Prof. Dr. R. Glockshuber, Institut für Molekularbiologie und Biophysik

Prof. Dr. R. Glockshuber, Institut für Molekularbiologie und Biophysik, ETH Hönggerberg,
CH-8093 Zürich
Dieses Skript beinhaltet nur denjenigen Teil der Vorlesung von R. Glockshuber, der im
begleitenden Buch “Fundamentals of Biochemisty” von Voet/Voet/Pratt nicht enthalten
ist. Darüber hinaus sind die Kapitel 1.4., 2., 5., 7-10, 13 und 27.3C des Buchs Stoff der
Vorlesung.
Inhalt
Seite
1.
1.1.
1.2.
1.2.1.
1.2.1.1.
1.2.1.2.
1.2.1.3.
1.2.1.4.
1.2.2.
1.2.3.
1.2.3.1.
Proteinfaltung und Proteinstabilität
Proteinfaltung: Definition und die zentralen Dogmen
Die thermodynamische Stabilität von Proteinen
Wechselwirkungen, die die native Tertiärstruktur von Proteinen stabilisieren
Wasserstoffbrücken
Ionische Wechselwirkungen
van der Waals Wechselwirkungen
Hydrophobe Wechselwirkungen
Die Gesamtstabilität von Proteinen
Experimentelle Bestimmung der Proteinstabilität
Das Zweizustandsmodell der Proteinfaltung: Denaturierungsmittelinduzierte Entfaltungsgleichgewichte und die Bedeutung der Kooperativität
1.2.4. Die Temperaturabhängigkeit der Proteinstabilität
1.3.
Proteinfaltung in vivo und in vitro
1.3.1. Die Konkurrenz zwischen Faltung und Aggregation, Molekulare Chaperone
1.3.2. Wie schnell können sich Proteine falten?
1.3.3. Mögliche langsame Faltungsreaktionen
1.3.3.1. Isomerisierung von X-Pro Peptidbindungen
1.3.3.2. Die Bildung von Disulfidbrücken
2.
2.1.
2.2.
2.3.
Das chemische Bindungsgleichgewicht
Die Bedeutung von Bindungs- und Dissoziationskonstanten
Die Analogie zwischen Bindungsgleichgewichten und Säure-Base
Gleichgewichten
Die pH-Abhängigkeit der Gesamtladung von Proteinen
2
2
3
3
3
5
7
8
8
9
9
13
14
14
16
18
18
19
21
21
23
24
Anhang:
A1:
Spektroskopische Methoden zur Bestimmung der Proteinkonformation
in Lösung: Absorptions-, Fluorszenz- und Circulardichroismus-Spektroskopie
A1.1-A1.3)
26-31
A2:
Physikalische Grössen und ihre Einheiten
33
A3:
Biologische Puffersysteme
34
1. Proteinfaltung und Proteinstabilität
1.1. Proteinfaltung: Definition und die zentralen Dogmen
Unter dem Begriff „Proteinfaltung“ versteht man den Prozess, bei dem eine unstrukturierte
Polypeptidkette (Abkürzung „U“ für „unfolded“) in wässriger Lösung spontan ihre biologisch
aktive, dreidimensionale Struktur (Abkürzung „N“ für „native“) einnimmt. Dieser Prozess
kann in der Zelle während oder nach der Synthese der Polypeptidkette am Ribosom stattfinden.
Entfaltete, unstrukturierte
Polypeptidkette (U)
Natives, biologisch
aktives Protein (N)
Der Faltungsprozess beinhaltet die folgenden, zentralen Dogmen der Biochemie von Proteinen:
-
Die biologisch aktive, dreidimensionale Struktur eines Proteins (der native Zustand des
Proteins) ist einzigartig und ausschliesslich durch seine Aminosäuresequenz und
Kettenlänge (Primärstruktur) festgelegt.
-
Die biologisch aktive, dreidimensionale Struktur eines Proteins ist der thermodynamisch
günstigste Zustand, den eine Polypeptidkette in wässriger Lösung einnehmen kann.
Dies bedeutet, dass wenn man z.B. 1 Million identischer, entfalteter Polypeptidketten in eine
physiologische Pufferlösung gibt, jedes einzelne Polypeptid spontan exakt die selbe dreidimensionale Struktur einnimmt. Trotz dieser Tatsache und der ca. 10000 bis heute
aufgeklärten Proteinstrukturen, die in der Proteinstrukturdatenbank (http://pdbbrowsers.ebi.ac.uk/) abgelegt sind, ist es bisher nicht möglich, aus der Aminosäuresequenz
eines Proteins, das keine Sequenzähnlichkeit mit einem anderen Protein aufweist, dessen
dreidimensionale Struktur und damit evtl. auch seine Funktion vorherzusagen. Dieses
sogenannte „Proteinfaltungsproblem“ ist in der Tat eines der grössten ungelösten Probleme in
der Biochemie und spielt auch eine zentrale Rolle bei der Aufklärung der Funktionen von
Genen, die bei der Sequenzierung von Genomen neu entdeckt werden. Bei neu sequenzierten
Genomen kann heute in der Regel mindestens einem Drittel der Gene keine Funktion zugeordnet werden. Um zumindest eine Vorhersage über die grobe dreidimensionale Struktur
eines Proteins zu machen, muss ein Protein mit unbekannter Funktion mindestens 25%
Sequenzidentität zu einem Protein mit bekannter dreidimensionaler Struktur aufweisen.
2
1.2. Die thermodynamische Stabilität von Proteinen
Unter der thermodynamischen Stabilität eines Proteins versteht man den Unterschied (∆G)
zwischen der Energie des vollkommen entfalteten Zustands (U) des Proteins in Wasser und
der Energie der biologisch aktiven Tertiärstruktur (nativer Zustand N) in Wasser. Nachdem
die Proteinfaltung in wässriger Lösung eine spontan ablaufende Reaktion ist, liegt das
Energieniveau des nativen Zustands tiefer als das des entfalteten Zustands (∆G < 0).
U
Energie
(freie Enthalpie G)
∆G = G(N) - G(U) < 0
N
Wenn man sich die Frage stellt, welche Arten von Wechselwirkungen den nativen Zustand
eines Proteins gegenüber dem entfalteten Zustand stabilisieren, muss man sich überlegen,
warum in Wasser eine bestimmte Wechselwirkung im nativen Zustand günstiger ist als im
entfalteten Zustand. Grundsätzlich gilt auch für die Proteinstabilität das thermodynamische
Gesetz
∆G = ∆H - T ∆S
Für biologische Makromoleküle mit definierter Tertiärstruktur gilt in der Regel:
∆H < 0 (die Proteinfaltung ist exotherm) und
∆S < 0 (insgesamt ist die Proteinfaltung entropisch ungünstig)
Enthalpisch günstige Beiträge durch stabilisierende, intramolekulare Wechselwirkungen und
entropisch ungünstige Beiträge wirken also bei der Bildung der Tertiätstruktur einander
entgegen.
1.2.1. Wechselwirkungen, die die native Tertiärstruktur von Proteinen stabilisieren
1.2.1.1. Wasserstoffbrücken
Wasserstoffbrücken sind ein essentieller Bestandteil der Kräfte, die die Struktur biologischer
Makromoleküle stabilisieren. Wasserstoffbrücken bestehen immer aus einem
Wasserstoffbrückendonor/Akzeptorpaar und sind mit geringfügigen Abweichungen linear.
Die wichtigsten H-Brückendonoren und -akzeptoren in Proteinen sind die Amid(NH)- bzw.
die Carbonyl(C=O)-Gruppen der Hauptkette, die die Wasserstoffbrücken in regulären Sekundärstrukturen ausbilden. Daneben können jedoch auch alle Aminosäureseitenketten, die Stickstoff-, Sauerstoff-, und Schwefelatome enthalten, an H-Brücken beteiligt sein. Die folgende
Tabelle zeigt einige wichtige Beispiele für die Arten von Wasserstoffbrücken in Proteinen
und deren Donor-Akzeptor Abstände.
3
Donor
Akzeptor
–O–H
–O–H
O–
H
O=C
DonorAkzeptorAbstand (Å)
2.8
Kommentar
Abstand = 2.7 Å bei Tyrosin-hydroxygruppe
2.8
N–H
O=C
2.9
N–H
O–
H
2.9
Häufigste Art von H-Brücken. Auch doppelte
(gabelförmige) Verbrückung möglich:
H N
C=O
H N
Häufigkeit
N–H
O
0°
Abweichung von 180°
30°
Wie oben erwähnt sind Wasserstoffbrücken im Idealfall linear (180° Winkel zwischen Donor,
Wasserstoff und Akzeptor). Die Analyse der Wasserstoffbrücken in Proteinstrukturen ergibt
jedoch, dass häufig Abweichungen von dieser idealen Geometrie beobachtet werden. Bei
Abweichungen von über 30° ist die Bezeichnung “Wasserstoffbrücke” nicht mehr
gerechtfertigt.
Es ist relativ schwierig, den Beitrag einzelner Wasserstoffbrücken zur Proteinstabilität
abzuschätzen. Dies liegt einerseits daran, dass auch im entfalteten Zustand Wasserstoffbrückendonoren und -akzeptoren der Proteinkette Wasserstoffbrücken zu Wassermolekülen ausbilden können, so dass insgesamt die Gesamtzahl der Wasserstoffbrücken bei der
Proteinfaltung praktisch gleich bleibt. Auch Abweichungen von der idealen Geometrie erschweren eine Abschätzung des energetichen Beitrags von H-Brücken zur Proteinstabilität.
4
Prinzipiell können bei der Bildung von einzelnen Wasserstoffbrücken Energien von 10-40
kJ/mol frei werden. Um einer bestimmten Wasserstoffbrücke in einem Protein (z.B. eine
Wasserstoffbrücke zwischen 2 Aminosäureseitenketten) einen zuverlässigen Energiebeitrag
zuzuordnen, ist die beste Möglichkeit, eine der Aminosäuren gegen eine ähnlich grosse
Aminosäure, die aber keine Wasserstoffbrücke ausbilden kann, auszutauschen und den
Unterschied zwischen der Faltungsenergie des Wildtyp-Proteins und der Variante des Proteins (∆∆G) zu bestimmen. Als Faustregel gilt ferner, dass geladene Wasserstoffbrücken (z.B.
zwischen der Hydroxygruppe eines Serins und der Carboxylatgruppe eines Aspartats) stärker
sind als ungeladene Wasserstoffbrücken (z.B. zwischen einer Serin- und Asparaginseitenkette).
1.2.1.2. Ionische Wechselwirkungen
Ionische Wechselwirkungen zwischen positiv und negativ geladenen Aminosäueseitenketten,
die aufgrund der Tertiärstrukturbildung in räumliche Nachbarschaft treten, werden häufig in
Proteinstrukturen beobachtet und können einen erheblichen Beitrag zur Gesamtstabilität von
Proteinen liefern. Der Energiebeitrag einer Salzbücke in Proteinen ist gegeben durch die
Formel
z ⋅ z ⋅ε 2
∆E = A B
D⋅r
wobei ε die Elementarladung ist, zA und zB die Ladungen der beteiligten Gruppen (in
Proteinen also immer +1 und –1, weil es nur einfach positiv oder negativ geladene
Seitenkettten gibt), r der Abstand zwischen den Ladungen und D die Dielektrizitätskonstante
des Mediums. Die Dielektrizitätskonstante eines Mediums gibt den Faktor an, um den ein
Medium eine elektrostatische Wechselwirkung zwischen Ladungen schwächt gegenüber der
Wechselwirkung zwischen diesen Ladungen im Vakuum. Die Dielektrizitätskonstante von
Wasser ist sehr hoch und hat einen Wert von 78,3. Dagegen haben unpolare Lösungsmittel
deutlich geringere Dielektrizitätskonstanten. Hieraus folgt unmittelbar, dass elektrostatische
Wechselwirkungen an der Proteinoberfläche einen geringeren stabilisierenden Beitrag liefern
als elektrostatische Wechselwirkungen im Inneren des Proteins, wo die Umgebung hydrophober ist. Die Unsicherheit über die Dielektrizitätskonstante an einem bestimmten Ort in der
Proteinstruktur ist der Hauptgrund dafür, warum es äusserst schwierig ist, den stabilisierenden Energiebeitrag einer Salzbrücke quantitativ richtig zu berechnen. Im Extemfall jedoch
könnte eine einzige elektrostatische Wechselwirkung bis zu 100 kJ/mol zur Proteinstanilität
beitragen.
Die Ausbildung von Salzbrücken hat eine wichtige Konsequenz für die pKa-Werte der
beteiligten Aminosäuren: Wenn eine Salzbrücke die Tertiärstuktur eines Proteins stabilisiert,
folgt unmittelbar, dass auch umgekehrt die Tertiätstruktur des Proteins die Salzbrücke
stabilisert. Bei einer die Tertiärstruktur stabilisierenden Salzbrücke wird es im Vergleich zum
entfalteten Zustand also schwieriger sein, die positiv geladene Seitengruppe durch hohe pHWerte zu deprotonieren oder die negative geladene Seitenkette durch niedrige pH-Werte zu
protonieren, weil durch Verschwinden einer der beiden Ladungen die Salzbrücke zerstört
würde. Dies hat zur Folge, dass sich bei einer Salzbrücke, z.B. zwischen einer Lysin- und
Aspartatseitenkette, der pKa-Wert der sauren Aminosäure erniedrigt und sich gleichzeitig der
pKa-Wert der basischen Aminosäure um den selben Betrag erhöht:
5
∆pKa (saure As.) = - ∆pKa (basiche As.)
r
-
CH-(CH2)4-NH3+
Lys
pKa erhöht sich
O2C-CH2-CH
Asp
pKa erniedrigt sich
Allgemeiner betrachtet kann man daraus die folgenden Vorhersagen über abnormal
verschobene pKa-Werte von Aminosäureseitenketten machen:
-
Saure Reste mit erniedrigten pKa-Werten und basische Reste mit erhöhten pKa-Werten
sind stabilisierend.
Saure Reste mit erhöhten pKa-Werten und basische Reste mit erniedrigten pKa-Werten
sind destabilisierend.
Aus der Grösse der Verschiebung des pKa-Werts lässt sich der stabilisierende oder
destabilisierende Beitrag einer geladenen Seitenkette für die Tertiärstruktur berechnen.
Auch destabilisierende, geladene Aminosäureseitenketten kommen in Proteinen vor. Denken
Sie sich z.B. ein Enzym mit einer hydrophoben Substratbindungstasche, das einen Aspartatrest im aktiven Zentrum für den katalytischen Mechanismus benötigt. Ein negativ geladener Aspartatrest in hydrophober Umgebung ist energetisch ungünstig, folglich wird sein pKaWert erhöht sein.
Neben basischen und sauren Seitenketten tragen auch Helixdipole zu elektrostatischen
Wechselwirkungen in Proteinen bei. Jede α-Helix trägt an ihrem N-terminalen Ende eine
positive Partialladung und an ihrem C-terminalen Ende eine negative Partialladung. Diese
Partialladungen können ihrerseits elektrostatische Wechselwirkungen mit geladenen Seitenketten eingehen. Deshalb sind saure Seitenketten im N-terminalen α-Helixbereich und
basische Reste im C-terminalen α-Helixbereich prinzipiell günstig.
N
δ+
δC
6
CO2-
1.2.1.3. van der Waals Wechselwirkungen (Dispersionskräfte)
van der Waals Wechselwirkungen sind ebenfalls elektrostatischer Natur, jedoch liefern
einzelne Wechselwirkungen wesentlich geringere Stabilisierungsbeiträge als Salzbrücken.
Vielmehr kommt bei van der Waals-Wechselwirkungen vor allem die Summe aller einzelner
Wechselwirkungen zum tragen, die durch die Vielzahl der direkten Kontakte in der dicht
gepackten Tertiärstruktur von Proteinen zwischen Aminosäureseitenketten entstehen.
Grundsätzlich unterscheidet man bei van der Waals Wechselwirkungen die Wechselwirkungen zwischen permanenten Dipolen (Dipol-Dipol-Wechselwirkungen) und induzierten
Dipolen (London’sche Dispersionkräfte). Wechselwirkungen zwischen permanenten Dipolen
sind z.B. solche zwischen räumlich benachbarten Carbonylgruppen. Die Carbonlygruppen
sind permanente Dipole, weil Sauerstoff wesentlich elektronegativer als Kohlenstoff ist und
deshalb stets eine positive Partialladung auf dem Kohlenstoff und eine negative Patialladung
auf dem Sauerstoff liegt:
δ- δ+
δ- δ+
C=O ------ C=O
London'sche Dispersionskräfte sind induzierte Dipole, die durch geringfügige Verschiebung
der die Atomkerne umgebenden Elektronenwolken zustandekommen. Solche induzierten
Dipole kommen v.a. durch Kontakte zwischen hydrophoben Seitenketten im Inneren von
Proteinen zustande, beispielsweise zwischen räumlich benachbarten Methylgruppen.
Wechselwirkungen zwischen permaneten Dipolen (ca. 10 kJ/mol) sind wesentlich stärker als
London’sche Disperionskräfte (ca. 0.3 kJ/mol). Ferner sind van der Waals-Wechselwirkungen stark vom Abstand (d) der beteiligten Atome/Moleküle abhängig und verhalten sich nach
dem sogenannten “6/12 Potential”. Eine zu starke Annäherung zwischen Atomen führt zu
einer Abstossung der positiv geladenen Atomkerne (proportional zu 1/d12), und die günstige
elektrostatische Dipol-Dipol-Wechselwirkung wird mit 1/d6 schwächer. Der van der Waals
Abstand ist der energetisch günstigste Abstand zwischen Atomen.
Energy
EWW ~
A
B
− 6
12
d
d
(A und B sind Konstanten)
van der Waals distance
distance d
7
1.2.1.4. Hydrophobe Wechselwirkungen
Unter dem hydrophoben Effekt versteht man das Phänomen, dass Wasser die spontane
Tendenz hat, möglichst wenige Kontakte mit hydrophoben Molekülen auszubilden. Der
hydrophobe Effekt ist verantwortlich dafür, dass hydrophobe Aminosäureseitenketten in der
Regel im Inneren von Proteinen konzentriert sind und den sogenannten “hydrophoben Kern”
der Tertiärstruktur bilden, während polare und geladene Seitenketten hauptsächlich an der
Proteinoberfläche zu finden sind. Bis heute ist jedoch die genaue physikalische Natur des
hydrophoben Effekts nicht exakt verstanden. Die plausibelste Erklärung ist ein
Entropiegewinn, der durch die bei der Zusammenlagerung hydrophober Seitenketten
freigesetzten Wassermoleküle zustandekommt (vergleiche auch Voet/Voet/Pratt 2.1.). Man
stellt sich dabei vor, dass Wassermoleküle in unmittelbarem Kontakt mit hydrophoben Molekülen weniger Möglichkeiten haben, Wassertoffbrücken zu benachbarten Wassermolekülen
auszubilden als freie Wassermoleküle, und dass Wassermoleküle um hydrophobe Moleküle
herum eine Art Wasserstoffbrückenkäfig bilden. Bei Zusammenlagerung von hydrophoben
Molekülen wird ein Teil der Wassermoleküle dieses Käfigs freigesetzt, und diese freigesetzten Wassermoleküle gewinnen zusätzliche Freiheitsgrade, weil sie nun mehr Möglichkeiten zur Wechselwirkung mit benachbarten Wassermolekülen haben.
Grundsätzlich sind hydrophobe Wechselwirkungen stark von den Bedingungen abhängig, und
zwar wie folgt:
-
Hohe Temperaturen und hohe Ionenstärken verstärken hydrophobe Wechselwirkungen.
-
Niedrige Temperaturen und niedrige Ionenstärken schwächen hydrophobe Wechselwirkungen.
1.2.2. Die Gesamtstabilität von Proteinen
Auch wenn die Proteinfaltung ein spontan ablaufender Prozess ist, ist die Faltungsenergie von
Proteinen typischerweise ein sehr kleiner Betrag, der bei Eindomänenproteinen im Bereich
zwischen –20 und –100 kJ mol-1 liegt. Der Grund hierfür ist, dass alle Wechselwirkungen, die
die Proteinkette stabilisieren (also H-Brücken, ionische Wechselwirkungen, van der WaalsWechselwirkungen und hydrophobe Wechselwirkungen), gerade eben ausreichen, um den
Entropieverlust der Polypeptidkette bei der Faltung auszugleichen. Dies ist am Beispiel der
Faltung des Proteins Lysozym in der folgenden Tabelle gezeigt:
Loss of chain entropy due to folding:
∆G (kcal mol-1)*
+ 167
All interactions stabilizing the folded state:
- 198
Energy of hydration of residues that are
buried in the folded state
+ 17
---------- 14
(* 1 kcal/mol = 4.1 kJ/mol)
Die Faltungsenergie von Proteinen ist also nur eine kleine Differenz grosser Beträge.
8
1.2.3. Experimentelle Bestimmung der Proteinstabilität
1.2.3.1.
Das Zweizustandsmodell der Proteinfaltung: Denaturierungsmittel-induzierte
Entfaltungsgleichgewichte und die Bedeutung von Kooperativität
Das Zweizustandsmodell der Proteinfaltung
Das sogenannte Zweizustandsmodell beschreibt das einfachste überhaupt denkbare Modell
der Proteinfaltung. Es macht folgende Annahmen:
-
Es besteht ein thermodynamisches Gleichgewicht zwischen der entfalteten (U) und der
nativen (N) Polypeptidkette.
Im Gleichgewicht werden keine teilgefalteten Moleküle beobachtet. Das heisst, dass das
Protein bei beliebigen Bedingungen immer als Gemisch völlig gefalteter und völlig entfalteter Moleküle vorliegt:
U
kF
N
kU
Damit lässt sich die Gleichgewichtskonstante K der Proteinfaltung definieren und mit Hilfe
der Gibbs-Gleichung die thermodynamische Stabilität ∆G eines nativen Proteins gegenüber
seinem entfalteten Zustand angeben:
K = [N] / [U] = kF / kU
∆G = – RT ln K
Dabei sind kF und kU die mikroskopischen Geschwindigkeitskonstanten 1. Ordnung von
Faltung und Entfaltung, R die allgemeine Gaskonstante und T die absolute Temperatur in
Kelvin.
Gemäss dem Zweizustandsmodell lässt sich die Faltungsenergie von Proteinen dadurch
ermitteln, dass man die im Gleichgewicht vorhandenen Konzentrationen [N] und [U] bestimmt. Dabei geht man in der Praxis so vor, dass man das zu untersuchende Protein mit
verschiedenen Konzentrationen eines Denaturierungsmittels inkubiert und nach Gleichgewichtseinstellung eine Denaturierungskurve aufnimmt. Dabei wird in der Regel mit Hilfe von
Fluoreszenz- oder Circulardichroismus-Spektroskopie bestimmt (siehe Anhang), zu wieviel
% das Protein bei der jeweiligen Denaturierungsmittelkonzentration gefaltet und entfaltet
vorliegt. Die hierbei am häufigsten eingesetzten Denaturierungsmittel sind Harnstoff und
Guanidiniumchorid (GdmCl):
O
NH2
C
H2N
C
NH2
Harnstoff
H2N
+
Cl
-
NH2
Guanidiniumchlorid (GdmCl)
9
Ist das Zweizustandsmodell der Proteinfaltung gültig, erhält man symmetrische, S-förmige
Denaturierungskurven, wenn man den prozentualen Anteil der denaturierten (oder der
nativen) Moleküle gegen die Denaturierungsmittelkonzentration aufträgt (siehe folgende
Abbildung, oberer Teil). Im Übergangsbereich der Denaturierungskurve (graue Messpunkte)
kann man nun für jede Denaturierungsmittelkonzentration die Gleichgewichtskonstante K
und damit auch ∆G bei der betreffenden Denaturierungsmittelkonzentration bestimmen. Trägt
man dann die jeweiligen Werte von ∆G wiederum gegen die Denaturierungsmittelkonzentration auf, erhält man eine lineare Beziehung mit der Gleichung
∆G = ∆GH20 + m [Denaturierungsmittel]
wobei ∆GH20 die Faltungsenergie in Abwesenheit des Denaturierungsmittels ist und m die
sogenannte Kooperativität der Faltung (Einheit: kJ mol-1 M-1). ∆GH20 erhält man also durch
lineare Extrapolation der gemessenen ∆G-Werte auf 0 M Denaturierungsmittel.
Dabei ist die Kooperativität der Faltung (m-Wert) proportional zur Grösse des Proteins.
m ~ Zahl der Aminoäuren in der Proteinkette
Dies liegt daran, dass die Kooperativität der Proteinfaltung linear abhängt vom Unterschied
zwischen der lösungsmittelzugänglichen Oberfläche des Proteins im nativen und entfalteten
Zustand (Abkürzung: “∆ASA“ für „accessible surface area“), und von der Tatsache, dass
∆ASA seinerseits linear von der Grösse des Proteins abhängt.
m ~ ∆ASA
∆ASA ~ Zahl der Aminoäuren in der Proteinkette
Liegt der experimentell gemessene m-Wert deutlich unterhalb des für die Grösse des betreffenden Proteins erwarteten Werts, ist dies in der Regel ein deutlicher Hinweis darauf, dass
das Zweizustandsmodell keine Gültigkeit mehr hat und auch teilgefaltete Moleküle signifikant im Gleichgewicht populiert werden. Die Wahrscheinlichkeit, dass dieser Fall eintritt,
nimmt stark mit der Grösse des Proteins zu. Kleine, monomere Proteine (ca. 50-200
Aminosäuren) verhalten sich in Gleichgewichts-Denaturierungsexperimenten jedoch häufig
nach dem Zweizustandsmodell.
Eine Konsequenz des Zweizustandsmodells ist, dass ein einzelner Aminosäureaustausch in
einem Protein, der die Stabilität des Proteins beeinflusst, nur zu einer Parallelverschiebung
der Denaturierungskurve hin zu kleineren oder grösseren Denaturierungsmittelkonzentrationen führt, aber keinen Einfluss auf die Kooperativität hat, weil die Grösse des Proteins und
damit der m-Wert unverändert bleibt.
10
%U
100
K = N/U = 0.1
K = N/U = 1; ∆G = -RT lnK = 0
50
K = N/U = 10
Transition midpoint
0
[Denaturant] (M)
∆G = ∆G
∆ H20 + m [Denaturant]
slope (m-value) corresponds to
the cooperativity of folding
0
[Denaturant] (M)
∆GH20
Extrapolation to 0 M denaturant
11
Um uns die Bedeutung von Kooperativität zu veranschaulichen, machen wir nun ein
Gedankenexperiment, bei dem wir folgende Annahmen treffen:
-
Gegeben sind verschiedene Peptide gleicher Länge, die ein zweisträngiges, antiparalleles
β-Faltblatt ausbilden können.
Die Peptide unterscheiden sich in der Zahl der möglichen Wasserstoffbrücken, die
ausgebildet werden können (1-10 Wasserstoffbrücken).
Wir nehmen ferner an, dass die Bildung der 1. intramolekularen Wasserstoffbrücke sehr
ungünstig ist ([Moleküle mit H-Brücke]/[Moleküle ohne H-Brücke] = K1 = 10-4), und
dass die Ausbildung jeder weiteren H-Brücke um den Faktor 10 günstiger wird (K2 = 10-3;
K3 = 10-2 etc.)
-
Wir berechnen für die verschiedenen Peptide die Gesamtgleichgewichtskonstante K, die wie
folgt definiert ist:
[Moleküle, die alle möglichen H-Brücken gleichzeitig ausgebildet haben]
K=
= K1. K2 . K3 …
[Moleküle, die keine einzige der möglichen H-Brücken ausgebildet haben]
________________________________________________________________________________________
Wir berechnen nun K für jedes einzelne der Peptide in Abhängigkeit von der Zahl der HBrücken, die das betreffende Peptid insgesamt ausbilden kann:
K
Number of
H-bonds
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
105
K = K1. K2 . K3 …
10-4
10-7
10-9
10-10
10-10
10-9
10-7
10-4
100
105
1
10-5
10-10
1
5
10
Number of possible H-bonds
Wir sehen aus dieser Betrachtung unmittelbar, dass erst bei Ausbildung der 10.
Wasserstoffbrücke die Gesamtgleichgewichtskonstante grösser als 1 wird und damit ∆G für
die gleichzeitige Ausbildung aller Wasserstoffbrücken kleiner 0 wird. Darüber hinaus hat der
Einbau der 10. Wasserstoffbrücke eine dramatische Veränderung der Gleichgewichtskonstate
um 5 Grössenordnungen zur Folge, was bewirkt, dass praktisch alle Moleküle im Gleich-
12
gewicht alle Wasserstoffbrücken gleichzeitig ausgebildet haben. Somit ist dieses Modell auch
mit der Annahme des Zweizustandsmodells, dass Proteinfaltung im wesentlichen ein Allesoder-Nichts Prozess ist, im Einklang.
Zusammenfassend bedeutet Kooperativität also, dass bereits vorhandene intramolekulare
Wechselwirkungen die Ausbildung weiterer, benachbarter intramolekularer Wechselwirkungen begünstigen.
Auch die Abhängigkeit der Kooperativität der Proteinfaltung von der Grösse des Proteins
kann man sich so erklären, dass grössere Proteine mehr sich gegenseitig verstärkende
intramolekulare Wechselwirkungen ausbilden können als kleine Proteine.
1.2.4. Die Temperaturabhängigkeit der Proteinstabilität
Ähnlich wie bei der Denaturierungsmittel-induzierten Entfaltung zeigen Proteine auch bei
Erhöhung der Temperatur S-förmige, kooperative Denaturierungskurven. Die Proteinfaltung
gehorcht dabei wie bereits besprochen der thermodynamischen Grundgleichung
∆G = ∆H -Τ∆S.
Aus den Temperaturabhängigkeiten von ∆H (d∆H/dT = ∆cp) und ∆S (d∆S/dT = ∆cp/T) ergibt
sich nach Lösung der Differentialgleichungen und Einsetzen die Gesamtgleichung für die
Temperaturabhängigkeit von ∆G:
∆G(T) = ∆Hm – T∆Sm + ∆cp (T-Tm – T ln(T/Tm)
Dabei sind Tm der Schmelzpunkt des Proteins, ∆Hm die thermische Umwandlungsenthalpie,
die ∆Sm die Umwandlungsentropie und ∆cp der Unterschied zwischen der Wärmekapazität des
nativen und entfalteten Proteins. Tm, ∆Hm ∆Sm und ∆cp können durch kalorimetrische Messungen experimentell bestimmt werden. Eine interessante Konsequenz der Temperaturabhängigkeit von ∆G ist die Tatsache, dass es für Proteine neben dem Schmelzpunkt auch einen
Kältedenaturierungspunkt gibt, und dass es für jedes Protein eine Temperatur maximaler
thermodynamischer Stabilität gibt. Bei den meisten Proteinen ist der Kältedenaturierungspunkt deutlich unterhalb von 0°C. Bei einigen Proteinen jedoch liegt der Kältedenaturierungspunkt im Bereich von 0°C, was dann bereits beim Aufbewahren bei 4°C im Kühlschrank zu
teilweiser Denaturierung führen kann.
∆G
Kältedenaturierungspunkt
0
Schmelzpunkt
Tm
0
Temperatur maximaler
Stabilität
13
100
T (°C)
1.3. Proteinfaltung in vivo und in vitro
1.1.1. Die Konkurrenz zwischen Faltung und Aggregation, Molekulare Chaperone
Trotz der Tatsache, dass die Information für das Erreichen der funktionellen dreidimensionalen Struktur eines Proteins vollständig in dessen Aminosäuresequenz enthalten ist,
kommt es bei der Proteinfaltung in vitro und in vivo häufig vor, dass die Ausbeute der
Proteinfaltung geringer ist als 100%. Dies kommt daher, dass als Nebenreaktion zur Proteinfaltung Polypeptidketten irreversibel miteinander aggregieren können. Solche Aggregate
werden durch unspezifische hydrophobe Wechselwirkungen zwischen verschiedenen
Proteinketten zusammengehalten. Diese Wechselwirkungen werden möglich, weil in entfalteten oder nur teilweise gefalteten Polypeptidketten hydrophobe Amiosäureseitenketten
exponiert und lösungsmittelzugänglich sind, während sie im gefalteten Protein normalerweise
im Inneren des Proteins begraben sind und dessen hydrophoben Kern bilden.
biologically active
tertiary structure
n-x
(x + y = n)
n
unfolded proteins with
exposed hydrophobic
side chains ( )
n-y
irreversible
aggregated protein chains, held
together by unspecific hydrophobic
interactions between exposed
hydrophobic side chains
Aus der Tatsache, dass Proteinaggregate Oligomere sind und durch hydrophobe Wechselwirkungen zusammengehalten werden, lassen sich folgende Überlegungen anstellen, um bei der
Rekonstitution von Proteinen in vitro möglichst hohe Ausbeuten zu erzielen:
-
Da hohe Ionenstärken und hohe Temperaturen unspezifische hydrophobe Wechselwirkungen verstärken, kann durch niedrige Temperaturen und niedrige Ionenstärken die
Proteinaggregation teilweise oder vollständig unterdrückt werden.
-
Die Aggregation von Proteinen ist mindestens ein bimolekularer Prozess, dessen
Geschwindigkeit mindestens quadratisch mit der Konzentration sich faltender Moleküle
steigt. Dagegen ist die Faltungsreaktion selbst unimolekular (Halbwertszeit der Reaktion
ist konzentrationsunabhängig). Deshalb kann man durch Verwendung niedriger
Proteinkonzentrationen während der Rückfaltung den Anteil der Moleküle, die
aggregieren, verringern und damit die Faltungsausbeute steigern.
14
-
Bedingungen, die die Faltungsreaktion schneller und die Aggregation langsamer machen,
erhöhen die Ausbeute der Proteinfaltung.
Die Proteinaggregation kommt als Nebenreaktion der Proteinfaltung auch in der lebenden
Zelle vor. So kommt es z.B. bei der Überproduktion von grossen Mengen eines rekombinanten Proteins in E. coli häufig dazu, dass sich Aggregate des überproduzierten Proteins
bilden, die man auch als Inclusion Bodies bezeichnet. Wie die folgende Abbildung zeigt,
können Inclusion Bodies Klumpen bilden, die grosse Teile des Cytoplasmas der E. coli-Zelle
ausfüllen.
Elektronenmikroskopische Aufnahmen von E. coli Zellen, die im Cytoplasma rekombinantes Protein
produzieren, das zu Inclusion Bodies aggregiert. Inclusion Bodies können Ansammlungen granulatähnlicher
Aggregate sein (rechts Bild), aber auch grössere Klumpen bilden, die eine grossen Teil des Cytoplasmas
ausfüllen (linkes Bild).
Auch für die Bildung von Inclusion Bodies in der lebenden Zelle gelten die gleichen
physikalischen Gesetzmässigkeiten wie bei der Proteinfaltung in vitro. So kann z.B. häufig
durch niedrige Wachstumstemperaturen (die hydrophobe Wechselwirkungen schwächen)
(z.B 20°C statt 37°C) die Bildung von Inclusion Bodies verhindert und so die Ausbeute an
löslichem, korrekt gefaltetem Protein im Cytoplasma erhöht werden.
In bestimmten Fällen kann die Bildung von Inclusion Bodies sogar erwünscht sein. Das ist
z.B. der Fall, wenn das zu produzierende rekombinante Protein anfällig ist gegenüber dem
Abbau durch cytoplasmatische Proteasen. In Inclusion Bodies sind die Proteinketten in der
Regel vor solch einem Abbau geschützt. Auf diese Weise lassen sich sehr grosse Mengen an
aggregiertem, rekombinantem Protein produzieren, das anschliessend jedoch erst noch in
vitro zurückgefaltet werden muss. Ein weiterer Vorteil der Inclusion Bodies ist deren
Unlöslichkeit. So können nach der Lyse der Bakterien alle löslichen E. coli Proteine in einem
einfachen Zentrifugationsschritt von den unlöslichen Inclusion Bodies abgetrennt werden.
Molekulare Chaperone
Um in der lebenden Zelle die Proteinaggregation möglichst gering zu halten, gibt es in allen
Organismen eine sehr wichtige Proteinklasse, die Molekularen Chaperone. Dies sind Proteine, die spezifisch und stöchiometrisch entfaltete und/oder unvollständig gefaltete Protein-
15
ketten binden. Molekulare Chaperone erkennen exponierte hydrophobe Seitenketten ungefalteter Proteinketten. Die Proteinketten werden durch die Bindung an die Chaperone vor
allem gegenüber irreversibler Aggregation stabilisiert und haben nach Dissoziation von den
Chaperonen erneut die Möglichkeit, sich korrekt zu falten.
Molekulare Chaperone erhöhen also die Ausbeute der Proteinfaltung, ohne in der Regel die
Faltung selbst zu beschleunigen.
Die Tatsache, dass die meisten Molekularen Chaperone unter Hitzestressbedingungen
besonders stark produziert werden, ist ebenfalls vollkommen im Einklang mit den physikalischen Eigenschaften hydrophober Wechselwirkungen. Einerseits ist bei hohen Temperaturen die Gefahr der Aggregation von Polypeptiden besonders gross, was durch erhöhte
Chaperon-Konzentrationen kompensiert werden kann. Andererseits können essentielle zelluläre Proteine bei hohen Temperaturen auch thermisch denaturiert werden. Durch Bindung an
thermisch entfaltete Proteinketten verhindern Chaperone deren irreversible Aggregation in
der Zelle und ermöglichen nach Temperaturerniedrigung und Ablösen der thermisch entfalteten Ketten deren Rückfaltung in vivo und somit das Überleben einer Zelle nach Hitzestress.
1.3.2. Wie schnell können sich Proteine falten?
Das Levinthal-Paradox
Wenn man sich vorstellt, ein Protein würde während des Faltungsprozesses zufällig alle seine
möglichen Konformationen erproben, um die einzig richtige, native Tertiärstruktur (und
damit den energetisch günstigsten Zustand) zu finden, kann man folgende Überlegung anstellen: Angenommen, ein Protein besteht aus 100 Aminosäuren und hat pro Aminosäure 3
verschiedene Konformationsmöglichkeiten (in Wirklichkeit sind es mehr!), dann kann die
ganze Proteinkette theoretisch 3100 = 5 . 1047 verschiedene Konformationen einnehmen.
Nimmt man ferner an, dass die Zeit für eine einzelne Konformationsänderung 10-13 Sekunden
dauert (dies ist in etwa die Zeit für die Rotation um eine C-C Einfachbindung), würde die
Proteinkette theoretisch 5 . 1034 Sekunden (das sind 1,6 . 1027 Jahre) benötigen, um sich zu
falten. Untersuchngen zur Proteinfaltung in vivo und in vitro haben jedoch gezeigt, dass sich
Proteine im Bereich zwischen Millisekunden bis maximal einigen Stunden falten. Dieser
apparente Widerspruch wurde erstmals von C. Levinthal diskutiert und ist als das sogenannte
“Levinthal-Paradox” in die Gechichte der Biochemie eingegangen.
Wie lässt sich der Widerspruch des Levinthal-Paradoxons auflösen? Zunächst ist es
offensichtlich, dass Proteine nicht alle möglichen Konformationen bei der Suche nach dem
nativen Zustand ausprobieren. Der Trick der Proteine zum schnellen Auffinden der nativen
Tertiärstruktur besteht in der Tat darin, dass einmal lokal korrekt gebildete Teilkonformationen während der weiteren Konformationssuche beibehalten werden. Damit ist auch klar,
dass bei der Proteinfaltung Kontakte zwischen Aminosäureseitenketten, wie sie im nativen
Zustand bestehen, bereits in teilstrukturierten Zwischenstufen vorkommen, und dass somit
nativ-ähnliche Kontakte den Faltungsweg von Proteinen bestimmen.
Untersuchungen in den letzten Jahren haben gezeigt, dass viele kleine Eindomänenproteine
sich im Millisekundenbereich, teilweise sogar im Submillisekundenbereich, falten können.
Man geht heute davon aus, dass die Proteinkette, ausgehend von einem Ensemble vieler
16
energetisch ähnlicher entfalteter Zustände, bei der Faltung viele Wege beschreiten kann, bei
denen die verschiedensten Zwischenstufen populiert werden können. Alle diese
Zwischenstufen sind energetisch günstiger als der entfaltete Zustand. Die dem entfalteten
Zustand energetisch nahen Zwischenstufen werden als “Molten Globule” Zustände bezeichnet. Von diesen Zuständen nimmt man an, dass sie zwar Sekundärstrukturelemente enthalten,
aber noch keine Tertiärstrukturelemente besitzen. Zwischenstufen, die bereits dem nativen
Zustand strukturell und energetisch relativ ähnlich sind, werden als (kinetische) Faltungsintermediate bezeichnet. Das Weiterreagieren dieser Intermediate bestimmt wahrscheinlich
die eigentlich gemessene Faltungsgeschwindigkeit, weil die Aktivierungsenergiebarrieren
zum Weiterreagieren eines Intermediats immer höher werden, je ähnlicher ein Intermediat
dem nativen Zustand ist. Dieses Konzept wird häufig in Form eines sogenannten “Faltungstrichters” dargestellt. In der folgenden Abbildung wurde zur Veranschaulichung des
Konformationsraums der Polypeptidkette willkürlich die x- und y-Achse mit Parametern
beschriftet (Zahl der nativen Kontakte und Entropie der Proteinkette), die sich beim Übergang
von entfalteten Zustandsensemble zum nativen Zustand ändern.
unfolded states
Energy
Molten globule
states
Intermediates
chain entropy
Native state
native contacts
native contacts
chain entropy
17
1.3.3. Mögliche langsame Faltungsreaktionen
Obwohl sich Proteine prinzipiell im Millisekundenberich falten können, ist die Faltung vieler
Proteine deutlich langsamer. Hierfür sind im wesentlichen zwei die Faltung verlangsamende
Reaktionen verantwortlich: Die Isomerisierung von X-Pro Peptidbindungen und die Bildung
von Disulfidbrücken. Beide Reaktionen sind so langasam, dass sie in der lebenden Zelle
durch Enzyme katalysiert sind. Die Anwesenheit von Faltungskatalysatoren und Molekularen
Chaperonen ist der Grund, warum die Proteinfaltung in vivo schneller und mit höheren
Ausbeuten abläuft als in vitro.
Als dritte langsame Faltungsreaktion ist für oligomere Proteine schliesslich noch die Assoziation von Proteinuntereinheiten nach deren Faltung zu nennen, die als mindestens bimolekularer Prozess von den Konzentrationen aller Untereinheiten abhängt.
1.3.3.1. Isomerisierung von X-Pro Peptidbindungen
Durch den partiellen Doppelbindungscharakter der C-N Bindung der Peptidbindung gibt es
für die der C-N-Bindung benachbarten Cα-Atome eine cis- und eine trans-Sellung. Die transStellung ist bei Peptidbindungen aus sterischen Gründen energetisch wesentlich günstiger, so
dass cis-Peptidbindungen in den bisher aufgeklärten Proteinstrukturen im Normalfall nie
vorkommen. Eine Ausnahme bilden jedoch X-Pro Peptidbindungen (X = irgendeine Aminosäure): Hier wird durch die Methylengruppe des Prolinrings (bei allen anderen Aminosäuren
ist hier nur ein Wasserstoffatom) die trans-Stellung sterisch destabilisiert, so dass die transStellung nur noch geringfügig günstiger ist als die cis-Stellung. Im entfalteten Zustand eines
Proteins und bei kurzen, unstrukturierten Modellpeptiden liegen somit im Gleichgewicht 1020% aller X-Pro Peptidbindungen in cis-Stellung vor. Damit ist die X-Pro Isomerisierung, die
an jeder X-Pro Peptidbindung eines entfalteten Proteins auftreten kann, auch mitverantwortlich für die strukturelle Heterogenität des entfalteten Zustands (Ensemble enfalteter
Zustände).
O=C
Cα
O
C
HC
H
EA = 80 kJ/mol
C
N
α
X
O
HC
180°
α
N
Cα
X
C=O
H
cis
(10-20% in unstrukturierten Peptiden)
trans
(80-90% in unstrukturierten Peptiden)
18
Aufgrund des minimalen Energieunterschieds zwischen der cis- und trans-Konformation
kommen cis-X-Pro Peptidbindungen relativ häufig auch in gefalteten Proteinen vor, wobei
dann in allen Molekülen die betreffende Bindung zu 100% in cis-Stellung ist. Es wird angenommen, dass bei der Proteinbiosynthese zunächst alle Peptidbindungen in trans-Stellung
synthetisiert werden. Demzufolge muss zur Ausbildung des nativen Zustands eines Proteins,
das eine cis-X-Pro Peptidbindung im nativen Zustand aufweist, diese Bindung zuerst von der
trans- in die cis-Stellung umklappen. Diese Isomerisierungsreaktion hat eine relativ hohe
Aktivierungsenergie von 80 kJ/mol und bei Raumtemperatur eine Halbwertszeit von ca. 100
Sekunden. Sie wird damit für die Proteinfaltung geschwindigkeitsbestimmend.
Die Analyse der bisher aufgeklären Proteinstrukturen zeigt, dass cis-X-Pro Peptidbindungen
besonders häufig in Turns zwischen β-Faltblattsträngen vorkommen. Dies ist auch plausibel,
weil die cis-Peptidbindung eine Umkehr des Verlaufs der Polypeptidkette bewirkt.
In der lebenden Zelle ist die Isomersisierung von X-Pro-Peptidbindungen katalysiert durch
das Enzym Peptidyl-Prolyl-cis-trans-Isomerase (PPI). In E. coli ist in diesem Zusammenhang besonders der sogenannte Trigger Faktor von Interesse. Trigger Faktor hat PPI-Aktivität
und ist gleichzeitig ein Ribosomen-assoziiertes Protein, so dass die Isomerisierung von XPro-Peptidbindungen in vivo sogar kotranslational katalysiert sein könnte.
1.3.3.2. Die Bildung von Disulfidbrücken
Die Bildung von Disulfidbrücken ist für die Faltung von sekretorischen Proteinen immer
geschwindigkeitsbestimmend, weil Disulfidbrücken sich nicht einfach automatisch ausbilden
können, wenn bei der Proteinfaltung die Thiolgruppen zweier Cysteinreste in räumliche
Nachbarschaft treten. Der Grund ist, dass bei der Bildung von Disulfidbrücken zwei
Elektronen freigesetzt werden, die von einem Oxidationsmittel aufgenommen werden müssen. Proteine mit Disulfidbrücken können sich also nur dann falten, wenn sie mit einem
Oxidationsmittel zusammentreffen. Aus diesem Grund gibt es in Zellkompartimenten mit
reduzierenden Bedingungen wie z.B. dem Cytoplasma in der Regel keine Proteine mit Disulfidbrücken. Oxidierende Zellkompartimente sind in Eukaryonten das endoplasmatische
Retikulum (ER) und in Bakterien das Periplasma, also diejenigen Zellkompartimente, in
denen sich sekretorische Proteine falten. In der Tat sind Disulfidbrücken eine typische
Eigenschaft sekretorischer Proteine.
SH
SH
S-S
+ 2 H+ + 2 e-
Die folgende Abbildung zeigt die Situation im Periplasma von Escherichia coli. Unter
aeroben Bedingungen ist das Oxidationsmittel für die Bildung von Disulfidbrücken im
Periplasma von E. coli molekularer Sauerstoff, während unter anaeroben Bedingungen andere
19
Elektronenakzeptoren wie z.B. Fumarat als Oxidationsmittel wirken. Sowohl unter aeroben
wie auch unter anaeroben Bedingungen ist das Enzym DsbA das Molekül, das die zur
Bildung der Disulfidbrücken erforderlichen Oxidationsäquivalente direkt auf sich faltende
Polypeptidketten überträgt. Dies geschieht dadurch, dass DsbA selbst eine katalytische
Disulfidbrücke besitzt, die durch Disulfidaustauschreaktionen auf reduzierte Proteinketten
übertragen wird. DsbA wird dabei selbst zur Dithiolform reduziert und durch eine weitere
Disulfidaustauschreaktion mit dem Protein DsbB in der inneren Bakterienmembran als
Oxidationsmittel regeneriert. DsbB wird dann seinerseits durch Chinone als Oxidationsmittel
regeneriert, wobei diese, abhängig von der Verfügbarkeit von Sauerstoff, ihre Oxidationsäquivalente von Proteinkomplexen der inneren Membran erhalten. Auch die Umlagerung
(Isomerisierung) falscher Disulfidbrücken ist in E. coli katalysiert durch das Enzym DsbC.
DsbC wird von der Zelle im reduzierten Zustand gehalten, damit es falsche Disulfidbrücken
angreifen und reduzieren kann.
Im endoplasmatischen Retikulum (ER) eukaryontischer Zellen übernimmt ein einziges
Enzym, die Proteindisulfidisomerase (PDI), die Katalyse von Disulfidbrückenbildung und
Disulfidbrückenisomerisierung. PDI enthält wie DsbA und DsbC eine katalytische Disulfidbrücke. Es gibt in der ER-Membran ein PDI-spezifisches Enzym, Ero1p, das Oxidationsäquivalente von FAD auf PDI überträgt. Somit kommen in Eukaryonten die Oxidationsäquivalente für die Bildung von Disulfidbrücken in sekretorischen Proteinen letzlich von
FAD (Science 290, 1571).
20
2.
Das chemische Bindungsgleichgewicht
2.1. Die Bedeutung von Bindungs- und Dissoziationskonstanten
Die Funktion der meisten Proteine besteht in der spezifischen Erkennung und Bindung eines
Liganden. Für die Bindung des Liganden L an ein Protein P lässt sich folgendes chemisches
Gleichgewicht formulieren:
k2
L + P
PL
k1
Dabei ist k2 die mikroskopische Geschwindigkeitskonstante 2. Ordnung für die Bildung von
PL, und k1 die mikroskopische Geschwindigkeitskonstante 1. Ordnung für den Zerfall von
PL. Die Gleichgewichtssituation ist nun dadurch definiert, dass die Geschwindigkeit der
Bildung des Protein-Ligandenkomplexes PL identisch ist mit der Geschwindigkeit des
Zerfalls von PL:
d [PL]
d [PL]
= dt
dt
k2 [P] [L] = k1 [PL]
Das Verhältnis der beiden Geschwindigkeitskonstanten kann nun zu einer neuen
Naturkonstante zusammengefasst werden, die man als Dissoziationskonstante KDiss
bezeichnet und die Einheit einer Konzentration (M) hat. Häufig benutzt man auch den Begriff
Bindungskonstante KBind, um die Stärke einer Ligandenbindung zu beschreiben. Die Bindungskonstante ist der Kehrwert der Dissoziationskonstante und hat die Einheit (M-1).
KDiss =
k1
[P] [L]
1
=
=
k2
[PL]
K Bind
Die Konstanten k1 und k2, und damit KDiss und KBind, sind Naturkonstanten für den
betreffenden Protein-Ligandenkomplex. Obige Gleichung ist identisch mit dem Massenwirkungsgesetz.
Um uns die Bedeutung des chemischen Bindungsgleichgewichts zu verdeutlichen, nehmen
wir den Fall an, dass in einer Lösung der Ligand in einem sehr hohen molaren Überschuss
über das Protein vorliegt. Unter diesen Umständen kann die Konzentration des freien Liganden [L] mit der Gesamtkonzentration des Liganden [L]tot gleichgesetzt werden:
[L]tot = [L] + [PL];
wenn [L]tot >> [P]tot
[L] ≈ [L]tot
unter diesen Bedingungen gilt:
KDiss =
[P] [L]tot
;
[PL]
K Diss
[P]
=
[L]tot
[PL]
21
Es folgt unmittelbar, dass man bei Kenntnis der gesamten Ligandenkonzentration und der
Dissoziationskonstante sofort das Verhältnis zwischen [P] und [PL] - und damit auch den
prozentualen Anteil des mit Ligand besetzten Proteins in Anbhängigkeit der Ligandenkonzentration - ausrechnen kann.
[L]tot
[P] / [PL]
KDiss/100
KDiss/10
KDiss
10 . KDiss
100 . KDiss
1000 . KDiss
100 : 1
10 : 1
1:1
1 : 10
1 : 100
1 : 1000
Besetzungsgrad des Proteins
(% PL im Gleichgewicht)
0.99 %
9.09 %
50 %
90.9 %
99.01 %
99.9 %
100
% PL
50
0
0.001 KD
0.01 KD
KD
0.1 KD
10 KD
100 KD
1000 KD
Ligand concentration (M)
Aus diesen Überlegungen wird ersichtlich, dass die Dissoziationskonstante diejenige
Ligandenkonzentration angibt, bei der das Protein im Gleichgewicht zu 50% mit dem Liganden besetzt ist. Hohe Affinitäten für einen Liganden bedeuten also niedrige Dissoziationskonstanten, weil hier bereits geringe Ligandenkonzentrationen zu einer 50%-igen Sättigung
der Ligandenbindungsstelle des Proteins ausreichen. Für Bindungskonstanten gilt entsprechend das umgekehrte: Hohe Werte von KBind bedeuten hohe Affinitäten.
Proteine haben gemäss ihrer Funktion in der Zelle sehr unterschiedlich starke Affinitäten für
ihre natürlichen Liganden. Die Werte natürlicher Dissoziationskonstanten von Proteinen
schwanken zwischen 10-3 M und 10-15 M.
22
2.2. Die Analogie zwischen Bindungsgleichgewichten und Säure-Base Gleichgewichten
Eine Säure AH (bzw. AH+) kann unter Freisetzung eines Protons H+ in wässriger Lösung zu
A− (bzw. A) dissoziieren:
A− + H+
AH
Man definiert die Gleichgewichtskonstante Ka wie bei einem normalen chemischen
Dissoziationsgleichgewicht:
Ka = [ A− ] [ H+ ] / [ AH ]
Mit den Definitionen [ H+ ] = 10−pH und [ Ka ] = 10−pKa folgt:
[ A− ] / [ AH ] = 10pH−pKa
Mit Kenntnis des pKa-Werts lässt sich also für eine Puffersubstanz bei jedem beliebigen pHWert das Verhältnis von deprotonierter und protonierter Form berechnen. Das Verhältnis ist
1:1, wenn der pH mit dem pKa identisch ist (100=1).
100
% AH
50
0
pK - 3
pK - 2
pK -1
pK
pK + 1
pK + 2
pK + 3
pH
Hieraus ergeben sich für die Verwendung von Pufferlösungen folgende wichtige Konsequenzen:
a) Die Pufferkapazität einer Puffersubstanz ist bei dem pH-Wert, der ihrem pKa-Wert entspricht, am grössten.
b) Die Pufferkapazität nimmt stark ab, sobald der pH-Wert vom pKa-Wert um mehr als 0.5
Einheiten abweicht. Bei noch stärkeren Abweichungen nimmt die Pufferkapazität mit
jeder pH-Einheit Abweichung um den Faktor 10 ab! Deshalb wählt man grundsätzlich
nur Puffersubstanzen aus, deren pKa-Wert nahe am gewünschten pH-Wert des Experiments liegt.
23
2.3. Die pH-Abhängigkeit der Gesamtladung von Proteinen
Als einfaches Beispiel betrachten wir die pH Titrationskurve (Gesamtladung in Abhängigkeit
vom pH-Wert) des folgenden Heptapeptids, welches am N-Terminus acetyliert und am CTerminus methyliert ist und deshalb an den Termini keine Ladungen trägt.
CH3-CO-NH-Ala1-Asp2-Ala3-Asp4-Ala5-Lys6-Ala7-CO2-CH3
Wir nehmen ferner an, dass der pKa-Wert der Asp Seitenketten 4.0 und der der Lys Seitenkette 11.0 ist. Mit Hilfe der Überlegungungen aus 2.2. ergibt sich für die einzelnen Ladungen
der Aminosäureseitenketten und für die Gesamtladung des Peptids folgende pH-Abhängigkeit:
pH
Ladung von Asp2
Ladung von Asp4
Ladung von Lys6
0
4
7
11
14
0
- 0.5
-1
-1
-1
0
- 0.5
-1
-1
-1
+1
+1
+1
+ 0.5
0
Gesamtladung des
ganzen Peptids
+1
0
-1
- 1.5
-2
Total
charge
Isoelectric point (pI) and
pKa of Asp side chain
+1
Number of all
basic residues
0
1
4
7
11
14
-1
Cys30
pH
Number of all
acidic residues
-2
pKa of Lys side chain
Es ist also möglich, aufgrund der Aminosäurezusammensetzung eines Proteins die pHAbhängigkeit der Gesamtladung und seinen isoelektrischen Punkt pI (pH, bei dem die
Gesamtladung 0 ist), vorauszuberechnen. Man führt solche Berechnungen z.B. häufig durch,
um für die Reinigung eines Proteins durch Ionenaustauschchromatographie die richtigen pHBedingungen festzulegen:
24
pH < pI
Protein ist positiv geladen
Bindet an Kationenaustauscher
pH > pI
Protein ist negativ geladen
Bindet an Anionenaustauscher
Für die Reinigung von Proteinen bedeuten identische isolelektrische Punkte zweier Proteine
nicht, dass diese Proteine sich durch Ionenaustauschchromatographie nicht voneinander
trennen lassen. Der Grund ist, dass zwei Proteine mit identischem pI bei pH-Werten abseits
vom pI aufgrund ihrer unterschiedlichen Aminosäurezusammensetzung unterschiedliche
Gesamtladungen haben können. Sie werden deshalb unterschiedlich stark an einen entsprechenden Ionenaustauscher binden und können deshalb mit Ionenstärkegradienten selektiv eluiert weden.
In der Praxis funktioniert die Vorausberechnung des pI eines Proteins aufgrund dessen
Aminosäuresequenz mit Computerprogrammen relativ zuverlässig. Prinzipiell können die
berechneten pI-Werte von den tatsächlichen pI Werten aber auch abweichen, wenn bestimmte
Aminosäureseitenketten im gefalteten Protein abnormale pKa-Werte haben. Im Bereich
„Proteomics und Functional Genomics“ wird die gute Übereinstimmung zwischen
experimentellen und berechneten pI-Werten auch als Parameter herangezogen, um Proteine
aus komplexen Gemischen, die z.B. durch zweidimensionale Gelelektrophorese aufgetrennt
wurden, eindeutig zu identifizieren.
25
Anhang
A 1. Spektroskopische Methoden zur Bestimmung der Proteinkonformation in Lösung
A 1.1. Absorptionsspektroskopie
Definition von Absorption und das Lambert-Beer’sche Gesetz
Unter Absorption von Licht versteht man die Eigenschaft einer Substanz, bei einer
bestimmten Wellenlänge Lichtquanten aufzunehmen (zu absorbieren). Typischerweise wird
die Absorption einer in einer Flüssigkeit gelösten Substanz in einer Küvette mit 1 cm
Schichtdicke gemessen.
hν
Io
I
d = 1 cm
Ein Absorptionsspektrometer ist in der Lage, bei verschiedenen Wellenlängen Unterschiede
zwischen der Intensität des auf die Küvette einfallenden und des aus der Küvette austretenden
Lichts zu messen. Die vom Spektrometer angezeigte, dimensionslose Grösse Absorption (A)
ist als der Logarithmus des Verhältnisses der Intensitäten von einfallendem um austretendem
Licht definiert:
A = log
Io
___
I
Das Lambert-Beer’sche Gesetz beschreibt die Tatsache, dass die Absorption A einer Probe
linear von der Konzentration der gelösten Substanz (c) und von der Schichtdicke der Küvette
(d) abhängt.
A ~ c und A ~ d
A = ε .c .d
Die Proportionalitätskonstante ε wird als Molarer Extinktionskoeffizient einer Substanz
bezeichnet. Er hat die Einheit M-1 cm-1 und gibt den Absorptionswert an, den eine 1 molare
Lösung der Substanz bei 1 cm Schichtdicke hätte. Der molare Extinktionskoeffizient bezieht
sich immer auf eine bestimmte Wellenlänge des Lichts und ist für jede Substanz und jede
Wellenlänge eine charakteristische Grösse. Absorptionsmessungen erlauben also bei
bekanntem molarem Extinktionskoeffizienten die Bestimmung der Konzentration und der
zeitlichen Konzentrationsänderung einer Substanz.
26
Es ist sehr wichtig, dass man sich darüber klar ist, dass die Absorption bezüglich der
Intensität der aus der Küvette austretenden Strahlung eine eine logarithmische Grösse ist. Ein
Absorptionswert von 1 bedeutet, dass nur noch 10% der einfallenden Strahlung wieder aus
der Küvette austreten. Bei einer Absorption von 3 sind es nur noch 0.1% der einfallenden
Strahlung. Dies bedeutet, dass bei hohen Absorptionswerten die Intensität der austretenden
Strahlung extrem klein wird, so dass Absorptionsänderungen nicht mehr zuverlässig gemessen werden können. Aus diesem Grund sind Absorptionwerte über 2 prinzipiell
unzuverlässig. Als Faustregel sollten Sie beherzigen, dass bei Absorptionsmessungen die
Absortion der Probe nicht über 1,5 ansteigt. Falls dies dennoch passiert, muss entweder die
Probe verdünnt oder die Schichtdicke der Küvette verkleinert werden.
Wenn man die Absorption einer Substanz bei verschiedenen Wellenlängen misst, erhält man
ihr Absportionsspektrum. Proteine absorbieren Licht nur im UV-Bereich unterhalb von 310
nm, vorausgesetzt sie haben keine Chromophore als Liganden gebunden (wie z.B. Häm in
Hämoglobin). Ein typisches Absorptionsspektrum eines Proteins hat ein Maximum bei 275280 nm, ein Minimum bei ca. 250 nm und zeigt keine Absorption über 310 nm. Das
Maximum bei 280 nm wird im wesentlichen von den aromatischen Aminosäuren Tyrosin und
Tryptophan bestimmt. Auch Disulfidbrücken tragen zu einem geringen Teil zur Absorption
von Proteinen bei. Da Tryptophan eine relativ seltene Aminosäure ist, kann es vorkommen,
dass ein Protein keinen Tryptophanrest enthält. Dies ist sofort im Absorptionsspektrum des
Proteins erkennbar, welches dann bereits ab 295 nm keine Absorption mehr zeigt und ein
Absorptionsmaximum bei ca. 274 nm aufweist.
A
280 nm
___
Protein with both Tyr
and Trp residues
----
Protein without Trp
residues
274 nm
No absorbance
above 295 nm
ca. 250 nm
No absorbance
above 310 nm
250
310
Wavelength (nm)
280
27
Die wichtigste Anwendung der Absorptionsspektroskopie in der Proteinchemie ist die
Konzentrationsbestimmung von Proteinen. Der molare Extinktionskoeffizient eines Proteins
bei 280 nm lässt sich relativ zuverlässig aus seiner Aminosäuresequenz berechnen und ist die
Summe der Beiträge aller Tryptophane, Tyrosine und Disulfidbrücken des Proteins:
amino acid
absorbance
maximum
ε280 nm
(M-1 cm-1)
Tryptophan (W)
280 nm
5690
Tyrosine (Y)
274 nm
1280
~ 280 nm
120
disulfide bridge (SS)
ε280 nm (theoretisch) = (nW . 5690 + nY . 1280 + nSS . 120) M-1 cm-1
Dabei bezeichnet nW, nY und nSS die Anzahl der Trp, Tyr und SS-Gruppen im Protein. Genau
genommem lässt sich der molare Extinktionskoeffizient eines Proteins nur für das entfaltete
Protein berechnen, weil die Umgebung der aromatischen Aminosäuren in jedem Protein
anders ist und sich dadurch die Absorptionseigenschaften einzelner Reste geringfügig ändern
können. Um für ein natives Protein einen zuverlässigen Wert von ε280 nm zu erhalten,
vergleicht man die Absorption des nativen und denaturierten Proteins und korrigiert den
berechneten Extinktionskoeffizienten entsprechend:
ε280 nm (natives Protein) = (A280 nm, nativ / A280 nm, denaturiert) . ε280 nm (theoretisch)
28
A 1.2. Fluoreszenzspektroskopie
Wenn eine Substanz Licht einer bestimmten Energie absorbiert und daraufhin Licht mit
geringerer Energie (d.h. grösserer Wellenlänge) wieder abgibt, spricht man von Fluoreszenz.
Ebenso wie die Absorptionseigenschaften von Proteinen werden auch deren Fluoreszenzeigenschaften von den aromatischen Aminosäuren Tyrosin und Typtophan bestimmt. Um das
Fluoreszenzspektrum eines Proteins aufzunehmen, wird dieses typischerweise bei 280 nm
angeregt, wo sowohl Tyr, als auch Trp stark absorbieren. Die vom Protein abgegebene
Strahlung wird dann senkrecht zur einfallenden Strahlung detektiert und die Intensität der
abgegebenen Strahlung wird bei Wellenlängen zwischen 290 und 450 nm registriert.
Excitation
λex
beam
sample
λem > λex
detector
Als Quantenausbeute φF bezeichnet man das Verhältnis zwischen der Zahl der abgegebenen
und aufgenommenen Lichtquanten. Da Tryptophan nicht nur die bessere Quantenausbeute
hat, sondern auch stärker absorbiert als Tyrosin, ist Tryptophan ein ca. 5.5 mal stärkeres
Fluorophor als Tyrosin (siehe Tabelle).
Fluorescence properties of tryosine and tryptophan residues
Tryptophan (W)
Absorptions maximum
280 nm
Fluoreszenz maximum
348 nm
Quanten ausbeute (φF)
20 %
Empfindlichkeit
(φF . εmax)
bezogen auf Trp
1
Tyrosin (Y)
274 nm
303 nm
14 %
0.18
Aminosäure
Neben ihrer hohen Empfindlichkeit hat die Fluoreszenzspektroskopie auch den Vorteil, dass
Proteine in der Regel stark unterschiedliche Fluoreszenzeigenschaften im nativen und
denaturierten Zustand zeigen. Dies kommt daduch zustande, dass v.a Tryptophanreste
bezüglich ihrer Fluoreszenzeigenschaften sehr empfindlich auf Änderungen ihrer Umgebung
reagieren. Da Tryptophane bei nativen Proteine meist im hydrophoben Inneren des Proteins
begraben sind, verschiebt sich neben der Fluoreszenzintensität auch das Emissionsmaximum
von nativen Proteinen gegenüber entfalteten Poykpeptidketten von 350 nm auf 320-335 nm.
Proteine, die keine Tryptophane enthalten, zeigen dagegen bei Entfaltung meist nur geringe
Fluoreszenzunterschiede, wobei das Fluoreszenzmaximum im nativen und denaturierten
Zustand bei ca. 305 nm liegt.
29
Für die spezifische Beobachtung von Tryptophanseitenketten in Proteinen, unabhängig von
den Tyrosinseitenketten, kann man die Tatsache ausnutzen, dass Tyrosine bei 295 nm nicht
mehr absorbieren, so dass sich durch Bestrahlen bei 295 nm selektiv die Tryptophane in
einem Protein anregen lassen.
Eine sehr wichtige, weitere Anwendung der Fluoreszenzspektroskopie ist die Bestimmung
von kleinen Konformationsänderungen und die Messung von Protein-Liganden-Wechselwirkungen. Bei letzterer Messung nutzt man die Tatsache aus, dass sich in Proteinen nach
Bindung eines Liganden häufig die Tryptophanfluoreszenz verändert. Bereits eine 10%ige
Fluoreszenzintensitätsänderung bei Bindung reicht in der Regel aus, um durch Fluoreszenztitration die Affinitätskonstante zwischen einem Protein und seinem Liganden quantitativ zu
bestimmen.
Fluorescence intensity
(arbitrary units)
320-335 nm
____
Native protein with Tyr and Trp residues
---- Unfolded protein with Tyr and Trp residues
…...
Native Protein with Tyr, but no Trp residues
305 nm
350 nm
300
400
440
Wavelength (nm)
30
A 1.3. Circulardichroismus (CD) Spektroskopie
Linear polarisiertes Licht ist Licht, bei die elektrischen Feldstärkevektoren aller Lichtstahlen
in einer Ebene schwingen. Es wird durch Polarisationsfilter erzeugt, die nur Lichtstrahlen mit
elektrischen Feldstärkevektoren in der gekann man durch Man kann sich linear polarisiertes
Licht aus zwei überlagerten, entgegengesetzt zirkular polarisierten Lichtwellen vorstellen.
Proteine als chirale Moleküle absorbieren rechts und links zirkular polarisiertes Licht mit
unterschiedlichen molaren Extinktionskoeffizienten. Dieser Unterschied ∆ε = εL-εR lässt sich
mit folgender Formel in die sogenannte molare Elliptizität [θ] umrechnen:
[θ] = 3300 . ∆ε
Analog zum Lambert-Beerschen Gesetz ist nun die gemessene Elliptizität θ (in Grad) mit der
Probenkonzentration c, der Schichtdicke d (in cm) und der molaren Elliptizität [θ] verknüpft.
[θ] =
θ . 100 . Mr
_________________
.
c d
(Einheit: Grad cm2 dmol-1)
Noch häufiger verwendet man als Messgrösse die mittlere molare Elliptizität eines Proteins
pro Aminosäure, die als [θ]MRW als bezeichnet wird. Speziell im Fern-UV CD Bereich bei
210-220 nm gibt dieser Wert einen guten Anhaltspunkt für das Ausmass und die Art der
Sekundärstrukturbildung in einem Protein. Den Wert von [θ]MRW eines Proteins erhält man
einfach dadurch, dass man die gemessene molare Elliptizität durch die Zahl der Aminosäuren
des Proteins (n) teilt:
[θ]MRW = [θ] / n (Einheit: Grad cm2 dmol-1)
Die folgende Abbildung zeigt, dass sich im Fern-UV Bereich zwischen 180 und 250 nm die
CD-Spektren von Proteinen mit verschiedenen Sekundärstrukturanteilen ganz charakteristisch
unterscheiden. Proteine, die ausschliesslich aus α-Helices aufgebaut sind, haben ein stark
negatives CD Signal mit Minima bei 208 und 222 nm und Werten von ca. –20000 Grad cm2
dmol-1, während reine β-Faltblattproteine ein schwächer negatives Signal (ca. –5000 Grad
cm2 dmol-1) mit einem Minimum bei 215 nm aufweisen. Da die Fern-UV CD Spektren von
entfalteten Proteinen von den Spektren nativer Proteine in der Regel stark verschieden sind
(Minimum erst unterhalb 200 nm, siehe Abbildung), bietet die Fern-UV CD Spektroskopie
hervorragende Möglichkeiten, Faltungs- und Konformationsübergänge in Proteinen zu
verfolgen. Die Gestalt der Fern-UV CD Spektren von Proteinen kommt durch die Umgebung
der Peptidbindungen der Protein-Hauptkette zustande, die in diesem Wellenlängenbereich
absorbieren.
Auch im Nah-UV Bereich (310-250 nm), dem Absorptionsbereich der aromatischen
Aminosäuren, zeigen Proteine charakteristische CD-Spektren, deren Gestalt im Gegensatz zu
den Fern-UV CD Spektren jedoch nicht vorhersagbar ist. Nah-UV CD Spektren sind in der
Tat eine Art Fingerabdruck eines Proteins und für jedes Protein charakteristisch. Sie kommen
durch die asymmetrische Umgebung der aromatischen Seitenketten im gefalteten Protein
zustande und sind daher ein Mass für die korrekte Tertiärstrukturausbildung. Daher zeigen
entfaltete Proteine normalerweise überhaupt kein CD Signal im Nah-UV Bereich.
31
Typische Fern-UV CD Spektren von Proteinen, die ausschliesslich α-Helices bzw. β Faltblätter als reguläre Sekundärstrukturelemente enthalten.
[θ
θ]MRW
(degree cm2 dmol-1)
15000
10000
5000
0
-5000
Unfolded protein
200
250 wavelength (nm)
215 nm
Pure β-sheet protein
-10000
-15000
Pure α-helical protein
-20000
208 nm 222 nm
32
A 2. Physikalische Grössen und ihre Einheiten
Für das Verständnis physikalischer Prozesse ist es sehr hilfreich, sich die Einheiten der
betreffenden physikalischen Grössen zu vergegenwärtigen. Davon sind die wichtigsten in den
folgenden Tabellen zusammengefasst:
Abkürzungen für Zehnerpotenzen
Bezeichnung
Abkürzung
tera
giga
mega
kilo
milli
micro
nano
pico
femto
Ångström
T
G
M
k
m
µ
n
p
f
Å
Zehnerpotenz
(Multiplikationsfaktor)
1012
109
106
103
10-3
10-6
10-9
10-12
10-15
-10
1 Å = 10 m = 0.1 nm
Einheiten wichtiger physikalischer Grössen
Physikalische Grösse
Masse
Molmasse
Volumen
Konzentration
Ionenstärke
Temperatur
Freie Enthalpie einer chemischen Reaktion
Enthalpieänderung einer chemischen Reaktion
Entropieänderung einer chemischen Reaktion
Geschwindigkeitskonstante 1. Ordnung
Geschwindigkeitskonstante 2. Ordnung
Reaktionsgeschwindigkeit
Beschleunigungsfaktor
Umsatzrate bei Maximalgeschwindigkeit (Vmax)
Michaeliskonstante
Dissoziationskonstante
Bindungskonstante
Standard-Redoxpotential bei pH 7.0
Wellenlänge elektromagnetischer Strahlung
Frequenz elektromagnetischer Strahlung
33
Abkürzung
m
MW
V
c oder [...]
I
T
∆G
∆H
∆S
k1
k2
v
kcat/kuncat
kcat
KM
KDiss
KBind
Eo
λ
ν
Einheit
g
-1
g mol oder Da
L
M (oder mol L-1 )
M
K
J mol-1
J mol-1
J K-1 mol-1
s-1
M-1 s-1
M s-1
dimensionslos
s-1
M
M
M-1
V oder J C-1
m
s-1
Physikalische Grösse
Absorption
Fluoreszenzintensität
Mittlere molare Elliptizität pro Aminosäure
Kooperativität der Proteinfaltung
Abkürzung
A
FI
[θ]MRW
m
Einheit
dimensionslos
willkürliche Einheiten
Grad cm2 dmol-1
J mol-1 M-1
Abkürzung
Wert
273.15 K
6.022 . 1023 mol-1
9.649 . 104 C mol-1
8.315 J K-1 mol-1
2.998 . 108 m s-1
6.626 . 10-34 J s
Wichtige physikalische Konstanten
Konstante
Nullpunkt der Celsius-Skala
Avogadrokonstante
Faraday-Konstante
Allgemeine Gaskonstante
Lichtgeschwindigkeit
Planck’sche Konstante
NA
F = NA e
R
c
h
A 3. Eigenschaften der am häufigsten verwendeten Puffersubstanzen in der Biochemie
Trivialname
Puffersubstanz und zum Einstellen des pH-Werts verwendete
Säure oder Base
Phosphat (pK1)
Phosporsäure-NaOH (H3PO4/H2PO4-)
Malat (pK1)
Malonsäure-NaOH
Formiat
Ameisensäure-NaOH
Succinat (pK1)
Bernsteinsäure-NaOH
Citrat (pK2)
Citronensäure-NaOH
Acetat
Essigsäure-NaOH
Succinat (pK2)
Bernsteinsäure-NaOH
MES
Sulfonsäure-NaOH
Cacodylat
Dimethylarsinsäure-NaOH
Carbonat (pK1)
Kohlensäure-NaOH
Citrat (pK1)
Citronensäure-NaOH
Bis-Tris
1,3-Bis(tris(hydroxyethyl)imino)tris(hydroxymethyl)methan-HCl
Imidazol
Imidazol-HCl
MOPS
3-(N-Morpholino)propansulfonsäure-NaOH
Phosphat (pK2)
Phosporsäure-NaOH (H2PO4-/HPO42-)
HEPES
N-2-Hydroxyethylpiperazin-N‘-2-Ethansulfonsäure-NaOH
TEA
Triethanolamin-HCl
Tris
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan-HCl
Tricin
N-(Tris(hydroxymethyl)methyl)glycin
Bicin
Glycin
TAPS
Propansulfonsäure-NaOH
Morpholin
Morpholin-HCl
Borat
Borsäure-NaOH
Ammonium
NH3-HCl
Ethanolamin
Ethanolamin-HCl
CHES
Cyclohexylaminoethansulfonsäure-NaOH
Glycin (pK2)
Gylcin-NaOH (H2N-CH2-CO2- / H3N+-CH2-CO2-)
Carbonat (pK2)
Kohlensäure-NaOH (HCO3-/CO32-)
Phosphat (pK3)
Phosporsäure-NaOH (H2PO42-/HPO43-)
Werte aus Blanchard J.S., Methods Enzymol. 104, 405 ff.
34
pKa
at 25 °C
2.15
3.40
3.75
4.21
4.76
4.76
5.64
6.10
6.27
6.35
6.40
6.46
6.95
7.20
7.20
7.48
7.76
8.06
8.05
8.26
8.40
8.49
9.23
9.25
9.50
9.55
9.78
10.33
12.33
dpKa/dT
0.0044
0.0
-0.0018
-0.0016
0.0003
0.0
-0.011
-0.0055
0.0
0.0
-0.020
0.015
-0.0028
-0.014
-0.020
-0.028
-0.021
-0.018
0.018
-0.008
-0.031
-0.029
0.029
-0.025
-0.009
-0.026