Y Chromosome AZF Analysis System Technical Manual

Transcription

TECHNICAL MANUAL
Y Chromosome
AZF Analysis System
2800 Woods Hollow Rd.
Madison, WI USA
In-vitroDiagnostikum
MDSS GmbH
Schiffgraben 41
30175 Hannover, Deutschland
GEBRAUCHSANLEITUNG
FÜR PRODUKT
Printed in USA
Revised 3/14
MD1631
Part# TM252
TM252DE.0314:TM252.0404.qxd
3/13/2014
8:29 AM
Page 1
Y Chromosome
AZF Analysis System
Technisches Handbuch TM252
GEBRAUCHSANLEITUNG FÜR DAS PRODUKT MD1631.
Unsere gesamte technische Fachliteratur ist im Internet unter www.promega.com zu finden
Um zu gewährleisten, dass Sie die aktuelle Version dieses Technischen Handbuchs verwenden, besuchen Sie
bitte unsere Website.
1.
Verwendungszweck des Produkts.........................................................................................1
2.
Beschreibung ..............................................................................................................................2
3.
Produktkomponenten ..............................................................................................................3
4.
Allgemeine Überlegungen .....................................................................................................3
A. Template DNA-Probe......................................................................................................3
B. Voraussetzungen für die Polymerase-Kettenreaktion (PCR)....................................4
C. Thermocycler ....................................................................................................................4
D. Kontaminationskontrolle ................................................................................................5
E. Kontrollreaktionen ...........................................................................................................5
5.
Amplifikationsreaktionen .......................................................................................................5
A. Reaktionsaufbau...............................................................................................................6
B. Optimales PCR-Thermocycling-Protokoll für den Perkin-Elmer Model 480
Thermal Cycler ................................................................................................................8
C. Agarosegelelektrophorese ..............................................................................................8
D. Datenanalyse—Kontrollen..............................................................................................9
E. Datenanalyse—Versuchsproben..................................................................................10
6.
Literaturangaben......................................................................................................................11
7.
Anhang .....................................................................................................................................11
A. Zusammensetzung der Puffer und Lösungen...........................................................11
B. Arbeitsblätter ..................................................................................................................12
MDSS GmbH
Schiffgraben 41
30175 Hannover,
Deutschland
DEUTSCH
1.
Verwendungszweck des Produkts
Das Y Chromosome AZF Analysis System(a) erfüllt die Anforderungen der EU-Richtlinie
98/79/EG über medizinische Geräte zur In-vitro-Diagnostik. Das Y Chromosome AZF
Analysis System verwendet ein Multiplexverfahren auf PCR-Basis zur Analyse der
Integrität des AZF-Bereichs im humanen Y-Chromosom. Das Y Chromosome AZF
Analysis System ist als Teil der Diagnostik zum Nachweis der Unfruchtbarkeit beim
Mann vorgesehen. Die unter Verwendung dieses Systems erzielten Diagnoseergebnisse
sind in Verbindung mit anderen klinischen Daten bzw. anderen Labordaten zu
interpretieren. Diese Information kann für Patienten dienlich sein, die eine künstliche
Befruchtung in Erwägung ziehen, da Deletionen im AZF-Bereich des Y-Chromosoms an
durch künstliche Befruchtung entstandene männliche Nachkommen weitergegeben
werden und die Unfruchtbarkeit des Kindes zur Folge haben.
Promega Corporation · 2800 Woods Hollow Road · Madison, WI 53711-5399 USA · Toll Free in USA 800-356-9526 · Phone 608-274-4330 · Fax 608-277-2516 · www.promega.com
Printed in USA.
Revised 3/14
Part# TM252
Page 1
TM252DE.0314:TM252.0404.qxd
2.
3/13/2014
8:29 AM
Page 2
Beschreibung
Das Y Chromosome AZF Analysis System ist ein Verfahren zum Nachweis des
AZF-Bereichs des humanen Y-Chromosoms. Das System umfasst 20 zu bereits bestimmten
und kartierten sequenzmarkierten Orten (STS; 1-7) homologe Primerpaare. Diese Primer
amplifizieren in Polymerase-Kettenreaktionen (PCR; 6,8) nichtpolymorphe kurze
DNA-Segmente auf dem Y-Chromosom. Zum Einsatz bei der Multiplex-PCR wurden sie in
fünf Multiplex Master Mix-Sets kombiniert. Das ermöglicht die Bestimmung des Vorliegens
bzw. Fehlens aller 20 STS durch fünf simultane PCR-Amplifikationen (Abbildung 1).
Deletionen des Y-Chromosoms in den durch diese Primer-Sets amplifizierten Bereichen
wurden mit Unfruchtbarkeit beim Mann assoziiert (1, 2, 6, 9-17). Benachbarte Bereiche des
Y-Chromosoms treten in einer einzelnen Multiplex-Amplifikationsreaktion nicht generell als
sequentielle Amplifikationsprodukte auf. Ausnahmen sind SY242 und SY208 des
DAZ-Locus als sequentielle Amplifikationsprodukte von Reaktionen mit dem Multiplex B
Master Mix, sowie SY84 und SY86 der Loci DYS273 bzw. DYS148 als sequentielle
Amplifikationsprodukte von Reaktionen mit dem Multiplex E Master Mix.
Die Multiplex Master Mix-Sets A–D enthalten ein Kontroll-Primerpaar, das Fragmente des
an X gekoppelten SMCX-Locus amplifiziert. Der fünfte Multiplex Master Mix, Multiplex E,
enthält ein Kontroll-Primerpaar, das nur einen bestimmten Bereich in der DNA sowohl des
Mannes als auch der Frau amplifiziert (ZFX/ZFY). Diese Kontroll-Primerpaare dienen als
interne Kontrolle für die Multiplex-Amplifikationsreaktionen und testen die Integrität der
genomischen DNA-Probe. Außerdem enthält der Multiplex E Master Mix ein Primerpaar
zur Amplifikation eines Bereichs des SRY-Gens, das als Kontrollamplifikation für den
Hoden-determinierenden Faktor am kurzen Arm des humanen Y-Chromosoms dient.
A
B
M 1 2 M 3 4
C
M 5 6
D
M 7 8
E
M 9 10 M
500 –
400 –
300 –
– 500
– 400
– 300
200 –
– 200
100 –
– 100
50 –
– 50
4322TA09_3A
bp
Abbildung 1. Beispiel für die Amplifikation der genomischen DNA des Mannes.
Amplifikation der genomischen DNA des Mannes (MD115A) (Bahnen 1, 3, 5, 7, 9) und
DNA-Negativkontrolle (Bahnen 2, 4, 6, 8, 10) für jedes der fünf Multiplex Master Mix-Sets.
Part# TM252
Page 2
Printed in USA.
Revised 3/14
TM252DE.0314:TM252.0404.qxd
3.
3/13/2014
8:29 AM
Page 3
Produktkomponenten
Produkt
Y Chromosome AZF Analysis System
Größe
25 Reaktionen
Kat.-Nr.
MD1631
Nicht zum Verkauf in den Vereinigten Staaten bestimmt. Nur zum Export bestimmt.
Das Y Chromosome AZF Analysis System besteht aus:
Symbolerklärungen
–10°C
–30°C
MD154A
MD155A
MD156A
MD157A
MD158A
M300C
P119F
G452C
MD115A
G190B
Multiplex A Master Mix
Multiplex B Master Mix
Multiplex C Master Mix
Multiplex D Master Mix
Multiplex E Master Mix
GoTaq® DNA Polymerase(c)
Nuclease-Free Water
50bp DNA Step Ladder (340ng/ml)
Male Genomic DNA (50ng/µl)
Blue/Orange 6X Loading Dye
500 µl
500 µl
500 µl
500 µl
500 µl
200 u
1,25 ml
90 µg
2,5 µg
1 ml
Aufbewahrung: Bewahren Sie alle Komponenten bei –10 bis –30°C. Wiederholtes
Auftauen und Einfrieren vermeiden.
MDSS GmbH
Schiffgraben 41
30175 Hannover, Deutschland
4.
In-vitro-Diagnostikum
–10°C
–30°C
Bei –10 bis –30°C
aufbewahren.
<n>
Ausreichend für <n>
Tests
DEUTSCH
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Allgemeine Überlegungen
A.
Template DNA-Probe
Autorisierte Vertretung
Wichtige Gesichtspunkte für den Erfolg des Y Chromosome AZF Analysis Systems
sind Konzentration, Reinheit und Menge der DNA. Eine DNA-Probe schlechter
Qualität kann eine Zunahme des Hintergrunds bzw. ausbleibende Amplifikation
zur Folge haben. Ausbleibende Amplifikation kann sich entweder als völliges
Fehlen der Amplifikation aller Banden bei allen Multiplex Master Mix-Sets bzw. als
Dropout von Allel-Subpopulationen bei einzelnen Master Mix-Sets äußern. Um
dieses zu vermeiden, nur qualitativ hochwertige DNA mit einer A260/A280
Absorptionsrate ≥1,8 verwenden. Die DNA sollte nicht geschnitten und frei von
Proteinkontaminationen, Ethanol oder Salzen sein (insbesondere EDTA; die
EDTA-Konzentration muss <0,4 mM betragen).
Vor der Verwendung im Y Chromosome AZF Analysis System die DNA
quantifizieren, da der Zusatz von sowohl zuviel als auch zuwenig DNA zum
Ausbleiben der Reaktion führen kann. Spektrophotometrische (Absorptions-)
Messwerte von 260 nm (A260) können zur Schätzung der DNA-Konzentration
dienen, wobei 1 Au = 50 µg Doppelstrang-DNA/ml ist. Für jede Multiplex-PCRAmplifikationsreaktion sollten fünfzig Nanogramm DNA verwendet werden. Bei
niedrigen A260/A280 -Raten bzw. Absorptionswerten (unter 0,1) kann die durch
Spektrophotometrie ermittelte DNA-Konzentration überschätzt werden.
Printed in USA.
Revised 3/14
Part# TM252
Page 3
TM252DE.0314:TM252.0404.qxd
3/13/2014
B.
8:29 AM
Page 4
Voraussetzungen für die Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
In Multiplex Master Mix-Sets kann bei der Aufbewahrung bei -20 °C ein
Konzentrationsgefälle auftreten. Nach dem vorschriftsmäßigen Auftauen jedes
Röhrchen vor Gebrauch 10-15 Sekunden lang vortexieren. Das Gerät vor dem
Einsetzen der Reagenzgläser auf 94 °C vorwärmen. Pro Multiplex PCRAmplifikationsreaktion nicht mehr als 1 Einheit GoTaq® DNA-Polymerase
verwenden. Beim Y Chromosome AZF Analysis System beträgt das StandardEndvolumen der PCR 25 µl. PCR-Volumina von 12,5 μl können zum Dropout
mehrerer Banden führen und sind zu vermeiden.
C.
Thermocycler
Das Y Chromosome AZF Analysis System wurde für den Perkin-Elmer DNA Thermal
Cycler 480 entwickelt. Bei Verwendung anderer Thermocycler ist es erforderlich, dass
der Anwender eine protokollkonforme Optimierung und Validierung durchführt.
Zur PCR-Amplifikation nur dünnwandige Reagenzgläser verwenden. In Verbindung
mit dem Perkin-Elmer Model 480 Thermal Cycler dünnwandige GeneAmp® 0,5-mlReagenzgläser verwenden.
1.
Thermocycler mit beheiztem Deckel im Vergleich zu Thermocyclern ohne
beheizten Deckel.
Thermocycler werden sowohl mit beheiztem als auch nicht-beheiztem Deckel
angeboten. Bei Thermocyclern mit nicht-beheiztem Deckel (z.B. Perkin-Elmer
DNA Thermal Cycler 480) ist das Reaktiongemisch mit Mineralöl zu
überschichten, um ein Verdunsten während des Thermocyclings zu
verhindern. Bei Geräten mit beheiztem Deckel kann das Mineralöl
weggelassen werden. Der beheizte Deckel verhindert bei diesen Modellen die
Verdunstung des Reaktionsgemischs während des Thermocyclings. Allerdings
muss der beheizte Deckel immer korrekt funktionieren. Bei der Amplifikation
in einem Thermocycler mit beheiztem Deckel ist das Auftreten von
Kondensation auf der Innenseite des Deckels und im oberen Bereich des
Reagenzglases ein Anzeichen für mangelnde Funktionstüchtigkeit des Deckels
und möglicherweise unzureichende Amplifikationsleistung des Systems.
Bei Zweifeln hinsichtlich der Kalibration des beheizten Deckels oder beim
Autreten von Kondensation im Reagenzglas mit Mineralöl überschichten.
2.
Rampengeschwindigkeit für Aufwärmen/Abkühlen im Thermocycler.
Die Zeit, die ein Thermocycler für den Wechsel zwischen den PCRTemperaturzyklen für Denaturation, Annealing und Elongation benötigt
(häufig als „Rampenzeit“ bezeichnet), kann sich auf die Effizienz der PCRAmplifikation auswirken. Die Geschwindigkeit, mit der ein Thermocycler
zwischen den Temperaturstufen eines PCR-Temperaturzyklus wechselt, hängt
vom jeweiligen Gerätetyp ab. Das beigefügte Protokoll für den Wechsel
zwischen den PCR-Zyklen wurde für den Perkin-Elmer Model 480 Thermal
Cycler optimiert. Werden andere Thermocycler verwendet, muss der
Anwender die Rampenzeiten validieren.
3.
Kalibrierung der Geräte.
Der Erfolg der PCR-Amplifikation ist besonders bei der Multiplex-PCR vom
genauen Thermocycling abhängig. Der mit dem Y Chromosome AZF Analysis
System verwendete Thermocycler muss kalibriert sein.
Part# TM252
Page 4
Printed in USA.
Revised 3/14
TM252DE.0314:TM252.0404.qxd
D.
3/13/2014
8:29 AM
Page 5
Kontaminationskontrolle
Die Vermeidung von DNA-Kontamination der Reaktionsbestandteile ist von
wesentlicher Bedeutung. Zur Kontaminationsvermeidung sollten die Bereiche für
die Prä- bzw. Post-Amplifikation voneinander isoliert, vorzugsweise räumlich
getrennt sein. Immer Pipettenspitzen mit Aerosolsperre, fest zugeordnete Pipetten
für die Zusammenstellung von Reaktionen sowie saubere Einmalhandschuhe
verwenden und die Einschleppung von Verunreinigungen aus Stammlösungen
vermeiden. Arbeitsplätze und Pipetten sind vor und nach dem Gebrauch mit einer
milden Bleichmittellösung zu reinigen.
E.
Kontrollreaktionen
Für jeden Versuch sind entsprechende Kontrollreaktionen unbedingt erforderlich.
5.
1.
Amplifikationsreaktionen mit der mitgelieferten Male Genomic
DNA-Positivkontrolle als Template sollten immer parallel zu den Proben
durchgeführt werden. Eine PCR-Amplifikation der mitgelieferten Male Genomic
DNA-Positivkontrolle sollte immer zu den erwarteten Amplifikationsergebnissen
führen (zu erwartende Größen siehe Abschnitt 7.B, Tabelle 1).
2.
Auch sollte parallel eine negative Kontroll-PCR-Amplifikationsreaktion ohne
DNA erfolgen, um zu gewährleisten, dass die Reagenzien nicht durch DNA
verunreinigt sind. Die PCR-Amplifikation der Kontrollprobe ohne DNA darf
keinerlei Amplifikationsergebnisse aufweisen.
Amplifikationsreaktionen
•
•
•
•
•
•
•
•
DEUTSCH
Vom Anwender bereitzustellende Materialien
(Die Zusammensetzung der Lösungen ist im Anhang, Abschnitt 7.A beschrieben.)
nukleasefreies leichtes Mineralöl
Thermocycler
dünnwandige Reagenzgläser zur Amplifikation
• Mit dem Thermocycler Perkin-Elmer DNA Thermal Cycler 480 dünnwandige
GeneAmp® 0,5-ml-Reagenzgläser verwenden (Applied Biosystems Teile-Nr.
N801-0737, N801-0611 oder N801-0537)
vorgefertigtes Agarosegel: 4 % NuSieve® 3:1 plus TBE-Puffer Agarose vorgefertigte
Reliant® Minigels (Cambrex Kat.-Nr. 54927, 54928 oder 54929)
1x TBE-Puffer
Ethidiumbromid
Pipettenspitzen mit Aerosolsperre
UV-Transilluminator
Printed in USA.
Revised 3/14
Part# TM252
Page 5
TM252DE.0314:TM252.0404.qxd
3/13/2014
A.
8:29 AM
Page 6
Reaktionsaufbau
Abbildung 2 zeigt eine Flowchart-Übersicht über das Reaktionsaufbauprotokoll. Bei
diesem Verfahren werden Aliquote der DNA-Proben in ein Reagenzglas eingefüllt.
Separat wird jedem der Multiplex Master Mixes Taq DNA-Polymerase hinzugegeben.
Anschließend wird der Taq DNA-Polymerase enthaltende Multiplex Master Mix zu
den Reagenzgläsern mit der DNA-Probe gegeben. Jede DNA-Probe wird mit jedem
der fünf Multiplex Master Mixes analysiert.
DNA-Probe
(in Nuclease-Free Water)
auflösen und Kontrollproben ansetzen
Für jeden Multiplex Master Mix je
ein Multiplex Master Mix und
Taq DNA-Polymerase-Gemisch ansetzen
Male
DNA-Probe Genomic DNA
Positivkontrolle
DNA-freie
Negativkontrolle
Reaktionen vorbereiten:
Multiplex
1. DNA- bzw. Kontrollproben
Master Mix
in Reagenzgläser einfüllen.
für jede Probe
2. Multiplex Master Mix und
Taq DNA-Polymerase-Gemisch
hinzugeben.
A
DNAProbe
Positivkontrolle
B
Taq
DNA-Polymerase
für jede Probe
C
D
E
Negativkontrolle
A
B
C
Thermocycling
D
E
3856MA10_2A
Agarosegelelektrophorese
Abbildung 2. Schematische Darstellung des Y Chromosome AZF Analysis System-Assays.
Part# TM252
Page 6
Printed in USA.
Revised 3/14
TM252DE.0314:TM252.0404.qxd
3/13/2014
8:29 AM
Page 7
1.
Multiplex Master Mixes, Nuclease-Free Water und Male Genomic DNA auf Eis
auftauen. Nach dem Auftauen auf Eis aufbewahren. Multiplex Master Mixes vor
der Verwendung 5–10 Sekunden lang vortexieren.
2.
Die untenstehende Tabelle ausfüllen, um die Anzahl der Reaktionen für jeden
Multiplex Master Mix zu bestimmen. Für jede DNA-Probe werden fünf
Reagenzgläser benötigt, je eines für jeden Multiplex Master Mix. Für jeden
Multiplex Master Mix eine Male Genomic DNA Positivkontrolle und eine
Negativkontrolle ohne DNA vorsehen.
Multiplex
Master Mix
A
B
C
D
E
Anzahl der
DNAProben
Positivkontrolle Male
Genomic DNA
1
1
1
1
1
Negativkontrolle
ohne DNA
1
1
1
1
1
Gesamtzahl
Reagenzgläser
3.
Die Anzahl der so ermittelten Reagenzgläser vorbereiten und etikettieren. Zur
Amplifikation nur dünnwandige Reagenzgläser verwenden. Die Reagenzgläser auf
Eis stellen.
4.
In einem separaten Reagenzglas jede DNA-Probe in dem mitgelieferten NucleaseFree Water auf 10 ng/µl verdünnen. Auf dem Vortexer 5–10 Sekunden lang
gründlich mischen. Den entsprechend etikettierten Reagenzgläsern auf Eis 5 µl
verdünnte DNA hinzugeben.
DEUTSCH
Positivkontrolle DNA-Probe: Für die Male Genomic DNA Positivkontrollprobe
Male Genomic DNA durch Zusatz von 6 µl Male Genomic DNA in 24 µl NucleaseFree Water auf 10 ng/µl verdünnen. Auf dem Vortexer 5–10 Sekunden lang
gründlich mischen. Den entsprechend etikettierten Reagenzgläsern auf Eis 5 µl
hinzugeben.
Negativkontroll-Probe ohne DNA: Für die Negativkontrolle ohne DNA den
entsprechend etikettierten Reagenzgläsern auf Eis jeweils 5 µl Nuclease-Free
Water hinzugeben.
5.
Für jeden Multiplex Master Mix fünf Multiplex Master Mix/GoTaq® DNA
Polymerase-Gemische auf Eis ansetzen. Die Multiplex Master Mixes vor dem
Gebrauch vortexieren.
Komponente
Multiplex Master Mix
GoTaq® DNA-Polymerase (5 u/µl)
Endvolumen
Volumen pro
Reaktion
20 µl
0,2 µl
20,2 µl
Volumen pro
10 Reaktionen
200 µl
2 µl
202 µl
6.
Auf dem Vortexer mischen.
7.
Den jeweiligen Reagenzgläsern mit der DNA-Probe oder den Kontrolllösungen auf
Eis 20µl des Multiplex Master Mix/GoTaq® DNA-Polymerase-Gemischs
hinzugeben.
8.
Auf dem Vortexer vorsichtig mischen.
9.
Die Reagenzgläser kurz zentrifugieren, damit sich der Inhalt auf dem Boden der
Gläser befindet. Die Reagenzgläser bis zum Thermocycling auf Eis lagern.
10.
Bei Thermocyclern ohne beheizten Deckel (wie beispielsweise dem Perkin-Elmer
Model 480 Thermal Cycler) ist eine Überschichtung der Reaktionen im
Reagenzglas mit Mineralöl erforderlich. Hierzu die Reagenzgläser leicht kippen,
einen Tropfen Öl auf die Innenwand des Glases geben und hinunterlaufen lassen.
Printed in USA.
Revised 3/14
Part# TM252
Page 7
TM252DE.0314:TM252.0404.qxd
3/13/2014
B.
8:29 AM
Page 8
Optimales PCR-Thermocycling-Protokoll für den Perkin-Elmer Model 480
Thermal Cycler
Das folgende Protokoll wurde für den Perkin-Elmer Model 480 Thermal Cycler
optimiert. Bei Verwendung eines anderen Thermocyclers ist der Anwender für die
Optimierung und Validierung des Protokolls verantwortlich.
Vor dem Einsetzen der Reagenzgläser in das Gerät ist dieses unbedingt auf 94 °C
vorzuwärmen.
Voraussetzungen für
Thermocycler
Reagenzgläser
DNA-Polymerase die Polymerase-Kettenreaktion
(PCR)
Model 480
C.
GeneAmp®
0,5 ml
dünnwandige
Reagenzgläser
GoTaq®
2 Minuten bei 94 °C, dann:
1 Minute bei 94 °C
30 Sekunden bei 57 °C
1 Minute bei 72 °C
35 Zyklen durchführen, dann:
5 Minuten bei 72 °C
4 °C einweichen
DNA
Polymerase
Agarosegelelektrophorese
Für die Elektrophorese und die anschließende optimale Darstellung der
Amplifikationsergebnisse sind 4% NuSieve® 3:1 Plus TBE-Puffer vorgefertigte
Reliant® Minigels (Cambrex Kat.-Nr. 54927, 54928 oder 54929) erforderlich.
1.
Molekulargewicht-Marker wie folgt verdünnen:
Komponente
50bp DNA Step Ladder
Blue/Orange 6X Loading Dye
Nuclease-Free Water
Volumen
12 µl
4 µl
8 µl
2.
Zu jedem Reagenzglas 2,5 µl Blue/Orange 6X Loading Dye hinzugeben und
mischen.
3.
10 µl des verdünnten Molekulargewicht-Markers auf die erste Vertiefung des
Gels aufbringen.
4.
Von jeder Probe 10 µl/Vertiefung aufbringen.
5.
Auf die letzte Vertiefung des Gels 10 µl des verdünnten MolekulargewichtMarkers aufbringen.
6.
Eine Spannung von 5 V/cm (gemessen als Abstand zwischen den Elektroden)
an das in 1X TBE mit 0,5 µg/ml Ethidiumbromid liegende Gel anlegen, bis die
Frontlinie des Bromophenol Blau-Farbstoffs auf den Boden des Gels gewandert ist.
7.
Das Gel mit einem UV Transilluminator fotografieren (320 nm).
Part# TM252
Page 8
Printed in USA.
Revised 3/14
TM252DE.0314:TM252.0404.qxd
D.
3/13/2014
8:29 AM
Page 9
Datenanalyse—Kontrollen
1.
Negativkontrolle ohne DNA: Die Bahnen der Negativkontrollreaktionen ohne
DNA sollten keine spezifischen Amplifikationsergebnisse aufweisen. PrimerInteraktionen können zu Banden mit niedrigem Molekulargewicht oder zum
Auslaufen führen. Bei Amplifikationsergebnissen der Negativkontrollreaktionen
ohne DNA sind die Testresultate als ungültig zu betrachten. Dies ist ein
Anzeichen für eine kontaminierende DNA, und der Versuch sollte sorgfältig
wiederholt werden, um eine Verschmutzung zu vermeiden.
2.
Male Genomic DNA Positivkontrolle: Anzahl und Umfang der
Amplifikationsergebnisse für jeden Multiplex Master Mix sind in Tabelle 1
beschrieben (Abschnitt 7.B). Die Male Genomic DNA Positivkontrollreaktion
sollte für jeden Multiplex Master Mix alle für diesen Master Mix angezeigten
Banden aufweisen (Abschnitt 7.B, Tabelle 1). Die Größenordnung der
Amplifikationsergebnisse kann durch Vergleich mit dem Verlauf des 50 bp
DNA Step Ladder Markers im Gel eingeschätzt werden. Fehlende Banden bei
der Positivkontrolle mit Male Genomic DNA oder markante Nebenbanden
zeigen ein Problem mit den Amplifikationsreagenzien oder dem Thermocycler
an. Fehlt bei der Male Genomic DNA Positivkontrollreaktion eines oder
mehrere der erwarteten Amplifikationsergebnisse, so sind die Testresultate als
ungültig zu betrachten.
3.
Kontrollprimer in Multiplex Master Mixes: Bei den Multiplex A, B, C and D
Master Mix-Reaktionen sollte das niedrigste Amplifikationsergebnis (83 bp)
bei einem X-gekoppelten Locus (SMCX) auftreten. Beim Multiplex E Master
Mix sollten die Gene ZFY/ZFX das höchste (496 bp) Amplifikationsergebnis
aufweisen. Das Fehlen dieser Ergebnisse ist ein Anzeichen für ein Problem bei
der betreffenden Multiplex PCR-Amplifikation. Treten diese Kontrollbanden
bei der Male Genomic DNA Positivkontrolle, nicht aber bei der DNA-Probe
auf, so liegt vermutlich ein Problem mit der als Template verwendeten
genomischen DNA vor. Bei der DNA-Probe können folgende Probleme
auftreten: Vorliegen von Fremdstoffen, ungenaue DNA-Quantifizierung oder
degenerierte DNA. Vor der erneuten Amplifikation das DNA-Template auf
Agarosegel überprüfen. Die Amplifikation für alle Reaktionen der DNA-Probe
wiederholen, bei denen das Kontrollergebnis fehlt. Gegebenenfalls ist die
genomische Template-DNA erneut zu isolieren.
DEUTSCH
Vor der Analyse der Proben ermitteln, ob die Kontrollreaktionen die gewünschten
Ergebnisse gezeigt haben. Die mitgelieferten Arbeitsblätter (siehe Abschnitt 7.B,
Tabelle 1) können für die Analyse der Kontroll- und Versuchsproben verwendet
werden.
Printed in USA.
Revised 3/14
Part# TM252
Page 9
TM252DE.0314:TM252.0404.qxd
3/13/2014
E.
8:29 AM
Page 10
Datenanalyse—Versuchsproben
Die mitgelieferten Arbeitsblätter (siehe Abschnitt 7.B im Anhang) können für die
Analyse der Versuchsproben verwendet werden. Das Vorliegen bzw. Fehlen der
erwarteten PCR-Ergebnisse ermitteln (Abschnitt 7.B, Tabelle 1). Eventuell fehlende
Ergebnisse können im Arbeitsblatt für die Kartierung des Y-Chromosoms
eingetragen werden (Abschnitt 7.B, Tabelle 2). Alle Deletionen sollten aneinander
angrenzen. Fehlen mehrere Amplifikationsbanden und befinden sich diese nicht in
benachbarten Bereichen des Y-Chromosoms (Abschnitt 7.B, Tabelle 2), so handelt es
sich um Dropouts, nicht um Deletionen. In diesem Fall sollte der Test wiederholt
werden. Eine einzige fehlende Amplifikationsbande in einer Probe kann einen
Dropout darstellen und der Test sollte wiederholt werden, um zu bestätigen, dass
der Locus nicht amplifiziert wird. Bitte beachten Sie, dass ein Locus, der in einer
Probe vorliegt, nicht amplifiziert werden kann, wenn in einer der Primerbindungsstellen für den Locus eine Mutation aufgetreten ist. Die mit diesem System
erzielten Diagnoseergebnisse sollten nur in Verbindung mit anderen klinischen
Daten bzw. anderen Labordaten interpretiert werden. Abbildung 3 zeigt ein Beispiel
für die Gelanalyse einer DNA-Probe mit einer Verschiebung der Y-ChromosomDeletion von Kartierungsposition 15 auf Position 20.
A
B
3 M
C
4
5 M
D
6
7 M
E
8
9 M 10
4534TA
1 M 2
Abbildung 3. Beispiel für Gelanalyse einer Y-Chromosom-Deletion. Dargestellt sind die
Amplifikationsergebnisse der Multiplex A–E Master Mix Reaktionen. Jeder Multiplex Master
Mix wird zur Amplifikation von Male Genomic DNA-Proben (MD115A) (Bahnen 1, 3, 5, 7, 9)
und als repräsentative Probe für Y-Chromosom-Deletionen (Bahnen 2, 4, 6, 8, 10) verwendet.
Aus der Amplifikation der Male Genomic DNA-Positivkontrolle resultierende Banden werden
mit denjenigen verglichen, die aus der Amplifikation der genomischen Test-DNA mit
Y-Chromosom-Deletionen hervorgegangen sind (bitte die deletierten Banden in all diesen
Bahnen außer bei Multiplex E beachten). Bei dem Marker (Bahn M) handelt es sich um den mit
dem System mitgelieferten 50bp DNA Step Ladder.
Beobachtet wurde das Auftreten einiger unspezifischer Banden auf dem Agarosegel
oberhalb oder unterhalb der erwarteten Amplifikationen — insbesondere ein
schwaches Band bei Multiplex D bei etwa 150 bp und bei Multiplex E oberhalb der
Kontrolle. Die Negativkontrollen (Probeamplifikationen ohne DNA) dürfen
keinerlei erkennbare PCR-Amplifikationsergebnisse aufweisen. Solange bei den
Negativkontrollen keine PCR-Amplifikationsergebnisse auftreten, haben diese
unspezifischen Banden keinen Einfluss auf die Analyse. Anmerkung: In einigen
Individuen mit bestätigter AZFb Deletion wurde ein positives SY133 Signal
Part# TM252
Page 10
Printed in USA.
Revised 3/14
TM252DE.0314:TM252.0404.qxd
3/13/2014
8:29 AM
Page 11
beobachtet, was darauf schließen lässt, dass der SY133 Locus in diesen Fällen an
einer anderen Stelle auf dem Chromosom liegt.
Literaturangaben
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
7.
Vollrath, D. et al. (1992) The human Y chromosome: A 43-interval map based on
naturally occurring deletions. Science 258, 52–9.
Reijo, R. et al. (1995) Diverse spermatogenic defects in humans caused by Y
chromosome deletions encompassing a novel RNA-binding protein gene. Nature
Genet. 10, 383–93.
Foote, S. et al. (1992) The human Y chromosome: Overlapping DNA clones spanning
the euchromatic region. Science 258, 60–6.
Affara, N. et al. (1996) Report of the second international workshop on Y
chromosome mapping 1995. Cytogenet. Cell. Genet. 73, 33–76.
Kent-First, M.G. et al. (1996) Gene sequence and evolutionary conservation of human
SMCY. Nat. Genet. 14, 128–9.
Kent-First, M.G. et al. (1999) Defining regions of the Y-chromosome responsible for
male infertility and identification of a fourth AZF region (AZFd) by Y-chromosome
microdeletion detection. Mol. Reprod. and Dev. 53, 27–41.
Vogt, P.H. et al. (1997) Report of the third international workshop on Y-chromosome
mapping 1997. Cytogenet. Cell Genet. 79, 1–20.
Skaletsky, H. et al. (2003) The male-specific region of the human Y chromosome is a
mosaic of discrete sequence classes. Nature 423, 825–37.
Pryor, J.L. et al. (1997) Microdeletions in the Y chromosome of infertile men. New
Eng. J. Med. 336, 534–39.
Kent-First, M.G. et al. (1996) The incidence and possible relevance of Y-linked
microdeletions in babies born after intracytoplasmic sperm injections and their
fathers. Mol. Hum. Reprod. 2, 943–50.
Kostiner, D.R., Turek, P.K. and Reijo, R.A. (1998) Male infertility: Analysis of the
markers and genes on the human Y chromosome. Hum. Reprod. 13, 3032–8.
Kuroda-Kawaguchi, T. et al. (2001) The AZFc region of the Y chromosome features
massive palindromes and uniform recurrent deletions in infertile men. Nat. Genet. 29,
279–86.
Lahn, B.T. and Page, D.C. (1997) Functional coherence of the human Y chromosome.
Science 278, 675–80.
Reijo, R. et al. (1996) Severe oligozoospermia resulting from deletions of azoospermia
factor gene on Y chromosome. Lancet 347, 1290–3.
Repping, S. et al. (2002) Recombination between palindromes P5 and P1 on the
human Y chromosome causes massive deletions and spermatogenic failure. Am. J.
Hum. Genet. 71, 906–22.
Saxena, R. et al. (1996) The DAZ gene cluster on the human Y chromosome arose
from an autosomal gene that was transposed, repeatedly amplified and pruned. Nat.
Genet. 14, 292–9.
Simoni, M. et al. (1999) Laboratory guidelines for molecular diagnosis of
Y-chromosomal microdeletions. Int. J. Androl. 22, 292–9.
DEUTSCH
6.
Anhang
A.
Zusammensetzung der Puffer und Lösungen
1X TBE-Puffer
89 mM Tris-Puffer basisch
110 mM Borsäure
2 mM EDTA
Printed in USA.
Revised 3/14
Part# TM252
Page 11
TM252DE.0314:TM252.0404.qxd
3/13/2014
B.
8:29 AM
Page 12
Arbeitsblätter
Tabelle 1. PCR-Amplifikationsergebnis-Profil für Testproben.
Das Vorliegen (+) bzw. Fehlen (–) der PCR-Amplifikationsergebnisse für jede
Versuchsprobe eintragen.
Multiplex A Master Mix
STS
SY254
SY157
SY81
SY130
SY182
Locus
DAZ
DYS240
DYS271
DYS221
KAL-Y
SMCX
Proben (+/–)
Produktgröße (bp)
380
290
209
173
125
83
Kartenposition
18
20
2
11
5
Kontrolle
Produktgröße (bp)
362
274
233
140
83
Kartenposition
7
9
16
17
Kontrolle
Produktgröße (bp)
228
190
143
124
83
Kartenposition
10
6
14
19
Kontrolle
Produktgröße (bp)
177
125
109
83
Kartenposition
12
15
8
Kontrolle
Produktgröße (bp)
496
400
303
232
177
Kartenposition
Kontrolle
1
13
3
4
Multiplex B Master Mix
STS
SYPR3
SY127
SY242
SY208
Locus
SMCY
DYS218
DAZ
DAZ
SMCX
Proben (+/–)
Multiplex C Master Mix
STS
SY128
SY121
SY145
SY255
Locus
DYS219
DYS212
DYF51S1
DAZ
SMCX
Proben (+/–)
Multiplex D Master Mix
STS
SY133
SY152
SY124
Locus
DYS223
DYS236
DYS215
SMCX
Proben (+/–)
Multiplex E Master Mix
STS
SY14
SY134
SY86
SY84
Locus
ZFX/ZFY
SRY
DYS224
DYS148
DYS273
Proben (+/–)
Part# TM252
Page 12
Printed in USA.
Revised 3/14
RBMY1, RBAY2 (Cluster)
DAZ (Cluster)
Page 13
SMCY
DYZ19 (repeat)
8:29 AM
TSPY
AMELY
Centromere
KAL-Y
3/13/2014
SRY
RPS4Y
ZFY
CSF2RA
IL3RA
ANT3
ASMT
XE7
MIC2p
MIC2
TM252DE.0314:TM252.0404.qxd
Yp
Yq
Euchromatin
Heterochromatin
pseudoautosomal
pseudoautosomal
SRY
SRY
DYS271
DYS148
DYS273
KALY
DYS212
SMCY
DYS215
DYS218
DYS219
DYS221
DYS223
DYS224
DYF51S1
DYS236
DAZ
DAZ
DAZ
DAZ
DYS240
proximal AZFc/AZFd
AZFb
AZFc
ZFX
SMCX
SMCX
SMCX
SMCX
ZFY
Control
Multiplex
A
Control
Multiplex
B
Control
Control
Multiplex Multiplex
D
C
Control
Multiplex
E
4320MA09_3A
DEUTSCH
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
SY14
SY81
SY86
SY84
SY182
SY121
SYPR3
SY124
SY127
SY128
SY130
SY133
SY134
SY145
SY152
SY242
SY208
SY254
SY255
SY157
AZFa
Tabelle 2. Arbeitsblatt für Y-Chromosom-Karte. Detaillierte Informationen siehe ergänzende Abbildung 2 von
Literaturhinweis 8. Palindrome 8, 7, 6, 5 und 4 liegen bei SY121 in proximaler und bei SY182 (1) in distaler Richtung. SY121
befindet sich am distalen Rand von P4 (8). AZFb erstreckt sich proximal von P5 zu P1 (8). AZFc enthält P1 und P2 (8).
Mindestens eine Kopie von SY157 erscheint außerhalb der Begrenzung von AZFc. Anmerkung: In einigen Individuen mit
bestätigter AZFb Deletion wurde ein positives SY133 Signal beobachtet, was darauf schließen lässt, dass der SY133 Locus in
diesen Fällen an einer anderen Stelle auf dem Chromosom liegt.
Printed in USA.
Revised 3/14
Part# TM252
Page 13
TM252DE.0314:TM252.0404.qxd
3/13/2014
8:29 AM
Page 14
(a)U.S. Pat. No. 6,242,235, Australian Pat. No. 761757, Canadian Pat. No. 2,335,153, Chinese Pat. No. ZL99808861.7, Hong
Kong Pat. No. HK 1040262, Japanese Pat. No. 3673175, European Pat. No. 1088060 and other patents pending.
© 2012, 2013, 2014 Promega Corporation. All Rights Reserved.
GoTaq is a registered trademark of Promega Corporation.
GeneAmp is a registered trademarks of Roche Molecular Systems, Inc. Reliant is a registered trademark of CBM Intellectual
Properties, Inc. NuSieve is a registered trademark of Lonza Sales AG.
Please contact Promega Technical Services or access our web site at www.promega.com for the most up-to-date information
on Promega products.
Part# TM252
Page 14
Printed in USA.
Revised 3/14

Y Chromosome AZF Analysis System Technical Manual

Transcription

Documents pareils

Verkaufe gut erhaltenen Elektrosegler EasyGlider Pro Elektro von

Download… - Multiplex

Download… - Multiplex

00_Intro_3rd Run_20150129.indd

2. DNA-Fingerprinting

4-Kanal Multiplexer / 4-ch. multiplexer

SMRT – der erste 3. Generation Sequenzgerät