Anleitung - SERVA Electrophoresis GmbH

BlueLine
Instruments for Electrophoresis
GEBRAUCHSANLEITUNG
BlueBlot Wet 100
BlueBlot Wet 200
Tankblot-Gerät
SERVA Electrophoresis GmbH Carl-Benz-Str. 7 D-69115 Heidelberg
Phone +49-6221-138400, Fax +49-6221-1384010
e-mail: [email protected] http://www.serva.de
Inhaltsverzeichnis
1.
Packliste
3
2.
Spezifikationen
3
3.
Betriebsbedingungen
4
4.
Bedienung des Gerätes
4
4.1. Sicherheitsvorkehrungen
4
4.2. Pflege und Wartung der Transferkammer
5
4.3. Durchführung eines Transfers
5
5.
Literatur
9
6.
Empfohlene Produkte für den Proteintransfer
10
Ver. 03/2007
1
Achtung
Dieses Gerät darf nur von geschultem Personal betrieben werden. Wenn es an eine
Stromversorgungsquelle angeschlossen wird, steht es potentiell unter elektrischer
(Hoch-) Spannung, die bei falscher Handhabung gesundheits-gefährdend ist.
Die BlueBlot Blotting-Systeme sind gemäß den gültigen Sicherheitsrichtlinien
hergestellt. Sie sind für die Erreichung bester Ergebnisse im Einklang mit langer
Lebensdauer ausgelegt. Um dies zu gewährleisten, lesen Sie bitte vor Inbetrieb-nahme
die Bedienungsanleitung sorgfältig durch.
Bitte überprüfen Sie nach dem Auspacken an Hand der Packliste, ob die Bestandteile des
Gerätes vollständig sind, und ob das Gerät unbeschädigt ist. Sollte dies nicht der Fall sein,
benachrichtigen Sie bitte sofort SERVA Electrophoresis GmbH in Heidelberg bzw. den
zuständigen Distributionspartner, um eine reibungslose Berichtigung zu gewähren.
Die Garantiezeit beträgt 12 Monate und beginnt mit der Auslieferung.
Wir bitten Sie, die Verpackungsmaterialien bis zu dem Ablauf der Garantiezeit
aufzubewahren.
2
1. Packliste
BlueBlot Wet 100
Kat.-Nr.: BB100
Anzahl
1
4
4
1
Beschreibung
Haupteinheit
Gelkassetten
Schwammeinlagen (2)
Bedienungsanleitung
Kat.-Nr.
BB100-2
BB100-3
BlueBlot Wet 200
Kat.-Nr.: BB200
Anzahl
1
4
4
1
Beschreibung
Haupteinheit
Gelkassetten
Schwammeinlagen (2)
Bedienungsanleitung
Kat.-Nr.
BB200-2
BB200-3
2. Spezifikationen
•
Stabile Acrylglas-Konstruktion.
•
Alle Acrylglas-Nahtstellen sind mit einem Spezialkleber verbunden.
•
Doppelt isolierte Stromkabel, bemessen für bis zu 3000 Volt.
•
Vergoldete Steckanschlüsse, korrosionsfrei, Sicherheitsbemessung für bis zu 1000 Volt.
•
In dem Deckel integrierte, zurückversetzte Anschlüsse.
•
Elektroden aus reinem Platindraht (0,2 mm Durchmesser).
•
Elektroden können einfach vom Anwender ausgetauscht werden.
•
Einfach zu bedienende Klammerverschlüsse zum Verschließen der Gelkassetten.
3
3. Betriebsbedingungen
Ca. Puffervolumen
Anzahl an Kassetten
Max. mögliches Gelformat
Max zulässige Spannung
Max. zulässiger Strom
BB100:
BB200:
1100 ml
4
8,5 x 9 cm
500 Volt
2 Amp.
4500 ml
4
14 x 16 cm
500 Volt
2 Amp.
Geeignetes Umfeld:
•
Diese Geräte sind nur für den Gebrauch in geschlossenen Räumen einzusetzen.
•
Die Betriebstemperatur beträgt 4 °C bis 65 °C.
•
Für den Betrieb ist empfohlen: Maximale relative Luftfeuchtigkeit bis zu 80 % (bei einer
Temperatur bis 31 °C), linear abnehmend bis zu 50 % relativer Luftfeuchtigkeit (bei einer
Temperatur bis 40 °C), bei maximaler Höhe von 2000 m (NN).
4. Bedienung des Gerätes
4.1.
Sicherheitsvorkehrungen
•
Bitte lesen Sie vor Gebrauch die Bedienungsanleitung.
•
Vor Entfernen des Kammerdeckels die Elektrophorese-Kammer von dem Stromgeber
trennen (Stecker ziehen).
•
Maximal zulässige Spannung und zulässiger Strom dürfen nicht überschritten werden
(siehe "Betriebsbedingungen").
•
Betreiben Sie diese Elektrophoresekammer nicht in einer Metallschale.
•
Beachten Sie das maximal zulässige Volumen des Transferpuffers
(siehe 3. Betriebsbedingungen).
•
Acrylamid ist ein leicht flüchtiges Neurotoxin und krebserregend. Bitte tragen Sie daher
Schutzkleidung.
•
Auch ein auspolymerisiertes Gel enthält noch unpolymerisierte Monomere. Tragen Sie
daher Sicherheitshandschuhe.
•
Bei Austausch der Platinelektrode sollte die Kammer durch einen Sicherheitsbeauftragten
überprüft werden.
4
4.2.
Pflege und Wartung der Transferkammer
•
Um den Kammerdeckel zu entfernen, drücken Sie mit beiden Daumen die Plastik-stege
nach unten und heben Sie parallel dazu den Deckel an.
•
Reinigen Sie vor Gebrauch die Kammer mit destilliertem Wasser.
Wichtiger Hinweis: Acrylplastik ist nicht resistent gegen aromatische oder halogenierte
Kohlenwasserstoffe, Ester, Ketone sowie Alkohole (>30 %) oder Säuren (>25 %). Trocknen
Sie die Elektroden vor Gebrauch mit einem sauberen Papiertuch.
•
Vor Erstbenutzung und in möglichst regelmäßigen Zeitabständen (z.B. 1x per Monat) sollten
Sie die Klebekanten der Kammer auf eventuelle undichte Stellen überprüfen. Hierzu stellen
Sie die Kammer auf ein Papiertuch und füllen sie mit destilliertem Wasser bis zu der
maximalen Füllhöhe. Sie können nun leicht undichte Stellen auf dem Papiertuch erkennen.
Sollte dies der Fall sein, informieren Sie bitte sofort SERVA ELECTROPHORESIS GmbH
in Heidelberg bzw. den zuständigen Distributionspartner.
•
Zur Reinigung der Elektroden darf keine Bürste verwendet werden. Hierfür genügt es, die
Kammer gründlich mit destilliertem Wasser zu spülen.
•
Versichern Sie sich, dass die Elektroden sauber und trocken sind, bevor Sie die Kammer
benützen oder zur Aufbewahrung lagern.
•
Alle Bestandteile nach der Benutzung gründlich mit deionisiertem Wasser spülen und die
Elektrodenverbindungen mit einem sauberen Papiertuch abtrocknen. Benutzen Sie
niemals organische Lösungsmittel.
4.3.
Durchführung eines Transfers
Kühlen und entgasen Sie das benötigte Puffervolumen an Transferpuffer vor
(siehe 3. Betriebsbedingungen, Seite 4). Der Puffer sollte vor Zusatz von SDS entgast werden.
Der am häufigsten eingesetzte Puffer ist der nach Towbin et al., 1997 (Kat.-Nr. 42558, Towbin
Buffer, 10x for Western Blotting):
25 mM Tris
192 mM Glycin
20 % Methanol pH 8,3
Dieser Puffer kann mit oder ohne Zusatz von 0,05 - 0,1 % (w/v) SDS eingesetzt werden.
5
Alternative Transferpuffer enthalten:
48 mM Tris
39 mM Glycin
20 % Methanol pH 9,2
(Bjerrum and Schafer-Nielsen, 1986)
und
10 mM NaHCO3
3 mM Na2CO3
20 % Methanol pH 9,9
(Dunn, 1986)
•
Füllen Sie den Tank zur Hälfte mit Transferpuffer.
•
Verbinden Sie den Kühlwasservorrat mit den Schlauchanschlüssen des Tank-sockels.
•
Legen Sie einen Magnet-Rührfisch in den Tank, um konstante Temperatur während des
Elektrophoresevorgangs zu erhalten.
•
Tragen Sie während dem Zusammenbau der Transferkassettenbestandteile Hand-schuhe
(wie unten beschrieben).
•
Äquilibrieren Sie das Gel im kalten Transferpuffer, um SDS und Salze zu entfernen.
Dadurch kommt es nicht zu Größenveränderungen der Gele während des Transfers und
Wärmeeffekte werden reduziert.
•
Äquilibrieren Sie ein im Gelformat zugeschnittenes Stück Transfermembran in
Transferpuffer für ca. 15 Minuten.
•
Schneiden Sie sechs Stücke Blottingpapier ca. 5mm größer als das Gelformat zurecht und
wässern Sie diese in Transferpuffer.
•
Legen Sie die Schwämme in Transferpuffer. Falls die Schwämme größer sind als das von
Ihnen üblicherweise benötigte Format, schneiden Sie diese auf Ihr Format zu.
•
Machen Sie sich vertraut mit den Kassetten und den zugehörigen Klammern zum Fixieren
des Blot-Sandwiches.
•
Richten Sie das Gel auf drei vorgefeuchteten Blottingpapieren in einer Wanne mit
Transferpuffer aus.
•
Richten Sie die Transfermembran aus und legen Sie diese vorsichtig über das Gel.
Arbeiten Sie von der Mitte aus und lassen Sie die Enden nach und nach herunter-gleiten.
Versuchen Sie nicht die Membran zu verrücken, da es bereits zu einem Transfer kommen
kann. Legen Sie drei weitere Blottingpapiere auf das Sandwich. Benutzen Sie einen
sauberen Glasstab, den Sie vorher in Transferpuffer getaucht haben, um eingefangene
Luftblasen durch Herausrollen zu entfernen.
Setzen Sie das Gel/Membranensandwich in die Klammerkassette wie es unten beschrieben
ist. Beachten Sie die Ausrichtung des Gels in Relation zu der Mem-bran, und benutzen Sie
einen Bleistift oder einen Marker (auf der Klammer), um die + (positive)- Seite (d.h. die
Membranseite) auf der Kassette zu markieren.
•
•
Sandwich in der folgenden Reihenfolge zusammensetzen:
6
1.
Kassette negative Seite
2.
Vorgefeuchteter Schwamm
3.
Drei vorgefeuchtete Blottingpapiere
4.
Gel
5.
Vorgefeuchtete Transfermembrane
6.
Drei vorgefeuchtete Blottingpapiere
7.
Vorgefeuchteter Schwamm
8.
Kassette positive Seite
9.
Klammer zum Zusammenhalten der Kassette
•
Drücken Sie anschließend vorsichtig die Kassettenseiten zusammen und befestigen Sie die
2 Klammern auf der oberen und unteren Kante.
•
Stecken Sie die Kassette mit der Transfermembrane auf der positiven Seite in einen der
Tankschlitze.
•
Fügen Sie noch etwas Transferpuffer hinzu, bis die gesamte Fläche der Kassette bedeckt
ist.
7
•
Schließen Sie den Sicherheitsdeckel und lesen Sie die Laufbedingungen in Tabelle 1.
Beachten Sie, dass diese Bedingungen für Ihre Anwendung optimiert sein sollten. Folgende
Faktoren können den Erfolg des Transfers beinflussen: Gelporosität,
Pufferzusammensetzung und pH, Transferzeit, Transferfelddichte (V/cm),
Molekulargewichtsbereich, Rühren des Puffers und Temperaturkontrolle, Wahl der
Membran und des Deketionssystems. Restliche Salze im Gel könnten eine Erhitzung des
Systems bewirken, deshalb ist eine vorherige Äquilibrierung des Gels mit Transferpuffer
wichtig.
•
Wählen Sie anfänglich ein Puffersystem wie das genannte von Towbin et al (1979), und
führen Sie einen Vorversuch mit Molekulargewichtsmarkern durch. Beginnen Sie mit einer
niedrigen Stromstärke oder Spannung.
Tabelle 1: Transferpuffer und Laufbedingungen:
Transferpuffer
Towbin Puffer
BlueBlot Wet 100
über Nacht
1 Stunde
25 - 40 Volt
50 - 100 Volt
40 - 80 mA
200 - 400 mA
BlueBlot Wet 200
über Nacht
1 Stunde
25 - 40 Volt
50 - 60 Volt
80 - 160 mA
200 - 250 mA
25 - 40 Volt
40 - 80 mA
50 - 100 Volt
200 - 400 mA
25 - 40 Volt
80 - 160 mA
50 - 60 Volt
200 - 250 mA
10
Volt
40 - 80 mA
40 - 80 Volt
200 - 250 mA
10
Volt
80 - 160 mA
50 - 60 Volt
200 - 300 mA
25 mM Tris pH 8,3
192 mM Glycin
20 % Methanol
Bjerrum Puffer
48 mM Tris pH 9,2
39 mM Glycin
20 % Methanol
Dunn Puffer
10 mM NaHCO3
3 mM Na2CO3 pH 9,9
20 % Methanol
•
pH-Wert nicht mit Säure oder Alkali einstellen. Der pH-Wert kann sich entsprechend der
Reinheit der Reagenzien und Genauigkeit des Wiegens leicht verändern. Hin-zugabe von
Ionen könnte eine Überhitzung während des Transfers hervorrufen.
•
Falls Sie einen Säurepuffer wählen, z.B. 0,7 % Essigsäure, verläuft der Transfer umgekehrt
als normal, d.h. von der Anode zu der Kathode. Dieser Puffer eignet sich für IEF Gele oder
basische Proteingele (native).
8
5. Literatur
Towbin, J., Staehelin, T., and Gordon, J. (1979).
Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets:
Procedure and some applications, Proc. Natl., Acad. Sci. USA, 76, 4350-4354.
Bjerrum, O.J. and Schafer-Nielsen, C. (1986).
Buffer systems and transfer parameters for semi-dry electroblotting with horizontal apparatus,
in: Dunn Electrophoresis 1986, 315-327, VCH, Weinheim, Germany.
Dunn, S.D. (1986).
Effects of the modification of transfer buffer composition and the renaturation of proteins in gels
on the recognition of proteins on Western blots by monoclonal antibodies, Anal. Biochem. 157,
144-153.
B.D. Hames (1990).
Blotting Techniques Ch.1, 7.10, p. 85-97.
In: Gel Electrophoresis of Proteins, A Practical Approach, 2nd Edition,
B.D.Hames and D.Rickwood, eds., IRL Press.
Sollten Sie weitere Fragen haben zur SERVA BlueLine, können Sie sich gerne an unseren
Technischen Service in Heidelberg wenden.
Tel.: 06221 - 1384044
9
6. Empfohlene Produkte für den Proteintransfer
Die SERVA Reagenzien für die Elektrophorese unterliegen der ständigen Qualitäts- und
Applikationskontrolle, um optimale Ergebnisse zu gewährleisten. Wir empfehlen den Einsatz
der Reagenzien besonders bei Betrieb der BlueLine Elektrophoresegeräte, da die Qualität der
Verbrauchsmittel auf die Geräte abgestimmt ist (Applikationstest).
Produkt
Glycin analytical grade
Kat.-Nr.
23390
Tris
37190
Sodium Dodecyl Sulfate
20760
Sodium Dodecyl Sulfate in pellets
20765
Methanol für HPLC
Towbin Buffer 10X, for Western Blotting
Nitrocellulose NC 45, 0,45 µm
45630
42558
42516
Nitrocellulose NC 45, 0,45 µm
71208
Nitrocellulose NC 2, 0,2 µm
71223
Nitrocellulose NC 2, 0,2 µm
71224
SERVA Fluorobind, PVDF, 0,2 µm
42572
SERVA Fluorobind, PVDF, 0,2 µm
42573
SERVA Fluorobind, PVDF, 0,2 µm
42571
SERVA Nylon-Bind A, amphoteric, 0,2 µm
42566
SERVA Nylon-Bind A, amphoteric, 0,45 µm
42517
SERVA Nylon-Bind A, amphoteric, 0,45 µm
42564
SERVA Nylon-Bind A, amphoteric, 0,45 µm
42567
SERVA Nylon-Bind A,amphoteric, 0,45 µm
42568
10
Abpackung
100 g
500 g
1 kg
5 kg
250 g
1000 g
5 kg
100 g
250 g
1 kg
100 g
250 g
1 kg
2,5 l
1l
10 Blätter
8,8 x 8,8 cm
1 Rolle
30 cm x 3 m
5 Blätter
20 x 20 cm
1 Rolle
30 cm x 3 m
10 Blätter
20 x 20 cm
20 Blätter
10 x 10 cm
1 Rolle
25 cm x 3 m
1 Rolle
30 cm x 3 m
10 Blätter
8,0 x 8,3 cm
20 Blätter
10 x 10 cm
1 Rolle
30 cm x 3 m
10 Blätter
20 x 20 cm
Produkt
SERVA Nylon-Bind B, positive, 0,45 µm
Kat.-Nr.
42518
SERVA Nylon-Bind B, positive, 0,45 µm
42565
SERVA Nylon-Bind B, positive, 0,45 µm
42569
SERVA Nylon-Bind B, positive, 0,45 µm
42570
Fluorobind Membrane, PVDF, 0,2 µm
42571
Fluorobind Membrane, PVDF, 0,2 µm
42572
Fluorobind Membrane, PVDF, 0,2 µm
42573
Immobilon™-P-membrane, PVDF, 0,2 µm
42574
Immobilon™-P-membrane, PVDF, 0,2 µm
42579
Abpackung
10 Blätter
8,0 x 8,3 cm
20 Blätter
10 x 10 cm
1 Rolle
30 cm x 3 m
10 Blätter
20 x 20 cm
1 Rolle
25 cm x 3 m
10 Blätter
20 cm x 20 cm
20 Blätter
10 cm x 10 cm
1 Rolle
26,5 cm x 3,75 m
10 Blätter
9 cm x 12 cm
Weitere Produkte für die Elektrophorese finden Sie im SERVA Electrophoresis Hauptkatalog,
den wir Ihnen auf Wunsch gerne zusenden.
11