Christine Pascal (format )

Étude des interactions entre les tanins du vin et les
protéines salivaires humaines riches en proline en
relation avec la sensation d’astringence
Christine PASCAL
UMR Sciences pour l’Oenologie (SPO)/
UMR Ingénierie des Réactions
Biologiques, Bioproductions (IR2B)
INRA Montpellier
Colloque GDR AMV – Pessac - Décembre 2005
Contexte scientifique
Raisin et vin:
Salive et colles œnologiques:
Tanins = polymères de
flavan-3-ols
Protéines Riches en Proline (PRP)
OH
OH
O
HO
H
N
OH
O
OH
COOH
OH
O
OH
OH
Astringence
Enjeux et stratégie
Enjeux
Comprendre les mécanismes d’interaction protéines / tanins
Comprendre l’origine de l’astringence
Maîtrise des procédés (collage, vinification)
Stratégie
Production d’une PRP salivaire humaine par voie hétérologue
Étude de ses interactions avec un monomère de flavan-3-ol
échelle moléculaire
échelle supramoléculaire
Production de PRP salivaires humaines par voie hétérologue
Proprotéine PRB4S: 6 sites de glycosylation + site de clivage
pour la furine
PRB4S
furine
IB-5
basique
+
II-1
glycosylée
M. Chan, A. Bennick, Proteolytic processing of a human salivary proline-rich protein
precursor. Eur. J. Biochem. 268 (2001) 3423-3431.
Organisme hôte: Pichia pastoris
maturation possible, production du mg au g.L-1
Fermenteur de 5L, 6 PRP de masses molaires
différentes produites
Chromatographie d’affinité sur silice
Tamisage moléculaire
M
Bl
eu
de
Purification:
Co
om
as
as
se
sie
sm
ola
ire
s
Production, purification et caractérisation des PRP
II-1
Caractérisation:
Séquençage N-terminal
MALDI TOF (après digestion trypsique)
50 mg d’IB-5
50 mg de II-1
IB-5
Étude des interactions entre PRP et tanins
Flavan-3-ol: EGCG
PRP: IB-5 (70 acides aminés,
basique, non glycosylée)
OH
OH
O
HO
OH
O
OH
OH
O
OH
OH
protéine intrinsèquement non
structurée= pas ou peu de
structure secondaire, grande
flexibilité de la chaîne protéique
Échelles d’étude
Supramoléculaire:
diffusion dynamique de lumière (PCS)
microcalorimétrie
Moléculaire:
microcalorimétrie
dichroïsme circulaire
RMN
Diffusion dynamique de lumière (PCS)
IB-5 0.2 mg/mL + EGCG 1 mM
IB-5 0.2 mg/mL + EGCG 1 mM
tailleph
(nm)
intensité
500
(kcps)
indice
de
polydispersité
IB-5 0.2 mg/mL + EGCG 1 mM
15003000
HCl pH 3.5 NaCl 5 mM
HCl pH 3.5 NaCl 100 mM
1,2
10002500
HCl pH 3.5 NaCl 5 mM
2000 1
tartrate 1.5 g/L pH 3.5
5001500
pH NaCl
3.5 NaCl
mM
HClHCL
pH 3.5
100 5mM
0,8
1000
0,6
HCl pH
100 mM
tartrate
1.53.5
g/LNaCl
pH 3.5
0 500
0,4
tartrate 1.5 g/L pH 3.5
0:00:00
12:00:00
24:00:00
36:00:00
48:00:00
0
0,2
0:00:00
12:00:00tem24:00:00
36:00:00
48:00:00
0
ps (h)
0:00:00
12:00:00 tem24:00:00
36:00:00
48:00:00
ps (h)
tem ps (h)
Dans HCl pH 3.5, NaCl 100 mM:
objets de taille élevée (agrégation)
diffusion plus importante que dans les autres solvants
indice de polydispersité faible
Microcalorimétrie
Collaboration avec le CERMAV (CNRS, Grenoble): Anne Imberty,
Catherine Gautier
HCl pH 3.5 NaCl 100 mM
Cellule:
IB-5 0.5 mg.mL-1
Titrée par:
EGCG 12.8 mM
Phénomènes successifs ? interaction, repliement, agrégation
Microcalorimétrie
Meilleur fit: « modèle à 2 sites »
Type 1
Type 2
n
15.1
2.0
K
8,6 104
609,0
∆H (kcal.mol-1)
-734.8
-2,2 104
∆S (kcal.mol-1.K-1)
20,1
-60,5
Séquence de la protéine: 20 sites potentiels
(successions de prolines et glycines)
17 sites au total
Dichroïsme circulaire
Collaboration avec le CBS (CNRS, Montpellier): Nathalie Declerck,
Yannick Bessin
IB-5 0.45 mg.mL-1 / EGCG 0.4 mM
HCl pH 3.5 NaCl 100 mM
Milliers
ellipticité (deg. cm².dmol1
IB-5 + EGCG HCl pH 3.5 NaCl 100 mM
10000
5000
0
-5000190
200
210
220
230
240
-10000
250
260
IB-5
IB-5 + EGCG
-15000
-20000
-25000
longueur d'onde (nm)
Changement de structure secondaire de la protéine: repliement
RMN du proton
Collaboration avec le CBS (CNRS, Montpellier): Marc André Delsuc
HCl pH 3.5 NaCl 100 mM / 10% D2O
IB-5 seule 3 mg.mL-1
IB-5 0.75 mg.mL-1
+ EGCG 1.25 mM
Proline
Chaînes aliphatiques
Modification des déplacements chimiques, élargissement des
raies: structure secondaire, rigidification
Conclusion et perspectives
Plusieurs échelles: mise en évidence de plusieurs phénomènes
Interaction (RMN)
Repliement (dichroïsme circulaire, RMN, microcalorimétrie)
Agrégation (diffusion de lumière, microcalorimétrie)
MAIS:
Concentrations utilisées pour les différentes méthodes différentes:
état des protéines en solution?
Rapports EGCG / protéine différents
Vérification de l’état des protéines à différentes
concentrations (agrégation): SAXS
Suivi d’une titration de la protéine par l’EGCG: SAXS / RMN
Remerciements
UMR SPO: Équipes « Technique
Intégrative » et « Systèmes
Supramoléculaires Impliquant les
Polyphénols »
Aude Vernhet
Hélène Boze
Robert Ratomahenina
Céline Poncet-Legrand
Pascale Sarni-Manchado
Véronique Cheynier
UMR IR2B: Équipe « Génie
Microbiologique et
Enzymatique »
Frédéric Bigey
Guy Moulin
Plateau protéomique SPO
CBS
Nathalie Declerck
Yannick Bessin
Marc André Delsuc
François Xavier Sauvage
CERMAV
Anne Imberty
Catherine Gautier