets vasculaires des récepteurs β3-AR ....................... 31
1.2.3. Régulation endothéliale de la fonction cardiaque ............................................. 33
1.2.3.1. Le NO .............................................................................................................. 35
1.2.3.2. L‟endothéline .................................................................................................. 36
1.2.3.3. Les eicosanoïdes .............................................................................................. 37
1.3. Choc Septique .......................................................................................... 41
1.3.1. Définitions ............................................................................................................. 41
1.3.2. Epidémiologie ....................................................................................................... 42
1.3.3. Physiopathologie ................................................................................................... 43
1.3.4. Modèles expérimentaux de choc septique .......................................................... 45
vi
1.3.4.1. Modèles d‟endotoxémie .................................................................................. 46
1.3.4.2. Perfusion intraveineuse de bactéries ............................................................... 47
1.3.4.3. Modèles de péritonites .................................................................................... 47
1.3.5. Altérations cardiovasculaires au cours du choc septique ................................. 47
1.3.5.1. Dysfonction cardiaque..................................................................................... 47
a- Mécanismes extracellulaires ................................................................................ 48
Ischémie myocardique globale ............................................................................. 48
Facteurs circulants dépresseurs ............................................................................ 48
b- Mécanismes cellulaires ........................................................................................ 49
Transport du calcium et myofilaments ................................................................. 49
Monoxyde d‟azote et peroxynitrite ...................................................................... 50
Apoptose............................................................................................................... 51
Récepteurs β-adrénergiques ................................................................................. 51
1.3.5.2. Dysfonction vasculaire .................................................................................... 52
a- Hyporéactivité vasculaire ..................................................................................... 53
b- Dysfonction endothéliale ..................................................................................... 54
c- Altérations de la microcirculation ........................................................................ 54
d- Récepteurs β-adrénergiques ................................................................................. 55
1.3.6. Traitements du choc septique.............................................................................. 56
1.4. Insuffisance cardiaque à fraction d’éjection préservée ...................... 58
1.4.1. Définitions ............................................................................................................. 58
1.4.2. Epidémiologie ....................................................................................................... 58
1.4.3. Physiopathologie ................................................................................................... 59
1.4.3.1. Hypertrophie ventriculaire .............................................................................. 59
1.4.3.2. Dysfonction diastolique................................................................................... 60
a-Matrice extracellulaire .......................................................................................... 60
b-Cardiomyocytes .................................................................................................... 61
1.4.3.3. Dysfonction systolique .................................................................................... 62
1.4.3.4. Couplage ventriculo-artériel et dysfonction vasculaire ................................... 62
1.4.3.5. Altérations des réserves cardiaques et insuffisance chronotrope .................... 64
1.4.3.6. Nouveau paradigme de l‟ICFEp ...................................................................... 65
1.4.4. Traitements de l’ICFEp ....................................................................................... 66
1.4.4.1. Traitements conventionnels............................................................................. 66
1.4.4.2. Traitements émergents .................................................................................... 67
1.4.5. Modèles expérimentaux d’ICFEp ....................................................................... 69
1.4.5.1. Modèles de rats................................................................................................ 70
a- Rat Dahl/Salt sensitive ......................................................................................... 70
b- Ratte mRen2.Lewis .............................................................................................. 71
c- Rat ZSF1 obèse .................................................................................................... 71
d- Modèle de constriction aortique ........................................................................... 72
1.4.5.2. Modèle de souris ............................................................................................. 73
a- Modèle de constriction aortique ........................................................................... 73
b- Souris DOCA/Salt ................................................................................................ 73
c- Souris SAM .......................................................................................................... 73
1.4.5.3. Modèles de gros animaux ................................................................................ 74
a- Chien hypertendu ................................................................................................. 74
b- Porc hypertendu ................................................................................................... 74
II-OBJECTIFS DE LA THÈSE ....................................................... 76
III-MATÉRIEL ET MÉTHODES ................................................... 79
vii
3.1. Modèles animaux .................................................................................... 80
3.1.1. Induction du choc endotoxémique ...................................................................... 80
3.1.2. Modèle de rat transgénique ................................................................................. 80
3.1.3. Ovariectomie ......................................................................................................... 81
3.2. Biochimie ................................................................................................. 83
3.2.1. Dissection et prélèvements ................................................................................... 83
3.2.1.1. Le Sang ............................................................................................................ 83
3.2.1.2. Le cœur et l‟aorte thoracique........................................................................... 83
3.2.2. Biochimie sanguine ............................................................................................... 83
3.2.3. Western Blot ......................................................................................................... 84
3.2.4. Etudes de binding ................................................................................................. 85
3.3. Histologie ................................................................................................. 90
3.4. Etudes fonctionnelles ex vivo ................................................................. 92
3.4.1. Substances pharmacologiques ............................................................................. 92
3.4.2. Etude de la réactivité vasculaire ......................................................................... 93
3.4.2.1. Aorte thoracique .............................................................................................. 93
3.4.2.3. Système vasculaire rénal ................................................................................. 95
3.4.2.4. Protocoles pharmacologiques .......................................................................... 95
3.4.3. Etude de la contractilité du muscle papillaires .................................................. 98
3.5. Etudes fonctionnelles in vivo ................................................................ 101
3.5.1. Echocardiographie-Doppler .............................................................................. 101
3.5.2. Mesure des pressions artérielles ........................................................................ 104
3.5.3. Mesure des boucles pressions-volumes ............................................................. 106
IV-RÉSULTATS ET DISCUSSIONS ............................................. 109
4.1. Remodelage β-adrénergique cardiovasculaire au cours du choc
endotoxémique chez le rat et rôle de l’endothelium dans les réponses
β­adrénergiques............................................................................................ 110
4.1.1. Introduction ........................................................................................................ 110
4.1.2. Article : Augmentation de la réponse β2-adrénergique vasculaire à la phase
précoce du choc endotoxémique chez le rat. .............................................................. 113
4.1.3. Article : Implication des cyclooxygénases dans la potentialisation de la
contractilité β1-adrénergique cardiaque à la phase précoce du choc endotoxémique
chez le rat. ..................................................................................................................... 138
4.1.4. Conclusion générale ........................................................................................... 168
4.2. Caractérisation d’un nouveau modèle d’insuffisance cardiaque à
fraction d’éjection préservée....................................................................... 174
4.2.1. Introduction ........................................................................................................ 174
4.2.2. Résultats .............................................................................................................. 175
4.2.2.1. Caractérisation morphologique ..................................................................... 175
4.2.2.2. Caractérisation morphométrique ................................................................... 176
4.2.2.3. Caractérisation hémodynamique ................................................................... 177
4.2.2.4. Caractérisation histologique .......................................................................... 178
4.2.2.5. Etude préliminaire de l‟influence des hormones sexuelles ........................... 179
4.2.3. Discussion ............................................................................................................ 181
V-CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES GÉNÉRALES .......... 186
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUE ........................................ 193
ANNEXE: Monitorat ........................................................................ 228
viii
Initiation à la pharmacologie – Deuxième année de licence ........ 228
Physiologie animale intégrée – Troisième année de licence ......... 230
ix
LISTE DES ABRÉVIATIONS
A
AA
AC
ACh
ADP
Adr
αi
AKAP
Akt
AMPc
AP-1
αs
ATP
acide arachidonique
adénylate cyclase
acétylcholine
adénosine diphosphate
adrénaline
sous unité alpha inhibitrice
A-kinase anchoring protein
protéine Akt
3‟,5‟-adénosine monophosphate cyclique
activator protein type 1
sous unité alpha stimulatrice
adénosine triphosphate
β-AR
β-Arr
Bcl-X2
BH4
récepteurs β-adrénergique
β-arrestine
Bcl-2 related gene X, long isoform
tetrahydrobioptérine
Ca2+
[Ca2+]i
CaM
CaMKII
canaux KATP
CEC
CICR
CML
COX
cPLA2
C-ter
ion calcium
concentration calcique intracellulaire
calmoduline
protéine kinase dépendante du complexe calcium/calmoduline
canaux potassiques dépendants de l‟adénosine triphosphate
couplage excitation-contraction
calcium induced-calcium released
cellule musculaire lisse
cyclooxygénase
phospholipase A2 cytosolique
extrémité carboxy-terminale
DAG
DP
diacylglycérol
récepteur aux prostaglandines de type D
E
Ea
ECC
EDHF
EE
Ees
eNOS
EP
boucle extracellulaire
élastance artérielle
endothélium des capillaires coronaires
endothelium derived hyperpolarizing factor
endothélium endocardique
élastance en fin de systole
synthase endothéliale de monoxyde d‟azote
récepteur aux prostaglandines de type E
B
C
D
E
x
Epac
Erk
ET
protéine d‟échange activée par l‟AMPc
extracellular signal regulated kinase
endothéline
FC
FE
FP
Fpassive
fréquence cardiaque
fraction d‟éjection
récepteur aux prostaglandines de type F
tension passive du myocarde
GCm/s
Gi
GMPc
Gq
GRK
Gs
GSK3β
guanylate cyclase membranaire/soluble
protéine G inhibitrice
3‟,5‟-guanosine monophosphate cyclique
protéine Gq
kinase des récepteurs couplés aux protéines G
protéine G stimulatrice
glycogène synthase kinase-3β
H+
HDAC4
proton
histone désacétylase de type 4
I
IC
ICFEa/p
ICa,L
IL
IP
IP3
IP3R
iNOS
boucle intracellulaire
insuffisance cardiaque
insuffisance cardiaque à fraction d‟éjection altérée/préservée
courant calcique de type L
interleukine
récepteur aux prostacyclines
inositol triphosphate
récepteur à l‟inositol triphosphate
synthase inductible de monoxyde d‟azote
K+
ion potassium
LBP
LPS
lipopolysaccharide binding protein
lipopolysaccharide
MEF2
MLC20
MLCK
MLCP
MYPT1
myocyte enhancer factor 2
chaîne légère de la myosine de 20 kDa
kinase des chaînes légères de la myosine
phosphatase des chaînes légères de la myosine
myosine phosphatase target subunit 1
NA
Na+
NCX
noradrénaline
ion sodium
échangeur sodium/calcium
F
G
H
I
K
L
M
N
xi
NF-κB
nNOS
NO
NOS
Nuclear Factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells
synthase neuronale de monoxyde d‟azote
monoxyde d‟azote
synthase de monoxyde d‟azote
OD
OG
oreillette droite
oreillette gauche
PA
PAD
PAM
PAMP
PAS
PE
PDE
PGD/E/F/G/H
PGI2
PI3K
PIP2
PKA
PKC
PKG
PLC
PLB
PP1
PP2A
PVG
potentiel d‟action
pression artérielle diastolique
pression artérielle moyenne
pathogen associated molecular pattern
pression artérielle systolique
phényléphrine
phosphodiestérase
prostaglandines de type D/E/F/G/H
prostacycline
phosphatidylinositol-3-kinase
phosphatidylinositol-4,5-biphosphate
protéine kinase A
protéine kinase C
protéine kinase G
phospholipase C
phospholamban
protéine phosphatase 1
protéine phosphatase 2A
pression intraventriculaire gauche
Rac1
RCPG
RhoA
RS
RYR
Ras related C3 botulinum toxin substrat 1
récepteurs à sept domaines transmembranaires couplés aux protéines G
Ras homolog type A
réticulum sarcoplasmique
récepteur à la ryanodine
SERCA
SIRS
sarco/endoplasmic reticulum calcium-adenosine triphosphatase
systemic inflammatory response syndrom
TLR
TM
Tn
TNF-α
TP
tubules T
TxA2
Toll-like receptor
domaine transmembranaire
troponine
tumor necrosis factor- α
récepteur aux tromboxanes
tubules transverses
tromboxane A2
O
P
R
S
T
xii
V
VD
VG
ventricule droit
ventricule gauche/ventriculaire gauche
xiii
LISTE DES FIGURES
Figure 1. Anatomie cardiaque en coupe frontale. .............................................................................. 2
Figure 2. Ultrastructure d’un cardiomyocyte. .................................................................................... 3
Figure 3. Représentation schématique du sarcomère et des myofilaments. ..................................... 4
Figure 4. Evolution de la tension passive du myocarde en fonction du ratio entre les isoformes de
la titine ainsi que de leur régulation à court terme. ........................................................................... 5
Figure 5. Couplage excitation-contraction. ......................................................................................... 7
Figure 6. Représentation schématique du mécanisme de contraction. ............................................. 8
Figure 7. Diagramme de Wigger (A) et boucle Pression-Volume (B) du ventricule gauche. ......... 9
Figure 8. Représentation schématique de l’organisation structurelle d’une artère. ..................... 10
Figure 9. Signalisation intracellulaire de la contraction des cellules musculaires lisses
vasculaires. ........................................................................................................................................... 11
Figure 10. Mécanisme d’hydrolyse des nucléotides cycliques par les phosphodiestérases. .......... 16
Figure 11. Structure primaire (A) et tertiaire (B) du récepteur β3-adrénergique. ........................ 20
Figure 12. Voies de signalisations β-adrénergiques cardiaques. ..................................................... 26
Figure 13. Voies de signalisation β-adrénergiques vasculaires. ...................................................... 32
Figure 14. Effet de la désendothélialisation au Triton X-100 sur la contractilité du muscle
papillaire de chat. ................................................................................................................................ 34
Figure 15. Voies de signalisation des récepteurs à l’endothéline au niveau du cardiomyocyte.... 37
Figure 16. Voies de synthèse des prostanoïdes. ................................................................................. 38
Figure 17. Shunt fonctionnel observé au cours du choc septique dans une unité
microcirculatoire. ................................................................................................................................ 55
Figure 18. Nombre d’amission de patients en insuffisance cardiaque au cours des années. ........ 59
Figure 19. Altérations du couplage NOS-BH4 suite à un stress oxydatif.. ...................................... 62
Figure 20. Altérations hémodynamiques du patient présentant une insuffisance cardiaque à
fraction d’éjection préservée (ICFEp) ............................................................................................... 63
Figure 21. Altérations des réserves cardiaques chez le patient ICFEp .......................................... 64
Figure 22. Nouveau paradigme de l’insuffisance cardiaque à fraction d’éjection préservée. ...... 66
Figure 23. Effets des β-bloquants sur la survie des insuffisants cardiaques. ................................. 67
Figure 24. Réaction en chaîne par polymérase après transcription inverse (RT) des transcrits
codant pour la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) et le récepteur β3adrénergique humain (hβ3-AR) au niveau de l’aorte thoracique, du cœur entier et de
cardiomyocytes isolés de rats transgéniques (Tgβ3) et sauvages (WT). .......................................... 81
Figure 25. Schéma théorique d’une courbe de saturation obtenue par la technique d’étude des
liaisons spécifiques ligand-récepteur. ................................................................................................ 86
xiv
Figure 26. Schéma théorique d’une courbe de compétition obtenue par la technique d’étude des
liaisons spécifiques ligand-récepteur, modèle à deux sites de fixation............................................ 87
Figure 27. Représentation schématique d’un ensemble de 4 cuves à organes isolés (EMKA
Technologies)........................................................................................................................................ 94
Figure 28. Représentation schématique d’un anneau d’artère mésentérique monté sur le capteur
de tension (DMT). ................................................................................................................................ 95
Figure 29. Représentation schématique de la cuve expérimentale.................................................. 98
Figure 30. Analyse de la déformation myocardique par le strain bidimensionnel. ..................... 104
Figure 31. Effets du choc endotoxémique sur la fonction endothéliale (A) et musculaire lisse (B)
évaluées au niveau d’aorte thoraciques. .......................................................................................... 168
Figure 32. Quantification de la fibrose dans le ventricule gauche des rats sauvage et
transgéniques (Tgβ3) de la lignée F20. ............................................................................................. 179
Figure 33. Effets du choc endotoxémique sur la fonction vasorelaxation dépendante des
adénylates cyclase .............................................................................................................................. 189
xv
LISTE DES TABLEAUX
Tableau I. Familles et isoformes de phosphodiestérases (PDE) exprimées au niveau cardiaque 17
Tableau II. Caractéristiques des récepteurs β1-, β2- et β3-adrénergiques humains. ...................... 18
Tableau III. Affinité relative pour l’isoprénaline, l’adrénaline et la noradrénaline pour chacun
des sous-types de récepteurs β-adrénergiques. ................................................................................. 21
Tableau IV. Liste non exhaustive d’agonistes et d’antagonistes des récepteurs β­adrénergiques 21
Tableau V. Différences entre endothélium endocardique (EE) et endothélium des capillaires
coronaires (ECC) ................................................................................................................................. 34
Tableau VI. Les récepteurs aux prostanoïdes au niveau cardiaque ............................................... 39
Tableau VII. Définition et classification des différents stades du choc septique ........................... 41
Tableau VIII : Modèles animaux de choc septique .......................................................................... 46
Tableau IX. Comparaison des différents modèles animaux d’insuffisance cardiaque à fraction
d’éjection préservée (ICFEp) avec la pathologie humaine .............................................................. 70
Tableau X. Spécificité relative à chaque protocole de Western blot............................................... 85
Tableau XI. Protocole d’inclusion en paraffine des cœurs de rat ................................................... 90
Tableau XII. Protocole de coloration des coupes de cœurs de rat .................................................. 91
Tableau XIII. Liste exhaustive des substances pharmacologiques utilisées dans les études
présentées dans ce manuscrit. ............................................................................................................ 92
Tableau XIV. Agents contractants et Δ de précontraction pour tous les modèles étudiés ........... 96
Tableau XV. Protocoles des courbes concentrations-réponses (C-R) réalisées pour les études de
réactivité vasculaire. ............................................................................................................................ 97
Tableau XVI. Protocoles des courbes concentrations-réponses réalisées pour la technique de
contractilité du muscle papillaire. .................................................................................................... 100
Tableau XVII. Paramètres évalués lors des mesures hémodynamiques par échocardiographieDoppler ............................................................................................................................................... 102
Tableau XVIII. Paramètres calculés suite aux analyses d'échocardiographie-Doppler ............. 103
Tableau XIX. Paramètres déterminés lors des mesures hémodynamiques in vivo par la technique
des boucles pressions-volumes. ......................................................................................................... 107
Tableau XX. Paramètres morphologiques des animaux des lignées F19 et F20 âgés de 30
semaines.............................................................................................................................................. 176
Tableau XXI. Paramètres morphométriques cardiaques évalués par échocardiographie des
animaux des lignées F19 et F20 âgés de 30 semaines...................................................................... 176
Tableau XXII. Paramètres de la fonction cardiaque évalués par échocardiographie des animaux
des lignées F19 et F20 âgés de 30 semaines. .................................................................................... 177
Tableau XXIII. Paramètres de la fonction cardiaque évalués par la technique des boucles
pression-volume chez des animaux des lignées F19 et F20 âgés de 30 semaines.......................... 178
xvi
Tableau XXIV. Effets de l’ovariectomie sur les paramètres morphologiques et les paramètres
morphométriques évalués par échocardiographie chez des femelles de la lignée F20 âgées de 30
semaines.............................................................................................................................................. 180
Tableau XXV. Effets de l’ovariectomie sur les paramètres de la fonction cardiaque évalués par
échocardiographie et par la technique des boucles pression-volume chez des femelles de la lignée
F20 âgées de 30 semaines. ................................................................................................................. 181
Tableau XXVI. Comparaison entre différents modèles animaux d’insuffisance cardiaque à
fraction d’éjection préservée (ICFEp) humaine et le modèle de rat transgénique surexprimant le
récepteur β3-adrénergique humain issu de la lignée F20 (F20 Tgβ3). ........................................... 182
xvii
I-INTRODUCTION
1
1.1. Physiologie cardiovasculaire
1.1.1. Physiologie cardiaque
Le cœur a pour fonction d‟assurer un débit sanguin adéquat, permettant d‟assurer un
apport en substrats et en oxygène nécessaire aux besoins énergétiques de l‟organisme. Ce
débit est très finement régulé dans les conditions physiologiques. Son altération ou des
perturbations de sa régulation peuvent entraîner l‟apparition et/ou le développement de
pathologies.
1.1.1.1. Structure cardiaque
Le cœur est un ensemble de cavités dans lesquelles circule le sang. Les parois sont
constituées de l‟endocarde (endothélium au contact du sang), du myocarde (cellules
musculaires striées myocardiques ou cardiomyocytes) et de l‟épicarde qui est au contact d‟un
feuillet séreux qui entoure le cœur, le péricarde (Boccara & Riou, 2009). Le cœur est divisé
de 2 parties anatomiquement distinctes et séparées par une cloison, le septum
interventriculaire : le cœur gauche et le cœur droit. Le cœur gauche qui assure la circulation
systémique est constitué de l‟oreillette (OG) et du ventricule (VG) gauche alors que le cœur
droit qui assure la circulation pulmonaire est constitué de l‟oreillette (OD) et du ventricule
(VD) droit. Il existe entre les oreillettes et les ventricules ainsi qu‟entre les ventricules et la
circulation, un système de valves qui empêche le sang de refluer en amont (Boccara & Riou,
2009) (Figure 1).
11
12
7
1
6
1. Oreillette droite
8. Valve mitrale
2. Ventricule droit
9. Valve aortique
3. Oreillette gauche
10. Veine cave inférieure
8
4. Ventricule gauche
11. Veine cave supérieure
4
5. Septum interventriculaire
12. Artère pulmonaire
6. Valve tricuspide
13. Veine pulmonaire
7. Valve pulmonaire
14. Aorte
14
9
13
3
5
2
10
Figure 1. Anatomie cardiaque en coupe frontale.
1.1.1.2. Structure du cardiomyocyte
Les cardiomyocytes sont les cellules musculaires cardiaques contractiles qui
représentent environ 75% du volume du myocarde (Rosenberg & Tavernier, 2009). Les
cardiomyocytes ventriculaires mesurent de 40 à 100 µm de longueur et de 10 à 25 µm de
2
diamètre (Rosenberg & Tavernier, 2009). Leur membrane plasmique forme des invaginations
appelées tubules transverses (tubules T) répartis régulièrement sur l‟ensemble de la cellule et
permettant la propagation du PA jusqu‟au cœur du cardiomyocyte (Brette & Orchard, 2003)
(Figure 2). Situé en regard des tubules T, le réticulum sarcoplasmique (RS) est un
compartiment intracellulaire dont les terminaisons forment des citernes spécialisées dans le
stockage et la libération du calcium (Ca2+). L‟association entre un tubule transverse et une
citerne du RS est appelé une diade (Figure 2).
RS longitudinal
Diade
Myofilaments
Cytosol
Membrane plasmique
Tubule transverse
Citerne terminales du RS
Mitochondrie
Figure 2. Ultrastructure d’un cardiomyocyte. D‟après JJ Mercadier1
RS : réticulum sarcoplasmique.
Les myofilaments représentent environ 50 à 60% du volume cellulaire du
cardiomyocyte (Rosenberg & Tavernier, 2009). Ils sont constitués des unités fonctionnelles
contractiles du cardiomyocyte : les sarcomères. Les sarcomères, délimités par deux disques
aussi appelés stries Z, mesurent environ 1,8 µm de longueur. Ils sont constitués de bandes
sombres (bande A) et de bandes claires (bande I). La bande A est traversée en son milieu par
une zone claire ou bande H, marquée en son centre par une ligne sombre M. Les sarcomères
résultent de l‟interpénétration de 2 types de filaments : (i) les filaments épais de myosine et
(ii) les filaments fins d‟actine (Rosenberg & Tavernier, 2009) (Figure 3).
3
1
JJ Mercadier. Faculté de médecine Paris Diderot ; cours sur le couplage excitation-contraction du cardiomyocyte.
Demi-bande I
Bande A
Strie Z
Bande H
Ligne M
Titine
2
Filament épais
1
3 6
Filament fin
4
5
Figure 3. Représentation schématique du sarcomère et des myofilaments. (Servier illustration)
1 : tropomyosine, 2 : monomère d‟actine, 3 : tête globulaire de la myosine, 4 : troponine C, 5 : troponine T,
6 : troponine I, Ca2+ : ion calcium, ADP : adénosine diphosphate, ATP : adénosine triphosphate
Chaque filament épais est constitué de près de 300 molécules de myosine se terminant
chacune par une tête globulaire bilobée. Ces têtes de myosines, porteuses d‟une activité
ATPasique et de sites d‟interaction avec l‟actine, sont orientées vers les 2 extrémités du
sarcomère laissant la région centrale du filament épais dépourvue de têtes de myosines
(Rosenberg & Tavernier, 2009). Le filament épais comprend également une protéine de
structure, la titine qui s‟étend de la strie Z à la ligne M. La titine stabilise les filaments épais
en couplant son extrémité aux protéines de la strie Z. Cette protéine est responsable de la
tension passive (Fpassive) générée par le myocarde lorsque ce dernier est étiré. La Fpassive du
myocarde traduit la rigidité du muscle cardiaque. Le ratio existant entre les 2 isoformes de la
titine, l‟isoforme court N2B et l‟isoforme long N2BA, va déterminer la Fpassive du myocarde
(Castro-Ferreira et al., 2011). L‟isoforme N2B, plus court que l‟isoforme N2BA, induit une
rigidité plus importante du myocarde et donc une augmentation plus importante de la Fpassive
lors de l‟étirement des sarcomères (Figure 4). La phosphorylation de ces isoformes ainsi que
leur liaison au Ca2+ régulent également leur rigidité (cf Régulation β-AR de la fonction
cardiaque).
4
Long terme
Tension passive du
myocarde (mN/mm2)
40
Court terme
Phosphorylation
30
Liaison du Ca2+
20
10
0
1,8
2,0
2,2
2,4
2,6
Longueur du sarcomère (en µm)
Figure 4. Evolution de la tension passive du myocarde en fonction du ratio entre les isoformes de la titine
ainsi que de leur régulation à court terme. D‟après (Castro-Ferreira et al., 2011).
Ca2+ : ion calcium, N2B : isoforme court de la titine, N2BA : isoforme long de la titine.
Chaque filament fin est constitué par l‟association de molécules d‟actine, de
tropomyosine et de complexes hétérotrimériques de troponines (Tn). Un filament fin
correspond à une double hélice de brins composés de monomères d‟actine. Ces monomères
possèdent notamment des sites de liaison pour le Ca2+, l‟ATP et 2 sites d‟interaction avec la
tête de myosine. Au repos, la tropomyosine va se positionner dans la gorge de la double hélice
d‟actine et masquer les sites d‟interaction entre l‟actine et la myosine. Enfin le complexe
hétérotrimérique de Tn est composé de la troponine C (TnC) qui possède un site liaison pour
le Ca2+, la troponine I (TnI) qui est liée à l‟actine et la troponine T (TnT) et qui assure le lien
entre le complexe TnI-TnC et la tropomyosine (Kobayashi & Solaro, 2005) (figure 4).
Les mitochondries jouent également un rôle important dans le cardiomyocyte par la
production de l‟ATP nécessaire à la contraction (Maack & O'Rourke, 2007).
1.1.1.3. Contraction cardiaque
Les cardiomyocytes possèdent des propriétés particulières leur permettant de
transformer un potentiel d‟action (PA) en un signal intracellulaire conduisant à la contraction
cellulaire. Ces mécanismes sont regroupés sous le terme de couplage excitation-contraction
(CEC) (Bers, 2001). Le CEC est possible grâce à l‟organisation structurelle et moléculaire
adaptée des cardiomyocytes et est sous la dépendance principale d‟un second messager : le
5
Ca2+. Ce Ca2+ est essentiel au CEC et est l‟activateur direct des protéines impliquées dans la
contraction (Bers, 2008).
Les tubules T possèdent des protéines intervenant dans le CEC dont les canaux Ca2+
de type L (Shaw & Colecraft, 2013). Sur la membrane des citernes du RS, en regard des
tubules T, est retrouvé un canal spécialisé dans la libération du Ca2+: le récepteur à la
Ryanodine de type 2 (RyR2) (Kushnir & Marks, 2010; Scriven et al., 2013) (Figure 5). Cette
organisation très précise de la structure des cardiomyocytes permet une communication
fonctionnelle efficace entre environ 10 à 25 canaux Ca2+ de type L et 100 à 200 RyR2 (Brette
& Orchard, 2003). Ce complexe de signalisation calcique est appelé un couplon (Bers, 2008).
Les citernes du RS sont reliées entre-elles par le RS longitudinal qui entoure les myofilaments
et est spécialisé dans la recapture du Ca2+, grâce notamment à une pompe calcique dépendante
de l‟hydrolyse d‟adénosine triphosphate (ATP) : la SERCA2a (Sarco/Endoplasmic Reticulum
Ca2+-ATPase). L‟activité de la SERCA2a est régulée par une protéine qui lui est associée, le
phospholamban (PLB) (Kranias & Hajjar, 2012).
a- Mécanisme du couplage excitation-contraction
Les canaux Ca2+ de type L au niveau des tubules T sont des canaux voltagedépendants formés par l‟association de 3 sous-unités : α1, β et α2-δ. La sous-unité α1 contient à
la fois le pore du canal et son voltage sensor (Shaw & Colecraft, 2013). Lors de la genèse
d‟un PA, les canaux Ca2+ de type L vont s‟ouvrir et laisser entrer du Ca2+ dans la cellule :
c‟est le courant calcique de type L entrant ICa,L. En moins d‟1 ms, la concentration de Ca2+
libre intracellulaire ([Ca2+]i) passe de 100 nM à 10-20 µM au voisinage des canaux Ca2+ de
type L (Bers, 2008). Cette augmentation localisée de [Ca2+]i permet l‟activation de RYR2.
RYR2 est un homotétramère qui interagit avec de nombreuses protéines régulatrices et
possède 2 sites de fixation au Ca2+ : l‟un à haute affinité induit l‟ouverture du canal et l‟autre,
à basse affinité induit la fermeture du canal.
La fixation de Ca2+ sur le site à haute affinité de RYR2 lors du CEC permet
l‟ouverture du canal et la libération du Ca2+ stocké dans le RS grâce à un mécanisme appelé
calcium induced-calcium released (CICR). La [Ca2+]i augmente alors à 200-400 µM. Le Ca2+
ainsi libéré va diffuser dans le cytosol pour activer les myofilaments et permettre la
contraction (Figure 5).
6
Ca2+ Ca2+
Ca2+ ATPase
PA
NCX
Membrane plasmique
Myofilaments
1
ATP ADP
7
6
Ca2+
Cytosol
NCX
[Ca2+]i
5
Tubule
transverse
4
Citerne du
réticulum
sarcoplasmique
Ca2+ L
Ca2+
2
[Ca2+]i
7
ADP ATP
PLB
SERCA2a
Ca2+
Mitochondrie
RYR2
3
ATP
Figure 5. Couplage excitation-contraction. D‟après (Bers, 2002).
Lors de l‟arrivée d‟un potentiel d‟action (PA ; 1), les canaux Ca2+ de type L (Ca2+ L) sont activés et laissent
entrer du calcium dans la cellule (2). La concentration de calcium intracellulaire ([Ca2+]i) augmente alors (3)
jusqu‟à atteindre le seuil d‟activation des récepteurs à la ryanodine (RyR2) qui vont libérer le Ca2+ stocké dans le
réticulum sarcoplasmique (4). La [Ca2+]i va encore plus augmenter (5) et le Ca2+ libre va diffuser vers les
myofilaments et engendrer une contraction (6). Enfin, le Ca2+ va être recapté (7) grâce aux pompes ATPase du
réticulum sarcoplasmique (SERCA) et extrudé grâce aux pompes ATPase de la membrane plasmique et à
l‟échangeur sodium/Ca2+ (NCX). ADP : adénosine diphosphate, ATP : adénosine triphosphate, PLB :
phospholamban.
A une faible [Ca2+]i, il existe un blocage des sites de liaison de l‟actine pour la
myosine empêchant la formation de ponts actine-myosine. A l‟initiation de la contraction, la
fixation de Ca2+ sur la TnC induit le déplacement de la TnI entraînant d‟une part le
pivotement du complexe Tn-Tm et d‟autre part la libération de l‟interaction TnI-actine
(Knowles et al., 2012). Ceci aboutit à une libération du site d‟interaction entre l‟actine et la
tête de myosine permettant la formation des ponts actine-myosine et l‟initiation de l‟activité
ATPasique de la tête de myosine. L‟hydrolyse d‟ATP qui en résulte est convertie en énergie
mécanique permettant de faire pivoter la tête de myosine qui exerce alors une traction sur le
filament fin en direction de la ligne M du sarcomère. Ainsi, on observe un raccourcissement
des sarcomères caractérisé par un rapprochement des stries Z (Carzorla, 2008) (Figure 6).
7
Contraction
2
1
3 6
4
5
Ca2+
Ca2+
ADP
ATP
Figure 6. Représentation schématique du mécanisme de contraction.
1 : tropomyosine, 2 : monomère d‟actine, 3 : tête globulaire de la myosine, 4 : troponine C, 5 : troponine T,
6 : troponine I, Ca2+ : ion calcium, ADP : adénosine diphosphate, ATP : adénosine triphosphate
b- Diminution de la concentration intracellulaire en calcium
Le recaptage du Ca2+ au niveau du RS est assurée par la SERCA2a qui réalise un
transport actif de Ca2+, à raison de deux ions Ca2+ transportés pour une molécule d‟ATP
hydrolysée (Kranias & Hajjar, 2012). D‟autres protéines participent à l‟extrusion du Ca2+
notamment l‟échangeur sodium (Na+)/Ca2+ (NCX) et la Ca2+-ATPase de la membrane
plasmique (Figure 5). La participation de chacune de ces protéines dans la diminution de
[Ca2+]i varie selon les espèces (Bers, 2008; Lompre et al., 2008). Ainsi chez le rat et la souris
90 à 95% du Ca2+ est recapté par le RS alors que dans d‟autres espèces comme le lapin, le
chien, le chat ou encore l‟homme seulement 70% du Ca2+ est recapté par le RS et environ
30% est extrudé (Bers, 2001).
c- Relation force-fréquence
La relation force-fréquence est un important mécanisme de régulation intrinsèque de la
contractilité cardiaque. Cette relation est dite positive, lorsqu‟une augmentation de la
fréquence (FC) est associée à une augmentation de la contraction et négative lorsqu‟à
l‟inverse une augmentation de la FC est associée à une diminution de la contraction (Endoh,
2004). Dans des conditions physiologiques, une relation force-fréquence positive est observée
chez la majorité des mammifères dont l‟homme alors qu‟une relation force-fréquence
négative est observée dans les espèces à très haute FC comme le rat ou la souris (Endoh,
2004).
1.1.1.4. Cycle cardiaque
L‟activité cyclique du myocarde est décomposée en 2 phases distinctes : (i) la phase de
contraction ou systole et (ii) la phase de relaxation ou diastole (Figure 7) (Boccara & Riou,
2009). Les expérimentations réalisées dans ce travail de thèse ont uniquement évalué la
8
fonction du VG. Dans un souci de clarté seule la fonction du VG sera détaillée dans ce
manuscrit (Figure 7).
La systole débute lorsque le remplissage du VG est terminé. Les valves cardiaques
sont alors fermées. Le VG se contracte provoquant une augmentation de la pression
intraventriculaire gauche (PVG) sans modification du volume ventriculaire (contraction
isovolumique). Lorsque la PVG devient supérieure à la pression régnant dans l‟aorte, la valve
aortique s‟ouvre : c‟est le début de la période d‟éjection systolique. La diminution de la PVG
provoque la fermeture de la valve aortique et la fin de la systole : c‟est la télésystole. Le VG
se relaxe provoquant une diminution de la PVG sans modification du volume ventriculaire
(relaxation isovolumique). Lorsque la PVG devient inférieure à la pression régnant dans
l‟OG, la valve mitrale s‟ouvre : c‟est le début de la période de remplissage diastolique. Ce
remplissage peut être divisé en 2 étapes. Tout d‟abord un remplissage passif en raison du
gradient de pression entre VG et OG. Puis un remplissage actif par contraction de l‟OG.
Quand la PVG devient supérieure à la pression de l‟OG cela provoque alors la fermeture de la
valve mitrale et la fin de la diastole : c‟est la télédiastole. (Boccara & Riou, 2009).
B
120
Pression
aortique
Pression (mmHg)
100
Télésystole
80
120
Pression
ventriculaire
60
Télésystole
40
20
Télédiastole
Pression atriale
0
Débit (mL.s-1)
Volume (mL)
Mitrale
Aortique
Ejection
Systolique
100
FERMÉE
OUVERTE
FERMÉE
OUVERTE
OUVERTE
FERMÉE
Volume ventriculaire
120
80
40
0
Pression (mmHg)
A
80
60
Relaxation
isovolumique
40
Remplissage
Diastolique
20
400
Débit cardiaque
Contraction
isovolumique
0
200
40
80
Volume (mL)
0
0
0,2
0,4
0,6
Temps (s)
Figure 7. Diagramme de Wigger (A) et boucle Pression-Volume (B) du ventricule gauche.
9
Télédiastole
120
1.1.2. Physiologie vasculaire
La fonction principale du système vasculaire est d‟assurer la répartition du débit
sanguin d‟origine cardiaque entre les organes, en fonction de leur activité, grâce au maintien
d‟une pression et d‟un débit de perfusion, contrôlés notamment par les modifications du
diamètre des vaisseaux, soumises à différents mécanismes de régulation.
La paroi artérielle est composée de trois couches concentriques : la tunique la plus
externe est l‟adventice, la couche intermédiaire est appelée la media et la tunique la plus
interne est l‟intima (Wiel et al., 2009) (Figure 8). Cette compartimentation est commune à
tous les vaisseaux mais l‟importance relative de chacun de ces éléments détermine des
propriétés différentes à chacun des secteurs vasculaires.
1
5
1. Intima
2. Limitante élastique interne
3
2
3. Media
4. Limitante élastique externe
5. Adventice
4
Figure 8. Représentation schématique de l’organisation structurelle d’une artère.
La contraction des vaisseaux provient d‟un type cellulaire particulier : les cellules
musculaires lisses (CML) situées principalement dans la média et aussi dans l‟adventice pour
certains lits vasculaires (Wiel et al., 2009).
1.1.2.1. Contraction des cellules musculaires lisses
Dans les CML vasculaires, deux types de stimuli vont pouvoir induire l‟augmentation
de la [Ca2+]i nécessaire à la contraction: (i) une dépolarisation membranaire (Wellman &
Nelson, 2003) (couplage électromécanique) et (ii) une fixation d‟agonistes sur des récepteurs
à sept domaines transmembranaires couplés aux protéines G (RCPG) (Cavalli et al., 2002;
Wright et al., 2013) (couplage pharmaco-mécanique). Dans les 2 cas, les stimuli ont pour
conséquence finale la mobilisation des stocks de Ca2+ du RS. Cette mobilisation s‟effectue par
activation des RYR pour le couplage électromécanique (Wellman & Nelson, 2003) et par
activation de la voie impliquant la protéine Gq/la phospholipase C (PLC)/l‟inositol
10
triphosphate (IP3) et le récepteur à l‟inositol triphosphate (IP3R) pour le couplage pharmacomécanique (Cavalli et al., 2002; Wright et al., 2013) (Figure 9).
Agent vasoconstricteur
Ca2+ Ca2+
Ca2+ ATPase
NCX
Gq
PLC
PiP2
ATP ADP
RhoA
DAG
IP3
ADP ATP
PLB
SERCA2b
PKC
Rho-Kinase
Ca2+
MLCP
P
Myosine
(inactive)
Relaxation
Myosine
(active)
Contraction
MLCK-Ca2+-CaM
IP3R
[Ca2+]i
CaM
MLCK
Ca2+-CaM
Cytosol
RYR
[Ca2+]i
Réticulum
sarcoplasmique
Membrane plasmique
Cav1.2
PA
Figure 9. Signalisation intracellulaire de la contraction des cellules musculaires lisses vasculaires. D‟après
(Ogut & Brozovich, 2003).
L‟activation des récepteurs à 7 domaines transmembranaires par un agent vasoconstricteur ou l‟ouverture des
canaux Ca2+ de type L suite à une dépolarisation membranaire conduit à une augmentation de la concentration
intracellulaire en calcium ([Ca2+]i). La formation du complexe calcium-calmoduline (Ca2+-CaM) et l‟interaction
de ce dernier avec la kinase des chaînes légères de la myosine (MLCK) permet la phosphorylation de la myosine.
La myosine ainsi activée peut induire la contraction cellulaire. L‟activation des récepteurs à 7 domaines
transmembranaires conduit également à l‟inhibition de la phosphatase des chaînes légères de la myosine (MLCP)
par la voie de la protéine kinase C (PKC). L‟inhibition de la MLCP est également sous le contrôle de la voie
RhoA-Rho Kinase. Enfin, le Ca2+ va être recapté par le réticulum sarcoplasmique (RS) grâce aux pompes
ATPase du RS (SERCA2b) et extrudé de la cellule grâce aux ATPase de la membrane plasmique et aux
échangeurs sodium/Ca2+ (NCX).
→ : activation ; ┴ : inhibition, DAG : diacylglycérol, IP3 : inositol triphosphate, PA : potentiel d‟action, PIP2 :
phosphatidylinositol-4,5-biphosphate, PLC :
La forte augmentation de la [Ca2+]i va permettre la mise en route de la machinerie
contractile. La formation d‟un complexe Ca2+-calmoduline (CaM) induit la libération d‟une
11
sous-unité de la CaM (Means et al., 1991) qui ne possède pas d‟activité enzymatique mais
peut agir comme sous-unité régulatrice de certaines enzymes comme la kinase des chaînes
légères de la myosine (MLCK). Le complexe Ca2+-CaM en se fixant sur la MLCK démasque
le site catalytique de cette dernière. Ceci permet l‟accès de la MLCK à divers substrats et
notamment la chaîne légère de la myosine de 20 kDa (MLC20) (Hong et al., 2011). La
phosphorylation de la MLC20 engendre un changement de conformation de la tête de
myosine qui peut alors se fixer sur l‟actine et hydrolyser une molécule d‟ATP. Cette
hydrolyse d‟ATP va induire un basculement de la tête de myosine et permettre la contraction
(Pfitzer, 2001; Ogut & Brozovich, 2003) (Figure 9).
Les CML possèdent la capacité à maintenir une contraction sans l‟apparition d‟effets
toxiques dus au Ca2+. Cela est permis grâce à divers mécanismes de sensibilisation de
l‟appareil contractile au Ca2+. L‟ensemble de ces mécanismes aboutissent à l‟inhibition de la
phosphatase des chaînes légères de la myosine (MLCP). La MLCP va inhiber la contraction
des CML en déphosphorylant la MCL20 empêchant ainsi l‟interaction entre la myosine et
l‟actine. Parmi les mécanismes de sensibilisation, on trouve notamment :
- la voie protéine Gq/PLC/diacylglycerol (DAG) qui aboutit à l‟activation de la
protéine kinase C (PKC). La PKC peut alors phosphoryler différentes protéines dont la MLCP
diminuant ainsi l‟activité de cette enzyme (Schubert et al., 2008),
- la voie de la petite protéine G monomérique RhoA (Ras homolog type A) qui
en activant la Rho-kinase induit la phosphorylation de la sous-unité régulatrice de la MLCP,
MYPT1 (myosine phosphate target subunit 1), inhibant ainsi la MLCP (Sward et al., 2003;
Schubert et al., 2008).
1.1.2.2. Relaxation des cellules musculaires lisses
La relaxation des CML, s‟effectue par un retour de la [Ca2+]i à sa valeur de repos et
une désensibilisation de l‟appareil contractile. Ce dernier mécanisme implique des facteurs
vasodilatateurs qui agissent sur l‟endothélium et/ou sur les CML, induisant l‟activation de la
MLCP et l‟inactivation de la MLCK.
12
Lors de l‟arrêt de la stimulation, des mécanismes cellulaires ramenant la [Ca2+]i à sa
valeur de repos sont proches de ceux rencontrés au niveau des cardiomyocytes c'est-à-dire :
- une activation des SERCA2b (Adachi, 2010), par phosphorylation du PLB,
qui permettent le recaptage du Ca2+ par le RS (Akata, 2007).
- une extrusion du Ca2+ intracellulaire par le NCX et la pompe Ca2+-ATPase de
la membrane plasmique (Akata, 2007).
La désensibilisation de l‟appareil contractile au Ca2+ va pouvoir être principalement
réalisée par 2 voies de signalisation : (i) la voie adénylate cyclase (AC)/ 3‟,5‟-adénosine
monophosphate cyclique (AMPc)/protéine kinase A (PKA) et (ii) la voie guanylate cyclase
(GC)/ 3‟,5‟-guanosine monophosphate cyclique (GMPc)/protéine kinase G (PKG) (cf
Régulation de la fonction cardiovasculaire) (Akata, 2007).
13
1.2. Régulation de la fonction cardiovasculaire
Le rôle du système cardiovasculaire est d‟assurer un débit tissulaire permettant un
apport en substrats et en oxygène suffisant aux besoins énergétiques de l‟organisme. Ce
système nécessite donc une régulation fine à court terme mais également à plus long terme.
Parmi ces mécanismes, on retrouve notamment : (i) le contrôle baroréflexe faisant intervenir
le système nerveux autonome, (ii) le système rénine-angiotensine-aldostérone, (iii) le système
hypothalamus-vasopressine, (iv) la régulation paracrine par l‟endothélium ou encore (v) la
fonction endocrine du cœur.
En lien avec mon travail de thèse et par soucis de clarté, dans ce manuscrit, seront
uniquement détaillés une composante du système nerveux autonome, le système βadrénergique (β-AR), et la régulation paracrine par l‟endothélium de la fonction cardiaque.
1.2.1. Les nucléotides cycliques
Les nucléotides cycliques sont les principaux seconds messagers des RCPG et régulent
un grand nombre de réponses physiologiques dans la plupart des cellules. L‟AMPc a été le
premier second messager identifié (Sutherland &
Rall, 1958). Le GMPc est purifié et
identifié pour la première fois 5 ans plus tard dans de l‟urine de rat (Ashman et al., 1963).
L‟AMPc et le GMPc sont respectivement synthétisés par des AC et des GC à partir d‟ATP et
de GTP. La concentration intracellulaire de l‟AMPc et de GMPc est dépendante de la balance
entre l‟activité des AC et GC et des enzymes responsables de leur dégradation, les
phosphodiestérases (PDE) (cf Compartimentalisation des nucléotides cycliques). L‟expression
des différents isoformes de ces enzymes varie en fonction du type cellulaire permettant la
grande variété de réponses physiologiques possibles.
1.2.1.1. Adénosine monophosphate cyclique
Les AC sont les uniques sources de synthèse de l‟AMPc. Il en existe 10 isoformes
dont 9 sont membranaires (AC1-AC9) et une soluble (AC10) (Hanoune & Defer, 2001).
L‟AMPc nouvellement produit diffuse dans le cytosol et se fixe sur ces différents effecteurs.
Bien qu‟il soit considéré que l‟AMPc produit l‟essentiel de ces effets par l‟activation de la
PKA, elle est cependant également capable d‟activer d‟autres enzymes dont la protéine
d‟échange activée par l‟AMPc (Epac), la PKG ou encore des PDE (cf Compartimentalisation
des nucléotides cycliques).
14
La PKA est un hétérotetramère composé de 2 sous-unités régulatrices et de 2 sousunités catalytiques (Taylor et al., 1990). Les sous-unités régulatrices possèdent chacune 2
sites de fixation pour l‟AMPc. La fixation de 4 molécules d‟AMPc sur ces sous-unités
régulatrices conduit à un changement conformationnel et à la dissociation des sous-unités
régulatrices et catalytiques. Les sous-unités catalytiques, libres de toute inhibition, deviennent
alors actives et peuvent phosphoryler les résidus sérine (Ser) et thréonine (Thr) de leurs
protéines cibles.
Découverte en 1998 (de Rooij et al., 1998; Kawasaki et al., 1998), les protéines Epac
ont été démontrées récemment comme des effecteurs important de l‟AMPc. La liaison de
l‟AMPc à Epac au niveau d‟un domaine homologue à ceux retrouvés au niveau de la PKA
provoque un changement conformationnel d‟Epac permettant la levée d‟une autoinhibition
existant au niveau de cette enzyme (Gloerich & Bos, 2010). Epac une fois activée va à son
tour activer une protéine G monomérique Rap (Ras-related protein) dont la voie de
signalisation aboutit à l‟activation de la protéine kinase dépendante du complexe Ca2+-CaM
(CaMKII).
La PKG peut également être activée par la liaison de l‟AMPc mais nécessite des
concentrations en AMPc dix fois plus importantes que celles nécessaires à l‟activation de la
PKA (Burnette & White, 2006; Morgado et al., 2012).
1.2.1.2. Guanosine monophosphate cyclique
Le GMPc est synthétisé par les GC. Il existe 2 types de GC : les GC membranaires,
activées par divers ligands, parmi lesquels on retrouve notamment les peptides natriurétiques,
et les GC solubles activées par le NO (Potter, 2011). Comme pour l‟AMPc, le GMPc une fois
synthétisé diffuse dans le cytosol et active ces effecteurs. Parmi les effecteurs du GMPc on
retrouve principalement la PKG mais ce nucléotide cyclique est également capable d‟activer
la PKA et des PDE (cf Compartimentalisation des nucléotides cycliques).
La PKG contrairement à la PKA ne possède que deux sous-unités. La fixation du
GMPc sur une sous-unité provoque la levée de l‟inhibition de son extrémité N-ter sur le site
catalytique de l‟enzyme (Francis et al., 2010). Les sites catalytiques, libres de toute inhibition,
deviennent alors, comme pour la PKA, actifs et peuvent phosphoryler les résidus sérine (Ser)
et thréonine (Thr) de leurs protéines cibles.
15
Comme la PKG qui peut être activée par l‟AMPc, la PKA peut de son côté être activée
par le GMPc. Encore une fois cette activation nécessite des concentrations en GMPc dix fois
plus importantes que celles nécessaires à l‟activation de la PKG (Burnette & White, 2006;
Morgado et al., 2012).
1.2.1.3. Compartimentalisation des nucléotides cycliques
Les effecteurs de l‟AMPc et du GMPc phosphorylent des cibles très nombreuses et
variées au sein des cellules. Afin de garantir la spécificité des réponses dépendantes des
différents RCPG activés, un confinement temporel et spatial de l‟AMPc et du GMPc est donc
nécessaire. Ce confinement fait intervenir des protéines particulières, les PDE. Les PDE sont
des enzymes qui catalysent l‟hydrolyse du 3‟,5‟-AMPc en 5‟-AMP et/ou du 3‟,5‟-GMPc en
5‟-GMP (Figure 10) (Lugnier, 2006). Il existe plus de 50 isoformes de PDE codés par 21
gènes et regroupés en 11 familles sur la base de leurs séquences protéiques, leurs propriétés
enzymatiques, leurs modes de régulation et leurs propriétés pharmacologiques (Conti &
Beavo, 2007).
PDE
3’,5’ AMPc/GMPc
H2O, Mg2+
5’ AMP/GMP
R
X
Adenine = H NH2
Guanine = NH2 0
Figure 10. Mécanisme d’hydrolyse des nucléotides cycliques par les phosphodiestérases. D‟après (Lugnier,
2006).
AMPc : adénosine monophosphate cyclique, PDE : phosphodiestérase, GMP : guanosine monophosphate
cyclique.
La compartimentation des réponses spécifiques des différents RCPG activés fait
également intervenir des protéines d‟ancrages AKAP (A-kinase anchoring protein) permettant
notamment la colocalisation, au niveau des RCPG, de plusieurs partenaires intervenant dans
une même voie de signalisation dont notamment, les protéines G, l‟AC, la PKA ou encore les
16
PDE (Xiang, 2011). Cela aboutit à la formation de complexes multipartenaires aussi appelés
signalosomes favorisant la rapidité et la spécificité des réponses biologiques.
a- Au niveau cardiaque
Au niveau du myocarde sont retrouvés des isoformes d‟au moins 6 familles de PDE
incluant PDE1, PDE2, PDE3, PDE4, PDE5 et PDE8 (Tableau I) (Miller & Yan, 2010).
L‟expression relative de chaque famille de PDE varie en fonction de l‟espèce, du
développement ou encore d‟une condition pathologique. Ainsi, dans le cœur de rat, les PDE3
et PDE4 sont responsables de plus de 90% de l‟activité des PDE (Richter et al., 2005) alors
que chez l‟homme ces 2 familles de PDE représentent une proportion moins importante du
pool de PDE (Richter et al., 2011).
Tableau I. Familles et isoformes de phosphodiestérases (PDE) exprimées au niveau cardiaque
Gènes
Substrats
Modes de régulation
PDE1
PDE1A/B/C
AMPc/GMPc
Activée par le complexe Ca2+-CaM
PDE2
PDE2A
AMPc/GMPc
Activée par le GMPc
PDE3
PDE3A/B
AMPc/GMPc
Inhibée par le GMPc, activé par la PKA
PDE4
PDE4A/B/C/D
AMPc
Activée par la PKA
PDE5
PDE5
GMPc
Activée par la PKA et/ou la PKG
PDE8
PDE8A/B
AMPc
Spécifique de l‟AMPc
D‟après (Omori & Kotera, 2007; Miller & Yan, 2010).
AMPc : adénosine monophosphate cyclique, Ca2+-CaM : calcium-calmoduline, Erk : extracellular signal
regulated kinase, GMPc : guanosine monophosphate cyclique, PDE : phosphodiestérase, PKA : protéine kinase
A, PKG : protéine kinase G.
b- Au niveau vasculaire
Comme au niveau cardiaque, les voies de l‟AMPc et du GMPc sont étroitement
régulées par l‟action des PDE dans les CML. Des PDE des familles PDE1 à PDE5
(Matsumoto et al., 2003; Morgado et al., 2012) ont été retrouvées dans les CML vasculaires.
La contribution relative de chacune de ces familles de PDE va dépendre de l‟espèce, du lit
vasculaire mais également du statut des cellules (quiescentes/prolifératives). Ainsi, par
exemple le transcrit de l‟isoforme PDE1C est retrouvé dans des CML aortiques humaines en
prolifération mais pas dans des cellules quiescentes (Rybalkin et al., 1997).
17
1.2.2. Le système β-adrénergique
Le système nerveux autonome participe largement à la régulation du système
cardiovasculaire. Ce dernier est composé de deux entités distinctes (i) le système nerveux
parasympathique ayant une voie uniquement nerveuse et dont le neurotransmetteur est
l‟acétylcholine (ACh) et (ii) le système nerveux sympathique ayant à la fois une voie nerveuse
avec comme neurotransmetteur la noradrénaline (NA) et une voie hormonale via la sécrétion
par les glandes médullosurrénales d‟adrénaline (Adr) principalement mais également dans une
moindre mesure de NA. NA et Adr agissent sur les récepteurs adrénergiques qui
appartiennent à deux grandes classes : les récepteurs α-adrénergiques et les récepteurs β-AR.
Seuls les récepteurs β-AR seront détaillés dans ce manuscrit.
1.2.2.1. Structure des récepteurs β-adrénergiques
Trois sous-types de récepteurs β-AR ont été clonés (Dixon et al., 1986; Frielle et al.,
1987; Emorine et al., 1989) et identifiés pharmacologiquement: β1-, β2- et β3-AR. Ces
récepteurs sont codés par 3 gènes distincts (Tableau II).
Contrairement aux gènes des récepteurs β1- et β2-AR, le gène du récepteur β3-AR a la
particularité de posséder des séquences introniques permettant l‟expression de plusieurs
isoformes du récepteur par épissage alternatif. Ces isoformes diffèrent au niveau de
l‟extrémité carboxy-terminale (C-ter). Ainsi, chez la souris, il a été démontré que les
isoformes β3a-AR et β3b-AR présentent des niveaux d‟expressions des transcrits différents
selon le tissu considéré (Evans et al., 1999). Une étude récente démontre, dans des cellules de
souris en culture, un couplage différent des deux isoformes dépendant notamment de
l‟interaction de l‟isoforme β3a-AR avec la cavéoline-1 (Sato et al., 2012).
Tableau II. Caractéristiques des récepteurs β1-, β2- et β3-adrénergiques humains.
Localisation
chromosomique
Introns
Nombre
d’acides aminés
Référence
β1-AR
10q24-q26
Non
477
(Frielle et al., 1987)
β2-AR
5q31-q32
Non
416
β3-AR
8p12-p11.2
Oui
402/408*
(Dixon et al., 1986; Kobilka et al.,
1987)
(Emorine et al., 1989; Granneman
et al., 1993; Lelias et al., 1993)
β-AR : récepteurs β-adrénergiques. *2 isoformes issus de l‟épissage alternatif du récepteur β3-AR
Les récepteurs β-AR font partie de la famille des RCPG caractérisés par leur structure
à sept domaines transmembranaires de 22 à 25 acides aminés hydrophobes reliés entre eux par
18
alternativement trois boucles intracellulaires (I1, I2 et I3) et trois boucles extracellulaires (E1,
E2 et E3) hydrophiles. Un pont disulfure, formé entre deux cystéines sur les boucles E2 et E3,
intervient dans la liaison du ligand et l‟activité des récepteurs (Figure 11). L‟extrémité aminoterminale de ces récepteurs est extracellulaire et possède des sites de N-glycolysation alors
que l‟extrémité C-ter est intracellulaire et possède un site de palmitoylation permettant un
ancrage dans la membrane plasmique. L‟extrémité C-ter présente, pour β1- et β2-AR, des
sérines et thréonines phosphorylables par les kinases des récepteurs couplés aux protéines G
(GRK), impliquées dans le phénomène de désensibilisation des RCPG (Brodde et al., 2006).
La mise en évidence au cours de la dernière décennie des structures cristallines des récepteurs
β1- et β2-AR (Rasmussen et al., 2007; Warne et al., 2008) a permis une avancée importante
dans la compréhension des mécanismes d‟activation des récepteurs β-AR. Ainsi, des études
récentes réalisées par résonnance magnétique nucléaire sur le récepteur β2-AR ont montré que
la conformation des boucles extracellulaires est modifiée lors de l‟activation du récepteur et
qu‟en fonction du type d‟agent pharmacologique (agoniste, antagoniste, agoniste partiel) les
boules extracellulaires se stabiliseraient dans des conformations différentes. Très récemment
la structure du récepteur β2-AR liée à trois agonistes différents dont l‟Adr a été mise en
évidence (Bokoch et al., 2010). Cette étude apporte des données importantes concernant la
sélectivité de ligands chimiquement différents pour un même récepteur (Ring et al., 2013).
19
A
Sites de
N-glycosylation
NH2
Pont disulfure
E2
E1
E3
extracellulaire
TM1
Membrane
plasmique
TM7
Intracellulaire
Site de
palmitoylation
I1
I2
I3
COOH
B
Figure 11. Structure primaire (A) et tertiaire (B) du récepteur β3-adrénergique. D‟après (Strosberg, 1997;
Strosberg & Nahmias, 2007)
Les acides aminés noircis sont ceux communs aux trois sous-types de récepteurs β-adrénergiques. E : boucle
extracellulaire, I : boucle intracellulaire, TM : domaine transmembranaire
1.2.2.2. Pharmacologie des récepteurs β-adrénergiques
Les agonistes endogènes des récepteurs β-AR sont les catécholamines : Adr et NA.
Leurs affinités relatives pour les trois sous-types de récepteurs β-AR ainsi que l‟affinité de
l‟isoprénaline, une catécholamine de synthèse couramment utilisée dans les études
pharmacologiques et en clinique, sont répertoriées dans le tableau III.
Contrairement aux récepteurs β1- et β2-AR, le β3-AR n‟est activé que par de fortes
concentrations en catécholamines (Strosberg, 1997), laissant penser que ce récepteur aurait
surtout une importance dans des situations où le système sympathique est fortement activé.
20
Tableau III. Affinité relative pour l’isoprénaline, l’adrénaline et la noradrénaline pour chacun des soustypes de récepteurs β-adrénergiques.
Affinité relative
β1-AR
Isoprénaline > Noradrénaline ≥ Adrénaline
β2-AR
Isoprénaline > Adrénaline > Noradrénaline
β3-AR
Isoprénaline ≥ Noradrénaline >> Adrénaline
D‟après (Frielle et al., 1989; Hoffmann et al., 2004).
De nombreux agonistes et surtout antagonistes β-AR, sont indiqués dans la
thérapeutique de pathologies très variées dont notamment l‟insuffisance cardiaque (IC),
l‟hypertension artérielle (HTA), l‟asthme ou encore le glaucome. Une liste non exhaustive de
ces molécules, ainsi que leurs propriétés, est répertoriée dans le tableau IV. Certains
antagonistes β1- et/ou β2-AR présentent également des propriétés β2- et/ou β3-AR agonistes.
C‟est le cas notamment du Nébivolol, qui présente à la fois des propriétés antagonistes pour le
récepteur β1-AR et agonistes pour les récepteurs β2- et/ou β3-AR (Rozec et al., 2006; Tran
Quang et al., 2009), et du CGP-12177, qui présente à la fois des propriétés antagonistes pour
les récepteurs β1- et β2-AR et agonistes pour le récepteur β3-AR (Kaumann & Molenaar,
1996).
Tableau IV. Liste non exhaustive d’agonistes et d’antagonistes des récepteurs β­adrénergiques
Agonistes
Antagonistes
$
β1-AR
β2-AR
β3-AR
Dobutamine
Dénopamine
Xamotérol
Salbutamol
Terbutaline
Salmeterol
fénotérol
SR 58611A
BRL 37344
CL 316,243
Nébivolol¥
CGP-12177
Nébivolol¥
Bisoprolol
Métoprolol
Aténolol
CGP 20712*
ICI 118,551
Carvédilol
Nadolol
Propranolol
CGP-12177
Bupranolol
L-748,337
L-748,328
SR 59230A
D‟après (Gauthier et al., 2008).
$
La dobutamine présent également une certaine action agoniste sur récepteur β2-AR. ¥ L‟énantiomère DNébivolol présente également une action agoniste sur le récepteur β 2-AR. *Le CGP 20712A présente également
une action agoniste sur le site de faible affinité du récepteur β1-AR.
21
Il est important de noter que les propriétés de ces molécules peuvent différer selon les
concentrations testées, les modèles d‟études (espèce, système natif ou de réexpression…) ou
encore l‟énantiomère utilisé. Ainsi par exemple, au niveau de l‟aorte de rat, le D-Nébivolol
induit une vasorelaxation dépendante à la fois des sous-types β2- et β3-AR alors que le LNébivolol induit une vasorelaxation dépendant uniquement du sous-type β3-AR (Tran Quang
et al., 2009). Dans une autre étude, les différents énantiomères du fénotérol, un agoniste
β2-AR, induisent un couplage du récepteur à différentes protéines G conduisant à des réponses
physiologiques différentes (Woo et al., 2009).
1.2.2.3. Désensibilisation des récepteurs β-AR
Deux mécanismes de désensibilisation ont été mis en évidence : la désensibilisation
hétérologue et la désensibilisation homologue. La désensibilisation homologue contrairement
à la désensibilisation hétérologue nécéssite la liaison d‟un ligand au récepteur.
La désensibilisation hétérologue implique la phosphorylation de résidus sérine et
thréonine des boucles cytoplasmiques intracellulaire et du domaine C-ter des récepteurs β-AR
par la PKA. Cela provoque un découplage rapide de la protéine G couplée au récepteur β-AR.
Cette désensibilisation est dite hétérologue car elle ne requiert pas la fixation d‟un agoniste au
récepteur β-AR et permet la désensibilisation de récepteurs pour d‟autres ligands (Freedman
& Lefkowitz, 1996).
La désensibilisation homologue implique de son côté la phosphorylation des
récepteurs β-AR par des GRK. Ce phénomène s‟effectue en 2 étapes. Lorsqu‟un ligand lie un
récepteur, cela provoque un changement de conformation de ce dernier et favorise ainsi, la
phosphorylation du récepteur par les GRK au niveau de la 3ème boucle cytoplasmique
intracellulaire et du domaine C-ter (Walther &
Ferguson, 2013). Ces phosphorylations
provoque une augmentation de l‟affinité du récepteur pour la β-arrestine (Lohse et al., 1992).
C‟est la liaison de cette β-arrestine au récepteur qui joue un rôle important dans le découplage
récepteur-protéine G. De plus, la β-arrestine joue également un rôle de protéine adaptatrice
grâce à ses motifs de liaison à la clathrine sur sa queue C-ter (Goodman et al., 1996) qui
facilite l‟interaction des récepteurs β-AR avec les vésicules de clathrine et par conséquent leur
internalisation aboutissant à leur dégradation et/ou leur recyclage à la membrane plasmique
(Kohout & Lefkowitz, 2003).
22
Contrairement aux récepteurs β1- et β2-AR, les β3-AR ne présentent pas de sites de
phosphorylation pour la PKA ou les GRK, et semblent donc réfractaires à la désensibilisation
homologue ou hétérologue (Rozec & Gauthier, 2006).
1.2.2.3. Régulation β-AR de la fonction cardiaque
Le sous-type β1-AR est majoritaire à la membrane des cardiomyocytes avec un ratio
β1-/β2-AR d‟environ 70%/30% dans les oreillettes et 80%/20% dans les ventricules. De plus,
ces récepteurs présentent des localisations à la membrane des cardiomyocytes différentes. En
effet, il est clairement démontré que les β1-AR sont retrouvés sur l‟ensemble de la surface des
cardiomyocytes alors que les β2-AR sont retrouvés au niveau des cavéoles (Steinberg, 2004;
Patel et al., 2008; Macdougall et al., 2012) et des tubules T (Nikolaev et al., 2010). Une étude
récente met cependant en évidence qu‟environ 85% des récepteurs β2-AR ne sont pas
localisés au niveau des cavéoles dans ces cellules H9c2 (lignée cellulaire clonée à partir de
cardiomyocyte de rat) sans pour autant exclure la participation des cavéoles dans la
signalisation β2-AR (Valentine & Haggie, 2011). Ce résultat est toutefois à interpréter avec
précaution étant donné l‟utilisation de cellules H9c2 qui présentent de nombreuses différences
avec les cardiomyocytes.
Concernant le sous type β3-AR, sa proportion n‟a pas encore pu être évaluée du fait
d‟un manque de radioligands suffisamment spécifiques permettant de mener les études de
binding nécessaires (Niclauss et al., 2006). La localisation cardiomyocytaire des β3-AR n‟a
été rapportée à l‟heure actuelle que dans une seule étude où les auteurs mettent en évidence
une localisation des β3-AR, dans des cœurs humains explantés IC, au niveau des disques
intercalaires (Napp et al., 2009). Les sous-types β1-AR et β3-AR, mais pas le sous-type β2AR, ont également été retrouvés à la membrane nucléaire de cardiomyocytes de rats et de
souris (Boivin et al., 2006).
a- Voies de signalisation et effets cardiaques du récepteur β1-AR
La stimulation du récepteur β1-AR catalyse la liaison de la sous-unité Gα d‟une
protéine G trimérique stimulatrice (Gs) à une molécule de GTP provoquant son détachement
des sous-unités Gβγ. La sous-unité Gα-GTP libre lie et active les AC et donc la voie
AC/AMPc/PKA. Les AC5 et AC6 sont les isoformes majoritaires dans le cœur (Defer et al.,
2000; Dessauer, 2009).
L‟activation de la voie AC/AMPc/PKA suite à une stimulation du récepteur β 1-AR va
conduire à des effets inotrope (vitesse de contraction), lusitrope (vitesse de relaxation),
23
chronotrope (fréquence) et dromotrope (vitesse de conduction) positifs. La PKA active
phosphoryle notamment des protéines impliquées dans le CEC (Ca2+ de type L, RYR2, PLB,
…) et des protéines de la machinerie contractile (TnI, Titine, …).
La phosphorylation des canaux Ca2+ de type L par la PKA augmente leur probabilité
d‟ouverture de 3 à 7 fois selon les études (Keef et al., 2001). Il en résulte une augmentation
du courant ICa,L et donc une augmentation de la [Ca2+]i au niveau des couplons. Dans le même
temps, la phosphorylation des canaux RYR2 augmente l‟activité du canal ainsi que sa
sensibilité au Ca2+ (Kushnir & Marks, 2010). Ces 2 phénomènes combinés intensifient le
CICR induisant une forte augmentation de la [Ca2+]i. Cela provoque une augmentation de
l‟amplitude de la contraction (effet inotrope positif) (Figure 12).
La PKA phosphoryle la TnI en 2 sites. Cela induit un changement conformationnel de
celle-ci provoquant une accélération de la cinétique de formation-rupture des ponts actomyosine (Kentish et al., 2001). Cela va à la fois avoir un effet inotrope et lusitrope positif.
Cette double phosphorylation de la TnI induit également un changement conformationnel du
complexe hétérotrimérique de Tn conduisant à une diminution de l‟affinité de la TnC pour le
Ca2+ amplifiant l‟effet lusitrope positif observé (Wijnker et al., 2012). La PKA phosphoryle
également au niveau des myofilaments l‟isoforme N2B de la titine réduisant sa rigidité. Cela
facilite l‟allongement des sarcomères lors de la relaxation (Yamasaki et al., 2002), ce qui
conduit à une diminution de la Fpassive du myocarde (augmentation de la compliance)
permettant un meilleur remplissage ventriculaire lors d‟une stimulation β1-AR (effet lusitrope
positif) (Figure 12).
Le PLB est également phosphorylé par la PKA. Cela provoque sa dissociation de la
SERCA2a et lève ainsi l‟inhibition exercée sur cette protéine (Cerra & Imbrogno, 2012)
ayant pour effet de favoriser la recapture du Ca2+ par le RS et ainsi d‟accélérer la relaxation
(effet lusitrope positif) (Figure 12).
Enfin la PKA phosphoryle et active des PDE4D et des PDE3 provoquant un
rétrocontrôle par dégradation de l‟AMPc (Fischmeister et al., 2006; Xiang, 2011). Ceci a
notamment pour but de limiter/contrôler l‟activation de la voie AC/AMPc/PKA qui peut avoir
des effets délétères à la fois par l‟induction d‟une surcharge calcique au niveau des
cardiomyocytes mais également par activation, par la PKA, d‟une voie de signalisation proapoptotique (Ponicke et al., 2003). Cette voie de signalisation est la voie de la GSK3β
24
(glycogène synthase kinase-3β) qui conduit à la libération d‟un facteur pro-apoptotique par les
mitochondries : le cytochrome c (Figure 12).
La stimulation prolongée du récepteur β1-AR, active une autre voie, la voie de la
CaMKII indépendante de la PKA (Grimm & Brown, 2009). La phosphorylation du récepteur
β1-AR par les GRK (principalement GRK2 au niveau cardiaque) permet le recrutement d‟un
complexe composé d‟une β-arrestine, de la CaMKII et d‟Epac. L‟AMPc nouvellement
synthétisé à proximité du complexe par l‟AC permet l‟activation d‟Epac qui active à son tour,
via la voie Rap, la CaMKII (Mangmool et al., 2010). La CaMKII activée phosphoryle des
protéines impliquées dans le CEC (Ca2+ de type L, RYR2, PLB, …) (Maier & Bers, 2007) et
des protéines de la machinerie contractile (titine, …) (Hamdani et al., 2013). Dans des
conditions pathologiques où le système sympathique est fortement activé la CaMKII va
également être responsable d‟une hypertrophie (Backs et al., 2006; Mishra et al., 2010) voir
d‟une apoptose des cardiomyocytes (Zhu et al., 2003) (Figure 12).
25
Ca2+ Ca2+
Membrane
plasmique
β3-AR
β1-AR
Ca2+-ATPase
AC
αs
Gs
Gi
AMPc
L-arginine
e/nNOS
GTP
GC
NO
GMPc
ATP ADP
ATP
GRK2
βArr-Epac
L-citrulline
PDE5
PKG
TnI
Ca2+
Ca2+
PI3K
PDE2
NXC
Gs
Akt
Titine
Gi
αi
AMPc
β2-AR
AC
Cavéole
ATP
PKA
PLC
Bcl-XL
GSK3β
Myofilaments
αs
β1-AR
Tubule
transverse
Cytochrome c
Gs
Mitochondrie
Citerne
Ca2+
SERCA2a
Ca2+
Ca2+
PLB
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Apoptose
AA
Ca2+
Réticulum sarcoplasmique
Ca2+
Ca2+
PKA
Ca2+ L
Ca2+
Ca2+
Ca2+
RYR2
ATP ADP
ATP ADP
AMPc
ATP
αs
Gs
GRK2
β1-AR
PDE4D
Noyau
β3-AR
βArr-Epac
AC
Gènes de
l’hypertrophie
PKA
PDE3
HDAC4
β1-AR
Cytosol
Figure 12. Voies de signalisations β-adrénergiques cardiaques.
AA : acide arachidonique, AC : adénylate cyclase, ADP : adénosine diphosphate, αi : sous unité alpha
inhibitrice, Akt : protéine Akt, AMPc : adénosine monophosphate cyclique, αs : sous unité alpha stimulatrice,
ATP : adénosine triphosphate, β-AR : récepteurs β-adrénergiques, β-Arr : β-arrestine, Bcl-XL : Bcl-2 related
gene X, long isoform, Ca2+ : ion calcium, Ca2+-ATPase : pompe calcique de la membrane plasmique adénosine
triphosphatase, CaMKII : protéine kinase dépendante du complexe Ca2+/calmoduline, Ca2+ L : canaux Ca2+ de
type L, Epac : protéine d‟échange activée par l‟AMPc, eNOS : synthase endothéliale de monoxyde d‟azote, GC :
26
guanylate cyclase, Gi : protéine G inhibitrice, GMPc : guanosine monophosphate cyclique, GRK2 : kinase des
récepteurs couplés aux protéines G, Gs : protéine G stimulatrice, GSK3β :glycogène synthase kinase-3β, GTP :
guanosine triphosphate, HDAC4 : histone désacétylase de type 4, MEF2 : myocyte enhancer factor 2, NCX :
échangeur sodium/Ca2+, NO : monoxyde d‟azote, PDE : phosphodiesterase, PI3K : phosphatidylinositol-3kinase, PKA : protéine kinase A, PKG : protéine kinase G, PLB : phospholamban, PLC : phospholipase C,
RYR2 : récepteur à la ryanodine, SERCA2a : sarco/endoplasmique reticulum Ca2+ adenosine triphosphatase,
TnI : troponine I, : phosphorylation, : S-nitrosylation.
La phosphorylation des canaux Ca2+ de type L par la CaMKII, dépendante de la
[Ca2+]i, provoque une augmentation du courant ICa,L. Dans le même temps, la CaMKII
phosphoryle les canaux RYR2 augmentant leur fréquence d‟ouverture ainsi que leur
sensibilité au Ca2+ (Wehrens, 2011). La CaMKII va ainsi renforcer l‟effet inotrope positif
engendré par la PKA. La CaMKII permet également un effet lusitrope positif accentué par la
phosphorylation du PLB provoquant sa dissociation de la SERCA2a (Wu et al., 2012). En cas
de forte stimulation β1-AR, la CaMKII va ainsi permettre d‟assurer une relation forcefréquence positive (Kushnir et al., 2010). Ce mécanisme est cependant délétère et notamment
pro-arythmogène au cours de l‟IC. Il a été récemment démontré une association entre une
augmentation des fuites de Ca2+ du RS dans des cœurs issus de patients en IC et une
augmentation du niveau de phosphorylation de RYR2 par la CaMKII (Fischer et al., 2013)
(Figure 12).
Au niveau des myofilaments, la CaMKII phosphoryle à la fois l‟isoforme N2B et
l‟isoforme N2BA de la titine réduisant leur rigidité permettant ainsi une diminution de la
Fpassive du myocarde et un effet lusitrope positif (Hamdani et al., 2013) (Figure 12).
Dans des conditions pathologiques où la stimulation β1-AR est trop importante, la
CaMKII phosphoryle les histones désacétylases de type 4 (HDAC4), ce qui lève l‟inhibition
de ces HDAC4 sur le facteur de transcription pro-hypertrophique MEF2 (myocyte enhancer
factor 2) (Mishra et al., 2010; Li et al., 2011) conduisant à une hypertrophie cardiaque. La
CaMKII va également avoir des effets pro-apoptotique en induisant une diminution de
l‟expression de la protéine anti-apoptotique Bcl-XL (Bcl-2 related gene X, long isoform)
favorisant la libération du cytochrome c, par les mitochondries (Zhu et al., 2007). La voie
CaMKII va enfin inhiber la voie phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K)/protéine Akt (Akt) et
lever son action anti-apoptotique (Liang et al., 2008) (cf Voies de signalisation et effets
cardiaques du récepteur β2-AR) (Figure 12).
27
b- Voies de signalisation et effets cardiaques du récepteur β2-AR
La stimulation du récepteur β2-AR active également la voie AC/AMPc/PKA. Bien que
le couplage du récepteur β2-AR à la protéine Gs soit plus stable que le couplage du récepteur
β1-AR à cette même protéine Gs (Casella et al., 2011), la stimulation de la voie
AC/AMPc/PKA par le récepteur β2-AR est de plus faible efficacité (Brodde & Michel, 1999).
En effet, bien qu‟une réponse inotrope soit observée suite à une stimulation β1-AR ou β2-AR,
l‟observation d‟une réponse lusitrope varie en fonction du récepteur stimulé mais également
en fonction de l‟espèce considérée (Afzal et al., 2011) (Figure 12).
Cela s‟explique par la localisation des récepteurs β2-AR au niveau des cavéoles à la
membrane des cardiomyocytes (Calaghan et al., 2008) ainsi que par l‟action de certaines
PDE. Comme après une stimulation du récepteur β1-AR, la PKA par phosphorylation des
PDE3 et PDE4D impose un rétrocontrôle négatif sur les concentrations d‟AMPc limitant les
effets de la stimulation β2-AR. Ces effets restent localisés à la périphérie des cavéoles
contrairement à ceux initiés par une stimulation β1-AR qui ont un effet beaucoup plus
répandue dans l‟ensemble du cardiomyocyte (Xiao, 2001), en raison de la répartition plus
homogène du récepteur β1-AR sur la membrane des cardiomyocytes (Figure 12).
De plus, le récepteur β2-AR est capable de lier une protéine G inhibitrice (Gi). Lors
d‟une stimulation prolongée, le récepteur β2-AR est phosphorylé par la PKA. Cela provoque
une diminution de l‟interaction du récepteur avec la protéine Gs et augmente son interaction
avec la protéine Gi (Daaka et al., 1997; Xiao, 2001). L‟activation de Gi conduit d‟une part à
l‟inhibition de la voie AC/AMPc/PKA, et donc à des effets inotropes et lusitropes négatifs, et
d‟autre part à l‟activation d‟autres voies de signalisation telles que la voie PI3K/Akt et la voie
de la phospholipase A2 cytosolique (cPLA2) (Pavoine & Defer, 2005) (Figure 12).
L‟inhibition de la voie AC/AMPc/PKA a un rôle protecteur vis à vis des effets
potentiellement néfastes de la stimulation trop importante du récepteur β1-AR. Cependant,
cette inhibition compromet également les capacités contractile du myocarde (Woo & Xiao,
2012) (Figure 12).
L‟activation de la voie PI3K/Akt par la protéine Gi inhibe également la voie
AC/AMPc/PKA par activation des PDE4D (Kerfant et al., 2006; Gregg et al., 2010). Cette
voie possède, de plus, des effets anti-apoptotiques par inhibition de la voie de signalisation de
la GSK3β/cytochrome c (Miyamoto et al., 2009). Ces effets vont ainsi contrebalancer les
effets pro-apoptotiques de la PKA et la CaMKII (cf Voies de signalisation et effets cardiaques
28
du récepteur β1-AR). La voie cPLA2 va quant à elle catalyser la formation d‟acide
arachidonique (AA). L‟AA va activer plusieurs cibles dont les canaux Ca2+ de type L (Xiao et
al., 1997) et les RYR2 (Uehara et al., 1996) conduisant à un effet inotrope positif (Pavoine &
Defer, 2005).
c- Voies de signalisation et effets cardiaques du récepteur β3-AR
La stimulation du récepteur β3-AR catalyse sa liaison à une protéine Gi (Gauthier et
al., 1996) aboutissant à l‟activation de la voie du monoxyde d‟azote (NO) (cf Régulation
endothéliale de la fonction cardiaque). La production de NO est attribuée à la NO synthase
endothéliale (eNOS) (Gauthier et al., 1998). Cependant des études récentes rapportent une
implication de la synthase neuronale de NO (nNOS) soit seule (Kulandavelu & Hare, 2012;
Niu et al., 2012) soit associée à la eNOS (Aragon et al., 2011) dans des conditions
pathologiques. Une étude a également mis en évidence une augmentation des transcrits de la
synthase inductible de NO (iNOS) dans du tissu cardiaque après 5h d‟incubation avec du
Nébivolol, qui possède des propriétés agoniste β3-AR et antagoniste β1-AR (Maffei et al.,
2007) (Figure 12).
Le NO produit active la GC soluble et donc la voie GC/GMPc/PKG. Cette voie
possède à la fois un effet inotrope négatif direct par la phosphorylation des canaux Ca2+ de
type L (Yang et al., 2007) et de la TnI (Lee et al., 2010) par la PKG, et un effet inotrope
négatif indirect par activation de la PDE2, suite à l‟augmentation de la concentration en
GMPc, qui diminue l‟action de la voie AC/AMPc/PKA (Mongillo et al., 2006). Un effet
inotrope négatif direct du NO est également possible par S-nitrosylation des canaux Ca2+ de
type L (Burger et al., 2009). La voie GCs/GMPc/PKG possède également un effet lusitrope
positif par phosphorylation des isoformes de la titine provoquant la diminution de la Fpassive du
myocarde (Kruger et al., 2009) (Figure 12).
1.2.2.4. Régulation de la vasomotricité
Au niveau vasculaire, les trois sous-types de récepteurs β-AR sont exprimés à la
membrane des cellules endothéliales alors que seuls les récepteurs β1- et β2-AR sont exprimés
à la membrane des CML. Cependant, la proportion et la localisation des différents sous-types
de récepteurs β-AR dépendent du lit vasculaire ainsi que de l‟espèce considérée (Guimaraes
& Moura, 2001). Pendant des années, la vasorelaxation induite par les catécholamines a été
uniquement attribuée au sous-type β2-AR (Lands et al., 1967) avant que des études ne
démontrent l‟implication du sous-type β1-AR (O'Donnell &
29
Wanstall, 1984; Graves &
Poston, 1993). Des études plus récentes ont même mis en évidence une implication
majoritaire des récepteurs β1-AR dans la vasorelaxation chez la souris (Chruscinski et al.,
2001) et au niveau des artères mésentériques de rat (Briones et al., 2005; Garland et al.,
2011). De plus, l‟implication du sous-type β3-AR dans la vasorelaxation induite par les
catécholamines a également été rapportée dans plusieurs lits vasculaires dont notamment les
artères mammaires internes (Rozec et al., 2005) et les artères coronaires chez l‟homme (Dessy
et al., 2004). Deux études récentes mettent en évidence que le taux des transcrits β3-AR est
très nettement supérieur aux taux des transcrits β1- et β2-AR au niveau de l‟aorte thoracique
de rat (Oliver et al., 2009; Flacco et al., 2013). L‟étude la plus récente rapporte qu‟à l‟inverse
le taux des transcrits β3-AR est très largement inférieur aux taux des transcrits β1 et β2-AR au
niveau de l‟artère mésentérique de rat (Flacco et al., 2013). Il est cependant important de
rester prudent quant à ces résultats qui ne reflètent pas les niveaux protéiques et encore moins
les niveaux d‟expression membranaire de ces récepteurs.
De nombreuses études sont encore de nos jours contradictoires concernant la
vasorelaxation β-AR. En effet, il est établi que la réponse physiologique à un agoniste β-AR
va pouvoir varier en fonction du diamètre des vaisseaux et sera au cours des études in vitro
très fortement dépendante de la précontraction (amplitude, stimulus). Ainsi, au niveau
pulmonaire, dans les artères extralobaires et intralobaires proximales (branches de 2e ou 3e
ordre), le sous-type 2-AR a un rôle prédominant (Priest et al., 1997; Pourageaud et al., 2005)
tandis que dans les artères intralobaires distales (branches de 5e ou 6e ordre), les sous-types
1- et 2-AR sont impliqués (Priest et al., 1997). Dans une autre étude, le même groupe
rapporte une vasorelaxation à l‟isoprénaline différente selon que les anneaux d‟artères
pulmonaires utilisés dans l‟étude aient été précontractées avec de la phényléphrine (PE) ou de
la prostaglandine de type F2 (PGF2) (Priest et al., 1999).
a- Voies de signalisation et effets vasculaires des récepteurs β1- et β2-AR
A la membrane des CML et des cellules endothéliales, la stimulation des récepteurs
β1- et β2-AR induit l‟activation de la voie AC/AMPc/PKA. L‟activation de cette voie entraîne
dans les cellules endothéliales l‟activation de la eNOS et la synthèse de NO (cf Régulation
endothéliale de la fonction cardiaque). Le NO produit diffuse à travers les membranes
plasmiques vers les CML où il active la voie GCs/GMPc/PKG (Francis et al., 2010). De
manière intéressante, comme cela a déjà été évoqué, il est établi que de fortes concentrations
en AMPc et en GMPc sont également capables d‟activer respectivement la PKG et la PKA
(Burnette & White, 2006; Morgado et al., 2012) (Figure 13).
30
Au niveau des CML, la PKA et/ou la PKG vont phosphoryler de nombreuses protéines
aboutissant à une relaxation par (i) une désensibilisation de l‟appareil contractile des CML
(MLCK, MLCP, RhoA …) et par (ii) un retour de la [Ca2+]i à son niveau de repos (Ca2+ de
type L, PLB, IP3R, canaux potassiques, …).
La désensibilisation de l‟appareil contractile des CML implique la phosphorylation de
la MLCK par la PKA, ce qui diminue son affinité pour le complexe Ca2+-CaM (Tansey et al.,
1994) et donc son activité. A l‟inverse, la PKA et la PKG par inhibition de la voie
RhoA/RhoKinase permettent la phosphorylation de la MLCP augmentant son activité et
favorisant la déphosphorylation de la MLC20 (Sauzeau et al., 2000; Nakamura et al., 2007;
Aslam et al., 2010) (Figure 13).
Le retour de la [Ca2+]i à son niveau de repos implique une inactivation des canaux
Ca2+ de type L. Cette inactivation est induite par une repolarisation voir une hyperpolarisation
membranaire qui dépend de la phosphorylation et de l‟activation par la PKA et/ou la PKG de
nombreux canaux ioniques de la membrane plasmique, dont des canaux potassiques (Barman
et al., 2003; Tian et al., 2004; Shi et al., 2007; Yang et al., 2008), et de la Ca2+-ATPase de la
membrane plasmique. De plus, la PKG phosphoryle l‟IP3R et l‟inactive empêchant ainsi
l‟augmentation de la [Ca2+]i par libération de Ca2+ des stocks du RS (Komalavilas & Lincoln,
1996). Enfin, la phosphorylation par la PKA et la PKG du PLB provoque son détachement de
SERCA2b et le recaptage du Ca2+ par le RS (Morgado et al., 2012) (Figure 13).
b- Voies de signalisation et effets vasculaires des récepteurs β3-AR
La stimulation du sous-type β3-AR, localisé uniquement à la membrane des cellules
endothéliales, aboutit à la libération par les cellules endothéliales de NO après activation de la
eNOS (Dessy et al., 2004; Rozec et al., 2005; Feng et al., 2012). Une étude réalisée sur des
cellules endothéliales en culture met en évidence l‟implication possible de la protéine G
monomérique Rac1 (Ras related C3 botulinum toxin substrat 1) et de la PKA dans la voie de
signalisation du récepteur β3-AR aboutissant à l‟activation de la eNOS (Kou & Michel, 2007)
(Figure 13).
Le NO produit diffuse vers les CML dans lesquelles il active la GCs et initie les
mécanismes de relaxation induits par la PKG. Il est également démontré, au niveau coronaire
chez l‟homme, que la vasorelaxation induite par les récepteurs β3-AR est en partie dépendante
de la libération d‟EDHF (endothelium derived hyperpolarizing factor) (Dessy et al., 2004).
(Figure 13).
31
β3-AR
Membrane plasmique
Cytosol
PKA
L-arginine
PKA
eNOS
L-citrulline
NO
Cellule endothéliale
EDHF
K+
Hyperpolarisation
membranaire
K+
K+
+
K+ K
Canaux
potassiques
K+
NO
Ca2+
K+
EDHF
Ca2+-ATPase
ADP
ATP
GC
GTP
Cellule
musculaire lisse
GMPc
Ca2+ L
β2-AR
IP3R
PKG
Gs
PKA
Réticulum
sarcoplasmique
αs
PLB
ATP
AC
RhoA
ADP
AMPc
αs
Ca2+
ATP
Serca2b
Rho-Kinase
MLCP
Gs
Cytosol
PKA
Myosine (inactive)
Relaxation
Myosine (active)
Contraction
β1-AR
MLCK
Figure 13. Voies de signalisation β-adrénergiques vasculaires.
AC : adénylate cyclase, ADP : adénosine diphosphate, AMPc : adénosine monophosphate cyclique, αs : sous
unité alpha stimulatrice, ATP : adénosine triphosphate, β-AR : récepteurs β-adrénergiques, Ca2+ : ion calcium,
Ca2+-ATPase : pompe calcique de la membrane plasmique adénosine triphosphatase, Ca2+ L: canaux Ca2+ de
32
type L, EDHF : endothelium derived hyperpolarizing factor, eNOS : synthase endothéliale de monoxyde
d‟azote, GC : guanylate cyclase, GMPc : guanosine monophosphate cyclique, Gs : protéine G stimulatrice,
GTP : guanosine triphosphate, IP3R : récepteur à l‟inositol triphosphate, K+ : ion potassium, MLCK : kinase des
chaînes légères de la myosine, MLCP : phosphatase des chaînes légères de la myosine, NO : monoxyde d‟azote,
PDE : phosphodiesterase, PI3K : phosphatidylinositol-3-kinase, PKA : protéine kinase A, PKG : protéine kinase
G, PLB : phospholamban, PLC : phospholipase C, Rac1 : Ras related C3 botulinum toxin substrat 1, RhoA : Ras
homolog type A, RYR2 : récepteur à la ryanodine, SERCA2b : sarco/endoplasmique reticulum Ca2+ adenosine
triphosphatase, : phosphorylation.
1.2.3. Régulation endothéliale de la fonction cardiaque
Il est établi que les cardiomyocytes, bien que représentant environ 75% du poids du
cœur sont trois fois moins nombreux que les cellules endothéliales dans le cœur (Anversa et
al., 1980). Le myocarde ne peut donc pas être considéré comme étant un muscle avec une
perfusion coronaire et une régulation uniquement neuro-hormonale mais doit être considéré
comme un organe pluricellulaire et multifonctionnel au sein duquel certains types cellulaires
comme les cellules endothéliales jouent un rôle essentiel dans la contractilité cardiaque
(Brutsaert, 2003). L‟endothélium joue un rôle important dans la régulation de la
vasomotricité, la perméabilité vasculaire (Stevens et al., 2000) et la prévention des
phénomènes thrombotiques (Grandel &
Grimminger, 2003). De plus l‟endothélium est
capable d‟interagir directement avec les cardiomyocytes afin de réguler leur contractilité. Cela
est permis grâce à une proximité importante entre cardiomyocytes et cellules endothéliales.
Un cardiomyocyte ne se trouve ainsi jamais à plus de 50 µm d‟une cellule endothéliale chez
l‟homme (Brutsaert, 2003).
Au niveau cardiaque 2 types d‟endothéliums sont décrits: (i) l‟endothélium
endocardique (EE) qui tapisse les parois des cavités ventriculaires et (ii) l‟endothélium des
capillaires coronaires (ECC) qui tapisse l‟ensemble du réseau vasculaire perfusant le cœur.
Ces 2 types d‟endothélium, bien que présentant des similitudes au niveau structurel et
fonctionnel, présentent également de nombreuses différences (Tableau V) (Kuruvilla &
Kartha, 2003).
33
Tableau V. Différences entre endothélium endocardique (EE) et endothélium des capillaires coronaires
(ECC)
EE
ECC
Localisation
Cavités cardiaques
Capillaires coronaires
Origine embryonnaire
Plaque cardiogénique
Cellules mésothéliales de
l‟épicarde
Organisation
du cytosquelette
>
Fibres de stress
Filaments de Vimentine
et microtubules
>
>
<
Golgi
Activité métabolique
Organelles
Vésicules
Jonctions
cellulaires
Compactes et alignés dans
l‟axe cellulaire
Réseau filamenteux
Espaces intercellulaires
Profonds
1 à 2 jonctions serrées
Peu profonds
Peu de jonctions serrées
Jonctions GAP
Abondantes
Probablement absentes
D‟après (Kuruvilla & Kartha, 2003)
Il y a 25 ans, Brutsaert et ses collaborateurs ont montré que l‟EE est capable de réguler
la contractilité cardiaque (Brutsaert et al., 1988). Après avoir immergé des muscles papillaires
de chat dans du Triton X-100 à 1% durant 1 s, ils ont réalisé des expériences de contraction à
diverses concentrations extracellulaires en Ca2+. Ils ont mis en évidence l‟apparition rapide
d‟une relaxation conduisant à une diminution de la durée et de l‟amplitude de contraction, au
moins pour les 2 premières concentrations en Ca2+, au niveau des muscles papillaires
désendothélialisés (Figure 14). Ces modifications de la contractilité des muscles papillaires
mettent ainsi en évidence la régulation de l‟activité contractile cardiaque par l‟EE. Ces
résultats ont depuis été confirmés (Bras-Silva & Leite-Moreira, 2006; Shen et al., 2013) et
transposés à l‟ECC (Li et al., 1993; Soni et al., 2010).
1,25 mM Ca2+
100
50
2,5 mM Ca2+
7,5 mM Ca2+
T (mN/mm2)
100ms
0
Figure 14. Effet de la désendothélialisation au Triton X-100 sur la contractilité du muscle papillaire de
chat. D‟après (Brutsaert et al., 1988).
─ : Endothélium intègre, --- : Endothélium abrasé, Ca2+ : ion calcium, T : tension développée.
34
Cette régulation de l‟endothélium sur la contractilité cardiaque s‟effectue par une
action autocrine et paracrine des cellules endothéliales impliquant notamment le NO,
l‟endothéline (ET) et les eicosanoïdes. Ces molécules permettent un maintien de la sensibilité
des myofilaments au Ca2+ (Brutsaert, 2003). Il a ainsi été récemment démontré que l‟EE est
essentiel au maintien d‟une relation force-fréquence positive. Ce phénomène implique
l‟activation combinée, dans les cardiomyocytes, des voies de signalisation AC/AMPc/PKA,
dépendante des récepteurs β1-AR, et PLC/DAG/PKG, dépendante des récepteurs à l‟ET-1
(Shen et al., 2013).
1.2.3.1. Le NO
Le NO est synthétisé à partir de la L-Arginine par trois types de NOS : la nNOS ou
NOS1, la eNOS ou NOS3 et la iNOS ou NOS2 (Bryan et al., 2009). La nNOS et la eNOS
sont exprimées par divers types cellulaires autres que ceux dans lesquels elles ont été
découvertes. La nNOS est notamment exprimée dans les CML et les cardiomyocytes tandis
que la eNOS est retrouvée dans les cardiomyocytes ou encore les plaquettes (Boulanger et al.,
1998; Moniotte et al., 2007; Seddon et al., 2007; Seddon et al., 2008). Ces 2 isoformes sont
dites constitutives mais il semblerait que leurs expressions puissent être régulées par des
stimuli physiologiques comme les forces de cisaillement (Gaucher et al., 2007). Lorsqu‟elles
sont activées, ces isoformes produisent du NO en petite quantité, de façon pulsatile et à court
terme (Bryan et al., 2009). La iNOS a initialement été décrite dans des macrophages
immunoactivés (Marletta et al., 1988) puis dans d‟autres types cellulaires dont les
cardiomyocytes (Jung et al., 2000), les CML (Hong et al., 2000) et les cellules endothéliales
(Zulueta et al., 2002). Elle est dite inductible car son expression est induite par des stimuli
inflammatoires comme les endotoxines ou certaines cytokines. Il a cependant été rapporté que
cette isoforme est exprimée de façon constitutive dans certains types cellulaires dont les
macrophages et les neutrophiles. Contrairement aux deux autres isoformes de NOS, la iNOS
lorsqu‟elle est activée, produit de fortes quantités de NO (Bryan et al., 2009).
Au niveau des cellules de l‟EE et de l‟ECC, le NO est produit par la eNOS. Il active la
voie GC/GMPc/PKG mais a également des effets indépendants de cette voie qui ne seront pas
détaillés dans ce manuscrit (Balligand & Cannon, 1997; Chesnais et al., 1999; Chesnais et
al., 1999). L‟activation de la voie GC/GMPc/PKG a des effets dépendants de la concentration
en NO (Casadei & Sears, 2003). Ainsi à de faibles concentrations (au repos), le NO a un effet
inotrope positif sur la contraction cardiaque alors qu‟à de fortes concentrations (à l‟effort, en
35
condition pathologique), le NO a un effet inotrope négatif (Francis et al., 2010; Hammond &
Balligand, 2012). Cela s‟explique car à de faibles concentrations le GMPc produit inhibe la
PDE3 induisant une augmentation des concentrations en AMPc alors qu‟à des concentrations
plus importantes, le GMPc active la PKG (Zaccolo & Movsesian, 2007) qui phosphoryle et
inactive les canaux Ca2+ de type L (Yang et al., 2007) et phosphoryle la TnI (Lee et al., 2010).
Le GMPc active également la PDE2 qui catalyse l‟AMPc et diminue l‟action de la voie
AC/AMPc/PKA (Mongillo et al., 2006). Enfin, un effet inotrope négatif direct du NO est
également possible par S-nitrosylation des canaux Ca2+ de type L (Burger et al., 2009).
1.2.3.2. L‟endothéline
L‟ET est un peptide cyclique de 21 acides aminés isolé pour la première fois dans le
surnageant de cellules endothéliales aortiques de porc en culture (Yanagisawa et al., 1988).
Ce peptide est encore de nos jours l‟agent vasoactif le plus puissant existant. Au niveau
cardiaque, en plus d‟être synthétisée et sécrétée par les cellules endothéliales (Kedzierski &
Yanagisawa, 2001) l‟ET-1 peut également être synthétisée en moindre quantité par les
fibroblastes (Fujisaki et al., 1995) et les cardiomyocytes (Suzuki et al., 1993). Les récepteurs
de l‟ET-1 sont des RCPG présents à la fois à la membrane des cellules endothéliales et des
cardiomyocytes. Il existe trois sous-type de récepteurs à l‟ET: le sous-type A (ETA), le soustype B (isoformes ETB1 et ETB2) et le sous-type C (ETC). Les deux premiers sous-types sont
retrouvés à la membrane des cardiomyocytes avec un ratio ETA/ETB2 d‟environ 80%/20%
(Allen et al., 2003). Ces récepteurs sont retrouvés en plus grande quantité dans les oreillettes
que dans les ventricules. A la membrane des cellules endothéliales, le sous-type majoritaire
est le sous-type ETB1 (Ohkita et al., 2012). Les différents récepteurs à l‟ET vont activer des
voies de signalisations nombreuses et variées dépendantes du type cellulaire et de la
concentration en ET-1.
En ce liant au récepteur ETB1 des cellules endothéliales, l‟ET-1 va avoir une action
paracrine par le biais de la production de NO et de prostacycline (PGI2). Ces derniers vont
engendrer une action inotrope négative sur les cardiomyocytes (Leite-Moreira & Bras-Silva,
2004).
A la membrane des cardiomyocytes, les récepteurs ETA et ETB2 lient principalement la
protéine Gq permettant la production par la PLC de DAG et d‟IP3. Le DAG va activer la PKC
qui, à son tour, active les canaux Ca2+ de type L, l‟échangeur Na+/proton (H+) et la protéine G
monomérique Ras (Drawnel et al., 2013). L‟activation des canaux Ca2+ de type L provoque
36
une augmentation du courant ICa,L et donc une augmentation de la [Ca2+]i. De plus,
l‟activation de l‟échangeur Na+/H+ induit une augmentation de la concentration intracellulaire
en Na+ provoquant l‟activation du NCX conduisant à une entrée de Ca2+ et une sortie de Na+
(Figure 15). Ce phénomène contribue à l‟augmentation de la [Ca2+]i (Cingolani & Ennis,
2007). L‟augmentation de la [Ca2+]i, associée à la sensibilisation des myofilaments par la
PKC (Pi et al., 2003), contribue à l‟effet inotrope positif généré par l‟ET-1.
Endothéline
H+
ETA/B2
NHX
Gq
Na+
NCX
PLC
Na+ Ca2+
PiP2
IP3
Tubule
transverse
DAG
[Ca2+]i
Ras
Ca2+ L
PKC
Ca2+
Hypertrophie
Cardiomyocyte
Contraction
Cytosol
Figure 15. Voies de signalisation des récepteurs à l’endothéline au niveau du cardiomyocyte.
AC : adénylate cyclase, AMPc : adénosine monophosphate cyclique, ATP : adénosine triphosphate, Ca2+ : ion
calcium, [Ca2+]i : concentration intracellulaire en Ca2+, Ca2+ L: canaux Ca2+ de type L, DAG : diacylglycérol,
ETA/B2 : récepteurs à l‟endothéline de type A et B2, Gq : protéine Gq, Gs : protéine G stimulatrice, H+ : proton,
IP3 : inositol triphosphate, Na+ : ion sodium, NCX : échangeurs Na+/Ca2+, NHX : échangeurs Na+/H+, PIP2 :
phosphatidylinositol-4,5-biphosphate, PKA : protéine kinase A, PKC : protéine kinase C, PLC : phospholipase
C, Ras : protéine Ras.
1.2.3.3. Les eicosanoïdes
Les eicosanoïdes sont des métabolites de l‟AA. Il en existe 2 familles, les leucotriènes,
qui ne seront pas détaillés dans ce manuscrit (Peters-Golden & Henderson, 2007), et les
prostanoïdes. Les prostanoïdes sont des acides gras polyinsaturés à 20 atomes de carbones. Ils
présentent un groupement cyclique, une double liaison entre les carbones 13 et 14 et un
groupement hydroxyle sur le carbone 15 (Bos et al., 2004) (Figure 16). Leur synthèse à partir
d‟AA implique l‟action d‟une enzyme, une cyclooxygénase (COX) (Smith et al., 2000), qui
convertie l‟AA en prostaglandine G2, puis en prostaglandine H2 (PGH2). La synthèse de
prostanoïdes à partir de PGH2 est réalisée par des synthases plus au moins spécifiques de
certains types cellulaires (Figure 16) conduisant à une production de prostanoïdes différents
d‟un type cellulaire à un autre. Ainsi, par exemple, les plaquettes synthétisent principalement
du tromboxane A2 (TxA2) alors que les cellules endothéliales synthétisent majoritairement des
37
PGI2 et que les cellules des tubes collecteurs du rein synthétisent principalement des
prostaglandines de type E (PGE) (Bos et al., 2004).
Il existe 2 isoformes de COX, l‟isoforme COX1 dite constitutive et l‟isoforme COX2
dite inductible. Il est cependant établi que les niveaux de COX1 peuvent être régulés par
certains processus inflammatoires alors que la COX2 est retrouvée en conditions
physiologiques dans certains tissus comme le cerveau ou les reins (Rouzer & Marnett, 2009).
Au niveau des cellules endothéliales vasculaires, la COX1 est retrouvée à la membrane
nucléaire et dans le cytoplasme alors que l‟isoforme COX2 est principalement localisée au
niveau de l‟enveloppe nucléaire (Parfenova et al., 2001). Dans des conditions physiologiques
la production de PGI2 par les cellules endothéliales, aussi bien vasculaires qu‟EE, est
dépendante de la COX1 (Kirkby et al., 2012).
Phosphatidylcholine
Phosphatidylinositol
cPLA2
PLC + glyceridelipase
Acide Arachidonique
2 O2
Cyclooxygénase
Chaine α
Chaine β
PGG2
Peroxidase
TXA synthase
TXA2
PGH2
PGD synthase
PGD2
PGI synthase
PGE synthase
PGE2
PGI2
PGF synthase
PGF2
Figure 16. Voies de synthèse des prostanoïdes. D‟après (Bos et al., 2004)
cPLA2 : phospholipase A2 cytosolique, PG : prostaglandine, PLC : phospholipase C, TxA2 : tromboxane A2.
Les récepteurs aux prostanoïdes sont des RCPG. Ils sont retrouvés à la membrane de
nombreux types cellulaires où ils vont avoir des fonctions variées en fonction des protéines G
auxquelles ils sont liés (Bos et al., 2004; Woodward et al., 2011). Au niveau cardiaque, un
38
nombre important de ces récepteurs est retrouvé à la membrane des cardiomyocytes de rat
(Tableau VI).
Tableau VI. Les récepteurs aux prostanoïdes au niveau cardiaque
Prostanoïdes
Récepteurs
Protéines G
Seconds messagers
Refs Localisation cardiaque
TxA2
TP
Gs
AMPc ↑
PGF2
FP
Gq
IP3/DAG
EP1
nd
[Ca2+]i ↑
EP2
Gs
AMPc ↑
(Takayama et al., 2005; Wacker et al.,
2009; Mechiche et al., 2012)
(Takayama et al., 2005; Jovanovic et
al., 2006; Mechiche et al., 2012)
(Mendez & LaPointe, 2002; Frazier et
al., 2012; Mechiche et al., 2012)
(Miyatake et al., 2007; Frazier et al.,
2012)
EP3 (A-D)
Gs, Gi, Gq
AMPc ↑, AMPc ↓
(Hohlfeld et al., 1997)
EP4
Gs
AMPc ↑
PGI2
IP
Gs, Gq
AMPc ↑, IP3/DAG
(Frias et al., 2007; Miyatake et al.,
2007; He et al., 2010)
(Ritchie et al., 2004; Mechiche et al.,
2012)
PGD2
DP (α et β)
Gi, Gs, Gq
IP3/DAG, AMPc ↓
PGE2
(Mechiche et al., 2012)
D‟après (Narumiya et al., 1999; Bos et al., 2004; Woodward et al., 2011)
AMPc : adénosine monophosphate cyclique, [Ca2+]i : concentration calcique intracellulaire, DAG :
diacylglycérol, DP : récepteur aux prostaglandines de type D, EP : récepteur aux prostaglandines de type E, FP :
récepteur aux prostaglandines de type F, Gi : protéine G inhibitrice, Gq : protéine Gq, Gs : protéine G
stimulatrice, IP : récepteur aux prostacyclines, IP3 : inositol triphosphate, nd : non déterminé, PGD/E/F/2 :
prostaglandines de type D/E/F2, PGI2 : prostacyclines, TP : récepteurs au tromboxane A2, TxA2 : tromboxane A2.
Une étude met en évidence la production importante de PGI2 et PGE2 par des cellules
EE de bovins en cultures. La production de PGI2 est 10 fois plus importante que celle de
PGE2 (Mebazaa et al., 1993). Dans une autre étude, le même groupe met en évidence une
production de PGI2 par des cellules EE 19 et 34 fois plus importante que par des cellules
endothéliales issus d‟aortes et d‟artères pulmonaires respectivement soumises à un stress
mécanique et un stress hypoxique (Mebazaa et al., 1995). Ces différences de productions
entre cellules EE et cellules endothéliales vasculaires ont par la suite été confirmées au niveau
de l‟ECC (Nosaka et al., 1997). De façon intéressante, cette étude rapporte également que
l‟ECC contrairement à l‟EE produit plus de PGE2 que de PGI2. La production de PGI va
également varier d‟une cavité cardiaque à l‟autre, en effet l‟EE produit plus de PGI2 au
niveau de l‟OD que de l‟OG (Nosaka et al., 1999). Les raisons de cette différence entre EE et
ECC ne sont pas encore clairement comprises à ce jour. La production importante de PGI2 par
l‟EE jouerait notamment un rôle anti-thrombotique important au niveau du VG (Discigil et
al., 2009).
39
Il est établi que les PGE2 et les PGI2 induisent des effets inotropes positifs (KischWedel et al., 2003; Klein et al., 2004; Riise et al., 2012) cependant les récepteurs impliqués
dans ces effets ne sont pas clairement déterminés. L‟activation des récepteurs aux PGF2 à
l‟aide de fluprostenol, un agoniste spécifique de ces récepteurs, induit un effet inotrope
positif, au niveau de cœur de rats (Riise et al., 2008) mais n‟induit aucun effet au niveau de
ventricules humain (Riise et al., 2012). De façon surprenante les PGF2 induisent un effet
inotrope négatif chez le rat (Jovanovic et al., 2006).
Des études mettent également en évidence des effets chronotropes des prostanoïdes.
Ainsi une étude récente démontre au niveau de cardiomyocytes de rats nouveau-nés un effet
chronotrope positif des récepteurs au TxA2, aux PGE2 et aux prostaglandines de type D2
(PDG2) et un effet chronotrope négatif des récepteurs IP et FP (Mechiche et al., 2012). A
l‟inverse, dans des conditions inflammatoires, les PGF2, ainsi que le TxA2, ont un effet
chronotrope positif sur le cœur de souris (Takayama et al., 2005).
Une régulation réciproque des voies du NO et des prostanoïdes est depuis longtemps
reconnue (Gerritsen, 1996; Hendrickson et al., 1999). Cette régulation réciproque est d‟autant
plus important dans de nombreuses pathologies impliquant des processus inflammatoires
comme l‟infarctus du myocarde, les accidents vasculaire cérébraux ou encore le choc septique
(Salvemini et al., 2013). Ainsi, la stimulation des eicosanoïdes endogènes (notamment les
PGI2) limite l‟effet inotrope du NO. De plus, la mise en évidence de l‟effet inotrope positif
des PGI2 dépend de l‟inhibition de la synthèse de NO (Brutsaert, 2003).
De façon intéressante, Shah et ses collaborateurs émettent l‟hypothèse selon laquelle
les eicosanoïdes, via leurs récepteurs, pourraient moduler les réponses inotropes d‟autres
agonistes (Shah et al., 1996). Ainsi le Treprostinil, un analogue des PGI2, potentialise l‟effet
inotrope positif des catécholamines dans les cardiomyocytes ventriculaires de rats adultes
(Fontana et al., 2007).
40
1.3. Choc Septique
1.3.1. Définitions
Le choc septique se défini comme la réponse inflammatoire systémique d‟un
organisme à une infection, d‟origine bactérienne, virale ou parasitaire, associée à une
défaillance cardiovasculaire. Les différents stades du sepsis ont été établis lors d‟une
conférence consensus en 1991 (Bone et al., 1992). Au cours de cette conférence, les termes
syndrome de réponse inflammatoire systémique (SIRS), sepsis, sepsis sévère, choc septique et
défaillance multi-viscérale ont été définis (Tableau VII). Le terme de SIRS a été introduit
pour la première fois afin d‟assurer la classification, lors d‟études épidémiologiques et
d‟essais cliniques randomisés, de patients présentant une hémoculture négative associé à des
symptômes de sepsis (pancréatites, grandes brûlés, traumatisme sévère).
Tableau VII. Définition et classification des différents stades du choc septique
Syndrome de Réponse inflammatoire
Systémique ou SIRS (Systemic
Inflammatory Response Syndrome)
Sepsis
Sepsis sévère
Choc septique
Syndrome de Défaillance Multi-Viscérale
(Multiple Organ Failure)
Les patients présentent au moins 2 des manifestations
suivantes :
▪ Température corporelle > 38°C ou < 36°C
▪ FC > 90 min-1 ou à 2 fois l‟écart type de la valeur normale à un
âge donné
▪ FR > 20 min-1 ou PaCO2 < 32mmHg
▪ Leucocytes sanguins > 12 000 ou < 4 000 mm-3 ou présence de
plus 10% de formes immatures de neutrophiles.
Les patients présentent un SIRS associé à la présence confirmée
ou supposée d‟un foyer infectieux
Les patients présentent les symptômes d‟un sepsis cumulé avec
une défaillance d‟organe, hypoperfusion ou hypotension
associés à une acidose lactique, une oligurie, une
encéphalopathie aiguë, une hypoxémie inexpliquée, une
coagulopathie.
Les patients présentent une hypotension secondaire au sepsis
(pression artérielle systémique < 90 mmHg ou diminution de
plus de 40 mmHg par rapport aux valeurs habituelles) malgré un
remplissage vasculaire adéquat, avec persistance des anomalies
de perfusion.
Les patients présentent ou moins deux dysfonctions d‟organe,
dans une situation telle que l‟homéostasie ne peut être
maintenue sans intervention thérapeutique.
D‟après (Riedemann et al., 2003).
FC : fréquence cardiaque, FR : fréquence respiratoire, PaCO2 : Pression partielle artérielle en CO2, SIRS :
Systemic Inflammatory Response Syndrome.
Bien que reconnues, ces définitions présentent toutefois des limites pour établir le
pronostic évolutif et vital du patient. Ainsi, lors d‟une nouvelle conférence en 2003, un
nouveau système de classification a été proposé. Ce dernier prend exemple sur le système
41
TMN (Tumor-Node-Metastasis) pour le cancer. Il a été baptisé système PIRO pour
Predisposition (facteurs génétiques) (Angus et al., 2003), Infection (type d‟infection, agent
responsable, etc…) (Vincent et al., 2003), Response (réponse de l‟hôte, SIRS, sepsis,
recherche de biomarqueurs) (Gerlach et al., 2003) et Organ dysfunction (Vincent et al., 2003).
Ce modèle permet de mieux caractériser ce syndrome sur la base des différents facteurs
intervenant dans le développement du sepsis (Levy et al., 2003) et a fait ses preuves
récemment (Howell et al., 2011).
1.3.2. Epidémiologie
Cette classification des patients a permis l‟apparition de nombreuses études
épidémiologiques. Il est estimé que les patients en choc septique représentent 2% des
hospitalisations dans les pays développés. Ce chiffre passe de 6 à 30% dans les unités de soins
intensifs. Cette variation vient de la grande hétérogénéité des unités de soins intensifs
(Vincent et al., 2006).
Dans les pays développés, l‟incidence du sepsis sévère est comprise entre 50 à 100 cas
pour 100 000 personnes (Danai & Martin, 2005). Malgré une baisse du taux de mortalité des
patients atteints de choc septique (Martin et al., 2003), il a été observé une augmentation du
nombre de décès par an des suites de choc septique (Dombrovskiy et al., 2007). Cela
s‟explique par l‟augmentation de l‟incidence des cas de sepsis décrite dans de nombreuses
études américaines (Martin et al., 2003; Dombrovskiy et al., 2005; Dombrovskiy et al., 2007),
européennes (Degoricija et al., 2006; Harrison et al., 2006) et australienne (Finfer et al., 2004;
Sundararajan et al., 2005).
En France, l‟étude EPISEPIS menée pendant 15 jours dans 206 services de
réanimation a mis en évidence une incidence de 14,6% d‟épisodes de sepsis sévère sur les
3738 patients hospitalisés en réanimation avec une mortalité totale de 42% (Brun-Buisson et
al., 2004). Une autre étude plus récente, menée dans une seule unité de soins intensifs, a mis
en évidence une mortalité de 55,2% sans évolution sur 5 ans, malgré la mise en place de
nouvelles approches thérapeutiques (Boussekey et al., 2010).
Parmi les facteurs de risques principaux associés au sepsis, on retrouve notamment
l‟âge, le sexe, l‟origine ethnique ainsi qu‟évidemment le statut immunitaire. Ainsi, les
hommes indépendamment de l‟âge, les non-caucasiens et les personnes immunodéprimées
(SIDA, cancer, diabète) ont un risque plus élevé de développer un sepsis (Martin et al., 2003).
42
Les patients immunodéprimés sont également plus sujets aux sepsis nosocomiaux du fait de
leur fréquentation plus importante des établissements hospitaliers.
Le sepsis a été décrit à l‟origine comme étant un syndrome spécialement attribuable à
une infection par des bactéries à Gram négatif conduisant de nombreux d‟essais cliniques à se
focaliser sur des thérapies visant spécifiquement ces bactéries (Martin, 2012). Il est depuis
clairement établi que le choc septique peut avoir une origine bactérienne variée mais aussi une
origine fongique, virale ou parasitaire. Les études épidémiologiques récentes mettent en avant
qu‟au cours des 30 dernières années, la répartition des agents infectieux responsables de
sepsis sévère a évoluée (Martin et al., 2003). Une augmentation de 200% du taux d‟infections
fongiques avec un passage d‟espèces communes à des espèces plus résistantes a notamment
été rapporté (Martin et al., 2003). Les sources d‟infections les plus fréquentes sont les
infections pulmonaires, qui représentent environ la moitié des cas, suivies des infections
abdominales et urogénitales (Angus et al., 2001; Martin et al., 2003; Esper et al., 2006;
Vincent et al., 2006).
1.3.3. Physiopathologie
A la phase initiale du choc septique, de fortes concentrations d‟antigènes de microorganismes pathogènes (micro-organismes entiers ou certains de leurs composants ou
sécrétions) apparaissent dans la circulation (Lopez-Bojorquez et al., 2004). Cela survient
lorsque la population microbienne d‟un foyer infectieux atteint une valeur seuil. Parmi ces
antigènes, appelés PAMP (pathogen associated molecular pattern), vont notamment être
retrouvés les lipopolysaccharides bactériens (LPS) ou endotoxines présents à la paroi externe
des bactéries à Gram négatif, l‟acide lipoteichoïque présent à la paroi des bactéries à Gram
positif, les ergostérols dérivés de la membrane des levures ou encore les antigènes fongiques
(mannose). Il est important de noter que le tableau clinique des patients atteints de sepsis sera
différent selon le pathogène à l‟origine de la pathologie (Murphy et al., 1998).
Ces PAMP vont être reconnus par le système immunitaire et notamment par les
récepteurs de l‟immunité innée, que sont les Toll-like receptor (TLR), qui jouent un rôle
essentiel (Yamamoto et al., 2004). A ce jour, 12 membres de la famille des TLR ont été
identifiés chez les mammifères (Beutler, 2009). Localisés à la membrane des cellules
immunitaires, ils initient rapidement une réponse lorsqu‟un ligand spécifique s‟y fixe. La
concentration de PAMP nécessaire pour une activation importante du système
43
monocytaire/macrophagique va dépendre du type d‟infection, de son importance et de sa
localisation (Gao et al., 2008).
Pour exemple, le LPS une fois libéré dans le sang, se fixe à une protéine de transport :
LPS binding protein (LBP) synthétisée par le foie. Le complexe LPS-LPB est reconnu par le
CD14, co-récepteur important dans la reconnaissance de nombreux PAMP (Zanoni &
Granucci, 2013), permettant l‟interaction avec le TLR de type 4 (TLR4) situé à la membrane
des cellules immunitaires. Cela conduit à l‟activation de nombreuses voies de signalisation
aboutissant à la libération et à la translocation dans le noyau de facteurs de transcriptions
comme NF-κB (Nuclear Factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) ou encore
AP-1 (activator protein type 1) (Zanoni & Granucci, 2013). Ces facteurs de transcriptions et
notamment NF-κB (Napetschnig &
Wu, 2013), jouent un rôle primordial au cours du
développement du choc septique et en particulier dans deux étapes majeures : (i) l‟activation
du système immunitaire avec comme conséquence la sécrétion rapide de fortes concentrations
de cytokines (Aziz et al., 2013) et (ii) l‟activation par ces cytokines des cellules endothéliales
(Shapiro et al., 2010). Il est intéressant de noter que le LPS peut également activer
directement les cellules endothéliales en y induisant la translocation de NF-κB (Dauphinee &
Karsan, 2006).
De nombreux gènes présentent un site de fixation au NF-κB tels que des gènes codant
pour des cytokines (le tumor necrosis factor-α (TNF-α), l‟interleukine (IL)-1β, l‟IL-6, ...), des
sélectines et d‟autres molécules d'adhésion cellulaire. NF-κB est également capable de réguler
la synthèse du NO et de PGI2 par l'induction des enzymes iNOS et COX2 (Zingarelli, 2005).
De plus, NF-κB est lui-même sensible à la réponse inflammatoire puisque le TNF-α et l‟IL-1
peuvent amplifier la réponse cellulaire en activant également la production de NF-κB créant
ainsi un cycle de maintien de la réponse inflammatoire qui augmente la durée et la sévérité de
celle-ci (Zingarelli, 2005).
Ces cytokines vont à leur tour activer d‟autres types cellulaires et induire des
altérations, tout d‟abord au niveau du système immunitaire et des cellules endothéliales
(Lopez-Aguirre &
Paramo, 1999; Matsuda et al., 2007), puis à l‟ensemble des tissus
(Fantuzzi et al., 2000).
44
1.3.4. Modèles expérimentaux de choc septique
Le choc septique est une pathologie complexe et multifactorielle rendant difficile
l‟obtention de modèles précliniques pertinents. Rares sont les modèles intégrant l‟ensemble
des paramètres retrouvés en clinique (infection pluribactérienne, ventilation mécanique,
cinétique d‟évolution, …) rendant souvent des traitements démontrés encourageant chez
l‟animal inefficaces chez l‟homme. Le modèle idéal, devrait être simple, reproductible avec
une agression initiale suivant une voie et une intensité proche de ce qui est observé en
clinique humaine. L‟animal devrait présenter des signes patents de sepsis avec un profil
bactériologique et/ou de sécrétion de cytokines adapté. La réponse devrait être graduée depuis
une réaction localisée, puis systémique et enfin une défaillance multiviscérale (Parker &
Watkins, 2001). Plusieurs modèles de sepsis existent actuellement (Tableau VIII). Les plus
populaires sont l‟injection de LPS (intraveineuse ou intrapéritonéale) et la péritonite par
ponction-ligature cæcale. Les modèles animaux les plus utilisés sont les rongeurs qui sont
plutôt résistants au LPS, ont un profil hémodynamique différent de l‟homme ainsi qu‟un
volume sanguin limité (Michie, 1998). De plus, les animaux utilisés sont généralement jeunes
et n‟ont pas de comorbidités associées limitant d‟autant plus la comparaison avec les
patients (van der Poll, 2012). L‟utilisation de modèles gros animaux et notamment le porc
permet de son côté un monitoring invasif sur des cinétiques plus longues ainsi plus proches de
la physiopathologie humain. L‟un des plus gros avantages des modèles animaux de choc
septique est la possibilité d‟obtenir des modèles animaux reproductibles facilitant la mise en
évidence d‟effets observés. Cela amène cependant le désavantage d‟une extrapolation difficile
à la pathologie chez l‟humain chez qui le choc septique est un syndrome très variable d‟un
patient à l‟autre.
45
Tableau VIII : Modèles animaux de choc septique
Modèle
Agent pathogène
Administration
Endotoxémie
LPS : E. coli, K. pneumoniae,
P. aeruginosa, Salmonella
IV, IP, Orale
Bactériémie
E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa, S. aureus
IV, IP
Formation d’abcès
Staphylococcus, B. fragilis
Pneumopathie
S. pneumoniae, K. pneumoniae
Péritonite
IM, Sous-cutanée,
Intra-abdominale
Intranasale,
Intratrachéale, IV
Selles autologues ou hétérologues
IP
Flore digestive indigène : E. coli, Klebsiella, Proteus,
P. aeruginosa, Enterococcus, streptocoques anaérobies
Ligature-ponction cæcale
IM : intramusculaire, IM : intrapéritonéale, IV : intraveineuse, LPS : lipopolysaccharide
1.3.4.1. Modèles d‟endotoxémie
Le LPS, composé stable et relativement pur, administré en perfusion prolongée ou en
bolus, constitue un modèle simple et aisément réalisable de sepsis. On définit une dose létale
pour chaque type de LPS, celle-ci étant variable, suivant l‟espèce concernée. Par exemple, la
dose létale du LPS de B. fragilis est 700 fois inférieure à celle de Salmonella chez la souris.
Bien que peu d‟auteurs les aient comparés, les différents LPS suivant leur origine bactérienne,
peuvent influencer les effets observés dans un même modèle.
Chez le rat, il est classiquement admis qu‟une forte dose de LPS en bolus induit une
vasodilatation, un collapsus cardiovasculaire et un décès précoce. A l‟opposé, une dose plus
faible engendre une réponse cardiovasculaire hyperdynamique, avec une augmentation
précoce du débit cardiaque (Parker & Watkins, 2001).
L‟endotoxémie présente l‟avantage d‟être aisément réalisable, d‟être reproductible et
d‟induire une réponse dose-dépendante. Elle permet de plus de "limiter" les voies de
signalisations impliquées. En revanche, les effets observés sont probablement assez éloignés
des tableaux retrouvés lors de sepsis de développement plus lent, secondaire à une infection
mono voire polymicrobienne. On retrouve par exemple des importants niveaux de cytokines
pro-inflammatoires à une phase beaucoup plus précoce dans ces modèles par rapport à la
pathologie humaine (Doi et al., 2009)
46
1.3.4.2. Perfusion intraveineuse de bactéries
De nombreux travaux ont étudié la réponse à l‟administration intraveineuse de
bactéries vivantes. De multiples espèces bactériennes ont été étudiées, la plus commune étant
E. coli. Comme pour l‟endotoxémie, la quantité de microorganismes et la durée de perfusion
va considérablement influencer la réponse observée. Chez les petits animaux, des doses
faibles d‟E. coli perfusées pendant plusieurs heures n‟entraînent que des effets précoces
modérés, alors que des doses massives sont responsables d‟une réponse biphasique avec
d‟abord une augmentation du débit cardiaque associée à une vasodilatation, puis une chute
secondaire du débit cardiaque (Parker & Watkins, 2001). Plusieurs auteurs remettent en
cause l‟injection unique de bactérie qu‟ils ne considèrent pas pertinent par rapport à la
présence d‟un foyer bactérien chez l‟homme (Poli-de-Figueiredo et al., 2008).
1.3.4.3. Modèles de péritonites
Les péritonites sont induites chez l‟animal de différentes manières. Il peut s‟agir
d‟inoculation intrapéritonéale de LPS, de bactéries ou de matières fécales. D‟autres modèles
consistent en une ligature d‟un segment digestif, conduisant au développement d‟une
péritonite (Dejager et al., 2011). L‟inconvénient de cette méthode est le caractère imprévisible
du début de la péritonite qui dépend de la survenue d‟une perforation. Pour s‟affranchir de ce
problème, Wichterman et coll., ont proposé un modèle simple de ligature et de perforation
cæcales (Wichterman et al., 1980). Une ligature du cæcum est réalisée à distance de la valvule
iléocæcale et une ponction du cæcum est réalisée. La mortalité va dépendre du nombre et de
la taille de la perforation (déterminée par la taille de l‟aiguille) (Baker et al., 1983). Il s‟agit
bien entendu d‟un modèle de sepsis polymicrobien qui dépend de la composition de la flore
bactérienne colique de l‟animal.
1.3.5. Altérations cardiovasculaires au cours du choc septique
1.3.5.1. Dysfonction cardiaque
La dysfonction myocardique est l‟un des symptômes les plus sévères du choc septique
(Brun-Buisson et al., 2004; Blanco et al., 2008). Présente chez environ 40% des patients en
choc septique (Hussain, 2013), elle se caractérise généralement par une dilatation des
ventricules, une diminution de la fraction d‟éjection (FE), une hypotension résistante au
remplissage vasculaire et une incapacité du cœur à augmenter son débit cardiaque malgré une
augmentation du taux des catécholamines circulantes.
47
En 1966, Clowes et ses collaborateurs (Clowes et al., 1966), à l‟aide d‟une cohorte de
patients atteints de péritonites, suggèrent que la dysfonction cardiovasculaire associée au
sepsis se présente en 2 phases distinctes : une première appelée choc chaud ou phase
hyperkinétique (warm shock) suivie d‟une seconde dénommée un choc froid ou phase
hypokinétique (cold shock). La phase hyperkinétique est caractérisée par une augmentation du
débit cardiaque associée à une diminution des résistances vasculaires alors que la phase
hypokinétique est caractérisée par une diminution du débit cardiaque associée à une
augmentation des résistances vasculaires conduisant à une hypoperfusion des organes et au
décès des patients (MacLean et al., 1967). Des recherches plus récentes ont mises en évidence
que la phase hypokinétique serait en fait la conséquence d‟un remplissage vasculaire
inadéquat (Abraham et al., 1983). Une dysfonction diastolique est également observée au
cours du choc septique (Jafri et al., 1990; Poelaert et al., 1997) et est un facteur prédictif
important de mortalité chez les patients (Furian et al., 2012; Landesberg et al., 2012).
a- Mécanismes extracellulaires
 Ischémie myocardique globale
La première hypothèse proposée pour expliquer la dysfonction myocardique du choc
septique a été l‟ischémie myocardique globale. Cette hypothèse a très vite été abandonnée
avec l‟utilisation des cathéters de thermodilution permettant la mesure du débit coronaire. En
effet des études ont montré un débit coronaire préservé sans élévation de la production de
lactates (Cunnion et al., 1986; Dhainaut et al., 1987) dans le cœur de patients en choc
septique. Une étude plus récente à cependant mis en évidence la présence d‟une
hypoperfusion coronaire dans un modèle de rat en choc endotoxémique (Chagnon et al.,
2006).
 Facteurs circulants dépresseurs
Le concept de facteurs circulants dépresseurs de la fonction myocardique au cours du
choc septique est proposé pour la première fois en 1970 (Lefer, 1970; Lefer & Rovetto,
1970). L‟existence de ces facteurs circulants est confirmée en 1985, lorsqu‟il est démontré
que le sérum obtenu à partir de patients à la phase initiale d‟un choc septique provoque une
diminution à la fois de l‟amplitude et de la vitesse de raccourcissement de cardiomyocytes de
rats nouveaux nés (Parrillo et al., 1985). Certaines cytokines ont été proposées comme
potentiel "facteurs circulants dépresseurs myocardiques", c‟est le cas du TNF-α et l‟IL-1β.
Ces deux cytokines sont présentes dans le plasma lors du sepsis (Finkel et al., 1992) et sont
48
responsables, in vitro, d‟un effet inotrope négatif direct mais transitoire (Kumar et al., 1996;
Duncan et al., 2007). Cependant, bien que les cytokines ont un effet dépresseur myocardique
à la phase initiale du sepsis, le profil de sécrétion de ces substances rend plus improbable un
effet retardé et prolongé. En effet, la performance myocardique est altérée pour une période
de 7 à 10 jours chez la plupart des individus, alors que les taux de TNF-α et l‟IL-1β retrouvent
une valeur normale 48 heures environ après le début du choc septique. De plus, plusieurs
études réalisées sur des muscles papillaires de lapin (Mebazaa et al., 2001; Tavernier et al.,
2001) ou des cardiomyocytes de rat (Abi-Gerges et al., 1999), prélevés à la phase aiguë du
choc septique décrivent une diminution prolongée de leur contractilité, à un niveau
comparable à celui qui est observé in vivo, et ce en absence de contact direct avec le plasma.
b- Mécanismes cellulaires
 Transport du calcium et myofilaments
Il a été démontré que le LPS (Stengl et al., 2010), comme certaines cytokines (Liu &
Schreur, 1995), diminue voir supprime le courant ICa,L au niveau de cardiomyocytes isolés de
rats et de porcs. En parallèle, il a été mis en évidence dans un modèle de rat en choc
endotoxémique et dans un modèle de rat en choc septique après ligature ponction caecale une
diminution de la densité des RYR2 à la membrane du RS au cours du sepsis (Dong et al.,
2001; Cohen et al., 2006). Ces altérations limitent fortement l‟augmentation de la [Ca2+]i au
cours du CICR provoquant une altération de la contraction.
Une altération du recaptage du calcium par le RS a également été mise en évidence
dans un modèle de rat en choc endotoxémique (Joulin et al., 2009). Cette altération implique
une diminution de phosphorylation du PLB due, en partie, à une augmentation de l‟activité
des protéines phosphatases 1 et 2A (PP2A) au niveau du RS. A l‟inverse, dans un modèle de
souris en choc endotoxémique, une diminution de l‟activité PP2A, associée à une
augmentation du taux de phosphorylation de la TnI, a été observée et associée à une
dysfonction cardiaque (Marshall et al., 2009). Ces différences peuvent être expliquées par des
localisations intracellulaires différentes d‟isoformes de PP2A (DeGrande et al., 2013).
L‟augmentation de la phosphorylation de la TnI, précédemment évoquée, provoque
une diminution de la sensibilité des myofilaments au Ca2+ conduisant à une réduction de la
contractilité cardiaque (Tavernier et al., 2001). Dans une autre étude utilisant un modèle de rat
en choc septique après ligature ponction caecale, un décours biphasique de la phosphorylation
49
des TnI et TnC est observé. A la phase précoce du choc une augmentation de la
phosphorylation des TnC et TnI est associée à une augmentation de la contractilité alors qu‟à
la phase tardive une diminution de la phosphorylation des TnI et TnC est associée à une
diminution de la contractilité. Dans les 2 cas, l‟état de phosphorylation de ces protéines est
associé à une diminution de la sensibilité des myofilaments au Ca2+ (Wu et al., 2001). Enfin,
une étude plus récente met en avant une désorganisation des myofilaments d‟actine et de
myosine dans les cœurs de patients décédés de choc septique (Rossi et al., 2007).
 Monoxyde d’azote et peroxynitrite
Le rôle du NO sur la dysfonction myocardique du choc septique est très complexe. En
plus de son action indirecte par ses effets vasculaires, le NO a également une action directe
sur la fonction cardiaque (cf Régulation endothéliale de la fonction cardiaque). Une
surproduction de NO au cours du choc septique diminue la contractilité cardiaque (Massion et
al., 2003). Ceci a été démontré dans plusieurs études in vitro (Balligand et al., 1993; Kumar et
al., 1999). Cette surproduction de NO semble impliquer majoritairement la iNOS (Cohen et
al., 2006) même si une étude récente, utilisant un modèle de souris KO pour la eNOS, met en
avant le rôle délétère de la eNOS sur la fonction cardiaque au cours du choc septique (van de
Sandt et al., 2013). Ces derniers résultats sont cependant en contradiction avec une autre
étude, utilisant le même modèle, où les auteurs mettent en avant un rôle protecteur de cette
eNOS dans la dysfonction cardiaque du choc septique (Bougaki et al., 2010). De plus, la
surexpression de la eNOS, spécifiquement dans des cardiomyocytes, prévient l‟apparition
d‟une dysfonction myocardique dans un modèle de souris en choc endotoxémique (Ichinose et
al., 2007). Une implication de la NOS mitochondrial dans la dysfonction myocardique du
choc septique a également été mise en évidence dans un modèle de ligature ponction caecale
chez le rat (Xu et al., 2012). Les mécanismes induisant l‟augmentation de l‟expression de la
iNOS ne sont pas tous connus. Il est établie cependant que plusieurs cytokines sont
impliquées, dont le TNF-α, l‟IL-1β et l‟IL6 (Taylor & Geller, 2000), et induisent notamment
la libération du facteur de transcription NF-κB (Kleinert et al., 2004). Les effets cardiaques
néfastes du NO semblent dépendants de la S-nitrosylation de diverses protéines (Sips et al.,
2013) et non de l‟activation de la voie GCs/GMPc/PKG (Buys et al., 2009).
En plus du rôle direct du NO, le peroxynitrite, produit à partir du NO et de l‟anion
superoxide, présent également des effets dépresseurs sur la contractilité cardiaque (ZanottiCavazzoni & Hollenberg, 2009; Hunter & Doddi, 2010). Ce peroxynitrite est hautement
50
cytotoxique car capable d‟interagir avec l‟ADN, les lipides et les protéines et de les
endommager.
 Apoptose
L‟hypoxie et la dysoxie mettent les cardiomyocytes en déficit énergétique pouvant
conduire à l‟apoptose. Des études mettent ainsi en avant la présence d‟apoptose dans un
modèle de choc endotoxémique in vivo (Buerke et al., 2008) et dans un modèle de challenge
au LPS in vitro (Wang et al., 2009). A l‟inverse d‟autres études menées sur des modèles de
rats en choc endotoxémique ne montrent que peu d‟apoptose (Neviere et al., 2001; Lancel et
al., 2005). De plus, des études post mortem sur des cœurs de patients en choc septique ne
démontrent pas la présence d‟apoptose (Soriano et al., 2006; Rossi et al., 2007). L‟implication
de l‟apoptose cardiaque dans la dysfonction myocardique du choc septique est donc à
relativiser sachant notamment qu‟une récupération totale de la fonction cardiaque intervient
dans les 10 jours suivant l‟altération cardiaque (Romero-Bermejo et al., 2011).
 Récepteurs β-adrénergiques
Les récepteurs β-AR sont impliqués dès la phase précoce du choc septique notamment
par le biais d‟une activation du système sympathique, observée dès l‟induction du choc et
caractérisée par une augmentation des concentrations plasmatiques en catécholamines
circulantes. Cette augmentation des catécholamines circulantes a été observé aussi bien chez
l‟homme (Annane et al., 1999; Ostrowski et al., 2013) que chez l‟animal (Mansart et al.,
2003; Barrett et al., 2007).
Les études sur les récepteurs β-AR cardiaques au cours du choc septique sont
contradictoires. Ainsi, deux études ne montrent pas de modifications de densité des récepteurs
β-AR à la membrane de cardiomyocytes de rats nouveau-nés stimulés avec des cytokines proinflammatoires (Gulick et al., 1989; Chung et al., 1990). Ces études mettent cependant en
évidence une altération de la contractilité cardiaque due à une diminution de la formation
d‟AMPc après stimulation des récepteurs β-AR. Les mêmes constatations ont été faites dans
un modèle de bactériémie chez le rat (Boillot et al., 1996). Enfin dans un modèle de ligature
ponction caecale chez le rat aucune modification d‟expression des récepteurs β-AR n‟a
également pu être observé (Mansart et al., 2003). De manière intéressante, une autre étude,
utilisant également un modèle de ligature ponction caecale chez le rat, met en évidence une
redistribution biphasique des récepteurs β1-AR en fonction de leur niveau de phosphorylation
: au stade initial, un recrutement à la membrane des récepteurs β1-AR est corrélé à une
51
diminution de leur phosphorylation, alors qu‟à un stade tardif une internalisation des
récepteurs β1-AR est associée à une augmentation de leur phosphorylation (Tang et al., 1998).
Cette sous expression tardive est associée à une altération des voies de signalisations en aval
de ces récepteurs. Une autre étude a également démontré une diminution de la densité des
récepteurs β-AR en plus d‟une diminution de l‟activité de l‟AC associée une augmentation de
l‟expression de la protéine Gi au niveau de cardiomyocytes de rats nouveau-nés incubés avec
du sérum de patients en choc septique (Reithmann et al., 1993). Il est cependant important de
souligner que ces patients étaient traités avec de la NA, lors du prélèvement de sanguin. Une
augmentation d‟expression de la protéine Gi a également été mise en évidence chez des
patients en choc septique (Bohm et al., 1995) ainsi qu‟à la phase tardive d‟un modèle de
ligature ponction caecale chez le rat (Wu et al., 2003). De manière intéressante, une sous
expression de la protéine Gs a été démontrée dans un modèle lapin en choc endotoxémique
(Matsuda et al., 2000). L‟activité AC, dépendante des protéines Gs et Gi, est donc
probablement modifiée au cours du choc septique. Une étude rapporte en ce sens une
diminution d‟environ 75% du taux de transcrits codant pour l‟AC6 dans le cœur de rats en
choc endotoxémique, sans modification des transcrits codant pour l‟AC5 (Risoe et al., 2007).
Ces résultats sont toutefois à prendre avec précaution car aucunes indications sur le niveau
d‟expression protéique ou le niveau d‟activité des AC ne sont rapportées dans cette étude.
A ce jour, très peu d‟études se sont intéressées à l‟implication des différents sous-types
de récepteurs β-AR cardiaques. Un recrutement des récepteurs β2-AR a été rapporté à la phase
initiale d‟un choc endotoxémique chez des rats décérébrés (Godlewski et al., 2006) alors
qu‟une étude a mis en évidence dans le cœur de patients décédés d‟un choc septique une
augmentation du récepteur β3-AR (Moniotte et al., 2007).
1.3.5.2. Dysfonction vasculaire
Le choc septique est caractérisé par une importante atteinte circulatoire conduisant à
une hypoperfusion des tissus et à des défaillances multiviscérales. Cette dysfonction
vasculaire (Matsuda &
Hattori, 2007), associée à la dysfonction myocardique et à une
hypovolémie, est responsable de l‟hypotension observée chez les patients. Elle se caractérise
par (i) une hyporéactivité vasculaire malgré des taux circulants élevés d‟agents
vasoconstricteurs comme les catécholamines (Annane et al., 1999; Ostrowski et al., 2013), la
vasopressine (Sharshar et al., 2003; Lodha et al., 2006) ou l‟angiotensine de type II (Ang II)
52
(Doerschug et al., 2010) ; (ii) une dysfonction endothéliale (Duffy et al., 2011; Szabo &
Goldstein, 2011) et (iii) une altération de la microcirculation (Vincent & De Backer, 2005).
a- Hyporéactivité vasculaire
La vasodilatation réfractaire du choc septique est due à une perte de la fonction
contractile des CML vasculaires. Plusieurs mécanismes ont été proposés pour expliquer ce
phénomène parmi lesquels une apoptose des CML due à une hypotension prolongée (Byrne,
1966), une défaillance de l‟extraction d‟oxygène par les tissus (Parrillo, 1993) ainsi qu‟une
augmentation de l‟activité des prostaglandines ayant une action vasodilatatrice (Bernard et al.,
1997). Certaines de ses hypothèses ont été testées avec des effets bénéfiques limités (Yu et
al., 1993; Bernard et al., 1997). Les mécanismes impliqués ont depuis été élucidés et
impliquent : (i) une activation des canaux potassiques dépendants de l‟ATP (canaux KATP) à
la membrane des CML vasculaires, (ii) une activation de la iNOS et (iii) un déficit en
vasopressine (Landry & Oliver, 2001).
L‟ouverture anormale des canaux KATP au cours du choc septique est responsable
d‟une hyperpolarisation des membranes plasmiques comme cela a été rapporté au niveau
d‟artères mésentériques (Wu et al., 2004) et d‟aortes de rat (Chen et al., 2000). Cette
hyperpolarisation membranaire est responsable d‟une fermeture des canaux Ca2+ dépendants
du potentiel de membrane, parmi lesquels les canaux Ca2+ de type L, ayant pour conséquence
une diminution de la [Ca2+]i. Ceci provoque une inhibition de la vasoconstriction même en
présence d‟agents vasoconstricteurs (Buckley et al., 2006).
Comme au niveau cardiaque, le NO jour un rôle important dans la dysfonction
vasculaire du choc septique. L‟augmentation de la synthèse de NO, au niveau des CML
vasculaires et des cellules endothéliales (Virdis et al., 2005), contribue, pour une large part, à
la vasoplégie ainsi qu‟à l‟hyporéactivité aux agents vasoconstricteurs, observée dans le choc
septique (Landry &
Oliver, 2001). Cette augmentation de la synthèse de NO est la
conséquence d‟une augmentation d‟expression de la iNOS (Su et al., 2007). Comme au
niveau cardiaque la formation de peroxynitrites est également impliquée dans la vasoplégie
dépendante de l‟augmentation de la synthèse de NO (Korkmaz et al., 2011).
La vasopressine est une neurohormone qui induit une vasoconstriction par plusieurs
mécanismes dépendants de l‟activation des récepteurs à la vasopressine de type 1 présents à la
membrane des CML (Kampmeier et al., 2010; Iovino et al., 2012). Cette hormone est
fortement sécrétée par l‟hypophyse dans des cas d‟hypotension comme le choc septique
53
(Sharshar et al., 2003). Cette augmentation de la concentration plasmatique en vasopressine
n‟est cependant que transitoire et une diminution est très vite observée suite à un épuisement
des stocks de vasopressine au cours du choc septique (Landry & Oliver, 2001).
b- Dysfonction endothéliale
L‟endothélium étant à l‟interface entre le sang et les CML, c‟est l‟une des premières
composantes activée et altérée par les PAMP ainsi que les effecteurs du système immunoinflammatoire (Matsuda & Hattori, 2007). Cela se traduit notamment par une surproduction
de NO par la iNOS. Il est également établi l‟apparition d‟une hyperperméabilité vasculaire
provoquant la perte de fluides vers les espaces extravasculaires et l‟apparition d‟importants
œdèmes au niveau notamment des poumons, des reins et du cerveau des patients en choc
septique (Huet et al., 2011). De plus, l‟endothélium connu pour ces propriétés
anticoagulantes/anti-thrombotiques (Pearson, 1999), passe à un état procoagulant par
diminution d‟expression de la thrombomoduline favorisant ainsi la constitution de caillots de
fibrine (Pawlinski & Mackman, 2004). Enfin une apoptose des cellules endothéliales est
observée au cours du choc septique (Matsuda et al., 2007).
c- Altérations de la microcirculation
La microcirculation est constituée par les vaisseaux (artérioles, capillaires et veinules)
de diamètre inférieur à 100 µm. C‟est au niveau de ces microvaisseaux que s‟effectue les
échanges gazeux. Une microcirculation intacte et fonctionnelle est indispensable pour
permettre un apport en oxygène efficace à l‟ensemble des tissus. Au cours du choc septique
l‟altération de la microcirculation est impliquée dans la défaillance d‟organes (De Backer et
al., 2002). L‟ensemble des mécanismes précis n‟est pas encore clair mais comprend : (i) une
diminution de la déformabilité des globules rouges provoquant une augmentation de la
viscosité du sang (Reggiori et al., 2009), (ii) une augmentation du nombre de neutrophiles
associée à une diminution de leur déformabilité (Skoutelis et al., 2000), (iii) une activation
des cascades de coagulation avec dépôt de fibrine et formation de thrombus (Levi et al., 2013)
ainsi (iv) qu‟une dysfonction des mécanismes d‟autorégulation vasculaire (Spronk et al.,
2004). L‟ensemble de ces mécanismes conduit à une dysoxie des tissus par une altération des
apports en oxygène et/ou une dysfonction mitochondriale (Spronk et al., 2004). Une altération
précoce de la microcirculation est un symptôme prédictif important de mortalité chez les
patients en choc septique (Trzeciak et al., 2007).
54
La dysfonction de la microcirculation est caractérisée par des anomalies hétérogènes
du flux sanguin, avec des capillaires hypoperfusés, alors que d‟autres ont un flux normal voire
augmenté (Bateman et al., 2003; Ince, 2005). Fonctionnellement très vulnérables, les unités
microcirculatoires deviennent hypoxiques, ce qui explique le défaut d‟extraction d‟oxygène
associé au sepsis (Ince & Sinaasappel, 1999). Dans ces conditions, la pression partielle en O2
au niveau de la microcirculation baisse en dessous de la pression partielle en O2 veineuse.
Cette différence est appelée le "pO2 gap", qui est une mesure de la sévérité du shunt
fonctionnel et qui est plus sévère dans le choc septique que dans le choc hémorragique (Ince
& Sinaasappel, 1999; Schwarte et al., 2005) (Figure 17). C‟est pour cela que le monitorage
des variables hémodynamiques et d‟oxygénations systémiques globales ne permet pas une
détection satisfaisante de la défaillance microcirculatoire.
Figure 17. Shunt fonctionnel observé au cours du choc septique dans une unité microcirculatoire.
A : artériole, V : veinule
d- Récepteurs β-adrénergiques
Bien que l‟hyporéactivité vasculaire soit principalement imputable à l‟augmentation
de la production de NO par la iNOS de nombreux travaux mettent en avant une persistance de
cette hyporéactivité après inhibition des NOS (Szabo et al., 1994; Takakura et al., 1994). Il a
été proposé que l‟inactivation des catécholamines circulantes par oxydation conduit à la
génération d‟adrénochromes pouvant avoir des effets cytotoxiques (Macarthur et al., 2000).
D‟autres radicaux libres comme le peroxynitrite induisent une diminution de l‟affinité des
récepteurs α1-AR pour la NA (Takakura et al., 2002). Ce phénomène pourrait également être
à l‟origine d‟une modification des récepteurs β-AR.
Peu de données existent concernant le remodelage du système β-AR vasculaire au
cours du choc septique et ce malgré l‟utilisation courante d‟agonistes β-AR dans la
thérapeutique du choc septique (cf Traitements du choc septique). Il est clairement établi qu‟il
55
existe une altération de la vasorelaxation β-AR au cours du choc septique aussi bien au niveau
artériel (Boillot et al., 1996; Donaldson & Myers, 1996) que veineux (Mallem et al., 2003).
Cette altération semble dépendante du lit vasculaire considéré avec notamment une altération
de la vasorelaxation à l‟isoprénaline plus importante au niveau de l‟artère pulmonaire qu‟au
niveau de l‟aorte (McIntyre et al., 1997). Très peu d‟études ont évalué l‟altération spécifique
d‟un sous type de récepteur β-AR. Seule une altération de la vasorelaxation dépendante du
récepteur β2-AR, par utilisation de salbutamol, a été mise en évidence (Guc et al., 1990;
Waller et al., 1994; Donaldson & Myers, 1996). De façon intéressante, un prétraitement de
rats en choc endotoxémique avec de la dopexamine, un agoniste β2-AR non sélectif qui
possède une action agoniste sur les récepteurs dopaminergique, permet un maintient de la
perfusion des villosités intestinales (Schmidt et al., 1996). Dans un modèle identique, un
prétraitement avec de la dopexamine attenue la dysfonction microcirculatoire, et notamment
l‟hyperperméabilité, au niveau mésentérique par action sur les récepteurs β2-AR (Schmidt et
al., 1998). Dans ce sens, un prétraitement à la terbutaline, un agoniste β2-AR, prévient en
partie l‟hyporéactivité à la NA dans un modèle de souris endotoxémique (Wu et al., 2000).
Enfin, le récepteur β2-AR semble également présenter des effets protecteurs importants au
niveau rénal au cour d‟un choc endotoxémique (Nakamura et al., 2004; Nakamura et al.,
2005).
1.3.6. Traitements du choc septique
Les dernières recommandations internationales regroupent l‟ensemble des traitements
potentiels et proscrits en 3 grandes tables : (i) réanimation initiale et infection, (ii) soutien
hémodynamique et thérapies complémentaires et (iii) autres thérapies de soutien (Dellinger et
al., 2013).
L‟antibiothérapie doit dans le meilleur du possible être initiée dans la première heure
après le diagnostique de sepsis sévère ou choc septique et éventuellement la détermination du
ou des pathogènes impliqués. De nombreuses études cliniques rapportent une corrélation entre
le temps de la mise en route d‟une antibiothérapie efficace et la mortalité (Barie et al., 2005;
Kumar et al., 2006). Bien que primordiale, les auteurs des recommandations insistent sur le
fait que la première des priorités dans la gestion d‟un patient septique doit être, avant
l‟antibiothérapie, l‟établissement d‟un abord vasculaire et l‟initiation d‟un remplissage
vasculaire. L‟utilisation de solutés de remplissage de type cristalloïdes, solutés isotoniques ou
hypertoniques,
est
conseillée
par
rapport
56
aux
colloïdes
et
notamment
les
hydroxyéthylamidons qui sont déconseillés après les résultats de récentes études cliniques
(Guidet et al., 2012; Myburgh et al., 2012; Perner et al., 2012). Dans le cas de volumes trop
important à administrer, l‟utilisation d‟albumine, colloïde naturel, peut être envisagée.
L‟utilisation d‟agents vasopresseurs doit également être rapidement initiée dans le cas
où le remplissage vasculaire ne suffit pas à restaurer une pression artérielle satisfaisante. Les
auteurs recommandent dans l‟ordre la NA, l‟Adr, la vasopressine et enfin la dopamine
(Dellinger et al., 2013). Ces agents vasopresseurs sont utilisés en association avec un agent
inotrope, la dobutamine, dans le cas où une dysfonction myocardique est mise en évidence.
De façon surprenante de nombreuses études précliniques mettent en avant un effet
potentiellement bénéfique d‟antagonistes β-AR et notamment β1-AR, comme l‟esmolol, dans
le traitement de la cardiomyopathie du choc septique (Rudiger, 2010). Bien que ces molécules
présentent des effets inotropes négatifs, l‟effet chronotrope négatif engendré par l‟utilisation
des antagonistes β1-AR permet, par un allongement de la période de remplissage diastolique,
un meilleur remplissage des ventricules et en conséquence un volume d‟éjection plus
important. L‟utilisation de molécules ayant des effets uniquement chronotropes négatifs,
comme l‟ivabradine, est actuellement en cours d‟investigation clinique (MODIfY trail). Les
agonistes β1-AR sont enfin connus pour posséder des effets proinflammatoires (Grisanti et al.,
2010) amplifiant la réponse inflammatoire à l‟origine du choc septique. Une étude clinique
récente met en évidence qu‟une utilisation raisonnée d‟esmolol, un antagoniste β1-AR, peut
permettre de diminuer la FC de patients en choc septique sans altérer les autres paramètres
cardiaques (Balik et al., 2012). Cette étude est cependant à regarder avec précaution aux vue
des remarques émissent sur sa conduite (Zante & Wirtz, 2013).
57
1.4. Insuffisance cardiaque à fraction d’éjection préservée
1.4.1. Définitions
L‟IC a été définie comme un syndrome clinique complexe résultant d‟altérations
structurales et/ou fonctionnelles du myocarde conduisant à une incapacité des ventricules à se
remplir ou à éjecter correctement le sang (Hunt, 2005). Les manifestations les plus
importantes de cette pathologie vont être une dyspnée et une fatigue, limitant la tolérance à
l‟exercice, ainsi qu‟une rétention d‟eau pouvant conduire à des congestions pulmonaires ou
des œdèmes périphériques (Hunt, 2005).
Il est maintenant clairement établie l‟existence de 2 formes d‟IC : (i) l‟IC à fraction
d‟éjection altérée (ICFEa) appelée initialement IC systolique et (ii) l‟IC à fraction d‟éjection
préservée (ICFEp) anciennement dénommée IC diastolique. Les termes IC systolique et IC
diastolique ont été abandonnés du fait de la complexité de cette pathologie. En effet, les
patients présentant une "IC systolique" présentent également des altérations diastoliques. De
plus, une dysfonction diastolique n‟est pas systématiquement associée à une "IC diastolique".
1.4.2. Epidémiologie
L‟IC représente un problème de santé publique majeur et voit sa prévalence augmenter
au cours du temps (Mosterd & Hoes, 2007). De même, son incidence augmente également,
principalement en raison de l‟amélioration de la prise en charge de diverses pathologies
cardiovasculaires tels que l‟infarctus du myocarde ou l‟HTA (Cheng & Vasan, 2011; Lam et
al., 2011). Il est estimé qu‟aux Etats Unis, à l‟horizon 2040, l‟amélioration des prises en
charge
thérapeutiques
associée
à
l‟augmentation
de
l‟incidence
des
pathologies
cardiovasculaires, relatives au mode de vie occidental, aboutira à une prévalence d‟IC dans la
population générale d‟environ 20% (Brouwers et al., 2012).
L‟évolution de l‟ICFEp est particulièrement alarmante, en effet, il a été mis en
évidence une augmentation constante des admissions hospitalières de patients ICFEp alors
que les admissions de patients ICFEa sont stables (figure 18) (Owan et al., 2006). Depuis
quelques années, les patients souffrant d‟ICFEp représentent la majorité de la population IC
du fait d‟une augmentation de son incidence estimée à environ 1% par an (Owan et al., 2006).
Ceci s‟explique par l‟augmentation de la prévalence des facteurs de risques associés à
l‟ICFEp tels que le diabète, l‟HTA et l‟obésité. De plus, l‟ICFEp atteint principalement une
population féminine plus âgée que les patients ICFEa (Owan et al., 2006).
58
Figure 18. Nombre d’amission de patients en insuffisance cardiaque au cours des années. D‟après (Owan et
al., 2006)
Il est maintenant clairement établi que le pronostic vital des patients ICFEp n‟est pas
meilleur que celui des patients ICFEa (Lam et al., 2011). Cela s‟explique, entre autre, par
l‟absence de traitements spécifiques de l‟ICFEp. En effet, malgré le fait que de nombreuses
études rapportent des effets potentiellement bénéfiques des inhibiteurs de l‟enzyme de
conversion (Cleland et al., 2006), des antagonistes des récepteurs à l‟angiotensine (Yusuf et
al., 2003) ou encore des β-bloquants (van Veldhuisen et al., 2009) dans l‟ICFEp , une métaanalyse récente ne met pas en évidence de réduction de la mortalité chez ces patients (Holland
et al., 2011).
1.4.3. Physiopathologie
1.4.3.1. Hypertrophie ventriculaire
L‟hypertrophie ventriculaire gauche est souvent considérée comme étant une réponse
adaptative à des surcharges de pressions et/ou de volumes afin de normaliser la tension
pariétale (Selvetella et al., 2004). Cependant, l‟hypertrophie concentrique retrouvée chez les
patients en ICFEp n‟est pas adaptative (Sano & Schneider, 2002). La voie de signalisation de
la calcineurine ainsi que le système rénine-angiotensine-aldostérone semblent jouer un rôle
majeur dans le développement de cette hypertrophie (Molkentin et al., 1998), caractérisée par
59
une augmentation du diamètre des cardiomyocytes sans modifications de leurs longueurs
(Gerdes, 2002; van Heerebeek et al., 2006; van Heerebeek et al., 2008).
1.4.3.2. Dysfonction diastolique
La fonction diastolique ventriculaire gauche est influencée à la fois par la rigidité
myocardique (propriétés élastiques passives du ventricule et relaxation active) et par la
fonction de l‟OG. En absence de pathologies endocardique ou péricardique, la rigidité
myocardique est régulée par (i) la matrice extracellulaire (MEC) et (ii) les cardiomyocytes
(Borlaug & Paulus, 2011).
a-Matrice extracellulaire
De nombreuses études mettent en évidence l‟importance de la fibrose myocardique
dans la dysfonction diastolique (MacKenna et al., 1994; Lamberts et al., 2004). Borbély et ses
collaborateurs ont mis en évidence dans des biopsies endomyocardiques humaines, un volume
de collagène plus important chez les patients souffrant d‟ICFEp, par rapport aux patients
témoins, corrélé avec l‟élévation de la PVG en fin de diastole chez ces mêmes patients
(Borbely et al., 2005).
La rigidité de la MEC va dépendre en grande partie du collagène à travers la
régulation de sa quantité et de sa réticulation. Le dépôt excessif de collagène de type I résulte
du déséquilibre existant entre une synthèse exagérée et une dégradation altérée. La synthèse
de collagène de type I à partir de procollagène de type I libère notamment un propeptide
pouvant être utilisé comme biomarqueur de la fibrose myocardique (Lopez et al., 2010).
L‟altération de la dégradation du collagène de type I est le résultat de la diminution de
l‟expression des MMP (Matrix MetalloProteinases) et l‟augmentation de l‟expression des
TIMP (Tissue Inhibitors of MMP). Le niveau plasmatique des TIMP a d‟ailleurs été
récemment proposé comme biomarqueur potentiel du développement de l‟ICFEp chez les
patients hypertendus (Gonzalez et al., 2010). L‟ensemble de ces modifications de la MEC
peut être induit à la fois par des facteurs autocrines, paracrines et endocrines (Yamamoto et
al., 2000; Koitabashi et al., 2007).
Il a été montré également que l‟inflammation myocardique contribue aux changements
observés au niveau de la MEC et au développement de l‟ICFEp (Westermann et al., 2011).
L‟augmentation de TGF-β, mise en avant dans des biopsies endomyocardiques, induit une
60
transdifférentiation de fibroblastes en myofibroblastes, ceci étant associé à une forte
production de collagène et une sous-expression de la MMP-1 (Westermann et al., 2011).
b-Cardiomyocytes
Il a été démontré au cours de l‟ICFEp une augmentation de la Fpassive des
cardiomyocytes (Borbely et al., 2005). Les auteurs émettent l‟hypothèse d‟un défaut de
phosphorylation de la titine par la PKA. La phosphorylation de l‟isoforme N2B de la titine par
la PKA (Kruger & Linke, 2006) mais aussi par la PKG (Kruger et al., 2009) est à l‟origine de
la diminution la Fpassive du myocarde. Ceci a été mis en évidence au niveau de myofilaments
issus de VG humains mais également au niveau de cardiomyocytes isolés de patients en
ICFEp (Borbely et al., 2009). La formation de ponts disulfures au sein de l‟isoforme N2B,
induit par un stress oxydatif, est également impliquée dans l‟augmentation de la Fpassive des
cardiomyocytes (Grutzner et al., 2009). Il est de plus établi, dans le myocarde de patients en
ICFEp, qu‟il existe une augmentation du ratio isoforme N2B/isoforme N2BA de la titine (van
Heerebeek et al., 2006; Schwartzenberg et al., 2012). Ceci serait un mécanisme compensateur
à l‟augmentation de l‟élastance artérielle (Ea) (cf Couplage ventriculo-artérielle et
dysfonction vasculaire) visant à augmenter la contractilité des cardiomyocytes au dépend de
leur rigidité.
Une étude récente a démontré une diminution de l‟activité de la PKG et de la
concentration en GMPc au niveau de biopsies de VG de patients en ICFEp sans modification
de l‟expression de la GCs ou de la PDE5A (van Heerebeek et al., 2012). Cette diminution de
la voie GC/GMPc/PKG semble être due à une altération de la biodisponibilité du NO liée à
une augmentation du stress oxydatif chez les patients en ICFEp (van Heerebeek et al., 2012).
Le stress oxydatif est connu pour diminuer la biodisponibilité du NO et altérer la voie
GC/GMPc/PKG (Munzel et al., 2005). En effet, le stress oxydatif va notamment provoquer
une oxydation de la tetrahydrobioptérine (BH4) comme cela a déjà été mis en évidence au
cours de l‟HTA (Landmesser et al., 2003). Cette BH4 est un cofacteur essentiel au bon
fonctionnement des NOS. Lorsque la BH4 est oxydée cela entraîne un découplage du
complexe NOS-BH4 provoquant la synthèse par les NOS d‟anions superoxyde à la place du
NO (Fleming & Busse, 2003). L‟anion superoxyde, en se couplant au NO, va permettre la
production de peroxynitrite, qui est plus délétère que l‟anion superoxyde ce qui accentue le
stress oxydatif et donc le découplage NOS-BH4 (Figure 19). Un tel découplage, à l‟origine
d‟une dysfonction diastolique, a été mis en évidence dans un modèle de souris hypertendues
présentant une réduction des niveaux en BH4 (Silberman et al., 2010).
61
BH2
Stress
oxydatif
BH2↑
BH4
oxydatif ↑
NADP+
NADPH
O2
NO
ONOO-
NADPH
O2-
O2
NOS couplée
Arginine
BH4↓
Stress
NO ↓
NOS découplée
Citrulline
NADP+
Figure 19. Altérations du couplage NOS-BH4 suite à un stress oxydatif. D‟après (Alkaitis & Crabtree,
2012).
BH2 : dihydrobioptérine, BH4 : tetrahydrobioptérine, NADP : Nicotinamide adénine dinucléotide phosphate, NO
: monoxyde d‟azote, NOS : synthase de monoxyde d‟azote, O2 : dioxygène, O2- : anion superoxyde, ONOO- :
peroxynitrite.
1.4.3.3. Dysfonction systolique
La FE, considérée comme le paramètre systolique de référence, est plus le reflet d‟un
couplage ventriculo-artériel que de la contractilité intrinsèque du myocarde (Borlaug et al.,
2009). Ainsi, malgré une FE préservée, plusieurs études mettent en avant des altérations
régionales de la contractilité myocardique chez les patients en ICFEp (Yu et al., 2002; Fukuta
& Little, 2007; Wang et al., 2008). Une étude récente a mis en évidence que cette altération
systolique retrouvée chez certains patients était associée à une augmentation de la mortalité
suggérant que la dysfonction systolique pourrait être un marqueur de sévérité de l‟ICFEp
(Borlaug et al., 2009). De façon surprenante, cette dysfonction systolique est associée à une
élévation de l‟élastance (rigidité) en fin de systole (Ees) mesurée par cathétérisme
ventriculaire gauche (Kawaguchi et al., 2003). L‟Ees est un paramètre dépendant de la
géométrie cardiaque qui est altérée au cours de l‟ICFEp à cause de l‟hypertrophie
myocardique. L‟utilisation d‟autres indices de contractilité, comme les fractions de
raccourcissement endocardique et myocardique, ont permis de caractériser la dysfonction
systolique de l‟ICFEp(Borlaug et al., 2009).
1.4.3.4. Couplage ventriculo-artériel et dysfonction vasculaire
Les rigidités aussi bien ventriculaire que vasculaire sont connues pour augmenter avec
l‟âge ainsi que l‟HTA ou le diabète qui sont particulièrement fréquents chez les patients en
ICFEp (Owan et al., 2006). Une élévation de l‟Ea associée à l‟élévation de l‟Ees conduit à
une variation importante de la PVG pour de petites variations de précharge (Figures 20 A et
B) ou de postcharge (Figures 20 C et D) (Borlaug & Kass, 2008). Ainsi, lors d‟un effort
physique, une petite élévation de la postcharge induit une forte augmentation de la PVG en fin
62
de systole provoquant un ralentissement et un allongement de la relaxation, ce qui conduit à
une élévation de la PVG en fin de diastole (Phan et al., 2011) (Figures 20 E et F).
Témoin
A
ICFEp
B
Δ Postcharge
ΔP
Pression
Pression
Δ Postcharge
C
D
Pression
Volume
Pression
Volume
Volume
E
ΔP
Volume
Δ Précharge
Δ Précharge
F
Pression
Pression
Témoin
ICFEp
Temps
Volume
Figure 20. Altérations hémodynamiques du patient présentant une insuffisance cardiaque à fraction
d’éjection préservée (ICFEp). D‟après (Borlaug & Paulus, 2011).
Δ : variation ; P : pression.
Une altération de la vasorelaxation est également observée au cours de l‟exercice chez
les patients en ICFEp. Elle résulte à la fois d‟une dysfonction endothéliale (Borlaug et al.,
2010) et d‟une hyporéactivité des CML (Bauersachs et al., 1999; Katz et al., 1999).
63
1.4.3.5. Altérations des réserves cardiaques et insuffisance chronotrope
Chez un sujet sain, au cours d‟un exercice, une relaxation plus importante et plus
rapide du VG permet d‟augmenter le volume télédiastolique, dans un temps plus court, sans
provoquer d‟augmentation de la pression télédiastolique. L‟altération de la relaxation chez les
patients en ICFEp, caractérisée par l‟augmentation de la Fpassive, provoque une diminution de
la réserve diastolique de ces patients (incapacité à augmenter le volume télédiastolique)
associée à une forte augmentation de la précharge (Borlaug et al., 2010). De façon
comparable, sur un cœur sain au cours de la systole pendant un exercice, l‟augmentation de sa
contractilité va permettre une augmentation du volume d‟éjection et donc de la FE du
ventricule. La dysfonction systolique observée chez les patients en ICFEp, associée à
l‟augmentation de l‟Ea, induit une altération de la réserve systolique (incapacité à abaisser le
volume télésystolique). Cela aboutit à une faible diminution du volume télésystolique et donc
à une faible augmentation du volume d‟éjection au cours d‟un exercice (Figure 21) (Phan et
al., 2009; Borlaug et al., 2010). Les causes des diminution des réserves systolique et
diastolique ne sont pas clairement élucidées, mais plusieurs études ont proposé des
hypothèses comme une altération des voies de signalisation β-AR (Chattopadhyay et al.,
2010), des capacités énergétiques du myocarde (Phan et al., 2009) et du cycle du calcium (Liu
Volume du ventricule gauche
et al., 1993).
Réserve
diastolique
Fin de diastole
Témoin
Patient
ICFEP
Volume
d’éjection
Fin de systole
Volume
d’éjection
Altérations des
réserves
cardiaque
Réserve
systolique
Repos
Exercice
Figure 21. Altérations des réserves cardiaques chez le patient ICFEp. D‟après (Borlaug & Paulus, 2011)
64
La réserve chronotrope est également altérée chez les patients en ICFEp (Phan et al.,
2009; Borlaug et al., 2010). Cela est probablement dû à des altérations des voies de
signalisation β-AR. En effet, il a été mis en évidence que les niveaux de catécholamines
circulantes sont les mêmes chez les patients en ICFEp et des contrôles sains, aussi bien avant
qu‟après un exercice (Borlaug et al., 2006).
1.4.3.6. Nouveau paradigme de l‟ICFEp
L‟ensemble des données sur la structure, la fonction et les voies de signalisation
myocardiques ont permis l‟établissement récent par Paulus et Tschöpe d‟un nouveau
paradigme de l‟ICFEp (Paulus & Tschope, 2013) (Figure 22). Ces auteurs définissent 5
étapes dans le développement de la dysfonction myocardique de l‟ICFEp :
- Tout d‟abord l‟établissement d‟un statut proinflammatoire systémique induit par les
diverses comorbidités de l‟ICFEp, qui sont pour rappel l‟obésité, le diabète et l‟HTA
artérielle.
- Ce statut proinflammatoire provoque une inflammation de l‟endothélium de la
microcirculation coronaire.
- Cela conduit à la réduction de la biodisponibilité du NO au niveau endothélial ayant
pour conséquence une réduction de la voie GC/GMPc/PKG dans les cardiomyocytes voisins
et la production de nombreux radicaux libres.
- La faible activité de la PKG favorise alors le développement de l‟hypertrophie,
l‟augmentation de la rigidité cardiomyocytaire par hypophosphorylation de l‟isoforme N2B
de la titine et l‟altération de la relaxation.
- Enfin, la fibrose interstitielle associée à l‟augmentation de la rigidité
cardiomyocytaire aboutit à une dysfonction diastolique caractérisée par une pression
télédiastolique élevée et impliquée dans le développement de l‟IC (Paulus & Tschope, 2013).
65
Obésité,
Hypertension,
Diabète,
…
IL-6,
TNF-α,
…
Cellules
endothéliales
ONOO
VCAM
E-selectine
ROS
NO ↓
leucocytes
TGF-β
Fibroblastes
Cardiomyocytes
Myofibroblastes
GCs ↓
Collagène
GMPc↓
Fpassive↑
PKG↓
Hypertrophie
Figure 22. Nouveau paradigme de l’insuffisance cardiaque à fraction d’éjection préservée. D‟après (Paulus
& Tschope, 2013).
Fpassive : tension passive du myocarde ; GCs : guanylate cyclase soluble ; GMPc : guanosine monophosphate
cyclique ; IL-6 : interleukine-6 ; NO : monoxyde d‟azote ; ONOO : peroxynitrite; PKG : protéine kinase G ;
ROS : espèces réactives de l‟oxygène ; TGF-β : transforming growth factor- β ; TNF-α : tumor necrosis factorα.
1.4.4. Traitements de l’ICFEp
Contrairement à l‟ICFEa, très peu d‟essais cliniques randomisés, visant à évaluer de
nouvelles thérapeutiques dans l‟ICFEp ont donné des résultats satisfaisants. Ceci s‟explique
notamment par les difficultés diagnostiques de l‟ICFEp, la difficulté d‟inclusion des patients
en ICFEp, qui étant généralement plus âgés présentent de nombreuses comorbidités, les
excluant ainsi des essais cliniques. Ces comorbidités induisent également l‟apparition de
complications non cardiaques conduisant à des taux de réhospitalisation et de mortalité
importants (From & Borlaug, 2011).
1.4.4.1. Traitements conventionnels
Les traitements conventionnels de l‟IC qui ont fait leur preuve dans le traitement de
l‟ICFEa sont, pour la grande majorité, inefficaces dans le traitement de l‟ICFEp. Ainsi, les
inhibiteurs de l‟enzyme de conversion de l‟angiotensine qui ont été les plus étudiés,
notamment dans deux essais cliniques de grande envergure, CHARM-Preserved (Yusuf et al.,
2003) et I-PRESERVE (Massie et al., 2008), n‟améliorent pas le pronostic vital des patients
66
en ICFEp. Des résultats limités ont été obtenus avec l‟utilisation de β-bloquants (Bergstrom et
al., 2004; Hernandez et al., 2009). Ainsi, à l‟exception d‟une étude utilisant du Nébivolol
(Flather et al., 2005), démontrant une diminution de la mortalité et de la morbidité des
patients âgés de plus de 70 ans, d‟autres études utilisant du Carvédilol (Bergstrom et al.,
2004) ou des β-bloquants, sans préciser leur nature exacte (Hernandez et al., 2009), ne
démontrent pas d‟amélioration de la survie chez les patients en ICFEp (Figure 23).
L‟utilisation de diurétique semble de son côté risqué étant donné la sensibilité des patients en
ICFEp aux variations de précharge et postcharge (cf Altérations des réserves cardiaques et
insuffisance chronotrope).
ICFEa
Survie
1,0
ICFEp
1,0
0,9
0,9
0,8
0,8
0,7
0,7
0,6
0,6
0,5
0,5
0,4
0,4
0,3
0,3
0,2
0,2
Pas
β-bloquants
Pasde
β-bloquant
β-bloquant
β-bloquants
0,1
0,0
0
030
60
Pas
β-bloquants
Pas de
β-bloquant
β-bloquant
β-bloquants
0,1
0,0
90 120 150 180 210 240 270 300 330 360
Jours depuis hospitalisation
0
030
60
90
120 150 180 210 240 270 300 330 360
Jours depuis hospitalisation
Figure 23. Effets des β-bloquants sur la survie des insuffisants cardiaques. D‟après (Hernandez et al., 2009).
ICFEa/p : insuffisance cardiaque à fraction d‟éjection altérée/préservée.
1.4.4.2. Traitements émergents
Basés sur les récentes avancées concernant la compréhension de la physiopathologie
de l‟ICFEp, de nombreuses thérapeutiques nouvelles sont actuellement à l‟essai. Ainsi,
l‟utilisation d‟inhibiteurs des PDE5 comme le Sildénafil semble être une voie thérapeutique
encourageante. En effet, ces molécules par augmentation des taux de GMPc vont notamment
permettre d‟atténuer les effets de la stimulation β-AR (Borlaug et al., 2005), de réduire la
rigidité ventriculo-artérielle (Vlachopoulos et al., 2003) et le remodelage ventriculaire gauche
(Takimoto et al., 2005) et d‟améliorer la fonction endothéliale (Katz et al., 2000). De façon
surprenante, une étude récente ayant testé le Sildénafil chez des patients en ICFEp, l‟étude
RELAX, n‟a pas mis en évidence d‟amélioration de la capacité à l‟effort et du statut clinique
des patients traités avec le Sildénafil par rapport aux patients traités avec un placébo (Redfield
et al., 2013). Cela renforce la nécessité d‟identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour le
traitement de l‟ICFEp. Ainsi, comme la réduction de la dégradation du GMPc ne donne pas
67
de résultats satisfaisants, certains auteurs tentent d‟en augmenter sa synthèse. Pour cela, une
supplémentation en BH4 permettant une augmentation des concentrations en NO et in fine de
GMPc est envisagée. Des études précliniques ont ainsi démontré que l‟administration de BH4
réduit l‟hypertrophie et la fibrose myocardique et améliore le couplage NOS-BH4 avec
comme conséquence une diminution du stress oxydant. De plus, l‟administration de BH4
améliore les fonctions diastoliques et systoliques (Moens et al., 2008; Silberman et al., 2010).
L‟aldostérone présente également de nombreux effets néfastes sur l‟hypertrophie
ventriculaire, la fibrose, la rigidité vasculaire ou encore la dysfonction endothéliale (Weber,
2001). Les antagonistes de l‟aldostérone ont donc un potentiel thérapeutique encourageant.
Un essai clinique évaluant l‟effet de la spironolactone dans l‟ICFEp est actuellement en cours,
l‟inclusion des patients étant terminée (TOPCAT Trial).
La modulation de la FC, qui est altérée dans l‟ICFEp, est également un domaine de
recherche très actif. Plusieurs études cliniques sont actuellement en cours pour évaluer
l‟impact de la réduction de la FC par un bloqueur des canaux HCN, à l‟origine du courant If,
l‟ivabradine. Contrairement aux β-bloquants, qui vont également avoir une action sur
l‟inotropisme et le lusitropisme cardiaque, l‟ivabradine, par son action propre sur le courant If,
va uniquement provoquer un ralentissement de la dépolarisation diastolique, à l‟origine du PA
sinusal, conduisant à un ralentissement de la FC (DiFrancesco & Camm, 2004). Ainsi, une
étude récemment publiée démontre l‟effet bénéfique de l‟ivabradine sur la capacité à l‟effort
des patients en ICFEp. Cet effet bénéfique se traduit notamment par une amélioration des
pressions de remplissage du VG au cours de l‟effort (Kosmala et al., 2013). D‟autres études
utilisant l‟ivabradine viennent d‟être complétées (Cice, 2013; Cocco, 2013) et les résultats
devraient être publiés prochainement, enfin une dernière étude est encore en cours de
recrutement de patients (McCaffrey, 2013)(clinicaltrials.gov, septembre 2013).
Enfin, de nombreuses études s‟intéressent à la modulation de la rigidité ventriculaire et
au potentiel thérapeutique que pourrait avoir des molécules ciblant le TGF-β, les MMP ou
encore la titine. L‟utilisation d‟anticorps anti-TGF-β s‟est ainsi montré efficace chez des rats
hypertendus présentant une dysfonction diastolique (Kuwahara et al., 2002). A l‟inverse
l‟administration d‟un inhibiteur des MMP, le PG116800, chez des patients 24h à 48h post
infarctus et pendant 90 jours n‟a pas montré d‟effets bénéfiques (Hudson et al., 2006).
L‟absence des résultats bénéfiques dans cette étude clinique a ralenti la mise en place d‟autres
études utilisant des inhibiteurs de MMP (Spinale, 2007). Il est cependant important de relever
68
que la fibrose observée suite à un infarctus du myocarde est une fibrose principalement
localisée au niveau de la zone nécrotique alors que dans l‟ICFEp, la fibrose observée est une
fibrose diffuse. Ainsi, il est possible que des inhibiteurs des MMP soient plus efficaces dans
l‟ICFEp qu‟en post-infarctus.
1.4.5. Modèles expérimentaux d’ICFEp
L‟absence d‟efficacité des thérapeutiques conventionnelles et les résultats peu
encourageants obtenus jusqu‟alors avec les traitements émergents, comme le sildénafil, ont
mis en avant le manque de connaissances qui existe encore dans la compréhension de la
physiopathologie de l‟ICFEp. Cela a conduit à l‟élaboration de nombreux modèles animaux
dans le but d‟étudier plus précisément cette physiopathologie. L‟ensemble des modèles
animaux les plus pertinents ainsi que leurs avantages et leurs limites sont répertoriés cidessous et résumés dans le tableau IX.
69
Tableau IX. Comparaison des différents modèles animaux d’insuffisance cardiaque à fraction d’éjection
préservée (ICFEp) avec la pathologie humaine
ICFEp
Humaine
Rat
Dalh/SS
1
Souris
mRen2.
Lewis2
ZSF1
obèse3
TAC
4
TAC
DOCA
/Salt6
SAM
5
Chien8
Porc9
7
Sexe
Femme >
Homme
mâle
femelle
OVA
mâle
mâle
mâle
mâle
mâle
mâle
femelle
Age
> 70 ans
19 sem
15 sem
18-20
sem
18-22
sem
12-13
sem
10 sem
6 mois
7-13 ans
nd
Diabète
+
nd
nd
+
nd
nd
nd
nd
nd
nd
Poids
+
-
+
+
=
=
nd
+
=
nd
PAM
+
+++
+++
+++
=
nd
+
=
+++
+++
FE
=
=
nd
=
nd
-
=
=
=
nd
Fonction
systolique
=
=
=
=
-
nd
=
=
=
=
PTDVG
+
+
nd
+
+
+
+
+
+
=
E/E'
+
nd
+
+
+
nd
+
nd
nd
nd
Ea
+
nd
nd
nd
nd
nd
=
=
+
nd
Hypertrophie
+
+
=
+
+
+
=
=
+
+
Fibrose
+
nd
+
=
nd
+
nd
+
+
+
Fonction
rénale
-
-
-
-
nd
nd
nd
nd
-
nd
Modifications potentielles par rapport à la pathologie humaine : = aucune différence, + légère augmentation, +++
forte augmentation, Ea : élastance artérielle, E/E‟ : rapport vitesse de l‟onde E/vitesse de déplacement de
l‟anneau mitral, FE : fraction d‟éjection, nd : non déterminé, OVA : ovariectomisée, PAM : pression artérielle
moyenne, PTDVG : pression télédiastolique du ventricule gauche.
1
:(Klotz et al., 2006), 2 : (Groban et al., 2008), 3 :(Hamdani et al., 2013) ,4 :(Litwin et al., 1995) , 5 :(Moens et
al., 2008), 6 :(Silberman et al., 2010) , 7 :(Reed et al., 2011), 8 :(Hart et al., 2001), 9 :(Rienzo et al., 2012).
1.4.5.1. Modèles de rats
a- Rat Dahl/Salt sensitive
Le modèle de rat Dahl/Salt sensitive (SS) est le modèle actuellement le plus utilisé
dans les études sur l‟ICFEp (Klotz et al., 2006; Kamimura et al., 2012; Omori et al., 2012;
Koshizuka et al., 2013). Ces animaux sont nourris pendant 7 semaines avec un régime pauvre
en sodium (0,3% NaCl) avant le changement pour une alimentation riche en sodium (8%
NaCl). Après 12 semaines de cette alimentation riche en sodium, les rats Dahl/SS présentent
une HTA sévère conduisant à une insuffisance rénale, démontrée par une élévation de
l‟urémie, et un remodelage cardiaque, caractérisé par un épaississement du septum
interventriculaire et une augmentation du poids du VG. Cela conduit à l‟apparition
70
d‟altérations cardiaques parmi lesquelles : une élévation des pressions télésystoliques et
télédiastoliques du VG, une diminution du volume télédiastolique du VG, une élévation de la
constante de relaxation isovolumique τ ainsi qu‟une élévation de la constante de rigidité
ventriculaire α. De plus, il n‟est pas observé chez ces animaux d‟altérations de la FE.
Cependant, après 12 semaines, en plus d‟une absence d‟augmentation du poids des poumons,
aucune altération du remplissage du VG n‟est observée par échocardiographie chez ces
animaux. Aux âges plus avancés, 16 et 20 semaines d‟alimentation riche en sodium,
l‟hypertrophie continue de se développer et des signes d‟IC apparaissent dont une élévation
du poids des poumons. Cependant, le cœur se dilate, ce qui normalise la constante de rigidité
ventriculaire α. De plus, une altération de la FE est observée à ces âges limitant la
comparaison avec l‟ICFEp retrouvée chez l‟homme.
b- Ratte mRen2.Lewis
Les femelles hétérozygotes mRen2 expriment le gène rénine-2 de souris, codant pour
l‟isoforme thermosensible rénine-2, dans l‟ensemble des tissus. Le gène rénine-1 code lui
pour un isoforme thermostable rénine-1 (Dickinson et al., 1984). L‟insertion du transgène
rénine-2 permet le développement, chez des femelles ovariectomisées, d‟une HTA
dépendante du système rénine-angiotensine-aldostérone, sans nécessité d‟un régime
alimentaire riche en sodium (Groban et al., 2008). Ainsi, après une ovariectomie réalisée chez
des femelles âgées de 4 semaines, ces dernières développent une HTA sévère dès 15
semaines. Cette HTA sévère conduit au développement d‟une dysfonction diastolique,
caractérisée par une élévation du rapport E/E‟, sans modification de la fonction systolique. La
FE ainsi que les pressions intraventriculaires n‟ont cependant pas été évaluées dans ce
modèle. La dysfonction diastolique observée est associée à une fibrose myocardique sans
mise en évidence d‟hypertrophie cardiaque. Enfin, ces animaux développent une altération de
la fonction rénale (Yamaleyeva et al., 2012). Ce modèle est l‟un des seuls prenant en compte
l‟importance du sexe et des hormones sexuelles dans le développement de l‟ICFEp.
Malheureusement, ces animaux sont utilisés jeunes et développent rapidement une HTA
sévère qui n‟est pas retrouvée dans le tableau clinique des patients en ICFEp.
c- Rat ZSF1 obèse
Le modèle de rats ZSF1 obèses résulte du croisement entre des rattes Zucker
diabétiques obèses et des rats SHHF (Spontaneously Hypertensive Heart Failure). Ces
animaux ont la particularité d‟être des hétérozygotes composites pour le gène de la leptine. En
effet, ils possèdent 2 allèles mutés pour le gène de la leptine. Une allèle fa héritée des rattes
71
Zucker (Phillips et al., 1996) et une allèle cp héritée des rats SHHF (Wu-Peng et al., 1997).
La leptine est une hormone qui régule les réserves de graisses ainsi que la sensation de faim
(Dubern & Clement, 2012).
La comparaison de ces rats ZSF1 obèses avec d‟autres souches de rats dont les rats
SHR (Spontaneously Hypertensive Rat) et les rats SHHF a mis en évidence le développement
d‟un syndrome métabolique chez ces animaux (Tofovic et al., 2000). Ce syndrome
métabolique est associé à une dysfonction ventriculaire gauche et au développement d‟une
néphropathie, caractérisée par une protéinurie massive, des anomalies histopathologiques et
un débit de filtration glomérulaire réduit. Une étude récente a démontré chez ces animaux,
âgés de 18 à 20 semaines, l‟apparition d‟une ICFEp après un régime riche en graisses
(Hamdani et al., 2013). Cette ICFEp se caractérise par une élévation du rapport E/E‟ et de la
pression télédiastolique du VG (PTDVG) ainsi qu‟un élargissement de l‟OG. Ces animaux
présentent également lors de leur sacrifice une forte augmentation du poids des poumons
signe probable de la survenue fréquente d‟œdèmes pulmonaires. De plus, ces animaux
possèdent une fonction systolique proche de celle des patients en ICFEp avec une FE
préservée et une élévation de l‟Ees. Enfin, ces animaux développent une hypertrophie
cardiaque sans toutefois de mise en évidence de fibrose myocardique. Ce modèle présente
cependant quelques limites. En effet, comme la plupart des autres modèles, ce modèle est
réalisé à partir de rats mâles et présent une HTA sévère limitant la comparaison de toutes les
caractéristiques avec l‟ICFEp humaine.
d- Modèle de constriction aortique
La constriction aortique est réalisée au niveau de l‟aorte ascendante chez des rats
mâles Wistar âgés de 3 à 4 semaines (Weinberg et al., 1994; Litwin et al., 1995). Quinze à 18
semaines après la chirurgie, les animaux présentent une altération diastolique caractérisée par
une élévation de la PTDVG et du rapport E/E‟. D‟autres paramètres diastoliques comme le
rapport E/A, le temps de décélération de l‟onde E (TDE) sont également augmentés. Ceci est
corrélé à une hypertrophie myocardique à l‟origine d‟une augmentation de la rigidité des
ventricules chez ces animaux. Ces animaux présentent cependant une dilatation du VG
associée une altération de la fonction systolique, caractérisée par une altération du
raccourcissement de l‟endocarde. La FE des animaux n‟est pas rapportée dans ces études.
Enfin, bien qu‟aucune élévation de la pression artérielle ne soit rapportée dans ce modèle,
l‟élévation de la pression télésystolique pour des valeurs voisines de 200 mmHg, à cause de la
72
constriction aortique, simule une HTA sévère, qui n‟est pas retrouvée chez les patients en
ICFEp.
1.4.5.2. Modèle de souris
a- Modèle de constriction aortique
Comme chez le rat, il existe un modèle de constriction aortique chez la souris (Moens
et al., 2008). La constriction de l‟aorte ascendante est réalisée chez des mâles C57BL/6 âgés
de 8 à 9 semaines. Les animaux analysés 4 semaines après la constriction de l‟aorte présentent
une altération diastolique, caractérisée par une élévation de la PTDVG. Ces animaux présentent
également une hypertrophie myocardique associée à une fibrose. Cependant, il existe de
nombreuses limites dont l‟utilisation d‟animaux mâles et la présence d‟une altération de la
FE. De plus, ce modèle, réalisé chez des animaux jeunes, a une évolution rapide avec
l‟installation d‟une dilatation du VG associée à une altération prononcée de la fonction
systolique dès 9 semaines après la constriction aortique.
b- Souris DOCA/Salt
Le modèle DOCA/Salt consiste en la réalisation, chez des mâles C57BL/6 âgés de 8
semaines, d‟une néphrectomie unilatérale associée à un régime hyper-salé (eau de boisson à
1% NaCl) et à une supplémentation en acétate de déoxycortisone (DOCA) à l‟aide d‟un pellet
sous-cutané (0,7 mg/jour) (Silberman et al., 2010). Ces animaux présentent, 2 semaines après
l‟opération, une élévation modérée de la pression artérielle associée à des altérations
diastoliques, dont une élévation de la PTDVG et du rapport E/E‟, sans altération des fonctions
systoliques et de la FE. Il n‟a cependant pas été mis en évidence chez ces animaux
d‟altérations du couplage ventriculo-artériel ou de remodelage myocardique (hypertrophie et
fibrose). Ce modèle est, encore une fois, réalisé chez des mâles jeunes limitant la pertinence
par rapport à l‟ICFEp retrouvée chez l‟humain.
c- Souris SAM
Le modèle de souris SAM (Senescence Accelerated Mouse) a été créé afin d‟étudier
de nombreuses pathologies liées au vieillissement comme l‟ICFEp (Reed et al., 2011). Ces
souris sont dérivées de la souche de souris AKR/J ; elles possèdent une espérance de vie
réduite de 40% comparées à des souris de même fond génétique (Flood & Morley, 1998).
Ces animaux présentent à 6 mois une altération de la fonction diastolique caractérisée par une
élévation de la PTDVG. Cette dysfonction diastolique est associée à une fibrose cardiaque mais
sans la présence d‟une hypertrophie myocardique. De plus, ils possèdent une fonction
73
systolique préservée avec une FE maintenue. Enfin, ces animaux présentent un léger surpoids
par rapport aux souris de même fond génétique au même âge. Cependant, ces animaux ne
présentent pas d‟élévation de la pression artérielle ou de l‟Ea limitant la comparaison avec
l‟ICFEp humaine.
1.4.5.3. Modèles de gros animaux
Il est important de relever qu‟en plus des modèles de rongeurs qui sont les plus
utilisés, il existe également des modèles de gros animaux comme les modèles de chien
(Munagala et al., 2005; Hamdani et al., 2013) et de porc (Rienzo et al., 2012) hypertendus.
Ces modèles bien que coûteux présentent l‟avantage d‟une physiologie cardiaque plus proche
de celle humaine et d‟une possibilité de suivi dans le temps grâce à l‟appareillage des
animaux.
a- Chien hypertendu
Le modèle de chien hypertendu, décrit initialement par Page (Page, 1939), consiste à
envelopper les reins dans du cellophane ou du papier de soie (Hart et al., 2001). Ces animaux
développent rapidement (2 semaines) une HTA sévère. Les analyses échocardiographiques
réalisées 12 semaines après la chirurgie montrent une diminution du diamètre télédiastolique
du VG, due à une hypertrophie associée au développement d‟une fibrose myocardique chez
ces animaux. A ce stade, il n‟y a pas d‟altération de la FE. L‟hypertrophie cardiaque est
associée au développement après 12 semaines d‟une fibrose myocardique (Hart et al., 2001).
Des études invasives par boucles pression-volume on également mis en évidence une
élévation de la PTDVG chez ces animaux ainsi qu‟une altération du couplage ventriculoartériel caractérisé par une élévation de l‟Ea (Hart et al., 2001). Ce modèle possède donc un
profil hémodynamique proche de celui des patients en ICFEp. Cependant, comme pour la
majorité des modèles de rongeurs, la présence d‟une HTA sévère et l‟utilisation de chiens
mâles limite la pertinence du modèle par rapport à la pathologie humaine.
b- Porc hypertendu
Dans ce modèle de truie, l‟HTA est induite par infusion d‟angiotensine de type II (30
ng.kg.min-1) pendant 28 jours. Préalablement à ce traitement, les animaux sont appareillés de
façon à pouvoir suivre l‟évolution de la fonction et de la morphologie cardiaques au cours du
temps. Bien qu‟aucune altération de la PTDVG ne soit mise en évidence après 28 jours, une
hypertrophie myocardique associée à de la fibrose est démontrée dans ce modèle. Aucune
étude échocardiographique sur les paramètres de la fonction cardiaque classiquement étudiés
74
comme la FE ou le rapport E/E‟ ne sont pas rapportés ici. Cependant, la caractérisation
hémodynamique des animaux met en avant une modification de l‟importance relative des
différentes périodes du cycle cardiaque. Ainsi, les animaux présentent une augmentation des
périodes de contraction et de relaxation isovolumique au dépend des périodes d‟éjection
systolique et de remplissage diastolique. Ces altérations du cycle cardiaque, bien qu‟étant sans
conséquence sur l‟éjection cardiaque, sont le signe d‟une incapacité du myocarde à s‟adapter
à des conditions de stress. En effet, il a été également montré qu‟une augmentation de la FC
n‟induit aucune modification de la constante de relaxation τ dans ce modèle alors qu‟une
augmentation de cette constante est observée chez les animaux contrôles.
Ce modèle est l‟un des rares avec le modèle de ratte mRen2.Lewis à prendre en
compte l‟importance du sexe dans le développement de l‟ICFEp. Une analyse
échocardiographique de ces animaux est nécessaire pour mieux caractériser les altérations
possibles de la fonction diastolique. Malheureusement, comme dans la plupart des autres
modèles d‟ICFEp, on observe chez ces animaux une HTA sévère qui n‟est pas retrouvée chez
les patients en ICFEp.
75
II-OBJECTIFS DE LA THÈSE
76
Les travaux de l‟équipe s‟intéressent à l‟étude de différentes formes d‟IC, aiguës et
chroniques. Pour mener à bien ces recherches, l‟équipe s‟attache à développer des modèles
animaux pertinents permettant d‟étudier les mécanismes physiopathologiques et plus
particulièrement l‟implication dans ces pathologies de l‟endothélium ainsi que du système βAR au niveau cardiovasculaire.
Le premier objectif de ce travail de thèse a été d‟étudier la physiopathologie de la
défaillance cardiovasculaire au cours de la phase précoce du choc septique, qui associe une
forme d‟IC aiguë à une dysfonction vasculaire notamment endothéliale. La première partie de
ce travail a donc consisté en la caractérisation et la validation d‟un modèle de rat en choc
endotoxémique pertinent et reproductible pour une approche préclinique du choc septique
avant l‟initiation de la réanimation. Ce modèle a permis par la suite la réalisation de la
seconde partie de ce travail qui a consisté en l‟étude du remodelage β-AR vasculaire et de
l‟implication de la dysfonction endothéliale dans ce remodelage, au cours du choc
endotoxémique. Ce travail, réalisé à la fois au niveau d‟artères de conductances et de
résistances fait l‟objet d‟un article soumis au journal Intensive Care Medicine dont je suis copremier auteur et est présenté dans la partie résultat 4.1.2. de ce manuscrit "Article :
Augmentation de la réponse β2-adrénergique vasculaire à la phase précoce du choc
endotoxémique chez le rat". Enfin, la troisième et dernière partie de ce travail s‟est intéressée
à l‟étude du remodelage β-AR cardiaque ainsi qu‟à la caractérisation de l‟altération de la
fonction paracrine de l‟EE qui n‟ont été que très peu étudiés. L‟implication de cette
dysfonction endothéliale dans le remodelage β-AR cardiaque, via la voie des NOS, de l‟ET et
des COX a également été évaluée. Cette étude a notamment été réalisée sur la contractilité de
muscles papillaires et sera prochainement soumise pour publication au Journal of the
American College of Cardiology. Je suis le premier auteur de ce travail présenté dans la partie
4.1.3. de ce manuscrit "Article : Implication des cyclooxygénases dans la potentialisation de
la contractilité β1-adrénergique cardiaque à la phase précoce du choc endotoxémique chez le
rat".
Le second objectif de cette thèse a consisté en la caractérisation d'un modèle de rat
pertinent pour l‟étude de l‟ICFEp, une forme d‟IC chronique dont la physiopathologie est très
mal connue. La première partie de ce travail a consisté en la génération, en collaboration avec
la plateforme de transgénèse rat de l‟unité INSERM UMR-643, de plusieurs lignées de rats
transgéniques surexprimant de manière ciblée sur les cellules endothéliales le récepteur β3-AR
humain. Une fois ces lignées créées et mises en élevage, nous les avons caractérisées
77
hémodynamiquement à l‟âge de 30 semaines par une approche échocardiographique et une
approche invasive de cathétérisme cardiaque (technique des boucles pression-volume). Les
lignées présentant le profil hémodynamique le plus pertinent par rapport au tableau clinique
de la pathologie humaine ont également été étudiées histologiquement afin de détecter
l‟apparition de fibrose myocardique. La caractérisation de ces animaux a été retardée pour
diverses raisons logistiques et est actuellement en cours de finalisation. Cette pathologie étant
principalement retrouvée chez des femmes ménopausées nous souhaiterions également
déterminer l‟influence des hormones sexuelles dans le développement de cette pathologie.
Ainsi, une caractérisation à l‟âge de 45 semaines est en cours chez des femelles transgéniques
ovariectomisées à l‟âge de 8 semaines. Le modèle apparaissant comme le plus pertinent pour
l‟étude de l‟ICFEp (en termes d‟âge et d‟influence hormonale) doit permettre à l‟équipe de
mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques impliqués dans l‟apparition et le
développement de cette pathologie. L‟implication de la dysfonction endothéliale rencontrée
dans cette pathologie, ainsi que le rôle du système β-AR au niveau des altérations
cardiovasculaires seront particulièrement étudiés. In fine, ce modèle devra permettre la
détermination de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles de l‟ICFEp et le passage à des
études cliniques en collaboration avec le service de cardiologie de l‟institut du thorax.
78
III-MATÉRIEL ET MÉTHODES
79
3.1. Modèles animaux
L‟intégralité des expérimentations animales a été réalisée en accord avec les règles
d‟éthique de la Communauté Européenne. J‟ai suivi et obtenu au cours de mon année de
master 2 le Niveau 1 de la formation à l‟expérimentation animale agréée par le Ministère de
l‟Alimentation, de l‟Agriculture et de la Pêche. Tous les animaux utilisés dans les études
décrites dans ce manuscrit ont été maintenus dans des conditions d‟élevage standard (T°C :
21-24°C ; humidité 40-60%) avec un accès à volonté à l‟eau et la nourriture. Un délai de 4 à 7
jours d‟acclimatation des rats à leur environnement est respecté avant de débuter tout
protocole expérimental.
3.1.1. Induction du choc endotoxémique
Le modèle de choc endotoxémique est réalisé chez des rats mâles de souche Sprague
Dawley (Elevage Janvier) âgés de 10 semaines (370-420g) au moment de l‟expérimentation.
Les rats sont anesthésiés par inhalation d‟isoflurane (Forène, Abbott, Rungis, France) 4%/O2
(2 L.min-1) dans une chambre d‟induction. L‟entretien de l‟anesthésie est assuré par un
masque placé sur le museau de l‟animal, en ventilation spontanée, permettant de délivrer un
mélange isoflurane 2%/O2 (0,4 L.min-1).
Une dose de 5 mg.kg-1 de LPS (Escherichia coli, O111B4, Sigma-Aldrich, Saint
Quentin Falavier, France) diluée dans du sérum physiologique (5 mg.mL-1) est injectée par
voie intraveineuse (i.v.) dans la veine dorsale de la verge : groupe LPS. Un volume équivalent
de sérum physiologique est injecté aux rats contrôles : groupe CTRL. Pour quelques animaux,
un suivi des paramètres in vivo est réalisé sous anesthésie générale pendant les 3 heures
suivant l‟injection de LPS ou de sérum physiologique seul. Lors de ces mesures, les rats sont
maintenus sous isoflurane 2%/O2 (0,4 L.min-1) après l‟injection et pendant tout le protocole
expérimental. Pour les autres protocoles expérimentaux les animaux sont réveillés après
l‟injection de LPS ou sérum physiologique et placés dans une cage où l‟eau et la nourriture
leurs sont fournies à volonté. Les différents protocoles expérimentaux sont commencés 3
heures après l‟injection de LPS ou de sérum physiologique.
3.1.2. Modèle de rat transgénique
Plusieurs lignées de rats transgéniques, sur fond génétique Sprague Dawley, ont été
réalisées au sein de la plateforme transgénèse rat située dans l‟unité INSERM UMR 643
dirigée par le Dr Ignacio Anegon. La transgénèse a été réalisée par injection, dans des
80
zygotes, de plasmides nus contenant le transgène codant pour le récepteur β3-AR humain sous
la dépendance du promoteur d‟ICAM-2 (IntraCellular Adhesion Molecule 2). ICAM-2 est
constitutivement et uniquement exprimée dans l‟endothélium vasculaire conduisant à
l‟expression du récepteur β3-AR humain uniquement au niveau des cellules endothéliales.
Cela a été vérifié par réaction en chaîne par polymérase après transcription inverse (RT-PCR)
au niveau de l‟aorte thoracique sans endothélium (Figure 24). De plus, le transcrit du
récepteur β3-AR humain est retrouvé au niveau du cœur entier mais ne l‟est pas lorsque les
cardiomyocytes sont isolés. Confirmant l‟expression du transgène uniquement au niveau des
cellules endothéliales.
Aorte thoracique
Endo - Endo +
Endo - Endo +
Endo - Endo +
Endo - Endo +
M
720
720bp
bp
505bpbp
505
GAPDH
mRNA
GAPDH
hβ3-AR
-AR mRNA
hβ
mRNA
3
Cœur
WT Tgβ3
RT RT
WT
M
Cardiomyocytes
WT Tgβ3
Tgβ3
RT
H2O NRT RT NRT RT
720 bp
M
720 bp
505 bp
GAPDH
RT
Contrôle
positif
H2O NRT RT
Tgβ3
505 bp
GAPDH
hβ3-AR mRNA
hβ3-AR mRNA
Figure 24. Réaction en chaîne par polymérase après transcription inverse (RT) des transcrits codant pour
la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) et le récepteur β 3-adrénergique humain (hβ3AR) au niveau de l’aorte thoracique, du cœur entier et de cardiomyocytes isolés de rats transgéniques
(Tgβ3) et sauvages (WT).
Au niveau de l‟aorte thoracique l‟expérience a est réalisée avant (Endo +) et après abrasion de l‟endothélium
(Endo -). Au niveau du cœur entier et des cardiomyocytes isolés des expériences sans transcription inverse
(NRT) où utilisant de l‟eau (H2O) à la place des transcrits servent de contrôles négatifs. M : marqueurs de taille.
Au sein du laboratoire nous possédons actuellement 5 lignées de rats transgéniques
nommées de F19 à F23. Les études présentées dans ce manuscrit utilisent des animaux issus
des lignées F19 et F20. Les résultats préliminaires existants pour les 3 autres lignées ne seront
pas présentés.
3.1.3. Ovariectomie
L‟intervention chirurgicale se déroule sous anesthésie générale. L‟entretien de
l‟anesthésie est assuré par un masque placé sur le museau de l‟animal, en ventilation
spontanée, permettant de délivrer un mélange isoflurane 2%/O2 (0,4 L.min-1). L‟analgésie
81
préopératoire est assurée par une injection de 1 mg.kg-1 de nalbuphine (Mylan, St Priest,
France) par voie sous-cutanée. L‟animal est tondu largement au niveau de la zone opératoire,
entre la jonction thoraco-lombaire et le sacrum, sur les deux flancs de l‟animal et la zone
opératoire est désinfectée.
La peau est incisée au niveau du flanc, environ 0,5 cm caudalement à la dernière côte,
sur 1 cm. Les parois musculaires sont dilacérées délicatement jusqu‟à la cavité abdominale.
L‟ovaire, qui est situé dans le tissu adipeux sous-jacent à l‟incision, est extériorisé. Deux
ligatures sont posées à l‟aide de fil tressé résorbable (Vicryl ® 3.0, Ethicon, Bruxelles,
Belgique), de part et d‟autres de l‟ovaire, et l‟exérèse est réalisée. Les plans musculaires et
sous-cutanés sont suturés avec du Vicryl® 3.0. La peau est suturée avec un monofil
irrésorbable (Dafilon® 3.0, B.Braun, Melsungen, Allemagne) après infiltration par lidocaïne
1 % dans les plans musculaires. Le même protocole opératoire est réalisé pour l‟ovaire
controlatéral. Pour une opération Sham, les ovaires sont extériorisés de la paroi abdominale,
puis replacés dans l‟animal, avant de suturer les différents plans de la même manière que pour
une ovariectomie.
Pendant les 3 jours qui suivent l‟opération, les rates opérées reçoivent 1 mg.kg-1 de
nalbuphine (Mylan) par voie sous cutanée une fois par jour. Elles sont également traitées
quotidiennement pendant une semaine avec de l‟ibuprofène (35 mg.kg-1.j-1, per os) : le
traitement est dilué dans l‟eau de boisson (eau distillée) à raison d‟une consommation de
30 mL d‟eau par rat et par jour associée à une nourriture sèche (soit une dose d‟ibuprofène de
0,35 mg.mL-1).
82
3.2. Biochimie
3.2.1. Dissection et prélèvements
3.2.1.1. Le Sang
Trois heures après l‟injection de LPS ou de sérum physiologique, les rats sont
anesthésiés par inhalation d‟isoflurane à 4%/O2 (2 L.min-1) dans une chambre d‟induction et
entretenus au masque en ventilation spontanée sous isoflurane à 2%/O2 (0,4 L.min-1). Après
une injection i.v. de 0,1 mL d‟héparine (25 000 UI.mL-1), une ponction intracardiaque est
alors réalisée à l‟aide d‟une seringue pour prélèvement artériel à remplissage automatique
contenant 60 UI d‟héparine équilibrée (PICO70, Radiometer Medical AsP, Brønshøj,
Danemark). Le sang, impérativement isolé de tout contact avec l‟air ambiant, est
immédiatement mis sur glace.
3.2.1.2. Le cœur et l‟aorte thoracique
Après prélèvement du sang, une incision cutanée ventrale, médiane, est réalisée et le
tissu cutané est décollé du plan musculaire. Les muscles de l‟abdomen sont ensuite coupés en
arrière de la coupole diaphragmatique, avant d‟inciser le diaphragme. Les côtes sont coupées
latéralement en leur milieu et le volet thoracique ainsi obtenu, est récliné crânialement. Le
cœur est prélevé le plus rapidement possible et placé dans du sérum physiologique à 4°C pour
être rincé et lavé de son sang. L‟aorte thoracique est ensuite prélevée et placée dans une boîte
de Pétri contenant du sérum physiologique à 4°C. Le cœur et l‟aorte sont alors isolés des
tissus adjacents (péricarde, restes de poumons et thymus, tissus conjonctifs et graisseux) et
plongés dans de l‟isopentane (Sigma-Aldrich) préalablement refroidi dans l‟azote liquide. Les
tissus sont alors stockés avant utilisation à -80°C.
3.2.2. Biochimie sanguine
Dans les 10 min suivant le prélèvement, l‟échantillon de sang est analysé à la
plateforme de biochimie du CHU de Nantes. Une fraction de sang total est analysée à l‟aide
d‟un GEM®4000 (Instrumentation Laboratory, Paris, France) alors qu‟une autre fraction est
centrifugée pendant 10 min à 4000 rotations par min (rpm). Le plasma est alors analysé à
l‟aide d‟un cobas®8000 (Roche, Meylan, France). A partir du sang total sont extraites les
valeurs de pH, pression partielle en oxygène (pO2) et pression partielle en dioxyde de carbone
83
(pCO2) ainsi que les concentrations en ions bicarbonates (HCO3-) et en lactate. L‟étude de la
fraction plasmatique permet d‟obtenir les concentrations d‟urée et de créatinine.
3.2.3. Western Blot
La technique de western blot permet de visualiser la présence ou non d‟une protéine
donnée dans un tissu et d‟en effectuer une analyse semi-quantitative.
Cette technique est ici employée pour :
-la détection et la quantification des protéines vasculaires β1-, β2- et β3-AR dans
l‟aorte thoracique de rats LPS et CTRL.
-la détection et la quantification des protéines cardiaques β1-, β2-, β3-AR,
COX1 et COX2 dans le cœur de rats LPS et CTRL.
L‟extraction des protéines est réalisée par broyage des tissus à l‟ultra-turrax, dans du
tampon Ripa (1x PBS ; 1% Nonidet P-40 ; 0,5% déoxycholate de sodium ; 0,1% Sodium
Dodecyl Sulfate (SDS) ; Sigma-Aldrich) à raison de 3 mL de Ripa pour 1 g de tissu
additionné de 1x de PMSF (Phenyl Methyl Sulfonyl Fluoride, un inhibiteur de protéases à
sérine, Interchim, Montluçon, France) et de 2x d‟un mélange d‟inhibiteur de protéases
(complete, Roche, Mannheim, Allemagne).
Après 30 min de repos à 4°C, les homogénats obtenus sont centrifugés à 15 000 g
durant 15 min à 4°C afin d‟éliminer les débris cellulaires. Les concentrations protéiques des
surnageants ainsi obtenus sont évaluées grâce au réactif de Bradford (Biorad, Hercules, USA)
après lecture spectrophotométrique à une longueur d'onde de 595 nm.
Les
échantillons
protéiques
sont
déposés
sur
un
gel
d‟électrophorèse
(Polyacrylamide/SDS) composé d'une partie dite de tassement et d'une partie résolutive. Un
champs électrique est appliqué de part et d‟autre des extrémités du gel et permet la migration
et la séparation des protéines selon leurs poids moléculaires. Ensuite, les protéines sont
transférées sur une membrane Hybond-C (Amersham). La migration et le transfert sont
réalisés grâce à des appareils d‟electroblotting (Bio-rad, Marnes La Coquette, France). Les
interactions protéines-protéines non spécifiques sont bloquées sur les membranes par une
solution de lait écrémé 5% dilué dans du TBS (200 mM Trizma base ; 1.4 M NaCl ; pH=7.5 ;
Sigma-Aldrich) additionné de 0.1 % de Tween 20 (Sigma-Aldrich ; TBS T) 1h (2h pour les
membranes destinées à la révélation du récepteur β2-AR) à température ambiante. Les
membranes sont ensuite incubées avec l‟anticorps primaire dilué dans du TBS T, avec ou sans
84
peptide bloqueur. Dans le cas d‟une incubation de la membrane avec un mélange anticorps
primaire/peptide bloqueur, ces deux molécules sont préalablement incubées ensemble pendant
2h à température ambiante. Ensuite, les membranes sont rincées dans du TBS T et incubées
avec l‟anticorps secondaire couplé à la peroxydase dilué dans du TBS T/lait écrémé 1%.
Enfin, les membranes sont rincées dans du TBS T puis du TBS. Les complexes d‟anticorps
sont détectés par un processus de détection de chimiluminescence (ECL plus, NEN Life
Science Products, Boston, USA ou Western lightening, Perkin Elmer Life Science, Boston,
USA) et exposés en autoradiographie. La mise en évidence de la protéine de référence est
réalisée sur la même membrane que la protéine d‟intérêt, selon le même protocole, après un
rinçage dans du TBS T. Les spécificités relatives à chaque protocole sont décrites dans le
tableau X.
Tableau X. Spécificité relative à chaque protocole de Western blot.
Protéine
Anticorps primaire
Anticorps secondaire
Tissus
Référence
Conditions d’utilisation
Référence
Conditions
d’utilisation
Aorte
A272
1/2 000, TBS-T,
Anti-IgG de lapin sc-2054
1/10 000,
Coeur
(Sigma-Aldrich)
12h à 4°C
(Santa-Cruz)
1h à TA
Aorte
ab3695
1/2 000, TBS-T,
Anti-IgG de lapin sc-2054
1/15 000,
Coeur
(AbCam Ltd)
12h à 4°C
(Santa-Cruz)
1h à TA
β3-AR
Aorte
Coeur
M50, sc-50436
(Santa-Cruz)
1/5 000, TBS-T,
12h à 4°C
Anti-IgG de lapin sc-2054
(Santa-Cruz)
1/15 000,
1h à TA
COX1
Coeur
COX2
Coeur
GAPDH
Aorte
Coeur
étudiée
β1-AR
β2-AR
ab133319
1/800 TBS-T, lait 1%,
Anti-IgG de lapin sc-2054
1/10 000,
(AbCam Ltd)
12h à 4°C
(Santa-Cruz)
1h à TA
ab6665
1/1330 TBS-T, lait 1%,
Anti-IgG de lapin sc-2054
1/10 000,
(AbCam Ltd)
12h à 4°C
(Santa-Cruz)
1h à TA
6C5, sc-32233
(Santa-Cruz)
1/10 000, TBS-T,
1h à TA
Anti-IgG de lapin sc-2054
(Santa-Cruz)
1/50 000,
1h à TA
Les cases grisées correspondent aux protéines de références. Toutes les dilutions sont réalisées dans du TBS
Tween 0,1%. GAPDH : Glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase ; IgG : immunoglobuline G ; TA :
température ambiante.
3.2.4. Etudes de binding
Cette technique fait partie des techniques dites de binding dont l‟intérêt est de réaliser
une étude quantitative des interactions ligands-récepteurs. Ces techniques ne donnent, en
revanche, aucune information sur l‟effet fonctionnel potentiellement induit par la fixation du
ligand sur son récepteur. L‟intérêt de l‟étude des liaisons spécifiques ligand-récepteurs sur
tissus entiers (ou tissue segment binding) est de pouvoir étudier les récepteurs sur des
85
fragments de tissus entiers. Les récepteurs sont donc étudiés dans leur environnement natif et
seuls les récepteurs présents à la membrane sont considérés.
Les techniques de binding sont basées sur le fait que les récepteurs sont saturables,
c‟est à dire en nombre limité sur une préparation. Elles sont réalisées grâce à des ligands
radiomarqués : ligands sélectifs d‟un récepteur donné marqués par un isotope radioactif.
Quelle que soit l‟expérience réalisée, il est indispensable de déterminer le niveau de fixation
non-spécifique d‟un radioligand sur une préparation. Pour cela, des expériences en présence
d‟un antagoniste sélectif du ou des récepteur(s) considéré(s) sont réalisées : on obtient alors le
niveau de fixation non-spécifique. Le niveau de fixation non spécifique est déduit du niveau
Quantité de radioligand fixée
de fixation totale pour obtenir le niveau de fixation spécifique (Figure 25).
Fixation totale
Fixation spécifique
Bmax
Fixation non spécifique
KD
Quantité de radioligand dans la
préparation
Figure 25. Schéma théorique d’une courbe de saturation obtenue par la technique d’étude des liaisons
spécifiques ligand-récepteur.
Bmax : quantité maximale de récepteur à la membrane ; KD : constante de dissociation.
L‟intérêt principal des expériences de binding est la détermination de la capacité de
fixation, appelée affinité, du ligand pour son récepteur. Elle est caractérisée par la
concentration du ligand occupant 50 % des récepteurs (constante de dissociation à
l‟équilibre : KD) sur une préparation. Une des méthodes permettant de déterminer la valeur de
KD est la méthode de saturation. Différentes préparations sont incubées avec des quantités
croissantes de ligand radioactif et la quantité de ligand fixé sur les préparations est mesurée.
Le nombre de récepteurs présents dans la préparation (Bmax) est la valeur maximale vers
laquelle tend la fixation spécifique. La valeur de KD est alors déduite (Fig. 29).
Ces expérimentations ont été réalisées sur des échantillons de cœur de rats afin de
déterminer si les récepteurs β1- et β2-AR subissent des modifications d‟affinité à la phase
86
précoce du choc endotoxémique. Malheureusement, cette technique ne permet pas d‟étudier le
récepteur β3-AR, de par l‟absence de ligand radioactif sélectif. Le ligand choisi ici est le
[3H]-CGP-12177, c‟est un antagoniste sélectif des récepteurs β1- et β2-AR. Les courbes de
saturation permettent donc de déterminer la quantité de récepteurs β1- et β2-AR (Bmax) et leur
affinité pour le CGP-12177 (KD).
Grâce aux expériences de compétition, la proportion relative de β1- et β2-AR peut être
déterminée. Ces expériences consistent à déplacer le radioligand par un autre ligand non
marqué (ligand froid). Cela permet de calculer la valeur d‟IC50 : concentration de ligand froid
nécessaire pour déplacer 50% du radioligand. La valeur de pKi, représentant l‟affinité du
ligand froid pour le récepteur peut ensuite être calculée à partir de pKi = -log IC50 (M). Le
ligand froid utilisé ici est l‟ICI-89,406, antagoniste sélectif des récepteurs β1-AR. A fortes
concentrations, l‟ICI-89,406 présente également une affinité pour le récepteur β2-AR. Il est
donc possible de déplacer le CGP-12177 des deux sous-types et de calculer ainsi la valeur de
Quantité de radioligand fixée
pKi pour chaque sous-type et leur proportion relative (Figure 26).
100%
% R2
pKi 1
pKi 2
Quantité de ligand froid dans la
préparation
Figure 26. Schéma théorique d’une courbe de compétition obtenue par la technique d’étude des liaisons
spécifiques ligand-récepteur, modèle à deux sites de fixation.
%R2 : proportion du récepteur 2. pKi 1 : affinité du ligand froid pour le récepteur 1 ; pKi 2 : affinité du ligand
froid pour le récepteur 2.
Les études de tissu segment binding ont toutes été réalisées par Leslie Audigane dans
le laboratoire du Pr. Ikunobu Muramatsu à l‟université médicale de Fukui (Japon). La
technique utilisée a été décrite par Muramastu (Muramatsu et al., 2005). En résumé, les cœurs
sont prélevés et rincés dans une solution physiologique à 4°C (composition en mM : NaCl
120,7 ; KCl 5,9 ; MgCl2 1,2 : CaCl2 2,0 ; NaH2PO41,2 ; NaHCO3 25,5 ; glucose 11,5 ; SigmaAldrich, Japon ; pH 7,4 par aération avec un mélange 95%O2/5% CO2). Ils sont ensuite
87
découpés en petits morceaux sous microscope, 30 fragments de chaque ventricule ou du
septum peuvent être obtenus. Chaque fragment est incubé à 4°C dans 1 mL de solution
d‟incubation (composition en mM : NaCl 135,7 ; KCl 5,9 ; MgCl2 1,2 : CaCl2 2,0 ;
NaH2PO41,2 ; NaHCO3 10,5 ; glucose 11,5 ; Sigma-Aldrich, Japon ; pH 7,4) avec le ligand
radioactif [3H]-CGP-12177 (agoniste β1- et β2-AR ; activité spécifique : 48,0 Ci.mmol-1 ;
Amersham Biosciences) pendant 12h.
Pour les expériences de saturation, le [3H]-CGP-12177 a été testé de 50 à 2000 pM en
absence ou présence de 1 µM propranolol (antagoniste des récepteurs β1- et β2-AR ; Nacalai
Tesque, Kyoto, Japon) pour évaluer les liaisons non-spécifiques.
Les expériences de compétition sont menées en utilisant une seule concentration de [ 3H]CGP-12177 (en général à la valeur de KD, soit 300 pM dans nos expériences) en présence
d‟un antagoniste β1-AR : l‟ICI-89,406 (Nacalai Tesque) à 8 concentrations allant de 1 pM à
10 µM, toujours en absence ou présence de 1 µM propranolol (Nacalai Tesque) pour évaluer
les liaisons non-spécifiques.
Après incubation, les fragments de tissus sont soigneusement essuyés et rincés pendant
1 min dans 2 mL de solution d‟incubation à 4°C, en étant "vortexer". Les fragments sont de
nouveau essuyés et solubilisés dans 1 mL de NaOH (0,3 M ; Sigma-Aldrich) afin de pouvoir
compter la radioactivité fixée et déterminer la concentration de protéine de chaque tube.
Chaque expérience est réalisée en doublet.
La radioactivité est comptée dans un compteur à scintillation (LC-3500, Aloka Co.
Ltd., Tokyo, Japon) grâce à un fluide scintillant hydrosoluble (ULTIMA GOLD™, Packard
Bioscience, Groningen, Pays-Bas). La concentration protéique de chaque tube est mesurée par
la méthode de Bradford (Biorad). Le niveau de fixation spécifique est déterminé par
soustraction de (1) la radioactivité fixée par mg de protéine en présence de 1 µM propranolol
et de (2) la radioactivité totale fixée par mg de protéine.
Les données de saturation sont analysées par régression non-linéaire à l‟aide du
logiciel GraphPad PRISM 5 (GraphPad Software Inc., San Diego, USA). La constante de
dissociation à l‟équilibre KD et le nombre maximum de site de fixation Bmax sont déduits des
courbes de saturation. Les expériences de compétitions sont analysées par régression non
linéaire à deux sites. La proportion de β1- et β2-AR (%) et la valeur de pKi sont calculées à
partir des courbes de compétitions. Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ±
88
SEM de n expériences. Les valeurs sont comparées avec un test t de Student non apparié. Une
valeur de p<0,05 est considérée comme significative. Tous les calculs statistiques et les
graphiques ont été réalisés à l‟aide du logiciel Graphpad PRISM 5.
89
3.3. Histologie
Le prélèvement des cœurs est identique à celui réalisé pour les expériences de
biochimie. Après rinçage dans du sérum physiologique, les cœurs sont immergés 24h
minimum dans du formol 4% avant de réaliser l‟inclusion dans la paraffine. L‟inclusion est
réalisée par un processeur de tissu STP120 (Thermo scientific, Asnières/Seine, France) selon
le protocole indiqué dans le tableau XI.
Tableau XI. Protocole d’inclusion en paraffine des cœurs de rat
Etapes
Réactifs
Durée
Vitesse d’agitation
1-2
Formol
2 x 1h00
60
3
Alcool 70%
1h30
70
4
Alcool 80%
1h30
70
5
Alcool 95%
1h30
70
6-8
Alcool 100%
3 x 1h00
70
9-10
Xylol
2 x 1h30
70
11-12
Paraffine
2x 2h00
60
L‟inclusion dans un bloc de paraffine est réalisée sur une plateforme EC 350-2
(Thermo scientific). Le bloc est placé 24h minimum à 4°C avant la réalisation de coupes
transversales des cœurs de 5 à 7 µm au niveau de l‟apex, de la base et de la zone médiane
grâce à un microtome MICRO HM355 S (Thermo scientific). Les coupes sont déposées sur
des lames et laissées à sécher avant coloration.
La coloration au picrosirius red est réalisée sous hotte selon le protocole indiqué dans
le tableau XII. Après coloration, les coupes sont immédiatement montées entre lame et
lamelle à l‟aide du milieu de montage coverquick 3000 (Labonord, Templemars, France) et
laissées sécher 24h avant analyse au microscope.
L‟analyse microscopique est réalisée à l‟aide d‟un microscope optique classique
Eclipse H-600 et de son logiciel Elements BR v4.10 software (Nikon, Japon). Une analyse
automatique d‟au moins 20 images pour chaque région du cœur est réalisée grâce au logiciel
ImageJ 1.45b (NIH software) afin d‟évaluer la présence de fibrose dans le VG. La fibrose est
déterminée en pourcentage de l‟aire de fibrose interstitielle sur l‟aire totale de l‟image
analysée.
90
Tableau XII. Protocole de coloration des coupes de cœurs de rat
Etapes
Réactifs
Durée
Remarques
1-3
Tissue clear
3 x 5 min
4
Alcool 100%
1 min
5
Alcool 95%
1 min
6
Alcool 80%
1 min
7
Alcool 70%
1 min
8
Eau distillée
1 min
9
Picrosirius Red
1h
À l‟abri de la lumière
10
HCl 0,01 N
2 min
Agitation constante
11
Eau distillée
1 min
12
Alcool 70%
1 min
13
Alcool 80%
1 min
14
Alcool 95%
1 min
15
Alcool 100%
1 min
16-17
Tissue clear
2 x 5 min
Réhydratation des coupes
Déshydratation des coupes
Les résultats sont présentés sous la forme de moyenne ± SEM de n expériences. La
fibrose entre les groupes transgéniques et sauvage est comparée est évaluée à l'aide d'un test t
de Student non apparié. Une valeur de p<0,05 est considérée comme significative. Tous les
calculs statistiques et les graphiques ont été réalisés à l‟aide du logiciel Graphpad PRISM 5.
91
3.4. Etudes fonctionnelles ex vivo
3.4.1. Substances pharmacologiques
L‟ensemble des substances employées dans les études pharmacologiques, ainsi que les
solvants utilisés sont énumérés dans le tableau XIII. Lorsque le solvant n‟est pas de l‟eau, les
expériences contrôles (état basal ou effet temps) sont réalisées en présence du solvant en
quantité équivalente à celle présente dans les expériences utilisant la molécule.
Tableau XIII. Liste exhaustive des substances pharmacologiques utilisées dans les études présentées dans
ce manuscrit.
Propriétés
pharmacologiques
Agoniste des récepteurs
cholinergiques muscariniques
Antagoniste des récepteurs à
l‟endothéline
Antagoniste -AR et 2-AR
radiomarqué
Solvant
Temps de
prétraitement
Fournisseur
H 2O
-
Sigma-Aldrich
Ethanol 50%
30 min
Actelion
Reçu en solution
dans de l‟éthanol
-
Amersham
Biosciences
CGP 20712A
Antagoniste 1-AR
H 2O
30 min
Sigma-Aldrich
Dobutamine
Agoniste 1-AR
H 2O
-
Tocris Biosciences
ICI-118,551
Antagoniste 2-AR
H 2O
30 min
Tocris Biosciences
ICI-89,406
Antagoniste 1-AR
Ethanol 99,5%
-
Nacalai Tesque
Indométacine
Inhibiteur des
cyclooxygénases
DMSO 50%
30 min
Sigma-Aldrich
Isoprénaline
Agoniste -AR non sélectif
Acide ascorbique
1%
-
Sigma-Aldrich
L-748,337
Antagoniste 3-AR
HCl 100%
30 min
Merck
L-NMMA
Inhibiteur des synthases de
monoxyde d‟azote
H 2O
30 min
Calbiochem
Nadolol
Antagoniste -AR et 2-AR
HCl 0,25%
30 min
Sigma-Aldrich
Phényléphrine
Agoniste α1-AR
H 2O
-
Sigma-Aldrich
DMSO 100%
30 min
Sigma-Aldrich
DMSO 50%
30 min
Tocris Biosciences
Molécules
Acétylcholine
Bosentan
[3H]-CGP 12177
MDL 12330A
NS398
Inhibiteur des adénylates
cyclases
Inhibiteur des
cyclooxygénases de type 2
Propranolol
Antagoniste -AR et 2-AR
H 2O
-
Nacalai Tesque
Salbutamol
Agoniste 2-AR
Methanol 2,5%
-
Sigma-Aldrich
SC560
Inhibiteur des
cyclooxygénases de type 1
DMSO 50%
30 min
Tocris Biosciences
SR 58611A
Agoniste 3-AR
H 2O
-
Sanofi Aventis
α1-AR récepteurs α1-AR adrénergiques, β-AR : récepteurs β-AR adrénergiques, DMSO : Diméthylsulfoxyde
92
Les dissections, prélèvements et préparations d‟organes relatifs à chaque technique seront
détaillés au début de chaque protocole.
3.4.2. Etude de la réactivité vasculaire
La méthode d‟étude de la réactivité vasculaire permet d‟évaluer la fonction musculaire
lisse, en contraction ou en relaxation, et sa régulation par l‟endothelium. Elle est réalisée dans
des cuves à organes isolés dans lesquelles des anneaux d‟aortes thoraciques ou d‟artère
mésentérique sont mis en place et reliés à des capteurs de tension. A partir de ces anneaux
vasculaires, la contraction et la relaxation en réponse à des agents pharmacologiques, sont
évalués par la mesure des forces générées par ces anneaux au niveau de capteurs de tensions.
La réactivité vasculaire est également évaluée sur un modèle plus intégré : le rein isolé
perfusé où l‟étude de la relaxation vasculaire se fait par mesure de la pression artérielle rénale.
Le rat est anesthésié par injection intrapéritonéale de pentobarbital sodique (30
mg.kg-1). L‟aorte et l‟artère mésentérique de 1er ordre sont prélevées et nettoyées de leur tissus
conjonctifs et adipeux dans une solution physiologique de Krebs-Henseleit (composition en
mM : NaCl 118,3 ; KCl 4,7 ; MgSO4-7H2O 1,2 ; KH2PO4 1,2 ; NaHCO3 20 ; Glucose 11,1 ;
EDTA 0,016 ; CaCl2 2,5). Le rein droit est ensuite prélevé en prenant soit de conserver une
longueur suffisante d‟artère rénale. L‟aorte thoracique et l‟artère mésentérique sont
respectivement coupées en anneaux de 3-4 mm et de 2 mm de long pour réaliser les
expérimentations.
3.4.2.1. Aorte thoracique
Pour étudier la réactivité vasculaire des anneaux d‟aorte, le laboratoire dispose de
deux ensembles de quatre cuves à organes isolés (EMKA Technologies, Paris, France ;
Figure 27). Chaque cuve est placée dans une enceinte thermostatée à 37°C par une pompe de
thermorégulation. Un bulleur en verre fritté assure la saturation de la solution physiologique
de Krebs-Henseleit avec du carbogène O2 95%/CO2 5% qui permet de maintenir le pH à 7,4.
Un réservoir de solution physiologique maintenu sous pression et des robinets à trois voies
assurent le remplissage des cuves. Un réservoir de vide permet l‟ajustement du volume des
cuves à 10 mL ainsi que leur vidange. Chaque cuve est surmontée d‟un capteur de force (IT2,
EMKA Technologies) dont le déplacement vertical sur une crémaillère est assuré par une vis
micrométrique. Les capteurs de force sont des transducteurs mécano-électriques.
93
Les anneaux vasculaires sont placés sur deux crochets en acier inoxydable. L‟un des
crochets repose sur la tige du capteur alors que l‟autre est fixe et solidaire du support du
bulleur. L‟ensemble de ce système est ensuite descendu dans la cuve afin que les anneaux
soient complètement immergés dans la solution physiologique. Le signal électrique,
correspondant à la tension isométrique développée, est amplifié puis enregistré grâce au
logiciel d‟acquisition IOX (EMKA Technologies). Les tensions sont exprimées en grammes.
Figure 27. Représentation schématique d’un ensemble de 4 cuves à organes isolés (EMKA Technologies).
Une tension dite de repos (2 g) est appliquée aux anneaux en les étirant à l‟aide d‟une
vis micrométrique. Cette tension de repos revêt une importance particulière, puisqu‟elle
influence la réponse du vaisseau aux agents contractants.
La période de stabilisation dure 30 min pendant lesquelles les anneaux sont
progressivement amenés à la tension de repos et rincés toutes les 10 min. Ensuite, les anneaux
sont contractés deux fois avec du KCl 60 mM pendant 30 min puis rincés, afin d‟équilibrer le
potentiel membranaire. Cela permet de stabiliser les préparations et d‟assurer des réponses
reproductibles par la suite.
3.4.2.2. Artère mésentérique
Pour étudier la réactivité vasculaire des anneaux d‟artère mésentérique, le laboratoire
dispose de deux myographes isométriques composés de 4 cuves à organes isolés (Mulvany,
94
Danish Myo Technology, Aarhus N, Danemark). Chaque cuve est placée dans une enceinte
thermostatée à 37°C par une pompe de thermorégulation. Les anneaux vasculaires sont
maintenus sur deux fils de Tungstène (Figure 28). Le signal électrique, correspondant à la
tension isométrique développée, est amplifié puis enregistré grâce au logiciel d‟acquisition
LabChart v7 software (AD instruments, Oxford, Royaume Uni). Les tensions sont exprimées
en mN.
Transducteur
de force
Micromètre
Anneau d’artère
mésentérique
Figure 28. Représentation schématique d’un anneau d’artère mésentérique monté sur le capteur de
tension (DMT).
Une tension dite de repos, équivalente à une pression artérielle de 90 mmHg, est
appliquée aux anneaux en les étirant à l‟aide d‟une vis micrométrique. La période de
stabilisation dure 30 min pendant laquelle les anneaux sont progressivement amenés à la
tension de repos et rincés toutes les 10 min. Ensuite, les anneaux sont contractés deux fois
avec du KCl 60 mM pendant 3 min puis rincés, afin d‟équilibrer le potentiel membranaire.
3.4.2.3. Système vasculaire rénal
Après isolement du rein, l‟artère rénale droite est canulée et le rein est perfusé
à l‟aide de Krebs Henseleit à un débit assurant une pression artérielle rénale de 90 mmHg. La
pression de perfusion mesurée grâce à un capteur de pression est amplifiée puis enregistrée
grâce au logiciel d‟acquisition LabChart v7 software (AD instruments). Après une période de
stabilisation de 60 min le système vasculaire rénal est contracté deux fois avec du KCl 60 mM
pendant 3 min, afin d‟équilibrer le potentiel membranaire.
3.4.2.4. Protocoles pharmacologiques
L'intégrité de l'endothélium est validée par la relaxation provoquée par l‟ACh
(agoniste des récepteurs cholinergiques muscariniques, 1 µM) sur des anneaux contractés
avec de la PE (Sigma-Aldrich ; agoniste des récepteurs α1-AR). La présence d‟un endothélium
95
fonctionnel est attestée par une relaxation supérieure ou égale à 80% de la contraction
maximale. Dans le cas d‟expériences réalisées sur des anneaux dont l‟endothélium a été
abrasé, l‟absence d‟endothélium est confirmée par une relaxation inférieure ou égale à 5%.
Suite à ce test, les anneaux sont rincés plusieurs fois.
Lorsque le niveau de tension de repos est restauré, certains anneaux sont soumis à un
traitement de 30 min par différents agents pharmacologiques selon le protocole choisi. Des
courbes concentrations-relaxations à différents agonistes vasodilatateurs, sur des anneaux
précontractés de façon stable, par la PE sont alors réalisées.
La concentration d‟agoniste précontractant utilisée est variable selon le type de
prélèvement vasculaire étudié, l‟objectif étant d‟obtenir environ 80% de la contraction
maximale (EC80). La gamme de valeurs de deltas (Δ) de contraction à l‟EC80 dépend du tissu
étudié (Tableau XIV).
Tableau XIV. Agents contractants et Δ de précontraction pour tous les modèles étudiés
Modèle
Précontraction (EC80)
Δ de précontraction
CTRL
Phényléphrine (1 µM)
4-6 g
LPS
Phényléphrine (2 µM)
> 0,5 g
CTRL
Phényléphrine (2 µM)
8-10 mmHg
LPS
Phényléphrine (10 µM)
6-8 mmHg
Aorte thoracique
Artère mésentérique
La valeur du Δ de contraction obtenue en réponse à la PE peut influencer la réponse
aux différents agents vasodilatateurs. Les Δ de précontraction des différents groupes ou des
différents protocoles sont donc comparés à l'aide d'une analyse de variance ANOVA à 1 voie
afin de s‟assurer qu‟ils ne sont pas différents.
Afin de s‟affranchir d‟une évolution de l‟état contractile de chaque anneau en fonction
du temps, la relaxation spontanée est mesurée sur des anneaux témoins en absence d‟agent
vasodilatateur pour l‟ensemble des protocoles réalisés sur des anneaux issus de rat LPS. Pour
chaque concentration d‟agoniste, la vasodilatation spontanée correspondante est retirée.
L‟intégralité des protocoles pharmacologiques réalisés est résumée dans le
tableau XV. Les résultats des courbes concentrations-relaxations sont exprimés en % de la
tension stable développée en présence de PE seule. Les résultats sont exprimés sous la forme
moyenne ± SEM de n expériences.
96
Tableau XV. Protocoles des courbes concentrations-réponses (C-R) réalisées pour les études de réactivité
vasculaire.
Modèle
Précontraction
Pré-traitement
Courbes C-R
-
Isoprénaline (1 nM-10 µM)
Dobutamine (1 nM-10 µM)
ICI-118,551 (7 µM)
-
Salbutamol (1 nM-10 µM)
Aortes thoraciques de
rats contrôles et LPS
Oui
ICI-118,551 (7 µM)
Salbutamol (1 nM-10 µM)
MDL 12330A (30 µM)
-
SR 58611A (0,1-100µM)
SR 58611A (0,1-100 µM)
Nadolol (10 µM)
L-748,337 (7 µM)
SR 58611A (0,1-100 µM)
Isoprénaline (1 nM-10 µM)
Artères mésentériques
de rats contrôles et LPS
Salbutamol (1 nM-10 µM)
Oui
Salbutamol (1 nM-10 µM)
ICI-118,551 (7 µM)
Rein de rats
contrôles et LPS
Oui
-
Isoprénaline (1 nM-10 µM)
Tous les protocoles ont été réalisés sur des anneaux dont la fonction endothéliale a été validée. Les protocoles
surlignés en orange ont aussi été réalisés sur des anneaux dont l‟endothélium a été abrasé.
Les effets des prétraitements ou des pathologies sur les courbes de relaxation en
réponse à des concentrations croissantes d‟agonistes sont analysés à l'aide d'une analyse de
variance ANOVA à 2 voies (concentration, traitement ou pathologie), suivie par un test de
Student-Newman-Keuls ou de Bonferroni. Une valeur de p < 0,05 est considérée comme
significative.
La concentration de l‟agoniste produisant la moitié de l'effet maximal (EC 50) est
calculée par modélisation mathématique. Les valeurs de pD2 représentant la puissance de
l'agoniste sont calculées selon l'équation : pD2 = -log EC50. La significativité de l'effet d'un
traitement ou d‟une pathologie sur les valeurs de pD2 des différents agonistes est évaluée à
l'aide d'un test t de Student non apparié. Une valeur de p<0,05 est considérée comme
97
significative. Tous les calculs statistiques et les graphiques ont été réalisés à l‟aide du logiciel
Graphpad PRISM 5.
3.4.3. Etude de la contractilité du muscle papillaires
Cette technique permet d‟étudier la contractilité de muscles papillaires placés dans une
cuve expérimentale (Figure 29). Elle a l‟avantage de conserver la structure du muscle en
s‟affranchissant de l‟organe entier.
Ces études ont été réalisées sur les muscles papillaires de VG de rats LPS et CTRL.
Elles nécessitent un prélèvement délicat du muscle sous loupe binoculaire. Un prétraitement
des muscles papillaires au Triton X-100 (Sigma-Aldrich) à 0,5% pendant 3s, permettant
l‟abrasion de l‟endothélium est réalisé dans certains protocoles.
La cuve expérimentale consiste en une gouttière (20 x 8 x 8 mm) fraisée dans un bloc
de Plexiglas où s‟écoule une solution physiologique (Composition en mM : NaCl 116 ; KCl
5 ; MgCl2 1,1 ; NaH2PO4 0,35 ; NaHCO3 27 ; glucose 5 ; CaCl2 2,7 ; Acide pyruvique 5 ;
Acide fumarique 0,15 ; Acide glutamique 5). La préparation est fixée par l‟une des extrémités
au fond de la cuve, à l‟aide d‟une minutie. L‟autre extrémité est fixée par une autre minutie
reliée à un transducteur mécano-électrique (Akers, AE, Sen Sonor, Norvège). La solution
physiologique est carbogénée avec un mélange 95% O2/5% CO2 et perfusée à 37±0,5°C à
l‟aide d‟une pompe péristaltique à un débit de 5 mL.min-1 (Figure 23).
t
m
s
o
I
s
Figure 29. Représentation schématique de la cuve expérimentale. D‟après (Gauthier et al., 1994).
I : arrivée des solutions ; m : minutie ; o : évacuation des solutions ; s : électrode de stimulation ; t : transducteur
mécano-électrique.
Les préparations sont stimulées à l‟aide d‟un stimulateur cardiaque (Medtronic inc.,
Minneapolis, USA) par l‟intermédiaire de deux électrodes de platine fixées sur les parois
latérales de la cuve (stimulation de champ). La fréquence de stimulation est de 1 Hz. La durée
98
des stimuli est de 2 à 4 ms et leur intensité fixée à deux fois celle du seuil de stimulation de la
préparation.
La contraction est mesurée à l‟aide du transducteur mécano-électrique (Ackes AE 801,
SensoNor, Horten, Norvège) qui transforme la réponse mécanique de la préparation en un
phénomène électrique quantifiable. Elle est recueillie sur un enregistreur thermique (Gould
8188, Les Ulis, France) et sur un enregistreur numérique (DTR-1200, Bio-Logic, Claix,
France). Les paramètres de contractions sont mesurés sur un oscilloscope numérique
(HMO1024, HAMEG Instruments, Mainhausen, Germany).
Chaque préparation est équilibrée avec la solution physiologique pendant 1 h avant le
début de l‟expérience. Une courbe tension-longueur est alors réalisée. Les expériences sont
effectuées à environ 90% de la tension maximale. Les agents pharmacologiques testés sont
ajoutés à la solution physiologique (Tableau XVI). Des courbes concentrations-réponses
cumulatives sont réalisées en perfusant la préparation avec des concentrations croissantes
d‟agoniste. Après l‟obtention d‟un état stable, la concentration supérieure est perfusée.
L‟amplitude de la contraction est mesurée au pic après l‟obtention d‟un état stable.
Elle est exprimée en pourcentage de l‟amplitude obtenue à l‟état basal. Le temps au pic et la
durée totale, contraction plus relaxation, sont exprimés en ms. Les temps de demi-contraction
et de demi-relaxation sont également mesurés et les rapports amplitude de contraction/temps
de demi-contraction et amplitude de contraction/temps de demi-relaxation donnent
respectivement la vitesse de contraction et la vitesse relaxation. Elles sont exprimées en
pourcentage de la vitesse obtenue à l‟état basal.
Les résultats sont exprimés sous la forme moyenne ± SEM de n expériences. L'analyse
statistique de l'effet des agonistes sur la contraction est calculée à l'aide d'une analyse de
variance ANOVA à deux voies pour mesures répétées suivie d‟un test de Student-NewmanKeuls. Une valeur de p<0,05 est considérée comme significative. Tous les calculs statistiques
et les graphiques ont été réalisés à l‟aide du logiciel Graphpad PRISM 5.
99
Tableau XVI. Protocoles des courbes concentrations-réponses réalisées pour la technique de contractilité
du muscle papillaire.
Modèle
Prétraitement
Antagonistes
-
-
-
Muscle papillaire
de VG de rats
contrôles et LPS
ICI-118,551 (1 µM) +
L-748,337 (7 µM)
CGP 20712A (1 µM) +
L-748,337 (7 µM)
Courbes C-R
Isoprénaline (0,1 nM-10 µM)
-
Nadolol (10 µM)
-
ICI-118,551 (1 µM) +
L-748,337 (7 µM)
Isoprénaline (0,1 nM-10 µM)
ICI-118,551 (1 µM) +
L-748,337 (7 µM)
Isoprénaline (0,1 nM-10 µM)
L-NMMA (1 µM)
Bosentan (10 µM)
Indométacine (10 µM)
SC 560 (3 µM)
NS 398 (3 µM)
Tous les protocoles ont été réalisés sur des muscles papillaires dont la fonction endothéliale a été validée. Les
protocoles surlignés en orange ont aussi été réalisés sur des muscles papillaires dont l‟endothélium a été abrasé.
100
3.5. Etudes fonctionnelles in vivo
3.5.1. Echocardiographie-Doppler
Le principe de l‟échocardiographie-Doppler repose sur l‟usage des ultrasons. Une sonde
d‟imagerie émet des ultrasons qui, à l‟interface de tissus d‟impédance acoustique différente,
sont partiellement réfléchis. L‟onde ultrasonore ainsi réfléchie est ensuite captée par la même
sonde d‟imagerie qui va alors créer une image de ce tissu, et la retransmettre sur un écran.
Lors de l‟analyse échocardiographique, les ultrasons émis sont réfléchis par les structures
cardiaques et les principaux vaisseaux à proximité tels que l‟aorte thoracique ascendante. Lors
de tirs Doppler cardiaque, les ultrasons sont réfléchis par les hématies transitant dans les
cavités cardiaques et les vaisseaux thoraciques. L‟onde ultrasonore réfléchie présente alors un
décalage de fréquence proportionnel à la vitesse du flux sanguin. L‟onde réfléchie possède
une polarité, ce qui indique l‟orientation du flux. De ce fait, l‟échocardiographie-Doppler est
une technique permettant une approche rapide et non invasive de l‟anatomie, de la fonction et
de l‟hémodynamique cardiaque.
L‟acquisition est réalisée sur des rats qui sont anesthésiés par inhalation d‟isoflurane à
4%/O2 (2 L.min-1) dans une chambre d‟induction et entretenus au masque en ventilation
spontanée sous isoflurane à 2%/O2 (0,4 L.min-1). Le rat est placé en décubitus dorsal sur un
tapis chauffant afin de maintenir la température centrale autour de 37°C. Un enregistrement
électrocardiographique (ECG) est réalisé au moyen de trois électrodes positionnées en souscutané à la base des membres de l‟animal. Il nous permet, en calculant l‟intervalle entre deux
ondes R des complexes QRS de l‟ECG (intervalle R-R), de déterminer la FC du rat. Un
ajustement du taux d‟isoflurane administré est éventuellement réalisé afin d‟effectuer toutes
les mesures échocardiographiques dans une même gamme de FC (300-405 bpm).
De manière à supprimer toute interposition d‟air, le thorax de l‟animal est rasé et
recouvert avec du gel ultrasons (Aquasonic® 100, Parker Laboratories, Fairfield, USA). Les
différentes mesures sont réalisées selon les incidences parasternales petit axe et grand axe, en
mode bidimensionnel puis en mode temps-mouvement. Ces mesures permettent de déterminer
les diamètres et les épaisseurs des parois du VG, renseignant alors sur la géométrie du VG et
permettant également de calculer des indices de la fonction systolique VG. Pour une meilleure
reproductibilité, les acquisitions en incidence petit axe sont effectuées à la hauteur des piliers
VG. Puis, selon l‟incidence cinq cavités, l‟analyse du flux mitral est réalisée par des tirs en
Doppler pulsé, effectués au niveau de la valve mitrale. Cette analyse permet d‟évaluer la
101
fonction de remplissage du VG, c‟est à dire la fonction diastolique VG. Enfin, en incidence
quatre cavités, des tirs Doppler tissulaire sont réalisés sur les parties latérale et septale de
l‟anneau mitral afin de déterminer l‟amplitude et la vitesse de déplacement de ces parois ainsi
que leur déformation grâce à l‟analyse dite de strain. L‟ensemble des paramètres étudiés lors
des ces différentes acquisitions est résumé dans les Tableau XVII et XVIII.
Paroi
antérieure
Épaisseurs des
Paroi
parois VG en
postérieure
télésystole et
Paroi
télédiastole
septale
(cm)
Paroi
latérale
PATDVG
PATSVG
PPTDVG
PPTSVG
PSTDVG
PSTSVG
PLTDVG
PLTSVG
Diamètres VG en
télésystole et télédiastole
(cm)
DTDVG
DTSVG
Vitesse de l'onde E
(cm.s-1)
E
Vitesse de l'onde A
(cm.s-1)
Temps de décélération de
l'onde E (s)
Temps de relaxation
isovolumique (s)
A
Fonction analysée
Illustration
Incidence
petit axe
Géométrie
et remodelage VG
Temps
Paroi antérieure VG
Cavité VG
Diastole
Systole
Paroi postérieure VG
Remplissage passif VG
(fonction diastolique +
pression de remplissage VG)
Remplissage actif VG
(fonction diastolique)
TDE
(fonction diastolique)
TRIV
Délai entre la fermeture de la
valve aortique et l'ouverture de
la valve mitrale
(fonction diastolique)
Flux mitral
Abrév.
+
Vitesse
des flux
E
+
A
Temps
Ouverture
valve mitrale
Flux aortique
Paramètres
TDE
Fermeture
valve aortique
TRIV
Vitesse
des flux
ITVAo
Flux d‟éjection aortique
(proportionnel au VES,
fonction systolique)
Temps
Flux aortique
Intégrale temps vitesse
sous aortique (cm)
Vitesse de l'onde Sa
Sa
Vitesse de l'onde Ea
(cm.s-1)
Ea
Vitesse de l'onde Aa
(cm.s-1)
Aa
Pic de vélocité systolique
(fonction systolique)
Indice de déformation VG dans
le sens longitudinal
Pic de vélocité diastolique
précoce
(fonction diastolique)
Pic de vélocité diastolique
tardif
(fonction diastolique)
En systole
ITVAo
En diastole
Doppler tissulaire
Doppler pulsé
Flux aortique
Doppler pulsé
Flux transmitral
Échocardiographie
Tableau XVII. Paramètres évalués lors des mesures hémodynamiques par échocardiographie-Doppler
Abrév. : Abréviation ; VES : volume d‟éjection systolique ; VG : ventriculaire gauche.
102
Vitesse
des parois
Sa
+
Temps
+
Ea
+
Aa
Tableau XVIII. Paramètres calculés suite aux analyses d'échocardiographie-Doppler
Paramètres
Abrév.
Formules
Indice d'épaississement
pariétal (%)
IEP
IEP = (PTSVG - PTDVG) / PTDVG
Volumes VG en télésystole
et télédiastole (mL)
VTDVG
VTSVG
Formule de Teicholz :
VTDVG = 7 DTDVG3 / 2,4 + DTDVG
VTSVG = 7 DTSVG3 / 2,4 + DTSVG
Volume d'éjection
systolique VG (mL)
VESVG
VESVG = VTDVG - VTSVG
Fraction d'éjection VG (%)
FEVG
FEVG = (VTDVG - VTSVG) / VTDVG
Fraction de
raccourcissement VG (%)
FRVG
FRVG = (DTDVG - DTSVG) / DTDVG
Débit cardiaque (mL.min-1)
Q
Q = VES x FC
Rapport E/A
E/A
E/A
Rapport E/Ea
E/Ea
E/Ea
Fonction analysée
Remodelage VG
(fonction systolique)
Fonction systolique
(paramètres dépendants des
conditions de charges VG)
Estimation des pressions de
remplissage VG (fonction
diastolique)
Estimation des pressions de
remplissage VG (fonction
diastolique)
L - L0 / L0
Déformation des parois
(L0 : longueur initiale du segment myocardique
myocardiques
L : longueur finale du segment myocardique)
A : Vitesse de l'onde A (cm.s-1), Abrév. : Abréviation, E : Vitesse de l'onde E (cm.s-1), Ea : Vitesse de l'onde Ea
(cm.s-1), VG : ventricule gauche
Strain
ε
La contraction ventriculaire entraîne un raccourcissement, un épaississement et une
rotation du myocarde et est ainsi assimilée à une déformation du myocarde. Le strain est la
mesure de ce taux de déformation pendant le cycle cardiaque. Jusqu‟à récemment encore, la
seule technique échocardiographique possible pour mesurer le strain était le Doppler
tissulaire. Dans ce cas, la déformation myocardique est déterminée à partir des vitesses de
déplacement des parois myocardiques selon un axe unidimensionnel et le strain est calculé
comme étant le taux de raccourcissement d‟un segment myocardique par rapport à la
dimension initiale de ce segment :
Strain = ε = (L - L0) / L0
avec
L0 : longueur initiale du segment analysé
L : longueur finale du segment analysé
Cependant, cette technique d‟analyse de strain par Doppler tissulaire présente
l‟inconvénient d‟être angle-dépendante par rapport à la sonde d‟acquisition. Une nouvelle
méthode d‟analyse a alors été développée : le strain bidimensionnel (2D strain) ou speckle
tracking. Dans cette technique, les speckles sont des marqueurs acoustiques naturels
réflecteurs d‟ultrasons, distribués uniformément à l‟ensemble du myocarde et d‟une taille de
20 à 40 pixels. Leur suivi dans l‟espace (ou tracking) permet de calculer la vitesse et la
103
déformation des différentes régions du VG et ce, dans les trois directions du cœur :
longitudinale, radiale et circonférentielle (Figure 30 A). Les mesures sont indépendantes de
l‟angle par rapport à la sonde d‟acquisition, sont reproductibles et faciles à obtenir mais
nécessitent cependant une image de haute qualité. De ce fait, chez l‟homme, on évalue plus
facilement la composante longitudinale du strain tandis que chez les rongeurs, où les
incidences petit axe sont plus fiables que les incidences grand axe, on étudie principalement la
composante radiale. La Figure 30 B représente un exemple d‟analyse du strain radial d‟un
VG de rat contrôle.
A
B
Circ.
Rad.
Long.
Figure 30. Analyse de la déformation myocardique par le strain bidimensionnel.
A- Représentation schématique des trois directions dans lesquelles le strain peut être évalué : radiale (Rad.),
longitudinale (Long.) et circonférentielle (Circ.). B- Illustration d‟une analyse de strain radial chez le rat. Chaque
courbe correspond au pourcentage de déformation selon la composante radiale d‟une région ventriculaire gauche
au cours du temps.
L‟ensemble des résultats obtenus par échocardiographie-Doppler sont présentés sous
la forme de moyenne ± SEM de n expériences. La significativité de l'effet d'un traitement
(LPS vs CTRL) ou d‟un génotype (transgéniques vs sauvages) sur les paramètres
échocardiographiques est évaluée à l'aide d'un test t de Student non apparié ou d'une analyse
de variance ANOVA à 1 voie lorsque plus de deux groupes sont comparés. Une valeur de
p < 0,05 est considérée significative. Tous les calculs statistiques et les graphiques ont été
réalisés à l‟aide du logiciel Graphpad PRISM 5.
3.5.2. Mesure des pressions artérielles
Cette technique permet de suivre l‟évolution des paramètres hémodynamique pendant
plusieurs heures. Bien qu‟invasive en comparaison à la technique de Tail Cuff, cette
technique permet de s‟affranchir des 2 semaines d‟habituations, nécessaires aux animaux,
avant toute mesure reproductible en Tail Cuff.
104
Après une induction de quelques min par isoflurane à 4%/O2 (2 L.min-1) dans une
chambre d‟induction, l‟anesthésie est entretenue par un masque placé sur le museau de
l‟animal, en ventilation spontanée, permettant de délivrer un mélange isoflurane 2%/O2
(0,4 L.min-1). L‟animal est placé sur un tapis chauffant afin de maintenir la température
centrale autour de 37°C. Au niveau de la région cervicale droite, la peau puis les muscles sont
incisés. L‟artère carotide droite est libérée du plan musculaire profond, séparée de son
adhérence avec le nerf vague, puis ligaturée en sa partie proximale et clampée côté distal. Le
cathéter de mesure de pression artérielle 2F (SPR 838 Microtip catheter ; Millar instruments,
USA) est introduit dans l‟artère carotide après réalisation d‟une incision longitudinale
d‟environ 1 mm. Le signal est amplifié et enregistré grâce au logiciel IOX (EMKA
technologies). L‟analyse des courbes de pression artérielle permet de déterminer les
paramètres suivants :
-
Pression artérielle systolique (PAS)
-
Pression artérielle diastolique (PAD)
-
Pression artérielle moyenne (PAM), calculée à l‟aide du logiciel IOX
(EMKA technologies) selon la formule : PAM = ⅔PAD + ⅓ PAS
-
FC, calculée à l‟aide du logiciel IOX (EMKA technologies) selon la
formule : FC = 60/période d‟un cycle cardiaque (en s). La période d‟un cycle cardiaque est
déduite de façon indirecte grâce au décours des courbes de pression artérielles enregistrées.
Après stabilisation des différents paramètres hémodynamiques, l‟injection de LPS ou
de sérum physiologique est réalisée selon le protocole précédemment décrit. Les mesures sont
faites sur 3h : toutes les 3 min pendant les 15 premières min puis toutes les 15 min pendant les
165 min restantes.
Les résultats sont présentés sous la forme de moyenne ± SEM de n expériences.
L‟évolution des paramètres dans le temps, en fonction des groupes de rats, est analysée par
une analyse de variance ANOVA à 2 voies suivie d‟un test de Bonferroni. Une valeur de
p < 0,05 est considérée comme significative. Tous les calculs statistiques et les graphiques ont
été réalisés à l‟aide du logiciel Graphpad PRISM 5.
105
3.5.3. Mesure des boucles pressions-volumes
Cette technique permet l‟évaluation de nombreux paramètres cardiaques et vasculaires
in vivo. Le dispositif expérimental et la préparation des animaux sont les mêmes que pour les
mesures de pression artérielle.
Après ouverture de la peau et des plans musculaires à droite et à gauche, la veine
jugulaire gauche est isolée, ligaturée à sa partie proximale et un cathéter y est introduit. Celuici sert à prélever un volume sanguin pour déterminer la résistivité du sang ρ, ou pour injecter
la solution saline nécessaire à l‟évaluation de la conductance parallèle Gp. L‟artère carotide
droite est également libérée du plan musculaire profond, séparée de son adhérence avec le
nerf vague, puis ligaturée en sa partie proximale. Elle est alors clampée côté distal de façon à
pouvoir y introduire le cathéter pressions-volumes.
Après 1 min de stabilisation, la pression artérielle est enregistrée dans l‟artère carotide
durant 1 min. Puis la sonde est descendue par voie rétrograde dans le VG, jusqu‟en position
de butée à l‟apex, où les cycles de pressions-volumes sont enregistrés pendant 1 min. Ensuite,
la cavité abdominale est ouverte et la veine cave inférieure est clampée brièvement dans le but
d‟induire une variation brutale des conditions de charges du VG. Ceci permet de déterminer la
relation pressions-volumes télésystoliques. Cette relation reflète la contractilité cardiaque
intrinsèque du VG, indépendamment des conditions de charges. Chez le rat, cette relation
n‟est pas linéaire (Sato et al., 1998) mais parabolique et est déterminée par l‟équation
suivante :
PES = a (VES-V0)2 + b (VES-V0)
avec PES : pression télésystolique ; VES : volume télésystolique et V0 le volume auquel la
relation coupe l‟axe des volumes. Le critère d‟évaluation de la relation pressions-volumes
télésystoliques est la valeur de pression télésystolique du VG observée sur la parabole au
volume télésystolique du VG moyen (VVGmid), déterminée lors de l‟occlusion de la veine
cave inférieure, calculée selon la formule suivante :
VVGmid= V0 + [(VES max – VES min)/2]
où VES max et VES min sont les volumes télésystoliques maximal et minimal lors de
l‟occlusion. Cette valeur est nommée PESmid.
106
Les différents paramètres obtenus au cours de ces mesures sont résumés dans le
tableau XIX.
Tableau XIX. Paramètres déterminés lors des mesures hémodynamiques in vivo par la technique des
boucles pressions-volumes.
Localisation de
l’enregistrement
Paramètres
Abréviation
Pression artérielle systolique (mmHg)
PAS
Pression artérielle diastolique (mmHg)
PAD
Pression artérielle moyenne (mmHg)
PAM
Fréquence cardiaque (min-1)
FC
Vitesse maximale de contraction (mmHg.s-1)
DP/dtmax
Vitesse maximale de relaxation (mmHg.s-1)
DP/dtmin
Pression télédiastolique (mmHg)
PTDVG
Elastance artérielle (mmHg.mL-1)
Ea
Contractilité intrinsèque du ventricule gauche
PESmid
Index de contractilité cardiaque
ICC
Index de résistances périphériques totales
IRPT
Artère carotide
Ventricule gauche
Le logiciel IOX est configuré de manière à fixer ρ et à exprimer les volumes mesurés
en unités arbitraires. Il paraît cependant plus juste, dans les modèles de pathologies
chroniques pouvant influer sur la viscosité sanguine et l‟équilibre hydro-électrolytique, de
mesurer ρ. Ainsi, en début de procédure, le cathéter placé dans la veine jugulaire gauche de
l‟animal permet de prélever deux échantillons de 0,5 et 1 mL de sang placés dans deux cuves
héparinées de mêmes volumes, maintenues au bain-marie à 37°C. Ce volume sanguin est
restitué à l‟animal avant les mesures hémodynamiques. Le cathéter de conductance est
introduit le plus précisément possible au centre de chaque cuve, la valeur de ρ est ainsi
étalonnée sur deux points à partir de la différence de potentiel (U) mesurée dans chacune des
deux cuves (le logiciel IOX ne permettant pas une calibration sur plus de valeurs) : ρ = U/I où
I est l‟intensité du courant produit par la sonde (fixe).
Le cathéter Millar SPR 838 est composé d‟un capteur de pression et de 4 électrodes
situées de part et d‟autre de ce capteur permettant de déterminer le volume d‟après la méthode
de mesure de conductance (Ito et al., 1996). La conductance mesurée in situ par le cathéter
n‟est pas due uniquement au sang contenu dans le VG, mais aussi en partie aux structures
107
cardiaques adjacentes. Il est généralement admis que la contribution de ces structures
thoraciques adjacentes à la conductance mesurée est constante tout au long du cycle
cardiaque. Elle est appelée conductance parallèle et est notée Gp. En principe, Gp serait la
conductance mesurée si la conductance à l‟intérieur du VG était nulle, c'est-à-dire si le
volume de la cavité était nul. Réduire à zéro le volume de la cavité du VG étant impossible,
Gp est mesurée selon la technique d‟injection d‟une solution saline hypertonique (Baan et al.,
1984). En fin d‟expérience, 100 μL de solution de NaCl 10% sont injectés par l‟intermédiaire
du cathéter jugulaire gauche mis en place initialement. Cette manipulation est impérativement
réalisée en fin d‟expérience de façon à ne pas modifier la résistivité du sang ρ, mesurée pour
l‟étude hémodynamique. Le principe est le suivant : le bolus de 100 μL induit une brève
augmentation de conductance dans la cavité ventriculaire gauche, et donc du volume mesuré,
sans que ce bolus de 100 μL soit suffisant pour induire une variation des pressions intracavitaires. La droite de régression linéaire représentant le volume télédiastolique en fonction
du volume télésystolique permet de déduire le point théorique pour lequel le volume du VG
est nul. Cela permet de déduire Gp.
Les résultats sont présentés sous la forme de moyenne±SEM de n expériences. Le
choix du test statistique dépend du nombre de groupes : un test t de Student non apparié est
utilisé pour comparer les paramètres de deux groupes alors qu‟une analyse de variance
ANOVA à 1 voie suivie d‟un test de Student-Newman-Keuls est utilisée lorsque plus de deux
groupes sont comparés. Une valeur de p<0,05 est considérée significative. Tous les calculs
statistiques et les graphiques ont été réalisés à l‟aide du logiciel Graphpad PRISM 5.
108
IV-RÉSULTATS ET DISCUSSIONS
109
4.1. Remodelage β-adrénergique cardiovasculaire au cours du choc
endotoxémique chez le rat et rôle de l’endothelium dans les réponses
β­adrénergiques
4.1.1. Introduction
Défini lors d‟une conférence consensus en 1991 (Bone et al., 1992), le choc septique
associe à un syndrome de réponse inflammatoire systémique une altération cardiovasculaire.
Cette dernière est caractérisée, à la phase précoce, par une hypotension réfractaire aux
traitements vasoconstricteurs associée, chez la majorité des patients, à une cardiomyopathie
aiguë initialement compensée (Hussain, 2013). L‟augmentation de l‟incidence des cas de choc
septique au cours des dernières décennies a conduit à une augmentation du nombre de décès
des suites de choc septique et ce malgré une meilleure prise en charge des patients (Martin et
al., 2003; Dombrovskiy et al., 2007).
La phase précoce du choc septique, au cours de laquelle les traitements sont initiés, est
caractérisée par une forte dysfonction endothéliale vasculaire impliquée dans l‟hypotension
réfractaire aux traitements vasoconstricteurs retrouvée chez les patients (Matsuda & Hattori,
2007). Cette dysfonction endothéliale semble également jouer un rôle important dans la
cardiomyopathie du choc septique via l‟endothélium vasculaire mais également via l‟EE
(Rudiger & Singer, 2007). En effet, quelques études mettent en évidence une régulation
paracrine de la fonction cardiaque par l‟EE. Cette régulation implique plusieurs médiateurs, le
NO, l‟ET et les prostaglandines (Corda et al., 1998; Mebazaa et al., 2001; Mink et al., 2005).
Les dernières conférences de consensus internationales recommandent, pour le
traitement des altérations cardiovasculaires du choc septique, l‟utilisation de NA et d‟Adr,
pour leurs propriétés vasopressives, associés, dans le cas où une dysfonction myocardique est
mise en évidence, à un autre agent inotrope, généralement la dobutamine (Dellinger et al.,
2013). L‟utilisation de ces agonistes β-AR reste cependant sujette à controverse en raison
notamment de la mise en évidence récente d‟une corrélation entre l‟administration de
catécholamines et la présence d‟altérations structurelles du myocarde de patients décédés de
choc septique (Schmittinger et al., 2013). De plus, de nombreuses études précliniques mettent
en avant, des effets bénéfiques d‟antagonistes β1-AR dans le traitement de la cardiomyopathie
du choc septique (Rudiger, 2010). L‟utilisation d‟antagonistes spécifiques des récepteurs
β1-AR ayant une demi-vie courte, comme l‟esmolol (Suzuki et al., 2005) ou le landiolol
110
(Hagiwara et al., 2009), a montré des effets plus intéressants que l‟utilisation de métoprolol
qui a une demi-vie plus importante (Ackland et al., 2010). Les études concernant l‟utilisation
de propranolol (antagoniste β-AR non sélectif) sont encore contradictoires. Certaines études
rapportent ainsi une amélioration de la survie chez des chiens en choc endotoxémique traités
avec du propranolol (Berk et al., 1969; Berk et al., 1970) alors qu‟une autre étude rapporte
une réduction de la survie dans un modèle de ligature ponction caecale chez la souris
(Schmitz et al., 2007). Enfin, les agonistes et antagonistes β-AR sont connus pour moduler la
réponse inflammatoire. Ainsi, les agonistes β1-AR ont un rôle proinflammatoire (Grisanti et
al., 2010), en favorisant notamment la sécrétion d‟IL-1β par les monocytes lors d‟un
challenge au LPS. Inversement, l‟administration d‟agonistes β2-AR dans différents modèles
animaux de choc septique induit un effet anti-inflammatoire par réduction des sécrétions de
cytokines pro-inflammatoires (TNF-α, IL-1β, IL-6) et augmentation des sécrétions de
cytokines anti-inflammatoires (IL-10) (Eijkelkamp et al., 2004; Tsao et al., 2010).
Dans ce contexte, la connaissance du remodelage du système β-AR ainsi que de
l‟implication des différents sous-types de récepteurs β-AR, à la phase initiale de la prise en
charge du choc septique, semble indispensable afin d‟améliorer l‟efficacité de ces traitements
tout en évitant des effets délétères trop importants. Cependant, à l‟heure actuelle, peu d‟études
se sont intéressées au remodelage du système β-AR, et encore moins au remodelage des
différents sous-types de récepteurs β-AR, aussi bien au niveau vasculaire (Boillot et al., 1996;
Donaldson & Myers, 1996; Mallem et al., 2003) que cardiaque (Godlewski et al., 2006;
Moniotte et al., 2007). De plus, une meilleure compréhension de l‟implication de la
dysfonction endothéliale, une composante majeure de l‟initiation du choc septique, dans ce
remodelage β-AR semble également indispensable.
Le but de ces travaux est donc dans un premier temps de caractériser un modèle de rat
en choc endotoxémique pertinent pour l‟étude de la phase initiale du choc septique, c'est-àdire un modèle intégrant à la fois une dysfonction endothéliale, une altération vasculaire et
une dysfonction cardiaque. Bien que le modèle de rat en choc endotoxémique soit très
rarement utilisé dans les études précliniques de la phase précoce du choc septique, il s‟avère
pertinent en raison (i) des similitudes avec le tableau initial du choc septique chez l‟homme,
(ii) du nombre limité de voies de signalisation impliquées par rapport à un modèle
polymicrobien et (iii) de sa reproductibilité (Doi et al., 2009). A partir d‟un tel modèle,
l‟objectif est alors dans un second temps d‟étudier les modifications protéiques et
fonctionnelles du système β-AR ainsi que l‟influence de la dysfonction endothéliale dans
111
celles ci au niveau cardiovasculaire. Une première étude a ainsi pour objectif d‟étudier le
remodelage β-AR vasculaire et l‟implication de la dysfonction endothéliale dans ce
phénomène, aussi bien au niveau de la macrocirculation que de la microcirculation. Une
seconde étude s‟intéresse cette fois au remodelage β-AR au niveau cardiaque ainsi qu‟à
l‟implication dans ce remodelage de la dysfonction de l‟EE, peu étudiée au cours du choc
septique, et notamment à sa phase précoce.
112
4.1.2. Article : Augmentation de la réponse β2-adrénergique vasculaire à la phase
précoce du choc endotoxémique chez le rat.
Increased vascular β2-adrenergic response at the early phase of
endotoxemic shock in rat
David ROUL*, Bertrand ROZEC*, Gwennan ANDRE, Nolwenn MERLET, Thuy TRAN
QUANG, Benjamin LAUZIER, Marine FERRON, Yvonnick BLANLOEIL, Gervaise
LOIRAND, Vincent SAUZEAU, Chantal GAUTHIER.
Intensive Care Medicine
(soumis)
* Les 2 auteurs ont contribué de façon équivalente à ce travail.
113
Increased vascular β2-adrenergic response at the early phase of
endotoxemic shock in rat
David Roul, PhD Student1,
2, 3,
°; Bertrand Rozec, MD PhD1,
2, 4,
°; Gwennan André, PhD
Student1, 2, 3; Nolwenn Merlet, PhD1, 2, 3, 5; Thuy Tran Quang, PhD1, 2, 3, 6; Benjamin Lauzier,
PhD1,
2, 3
; Marine Ferron, Msc student1,
2, 3
; Yvonnick Blanloeil, MD6; Gervaise Loirand,
PhD1, 2, 3; Vincent Sauzeau, PhD1, 2, 3; Chantal Gauthier, PhD1, 2, 3.
° The first two authors contribute equally to this work
1
INSERM, UMR-1087, l‟institut du thorax, Nantes, 44000 France
2
CNRS, UMR-6291, Nantes, 44000 France
3
Université de Nantes, Nantes, 44000 France
4
CHU Nantes, Department of Anesthesiology and Intensive Care, Nantes, 44000 France
5
Present address: Montreal Heart Institute, Montreal, H1T 1C8 Québec, Canada
6
Present address: Research Center, Hôpital du Sacré Cœur, Montreal, H4J 1C5 Québec,
Canada
Corresponding Author:
Correspondence and requests for reprints should be addressed to Chantal Gauthier, PhD;
INSERM UMR-1087, CNRS, UMR-6291, l‟institut du thorax, IRS-UN, 8 quai Moncousu,
BP 70721, 44007 Nantes, France, Phone: +33 2 28 08 01 58, Fax : +33 2 28 08 01 30, E-mail:
[email protected]
114
Abstract
Purpose: The early management of the cardiovascular dysfunction of septic shock is critical
as it is associated with a poor outcome. Albeit the use of catecholamines is an usual therapy in
this syndrome, no data are available on the involvement of β-adrenoceptor (β-AR) subtypes
and only few studies report an alteration of β-adrenergic-induced vasodilation in the septic
shock. The purpose was to evaluate the vascular β1, β2 and β3-AR subtypes remodeling in an
endotoxemic model.
Methods: Endotoxemic rats were obtained by intravenous injection of lipopolysaccharide
(LPS). Protein expressions and vascular functions of β1, β2 and β3-AR were evaluated on
conducting (aorta) and resistance (mesenteric and renal) arteries.
Results: In LPS aorta, the β1 and β3-AR expressions were unchanged, whereas β2-AR one was
decreased. The function of each β-AR subtype was evaluated by concentration-relaxationcurves to β-AR agonists. The maximal effect of isoproterenol was decreased by 31 to 61% in
the three vascular beds from LPS rats compared to control. Specific β1 and β3-AR-induced
vasodilations were reduced in LPS aorta. Conversely, the maximal β2-AR-induced
vasodilation was increased by 49% in LPS aorta compared to control. This increase was not
affected by the endothelium removal but was abolished in the presence of a β2-AR antagonist
or an adenylate cyclase inhibitor.
Conclusions: In endotoxemia, β2-AR vasodilation was increased by the recruitment of β2-AR
located on smooth muscle cells. This study suggests that vascular β2-AR should be a putative
new therapeutic target in the septic shock.
Keywords
septic shock, beta-adrenoceptor, blood vessels, animal model, lipopolysaccharide
115
Introduction
Septic shock is a leading cause of mortality in critically ill patients (Angus et al.,
2001). Despite recent advances in the septic shock physiopathology understanding, its
treatment remains a “therapeutic challenge”. The cardiovascular dysfunction plays a key role
in the development of multiple organ failure, the ultimate stage of septic shock being
associated with a poor outcome. It includes marked hypotension with cardiac dysfunctions
(Poelaert et al., 1997; Vieillard-Baron et al., 2003). The time-window for interventions is
short, and treatment must promptly control the source of infection and restore hemodynamic
(Annane et al., 2005).
Classically, septic shock is defined as a vasodilatory shock characterised not only by
hypotension due to peripheral reduction of vascular resistance but also by a poor response to
vasoconstrictor (Landry & Oliver, 2001). Vascular alteration results from the impairment of
vascular smooth muscle (VSM) cells contraction capacity (Gunnett et al., 1998) and/or an
endothelial dysfunction (Dauphinee & Karsan, 2006).
Nevertheless, during septic shock, the vasodilation is different in the diverse vascular
beds with a significant difference in vasomotricity alterations according to the size of the
vessels.
Indeed,
underperfused
microcirculation
may
persist,
despite
restored
macrohemodynamics (i.e. blood pressure) (Sakr et al., 2004). Even in a same organ, blood
flow distribution can vary regionally: for instance in kidney, endotoxemia caused a significant
reduction in renal cortical, but not in medullary perfusion (Millar & Thiemermann, 1997). It
highlights that different mechanisms could be involved in the regulation of microvascular and
macrovascular tone.
β-adrenoceptors (β-AR), present in both VSM and endothelial cells, contribute to the
regulation of the vascular tone. Indeed, β-AR stimulation produces a vasodilation modulating
the peripheral vascular resistance and consequently the blood distribution to the different
organs. This regulation fluctuates according to the vascular bed and the diameter of vessel
considered. During septic shock, the excessive sympathetic nervous system activation and the
infusion of substantial amounts of exogenous catecholamines for resuscitation lead patients to
an adrenergic storm. Surprisingly, there are relatively few studies that have evaluated the βAR-induced vasodilation impairment during septic shock, particularly at an early stage
(Boillot et al., 1996; Donaldson & Myers, 1996). Even if pharmacological studies attribute
mostly this vasodilation to β2-AR (Guimarães & Moura, 2001), it is admitted that the three β116
AR subtypes are involved in β-AR-induced vasodilation. However, the involvement of each
β-AR subtype varies according to species and vascular beds (Rozec & Gauthier, 2006).
In this context, the aim of the present study was to identify the β-AR subtypes
implicated in the alterations of the β-AR-induced vasodilation during endotoxemic shock in
both the macro and microcirculations.
Material and methods
Animals
Ten-week-old male Sprague-Dawley rats (Janvier, Le Genest St, France) were housed
under standard conditions. Experiments were performed in compliance with the 1996 Guide
for the Care and Use of Laboratory Animals published by the U.S. NIH.
Endotoxemic model
Rats were anesthetized with 4% isoflurane (Forene®, Abbott France, Rungis, France)
in 1 L.min-1 O2 flow. They were randomly allocated for the intravenously injection in the
dorsal penile vein with either 5 mg.kg-1 of purified lipopolysaccharide (LPS) derived from E.
Coli 0111:B4 (Sigma, St Quentin Fallavier, France) dissolved in 1 mL saline 0.9% (LPS
group) or the same volume of saline 0.9% (CTRL group). Rats were thereafter not
resuscitated. In some rats, in vivo hemodynamic parameters were immediately measured,
whereas for in vitro experiments, other rats were housed for 180 min after LPS or saline
injection.
Hemodynamic measurements
After LPS or saline injection, anesthesia maintenance on spontaneously breathing rats
was performed with an inhalational anesthesia system (TEM anesthesia, Lormont, France) in
2% isoflurane in 1 L.min-1 O2 flow. Body temperature was maintained constant (37°C). The
right carotid artery was isolated and a 2F microtip pressure catheter (Millar instruments,
Houston, Texas) was inserted in it to measure the arterial blood pressure. Pressure signal and
heart rate (HR) were continuously recorded during 180 min using an A/D converter (EMKA
Technologies, Paris, France), stored and displayed on a computer by the IOX1.5.7 Software
System (EMKA Technologies). Animals were thereafter sacrificed by a pentobarbital
overdose.
117
Blood chemistry measurements
Blood sample were collected by intracardial puncture in animal anesthetized with 2%
isoflurane in 1 L.min-1 O2 flow and analyzed using a GEM®4000 (Instrumentation
Laboratory, Paris, France) and a cobas®8000 (Roche, Meylan, France).
Tension studies
Tension studies were recorded as previously described in thoracic aorta (Tran Quang
et al., 2009), mesenteric artery rings and in renal vascular system (Sauzeau et al.)
precontracted with a concentration of phenylephrine producing 80% of the maximum effect
(i.e. 1 and 2 µM of phenylephrine for CTRL and LPS aorta, respectively; 2 and 10 µM of
phenylephrine for CTRL and LPS mesenteric artery and renal vascular system, respectively).
All drugs used were obtained from Sigma, except SR 58611A which was a generous gift from
Sanofi-Synthelabo (Montpellier, France).
Western blotting
Western blotting experiments were realized on aortas as previously described (Merlet
et al.).
Data and statistical analysis
Results are expressed as the mean ± SEM of n experiments. Significant differences in
blood chemistry parameters and protein levels were determined using Mann-Whitney t tests.
Hemodynamic parameters and concentration-response curves were compared using two-way
ANOVA with repeated measures completed by Student-Newman-Keuls post hoc tests.
Agonist potencies, the concentrations producing 50% of the maximum effect (EC50), were
calculated by fitting concentration-response curves with the Boltzmann equation. pD2 values
were determined according to the equation pD2=-log(EC50) and compared using MannWhitney t tests. A P-value < 0.05 was considered statistically significant.
Results
Model characterization and hemodynamic measurements
LPS injection induced promptly a transient but significant decrease in mean arterial
blood pressure (MAP) in rats (Figure 1A). Six minutes after this LPS-dependent hypotension,
118
the arterial pressure reverts to normal values. However, in LPS-treated rats, the MAP drops
down again. The maximal effect was observed after 165 min (6111 vs 8510 mmHg;
P<0.05).
HR was stable all along the protocol in CTRL rats but gradually increased in LPS rats
to reach a steady state at 90 min. This increase was significantly higher 60 min after the LPS
injection (Figure 1B). Three hours after injection, HR was around 30% higher in LPS group
than in CTRL rats (48923 vs 33017 beat.min-1; P<0.001).
As shown in Table 1, 180 min after the LPS injection, the plasmatic concentration of
lactate was increased by 87% whereas the plasmatic bicarbonate concentration and pCO2 were
decreased by 31% and 27%, respectively, in comparison to CTRL animals. In addition,
plasmatic urea and creatinine concentrations were increased in LPS rats by 100% and 139%,
respectively.
Effect of endotoxemic shock on isoproterenol-induced vasodilation
Vasodilation to isoproterenol, a non-specific -AR agonist, was evaluated in aorta,
mesenteric and renal arteries, vasoconstricted with phenylephrine. Concentration-dependent
vasodilation to isoproterenol was significantly reduced in aortic (-31%), mesenteric artery
rings (-61%) as well as in the renal vascular system (-44%) from LPS rats (Figures 2A, 2B
and 2C, respectively). Nevertheless, the isoproterenol pD2 value was not affected by LPS
treatment in any studied vascular beds (Table 2).
These results demonstrate an alteration to isoproterenol-induced vasodilation in all
vascular beds. Thereby, the following study evaluated -AR subtype expression and function
in thoracic aortas. Some protocols have been also evaluated in mesenteric arteries.
Effect of the endotoxemic shock on aortic 1- and 3-AR expression and function
In our experimental conditions, the aortic 1 and β3-AR [in a native (44 kDa) or a
glycosylated form (68 kDa)] protein expression levels were not significantly modified 180
min after LPS infusion (Figures 3A and 3C, respectively).
Dobutamine, described as a 1-AR agonist (Schiffelers et al., 1999), produced the
same maximal effect at 10 µM in both groups (Figure 4). However, its pD2 value was
significantly higher in LPS rats (6.2±0.1 vs 5.8±0.0; P<0.05; Table 2). Dobutamine has also
been described as a 2-AR agonist (Waldeck, 2011), consequently we have performed the
119
same protocol in the presence of a 2-AR antagonist: ICI 118,551. In this condition,
dobutamine-induced vasodilation was significantly reduced by 30% in LPS (42.2±5.9 vs
60.7±4.1%; P<0.01), but not modified in CTRL aorta rings (Figure 4).
SR 58611A, a 3-AR agonist, produced a concentration-dependant vasodilation in
CTRL aorta rings. This vasodilation was reduced in LPS aorta rings compared to CTRL ones
(44.9±5.7 vs 87.6±3.8%; P<0.05; Figure 5A) without modification of SR 58611A pD2 value
(Table 2). The maximal relaxant effect induced by SR 58611A in CTRL rings was reduced by
45% after endothelium removal (47.6±5.1 vs 87.6±3.8%; P<0.05; Figure 5A), and associated
to a decrease in SR 58611A pD2 value (3.6±0.3 vs 4.6±0.1; P<0.05; Table 2). Conversely, in
aorta rings from LPS rats, the endothelial removal had no effect on SR 58611A-induced
vasodilation or on SR 58611A pD2 value.
To evaluate whether SR 58611A-induced vasodilation was strictly related to β3-AR
stimulation, we evaluated relaxation to SR 58611A in the presence of a preferential β3-AR
antagonist, L-748,337 (Figure 5B). The presence of L-748,337 significantly reduced the
maximal SR 58661A-induced vasodilation in CTRL aorta rings (64.3±6.3 vs 87.6±3.8%;
P<0.05) but had no effect on the SR 58661A-induced vasodilation in LPS aorta rings. To
investigate a potentially β1-/β2-AR effect of SR 58611A, we also performed SR 58611Ainduced vasodilation curves in denuded aorta rings pretreated with Nadolol, a β1-/β2-AR
antagonist (Figure 5C). In this condition, the SR 58611A-induced vasodilation was strongly
reduced in LPS aorta rings (22.4±4.7 vs 50.0±8.4%; P<0.05), but unchanged in CTRL aorta
rings.
Effect of the endotoxemic shock on vascular 2-AR expression and function
Three hours after LPS injection, aortic 2-AR protein expression was reduced by 64%
in LPS group (Figure 3B). The maximal vasodilation induced by 10 µM salbutamol, a
preferential 2-AR agonist, was significantly increased in LPS aorta rings compared to CTRL
(61.2±4.3 vs 33.9±4.6%; P<0.05; Figure 6A) and associated with a significantly higher
salbutamol pD2 value in LPS as compared to CTRL (6.3±0.1 vs 5.6±0.2; P<0.05; Table 2).
To determine the endothelium involvement in salbutamol-induced vasodilation, we
performed the same protocols in aortic rings with disrupted endothelium. In this condition, the
salbutamol-induced vasodilation was blunted in CTRL (4.1±1.6 vs 33.9±4.6%; P<0.05) but
was not modified in LPS aorta rings (Figure 6A).
120
A pretreatment with ICI 118,551 (a 2-AR antagonist), or MDL 12,330A (an adenylyl
cyclase inhibitor), abolished the salbutamol-induced vasodilation obtained in endothelialdenuded LPS aorta rings (Figures 6C and 6E).
In mesenteric arteries rings, the maximal response to salbutamol (Figure 6B) was not
modified in LPS as compared to CTRL (66.1±3.5 vs 57.3±8.0%). In mesenteric arteries rings
with disrupted endothelium, salbutamol-induced vasodilation was abolished in CTRL
(2.7±2.1 vs 57.3±8.0%; P<0.05) but not modified in LPS (Figure 6B). In this last condition,
salbutamol-induced vasodilation was fully abolished by ICI 118,551 (Figure 6D).
Discussion
Our study reported ex vivo an altered isoproterenol-induced vasodilation in both
conducting (aorta) and resistance (mesenteric) arteries. These results were confirmed with
more integrate experiments using the kidney vascular system. In LPS aorta, β2-AR expression
was significantly decreased when β1 and β3-AR expressions were unchanged. Surprisingly,
β2-AR-induced vasodilation was increased in LPS and resulted from an activation of β2-AR
located in smooth muscle cells through the activation of the cAMP pathway.
Model of endotoxemic shock
To mimic the clinical situation (early shock period), the animals used in our study
were not resuscitated. Three hours after the shock induction, LPS rats developed an
hypotension and a tachycardia. Their blood analysis showed an increased anaerobic
metabolism in LPS animal as evidenced by increased lactate and decreased bicarbonate
concentrations associated with an alveolar hyperventilation as shown by a decreased pCO2. In
addition, LPS rats developed as previously described (Bangash et al., 2013) a renal failure
characterized by increased urea and creatinine blood concentrations. Even if the endotoxemic
rat is not the best model to evaluate the septic shock, its reproducibility allowed a relevant
study of the early shock (Doi et al., 2009). Furthermore, all those data obtained in our
experimental conditions (spontaneously breathing animals and IV bolus administration of
LPS), comparable to those previously described by Cuzzocrea et al (Cuzzocrea et al., 2006),
demonstrated that our endotoxemic model presented similar features than human severe sepsis
including hypotension, tachycardia, hyperventilation and renal failure (Bone et al., 2009).
Effects of LPS treatment on isoproterenol-induced vasodilation
121
In our model, the vasodilation induced by a non-selective β-AR agonist, isoproterenol,
was significantly reduced in the three investigated vascular beds. In a similar model studied
six hours after the IP injection of LPS, the vasodilation produced by isoproterenol was
preserved in aorta but reduced in the pulmonary artery (McIntyre et al., 1998). In this study,
forskolin (an adenylyl cyclase activator)-induced vasodilation was not modified in both
vascular beds suggesting that the reduced isoproterenol-induced vasodilation resulted from an
alteration of β-AR and/or G protein (McIntyre et al., 1998). It is important to note that to the
best of our knowledge, no study in the literature have evaluated the β-AR-induced
vasodilation in mesenteric arteries or in renal vascular system. However, in coronary
microvessel isolated from endotoxemic pigs, the vasodilations in response to isoproterenol or
sodium fluoride (a Gs-protein activator) were reduced whereas forskolin-induced vasodilation
was not modified suggesting an uncoupling of β-AR and Gs-protein from adenylyl cyclase
after LPS treatment (Wang et al., 1994).
Effects of LPS treatment on vascular β1- and β3-AR expression and function
Three hours after LPS injection, aortic β1-AR protein expression was unchanged.
Dobutamine, described as a β1-AR agonist (Schiffelers et al., 1999), induced a comparable
vasodilation in CTRL and LPS aortic rings. In the presence of a selective β2-AR antagonist
(ICI 118,551), dobutamine-induced vasodilation was not modified in CTRL aortas indicating
that its effect is only due to β1-AR activation. Surprisingly, in LPS aorta, dobutamine-induced
vasodilation was reduced in the presence of ICI 118,551, showing a loss of specificity of
dobutamine leading to a β2-AR activation. Albeit dobutamine is largely described as a
selective β1-AR agonist (Schiffelers et al., 1999), some studies reported that dobutamine
could also stimulate vascular β2-AR (Waldeck, 2011). Thus, the clinical use of dobutamine in
the treatment of septic shock as an inotropic agent could be reconsidered due to its ancillary
effects on β2-AR.
In LPS aorta, albeit β3-AR protein expression was unchanged, the vasodilation
induced by SR 58611A, a preferential β3-AR agonist, was significantly reduced by LPS
pretreatment. In CTRL aorta rings, we confirmed the location of β3-AR in the endothelial
layer as previously reported (Trochu et al., 1999; Rautureau et al., 2002 ). However, in LPS
aorta, we showed that the β3-AR-induced relaxation was unaffected by the endothelium
removal as well as by the pretreatment with a β3-AR antagonist, L-748,337. However, SR
58611A-induced relaxation in LPS denuded aortic rings was strongly reduced by Nadolol, a
122
β1-/β2-AR antagonist, suggesting a non-selective action of SR 58611A on β1- or β2-AR
located in VSM cells from LPS rats.
Effects of LPS treatment on vascular β2-AR expression and function
In our study, we demonstrated that aortic β2-AR protein expression was reduced while
salbutamol-induced vasodilation was significantly increased in LPS aorta compared to CTRL
one. Conversely, salbutamol-induced vasodilation was similar both in CTRL and LPS
mesenteric arteries. More interestingly, in both conducting and resistance arteries, salbutamolinduced vasodilation was completely blunted after the endothelium removal in CTRL, but
unchanged in LPS. Those results suggest that the salbutamol target was only located on VSM
cells in LPS vessels. In addition, we showed that salbutamol-induced vasodilation was fully
abolished by ICI 118,551, a selective β2-AR antagonist, in both vascular beds. The same
results were obtained with MDL 12,330A, an adenylyl cyclase inhibitor, in aorta indicating
that salbutamol effect in LPS vessels could be attributed to β2-AR through the activation of
adenylyl cyclase pathway. Our results are not in agreement with those reported in the
literature. In a close model, Donaldson and Myers described a decreased salbutamol-induced
relaxation of endothelium-denuded aortic rings (Donaldson & Myers, 1996). In conscious
rats, LPS infusion substantially attenuated the salbutamol-induced vasodilation of the
hindquarter vascular bed (Waller et al., 1994). Although, these last two studies were also
performed at the early phase of endotoxemic shock in rats, several points that differed from
our study could explain these discrepancies: (i) the serotype and the amount of the E. Coli
LPS used; (ii) the rat strain; (iii) the anesthetic-resuscitation protocol; and (iv) the delay
before the realization of the functional study (6 h after LPS injection versus 3 h in our study).
Our findings suggest that a pool of β2-AR located in VSM cells was recruited at the early nonresuscitated endotoxemic shock. Interestingly, a similar recruitment of functionally cardiac
β2-AR was reported in the initial phase of endotoxemic shock in pithed rats (Godlewski et al.,
2006). Nevertheless, this work did not evaluate the β2-AR expression.
Our study strengthens the putative protective effects of β2-AR agonists previously
described in several experimental studies. β2-AR agonists have also immunosuppressive
effects (Eijkelkamp et al., 2004) that could prevent multiple organ failure in endotoxemic
shock. Terbutaline, a β2-AR agonist, limits interleukin-1β secretion, superoxide anion
overproduction and plasma nitrite/nitrate increased in a rat septic shock (Tsao et al., 2010). In
addition, β2-AR agonists reduce liver damage (Izeboud et al., 2004) and induce resistance to
diaphragm fatigue associated with the septic shock (Uzuki et al., 2007). A renal β2-AR
123
blockade worsens the outcome of rats infected with E. Coli (Nakamura et al., 2010) whereas a
renal β2-AR over-expression appears as a promising new therapeutic strategy (Nakamura et
al., 2005). Finally, β2-AR agonists could attenuate the increased vascular permeability
(Schmidt et al., 1998; Irie et al., 2001), delay hypotension and prevent vascular hyporeactivity
to norepinephrine in the septic shock.
Albeit the use of β2-AR agonists in clinical practice is limited, clinical trials using
dopexamine open new fields of investigation. At low doses, dopexamine, a non-selective β2AR agonist, which possesses agonist activity at dopaminergic receptors (Fitton & Benfield,
1990), improved survival and reduced duration of hospital stay of septic patients (Pearse et
al., 2008). A dopexamine infusion (0.5 µg.kg-1.min-1) during 6 hours decreased lactatemia in
52% of septic patients. This decrease could be predicted by an increase over 14% in MAP
within 30 min (Mayeur et al., 2010). However, additional studies are needed to confirm those
results.
Conclusion and perspectives
Our work suggests a preserved function of vascular β2-AR located in the VSM cells in
three different vascular beds at the early phase of a non-resuscitated endotoxemic shock in rat.
These data suggest that β2-AR constitute a new putative therapeutic target to preserve organ
blood flow and to protect various tissues during the septic shock. Albeit this hypothesis
should be confirmed in human, our findings are supported by a recent study which
demonstrated an increased mortality in septic patients with a β2-AR polymorphism (Nakada et
al., 2010).
Acknowledgements
We would like to thank Stéphanie Lemarchand-Mindé, Amandine Lefebvre and
Patricia Charpentier for animal care, Mortéza Erfanian for its technical assistance and the
biochemistry laboratory of Nantes CHU for providing equipment for blood analysis. This
study was financially supported by the "Fédération Française de Cardiologie" and the
"Fondation de France".
Conflicts of interest
None.
124
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127
Figures legends
Fig. 1 Effects of lipopolysaccharide (LPS) administration on hemodynamic parameters. (a)
Mean arterial blood pressure and (b) heart rate were evaluated during 180 min after LPS
injection and were expressed in mmHg and beats per minute (beat.min-1), respectively. Solid
and open squares represent the CTRL and LPS rats respectively. Values represent mean ±
SEM of 6 rats per group. * P<0.05 LPS vs CTRL after two-way analysis of variance with
repeated measures followed by Student-Newman-Keuls test as post hoc analysis
Fig. 2 Concentration-relaxation curves to isoproterenol (a) thoracic aortic rings, (b)
mesenteric artery rings and (c) renal vascular system precontracted by phenylephrine from
control (CTRL) and LPS rats. Results were expressed as the percentage of relaxation from the
maximal contraction induced by phenylephrine. The mean curves are shown resulting from
subtraction of the spontaneous relaxation of vessels for aortic and mesenteric rings
experiments. Solid and open squares represent the CTRL and LPS rats, respectively. Values
represent mean ± SEM of a minimum of 5 rats per group. * P<0.05 LPS vs CTRL after twoway analysis of variance with repeated measures followed by Student-Newman-Keuls test as
post hoc analysis
Fig. 3 Effects of lipopolysaccharide (LPS) administration on aortic protein expression of (a)
β1-, (b) β2- and (c) β3-AR subtypes. A positive control of the protein presence was evaluated
with GAPDH. Values represent mean ± SEM. * P<0.05 LPS vs CTRL after a Mann-Whitney
t test
Fig. 4 Concentration-relaxation curves to dobutamine, a β1-AR agonist, in control (CTRL)
and LPS rats. Solid and open symbols represent the CTRL and LPS rats, respectively.
Thoracic aortic rings were precontracted by phenylephrine in the absence (square) or the
presence (triangle) of ICI 118,551, a β2-AR antagonist. Results were expressed as the
percentage of relaxation from the maximal contraction induced by phenylephrine. The mean
curves are shown resulting from subtraction of the spontaneous relaxation of vessels. Values
represent mean ± SEM of a minimum of 6 rats per group with * P<0.05 LPS vs CTRL; †
P<0.05 LPS vs LPS + 7 μM ICI 118,551 after two-way analysis of variance with repeated
measures followed by Student-Newman-Keuls test as post hoc analysis
Fig. 5 Concentration-relaxation curves to SR 58611A, a preferential β3-AR agonist, in control
(CTRL) and LPS rats. Solid and open symbols represent the CTRL and LPS rats, respectively.
(a) Thoracic aortic rings with (square) or without (circle) endothelium precontracted by
128
phenylephrine. (b) Thoracic aortic rings precontracted by phenylephrine in the absence
(square) or in the presence (triangle) of 7 μM L-748,337, a β3-AR antagonist. (c) Thoracic
aortic rings without endothelium precontracted by phenylephrine in the absence (circle) or in
the presence (diamond) of 10 μM Nadolol, a β1- and β2-AR antagonist. Results were
expressed as the percentage of relaxation from the maximal contraction induced by
phenylephrine. The mean curves are shown resulting from subtraction of the spontaneous
relaxation of control vessels. Values represent mean ± SEM of a minimum of 3 rats per group.
* P<0.05 LPS endo+ vs CTRL endo+; † P<0.05 CTRL endo- vs CTRL endo+; ‡ P<0.05
CTRL endo+ + L-748,337vs CTRL endo+; § P<0.05 LPS endo+ + L-748,337 vs CTRL
endo+ + L-748,337; ll P<0.05 LPS endo- vs LPS endo- + Nadolol after two-way analysis of
variance with repeated measures followed by Student-Newman-Keuls test as post hoc analysis
Fig. 6 Concentration-relaxation curves to salbutamol, a β2-AR agonist, in control (CTRL) and
LPS rats. Solid and open symbols represent the CTRL and LPS rats respectively. (a) Thoracic
aortic and (b) mesenteric artery rings with (square) or without (circle) endothelium
precontracted by phenylephrine. (c) Thoracic aortic and (d) mesenteric artery rings without
endothelium precontracted by phenylephrine in the absence (circle) or the presence (triangle)
of 7 μM ICI 118,551, a β2-AR antagonist. (e) Thoracic aortic rings without endothelium
precontracted by phenylephrine in the absence (circle) or the presence (triangle) of 30 μM
MDL 12,330A, an adenylyl cyclase antagonist. Results were expressed as the percentage of
relaxation from the maximal contraction induced by phenylephrine. The mean curves are
shown resulting from subtraction of the spontaneous relaxation of vessels. Values represent
mean ± SEM of a minimum of 5 rats per group. * P<0.05 LPS endo+ vs CTRL endo+; †
P<0.05 CTRL endo- vs CTRL endo+; ‡ P<0.05 LPS endo- + ICI 118,551 vs LPS endo-; §
P<0.05 LPS endo- + MDL 12,330A vs LPS endo- after two-way analysis of variance with
repeated measures followed by Student-Newman-Keuls test as post hoc analysis.
129
Table 1. Hemodynamic parameters and blood analysis of control (CTRL) and LPS rats.
CTRL (n=5-12)
LPS (n=6-9)
P
Heart rate (bpm)
330.2 ± 16.6
449.0 ± 20.9
<0.01
Mean Arterial Pressure (mmHg)
87.9 ± 7.0
60.1 ± 7.1
<0.05
pH
7.36 ± 0.01
7.34 ± 0.01
0.23
pCO2 (kPa)
7.25 ± 0.12
5.29 ± 0.23
<0.01
pO2 (kPa)
68.78 ± 1.47
67.87 ± 3.76
0.66
HCO3- (mM)
30.70 ± 0.82
21.06 ± 0.84
<0.01
Lactate (mM)
2.03 ± 0.09
3.80 ± 0.29
<0.01
Urea (mM)
3.76 ± 0.13
7.53 ± 0.22
<0.001
Creatinine (µM)
22.36 ± 2.69
53,33 ± 3.81
<0.001
pCO2: partial pressures of carbon dioxide; pO2: partial pressures of oxygen
130
Table 2. Efficiencies and potencies of β-AR agonists on aorta and mesenteric artery rings and
on renal vascular system from control (CTRL) and LPS rats.
Vascular Bed
Agonist
Iso
Emax (%)
Antagonist
Inhibitor
Endo
/
pD2
CTRL
LPS
CTRL
LPS
+
85.4 ± 2.7
58.3 ± 2.8*
6.7 ± 0.1
6.9 ± 0.5
/
+
59.6 ± 4.2
60.7 ± 4.1
5.8 ± 0.0
6.2 ± 0.1*
ICI
+
49.1 ± 7.4
42.2 ± 5.9§
5.8 ± 0.2
6.0 ± 0.2
/
+
33.9 ± 4.6
61.2 ± 4.3*
5.6 ± 0.2
6.3 ± 0.1*
/
-
4.1 ± 1.6†
51.4 ± 6.5*
5.8 ± 0.4
6.1 ± 0.3
ICI
-
nd
12.4 ± 6.1§
nd
6.7 ± 1.2
MDL
-
nd
5.7 ± 5.9§
nd
6.4 ± 0.4
/
+
87.6 ± 3.8
44.9 ± 5.7*
4.6 ± 0.1
4.6 ± 0.1
/
-
47.6 ± 5.1†
50.0 ± 8.4
3.6 ± 0.3†
4.3 ± 0.3
L
+
64.3 ± 6.3‡
37.7 ± 5.8
4.6 ± 0.1
4.1 ± 0.4
Nado
-
44.2 ± 9.8
22.4 ± 4.7§
3.7 ± 0.4
4.7 ± 1.0
/
+
73.3 ± 3.4
28.4 ± 7.2*
6.8 ± 0.3
7.4 ± 0.3
/
+
57.3 ± 8.0
66.1 ± 3.5
5.9 ± 0.4
6.8 ± 0.7*
/
-
2.7 ± 2.1†
39.8 ± 11.8*
nd
5.3 ± 0.3
ICI
-
nd
13.2 ± 8.6§
nd
nd
/
+
79.6 ± 5.6
44.8 ± 3.8*
5.5 ± 0.8
5.9 ± 0.2
Dobu
Salbu
Aorta
SR
Iso
Mesenteric
artery
Renal vascular
system
Salbu
Iso
Values represent mean ± SEM of a minimum of 3 rats per group. Emax: Maximal Effect; Endo:
endothelium; Iso: isoproterenol; Dobu: dobutamine; ICI: ICI 118,551; Salbu: salbutamol;
MDL: MDL 12 330A; SR: SR 58611A; L: L-748,337; Nado: Nadolol; nd: value not
determined. * P<0.05 LPS vs matching CTRL; † P<0.05 CTRL endo- vs matching CTRL; ‡
P<0.05 CTRL + antagonist vs matching CTRL; § P<0.05 LPS + antagonist vs matching LPS
after a Mann Whitney t test.
131
Figure 1.
132
Figure 2.
133
Figure 3.
134
Figure 4.
135
Figure 5.
136
Figure 6.
137
4.1.3. Article : Implication des cyclooxygénases dans la potentialisation de la
contractilité β1-adrénergique cardiaque à la phase précoce du choc endotoxémique chez
le rat.
The endocardial endothelium potentiates β1-adrenergic cardiac
contractility at the early endotoxemic shock.
Involvement of cyclooxyenases
David ROUL, Bertrand ROZEC, Mortéza ERFANIAN, Leslie Audigane, Amandine
GRABHERR, Angélique ERRAUD, Nolwenn MERLET, Damien GUIJARRO, Ikunobu
MURAMATSU, Benjamin LAUZIER, Chantal GAUTHIER.
Journal of the American College of Cardiology
(en rédaction)
138
The endothelial dysfunction increased β1-adrenergic cardiac
contractility at the early endotoxemic shock.
Involvement of cyclooxygenases
David Roul, PhD Student1, 2, 3; Bertrand Rozec, MD PhD1, 2, 4; Mortéza Erfanian1, 2, 3; Leslie
Audigane1, 2, 3; Amandine Grabherr1, 2, 3; Angelique Erraud1, 2, 3; Nolwenn Merlet, PhD1, 2, 3, 5;
Damien Guijarro, MD1, 2, 6; Ikunobu MURAMATSU7; Benjamin Lauzier, PhD1, 2, 3; Chantal
Gauthier, PhD1, 2, 3.
1
INSERM, UMR-1087, l‟institut du thorax, Nantes, 44000 France
2
CNRS, UMR-6291, Nantes, 44000 France
3
Université de Nantes, Nantes, 44000 France
4
CHU Nantes, Department of Anesthesiology and Intensive Care, Nantes, 44000 France
5
Present address: Montreal Heart Institute, Montreal, H1T 1C8 Québec, Canada
6
CHU Nantes, Department of Cardiology, Nantes, 44000 France
7
School of Medicine, University of Fukui, Fukui, Japan
139
Abstract
The endothelial dysfunction is one of the earliest symptoms of septic patients and
plays an important role in the cardiovascular alterations in the septic shock. However, the
endothelial mechanisms involved in the impaired sympathetic regulation of the cardiovascular
system are not yet clear. This study aimed to determine the role of the endocardial
endothelium (EE) in the cardiac β-adrenergic (β-AR) remodelling at the early phase of septic
shock.
Twelve
weeks-old
Sprague
Dawley
rats
received
either
5
mg.kg-1
of
lipopolysaccharide (LPS) or saline (C) intravenously. Three hours later, β-AR cardiac
contractility was evaluated on papillary muscle with or without a functional EE. EE removal
was performed with immersion in Triton X-100 at 0.5% during 3s and was validated by
electronic microscopy and functional studies.
Surprisingly, isoproterenol (non-selective β-AR agonist) induced contractility was
strongly increased in papillary muscle from LPS rat (+102±19% vs C; p<0.05). A similar
increase was observed with a β1-AR stimulation (+90±25% vs C; p<0.05) whereas β2-AR and
β3-AR produced similar contractility both in C and LPS muscles. The EE removal did not
modified β1-AR-induced contractility in C whereas it abolished the increased β1-AR response
in LPS. In LPS papillary muscle, the increased β1-AR-induced contractility was not modified
by pretreatment with 1µM L-NMMA, a NOS inhibitor, or 10µM bosentan, an endothelin
receptor antagonist. Conversely, the increased β1-AR-induced contractility was abolished by
10µM indomethacin, a non selective cyclooxygenase (COX) inhibitor, as well as by selective
inhibitors of COX1 (SC560, 3µM) and COX2 (NS398, 3µM). An early treatment one hour
after the shock induction with 1 mg.kg-1 of indomethacin improved the survival of LPS rats.
Our results demonstrate the EE involvement in the increased cardiac β1-AR
contractility at the early phase of endotoxemic shock. This effect is mediated through the
activation of both COX1 and COX2 which appears as new putative therapeutic targets at the
early phase of endotoxemic shock.
140
Introduction
Severe sepsis and septic shock are the leading causes of mortality in non-cardiac
intensive care unit (Martin et al., 2003). Even if a decrease in case fatality rate is observed in
septic patients, the continual increase of hospitalization over the years lead to an increase of
mortality rates (Dombrovskiy et al., 2007). Last guidelines from the Surviving Sepsis
Campaign stated that “similar to polytrauma, acute myocardial infarction or stroke, the speed
and appropriateness of therapy administered in the initial hours after the septic shock are
likely to influence outcome” (Dellinger et al., 2013). Unfortunately, most studies aiming to
identify new relevant therapeutic targets, to improve the outcome of septic patients, do not
investigate the initial stage of this syndrome.
The early stage of the septic shock is mainly characterized by an important and
expanded endothelial dysfunction (Aird, 2003). This dysfunction is clearly established in
vessels where it is involved in the significant hypotension observed in the septic shock
(Matsuda et al., 2000). In the septic heart, the involvement of the endothelial dysfunction
remained poorly explored. Indeed, only few studies demonstrated that the endothelial
dysfunction modified the cardiac function. These alterations involved an increased production
of nitric oxide (NO), endothelin and prostaglandins (Corda et al., 1998; Mebazaa et al., 2001;
Mink et al., 2005). Interestingly, these mediators are released by the vascular endothelium but
in these studies the authors stated also an important involvement of the endocardial
endothelium (EE) (Corda et al., 1998; Mebazaa et al., 2001; Mink et al., 2005).
Besides the endothelial dysfunction, the early septic shock is also characterized by
increased circulating catecholamines concentrations in the plasma of patients leading to a
sympathetic overstimulation (Annane et al., 1999; Ostrowski et al., 2013). Such phenomena
have already been described in the early stage of heart failure where it induced a remodeling
of β-adrenergic receptor (β-AR) (Fu et al., 2012). The three β-AR subtypes, β1-, β2- and β3AR, are found in the heart where β1- and β2-AR induced a positive inotropic effect while the
β3-AR induced a negative inotropic effect (Gauthier et al., 1998). Surprisingly, alterations of
β-AR have barely been investigated in the septic heart. Indeed, to the best of our knowledge,
only two studies have evaluated the involvement of specific β-AR subtypes in the septic
cardiomyopathy. A recruitment of β2-AR has been reported in hearts from pithed
endotoxemic rats (Godlewski et al., 2006) while an upregulation of β3-AR was reported in
patients‟ heart dead from a septic shock (Moniotte et al., 2007).
141
Given the evidences pointing out the importance of the EE dysfunction and the
probable alterations of cardiac β-AR in the initial stage of the septic shock, we investigate in
the present study the cardiac β-AR remodeling at the early phase of the endotoxemic shock
and the possible involvement of the EE in the regulation of this remodeling. To determine the
endothelial mediators involved in this paracrine regulation, we particularly focus NO, the
endothelin and the prostaglandins.
142
Methods
Animals
Ten-week-old male Sprague-Dawley rats (Janvier, Le Genest St, France) were housed
under standard conditions of temperature (21–24°C), humidity (40–60%) and 12 h light/dark
cycle. Food and water were available ad libitum. The experiments were performed in
compliance with the 1996 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals published by
the U.S. National Institute of Health.
Endotoxemic rat model
Rats were anesthetized with 4% isoflurane in air (Forene®, Abbott France, Rungis,
France). They were randomly allocated for the intravenously injection with either 5 mg.kg-1 of
purified Escherichia Coli LPS derived from E. Coli 0111:B4 (Sigma, St Quentin Fallavier,
France) in 1 mL of saline 0.9% (LPS group) or the same volume of saline 0.9% (CTRL
group) in the dorsal penile vein. Rats were thereafter not resuscitated. In some rats, in vivo
hemodynamic parameters were immediately measured, whereas for echocardiographic and in
vitro experiments, other rats were housed alone after LPS injection and allowed to move
freely in cages for 3 h with water ad libitum.
Echocardiographic measurements
Three hours after LPS or saline injection, animals were anesthetized with 4%
isoflurane in O2 (TEM anesthesia). Isoflurane was delivered at a concentration of 2% volume
and 1 L.min-1 O2 flow to limit hemodynamic repercussion. Transthoracic echocardiography
was performed using an ultrasound system VIVID7 (GE Healthcare, Horton, Norway)
equipped with a 10 MHz sectorial probe as previously described (Merlet et al., 2013).
Measurements were made on five cardiac cycles and averaged for each data value.
Hemodynamic measurements
After LPS or saline injection, anesthesia maintenance on spontaneously breathing rats
was performed with an inhalational anesthesia system for small animal (TEM anesthesia,
Lormont, France). Isoflurane was delivered at a concentration of 2% volume and 1 L.min-1 O2
flow to limit hemodynamic repercussion. The animal was positioned on a heating pad in a
supine position. The right carotid artery was isolated, ligated at the proximal part and a 2F
microtip pressure catheter was insert in it (Millar instruments Inc, Houston, Texas) to measure
the arterial blood pressure. Pressure signal and heart rate were continuously recorded during 3
143
h after LPS or saline injection using an A/D converter (EMKA Technologies, Paris, France)
stored and displayed on a computer by the IOX1.5.7 Software System (EMKA Technologies).
Animals were thereafter sacrificed by administrating pentobarbital overdose.
Papillary muscle contractility measurement
Papillary muscle from the left ventricle were harvested and quickly placed in an
experimental chamber and superfused at a flow rate of 5 ml/min with oxygenated (95% O2,
5% CO2) Tyrode‟s solution (37 ± 0.5°C) composed as follows (in mmol/l): 116 NaCl, 5 KCl,
2.7 CaCl2, 1.1 MgCl2, 0.35 NaH2PO4, 27 NaHCO3, 5 glucose, 5 pyruvic acid sodium salt,
0.15 fumaric acid and 5 L-glutamic acid. Papillary muscles were subjected to field stimulation
at a frequency of 1 Hz using square-wave pulses of 1 to 2 ms duration, and amplitude was
twice the diastolic threshold. Mechanical tension was recorded using a mechanoelectric force
transducer Akers AE 801 (SensoNor, Horton, Norway). After a 60 min equilibration period,
papillary muscle were stretched stepwise (10 µm increments) to a length at which contraction
force was at 90% of the maximal tension. Cumulative concentration-response curves of
isoproterenol, associated or no with specific β1- and/or β2- and/or β3-AR antagonists were then
determined by superfusion with successive increasing concentrations of isoproterenol to
evaluate non specific and subtype specific β-AR responses. Experiments evaluating β1-ARinduced contractility were also performed with the presence in the superfused Tyrode of
endothelial mediators‟ pathways inhibitors.
For all isoproterenol concentrations, tension was measured at steady state using a
digital storage oscilloscope HMO1024 (HAMEG Instruments, Mainhausen, Germany), a strip
chart recorder model 8188 (Gould, Les Ullis, France), and a digital tape recorder (model
DTR-1200, Biologic, Claix, France). To alter EE, papillary muscles were quickly immersed in
Triton X-100 (Sigma) at 0.5% during 3 s, and immediately rinsed in several Tyrode baths
before being placed in the experimental chamber, in order to remove the EE without alteration
of the underneath cardiomyocytes.
Tissue segment binding experiments
Tissue segment binding experiments were performed as previously described
(Muramatsu et al., 2005). Briefly, isolated left ventricle was cut into small pieces under a
microscope. About 30 pieces were prepared for one rat. Each piece was incubated at 4°C in 1
mL of Krebs incubation buffer (Sigma) with [3H]-CGP-12177 for 12h.
144
In the saturation binding experiments, 50 pM – 20 nM [3H]-CGP-12177, a β1/2-AR
antagonist, was used in the absence or presence of 1 µM propranolol to define nonspecific
binding. Competition binding experiments were conducted by using 300 pM of [ 3H]-CGP12177 and 1 pM – 10 µM of ICI-89,406, a β1-AR antagonist, in the absence or presence of 1
µM propranolol to define nonspecific binding. The pieces were then blotted and solubilized in
1mL of 0.3 M NaOH (Sigma) to estimate the radioactivity and protein content. The specific
binding was determined by subtracting the radioactivity bound per mg of protein in the
presence of propranolol from total radioactivity bound per mg of protein. Experiments were
done in duplicate.
Radioactivity was counted in a liquid scintillation counter (LC-3500, Aloka Co Ltd,
Tokyo, Japan) using water-miscible scintillation fluid (ULTIMA GOLDTM, Packard
Bioscience, Groningen, Netherlands). The protein of tissue segment in each tube was
measured by the method of Bradford using bovine serum albumin as a standard.
Electron microscopy
For ultrastructure analysis, harvested papillary muscles were fixed during 1h30 in
glutaraldehyde fixative at 4°C followed by postfixation during 1 h in 2% osmium tetroxide at
room temperature. After dehydration in a graded ethanol series, the fragments were embedded
in epoxy resin. 70 nm sections were realized using a ultramicrotom UTRLACUT-E (Reichert
Jung, Vienna, Austria), stained with the Reynolds method and examined using a JEOL-JEM
1010 (Jeol Korea Ltd, Seoul, South Korea).
Western blotting
Western blotting experiments were realized on left ventricles as previously described
(Merlet et al., 2013) using a rabbit antibody raised against the mouse and rat β1-AR (A-272,
Sigma), a rabbit polyclonal antibody raised against the human, mouse and rat β2-AR
(ab36956, AbCam Ltd, Cambridge Science Park, Cambridge, UK), a rabbit polyclonal
antibody raised against mouse and rat β3-AR (M-50, sc-50436, Santa-Cruz Biotechnology,
Tebubio®, Le Peray en Yvelines, France), a rabbit monoclonal antibody raised against the
human, mouse and rat COX1 (ab133319, AbCam Ltd) and a rabbit polyclonal antibody raised
against the human, mouse and rat COX2 (ab133319, AbCam Ltd).
Survival Curve
One hour after LPS injection, rats were anesthetized with 4% isoflurane in air and
were randomly allocated for the intravenously injection with either 1 mg.kg-1 of Indomethacin
145
in 1 mL of saline 0.9% or the same volume of saline 0.9% in the dorsal penile vein. Rats were
allowed to move freely in cages after treatment with food and water ad libitum. Survival was
evaluated every hour during the following 48 hours. CTRL animal received 1 mL.kg-1 of
saline 0.9% one hour after the first injection.
Drugs
Isoproterenol (a non specific β-AR agonist), Indomethacin (a non specific COX
inhibitor) and Triton X-100 were purchased from Sigma. CGP 20712 (a specific β1-AR
antagonist), ICI 118,551 (a specific β2-AR antagonist), L-748,337 (a specific β3-AR
antagonist), SC560 (a specific COX1 inhibitor) and NS398 (a specific COX2 inhibitor) were
purchased from Tocris (Bristol, United Kingdom). ICI-89,406 (a specific β1-AR antagonist)
and propranolol (a β1/2-AR antagonist) were purchased from Nacalai Tesque (Kyoto, Japan).
NG-monomethyl-L-arginine, mono-acetate (L-NMMA) (a non specific NOS inhibitor) was
purchased from Calbiochem (La Jolla, California). Bosentan (a non specific endothelin
receptor antagonist) was purchased from Actelion (Allschwil, Switzerland). [3H]-CGP-12177
(a
β1/2-AR
antagonist
radioligand)
was
purchased
from
Amersham
Biosciences
(Buckinghamshire, UK)
Data and statistical analysis
Results are expressed as the mean ± SEM of n experiments. Significant differences in
echocardiographic parameters, binding experiments parameters and protein levels of each βAR and COX isoforms were determined using an unpaired Mann-Whitney t test. The
comparison of hemodynamic parameters and concentration-response curves was performed
by a two-way ANOVA (concentration, treatment) with repeated measures completed when
appropriate by a Bonferroni test as post hoc analysis. Agonist potencies, the concentrations
producing 50% of the maximum effect (EC50), were calculated by fitting concentrationresponse curves with the Boltzmann equation. pD2 values were determined according to the
equation pD2=-log(EC50) and compared using Mann-Whitney t tests. A P-value < 0.05 was
considered statistically significant.
146
Results
Effect of endotoxemic shock on hemodynamic and echocardiographic parameters
Three hours after LPS injection, animals presented an hypotension (60.1  7.1 vs 87.9
 7.1 mmHg; P<0.05) associated with a tachycardia (449  21 vs 330  17 beat.min-1;
P<0.001) (table 1). An impaired systolic function, as shown by decreased ejection (74.5  2.2
vs 83.8  2.7%; P<0.05) and shortening (38.6  1.8 vs 48.6  3.0%; P<0.05) fraction, was
found in LPS rats compared to CTRL (Table 1). In addition, LPS rats presented an impaired
diastolic function characterized by an increased isovolumic time of relaxation (29.62  2.31 vs
24.13  1.77 ms; P<0.05) and a slow down early diastolic peak flow velocity (0.579  0.057
vs 0.978  0.048 m.s-1; P<0.05) compared to CTRL (table 1).
Effect of endotoxemic shock on cardiac -AR function and expression
The isoproterenol concentration dependant papillary muscle contractility was
increased by 105 % in papillary muscles from LPS rats compared to CTRL papillary muscles
(306.2 ± 31.4 vs 149.2 ± 8.4%; P<0.05) (fig. 1).
Both β1- and β2-AR total protein levels were decreased, in left ventricles (LV) from
LPS rats compared to CTRL ones, by 56 and 47%, respectively (fig. 2A and C, respectively).
β1- and β2-AR membrane protein levels were unchanged in LV from LPS rats compared to
CTRL ones, as evidenced by preserved radioligand [3H]-CGP-12117 maximum binding
capacity (Bmax) (table 2). Moreover, neither β1-/β2-AR ratio nor β1- and β2-AR affinities for
the CGP-12177 were modified in LPS LV compared to CTRL ones (table 2). β1- and β2-AR
affinities for the CGP-12177 were evidenced with the equilibrium dissociation constant (KD)
of the CGP-12177. β3-AR binding experiments cannot be performed as no selective
radioligand is available for the β3-AR. However, by western blotting β3-AR total protein level
was reduced by 20% in LV from LPS rats compared to CTRL ones (fig. 2E).
Albeit cardiac β2- and β3-AR-induced contractility were not modified in papillary
muscle from LPS rats (fig. 2D and F), β1-AR-induced contractility was significantly increased
by 94% in LPS papillary muscles compared to CTRL papillary ones (534.2 ± 83.2 vs 275.8 ±
34.8%; P<0.05; fig. 2B).
Endocardial endothelium involvement in the increased β1-AR response
In order to determine the involvement of the EE in this increased β1-AR-induced
contractility, the same experiments were performed on papillary muscles previously treated
147
with Triton-X100 at 0.5% during 3 s. The efficiency of EE removal was first evaluated using
both electron microscopy and papillary muscle contractility technique. Compared to control
conditions (fig. 3A), papillary muscles pre-treated with Triton-X100 presented altered EE
cells (fig. 3B) without alteration of the underneath cardiomyocytes. The viability of
cardiomyocytes was evidenced by sarcomere and mitochondria integrities. On functional
point, the EE removal produced an accelerated relaxation in papillary muscles leading to a
shortened contraction period (fig. 3C), without modification of contractile phase
The EE removal had no significant effect on the β1-AR-induced contractility on
papillary muscle from CTRL rats, whereas it completely abolished the increased β1-ARinduced contractility observed in LPS rats (245.8 ± 29.2 vs 534.2 ± 83.2%; P<0.05; table 3
and fig. 4A).
Endocardial endothelial mediators involved in the increased β1-AR response
To determine the EE mediators involved in the increase β1-AR-induced contractility,
concentration-response curves to β1-AR stimulation were established in the presence of 1 µM
L-NMMA (a non specific NOS inhibitor) or 10 µM bosentan (a non selective antagonist of
endothelin receptor). We demonstrate that neither L-NMMA nor bosentan modified the β1AR enhanced contractility on papillary muscle from LPS rats (fig. 4B). These molecules did
not modify the β1-AR-induced contractility on papillary muscle from CTRL rats either (table
3).
In another set of experiments, we assessed the involvement of the cyclooxygenases
(COX) pathway in the increased β1-AR contractility. Concentration-response curves to β1-AR
stimulation were constructed in the presence of 10 µM indomethacin, a non specific COX
inhibitor (fig. 5A). While indomethacin had no significant effect on the β1-AR-induced
contractility on papillary muscle from CTRL rats (table 3), it totally abolished the potentiated
β1-AR-induced contractility observed on papillary muscle from LPS rats (table 3; fig 5A). To
further explore the COX isoforms involved in this phenomenon, similar experiments were
performed in the presence of 3 µM SC560 or NS398, specific COX1 and COX2 inhibitors,
respectively (fig. 5A). It appeared that both drugs abolished the potentiated β1-AR-induced
contractility observed on papillary muscles from LPS rats without any effects on the β1-ARinduced contractility recorded on papillary muscles from CTRL rats (table 3; fig 5A).
Interestingly, isoproterenol pD2 value, in presence of β2- and β3-AR antagonists, was
significantly lower when the papillary muscles were pre-treated with NS398, the COX2
inhibitor in comparison with the papillary muscles pre-treated with SC560, COX1 inhibitor
148
(table3). Finally, COX1 and COX2 protein expressions (fig. 5B and C, respectively) were not
modified in left ventricles from LPS animal compared to CTRL.
Survival experiments
In order to evaluate if the COX pathway inhibition could be a suitable therapy in the
septic shock, a survival curve was establish in LPS rats, in the presence or not of
indomethacin treatment. As expected every CTRL rats survived over a 48h period after NaCl
injection. By opposite, the survival curve of LPS rats started to decline 9h after the LPS
injection to reach a 0% of surviving rat 9h later with a median survival calculated at 12h after
the LPS injection. Rats treated with an intravenous injection of indomethacin alone (1 mg.kg1
) one hour after the LPS injection presented a significantly extended survival to 22% 48h
after the LPS injection with a median survival calculated at 19h (fig. 6).
149
Discussion
The early stage of the septic shock is characterized by an important endothelial
dysfunction but also by increased circulating plasma catecholamines (Ostrowski et al., 2013).
The involvement of these both alterations in the septic cardiomyopathy and their putative
interactions are unclear. This study evaluates, for the first time, (i) the three cardiac β-AR
subtypes protein expression and functional remodeling at the early phase of the endotoxemic
shock in rats and (ii) the involvement of the endothelial paracrine function in the β1-AR
induced contractility. An increased β1-AR-induced contractility was demonstrated in papillary
muscle from LPS rats without any modifications in the membrane β1-AR protein density. We
highlighted the involvement of the endothelial dysfunction, and particularly the EE
dysfunction, in the increased β1-AR-induced contractility. Finally, using inhibitors and
antagonists of various endothelial signalling pathways, we demonstrated an involvement of
both COX1 and COX2 isoforms in the endocardial endothelial dependant increased β1-ARinduced contractility.
Cardiac and hemodynamic alteration at the early endotoxemic shock
In the present work, we first demonstrated, 3 h after the induction of the endotoxemic
shock, an hypotension associated with a tachycardia comparable to those observed at the
initial stage of the septic shock in patients (Riedemann et al., 2003). Moreover, using
echocardiography, we characterized both systolic and diastolic cardiac dysfunctions in our
endotoxemic rat model. We reported alterations, such as decreased ejection and shortening
fraction and slowed down early peak flow velocity, comparable to those observed in septic
patients (Brown et al., 2012) and other animal models like cecal ligation-puncture mice (Celes
et al., 2012).
Cardiac β-AR remodeling at the early endotoxemic shock
The regulation of cardiac contractility by β-AR was evaluated using isoproterenol, a
non specific β-AR agonist. This contractile response was increased in LPS papillary muscles
compared to CTRL ones. This result is not in agreement with previous reports of the literature
in which β-AR contractility, evaluated using isoproterenol, was decreased (Yasuda & Lew,
1997; Matsuda et al., 2000; Spiers et al., 2000). However, in these studies, the β-AR
150
contractility was evaluated on isolated cardiomyocytes and/or after longer LPS challenges,
from 6 to 15 hours, which could explain the reported differences.
In our endotoxemic model, total cardiac protein levels of all β-AR subtypes were
decreased while membrane proteins densities for β1- and β2-AR were not modified. Binding
experiments presented the advantage of measuring native β-AR at the membrane which
represents the active pool of receptors. Unfortunately, β3-AR binding experiments cannot be
performed as non selective radioligands are available for this receptor. Such binding
experiments had already demonstrated a preserved β-AR expression at the cardiac membrane
of rabbit heart 6h after an LPS injection (Matsuda et al., 2000). However, in this study, the
specific expression of β1-AR and β2-AR were not investigated as the radioligand used was
[125I]-iodocyanopindolol. Moreover, this radioligand is also a ligand for 5HT1B-serotonergic
receptors which could distort these results (Tsuchihashi et al., 1989 153). In this context,
pharmacological experiments are critical to assess the cardiac functional remodeling of each
β-AR subtype at the early endotoxemic shock. Such pharmacological experiments were
performed using isoproterenol in the presence of selective antagonists for β1-, β2- and/or β3AR. We demonstrated that at the early endotoxemic shock, the isoproterenol increased cardiac
contractility was only dependant of β1-AR stimulation in LPS papillary muscle. There was no
modifications in β2- and β3-AR-induced contractility in LPS papillary muscle compared to
CTRL ones.
β-AR protein and functional remodeling had already been described in early stages of
other pathophysiological conditions such as heart failure (HF) where it plays a key role (Fu et
al., 2012). Interestingly, during the early stage of HE, like during the early phase of septic
shock, an endothelial dysfunction is clearly established and involved in the development of
the disease (Strauer, 1990). Whether the β-AR and the endothelial dysfunction are linked and
share common pathways is of particular interest. In order to evaluate the involvement of the
endothelial dysfunction in the β-AR remodeling in our model, we disrupted the endocardial
endothelium using Triton-X100. The EE was already demonstrated as a regulator of cardiac
contractility during the endotoxemic shock (Corda et al., 1998; Mebazaa et al., 2001; Mink et
al., 2005). Moreover, although the coronary vascular endothelium is also probably involved in
the regulation of cardiac contractility (Qi et al., 1999), its removal is technically more difficult
and less reproducible.
151
Endothelial dysfunction involvement in the increased β1-AR-induced contractility
When the EE was disrupted following a treatment with Triton X-100, the β1-ARincreased response was completely abolished. Albeit it has been reported that Triton X-100, at
concentrations lower than the one used in this study, is able to inhibit L-type voltage calcium
channels (Narang et al., 2013), the β1-AR-induced contractility was not modified in CTRL
papillary muscles following Triton X-100 treatment, excluding a non selective action of
Triton X-100 in our model.
Previous studies involving the EE in the regulation of the cardiac contractility during
the endotoxemic shock, reported the possible involvement of three endothelial mediators, the
NO, the endothelin and the prostaglandins (Corda et al., 1998; Mebazaa et al., 2001; Mink et
al., 2005). Based on these previous results, we investigated the potential involvement of these
three paracrine mediators in the increased β1-AR-induced contractility at the early phase of
the septic shock. The increased β1-AR-induced contractility was not modified by L-NMMA
or bosentan but was abolished by COX inhibitors such as indomethacin. COX are the rate
limiting enzymes in prostaglandins biosynthesis pathways (Rouzer & Marnett, 2009).
As β1-AR overstimulation is deleterious in HF, and probably during the septic shock,
our data demonstrated a potential beneficial effect of COX inhibitors in the treatment of the
early septic cardiomyopathy, since COX induced an increased β1-AR cardiac response in LPS
rats. This is reinforced by recent discrepancies concerning the use of β1-AR agonists at the
early septic shock since several authors recommended the use of β1-AR antagonists (Rudiger,
2010). We confirmed the beneficial effect of COX inhibitors through survival experiments
where we demonstrated that endotoxemic rats treated with indomethacin one hour after the
induction of the shock presented an increased survival rate over 48h. These effects of
indomethacin confirmed results from numerous previous preclinical reports (Aronoff, 2012).
All together, these data demonstrate for the first time the involvement of COX in the
increased β1-AR cardiac contractility at the early endotoxemic shock and the therapeutic
relevance of COX inhibitors at the early septic shock. However, clinical studies using COX
inhibitors did not demonstrate any beneficial effects during the septic shock (Haupt et al.,
1991; Bernard et al., 1997; Memis et al., 2004). Such regulation of β-AR function through
COX has already been demonstrated on isolated equine artery where COX2 isoform
decreased the β2-AR induced vasodilation (Zizzadoro et al., 2011).
152
We thus inhibited independently both COX isoforms to evaluate their relative
involvement in the effects observe with indomethacin we demonstrated that both COX1 and
COX2 were involved in this phenomenon. However, isoproterenol potency, in the presence
β2- and β3-AR antagonists, was lower when using the COX2 inhibitor compared to the COX1
inhibitor which is consistent with a major involvement of COX2 in this abolished β1-ARinduced increased contractility. However, we were did not demonstrate an increased in COX2
protein level in the left ventricle from LPS rats which is in disagreement with previous reports
(Tunctan et al., 2013). It‟s not surprising that only three hours after the LPS induction protein
levels were not modified. Moreover as EE cells represent only few cells in the myocardium,
it‟s possible that modifications of proteins levels in these cells could not be detected by our
approach. While the used of COX2 specific inhibitors could appears more attractive,
numerous clinical trials demonstrates that these molecules mainly increased cardiovascular
risks (Bresalier et al., 2005; Nussmeier et al., 2005) through the increased of coagulation
processes (Cannon & Cannon, 2012). As such coagulation processes are already increased
during the septic shock (Levi et al., 2013), the use of COX2 inhibitor should be reconsider.
Conclusions
In summary, our works confirmed the therapeutic relevance of β1-AR antagonists and
identify the COX as interesting therapeutic targets in the regulation of β1-AR overstimulation
at the initial stage of the septic shock. However these drugs also produced adverse effects
which limit their clinical use. In this context, investigations for new therapeutic targets remain
necessary. A better understanding of the EE regulation of the β1-AR contractility and
investigation of COX products, prostaglandins and there receptors, is of particular interest in
the identification of such targets.
Acknowledgements
We would like to thank Chrystelle Bailly, Stéphanie Lemarchand-Mindé, Amandine
Lefebvre and Patricia Charpentier for animal care. We also would like to thank Claire Toquet
and Paul Pilet for electron microscopy experiments acquisitions and analysis. This study was
financially supported by the "Fédération Française de Cardiologie" and the "Fondation de
France".
153
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156
Figures legends
Figure 1. Effects of lipopolysaccharide (LPS) administration on β-adrenergic-induced
contractility. Results were expressed as the percentage of contraction from the basal
contraction. Values represent mean ± SEM of a minimum of 6 rats per group. * P<0.05 after
two-way analysis of variance with repeated measures followed by Student-Newman-Keuls
test as post hoc analysis.
Figure 2. Effects of lipopolysaccharide (LPS) administration on left ventricle protein
expression and papillary muscle contractility of β1-AR (A and B), β2-AR (C and D), and
β3-AR (E and F) subtypes. Positive control of protein presence was evaluated with GAPDH.
Results were expressed as the percentage of contraction from the basal contraction.
Isoproterenol concentration-curves were constructed in the presence of 1 µM ICI 118,551 and
L-748,337 to evaluate β1-AR response, 1 µM CGP 20712 and L-748,337 to evaluate β2-AR
response and 10 µM Nadolol to evaluate β3-AR response. Values represent mean ± SEM of a
minimum of 5 rats per group. * P<0.05 after a Mann-Whitney t test or a two-way analysis of
variance with repeated measures followed by Student-Newman-Keuls test as post hoc
analysis.
Figure 3. Effects of Triton-X100 pretreatment on endocardial endothelium (EE)
integrity. Cardiomyocytes mitochondria (Mi) and sarcomere (Sa) integrities were evaluated
using electron microscopy in papillary muscle with preserved (A left) or altered (A right) EE.
Papillary muscle contractility was evaluated with preserved or altered EE. Arrow: disruption
site of the plasma membrane of endocardial endothelial cells, Nu: Nucleus. Values represent
mean ± SEM of a minimum of 7 rats per group. * P<0.05 after a two-way analysis of variance
with repeated measures followed by Student-Newman-Keuls test as post hoc analysis.
Figure 4. Effects of (A) endocardial endothelium (EE) and (B) NOS and endothelin
signaling pathways on the β1-adrenergic response in LPS rats. Results were expressed as
the percentage of contraction from the basal contraction. Isoproterenol responses were
performed in presence of 1 µM ICI 118,551 and L-748,337. β1-AR response was evaluated in
CTRL and LPS papillary muscle with or without EE. In LPS papillary muscles, β 1-AR
response was evaluated in the presence of L-NMMA or Bosentan. Values represent mean ±
SEM of a minimum of 5 rats per group. * P<0.05 after a two-way analysis of variance with
repeated measures followed by Student-Newman-Keuls test as post hoc analysis.
157
Figure 5. Effects of (A) COX signaling pathway on the β1-adrenergic response in LPS
rats and left ventricle protein expression of (B) COX1 and (C) COX2 isoformes. Results
were expressed as the percentage of contraction from the basal contraction. Isoproterenol
responses were performed in presence of 1 µM ICI 118,551 and L-748,337. β1-AR response
was evaluated in LPS papillary muscles with or without endocardial endothelium and in the
presence of indomethacin, SC560 or NS398. Positive control of COX protein presence was
evaluated with GAPDH. Values represent mean ± SEM of a minimum of 5 rats per group.
* P<0.05 after a two-way analysis of variance with repeated measures followed by Student-Newman-Keuls test as post hoc analysis or a Mann-Whitney t test.
Figure 6. Effects of indomethacin on 48 h survival after LPS administration.
* P<0.05 vs CTRL and $ P<0.05 vs LPS after a Mantel-Cox test.
158
Table 1. Hemodynamic and cardiac parameters of control (CTRL) and LPS rats.
CTRL (n=6-8)
LPS (n=6-10)
87.9 ± 7.1
60.1 ± 7.1*
330.2 ± 16.6
488.8 ± 23.4*
Ejection fraction (%)
83.8 ± 2.7
74.5 ± 2.2*
Shortening fraction (%)
48.6 ± 3.0
38.6 ± 1.8*
Isovolumic Relaxation Time (ms)
24.13 ± 1.77
29.26 ± 2.31*
Early diastolic peak flow velocity (m.s-1)
0.978 ± 0.048
0.579 ± 0.057*
Mean Arterial Pressure (mmHg)
Heart Rate (bpm)
Values represent mean ± SEM. * P<0.05 LPS vs CTRL after a Mann Whitney t test.
159
Table 2. Binding site characteristics of [3H]-CPG-12177 on left ventricles from CTRL
and LPS rats.
CTRL (n=4)
LPS (n=4)
KD (pM)
269.0 ± 28.0
218.3 ± 31.8
Bmax (fmol.mg-1 total tissue protein)
41,72 ± 2,18
44,63 ± 3,24
β1-AR (%)
65.50 ± 1.10
68.63 ± 1.49
Values represent mean ± SEM. KD : equilibrium dissociation constant; Bmax : maximum
binding capacity.
160
Table 3. Efficiencies and potencies of isoproterenol on papillary muscle from control (CTRL
and LPS rats
Protocol
response
Antagonist(s)
β-AR
/
β1-AR
ICI + L
Inhibitor
Antagonist
Emax (%)
pD2
Endo
CTRL
LPS
CTRL
LPS
/
+
149.2 ± 8.8
306.2 ± 31.4* 7.76 ± 0.16 7.61 ± 0.10
/
+
275.8 ± 34.8
534.2 ± 83.2* 6.69 ± 0.11 6.37 ± 0.19
/
-
215.4 ± 71.6
245.8 ± 29.2‡ 5.23 ± 0.61‡ 6.10 ± 0.17
L-NMMA
+
198.7 ± 18.0
446.5 ± 53.6* 6.66 ± 0.19 6.19 ± 0.14
Bosentan
+
315.2 ± 51.9
642.3 ± 123.3* 6.69 ± 0.11 6.54 ± 0.08
Indo
+
308.6 ± 63.1
312.1 ± 58.9† 6.28 ± 0.15 6.28 ± 0.18
SC560
+
231.2 ± 26.7
261.0 ± 30.8† 6.54 ± 0.30 6.87 ± 0.09
NS398
+
188.2 ± 15.7
257.8 ± 40.7† 6.02 ± 0.25† 5.96 ± 0.18§
β2-AR
CGP + L
/
+
172.6 ± 16.6
198.8 ± 43.7
nd
nd
β3-AR
Nadolol
/
+
218.0 ± 27.5
213.6 ± 65.7
nd
nd
Values represent mean ± SEM of a minimum of 3 rats per group. Emax: Maximal Effect; Endo:
endothelium; CGP: CGP 20712A; ICI: ICI 118,551; Indo: indomethacin; L: L-748,337; nd:
value not determined. * P<0.05 LPS vs matching CTRL; † P<0.05 CTRL/LPS +
inhibitor/antagonist vs matching CTRL/LPS; ‡ P<0.05 CTRL/LPS endo- vs matching
CTRL/LPS; § P<0.05 LPS NS398 vs LPS SC560 after a two-way ANOVA (concentration,
treatment) with repeated measures completed when appropriate by a Bonferroni test as post
hoc analysis for Emax and after a Mann Whitney t test for pD2 values.
161
Figure 1.
peak tension (%)
700
CTRL (n=7)
500
LPS (n=6)
300
*
100
Basal
-10
-9
-8
-7
-6
-5
-4
log [Isoproterenol] (M)
162
Figure 2.
A
B
LPS
peak tension (%)
CTRL
150
100
LPS (n=5)
*
400
0
CTRL (n=7)
Basal
LPS (n=7)
-10
-9
-8
-7
-6
-5
-4
log [Isoproterenol] (M)
D
LPS
peak tension (%)
CTRL
β2 -AR (55 kD)
GAPDH
 2 -AR relative expression
to GAPDH (% of CTRL)
CTRL (n=6)
200
C
150
100
800
600
CTRL (n=6)
LPS (n=6)
400
200
*
50
0
CTRL (n=7)
Basal
LPS (n=7)
-10
-9
-8
-7
-6
-5
-6
-5
log [Isoproterenol] (M)
E
F
CTRL
150
100
800
LPS
β3 -AR (72 kD)
GAPDH
 3 -AR relative expression
to GAPDH (% of CTRL)
600
*
50
*
peak tension (%)
 1 -AR relative expression
to GAPDH (% of CTRL)
β1 -AR (72 kD)
GAPDH
800
600
CTRL (n=6)
LPS (n=6)
400
200
50
0
CTRL (n=7)
LPS (n=7)
Basal
-10
-9
-8
-7
log [Isoproterenol] (M)
163
Figure 3.
A
Nu
Nu
BL
BL
Mi
Sa
Mi
Sa
500nm
500nm
B B
E E + (n=7)
100
Contraction (%)
E E - (n=13)
50
*
0
*
0
50
100
150
Time (ms)
164
Figure 4.
B
800
600
CTRL (n=6)
LPS (n=5)
400
CTRL EE- (n=6)
**
LPS EE- (n=6)
200
peak tension (%)
peak tension (%)
A
800
600
LPS (n=5)
LPS EE- (n=6)
400
LPS + 1M L-NMMA (n=6)
*
LPS + 10M Bosentan (n=5)
200
Basal
-10
-9
-8
-7
-6
-5
-4
Basal
log [Isoproterenol] (M)
-10
-9
-8
-7
-6
log [Isoproterenol] (M)
165
-5
-4
Figure 5.
A
peak tension (%)
800
600
LPS (n=5)
LPS EE- (n=6)
400
*
LPS + 10M Indo (n=6)
LPS + 3M SC560 (n=5)
LPS + 3M NS398 (n=5)
200
Basal
-10
-9
-8
-7
-6
-5
-4
log [Isoproterenol] (M)
B
C
COX1 relative expression
to GAPDH (% of CTRL)
200
C LPS CTRL
COX2(70 kD)
GAPDH
ns
150
100
50
0
CTRL (n=6)
L
LPS
LPS (n=6)
COX2 relative expression
to GAPDH (% of CTRL)
CTRL
COX1(68 kD)
GAPDH
200
150
ns
100
50
0
CTRL (n=11) LPS (n=11)
166
Figure 6.
Percent survival
100
CTRL (n=5)
75
LPS (n=7)
LPS + Indomethacine (n=9)
50
25
*$
0
*
0
8
16
24
32
40
Hours
167
48
4.1.4. Conclusion générale
Le premier objectif de ces études était la caractérisation d‟un modèle pertinent pour
l‟étude des altérations cardiovasculaires à la phase précoce du choc septique. Après avoir
injecté 5 mg.kg-1 de LPS en IV à des rats de 10 semaines, nous avons pu mettre en évidence
chez ces animaux, 3h après injection, une hypotension artérielle associée à une tachycardie.
De plus, ils présentent une altération cardiaque, caractérisée par une réduction des fonctions
systolique et diastolique. Enfin, nous avons pu mettre en évidence des modifications des
paramètres biochimiques sanguins caractéristiques du choc septique associant une acidose
métabolique compensée et une dysfonction rénale. D‟autres altérations, comme une
dysfonction des cellules endothéliale et des CML vasculaires (Figure 29) et qui n‟ont pas été
détaillées dans ces manuscrits, viennent compléter la caractérisation de ce modèle.
A
B
100
0
80
% Contraction
% Relaxation
20
40
60
CTRL (n=6)
60
*
LPS (n=6)
40
20
80
*
CTRL (n=6)
LPS (n=6)
0
100
-9
-8
-7
-6
-5
-9
Log [Acétylcholine] (M)
-8
-7
-6
-5
Log [Phényléphrine] (M)
Figure 31. Effets du choc endotoxémique sur la fonction endothéliale (A) et musculaire lisse (B) évaluées
au niveau d’aorte thoraciques.
* :P<0,05 CTRL vs LPS
Ainsi, ce modèle possède donc un profil proche de celui du patient à la phase initiale
du choc septique caractérisé par une hypotension artérielle et une tachycardie auxquelles sont
associées des défaillances d‟organes et une forte dysfonction endothéliale. Ceci nous a donc
autorisé à utiliser ce modèle pour évaluer les modifications protéiques et fonctionnelles des
trois sous-types de récepteurs β-AR vasculaires et cardiaques, ainsi que l‟influence de la
dysfonction endothéliale dans ce remodelage.
Nous avons, dans un premier temps, mis en évidence un remodelage précoce du
système β-AR au niveau vasculaire avec des conséquences fonctionnelles importantes. Ainsi,
168
au niveau d‟artères de conductance comme de résistance, nous avons pu démontrer une
vasorelaxation β-AR globalement altérée. Cette altération a été confirmée sur un modèle plus
intégré grâce à la technique du rein isolé perfusé. En revanche, il existe un maintien voire une
augmentation de la vasorelaxation β2-AR malgré une diminution du taux protéique des β2-AR
au niveau des aortes thoraciques des animaux LPS. De façon intéressante, alors que dans des
conditions contrôles, la vasorelaxation β2-AR est dépendante de récepteurs localisés à la
membrane des cellules endothéliales, chez les animaux LPS, cette vasorelaxation est
dépendante des β2-AR localisés à la membrane des CML. Nos résultats suggèrent donc la
mobilisation d‟un pool de récepteurs β2-AR à la membrane des CML au cours de la phase
précoce du choc endotoxémique afin de limiter les altérations de la vasorelaxation
dépendantes de la dysfonction endothéliale démontrée dans ce modèle (Figure 30).
Cependant, aucune étude n‟a été réalisée afin d‟évaluer la localisation des récepteurs β2-AR à
la membrane et/ou dans le cytosol des CML. De même, les voies de signalisations des
récepteurs β2-AR vasculaires n‟ont pas été étudiées dans notre modèle.
Dans un second temps, nous avons démontré, au niveau cardiaque, une potentialisation
de la contractilité β-AR dépendante des récepteurs β1-AR. De plus, grâce à des études de
binding permettant d‟évaluer la densité membranaire des récepteurs β1- et β2-AR dans leur
environnement natif, nous avons pu mettre en évidence que la densité membranaire des
récepteurs β1-AR n‟était pas modifié au niveau du VG des animaux LPS. Toutefois ces
résultats n‟indiquent pas l‟effet fonctionnel potentiellement induit par la fixation d‟agonistes à
ces récepteurs β1-AR. Par la suite, nous avons mis en évidence que cette potentialisation
β1-AR était dépendante de la dysfonction des cellules endothéliales endocardiques et
notamment de la voie des COX. Bien que l‟augmentation de la contractilité β1-AR semble
bénéfique à court terme sur la contractilité cardiaque, les effets néfastes d‟une stimulation β1AR prolongée (Mangmool et al., 2010) nous amènent à penser que ce mécanisme de
potentialisation joue à plus long terme un rôle délétère dans la cardiomyopathie du choc
septique. Dans ce sens, le traitement précoce des rats LPS, une heure après induction du choc,
avec de l‟indométacine, un inhibiteurs des COX, améliore la survie de ces animaux à 48h par
rapport à des animaux LPS non traités. On peut supposer que cet effet bénéfique implique une
inhibition de l‟interaction existant entre la voie des COX et la voie de signalisation du
récepteur β1-AR et des effets néfastes qu‟elle peut induire.
Ces travaux suggèrent l‟intérêt potentiel de l‟utilisation conjointe d‟agonistes β2-AR et
d‟antagonistes β1-AR dans la prise en charge des altérations cardiovasculaires du choc
septique. Cette stratégie thérapeutique s‟est déjà révélée efficace dans la cardiomyopathie
169
dilatée post infarctus du myocarde (Ahmet et al., 2008). Dans ce modèle de ligature coronaire
gauche chez le rat, un traitement associant métoprolol (antagoniste β1-AR) et fenoterol
(agoniste β2-AR) améliore la survie à un an des animaux, grâce notamment à une réduction de
l‟apoptose myocardique et une réduction de la taille de l‟infarctus. Cela permet notamment
d‟améliorer plusieurs paramètres cardiaques parmi lesquels la FE ainsi que les volumes
télédiastolique et télésystolique. Les dernières conférences de consensus internationales
recommandent cependant l‟utilisation de la dobutamine (Dellinger et al., 2013), considérée
comme un agoniste β1-AR (Schiffelers et al., 1999). Nos résultats au niveau des anneaux
d‟aorte de rats LPS montrent cependant une action également β2-AR de la dobutamine, ce qui
a déjà été mis en évidence au niveau vasculaire (Waldeck, 2011). De possibles effets
bénéfiques de la dobutamine par action sur les récepteurs β2-AR au niveau vasculaire
semblent envisageables (De Backer et al., 2006) bien qu‟une étude récente ne montre pas
d‟amélioration de la microcirculation sublinguale après un traitement à la dobutamine chez les
patients en choc septique depuis 24 à 48h (Hernandez et al., 2013). De plus, l‟utilisation de la
dobutamine, associée aux taux de catécholamines circulantes importants (Ostrowski et al.,
2013), va conduire à une stimulation soutenue des β1-AR cardiaques pouvant entraîner de
nombreux effets délétères. Dans ce sens, de nombreuses études précliniques mettent en avant
un effet potentiellement bénéfique d‟antagonistes β1-AR à demi-vie courte, comme l‟esmolol
ou le landiolol, dans le traitement de la cardiomyopathie du choc septique (Rudiger, 2010).
Une étude clinique rapporte que l‟utilisation d‟esmolol, peut diminuer la FC de patients en
choc septique sans altérer les autres paramètres cardiaques (Balik et al., 2012). Cette étude est
cependant à considérer avec précaution en raison de limites méthodologiques (Zante &
Wirtz, 2013). En effet, la dose d‟esmolol administrée dans cette étude n‟est pas adaptée au
poids des patients. De plus, le protocole antalgique et analgésique utilisé n‟est pas détaillé
alors que de tels traitements peuvent induire des effets directs et indirects sur le système
nerveux autonome. Enfin, aucune évaluation de l‟effet immunomodulateur de l‟esmolol n‟est
réalisé dans cette étude alors que les récepteurs β1-AR sont connus pour induire des effets
pro-inflammatoires (Grisanti et al., 2010), amplifiant la réponse inflammatoire à l‟origine du
choc septique. Une autre étude clinique évaluant l‟utilisation de l‟esmolol afin de réduire la
FC au cours du choc septique vient de terminer l‟inclusion de 154 patients (Morelli, 2013).
Les résultats pour cette étude ne sont cependant pas encore connus.
L‟utilisation d‟agonistes β2-AR semble également une approche thérapeutique
intéressante d‟autant plus que ces derniers, en plus des effets attendus au niveau de la
microcirculation, possèdent (i) des effets immunosuppresseurs, pouvant prévenir la
170
défaillance d‟organes dans le choc septique (Eijkelkamp et al., 2004), (ii) des effets
bénéfiques au niveau hépatique (Izeboud et al., 2004) et (iii) un rôle protecteur au niveau
rénal dans un modèle de rat infecté avec E. Coli (Nakamura et al., 2010). Une étude
préclinique réalisée dans un modèle de rat en choc endotoxémique met en avant qu‟un
traitement par de la terbutaline, un agoniste β2-AR, prévient en partie l‟apparition de
l‟hypotension ainsi que la tachycardie et diminue les taux plasmatiques de TNF-α, cytokine
pro-inflammatoire majeure (Liaw et al., 2003). De plus, une étude récente démontre qu‟une
stimulation β2-AR inhibe l‟activité du facteur de transcription NF-κB dans le cerveau de rat
par augmentation de son inhibiteur, l‟IκB (Ryan et al., 2013). Le NF-κB étant l‟un des
médiateurs majeurs de la libération de cytokines pro-inflammatoires, cette propriété des
agonistes β2-AR pourrait être utile dans le traitement du choc septique. Par ailleurs, NF- κB
est impliqué dans l‟augmentation de l‟expression de COX2 et de iNOS. Réduire les niveaux
protéiques de ces 2 enzymes pourrait également s‟avérer bénéfique. En effet, comme nous
l‟avons démontré, COX2 est impliquée dans le remodelage fonctionnel du récepteur β1-AR au
niveau cardiaque. De plus, la surexpression de iNOS participe à la dysfonction cardiaque
(Cohen et al., 2006), vasculaire (Su et al., 2007) et endothéliale (Matsuda & Hattori, 2007) à
la phase précoce du choc septique.
Il apparait donc pertinent d‟évaluer le potentiel thérapeutique de cette association
antagoniste β1-AR - agoniste β2-AR dans notre modèle de rat en choc endotoxémique. Des
molécules possédant les deux propriétés existent : le céliprolol et le nébivolol. Seul le
nébivolol a reçu une autorisation de mise sur le marché en France. Cependant, plusieurs
limites existent quant à l‟utilisation du nébivolol dans le traitement de la dysfonction
cardiovasculaire septique. En effet, le nébivolol possède également une activité β3-AR
agoniste responsable d‟un effet inotrope négatif NO-dépendant qui pourrait s‟avérer délétère
dans le choc septique. De plus, la cinétique du nébivolol et notamment sa demi-vie longue le
rend peu compatible avec son utilisation dans le contexte du choc septique et ce d‟autant plus
qu‟il semble que les antagonistes β1-AR les plus efficaces dans le traitement du choc septique
soient des antagonistes à demi-vie courte.
Il sera également intéressant d‟évaluer l‟intérêt de traitements ayant comme cible la
dysfonction endothéliale très précoce et constamment retrouvée dans le choc septique. Nous
avons donc testé différentes voies de signalisation impliquant l‟endothélium. Il est apparu
dans notre modèle, que les COX endothéliales, et notamment l‟isoforme COX2, sont
impliquées dans le remodelage fonctionnel β1-AR observé au niveau cardiaque. Les COX
endothéliales induisent notamment, la production de plusieurs prostanoïdes qui vont agir sur
171
divers types cellulaires, dont les cardiomyocytes, grâce à la liaison à leurs récepteurs
spécifiques. Il est important de relever que la surexpression des COX2 joue également un rôle
important dans les altérations vasculaires dépendantes de la dysfonction endothéliale et
notamment au niveau microcirculatoire (Katagiri et al., 2004; Virdis et al., 2005). Le TxA2
apparait particulièrement impliqué dans ces phénomènes.
Ces données suggèrent que l‟utilisation d‟inhibiteurs de COX puisse avoir un effet
bénéfique dans la dysfonction cardiovasculaire du choc septique. Cependant, l‟utilisation de
tels inhibiteurs au cours du choc septique a déjà été testée dans trois études cliniques et n‟a
pas montré d‟effets bénéfiques sur la survie des patients. Deux études ont utilisés de
l‟ibuprofène, un inhibiteur non sélectif des COX, (Haupt et al., 1991; Bernard et al., 1997) et
une troisième a utilisée du lornoxicam, un inhibiteur préférentiel de COX2, (Memis et al.,
2004). Cependant, une seule de ces études rapporte une administration du traitement
rapidement après la mise en évidence du choc septique et donc potentiellement dans la phase
précoce de ce même choc (Haupt et al., 1991). De plus, de nombreuses études cliniques
rapportent les risques cardiovasculaires associés à l‟utilisation d‟inhibiteurs de COX2
(Bresalier et al., 2005; Graham et al., 2005; Nussmeier et al., 2005; Solomon et al., 2005;
McGettigan & Henry, 2006). Ces risques cardiovasculaires s‟expliquent principalement par
une diminution de la production de PGI2, et de leurs effets antiagrégants, sans diminution de
la production de TxA2, qui possède des effets pro-agrégants, via les COX1 localisées au
niveau plaquettaire (Cannon & Cannon, 2012). Ceci, associé à l‟activation des cascades de
coagulation au cours du choc septique (Levi et al., 2013) limite d‟autant plus l‟utilisation de
tels molécules dans la thérapeutique de cette pathologie.
L‟utilisation d‟antagonistes des récepteurs aux prostanoïdes pourrait donc être une
autre voie thérapeutique intéressante. Il a déjà été démontré l‟effet bénéfique, dans un modèle
de rat en choc endotoxémique, de l‟utilisation d‟un antagoniste des récepteurs aux PGI2 (IP),
le CAY-10441. Cet antagoniste permet notamment dans cette étude d‟atténuer l‟hypotension
et la tachycardie observée dans le modèle utilisé (Hocherl et al., 2008). Il sera également
intéressant de mieux comprendre les interactions existantes entre les voies de signalisations
activées en aval des COX et la voie de signalisation du récepteur β1-AR. En effet, des
interactions de ce type ont déjà été mises en évidence (Fontana et al., 2007; Liu et al., 2012;
Riise et al., 2012). Cependant, ces études sont contradictoires et demandent une étude plus
approfondie dans notre modèle. En effet, deux de ces études démontrent en particulier
l‟implication des PDE (Fontana et al., 2007; Liu et al., 2012) alors qu‟une autre l‟exclue
(Riise et al., 2012). Les inhibiteurs de PDE, comme le sildénafil, étant déjà utilisé en clinique
172
il sera important de mieux comprendre l‟implication de ces dernières dans la dysfonction
cardiaque du choc septique car cela pourrait rapidement amener à une utilisation clinique.
Cependant, certains de ces inhibiteurs comme la milrinone ont déjà été testés au cours du choc
septique mais ont montré peu d‟intérêts du fait de leurs effets vasodilatateurs (Schmittinger et
al., 2008). De plus, le conditionnement de ces médicaments (administration per os) limite leur
utilisation chez des patients sous ventilation mécanique.
173
4.2. Caractérisation d’un nouveau modèle d’insuffisance cardiaque à
fraction d’éjection préservée
4.2.1. Introduction
Plus de la moitié des patients porteurs d‟une IC présentent une forme d‟IC associée à
une fonction systolique dite préservée, l‟ICFEp. L‟ICFEp étant classiquement associée avec le
vieillissement, une augmentation de l‟incidence de l‟ICFEp d‟environ 1% par an est décrite
(Owan et al., 2006), ce qui fait de cette pathologie un problème de santé publique majeur et
grandissant. L‟allongement de la durée de vie des patients grâce à l‟amélioration de la prise en
charge des pathologies cardiovasculaires et des co-morbidités du vieillissement (Cheng &
Vasan, 2011; Lam et al., 2011) explique partiellement l‟augmentation de l‟incidence de
l‟ICFEp. Cependant, l‟arsenal thérapeutique à disposition des cliniciens est encore à l‟heure
actuelle peu efficace. En effet, la plupart des agents thérapeutiques utilisés pour le traitement
de l‟ICFEp sont des molécules ayant fait leurs preuves dans le traitement l‟ICFEa mais
n‟ayant démontré que peu voir aucune efficacité réelle dans le traitement de l‟ICFEp (From &
Borlaug, 2011).
Une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques de l‟ICFEp ainsi
que de son évolution au cours du temps est donc primordiale afin de permettre la découverte
de nouvelles cibles thérapeutiques et la mise en place d‟une prise en charge réellement
adaptée à cette pathologie. Les années 2000 ont permis en ce sens une grande avancée dans la
définition et la caractérisation de cette pathologie aboutissant récemment au paradigme de
l‟ICFEp (Paulus &
Tschope, 2013). Ces avancées sont toutefois limitées en raison de
l‟absence de modèles animaux pertinents de l‟ICFEp. En effet, les modèles animaux utilisés
actuellement présentent de nombreuses différences avec le patient souffrant d‟ICFEp. A titre
d‟illustration, le modèle classiquement utilisé dans la littérature est le rat "Dahl/salt-sensitive"
qui développe, en présence d‟un régime hyper-salé, une HTA sévère, une rétention hydrique
et une insuffisance rénale, aboutissant à des troubles de la diastole en raison notamment d‟une
hypertrophie ventriculaire (Klotz et al., 2006). Dans ce modèle, les troubles observés sont très
précoces, sévères, et rapidement associés à une altération de la fonction systolique, alors que
ces caractéristiques ne sont pas retrouvées chez les patients souffrant d‟ICFEp. De plus, les
études utilisant ce modèle sont menées le plus souvent chez de jeunes mâles alors que
l‟ICFEp touche préférentiellement des femmes, ménopausées. Enfin, l‟ICFEp est associée à
de nombreuses comorbidités parmi lesquelles l‟obésité, le diabète ou encore l‟HTA modérée.
A titre de comparaison, les rats Dahl/salt-sensitive, présentant une dysfonction diastolique
174
sans altération de la FE, sont amaigris et présentent une HTA sévère avec une élévation de la
pression artérielle moyenne de plus de 40 mmHg par rapport aux rats contrôles (Klotz et al.,
2006). D‟autres modèles pour l‟étude de l‟ICFEp existent. Alors que certains d‟entre eux,
comme le modèle de rat ZSF1 obèse (Hamdani et al., 2013), intègrent le diabète et l‟obésité
comme comorbidités, d‟autres privilégient l‟influence du sexe comme le modèles de la ratte
mRen2.Lewis (Groban et al., 2008), qui présente également un léger surpoids, ou le modèle
de la truie hypertendue (Rienzo et al., 2012). Cependant, l‟ensemble des modèles
précédemment cités ne sont pas étudiés à des âges avancés. D‟autres modèles, comme le
modèle de la souris sénescente SAM (Reed et al., 2011) ou du chien hypertendu (Hart et al.,
2001), prennent en compte l‟effet du vieillissement dans le développement de la pathologie.
Enfin, certains modèles n‟intègrent aucune des comorbidités de l‟ICFEp comme les modèles
de constriction aortique chez le rat (Litwin et al., 1995) et la souris (Moens et al., 2008) ainsi
que le modèle souris DOCA/Salt (Silberman et al., 2010). Bien que l‟ensemble de ces
modèles présentent des caractéristiques proches de l‟ICFEp, permettant des études
approfondies de certaines altérations rencontrées dans cette pathologie, aucun d‟entre eux
n‟est réellement pertinent pour étudier le développement de la pathologie ainsi que les
mécanismes physiopathologiques à l‟échelle de l‟organisme entier.
Dans ce contexte, l‟objectif de ce travail de thèse a été de caractériser un modèle de rat
transgénique surexprimant le récepteur β3-AR humain au niveau des cellules endothéliales
(Tgβ3). Ce modèle, crée dans l‟équipe pour évaluer l‟influence du récepteur β3-AR dans
l‟HTA et son rôle dans l‟IC, développe avec l‟âge une ICFEp. Le laboratoire possède
actuellement 5 lignées transgéniques surexprimant le transgène, nommées de F19, F20, F21,
F22 et F23. Une caractérisation hémodynamique de ces lignées à l‟âge de 30 semaines a été
réalisée afin de sélectionner la lignée présentant le profil hémodynamique le plus proche des
altérations retrouvées dans l‟ICFEp. Une étude histologique afin de caractériser un éventuel
remodelage myocardique a également été réalisée. Les résultats concernant seulement 2 de
ces lignées sont présentés dans cette étude. En effet, les effectifs étudiés concernant les autres
lignées sont trop faibles pour permettre une interprétation pertinente des résultats obtenus.
4.2.2. Résultats
4.2.2.1. Caractérisation morphologique
A l‟exception de la taille des femelles de la lignée F19, le génotype n‟influence ni le
poids, ni la taille des animaux, représentée ici par la longueur du tibia. A l‟inverse,
indépendamment de la lignée étudiée ou du génotype comparé, les mâles pèsent plus lourds et
175
sont plus grands que les femelles (Tableau XX). Ainsi, une comparaison hémodynamique des
animaux est donc possible selon le génotype des animaux mais pas selon leur sexe. En effet,
la morphologie des animaux influençant les paramètres morphométriques et hémodynamiques
étudiés, les résultats s‟en trouveraient faussés et ce d‟autant plus que leur indexation au poids
et à la taille ne font pas l‟objet d‟un consensus pour tous les paramètres.
Tableau XX. Paramètres morphologiques des animaux des lignées F19 et F20 âgés de 30 semaines.
Poids (g)
Longueur du tibia (mm)
F19
F20
F19
F20
Sauvages
546 ± 10 (n=10)
622 ± 21 (n=8)
58,3 ± 0,2 (n=10)
60,4 ± 0,7 (n=8)
Tgβ3
552 ± 9 (n=8)
628 ± 17 (n=8)
58,2 ± 0,4 (n=8)
60,6 ± 0,4 (n=8)
Sauvages
307 ± 4* (n=4)
363 ± 7* (n=10)
51,8 ± 0,7* (n=4)
53,3 ± 0,4* (n=10)
Tgβ3
294 ± 6* (n=11)
365 ± 15* (n=5)
50,1 ± 0,2*§ (n=11)
53,3 ± 0,6* (n=5)
Mâles
Femelles
Tgβ3 : rats transgéniques surexprimant le récepteur β3-AR humain à la membrane des cellules endothéliales. * :
P < 0,01 vs mâles de même génotype, § : P < 0,05 vs sauvages de même sexe
4.2.2.2. Caractérisation morphométrique
La comparaison des paramètres morphométriques par échocardiographie ne met en
évidence aucune différence entre les rats sauvages et Tgβ3 de même sexe, quelque soit la
période du cycle cardiaque à laquelle sont comparés les paramètres (télédiastole ou
télésystole) et la lignée étudiée (Tableau XXI).
Tableau XXI. Paramètres morphométriques cardiaques évalués par échocardiographie des animaux des
lignées F19 et F20 âgés de 30 semaines.
F19
Epaisseurs
(en mm)
Mâles
F20
Femelles
Mâles
Femelles
Sauvages
(n=10)
Tgβ3
(n=8)
Sauvages
(n=4)
Tgβ3
(n=11)
Sauvages
(n=8)
Tgβ3
(n=8)
Sauvages
(n=10)
Tgβ3
(n=5)
PPTDVG
1,75 ± 0,06
1,75 ± 0,03
1,52 ± 0,05
1,53 ± 0,05
1,79 ± 0,03
1,78 ± 0,02
1,56 ± 0,05
1,64 ± 0,03
PPTSVG
2,72 ± 0,08
2,78 ± 0,06
2,38 ± 0,04
2,41 ± 0,08
2,76 ± 0,07
2,92 ± 0,09
2,59 ± 0,12
2,67 ± 0,16
PATDVG
1,70 ± 0,03
1,67 ± 0,04
1,60 ± 0,04
1,54 ± 0,03
1,87 ± 0,04
1,87 ± 0,09
1,58 ± 0,04
1,62 ± 0,04
PATSVG
2,28 ± 0,05
2,28 ± 0,04
2,16 ± 0,10
2,20 ± 0,04
2,44 ± 0,06
2,45 ± 0,05
2,20 ± 0,05
2,19 ± 0,04
DTDVG
8,05 ± 0,17
8,09 ± 0,22
6,83 ± 0,31
6,65 ± 0,16
8,51 ± 0,23
8,51 ± 0,20
7,00 ± 0,14
7,17 ± 0,16
DTSVG
4,69 ± 0,15
4,80 ± 0,18
3,86 ± 0,21
3,57 ± 0,13
4,83 ± 0,17
4,91 ± 0,13
3,60 ± 0,21
3,82 ± 0,17
DTDVG : diamètre télédiastolique du ventricule gauche, DTSVG : diamètre télésystolique du ventricule gauche,
PATDVG : paroi antérieure du ventricule gauche en télédiastole, PATSVG : paroi antérieure du ventricule gauche
176
en télésystole, PPTDVG : paroi postérieure du ventricule gauche en télédiastole, PPTSVG : paroi postérieure du
ventricule gauche en télésystole, Tgβ3 : rats transgéniques surexprimant le récepteur β3-AR humain à la
membrane des cellules endothéliales.
4.2.2.3. Caractérisation hémodynamique
La comparaison des paramètres de la fonction cardiaque enregistrés par
échocardiographie est possible car aucune différence de FC n‟est observée entre les rats
sauvages et Tgβ3 de même sexe appartenant à une même lignée.
Aucune différence des paramètres de la fonction cardiaque n‟est observée entre les rats
sauvages et Tgβ3 de même sexe appartenant à la lignée F19 (Tableau XXII). Concernant la
lignée F20, on observe chez les mâles Tgβ3 un ralentissement de la vitesse de déplacement de
l‟anneau mitral (onde E‟) conduisant à une augmentation du rapport E/E‟ par rapport aux
mâles sauvages. Chez les femelles, pour l‟ensemble des paramètres comparés entre les
animaux sauvages et Tgβ3 aucune différence statistique n‟est mise en évidence cependant une
tendance au raccourcissement du temps de relaxation isovolumique (P = 0,073) peut être
relevé (Tableau XXII).
Tableau XXII. Paramètres de la fonction cardiaque évalués par échocardiographie des animaux des
lignées F19 et F20 âgés de 30 semaines.
F19
Mâles
F20
Femelles
Mâles
Femelles
Sauvages
(n=10)
Tgβ3
(n=8)
Sauvages
(n=4)
Tgβ3
(n=11)
Sauvages
(n=8)
Tgβ3
(n=8)
Sauvages
(n=10)
Tgβ3
(n=5)
FC (bpm)
321 ± 9
326 ± 11
380 ± 18
355 ± 13
358 ± 12
336 ± 11
394 ± 9
387 ± 18
FE (%)
77,6 ± 1,4
76,7 ± 0,9
80,0 ± 1,0
82,8 ± 0,8
79,1 ± 1,4
78,0 ± 1,7
84,2 ± 1,9
82,6 ± 1,7
E (m.s-1)
0,99 ± 0,04
1,11 ± 0,03
0,97 ± 0,04
0,94 ± 0,04
1,11 ± 0,04
1,12 ± 0,04
1,02 ± 0,05
1,01 ± 0,06
E/A
1,01 ± 0,07
1,06 ± 0,05
1,06 ± 0,12
1,16 ± 0,09
1,17 ± 0,08
1,20 ± 0,07
1,20 ± 0,04
1,22 ± 0,12
TDE (ms) 42,72 ± 2,23 37,60 ± 2,93 33,02 ± 5,65 33,99 ± 1,92 33,68 ± 1,05 39,69 ± 3,10 32,50 ± 1,66 33,33 ± 1,62
TRIV (ms) 23,68 ± 0,44 23,07 ± 0,43 21,97 ± 0,81 22,92 ± 0,47 20,28 ± 0,66 22,03 ± 0,72 20,30 ± 0,44 18,73 ± 0,58
E’ (m.s-1)
3,81 ± 0,30
4,15 ± 0,52
3,97 ± 0,42
4,25 ± 0,73
4,56 ± 0,17 3,30 ± 0,21* 3,61 ± 0,23
3,14 ± 0,16
E/E’
0,28 ± 0,03
0,29 ± 0,03
0,27 ± 0,02
0,28 ± 0,01
0,24 ± 0,01 0,35 ± 0,02*
0,29 ± 0,02
0,32 ± 0,02
E : vitesse de l‟onde E, E‟ : vitesse de déplacement de l‟anneau mitral, FC : fréquence cardiaque, FE : fraction
d‟éjection, TDE : temps de décélération de l‟onde E, Tgβ3 : rats transgéniques surexprimant le récepteur β3-AR
humain à la membrane des cellules endothéliales, TRIV : temps de relaxation isovolumique, * : P < 0,05 vs
sauvages de même sexe.
177
Concernant les paramètres de la fonction cardiaque évalués par la technique des
boucles pression-volume, l‟absence de différence de FC entre les rats sauvages et Tgβ3 de
même sexe appartenant à une même lignée nous autorise une comparaison des autres
paramètres étudiés entre ces animaux.
Au niveau de la lignée F19 on observe une forte augmentation de Ea chez les mâles
Tgβ3 par rapport aux mâles sauvages (Tableau XXIII). Concernant les autres paramètres
étudiés aucune différence n‟est observée entre les animaux Tgβ3 et sauvages, aussi bien chez
les mâles que chez les femelles. Concernant la lignée F20, aucune différence statistique n‟est
mise en évidence entre les rats sauvages et Tgβ3 de même sexe (Tableau XIII). Cependant,
plusieurs tendances apparaissent chez les mâles. Ainsi, chez les rats Tgβ3 on observe une
tendance à l‟augmentation de PTDVG (P = 0,06), de l‟Ea (P = 0,11) et de l‟index de
résistances périphériques totales (P = 0,11) par rapport aux rats sauvages (Tableau XXIII). De
plus, on observe également chez les rats Tgβ3 une tendance à la diminution de l‟index de
contractilité cardiaque (P = 0,06) par rapport aux rats sauvages (Tableau XXIII).
Tableau XXIII. Paramètres de la fonction cardiaque évalués par la technique des boucles pression-volume
chez des animaux des lignées F19 et F20 âgés de 30 semaines.
F19
Mâles
F20
Femelles
Mâles
Femelles
Sauvages
(n=7-8)
Tgβ3
(n=5-6)
Sauvages
(n=3-4)
Tgβ3
(n=11)
Sauvages
(n=3-4)
Tgβ3
(n=4)
Sauvages
(n=11-12)
Tgβ3
(n=6)
FC (bpm)
264 ± 9
281 ± 12
305 ± 12
301 ± 4
310 ± 25
277 ± 15
326 ± 10
317 ± 11
PAM (mmHg)
97,6 ± 3,5
103,3 ± 6,6
105,7 ± 6,1
96,1 ± 2,8
99,3 ± 4,5
97,8 ± 4,2
105,0 ± 2,4
102,4 ± 2,8
PTDVG (mmHg)
8,0 ± 1,5
11,9 ± 3,8
8,2 ± 2,3
7,5 ± 1,3
6,7 ± 1,5
16,0 ± 3,1
10,0 ± 0,9
10,2 ± 1,1
ICC
15,5 ± 0,5
17,3 ± 1,0
31,52 ± 1,78 32,50 ± 1,18 16,4 ± 1.0
13,5 ± 0,3
25,8 ± 0,9
26,3 ± 0,6
(mL.min-1.100g)
IRPT
6,34 ± 0,28
6,04 ± 0,38
3,42 ± 0,33 2,99 ± 0,13 6,12 ± 0,47 7,28 ± 0,48 4,16 ± 0,25 3,88 ± 0,06
(mmHg. mL-1.min)
Ea
170,6 ± 11,0 257,3 ± 28,9* 172,0 ± 10,2 168,8 ± 18,9 150,0 ± 13,8 189,0 ± 21,5 182,4 ± 12,3 183,2 ± 27,8
(mmHg.mL-1)
PESmid (mmHg)
27,76 ± 3,32
33,67 ± 4,57
35,11 ± 1,83 36,25 ± 3,53 33,82 ± 8,73 24,73 ± 3,86 52,27 ± 4,55 45,19 ± 3,00
DP/dtmin : vitesse maximale de relaxation, Ea : élastance artérielle, FC : fréquence cardiaque, ICC : index de
contractilité cardiaque, IRPT : index de résistances périphériques totales, PAM : pression artérielle moyenne,
PES : pression télédiastolique, PESmid : contractilité intrinsèque du ventricule gauche, Tgβ3 : rats transgéniques
surexprimant le récepteur β3-AR humain à la membrane des cellules endothéliales, * : P < 0,05 vs sauvages de
même sexe.
4.2.2.4. Caractérisation histologique
Afin de compléter la caractérisation du modèle, une analyse histologique permettant
de mettre en évidence la fibrose cardiaque est réalisée au niveau des cœurs de rats âgés de 30
178
semaines issus de la lignée F20. Bien qu‟une analyse statistique ne soit pas possible entre les
rats mâles sauvages et Tgβ3 compte tenu du faible effectif, les données préliminaires montrent
une tendance à l‟augmentation de l‟infiltration de collagène au niveau du myocarde des rats
Tgβ3. De même la surexpression du récepteur β3-AR humain semble induire une
augmentation de l‟infiltration de collagène dans le myocarde chez les femelles (Figure 32).
A
B
Tg β3-AR
Sauvages
Inflitration cardiaque de collagène
P = 0,339
50 µm
Femelles
50 µm
Unité arbitraire
Mâles
4
3
2
1
50 µm
50 µm
Tg 3
Sauvages
Sauvages
Mâles
Tg 3
Femelles
Figure 32. Quantification de la fibrose dans le ventricule gauche des rats sauvage et transgéniques (Tgβ3)
de la lignée F20.
(A) Images représentatives et (B) quantification de l‟infiltration cardiaque de collagène dans le cœur des rats
sauvages et transgéniques.
4.2.2.5. Etude préliminaire de l‟influence des hormones sexuelles
L‟ovariectomie provoque une prise de poids aussi bien chez les femelles sauvages que
Tgβ3 cependant cette dernière est significativement plus importante chez les femelles
sauvages par rapport aux femelles Tgβ3. L‟ovariectomie n‟a par contre aucun effet sur la taille
des animaux (Tableau XXIV). Concernant la géométrie myocardique, l‟ovariectomie
provoque chez les femelles sauvages un élargissement du diamètre du VG aussi bien en
diastole qu‟en systole. Ce phénomène n‟apparait
ovariectomisées (Tableau XXIV).
179
pas
chez
les
femelles
Tgβ3
Tableau XXIV. Effets de l’ovariectomie sur les paramètres morphologiques et les paramètres
morphométriques évalués par échocardiographie chez des femelles de la lignée F20 âgées de 30 semaines.
Femelles
Morphologie
Morphométrie
évaluée par
échocardiographie
Femelles ovariectomisées
Sauvages
(n=10)
Tgβ3 (n=5)
Sauvages
(n=2-3)
Poids (en g)
363 ± 7 (n=10)
365 ± 15
499 ± 12
433 ± 17*
Longueur du tibia
(en mm)
53,3 ± 0,4
53,3 ± 0,6
53,7 ± 1,0
53,0 ± 0,7
PPTDVG (en mm)
1,56 ± 0,05
1,64 ± 0,03
1,59 ± 0,08
1,61 ± 0,11
PPTSVG (en mm)
2,59 ± 0,12
2,67 ± 0,16
2,33 ± 0,07
2,44 ± 0,12
PATDVG (en mm)
1,58 ± 0,04
1,62 ± 0,04
1,56 ± 0,04
1,60 ± 0,06
PATSVG (en mm)
2,20 ± 0,05
2,19 ± 0,04
2,27 ± 0,02
2,23 ± 0,05
DTDVG (en mm)
7,00 ± 0,14
7,17 ± 0,16
7,94 ± 0,54
DTSVG (en mm)
3,60 ± 0,21
3,82 ± 0,17
4,80 ± 0,56
Tgβ3 (n=6)
§
§
§
7,19 ± 0,12*
§
3,99 ± 0,05
DTDVG : diamètre télédiastolique du ventricule gauche, DTSVG : diamètre télésystolique du ventricule gauche,
PATDVG : paroi antérieure du ventricule gauche en télédiastole, PATSVG : paroi antérieure du ventricule gauche
en télésystole, PPTDVG : paroi postérieure du ventricule gauche en télédiastole, PPTSVG : paroi postérieure du
ventricule gauche en télésystole, Tgβ3 : rats transgéniques surexprimant le récepteur β3-AR humain à la
membrane des cellules endothéliales, * : P < 0,05 vs sauvages de même statut hormonale. § : P < 0,05 vs
femelles non ovariectomisées de même génotype
L‟analyse de la fonction cardiaque par échocardiographie est réalisée cependant il est
important de rester prudent quant aux comparaisons effectuées entre les femelles Tgβ3 non
ovariectomisées et ovariectomisées. En effet, la FC, au moment de l‟acquisition des données,
entre ces 2 groupes est significativement différente limitant la pertinence des comparaisons
réalisée pour les autres paramètres de la fonction cardiaque (Tableau XXV). Ainsi on observe
chez les femelles ovariectomisées une diminution du rapport E/A ainsi qu‟un allongement du
TRIV qui sont des paramètres fortement dépendants de la FC. De manière plus intéressante,
on observe que l‟ovariectomie provoque chez les femelles sauvages mais pas chez les
femelles Tgβ3, une réduction de la FE (Tableau XXV).
L‟analyse des paramètres acquis par la technique des boucles pression-volume pose le
même problème que précédemment avec les paramètres échocardiographiques. En effet, les
femelles ovariectomisées, aussi bien sauvages que Tgβ3, présentent une FC réduite par
rapports aux femelles non ovariectomisées. L‟ovariectomie provoque, aussi bien chez les
femelles sauvages que Tgβ3, une diminution de la PTDVG et de l‟IC ainsi qu‟une
augmentation de l‟IRPT. Aucune différence n‟est observée entre les femelles sauvages et
Tgβ3 ovariectomisées.
180
Tableau XXV. Effets de l’ovariectomie sur les paramètres de la fonction cardiaque évalués par
échocardiographie et par la technique des boucles pression-volume chez des femelles de la lignée F20 âgées
de 30 semaines.
Femelles
Fonction cardiaque
évaluée par
échocardiographie
Fonction cardiaque
évaluée par
la technique
des boucles
pression-volume
Femelles ovariectomisées
Sauvages
(n=9-12)
Tgβ3 (n=5-6)
Sauvages
(n=2-3)
Tgβ3 (n=5-6)
FC (bpm)
394 ± 9
387 ± 18
354 ± 15
346 ± 9
FE (%)
84,2 ± 1,9
82,6 ± 1,7
75,6 ± 3,6
E (m.s-1)
1,02 ± 0,05
1,01 ± 0,06
0,96 ± 0,07
0,94 ± 0,04
E/A
1,20 ± 0,04
1,22 ± 0,12
1,05 ± 0,05
1,00 ± 0,03
TDE (ms)
32,50 ± 1,66
33,33 ± 1,62
30,33 ± 1,35
35,67 ± 2,06
TRIV (ms)
20,30 ± 0,44
18,73 ± 0,58
21,67 ± 0,58
21,94 ± 1,10
E’ (m.s-1)
3,61 ± 0,23
3,14 ± 0,16
3,10 ± 0,90
3,48 ± 0,24
E/E’
0,29 ± 0,02
0,32 ± 0,02
0,37 ± 0,11
0,28 ± 0,02
FC (bpm)
326 ± 10
317 ± 11
244 ± 52
278 ± 16
PAM (mmHg)
105,0 ± 2,4
102,4 ± 2,8
97,3 ± 11,1
103,5 ± 2,6
PTDVG (mmHg)
10,0 ± 0,9
10,2 ± 1,1
5,0 ± 0,6
25,8 ± 0,9
26,3 ± 0,6
17,7 ± 1,8
4,16 ± 0,25
3,88 ± 0,06
5,57 ± 0,70
5,25 ± 0,43
182,4 ± 12,3
183,2 ± 27,8
136,4 ± 18,2
204,9 ± 20,1
52,27 ± 4,55
45,19 ± 3,00
58,23 ± 7,89
42,89 ± 4,17
IC
(mL.min-1.100g)
IRPT
(mmHg. mL-1.min)
Ea
(mmHg.mL-1)
PESmid (mmHg)
§
§
§
80,6 ± 1,0
§
§
§
§
§
5,3 ± 0,8
§
§
20,3 ± 1,5
§
§
E : vitesse de l‟onde E, E‟ : vitesse de déplacement de l‟anneau mitral, FC : fréquence cardiaque, FE : fraction
d‟éjection, PATDVG : paroi antérieure du ventricule gauche en télédiastole, PATSVG : paroi antérieure du
ventricule gauche en télésystole, PPTDVG : paroi postérieure du ventricule gauche en télédiastole, PPTSVG : paroi
postérieure du ventricule gauche en télésystole, TDE : temps de décélération de l‟onde E, Tgβ3 : rats
transgéniques surexprimant le récepteur β3-AR humain à la membrane des cellules endothéliales, TRIV : temps
de relaxation isovolumique, * : P < 0,05 vs sauvages de même statut hormonale. § : P < 0,05 vs femelles non
ovariectomisées de même génotype
4.2.3. Discussion
Le tableau clinique de l‟ICFEp se caractérise principalement par la présence d‟une
dysfonction diastolique sans altération de la FE. L‟altération de la fonction diastolique est la
conséquence d‟une augmentation de la rigidité myocardique et d‟une altération de la fonction
atriale, aboutissant principalement à une augmentation de la PTDVG et à une hypertrophie
myocardique concentrique non adaptative. Ce tableau, principalement retrouvée chez des
femmes âgées ménopausées, est généralement complété par une altération du couplage
181
ventriculo-artériel ainsi que par la présence de nombreuses comorbidités comme l‟obésité, le
diabète ou l‟HTA.
Dans cette étude, bien qu‟il soit important d‟analyser les résultats obtenus avec une
grande précaution en raison des faibles effectifs des différents groupes étudiés, nous avons
observé chez des rats Tgβ3 mâles issus de la lignée F20 âgés de 30 semaines, des altérations
diastoliques très proches de celles observées au cours de l‟ICFEp chez l‟homme (Tableau
XXVI). Ces altérations de la fonction diastolique se caractérisent par une tendance à
l‟augmentation de la PTDVG associée une augmentation du rapport E/E‟. De plus, une
altération du couplage ventriculo-artériel, semble s‟installer dans ce modèle avec une
tendance à l‟augmentation de l‟Ea. Ces animaux présentent une fonction systolique non
altérée, caractérisée par une FE et un PESmid préservés. Enfin, bien que les effectifs soient
réduits, on retrouve une tendance à la fibrose au niveau du myocarde des rats Tgβ3 mâles. Une
telle fibrose est clairement observée dans le cœur de patients décédés d‟ICFEp (Borbely et al.,
2005) (Tableau XXVI).
Tableau XXVI. Comparaison entre différents modèles animaux d’insuffisance cardiaque à fraction
d’éjection préservée (ICFEp) humaine et le modèle de rat transgénique surexprimant le récepteur β3adrénergique humain issu de la lignée F20 (F20 Tgβ3).
ICFEp
Humaine
Rat
F20
Tgβ3
Dalh/SS
1
Souris
mRen2.
Lewis2
ZSF1
obèse3
TAC
4
TAC
DOCA
/Salt6
SAM
5
Chien8
Porc9
7
Sexe
Femme >
Homme
Mâle >
Femelle
mâle
femelle
OVA
mâle
mâle
mâle
mâle
mâle
mâle
femelle
Age
> 70 ans
Avec l‟âge
19 sem
15 sem
18-20
sem
18-22
sem
12-13
sem
10 sem
6 mois
7-13 ans
nd
Diabète
+
nd
nd
nd
+
nd
nd
nd
nd
nd
nd
Poids
+
=
-
+
+
=
=
nd
+
=
nd
PAM
+
=
+++
+++
+++
=
nd
+
=
+++
+++
FE
=
=
=
nd
=
nd
-
=
=
=
nd
Fonction
systolique
=
=
=
=
=
-
nd
=
=
=
=
PTDVG
+
+
+
nd
+
+
+
+
+
+
=
E/E'
+
+
nd
+
+
+
nd
+
nd
nd
nd
Ea
+
+
nd
nd
nd
nd
nd
=
=
+
nd
Hypertrophie
+
=
+
=
+
+
+
=
=
+
+
Fibrose
+
+
nd
+
=
nd
+
nd
+
+
+
Fonction
rénale
-
nd
-
-
-
nd
nd
nd
nd
-
nd
182
Différences par rapport à l‟état physiologique, = aucune différence, + légère augmentation, +++ forte
augmentation, Ea : élastance artérielle, E/E‟ : rapport vitesse de l‟onde E/vitesse de déplacement de l‟anneau
mitral, FE : fraction d‟éjection, OVA : ovariectomisée, PAM : pression artérielle moyenne, PTDVG : pression
télédiastolique du ventricule gauche. 1 :(Klotz et al., 2006), 2 : (Groban et al., 2008), 3 :(Hamdani et al., 2013)
,4 :(Litwin et al., 1995) , 5 :(Moens et al., 2008), 6 :(Silberman et al., 2010) , 7 :(Reed et al., 2011), 8 :(Hart et al.,
2001), 9 :(Rienzo et al., 2012).
Bien que le modèle Tgβ3 soit proche des caractéristiques de l‟ICFEp humaine, il
présente cependant certaines limites dans son analogie avec le tableau clinique retrouvé chez
l‟homme. Tout d‟abord l‟apparition d‟une ICFEp se développe uniquement chez les mâles
dans notre modèle alors que cette pathologie est connue pour affecter principalement les
femmes âgées, ménopausées (Owan et al., 2006). A 30 semaines, les rattes étudiées ne
présentent pas le profil hormonal d‟une femme ménopausée limitant la pertinence des
résultats obtenus chez les femelles. En effet, de nombreuses études ont déjà montré que les
œstrogènes produisent un effet anti-apoptotique et anti-nécrotique sur les cardiomyocytes et
les cellules endothéliales. De plus, ils réduisent le développement de la fibrose et de la
réponse inflammatoire (Knowlton & Lee, 2012). Dans ce sens, des études préliminaires
utilisant des femelles ovariectomisées, reproduisant la ménopause, ont été réalisées afin
d‟évaluer l‟influence des œstrogènes sur le développement d‟une dysfonction diastolique.
Hormis l‟apparition d‟une obésité chez les femelles ovariectomisées caractérisée par une prise
de poids sans modification de la taille des animaux, ces résultats préliminaires ne donnent pas
satisfaction. En effet, alors que les femelles sauvages ovariectomisées présentent un début de
dysfonction systolique, caractérisé par une augmentation des volumes télédiastolique et
télésystolique du VG, associé à une baisse de la FE et à une diminution de l‟index de
contractilité cardiaque, les femelles Tgβ3 ovariectomisées ne présentent pour leur part qu‟une
altération de l‟index de contractilité cardiaque. Ces altérations systoliques sont associées aussi
bien chez les femelles sauvages que Tgβ3 ovariectomisées à une altération de l‟index de
résistance périphérique totale et à une amélioration de la fonction diastolique démontrée par
un abaissement de la PTDVG. L‟ensemble des ces caractéristiques de la fonction cardiaque ne
font pas de ce modèle un modèle pertinent pour l‟étude de l‟ICFEp. Il est toutefois intéressant
de remarquer que les femelles Tgβ3 ovariectomisées ont un poids significativement plus
faible que celui des femelles sauvages ovariectomisées. Ceci suggère que la surexpression
endothéliale du récepteur β3-AR dans notre modèle limite la prise de poids des femelles
ovariectomisées. L‟implication des récepteurs β3-AR dans le métabolisme lipidique et la prise
alimentaire est déjà connue. Plusieurs études ont montré que la stimulation de ce récepteur
induisait une diminution de la prise alimentaire (Kumar et al., 1999), une augmentation de la
183
lipolyse dans le tissu adipeux blanc (Collins & Surwit, 2001; Russell & Tisdale, 2012), et
une augmentation des dépenses énergétiques (Grujic et al., 1997).
Une autre limite au modèle de rat Tgβ3 est l‟absence de modifications morphologiques
cardiaques. L‟ICFEp est caractérisée par une hypertrophie concentrique (Sano & Schneider,
2002) qui n‟est pas retrouvée chez les rats Tgβ3 (Tableau XXI). Pour rappel, l‟hypertrophie
concentrique est une conséquence de l‟augmentation de la PTDVG. L‟apparition d‟une
hypertrophie à un âge plus tardif est donc envisageable dans ce modèle et une caractérisation
du modèle à 45 semaines est en cours de réalisation afin d‟évaluer notamment l‟apparition
potentielle de cette hypertrophie avec le vieillissement. L‟absence de telles modifications
morphologiques cardiaques est particulièrement surprenante chez les femelles sauvages
lorsqu‟elles sont ovariectomisées. Une étude réalisée chez des souris ovariectomisées a
montré que celles ci présentaient 10 semaines après la perte en hormones sexuelles une
hypertrophie cardiaque de type concentrique, avec une augmentation de l‟épaisseur des parois
et une augmentation du diamètre cardiaque (Sebag et al., 2011). Cette absence d‟effet de
l‟ovariectomie chez les femelles sauvages pourrait avoir plusieurs origines. Tout d‟abord, des
différences interespèces dans la réponse à la perte en hormones sexuelles sont possibles étant
donné que l‟étude citée est réalisée chez des souris. Ensuite, l‟alimentation pourrait également
influencer les résultats par la présence des phytoestrogènes contenus dans le soja. Pour étayer
cette dernière hypothèse, il est apparu au cours de notre étude que l‟alimentation standard
contenait effectivement du soja et notamment des phytoestrogènes naturellement contenus
dans le soja. Les phytoestrogènes sont des molécules dont la structure s‟apparente à celle des
œstrogènes endogènes, et qui sont capables d‟activer leurs récepteurs. Bien que les
phytoestrogènes de l‟alimentation n‟aient pas d‟impacts sur la physiologie des rats non
stérilisés (Douglas et al., 2006), plusieurs études soulignent les effets que peuvent avoir ces
molécules sur le système cardiovasculaire d‟animaux stérilisés (Martin et al., 2001; Nguyen et
al., 2012). Les doses employées dans leurs études sont supérieures à celles contenues dans
l‟aliment des femelles Tgβ3, néanmoins, la durée d‟exposition aux phytoestrogènes dans notre
modèle est également plus longue. De nouvelles études permettant d‟évaluer plus précisément
l‟impact sur la fonction cardiaque de la perte en hormones sexuelles sont actuellement en
cours de réalisation au sein du laboratoire. Dans ces études les animaux sont soumis à un
régime sans phytoestrogènes à partir du moment de l‟ovariectomie jusqu‟à 45 semaines, âge
auquel s‟arrêtent les études.
184
Enfin, une dernière limite à ce modèle est l‟absence de comorbidités classiquement
associées à l‟ICFEp (Owan et al., 2006) chez nos rats Tgβ3. En effet, nos animaux ne
présentent ni surcharge pondérale, ni élévation de la PAM, ni diabète. Il est toutefois certains
qu‟un modèle plus proche du profil du patient présentant un l‟ICFEp comme la femelle Tgβ3
ovariectomisée âgée de 45 semaines, présente une ou plusieurs de ces comorbidités. Il est
possible qu‟à la prise importante de poids, déjà mise en évidence à 30 semaines chez les
femelles ovariectomisées, s‟associe d‟autres comorbidités. Il sera donc important d‟évaluer
l‟apparition de ces comorbidités lors des prochaines caractérisations réalisées dans ce modèle.
Malgré ces quelques limites ce modèle apparait prometteur car il présente le profil le plus
proche de la pathologie humain (tableau XXVI).
Nous avons, dans cette étude, réalisé la caractérisation d‟un modèle de rat Tgβ3. Ce
modèle, bien qu‟ayant encore quelques limites, est aujourd‟hui le modèle présentant le
phénotype le plus proche du tableau clinique de l‟ICFEp humaine. Une étude préliminaire
évaluant l‟importance du statut hormonal chez les femelles Tgβ3 n‟a pas donné de résultats
satisfaisant. Cela s‟explique notamment par la présence de phytoestrogènes dans
l‟alimentation des animaux et de nouvelles études prenant en compte cet élément sont
actuellement en cours de réalisation au laboratoire. Enfin il sera également important
d‟intégrer d‟autres comorbidités de l‟ICFEp à ce modèle dont notamment l‟âge et la surcharge
pondérale afin éventuellement d‟obtenir un modèle le plus proche possible de l‟ICFEp
humaine. Un tel modèle permettra par la suite une étude précise des mécanismes
physiopathologiques liés à l‟ICFEp.
185
V-CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES GÉNÉRALES
186
Le système β-AR est un des principaux systèmes de régulation de la fonction
cardiovasculaire. Fortement activé en conditions de stress, il est souvent altéré/remodelé dès
l‟initiation de processus pathologiques. Pour cette raison, les trois sous-types de récepteurs βAR, qui composent ce système, sont des cibles thérapeutiques potentielles dans de
nombreuses pathologies cardiovasculaires. Ainsi, on retrouve l‟utilisation d‟agonistes et/ou
d‟antagonistes β-AR dans le traitement de nombreuses pathologies et notamment
cardiovasculaires. Ces agents sont cependant trop souvent utilisés de façon empirique, soit
d‟après les connaissances que nous possédons sur le système β-AR dans des conditions
physiologiques, soit sur la base de résultats d‟études cliniques. Or, le remodelage de ce
système β-AR dans ces conditions pathologiques, par modification d‟expression, d‟affinité ou
encore par modification des voies de signalisations sous-jacentes, peut induire des réponses
biologiques différentes de celles attendues lors de la stimulation ou du blocage de l‟un ou
l‟autres des sous-types β-AR.
Dans la plupart des pathologies cardiovasculaires, comme le choc septique et l‟IC, on
retrouve, en plus de la forte activation du système β-AR, une importante dysfonction
endothéliale dès l‟initiation des processus physiopathologiques. L‟endothélium, connu pour
réguler les réponses physiologiques, notamment au niveau vasculaire et cardiaque, semble
également fortement impliqué dans la régulation de ces fonctions biologiques en conditions
pathologiques et joue probablement un rôle délétère ou protecteur important.
Dans ce travail de thèse, nous nous sommes donc, dans un premier temps, intéressés
au remodelage du système β-AR cardiovasculaire et à l‟implication de la dysfonction
endothéliale dans ce remodelage, à la phase précoce du choc septique. En effet, la
thérapeutique de cette pathologie, mise en route le plus rapidement possible, est un exemple
de l‟utilisation empirique des agonistes β-AR notamment pour le traitement de la
cardiomyopathie septique et de l‟amélioration de la perfusion d‟organes clés (comme les reins
et le tube digestif). Dans cette étude, nous avons donc eu pour objectif premier de caractériser
un modèle animal pertinent pour l‟étude de la phase précoce du choc septique : le modèle de
rat en choc endotoxémique suite à une injection intraveineuse de LPS. Ce modèle, qui
reproduit le profil hémodynamique d‟un patient en phase initial de choc septique avant toute
réanimation, nous a permis de mettre en évidence un remodelage β-AR aussi bien au niveau
vasculaire que cardiaque. Ainsi, au niveau vasculaire la phase précoce du choc
endotoxémique se caractérise par une altération de la vasorelaxation β-AR globale,
partiellement compensée par une augmentation de la vasorelaxation dépendante du sous-type
β2-AR. Alors que chez les animaux contrôles la vasorelaxation β2-AR est principalement
187
dépendante de récepteurs localisés au niveau des cellules endothéliales, la forte dysfonction
endothéliale retrouvée au niveau vasculaire dans notre modèle conduit à une augmentation de
la vasorelaxation β2-AR qui implique uniquement les récepteurs localisés à la membrane des
CML. Au niveau cardiaque, nous avons observé une augmentation de la contractilité β-AR à
la phase précoce du choc endotoxémique dépendante du sous-type β1-AR. Cette augmentation
de la contractilité cardiaque β1-AR est fortement dépendante de la dysfonction de l‟EE et plus
particulièrement de médiateurs de cet endothélium : les prostaglandines. En effet, nous avons
pu mettre en évidence dans ce modèle une forte implication des 2 isoformes de COX et
notamment COX2 dans l‟augmentation de la contractilité β1-AR cardiaque.
Ces travaux soulèvent également de nombreuses interrogations qui nécessiteront des
études complémentaires. Ainsi, il sera intéressant de mieux comprendre les mécanismes
impliqués dans l‟augmentation de la vasorelaxation β2-AR malgré la diminution d‟expression
protéique des récepteurs β2-AR au niveau des aortes de rat en choc endotoxémique. Il sera
avant tout nécessaire de mener des études de binding afin d‟évaluer les modifications
potentielles de densité membranaire de récepteurs natifs et/ou de localisation des récepteurs à
la membrane des CML et des cellules endothéliales au cours du choc endotoxémique. Ensuite
une exploration de la voie de signalisation β2-AR au niveau des CML semble indispensable
afin de mieux identifier les mécanismes impliqués. En effet, cette augmentation de la
vasorelaxation peut tout aussi bien découler d‟une augmentation de l‟affinité du salbutamol
pour le récepteur β2-AR que d‟un remodelage protéique de la voie de signalisation elle-même,
au niveau par exemple des AC ou des protéines G impliquées, ou encore d‟une modification
de la compartimentation des nucléotides cycliques par altération des PDEs impliquées au
niveau des CML. De plus, une étude préliminaire en cuve à organes isolés utilisant de la
forskoline, un activateur direct de l‟AC ne démontre aucune modification de la vasorelaxation
au niveau d‟aorte de rats LPS par rapport aux rats contrôles suggérant une modification de la
voie de signalisation en amont de cette dernière c'est-à-dire au niveau du récepteur β2-AR luimême ou de la protéine Gs qui lui est liée (fig. 33). Cette étude confirme cependant
l‟altération endothéliale et la vasorelaxation principalement dépendante des voies de
signalisations des CML au cours du choc endotoxémique. Chez les animaux contrôles il est
intéressant de noter qu‟à de faibles concentrations de forskoline la vasorelaxation est plus
importante au niveau d‟anneaux d‟aorte dont l‟endothélium est intègre en comparaison avec
des anneaux désendothélialisés. Par contre, à de forte concentration, la forskoline provoque
une vasodilatation similaire au niveau d‟anneaux d‟aorte avec ou sans endothélium. Ceci met
en évidence la présence de 2 mécanismes impliqués dans la vasorelaxation chez les animaux
188
contrôles. Une vasorelaxation avec effet directe de la forskoline au niveau des CML,
indépendante de l‟endothélium, et une vasorelaxation dépendante de la présence d‟un
endothélium fonctionnel. Cette double composante de la vasorelaxation à la forskoline chez
des rats contrôles a déjà été mis en évidence (Mori et al., 1996). Chez les animaux LPS la
vasorelaxation à la forskoline n‟est que peu modifiée par une abrasion de l„endothélium
mettant en évidence une vasorelaxation majoritairement dépendante des CML.
0
% Relaxation
20
40
60
80
100
CTRL endo+ (n=4)
120
LPS endo+ (n=3)
140
CTRL endo- (n=4)
*
*
LPS endo- (n=3)
10
9
8
7
6
5
log [Forskoline] (M)
Figure 33. Effets du choc endotoxémique sur la fonction vasorelaxation dépendante des adénylates cyclase
* :P<0,05 CTRL/ LPS endo - vs endo +
Il sera bien entendu très important d‟évaluer l‟évolution de ce remodelage β-AR
vasculaire, ainsi que sa régulation par l‟endothélium, à plus long terme. Dans ce sens,
l‟utilisation de modèles ayant un décours d‟évolution plus lent et sur une durée plus
importante comme les modèles de ligatures ponction caecales (Dejager et al., 2011)
permettrait d‟avoir un regard à plus long terme sur les phénomènes observés à la phase
précoce du choc. De même, il conviendra de tester les effets de traitements utilisés dans la
réanimation précoce du choc septique sur le remodelage β-AR ainsi que la dysfonction
endothéliale. Dans ce sens, des résultats de mon projet de master 2 démontrent les effets
bénéfiques d‟un remplissage vasculaire précoce à l‟aide d‟hydroxyéthylamidons (une heure
après l‟induction du choc) sur l‟évolution de la dysfonction endothéliale dans notre modèle.
Ces résultats seront cependant à confirmer avec un autre soluté de remplissage. En effet, des
études cliniques récentes ont démontré des effets délétères des hydroxyéthylamidons dans le
traitement du choc septique (Brunkhorst et al., 2008; Guidet et al., 2012; Myburgh et al.,
2012; Perner et al., 2012)
189
Enfin, la perspective principale de ce travail reste le potentiel thérapeutique que peut
impliquer ce remodelage β-AR avec notamment l‟utilisation d‟agonistes β2-AR à la phase
précoce du choc endotoxémique. Ainsi, il a déjà été démontré qu‟un traitement précoce, de
rats en choc endotoxémique, avec de la terbutaline, présentait des effets bénéfiques,
notamment inflammatoires, au niveau vasculaire assurant une meilleure perfusion des organes
et limitant leur défaillance (Liaw et al., 2003). Cependant, la mise en place d‟études
précliniques pertinentes prenant en compte l‟ensemble des paramètres retrouvés en clinique
(ventilation mécanique, remplissage vasculaire, antibiothérapie, …) reste difficile mais doit
constituer un préalable indispensable avant d‟envisager des essais cliniques.
De même, les travaux menés sur la dysfonction cardiaque amènent également de
nombreuses questions sur les mécanismes impliqués dans la mise en place de ces
remodelages, les conséquences à plus long terme de ces derniers ainsi que leurs pertinences
par rapport à la physiopathologie humaine. Ainsi, il sera important de mieux comprendre
l‟implication de la voie des COX et de déterminer la nature de prostaglandines impliquées
dans la potentialisation de la contractilité β1-AR cardiaque. En effet, comme un traitement des
animaux en choc endotoxémique à l‟aide d‟indométacine améliore la survie, notre hypothèse
est que cet effet peut notamment dépendre de l‟amélioration de la fonction cardiaque, sans
que l‟on ne puisse cependant exclure d‟autres effets bénéfiques de l‟indométacine par action
sur d‟autres organes. Dans ce sens, il sera intéressant d‟évaluer in vivo la fonction cardiaque
de base ainsi que les réponses β-AR cardiaques des animaux en choc endotoxémique traités
par l‟indométacine. Il apparait également important de mieux appréhender le profil
d‟expression et d‟activation des COX. En effet, l‟absence de surexpression de l‟isoforme
COX2 dans notre modèle est surprenante car une surexpression a déjà été décrite à maintes
reprises dans des modèles animaux de choc septique (Bawolak et al., 2008; Kirkby et al.,
2013; Tunctan et al., 2013). La possibilité d‟une absence de surexpression du fait d‟une
évaluation trop précoce est envisageable. En effet, la courbe de survie des animaux traités
avec de l‟indométacine se démarque de celle des animaux LPS environ 11h après l‟induction
du choc. Une surexpression des COX dans cette période pourrait être une explication à ce
décours particulier de cette courbe de survie des animaux traités avec de l‟indométacine.
Enfin, la présence d‟une surexpression uniquement au niveau de l‟EE, masquée lors des
expérimentations réalisées par western blot sur cœur entier. De plus, la connaissance des voies
de signalisations intervenant dans cette potentialisation β1-AR semble indispensable afin de
permettre l‟identification de cibles thérapeutiques, autres que les récepteurs β1-AR, bien
qu‟un blocage de ces derniers à l‟aide d‟antagonistes spécifiques semble être une voie
190
thérapeutique intéressante. Il sera également intéressant d‟évaluer les conséquences de cette
augmentation de la réponse β1-AR cardiaque à des temps plus long du fait des effets délétères
connus d‟une stimulation β1-AR prolongée (Mangmool et al., 2010). Il n‟est en effet pas
exclu que cette potentialisation β1-AR soit un phénomène transitoire de la phase précoce du
choc endotoxémique et que l‟inhibition de ce phénomène n‟apporte que peu voire aucun
bénéfice thérapeutique. L‟utilisation d‟un modèle de ligature ponction caecale permettrait
d‟avoir un regard à plus long terme sur le remodelage β-AR.
Dans un second temps, ce travail de thèse a consisté en la caractérisation de plusieurs
lignées (F19, F20, F21, F22 et F23) d‟un modèle de rats transgéniques, développées dans
l‟équipe, qui surexpriment le récepteur β3-AR humain à la membrane des cellules
endothéliales. De façon intéressante, la caractérisation réalisée à 30 semaines, par des
approches hémodynamiques et histologiques, met en évidence l‟établissement chez les rats
Tgβ3 de la lignée F20, mâles uniquement, d‟un profil proche de celui rencontré chez les
patients atteints d‟ICFEp. En effet, ces animaux présentent une altération de la fonction
diastolique sans altération de la fonction systolique, avec notamment la présence d‟une FE
préservée. Cette caractérisation hémodynamique a été complétée par une étude histologique
qui a mis en évidence une tendance au développement d‟une fibrose myocardique chez ces
animaux Tgβ3. Des études préliminaires cherchant à évaluer l‟influence des œstrogènes dans
le développement de l‟ICFEp ne se sont pas montrées concluantes et nécessitent d‟être
approfondies. Cette évaluation de l‟influence hormonale possède également l‟avantage
d‟intégrer l‟influence de l‟obésité sur l‟évolution du phénotype des animaux. Une
caractérisation à un âge plus avancé est également en cours de réalisation.
L‟IC est une pathologie qui a un impact important sur la qualité de vie des patients. En
effet, parmi les symptômes de l‟ICFEp figure notamment l‟incapacité d‟adaptation à l‟effort
du fait d‟une altération des réserves cardiaques et d‟une incompétence chronotrope. Il sera
donc important d‟évaluer la fonction cardiaque dans des conditions de stress mimant l‟effort
physique. Ainsi, les animaux seront soumis à divers stress parmi lesquels une tachycardie (par
pacing), une augmentation de la précharge (par remplissage vasculaire) ou encore une
augmentation de la postcharge (par des agents vasoconstricteurs).
L‟effet délétère de la surexpression du récepteur β3-AR dans ce modèle reste encore
mal expliqué et contradictoire. Il sera important d‟étudier les voies de signalisation β-AR ainsi
que la voie du NO et de la PKG afin de mieux comprendre les mécanismes de développement
de l‟ICFEp dans ce modèle. En effet, un découplage de la NOS avec son cofacteur essentiel,
191
la tetrahydrobiopterin semble notamment être un phénomène important dans l‟établissement
du stress oxydant conduisant au développement de l‟ICFEp. L‟implication d‟une
surexpression du récepteur β3-AR dans un tel phénomène semble être une hypothèse
physiopathologique intéressante et importante à approfondir. Dans ce sens des études seront
menées en collaboration avec l‟équipe de Jean-Luc Balligand à Bruxelles. L‟étude d‟autres
voies de signalisation ayant des effets cardiaques comme la voie de l‟ET ou de l‟angiotensine
sera également réalisée. Le système rénine angiotensine aldostérone est notamment connu
pour favoriser le développement de la fibrose cardiaque (Kong et al., 2013). Enfin, il semble
important d‟évaluer l‟influence de l‟endothélium cardiaque dans le développement de cette
pathologie du fait de l‟expression uniquement endothéliale du transgène. L‟influence de
l‟endothélium cardiaque apparait d‟autant plus importante que l‟établissement du paradigme
de l‟ICFEp rapporté récemment implique l‟endothelium dans le développement de
l‟ICFEp(Paulus & Tschope, 2013).
192
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227
ANNEXE: Monitorat
Initiation à la pharmacologie – Deuxième année de licence
Ces TP sont en complément de cours magistraux de pharmacologie et permettent
d‟illustrer et d‟assimiler la notion de transmission synaptique (synapses neuro-neuronique et
neuromusculaire) ainsi que les concepts de pharmacodynamie et pharmacocinétique. Un TP
est consacré à évaluer les effets de substances pharmacologiques sur le système nerveux
central grâce à une étude des activités exploratrices et motrices chez la souris. Ces TP sont
répartis en quatre séances de trois heures. Lors de cet enseignement, j‟ai encadré ou coencadré, avec un second enseignant, dix séances par an (effectif moyen : 35 étudiants par
groupe et 18 par demi groupe) soit un total de 90 heures au cours de ma thèse.
Transmission synaptique
Activité électrique des neurones et synapses neuro-neuroniques (logiciel SYNAPSE)
Le modèle expérimental est constitué de plusieurs neurones pré-synaptiques, dont un
appartient à une cellule sensorielle, qui font synapse au niveau d‟une dendrite ou du corps
cellulaire d‟un neurone post-synaptique. Ce logiciel permet aux étudiants d‟évaluer les
activités électriques des neurones, la transmission synaptique ainsi que les phénomènes de
sommations spatiales et temporelles. Il permet également d‟aborder le rôle des
neurotransmetteurs dans la transmission de l‟information de neurone à neurone.
Pharmacologie de la transmission neuromusculaire du muscle squelettique (logiciel
PHARMATUTOR)
Ce logiciel modélise une expérience réalisée sur une préparation de diaphragme
(muscle squelettique) de souris couplé à son nerf moteur (le nerf phrénique), tous deux reliés
à un générateur d'impulsions. Ce logiciel permet d‟appréhender le fonctionnement d‟une
jonction neuromusculaire et de déterminer les récepteurs impliqués dans ce phénomène
physiologique.
Activité électrique de surface de la préparation "nerf sciatique – muscle gastrocnémien"
isolée de grenouille
L‟objectif de ce TP est (i) de caractériser et comparer les activités électriques globales
du nerf sciatique et du muscle gastrocnémien, (ii) de comprendre le fonctionnement de la
synapse neuromusculaire, et (iii) de déterminer le délai synaptique. En augmentant
228
progressivement varier l‟intensité de stimulation sur le nerf, les étudiants abordent les notions
d‟intensité seuil de stimulation et de recrutement de fibres musculaires. Ensuite, ils doivent
déterminer le délai synaptique neuromusculaire. Enfin, ils réalisent l‟expérience de Claude
Bernard afin de déterminer les récepteurs impliqués au niveau de la plaque motrice.
Pharmacodynamie et pharmacocinétique
Pharmacodynamie :
réalisation
de
courbes
concentration-réponse
(logiciel
PHARMATUTOR)
Le logiciel modélise une expérience d'enregistrement de la contraction d'un fragment
d‟intestin isolé placé dans une cuve remplie de liquide physiologique oxygéné. À partir de ce
logiciel, les étudiants doivent mimer l‟ajout dans la cuve d‟un agoniste à différentes
concentrations et déterminer à partir des courbes concentration-réponse obtenues la nature des
antagonistes X et Y préalablement ajouté dans la cuve expérimentale.
Simulation de pharmacocinétique (logiciel PHARMATUTOR)
Le logiciel présente un modèle animé de la disponibilité et de l‟élimination d‟une
substance pharmacologique donnée dans un organisme. La substance pharmacologique peut
être administrée de différentes manières : par IV, par perfusion IV, par dose orale unique ou
par injection IV avec un modèle à deux compartiments. Les manipulations sont réalisées dans
un modèle sain et un modèle insuffisant rénal. Les étudiants doivent alors conclure sur
l‟importance de contrôler le taux plasmatique des substances pharmacologiques administrées
chez un patient sain et un patient insuffisant rénal.
Tests comportementaux chez la souris
Le but de ce TP est d‟évaluer l‟effet sur le système nerveux central de deux molécules
psychotropes, au moyen de différents tests comportementaux. Les étudiants ont quatre souris
à leur disposition, chacune ayant reçu une injection intrapéritonéale de diazépam, de caféine,
d‟excipient, ou d‟une solution X (correspondant à l‟une des trois solutions précédentes, à
déterminer par les étudiants). Chacune de ces quatre souris est soumise à trois tests
comportementaux : (i) le test de la barre fixe, (ii) le test de curiosité et (iii) le test de la nage
forcée. Les étudiants doivent rédiger un compte-rendu complet où les résultats sont analysés,
interprétés et discutés les résultats obtenus, à l‟aide de leur cours et de la littérature. Ils
doivent déterminer la nature de la solution X.
229
Physiologie animale intégrée – Troisième année de licence
Ces TP représentent une unité d‟enseignement à part entière et ont pour objectif
l‟acquisition
de
compétences
pratiques
et
méthodologiques,
d‟une
part,
pour
l‟expérimentation en physiologie animale et, d‟autre part, pour l‟analyse des régulations des
grandes fonctions physiologiques chez l‟homme et l‟animal. Lors de ces TP, les étudiants sont
également initiés aux bonnes pratiques de laboratoire en remplissant un cahier de laboratoire.
Ces TP sont répartis en cinq séances de trois heures et cinq autres séances de quatre
heures, soit un équivalent de 35 heures par groupe. Au cours de mes trois années de
monitorat, j‟ai encadré au total trois groupes (effectif moyen : 15 étudiants par séance) soit un
total de 105 heures au cours de ma thèse
Étude de la consommation de dioxygène chez l’homme et chez la souris
Le but de ce TP est d‟évaluer la consommation de dioxygène chez l‟homme au repos
et au cours d‟un travail mécanique (flexions), et d‟estimer la valeur du métabolisme
énergétique de repos. Les étudiants comparent les valeurs obtenus sur 2 d‟autres eux pour
tenter d‟établir une relation entre leurs caractéristiques personnelles (poids, sexe, taille,
conditions physiques) et la valeur du métabolisme de repos correspondante. La mesure de la
consommation de dioxygène est ensuite évaluée chez la souris à l‟aide d‟un respiromètre
volumétrique à pression constante. Ce système permet de déterminer à la fois les volumes
d‟oxygène consommé et de dioxyde de carbone rejetés, et permet donc de calculer le quotient
respiratoire de la souris. Les étudiants concluent ensuite sur une comparaison des résultats
obtenus chez l‟homme et chez la souris.
Étude de la contraction du muscle squelettique de grenouille
L‟objectif de ce TP est de comprendre le rôle des activités électriques nerveuse et
musculaire dans la contraction du muscle squelettique ainsi que de mettre en évidence les
mécanismes siégeant au niveau des synapses neuromusculaires. Les étudiants doivent mettre
en évidence dans ce TP (i) le phénomène de recrutement des fibres musculaires, et (ii) les
phénomènes de sommation des contractions (fusion de deux contractions, phénomènes de
tétanos imparfait et parfait). Le rôle du neurotransmetteur et le phénomène d‟acidification du
muscle au cours de la fatigue musculaire sont également mis en évidence dans ce TP. Les
étudiants doivent ensuite conclure quant au fonctionnement de la jonction neuromusculaire.
230
Électromyographie – Réflexe myotatique chez l’homme
Les objectifs de ce TP sont de caractériser l‟activité électrique globale (i) d‟un muscle
lors de contractions volontaires, (ii) de deux muscles antagonistes au cours de contractions
volontaires alternées et (iii) d‟un muscle lorsqu‟il est le siège d‟un réflexe myotatique avant et
après la manœuvre de Jendrassik permettant de mettre en évidence la facilitation des
motoneurones α par les motoneurones γ. Les étudiants doivent conclure sur le TP en réalisant
un schéma complet des mécanismes étudiés.
Enregistrement des mouvements spontanés de l’intestin de rat
L‟objectif de ce TP est d‟évaluer le rôle du système nerveux autonome sur les
contractions intestinales à partir d‟un segment de duodénum de rat monté dans une cuve à
organe isolé. Après avoir enregistré les mouvements pendulaires normaux, les étudiants
injectent dans la cuve des doses croissantes cumulées d‟ACh, en présence ou non d‟atropine,
puis d‟isoprénaline, en présence ou non de Nadolol. À partir des tracés obtenus les étudiants
doivent construire les courbes concentration-réponse correspondantes et conclure quant aux
modes d‟action cellulaire des substances utilisées puis réaliser un schéma général de la
régulation de la motricité intestinale.
Électrocardiographie chez l’homme
L‟objectif de ce TP est d‟illustrer plusieurs notions d‟électrocardiographie abordées en
cours que sont : connaître les différentes dérivations bipolaires et unipolaires du plan frontal,
savoir définir la théorie d‟Einthoven et son triangle, savoir calculer l‟axe électrique du cœur à
partir d‟un électrocardiogramme. La relation entre activité électrique et activité mécanique du
cœur est abordée grâce à l‟enregistrement simultané de l‟électrocardiographe et du débit
cardiaque (obtenu indirectement par un capteur de bout de doigt).
Clairance de l’inuline chez le rat
L‟objectif de ce TP est de déterminer le taux de filtration glomérulaire d‟un rat
anesthésié à partir de la clairance de l‟inuline. Lors de ce TP, les étudiants doivent poser
différents cathéters : sur la veine jugulaire de rat pour y perfuser un mélange de mannitol +
inuline, un au niveau de l‟artère carotide pour un prélèvement sanguin, et un au niveau de la
vessie pour récolter les urines et déterminer la diurèse du rat. Les concentrations plasmatique
et urinaire en inuline sont ensuite dosées par colorimétrie à partir d‟une gamme étalon
d‟inuline préalablement préparée. Les étudiants doivent ainsi calculer la clairance de l‟inuline
231
du rat et déterminer le taux de filtration glomérulaire du rat, puis conclure sur la fonction
rénale.
Régulation de la sécrétion pancréatique chez le rat
L‟objectif de ce TP est de mettre en évidence la double régulation, nerveuse et
hormonale, de la sécrétion du suc pancréatique chez le rat. Pour ce faire, les étudiants placent
un cathéter au niveau du canal cholédoque d‟un rat anesthésié, à proximité de son
embouchure avec l‟intestin, et clampent l‟arrivée de la bile pour ne recueillir que le suc
pancréatique. Les étudiants déterminent la sécrétion de suc pancréatique dans des conditions
basales et suite à des injections d‟ACh ou de sécrétine via un cathéter préalablement introduit
dans la veine jugulaire de l‟animal. Les étudiants doivent discuter et conclure quant au mode
de régulation de la sécrétion pancréatique chez le rat.
Régulation de la pression artérielle chez le rat
L‟objectif de ce TP est d‟évaluer le rôle du système nerveux autonome sur la
régulation de la pression artérielle. Lors de ce TP, les étudiants doivent mesurer les variations
de pression artérielle chez un rat préalablement anesthésié grâce à un capteur de pression
introduit dans l‟artère carotide du rat. Les étudiants réalisent des injections d‟ACh et
d‟isoprénaline dans la veine jugulaire et évaluent le rôle hypo ou hypertenseur de ces
molécules. Également, la notion d‟intégration nerveuse est abordée en clampant la seconde
artère carotide créant ainsi une hypertension au niveau cardiaque mais une hypotension au
niveau cérébral. Les étudiants concluent sur le rôle du système nerveux autonome dans la
régulation de la pression artérielle.
Cœur isolé perfusé de rat par la technique de Langendorff
L‟objectif de ce TP est d‟étudier la contractilité cardiaque intrinsèque par la technique
de cœur isolé perfusé à pression constante chez le rat. Après avoir enregistré les paramètres
inotrope, lusitrope et chronotrope de base, les étudiants évaluent le rôle des ions K+ et Ca2+
dans la contractilité cardiaque en perfusant le cœur par des solutions hypocalcique puis
hyperpotassique. Après retour aux paramètres de base, les étudiants perfusent le cœur par des
solutions croissantes d‟isoprénaline puis d‟ACh. Ils doivent alors construire des courbes
concentration-réponse à l‟isoprénaline et à l‟ACh pour chaque paramètre étudié. Enfin, les
étudiants concluent sur le rôle des ions dans la contractilité cardiaque et sur le rôle du système
nerveux autonome dans la régulation de la contractilité cardiaque.
232
Étude des potentiels d'action cardiaques chez la grenouille enregistrés à l'aide de
microélectrodes intracellulaires
L‟objectif de ce TP est d‟enregistrer des PA cardiaques ventriculaires à l‟aide de la
technique des microélectrodes de verre et d‟étudier l‟influence de différentes substances
pharmacologiques (neurotransmetteurs et inhibiteurs des canaux calciques) sur le décours et
la fréquence des PA. Ils enregistrent les PA cardiaques dans les conditions contrôles ou en
présence de différentes substances pharmacologiques : ACh, Adr, nifédipine. Pour chaque
condition, les étudiants doivent déterminer le potentiel membranaire de repos, l‟amplitude
totale du PA, la durée du PA à 30 %, 50 % et 90 % de repolarisation ainsi que la fréquence
des PA. Les étudiants doivent ainsi conclure sur les effets des différentes substances
pharmacologiques testées sur les PA cardiaques.
233
The First Step
The young poet Evmenis
complained one day to Theocritos:
"I've been writing for two years now
and I've composed only one idyll.
It's my single completed work.
I see, sadly, that the ladder
of Poetry is tall, extremely tall;
and from this first step I'm standing on now
I'll never climb any higher."
Theocritos retorted: "Words like that
are improper, blasphemous.
Just to be on the first step
should make you happy and proud.
To have reached this point is no small achievement:
what you've done already is a wonderful thing.
Even this first step
is a long way above the ordinary world.
To stand on this step
you must be in your own right
a member of the city of ideas.
And it's a hard, unusual thing
to be enrolled as a citizen of that city.
Its councils are full of Legislators
no charlatan can fool.
To have reached this point is no small achievement:
what you've done already is a wonderful thing."
Constantine P. Cavafy
234
Etude du système bêta-adrénergique dans 2 modèles d’insuffisance cardiaque : la
cardiomyopathie du choc septique et l’insuffisance cardiaque à fraction d’éjection préservée
Trois sous-types de récepteurs β-adrénergiques (β-AR) ont été identifiés au niveau cardiovasculaire, β1-, β2- et
β3-AR. Des altérations β-AR sont impliquées dans de nombreuses pathologies cardiovasculaires. De plus, les
β-AR sont actuellement identifiés comme des cibles thérapeutiques efficaces dans plusieurs pathologies comme
l‟insuffisance cardiaque (IC).
Le choc septique est considéré comme une IC aiguë. Bien que sa thérapeutique implique l‟utilisation
d‟agonistes β-AR, la noradrénaline et la dobutamine, une controverse existe quant à leur utilisation car peu de
données sont rapportées sur le remodelage β-AR cardiovasculaire dans cette pathologie. Le premier objectif de
cette thèse a donc été d‟évaluer le remodelage β-AR cardiovasculaire chez le rat en choc endotoxémique. Nous
avons mis en évidence dans ce modèle une augmentation de la vasorelaxation β2-AR et de la réponse β1-AR
cardiaque.
L‟IC à fraction d‟éjection préservée (ICFEp) est la forme majoritaire d‟IC. Cette pathologie liée au
vieillissement est un problème de santé public majeur. La physiopathologie complexe associée à un manque de
modèle animal pertinent conduit à l‟absence de traitement spécifique pour l‟ICFEp. L‟équipe dans laquelle a été
réalisé ce travail possède un modèle de rat transgénique surexprimant le β 3-AR humain à la membrane des
cellules endothéliales. Le second objectif de cette thèse a donc été de caractériser ce modèle à 30 semaines.
Nous avons pu mettre en avant chez ces animaux un profil proche du patient ICFEp, c'est-à-dire la mise en
place d‟une dysfonction diastolique, sans altération de la fraction d‟éjection, associée à une fibrose
myocardique. Ce rat est donc un modèle pertinent pour l‟étude de l‟ICFEp.
Mots clés : récepteurs β-adrénergiques, choc septique, insuffisance cardiaque à fraction d‟éjection préservée,
modèle animal
Cardiovascular beta-adrenergic remodeling in two types of heart failure : the septic shock
and heart failure with preserved ejection fraction
Three β-adrenoceptors (β-AR) are described in the cardiovascular system, β1-, β2- and β3-AR. Alterations of βAR are involved in numerous cardiovascular diseases. Moreover, β-AR are currently identified as efficient
therapeutic targets in diseases like heart failure (HF).
The septic shock is described as an acute HF. While its therapeutic involved β-AR agonists, norepinephrine and
dobutamine, discrepancies exist concerning the relevance of these agents as very few studies evaluate the
cardiovascular β-AR remodeling in this disease. In this context the first part of this PhD work focus on the
cardiovascular β-AR remodeling in an endotoxemic rat model. We demonstrated both increased β2-AR
vasodilation and β1-AR cardiac contractility in this model.
HF with preserved ejection fraction (HFpEF) is the predominant form of HF. This disease associated with aging
is a growing public health burden. The complex pathophysiology associated with a lack of relevant animal
model lead to an absence of efficient treatment for this disease. Pr C. Gauthier‟s team developed a transgenic rat
model overexpressing β3-AR at the membrane of endothelial cells. In this context the second part of this PhD
work focus on the characterization of this transgenic rat model at 30 weeks. We demonstrated a close profile to
the human ICFEp in this model i.e. an altered diastolic function associated with a preserved ejection fraction
and an increased myocardial fibrosis. This transgenic rat is therefore a relevant model for researches on ICFEp.
Key words : β-adrenoceptors, septic shock, heart failure with preserved ejection fraction, animal model
235