Entwicklung und Validierung eines Protein

Transcription

Tierärztliche Hochschule Hannover
Entwicklung und Validierung eines
Protein-Microarrays zur simultanen serologischen
Untersuchung von Fleischsaftproben auf Erreger
von Zoonosen und Produktionskrankheiten beim
Schwein
INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Grades eines Doktors der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae (Dr. med. vet.)
vorgelegt von
Sebastian Hahne
Bad Oeynhausen
Hannover 2014
Wissenschaftliche Betreuung:
Prof. Dr. Diana Meemken
Institut für Lebensmittelqualität und –sicherheit
Tierärztliche Hochschule Hannover
1. Gutachter:
Prof. Dr. Diana Meemken
2. Gutachter:
Prof. Dr. Ralph Goethe
Tag der mündlichen Prüfung: 12.06.2014
Gefördert durch:
Gefördert durch das Bundesministerium für Ernährung,
Landwirtschaft und Verbraucherschutz aufgrund eines
Beschlusses des Deutschen Bundestages
Gefördert über die Bundesanstalt für Landwirtschaft und
Ernährung (BLE), Förderkennzeichnen 28011HS013
Meiner Familie gewidmet
Erste Ergebnisse dieser Arbeit wurden bereits veröffentlicht:
MEEMKEN, D., S. HAHNE, G. KLEIN, C. ENGEMANN, J. GABERT, T. BLAHA,
(2012):
Der Microarray als simultanes, miniaturisiertes Testsystem zur Nutzung im
Rahmen der "Fleischsaftmultiserologie"
In: ALPHA Informationsgesellschaft; Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft;
Bundesverband der beamteten Tierärzte (Hrsg.): Amtstierärztlicher Dienst und
Lebensmittelkontrolle (Sonderausgabe) 53. Arbeitstagung des Arbeitsgebietes
Lebensmittelhygiene: Dreiländertagung; Programm- und Abstract-Band, GarmischPartenkirchen, 25.-28.09.2012; Lampertheim: Alpha Informationsgesellschaft,
2012, 102
MEEMKEN, D., S. HAHNE, G. KLEIN, C. BÄCHLEIN, C. ENGEMANN, J. GABERT,
T. BLAHA, (2012):
Einsatz von Microarrays im Rahmen der "Fleischsaftmultiserologie"
In: Ellerbroek, L. (Hrsg.): Abstracts zum BfR-Symposium: Zur Weiterentwicklung
der Fleischuntersuchung - Stand und Perspektiven BfR-Symposium: Zur
Weiterentwicklung der Fleischuntersuchung - Stand und Perspektiven, Berlin,
07.02.2013; 2013, 12
HAHNE, S., T. BLAHA, G. KLEIN, C. ENGEMANN, J. GABERT, C. SANDER, D.
LICHTER, D. MEEMKEN (2013):
"Meat Juice Multi-Serology" - development of a swine specific microarray
In: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft (Hrsg.): 16th International
symposium of the World Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians
(WAVLD), 10th OIE Seminar, 32nd Symposium of AVID Berlin, Germany, 05.08.06.2013; Giessen: DVG Service, 2013, 48
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis ........................................................................................... 1
1
Einleitung ........................................................................................................... 1
2
Literaturübersicht .............................................................................................. 3
2.1
Rechtliche Grundlagen ................................................................................. 3
2.2
Tiergesundheitsprogramme ......................................................................... 5
2.2.1 Tiergesundheitsüberwachung in Dänemark ............................................. 5
2.2.2 Tiergesundheitsüberwachung in den Niederlanden .................................. 6
2.2.3 Tiergesundheitsüberwachungsprogramme in Deutschland ...................... 7
2.3
Antikörper - ein Einblick in die Immunologie ................................................. 9
2.3.1 Maternale Antikörper und die immunologische Lücke ............................ 12
2.4
Vor- und Nachteile der serologischen Untersuchung ................................. 14
2.5
Serologische Testsysteme – eine Auswahl ................................................ 15
2.5.1 ELISA als Testsystem............................................................................. 15
2.5.2 Protein-Microarray als Testsystem ......................................................... 17
2.5.3 Bead-based Technologie als Testsystem ............................................... 19
2.5.4 Vor- und Nachteile ähnlicher Verfahren gegenüber der MicroarrayTechnologie ....................................................................................................... 20
2.5.4.1
ELISA ............................................................................................. 20
2.5.4.1.1 Vorteile ....................................................................................... 20
2.5.4.1.2 Nachteile .................................................................................... 21
2.5.4.2
X-Map-Technologie ........................................................................ 21
2.5.4.2.1 Vorteile ....................................................................................... 21
2.5.4.2.2 Nachteile .................................................................................... 21
2.6
Untersuchungsmedium Fleischsaft ............................................................ 21
2.7
Ausgewählte Erreger .................................................................................. 22
2.7.1 Ausgewählte lebensmittelsicherheitsrelevante Erreger .......................... 23
2.7.1.1
Salmonella spp. .............................................................................. 23
2.7.1.2
Toxoplasma gondii ......................................................................... 25
2.7.1.3
Trichinella spiralis ........................................................................... 26
2.7.1.4
Yersinia enterocolitica .................................................................... 27
2.7.1.5
Hepatitis E-Virus............................................................................. 28
2.7.2 Tiergesundheitsrelevante Antigene ........................................................ 29
3
2.7.2.1
Influenza A ..................................................................................... 29
2.7.2.2
Mycoplasma hyopneumoniae ......................................................... 30
2.7.2.3
Actinobacillus pleuropneumoniae ................................................... 31
2.7.2.4
PRRSV ........................................................................................... 32
Material und Methoden ................................................................................... 34
3.1
Material ...................................................................................................... 34
3.1.1 Probenmaterial ....................................................................................... 34
3.1.2 Antigenmaterial ....................................................................................... 35
3.1.3 ELISA-Test-Material ............................................................................... 38
3.1.4 Der Microarray ........................................................................................ 39
3.1.5 Sonstige Materialen ................................................................................ 41
3.2
Methoden ................................................................................................... 42
3.2.1 Entwicklung eines Testprotokolls ............................................................ 42
3.3
Vergleichsuntersuchung Microarray vs. ELISA .......................................... 46
3.4
Statistische Auswertung ............................................................................. 48
3.4.1 Verfahren der deskriptiven Statistik ........................................................ 48
3.4.2 ROC-Kurve ............................................................................................. 48
3.4.3 Bland-Altman-Analyse ............................................................................ 51
3.4.4 Passing-Bablok-Regressionsanalyse ..................................................... 53
4
Ergebnisse ....................................................................................................... 55
4.1
Ablauf der Testentwicklung ........................................................................ 55
4.1.1 Vorbereitung des Microarrays ................................................................. 56
4.1.2 Fleischsaft als Untersuchungsmedium ................................................... 57
4.1.3 Konjugate ............................................................................................... 59
4.1.4 Waschschritte ......................................................................................... 60
4.1.5 Substrat .................................................................................................. 60
4.2
Ergebnisse der Vergleichsuntersuchung ELISA vs. Microarray nach
Erregern ................................................................................................................ 63
4.2.1 Lebensmittelsicherheitsrelevante Erreger ............................................... 63
4.2.1.1
Salmonella spp. .............................................................................. 63
4.2.1.2
Toxoplasma gondii ......................................................................... 75
4.2.1.3
Trichinella spp. ............................................................................... 80
4.2.1.4
Yersinia enterocolitica .................................................................... 84
4.2.1.5
Hepatitis E-Virus............................................................................. 90
4.2.2 Tiergesundheitsrelevante Erreger........................................................... 94
5
4.2.2.1
Influenza A ..................................................................................... 94
4.2.2.2
Mycoplasma hyopneumoniae ......................................................... 98
4.2.2.3
Actinobacillus pleuropneumoniae ................................................. 101
4.2.2.4
PRRSV ......................................................................................... 105
Diskussion ..................................................................................................... 110
5.1
Der Arbeitsplan......................................................................................... 110
5.2
Auswahl der Erreger................................................................................. 111
5.3
Akquirierung der Materialien .................................................................... 111
5.4
Entwicklung des Testablaufes .................................................................. 112
5.5
Validierung anhand von ELISA-Werten .................................................... 113
5.5.1 Salmonella spp. .................................................................................... 113
5.5.2 Toxoplasma gondii................................................................................ 114
5.5.3 Trichinella spp....................................................................................... 114
5.5.4 Yersinia enterocolitica........................................................................... 115
5.5.5 Hepatitis E-Virus ................................................................................... 116
5.5.6 Influenza A ............................................................................................ 116
5.5.7 Mycoplasma hyopneumoniae ............................................................... 117
5.5.8 Actinobacillus pleuropneumoniae ......................................................... 117
5.5.9 PRRSV ................................................................................................. 118
5.6
Grenzen und Erweiterungsmöglichkeiten ................................................. 118
5.7
Nutzbarkeit von serologischen Profilen .................................................... 119
6
Zusammenfassung ........................................................................................ 123
7
Summary ........................................................................................................ 125
Literaturverzeichnis ............................................................................................. 127
Gesetze und Verordnungen ................................................................................. 140
Tabellenverzeichnis ............................................................................................. 141
Abbildungsverzeichnis ........................................................................................ 143
Anhang .................................................................................................................. 148
Danksagung .......................................................................................................... 153
Abkürzungsverzeichnis
Ag
Antigen
Ak
Antikörper
bzw.
beziehungsweise
d.h.
das heißt
DMA
Danish Meat Association
EfQ
Erzeugergemeinschaft für Qualitätstiere Syke-Bassum eG
EFSA
European Food Safety Authority
EG
Europäische Gemeinschaft
EGF
Erzeugergemeinschaft der Qualitätsferkel
ELISA
Enzyme linked Immoabsorbend assay
EU
Europäische Union
FLI
Friedrich-Löffler-Institut
GD
Gezondheidsdienst voor Dieren b.v.
i.A.
Im Allgemeinen
IgA
Immunoglobulin A
IgD
Immunoglobulin D
IgE
Immunoglobulin E
IgG
Immunoglobulin G
IgM
Immunoglobulin M
IKB
Integrale Keten Beheersing
LPS
Lipopolysaccharid
PCV2
Porcines Circovirus 2
p.i.
post infectionem
PRRSV
Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus
SPF
specific pathogen free
TiGA
Tiergesundheitsagentur
Vgl.
Vergleich
VO
Verordnung
vs.
versus
WHO
World Health Organization
z.B.
zum Beispiel
ZNGV
Vermarktungsgemeinschaft für Zucht- und Nutzvieh e. G.
Einleitung
1 Einleitung
Das neue Lebensmittelsicherheitskonzept der Europäischen Union verfolgt neben
einer stetigen Verbesserung der Lebensmittelsicherheit zwei weitere Ziele. Zum
einen eine kontinuierliche Verbesserung der Tiergesundheit und zum anderen eine
Erhöhung des Tierwohlniveaus in den Herkunftsbeständen.
Dies ist ein wesentlicher Bestandteil der maßgeblich von der EFSA koordinierten
vielfältigen Bemühungen und Entwicklungen zur Umsetzung des sogenannten
„Hygienepaketes der EU“ (VO [EG] Nr. 178/2002, Nr. 852-854/2004, Nr. 882/2004).
Die Einbeziehung aller Stufen der Lebensmittelkette (food safety from stable to table)
und die Nutzung und der Austausch von Informationen z.B. zur Tiergesundheit und
zu latenten Infektionen mit Zoonoseerregern der für die Schlachtung vorgesehenen
Tieren stehen dabei im Vordergrund.
Innerhalb der sogenannten risikoorientierten Schlachttier- und Fleischuntersuchung
stellen insbesondere solche Informationen, gewonnen aus labordiagnostischen
Untersuchungen, einen wichtigen Anteil dar.
So ist zum Beispiel in der Verordnung (EG) Nr. 1244/2007 als eine Voraussetzung
zur Zulassung von Mastschweinen zur risikoorientierten Fleischuntersuchung ohne
Anschnitte
das
Einbeziehen
von
mikrobiologischen
und/oder
serologischen
Monitoringergebnissen angegeben. In Deutschland wird derzeit nur die serologische
Untersuchung auf Salmonellen-Antikörper nach der sogenannten SchweineSalmonellenverordnung aus dem Jahr 2007 routinemäßig durchgeführt.
Ziel, der in der vorliegenden Arbeit aufgeführten Untersuchungen, war es, ein
Testsystem zu entwickeln, welches eine sinnvolle Erweiterung des serologischen
Monitorings ermöglichen könnte.
Die Idee war, zum einen den Nutzen der für das Salmonellenmonitoring
entnommenen Probe „Fleischsaft“ zu erhöhen, indem mehr Informationen als nur der
1
1
Antikörpergehalt
gegen
Salmonellen
gewonnen
Einleitung
werden.
Durch
zusätzliche
Untersuchungen der bereits gewonnenen Probe auf Antikörper gegen andere
Erreger, würde dem gesamten Probengewinnungs- und –verarbeitungsprozess mehr
Effizienz beizumessen sein.
Zum anderen bietet sich die Möglichkeit durch ein Monitoring über verschiedenen
Krankheiten zu einer kontinuierlichen Verbesserung der Lebensmittelsicherheit
(Zoonosen) und der Herdengesundheit und folglich auch des Tierwohlniveaus
beitragen zu können.
Die dargestellten Untersuchungen und aufgeführten Ergebnisse beschreiben die
Entwicklung und Validierung eines Untersuchungsverfahrens zur gleichzeitigen
Erfassung von Antikörpern gegen verschiedene Erreger auf Basis eines ProteinMicroarray-Tests, welches im Folgenden als „multiserologische Untersuchung“
aufgeführt wird. Eine simultane serologische Erkennung von verschiedenen
„schweinespezifischen“
sowie
zoonotischen
Erregern
Untersuchungsmedium Fleischsaft soll ermöglicht werden.
2
aus
dem
Literaturübersicht
2 Literaturübersicht
2.1 Rechtliche Grundlagen
Die im Jahr 2002 in Kraft getretene Verordnung (EG) Nr. 178/2002 beinhaltet die
aktuellen Grundsätze und Anforderungen des europäischen Lebensmittelrechts. In
Kapitel 1 Artikel 1 Absatz 1 wird das Ziel der Verordnung, die Grundlage für ein
hohes
Schutzniveau
für
die
Gesundheit
des
Menschen
und
die
Verbraucherinteressen bei Lebensmitteln schaffen, aufgestellt. Wichtig ist, wie in
Kapitel 1 Artikel 1 Absatz 3 erwähnt, dass dabei alle Produktions-, Verarbeitungsund Vertriebsstufen von Lebensmitteln und Futtermitteln beachtet werden. Die
gesamte Lebensmittelkette wird mit einbezogen (from stable to table).
Im Jahr 2004 wurde das sogenannte “Hygienepaket” verabschiedet, welches
detaillierter
auf
die
Kontrolle
der
Lebensmittel,
die
Lebensmittelhygiene,
insbesondere auf die bei Lebensmitteln tierischen Ursprungs sowie dem Verfahren
bei der Überwachung eingeht. Darin ist festgehalten, dass Informationen zur
Lebensmittelkette vorliegen müssen. In Anhang II Abschnitt III der VO (EG) Nr.
853/2004 sind diese näher beschrieben. Ergebnisse von Proben, die zur Diagnose
von Krankheiten sowie zur Zoonosen- und Rückstandsüberwachung und bekämpfung dienen, gehören zu diesen Informationen. Des Weiteren sollen
Ergebnisse von früheren Schlachtpartien aus dem Herkunftsbetrieb einbezogen
werden.
In VO (EG) Nr. 854/2004 werden Angaben über die Art der Überwachung gemacht.
Dabei kann auf Grundlage von ausreichenden Informationen der Lebensmittelkette
eine
risikoorientierte
Fleischuntersuchung
durchgeführt
werden.
Genauere
Bestimmungen zu der Durchführung einer solchen Untersuchung sind in der VO
(EG) Nr. 1244/2007 aufgeführt.
3
Literaturübersicht
Eine Voraussetzung zur Zulassung von Mastschweinen zur risikoorientierten
Fleischuntersuchung ohne Anschnitte ist das Einbeziehen von mikrobiologischen
und/oder serologischen Monitoringergebnissen.
Als Erweiterung zu der bisher üblichen amtlichen Prüfung auf Genusstauglichkeit für
den menschlichen Verzehr werden von dem europäischen Lebensmittelkonzept der
EFSA nunmehr zwei weitere Ziele verfolgt. Zum einen wird eine stetige
Verbesserung der Tiergesundheit gefordert. Ein anderes Ziel ist die Optimierung des
Tierwohls
der
zur
Fleischgewinnung
gehaltenen
Tiere
und
damit
der
tierschutzrelevanten und haltungsbedingten Probleme.
Nach
der
Scientific
Opinion
der
EFSA
aus
dem
Jahr
2011
zu
den
Gesundheitsgefahren im Zusammenhang mit der amtlichen Fleischuntersuchung
wird ein serologisches Monitoring der Zoonoseerreger Salmonellen, Yersinien,
Toxoplasmen und Trichinen zur Verbesserung der Lebensmittelsicherheit für sinnvoll
erachtet (EFSA 2011b).
In Deutschland wird bisher nur ein serologisches Salmonellenmonitoring, geregelt
durch die nationale „Schweine-Salmonellen-Verordnung“, durchgeführt. Diese
Untersuchungen können mit Blutserum, entnommen im Tierbestand frühestens 14
Tage
vor
der
Schlachtung,
oder
mit
Fleischsaft,
entnommen
Schlachttierkörpern im Schlachtbetrieb, durchgeführt werden.
4
von
den
Literaturübersicht
2.2 Tiergesundheitsprogramme
2.2.1 Tiergesundheitsüberwachung in Dänemark
Seit 1971 wird in Dänemark das „specific pathogen free -System“ (SPF-System) zur
Überwachung des Gesundheitsstatus in der Schweineproduktion durchgeführt.
Nach Angaben des Danish Agriculture and Food Council waren Anfang September
2009 bereits 98% aller gehandelten Zuchttiere in Dänemark SPF-Tiere und somit in
dem Überwachungssystem registriert (Danish Agriculture and Food Council 2009a).
Die Organisation dieser landesweiten Gesundheitsdatenbank übernimmt die Danish
Meat Association (DMA), welche sich aus Fleischverbänden der Schweine-, Rinderund Geflügelfleischproduktionen zusammensetzt. Je nach Status werden die
Bestände in die Sicherheitsniveaus “rot” für besseres Niveau, “blau” für Bestände mit
bekannter Information oder “grün” für Bestände, die noch nicht eingeteilt wurden,
aber am SPF-System teilnehmen, eingeteilt. Als letzte Gruppe werden als
“unbekannt” die herkömmlichen Betriebe gelistet, welche nicht an dem SPF-System
teilnehmen. Bei den zu untersuchenden Krankheiten handelt es sich um die in
Tabelle 1 dargestellten Erreger.
Die Teilnahme ist freiwillig und erfordert regelmäßige Kontrollen durch serologische
Untersuchungen und Bestandsbesuche. Die rot markierten Betriebe, welche sich aus
Zucht- und Vermehrungsbetriebe zusammensetzen, werden monatlich serologisch
untersucht. Im blauen Niveau befindliche Betriebe, welche v.a. Ferkelerzeuger und
Mastbetriebe
sind,
werden
mindestens
alle
15
Wochen
durch
den
bestandsbetreuenden Tierarzt kontrolliert. Hier werden jährlich serologische
Untersuchungen durchgeführt (Danish Agriculture and Food Council 2009b).
5
Literaturübersicht
Tabelle 1:
Liste der im SPF-System zu untersuchenden Erreger (Krankheiten)
(modifiziert nach Danish Agriculture and Food Council 2009b)
Abk.
Erreger
Ap
Actinobacillus pleuropneumoniae, Serotypen 1-10 und 12
Myc
Mycoplasma hyopneumoniae
Dys
Brachyspira hyodysenteriae
Nys
Toxin bildende Pasteurella multocida und Bordetella bronchiseptica
PRRS
Porzines Reproduktives und Respiratorisches Syndrom
DK-Virus (Europäisches Virus) und Vakzine-Virus (Amerikanisches Virus)
Lus
Laus
Skab
Räudemilbe
2.2.2 Tiergesundheitsüberwachung in den Niederlanden
Vom
Gezondheidsdienst
voor
Dieren
b.v.
(GD),
einem
unabhängigen
Veterinäruntersuchungsinstitut in den Niederlanden, das für Auftraggeber aus
Wirtschaft, Staat und dem Primärsektor arbeitet, wurde 2012 das PigMatch-System
eingeführt (CZEKALA et al. 2013).
Das System ist besonders an Schweinezüchter und –vermehrer gerichtet. Innerhalb
des PigMatch-Systems besteht die Möglichkeit zwischen drei Levels zu wählen:
PM12, PM6 und PM3.
Sie
unterscheiden
sich
in
der
Beprobungsfrequenz
und
der
Anzahl
der
Betriebsinspektionen. Je nach Betriebssituation und Vermarktungsmöglichkeiten
wählt ein Teilnehmer den für sich optimalen Level. Es werden serologische
Untersuchungen auf die Erreger Actinobacillus pleuropneumoniae (verschiedene
Serotypen), Brachyspira hyodysenteriae/pilosicoli, Toxin bildende Pasteurella,
Mycoplasma hyopneumoniae, PRRSV, Salmonella spp. und Sarcoptes durchgeführt.
6
Literaturübersicht
Das IKB-System (Integrale Keten Beheersing), welches sich eher an Mastbetriebe
wendet, verfolgt Maßnahmen zur Salmonellenbekämpfung. Vergleichbar zu dem QSMonitoring,
welches
in
Deutschland
durchgeführt
wird,
wird
in
Mastschweinebetrieben durch serologische Untersuchungen der Salmonellen-Status
des jeweiligen Betriebes bestimmt. Der Betrieb wird dann in eine der drei
Salmonellenkategorien „leicht", „mäßig" oder „schwer kontaminiert" eingeteilt.
Betriebe der Kategorie „schwer kontaminiert“ müssen dann einen Interventionsplan
erarbeiten, um wieder in die Kategorien eins oder zwei zu gelangen.
Des Weiteren ist der sogenannte Biggen Pas (Ferkelpass), welcher im Jahr 2009
eingeführt wurde, vorhanden. Er stellt ein Dokument dar, in dem vom Ferkelerzeuger
durchgeführte Maßnahmen dokumentiert werden. Diese werden dann an den Mäster
weitergegeben. Eine Datenbank, Monitoring oder Kontrollen sind hierbei nicht
vorhanden.
2.2.3 Tiergesundheitsüberwachungsprogramme in Deutschland
In
Deutschland
werden
auf
Landesebene
verschiedene
Gesundheitsüberwachungsprogramme für Schweine durchgeführt.
Von der Vermarktungsgemeinschaft für Zucht- und Nutzvieh e. G. (ZNVG) wurde
1998
ein
vom
bestandsbetreuenden
Tierarzt
durchzuführendes
ZNVG-
Monitoringprogramm beschrieben. Dabei werden vierteljährlich Proben genommen,
wobei
serologisch
auf
Antikörper
gegen
Salmonellen,
Actinobacillus
pleuropneumoniae, PRRSV und Brachyspira hyodysenteriae untersucht wird
(SEYBOLD 2009).
Bei teilnehmenden Betrieben am EGF-Monitoring (Erzeugergemeinschaft der
Qualitätsferkel im Raum Osnabrück) werden halbjährlich Blutproben genommen.
Diese werden auf Salmonellen sowie PRRSV untersucht, wobei die Testung auf
PRRSV abhängig vom Impfstatus serologisch oder molekularbiologisch mittels PCR
erfolgt. Auf weitere Erreger (Actinobacillus pleuropneumoniae, PCV2, Lawsonia
7
Literaturübersicht
intracellularis, Influenza A-Virus und M. hyopneumoniae) wird bei klinischem
Verdacht untersucht.
Seit
2007
wurde
im
Emsland
Schweinegesundheitsdienst
das
von
dortigen
Erzeugergemeinschaften
„Emslandscreening“
eingeführt.
Hier
und
werden
halbjährlich zehn Ferkel pro Bestand auf Antikörper gegen Salmonellen und
Actinobacillus pleuropneumoniae und molekularbiologisch auf Genomfragmente von
PRRSV und PCV2.
In NRW gibt es den „Westfalenpass“. Hier wird in der gleichen Altersgruppe, bei
gleichem Probenumfang untersucht, wobei hier auch die serologische Untersuchung
für PRRSV durchgeführt wird. Außerdem werden Lungenspülproben bakteriologisch
auf Actinobacillus pleuropneumoniae, M. hyopneumoniae, Pasteurellen, Bordetellen
und Haemophilus parasuis sowie Sammelkotproben auf B. hyodysenteriae,
Salmonellen und Lawsonia intracellularis untersucht (SEYBOLD 2009).
Seit 2010 wird versucht über die neu eingerichtete Tiergesundheitsagentur (TiGA), in
der sich die Erzeugergemeinschaft für Qualitätsferkel im Osnabrücker Raum (EGF),
Erzeugergemeinschaft für Qualitätstiere Syke-Bassum eG (EfQ), Viehvermarktung
Walsrode-Visselhövede eG, Stader Saatzucht eG, Abteilung Vieh, vereinen, eine
Tiergesundheitsdatenbank mit nationalem Standard zu führen. Vergleichbar zu dem
dänischen SPF-System erfolgt über die Einteilung: „Statuserhebung“, „unverdächtig“,
„bedingt unverdächtig“, „positiv“ und „Impfstatus“ eine Einordnung in Kategorien.
Aus
15
Blutproben
und
15
Kotproben
von
Flatdeckferkeln
werden
als
Pflichtuntersuchung PRRSV- und Salmonellen-Antikörper bestimmt. Die Kotproben
werden auf Brachyspira hyodysenteriae/pilosicoli via PCR untersucht. Zusätzlich
werden als Wahluntersuchung die Untersuchung auf toxinbildende Pasteurella
multocida,
Actinobacillus
pleuropneumoniae,
Influenza-A-Virus,
PCV-2
und
Mycoplasma hyopneumoniae angeboten. Über einen Onlinezugang können die
Betriebsdaten aus einer Datenbank jederzeit abgerufen werden (Anonymus 2012a).
8
Literaturübersicht
2.3 Antikörper - ein Einblick in die Immunologie
Die Antikörperbildung dient dazu, eine spezifische Immunantwort auf ein Antigen zu
geben.
Die
Entstehung
einer
Antigen-Antikörperbindung
wird
auch
als
Schlüsselmechanismus bezeichnet. Bei Antikörpern handelt es sich um lösliche
Immunoglobuline. Diese werden in fünf verschiedene Hauptklassen eingeteilt: IgG,
IgA, IgM, IgD und IgE (TIZARD 1992), schematisch dargestellt in Abbildung 1.
Am häufigsten kommt das IgG vor. Nach Erstkontakt mit einem Antigen wird es
innerhalb von ca. 3 Wochen p.i. gebildet. Sollte es zu einem erneuten Kontakt zu
demselben Antigen kommen, kann sofort eine große Menge IgG synthetisiert
werden.
Das IgM wird als erster Antikörper bei einem Antigenkontakt ausgeschüttet. Über
eine IgM-Detektion lassen sich die Erreger bereits Tage nach der Infektion ermitteln.
Liegt ein Zweitkontakt mit dem Erreger vor, so steigt die IgM-Konzentration nur wenig
an (SILBERNAGL u. LANG 2009).
Das Immunglobulin A findet sich an Schleimhautoberflächen und sorgt für ein frühes
Abfangen von Antigenen. Das Immunglobulin D ist nur im Serum nachzuweisen und
eng mit Aktivierung von B-Lymphozyten verknüpft.
Das Immunglobulin E spielt bei allergischen Reaktionen und Parasitenabwehr eine
Rolle.
9
Literaturübersicht
Antigenbindender
Abschnitt
Sekretorische
Komponente
Disulfidbrücke
IgA
IgG
IgM
IgD
Abbildung 1:
IgE
Schematische Darstellung der verschiedenen
Antikörperklassen (TODAR 2006)
Die fünf verschiedenen Antikörperhauptklassen (IgG, IgD, IgM, IgE, IgA) schematisch dargestellt mit
ihren leichten (L) und schweren (H) Ketten über Disulfidbrücken miteinander verbunden. Am Beispiel
des IgG ist der antigenbindende Abschnitt vergrößert dargestellt. Weitere Besonderheit ist das IgM als
Pentamer, das IgA als Dimer mit sektretorischer Komponente.
Allgemein besteht ein Antikörper aus vier Untereinheiten, je zwei leichten und zwei
schwere
Ketten
(H-Kette,
L-Kette).
Diese
werden
über
Disulfidbrücken
zusammengehalten (TIZARD 1992).
An den Antigenbindungsstellen wird dem Antikörper eine hohe Variabilität
abgefordert. Deshalb wird am Antikörper von einer konstanten und einer variablen
Region gesprochen.
Diese variablen Regionen beinhalten die jeweils antigen- oder epitopspezifischen
Paratope des Antikörpers. An diesen Stellen findet die Bindung statt. Die
Bindungsstärke zwischen Paratop und Epitop wird als Bindungsaffinität bezeichnet
(siehe Abbildung 2).
In den hier durchgeführten Untersuchungen sollen zum Zeitpunkt der Schlachtung
Antikörper aus dem Medium Fleischsaft gebunden werden. Da, wie oben
beschrieben, IgA an der Schleimhautoberfläche zu finden ist, IgD an B-Lymphozyten
gebunden scheint und IgE auf Allergene wirkt, waren für die Untersuchungen nur IgM
und IgG in Betracht zu ziehen.
10
Literaturübersicht
Auf Grund seiner Pentamer-Struktur ist IgM vermutlich zu groß um im Fleischsaft
ähnliche vergleichbare Titer wie im Blutserum zu entwickeln wie IgG (STEINBACH et
al. 2003). Außerdem sind nur Erstinfektionen der letzten sechs bis sieben Wochen
sicher nachzuweisen.
Paratop
Paratop
Variabler Anteil
Disulfidbrücken
Leichte Kette
Schwere Kette
Konstanter Anteil
Abbildung 2:
Aufbau Antikörper am Beispiel von Immunoglobulin G
(modifiziert nach Koolmann 2003)
Hier sind am Beispiel von Immunoglobulin G die Untereinheiten des Antikörpers bestehend aus je
zwei leichten und schweren Ketten dargestellt. Diese bestehen aus einem konstanten Anteil, sowie
aus einem variablen Anteil, welcher antigenspezifisch aufgebaut ist (Paratop). Disulfidbrücken (gelb
unterlegt) stellen Verbindungsstücke zwischen den einzelnen Ketten dar.
Das Immunglobulin G hingegen kommt, wie in Studien von Nielsen, der
Untersuchungen zu Salmonellenantikörpern durchgeführt hat oder Molina, welcher
sich mit PRRSV-Antikörpern Blutserum im Vergleich zu Fleischsaft beschäftigt hat, in
einem Verhältnis von ca. 1:10 im Vergleich zu Blutserum im Fleischsaft vor
(NIELSEN et al. 1998, MOLINA et al. 2008). Das IgG liefert außerdem über einen
relativ langen Zeitraum Antikörpertiter auf einem konstanten Niveau, wie in Abbildung
3 zu schematisch dargestellt.
Deshalb basieren die meisten serologischen Untersuchungen auf dem Nachweis von
spezifischen IgGs gegen das jeweilige Epitop.
11
Relative Antikörperkonzentration
Literaturübersicht
Nachweisgrenze ELISA
-3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Wochen
Abbildung 3:
Schematischer
Verlauf
der
Antikörpertiter
im
Blut
(modifiziert nach TIZARD 1992)
Die relative Antikörperkonzentration gemessen im Blut ist gegen den Zeitpunkt der Probenentnahme
aufgetragen. Als Kurven sind die gemessenen Titer von IgM und IgG dargestellt. Außerdem ist die
Nachweisgrenze des ELISAs, ab hier führt der ELISA zu einem positiven Ergebnis, eingezeichnet.
Der Zeitpunkt der Infektion ist in Woche 0. Erkennbar ist der schnelle Anstieg an IgM im Blut, der
bereits nach einer Woche zu Positiv-Nachweisen führt. Nach ca. zwölf Wochen ist der IgM-Titer
wieder abgeflacht. Erst nach ca. drei Wochen ist der IgG-Titer angestiegen, bleibt aber auf einem
relativ konstant hohen Niveau über lange Zeit.
2.3.1 Maternale Antikörper und die immunologische Lücke
Über das Kolostrum aufgenommene Antikörper, sogenannte maternale Antikörper,
schützen das Ferkel in den ersten Lebenswochen vor den jeweiligen Infektionen.
Bereits in den ersten Stunden nach der Geburt ändert sich die Zusammensetzung
des Kolostrums bezüglich der darin enthaltenden Antikörper.
Es ist beschrieben, dass zur Geburt der IgG-Titer im Kolostrum bei 95,6 g/l und der
IgM-Titer bei 9,1g/l liegt. Bereits nach 24h beträgt der IgG-Titer nur noch 14,2g/l, der
für IgM bei 2,3g/l (KLOBASA u. WERHAHN 1984).
Die Ferkel sind durch die Aufnahme der maternalen Antikörper für die erste Zeit
geschützt. Allgemein beginnt der Rückgang der maternalen Antikörper ab dem
achten bis zehnten Lebenstag. Der Dauer des Schutzes hängt einerseits von der
Depletion
des
jeweiligen
Antigens,
aber
12
auch
von
der
aufgenommenen
Literaturübersicht
Antikörpermenge ab. Bei Ferkeln, die viele maternale Antikörper über das Kolostrum
aufgenommen haben, konnten z.B. noch bis über den 60. Lebenstag hinaus
Antikörper gegen Mycoplasma hyopneumoniae nachgewiesen werden, bei Ferkeln
mit geringerer Aufnahme waren teilweise bereits nach 30 Tagen keine maternalen
Antikörper mehr zu finden (ROSS 1999).
Die Phase in der die Titer der maternalen Antikörper sinken, die selbstgebildeten
Antikörper aber noch keinen genügend hohen Titer erreicht haben, um eine Infektion
zu verhindern, wird als immunologische Lücke bezeichnet (Erhardt 1999), siehe auch
Abbildung 4.
Durch geschicktes Impfmanagement lässt sich das „Problem“ der immunologischen
Lücke verringern. So verhilft zum Beispiel eine Sauenimpfung ante partum gegen
Mycoplasma hyopneumoniae kombiniert mit einer späten Ferkelimpfung zu einem
Relative Antikörperkonzentration
durchgehenden Schutz über die ersten Monate (SCHREIBER 2002).
Antikörper im Blut von Ferkeln
Maternale Immunität
Erworbene
Immunität
Absetzzeitpunkt
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Alter in Wochen
Abbildung 4:
Immunologische Lücke (modifiziert nach ANONYMUS
2012b)
Auf der Senkrechten ist die relative Antikörperkonzentration aufgetragen, auf der Waagerechten das
Alter des Ferkels in Wochen. Als Punktewolke ist die fallende Konzentration an maternalen
Antikörpern dargestellt. Ab ca. Woche drei beginnt die Kurve der erworbenen Immunität anzusteigen.
Der Bereich mit niedrigem Spiegel an maternalen
und erworbenen Antikörpern wird als
immunologische Lücke bezeichnet. Genau in diesen Bereich fällt häufig der Absetzzeitpunkt der
Ferkel.
13
Literaturübersicht
2.4 Vor- und Nachteile der serologischen Untersuchung
Die Untersuchung von Proben in der Serologie hat Vor- und Nachteile.
Vorteilhaft ist, dass subklinische Infektionen, welche die Tiere innerhalb der
Mastperiode durchgemacht haben, über den Antikörpernachweis aufgedeckt werden
können. Auf diese Weise können dem Erzeuger wertvolle Informationen geliefert
werden (MEEMKEN u. BLAHA 2011a).
Über
die
langanhaltenden
IgG-Spiegel
kann
eine
schon
zurückliegende,
Diagnostik
von
akuten
Erkrankungen.
überstandene Erkrankung detektiert werden.
Problematisch
ist
vor
allem
die
Erregerspezifisch etwas unterschiedlich dauert es einige Zeit bis Antikörper gegen
das durch die Infektion dem Immunsystem präsentierte Antigen gebildet werden
können. Hierauf soll in den einzelnen Erregerkapiteln näher eingegangen werden.
Allgemein wird bei dieser Zeitspanne auch von Serokonversion gesprochen. Diese
ist abgeschlossen, sobald Antikörper gegen das Antigen im Blut vorhanden bzw.
nachweisbar sind.
In dem Zeitraum der Serokonversion entsteht eine diagnostische Lücke, d.h. dass
der
zurückliegende
Erregerkontakt
in
dieser
Zeitspanne
serologisch
nicht
nachweisbar ist.
Des Weiteren lässt sich über die serologischen Untersuchungsmethoden bei vielen
Erregern keine Unterscheidung zwischen Antikörpern, die durch Impfungen induziert
wurden, und Antikörpern als Reaktion auf eine Erkrankung in einer gewissen
Zeitspanne machen. Die Zeitspanne, in der die Impfantikörper nachweisbar im Blut
zirkulieren ist von Erreger zu Erreger unterschiedlich, wobei bei den meisten
Impfungen beim Schwein, welche im Saugferkel- oder Absetzalter durchgeführt
wurden, keine Impfantikörper zum Zeitpunkt der Schlachtung mehr vorhanden sind.
Aus diesem Grund sind nachgewiesenen Antikörper zum Zeitpunkt der Schlachtung
der Tiere in fast allen Fällen auf eine Feldinfektion im Laufe des Lebens der Tiere
zurückzuführen. Bei den Markerimpfstoffen, auch DIVA-Impfstoffe (Differentiating
14
Literaturübersicht
Infected from Vaccinated Animals) genannt, ist eine Unterscheidung zwischen durch
Impfung induzierten Antikörpern und durch Feldinfektion induzierten Antikörpern
möglich und wird u.a. bei der Impfung gegen die Aujeszkysche Krankheit eingesetzt.
Dabei wird in den meisten Fällen dem Impfstoff ein nicht essentielles Protein entfernt
oder ein Markerprotein hinzugefügt.
An dieser Stelle ist eine gute Lebensmittelinformationskette wichtig. Innerhalb der
Tiergesundheitsdatenbank wird beispielsweise der Impfstatus mit erfasst.
2.5 Serologische Testsysteme – eine Auswahl
2.5.1 ELISA als Testsystem
Bei dem „enzyme-linked-immunosorbent assay“ (ELISA) handelt es sich um einen
Test bei dem anhand von Antigen-Antikörper-Bindungen das Vorhandensein und die
Konzentration von Antikörpern im Testmedium erkannt werden. Durch verschiedene
Bindungsschritte können auf diese Weise Antikörper nachgewiesen werden. Über ein
Substrat, welches durch ein entsprechendes Enzym seine Eigenschaften wie z.B. die
Farbe ändert, kann diese Reaktion nachweisbar gemacht werden (ELGERT 2009).
Die Intensität des Signals korreliert mit der Anzahl an Antigen-Antikörper-Bindungen
und somit mit der Antikörperkonzentration im Serum (VOLLER et al. 1978). Daher ist
der Einsatz von ELISA-Testsystemen auch für quantitative Untersuchungen geeignet
(ENGVALL u. PERLMANN 1972).
Es wird zwischen direktem und indirektem ELISA ELISA-Tests unterschieden. Bei
dem direkten ELISA werden Primärantikörper, die an bereitgestellte Antigene binden
direkt nachgewiesen. Bei dem indirekten ELISA werden Sekundärantikörper
eingesetzt und deren Bindung an die primären Antikörper nachgewiesen.
Des Weiteren gibt es kompetitive und nicht kompetitive Varianten.
15
Literaturübersicht
Bei der kompetitiven Variante konkurriert der in der Probe befindliche Antikörper mit
einem enzymmarkierten Antikörper um die Bindungsstelle am Antigen. Die
Signalintensität ist hier antiproportional zur Antikörpermenge in der Probe.
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Antigen
HRP-empfindliches Substrat
Y
Antikörper aus Fleischsaft
Waschschritt zur Entfernung
ungebundener Substanzen
Y
Anti-Pig IgG-HRP
Abbildung 5:
Prinzip des indirekten ELISAs
Der indirekte ELISA wird ein erregerspezifsiches fixiertes Antigenmaterial vorgelegt. An dieses binden spezifische
Antikörper aus der Probe ( Paratop/Epitop – Bindung). Alles ungebundene Material wird durch einen Waschschritt
entfernt. Mittels eines Konjugates, welches einerseits an die Antikörper bindet andererseits enzymmarkiert ist
(hier Horsadishperoxidase) kann nach einem weiteren Waschschritt ein hinzugegebenes Substrat durch das
Enzym umgewandelt werden und z.B. einen Farbumschlag hervorrufen.
Bei dem nicht kompetitiven indirekten ELISA wird auf eine mit Antigen beschichte
Platte eine Testsubstanz gegeben. Die Antikörper binden spezifisch an die Antigene.
Ein gegen die Antikörper gerichteter enzymmarkierter Sekundärantikörper dient als
Brücke zum Substrat (Abbildung 5).
16
Literaturübersicht
2.5.2 Protein-Microarray als Testsystem
Bei einem Microarray handelt es sich um ein Untersuchungssystem, mit dem eine
Vielzahl von Parametern parallel aus einer geringen Menge Probenmaterial
quantitativ bestimmt werden kann (EKINS et al. 1989).
Vor allem auf dem Gebiet der molekularbiologischen Untersuchungen kommt der
Microarray zum Einsatz (Abbildung 6). Dabei handelt es sich um genombasierte
Arrays, bei denen verschiedene definierte Genomfragmente (PCR-Fragmente,
Oligonukleotide) nebeneinander an definierten Stellen aufgebracht werden und so
als Bindungspartner für komplementäre, nachzuweisende Genomabschnitte dienen.
Der innerhalb dieses Projektes verwendete Microarray-Typ gehört hingegen in die
Gruppe der Protein-Microarrays, genauer zu den Antigen-Microarrays oder MultiImmunoassays. Dieses Testprinzip wurde erstmals von Ekins 1989 beschrieben
(EKINS et. al. 1989).
Spezifisches Antigen-Material wird auf den Microarray gespottet. Ziel ist es, daran
bindende Antikörper aus der Probe zu detektieren (EKINS u. CHU 1999). Die in der
aufgebrachten Probe befindlichen Antikörper binden an die Antigene. So werden
Antikörper-Antigen Komplexe gebildet. Über eine Bindung an einen enzymmarkierten
Zweitantikörper können diese Probenantikörper an ihren Bindungsstellen nach
Substanzzugabe sichtbar gemacht werden.
Das Prinzip des Testablaufs ist vergleichbar mit dem eines nicht kompetitiven,
indirekten ELISA-Tests.
17
Literaturübersicht
Abbildung 6:
Übersicht über die prozentualen Anteile an
Veröffentlichungen zu Microarrays von 1995 bis 2002
(SCHENA 2003)
Zwischen 1995 und 2002 wurden in verschiedenen Anwendungsbereichen Veröffentlichungen zu
Microarrays gemacht. In diesem Kreisdiagramm sind die am häufigsten vorkommenden Arbeitsfelder
des Microarrays prozentual dargestellt.
Bei der Herstellung eines solchen Mikrochips werden mittels einer Sonde ca. 12
Pikogramm des entsprechenden Antigenmaterials in einer Konzentration von bis zu
0,5mg/ml auf eine definierte Position einer Trägerplatte aufgebracht. Bei dem
innerhalb der Studie verwendeten Microarray handelt es sich bei der Trägerplatte um
eine ca. 3x3mm große modifizierte Glasplatte (HÜLSWEH et al. 2006). Auf diese
Weise können je nach Beschaffenheit des Proteinmateriales mehrere Hundert Spots
auf die Platte gesetzt werden. Jeder Spot hat dabei, abhängig von der Viskosität des
Proteinmaterials eine Größe von ca. 80µm bis 120µm.
Die Platte ist auf den Boden eines 1,5ml großen Reaktionsgefäßes aus Polystyrol
eingelassen. Zum Schutz der aufgebrachten Proteine hat sich eine ZuckeralkoholBeschichtung als gut erwiesen. Diese lässt sich vor Einsatz des Arrays leicht
abwaschen (WOELFL et al. 2004).
Innerhalb einer Qualitätskontrolle wird jeder der produzierten ArrayTubes überprüft,
ob die eingelassene Glasplatte fest sitzt und ob sich die gespotteten Antigene an der
richtigen Stelle befinden. Fehlerhafte Arrays werden gegebenenfalls aussortiert.
18
Literaturübersicht
2.5.3 Bead-based Technologie als Testsystem
Die „Luminex® xMAP-Technologie“ ist eine weitere Methode Paralleluntersuchungen
durchzuführen. Mit auf xMAP-Technologie basierenden Tests ist es möglich, die
simultane Quantifizierung von bis zu einhundert verschiedenen analytischen
Parametern einer einzigen Probe zu testen. Grundlage der Technologie sind
mikroskopisch kleine sphärische Polystyrolkugeln, so genannte Mikrosphären oder
Beads. Diese dienen als Festphase für biochemische Nachweisreaktionen ähnlich
wie die Polystyrolplatten bei ELISA-Testsystemen oder die Glasplatte bei den
Microarrays. Zurzeit sind einhundert verschiedene Bead-Typen verfügbar, die sich in
ihrem Fluoreszenzfarbton unterscheiden, so dass theoretisch bis zu einhundert
verschiedene Nachweisreaktionen simultan durchgeführt werden können.
In der Humanmedizin wird die Technologie bereits zur Detektion von antiviralen
Antikörpern eingesetzt, findet aber auch Einsatz zum Nachweis von bakterieller
rRNA, Zytokinen oder Genfragmenten (OLIPHANT et al. 2002).
Das
Prinzip
der
Technik
liegt
in
der
Färbung
der
Beads
mit
zwei
Fluoreszenzfarbstoffen (Rot und Infrarot). Die Kombination dieser beiden Farbstoffe
in jeweils zehn verschiedenen Konzentrationsstufen führt zu einhundert spektral
unterscheidbaren
Schattierungen
von
Rot
und
Infrarot.
Jede
der
daraus
resultierenden Fluoreszenzintensitäten definiert eine Bead-Population (CHEN et al.
1999).
Der spezifische Nachweis der Bindung von Analyten an die Beads erfolgt über ein
Detektionsmolekül (Konjugat) ähnlich dem ELISA-Prinzip. An das Konjugat ist ein
Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt, dessen spektraler Bereich sich von denen der
internen roten Farbstoffe unterscheidet. So kann auch eine Quantifizierung
stattfinden. Die Analyse und Auswertung der Bead basierten Assays erfolgt mit dem
Luminex®-Analysesystem. Hierbei handelt es sich um einen ähnlichen Vorgang wie
bei
der
Durchflusszytometrie
(FACS-Analyse)
unter
Verwendung
zweier
unterschiedlicher Laser. Aktuell werden immer mehr Testsysteme auch für einen
möglichen Einsatz in der tiermedizinischen Diagnostik entwickelt (GRUMMER et al.
2010).
19
Literaturübersicht
Auf der Basis der Luminex-Technologie ist z.B. ein BVD-Antikörper Test entwickelt
worden (XIA et al. 2010).
Auch im Schweinesektor wurde diese Technik bereits eingesetzt. In den USA wurde
zur Überprüfung der Immunantwort nach Impfung gegen das Porzine Reproduktive
und Respiratorische Syndrom Virus (PRRSV) ein Nachweistest auf LuminexTechnologiebasis von acht verschiedenen Cytokinen beim Schwein entwickelt
(LAWSON et al. 2010). Es wurden auch schon verschiedene Erreger mit Hilfe der
bead-based Technologie detektiert. So konnten Bokken, Bergwerff und Knapen unter
Anwendung dieser Methode spezifische Antikörper gegen Toxoplasmen und
Trichinen simultan detektieren (BOKKEN et al. 2012).
2.5.4 Vor- und Nachteile ähnlicher Verfahren gegenüber der
Microarray-Technologie
2.5.4.1 ELISA
2.5.4.1.1
Vorteile
Es handelt sich bei dem 1971 in Schweden entwickelten ELISA um eine (alt-)
bewährte Untersuchungsmethode zum quantitativen Nachweis von Antikörpern
(ENGVALL et al. 1971). Da es bei Antikörperbestimmungen keinen „Gold-Standard“
gibt, wird der ELISA häufig ersatzweise herangezogen. Auf dem deutschen Markt
befinden sich zahlreiche durch das Friedrich-Löffler-Institut (FLI) zugelassene Tests
für Schweinekrankheiten und auch Zoonosen (FLI 2010). Aufgrund des relativ
geringen Bedarfs an Laborequipment und an Know-How findet das ELISA-Verfahren
flächendeckend in vielen Laboren Anwendung (LUTTMANN et al. 2006).
20
Literaturübersicht
2.5.4.1.2
Nachteile
Wenn nicht auf eine kostenintensive Automatisierung umgestellt wird, ist das ELISAVerfahren
eine
sehr
arbeitsintensive
und
ressourcenbindende
Untersuchungsmethode – insbesondere bei Massenuntersuchungen.
2.5.4.2 X-Map-Technologie
2.5.4.2.1
Vorteile
Der Vorteil der X-Map-Technologie liegt v.a. darin, dass der Untersuchungsumfang je
nach Kundenwunsch unkompliziert erweitert oder auch reduziert werden kann. Beim
Microarrayverfahren ist eine Erweiterung des Untersuchungsumfangs immer nur
dann möglich, wenn eine neue Arraycharge hergestellt wird.
Außerdem
verändert
eine
Erweiterung
des
Untersuchungsumfangs
nur
vernachlässigbar die Untersuchungskosten – im Gegensatz zum ELISA-Verfahren,
bei dem jede Erweiterung zusätzlich jeweils vergleichbar hohe Kosten verursacht.
2.5.4.2.2
Nachteile
Für die Durchführung der X-Map-Technologie wird relativ kostenintensives
Equipment benötigt, was für einen flächendeckenden Einsatz insbesondere in
kleinen Laboren ein Hemmnis darstellen würde.
2.6 Untersuchungsmedium Fleischsaft
An deutschen Schlachthöfen werden im Zuge des Schweine-Salmonellenmonitorings
routinemäßig
Fleischsaftproben
während
der
Schlachtung
genommen.
Das
entsprechende Muskelgewebe wird in den meisten Fällen aus dem Zwerchfellpfeiler
gewonnen.
21
Literaturübersicht
Diese Muskulatur eignet sich besonders, da sie stark durchblutet ist und zu
Ergebnissen führt, die mit denen aus Blutserumproben vergleichbar sind. Im
Verhältnis zu anderen Muskelgruppen weist die Zwerchfellmuskulatur eine höhere
Antikörperkonzentration als z.B. die Nackenmuskulatur auf (NOBMANN et al. 2011).
Die
gewonnenen
Fleischsaftproben
werden
bei
-18°C
eingefroren.
Beim
Auftauprozess verliert das Fleisch Flüssigkeit, bei der es sich um den sogenannten
Fleischsaft handelt. Dieser wird aufgefangen und kann für labordiagnostische
Untersuchungen verwendet werden.
Aus Untersuchungen über die Antikörperkonzentrationen in Fleischsäften im
Vergleich zu denen im Blut (NIELSEN et al. 1998, ANDREASEN et al. 2000,
MEEMKEN u. BLAHA 2011b, MOLINA et al. 2008) lässt sich auf eine circa zehnfach
niedrigere Konzentration an Antikörpern im Fleischsaft schließen.
In Arbeitsanweisungen von zugelassenen, kommerziell erhältlichen ELISA-Test-Kits,
die für Fleischsaft und Serum zugelassen sind, wird dieses Verhältnis ebenfalls
angegeben. Die hier eingesetzten Verdünnungen lagen zwischen 1:40 bis 1:100 bei
Serum, dementsprechend bei 1:4 und 1:10 bei Fleischsaft.
2.7 Ausgewählte Erreger
Innerhalb des vom BMELV finanzierten Forschungsprojektes „Entwicklung eines
„schweinespezifischen Microarrays“ als Kontrollinstrument zum Aufbau eines
multiserologischen
Minimierung
pathogener/
(Förderkennzeichen:
Microarray“
Monitoringsystems
zoonotischer
2811HS013)
Antikörper
auf
mit
sollen
Fleischsaft
Erreger
mittels
in
dem
als
der
Probematerial
zur
Lebensmittelkette“
Testsystem
„Protein-
bestimmte Schweine spezifische Erreger sowie
Zoonoseerreger sowohl im Fleischsaft als auch im Blutserum nachgewiesen werden.
Zoonosen sind Krankheiten und Infektionen, die auf natürliche Weise zwischen
Menschen und Wirbeltieren übertragen werden können (WHO 1959). Bei den beim
Schwein vorkommenden Zoonosen ist es so, dass die meisten latente Infektionen
22
Literaturübersicht
hervorrufen, was die Kontrolle und Bekämpfung auf Bestandsebene schwieriger
macht. Da diese auch über den Verzehr von ungenügend erhitztem Fleisch auf den
Menschen übertragen werden, wird von lebensmittelsicherheitsrelevanten Erregern
gesprochen.
Außerdem wurden tiergesundheitsrelevante Erregerantigene, welche für die
Untersuchung auf Antikörper gegen sogenannte Produktionserkrankungen des
Schweines benötigt wurden, auf die Microarrayplatte gebracht.
Es wurde eine Auswahl nach Vorkommen des Erregers in Deutschland und nach
Relevanz bezüglich der Bedeutsamkeit in dem Bereich Lebensmittelsicherheit oder
Tiergesundheit getroffen. Somit wurden Erreger ausgewählt, bei denen ein
serologisches Monitoring als sinnvoll erachtet werden kann.
2.7.1 Ausgewählte lebensmittelsicherheitsrelevante Erreger
2.7.1.1 Salmonella spp.
Als einziger Erreger wird derzeit Salmonella spp. durch ein serologisches Monitoring
flächendeckend in Deutschland wie auch in den Niederlanden und Dänemark
kontrolliert, wobei die Probenentnahme in den meisten Fälle am Schlachtband
durchgeführt wird.
Nach dem infektionsepidemiologischen Jahrbuch meldepflichtiger Krankheiten des
Robert Koch-Instituts (RKI) handelt es sich bei den Salmonellosen um “durch
Bakterien der Gattung Salmonella verursachte Erkrankungen, die vorwiegend den
Darm betreffen. Enteritis-Salmonellen kommen weltweit u.a. in Geflügel, Schweinen,
Rindern aber auch Reptilien vor. Sie werden meist durch Lebensmittel übertragen.
Beim Krankheitsbild steht Durchfall im Vordergrund. Daneben sind Bauchschmerzen,
Übelkeit, Erbrechen und Fieber möglich. Die Symptome dauern in der Regel wenige
Stunden oder Tage, führen bei einem Teil der Betroffenen aber auch zu mehrtägigen
23
Literaturübersicht
Krankenhausaufenthalten”. Vor allem bei immunsuppremierten Personen kann die
Erkrankung auch zum Tode führen (RKI 2012).
Circa 20% aller Salmonellosen beim Menschen lassen sich auf kontaminiertes
Schweinefleisch zurückführen (STEINBACH u. HARTUNG 1999).
Laut Erhebungen des statistischen Bundesamtes, dargestellt in Tabelle 2, sind die
gemeldeten Fälle von humanen Salmonellosen rückläufig (ANONYMUS 2011a).
Tabelle 2:
An Salmonellose erkrankte Menschen in Deutschland /Jahr
(Statistisches Bundesamt 2011)
Jahr
Salmonelloseerkrankt
1995
115788
1996
109910
1997
106291
1998
98663
1999
85306
2000
79824
2001
77386
2005
52267
2010
25310
2011
24512
Das Genus Salmonella lässt sich in zwei Spezies unterteilen: S. enterica und S.
bongori. Salmonella enterica lässt sich weiter in sechs Subspezies unterteilen, wobei
die meisten Salmonella der Subspezies S. enterica spp. enterica angehören.
Unter den Salmonellen als Krankheitserreger wird zwischen wirtsassoziierten, hier
erkranken die Träger selbst, und nicht wirtsassoziierten Typen unterschieden, hier
wird der Erreger durch den Erreger übertragen, unterschieden.
Als Zoonoseerreger ist der nicht wirtsassoziierte Typ relevant.
24
Literaturübersicht
Innerhalb der EU hat für die Erkrankung beim Menschen die Subspezies S.
Typhimurium gefolgt von S. Enteriditis die größte Bedeutung.
Beim Schwein treten nach einer Studie vom BfR aus dem Jahr 2008 vor allem S.
Typhimurium auf. Danach folgen S. Derby und S. Enteritidis (BFR 2008).
Durch Erkrankung mit dem wirtsassoziierten S. Cholerasuis kann es beim Schwein
zu einer Septikämie kommen (REED et al. 1986).
Auch der nicht wirtsassoziierte Erreger Salmonella Typhimurium kann zu einer
Infektion führen. Normalerweise beschränkt sich die Klinik auf eine enterokolitische
Klinik. Es kann aber auch zu schweren septikämischen Erkrankungen vor allem bei
Mastschweinen und Absatzferkeln kommen. Seltener werden auch S. Enteritidis, S.
Agona, S. Derby, S. Heidelberg und S. Newport in solchen Fällen isoliert (BAUER u.
HÖRMANNSDORFER
1995).
Meist
bleiben
die
Infektionen
mit
nicht
speziesadaptierten Serovaren jedoch latent und unerkannt. Diese Tatsache führt zu
den Schwierigkeiten und dem Problem der Salmonellen als bedeutende Zoonose.
Infizierte Tiere bleiben aufgrund fehlender klinischer Symptome unerkannt. Diese
gelangen in den Schlachtprozess und stellen somit eine Kontaminationsquelle für
andere (Salmonellen freie) Karkassen dar (GAREIS 1995, SELBITZ 2006).
Kauffmann und White haben die Salmonellen nach ihren Oberflächenantigenen
kategorisiert (KAUFFMANN 1972), gegen welche der Körper spezifische Antikörper
ausbildet. Hat es einen Kontakt mit dem Erreger gegeben, so können bereits zwei
Wochen danach erste Antikörper vorhanden sein (NIELSEN et al. 1995).
2.7.1.2 Toxoplasma gondii
Bei Toxoplasma gondii handelt es sich um einen parasitischen Einzeller, der in die
Klasse der Kokzidien eingeordnet wird. Er ist obligat intrazellulär und vermehrt sich
fakultativ heteroxen. Aus vom Zwischenwirt aufgenommene Oozysten oder Zysten
werden Sporozoiten bzw. Bradyzoiten freigesetzt, welche über die Blut-DarmSchranke in verschiedene Organe gelangen. Hier findet eine als Endodyogenie
25
Literaturübersicht
bezeichnete Vermehrung statt. Schließlich wird aus der Wirtszelle eine Zyste
gebildet. Diese persistiert und kann in dieser Form aufgenommen werden.
Im Endwirt findet eine ähnliche Vermehrung statt. Letztendlich wandern einige
Stadien aber wieder in den Darm zurück, um sich über die Bildung von Mikro- und
Makrogameten in Oozysten zu verwandeln und über den Kot zu verbreiten
(JACKSON u. HUTCHISON 1989).
Ein weiteres Problem stellt die vertikale Übertragung über das Entwicklungsstadium
Tachyzoit dar, welcher die Plazentaschranke überwinden kann und somit eine Fetus
infizieren kann (TENTER u. FEHLHABER 2002).
Schweine infizieren sich in der Regel oral über die Aufnahme von infiziertem Material
wie zum Beispiel Kot oder Gewebe von befallenen Tieren (DUBEY 1986).
Die Toxoplasmose verläuft beim Schwein als latente bis subklinische Infektion. Es
wurden aber auch Fälle beschrieben, in denen die Mortalität bei bis zu 42% lag
(GELMETTI et al. 1999). In diesen Fällen herrschte ein außergewöhnlich hoher
Infektionsdruck.
Menschen infizieren sich hauptsächlich durch den Verzehr von rohem oder
ungenügend erhitztem Fleisch und Fleischprodukten gefolgt von Infektion aus der
Umwelt und der transplazentaren Infektion (JONES et al. 2001).
Erste IgG-Antikörpertiter konnten nach experimenteller Infektion beim Schwein nach
ca. 14 Tagen festgestellt werden (LIND et al. 1997). Diese waren noch nach vier
Monaten nachweisbar. Impfungen gegen Toxoplasmose gibt es sowohl beim
Menschen als auch beim Schwein derzeit noch nicht.
2.7.1.3 Trichinella spiralis
Der Parasit Trichinella spiralis ist der in der Schweinefleischproduktion am weitesten
verbreitete Trichinella-Subtyp. Andere Trichinella-Subtypen kommen hauptsächlich in
Wildpopulationen vor.
Die Larven der Trichinellen dringen durch die Darmwand bis in die Skelettmuskulatur
vor, wo sie eingekapselt Jahre überleben (ECKERT et al. 2008).
26
Literaturübersicht
Beim Schwein verläuft die Trichinellose in der Regel subklinisch. Die im Feld
auftretenden Erregerkonzentrationen sind für ein klinisches Bild zu gering (ECKERT
et al. 2008). Auch bei einer Infektion auf einem sehr geringen Niveau sind nach vier
bis sechs Wochen Antikörper gegen Trichinella spp. nachzuweisen (NÖCKLER et al.
2005, SMITH u. SNOWDON 1989).
Laut VO (EG) Nr. 2075/2005 werden alle Schlachttiere, die für den menschlichen
Verzehr bestimmt sind und Träger von Trichinellen sein können, auf Trichinen
untersucht. Diese Untersuchung findet mittels einer Verdauungsmethode mit
anschließendem visuellem Larvennachweis statt.
Nimmt der Mensch rohes, mit Trichinellen belastetes Schweinefleisch auf, so kann
es je nach Menge an aufgenommenen Larven zu subklinischen bis schweren
Symptomen kommen. Angefangen mit Bauchschmerzen treten Symptome analog
zum Wanderweg der Larven auf wie z. B. Fieber, Muskelschmerzen, Ödeme etc.
Innerhalb einer Infektionsstudie an SPF-Schweinen konnten nach spätestens drei bis
vier Wochen Antikörper im Blut nachgewiesen werden (KAPEL et al. 2000).
Bei Vergleichsuntersuchungen von Fleischsaftproben und Blut infizierter Tiere zum
Zeitpunkt der Schlachtung konnte auch für Trichinella spiralis der AntikörperKonzentrationsunterschied um den Faktor zehn bestätigt werden (NÖCKLER 2005).
2.7.1.4 Yersinia enterocolitica
Nach der Salmonellose ist die Yersiniose der häufigste über Schweinefleisch
übertragene Durchfallerreger beim Menschen in Europa (ANONYMUS 2011b). Im
Jahr 2011 wurden in Deutschland 3.397 Yersiniose-Fälle gemeldet (RKI 2012).
Yersina enterocolitica gehört wie auch Salmonella spp. zu den Enterobacteriaceae.
(EWING 1963). Es ist gramnegativ, fakultativ anaerob und hat die typische Form
eines kokkidoiden Stäbchens. Da Yersinien kältetolerant, sind, können sie sich auch
noch bei Kühlschranktemperaturen vermehren (BERCOVIER u. MOLLARET 1984).
27
Literaturübersicht
In der Diagnostik wird dieses bei der Kälteanreicherung verwendet. Es macht
Yersinien aber auch in Bezug auf die Lebensmittelsicherheit gefährlich. Das Schwein
gilt als Hauptreservoir für humanpathogene Yersinien (BOTTONE 1997). Die
Erkrankung verläuft beim Schwein aber in der Regel inapparent.
Bereits 19 bis 21 Tage nach experimenteller Infektion konnten Antikörper gegen
Yersinia spp. mittels indirektem ELISA nachgewiesen werden. Aber auch bei der
Schlachtung, im Versuch ca. 70 Tage p.i., konnten noch positive Antikörpertiter
ermittelt werden (NIELSEN et al. 1996, THIBODEAU et al. 2001).
2.7.1.5 Hepatitis E-Virus
Bei dem Hepatitis E-Virus handelt es sich um ein unbehülltes Einzelstrang RNAVirus. Das Virus hat Größe von 27-34nm. Äußerlich ähneln das Virus den Caliciviren
(siehe Abbildung 1) (PREVISANI u. LAVANCHI 2001). Taxonomisch gehört es in
eine eigene Familie (Hepeviridae) (PANDA et al. 2007).
Von dem Herpesvirus ist bislang nur ein Serotyp bekannt. Dieser wird in vier
Genotypen unterteilt. Alle sind humanpathogen, wobei in Europa vor allem Genotyp
3 vorkommt (KANTALA et al. 2009). Bei den Schweinen wurden bisher die
Genotypen 3 und 4 isoliert (TEO 2010).
28
Literaturübersicht
Abbildung 7:
HEV-Partikel im Elektronenmikroskop (Center of Disease
Control and Prevention 2006)
Von HEV beim Schwein wurde erstmals 1990 berichtet (BALAYAN et al. 1990). Ein
Zusammenhang
zu
den
Erkrankungen
bei
Menschen
entstand
durch
Übereinstimmungen im Genom von bei Schweinen und Menschen isolierten HEVIsolaten (MENG et al. 2002). Eine Übertragung vom Schwein auf den Menschen ist
daher denkbar und es besteht ein zoonotisches Potential.
Die Erkrankung Hepatitis ist laut Robert-Koch-Institut meldepflichtig (RKI 2001).
Kardinalsymptome
sind
Oberbauchschmerzen,
Gelbsucht,
erhöhte
Serumtransaminasen sowie Fieber. Beim Schwein ist keine spezifische Klinik
bekannt (MODROW 2009).
Nach Untersuchungen von Bächlein sind durchschnittlich 49,8% der Schweine in
Deutschland (oder weltweit oder in ihrer Studienpopulation) seropositiv auf Hepatitis
E-Virus (BÄCHLEIN 2011).
Die Bildung spezifischer Antikörper gegen das Hepatitis E-Virus findet kurz nach dem
Erregerkontakt statt. Nachdem ab dem siebten Tag spezifische IgM ausgeschüttet
werden, die zwei bis drei Monate messbar bleiben, kommt es nach drei bis vier
Wochen zu einem Anstieg von IgG, welcher bis zum Mastende messbar bleibt
(MENG et al., 1997, DE DEUS et al. 2008a, CASAS et al. 2011).
2.7.2 Tiergesundheitsrelevante Antigene
2.7.2.1 Influenza A
In Europa sind die Influenza A-Subtypen H1N1, H1N2 und H3N2 beim Schwein weit
verbreitet. Sie unterscheiden sich in der Struktur der Oberflächenantigene
29
Literaturübersicht
Hämagglutinin und Neuraminidase. Durch starke Mutation entstehen immer wieder
infektiöse Varianten.
Influenza A - Viren sind sRNA-Viren mit sphäroider Gestalt. Sie werden oronasal
aufgenommen und vermehren sich bereits wenige Stunden nach Kontakt in den
Epithelien der oberen Atemwege. Ein Vermehrungshöhepunkt liegt ca. zwei Tage p.i.
und nach acht Tagen p.i. in der Regel vorbei (PLONAIT et al. 2004).
Klinisch
sind
eine
deutlich
erhöhte
Temperatur
(bis
42.5
°C),
sowie
Kreislaufprobleme, Inappetenz und eine hohe Durchseuchung zu beobachten. Die
Mortalität ist gering.
Nach Untersuchungen von de Boer bleiben die Antikörpertiter nach experimenteller
Infektion mindestens drei Monate deutlich erhöht (DE BOER et al. 1990).
Gegen Influenza A werden in der Praxis häufig Impfstoffe eingesetzt. Vor allem
Sauen werden regelmäßig geimpft und geben so maternale Antikörper über das
Kolostrum
an
die
Saugferkel
weiter.
Problematisch
sind
die
Vielfalt
der
Virusoberflächen und deren ständige Mutation. Eine Vakzine, die gegen einen
Bestandteil des Influenza -Virus (Matrixprotein M2) gerichtet ist, bietet nicht die
erhoffte Kreuzprotektion gegen verschiedene Influenza-Typen, wie Versuche von
Thacker et al. ergaben (THACKER et al. 2008). Deshalb werden vermehrt
Mischvakzinen eingesetzt.
Eine Unterscheidung zwischen den Impfantikörpern und den Antikörpern nach
Infektion ist derzeit nicht möglich (WOESTE u. GROßE BEILAGE 2007).
2.7.2.2 Mycoplasma hyopneumoniae
Mycoplasma hyopneumoniae ist der Primärerreger der enzootischen Pneumonie. Er
gehört in die Familie der Mycoplasmataceae. Bemerkenswert ist, dass das Bakterium
bei einer Größe von 0,3- 0,8µm über eine nur drei Schichten dicke Zellwand verfügt
und damit recht empfindlich ist.
30
Literaturübersicht
Der Erreger kommt lediglich in der Schweinepopulation vor. Er vermehrt sich nach
oronasaler Aufnahme vor allem in den unteren Atemwegen. Dabei wird die
mukoziliäre Clearance, die wichtig für eine unspezifische Abwehr ist, empfindlich
gestört.
Mycoplasma
hyopneumoniae
ist
dadurch
ein
Wegbereiter
für
Sekundärinfektionen (MAES et al. 2008, RAZIN 1979). Über nasale Sekrete wird er
von Tier zu Tier übertragen (WOESTE u. GROßE BEILAGE 2007). Die
Durchseuchung ist hier eher mäßig.
Die enzootische Pneumonie ist eine Faktorenkrankheit. In Abhängigkeit von
Infektionsdruck, Umweltbedingungen, möglichen Koinfektionen oder Virulenz des
Stammes kommt es zu einer mehr oder weniger stark ausgeprägten Klinik.
Als typisch wird ein chronischer, trockener Husten, der spontan oder nach Auftreiben
auftritt, angesehen. Auch die Rektaltemperatur kann auf über 41°C steigen (WENDT
u. GROßE BEILAGE 2013).
Untersuchungen von Horst ergaben eine Prävalenz von 84,4% seropositiver
Bestände in Niedersachsen und 81,2% in Deutschland (HORST et al. 1997).
Mittlerweile sind bis zu zehn verschiedene Impfungen gegen Mycoplasma
hyopneumoniae auf dem Markt, wobei in der Regel Ferkel bis zur vierten
Lebenswoche damit immunisiert werden (WENDT u. GROßE BEILAGE 2013).
Nach Infektionsversuchen konnten frühestens ab dem 20. Tag p. i. Antikörper gegen
Mycoplasma hyopneumoniae nachgewiesen werden (MORRIS et al. 1995,
ANDREASEN et al. 2000).
2.7.2.3 Actinobacillus pleuropneumoniae
Bei diesem Erreger handelt es sich um einen bakteriellen Erreger, der gramnegativ,
unbeweglich, fakultativ anaerob und kokkoid ist. Es kommen 15 verschiedene
Serotypen verschiedener Pathogenität vor. Actinobacillus pleuropneumoniae bildet
sogenannte Apx–Toxine. Das Toxin Apx IV kommt bei jedem Serotyp vor und wird
häufig für allgemeine Nachweise auf Actinobacillus pleuropneumoniae verwendet.
31
Literaturübersicht
Die Toxine Apx I, Apx II und Apx III machen die Virulenz der einzelnen Serotypen
aus.
Die Erkrankung durch Actinobacillus pleuropneumoniae beim Schwein steht in der
Schweiz auf der Liste der “zu bekämpfenden Tierseuchen” (BVET 2013).
In Abhängigkeit von Virulenz des Erregers, der Umweltsituation usw. kann es zu
perakuten bis akuten aber auch chronischen klinischen Erscheinungsformen
kommen
(WENDT
u.
GROßE
BEILAGE
2013).
Hochfrequente
Atmung,
Körpertemperaturen bis zu 42,5°C führen häufig zum Verenden. Oft sind
ausgeprägte Zyanosen an der Körperunterseite festzustellen. Aus Nasen – und
Maulöffnung tritt häufig blutig-schaumige Flüssigkeit aus. Teilweise sind hingegen
nur Dyspnoe und trockener Husten zu beobachten, die in den meisten Fällen mit
einer Leistungseinbuße einhergehen.
Zur serologischen Untersuchung stehen verschiedene Möglichkeiten zur Verfügung.
Es ist möglich, eine Infektion mit Actinobacillus pleuropneumoniae auf Grund der
Antikörper gegen die Toxine festzustellen. Aber auch über die Verwendung von
spezifischen Oberflächenantigenen ist eine Untersuchung möglich. Leider scheint es
nicht immer zu einer spezifischen Immunantwort zu kommen, sodass es sein kann,
dass Trägertiere in der serologischen Untersuchung negativ bleiben (WENDT u.
GROßE BEILAGE 2013).
Der früheste Zeitpunkt an dem eine Infektion mit Actinobacillus pleuropneumoniae
serologisch nachgewiesen werden konnte, war fünf bis 13 Tage p.i. (WENDT u.
GROßE BEILAGE 2013).
2.7.2.4 PRRSV
Das Porzines Reproduktives und Respiratorisches Sysndrom Virus, kurz PRRSV,
gehört in die Familie der Arteriviridae. Es werden zwei Genotypen des PRRSV
unterschieden. Der hauptsächlich in Europa auftretende EU-Genotyp und der in
Amerika und Asien vertretene North American Genotyp (NA-Genotyp). Bisher konnte
32
Literaturübersicht
das Virus bei keinem anderen Tier außer dem Schwein isoliert werden (NELSEN et
al. 1999).
Nach
in
der
Regel
oronasaler
Aufnahme
vermehrt
sich
der
Virus
im
Makrophagengewebe der Lunge und des Lymphsystems (YAEGER et al. 1993).
Innerhalb von 24 Stunden p. i. kommt es zu einer Virämie (ROSSOW et al. 1994).
Nach der Virämie verbleibt das Virus noch über Monate im lymphatischen Gewebe,
sodass es in Stresssituationen zu einem erneuten Ausbruch kommen kann.
Problematisch ist auch die Infektion tragender Sauen. Hier kann es zu einer
transplazentaren Übertragung auf die Feten kommen.
Klinisch hängt die Ausprägung der Erkrankung stark vom der Virulenz des Stammes,
dem Tieralter, den Umweltbedingungen sowie Ko-Infektionen ab. Die Tiere zeigen
Inappetenz und Fieber bis 41°C. Früh infizierte Tiere weisen oft einen
Kümmererhabitus auf. Bei intrauterinen Infektionen kommt es vermehrt zu
Spätaborten, Mumien, Totgeburten und lebensschwachen Ferkeln. Die serologische
Diagnostik kann auch bei älteren Schweinen, wie Altsauen oder Ebern helfen, da
diese auch bei akuten Infektionen ein ungestörtes Allgemeinbefinden aufweisen
können (Zimmerman 2012).
Nach einer experimentellen Infektion mit dem NA-Genotyp konnte nach neun Tagen
eine positive Immunantwort mittels ELISA festgestellt werden; bei dem EU-Genotyp
nach 15 Tagen (NODELIJK 2002). Die Antikörpertiter bleiben bis zu 10 Monaten p. i.
erhöht (NELSON et al. 1994, YOON et al. 1995).
33
Material und Methoden
3
3.1 Material
3.1.1 Probenmaterial
Die Entwicklung und das Validieren des Testsystems „Protein-Microarray“ soll mit
Fleischsaft und Blutserum als Probenmaterial durchgeführt werden. Dabei sollten
Proben untersucht werden, welche zuvor mittels kommerziellen ELISA auf die
jeweiligen Erreger getestet wurden.
Innerhalb des bereits abgeschlossenen Forschungsprojektes „ NRW-Multiserologie“
an der Außenstelle für Epidemiologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover
(TANGEMANN
2012)
sind
Fleischsaftproben
von
auswählten
Betrieben
in
Nordwestdeutschland entnommen und mittels ELISA-Tests untersucht worden.
Diese Proben wurden für weitere Studien in der Außenstelle für Epidemiologie bei 20°C archiviert. Somit konnte auf ein Archiv mit über 3000 Fleischsaftproben
zurückgegriffen werden, die auf Antikörpergehalte einer Vielzahl der hier zu
untersuchenden Erreger mittels ELISA getestet wurden. Aus diesen wurden zur
Validierung des Protein-Microarrays 60 Proben ausgewählt, so dass Antikörper
positive und Antikörper negative Proben für jeden Erreger zur Verfügung standen.
Einhundert weitere Fleischsaft- und Blutserumpaare von jeweils denselben
Schlachtschweinen, je zehn von zehn Schweinemastbetrieben, wurden bei einer
Probenentnahme auf einem Schlachthof in Niedersachsen entnommen.
Diese Betriebe wie auch die beprobten Schlachttiere wurden zufällig ausgewählt.
Des Weiteren wurden vom Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR) einzelne
Referenzfleischsäfte und Seren käuflich erworben bzw. zur Verfügung gestellt.
34
Hierbei handelte es sich um jeweils fünf Fleischsaft- und Serumproben aus
Infektionsversuchen mit Salmonella Typhimurium aus dem Nationalen Referenzlabor
für die Durchführung von Analysen und Tests auf Zoonosen (Salmonellen) und
Trichinella spiralis aus dem Nationalen Referenzlabor für Trichinella mit definierten
Antikörpertitern.
Vom Nationalen Referenzlabor für Trichinella wurden drei Fleischsaftproben vom
Wildschwein mit definierten Antikörpertitern bereitgestellt.
Aus Ringversuchen der QS Qualität und Sicherheit GmbH lagen außerdem zehn
lyophilisierte Fleischsaftproben mit bekannten Antikörperkonzentrationen gegen
Salmonella spp. als Referenzproben für die initiale Testablaufentwicklung vor.
Zusätzlich wurden auch fünf Referenzseren aus Infektionsversuchen mit bekannten
Antikörperkonzentrationen gegen Toxoplasma gondii, bereitgestellt vom Institut für
Parasitologie
der
Tierärztlichen
Hochschule
Hannover,
zur
initialen
Testablaufentwicklung eingesetzt.
3.1.2 Antigenmaterial
Als
Ausgangsmaterial
für
die
Bespottung
der
Protein-Microarrays
wurde
Antigenmaterial der jeweiligen Erreger ausgewählt. Wichtig für die Entwicklung und
Validierung eines neuen Tests, wie auch hier, ist die möglichst gute Vergleichbarkeit
zwischen dem zu entwickelnden Test und einem Vergleichstest, der oft auch als
„Goldstandard“ bezeichnet wird.
Mit Unterstützung der Fa. Qiagen Leipzig GmbH (Leipzig, Deutschland) (ehemals
Labor Diagnostik Leipzig GmbH) konnte Antigenmaterial der Erreger Salmonella
spp., Influenza A-Virus, PRRSV, Toxoplasma gondii, Trichinella spp. und Yersinia
enterocolitica bereitgestellt werden.
Bei dem Antigenmaterial von Salmonella Typhimurium, Salmonella Cholerasuis,
Salmonella Enteritidis und Salmonella Agona handelt es sich um LipopolysaccharidAntigene. Bei dem verwendeten Antigenmaterial von Yersinia enterocolitica handelt
35
es sich um „Yersinia outer Proteins“, welche nur von pathogenen Yersinien
produziert werden.. Influenza A-Virus, PRRSV, Toxoplasma gondii, Trichinella spp.
und Yersinia enterocolitica sind rekombinante Antigene. Genauere Informationen
über die Antigene wurden aus schutzrechtlichen Gründen von den Testherstellern
nicht weitergegeben.
Ein rekombinantes HEV ORF2 Virusantigen wurde aus dem Institut für Virologie der
Tierärztlichen
Hochschule
Hannover
bereitgestellt,
welches
in
einem
neu
entwickelten in-house-ELISA angewendet wird (BÄCHLEIN et al. 2011, BÄCHLEIN
et al. 2013).
Um Antigene von Mycoplasma hyopneumoniae verwenden zu können, wurden von
der bakteriologischen Abteilung der Veterinärmedizinischen Universität Wien zwei
isolierte Referenzstämme (Mhyo 7.1 und Mhyo 232) angezüchtet, thermisch
inaktiviert und als Nativantigen zur Konzentrationseinstellung und Bespottung der Fa.
Alere Technologies GmbH, Jena, Deutschland zugeschickt.
Actinobacillus
pleuropneumoniae-Antigene
stammten
sowohl
von
den
zwei
Referenzstämmen (ATCC-33378 und ATCC-27088) und zwei von ausgewählten
asservierten APP-Stämmen (APP-2 und APP-9) der akkreditierten Erregerbank der
Außenstelle für Epidemiologie in Bakum.
Diese wurden ebenfalls angezüchtet, abgeschwemmt und zehn Minuten bei 56°C
inaktiviert. Das durch dieses Verfahren gewonnene Nativantigenmaterial wurden in
Jena auf die Protein-Microarrays gespottet.
Der vom FLI zugelassene ELISA-Test Salmotype (Fa. Qiagen Leipzig GmbH,
Leipzig, Deutschland) basiert auf einer Mischung von Salmonellen LPS-Antigenen
von Salmonella Typhimurium, Salmonella Cholerasuis, Salmonella Enteritidis und
Salmonella Agona. Deshalb wird von Salmonella spp.- Antikörper-Nachweistest
gesprochen.
Für die Bespottung der Protein-Microarray-Oberfläche wurden von der Fa. Qiagen
Leipzig GmbH (Leipzig, Deutschland) das Antigenmaterial der Erreger separat zur
Verfügung gestellt.
36
Auf diese Weise war es möglich, sowohl einen „Mischspot“ analog zu dem
„Goldstandard“ ELISA auf die Oberfläche aufzubringen, als auch die einzelnen zur
Verfügung gestellten Subtypen einzeln zu testen.
Folgende Spots wurden im Laufe der Untersuchungen jeweils in einer
Konzentration von 0,1µmol/µl und 0,5µmol/µl gespottet:
Salmonella spp.:
Salmonella Typhimurium 078K
Salmonella Typhimurium ML04
Salmonella Enteritidis
Salmonella Agona
Salmonella Cholerasuis
SalmonellaMix:
- je ¼ S. Thyphimurium, S. Enteritidis, S. Agona, S. Cholerasuis
Yersinia enterocolitica
Toxoplasma gondii
Trichinella spp.
abweichend 0,1µmol/µl und 0,4µmol/µl
PRRSV:
EU
US
Influenza A-Virus
HEV
abweichend 0,167µmol/µl
Im weiteren Vorgehen wurden die Konzentrationen ergebnisorientiert angepasst,
sodass die im Ergebnisteil vorgestellten Konzentrationen von den hier erwähnten
abweichen können.
37
3.1.3 ELISA-Test-Material
Für
die
einzelnen
Erreger
wurden
folgende
„ELISA-Test-Kits“
zur
Referenzwertermittlung der Antikörperkonzentration eingesetzt (Tabelle 3):
Tabelle 3:
Darstellung der verwendeten ELISA-Tests mit Hersteller- und
Zulassungsangaben
Erreger
TestKit
Hersteller
Salmonella spp.
SALMOTYPE®Pig Screen Fa. Qiagen
Leipzig
Zulassung für:
Fleischsaft
Blutserum
(vorher
LDL)
Toxoplasma gondii PIGTYPE®Toxoplasma
Ab
Fa. Qiagen
Prototyp im
Leipzig
Zulassungsverfahren
für Fleischsaft und
Blutserum
Trichinella spp.
Yersinia
PIGTYPE®Trichinella Ab
PIGTYPE®Yopscreen
enterocolitica
Hepatitis E-Virus
Influenza A-Virus
Mycoplasma
PrioCHECK®HEV Ab
Fa. Qiagen
Fleischsaft
Leipzig
Blutserum
Fa. Qiagen
Fleischsaft
Leipzig
Blutserum
Prionics AG
Fleischsaft
porcine
Blutserum
Influenza A Virus Antibody IDEXX
Blutserum
Test Kit
Laboratories
IDEXX M. hyo. Ab Test
IDEXX
Blutserum
Laboratories
hyopneumoniae
Actinobacillus
ID Screen® APP
IDvet
pleuropneumoniae
Screening Indirect
Innovative
Blutserum
Diagnostics
PRRSV
IDEXX PRRS X3 Ab Test
IDEXX
Laboratories
38
Blutserum
Die einzelnen Untersuchungen wurden entsprechend der jeweiligen Testanleitungen
durchgeführt. Im Falle von Influenza A-Virus, Mycoplasma hyopneumoniae,
Actinobacillus
pleuropneumoniae
und
PRRSV
waren
die
ELISA-Testkits
ausschließlich für Blutserum zugelassen. Für diese Erreger wurden die Tests mit
Fleischsaft
unter
der
Annahme,
dass
die
Antikörperkonzentration
in
Fleischsaftproben ca. 10mal geringer ist, durchgeführt, welches auch durch
Vergleichsuntersuchungen innerhalb einer Studie von MEEMKEN und BLAHA
(MEEMKEN u. BLAHA 2011b) mit denselben ELISA-Tests bestätigt werden konnte.
Bei dem Toxoplasmen- AK-ELISA der Fa. Qiagen Leipzig GmbH (Leipzig,
Deutschland) handelt es sich um einen Test, welcher sich im Zulassungsverfahren
befindet, also als funktionstüchtig betrachtet werden kann.
Über das photometrische computergestützte Auslesegerät „Tecan Sunrise“ (Tecan
Group Ltd., Männedorf, Schweiz) wurden die „optische Dichte“-Werte (OD-Werte)
ermittelt. Mit Hilfe von im TestKit angegebenen Auswertungsvorgaben konnten aus
den jeweiligen OD-Werten positive oder negative Testergebnisse ermittelt werden.
In einigen ELISA-Tests gab es einen „fraglicher Bereich“ zwischen dem positiven und
negativen Bereich. Da bei der Testvalidierung eine Ja/Nein-Entscheidung nötig ist,
wird der „fragliche Bereich“ zu den positiven Ergebnissen gezählt.
3.1.4 Der Microarray
Um die multiserologischen Untersuchungen durchführen zu können, wurden von der
Firma Alere Technologies (Jena, Deutschland) Protein-MicroarrayTubes (Abb. 3)
produziert. Auf dessen Bodenfläche befindet sich ein 3x3mm großer Glas-Chip, auf
den die verschiedenen Erregerantigene an definierten Positionen aufgebracht
wurden.
39
Abbildung 8:
MicroarrayTube (Fa. Alere Technologies GmbH)
Auf einem 3x3mm großen Glaschip im Boden des Tubes befinden sich die verschiedenen Antigene
an definierten Positionen.
.
Zudem wurde ein Arrayscanner zum Ablesen der Testergebnisse von der Fa. Qiagen
Leipzig GmbH (und von der Firma Alere Technologies (Jena, Deutschland) eine
dazugehörige Auslesesoftware bereitgestellt.
Zur Findung einer optimalen Antigenkonzentration für jeden Erreger wurden die
Antigene in verschiedenen Antigenkonzentrationen aufgespottet.
Um die Qualität der aufgespotteten Antigene untereinander zu vergleichen und um
die
bei
der
ELISA-Testung
übliche
Mehrfachbefundung
(meistens
Doppelbefundungen) anzuwenden, wurde jeder Spot dreifach auf den Array
aufgebracht.
Zusätzlich befinden sich auf dem Protein-Microarray eine dreifache Positivkontrolle,
bei welcher es sich um eine sogenannte Biotinmarke handelt sowie eine dreifach
gespottete Negativkontrolle, bei der nur eine Pufferlösung ohne Antigenstrukturen
aufgebracht wurde.
Da die Antigenkonzentrationen der einzige Punkt des Testsystems ist, an dem
erregerindividuelle Veränderungen vorgenommen werden konnten, war es wichtig,
während der gesamten Untersuchungen zur Validierung die jeweiligen Ergebnisse
kritisch zu betrachten. Das Spotten von gleichen Antigenen in verschiedenen
Konzentrationen half bei der Beurteilung und dabei diese zu optimieren.
Antigene, die zu keinem sinnvollen Ergebnis führten, konnten so für die nächste
Microarrayproduktion aus dem Layout genommen und durch andere ersetzt werden.
40
3.1.5 Sonstige Materialen
Bei der Entwicklung des Testprotokolls, d.h. eines standardisierten Testablaufs,
wurden
verschiedene
Reagenzien
angewendet
und
hinsichtlich
der
damit
produzierten Ergebnisse ausgewertet.
In Anlehnung an das „Protein Binding Kit“ (Alere Technologies GmbH item number
245500100) und die Erfahrungen der Fa. Qiagen Leipzig GmbH (Leipzig,
Deutschland) wurden folgende Reagenzien hinsichtlich der Eignung im ProteinMicroarray getestet:
Pufferlösungen (Wasch-und Verdünnungspuffer):
Salmotype PigScreen LDL (Qiagen Leipzig, Leipzig, Deutschland)
PigType blau LDL (Qiagen Leipzig, Leipzig, Deutschland)
P1 Waschpuffer (Alere Technologies, Jena, Deutschland)
Destilliertes Wasser
Fetales Kälberserum (FCS):
als Vorbereitungsschritt vor der Probeninkubation
als Zusatz zu den Waschpuffern in verschiedenen Konzentrationen
Konjugate:
Multi-species-HRP (Qiagen Leipzig, Leipzig, Deutschland)
Anti-Pig IgG-HRP [Goat] (Biomol, Hamburg, Deutschland)
Protein-A-HRP (Qiagen Leipzig, Leipzig, Deutschland)
Anti-Pig IgG-Biotin [Goat] (Bethyl, Montgomery, USA)
Streptavidin-HRP (C3) (Alere Technologies, Jena, Deutschland)
41
3.2 Methoden
3.2.1 Entwicklung eines Testprotokolls
Zur Validierung des Testsystems „Protein-Microarray“ musste ein Testablauf
entwickelt werden, in dem konkrete Mengen- und Zeitangaben für Reagenzien und
Einwirkdauern festgelegt sind. Außerdem musste die Vorgehensweise standardisiert
werden.
In Anlehnung an die Funktionsweise eines ELISAs und auf Grundlage des von der
Produktionsfirma der Microarrays mitgelieferten Ablaufschemas „Protein Binding
Kit“ (Alere Technologies GmbH item number 245500100), war es das Ziel, ein
möglichst optimales Testprotokoll zu erstellen.
Angelehnt an die Erfahrungen aus verwandten serologischen Nachweismethoden
zur Testung von Serum und in Rücksprache mit der Laborabteilung der Fa. Qiagen
Leipzig GmbH (Leipzig, Deutschland) entstand ein erster Ablaufplan (Tabelle 4).
Zur Optimierung wurden nacheinander Parameter wie Probenverdünnung und –
aufbereitung, Wasch- und Einwirkzeiten, Schüttelfrequenzen und Reagenzien des
Ablaufplans verändert, getestet und je nach Ergebnis beibehalten oder ausgetauscht.
42
Tabelle 4:
Erster Ablaufplan zur Durchführung von MicroarrayUntersuchungen
Schritt
Reagenz
Waschen
PBST
Blocken
Fetales
Verdünnung
Kälber
10%
Volumen
Temp.
Schütteln
Zeit
500µl
37°
550rpm
2x5min
100µl
37°
550rpm
15min
500µl
37°
550rpm
2x5min
100µl
37°
400rpm
1h
500µl
37°
550rpm
2x5min
100µl
37°
400rpm
15min
550rpm
2x5min
Serum (FCS)
Waschen
PBST
Probe
Serum
Waschen
PBST
Konjugat
Multispez./
1:500
Strep
1:5000
1:20
Waschen
PBST
500µl
37°
Substrat
SeramunGrün
100µl
23°
10min
PBST : Phospat Buffered Saline with Tween-20
rpm
: rounds per minute (Umdrehungen pro Minute)
Im Lieferzustand sind die bespotteten Protein-Microarrays mit einem Polysaccharid
haltigen Schutzfilm bedeckt. Diese muss zuerst abgewaschen werden, um die
spezifischen Antigene freizulegen, was dem ersten Waschschritt entspricht.
Zur
Vorbereitung
der
Microarrayoberfläche
wurde
der
Effekt
von
fetalem
Kälberserum (FCS) ausgetestet. Das fetale Kälberserum (FCS) sorgt für eine
Stabilisierung der Bindungsreaktion zwischen Antikörper und Antigen, indem es z.B.
enzymatische Reaktionen abpuffert, selbst aber nicht mit den Antigenen interagiert.
Das
FCS
wurde
in
verschiedenen
Konzentrationen
mit
verschiedenen
Inkubationszeiten ausgetestet.
Statt Phosphate Buffered Saline Tween-20 (PBST) wurden die oben erwähnten
unterschiedlichen Pufferlösungen nacheinander getestet.
Auch die Verdünnung der Proben wurde mit verschiedenen Pufferlösungen getestet,
sowie die Verdünnungsstufe selbst in Reihenuntersuchungen evaluiert.
43
Der
Fleischsaft
wurde
in
verschiedenen
Verdünnungen,
genauer
in
den
Verdünnungsstufen 1:10, 1:5 und 1:2 geprüft.
Das Austesten der Inkubationszeiten, die die einzelnen Reagenzien auf die
Arrayspots bzw. die zu dem jeweiligen Zeitpunkt dort gebundenen Substanzen
einwirken, war ebenfalls wichtig, um vor allem den Ablauf zu optimieren.
Ebenfalls mussten die Zeiten und die Anzahl der einzelnen Waschschritte zwischen
den Inkubationen eingestellt werden.
Die Auswahl eines geeigneten Konjugates war von besonderer Bedeutung. Nur so
konnten die gebundenen Antikörper auch sichtbar gemacht werden. Die Konjugate
müssen auf der einen Seite an den Schweine-Ak binden, auf der anderen aber auch
eine enzymatische Reaktion des Substrates bewirken.
„Multi-spezies-Konjugat“, „anti-Pig IgG-Konjugat“ und „Protein-A-Konjugat“ wurden
als Konjugat gekoppelt mit „horseradish peroxidase“ (HRP) verwendet, getestet und
verglichen. Die Markierung der „Erregerspots“ läuft über das an Antikörper
gebundene Konjugat ab.
Das Protein „Streptavidin“ bindet sehr affin an Biotin und wird daher häufig als
Brückenmolekül genutzt. Es sorgt für eine Bindung an den aufgespotteten
Biotinmarken, welche als Positivkontrolle verwendet werden sollten. Gekoppelt an
HRP ließ sich diese Bindung über die erwähnte Substratreaktion nachweisen.
Als letzter Schritt des Versuchsablaufs musste die Inkubationszeit des Substrats
„SeramunGrün“ (Seramum, Berlin, Deutschland) beurteilt werden. Durch eine
enzymatische Reaktion mit der Horseradishperoxidase wird das Substrat und somit
auch die gebundenen Antikörper farblich sichtbar gemacht.
Die Positivkontrollspots wurden also parallel zu den anderen Spots getestet.
Um die Positivkontrolle auch als solche verwenden zu können, war es sinnvoll sie in
den Ablauf der einzelnen Bindungen zu integrieren. Daher war es ein Ziel, die beiden
Konjugate zu verknüpfen.
Als neue Positivkontrolle wurde ein Schweine-Immunoglobulin G aufgebracht. Diese
konnte im Weiteren genau wie die gebundenen Antikörper aus der Probe behandelt
44
werden. Über ein „antiPig IgG, gekoppelt an Biotin und ein Streptavidin-HRP, sollte
sich der Ablauf vereinheitlichen lassen.
Die Darstellung der Glasplatte mit den auf ihr befindlichen lokalisierten Reaktion
wurde mit Hilfe des zur Verfügung gestellten ArrayTubeReader „ATR01“ (Alere
Technologies, Jena, Deutschland) durchgeführt (Abbildung 9).
Abbildung 9:
ATR03 (Fa. Alere Technologies GmbH)
Auslesegerät für die Microarrays. Über eine Kamera lässt sich der Chip darstellen und
computergestützt auswerten.
Mit Hilfe der Computersofware „Partisan Iconoclust“ (Alere Technologies, Jena,
Deutschland) ließ sich über ein Raster die genaue Position der Antigene auf dem
Microarray für die EDV definieren bzw. festlegen. Die jeweilige Spotschwärzung
wurde mit Hilfe der Software in einen Zahlenwert zwischen 0 (bedeutet keine
Antikörper in der Probe vorhanden) bis maximal 1 (hohe Antikörperkonzentration in
der Probe) umgewandelt. Dabei wurde auch eine eventuelle Hintergrundanfärbung
mit beachtet, so dass die Fehlerquelle einer unspezifischen Schwärzung der
45
Glaspatte minimiert wurde. Auf diese Weise ergaben sich auswertbare Werte für die
einzelnen Spots.
Auf eine mögliche Quantifizierbarkeit über die Schwärzungsgrade wird im
Ergebnisteil eingegangen.
Abbildung 10:
Schematisch dargestellter Testablauf (Fa. Alere
Technologies GmbH)
Von links nach rechts schematisch dargestellt ist die Durchführung des Arraytests. Beginnend mit dem
ArrayTube mit benutzerspezifisch antigenbespottetem Chip werden im nächsten Schritt dir Probe
hinzugefügt und die einzelnen Aufbereitungsschritte durchgeführt. Ein entsprechendes Substrat führt
zu einer Farbreaktion an den einzelnen Spots. Diese können über ein Auslesegerät dargestellt und
mittels geeigneter Software ausgewertet und präsentiert werden.
3.3 Vergleichsuntersuchung Microarray vs. ELISA
Zur Erprobung des entwickelten Microarray-Prototyps mit einem festgelegten
Versuchsablauf wurden Fleischsaftproben aus dem abgeschlossenen Projekt
„Multiserologie-NRW“ (TANGEMANN 2012) via Microarray untersucht. Ergänzend
kamen Proben aus Infektionsversuchen des BfR, des Instituts für Virologie und
Parasitologie sowie drei von Trichinen infizierten Wildschein-Fleischsaftproben zum
Einsatz.
Ziel des Arbeitsschrittes war die Überprüfung, inwieweit der entwickelte MicroarrayPrototyp zuverlässige Testergebnisse produziert, also Spotanfärbungen an den
entsprechenden Positionen des Rasters entstehen.
46
Durch eine gezielte Auswahl an Beständen und mittels im ELISA vorgetesteten
Fleischsaftproben stand das gesamte Spektrum an Antikörpertitern für jeden Erreger
zur Verfügung und konnte getestet werden.
Die ermittelten Werte wurden als Referenzwerte angesehen, die mit den mittels
Microarray gewonnenen Daten verglichen werden konnten.
Neben der Überprüfung der Funktionsfähigkeit des Microarrays sollten so auch
Grenzwertermittlungen für eine qualitative Aussage untersucht werden.
Um die geeignetsten Antigenkonzentrationen der verwendeten Antigene für den
Microarray zu ermitteln, wurden verschiedene Antigenkonzentrationen gespottet. Die
Testergebnisse des Microarrays wurden je Antigen und Konzentration mit dem
ELISA-Testergebnis hinsichtlich deren Übereinstimmung verglichen. Nur diese soll
im Ergebnisteil ausgewertet werden. Insgesamt wurden 160 Fleischsaftproben und
100 Seren mit dem festgelegten Testablauf untersucht. Dabei handelte es sich bei
den 60 Fleischsaftproben um ausgewählte Proben aus dem „Multiserologie-NRWProjekt“ (TANGEMANN 2012). Insgesamt 100 weitere Fleischsaftproben, sowie 100
Serumproben
wurden
aus
zufällig
ausgewählten
Beständen
an
einem
niedersächsischen Schlachthof im Jahr 2013 gewonnen.
Zur Auswertung der mittels Partisan Iconoclust (Alere Technologies, Jena,
Deutschland) erfassten Daten wurde das Programm Microsoft Office Excel
verwendet. Bei der Erhebung von statischen Parametern wurde das AddInProgramm „XLSTAT“ eingesetzt. Dieses Statistikprogramm wird von vielen
Universitäten neben SAS oder SPSS zur Auswertung von Arbeiten verwendet
(TUSCHL 2010).
In verschiedenen Arbeiten und Dissertationen wurden Auswertungen mit XLSTAT
durchgeführt, z.B. in Komorowski, Diss Berlin Freie Univ. 2011 (KOMOROWSKI
2011). Nach Desdevises deckt das Programm eine überraschend große Breite an
statistischen Methoden ab (DESDEVISES 2013) und ist für wissenschaftliche
Auswertungen geeignet.
Mit Hilfe dieses Programmes wurden die Ergebnisse der ELISA-Untersuchungen mit
denen der Microarray-Untersuchungen verglichen.
47
Durch die Verwendung einer „Receiver Operating Characterisic“ (ROC) Analyse
konnte die Testsicherheit des neuen Testes für jedes Antigen ermittelt werden. Es
wurde hierbei von dem ELISA als Goldstandard ausgegangen.
Die ermittelte Testsicherheit bezieht sich also auf den Vergleich zu den im ELISA
ermittelten Ergebnissen.
3.4 Statistische Auswertung
Ziel
der
Auswertung
war
es,
die
gewonnenen
Ergebnisse
aus
der
Microarrayuntersuchung mit denen der ELISA-Tests zu vergleichen. Neun Erreger
wurden separat ausgewertet und der neue Test validiert.
Die Ergebnisse wurden zunächst mittels deskriptiver Statistik, „ROC-Kurve“
(Receiver Operating Characteristic-Kurve) zur optimalen Grenzwertbestimmung (CutOff) untersucht und, wenn es sinnvoll war, mit weitergehenden statistischen
Methoden wie Bland-Altmann-Analyse und Regressionsanalyse nach PassingBablok ausgewertet.
3.4.1 Verfahren der deskriptiven Statistik
Um einen ersten Eindruck über den Zusammenhang zwischen den Werten des
ELISA-Tests
und
den
entsprechenden
Array-Werten
zu
erhalten,
ist
die
Visualisierung der Daten durch ein Punktdiagramm ein geeignetes Mittel. Dabei
werden den ELISA-Werten die Werte des Arrays zugeordnet.
3.4.2 ROC-Kurve
Bei der ROC-Analyse wird der Zusammenhang zwischen Spezifität und Sensitivität
eines Testsverfahrens untersucht.
48
Die Sensitivität gibt den Anteil der richtig positiven Ergebnisse des Array-Tests
bezogen auf ein positives Ergebnis des ELISA-Tests an:
rp
rp  fn
Sensitivität =
Die Abkürzung „rp“ steht für „richtig positiv“ und bedeutet, dass als positiv gewertete
Ergebnis des Microarrays auch im ELISA positiv ist. „fn“ steht für „falsch negativ“.
Das Ergebnis des Microarrays ist negativ, obwohl die Probe positiv ist.
Die Spezifität gibt den Anteil der richtig negativen Testergebnisse des Array-Tests
bezogen auf ein negatives Ergebnis des ELISA-Tests an:
Spezifität =
rn
rn  fp
Hier steht „rn“ für „richtig negativ“. Das negative Microarrayergebnis stimmt mit dem
negativen
ELISA-Ergebnis
überein.
„fp“
steht
für
„falsch
positiv“.
Das
Microarrayergebnis sagt positiv, obwohl der Goldstandard ELISA ein negatives
Ergebnis liefert.
Dieser Sachverhalt lässt sich tabellarisch wie folgt erfassen (Vierfeldertafel):
Tabelle 5:
Vierfeldertafel ELISA-Test/ Array-Test
ELISA-Test positv
ELISA-Test negativ
Array-Test positiv
richtig positv (rp)
falsch positiv (fp)
Array-Test negativ
falsch negativ (fn)
richtig negativ (rn)
Die Testsicherheit des jeweiligen ELISA-Tests wird hierbei außer Acht gelassen.
49
Bei der ROC-Kurve wird die Zuordnung
Falschpositivrate (1-Spezifität) → Richtigpositivrate (Sensitivität)
graphisch dargestellt (siehe Abbildung 11).
Abbildung 11:
Beispiel einer ROC-Kurve (modifiziert aus Public Health
Service. Diabetes program guide, 1960)
Bei der Darstellung der ROC-Kurve ist die Sensitivität (Richitgpositivrate) gegen 1-Spezifität
(Falschpositvrate) aufgetragen. Bei der Erstellung einer ROC wird jedes der ermittelten Ergebnisse als
Grenzwert betrachtet und die dazugehörige Sensitivität und Spezifität ermittelt. Werden diese grafisch
dargestellt, so ergibt sich eine Kurve. Die Fläche unter der Kurve (AUC) gibt eine Aussage über die
50
Testqualität Sie kann zwischen 0 und 1 liegen. Die gestrichelte Linie halbiert den Grafen und würde
einer AUC von 0,5 entspechen. Ein Ergebnis nahe 0,5 lässt auf einen Zufallsprozess schließen.
Bei der ROC-Kurve ist die „Area under curve“ (AUC) als Maß für die Qualität des
entwickelten Testes anzusehen. Zur Interpretation der Ergebnisse ist zu wissen,
dass die AUC einen Wert zwischen 0 und 1 annehmen kann, wobei aber 0,5 der
schlechteste Wert ist. Eine ROC-Kurve nahe der Diagonalen ist das zu erwartende
Ergebnis eines Zufallsprozesses, was dann der AUC von 0,5 entspricht. Ein hoher
ROC-AUC-Wert bedeutet ein gutes Ergebnis: Das Ergebnis des Array-Tests
entspricht dem Ergebnis des ELISA-Tests. Liegt der Wert deutlich unter 0,5, so liegt
ein umgekehrter Zusammenhang vor. Der zu überprüfende Test liefert eher das
Gegenteil des Goldstandard-Ergebnisses.
Innerhalb der ROC-Analyse wird jeder gemessene Wert als „theoretischer
Grenzwert“ angesehen und dazu Sensitivität und Spezifität berechnet. Auf diese
Weise lässt sich ein optimaler Grenzwert ermitteln.
In der Abbildung ist der Grenzwert der Punkt mit dem größten Abstand zur
Diagonalen;
dieser
Punkt
-
auch
Cut-Off
genannt
-
ist
der
optimale
Entscheidungspunkt: Es ist der Punkt maximaler Sensitivität und maximaler
Spezifität.
Der
Abszissenwert
gibt
die
Spezifität
(durch
1-Spezifität),
der
Ordinatenwert die dazugehörige Sensitivität an.
3.4.3 Bland-Altman-Analyse
Bei einem Bland-Altman-Diagramm wird die Differenz zweier Testergebnisse einer
Probe mit dem Mittelwert dieser beiden Testergebnisse verglichen. Die graphischen
Darstellungen, die mittels XLSTAT angefertigt wurden, enthalten neben der
Zuordnung:
Mittelwert der beiden Testergebnisse → Differenz der Testergebnisse
51
noch die Hilfslinien
-
Mittelwert der Differenz (Schiefe)
-
Begrenzungslinien des 95%- Konfidenzintervalls
Ein Beispiel für ein Bland-Altman-Diagramm ist in Abbildung 12 dargestellt.
Durch diese Analyse lassen sich die zwei Testsysteme anschaulich miteinander
vergleichen. Man sieht durch das Auftragen der Differenzen, ob beide Messsysteme
einen vergleichbaren Wertebereich haben, ob die Abweichungen im gewählten
Differenz der
zwei Testgrößen
Konfidenzbereich liegen und wo die Abweichungen besonders groß sind.
Mittelwert der zwei Testgrößen
Abbildung 12:
Beispiel eines Bland-Altman-Diagrammes
Auf der Waagerechten ist der Mittelwert der zu vergleichenden Testgrößen aufgetragen, auf der
Senkrechten deren Differenz. Als Interpretationshilfen sind der Mittelwert der Differenz, auch als
Schiefe
bezeichnet
(gestrichelte
waagerechte
Linie)
und
Begrenzungslinien
des
95%-
Konfidenzintervalls dazu einzeichnet. Durch die Auswertung mittels Bland-Altman-Diagramm lässt
sich anschaulich überprüfen ob zwei Testsysteme einen vergleichbaren Wertebereich haben.
52
3.4.4 Passing-Bablok-Regressionsanalyse
Standardmäßig werden zu untersuchende Zusammenhänge oft auf deren Linearität
getestet.
Auf die üblichen Annahmen, unter denen eine lineare Regression betrachtet wird,
wird in diesem Fall verzichtet. Stattdessen wird bei der Untersuchung der Daten mit
einer Passing-Bablok-Regressionsanalyse ein Linearitätstest durchgeführt, bei der
die Steigungen zwischen zwei Messpunkten aus ELISA- und Array-Werten
betrachtet werden.
Die Regressionsanalyse nach Passing-Bablok orientiert sich im Gegensatz zu einer
linearen Regressionsanalyse am Median der geordneten Steigungen. Ausreißer und
extreme Werte fallen entsprechend nicht ins Gewicht (PASSING et al. 1983).
Die Aufgabe ist es allerdings, bei Passing-Bablok durch diese Regressionsanalyse
festzustellen, ob ein linearer Zusammenhang zwischen den Messwerten vorhanden
ist.
53
Abbildung 13:
Beispiel einer Passing-Bablok-Regressionsanalyse nach
Miler et al. (2009)
TDx und AxSYM stehen für die zu vergleichenden Parameter.
Bei der Passing-Bablok-Regressionsanalyse handelt es sich um einen Test auf Linearität. Dabei
werden die zu vergleichenden Parameter gegeneinander aufgetragen und die Steigungen zwischen
diesen analysiert. Bei der Passing-Bablok-Analyse wird ein Median (fett markierte Linie) durch die
Wertepaare gelegt, sodass Ausreißer weniger gewichtet werden als üblich. Die gestrichelten Linien
geben das 95%-Konfidenzinterval an. Die gepunktete Linie dient als Winkelhalbierende lediglich der
Orientierung.
54
Ergebnisse
4 Ergebnisse
4.1 Ablauf der Testentwicklung
Für die Entwicklung und Validierung des Microarrays waren unterschiedliche
Arbeitsschritte notwendig. Diese sollen hier kurz aufgeführt und später näher
erläutert werden.
Zunächst war es notwendig, das passende Probenmaterial zu akquirieren, mit denen
die Tests durchgeführt werden können. Es war wichtig, dass sowohl mittels ELISATest vorgetestete Fleischsaft- als auch Blutserumproben zur Verfügung standen. Des
Weiteren
musste
der
Probenpool
sowohl
antikörperpositive,
als
auch
antikörpernegative Proben beinhalten, die das gesamte Spektrum der in die
Testentwicklung einbezogenen Erreger abdeckten.
Das Akquirieren geeigneter Antigene war essentiell, um die Möglichkeit zu schaffen
einen funktionsfähigen „Prototyp eines Microarrays“ zu produzieren.
Die Herstellung der Microarrays bedurfte der Entwicklung eines passenden Layouts
in Bezug auf die Auswahl der Antigene, Wahl von verschiedenen Konzentrationen
der Antigene als auch der Auswahl geeigneter Positiv- und Negativkontrollen.
Verwendung von einzelnen Fleischsaftproben aus der mittels ELISA voruntersuchten
Probensammlung des Multiserologie-NRW-Projektes (TANGEMANN 2012) statt.
Dabei wurde Schritt für Schritt versucht, den Ausgangstestablauf zu optimieren.
Insgesamt wurden 60 Microarray-Chips für diesen Arbeitsschritt benötigt.
In mehreren Versuchsreihen wurden dazu verschiedene Testsubstanzen in
verschiedenen Konzentrationen und verschiedenen Medien getestet und verglichen.
Unterschiedliche Waschlösungen und Behandlungen der Substanzen wurden
getestet. Außerdem trug die Wahl geeigneter Inkubationszeiten ebenfalls maßgeblich
zu dem Ergebnis bei.
Mit
dem
schließlich
entwickelten
Testablauf
mussten
in
einem
weiteren
Validierungsschritt Ergebnisse erzeugt und bewertet werden. Zur Bewertung wurde
55
Ergebnisse
der in der Labordiagnostik routinemäßig eingesetzte ELISA als „Goldstandard“
gewählt. Mit diesem wurden die mittels Microarray erarbeiteten Ergebnisse
verglichen und statistisch ausgewertet.
So konnten Aussagen über die Testsicherheit, Sensitivitäten, Spezifitäten und cutoff-Werte gemacht werden. Als Ergebnisse standen hierzu die Testungen der 60
Fleischsaftproben
des
Multiserologie-NRW-Projektes,
sowie
Ergebnisse
von
einhundert Fleischsaftproben und einhundert Blutserumproben von einhundert
Schweinen, die am Schlachthof gewonnen wurden, zur Verfügung.
Da bei einzelnen
der gespotteten Konzentration des Errregerantigens etwas
verändert wurde, konnten nicht immer die insgesamt 260 Tests miteinander
verglichen werden.
4.1.1 Vorbereitung des Microarrays
Die vom Hersteller aufgebrachte Polysaccarid haltige Schutzschicht auf den
Microarrays ließ sich problemlos durch Waschen mit dem Waschpuffer entfernen.
Dabei konnten keine Unterschiede zwischen den einzelnen Waschpuffern festgestellt
werden. Wichtig war, dass das Waschen mehrmals durchgeführt wurde. Bei
einmaligem Waschen konnte nicht die gesamte Schutzschicht entfernt werden. Als
effizient stellte sich das dreimalige Waschen mit jeweils zwei Minuten Waschzeit
unter langsamem Schütteln bei 350rpm heraus.
Zur Vorbereitung der Microarrayoberfläche erwies sich fetales Kälberserum in einer
Verdünnung von 10% als am besten geeignet. Eine Menge von 10µl FCS verdünnt
mit 90µl P1 wurden für 15 min auf den Array gegeben und bei 350rpm geschüttelt.
Die Ergebnisse, die so erzielt wurden, waren klarer, das heißt es gab weniger
ungewollte Bindungsreaktionen und die als positiv erkannten Spots waren deutlicher
erkennbar.
56
Ergebnisse
4.1.2
Fleischsaft als Untersuchungsmedium
Die im Material und Methodenteil erwähnten ausgewählten Fleischsaftproben wurden
in verschiedenen Verdünnungsstufen und mit verschiedenen Verdünnungslösungen
getestet. Insgesamt wurde so versucht, einen für Reihenuntersuchungen stabilen
Testablauf festzulegen.
Da bei einer Verdünnung von 1:2 die Probe sehr inhomogen war und invalide
Testergebnisse lieferte, welche durch „Verunreinigungen“ auf dem Arraybild
zustande kamen und die das Ablesen des Schwärzungsgrades der Spots unmöglich
machten, wurde der Fleischsaft vor dem Verdünnen zentrifugiert. Durch diesen
Arbeitsschritt konnte der Fleischsaft von weiteren möglicherweise inhibitorisch
wirkenden Bestandteilen befreit werden. Eine Zentrifugation für drei Minuten bei
4000rpm war ausreichend.
Eine Testdurchführung mit einer Verdünnung des Fleischsaftes von 1:2 erwies sich
zusammen mit dem Zwischenschritt der Zentrifugation als am besten geeignet.
Die Fleischsaftverdünnung 1:5 führte zu einem Ergebnis, dargestellt in Abbildung 14,
bei dem eindeutig Bindungsreaktionen erkannt werden konnten. Betrachtet man im
Vergleich das Ergebnis des gleichen Fleischsaftes eingesetzt in einer Verdünnung
von 1:2 (Abbildung 15), so erkennt man, dass die Bindungsreaktionen mit einer 1:2
Verdünnung deutlicher sind.
Entscheidend
bei
diesem
wichtigsten
Schritt,
der
Antigen-Antikörper-
Komplexbildung, war die Wahl des richtigen Verdünnungspuffers. Durch „try-anderror“-Tests stellte sich der PigType Blau LDL als am besten geeignet heraus. Bei
anderen ergaben sich vor allem unspezifische Bindungen an den Spots.
57
Ergebnisse
Abbildung 14:
Ergebnisbild der Microarrayuntersuchung einer
Fleischsaftprobe (1:5 verdünnt; zentrifugiert)
Blick auf das Ergebnisbild eines Testdurchlaufs. Graue Punkte weisen auf Bindungsreaktionen bzw.
auf Antikörper gegen an diesen Stellen gespottete Antigene in der Probe hin. Die schwarzen
Rechtecke dienen der Software als Orientierung zum Auslesen des Rasters.
Abbildung 15:
Ergebnis der Testdurchführung mit einer Probenverdünnung von 1:2 und vorheriger Zentrifugation der
Fleischsaftprobe. Weitere Erklärungen siehe Legende Abb. 14.
58
Ergebnisse
Bei der Austestung der Inkubationszeit ergab sich eine 30 minütige Inkubation als
zweckmäßig und ausreichend. Bei längeren Inkubationen von 60 Minuten oder 90
Minuten konnten keine besseren Bindungsreaktionen festgestellt werden.
4.1.3 Konjugate
In ersten Untersuchungen wurde ein anti-Pig IgG-HRP-Konjugat verwendet. Dieses
führte in einer Verdünnung von 1:5000 zu guten Ergebnissen. Zusätzlich wurde ein
Streptavidin-HRP in einer Verdünnung von 1:1000 hinzugegeben. Dieses sehr Biotin
affine Präparat sorgte letztendlich für die Anfärbung der Positivkontrolle.
Weitergehend war es notwendig, die Positivkontrolle in den Reaktionsablauf der
anderen Spots zu integrieren.
Statt einem „anti-Pig IgG-HRP-Konjugat“ wurde deshalb ein „anti-Pig IgG-BiotinKonjugat“ (Bethyl, Montgomery, USA) verwendet.
So wurden alle Spots, an denen Antikörper gebunden hatten, „biotinmarkiert“ und
gelangten somit auf eine Reaktionsebene mit der Positivkontrolle.
Durch Zugabe eines Streptavidin-HRP-Konjugats (C3 im „Protein Binding Kit“ von
der Alere Technologies, Jena, Deutschland) ließen sich nun Positivkontrollen und
Spots einheitlich über die Substratreaktion anfärben.
Die ermittelten Inkubationszeiten lagen für anti-Pig IgG-Biotin und Streptavidin-HRP
jeweils bei 15 Minuten.
Anti-Pig IgG-Biotin lag als Konzentrat vor. Deshalb musste es sehr hoch verdünnt
werden. Geeignet erwies sich dafür der Puffer P1.
Es stellte sich eine Verdünnung von 1:20.000 als gut heraus. Diese wurde über eine
Verdünnungsreihe erreicht.
Zuerst wurde 1µl anti-Pig IgG-Biotin zu 99µl P1 gegeben. So entstand eine
Verdünnung von 1:100. In einem nächsten Schritt wurde 1µl von der 1:100
Verdünnung zu 199µl P1 gegeben Die Verdünnung betrug damit 1:20.000.
Bei dem verwendeten Streptavidin-HRP handelte es sich um ein bereits
vorverdünntes Konjugat aus dem „ProteinBindingKit“ der Fa. Alere Technologies
59
Ergebnisse
(Jena, Deutschland). Dieses führte nach angegebener Verdünnung von 1:100 mit P1
zu guten Resultaten.
4.1.4
Waschschritte
Wie beschrieben, wurde zuerst die Polysaccharid haltige Schutzschicht durch 3 x 2
Minuten langes Waschen mit jeweils 300 bis 400µl P1 bei 350rpm von der
Microarrayoberfläche entfernt.
Das Waschen nach der Inkubation der Fleischsaftprobe wurde ebenfalls mit einer
Zeitdauer von 3 x 2 Minuten mit 300 bis 400µl Waschpuffer bei 350rpm als Optimum
ermittelt. Bei diesem Waschschritt wurde allerdings PigType Blau LDL verwendet.
Dieser wurde auch zur Probenverdünnung benutzt und stellte sich als deutlich
schonender für den Antigen-Antikörper-Komplex heraus.
Der Waschschritt nach der Inkubation mit anti-Pig IgG-Biotin-Konjugat beinhaltete
lediglich ein Waschschritt ohne Wartezeit mit einer Menge von 300 bis 400µl P1.
Nach Inkubation des Streptavidin-HRP-Konjugates wurde einmal mit 300 bis 400µl
P1 und 2 Minuten Wartezeit gewaschen, worauf ein zweiter Waschschritt mit 300 bis
400µl P1 ohne Warten folgte.
4.1.5 Substrat
Das als Substrat extra für Microarrayanwendungen vertriebene „Seramun Grün Chip“
war auch für diesen Microarray-Prototypen tauglich.
Es stellte sich heraus, dass nach einer Zeit von 10 Minuten eine vollständige
enzymatische Reaktion mit der Horseradishperoxidase vollzogen war. Damit hatte
eine Färbung der spezifischen Antigenspots, an denen Antikörper gebunden hatten,
stattgefunden.
60
Ergebnisse
In der Tabelle 6 sind alle Erkenntnisse zusammengefasst dargestellt. Nach diesem
Testablauf wurde der Protein-Microarray für Schweine mit den ELISAs hinsichtlich
der Vergleichbarkeit der Testergebnisse verglichen.
Abbildung 16 und 17 zeigen suboptimale Ergebnisse in der Entwicklungsphase des
Testablaufs.
Abbildung 16:
Schlierenbildung durch Waschpuffer PigType Blau LDL
(Qiagen Leipzig GmbH, Leipzig, Deutschland) bei
durchgehender Verwendung für alle Waschschritte
Suboptimales Ergebnis des Bildes durch Schlierenbildung bei der Substratzugabe bei der Testung
des Waschpuffers PigType Blau LDL. Weitere Erklärungen siehe Legende Abb. 14.
61
Ergebnisse
Abbildung 17:
PigScreen LDL (Qiagen Leipzig GmbH, Leipzig,
Deutschland) als Verdünnungspuffer für Fleischsaft, wegen
Auftretens von unspezifischen Bindungen ungeeignet
Suboptimales Ergebnis des Bildes durch unspezifische Bindungsreaktionen an den Spots durch
Verwendung von PigScreen LDL als Verdünnungspuffer. Weitere Erklärungen siehe Legende Abb.14.
Tabelle 6:
Validierter Testablauf
Schritt
Reagenz
Waschen
P1
Blocken
FCS
Probe
Fleischsaft
Verdünnung
Volumen
Temp.
Schütteln
Zeit
350µl
37°
350rpm
3x2min
10%
100µl
37°
350rpm
15min
3min/4000rpm
100µl
37°
350rpm
30min
350µl
37°
350rpm
3x2min
100µl
37°
350rpm
15min
500µl
37°
100µl
37°
zentrifugiert
1:2 mit PigType
blau
Waschen
PigType blau
Konjugat1
Anti-Pig IgG-
1:20000
Biotin
Waschen
P1
Konjugat2
C3 (Streptavidin-
1:100
1x0min
350rpm
15min
HRP)
Waschen
P1
350µl
1x2min
1x0min
Substrat
SeramunGrün
100µl
62
23°
10min
Ergebnisse
4.2 Ergebnisse der Vergleichsuntersuchung ELISA vs. Microarray
nach Erregern
Nachdem der Testablauf festgelegt worden war, konnten die Microarrays, genauer
die einzelnen Spots in einer Serienuntersuchung auf ihre Eignung als Testsystem
untersucht werden. Dabei wurde die Reaktion, also die Schwärzung des jeweiligen
Spots, mit dem Ergebnis der ELISA-Untersuchung der gleichen Probe ausgewertet.
Im Folgenden sollen die erlangten Erkenntnisse und Ergebnisse Erreger für Erreger
abgehandelt werden. Dabei wird auf die getesteten Antigene, deren Konzentration
und Veränderung eingegangen. Die Größe des Probenumfangs der ausgewertet
wurde, variierte geringfügig, da sich nicht auf jedem der produzierten Arraylayouts (s.
Anhang) die gleichen Spots befanden. Insgesamt wurden 260 Microarray-Chips für
diesen Arbeitsschritt verwendet.
4.2.1 Lebensmittelsicherheitsrelevante Erreger
4.2.1.1
Salmonella spp.
Für die Untersuchung der Proben auf Salmonellen-Antikörper wurden vier
verschiedene Serotypen sowie ein Mix-Spot aus diesen vier auf dem Array
untersucht.
Es wurden gleichzeitig Ergebnisse für die Salmonellenstämme Salmonella
Typhimurium, Salmonella Cholerasuis, Salmonella Enteritidis und Salmonella Agona
produziert.
Der verwendete ELISA zur Salmonellen-Ak-Diagnostik „SALMOTYPE®Pig Screen”
der Fa. Qiagen Leipzig GmbH (Leipzig, Deutschland) erfasst eine Untersuchung auf
Antikörper gegen Salmonella Typhimurium und Salmonella Cholerasuis mit den OAntigenen 1,4,5,6,7, und 12. Damit beinhaltet er eine Mischung aus mehreren
Salmonella-Serotypen. Es wird also Serotyp übergreifend auf ein Vorkommen von
63
Ergebnisse
Antikörpern gegen Salmonellen untersucht. Nähere Informationen zu den Antigenen
wurden vom Hersteller aus schutzrechtlichen Gründen nicht angegeben.
Um diese Ergebnisse mit denen des ELISAs zu vergleichen, wurde ein Mix aus den
erwähnten Serotypen gespottet; zur Ermittlung einer geeigneten Konzentration
wurden hier ebenfalls zwei verschiedene Konzentrationen (0,1mg/ml und 0,25mg/ml)
auf den Microarray aufgebracht.
Im Folgenden werden die Ergebnisse des Vergleichs zwischen ELISA und
„Salm_Mix“-Spot ausgewertet. Exemplarisch auch für die weiteren Erreger sind in
Tabelle 7 die ermittelten Daten der ersten 20 Proben abgebildet.
64
Ergebnisse
Tabelle 7:
Auszug aus der Ergebnisübersicht für die Untersuchung von 20
Proben auf Salmonellenantikörper
SALMOTYPE®
Microarray
Microarray
Pig Screen
Bewertung
Salm_Mix_01
Salm_Mix_025
Probe
(OD%)
ELISA
(Schwärzungsgrad)
(Schwärzungsgrad)
1
0,11
Negativ
0,0994995
0,049514
2
0
Negativ
0,022930667
0,017163333
3
0
Negativ
0,018030333
0,040571667
4
0
Negativ
0,047132333
0,076519333
5
0
Negativ
0,031018333
0,016815333
6
28,16
Negativ
0,091885667
0,214168667
7
8,69
Negativ
0,046388
0,226061667
8
0
Negativ
0,015695333
0,048815667
9
0,53
Negativ
0,0312425
0,054633667
10
0
Negativ
0,063915333
0,142241333
11
106,88
Positiv
0,490765333
0,75778
12
74,123
Positiv
0,776565
0,809148667
13
13,313
Negativ
0,467967
0,744356667
14
8,11
Negativ
0,065801667
0,349480333
15
100,3
Positiv
0,807145333
0,818290333
16
51,675
Positiv
0,362810667
0,582969667
17
42,207
Positiv
0,275787333
0,599957
18
4,91
Negativ
0,116439
0,240449333
19
32,03
Negativ
0,160342333
0,539871333
20
25,27
Negativ
0,092229
0,325709
OD%: Optische Dichte; OD% ≥ 40: positives Testergebnis
Laut dem SALMOTYPE® Pig Screen gelten Proben mit einer optischen Dichte
(OD%) von ≥ 40 als positiv, wenn sie nach dem Vorbild der ersten Stufe des
Dänischen und Deutschen Monitoringprogrammes für Salmonellen bewertet werden.
65
Ergebnisse
Tabelle 8:
Beurteilung laut dem SALMOTYPE® Pig Screen ELISA (Qiagen
Leipzig GmbH, Leipzig, Deutschland) von 260 Serum- und
Fleischsaftproben (100 Seren, 160 Fleischsaftproben)
Bewertung Häufigkeit
ELISA
(n)
82%
-
(213)
+
18%
(47)
Gesamt
260
+: Positives Testergebnis
-: Negatives Testergebnis
Bei den untersuchten Proben sind 18% im ELISA als positiv, das heißt mit einem
OD%-Wert von ≥ 40, getestet worden (Tabelle 8). Zur Auswertung werden die
absoluten ELISA-Werte verwendet, da diese in einer vergleichbaren Größenordnung
wie die Microarray-Werte (0-0,8) liegen. Der ELISA-Grenzwert ist also ≥ 0,4.
Betrachtet man die Wertepaare von ELISA und „Salm_Mix“-Spot in einem
Punktdiagramm, so bekommt man einen ersten Eindruck über einen möglichen
Zusammenhang. Die ELISA-Werte sind auf der x-Achse aufgetragen, die
„Salm_Mix“-Spot-Werte auf der y-Achse (Abbildung 18, Abbildung 19).
66
Ergebnisse
0,9
0,8
0,7
Salm_Mix_025
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
ELISA
Abbildung 18:
Punktdiagramm der ELISA-Ergebnisse und der
Salm_Mix_025-Spot-Ergebnisse
In der Waagerechten sind die ELISA-Ergebnisse in OD% gegen die Microarray Ergebnisse des
Salm_Mix_025 - Spots in der Senkrechten aufgetragen. Betrachtet man die Punkte, so lassen sich
gewisse Zusammenhänge zwischen den Testergebnissen erkennen.
67
Ergebnisse
0,9
0,8
0,7
Salm_Mix_01
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
-0,1
ELISA
Abbildung 19:
Punktdiagramm der ELISA-Ergebnisse und der Salm_Mix_01
-Spot-Ergebnisse
Weitere Erläuterungen siehe Abbildung 18
Es ist auf beiden Diagrammen zu erkennen, dass bei niedrigen ELISA-Werten auch
die Arraywerte niedrig sind. Genauso findet man bei hohen ELISA-Werten auch hohe
Arraywerte. Es ist ein sowohl für Salm_Mix_01 als auch für Salm_Mix_025 ein
Zusammenhang zu den ELISA-Werten zu erkennen.
Mit Hilfe der im Methodenteil beschriebenen ROC-Kurvenanalyse wurden die
Microarraydaten im weiteren Vorgehen mit den ermittelten ELISA-Ergebnissen
verglichen und beurteilt.
Über diese Methode wurde auch ein Grenzwert („cut-off“) für den Microarrayspot mit
der jeweiligen Antigenkonzentration ermittelt.
68
Ergebnisse
ROC‐Kurve / Salm_Mix_025 / AUC=0,934
1
0,9
Echt‐positive Rate (Sensitivität)
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
Falsch‐positive Rate (1 ‐ Spezifizität)
Abbildung 20:
ROC-Analyse Salm_Mix_025
In der hier dargestellten ROC-Analyse wurden die Ergebnisse der Testungen für den Salm_Mix_25Spots mit Hilfe des Goldstandards „ELISA“ ausgewertet. Siehe auch Abb. 11.
Bei dem Spot Salm_Mix_025 liegt der errechnete optimale Grenzwert bei einem
Schwärzungsgrad von 0,54. Die „Testqualität“ (AUC) beträgt 93,4%.
Führt man die ROC-Analyse für den Spot Salm_Mix_01 durch, so erhält man
folgendes Ergebnis:
69
Ergebnisse
ROC‐Kurve / Salm_Mix_01 / AUC=0,883
1
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
Falsch‐positiv Rate (1 ‐ Spezifizität)
Abbildung 21:
In der hier dargestellten ROC-Analyse wurden die Ergebnisse der Testungen für den Salm_Mix_01Spots mit Hilfe des Goldstandards „ELISA“ ausgewertet. Siehe auch Abb. 11.
Hier liegt der errechnete Grenzwert bei einem Schwärzungsgrad von 0,09, also
erwartungsgemäß niedriger. Bei der „Testqualität“ gibt es aber nur geringe
Unterschiede (am besten ersichtlich am Verlauf der ROC-Kurve). Die AUC hat hier
einen Wert von 88,3%.
Die Auswertung der Spots nach Bland-Altman führte zu folgendem Ergebnis:
70
Ergebnisse
Bland und Altman Diagramm
Differenz (Salm_Mix_025 - FLS/100)
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
-0,2
-0,4
-0,6
-0,8
Mittelw ert (FLS/100 + Salm _Mix_025)/2
Schiefe
Abbildung 22:
KI Schiefe (95%)
KI (95%)
Bland-Altman Diagramm für Spot Salm_Mix_025
Auf der Waagerechten sind die Mittelwerte aus ELISA- und Microarrayergebnissen aufgetragen. Auf
der Senkrechten befinden sich die Differenzen dieser Werte. Als Bewertungshilfe sind der Mittelwert
der Differenzen, sowie das 95%-Konfidenzintervall (gestrichelte Linie angegeben). Betrachtet man die
Punkteverteilung, so fällt auf, dass bis auf wenige Ausreißer alle Werte innerhalb des
Konfidenzintervalls liegen. Bei Mittelwerten >0,6 fällt auf, dass die zugehörigeren Microarray-Werte
einer Sättigung unterliegen. Bezieht man diese Tatsache in die Bewertung mit ein, lässt sich anhand
der Bland-Altman-Analyse sagen, dass der Test zu zuverlässigen Ergebnissen führt.
Abgesehen von wenigen Ausreißern befinden sich alle errechneten Werte in dem
Konfidenzintervall von 95%. Dabei fällt auf, dass die Werte bis zu einem Mittelwert
von ungefähr 0,6 in ihren Abweichungen recht symmetrisch um die Schiefe von
0,044 verteilt sind. Bei den Mittelwerten > 0,6 wird der Einfluss der frühen Sättigung
der Array-Spots deutlich. Bezieht man diese Tatsache in die Bewertung mit ein, lässt
sich anhand der Bland-Altman-Analyse sagen, dass der Test zu zuverlässigen
Ergebnissen führt.
Bei einem vermuteten linearen Zusammenhang ist die Regressionsanalyse nach
Passing-Bablok sinnvoll. Aus der Auswertung des Spots Salm_Mix_025 ergibt sich
das in Abbildung 23 dargestellte Bild. Auch hier wird das Problem der zu frühen
Sättigung der Spots deutlich. Es ist eine Sättigung erreicht, wobei die ELISA-Werte
71
Ergebnisse
weiter steigen. Das ist auch der Grund dafür, dass hier kein linearer Zusammenhang
ermittelt werden kann.
Betrachtet man hingegen die Auswertung des Spots Salm_Mix_01 (Abbildung 24)
ergibt sich ein linearer Zusammenhang. Hier folgen die Proben mit höherer
Antikörperkonzentration dem linearen Verlauf.
Regression von Salm_Mix_025 durch FLS/100
2,5
Salm_Mix_025
2
1,5
1
0,5
0
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
-0,5
FLS/100
Abbildung 23:
Regressionsanalyse nach Passing-Bablok für Spot
Salm_Mix_025
Bei der Passing-Bablok-Analyse, der Testung auf einen linearen Zusammenhang zwischen
ELISA-Ergebnissen und dem Salm_Mix_25-Spot lässt sich, wie auch in dem Bland-Altman-Diagramm
ab einem ELISA-Wert von ca. 0,6 eine Sättingung des Arrays feststellen. Genauere Informationen zur
Passing-Bablok-Analyse siehe Abb. 13.
72
Ergebnisse
Regression von FLS/100 durch FLSSalm_Mix_01
2
1,5
FLS/100
1
0,5
0
-0,2
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
-0,5
-1
FLSSalm_Mix_01
Abbildung 24:
Salm_Mix_01
Die Passing-Bablok-Analyse der Salm_Mix_01-Werte mit den ELISA-Werten ergibt sich ein linearer
Zusammenhang. Hier folgen die Proben mit höherer Antikörperkonzentration dem linearen Verlauf.
Die
Untersuchung
der
Fleischsäfte
aus
dem
Salmonella
Typhimurium-
Infektionsversuch (BfR) wiesen alle starke Reaktionen an den entsprechenden Spots
auf (Abbildung 25). Die Antikörper konnten mittels Microarray-Test bei allen Proben
nachgewiesen werden.
73
Ergebnisse
Abbildung 25:
Ergebnisbild der Microarrayuntersuchung mit FLS 23 aus
Salmonella Typhimurium-Infektionsversuch (BFR); (S.
Typhimurium-Spots blau eingekreist, Positivkontrollen rot
eingekreist)
Das Ergebnisbild der Microarrayuntersuchung eines Fleischsaftes (FLS 23) aus einem SalmonellaTyphimurium-Infektionsversuch des BFR gibt an den S.typhimurium-Spots Schwarzfärbungen wieder.
Diese sind hier blau eingekreist. Zusätzlich sind die Positivkontrollen rot eingezeichnet. Die
Dreifachspottung ist sehr gut zu erkennen.
Es ist auch eindeutig das dreifache Spotten der spezifischen Antigene zu erkennen.
Auffällig ist, dass auch bei den anderen Salmonellen-Serotypen leichte Reaktionen
zu beobachten sind. Eine gewisse Kreuzreaktivität zwischen den SalmonellenSerovaren scheint daher gegeben zu sein.
74
Ergebnisse
4.2.1.2 Toxoplasma gondii
Auf Antikörper gegen den Erreger der Toxoplasmose ist mit dem ELISA PIGTYPE
Toxoplasma Ab (Qiagen Leipzig GmbH, Leipzig, Deutschland) untersucht worden.
Hier wurden insgesamt nur sehr wenig positive Fleischsaftproben nachgewiesen
(Tabelle 9).
Tabelle 9:
Beurteilung laut PIGTYPE Toxoplasma Ab ELISA (Qiagen Leipzig
GmbH, Leipzig, Deutschland) von 160 Fleischsaftproben
ELISA
(n)
-
96%
(153)
+
4%
(7)
160
Gesamt
Die für die Toxoplasmenuntersuchungen gewählten Antigenkonzentrationen auf dem
Microarray waren 0,1µg/µl und 0,5µg/µl. Diese erwiesen sich nach ersten
Auswertungen als zu hoch (siehe Abbildung 26), da es bereits sehr früh zu einer
Schwärzung und damit Sättigung der Spots kam.
Aus diesem Grund wurde in einer späteren Bespottung die Antigenkonzentration
noch einmal halbiert und eine Konzentration von 0,05µg/µl gespottet.
Das entstandene Punktdiagramm für den Spot Toxo01 (Antigenkonzentration
0,1µg/µl) zeigt deutlich, dass die Verteilung einer Sättigungskurve entspricht.
75
Ergebnisse
1
0,8
Toxo01
0,6
0,4
0,2
0
-0,1
0,4
0,9
1,4
1,9
-0,2
FLS ELISA
Abbildung 26:
Punktdiagramm der ELISA-Ergebnisse und Toxo01-SpotErgebnisse
In der Waagerechten sind die ELISA-Ergebnisse gegen die Microarray Ergebnisse des Toxo_01 –
Spots
in der Senkrechten aufgetragen. Betrachtet man die Punkte, zeigt deutlich, dass die Verteilung einer
Sättigungskurve entspricht.
Der berechnete cut-off-Werte des PIGTYPE Toxoplasma Ab liegt im Bereich von 0,3.
Bereits bei Ergebnissen von Proben mit OD-Werten von 0,15 im ELISA kommt es bei
der Microarrayuntersuchung zu einer Sättigung des Spots mit der geringen
Antigenkonzentration von 0,1µg/µl.
Es ist jedoch zu erkennen, dass die im ELISA als positiv getesteten Proben alle auch
im Microarray positiv getestet wurden. Somit ist der Test für einen Vergleich mit dem
ELISA zu sensitiv eingestellt. Dementsprechend ergibt sich das folgende Ergebnis
der ROC-Analyse.
76
Ergebnisse
ROC‐Kurve / Toxo01 / AUC=0,991
1
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
Abbildung 27:
ROC-Kurve Toxo01
In der hier dargestellten ROC-Analyse wurden die Ergebnisse der Testungen für den Toxo_01-Spot
mit Hilfe des Goldstandards „ELISA“ ausgewertet. Siehe auch Abb. 11.
Bei einem Grenzwert von 0,65 hat der Test eine Sensitivität von 100% und eine
Spezifität von 95,4%.
Die
Bland-Altman-Analyse,
dargestellt
in
Abbildung
28,
bestätigte
den
Zusammenhang der frühen Sättigung der Spots.
Ab einem Mittelwert von ca. 0,1 beginnen die ermittelten Differenzen ins Positive
abzuweichen. Die Array-Werte steigen erst überproportional schnell an.
Ab einem Mittelwert von ca. 0,4 fallen die Differenzen wieder. Die weiter steigenden
ELISA-Werte führen bei konstant hohen Arraywerten schließlich zu einem Abfallen
der Differenzwerte.
77
Ergebnisse
1
Differenz (Toxo01 - FLS ELISA)
0,8
0,6
0,4
0,2
0
-0,2
-0,2
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
-0,4
-0,6
-0,8
-1
-1,2
Mittelw ert (FLS ELISA + Toxo01)/2
Schiefe
Abbildung 28:
KI Schiefe (95%)
KI (95%)
Bland-Altman Diagramm für Toxo01
Die Bland-Altman-Analyse der Toxo01-Werte verglichen mit den ELISA-Werten bestätigt den
Zusammenhang der frühen Sättigung der Spots. In einem Mittelwert-Bereich von ca. 0,1 bis 0,4
steigen die Arraywerte überproportional schnell an. Ab einem Mittelwert von ca. 0,4 fallen die
Differenzen wieder. Da die ELISA-Werte weiter steigen kommt es bei konstant hohen Arraywerten
schließlich zu einem Abfallen der Differenzwerte.
Die Antigenkonzentration von 0,05µg/µl konnte dem Projektplan entsprechend erst
mit Proben aus dem Feld untersucht werden. Obwohl hier keine seropositive Probe
hinsichtlich Toxoplasma vorhanden war, fällt auf, dass erste Schwärzungen des
Spots später auftreten (Abb. 29).
78
Ergebnisse
0,7
0,6
FLSToxo_005
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
0,08
-0,1
FLS ELISA
Abbildung 29:
Punktdiagramm der ELISA-Ergebnisse und Toxoplasma
0,05µg/µl
In dem Punktdiagramm sind die ELISA-Werte gegen die Toxo_005 Werte aufgetragen.
Da alle
Proben im ELISA negative Ergebnisse haben, lässt sich lediglich eine positive Tendenz durch weniger
schnell positiv reagierende Array-Spots als bei höheren Spotkonzentrationen feststellen.
Differenz (FLSToxo_005 - FLS ELISA)
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
-0,05
-0,1
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
-0,2
Mittelw ert (FLS ELISA + FLSToxo_005)/2
Schiefe
Abbildung 30:
KI Schiefe (95%)
KI (95%)
Bland-Altman Diagramm für Toxoplasma 0,05µg/µl
Das Diagramm liefert entsprechend der sehr niedrigen Werte gute Ergebnisse. Siehe auch Abb. 12.
79
Ergebnisse
4.2.1.3 Trichinella spp.
In den ELISA-Untersuchungen waren alle Fleischsaftproben vom Schlachthof negativ
auf Antikörper gegen Trichinella spiralis. Die produzierten Ergebnisse sollen im
Folgenden dargestellt werden.
Zur Untersuchung der Fleischsaftproben auf Trichinellenantikörper wurden für die
Bespottung auf den Microarray zwei Antigene von Trichinella spiralis verwendet. Das
mit „Trichinella-Spot 1“ bezeichnete Antigen war zum Untersuchungszeitpunkt bereits
ca. 20 Monate alt. Es wurde in einer Konzentration von 0,126µg/µl auf den
Microarray gespottet. Das mit „Trichinella-Spot 2“ bezeichnete war vor ca. 4 Monate
hergestellt worden. Die Konzentration des Antigens betrug 0,4µg/µl. Gelagert wurden
die Antigene bei 4-8°C bei der Fa. Alere Technologies (Jena, Deutschland).
Tabelle 10: Bewertung der Ergebnisse nach PIGTYPE Trichinella Ab (Qiagen
Leipzig GmbH, Leipzig, Deutschland) von 108 Fleischsaftproben
und 100 Serumproben
ELISA
(n)
-
96%
(200)
4%
+
(8)
208
Gesamt
Die acht positiven Ergebnisse stammen von Proben aus einem Infektionsversuch
des Bundesinstituts für Risikobewertung (BfR) konnten fünf Fleischsaftproben aus
einem Infektionsversuch erworben werden. Zusätzlich wurden vom BfR drei
Trichinella-positiv getestete Wildschweinfleischsaftproben bereitgestellt.
80
Ergebnisse
Diese insgesamt acht Proben führten in den Microarrayuntersuchungen alle zu
Spotschwärzungen an Trichinella Spot 1 und Trichinella Spot 2 (Tabelle 11).
Tabelle 11: Ergebnisse der untersuchten positiven Fleischsaftproben
Probennummer Fleischsaftprobe
AntikörperMicroarray
Microarray
Titer
1
Schwein
Trichinella
Trichinella
Spot 1
Spot 2
0,34083833
0,79514833
0,25589333
0,80648133
0,41689
0,79990367
0,15630233
0,80169733
0,72938967
0,83620667
1:8
0,52699
0,7973
1:16
0,601578
0,81505467
1:16
0,71218233
0,81896567
(BfR 1:64
Infektionsversuch)
2
Schwein
(BfR >1:128
Infektionsversuch)
3
Schwein
(BfR 1:32
Infektionsversuch)
4
Schwein
(BfR >1:128
Infektionsversuch)
5
Schwein
(BfR 1:64
Infektionsversuch)
6
Feldprobe
Wildschwein
7
Feldprobe
Wildschwein
8
Feldprobe
Wildschwein
Auffallend ist, dass in allen Ergebnissen die Trichinella Spots 2 einen höheren
Schwärzungsgrad haben als die Trichinella Spots 1(Abb. 31).
81
Ergebnisse
Abbildung 31:
Microarraybild einer untersuchten Fleischsaftprobe aus
einem Infektionsversuch mit Trichinella spiralis (BfR)
Ergebnisbild einer Fleischsaftprobe mit Antikörpern gegen Trichinella spirals. Die Spots Trichinella
Spot 1 sind grün umrandet. Trichinella Spot 2 ist gelb umrandet. Durch die Schwärzung der Spots ist
eine eindeutig positive Reaktion erkennbar.
Wertet man die Ergebnisse unter Einbeziehung der Referenzproben mittels einer
ROC-Analyse aus, ergibt sich ein den Werten entsprechend gutes Bild. Der zur
Auswertung verwendete Spot wird im Folgenden als Trichinella_neu bezeichnet, es
handelt sich um Trichinella Spot 2.
82
Ergebnisse
ROC‐Kurve / Trichinella_neu / AUC=1
1
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
Abbildung 32:
ROC-Kurve Trichinella_neu
In der hier dargestellten ROC-Analyse wurden die Ergebnisse der Testungen für den Trichinella_neuSpot mit Hilfe des Goldstandards „ELISA“ ausgewertet. Siehe auch Abb. 11.
Mit einer AUC von 1, sowie einer Sensitivität von 100% und Spezifität von 100%
würde der Grenzwert mit 0,15 dem höchsten Arraywert einer negativen
Fleischsaftprobe entsprechen.
Auf eine weitere statistische Auswertung wird verzichtet.
83
Ergebnisse
4.2.1.4 Yersinia enterocolitica
Die für die Untersuchung auf Yersinia enterocolitica-AK verwendeten Antigene
wurden in Konzentrationen von 0,1µg/µl und 0,3µg/µl gespottet, da zum Zeitpunkt
der Bestellung der Microarrays keine höher konzentrierten Ausgangslösungen
bereitstanden.
Im ELISA-Test „PIGTYPE®Yopscreen“ (Qiagen Leipzig, Leipzig, Deutschland)
wurden Ergebnisse von negativ bis stark positiv gemessen. Insgesamt konnten ca.
30% der untersuchten Proben als positiv bewertet werden (Tabelle 12).
Tabelle 12: Bewertung der Ergebnisse nach PIGTYPE®Yopscreen (Qiagen
Leipzig GmbH. Leipzig, Deutschland) von 100 Fleischsaftproben
und 100 Serumproben
Bewertung
Häufigkeit
ELISA
(n)
-
69,5%
(139)
+
30,5%
(61)
Gesamt
200
Vergleicht man die Ergebnisse der Spots 0,1µg/µl (Yersinia_01) und 0,3µg/µl
(Yersinia_03) in einem Punktdiagramm aufgetragen gegen die ELISA-Ergebnisse
(siehe Abbildungen 33/34), so wird deutlich, dass die geringere Antigenkonzentration
zu nicht befriedigenden Resultaten führt. Die im ELISA positiv getesteten Proben
führen auf dem Microarray an Spot 0,1µg/µl nicht zu den gewünschten
Bindungsreaktionen.
84
Ergebnisse
0,6
0,5
FLSYersinia_01
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
50
100
150
200
-0,1
ELISA FLS
Abbildung 33:
Punktdiagramm ELISA- zu Array-Ergebnissen Yersinia_01
Aufgetragen sind die ELISA-Werte gegen die Microarray-Werte des Spots Yersinia_01. Zu erkennen
ist eine sehr geringe Schwärzung der Arrayspots.
Betrachtet man die Ergebnisse des Spots 0,3µg/µl im Vergleich zu den ELISAErgebnissen, so lassen sich hier Zusammenhänge erkennen. Die gewählte
Antigenkonzentration liefert ein akzeptables Bild.
85
Ergebnisse
0,9
0,8
0,7
Yersinia_03
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
50
100
150
200
-0,1
ELISA FLS
Abbildung 34:
Im Vergleich zu des in Abb. 33 dargestellten Punktdiagrammes ist bei dem hier dargestellten
Zusammenhang
zwischen
ELISA-Werten
und
Yersinia_03-Microarray-Werten
zeigt
einen
Zusammenhang. Weitere Auswertungen in Abb. 35-37.
Die folgenden statischen Auswertungen beziehen sich nur auf den Spot der
Yersinien-Antigenkonzentration von 0,3µg/µl. Eine weitere Auswertung des Spots
Yersinien 0,1µg/µl erscheint wenig sinnvoll.
Die durchgeführte ROC-Analyse ergab das in Abbildung 35 dargestellte Ergebnis.
86
Ergebnisse
ROC‐Kurve / Yersinia_03 / AUC=0,942
1
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
Falsch‐positve Rate (1 ‐ Spezifizität)
Abbildung 35:
ROC-Analyse Yersinia_03
In der hier dargestellten ROC-Analyse wurden die Ergebnisse der Testungen für den Yersinia_03Spot mit Hilfe des Goldstandards „ELISA“ ausgewertet. Siehe auch Abb. 11.
Die AUC für den Spot mit einer Antigenkonzentration von 0,3µg/µl betrug 0,94.
Die Grenzwertoptimierung führte zu einem Grenzwert von 0,34. Die ermittelte
Sensitivität beträgt 90% und die Spezifität 84,2%.
87
Ergebnisse
Differenz (Yersinia_03mal2 - ELISA)
2
1,5
1
0,5
0
-0,2
0,3
0,8
1,3
1,8
-0,5
-1
Mittelw ert (ELISA + Yersinia_03m al2)/2
Schiefe
Abbildung 36:
KI Schiefe (95%)
KI (95%)
Bland-Altman Diagramm für Yersinia_03
Die Bland-Altman-Analyse der Yersinia_03-Werte verglichen mit den ELISA-Werten bestätigt den
Zusammenhang der frühen Sättigung der Spots. Die Arraywerte steigen überproportional schnell an.
Zur besseren Darstellung wurden die Microarray-Werte um den Faktor zwei erweitert. Bei einem
Mittelwert von ca. 0,8 fallen die Differenzen wieder. Da die ELISA-Werte weiter steigen kommt es bei
konstant hohen Arraywerten schließlich zu einem Abfallen der Differenzwerte.
Wertepaare, die zu einem Mittelwert zwischen 0,55 und 0,9 gehören, liegen teilweise
außerhalb des 95%-Konfidenzintervalls der Differenzen. Für Mittelwerte unter 0,55
bzw. über 0,9 befinden sich alle Werte im oben aufgeführten Konfidenzintervall. Hier
wird deutlich, dass gerade im dynamischen Bereich des Testes die schlechteste
Übereinstimmung besteht. Die negativen und eindeutig positiven Proben werden
sehr sicher erkannt.
88
Ergebnisse
Regression von Yersinia_03 durch ELISA
3
2,5
Yersinia_03
2
1,5
1
0,5
0
0
0,5
1
1,5
2
-0,5
-1
ELISA
Abbildung 37:
Passing-Bablok- Analyse für Yersinia_03
Die Passing-Bablok-Analyse (s. Abb. 13) lässt durch sehr früh erreichte Sättigung der Arrayspots
keine ausreichende Aussage über einen linearen Zusammen zu.
Die Darstellung der Regressionsanalyse nach Passing-Bablok zeigt keinen linearen
Zusammenhang.
Wie oben im Punktdiagramm deutlich wird, erreichen die Arraywerte recht früh einen
Sättigungswert. Dieser verhindert einen linearen Zusammenhang der Werte.
Betrachtet man alle hier aufgeführten Aspekte der Auswertung, so kann festgestellt
werden, dass der Microarray zum Nachweis von Yersinia im Fleischsaft geeignet ist.
89
Ergebnisse
4.2.1.5 Hepatitis E-Virus
Das aus dem Institut für Virologie zur Verfügung gestellte Antigen von Hepatitis EVirus lag in einer Höchstkonzentration von 0,16mg/ml vor. Diese Konzentration
wurde gespottet und für die Vergleichsuntersuchung verwendet.
Bei
circa
25%
der
untersuchten
Proben
wurde
im
verwendeten
ELISA
PrioCHECK®HEV Ab porcine der Grenzwert überschritten (Tabelle 13).
Tabelle 13: Bewertung der Ergebnisse nach PrioCHECK®HEV Ab porcine
(Prionics Deutschland GmbH, Wolfratshausen, Deutschland) von
160 Fleischsaftproben und 100 Serumproben
ELISA
(n)
25%
+
(66)
75%
-
(194)
Gesamt
260
90
Ergebnisse
0,9
0,8
0,7
0,6
HEV_0,18µg/µl
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
FLS ELISA
Abbildung 38:
Punktdiagramm ELISA- zu Array-Ergebnissen HEV_0,18µg/µl
Das in Abb. 38 dargestellte Punktdiagramm ELISA- gegen HEV_0,18-Microarray-Werte lässt den
Schluss zu, dass es bereits bei geringen ELISA-Reaktionen zu eindeutigen Spotschwärzungen
kommt.
Hier wird, vergleichbar zu den Erkenntnissen aus den Spotauswertungen für
Toxoplasma, deutlich, dass bereits bei geringen ELISA-Reaktionen deutliche
Schwärzungen an dem Microarrayspot entstehen. Der Microarraytest scheint also
sensitiver zu sein als der ELISA. Für eine bessere Vergleichbarkeit ist auch hier eine
geringere Antigenkonzentration zu wählen.
91
Ergebnisse
In der weiteren Analyse ergab sich folgende ROC-Kurve:
ROC‐Kurve / ARRAY / AUC=0,957
1
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
Abbildung 39:
ROC-Kurve HEV_0,18µg/µl
In der hier dargestellten ROC-Analyse wurden die Ergebnisse der Testungen für den HEV_0,18-Spot
Die AUC von 0,957 spricht für eine sehr gute Testqualität. Die Sensitivität von 97%
und einer Spezifität von 88% hat der Test bei einem ermittelten Grenzwert von 0,59.
Mit Wahl einer geringeren Antigenkonzentration sollte der berechnete Grenzwert
ebenfalls sinken.
Untersucht man die ermittelten Werte der Untersuchungen auf Hepatitis E-Virus
mittels Bland-Altman-Analyse ergibt sich folgendes Bild:
92
Ergebnisse
Abbildung 40:
Bland-Altmann Diagramm für HEV_0,18µg/µl
Das in Abb. 40 dargestellte Diagramm nach Bland-Altman zeigt zunächst schneller steigende
Arraywerte im Vergleich zu den ELISA-Werten. An einem Umkehrpunkt bei einem Mittelwert von ca.
0,5 (nährere Informationen siehe Abb. 12) ist der Microarray gesättigt, der ELISA noch nicht.
Zuerst steigen die Arraywerte stärker an als die ELISA-Werte. Bei einem Mittelwert
((Arraywert + ELISA Wert)/ 2) von ca. 0,5 steigen diese langsamer an bis bei
höheren Antikörper-Konzentration ELISA-Werte deutlich größer sind als die des
Arrays.
Auf Grund der frühen Sättigung der Arrayspots kommt es nicht zu einem linearen
Zusammenhang der Wertepaare. Deshalb wird auf eine lineare Regressionsanalyse
verzichtet.
93
Ergebnisse
4.2.2 Tiergesundheitsrelevante Erreger
4.2.2.1 Influenza A
Für
den
Vergleich
zwischen
Influenza
A-Virus
Antikörpernachweisen
in
Fleischsaftproben ermittelt mit dem Influenza A-Virus Antibody Test Kit (Fa. IDEXX
Laboratories, Westbrook, Maine, USA) wurden auf den Microarray Influenza AAntigen in den Konzentrationen 0,2mg/ml und 0,4 mg/ml aufgebracht.
Insgesamt ergab die ELISA-Untersuchung folgende Verteilung:
Tabelle 14: Bewertung der Ergebnisse nach Influenza A-Virus Antibody Test
Kit (IDEXX Laboratories, Westbrook, USA) von 100
Fleischsaftproben und 100 Serumproben
ELISA
(n)
18%
(36)
-
82%
+
(164)
Gesamt
200
Die aufgebrachten Konzentrationen des Antigens reagierten sehr unterschiedlich auf
die Proben. So waren am Spot 0,2µg/µl (SIV_02) kaum Bindungsreaktionen zu
beobachten, am Spot 0,4µg/µl (SIV_04) verhältnismäßig zu viele. Die in Abbildung
41 und Abbildung 42 dargestellten Punktdiagramme verdeutlichen diesen
Zusammenhang.
94
Ergebnisse
0,7
0,6
0,5
SIV_02
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
-0,1
FLS ELISA
Abbildung 41:
Punktdiagramm ELISA- zu Array-Ergebnissen SIV_02
Die Punkte des in Abb. 41 dargestellten Diagrammes zeigen sehr schwache Bindungsreaktionen
zwischen Microarray und zugehörigem ELISA.
0,9
0,8
0,7
0,6
SIV_04
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
-0,1
FLS ELISA
Abbildung 42:
Hier sind deutlche Reaktionen des Microarras zu sehen. Allerdings ist ein eindeutiger Zusammenhang
zu den ELISA-Ergebnissen fragwürdig
95
Ergebnisse
Die Grenzwertoptimierung über ROC-Kurvenanalyse ergab eine Testsicherheit von
0,731 für die geringere Konzentration bzw. 0,663 für die höhere.
ROC‐Kurve / SIV_02 / AUC=0,731
1
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
Abbildung 43:
ROC-Kurve SIV_02
In der hier dargestellten ROC-Analyse wurden die Ergebnisse der Testungen für den SIV_02-Spot mit
Hilfe des Goldstandards „ELISA“ ausgewertet. Siehe auch Abb. 11.
96
Ergebnisse
ROC‐Kurve / SIV_04 / AUC=0,663
1
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
Abbildung 44:
ROC-Kurve SIV_04
In der hier dargestellten ROC-Analyse wurden die Ergebnisse der Testungen für den SIV_04-Spot mit
Hilfe des Goldstandards „ELISA“ ausgewertet. Siehe auch Abb. 11.
Betrachtet man die ermittelten Grenzwerte, so fällt auf, dass der Grenzwert für die
niedrigere Konzentration an Influenza A-Antigen bei 0,039 liegt, was eindeutig zu
niedrig ist. Der Grenzwert für die höhere Konzentration an Influenza A-Antigen liegt
bei 0,78, was oberhalb des dynamischen Bereiches liegt.
Für eine weitere Optimierung des Grenzwerts müsste die Konzentration des
Influenza A-Antigens zwischen den getesteten liegen. Dieses deckt sich mit den
Eindrücken aus den Punktdiagrammen.
Aus diesem Grund wird auch hier auf eine weitere Auswertung der Ergebnisse
verzichtet.
97
Ergebnisse
4.2.2.2 Mycoplasma hyopneumoniae
Die Untersuchung auf Antikörper gegen Mycoplasma hyopneumoniae wurde mit dem
ELISA IDEXX M. hyo. Ab Test (Fa. IDEXX Laboratories, Westbrook, Maine, USA)
durchgeführt. Es ergab sich folgendes Ergebnisbild im ELISA:
Tabelle 15: Bewertung der Ergebnisse nach Influenza A Virus Antibody Test
ELISA
(n)
18%
(36)
-
82%
+
(164)
Gesamt
200
Dieses Ergebnis entspricht der erwartet hohen Durchseuchung durch Mycoplasma
hyopneumoniae.
Eine Validierung der Ergebnisse des Microarrays, auf welchen zwei Stämme von
Mycoplasma hyopneumoniae separat gespottet wurden, ergab keine erkennbaren
Zusammenhänge, da es in allen Fällen zu unspezifischen Bindungsreaktionen auf
dem Microarray gekommen ist.
Ein Zusammenhang zwischen den ELISA-Werten (Mhyo S/P(1)) und den
Mhyo232_1 –Werten kann nicht festgestellt werden, da alle Mhyo232_1 –Werte
98
Ergebnisse
unabhängig von den Mhyo S/P(1) –Werten zwischen 0,7 und 0,81 liegen (selbst die
beiden „Ausreißer“ liegen bei 0,66 bzw. 0,68).
Auch ein entsprechendes Punktdiagramm mit Mhyo S/P(1) und Mhyo7_1 –Werten
weist nicht auf einen Zusammenhang zwischen diesen Werten hin, da auch hier die
Mhyo7_1-Werte unabhängig von den Mhyo S/P(1)-Werten im Wesentlichen
zwischen 0,7 und 0,8 liegen.
Die Punktdiagramme in Abbildung 45 und Abbildung 46 verdeutlichen die
unspezifischen Bindungsreaktionen der Arrayspots.
0,9
0,8
Mhyo7_1
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
0,5
1
1,5
2
2,5
Mhyo S/P(1)
Abbildung 45:
Punktdiagramm Mhyo7_1 und ELISA (Mhyo S/P (1))
Das Punktdiagramm zwischen Mhyo7_1-Ergebnis des Microarrays verglichen mit dem ELISAErgebnis weist auf unspezifische Bindungen hin.
99
Ergebnisse
0,9
0,8
Mhyo232_1
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
0,5
1
1,5
2
2,5
Mhyo S/P(1)
Abbildung 46:
Punktdiagramm Mhyo232_1 gegen ELISA (Mhyo S/P (1))
Dargestellt ist der Zusammenhang zwischen Mhyo232_1 und ELISA-Test. Es scheint zu
unspezifischen Bindungsreaktionen zu kommen.
Die AUC von 0,53, dargestellt in Abbildung 47, lässt auf einen Zufallsprozess
schließen.
100
Ergebnisse
ROC‐Kurve / Mhyo7_1 / AUC=0,530
1
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
Abbildung 47:
ROC-Kurve Mhyo7_1
In der hier dargestellten ROC-Analyse wurden die Ergebnisse der Testungen für den Mhyo7_1-Spot
Auf eine weitere Untersuchung der Ergebnisse wird auf Grund des unzureichenden
Zusammenhangs zwischen den beiden Testsystemen verzichtet.
4.2.2.3 Actinobacillus pleuropneumoniae
Bei dem für die Vergleichsuntersuchung verwendeten ELISA handelt es sich um den
ID Screen® APP Screening Indirect (Fa. IDvet Innovative Diagnostics, Grabels,
France).
Mit
diesem
Test
können
Antikörper
nachgewiesen werden.
101
gegen
die
Serotypen
1-12
Ergebnisse
Tabelle 16: Bewertung der Ergebnisse nach ID Screen® APP Screening
Indirect (ID Vet, Grabels, Frankreich)
ELISA
(n)
52%
+
(104)
48%
-
(96)
Gesamt
200
Auf dem Microarray wurden einzelne Serotypen gespottet. In Konzentrationen von
0,1µg/µl und 0,5µg/µl wurden zur Testung die Serotypen 2, 7, 8 und 9 aufgetragen.
Um eine einigermaßen gute Vergleichsmöglichkeit mit dem Testsystem ELISA zu
schaffen, wurde jeweils die Summe der gemessenen Spotintensitäten für die
Konzentration
0,1µg/µl
und
0,5µg/µl
und
gebildet
und
zur
Berechnung
herangezogen, im Folgenden als „Summe APP“ bezeichnet:
Beispiel:
Zum Vergleich ermitteltes
ELISA-Ergebnis dieser Probe:
0,55
Spot 0,1µg/µl
Serotyp 2
Serotyp 7
Serotyp 8
Serotyp 9
0,471292
0,046914
0,029829
0,048232
0,59626633
102
Ergebnisse
Diese Summenwerte wurden mit den ELISA-Werten verglichen. In Abbildung 48 sind
die Werte in einem Punktdiagramm gegeneinander aufgetragen.
3
2,5
Summe APP
2
1,5
1
0,5
0
-0,5
0
0,5
1
1,5
2
ELISA
Abbildung 48:
Punktdiagramm Summe APP gegen ELISA
Die hier dargestellten Wertepaare bilden eine relativ große Punktewolke. Eine Aussage über einen
Zusammenhang ist fraglich.
In der ROC-Analyse stellte sich folgendes Bild in Abbildung dar:
103
Ergebnisse
ROC‐Kurve / Summe APP / AUC=0,603
1
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
Abbildung 49:
ROC-Kurve Summe APP
In der hier dargestellten ROC-Analyse wurden die Ergebnisse der Testungen für den Summe APPSpot mit Hilfe des Goldstandards „ELISA“ ausgewertet. Siehe auch Abb. 11.
Mit einer Sensitivität von 45% und einer Spezifität von 83% bei einem optimierten
Grenzwert von 0,78 kann davon ausgegangen werden, dass die Antigene nur
bedingt geeignet sind um APP-Antikörper zu detektieren. Vielmehr scheint es zu
unspezifischen Bindungen zu kommen.
Die
weiterführenden
statistischen
Untersuchungen
interpretationswürdigen Ergebnissen.
104
führten
zu
keinen
Ergebnisse
4.2.2.4 PRRSV
Die Untersuchung der auf PRRSV-Antikörper wurde mit dem Test IDEXX PRRS X3
Ab Test (IDEXX Laboratories, Westbrook, USA) durchgeführt.
Tabelle 17: Bewertung der Ergebnisse nach IDEXX PRRS X3 Ab Test (IDEXX
Laboratories, Westbrook, USA) von 100 Fleischsaftproben und 100
Serumproben
ELISA
(n)
81%
+
(162)
19%
-
(38)
Gesamt
200
Dieser Test arbeitet mit polyvalenten Antigenen von PRRSV. Da es von Interesse ist
auch die Serotypen unterscheiden zu können, wurden auf den Microarray PRRSVEU-Ag und PRRSV-US-Ag aufgetragen.
Wie bei den Salmonellen-Antigene wurde zur Vergleichbarkeit auch hier ein PRRSVMix-Spot
gespottet
mit
gleichen
Anteilen
der
Testsicherheitsberechnung herangezogen werden.
105
Serotypen.
Dieser
soll
zur
Ergebnisse
ROC‐Kurve / PRRSV‐MIX / AUC=0,913
1
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
Abbildung 50:
ROC-Kurve PRRSV-Mix
In der hier dargestellten ROC-Analyse wurden die Ergebnisse der Testungen für den PRRSV-MixSpot mit Hilfe des Goldstandards „ELISA“ ausgewertet. Siehe auch Abb. 11.
Bei einem Grenzwert von 0,36 hat die Microarrayuntersuchung eine Sensitivität von
92,5% und eine Spezifität von 90,5%.
Betrachtet man die gewonnenen Ergebnisse in der Untersuchung nach BlandAltman, so ergibt sich folgender in Abbildung 51 dargestellter Zusammenhang.
106
Ergebnisse
B land und Altm an Diag ram m
2
Differen z (A rrayMix ‐ E L IS A )
1
0
0
0,5
1,5
2
2,5
3
-1
-2
-3
-4
-5
Mitte lw e rt (EL IS A + A rrayMix)/2
S c hiefe
Abbildung 51:
1
K I S c hiefe (95% )
K I (95% )
Bland-Altman Diagramm für PRRSV-MIX
Hier ist das Bland-Altman Diagramm für PRRSV-MIX gegebn den ELISA dargestellt. Auf Grund
verhältnismäßig zu großer ELISA-Werte verzehrt sich das Ergebnis und ist so nicht auszuwerten.
Weitere Maßnahmen zur Ermöglichung der Auswertung siehe folgende Abb.
Hier fällt auf, dass sie Differenzen zwar im 95%-Konfidenzintervall liegen, jedoch der
ELISA-Wert i.A. größer ist als der Array-Wert. Der Maximalwert beim Array-Test ist
0,83, der vom ELISA-Test 4,48.
Da der Messbereich des Microarraytestsystems i.W. zwischen 0 und 0,8 liegt, der
der verschiedenen ELISAs aber variiert, liegt der Mittelwert der Differenzen in der
Regel nicht bei „Null“.
Um diese Situation entsprechend anzupassen, kann man die ELISA-Werte
transformieren. Transformiert man die Elisa-Werte, indem man sie durch den
Quotienten der Maximalwerte dividiert, so erhält man folgendes Diagramm:
107
Ergebnisse
1
Differenz (ArrayMix - Elisa/5,4)
0,8
0,6
0,4
0,2
0
-0,2
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
-0,4
-0,6
-0,8
Mittelw ert (Elisa/5,4 + ArrayMix)/2
Schiefe
Abbildung 52:
KI Schiefe (95%)
KI (95%)
Bland-Altman Diagramm mit angepassten Werten
Die ELISA-Werte wurden transformiert (in einen Wertebereich zwischen 0 und 1 gebracht). Dadurch
ergibt sich ein erkennbarer Zusammenhang der Werte (siehe auch Abb. 12).
Hier wird deutlich, dass es für eine Beurteilung eines Testergebnisses günstig ist,
wenn die Wertebereiche beider Messungen übereinstimmen.
Man würde in diesem Fall die Hypothese, dass die Differenz zwischen den
Mittelwerten Null ist, auf einem Signifikanzniveau von α = 0,05 beibehalten. Die
Array-Werte erfassen also den Sachverhalt.
Die Analyse nach Passing-Bablok (Abbildung 53) führt zu dem Ergebnis, dass der
Zusammenhang zwischen ELISA- und Array-Werten nicht problemlos linear ist. Hier
spielt die Sättigung des Microarrays bei ca. 0,8 eine Rolle. Des Weiteren streuen die
Werte zu sehr um einer Linearität zu genügen.
108
Ergebnisse
Regression von ArrayMix durch ELISA
7
6
5
ArrayMix
4
3
2
1
0
0
1
2
3
4
5
6
-1
ELISA
Abbildung 53:
Passing Bablok für den Spot PRRSV-MIX
Die Darstellung der Passing-Bablok-Analyse zeigt einen nicht eindeutigen linearen Zusammenhang.
Die Sättigung des Microarrays bei ca. halber „ELISA-Sättigung“ führt zu einer Sättigungskurve. Des
Weiteren streuen die Werte zu sehr um einer Linearität zu genügen.
109
Diskussion
5 Diskussion
5.1 Der Arbeitsplan
Bei der Entwicklung und Validierung des neuen Testsystems „Protein-Microarray für
Schweine“ handelte es sich um einen iterativen Prozess.
Nach einer ausführlichen Literaturrecherche wurden entsprechende Testmaterialien
akquiriert. Dazu gehörten neben dem Protein-Microarray selbst auch spezifische
Antigene und Reagenzien zur Durchführung des Testes. Um die Untersuchungen
nach wissenschaftlichem Standard durchführen zu können, war ein geeignetes Labor
mit entsprechender Ausrüstung notwendig. Des Weiteren mussten die zur
Auswertung benötigte Hard- und Software zur Verfügung stehen.
Die Aufstellung eines Testablaufs mit neu hinzugefügten bzw. ausgetauschten
Testreagenzien, der zu optimierten Ergebnissen mit den ausgewählten Reagenzien
führt, war der nächste Schritt des aufgestellten Arbeitsplans.
Als konstant auszuwertende Ergebnisse produziert werden konnten, begann die
nächste Stufe der Validierung: Der Vergleich mit einem etablierten Testsystem.
In diesem Fall wurde auf den routinemäßig häufig eingesetzten ELISA als
Goldstandard zurückgegriffen.
In Fällen in denen der alternative Test sensitiver als der Goldstandard ist, erscheint
dies als verminderte diagnostische Spezifität. Ist der alternative Test spezifischer als
der Goldstandard, erscheint dies als verminderte diagnostische Sensitivität
(CONRATHS 2005). Die Wahl eines Goldstandards muss daher immer auch kritisch
betrachtet werden.
110
Diskussion
5.2 Auswahl der Erreger
Das Ziel der vorliegenden Untersuchung war es, Antikörper verschiedener relevanter
„schweinespezifischer“ sowie zoonotischer Erreger in dem Untersuchungsmedium
Fleischsaft nachzuweisen.
Laut der „scientific opinion“ der EFSA stellen vor allem Salmonellen, Trichinen,
Toxoplasmen, Yersinien eine zoonotische Gefahr dar (EFSA 2011b). Zusätzlich
wurde HEV hinzugenommen, ein Erreger der durch die starke Durchseuchung in der
Schweinepopulation (BÄCHLEIN 2011) mit humanpathogenen Stämmen ein
zoonotisches Potenzial aufweist.
Bei den tiergesundheitlich relevanten Erregern wurde bei der Auswahl auf das
Erregerspektrum der Tiergesundheitsüberwachungssysteme geschaut. Mit Influenza
A Virus handelt es sich um einen weit verbreiteten Erreger, der immer wieder für
Leistungseinbußen auf allen Ebenen der Schweinehaltung verantwortlich ist.
Informationen
über
das
Vorkommen
von
Mycoplasma
hyopneumoniae,
Actinobacillus pleuropneumoniae und PRRSV ist für den Landwirt in Bezug auf
Impfstrategien von großer Bedeutung.
5.3 Akquirierung der Materialien
Besonders wichtig war die Auswahl geeigneter Antigene, die auf den Microarray
gespottet werden sollten. Durch die Unterstützung der Fa. Qiagen Leipzig GmbH
(Leipzig, Deutschland), welche als ELISA-Testentwickler und –anbieter erfahren in
der Verwendung und Auswahl von Antigenen für indirekte Erregernachweise sind,
konnten Antigene der Erreger Salmonella spp., Yersinia enterocolitica, Trichinella
spiralis, Toxoplasma gondii und PRRSV akquiriert werden. Genauere Informationen
über die Antigene wurden aus schutzrechtlichen Gründen von den Testherstellern
nicht weitergegeben. Aus von Frau Dr. Bächlein, Institut für Virologie der Stiftung
Tierärztliche Hochschule, konnte ein durch ihre Arbeitsgruppe entwickeltes,
produziertes und vorgetestetes HEV-Antigen für die Studie gewonnen werden
111
Diskussion
(BÄCHLEIN et al. 2013). Antigene von Mycoplasma-hyopneumoniae-Stämmen
wurden unter Mithilfe von Dr. Spergser (Uni Wien), Antigene verschiedener
Actinobacillus-pleuropneumoniae-Serotypen
Epidemiologie
der
TiHo
Hannover
innerhalb
durch
der
Inaktivierung
Außenstelle
von
für
kultivierten
Referenzstämmen gewonnen werden. Als problematisch erwies sich gerade bei den
selbst akquirierten die Spezifität der Antigene. Hier ergaben sich im Vergleich zu den
„bewährten“ Antigenen vermehrt falsch positive Arrayergebnisse.
Der als Testgefäß verwendete MicroarrayTube wird von der Fa. Alere Technologies
(Jena, Deutschland) serienmäßig hergestellt. Durch Platzierung einer individuell nach
gewünschtem Layout bespotteten Glasplatte der Größe 3 x 3mm können
verschiedene Tests hergestellt werden. Da das System bereits seit Jahren in der
Humanmedizin Verwendung findet, ist der Herstellungsprozess ausgereift. Die
innerhalb einer Charge hergestellten Microarray-Chips waren identisch.
Bei der Akquirierung und Testung der Reagenzien war ein „try-and-error“-Verfahren
unerlässlich. So wurden nach und nach geeignete Waschpuffer, Verdünnungspuffer,
Konjugate etc. für einen letztendlich zufriedenstellend funktionierenden Test
zusammengestellt.
5.4 Entwicklung des Testablaufes
Die Durchführung eines indirekten nicht kompetitiven ELISA-Tests diente als
Grundlage für die Entwicklung eines Testablaufs für die Microarrayuntersuchungen.
Wie schon von EKINS (1989) beschrieben, kann der Ablauf eines „multianalytischen
Immunassays“ ähnlich dem des ELISA-Tests gesehen werden.
Auch in Untersuchungen von HAAS et al. (2001) wurden die Microarray-Versuche
zur Antikörper-Detektion entsprechend dem ELISA-Test mit Probe, Konjugat und
Substrat
durchgeführt.
Insgesamt
wurden
Arbeitsschritt benötigt.
112
60
Microarray-Chips
für
diesen
Diskussion
5.5 Validierung anhand von ELISA-Werten
Die Diskussion zu den Validierungsergebnissen soll Erreger für Erreger erfolgen, da
diese unabhängig voneinander zu betrachten sind.
5.5.1 Salmonella spp.
Die stichprobenartige Untersuchung auf Salmonellen-Antikörper ist gesetzlich
vorgeschrieben und wird routinemäßig in Deutschland durchgeführt. Die dazu
zugelassenen Tests unterscheiden nicht zwischen den einzelnen SalmonellenSerotypen.
Innerhalb der Microarrayuntersuchungen wurde versucht, Antikörper gegen die
Serotypen Salmonella Typhimurium, Salmonella Cholerasuis, Salmonella Enteritidis
und Salmonella Agona einzeln zu detektieren. Bisher ist es noch sehr schwierig
zwischen den einzelnen Serotypen auf Grund sehr vieler Kreuzreaktionen zu
differenzieren. Für fortschreitende Überwachung ist nach DAHL (2012) eine bessere
Unterscheidung der verschiedenen Salmonellenarten erstrebenswert.
Zur Validierung wurde ein „Salmonellen-Mix-Spot“ (Mischung von LPS-Antigenen
von Salmonella Typhimurium, Salmonella Cholerasuis, Salmonella Enteritidis und
Salmonella Agona) zusätzlich hinzugefügt, welcher zu gleichen Teilen aus den oben
genannten Serotypen besteht. Über die genaue Zusammensetzung des zum
Vergleich verwendeten „SALMOTYPE®Pig Screen” der Fa. Qiagen Leipzig GmbH
(Leipzig, Deutschland) ist lediglich nur bekannt, dass es sich um eine Mischung der
Serotypen handelt (ANONYMUS 2013a).
Untersucht wurden die Konzentrationen 0,1µmol/µl und 0,25mol/µl. Dabei ließ sich
schnell erkennen, dass es Zusammenhänge in den Ergebnissen gibt. Die
Untersuchungen mittels ROC-Analyse ergaben für den Salm_Mix_025-Spot einen
erwartungsgemäß
höheren
Grenzwert
als
für
den
Salm_Mix_01-Spot.
Die
Antigenkonzentration sollte optimaler Weise so eingestellt werden, dass der
letztendlich entstehende Grenzwert für eine Positiv-/Negativ-Entscheidung im
113
Diskussion
dynamischen Bereich des Tests liegt. Das heißt, der Grenzwert sollte in einem
Bereich liegen, in dem die Änderung der Antikörperkonzentration eine signifikante
Änderung der Werte und damit des entstehenden Signals bewirkt. Der Spot
Salm_Mix_025 ist demnach vorzuziehen.
Auf Grund der Proben aus dem Infektionsversuch des BfR, in dem Schweine mit S.
Typhimurium infiziert worden sind, war es möglich, auf die Reaktionen des S.Typhimurium-Spots zu schauen. Hier zeigte sich, wie in Abbildung 26 dargestellt,
dass sich in gewissem Umfang eine serotypspezifische Bindung darstellen lässt.
5.5.2 Toxoplasma gondii
Betrachtet man die Microarrayergebnisse, so fällt auf, dass sehr sensitiv getestet
wird. Proben, welche im ELISA reagieren, aber noch nicht als positiv zu bewerten
sind, erzeugen in den Microarrayuntersuchungen bereits eine Sättigung des Spots.
Um das Testsystem besser an die ELISA-Ergebnisse anzupassen, sollte die
Antigenkonzentration weiter verringert werden. Die ersten Eindrücke mit einer
niedrigeren Konzentration, wie in Abbildung 30 erkennbar, sind vielversprechend und
sollten bei einer erneuten Chargenherstellung berücksichtigt werden.
5.5.3 Trichinella spp.
Die Validierung des Tests für Trichinella spiralis lieferte ebenfalls sehr gute
Ergebnisse. Von den untersuchten Proben vom Schlachthof war keine positiv. Diese
Ergebnisse decken sich mit den Ergebnissen der ELISA-Untersuchung. Die vom BfR
zur Verfügung gestellten Proben aus einem Infektionsversuch, sowie fünf vom BfR
als positiv bestätigte Wildschweinproben, führten in den Microarrayuntersuchungen
zu deutlichen Schwärzungen. Es ist eindeutig, dass mittels des Microarraytests
Antikörper gegen Trichinella spiralis detektiert werden können. Durch die starken
114
Diskussion
Schwärzungen, auch bei Proben mit geringen Antikörpertitern, lässt sich sagen, dass
der Test, durchgeführt mit den gewählten Antigenkonzentrationen sehr sensitiv
arbeitet. Auch wenn anhand der geringen
Stichprobe
nicht
abschließend
ausgeschlossen werden kann, dass es zu Kreuzreaktionen z.B. mit Antikörpern
gegen Kryptosporidien kommen kann, zeigen die Ergebnisse der 260 auf Antikörper
gegen Trichinella voruntersuchten negativen Serum – und Fleischsaftproben
keinerlei Schwärzungen. Damit scheint das Risiko einer Kreuzreaktion gering zu
sein.
Derzeit
wird
der
Verdauungsmethode
direkte
Erregernachweis
durchgeführt.
Die
über
Larvendetektion
serologische
mit
Untersuchung
der
bietet
nachweislich eine höhere Sensitivität als der direkte Nachweis (GROSS et al. 2012).
Der Microarray liefert diesen höheren Sensitivitätsstandard ebenfalls.
5.5.4 Yersinia enterocolitica
Die Untersuchungen für die Yersinien zeigen deutlich, wie entscheidend die Wahl
einer geeigneten Antigenkonzentration für die Spots ist. Bei einer Konzentration von
0,1µmol/µl entstehen kaum Bindungen. Die dreifache Konzentration des Antigens
liefert Ergebnisse, die mit einer Testsicherheit von über 90% sehr nah an die
Goldstandard-Werte des ELISAs herankommen. Die Möglichkeit einer Kreuzreaktion
mit
Antikörpern
gegen
andere
Erreger
erscheint
auf
Grund
der
hohen
Testübereinstimmung zwischen dem zugelassenen ELISA und dem Microarray
gering.
Wie von der EFSA im Jahr 2011 beschrieben, bietet die multiserologische
Untersuchung ein adäquates Mittel auch die Yersinien in ein Monitoring
einzubeziehen.
Der direkte Erregernachweis aus Tonsillengewebe stellt dagegen ein wenig
sensitives Mittel dar. Hier wäre eine molekularbiologische Absicherung notwendig
(FREDERIKSSON-AHOMAA u. KORKEALA 2003). Da sich der Erreger auch bei
kalten Temperaturen vermehrt (BERCOVIER u. MOLLARET 1984), ist die
115
Diskussion
Überwachung dieser Zoonose wichtig und kann z.B. bei der Weiterverarbeitung des
Schlachttieres zu Roh- oder Kochwurst eine Rolle spielen.
5.5.5 Hepatitis E-Virus
In den letzten Jahren ist die Übertragung des Hepatitis E-Virus durch den Verzehr
von rohen Schlachtprodukten immer mehr in den Fokus gerückt.
Die Validierung mit Hilfe eines spezifischen Antigens (BÄCHLEIN et al. 2013) für die
Detektion von Hepatitis E-Antikörper in Fleischsaft ergab eine Testsicherheit des
Microarraytest von über 90 %. Damit ist es möglich auch für die Zoonose Hepatitis E
in der multiserologischen Untersuchung Antikörper aus Fleischsaft zu detektieren.
Die in der Studie ermittelten Ergebnisse zeigen, dass der Microarray eine zu frühe
Sättigung der Spots liefert (Abbildung 39). Entsprechend hoch ist die Sensitivität mit
üner 95 %. Ist eine sehr hohe Sensitivität gewünscht, kann die aufgebrachte
Antigenkonzentration beibehalten werden. Bei der Bewertung des Tests sollten die
Einflüsse der Sensitivität und Spezifität des Goldstandard in Bezug auf die
diagnostische Qualität (CONRATHS 2005) nicht außer Acht gelassen werden. Um
den Arraytest besser an den ELISA anzugleichen, müsste die Antigenkonzentration
nach unten korrigiert werden.
5.5.6 Influenza A
Die beim Schwein häufig zu findenden Influenza A-Subtypen H1N1, H1N2 und H3N2
bzw. deren entsprechende Antikörper wurden innerhalb der Studie mit einem ELISATest untersucht, welcher subtypenübergreifend auf Antikörper gegen Influenza AVirus testet.
Entsprechend dieses Testes wurden auf dem Microarray Influenza A-Antigenspots
getestet.
Die Ergebnisse, in Kapitel 4.2.1.1 ausgeführt, weisen darauf hin, dass in einem Fall
eine zu niedrige, in dem anderen eine zu hohe Konzentration an Antigen aufgebracht
116
Diskussion
wurde. Die Testsicherheit von unter 75 % ließe sich durch die Wahl einer mittleren
Konzentration sehr wahrscheinlich verbessern.
Die bestehende Dynamik in der Veränderung der Oberflächenantigene von Influenza
A-Viren (BHATT et al. 2013) sollte bei der Beurteilung der Ergebnisse mit
einbezogen werden. Daher ist es entscheidend für eine korrekte Detektion von
Influenza A oder sogar der einzelnen Subtypen geeignete Antigene benutzen zu
können.
5.5.7 Mycoplasma hyopneumoniae
Für die Untersuchung auf Antikörper gegen Mycoplasma hyopneumoniae wurden
zwei Stämme für die Arrayvalidierung verwendet. Leider muss es in beiden Fällen zu
unspezifischen Bindungsreaktionen auf dem Chip gekommen sein. Dies ist dadurch
begründet, dass es in nahezu allen Fällen zu Schwärzungen der entsprechenden
Spots kam. Daraus resultierend ist die unbefriedigende Testsicherheit von ca. 50 %
gegenüber dem zugelassenen ELISA-Test.
Es müssen andere, spezifischere Antigene von Mycoplasma hyopneumoniae
gespottet werden, als die hier verwendeten nativen Antigene, um bessere
Ergebnisse zu erhalten.
5.5.8 Actinobacillus pleuropneumoniae
Innerhalb
der
Studie
wurde
das
Vorhandensein
von
Actinobacillus-
pleuropneumoniae-Antikörper in Fleischsaft- und Serumproben getestet. Der
verwendete ELISA basierte auf LPS-Antigenen, also auf Antigenen, welche nicht
serotypspezifisch auf allen APP- Stämmen nachzuweisen sind.
Bei den Untersuchungen waren ca. 50 % der Proben positiv (Tabelle 16). Die
Arrayergebnisse
waren
im
Vergleich
mit
den
ELISA-Ergebnissen
nicht
zufriedenstellend. Es ergab sich lediglich eine Testsicherheit von 60% (Abbildung
117
Diskussion
49). Dabei wurden vier Serotypen, welche in Deutschland häufig vorkommen
(STRUTZBERG-MINDER 2008), aufsummiert und so mit dem ELISA verglichen.
Die Tatsache, dass es deutlich mehr positive Proben im Microarray gab, lässt auch
für
Actinobacillus
pleuropneumoniae
auf
unspezifische
Bindungsreaktionen
schließen. Hier müssen besser geeignete Antigene ausgetestet werden.
5.5.9 PRRSV
Bei der Untersuchung der Proben auf PRRSV-Antikörper wurden im ELISA ca. 80%
der Proben positiv getestet (Tabelle 17).
Bei der Validierung des Microarray ergab sich eine Testsicherheit von knapp über
90 % (Abbildung 50). Der PRRSV-Mix-Spot beschreibt den in den ELISAUntersuchungen festgestellten Sachverhalt besser als die einzeln aufgebrachten EUund US-Typen des PRRSV-Virus. Zum Zeitpunkt der Studie waren zwei ELISA-Tests
der Fa. Analytik Jena AG. Die beiden neuen ELISAs ermöglichen zusätzlich die
Differenzierung zwischen PRRSV-Typ I (Europa-Typ) und Typ II (Nordamerika-Typ).
5.6 Grenzen und Erweiterungsmöglichkeiten
Eine
Herausforderung
war
es,
für
mehrere
Erreger
eine
einheitliche
Testdurchführung zu erarbeiten.
Bei einer Erweiterung des Testes um zusätzliche Erreger müssten diese an dem
bestehenden, für sechs Erreger funktionierenden Testablauf angepasst werden.
Aufgrund der aktuellen Bemühungen von der Fa. Qiagen Leipzig GmbH (Leipzig,
Deutschland) die Testsubstanzen der von ihnen vertriebenen ELISA-Testsysteme zu
vereinheitlichen, waren einige der verwendeten Antigene weitgehend auf einen
gleichbleibenden Ablauf abgestimmt.
Da mit einem Konjugat gearbeitet wird, welches an Immunoglobulin G bindet, können
auch lediglich diese Antikörper (IgG) nachgewiesen werden.
118
Diskussion
Der Nachweis eines akuten Krankheitsgeschehens ist auf diese Weise nicht möglich
(TIZARD 1992). Im Durchschnitt dauert es drei Wochen bis ein nachweisbar hoher
Titer an Antikörpern des Typs Immunoglobulin G vorhanden ist (Kapitel 2.3 und
Kapitel 2.7).
Für
die
Validierung
des
Microarrays
wurden
innerhalb
der
verwendeten
Microarraychargen zwischen 27 und 44 verschiedene Spots dreifach auf die
Mircoarrayplatte gespottet, darunter auch Positiv- und Negativkontrollen. Damit
befanden sich im Maximum 132 Spots auf einem Microarray.
Innerhalb der Studie wurden verschiedene Antigenkonzentrationen desselben
Antigens gespottet, um eine Konzentration zu ermitteln, welche Ergebnisse liefert,
die den Ergebnissen des ELISA-Tests am ähnlichsten sind.
Davon ausgehend, dass bei dem ausgereiften Test für jeden der gewünschten
Erreger nur eine Konzentration in dreifacher Ausführung aufgebracht wird, würden
sich für mehr als 40 verschiedene Erreger Antikörpertests simultan durchführen
lassen.
5.7 Nutzbarkeit von serologischen Profilen
Insgesamt
wurden
Antikörperdetektion
Referenztestsystem
in
des
diesem
Projektabschnitt
entwickelten
ELISA
Microarrays
untersucht.
die
mit
Es
Vergleichbarkeit
dem
der
ausgewählten
wurden
fünf
lebensmittelsicherheitsrelevante Zoonoseerreger serologisch untersucht. Bei den
tiergesundheitsrelevanten Erregern wurden vier Erreger auf die jeweiligen Antikörper
getestet.
Insgesamt wurden dabei bei sechs von diesen Erregern Testsicherheiten von über
90% ermittelt. Für einen weiteren ergab sich eine Testsicherheit von 73%. Für zwei
Erreger mit einer Testsicherheit von 60% bzw. 53% sollte weiterhin an dem Antigen
bzw. dessen Konzentration auf Grundlage der hier festgestellten Ergebnisse
gearbeitet werden.
119
Diskussion
Ein großer Vorteil der validierten Microarraytechnologie für die Untersuchung von
Fleischsaftproben ist der geringe Umfang des Probenmaterials. Für die bisherige
Untersuchung mit mehreren ELISA Tests wurden mehrere Milliliter Fleischsaft
benötigt (TANGEMANN 2012). Das ist für den Einsatz in der Praxis recht aufwendig,
da die mit dem Fleischsafttrichter gewonnenen Probenmengen zu gering sind. Für
die Microarrayuntersuchung reicht eine Probenmenge von ca. 100µl aus. Der
Aufwand der Probengewinnung ist vergleichbar mit dem des bereits routinemäßig
durchgeführten für Untersuchungen auf Salmonellen-Antikörper nach der „SchweineSalmonellen-Verordnung“ und damit voll praxistauglich. Ein weiterer Vorteil dieses
miniaturisierten Testsystems ist, dass man auch nur sehr geringe Mengen an
Antigenmaterial im Gegensatz zum ELISA-Testsystem benötigt.
Zusätzlich hat man mit dem Microarraytest die Möglichkeit, simultan Tests auf das
Vorhandensein von verschiedenen Antikörpern durchzuführen (EKINS 1989).
Der Zeitaufwand beläuft sich bei dem entwickelten Testablauf (s. Tabelle 6) auf
weniger als zwei Stunden. Damit ist er vergleichbar zu dem eines ELISA-Tests.
Für die innerhalb der Studie durchgeführten Untersuchungen wurden von der Fa.
Alere Technologies (Jena, Deutschland) einzelne ArrayTubes hergestellt (s.
Abbildung 8). Für die Entwicklung waren diese Einzeluntersuchungen nützlich. Für
einen Einsatz bei Massenuntersuchungen bietet sich die Verwendung von 96-wellPlatten an. Auf jedem Boden der 96 Vertiefungen der Platte, wäre dann ein
Microarraychip platziert. So würden sich die Untersuchungen analog der ELISAUntersuchungen auch automatisierbar durchführen lassen.
Das
durchgeführte
Antikörperstatus
Projekt
von
bietet
mehreren
die
Möglichkeit
Krankheiten.
der
Viele
Überprüfung
der
in
des
den
Tiergesundheitsüberwachungsprogrammen zu untersuchenden Krankheiten wurden
innerhalb der Studie aufgegriffen. So kann das Monitoring und das damit mögliche
herdenspezifische Überwachen zur Tiergesundheits- und Tierwohloptimierung
beitragen (MEEMKEN et al. 2014). Eine Übersicht über relevante Krankheiten im
Bestand, hierbei werden auch subklinisch verlaufende Erkrankungen berücksichtigt
(MEEMKEN et al. 2011a), liefert dem Landwirt wichtige Herdeninformationen.
120
Diskussion
Damit würden für den Landwirt, bei gesünderen Tieren die Produktionskosten sinken,
die Wettbewerbsfähigkeit wird verbessert und das Tierwohl erhöht (BRINKMANN
2012).
Für den bestandsbetreuenden Tierarzt bieten momentan die Ergebnisse aus dem
Salmonellenmonitoring,
sowie
Tiergesundheitsprogrammen
die
die
Informationen
Möglichkeit
den
aus
Landwirt
den
jeweiligen
bezüglich
seines
Managements zu unterstützen. So kann der betreuende Tierarzt, je nach
Kategorisierung Interventionsmaßnahmen und Behandlungen durchführen und so
mittels gelieferter Informationen die Tiergesundheit verbessern.
Durch
die
serologische
Untersuchung
aus
Fleischsaftproben
könnte
die
Blutprobengewinnung im Bestand teilweise ersetzt werden.
Auch
der
Einsatz
von
Antibiotika
kann
durch
Transparenz
in
dem
Herdengesundheitsstatus verbessert werden (ANONYMUS 2013b).
Die im „Hygienepaket“ der EU vorgeschriebenen Anforderungen beschreiben unter
anderem
die
Notwendigkeit
für
serologische
und/oder
mikrobiologische
Untersuchungen von Mastschweinen zur Verbesserung der Lebensmittelsicherheit.
Da
bisher
innerhalb
des
Schlachtbetriebes
lediglich
Trichinen-
und
Salmonellenproben zur Untersuchung entnommen werden, wäre es leicht durch
Anwendung eines multiserologischen Testsystems das Untersuchungsspektrum zu
erweitern. So schlägt die EFSA im Jahr 2011 vor, wichtige Zoonosen (s.o.) in ein
Monitoring aufzunehmen.
Betrachtet man die Herausforderungen des Veterinäramtes lässt sich sagen, dass
über die Fülle an Informationen, die mit dem Testsystem Microarray zu gewinnen
sind, leicht ein Überblick über die aktuellen krankheitsspezifische Entwicklungen in
Beständen zu gewinnen ist. So kann die Planung von Eradikationsmaßnahmen, die
Bewertung der Biosecurity, die Planung der Frequenz von Kontrollen an eine
Risikoeinschätzung anhand eines fortlaufenden multiserologischen Monitorings
erfolgen.
121
Diskussion
Auch
ein
Einbeziehen
von
Untersuchungen
auf
Antikörpernachweise
von
Tierseuchenerregern ist denkbar und wäre für ein Monitoring zur Seuchenprophylaxe
sinnvoll.
Im Rahmen der Risikobewertung innerhalb der visuellen oder gezielt erweiterten
Fleischuntersuchung sind Lebensmittelketteninformation sehr wichtig (festgelegt in
VO (EG) Nr. 853/2004, Angaben über den Tierbestand im Rahmen der
risikoorientierten Schlachttier- und Fleischtieruntersuchung).
Informationen zur Gefahrenerkennung sind nötig (ELLERBROEK 2011). Diese
müssen innerhalb einer Datenbank gesammelt und für jede an der Lebensmittelkette
beteiligte Person im Rahmen einer Befugnis einsehbar sein.
Anhand der gesammelten Informationen lassen sich, vergleichbar mit den
Salmonellenkategorisierungen, Risikoprofile für die Bestände erstellen. Diese können
dann als Entscheidungsgrundlage dienen, für welche Art der Weiterverarbeitung wie
z.B. die Rohwurstherstellung die Schlachttiere am besten zu verarbeiten sind. So
lässt sich auch auf dieser Ebene die Lebensmittelsicherheit erhöhen.
122
Zusammenfassung
6 Zusammenfassung
Sebastian Hahne
Entwicklung und Validierung eines Protein-Microarrays zur simultanen
serologischen Untersuchung von Fleischsaftproben auf Erreger von Zoonosen
und Produktionskrankheiten beim Schwein
Ziel der vorliegenden Studie war es, ein Testsystem zu entwickeln, mit dem simultan
serologische Untersuchungen sowohl gegen verschiedene schweinespezifische als
auch Zoonoseerreger in Blutserum und Fleischsaft durchgeführt werden können.
Im Hinblick auf Lebensmittelsicherheit und öffentliche Gesundheit schreibt die VO
(EG) Nr. 853/2004 ein Monitoring von Zoonosen vor. Außer verschiedener
Salmonellenmonitoringprogamme einiger Länder gibt es derzeit kein serologisches
Monitoring auf Bestandsebene für andere schweinespezifische Erreger.
Das Konzept dieser Studie war es, die Untersuchung der Proben aus dem
Salmonellenmonitoring auf andere Zoonosen und tiergesundheitsrelevanten Erreger
zu erweitern.
Eine zusätzliche Herausforderung war der Nachweis von Antikörpern aus Fleischsaft
als Untersuchungsmedium.
Die Technologie des Microarrays diente als Grundlage für die Entwicklung.
Rekombinante oder native Antigene folgender Erreger wurden auf den Arraychip
gespottet: Lebensmittelsicherheitsrelevante Erreger: Salmonella spp., Yersinia
enterocolitica, Toxoplasma gondii, Trichinella spp. und Hepatitis E-Virus.
Tiergesundheitsrelevante Erreger: Mycoplasma hyopneumoniae, PRRSV, Influenza
A und Actinobacillus pleuropneumoniae.
123
Zusammenfassung
Nach der Entwicklung und Optimierung eines geeigneten Testablaufs war die Dauer
der Durchführung des Microarraytests vergleichbar mit der eines ELISAs.
Durch den Vergleich von Ergebnissen der Microarrayuntersuchung mit Ergebnissen
des ELISAs wurde das neue Testsystem validiert.
Innerhalb dieses Validierungschrittes wurde ein antigenspezifischer „Cut-off“ für eine
optimale Testsicherheit, Sensitivität und Spezifität mit Hilfe der ROC-Analyse
festgelegt.
Für
die
neun
serologisch
untersuchten
Erreger
wurde
jeweils
die
Antigenkonzentration ermittelt, welche zu den besten Testsicherheiten führte. Die
Untersuchungen der Erreger Salmonella spp., Yersinia enterocolitica, Toxoplasma
gondii, Trichinella spp., Hepatitis E-Virus und PRRSV ergaben jeweils eine
Testsicherheit von über 90% im Vergleich zu dem jeweiligen ELISA-Test. Bei
Auswertung der untersuchten Proben für Actinobacillus pleuropneumoniae ergab
sich eine Testsicherheit von 60%, für Influenza A eine Testsicherheit von 74% und
für Mycoplasma hyopneumoniae von 53%. Hierbei wurde deutlich, dass die Qualität
des Ergebnisses stark von der Wahl geeigneter Antigene abhängt.
Die Ergebnisse machen deutlich, dass Fleischsaft als Probe für den entwickelten
Test geeignet ist. Die Logistik jedes serologischen Salmonellenmonitorings kann
verwendet werden.
Die „Multiserologie“ mit Fleischsaft oder Blutserum könnte ein leistungsfähiges
Diagnostikum zur Verbesserung der Lebensmittelsicherheit und Tiergesundheit
werden.
124
Summary
7 Summary
Sebastian Hahne
Development and validation of a protein-microarray for simultaneous
serological analysis of meat juice samples for zoonotic pathogens and animal
health relevant pathogens for pigs
The objective of this study was to develop a test system for simultaneous serological
analysis of different pig diseases and zoonoses in blood serum and meat juice
samples.
With regard to food safety and public health, the Regulation (EU) No. 853/2004
demands for monitoring programmes for zoonotic diseases. In the EU some
countries developed salmonella monitoring programmes on herd level, but other
porcine pathogens are not serologically monitored, yet.
The concept of this study was to use the meat juice samples from the salmonella
monitoring and to extend the serological analysis to other zoonotic and animal health
relevant pathogens.
The microarray technology was used as the technical basis.
Recombinant or native antigens of the following pathogens were selected and
spotted on serochips: Zoonotic agents: Salmonella spp., Yersinia enterocolitica,
Toxoplasma gondii, Trichinella spp. and Hepatitis E–virus.
Animal health relevant pathogens: Mycoplasma hyopneumoniae, PRRSV, Influenza
A Virus and Actinobacillus pleuropneumoniae.
After development and optimization of a useful test procedure the duration of the
microarray test was comparable to the test duration of the ELISA tests.
125
Summary
The test validation was carried out by comparing the results gained by microarray
testing to the results gained by ELISA system of the same samples.
For achieving optimal test accuracy, test sensitivity and test specificity for each
antigen specific cut-off values were determined by means of the ROC analysis.
For six out of nine pathogens the test accuracy values for the serological detections
was more than 90%. These pathogens were Salmonella spp., Yersinia enterocolitica,
Toxoplasma gondii, Trichinella spp., Hepatitis E-virus and PRRSV. For the
serological detection of Actinobacillus pleuropneumoniae the test accuracy was 60%,
for Influenza A virus 74% and for Mycoplasma hyopneumoniae the test accuracy was
53%.
The quality of results depended on choosing appropriate antigens.
In conclusion, meat juice samples are as suitable as specimen as blood serum
samples. The logistics of any meat juice based salmonella monitoring programme
can be used. Meat juice multi-serology could become a powerful diagnostic tool for
improving animal health and food safety.
126
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Zuletzt geändert durch Art. 1 ÄndVO (EG) 202/2008 vom 4. 3. 2008 (Amtsbl. der EU
L60/17)
VO (EG) Nr. 853/2004
Verordnung (EG) Nr. 853/2004 des Europäischen Parlaments und des Rates mit
spezifischen Hygienevorschriften für Lebensmittel tierischen Ursprungs vom 29. April
2004
Zuletzt geändert durch Art. 1, Art. 2 ÄndVO (EG) 1020/2008 vom 17. 10. 2008
(Amtsbl. der EU L277/8)
VO (EG) Nr. 1244/2007
Verordnung (EG) Nr. 1244/2007 der Kommission zur Änderung der Verordnung (EG)
Nr. 2074/2005 hinsichtlich der Durchführungsmaßnahmen für bestimmte
Erzeugnisse tierischen Ursprungs, die zum menschlichen Verzehr bestimmt sind,
und zur Festlegung spezifischer Bestimmungen über amtliche Kontrollen zur
Fleischuntersuchung vom 24. Oktober 2007
Schweinesalmonellenverordnung
Verordnung zur Verminderung der Salmonellenverbreitung durch Schlachtschweine
(Schweine-Salmonellen-Verordnung) vom 13. März 2007
Bundesgesetzbl. I S. 322 vom 23.03.2007
140
Tabellenverzeichnis
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1:
Liste der im SPF-System zu untersuchenden Erreger (Krankheiten)
(modifiziert nach Danish Agriculture and Food Council 2009b)
Tabelle 2:
An Salmonellose erkrankte Menschen in Deutschland /Jahr
(Statistisches Bundesamt 2011)
Tabelle 3:
Darstellung der verwendeten ELISA-Tests mit Hersteller- und
Zulassungsangaben
Tabelle 4:
Erster
Ablaufplan
zur
Durchführung
von
Microarray-
Untersuchungen
Tabelle 5:
Vierfeldertafel ELISA-Test/ Array-Test
Tabelle 6:
Validierter Testablauf
Tabelle 7:
Auszug aus der Ergebnisübersicht für die Untersuchung von 20
Proben auf Salmonellenantikörper
Tabelle 8:
Beurteilung laut dem SALMOTYPE® Pig Screen ELISA (Qiagen
Leipzig GmbH, Leipzig, Deutschland) von 260 Serum- und
Fleischsaftproben (100 Seren, 160 Fleischsaftproben)
Tabelle 9:
Beurteilung laut PIGTYPE Toxoplasma Ab ELISA (Qiagen Leipzig
GmbH, Leipzig, Deutschland) von 160 Fleischsaftproben
Tabelle 10: Bewertung der Ergebnisse nach PIGTYPE Trichinella Ab (Qiagen
Leipzig GmbH, Leipzig, Deutschland) von 168 Fleischsaftproben
und 100 Serumproben
141
Tabellenverzeichnis
Tabelle 11: Ergebnisse der untersuchten positiven Fleischsaftproben
Tabelle 12: Bewertung der Ergebnisse nach PIGTYPE®Yopscreen (Qiagen
Leipzig GmbH. Leipzig, Deutschland) von 100 Fleischsaftproben
und 100 Serumproben
Tabelle 13: Bewertung der Ergebnisse nach PrioCHECK®HEV Ab porcine
(Prionics Deutschland GmbH, Wolfratshausen, Deutschland) von
160 Fleischsaftproben und 100 Serumproben
Tabelle 14: Bewertung der Ergebnisse nach Influenza A-Virus Antibody Test
Tabelle 15: Bewertung der Ergebnisse nach Influenza A Virus Antibody Test
Tabelle 16: Bewertung der Ergebnisse nach ID Screen® APP Screening
Indirect (ID Vet, Grabels, Frankreich)
Tabelle 17: Bewertung der Ergebnisse nach IDEXX PRRS X3 Ab Test (IDEXX
Laboratories, Westbrook, USA) von 100 Fleischsaftproben und 100
Serumproben
142
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1:
Schematische Darstellung der verschiedenen
Abbildung 2:
Aufbau Antikörper am Beispiel von Immunoglobulin G
(modifiziert nach Koolmann 2003)
Abbildung 3:
Schematischer
Verlauf
der
Antikörpertiter
im
Blut
(modifiziert nach TIZARD 1992)
Abbildung 4:
Immunologische Lücke (modifiziert nach ANONYMUS
2012b)
Abbildung 5:
Prinzip des indirekten ELISA
Abbildung 6:
Übersicht
über
die
prozentualen
Anteile
an
Veröffentlichungen zu Microarrays von 1995 bis 2002
(SCHENA 2003)
Abblidung 7:
HEV-Partikel im Elektronenmikroskop (Center of Disease
Control and Prevention 2006)
Abbildung 8:
ArrayTube (Fa. Alere Technologies GmbH)
Abbildung 9:
ATR03 (Fa. Alere Technologies GmbH)
Abbildung 10:
schematisch dargestellter Testablauf
(Fa. Alere Technologies GmbH)
Abbildung 11:
Beispiel einer ROC-Kurve (modifiziert aus Public Health
Service. Diabetes program guide, 1960)
143
Abbildung 12:
Beispiel eines Bland-Altman-Diagrammes
Abbildung 13:
Beispiel einer Passing-Bablok-Regressionsanalyse nach
Miler et al. (2009)
Abbildung 14:
Ergebnisbild
der
Microarrayuntersuchung
einer
Abbildung 15:
Abbildung 16:
Schlierenbildung durch Waschpuffer PigType Blau LDL
(Qiagen
Leipzig
GmbH,
Leipzig,
Deutschland)
bei
durchgehender Verwendung für alle Waschschritte
Abbildung 17:
PigScreen
LDL
(Qiagen
Leipzig
GmbH,
Leipzig,
Deutschland) als Verdünnungspuffer für Fleischsaft, wegen
Auftretens von unspezifischen Bindungen ungeeignet
Abbildung 18:
Punktdiagramm der ELISA-Ergebnisse und der
Salm_Mix_025-Spot-Ergebnisse
Abbildung 19:
Punktdiagramm der ELISA-Ergebnisse und der Salm_Mix_01
-Spot-Ergebnisse
Abbildung 20:
Abbildung 21:
ROC-Analyse Sam_Mix_01
Abbildung 22:
Bland-Altman Diagramm für Spot Salm_Mix_025
144
Abbildung 23:
Salm_Mix_025
Abbildung 24:
Salm_Mix_01
Abbildung 25:
Ergebnisbild der Microarrayuntersuchung mit FLS 23 aus
Salmonella Typhimurium-Infektionsversuch (BFR); (S.
Typhimurium-Spots blau eingekreist, Positivkontrollen rot
eingekreist)
Abbildung 26:
Punktdiagramm der ELISA-Ergebnisse und Toxo01-SpotErgebnisse
Abbildung 27:
ROC-Kurve Toxo01
Abbildung 28:
Bland Altman Diagramm für Toxo01
Abbildung 29:
Punktdiagramm der ELISA-Ergebnisse und Toxoplasma
0,05µg/µl
Abbildung 30:
Bland-Altman Diagramm für Toxoplasma 0,05µg/µl
Abbildung 31:
Microarraybild einer untersuchten Fleischsaftprobe aus
einem Infektionsversuch mit Trichinella spiralis (BfR)
Abbildung 32:
ROC-Kurve Trichinella_neu
Abbildung 33:
145
Abbildung 34:
Abbildung 35:
ROC-Analyse Yersinia_03
Abbildung 36:
Bland-Altman-Diagramm für Yersinia_03
Abbildung 37:
Passing-Bablok- Analyse für Yersinia_03
Abbildung 38:
Punktdiagramm ELISA- zu Array-Ergebnissen HEV_0,18µg/µl
Abbildung 39:
ROC-Kurve Hepatits E-Virus 0,18 mg/ml
Abbildung 40:
Bland-Altmann-Diagramm für HEV_0,18µg/µl
Abbildung 41:
Abbildung 42:
Abbildung 43:
ROC-Kurve SIV_02
Abbildung 44:
ROC-Kurve SIV_04
Abbildung 45:
Punktdiagramm Mhyo7_1 und ELISA (Mhyo S/P (1))
Abbildung 46:
Punktdiagramm Mhyo232_1 gegen ELISA (Mhyo S/P (1))
Abbildung 47:
ROC-Kurve Mhyo7_1
Abbildung 48:
Punktdiagramm Summe APP gegen ELISA
Abbildung 49:
ROC-Kurve Summe APP
146
Abbildung 50:
ROC-Kurve PRRSV-Mix
Abbildung 51:
Bland-Altman Diagramm für PRRSV-MIX
Abbildung 52:
Bland-Altman-Diagramm mit angepassten Werten
Abbildung 53:
Passing Bablok für den Spot PRRSV-MIX
147
Anhang
Anhang
Layout 1:
Ausgangskonz.
Spot Nr.
Substanz
mg/ml
Spot-konz.
1
0,1
Salm_
1
STM_078K_01
Salm_
2
STM_078K_05
1
0,5
3
Salm_STM_ML04_01 1
0,1
4
Salm_STM_ML04_05 1
0,5
5
Salm_SCS_01
1
0,1
6
Salm_SCS_05
1
0,5
7
Salm_SE_01
1
0,1
8
Salm_SE_05
1
0,5
9
Salm_SA_01
1
0,1
10
Salm_SA_05
1
0,5
11
Yersinia_01
0,27
0,1
12
Yersinia_03
0,27
0,27
13
Toxoplasma_01
0,7
0,1
14
Toxoplasma_05
0,7
0,5
15
Trichinella_01
0,126
0,1
16
MAP_01
1,12
0,1
17
MAP_05
1,12
0,5
18
MAH_01
0,257
0,1
19
MAH_03
0,257
0,257
20
PRRSV-US_01
1,19
0,1
21
PRRSV-US_05
1,19
0,5
22
PRRSV-EU_01
0,69
0,1
23
PRRSV-EU_05
0,69
0,5
148
Anhang
24
SIV_01
0,4
0,1
25
SIV_04
0,4
0,4
26
Spotting Puffer
27
Biotin -Marke_2,5µM
Layout 2:
Ausgangskonz.
Spot-Nr.
Substanz
mg/ml
Spot-konz.
1
Salm_STM_078K_01
1
0,1
2
Salm_STM_ML04_01 1
0,1
3
Salm_SCS_05
1
0,5
4
Salm_SE_05
1
0,5
5
Yersinia_01
0,3
0,1
6
Yersinia_03
0,3
0,3
7
Toxoplasma_01
0,7
0,1
8
Toxoplasma_025
0,7
0,25
9
Toxoplasma_05
0,7
0,5
10
Trichinella_alt
0,4?
SL
11
Trichinella_neu
0,4?
0,4?
12
MAP_025
1,12
0,25
13
MAP_05
1,12
0,5
14
MAH_0257
0,257
0,257
15
PRRSV-US_05
1,19
0,5
16
PRRSV-US_1
1,19
1
17
PRRSV-EU_035
0,69
0,35
18
PRRSV-EU_069
0,69
0,69
19
SIV_02
0,4
0,2
20
SIV_04
0,4
0,4
21
Mhyo7_1
1,9
1
22
Mhyo7Überstand_1
1
1
23
Mhyo7Pellett_1
5
1
24
Mhyo232_1
1,9
1
149
Anhang
25
Mhyo232Überstand_1 1,1
1
26
Mhyo232Pellett_1
4,1
1
27
HEV_018
0,18
0,18
28
App2_05
4
0,5
29
App2 Überstand_05
1,3
0,5
30
App2 Pellett_05
9,9
0,5
31
App7_05
3,6
0,5
32
App7 Überstand_05
1,5
0,5
33
App7 Pellett_05
10,7
0,5
34
App8_05
6,5
0,5
35
App8 Überstand_05
0,4
0,5
36
App8 Pellett_05
11,5
0,5
37
App9_05
5
0,5
38
App9 Überstand_05
1,5
0,5
39
App9 Pellett_05
17,5
0,5
40
Spottingpuffer
1
1
41
Pig IgG_01
1
0,1
42
Pig IgG_05
1
0,5
43
Pig IgG_1
1
1
44
Biotin-Marke_2,5µM
1
1
Layout 3:
Spot-Nr.
Substanz
Spot-konz.
1
Salm_STM_078K_01
1
0,1
2
Salm_STM_078K_05
1
0,5
3
Salm_STM_ML04_01
1
0,1
4
Salm_STM_ML04_05
1
0,5
5
Salm_SCS_05
1
0,5
6
Salm_SE_05
1
0,5
7
Salm_SA_05
1
0,5
8
Salm_Mix_01
1/1/1/1
0,1/0,1/0,1/0,1
150
Anhang
9
Salm_Mix_025
1/1/1/1
0,25/0,25/0,25/0,25
10
Yersinia_01
0,3
0,1
11
Yersinia_03
0,3
0,3
12
Toxoplasma_005
0,7
0,05
13
Toxoplasma_01
0,7
0,1
14
Trichinella_alt
~ 0,4
SL
15
Trichinella_neu
~ 0,4
SL
16
MAP_025
1,12
0,25
17
MAP_05
1,12
0,5
18
MAH_0257
0,257
0,257
19
PRRSV-US_05
1,19
0,5
20
PRRSV-US_1
1,19
1
21
PRRSV-EU_035
0,69
0,35
22
PRRSV-EU_069
0,69
0,69
23
PRRSV-MIX
1,19/0,69
0,47/0,47
24
SIV_02
0,4
0,2
25
SIV_04
0,4
0,4
26
Mhyo7_01
1,9
0,1
27
Mhyo7_02
1,9
0,2
28
Mhyo7_1
1,9
1
29
Mhyo232_01
1,9
0,1
30
Mhyo232_02
1,9
0,2
31
Mhyo232_1
1,9
1
32
HEV_018
0,18
0,18
33
App2_01
4
0,1
34
App2_05
4
0,5
35
App7_01
3,6
0,1
36
App7_05
3,6
0,5
37
App8_01
6,5
0,1
38
App8_05
6,5
0,5
39
App9_01
5
0,1
40
App9_05
5
0,5
41
Spot-Puffer Protein
1
1
42
Pig IgG_01
1
0,1
151
Anhang
43
Biotin-Marke_2,5µM
1
152
1
Danksagung
An dieser Stelle
möchte ich mich ganz herzlich bei Juniorprofessorin Dr. Diana
Meemken für die Überlassung des
hervorragende
wissenschaftliche
interessanten Dissertationsthemas, die
Betreuung
und
freundliche
immer
wieder
motivierende Unterstützung bei der Erstellung der Dissertation.
Labor 3 der Außenstelle für Epidemiologie in Bakum, in Person von Mechthild
Busemann, gilt ein ganz besonderer Dank, da sie mit viel Tatendrang und immer
wieder neuen antreibenden Ideen eine große Unterstützung war.
Vielen Dank an Prof. Dr. Thomas Blaha und allen Mitarbeitern und Kollegen der
Außenstelle für Epidemiologie in Bakum für die fachliche Beratung, Unterstützung
und vor allem die schöne Zeit.
Der Fa. Qiagen Leipzig GmbH (Leipzig, Deutschland) für die gute wissenschaftliche
Zusammenarbeit und der stetigen Hilfsbereitschaft bei Fragen und Problemen.
Ebenso der Fa. Fa. Alere Technologies GmbH, Jena, Deutschland für die sehr gute
individuelle Beratung.
Meiner Freundin Antonia danke ich für die Geduld, die Rücksicht und das
Verständnis vor allem innerhalb der letzten Monate.
Vielen Dank auch meinen Eltern und meiner Familie, die mich immer sehr unterstützt
und einige Launen ausgehalten haben.
153

Entwicklung und Validierung eines Protein

Transcription

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