Aus der Klinik für kleine Klauentiere und forensische Medizin und

Transcription

Aus der Klinik für kleine Klauentiere und forensische Medizin
und Ambulatorischen Klinik
der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Vergleich von Methoden zum Nachweis von
Mycoplasma hyopneumoniae-Infektionen beim Schwein
sowie epidemiologische Untersuchungen über die Verbreitung der
Enzootischen Pneumonie im Weser-Ems Gebiet im Jahre 1996
INAUGURAL-DISSERTATION
Zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Elke Hiltermann-Linden
aus Dissen a. T. W.
Hannover 2004
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. M. Ganter
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. M. Ganter
2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Th. Blaha
Tag der mündlichen Prüfung: 24.11.2004
Meiner Familie
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung
9
2 Schrifttum
10
2.1 Mycoplasma (M.) hyopneumoniae
2.1.1 Ätiologie
2.1.2 Epidemiologie
2.1.3 Pathogenese
2.1.4 Klinik
2.1.5 Immunität
2.1.6 Pathologie
2.1.7 Diagnose
2.1.7.1 Nachweis spezifischer Antikörper
2.1.7.2 Immunfluoreszenztest
2.1.7.3 Kultureller Nachweis des Erregers
2.1.7.4 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
2.1.8 Bekämpfung
2.1.8.1 Sanierungsverfahren
2.1.8.2 Impfung
2.1.8.3 Therapie
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3 Material und Methode
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3.1 Chemikalien und Reagenzien
3.2 Geräte und Hilfsmittel
3.3 Lösungen
3.4 Antigen für den TiHo-ELISA
3.5 Hyperimmunseren für den Immunfluoreszenztest
3.6 Probenmaterial und –auswahl
3.7 Vergleich der serologischen Testsysteme
3.7.1 Enzyme Linked Immunosorbent Assay des Instituts für
Mikrobiologie und Tierseuchen der Tierärztlichen Hochschule Hannover
(TiHo-ELISA)
3.7.2 DAKO Mycoplasma hyopneumoniae ELISA (DAKO-ELISA)
3.7.3 Chekit-Hyoptest I nach Dr. Bommeli (Bommeli I-ELISA)
3.7.4 Chekit-Hyoptest II nach Dr. Bommeli (Bommeli II-ELISA)
3.8 Vergleich der unterschiedlichen Methoden zum Nachweis von
M. hyopneumoniae-Infektionen
3.8.1 Vergleich der Serologie mit dem Immunfluoreszenztest und der Kultur
3.8.1.1 Nachweis von M. hyopneumoniae in Lungen mit dem indirekten
Immunfluoreszenztest
3.8.2 Vergleich der Serologie und des Immunfluoreszenztests mit der Sektion
3.9 Epidemiologische Untersuchung
3.9.1 Kartographierung der Betriebe
3.10 Vergleich der Epidemiologie von M. hyopneumoniae mit denen von
Actinobacillus pleuropneumoniae (A. pp.) und Influenza
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3.11 Statistische Auswertung
43
4 Ergebnisse
45
45
4.1.1 Analyse von Häufigkeiten qualitativer Daten mit Berechnung von Sensitivität
und Spezifität
45
4.1.2 Konkordanzindex Kappa und Mc-Nemar-Test
46
4.1.3 Regressionsanalyse
47
4.2 Drei verschiedene Nachweismethoden für
M. hyopneumoniae-Infektionen im Vergleich
47
4.2.1 Der indirekte Immunfluoreszenztest
47
4.3 Vergleich des indirekten Immunfluoreszenztests an Lungenproben
mit dem Bommeli II-ELISA korrespondierender Serumproben
48
4.3.1 Überprüfung der Sensitivität und Spezifität des Bommeli II-ELISAs
49
4.3.1.1 Konkordanzindex Kappa und Mc-Nemartest
49
4.4 Vergleich der Serologie mit dem Immunfluoreszenztest und der Kultur
50
4.5 Vergleich der Serologie und des Immunfluoreszenztests mit der Sektion
51
4.5.1 Auswertung der Sektionsprotokolle
51
4.5.2 Vergleich der Ergebnisse der Serologie und des Immunfluoreszenztests mit
den makroskopischen Untersuchungen der Lungen
auf M. hyopneumoniae
52
53
4.6.1 Auswertung der untersuchten Serumproben von Schlachtschweinen
53
4.6.1.1 Scheinbare Intra-Herden-Prävalenz (PN) von M. hyopneumoniae
53
4.6.1.2 Scheinbare Intra-Herden-Prävalenz (PN) von Antikörpern gegen
Influenzavirus A/swine/Bakum/5/95 (H1N1)
53
4.6.1.3 Scheinbare Intra-Herden-Prävalenz (PN) von Antikörpern gegen
54
4.6.1.4 Scheinbare Herden-Prävalenz von M. hyopneumoniae
54
4.6.1.5 Scheinbare Herden-Prävalenz von Antikörpern gegen Influenzavirus
A/swine/Bakum/5/95 (H1N1)
55
4.6.1.6 Scheinbare Herden-Prävalenz von Antikörpern gegen Influenzavirus
55
4.6.2 Einflussfaktoren auf die Intra-Herden-Prävalenzen
55
4.6.2.1 Anzahl und Einfluss der Mastplätze auf die M. hyopneumoniaePrävalenz
56
4.6.2.2 Anzahl und Einfluss der Mastplätze auf Infektionen mit Influenzavirus
57
4.6.2.3 Anzahl und Einfluss der Mastplätze auf Infektionen mit Influenzavirus
58
4.6.2.4 Einfluss der Betriebsform auf die M. hyopneumoniae-Prävalenz
59
4.6.2.5 Einfluss der Betriebsform auf Infektionen mit Influenzavirus
60
4.6.2.6 Einfluss der Betriebsform auf Infektionen mit Influenzavirus
61
4.6.2.7 Einfluss der Einstallungsform auf die M. hyopneumoniae-Prävalenz
61
4.6.2.8 Einfluss der Einstallungsform auf Infektionen mit Influenzavirus
63
4.6.2.9 Einfluss der Einstallungsform auf Infektionen mit Influenzavirus
64
4.6.2.10 Einfluss der Ferkelherkunft auf die M. hyopneumoniae-Prävalenz
65
4.6.2.11 Einfluss der Ferkelherkunft auf Infektionen mit Influenzavirus
66
4.6.2.12 Einfluss der Ferkelherkunft auf Infektionen mit Influenzavirus
67
4.6.2.13 Einfluss der Produktionsverfahren auf die
M. hyopneumoniae-Prävalenz
68
4.6.2.14 Einfluss der Produktionsverfahren auf Infektionen mit Influenzavirus
71
4.6.2.15 Einfluss der Produktionsverfahren auf Infektionen mit Influenzavirus
73
4.7 Beziehung zwischen Lungenbefundung und dem jeweiligen Testsystem für
M. hyopneumoniae und den beiden Influenzavirus Subtypen
(H1N1) und (H3N2)
74
4.7.1 Beziehung zwischen Lungenbefundung und M. hyopneumoniaeAntikörpernachweisen
74
4.7.2 Beziehung zwischen Lungenbefundung und Influenzavirus H1N1Antikörpernachweisen
75
76
4.8 Geographische Verteilung einzelner Erreger respiratorischer Erkrankungen bei
Mastschweinen
77
4.8.1 Geographische Verteilung von M. hyopneumoniae
77
4.8.2 Geographische Verteilung von Actinobacillus pleuropneumoniae (A. pp.) 79
4.8.3 Geographische Verteilung des
Influenzastammes A/swine/Bakum/5/95 (H1N1)
80
4.8.4 Geographische Verteilung des
Influenzastammes A/swine/Bakum/909/93 (H3N2)
81
Actinobacillus pleuropneumoniae (A. pp.) nach POPPE (1997) und den beiden
Influenzastämmen A/swine/Bakum/5/95 (H1N1) und A/swine/Bakum/909/93
(H3N2) nach SCHENK 2000
82
5 Diskussion
84
5.4 Epidemiologische Studie
5.5 Lungenbefundung
5.6 Geographische Verteilung von M. hyopneumoniae
Actinobacillus pleuropneumoniae nach POPPE (1997) und den beiden
Influenzavirusstämmen A/swine/Bakum/5/95 (H1N1) und
A/swine/Bakum/909/93 (H3N2) nach SCHENK (2000)
84
86
87
88
90
90
6 Zusammenfassung
94
7 Summary
96
8 Literaturverzeichnis
98
91
Abkürzungsverzeichnis
Abb.
A. pp.
Aqua dest.
Aqua tridest.
BALF
bp
-NAD
bzgl.
bzw.
BO II-ELISA
cfu
d. h.
DNA
ELISA
EP
fg
FITC
IFT
Ig
IBA
IVD
Ig PO
kDa
LT
LW
MIRD
M. hyo.
n
ng
P. multocida
PBS
PCR
PRDC
PRRS
RT
®
sm
SPF
Tab.
™
v. a.
v/v
z. B.
Abbildung
Actinobacillus pleuropneumoniae
Aqua destillata (destilliertes Wasser)
Aqua tridestillata (3-fach destilliertes Wasser)
bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit
Basenpaare
-Nicotinamid-adenin-dinucleotid
bezüglich
beziehungsweise
Bommeli II-ELISA
colony forming units
das heißt
Desoxyribonucleid Acid
Enzyme Linked Immunosorbent Assay
Enzootische Pneumonie
femtogramm 10-15
Fluoresceinisothiocyanat
Immunglobulin
Immuno-Binding-Assay
Innovative Diagnostik
Immunglobulin Peroxidase
kiloDalton
Lebenstag
Lebenswoche
Mycoplasma Induced Respiratory Disease
Mycoplasma hyopneumoniae
Anzahl der untersuchten Proben
nanogramm 10-9
Pasteurella multocida
phosphate buffered saline
polymerase chain reaction
Porcine Respiratory Disease Complex
Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome
Raumtemperatur
registered
registered service mark
spezifisch pathogenfrei
Tabelle
trademark
vor allem
volume per volumen
zum Beispiel
9
1 Einleitung
Untersuchungen zur Enzootischen Pneumonie besagen eine weltweite Verbreitung
des Erregers Mycoplasma (M.) hyopneumoniae.
Dieser verursacht erhebliche wirtschaftliche Verluste, v. a. durch eine Verschlechterung der Futteraufnahme sowie Futterverwertung, damit Wachstumsminderung und
somit Verlängerung der Mastdauer. Der ökonomische Verlust resultiert aus einer
komplexen Interaktion zwischen M. hyopneumoniae und anderen Infektionen,
schlechtem Management und schlechten Umweltbedingungen (ROSS 1999).
Da die Ausbreitung der Infektion weder durch eine antibiotische Behandlung noch
durch Impfungen verhindert werden kann, besteht die einzige Möglichkeit, diese
Erkrankung in den Griff zu bekommen, in der Eliminierung infizierter Schweine
(HOWARD und TAYLOR 1985, SCHATZMANN et al. 1996, CALSAMIGLIA und
PIJOAN 1998).
Die exakte Diagnostik ist jedoch ein Problem, da insbesondere Trägertiere oder
chronisch infizierte Tiere mit den gängigen Methoden oft nicht erkannt werden.
Ein Ziel dieser Arbeit ist daher der Vergleich der bisher am häufigsten gebrauchten
Nachweismethoden für M. hypneumoniae in Blut- und Lungenproben.
Ein weiteres Ziel ist die epidemiologische Untersuchung über die Verbreitung von M.
hyopneumoniae an Mastschweinen im Weser-Ems Gebiet aus dem Jahre 1996.
Abschließend sollen die gefundenen Ergebnisse mit den Ausbreitungsmustern von
Actinobacillus pleuropneumoniae (A. pp.) aus der Arbeit von POPPE (1996) und den
Influenzastämmen A/swine/Bakum/5/95 (H1N1) und A/swine/Bakum/909/93 (H3N2)
mit den Daten von SCHENK (2000) aus dem gleichen Probenpool von 1996
verglichen werden.
10
2 Schrifttum
2.1 Mycoplasma (M.) hyopneumoniae
2.1.1 Ätiologie
Die zellwandlosen und daher pleomorphen Mykoplasmen passieren die üblichen
bakteriendichte Filter, da sie mit 0,1-0,3 µm Durchmesser die kleinsten
Mikroorganismen sind, die sich außerhalb von Zellen selbständig vermehren können
(BISPING und AMTSBERG 1988, ROLLE und MAYR 1993, 2002).
Für Mensch und Tier von besonderer Bedeutung ist die Familie der
Mykoplasmataceae, die zur Klasse der Mollicutes und der Ordnung Mykoplasmatales
gehören. Von diesen stellt die Gattung Mycoplasma mit ihren ca. 100 Arten die wohl
wichtigste Gruppe dar.
Mykoplasmen sind überwiegend harmlose Parasiten der Schleimhäute, vor allem im
Respirations- und Urogenitaltrakt, kommen aber auch im Euter und in den Gelenken
vor. Neben den vielen apathogenen Mykoplasmaarten gibt es jedoch viele Spezies,
die als Sekundärerreger bekannt sind, und einige, die als primäre
Krankheitserreger isoliert wurden (ROLLE und MAYR 1993, RAZIN et al. 1998). Für
das Schwein gelten die folgenden vier Arten als bedeutend:
1. M. flocculare
2. M. hyopneumoniae
3. M. hyorhinis
4. M. hyosynoviae
Von besonders großer Bedeutung für das Schwein ist dabei M. hyopneumoniae.
Zwei unabhängig voneinander arbeitende Forschergruppen in England und den
U.S.A. (GOODWIN et al. sowie MARÉ und SWITZER) gelang 1965 der Beweis, dass
dieses Bakterium als der primäre Erreger der Enzootischen Pneumonie der
Schweine anzusehen ist.
Die kulturelle Anzüchtung der Mykoplasmen ist sehr aufwändig, da sie extreme
Nährbodenansprüche stellen, u.a. benötigen sie Bausteine der DNA, Cholesterin,
enthalten in den zugesetzten Tierseren (v.a. Pferdeserum), und Hefeextrakt. Hinzu
kommt die relativ lange Bebrütungszeit von mindestens zehn Tagen (BISPING und
AMTSBERG 1988, ROLLE und MAYR 1993, 2002). Beim Gelingen der Anzucht von
M. hyopneumoniae zeigen sich dann sehr kleine Kolonien mit 0,25–1 mm
Durchmesser (ROLLE und MAYR 1993, 2002), die jedoch nicht wie die meisten
Mykolasmen ein spiegeleiförmiges, d.h. biphasisches Wachstum (WHITTLESTONE
1979), sondern eine homogene Kolonieoberfläche aufweisen.
Die Isolierung von M. hyopneumoniae wird nach WHITTLESTONE (1979) und
ROLLE und MAYR (1993) zudem oft noch durch die Anwesenheit und das schnellere
Wachstum von M. hyorhinis, der nach ROLLE und MAYR (1993) als ein häufiger
Begleiter auf der Bronchialschleimhaut anzusehen ist, erschwert. Seine Beteiligung
am Krankheitskomplex wurde schon 1991 von FALK und Mitarbeitern vermutet, und
ist nach ROLLE und MAYR (2002) mittlerweile nicht mehr auszuschließen.
11
Anhand der typischen biochemischen Merkmale für M. hyopneumoniae, wie der
Sterolabhängigkeit, der Glukosefermentation, einer fehlenden Arginin- und
Harnstoffhydrolyse etc. kann eine Artbestimmung versucht werden, größere
Sicherheit bringt aber (ROLLE und MAYR 2002) die serologische Differenzierung
von Mykoplasmen, wobei das Arbeiten mit DNA-Sonden und der PCR zunehmend
an Bedeutung gewinnt.
2.1.2 Epidemiologie
Die Enzootische Pneumonie ist eine der häufigsten und ökonomisch wichtigsten
Erkrankung der Schweine. Sie ist in der ganzen Welt verbreitet (SIMECKA et al.
1992, MAES et al. 1996, ROSS 1999). Fast 50 % aller Mastschweine weisen
Lungenveränderungen auf, die auf eine Enzootische Pneumonie zurückgehen
(WHITTLESTONE 1972, EICH und SCHMIDT 2000). Dieser Prozentanteil liegt aber
wahrscheinlich höher, denn nach WALLGREN et al. (1993, 1994) werden abgeheilte
Lungenläsionen früher Infektionen bei der Schlachtung oft nicht erkannt und damit
registriert. BERNER (1995) sowie PFÜTZNER und BLAHA (1995) gehen davon aus,
dass ein hoher Prozentanteil deutscher Betriebe mit M. hyopneumoniae infiziert ist.
Dies konnte 1997 durch HORST et al. bestätigt werden. Sie zeigten, dass der Anteil
seropositiver Bestände in den einzelnen Bundesländern bei 75-100 % liegt. In
Belgien beträgt die mittlere Seroprävalenz auf Herdenbasis 88 % (MAES et al. 1999).
In Skandinavien sind die Herden-Prävalenzen mit 39 % im Westen Finnlands
(RAUTIAINEN 1998) und in Dänemark mit 30 % (SØRENSEN et al. 1992b) deutlich
geringer.
Die Infektion mit M. hyopneumoniae erfolgt als Tröpfcheninfektion entweder direkt
durch das Nasensekret kranker Tiere oder über ein Aerosol in der Atemluft
(WHITTLESTONE 1979, LEON et al. 2001). Der Nachweis einer in-utero Infektion
fehlt (DONE 1996). Das Bakterium überlebt besonders gut im Regenwasser bei
niedrigen Temperaturen, also in feucht-kalter Luft, so dass eine Tendenz für
beginnende Ausbrüche im Herbst und Winter zu beobachten sind (GOODWIN 1985).
Neben den klimatischen Bedingungen spielen für die Einschleppung von M.
hyopneumoniae in einen Betrieb, bzw. für die generelle Verbreitung dieser
multifaktoriellen Erkrankung, eine ganze Reihe von weiteren Faktoren eine große
Rolle, wie die Luftübertragung über mehrere Kilometer, der Zukauf subklinisch
infizierter Tiere und der Tiertransport, v. a. von Schlachtschweinen (GOODWIN
1985, STÄRK et al. 1992, 1998, MAES et al. 2000, HEGE et al. 2002).
Unterschiedliche Managementsysteme, das Stallklima sowie eine hohe
Schweinedichte im Bestand bzw. in der Region sind prädisponierend (STÄRK et al.
1992, BERNER 1995, DONE 1996, ROSS 1999). Ein besonderes Infektionsrisiko
stellt dabei (STÄRK et al. 1992, DONE 1996) die Größe und die Entfernung des
nächsten infizierten Nachbarbetriebes dar. Ein weiterer beeinflussender Faktor ist
nach STÄRK et al. (1992) und DONE (1996) die Topographie. Hier bilden so
genannte „Hanglagen“ der Betriebe und isolierte Standorte außerhalb einer
Gemeinde einen gewissen Schutz vor einer Infektion mit M. hyopneumoniae. Nach
BATISTA et al. (2002) kann die Übertragung von M. hyopneumoniae über exponierte
Personen durch das Tragen von betriebseigener Schutzkleidung und Stiefeln sowie
Duschen und Kleiderwechsel zwischen den Bestandsbesuchen verhindert werden.
12
BESKOW und Mitarbeiter (1998) untersuchten die Schnelligkeit der Ausbreitung
einer Mykoplasmeninfektion. Sie kamen dabei zu dem Schluss, dass diese eher von
dem Antikörperstatus der Ferkel bei der Einstallung abhängig zu sein scheint als z.
B. vom Stallklima. Die Schwierigkeit der Bekämpfung der Enzootischen Pneumonie
spiegelt v. a. die jährliche Reinfektionsrate wieder. Sie beträgt nach
WHITTLESTONE (1990) 5–10 %. Im Jahre 2000 lag sie in der Schweiz bei immerhin
2,6 % (HEGE et al. 2002). Als Hauptursache dafür nennen die Schweizer Autoren
den Zukauf von Tieren, aerogene Infektionen und chronisch unentdeckte Infektionen
in der Herde.
Nach SØRENSEN et al. (1994b) können die ersten Symptome einer Infektion in
einer Herde klinische Symptome, positive serologische Befunde oder pneumonische
Läsionen bei der Schlachtung sein. Sehr oft verkompliziert sich eine
Mykoplasmenpneumonie durch bakterielle Sekundärinfektionen (MAES et al. 1996,
SØRENSEN et al. 1997), so dass man in diesem Zusammenhang besser von der
Mycoplasma Induced Respiratory Disease (MIRD) spricht (BÆKBO et al. 1994,
PFÜTZNER und BLAHA 1995, ROLLE und MAYR 2002). Nach CLARK (1999)
beschreibt der Name Porcine Respiratory Disease Complex (PRDC) die Erkrankung
noch treffender, denn Viren, hauptsächlich das Influenza-Virus, das PRRS (Porcine
Respiratory and Reproductive Syndrome)-Virus und das PRC (Porcine Respiratory
Corona)-Virus, initiieren den Lungenschaden. M. hyopneumoniae verstärkt die
bakteriellen Sekundärinfektionen, und es entsteht eine sehr ernste respiratorische
Erkrankung. So soll M. hyopneumoniae selbst nach Untersuchungen von THACKER
et al. (1999) sowie OPRIESSNIG und HALBUR (2004) die Schwere und Dauer einer
PRRS-induzierten bzw. einer PCV2 (Porcine Circo-Virus Type 2)-induzierten
Viruspneumonie potenzieren. Neuere Untersuchungen von THANAWONGNUWECH
und THACKER (2003) ergaben unter anderem einen signifikanten Anstieg des
Cytokins Interleukin-12 (Il-12) in Schweinen mit beiden Infektionen. Dadurch könnte
ihrer Meinung nach die Fähigkeit des Immunsystems beeinträchtigt werden, PRRS
aus der Lunge zu eliminieren. Dies würde die verlängerte Präsens von PRRS und die
Verstärkung der Pneumonie in dualinfizierten Schweinen erklären. Nach
Untersuchungen von THACKER et al. (2001) wird dagegen eine InfluenzaVirusinfektion im Gegensatz zur PRRS-Virusinfektion nicht von M. hyopneumoniae
potenziert. ROSS und Young (1993) konnten wiederum in ihren Untersuchungen
zeigen, dass eine Anfälligkeit der Schweine für Actinobacillus pleuropneumoniae (A.
pp.) durch eine M. hyopneumoniae-Infektion verstärkt wird.
Dabei führen nicht nur offensichtliche Pneumonien, sondern auch subklinische
Infektionen durch Reduktion der Wachstumsrate und der Futterverwertung, zu
erheblichen wirtschaftlichen Einbußen (POINTON et al. 1985, STRAW et al. 1989,
REGULA et al. 2000). In diesem Zusammenhang scheinen besonders
Sekundärinfektionen und Umweltfehler eine besondere Rolle zu spielen
(RAUTIAINEN et al. 2000b, ESCOBAR et al. 2002). CLARK et al. 1991 schätzen,
dass die Enzootische Pneumonie der nordamerikanischen Schweineindustrie Kosten
in Höhe von $ 200 Millionen bis zu $1 Milliarde jährlich verursachen. Nach ROSS
(1999) ist der ökonomische Verlust assoziiert mit dieser Erkrankung das Resultat
einer komplexen Interaktion zwischen den Mykoplasmen und anderen Infektionen,
schlechtem Management und schlechten Umweltbedingungen.
Nach CLARK et al. (1991) übertragen erkrankte oder infizierte Sauen M.
hyopneumoniae auf wenigstens einige ihrer Ferkel. Die Sau ist allerdings nicht als
Hauptübertragungsquelle anzusehen (SHELDRAKE et al. 1990, ROSS 1992, 1999).
Als eine weitere Möglichkeit ist die Übertragung zwischen Wurfgeschwistern und
zwischen den Würfen in der Aufzuchtphase anzusehen. Eine besonders wichtige
13
Stellung nimmt die Infektion der Mastläufer, vorwiegend durch ältere Mastschweine,
ein (CLARK et al. 1991). Wie schon GROßE BEILAGE (1999) zeigen konnte,
verdeutlichen auch die Untersuchungen von RAUTIAINEN et al. (2000b) die
Bedeutung der erst im Verlauf der Mast erfolgenden Ausbreitung der M.
hyopneumoniae-Infektion. In zwei Mastbeständen stieg die Seroprävalenz von
anfänglich 6 auf 54 % bzw. von 31 auf 81 % respektive zum Ende der Mastperiode.
Nach ROSS (1992, 1999) trägt die lange Inkubationsperiode, die langsame
Ausbreitung der Organismen in den Würfen, die Zunahme der Tierdichte, die
Ausbreitung anderer infektiöser Keime und Umweltfaktoren dazu bei, dass nach dem
Absetzen die Prävalenz der M. hyopneumoniae-Erkrankung bei Läufer und
Mastschweinen am höchsten ist. RAUTIAINEN et al. (2001) stellten fest, dass v.a.
geschlossene Betriebe und Mastbetriebe mit kontinuierlicher Belegung ein
konstantes Risiko für eine M. hyopneumoniae-Infektion auf andere Herden, durch
Tiertransport, Verkauf von Mastläufern und enger Nachbarschaft der Betriebe,
darstellen.
2.1.3 Pathogenese
M. hyopneumoniae produziert eine chronische, lymphohistiozytäre Bronchopneumonie bei Schweinen (THACKER et al. 1999). Nach natürlicher Infektion reicht
die Inkubationszeit von 10-16 Tagen bis zu 3-5 Monaten (BETTS 1952, GOODWIN
1984) und scheint damit abhängig von der Antigendosis zu sein (BARFOD 1994).
Nach experimentell induzierter Infektion liegt die Inkubationszeit gewöhnlich bei 7-10
Tagen (WHITTLESTONE 1985).
Die Tröpfcheninfektion führt zu einer bronchogenen Ausbreitung und zur Anheftung
des Erregers an die Oberflächen des Flimmerepithels von Trachea, Bronchien und
Bronchiolen (ROLLE und MAYR 1993, 2002). KWON und Mitarbeiter (2002) konnten
im Rahmen eines Infektionsversuches durch in situ Hybridisation die DNA von M.
hyopneumoniae eine Woche post inoculationem in bronchialen und bronchiolären
Epithelzellen und eine weitere Woche später in alveolären und interstitiellen
Makrophagen und Typ I Pneumozyten nachweisen. Starke Hybridisationssignale
konnten hauptsächlich an der luminalen Oberfläche der Bronchialepithelzellen
entdeckt werden. Wie jedoch schon GOODWIN (1972) vermutete, konnten UTRERA
und Mitarbeiter (2002a) in einem in vitro Versuch in zwei verschiedenen genetischen
Schweinezuchtlinien, die sich im übrigen als sehr resistent gegenüber der
Kolonisierung von M. hyopneumoniae zeigten, Unterschiede in den Ausmaßen der
von Mykoplasmen besetzten Tracheen zwischen Ferkelwürfen feststellen. Des
Weiteren schien auch das Geschlecht der Tiere bei der Ausprägung eine Rolle zu
spielen. Hier bedarf es weiterer Klärung.
Elekronenmikroskopische Untersuchungen ergaben, dass die Mykoplasmen bis ca.
einen Monat nach experimenteller Infektion am zahlreichsten vorliegen, und zwar
hauptsächlich zwischen den Zilien des Bronchiolarepithels und nur selten in den
Alveolen (BERTSCHINGER et al.1972, WHITTLESTONE 1972).
Für die Adhärenz von M. hyopneumoniae an den Zilien scheinen nicht nur
strahlenförmige Fibrillen auf der äußeren Membranoberfläche der Bakterien (TAJIMA
und YAGIHASHI 1982, BLANCHARD et al. 1992) sowie spezielle Strukuren ZHANG und Mitarbeiter konnten dort 1995 ein Adhesin identifizieren - eine Rolle zu
spielen, sondern auch spezifische Strukturen auf der Zilienoberfläche, die als Glykolipidrezeptoren für die Bakterien funktionieren (ZHANG et al. 1994). Nach ZIELINSKI
und ROSS (1993) sind auch unspezifische hydrophobische Interaktionen am
14
Anheftungsprozess beteiligt. Diese zumindest enge Assoziation von M.
hyopneumoniae an das zilientragende Epithel, unterstützt durch die den
Mykoplasmen eigene Pleomorphie durch das Fehlen einer Zellwand (HOWARD und
TAYLOR 1985), scheint die folgende Ziliostase mit Verlust der Zilien zu induzieren
(MEBUS und UNDERDAHL 1977, BLANCHARD et al. 1992, DE BEY und ROSS
1994). Der exakte Zerstörungsvorgang ist noch nicht genau geklärt, u.a. soll auch ein
zytopathischer Faktor, lokalisiert auf der Membran von M. hyopneumoniae (GEARY
und WALCZAK 1985), beteiligt sein. HOWARD und TAYLOR (1985) vermuten
hingegen, dass die Freisetzung von toxischen Produkten zur Zellzerstörung führt.
Durch Desquamation der Epithelzellen, besonders der Alveolarepithelzellen mit
folgendem Mangel des Surfactants (produziert von den Typ II Pneumozyten), kommt
es zur Störung der mukoziliären Clearance. Ein weiterer wichtiger Faktor der
pathogenen Kapazität von M. hyopneumoniae liegt nach ADEGBOYE (1978) in der
Unterdrückung der zellulären Immunabwehr. CARUSO und ROSS konnten 1990
zeigen, dass eine Suppression des Phagozytosepotentials der Alveolarmakrophagen
bei einer Sekundärinfektion auftritt. Hieraus resultiert eine Begünstigung der
Anheftung von Sekundärerregern. In der Regel führt dies zu ausgeprägteren
Erkrankungsformen (CIPRIÁN et al. 1988, AMASS et al. 1994, BERNER 1995,
THACKER et al. 1999).
M. hyopneumoniae hat nicht nur eine immunsuppressive Wirkung sondern auch eine
immunstimulierende (MESSIER et al. 1990) und zwar kommt es durch die Infektion
zu einer zunehmenden Anhäufung von Lymphozyten im perivaskulären und
peribronchialen Raum. Weiterhin induziert M. hyopneumoniae nach neueren
Untersuchungen von ESCOBAR und Mitarbeitern (2002) einen signifikanten Anstieg
des inflammatorischen Zytokins Interleukin-1beta (Il-1 ß) und einen statistisch nicht
ät des
Wirtes trägt zu einem großen Teil an der Entstehung der pathologischen Läsionen
bei.
Über eine mögliche Variabilität der Virulenz von M. hyopneumoniae ist bislang noch
recht wenig bekannt. So stellten ARTIUSHIN und MINION (1996) eine genetische
Heterogenität in den von ihnen untersuchten Feldisolaten von M. hyopneumoniae
fest, konnten aber eine gesicherte Korrelation dieser Heterogenität mit der Virulenz
nicht überprüfen. VICCA und Mitarbeiter (2002a, b) untersuchten das Infektionsmuster von M. hyopneumoniae anhand von fünf klinisch infizierten Herden mit guten
und fünf subklinisch infizierten Herden mit schlechten Haltungs- und
Managementbedingungen. Da die Seroprävalenzen in den klinisch infizierten Herden
höher waren, und sich die meisten Schweine dort in einem jüngeren Alter mit M.
hyopneumoniae angesteckt hatten, folgerten sie, dass eine ziemlich hohe Variation
der Virulenz zwischen den Feldisolaten vorliegt, wie schon ROSS (1996) vermutete.
Virulenzmarker könnte ein 5000 bp Fragment, gewonnen mit der arbitrarily primedPCR (AP-PCR), sein. Weitere Untersuchungen müssen folgen (VICCA et al. 2002a).
2.1.4 Klinik
Die Enzootische Pneumonie ist eine ansteckende respiratorische Erkrankung,
charakterisiert durch einen chronischen Husten, Wachstumsverzögerung, einer
hohen Morbidität von 30 bis 80 % aller Schweine und einer Mortalität, die gegen Null
geht (SIMECKA et al. 1992, MAES et al. 1996, SIEVERDING 2000). Generell sind
Schweine aller Altersklassen anfällig für eine Infektion mit M. hyopneumoniae, wobei
sich die Schweine innerhalb einer Herde gewöhnlich in den aller ersten Lebens-
15
wochen infizieren (GOODWIN und WHITTLESTONE 1967, SIMECKA et al. 1992).
PIFFER und ROSS (1984) untersuchten Ferkel im Alter von 3, 6 und 12 Wochen und
konnten keinen Unterschied in der Anfälligkeit finden, während nach STRASSER et
al. (1992) zwei Wochen alte Schweine nach experimenteller Infektion schwerer
erkrankten als acht Wochen alte Tiere. Gewöhnlich breitet sich die Erkrankung unter
den Tieren langsam aus. Ferkel unter sechs Wochen sind meistens noch nicht
betroffen. Hauptsächlich erkranken Schweine im Alter von drei bis sechs Monaten, d.
h. bei Läufern und Mastschweinen ist die Hustenintensität oft am größten (ROSS
1992, DONE 1996, ROSS 1999), wobei nach BAHNSON et al. (1996) ein spät
einsetzender und lang andauernder Husten mit einer hohen Prävalenz der
Lungenveränderungen zum Mastende korreliert.
Die Dauer der aktiven Infektion wird von WALLGREN et al. 1994 auf ca. 12 Wochen
geschätzt. Der Husten tritt erstmalig 6-21 Tage post infektionem (BERTSCHINGER
et al.1972, WHITTLESTONE 1985, ABIVEN et al. 1990, BEREITER et al. 1990,
KOBISCH et al. 1993, FEENSTRA et al. 1994, SØRENSEN et al. 1997) auf, erreicht
ein Maximum zwischen 3. und 4. Woche (FEENSTRA et al. 1994, SØRENSEN et al.
1994b, 1997) und hört ca. zwei Monate post infektionem auf, bzw. ist danach nur
noch sporadisch zu beobachten (BERTSCHINGER et al. 1972, SØRENSEN et al.
1997) in Abhängigkeit vom Immunstatus des Tieres und dem Herdenmanagement
(MAES et al. 1996). Nach SØRENSEN et al. (1994b) besteht nicht nur eine
Korrelation zwischen dem Auftreten von Husten und der Entwicklung einer
Pneumonie, sondern die Pneumonie verhält sich auch, parallel zur Abnahme des
Hustens, rückläufig.
Eine M. hyopneumoniae-Infektion ist zwar selten unkompliziert, ist dann aber
gewöhnlich subklinisch oder charakterisiert durch einen trockenen, unproduktiven
Husten, der meistens bemerkt wird, wenn die Schweine plötzlich nach einer
Ruheperiode aktiv werden, geringgradigem Fieber und Anorexie (MAES et al. 1996,
RUNNELS 1988). Bei einer Mykoplasmenpneumonie begleitet von einer
Sekundärinfektion, z. B. durch Pasteurella multocida, Bordetella bronchiseptica,
Arcanobacterium pyogenes, Streptococcus- und Staphylococcus-Spezies, aber auch
Wanderlarven von Ascaris suum in der Lunge, ist gewöhnlich ein größerer Anteil der
Lunge betroffen. Dies spiegelt sich meistens in einem mehr feuchten Husten, hohem
Fieber, Anorexie, hochgradiger Atemnot bis hin zu Todesfällen, aber auch ungleiches
Wachstum bzw. Wachstumsstillstand und ein rauhes Haarkleid wieder (RUNNELS
1988, MAES et al. 1996, SIEVERDING 2000). Nach PLONAIT (1988) werden
Schwere und Verlauf dieser Erkrankung dann zu einem großen Teil vom Stallklima
und Infektionsdruck bestimmt.
2.1.5 Immunität
Auf eine M. hyopneumoniae-Infektion folgt eine adequate Immunantwort auf ein
breites Spektrum virulenter Faktoren und zwar nicht nur systemisch, sondern auch
lokal (ROSS und YOUNG 1993). Es kommt zum Aufbau einer Resistenz (KOBISCH
und FRIIS 1996) in den Schweinen. Die Serokonversion tritt dabei ungefähr zur
gleichen Zeit wie der Husten (LEON et al. 2001), bzw. nach SØRENSEN et al.
(1994b) durchschnittlich neun Tage nach Hustenbeginn auf. In dem von BAHNSON
al. (1994) entwickeltem Modell verläuft die Höhe des Antikörpertiters parallel zu den
Lungenläsionen und zum Husten.
Die ersten Serumantikörper können sich schon nach 8-46 Tagen post infektionem
entwickeln, wobei 50 % der untersuchten spezifisch pathogenfreien (SPF)-Schweine
16
innerhalb der ersten drei Wochen serokonvertierten (KOBISCH et al. 1993, BARFOD
et al. 1994, DONE 1996). Der Höhepunkt der Antikörperproduktion ist nach 10-12
Wochen (KOBISCH et al. 1993, DONE 1996) erreicht. Danach erfolgt eine graduelle
Abnahme, und einzelne Immunglobuline können ein bis drei Jahre persistieren
(BEREITER et al. 1990, KOBISCH et al. 1993, DONE 1996, RAUTIAINEN et al.
2000a). Bei einer natürlichen Infektion kann die Serokonversion (SØRENSEN et al.
1993), in Abhängigkeit vom Managementsystem, nach drei bis fünf Wochen
auftreten. Nach Untersuchungen von WALLGREN und SCHWAN (1994)
serokonvertierten vier Monate alte Schweine in einem geschlossenen Zuchtbetrieb
innerhalb 50–70 Tagen nach Einstallung mit älteren infizierten Tieren.
Im Serum können erstmalig zwei Wochen nach experimenteller Infektion Antikörper
der Klasse IgG entdeckt werden (SUTER et al. 1985, STRASSER et al. 1992). Nach
HOLMGREN (1974a) bestanden die Serumantikörper zwei bis vier Wochen post
infektionem aus den Ig-Klassen G und hochmolekularem IgA. In den tracheobronchialen Sekreten zeigten die Immunglobuline der Klassen IgA, IgG, IgM zwei
Wochen post infektionem nach SUTER et al. (1985) erhöhte Werte. Hier erreichten
die Antikörper der IgM- und IgG-Klasse fünf Wochen nach Infektion ihre
Maximalwerte und herrschten somit in der frühen Phase der Infektion vor, während
die Antikörper der IgA-Klasse im Verlauf des achtwöchigen Experiments stetig
zunahmen. Nach MESSIER et al. (1990) bestanden die Antikörper in Lungenspülungen von Schweinen zwei bis sechs Wochen post infektionem hauptsächlich
aus IgG und IgA Isotypen.
Das Kolostrum der Muttersauen besteht in den ersten 6 Stunden nach dem
Abferkeln, neben IgM und IgA, hauptsächlich aus dem Immunglobulin G (KLOBASA
1987). Dieses Kolostrum verleiht den neugeborenen Ferkeln, zumindest bis zu einem
Alter von zwei Wochen, einen kompletten passiven Schutz unabhängig vom Alter
und dem Immunstatus der Sauen (RAUTIAINEN et al. 1998, WALLGREN et al.
1998). Die Persistenz der maternalen Antikörper bezieht sich letztlich auf die Höhe
der Antikörper im Serum der Sauen, deren Höhe auch wiederum vom Alter der Sau
abhängig zu sein scheint (MORRIS et al. 1994, ZIMMERMANN und WEISKOPF
1996) und variiert so zwischen Würfen (WALLGREN et al. 1998). Nach MORRIS et
al. (1994) beträgt die mittlere Halbwertzeit der M. hyopneumoniae-Antikörper 15,8
(8,3-28,4) Tage in Abhängigkeit von der initialen Konzentration der passiv
erworbenen Antikörper im Ferkel. In Bezug auf den Zeitpunkt einer prophylaktischen
Impfung sind dabei an die suppressiven Effekte maternaler Antikörper zu denken
(MORRIS et al. 1994, HODGINS et al. 2002).
Im weiteren Verlauf verfügen Schweine besonders zu Beginn der Mastperiode nur
über eine niedrige Antikörperkonzentration (LEON et al. 2001). Das ist, nach
Untersuchungen dieser Autoren in drei geschlossenen Betrieben, die kritische
Periode für eine Übertragung von M. hyopneumoniae.
2.1.6 Pathologie
Ein bis zwei Wochen nach experimenteller Infektion von Schweinen mit M.
hyopneumoniae können die ersten für eine Mykoplasmenpneumonie typischen
makroskopischen Lungenveränderungen zu sehen sein (WHITTLESTONE 1972,
1985, BLANCHARD et al. 1992, KOBISCH et al. 1993). Im ersten Monat post
infektionem zeigten bei SPF-Schweinen vorwiegend die ventralen Abschnitte der
Spitzen- und Mittellappen verfestigte Bezirke, die farblich von rot bis dunkelrot, über
blaßrot bis blaßgelb zu blaßgrau reichen (BERTSCHINGER et al.1972,
17
WHITTLESTONE 1972, 1985, FEENSTRA et al. 1994). Die meist scharf lobulär
begrenzten Herde waren im Anschnitt saftreich und nicht erhaben. In einigen zeigte
sich lufthaltiges eingesprengtes Gewebe. Nur aus den Bronchien makroskopisch
veränderter Lungenlappen ließ sich trüber, weißlicher Schleim auspressen, der meist
auch in der Trachea zu sehen war. Die Pleura zeigte nie eine Veränderung, und die
Bronchiallymphknoten waren leichtgradig geschwollen (BERTSCHINGER et al.
1972). Die makroskopischen Lungenveränderungen können bei SPF-Schweinen
nach BERTSCHINGER et al. (1972) schon innerhalb von zwei Monaten verschwinden. Länger vorhandene Veränderungen zeigten sich dann als wenig
ausgedehnte band- oder sternförmige Einziehungen der Lungenoberfläche. Nach
KOBISCH und NICOLET (1987) sowie KOBISCH et al. (1993) sind Reparationsvorgänge 7-10 Wochen post infektionem erkennbar. Eine vollständige Abheilung
kann nach WHITTLESTONE (1972, 1985) neun Monate und länger dauern. Nach
Abheilung sind bei makroskopisch negativem Lungenbefund aber histologisch meist
immer noch deutliche Läsionen sichtbar (BERTSCHINGER et al. 1972).
Sehr oft verkompliziert sich diese Lungenerkrankung durch bakterielle
Sekundärinfektionen. Dies kann zu ausgedehnteren Läsionen bis hin zur Perikarditis,
Pleuritis und Abszedierungen (CIPRIÁN et al. 1988, AMASS et al. 1994,
SØRENSEN et al. 1997, SIEVERDING 2000) führen.
Die histologische Untersuchung in der frühen Phase der Infektion zeigt das Bild einer
Pneumonie, charakterisiert durch eine bronchioläre und lymphorretikuläre Hyperplasie mit einer zunehmenden perivaskulären Akkumulation mononuklearer Zellen
(BLANCHARD et al. 1992). Die Bronchiolen und Alveolen enthalten anfangs
polymorphkernige neutrophile Granulozyten. Es kommt zur Proliferation und
Vergrößerung von Alveolarzellen mit Vakuolen im Zytoplasma. Nach
WHITTLESTONE (1972, 1985) ist dies eine der auffälligsten Merkmale der
Enzootischen Pneumonie. Im weiteren Verlauf akkumulieren Lymphozyten,
Histiozyten und Plasmazellen erst im perivaskulären und dann im peribronchiolären
Gewebe. In der etablierten Pneumonie entwickelt sich ein alveoläres Exsudat, und es
kommt zur Proliferation von lymphoretikulärem Gewebe im perivaskulären und
besonders im peribronchiolären Gewebe. Nach HODGES et al. (1969) ist das
alveoläre Exsudat ein signifikantes Merkmal für die Dissemination von M.
hyopneumoniae. DONE (1996) beschreibt dagegen das Vorliegen von Exsudat als
variabel und seinen Untersuchungen zufolge ist es gewöhnlich in unkomplizierten,
einfachen Mykoplasmeninfektionen nicht vorhanden. Die so um Bronchien und
Bronchiolen zirkulär ausgebildeten Infiltratmäntel können die einzelnen Bronchiolen
deutlich einengen und sich häufig auch auf die benachbarten Alveolarsepten
fortsetzen. Diese Infiltratmäntel enthalten in der Regel die eigentlichen Lymphfollikel.
Das zelluläre Exsudat enthält nun weniger polymorphkernige neutrophile Granulozyten, dafür aber mehr Plasmazellen. In den Reparationsvorgängen kommt es
gewöhnlich an den Spitzen der apikalen und kardialen Lungenlappen zu flachen
Fissuren, entstanden aus kollabierten Alveolen neben alveolären Emphysemen. Das
alveoläre Exsudat verschwindet, und die Hyperplasie des Bronchialepithels bildet
sich mit der Zeit zurück (BERTSCHINGER et al.1972, WHITTLESTONE 1972, 1985).
Auch die Sekundärinfektionen führen zu veränderten histologischen Befunden, wie z.
B. einer Betonung der exsudativen Komponente (CIPRIÁN et al. 1988).
Nach HURNIK et al. (1993) hat die makroskopische Beurteilung der Lunge nach M.
hyopneumoniae-verdächtigen Veränderungen, verglichen mit der histologischen
Untersuchung als „Golden Standard“, nur eine Sensitivität von 76 % und eine
Spezifität von 71 %.
18
2.1.7 Diagnose
Klinische Symptome einer M. hoypneumoniae-Infektion erlauben nur eine Verdachtsdiagnose. Die Lungenläsionen sind zwar charakteristisch, aber nicht pathognomonisch (ROSS 1992, ARMSTRONG 1994, ROSS 1999). ZIMMERMANN et al.
(1989) sowie ZIMMERMANN (1990) sind der Überzeugung, dass Mischmastversuche, Kontrollschlachtungen und die ELISA-Serologie für eine sichere Diagnose
ausreichen und sogar latente Infektionen aufdecken können. Nach ARMSTRONG
(1994) wird für die definitive Diagnose der Enzootischen Pneumonie ein positives
Ergebnis in der Immunfluoreszenz oder ein kultureller Erregernachweis gefordert.
ROSS (1996) empfiehlt für die Diagnose bei dem Ausbruch einer akuten Infektion im
Rahmen der PRDC die ELISA-Serologie, und zwar die Anfertigung eines Serumprofils zur Dokumentation der Antikörper und des Antikörper-Titeranstiegs bei
gleichzeitigem Anstieg der klinischen Symptome. Für die Bestätigung der Diagnose
sollte die Histopathologie verbunden mit dem Immunfluoreszenztest angewendet
werden.
Folgende Laboruntersuchungen stehen für einen Antikörper- bzw. Erregernachweis
zur Verfügung.
2.1.7.1 Nachweis spezifischer Antikörper
Für den Nachweis von spezifischen Antikörpern sind verschiedene Testsysteme
entwickelt worden, u. a. sind das der indirekte Hämagglutinationstest, die
Komplementbindungsreaktion und der Enzyme Linked Immunosorbent Assay
(ELISA). Vergleichsuntersuchungen der verschiedenen Techniken sind mehrfach
unternommen worden.
So zeigte sich der indirekte Hämagglutinationstest relativ unsensitiv bei der
Untersuchung von kontaktinfizierten Schweinen und technisch umständlich und war
damit ungeeignet als praktischer Feldtest (ARMSTRONG et al. 1983, FREEMAN et
al. 1984b, FELD et al. 1992).
Mit der Komplementbindungsreaktion können v. a. frühe Antikörper gegen M.
hyopneumoniae nachgewiesen werden (ARMSTRONG et al. 1983, BEREITER et al.
1990), aber für den Nachweis der späten Antikörperantwort war sie am
unzuverlässigsten (ARMSTRONG et al. 1983, MORI et al. 1987). Für beide
Testsysteme konnten FREEMAN et al. (1984a) Kreuzreaktionen zwischen M.
hyopneumoniae, M. flocculare und M. hyorhinis feststellen.
Letztlich stellte sich der ELISA als der sensitivste und als der am einfachsten
handzuhabende diagnostische Test heraus (ARMSTRONG et al. 1983, PIFFER et al.
1984, KOBISCH und NICOLET 1987, FELD et al. 1992, KENNY 1992, SØRENSEN
et al. 1992a, 1992b). Auch eine Untersuchung von Kolostrumproben ist mit dem
ELISA möglich (NICOLET et al. 1990, SØRENSEN e t al. 1992a, 1992b, LEVONEN
1994). Von Vorteil ist dabei, dass im Kolostrum eine z. T. bis zu fünf mal höhere
Antikörper-Konzentration vorliegt als im Serum. Daher ist die Kolostrum-Serologie für
die Herdenkontrolle von Bedeutung (CHASTTONAY 1988, SØRENSEN et al. 1992a,
YAGIHASHI et al. 1993, MORRIS et al. 1994, RAUTIAINEN et al. 2000a). Der ELISA
hat viele Vorteile, aber er ist abhängig von der Fähigkeit des Schweins, die für ihn
spezifischen Antikörper zu produzieren (SIMECKA et al. 1992). Weiterhin zeigten
sich auch beim ELISA Kreuzreaktionen zwischen M. hyopneumoniae und den
obengenannten Mykoplasmen sowie M. hyosynoviae (FREEMAN et al. 1984a). Je
nach Testsystem und abhängig vom Versuchsaufbau sind Antikörper gegen M.
19
hyopneumoniae erstmals ab dem 8. Tag bis zu sieben Wochen und längstens bis zu
ein bis drei Jahren nachweisbar (ARMSTRONG et al. 1983, BEREITER et al. 1990,
BARFOD et al. 1994, LE POTIER et al. 1994, FUTO et al. 1995, WALLGREN et al.
1996, RAUTIAINEN et al. 2000a). Da jedoch nicht jedes mit M. hyopneumoniae
subklinisch infizierte Schwein bzw. Trägertier einen mit diesem Testsystem
detektierbaren Antikörper-Titer aufweist, ist der ELISA ungeeignet für die Einzeltierdiagnostik und damit für Eradikationsprogramme. Für die Herdendiagnostik und
Herdenüberwachung hat er sich jedoch bewährt (RUNNELS 1988, WHITTLESTONE
1990, VAN AKEN und GEERTS 1992, ARMSTRONG 1994).
Eine Verbesserung der Spezifität des von BRUGGMANN et al. (1977) entwickelten
ELISAs, bei dem ein mit Natriumdodecylsulfat gelöster Extrakt von M.
hyopneumoniae als Antigen verwendet wird, konnte erst durch Reinigung dieses
Antigens mit Tween 20 erreicht werden (NICOLET et al. 1980, BOMMELI und
NICOLET 1983). Nach NICOLET et al. (1990) ist dieser Tween 20-ELISA eine sehr
sensitive Methode und erlaubt auch eine Diagnose der Infektion ohne Schwierigkeiten in chronisch infizierten Herden, allerdings nur auf Herdenbasis. SHELDRAKE
und ROMALIS (1992) ermittelten für diesen ELISA auf Einzeltierbasis eine Sensitivität von 95,6 % und eine Spezifität von 98,8 % in Bezug auf die pathologischanatomische Beurteilung der Lunge als „Golden Standard“. Nach Angaben von
ABIVEN et al. (1990) konnten sie zwar schwache Kreuzreaktionen zwischen M.
hyopneumoniae und M. flocculare im Immunoblot belegen, diese hatten allerdings
keine Auswirkungen in Bezug auf falsch-positive Ergebnisse des Tween 20-ELISAs.
BEREITER et al. (1990) konnten dagegen in Seren mit einem hohen Antikörpertiter
gegen M. flocculare schwache Kreuzreaktionen mit dem M. hyopneumoniae-Antigen
im ELISA nachweisen. Beim indirekten ELISA, wie z. B. dem TiHo-ELISA (AMMAR
et al. 1980, SCHERM et al. 2002) und dem kommerziell erhältlichem Chekit®Hyoptest I bzw. II nach Dr. Bommeli, werden Mikrotiterplatten verwendet, die mit dem
Tween 20 gereinigtem Antigen von M. hyopneumoniae beschichtet sind. Beim
Chekit®-Hyoptest ist das Antigen ein Membran-Lysat und für den TiHo-ELISA wird
ein Ganzzell-Antigen verwendet. Nacheinander werden die zu untersuchenden
Serumproben, der zweite mit Peroxidase markierte Antikörper, bei Chekit®-Hyoptest
I und dem TiHo-ELISA ist das Konjugat polyklonal; bei Chekit®-Hyoptest II, einer
Weiterentwicklung Ende der 90iger Jahre im letzten Jahrhundert, monoklonal und
das Enzymsubstrat, mit den jeweiligen Waschschritten dazwischen, aufgetragen. Der
Test ist mit Entstehung des gefärbten Produkts, der Enzymreaktion, beendet, und
das Resultat kann mit Hilfe eines Photometers abgelesen werden. Die Intensität der
Verfärbung ist dabei proportional zur Konzentration der Serum-antikörper. LEVONEN
(1994) ermittelte für den Chekit®-Hyoptest I eine Spezifität von 91,5 % und eine
Sensitivität von 66,7 % auf Herdenbasis in Bezug auf die klinische Untersuchung.
Nach SCHELP1 zeigten interne Untersuchungen der Firma Intervet eine Spezifität
des Chekit®-Hyoptest II mit Proben aus negativen Beständen von 97,2 %. In akut
infizierten Beständen wurden etwa 93 % der Tiere positiv getestet. Bei chronisch
infizierten Herden lag der Anteil positiver Tiere bei etwa 13 %.
Daneben wurde in Dänemark ein Blocking-ELISA entwickelt, der mit Hilfe von
monoklonalen Antikörpern spezifische Proteine der cytoplasmatischen Membran von
M. hyopneumoniae entdecken kann (FELD et al. 1992, DJORDJEVIC et al. 1994, LE
POTIER et al. 1994, FUTO et al. 1995). LE POTIER et al. (1994) konnte mit dieser
Methode und einem 40 kDa Membran-Protein, und FUTO et al. (1995) mit einem
rekombinanten 46 kDa Oberflächenantigen, keine Kreuzreaktionen zwischen M.
1
Persönliche Mitteilung von Dr. Chr. Schelp vom 27.06.03
20
hyopneumoniae, M. flocculare und M. hyorhinis beobachten. Nach WALLGREN et al.
(1996) ist durch den Gebrauch monoklonaler Antikörper das Risiko für Kreuzreaktionen mit anderen Mykoplasmenspezien reduziert worden. Dieser Test ist unter
dem Namen DAKO Mycoplasma hyopneumoniae ELISA auf dem Markt. Hier sind die
Mikrotiterplatten mit dem M. hyopneumoniae-Antigen, einem 74 kDa Protein, beschichtet. Der methodische Ablauf ist der gleiche wie oben beschrieben, außer, dass
zwischen dem Auftragen der Serumproben und dem monoklonalen Konjugat der
Waschschritt entfällt. Dieser 2. markierte Antikörper tritt nun in Konkurrenz zu den
Antikörpern im Serum. Die gemessene Farbintensität ist hier nun umgekehrt
proportional zur Konzentration der Antikörper im Serum. BARFOD und Mitarbeiter
(1994) sowie SØRENSEN und Mitarbeiter (1997) berechneten mit Proben von SPFKontrolltieren für den DAKO-ELISA eine Spezifität von 93-100 %, und eine Sensitivität von 98-100 % mit den Proben von experimentell infizierten Schweinen. Auf
Herdenbasis, anhand klinischer, pathologischer und kultureller Untersuchungen,
konnten SØRENSEN und Mitarbeiter (1992a, b) eine Spezifität von 96 % und eine
Sensitivität von 93 % ermitteln. RAUTIAINEN und Mitarbeiter (1996) errechneten auf
der Grundlage von klinischen und pathologischen Untersuchungen für den DAKOELISA auf Herdenbasis eine Spezifität von 98,7 % und eine Sensitivität von
annähernd 100 %.
Bei dem direkten Vergleich des DAKO-ELISAs mit einem Tween 20-ELISA war der
DAKO-ELISA nach THACKER et al. (2004) und FANO et al. (2004b) die sensitivere
Methode. LEVONEN und Mitarbeiter (1999) verglichen die beiden kommerziellen
Testsysteme Chekit®-Hyoptest und den DAKO-ELISA. Leider ist in ihren
Ausführungen nicht ersichtlich, ob sie den Chekit®-Hyoptest I oder II untersucht
haben. Nach Meinung dieser Autoren sind bei Anwendung beider Tests die
Einteilung der Proben in richtig-positiv und falsch-positiv möglich, da sie sich
ergänzen. In ihren Untersuchungen zeigte sich der DAKO-ELISA auf individuellem
Niveau sensitiver, doch auf Herdenniveau war ihre geschätzte Sensitivität gleich und
hoch genug für eine Eradikation der Erkrankung auf Herdenbasis. Dies entsprach
somit den Angaben der beiden Hersteller, dass es sich um Herdentests handelt.
Basierend auf klinischen, pathologischen und epidemiologischen Folgeuntersuchungen konnten sie anhand individueller Proben für den DAKO-ELISA eine
Spezifität von 99,3 % und für den Chekit®-Hyoptest eine Spezifität von 98 %
bestimmen. Die höhere Spezifität des DAKO-ELISAs erklären sie sich hauptsächlich
durch den unterschiedlichen Aufbau des Testsystems und den Gebrauch von
monoklonalen Antikörpern. Die falsch-positive Kategorie besteht ihrer Meinung nach
aus kontaminierten Proben und so genannten „singleton reactors“, bei denen
Antikörper der IgM Klasse untypisch reagieren.
2.1.7.2 Immunfluoreszenztest
Mit der in den 60iger Jahren des letzten Jahrhunderts von DEL GIUDICE et al.
(1967) entwickelten Fluoreszenz-Antikörper-Methode, war die schnelle Identifizierung
von auf Agar wachsenden Kolonien von Mykoplasmen möglich. Die mit
Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-konjugierten Antiköper wurden auf die Kolonien
aufgebracht, um diese dann nach Inkubation und folgenden Waschschritten unter
dem Fluoreszenzmikroskop zu untersuchen. Die Methode zeigte sich effektiv, da
auch Mischkulturen auf den Primärplatten durch Verwendung homologer Antiseren
erkannt werden konnten. SCHULLER und Mitarbeiter (1976) beschrieben eine weiter
entwickelte Immunfluoreszenz-Technik zur Identifizierung von M. hyopneumoniae-
21
Kolonien. Hierbei wird das Kulturmedium in einer dünnen Schicht auf Objektträger
aufgebracht, die dann mit der Flüssigkultur von M. hyopneumoniae beschickt und
inkubiert werden. Der entscheidende Schritt besteht nun in der Lufttrocknung der
Objektträger mit Hilfe eines Ventilators für 12-14 Stunden. Diese Prozedur fixiert die
Kolonien so dauerhaft, dass sie bei der weiteren Behandlung mit dem Fluoresceinkonjugiertem Antiserum und den Waschschritten mit PBS nicht mehr abgespült
werden können. Kreuzreaktionen mit M. hyorhinis und M. hyosynoviae traten in ihren
Untersuchungen nicht auf. M. flocculare wurde nicht getestet. L’ECUYER und
BOULANGER (1970) sowie MEYLING (1971) wendeten die direkte Nachweismethode für die Diagnose der Enzootischen Pneumonie unter anderem in
Gewebeproben der Lunge an. In den Fällen mit deutlich positiven Befunden ist die
Oberfläche des Epithels der Bronchien und Bronchiolen von einer intensiven, gelbgrünen fluoreszierenden Mykoplasmenschicht bedeckt. In den Untersuchungen von
MEYLING (1971) zeigte sich M. hyorhinis in pneumonisch veränderten Lungen von
Ferkeln in der gleichen Lokalisation, die auch für M. hyopneumoniae typisch ist. Die
ansonsten vergleichbare Fluoreszenz war aber oft reichlicher, und manchmal wurden
Herde von Organismen auch im Alveolargewebe gefunden. Kreuzreaktionen mit M.
hyorhinis oder M. hyosynoviae konnten nicht beobachtet werden. Selbst selten
auftretende Kreuzreaktionen mit M. flocculare sind im Gegensatz zu
WHITTLESTONE (1990) nach FRIIS (1990) von geringer Bedeutung für die
Spezifität des indirekten Immunfluoreszenztests (einer Modifikation) für M.
hyopneumoniae. Nach RUNNELS (1988) ist der Immunfluoreszenztest an
verändertem Gewebe die verlässlichste Untersuchungsmethode, und positive
Ergebnisse sind daher spezifisch und diagnostisch signifikant. Dies konnte
ARMSTRONG (1994) bestätigen. Aber ein negatives Ergebnis besagt nicht, dass
eine M. hyopneumoniae-Infektion nicht vorliegt (ARMSTRONG et al. 1984,
RUNNELS 1988, ARMSTRONG 1994). So konnten L’ECUYER und BOULANGER
(1970) erst ab dem 25. Tag post infektionem M. hyopneumoniae mit dem Immunfluoreszenztest nachweisen. FEENSTRA et al. (1994) sowie SØRENSEN et al.
(1997) konnten zeigen, dass in chronischen Krankheitsstadien diese Methode eine
deutlich geringere Sensitivität besitzt als der kulturelle Nachweis von M.
hyopneumoniae. So lag er nach SØRENSEN et al. (1997) am 57. Tag post
infektionem bei 59-85 % und sank bis auf 11-38 % am 85. Tag nach experimenteller
Infektion. Zwei Gründe für die Schwierigkeit der Diagnostik in den Frühstadien wären
nach L’ECUYER und BOULANGER (1970): die Schwierigkeit repräsentative
Lungenproben zu bekommen, wenn die Gebiete der Lungenveränderungen noch
sehr klein sind, und ein Auswaschen des Antigens aus dem Epithel der Luftwege
während des Immunfluoreszenztests. Dieser Wascheffekt dürfte noch bedeutender
sein in den Frühstadien der Infektion, da der so genannte „Verschluss“ durch das
bronchioläre Exsudat, welches oft die Luftwege in späteren Stadien ausfüllt, fehlt.
Generell kann man aber sagen, dass die Sensitivität des Immunfluoreszenztests von
der Anzahl der Organismen in dem untersuchten Probestück abhängt (L’ECUYER
und BOULANGER 1970, MEYLING 1971, HOLMGREN 1974b, VAN WEES 1987,
FEENSTRA et al. 1994). Nach WHITTLESTONE (1990) sind für ein definitives
positives Ergebnis wahrscheinlich mehr als 104-105 Mykoplasmen/g Gewebe
notwendig. Weiterhin ist auch die Zugänglichkeit dieser Organismen zu den
markierten Antikörpern von Wichtigkeit. Lokale Antikörper, die die Mykoplasmen von
den markierten Antikörpern abschirmen, könnten auch für die schwachen oder
negativen Färbeergebnisse in chronischen Fällen einer M. hyopneumoniae-Infektion
verantwortlich sein (L’ECUYER und BOULANGER 1970, MEYLING 1971,
HOLMGREN 1974b, SCHULLER et al. 1977, FEENSTRA et al. 1994). Daher ist
22
diese Methode wenig geeignet, um Trägertiere oder subklinische Erkrankungen zu
erkennen. Ist die Anzahl von Mykoplasmen aber hoch, wie es in akuten
Krankheitsstadien der Fall ist, liegt seine Sensitivität bei 86-100 % und seine
Spezifität bei 93-100 % verglichen mit dem kulturellen Nachweis (SØRENSEN et al.
1997). In solchen Fällen erweist sich diese schnelle und einfach zu handhabende
Technik als brauchbare Diagnostikmethode (WHITTLESTONE 1990, SIMECKA et al.
1992, ROSS 1992, 1999).
GIGER und Mitarbeiter (1977) sowie DOSTER und LIN (1988) verglichen den
mit
dem
Immunoperoxidase-Test.
Anstelle
von
Fluoresceinisothiocyanat (FITC) werden hier Peroxidase-Enzym-Einheiten an die
Antikörper gekoppelt. Die Untersuchung von GIGER et al. (1977) zeigte eine gute
Korrelation
zwischen
Immunofluoreszenz
und
Peroxidasetest.
Beide
immunologischen Methoden hatten eine hohe Spezifität, d. h. bei positiven
immunologischen Befunden war der Nachweis von M. hyopneumoniae gesichert.
Nach DOSTER und LIN (1988) zeigte sich der Peroxidasetest sensitiver als der
Immunfluoreszenztest, da die Meerrettich-Peroxidase eine Verstärkung der
Chromogenwirkung bewirkte. Geringe Mengen der Erreger, wie bei chronisch
infizierten Trägern oder bei abflauenden Infektionen, führten aber auch zu Problemen
bei der Interpretation ähnlich wie bei der Immunfluoreszenz-Technik. Der Vorteil des
Peroxidasetests liegt jedoch in dem Gebrauch eines gewöhnlichen Labormikroskops
im Vergleich zum relativ teuren Fluoreszenzmikroskop.
2.1.7.3 Kultureller Nachweis des Erregers
Die Isolierung von M. hyopneumoniae ist sehr schwierig und zeitaufwendig
(MCKEAN et al. 1976, WHITTLESTONE 1990, ROSS 1992, 1999), da er sehr hohe
Nährstoffansprüche stellt (ROLLE und MAYR 1993, 2002), und die Kulturansätze
häufig mit bakterieller Kontamination überwachsen waren. Deshalb sollte nach
SCHULLER (1986) eine Isolierung nur bei frischen, d.h. akut veränderten
Gewebeteilen versucht werden. Die Isolierung und Differenzierung kann schon
innerhalb von 7-10 Tagen erfolgen, es kann aber auch 20-30 Tage dauern. Der
Schnitt liegt zwischen 10-21 Tage (WHITTLESTONE 1985, 1990). Eine negative
Beurteilung sollte erst nach mehrwöchiger Inkubation getroffen werden
(WHITTLESTONE 1985). Eine weitere Schwierigkeit in der Kultivierung besteht
darin, dass M. hyopneumoniae häufig von M. hyorhinis, der sich schneller an das
künstliche Medium adaptieren kann, überwuchert wird, wodurch dessen Isolierung
noch schwieriger und zeitaufwendiger wird, und es so zu falsch-negativen
Ergebnissen kommt (FRIIS 1975, SCHULLER et al. 1977, WHITTLESTONE 1985,
ARMSTRONG 1994). Andere Mykoplasmen stören dagegen selten bei der Isolierung
(WHITTLESTONE 1985). Um das schnellere Wachstum von M. hyorhinis zu
unterdrücken, hat sich der Zusatz des Antibiotikums Cycloserin, sowie Antiserum
gegen M. hyorhinis und fünf bis sieben wöchentliche Passagen, nach denen sich M.
hyopneumoniae aber nicht M. hyorhinis weiterhin vermehrt, bewährt (ARMSTRONG
1994, GOI
M. hyorhinis wächst M. hyopneumoniae
etwas besser in nichtselektivem Medium (WHITTLESTONE 1979). Nach FRIIS
(1975), WHITTLESTONE (1979) und ARMSTRONG (1994) sollte die Primärisolierung aus dem Gewebe in flüssigem Kulturmedium erfolgen, da wenig bis kein
Wachstum aus der Inokulation direkt auf festem Medium erfolgt. Da M.
hyopneumoniae ein Säurenbildner ist, wird sein Wachstum durch eine pHWertänderung angezeigt. Die Subkultivierung kann nach Farbumschlag des pH-
23
Indikators in beiden Medien erfolgen. Auf festem Medium erscheinen die ersten
Kolonien nach zwei- bis dreitägiger Inkubation. Im Gegensatz zu den meisten
anderen Mykoplasmen haben die Kolonien von M. hyopneumoniae keinen dunklen
Zentralbereich (FRIIS 1975, WHITTLESTONE 1979). Misslungene Isolierungen
können auch auf kleine Unterschiede zwischen den einzelnen Chargen des
Kulturmediums zurückzuführen sein (WHITTLESTONE 1985). Für die Isolierung von
M. hyopneumoniae haben sich besonders die Selektivmedien, die von FRIIS (1971,
1975) und von GOODWIN (1976) beschrieben wurden, bewährt. Eine weitere
Verbesserung des Friis-Med
-NAD
erreicht werden (ETHERIDGE et al. 1979). Die Identifizierung der Art erfolgt
serologisch anhand des Wachstumshemmtests, des Immunfluoreszenztests an auf
Agar wachsenden Kolonien oder dem indirekten Immunfluoreszenztest an
gewachsenen Kolonien auf einer Filtermembran (ARMSTRONG 1994). Nach
ARMSTRONG et al. (1984) sowie HURNIK et al. (1993) ist die Isolierung von M.
hyopneumoniae nicht nur teuer, sondern die Kulturtechniken sind zudem auch
unzuverläßlich, da viele falsch-negative Ergebnisse auftreten. In den chronischen
Stadien der Infektion sollte die kulturelle Untersuchung jedoch nach SØRENSEN et
al. (1997) als Bestätigung negativer Ergebnisse des indirekten Immunfluoreszenztests, der PCR und des Antigen-ELISAs nach PEDERSEN et al. (1990) dienen.
2.1.7.4 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Die von MULLIS und Mitarbeitern (1986) erarbeitete Methode ist in der Lage, die
DNA lebender Organismen zu vervielfältigen. Ausgangsmaterial ist ein Gemisch an
doppelsträngiger DNA, die die zu vermehrende und als Matrize dienende DNASequenz enthält. Der PCR-Prozess, das so genannte „Amplifizieren“, besteht aus
mehreren Wiederholungen der drei folgenden Schritte. Zunächst wird die
doppelsträngige DNA bei hoher Temperatur in ihre beiden Einzelstränge aufgetrennt.
Danach lagern sich zwei Primer (Oligonukleotide), die komplementär zu den
Randsequenzen des zu vermehrenden DNA-Abschnitts sind, an ihre Zielsequenzen
und dienen der DNA-Polymerase als Startstellen für den letzten Schritt, d. h. für die
Synthese der komplementären DNA-Stränge. Als Endergebnis ist die zunächst sehr
kleine Menge an DNA exponentiell vermehrt und kann, nach Gelelektrophorese
mittels Ethidiumbromidfärbung oder Hybridisierung mit DNA-Sonden, nachgewiesen
werden (MULLIS et al. 1986, MATTSSON et al. 1995). Durch die Detektion von
speziesspezifischen DNA-Sequenzen kann auf die Anwesenheit des gesuchten
Organismus in der Probe geschlossen werden. Seit der Einführung dieser Technik
sind eine ganze Reihe von PCRs entwickelt worden. Die Nachweisgrenze konnte
immer mehr verbessert werden (siehe Tabelle 1). Die bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit und Nasentupfer haben als Untersuchungsmaterial an Bedeutung
gewonnen (SØRENSEN et al. 1997, CALSAMIGLIA et al. 1999, KURTH et al. 2002,
SIBILA et al. 2002), wobei der Nachweis in Nasentupfern selbst mit der nested-PCR
(zwei speciesspezifische Primerpaare werden verwendet) bzw. der neuesten
Entwicklung, der Real-Time-PCR, nicht immer gelingt (RUIZ und PIJOAN 2002,
FANO et al. 2004c, ZEEH et al. 2004). Mit der Weiterentwicklung der nested-PCR ist
man jetzt in der Lage, die kleinste Menge an Organismen aufzuspüren, die
anwesend sein könnte (VERDIN et al. 2000, KURTH et al. 2002). Heute ist es daher
möglich, nicht nur Infektionen im Frühstadium, sondern auch subklinische
Erkrankungen und damit Trägertiere eindeutig zu erkennen (VERDIN et al. 2000,
KURTH et al. 2002). Die Vorteile der PCR liegen nicht nur in der Schnelligkeit,
24
sondern vor allem in der hohen Sensitivität und der hohen Spezifität, da die beiden
Werte bis 100 % erreichen (BAUMEISTER 1996, THOMSON et al. 1996,
SØRENSEN et al. 1997, BAUMEISTER et al. 1998, KURTH et al. 2002). So ist die
nested-PCR in Kombination mit einer Luft-Filtration (STÄRK et al. 1998) für den
Nachweis von Aerosol-Übertragungen geeignet. Ein weiterer Vorteil der PCR liegt
darin, dass auch unkultivierbare Stämme von M. hyopneumoniae bzw. tote oder
beschädigte Organismen, die dann in der Kultur natürlich nicht wachsen, erkannt
werden (BAUMEISTER et al. 1998, CALSAMIGLIA 1999). Nachteilig kann dies
allerdings für die nested-PCR sein, denn aufgrund ihrer hohen Sensitivität ist es
möglich, dass sie in einer kontaminierten Umgebung falsch-positive Ergebnisse
liefert (KURTH et al. 2002). Vorsichtsmaßnahmen sind daher ein wichtiger
Bestandteil für die Durchführung dieser Methode.
Nach CALSAMIGLIA et al. (2001) ist die nested-PCR eine gut geeignete
Untersuchungsmethode, wenn histopathologisch nicht ganz eindeutige Befunde
erhoben werden können. Den Untersuchungen von VERDIN et al. (2000) zufolge ist
die nested-PCR verglichen mit dem Blocking-ELISA und dem Immunfluoreszenztest
signifikant sensitiver.
An die für die Routinediagnostik besser geeignete Real-Time-PCR und an der
multiplex Real-Time-PCR, die eine schnelle und gleichzeitige Entdeckung von
mehreren PRDC-assoziierten Keimen ermöglicht, wird gearbeitet (HARDER und
HUEBERT 2004, KUHNERT et al. 2004, SIBILA et al. 2004).
25
Tab. 1: In der Literatur beschriebene PCRs zum Nachweis von M. hyopneumoniae
Autor
Art der Größe des
Herkunft des Nachweisgrenze Anwendung
PCR
amplifizierten amplifizierten
Produktes
Fragments
STEMKE et al. single- 238 bp
(1994)
stage
Sequenz aus 3 ng DNA
dem 16S-r- = ca. 1000
RNA-Gen
Organismen
DNA von
einem
Laborstamm
und 4
Feldisolaten
von M. hyo.
THOMSON et
al. (1996)
Sequenz aus 500 cfu
dem 16S-rRNA-Gen
Lungenproben
von natürlich
infizierten
Schweinen
single- 230 bp
stage
BAUMEISTER single- 853 bp
(1998)
stage
Unbekannte
Sequenz
CALSAMIGLIA nested- 649 bp + 352 Sequenzen
et al. (1999)
PCR
bp
aus dem
16S-r-RNAGen
VERDIN et al.
(2000)
nested- nicht
Unbekannte
PCR
genanntes
Sequenz
bp-Produkt +
706 bp
10² cfu/ml BALF Bronchoalveoläre
Lavageflüssigkeit von
experimentell
infizierten
SPFSchweinen
80 Organismen Nasentupfer
von natürlich
und
experimentell
infizierten
Schweinen
Ca. 1fg
Tracheo= ca. 1
bronchialOrganismus
lavage und
Nasentupfer
von natürlich
infizierten
Schweinen
2.1.8 Bekämpfung
Nach den Untersuchungen von CLARK et al. (1991) ist ein Rein-RausManagementsystem, verbunden mit einer routinemäßigen Reinigung und
Desinfektion und stabilen Umweltbedingungen, bei Schweinen einer enzootisch mit
M. hyopneumoniae infizierten Herde geeignet, die Entwicklung von Pneumonien zu
26
verhindern und die Gewichtszunahme der Schweine zu erhöhen. Dies belegt die
große Bedeutung optimaler Umwelt- und Managementbedingungen. Daneben erfolgt
die Bekämpfung der Enzootischen Pneumonie über Sanierungsverfahren zur
Eliminierung des Erregers, prophylaktische Impfungen und Gabe von
Chemotherapeutika.
2.1.8.1 Sanierungsverfahren
Schon WALDMANN und RADTKE erkannten 1937 die Vorteile der räumlichen
Isolierung von Sauen und deren Nachkommen und konnten erste Erfolge in der
Bekämpfung der Enzootischen Pneumonie mit Hilfe der so genannten „Riemser
Einzelhüttenanlage“ vorweisen. Das Grundprinzip aller Sanierungsverfahren ist
seitdem die frühe Isolierung der Ferkel von der Sau und anderen Schweinen, um
Übertragungswege für Krankheitserreger zu unterbrechen.
Die extremste Form stellt dabei das spezifisch pathogenfrei (SPF)-Verfahren dar, bei
dem Ferkel per Sectio Cesarea gewonnen, kolostrumfrei und isoliert aufgezogen
werden. Das Ziel ist eine Schweineproduktion im Zucht- und Mastbereich ohne die
Gegenwart von vorher festgelegten schweinespezifischen Krankheitserregern, wozu
auch M. hyopneumoniae gehört. Das SPF-Verfahren wird heute noch in Dänemark
und der Schweiz durchgeführt (BLAHA 1992, ROSS 1992, EICH und SCHMIDT
2000).
Das Medicated early weaning (MEW)-Verfahren wurde von ALEXANDER et al.
(1980) in den U.S.A. entwickelt und dort angewandt, und ist nach PLOMGAARD et
al. (1992) als effektive und günstige alternative Methode zum SPF-Verfahren zu
sehen. Das Ziel ist der Aufbau von Minimal-Disease-Herden, die das SPF-Verfahren
zum Zwecke der Sanierung von Nukleus- oder Vermehrungsherden ersetzt (BLAHA
1992, EICH und SCHMIDT 2000). Die Unterbrechung der vertikalen Erregerübertragung von der Sau auf die Ferkel basiert auf der Verabreichung eines
Medizinalfutters an die Sauen ab dem Eintritt in einen isolierten Abferkelstall bis zum
frühen Absetzen der Ferkel mit 5 Tagen, die dann jeweils in einer isolierten Abteilung
aufgezogen bzw. gemästet werden. Auch die Ferkel werden antibiotisch vom Tag der
Geburt bis zum 10. Lebenstag behandelt. Mit dieser Behandlung blieben die
Schweine bis zur Schlachtung mykoplasmenfrei.
Ein ähnliches Sanierungsprogramm beschreibt MÉSZÁROS et al. (1985). Aber hier
werden die mit 6 Tagen früh abgesetzten, stärkeren Ferkel dann auf eine isolierte
und desinfizierte Farm verbracht und dort aufgezogen und die 2. und 3. Generation
gezüchtet. Auch hier war keines der 2000 untersuchten Schweine in der drei Jahre
dauernden Versuchsperiode mit M. hyopneumoniae infiziert. In den Seren der drei
Tage alten Saugferkel der 2. und 3. Generation ließen sich keine maternalen
Antikörper gegen diesen Erreger nachweisen. HOFMO und LIUM (1998) erreichten
mit dieser Methode in Norwegen die Schaffung einer M. hyopneumoniae- und
Actinobacillus pleuropneumoniae (A. pp)-freien Herde mit Elterntieren, die mit beiden
Erregern infiziert waren. Zusätzlich impften sie vorher alle Tiere gegen A. pp. mit
Pleurinord® und verbrachten die Schweine in einen isolierten Stall vier Wochen vor
dem erwarteten Wurftermin. Die Verabreichung eines Medizinalfutters erfolgte fünf
Tage vor bis fünf Tage nach dem Transport und fünf Tage vor dem erwarteten
Wurftermin bis zum Absetzen der Ferkel mit fünf Tagen. Die Ferkel wurden dann in
einen mehrere km entfernten Stall verbracht und vom Tag der Geburt an bis zum 5.
Tag nach dem Absetzen antibiotisch behandelt. Diese Ferkel bildeten nun die
Grundlage der neuen Herde. Die zwei Jahre dauernde Versuchsperiode wurde mit
27
Hilfe serologischer Untersuchungen überwacht, und es wurden weder Antikörper
gegen M. hyopneumoniae noch gegen A. pp. gefunden.
ZIMMERMANN et al. (1989, 1990) führten in der Schweiz eine erfolgreiche
Teilsanierung in 17 infizierten Herden durch. Ihr Sanierungsprogramm beinhaltete die
Entfernung aller Tiere, die jünger als zehn Monate waren, sowie die Verabreichung
eines Medizinalfutters in einer ferkelfreien Periode von 10-14 Tagen. Ihrer Meinung
nach kann die Teilsanierung als vollwertige Alternative zur Totalsanierung, d. h. dem
Verkauf des ganzen Bestandes und Aufbau einer neuen Herde aus z. B. SPF-Tieren,
betrachtet werden. Im August 1995 begann dann in der Schweiz das landesweite
Tilgungsprogramm gegen die Enzootische Pneumonie auf der Basis der Teilsanierung und gegen Actinobacillus pleuropneumoniae Serotyp 2 (A. pp.2) auf der
Basis der Totalsanierung. Seit Oktober 2003 sind alle Betriebe, die unter der Aufsicht
des Schweizer Schweinegesundheitsdienstes stehen, EP und A. pp. frei (SCHEER
und ZEHNDER 2004). Die Anwendung dieses Verfahrens mit kleinen Modifikationen
führte auch in anderen Ländern, wie z. B. Australien, zum gewünschten Erfolg
(BARÁ 2002). ANDERSEN und GRAM (2004) erreichten in einer Sauenherde in
Dänemark, die positiv auf A. pp. 2, M. hyopneumoniae und PRRS getestet wurde,
durch eine Teilsanierung und dem mit 14 Tagen frühen Absetzen der in dieser Zeit
geborenen Ferkel die Eliminierung von A .pp. 2, M. hyopneumoniae und PRRS. Die
Teilsanierung beinhaltete die Entfernung aller Jungtiere zwischen 14 Tagen und 6
Monaten, eine Medikation der Sauen über 24 Tage und eine antibiotische
Behandlung der in diesem Zeitraum geborenen Ferkel. Die nach der Medikationsperiode geborenen Ferkel wurden nicht mehr behandelt und mit 21 Tagen abgesetzt.
Eine Gruppe von SPF-Jungsauen wurde 4 Monate nach der Sanierung in die Herde
eingestallt und serologisch weitere 11 Monate überwacht. Keines der Tiere
serokonvertierte. SØRENSEN und BARFOD (1992) konnten einen weiteren Beweis
dafür erbringen, dass die Infektionskette für M. hyopneumoniae hauptsächlich durch
Jungtiere aufrechterhalten wird. Sie verbrachten tragende Jungsauen, älter als 10
Monate, aus einer mit M. hyopneumoniae infizierten ursprünglichen SPF-Herde an
einen isolierten Ort. Die Sauen, und auch die später geborenen Ferkel, erhielten kein
Medizinalfutter. Am Ende des Experiments konnte anhand der Untersuchungen der
Ferkel gezeigt werden, dass auch ohne Medikation eine Eradikation serologischer
Reagenten gegen M. hyopneumoniae erfolgreich war. BÆKBO et al. (1994)
bewiesen, dass sogar in großen Beständen mit mehreren hundert Sauen ein
Tilgungsprogramm mit Medikation der über 10 Monate alten Zuchttiere über 2-3
Wochen, während eines jungtierfreien Intervalls von 14 Tagen, erfolgreich ist. Im
Vergleich zur Erneuerung des Betriebs mit SPF-Tieren ist dieses Verfahren
kostengünstiger, da Produktionsverluste reduziert werden, und das genetische
Potential der Zuchtsauen erhalten bleibt. Es ist damit relevant für Nukleus-ZuchtHerden und Aufzucht-Mastbetriebe mit schweren Verlusten durch den MIRDKomplex. Das Risiko der Reinfektion sollte jedoch vorher abgewogen werden
(BÆKBO et al. 1994). In diesem Zusammenhang sollten auch die neuesten
Untersuchungen von FANO et al. (2004a) betrachtet werden. Sie zeigten, dass
natürlich und experimentell infizierte drei Monate alte Jungsauen noch 185 Tage post
infektionem zu ca. 80-100 % nested-PCR M. hyopneumoniae-positiv waren. In dieser
Studie wurde zwar eine Erregerübertragung nicht überprüft, doch selbst ein „cutoffAlter“ einiger Eradikationsprogramme von zehn Monate könnte hiernach ungenügend
sein und dadurch zu der hohen Reinfektionsrate beitragen.
Als eine Weiterführung des MEW-Verfahrens kann das Isoweansm –Verfahren nach
HARRIS (1990) angesehen werden. Die mit 8-24 Tagen früh abgesetzten Ferkel und
die Mastschweine werden zusätzlich an weit auseinanderliegenden Orten gehalten,
28
um eine Infektion zwischen verschiedenen Altersklassen zu verhindern (BLAHA
1992). Dies führte in den U.S.A. zur Entwicklung des SEW-Verfahrens nach DRITZ
et al. (1996). Hier verhindert schon das so genannte „segregated early weaning“die
vertikale Übertragung von M. hyopneumoniae. Die Ferkel werden im Alter von sieben
bis zehn Tagen, also mit dem kompletten passiven Schutz über das Kolostrum
(RAUTIAINEN et al. 1998), abgesetzt und an isolierter Lokalisation ohne Medikation
aufgezogen. Dieses Verfahren zeigt damit, dass die Verabreichung von Antibiotika
nicht der wichtigste Faktor in der Kontrolle dieser Erkrankung spielt. Nach CLARK
(1999) sind die Bedingungen eines erfolgreichen Gelingens aber an die strikte
Befolgung der Regeln des SEW-Verfahrens und an ein Absetzalter unter 14-17
Tagen gebunden. Nach LINDBERG et al. (2004) gewinnt dieses Verfahren in
Schweden immer mehr an Bedeutung.
2.1.8.2 Impfung
Da die Infektion mit M. hyopneumoniae zu einer humoralen und zellulären
Immunantwort und damit zum Aufbau einer Resistenz (HOWARD und TAYLOR
1985, KOBISCH et al. 1993, KOBISCH und FRIIS 1996) führt, lag der Gedanke nicht
fern, dies zur Kontrolle der Enzootischen Pneumonie in Form von Impfungen
auszunutzen. Nach OKADA et al. (2000) sowie THACKER et al. (2000) induziert die
Impfung gegen M. hyopneumoniae eine lokale humorale und zelluläre Immunantwort
in der Mukosa des Respirationstrakts der Schweine. Außerdem trägt die Impfung zu
und es
kommt zur Unterdrückung der Antwort der Entzündungszellen in der Lunge auf eine
M. hyopneumoniae-Infektion. Es entstehen weniger Lungenläsionen. Bei einer
Auswertung der Ergebnisse untersuchter Impf- und Kontrollgruppen zeigen sich
neben
dem
signifikant
verbesserten
Lungenläsionen-score,
weiterhin
Verbesserungen der Wachstumsrate, der Futterverwertung sowie eine signifikante
Reduktion der Medikamentenkosten für die geimpften Gruppen im Vergleich zu
Kontrollgruppen (SCHEIDT et al. 1994, SCHATZMANN et al. 1996, REYNAUD et al.
1998, MAES et al. 1999b, OKADA et al. 1999, BOUWKAMP et al. 2000, THACKER
et al. 2000, KYRIAKIS et al. 2001). Auch positive Beeinflussungen auf
Viruserkrankungen werden berichtet (HORST et al. 1998, OPRIESSNIG und
HALBUR 2004). Bei dem Vergleich einer geimpften Herde mit einem hohen
gesundheitlichen Status ohne klinische Zeichen einer respiratorischen Infektion und
einer geimpften Herde mit niedrigem Gesundheitsstatus und ernsten
epidemiologischen und ökonomischen Problemen kommen OKADA et al. (1999) zu
dem Schluss, dass eine Impfung nur dann von Vorteil ist, wenn die Herde
signifikante klinische Symptome und ökonomische Verluste aufweist. Nach CLARK
(1999) ist eine Impfung nur dann kosteneffektiv, wenn die Schweine länger als 180
Tage brauchen, um ihr Schlachtgewicht zu erreichen.
Eine Impfung verhindert jedoch nicht eine Kolonisation von M. hyopneumoniae im
Respirationstrakt befallener Tiere und schützt nicht vor einer weiteren Verbreitung
der Erkrankung, denn durch eine Vakzination wird eine Erregerausscheidung weder
verhindert noch vermindert (SCHATZMANN et al. 1996, CALSAMIGLIA und PIJOAN
1998, THACKER et al. 1998a, THACKER et al. 1998b). Neueste Untersuchungen
(THACKER et al. 2002, 2004) ergaben allerdings, dass möglicherweise einige „OneShot-Produkte“ dazu beitragen könnten, die Anzahl der Organismen in den infizierten
Schweinen zu reduzieren. Im Gegensatz zum „Two-Shot-Produkt“, mit dem nach der
29
Grundimmunisierung eine Boosterimpfung nach 2-3 Wochen vorgenommen wird,
wird mit dem so genannten „One-Shot–Produkt“ nur einmal geimpft.
Die Impfung tragender Sauen führt zu einer Schutzwirkung für die Saugferkel durch
die kolostralen Antikörper (KOBISCH et al. 1987), wobei nach dem Impfen der
Antikörper-Titer der Sauen zum Zeitpunkt des Ferkelwerfens signifikant ansteigt. Die
Übertragung hoher Konzentrationen maternaler Antikörper zeigte sich dann bei den
Saugferkeln, die einen signifikant höheren Antikörper-Spiegel im Vergleich zu den
Ferkeln nicht geimpfter Sauen bis zu einem überprüften Alter von drei Wochen
aufwiesen (KRISTENSEN et al. 2002). Ging man bislang davon aus, dass maternale
Antikörper den Impferfolg bei Ferkeln beeinträchtigen können (MORRIS et al. 1994,
BERNER 1995, HODGINS et al. 2002), konnten THACKER et al. (2002, 2004) in
Untersuchungen über zwei „One-Shot-Produkte“ zeigen, dass weder maternale
Antikörper noch das Impfalter der Ferkel Auswirkungen auf die Effizienz dieser
Vakzine haben. Einfluss auf den Impferfolg von Ferkeln in einem infizierten Bestand
haben dagegen nach BERNER (1995) v. a. der Infektionsdruck und der
Krankheitsgrad im Bestand aber auch die anzutreffenden Sekundärerreger,
Stallklima und Management. CLARK (1999) schlägt in Verbindung mit dem SEWSystem die Sauenimpfung vor. Die Ferkelimpfung sollte dann erst ab einem Alter von
sechs Wochen erfolgen, da die Tiere ungefähr in diesem Alter seronegativ werden.
Im geschlossenen System sollten die Ferkel, in Abhängigkeit von kolostralen
Antikörpern, ab einem Alter von drei bis vier Wochen geimpft werden.
Zur Zeit sind in Deutschland verschiedene inaktivierte Vakzinen gegen M.
hyopneumoniae erhältlich, so u. a. Suvaxyn®M.hyo (Fort Dodge Veterinär GmbH,
Würselen), Hyoresp® (Merial, Hallbergmoos), Stellamune®Mycoplasma bzw.
Stellamune®oneshot (Pfizer, Karlsruhe) und Ingelvac®M.hyo (Boehringer Ingelheim
Vetmedica GmbH, Ingelheim). Die Impfungen werden entweder vor dem Absetzen
(häufig schon in der 1. Lebenswoche), nach dem Absetzen oder zu Beginn der
Mastperiode durchgeführt. Neben den „Two-Shot-Produkten“, geht die neueste
Entwicklung in der Impfstofftechnik in Richtung „One-Shot-Produkte“, wie z. B.
Ingelvac®M.hyo, welches durch das Depot-Adjuvans Impran® über eine verlängerte
Freisetzung des Antigens verfügt. Tabelle 2 gibt eine Übersicht über verschiedene
Impfprogramme der oben genannten Impfstoffe.
Die von den einzelnen Autoren empfohlenen Impfstrategien sind dabei aber immer
im Zusammenhang mit den jeweiligen Versuchsbedingungen bzw. dem Zeitpunkt der
Infektion in der untersuchten Herde zu sehen. So zeigten einige empfohlene
Impfstrategien noch Verbesserungen im Wachstum oder der Lungenqualität (VRAAANDERSEN et al. 1994, LILLIE et al. 2004). MARTINON und Mitarbeiter (1998)
sowie KYRIAKIS und Mitarbeiter (2001) bevorzugen die frühe Impfung beim frühen
Auftreten von Infektionen in der Herde, oder um das Risiko für die Ferkel zu
minimieren. Auch hier empfiehlt MARCO et al. (2004) das „One-Shot-Produkt“
Ingelvac®M.hyo, verabreicht in der 3. Lebenswoche. Eine Impfung zu Beginn der
Mast bzw. nach dem Absetzen in Kombination mit der Sauenimpfung sollten dann
vorgenommen werden, wenn Anzeichen einer Infektion sehr spät auftreten
(KYRIAKIS et al. 2001, GROßE BEILAGE und SCHREIBER 2002). Nach PABST et
al. (2004) ist auch hier die alleinige Impfung der Ferkel im Alter von vier Wochen mit
dem „One-Shot-Produkt“ Ingelvac®M.hyo effizient.
30
Tab. 2: Vergleich der untersuchten Impfprogramme einiger Impfstoffe
Autor
Impfstoff
Untersuchte
Impfstrategien
VRAA-ANDERSEN Suvaxyn®M.hyo
1. + 3.
LW
et al. 1994
(Two-Shot-Produkt) beim Absetzen + 2
Wo später
MARTINON et al.
Hyoresp®
1.-2. + 4.- 5. LW
1998
(One-Shot- bzw.
6.-8. + 9.-11. LW
Two-Shot-Produkt)
10.-11. LW
REYNAUD et al.
1998
KYRIAKIS et al.
2001
GROßE BEILAGE
und SCREIBER
2002
DAWSON et al.
2002
LILLIE et al. 2004
DIAZ et al. 2002
ROOF und KOLB
2004
Stellamune®
oneshot
Stellamune®
oneshot
Stellamune®
Mycoplasma
(Two-Shot-Produkt)
Ingelvac®M.hyo
(One-Shot-Produkt)
Empfohlene
Impfstrategien
Beim Absetzen +2
Wo später
Ab 3. LT + 3 Wo
später
und
10.LW
Kein Unterschied
1. + 4.
6.-8. +11.
11.
1. + 4.
10.
1. + 4.
4. + 8.
LW
LW
LW
LW
LW
LW
LW
3.-5.
LW
1.
4.
LW
LW
1. + 4.
LW
5.
LW
5. LW
3.
LW
3. LW
1.+ 4. LW
Sauenimpfung
+
4. + 8. LW
3.-5. LW
1.LW, Ergebnisse
geringfügig besser;
die beiden anderen
Impfstrategien sind
gleichwertig gut
Nach DÍAZ et al. (2004a,b) zeigte sich eine Ferkelimpfung mit Ingelvac®M.hyo im
Alter von sechs Wochen in Kombination mit der Sauenimpfung einer Impfung mit
Stellamune®Mycoplasma in der 1.+3. Lebenswoche, allerdings ohne Sauenimpfung,
überlegener. Kein Unterschied bestand dagegen zwischen dem „Two-Shot-Produkt“
und dem „One-Shot“ in der 4. Lebenswoche. Für die Ferkel bedeutet eine einmalige
Verabreichung jedoch weniger Stress.
An Neuentwicklungen wie intradermaler Impfungen (JONES et al. 2002), eine oral zu
verabreichende Vakzine mit mikroeingekapselten M. hyopneumoniae-Erregern (LIN
et al. 2002) und der Entwicklung von verschiedenen avirulenten Lebendvakzinen
(UTRERA et al. 2002b, MENDOZA und PIJOAN 2004, OISHI et al. 2004) wird
gearbeitet.
31
2.1.8.3 Therapie
Nach STIPKOVITS et al. (2001) werden die besten Resultate in der Behandlung mit
M. hyopneumoniae experimentell infizierter Schweine mit den Chemotherapeutika
Econor® (Tiamulinderivat) in Kombination mit Chlortetracyclin, gefolgt von
Tetramutin® (Tiamulin und Chlortetracyclin), Pulmotil® (Tilmicosin), Cyfac®
(Sulfadimidin und Chlortetracyclin), sowie der Kombination von Lincomycin und
Chlortetracyclin, erzielt. BOUSQUET et al. (1998) zeigte, dass die durchschnittliche
Dosis von 11 mg Doxycyclin/kg Körpergewicht pro Tag im Futter über 8 Tage in der
Kontrolle einer Pneumonie ausgelöst durch M. hyopneumoniae und P. multocida bei
Mastschweinen effektiv war. Nach den neuesten Untersuchungen von STIPKOVITS
et al. (2004) reagiert M. hyopneumoniae am sensibelsten auf Valnemulin und
Tiamulin. Ein synergistischer Effekt wird noch durch Kombination dieser Antibiotika
jeweils mit Doxycyclin erreicht. Durch die Behandlung erkrankter Tiere mit
Chemotherapeutika wird die Infektion jedoch nicht vollständig beseitigt (HOWARD
und TAYLOR 1985). Der therapeutische Einsatz reduziert nicht nur die Schwere der
Erkrankung, sondern verbessert die Futterverwertung und die Wachstumsrate
(HOWARD und TAYLOR 1985, BOUSQUET et al. 1998, WALTER et al. 1999).
Antibiotika finden aber auch in der Prophylaxe ihren Einsatz. So u. a. als
Fütterungsarzneimittel in einigen Eradikationsprogrammen. So verwendete BÆKBO
et al. (1994) Tiamulin und Chlortetracyclin, MADSEN und LARSEN (1996) benutzten
Enrofloxacin (Baytril®), und ZMMERMANN und WEISKOPF (1996) verwendeten
Lincomycin (LINCOMIX/ALBIOTIC Premix). Das Ziel dieser prophylaktischen
Maßnahmen ist die Verminderung des Infektionsdruckes und Verbesserung der
Wiederstandsfähigkeit eines Betriebes gegen eine M. hypneumoniae-Infektion.
Erschwerend für die Bekämpfung sind allerdings die neuesten Untersuchungen über
erste Resistenzen gegen einige Chemotherapeutika. So fanden VICCA et al. (2004)
erste erworbene Resistenzen einiger Feldisolate von M. hyopneumoniae gegen
Makrolide (Tylosin und Tilmicosin), dem Lincosamid Lincomycin und dem
Fluochinolon Enrofloxacin.
LATELL und NEIKE (1998) stellten eine verbesserte Gewichtszunahme und
Futterverwertung bei Kombination der Impfungen am 7. und 28. Tag
(Suvaxyn®M.hyo) mit der Futtermedikation (Lincocin Premix) über 21 Tage,
angefangen am Tag des Absetzens, verglichen mit der nur Impfung oder der nur
Futtermedikation fest. Auch STIPKOVITS et al. (2003) konnten eine Reduzierung
ökonomischer Verluste durch die späte Impfung der Tiere am 69. bzw. 69. und 80.
Tag in Kombination mit einer Fütterungsprophylaxe erreichen.
Die positiven Effekte einer präventiven Fütterungsmedikation über mehrere Wochen
scheinen nach MATEUSEN et al. (2001, 2002) mit der zweimaligen Impfung von
Stellamune®Mycoplasma in der 1. und 4. Lebenswoche vergleichbar zu sein. Nur die
durchschnittliche Anzahl der zusätzlichen kurativen Medikamententage pro Schwein
war in der Gruppe mit der Futtermedikation signifikant höher. Im Gegensatz zu
MATEUSEN et al. (2002), die durch Kombination der Futtermedikation mit der
Impfung keinen weiteren Vorteil erkennen konnten, zeigten THACKER und
Mitarbeiter (2002a), dass die Verabreichung einer Fütterungsarznei über drei
Wochen um den Zeitpunkt einer experimentellen Infektion mit M. hyopneumoniae
und PRRSV bei den gegen M. hyopneumoniae geimpften Ferkeln zu einer sogar
noch größeren Reduzierung der respiratorischen Symptome und einer signifikanten
Verminderung der Potenzierung einer PRRS-Viruspneumonie durch M.
hyopneumoniae führte.
32
3 Material und Methoden
3.1 Chemikalien und Reagenzien
ABTS (2,2`-Azino-di-[3-äthyl-benzthiazolinsulfonat (6)], Boehringer, Ingelheim
Aceton, CG Chemikalien GmbH & CO. KG, Laatzen
di-Natriumhydrogenphosphat (Na2HPO4), Merck, Darmstadt
di-Natriumhydrogenphosphat-Dodecahydrat (Na2HPO4 x12H2O), Merck,
Darmstadt
Einbettmedium, Microm, Walldorf
FITC Fluoresceinisothiocyanat, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
Glycerin, 99 % (C3H8O3), Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
Kaliumchlorid (KCl), Merck, Darmstadt
Kaliumdihxdrogenphosphat (KH2PO4 ), Merck, Darmstadt
Methanol, reinst, Merck, Darmstadt
Natriumcarbonat (Na2C03), Merck, Darmstadt
Natriumchlorid (NaCl), Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
Natriumhydrogencarbonat (NaHC03), Merck, Darmstadt
Natronlauge (NaOH), 1 M, Merck, Darmstadt
Salzsäure (HCl), 1 M, Merck, Darmstadt
Schweineserum von Gnotobioten (Klinik für kleine Klauentiere, Hannover)
Tween 20 (Polyoxyethylensorbitammonolaurat), Merck, Darmstadt
Tris Tris(Hydroxymethyl)-aminomethan, Serva, Heidelberg
Wasserstoffperoxid (H2O2), Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
Ziege-anti-Kaninchen-Immunglobulin, Dianova, Hamburg
Zitronensäure, Serva, Heidelberg
3.2 Geräte und Hilfsmittel
Analysenwaage, Sartorius über Landgraf, Hannover
Eppendorf-Reaktionsgefäße, Eppendorf, Hamburg
Fotometer, Revelation MRX mit eingebautem PC, Dynex Technologies MRX
pH-Meter, CG707, Schott über Landgraf, Hannover
Magnetrührer, neolab 500 series
Microelisa Auto Reader, MR 580, Dynatech, Denkersdorf
Mikrotom-Kryostat, HM500OM, Microm, Walldorf
Photomikroskop III für Durchlicht mit Fluoreszenz-Auflichtkondensor III RS, Carl
Zeiss, Oberkochen
Plattenwaschgerät, Dynatech MRW, Denkersdorf
Polysorb®-Mikrotiterplatte, Nunc, Wiesbaden
Rotationsschüttler, Janke u. Kunkel GmbH & Co. KG, Staufen
Software: Dynex Revelation G 3.2 (1997), Microsoft Windows
Ultraschall Wasserbad, Bandelin, Sonorex Super AK 103 H
Zentrifuge, Omnifuge2, Heraeus, Kendro Laboratory Products GmbH,
Langenselbold
33
3.3 Lösungen
Coatingpuffer pH 9,6
NaHC03
Na2C03 bis pH 9,6 erreicht ist
in Aqua tridest
8,4 g
ca. 4,9 g
1.000,0 ml
Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS)) 10-fach
NaCl
KH2PO4
KH2PO4 x 12 H2O
KCl
Aqua dest. ad
80,0 g
2,0 g
29,0 g
2,0 g
1.000,0 ml
PBS + Tween 20
PBS 10-fach
Aqua dest.
Tween 20, 0,05 %
PBS mit 1 % Schweineserum
PBS
Schweineserum von Gnotobioten
Tris HCl Puffer (0,025 M)
Tris
HCl, 0,1 M
Aqua dest. ad
Einstellung des pH-Wertes auf 8,0 mit NaOH
Glycerin-Tris HCl Puffer (1:2)
Tris-HCl Puffer (0,025 M)
Glycerin 99 %
Zitronenpuffer
Lösung 1
Na2HPO4
in Aqua dest.
Lösung 2
Zitronensäure
Aqua dest. ad
Lösung 1 vorlegen und mit Lösung 2 auf den pH-Wert 4,25 einstellen
Chromogenlösung
400 mg ABTS ad 1.000,0 ml Zitratpuffer
alliquotieren à 10 ml und einfrieren
100,0 ml
900,0 ml
0,5 ml
9,9 ml
0,1 ml
3.037,0 g
134,0 ml
1.000,0 ml
5,0 ml
5,0 m l
17,8 g
1.000,0 ml
21,0 g
1.000,0 ml
34
3.4 Antigen für den TiHo-ELISA
Die Präparation des M. hyopneumoniae-Ganzzell-Antigens erfolgte im Institut für
Mikrobiologie und Tierseuchen der Tierärztlichen Hochschule Hannover. Es wurde
dort routinemäßig in der Diagnostik eingesetzt. 2,5 µg Antigen pro ml Coatingpuffer
wurden dabei verwendet.
3.5 Hyperimmunseren für den Immunfluoreszenztest
Die Kaninchenhyperimmunseren gegen M. hyopneumoniae bzw. M. bovirhinis sowie
M. hyorhinis wurden im Institut für Mikrobiologie und Tierseuchen der Tierärztlichen
Hochschule Hannover hergestellt. Sie wurden in der Verdünnung 1:300 in PBS mit
Zusatz von 1 % Schweineserum verwendet.
Die Konjugierung des Ziege-anti-Kaninchen-Immunglobulins mit dem Fluorochrom
FITC wurde ebenfalls im Institut für Mikrobiologie und Tierseuchen der Tierärztlichen
Hochschule Hannover vorgenommen und gleichfalls in PBS mit 1 % Schweineserum
1:50 verdünnt.
3.6 Probenmaterial und -auswahl
Die Blutproben für den Vergleich der serologischen Testsysteme und für die
epidemiologische Untersuchung wurden im Rahmen eines Projektes der Außenstelle
für Epidemiologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover in Bakum von August bis
Dezember 1996 auf zwei Schlachthöfen gewonnen (GANTER et al. 1997). Die
insgesamt
6960
Blutproben
stammten
aus
136
Betrieben
zweier
Erzeugergemeinschaften ansässig im Landkreis Osnabrück. Zu 107 Betrieben
wurden außerdem Angaben zur Betriebsgröße und -struktur sowie zu Art und
Herkunft der Ferkel aufgenommen.
Die Anzahl der Blutproben je Bestand lag unabhängig von der Größe der
Schlachtpartie und dem Geschlecht der Schweine zwischen 15 und 100, in der Regel
jedoch bei 50 Proben. Nach der Lagerung von maximal einem Tag auf den
Schlachthöfen wurden die Blutproben in der Außenstelle für Epidemiologie der
Tierärztlichen Hochschule Hannover zentrifugiert (3000 g für 8 min bei 14 ºC), und
das überstehende Serum in entsprechend den Blutproben nummerierten 1,5 ml
Eppendorf-Reaktionsgefäße dekantiert und bei -20 ºC eingelagert.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden nun von den Proben aus insgesamt 106 Betrieben
nach dem Zufallsprinzip jeweils durchschnittlich 13 Stichproben pro Betrieb
ausgewählt und serologisch untersucht. Statistisch gesehen liegt, bei 13 Stichproben
aus einer Bestandsgröße von z. B. 500 Tieren, die Wahrscheinlichkeit, eine falschnegative Aussage zu machen, bei höchstens 5 % (MÜLLER et al. 1988).
Von den Schweinen aus 11 Betrieben lagen außerdem auf dem Schlachthof
erhobene Lungenbefunde vor, die nach einem einheitlichen Bewertungsschlüssel
nach BLAHA (1993) folgendermaßen kategorisiert wurden:
1. Pneumonische Veränderungen der Lunge:
Pn 0: keine makroskopischen Veränderungen der Lunge
Pn 1: geringgradige (bis 10 %)
„
„
„
Pn 2: mittelgradige (bis 30 %)
„
„
„
Pn 3: hochgradige (über 30 %)
„
„
„
35
2. Verwachsungsgrad der Pleura:
Pl 0: keine makroskopisch sichtbaren Verwachsungen der Pleura
Pl 1: geringgradige (bis 5-DM-Stück-große) Verwachsungen der Pleura
Pl 2: mittelgradige (bis handflächengroße)
„
„
„
Pl 3: hochgradige (über handflächengroße)
„
„
„
Die Höfe mit den bekannten Betriebsdaten liegen in Ortschaften (siehe Tabelle 1), in
denen die Struktur der Schweineproduktion durch die allgemeine Viehzählung vom
03. Dezember 1996 (Niedersächsisches Landesamt für Statistik und
Landwirtschaftskammer Westfalen-Lippe) bekannt ist.
Tab. 3: Anzahl der Mastschweine und Schweine insgesamt in folgenden Ortschaften
Landkreis
Osnabrück
Ankum
Badbergen
Bad Essen
Bad Iburg
Bad Rothenfelde
Belm
Bersenbrück
Bissendorf
Bohmte/Hunteburg
Bramsche
Dissen
Eggermühlen
Fladderlohhausen/
Bad Laer
Fürstenau
Gehrde
Georgsmarienhütte
Glandorf
Hagen
Hilter
Melle
Menslage
Merzen
Neuenkirchen
Nortrup
Ostercappeln/Venne
Rieste
Landkreis Steinfurt
Mettingen
Landkreis Vechta
Damme
Mastschweine
Schweineinsgesamt
Halter
17.872
8.166
9.689
5.435
1.519
2.916
16.009
5.201
9.230
14.140
2.787
4.404
37.029
21.689
31.904
14.395
6.741
9.936
27.304
17.658
25.328
28.212
4.549
13.021
99
70
156
59
27
43
65
89
105
115
30
48
7.249
17.171
111
8.704
2.399
6.733
18.551
857
10.290
45.128
3.333
17.918
12.903
2.790
6.813
7.100
27.862
7.070
13.791
48.048
5.731
24.453
12.2415
11.024
56.771
31.301
6.422
18.974
14.312
116
31
72
151
54
92
540
68
134
144
23
103
43
5.446
7.791
83
104.154
17.1821
240
36
Abbildung 1 verdeutlicht noch einmal die Schweinedichte in Bezug auf die
Gemeindefläche im Landkreis Osnabrück (BROECKER und SCHERBRINK 2000).
Abb. 1: Schweinedichte – bezogen auf die Gemeindefläche – im Landkreis Osnabrück
37
Die Proben für den zweiten Block der Untersuchungen stammten von 153
Schweinen, die in dem Zeitraum von September 1997 bis Juli 1998 zur Sektion nach
Bakum, in die Außenstelle für Epidemiologie der Tierärztlichen Hochschule
Hannover, geschickt wurden.
Die Blutproben wurden, wie oben beschrieben, behandelt. Die Organproben aus den
Lungenspitzenlappen für den Immunfluoreszenztest wurden sofort nach der Sektion
bei –20 °C eingefroren. Ebenso sind die Lungenproben für den kulturellen Nachweis
sofort in Friis-Medium überführt und an das Institut für Mikrobiologie und Tierseuchen
der Tierärztlichen Hochschule Hannover zur Untersuchung weitergeleitet worden.
Für den Nachweis von Antikörpern im Blutserum standen vier ELISA Testsysteme
zur Verfügung.
3.7.1 Enzyme Linked Immunosorbent Assay der Mikrobiologie der
Tierärztlichen Hochschule Hannover (TiHo-ELISA)
Die zu untersuchenden Seren sowie die Kontrollen, das Konjugat, das Substrat und
das Antigen wurden vor der Durchführung aufgetaut. Bei dieser Methode wurde das
Antigen des Mycoplasmenstammes M. hoypneumoniae J an die Trägeroberfläche
einer Polysorb®–Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen (Wells) gebunden. Bei diesem
als „coating” bezeichneten Vorgang wurde das Antigen zunächst 1:1500 mit
Coatingpuffer verdünnt und jeweils 100 µl dieser Verdünnung in jedes Well pipettiert.
Die Platten wurden anschließend mit Folie abgedeckt und bei RT über Nacht auf
einem Rotationsschüttler inkubiert.
Am folgenden Tag wurden die Platten dreimal in einem Plattenwaschgerät mit PBSTween 20 als Waschpuffer gewaschen. Die Seren sowie die Positiv- und NegativKontrollen wurden 1:10 mit dem Waschpuffer vorverdünnt. Jeweils 200 µl dieser
Seren wurden in die Wells 1-10 der Reihe A, 200 µl der Positiv-Kontrolle wurden in
das Well A11 und 200 µl der Negativ-Kontrolle in das Well A12 pipettiert. In die Wells
der Reihen B bis H wurden jeweils 100 µl Waschpuffer vorgelegt. Anschließend
wurden die Seren und die Kontrollen durch Überführen von jeweils 100 µl aus Reihe
A in Reihe B und gründliches Mischen verdünnt. Die Verdünnungen wurden in
gleicher Weise bis Reihe H fortgeführt. Aus den Wells der Reihe H wurden zum
Schluss jeweils 100 µl verworfen. So entstand eine 1:2-er Verdünnungsreihe für die
Seren und Kontrollen von 1:10 in Reihe A bis zu 1:1280 in Reihe H.
Die abgedeckten Platten wurden 30 Minuten inkubiert und anschließend dreimal mit
dem PBS-Tween 20 gewaschen. Im nächsten Arbeitsschritt wurden 100 µl des
Peroxidase-anti-Schwein-Konjugates in einer Gebrauchsverdünnung von 1:3000 mit
PBS in jedes Well eingefüllt. Nach 30 minütiger Inkubation wurden die Platten, wie
oben beschrieben, gewaschen. Als Chromogen wurde ABTS (2,2`-Azino-di-[3-äthylbenzthiazolinsulfonat (6)], gelöst in Zitronenpuffer, eingesetzt. Unmittelbar vor der
Verwendung wurden zu je 10 ml der 0,04 %igen Chromogen-Lösung 20 µl H2O2 1
%ig (v/v) zugegeben. 100 µl dieser Substratlösung wurden im letzten Schritt in jedes
Well pipettiert. Bei der letzten Inkubation wurden die Platten nicht abgedeckt. Nach
30 Minuten wurde die Enzym-Substrat-Reaktion schließlich mit 50 %-igem Methanol
(jeweils 100 µl pro Well) gestoppt und die Absorptionen bei 405 nm gegen 492 nm in
einem Fotometer gemessen.
38
Für die Auswertung wurde die Extinktion der Negativkontrolle in dem Well A12 mit
dem Faktor 2 multipliziert. Die Verdünnungsstufe, bei welcher der Extinktionswert der
Probe oberhalb dieses errechneten Grenzpunktes liegt, beschrieb somit die Höhe
des Titers.
Die Inkubationen erfolgten bei RT auf einem Rotationsschüttler, die Waschschritte
wurden mittels eines Plattenwaschgerätes durchgeführt.
Tab. 4: Bewertung des Titers des TiHo-ELISAs
Kriterium
Titer < 1:10
Titer
1:10
Titer > 1:20
Aussage
negative Probe, d. h. es sind keine
Antikörper gegen M. hyopneumoniae
nachweisbar
zweifelhafter Bereich
positive Probe, d. h. es sind Antikörper
gegen M. hyopneumoniae nachweisbar
3.7.2 DAKO Mycoplasma hyopneumoniae ELISA (DAKO-ELISA)
Mit dem (käuflichen) kommerziell erhältlichen Enzymimmuntest-Kit von DAKO A/S,
Glostrup, Dänemark, wird das Verdünnungsmedium, der Substratpuffer (enthält
Wasserstoffperoxid), die Stopp-Lösung (Schwefelsäure-Lösung) und das Konjugat
gebrauchsfertig geliefert. Bei dem Konjugat handelt es sich um Peroxidasekonjugierte monoklonale Mäuse-Antikörper, die gegen ein spezifisches Epitop eines
74 kDa Proteins gerichtet sind. Das Chromogen, ein 1,2-Phenylenediamin, in
Tablettenform muss kurz vorher mit Substratpuffer im Dunkeln aufgelöst werden. Die
mitgelieferten Platten, bestehend aus 16 Vertiefungen, angeordnet in zwei Reihen
(siehe Abbildung 2), sind gebrauchsfertig mit M. hyopneumoniae-Antigen
beschichtet. Auch bei diesem System müssen die beiden mitgelieferten Kontrollen
(positiv und negativ) und die Serumproben zuvor 1:10 mit dem Verdünnungsmedium
verdünnt werden.
Es wurden von allen Proben und Kontrollen Doppelansätze sowie vom
Verdünnungsmedium ein Vierfachansatz (jeweils 100 µl) gemacht und in die Wells
nach folgendem Muster eingebracht.
P
N
V
V
1
2
3
4
P
N
V
V
1
2
3
4
5
6
7
5
6
7
Abb. 2: 2 Mikrotiterplatten mit jeweils 16 Wells und ein Beispiel der Probenverteilung
P
= Positivkontrolle
N
= Negativkontrolle
V
= Verdünnungsmedium
1, 2, 3, 4, 5, 6, usw. = Probennummer
39
Die mit Folie abgedeckten Platten wurden für 1,5 Stunden ohne Schütteln bei RT
(20-25 °C) inkubiert. Im nächsten Arbeitsschritt wurden jeweils 100 µl Konjugat
zusätzlich in alle Wells gegeben und 15 Minuten ohne Schütteln inkubiert.
Anschließend wurden die Platten viermal mit Aqua dest. gewaschen und schließlich
100 µl Chromogen in jedes Well pipettiert. Die Inkubation erfolgte im Dunkeln für 10
Minuten bei RT (20-25 °C). Im letzten Arbeitsschritte wurden jeweils 100 µl der
Stopp-Lösung in jedes Well überführt und die Absorption bei 490 nm (Referenzfilter
zwischen 600 und 650 nm) innerhalb einer Stunde nach Zufügen der Stopp-Lösung
gemessen.
Die optischen Dichten (OD) wurde folgendermaßen ermittelt:
Berechnung der Absorptions-Mittelwerte für die zwei Positivkontrollen (= ODPositivkontrolle), die zwei Negativkontrollen (= OD-Negativkontrolle), die vier
Pufferkontrollen (= OD-Pufferkontrolle) und den einzelnen Proben (= OD-Probe).
Qualitätskontrolle:
- OD-Pufferkontrolle muss > 0.75 und < 2.500 sein
(der erwartete Wert liegt bei ca. 1.000 - 1.400)
- OD-Positivkontrolle muss < 50 % der OD-Pufferkontrolle sein
(der erwartete Wert liegt bei ca. 20 – 40 %)
- OD-Negativkontrolle muss > 75% der OD-Pufferkontrolle sein
(der erwartete Wert liegt bei ca. 90 - 110%)
Tab. 5: Interpretation der Ergebnisse des DAKO-ELISAs
Kriterium
Aussage
OD-Probe > 50 % der negative Probe, d.h. es sind keine
OD-Pufferkontrolle
nachweisbar
OD-Probe < 50 % der positive Probe, d.h. es sind Antikörper
gegen M. hyopneumoniae nachweisbar
OD-Pufferkontrolle
Liegt die OD-Probe zwischen 50 und 65 %, sollte, entsprechend der Empfehlung des
Herstellers, das Tier nach zwei Wochen noch einmal getestet werden.
3.7.3 Chekit®-Hyoptest I nach Dr. Bommeli (Bommeli I-ELISA)
Dieser Enzymimmuntest (Dr. Bommeli AG, Liebefeld-Bern, Schweiz, jetzt: Intervet
International bv, Niederlande) liefert Testplatten, deren 96 Wells gebrauchsfertig mit
dem inaktivierten Erregerantigen M. hyopneumoniae beschichtet sind. Außer dem
Chromogen wird die Stopplösung gebrauchsfertig mitgeliefert.
Nach Herstellung der Wasch- und Verdünnerlösung aus dem 10-fach-Konzentrat
wurden das Positiv- und Negativ-Kontrollserum sowie die einzelnen Proben 1:100
sowie das Protein A-Konjugat (polyklonal), markiert mit Meerrettichperoxydase,
1:200 verdünnt. Von den Proben wurden Doppelansätze, von den Kontrollen
Vierfach-ansätze gemacht (siehe Abbildung 3), wobei jeweils 200 µl der verdünnten
Proben und Kontrollen in die Wells der Testplatte übertragen wurden. Die Testplatten
wurden mit Folie abgedeckt und 90 Minuten bei RT in einer feuchten Kammer ohne
Schütteln inkubiert. Der nächste Arbeitsschritt beinhaltete das dreimalige Waschen
der Platten mit der Wasch- und Verdünnerlösung (mindestens 300 µl pro Well).
40
A
B
C
D
E
F
G
H
1
N
P
1
2
3
4
5
6
2
N
P
1
2
3
4
5
6
3
N
P
7
8
4
N
P
7
8
5
6
7
8
9
10
11
12
Abb. 3: Format der Testplatte und ein Beispiel der Probenverteilung
N
= Negativkontrolle
P
= Positivkontrolle
1,2,3, usw. = Probennummer
Nach dem Waschen werden die Platten sorgfältig ausgeklopft, bevor in jedes Well
200 µl des verdünnten Konjugats pipettiert wird. Die Testplatten wurden wiederum
abgedeckt und 90 Minuten bei RT in einer feuchten Kammer inkubiert. Der folgende
Waschschritt wurde, wie bereits oben beschrieben, durchgeführt. Anschließend
erfolgte die Verteilung des auf 25 °C vorgewärmten Chromogens (jeweils 200 µl) mit
Inkubation bei RT oder optimal bei 25 °C. Die Differenz der Extinktionen zwischen
negativer und positiver Kontrolle, gemessen im Fotometer bei einer Wellenlänge von
405 nm (Referenzwellenlänge = 492 nm), sollte nach 15 bis 30 Minuten größer oder
gleich 0,7 sein. Dann wurde die Farbreaktion mit 50 µl/Well der auf RT erwärmten
Stopplösung gestoppt.
Bewertung der Ergebnisse:
Nach Berechnung der Mittelwerte der optischen Dichte (OD) der beiden Kontrollen
sowie der Proben, wurden die ODs der positiven Kontrolle und der Proben durch
Subtraktion der OD der negativen Kontrolle korrigiert. Die Proben wurden dann auf
die positive Kontrolle (=100%) bezogen.
OD-Probe – OD-neg.
Probenwert (%)= ---------------------------- x 100 %
OD-pos. – OD-neg.
Tab. 6: Interpretation der Ergebnisse des Bommeli I-ELISAs
Kriterium
Probenwert < 50 %
Probenwert 50 – 70 %
Probenwert > 70 %
Aussage
negative Probe, d. h. es sind keine
nachweisbar
grenzwertiger Bereich
positive Probe, d. h. es sind
nachweisbar
Nach Angaben des Herstellers sollte eine grenzwertige Probe ein zweites Mal
getestet werden. Bleibt sie auch dann grenzwertig, so sollte von dem gleichen Tier
eine zweite Probe untersucht werden. Ergibt diese Probe abermals ein grenzwertiges
41
Resultat, sollte das Ergebnis mit einer anderen Labormethode überprüft und das
epidemiologische Umfeld mit in die Diagnose einbezogen werden. Dies konnte hier
im Zweifelsfalle nicht vorgenommen werden, da es sich um Blutproben schon
geschlachteter Mastschweine handelte.
3.7.4 Chekit®-Hyoptest II nach Dr. Bommeli (Bommeli II-ELISA)
Die wichtigste Weiterentwicklung dieses Enzymimmuntests (Dr. Bommeli AG,
Liebefeld-Bern, Schweiz, jetzt: Intervet International bv, Niederlande) war hier die
Verwendung eines monoklonalen Antikörpers gegen ein Immunglobulin vom
Schwein, das mit Meerrettichperoxidase konjugiert ist. Auch dieses Konjugat wurde
in einer Verdünnung von 1:200 verwendet. Weitere Änderungen waren das direkte
Verdünnen der Kontrollen und der Proben in die Wells in einer Endverdünnung von
1:10 sowie der Gebrauch des halben Volumens der verdünnten Kontrollseren, der
Proben und des Konjugats für die weiteren Testschritte. Abgesehen von diesen
Änderungen verlief die Durchführung dieses Tests genauso wie die des Bommeli IELISAs.
Bei der Ablesung der Ergebnisse soll dann die Differenz der Extinktionen zwischen
negativer und positiver Kontrolle größer gleich 0,3 sein (siehe oben). Die Bewertung
der Ergebnisse erfolgte analog zum Bommeli I-ELISA.
Tab. 7: Interpretation der Ergebnisse des Bommeli II-ELISAs
Kriterium
Aussage
negative Probe, d. h. es sind
keine Antikörper gegen M.
Probenwert < 20 %
hyopneumoniae nachweisbar
Probenwert 20 – 30 % grenzwertiger Bereich
positive Probe, d. h. es sind
Antikörper gegen M.
Probenwert > 30 %
hyopneumoniae nachweisbar
3.8 Vergleich der unterschiedlichen Methoden zum Nachweis von
M. hyopneumoniae-Infektionen
3.8.1 Vergleich der Serologie mit dem Immunfluoreszenztest und der Kultur
Durch die Untersuchungen sollten drei verschiedene Methoden zum direkten oder
indirektem Nachweis von M. hyopneumoniae miteinander verglichen werden. Das
Probenmaterial für diese Untersuchungen stammte von der Außenstelle für
Epidemiologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover (siehe Kapitel 3.6). Zum
Nachweis der Antikörper aus dem Blutserum diente der Bommeli II-ELISA (siehe
Kapitel 3.7.4). Die Ergebnisse der kulturellen Untersuchungen der entsprechenden
Lungenproben lagen aus dem Institut für Mikrobiologie und Tierseuchen der
Tierärztlichen Hochschule vor (siehe Kapitel 3.6).
42
3.8.1.1 Nachweis von M. hyopneumoniae in Lungen mit dem indirekten
Von jeder gefrorenen Lungenprobe wurden zwei Lokalisationen untersucht. Hierzu
wurde jeweils ein ca. 1 cm großes Lungenstück auf dem Schneidetisch des
Kryotoms mit Hilfe des dazugehörenden Einbettmediums befestigt und 3-4 µm dicke
Gefrierschnitte angefertigt. Insgesamt entstanden so 5 Gefrierschnitte pro
Lungenprobe, wobei der 5. Schnitt von der zweiten Lokalisation stammte und als
Kontrolle diente. Nach dem Trocknen bei RT wurden die Gefrierschnitte 10 Minuten
in 20 °C warmem Aceton fixiert.
Es wurden jeweils 1-2 Tropfen (ca.20-40 µl) 1:300 in PBS, mit Zusatz von 1 %
Schweineserum, verdünntes Kaninchenhyperimmunserum gegen M. hyopneumoniae
auf den 1. und den 5. Gefrierschnitt, gegen M. bovirhinis auf den 2. Gefrierschnitt
und gegen M. hyorhinis auf den 3. Gefrierschnitt aufgetragen. Der 4. Gefrierschnitt
blieb unbehandelt und diente als Konjugatkontrolle. Die Gefrierschnitte wurden 30
Minuten in einer feuchten Kammer bei RT inkubiert, die Hyperimmunseren mit
Leitungswasser abgespült und die Objektträger in einer Schale mit PBS-Tween (0,05
%) 10 Minuten auf einem Rotationsschüttler gewaschen. Dieser Schritt wurde ein
zweites Mal wiederholt. Als 2. Antikörper diente ein FITC-konjugiertes Ziege-antiKaninchen-Immunglobulin in der Verdünnung 1:50 in PBS mit Zusatz von 1 %
Schweineserum. Alle 5 Schnitte wurden mit jeweils einem Tropfen (ca. 20 µl) dieses
Konjugats beschichtet und für eine halbe Stunde bei RT in einer feuchten Kammer
bei Dunkelheit inkubiert. Der sich anschließende Waschvorgang erfolgte wie oben
beschrieben. Nach dem Trocknen mit dem Fön wurden die Schnitte schließlich mit
einem Tropfen (ca. 20 µl) Glycerin-Tris HCl-Puffer überschichtet und mit einem
Deckglas belegt. Die Auswertung erfolgte unter dem Fluoreszenzmikroskop bei 160und 400-facher Vergrößerung. Lungenschnitte mit einer deutlichen Fluoreszenz von
einzelnen Mykoplasmen oder Aggregaten von Mykoplasmen am Rand oder im
Lumen von Bronchien wurden als positiv beurteilt, wenn bei der negativen Kontrolle
mit M. bovirhinis-Antiserum oder der Konjugatkontrolle keine typische Fluoreszenz
auftrat. Als Beispiel für das Aussehen einer positiven Reaktion diente der Schnitt mit
M. hyorhinis-Antiserum.
Durch die Zugabe von 1 % Schweineserum zum Verdünnungsmedium wurde die bei
fluoreszenzserologischen Untersuchungen häufig auftretende unspezifische
Hintergrundfluoreszenz eliminiert. Die Hintergrundfluoreszenz wird durch Antikörper
hervorgerufen, die bei der Herstellung von Antiserum mit in Schweineserummedium
angezüchteten Mykoplasmen entstehen können.
3.8.2 Vergleich der Serologie und des Immunfluoreszenztests mit der Sektion
Ein Zusammenhang zwischen den serologischen Ergebnissen und den Ergebnissen
des Immunfluoreszenztests mit den Befunden der Sektionsberichte, die von der
Außenstelle für Epidemiologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover zur
Verfügung gestellt wurden, sollte überprüft werden.
43
Für die serologischen Untersuchungen der insgesamt 1392 Blutproben aus 106
Betrieben diente der Bommeli II-ELISA (siehe Kapitel 3.7.4). Zu 83 der untersuchten
Betriebe waren Angaben zur Betriebsgröße und -struktur sowie zu Art und Herkunft
der Ferkel bekannt. Die Lungenbefunde aus den 11 Betrieben wurden mit den
Ergebnissen der Blutprobenuntersuchung in Beziehung gesetzt.
3.9.1 Kartographierung der Betriebe
96 Betriebe mit bekannten Adressen konnten mit Hilfe der Programme PhotoImpact,
Version 5.0 (Ulead Systems, Inc., Taipeh, Taiwan) und Falk Reiseplaner City 6.51
(MAP&GUIDE GmbH, Karlsruhe) in die Landkarte des Weser-Ems Gebietes
eingetragen werden. Dabei gilt die in Tabelle 8 dargestellte farbliche Differenzierung.
Tab. 8: Darstellung der Intra-Herden-Prävalenzen
scheinbare Intra-HerdenPrävalenz
0%
1-25 %
26-50 %
51-75 %
76-100 %
Farbe
schwarz
blau
grün
orange
rot
Actinobacillus pleuropneumoniae (A. pp.) und Influenza
Die Ergebnisse der epidemiologischen Untersuchungen von Actinobacillus
pleuropneumoniae (A. pp.) entstammten der Dissertation von POPPE (1997). Die
Daten für die statistische Auswertung der beiden Influenzastämme
A/swine/Bakum/909/93 (H3N2) und A/swine/Bakum/5/95 (H1N1) wurden der
Dissertation von SCHENK (2000) entnommen. Die Proben von diesen Arbeiten
kommen aus dem gleichen Probenpool von 1996 (GANTER et al. 1997).
Um die scheinbare Intra-Herden-Prävalenz von M. hyopneumoniae mit denen von A.
pp. und den beiden Influenzastämmen (H3N2) und (H1N1) außerdem direkt visuell
vergleichen zu können, wurden für jeden Erreger gesondert eine Landkarte
angefertigt, aus der die geographische Lage der Betriebe mit der jeweiligen
scheinbaren Intra-Herden-Prävalenz ersichtlich ist.
3.11 Statistische Auswertung
Sensitivität und Spezifität charakterisieren den Wert einer diagnostischen Methode.
Die Sensitivität oder Empfindlichkeit des Messverfahrens drückt bei den hier
durchgeführten Untersuchungen die Wahrscheinlichkeit aus, dass mit dem Test M.
hyopneumoniae-infizierte Tiere erkannt werden, während die Spezifität oder
Treffsicherheit die Wahrscheinlichkeit angibt, dass der Test bei M. hyopneumoniaefreien Tieren negativ ausfällt.
44
Sensitivität (%)=
Anzahl der richtig Positiven mit der untersuchten Methode
------------------------------------------------------------------------------ x 100
Anzahl der Positiven mit der Referenzmethode
Spezifität (%)=
Anzahl der richtig Negativen mit der untersuchten Methode
------------------------------------------------------------------------------- x 100
Anzahl der Negativen mit der Referenzmethode
Für die statistische Bearbeitung wurde das Auswertungsprogramm EXEL (Microsoft
GmbH, Unterschleißheim) verwendet. Mit dem Statistikprogramm SAS® (statistical
analysis system, Version 8.2, SAS Institute Inc. 1988, Cary, NC, USA.) wurden im
Rechenzentrum der Tierärztlichen Hochschule Hannover die Berechnungen
durchgeführt.
Für den Vergleich zweier diagnostischer Tests (Zusammenhang dichotomer
Merkmale) wurden der Konkordanzindex Kappa sowie der McNemar-Test
verwendet. Des Weiteren wurde zur Prüfung der Häufigkeitsverteilung eines
qualitativen Merkmals in verschiedenen Stichproben mit dem Chi²-Test und dem
„exakten Test“ von Fischer und mit dem WILCOXON-Test gearbeitet. Für einzelne
Ergebnisse wurden das relative Risiko und das „Odds Ratio“ berechnet
(KREIENBROCK und SCHACH 1995).
45
4 Ergebnisse
4.1 Vergleich der serologischen Testsysteme:
Aus dem Pool der Serumproben für die epidemiologische Untersuchung wurden 99
Proben mit den ELISA Testsystemen DAKO, Bommeli I (Chekit®-Hyoptest I),
Bommeli II (Chekit®-Hyoptest II) und dem der TiHo parallel gemessen.
Tab. 9: Ergebnisse der Testsysteme
DAKO
Bommeli I
Bommeli II
TiHo
Gesamtanzahl der Proben: 99, davon:
negativ
fraglich
positiv
12
19
68
58
8
33
17
21
61
35
35
29
Da alle fraglichen Ergebnisse in der folgenden Auswertung unberücksichtigt bleiben
würden, werden sie von mir durch die Einrichtung eines jeweiligen neuen Cutpoints
zu den seropositiven Proben gezählt.
4.1.1 Analyse von Häufigkeiten qualitativer Daten mit Berechnung
von Sensitivität und Spezifität
Da der DAKO-ELISA auf individuellem Niveau mit einer Sensitivität von 98-100 %
(berechnet anhand von Proben von experimentell infizierten Schweinen) in dem
akuten Stadium der Mykoplasmenpneumonie und einer Spezifität von 93-100 % (mit
Proben von SPF-Kontrolltieren ermittelt) nach Untersuchungen von S∅RENSEN et
al. (1997) bekannt ist, wird er als „Golden Standard“ angenommen und mit den
übrigen drei Systemen verglichen.
Tab. 10: Vergleich des DAKO-ELISAs mit dem Bommeli I-ELISA
positiv
Golden Standard (DAKO)
positiv
Negativ
39
3
Summe
42
48
87
57
99
Bommeli I
negativ
Summe
A. Sensitivität: 39/87 = 0,448 = 45 %
B. Spezifität : 9/12 = 0,75 = 75 %
9
12
46
Tab. 11: Vergleich des DAKO-ELISAs mit dem Bommeli II-ELISA
positiv
positiv
Negativ
74
8
Summe
82
13
87
17
99
Bommeli II
negativ
Summe
4
12
A. Sensitivität: 74/87 = 0,851 = 85 %
B. Spezifität : 4/12 = 0,33 = 33 %
Tab. 12: Vergleich des DAKO-ELISAs mit dem TiHo-ELISA
positiv
positiv
Negativ
58
6
Summe
63
29
87
35
99
TiHo
negativ
Summe
6
12
A. Sensitivität: 58/87 = 0,66 = 66 %
B. Spezifität : 6/12 = 0,5 = 50 %
Das Testsystem Bommeli II-ELISA, die Weiterentwicklung des Bommeli I-ELISAs,
zeigt, dass durch die Erhöhung der Sensitivität von 45 % auf 85 % eine Abnahme der
Spezifität von 75 % auf nur 33 % in Kauf genommen wurde, d.h. die Zahl der falschnegativen Diagnosen konnte zwar herabgesetzt werden, die Zahl der falsch-positiven
Diagnosen steigt dagegen an.
4.1.2 Konkordanzindex Kappa und Mc-Nemar-Test
Die Ergebnisse der Vergleiche der Testsysteme zeigt folgende Tabelle:
Tab. 11: Konkordanzindex Kappa und Mc-Nemar-Test
DAKO und Bommeli II
DAKO und Bommeli I
DAKO und TiHo
Kappa
0,155
0,0758
0,0913
Pr > S
0,2752
<0,0001
0,0001
Nur die beiden Testsysteme DAKO-ELISA und Bommeli II-ELISA unterscheiden sich
trotz der geringen Übereinstimmung der Testergebnisse von nur 16 % (Kappa =
0,155) hinsichtlich des prozentualen Anteils positiver Proben nicht signifikant (p >
0,05) voneinander. Der Bommeli I- sowie der TiHo-ElLISA weisen mit p < 0,01
signifikante Unterschiede zum DAKO-ELISA auf.
47
4.1.3 Regressionsanalyse
Das lineare Regressionsmodell kann keine sehr gute Annäherung der berechneten
Funktion an die tatsächlichen Werte der beiden Testsysteme DAKO- und Bommeli IIELISA liefern. Das geringe Bestimmtheitsmaß (R² = 0,2571) macht auch hier
deutlich, dass durch das Testsystem Bommeli II-ELISA nur 26 % der Variation des
DAKO-ELISAs linear erklärt wird.
Extinktionswerte Dako
160
140
120
100
y = -0,7361x + 74,769
R2 = 0,2571
80
60
40
20
0
0
20
40
60
80
100
120
Extinktionswerte BII
Abb. 4: Korrelation zwischen den Extinktionswerten der Testsysteme DAKO-ELISA
und Bommeli II-ELISA
4.2 Drei verschiedene Nachweismethoden für M. hyopneumoniae-Infektionen
im Vergleich
4.2.1 Der indirekte Immunfluoreszenztest
Insgesamt wurden 127 Lungenschnitte auf M. hyopneumoniae untersucht. Davon
war bei 49 Präparaten die typische Fluoreszenz von Mykoplasmen am Rand oder im
Lumen von Bronchien zu sehen und sie wurden somit als positiv beurteilt. Auf eine
Bewertung der Stärke der Fluoreszenz wurde dabei zugunsten der einfacheren
Auswertung verzichtet. 23
Lungenschnitte ließen sich nicht eindeutig beurteilen und wurden somit als fraglich
gekennzeichnet. 55 der 127 untersuchten Lungen zeigten keine spezifische
Fluoreszenz.
Abbildung 5 stellt zwei positive Lungenbefunde dar.
48
A
B
Abb. 5: Immunfluoreszenzmikroskopisch-positive Lungenbefunde
A: am Bronchialepitel und umgebendes Lungengewebe; B: außerdem im Lumen
eines Bronchus.
Der Immunfluoreszenztest wurde an Gefrierschnitten von Lungengewebe mit
Kaninchenhyperimmunserum gegen M. hyopneumoniae durchgeführt. Als Konjugat
diente FITC-gekoppeltes Ziege-anti-Kaninchen-Immunglobulin.
a: Bronchus, b: umgebendes Lungengewebe (400fache Vergrößerung)
4.3 Vergleich des indirekten Immunfluoreszenztests an Lungenproben mit
dem Bommeli II-ELISA korrespondierender Serumproben
Ausgehend von den 153 Schweinen, die in die Außenstelle für Epidemiologie der
Tierärztlichen Hochschule Hannover zur Sektion kamen, wurden insgesamt 127
Lungenschnitte und 137 Serumproben untersucht, Auswertungen konnten allerdings
nur für 111 „Paare“ vorgenommen werden (siehe Tabelle 13).
49
Tab. 13: Ergebnisse des Immunfluoreszenztests mit n = 111
M. hyo.
IFT
negativ
fraglich
positiv
Mw-M. hyo.
ELISA %
23,30
20,06
28,79
n
48
22
41
Auch bei dem Immunfluoreszenztest werden die fraglichen Ergebnisse zu den
positiven Proben gezählt, um sie in der Auswertung berücksichtigen zu können.
Mittels Chi²-Test konnte kein signifikanter Zusammenhang (p>0,05) zwischen den
Ergebnissen des Immunfluoreszenztests und den Extinktionswerten des Bommeli IIElisas nachgewiesen werden.
4.3.1 Überprüfung der Sensitivität und Spezifität des Bommeli II-ELISAs
Zur Überprüfung der Sensitivität und Spezifität des Bommeli II Testsystems wird der
Immunfluoreszenztest zum „Golden Standard“ gewählt, da seine Spezifität nach
SØRENSEN et al. (1997) in Bezug auf die kulturelle Untersuchung als „Golden
Standard“ bei 93-100 % und seine Sensitivität zumindest bei akuten Erkrankungen
zwischen 86-100 % lag.
Tab. 14: Vergleich des IFTs mit dem Bommeli II-ELISA
positiv
Golden Standard (IFT)
positiv
negativ
19
13
Summe
32
44
63
79
111
Bommeli II
negativ
Summe
35
48
A. Sensitivität: 19/63 = 0,30 = 30 %
B. Spezifität : 35/48 = 0,73 = 73 %
In Bezug zum IFT zeigt der Bommeli II-ELISA eine sehr geringe Sensitivität von nur
30 % und eine Spezifität von 73 %.
4.3.1.1 Konkordanzindex Kappa und Mc-Nemar-Test
Der Vergleich der beiden Testsysteme ergibt folgendes:
Tab. 15: Konkordanzindex Kappa und Mc-Nemar-Test
IFT und Bommeli II
Kappa
0,0286
Pr > S
<0,0001
Die beiden Testsysteme IFT und Bommeli II-ELISA unterscheiden sich mit p<0,01
signifikant voneinander.
50
Von den 51 kulturellen Untersuchungen hätten 50 mit den dazugehörenden
Serumproben, 38 mit den jeweiligen Lungenschnitten und insgesamt 37 mit beiden
Methoden verglichen werden können.
Von den 51 kulturellen Untersuchungen waren jedoch 27 Kulturen (53 %) wegen
Kontamination mit anderen Keimen nicht auswertbar. Die Ergebnisse der
verbliebenen 26 Kulturuntersuchungen sind in Tabelle 16 aufgeführt. In keiner dieser
Kulturen konnte M. hyopneumoniae nachgewiesen werden.
Tab. 16: Ergebnisse der kulturellen Untersuchung der Lungen auf
M. hyopneumoniae mit den dazugehörenden Befunden der
Serologie sowie des Immunfluoreszenztests
Nummer BO IIELISA
1366
-5
1617
-3,3
1618
76,5
1631
19
1632
21,3
1636
-5,2
2441
-4,45
2934
-5,5
2936
-4
3780
93,3
2935
3,9
3938
4
3939
0,3
1633
4,4
1635
103,6
2334
-3,7
4281
16,8
4336
14
4434
132,8
4222
106,9
1829
n.u.
551
-6,6
4643
5,1
3500
20
552
47,2
4205
30,5
BO II
IFT
Kultur
Neg
Neg
Pos
Neg
?
Neg
Neg
Neg
Neg
Pos
Neg
Neg
Neg
Neg
Pos
Neg
Neg
Neg
Pos
Pos
Neg
Neg
?
Pos
Pos
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
?
?
?
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Neg
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
M.hyorhinis
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
M.hyorhinis
n.n.
M.hyorhinis
n.n.
n.n.
Mykoplasmen 1
n.n.
n.n.
Mykoplasmen 2
n.n.
n.n.
BO II-ELISA = Bommeli II-ELISA (Prozent der Positivkontrolle); BO II = Beurteilung des
Bommeli II-ELISAs; n. u. = nicht untersucht; n. n. = Mykoplasmen konnten nicht
nachgewiesen werden; Mykoplasmen 1 = es konnten Mykoplasmen nachgewiesen werden,
die sich jedoch nicht differenzieren ließen. Mittels IBA wurden folgende Spezies
ausgeschlossen: M. hyorhinis, M. hyopneumoniae, M. hyosynoviae und A. granularum;
Mykoplasmen 2 = es konnten Mykoplasmen nachgewiesen werden, die sich jedoch nicht
passagieren ließen.
51
4.5.1 Auswertung der Sektionsprotokolle
Von den 135 ausgewerteten Sektionsberichten der eingesendeten Schweine nach
Bakum (überwiegend aus dem süd-westlichen Niedersachsen) konnten mit den
Daten von insgesamt 106 Tieren die Zusammenhänge zwischen Gewicht,
Lungenveränderungen, dem Bommeli II-ELISA und dem IFT überprüft werden. Allein
99 Sektionen konnten mit dem Bommeli II-ELISA verglichen werden.
Tabelle 17 gibt das Gewicht, die Anzahl dieser Sektionstiere sowie ihre
Lungenveränderungen wieder.
Tab. 17: Gewicht und Anzahl der Sektionstiere und ihre Lungenveränderungen
Gewicht in
kg
Anzahl
Lunge
o. b. B.
0,7 - 9
10,6 - 20
22 - 30
31 - 38
43 - 48
60 - 81
Summe
59
18
8
4
4
6
99
29
4
2
1
1
37
Pneumonie chron. Lungenspitzenlappenveränderung¹
20
10
7
7
6
1
3
3
1
4
29
33
Pleuritis
1
1
Lunge o. b. B.: Lunge ohne besonderen Befund
¹: mit und ohne Pneumonie
Nach dem „exakten Test“ von Fischer ist das Verteilungsmuster der
Lungenveränderungen in den einzelnen Gewichtsklassen mit p<0,05 signifikant
verschieden.
57,14 % der bis zu 20 kg schweren Tiere zeigten Lungenveränderungen (in Form
von Pneumonien, Pleuritiden und chronische Veränderungen der Lunge) auf, davon
allein 22,08 % chronische Lungenspitzenlappenveränderungen. Nur 42,86 % der
Lungen aus dieser Altersklasse waren ohne makroskopische Lungenveränderungen.
Insgesamt zeigten 81,82 % der älteren (22–81 kg) Tiere Lungenveränderungen. Bei
diesen Tieren war der Anteil der chronischen Lungenspitzenlappenveränderungen
mit 72,73 % schon mehr als dreimal so hoch als bei den jüngeren Schweinen. Nur
noch knapp 1/5 (nämlich 19,05 %) der Lungen zeigten sich ohne makroskopische
Lungenveränderungen.
Ohne einen Anhaltspunkt für eine Ursache zu haben, lässt sich hieraus schließen,
dass bei den untersuchten Schweinen die Lungen in über 50 % der Fälle schon in
einem sehr frühen Lebensalter geschädigt wurde. Die Anzahl der
Lungengeschädigten steigt mit zunehmendem Alter an, wobei allein die chronischen
Lungenveränderungen bei den noch nicht ausgewachsenen Tieren mit bis zu 81 kg
schon über 70 % betragen.
52
4.5.2 Vergleich der Ergebnisse der Serologie und des Immunfluoreszenztests
mit den makroskopischen Untersuchungen der Lungen auf M. hyopneumoniae
Bei der Korrelation der Lungenveränderungen (Lunge o. b. B., Pneumonie, Chron.
Lungenspitzenlappenveränderungen, Chron. Lungenspitzenlappenveränderungen
mit Pneumonie) mit den ELISA Testergebnissen (n = 99) zeigt der Spearman
Korrelationskoeffizient r = -0,11 mit p>0,05, dass die beiden Variablen nicht
nennenswert miteinander korreliert sind.
Mit dem Chi²-Test konnte kein signifikanter Zusammenhang (p>0,05) zwischen den
Lungenveränderungen und den Ergebnissen des Immunfluoreszenztests (n = 88)
festgestellt werden.
Bei einem Vergleich der beiden Testsysteme für jede der 4 Lungenkategorien
(Einteilung siehe oben) konnte nur für die zuletzt genannte Kategorie (n = 16) mit
dem McNemar-Test für den Bommeli II-ELISA ein signifikanter Unterschied zum IFT
(p<0,05) nachgewiesen werden. Der Immunfluoreszenztest war bei 10 von 16
Lungen mit chronischen Lungenspitzenlappenveränderungen und Pneumonie positiv
im Gegensatz zum Bommeli II-ELISA, der von den 16 Lungen nur 3 als positiv
erkannte.
Tabelle 18 zeigt die unauffällige Lunge in Bezug zu den negativen Ergebnissen des
Bommeli II-ELISAS und des Immunfluoreszenztestes und die pathologischen
Veränderungen der Lunge in Beziehung zu den positiven Ergebnissen der beiden
Testsysteme.
Tab. 18: Lungenveränderungen in Bezug zu den Nachweisraten (n = 81)
Nur BO II-ELISA nur IFT negativ
negativ
Lunge o. b. B.
68,75 %
46,88 %
Nur BO II-ELISA
nur IFT positiv
positiv
Lungenveränderungen
26,53 %
gesamt
chron.
Lungenspitzenlappenver- 30,77 %
änderungen¹
BO II-ELISA
negativ +
IFT negativ
31,25 %
BO II-ELISA
positiv +
IFT positiv
63,27 %
16,33 %
61,54 %
19,23 %
Lunge o.b.B.: Lunge ohne besonderen Befund
¹: mit und ohne Pneumonie
Nur bei 10 von 32 (31,25 %)der Tiere mit einer unauffälligen Lunge waren sowohl der
Bommeli II-ELISA als auch der Immunfluoreszenztest negativ. Bei einem Vergleich
der Lungen ohne besonderen Befund nur mit dem Immunfluoreszenztest bzw. nur
mit dem ELISA lag der Anteil der Übereinstimmungen bei 46,88 % bzw. 68,75 %.
Bei den Lungenveränderungen allgemein und speziell bei den chronischen
Lungenspitzenlappenveränderungen war es teilweise ähnlich. Hier zeigte sich bei
dem Vergleich mit den positiven ELISA- und Immunfluoreszenztestergebnissen eine
Übereinstimmung in 16,33 % (8 von 49) bzw. 19,23 % (5 von 26) der Fälle.
Wurden jedoch diese Lungenveränderungen nur mit dem Immunfluoreszenztest
verglichen, stimmten 63,27 % bzw. 61,54 % der Untersuchungen überein. Verglich
53
man aber die Pathologie nur mit dem Bommeli II-ELISA, so waren 13 von 49 (26,53
%) der Tiere bzw. 8 von 26 (30,77 %) der Schweine positiv.
4.6.1 Auswertung der untersuchten Serumproben von Schlachtschweinen
Die Proben für die Antikörperbestimmung auf M. hyopneumoniae stammen aus 106
Betrieben,
die
Proben
für
die
Titerbestimmung
mit
dem
Hämagglutinationshemmungstest gegen porcine Influenzaviren der Subtypen A
(SCHENK 2000) kommen aus 136 Betrieben aus den Landkreisen Osnabrück,
Vechta und Steinfurt und wurden 1996 auf zwei Schlachthöfen durch Mitarbeiter des
Veterinäramtes des Landkreises Osnabrück gewonnen. Zu dieser Zeit wurden noch
keine Impfungen gegen M. hyopneumoniae durchgeführt.
4.6.1.1 Scheinbare Intra-Herden-Prävalenz (PN) von M. hyopneumoniae
Die scheinbare Intra-Herden-Prävalenz ergibt sich aus dem Anteil sero-positiver
Proben an der Gesamtstichprobenzahl. Die serologische Untersuchung auf M.
hyopneumoniae erfolgte mit dem Bommeli II-ELISA. Auch hier wurden die fraglichen
Proben zu den positiven gezählt.
Tab. 19: Anteil positiver Proben an der Gesamtstichprobenzahl
Gesamtstichprobenzahl
M. hyopneumoniae-sero-positiv
scheinbare Intra-Herden-Prävalenz (PN)
(%)
1392
1131
81,25
Von den 1392 untersuchten Serumproben sind 1131 Proben positiv, d.h. sie wiesen
eine Antikörperaktivität gegen M. hyopneumoniae auf. Hiermit beträgt die scheinbare
Intra-Herden-Prävalenz 81,25 %.
Pro Herde (106) wurde jeweils separat die scheinbare Intra-Herden-Prävalenz
errechnet und daraus der Mittelwert gebildet. Dieser ergibt somit:
81,41 % ± 26,88 % (Mittelwert (PN) ± einfache Standardabweichung).
4.6.1.2 Scheinbare Intra-Herden-Prävalenz (PN) von Antikörpern
gegen Influenzavirus A/swine/Bakum/5/95 (H1N1)
Influenzavirus H1N1-sero-positiv
(%)
2057
1208
58,73
54
Von den 2057 untersuchten Serumproben sind 1208 Proben positiv, d.h. sie wiesen
Antikörperaktivitäten gegen Influenzavirus H1N1 auf. Hiermit liegt die scheinbare
Intra-Herden-Prävalenz bei 58,73 %
Der arithmetische Mittelwert aus der Gesamtheit der 136 scheinbaren Intra-HerdenPrävalenzen ergibt:
4.6.1.3 Scheinbare Intra-Herden-Prävalenz (PN) von Antikörpern
gegen Influenzavirus A/swine/Bakum/909/93 (H3N2)
Influenzavirus H3N2-sero-positiv
(%)
2756
360
13,06
Von den 2756 untersuchten Serumproben sind 360 Proben positiv. Die scheinbare
Intra-Herden-Prävalenz beträgt also 13,06 %
Der arithmetische Mittelwert aus der Gesamtheit der 136 scheinbaren Intra-HerdenPrävalenzen ergibt:
4.6.1.4 Scheinbare Herden-Prävalenz von M. hyopneumoniae:
Die scheinbare Herden-Prävalenz gibt den prozentualen Anteil der seropositiven
Bestände bezogen auf die 106 bzw. 136 untersuchten Bestände an. Ein Bestand gilt
hierbei als positiv, wenn mindestens ein Tier seropositiv reagiert. Auf M.
hyopneumoniae bezogen stellen sich 103 Betriebe als seropositiv heraus (siehe
Tabelle 22). Die scheinbare Herden-Prävalenz beträgt somit 97,17 %.
Tab. 22: Anzahl der seropositiven Bestände, ausgehend von der scheinbaren
Herden-Prävalenz
Untersuchte Bestände
106
M. hyopneumoniae-seropositiv 103
scheinbare Herden-Prävalenz 97,17
(%)
55
4.6.1.5 Scheinbare Herden-Prävalenz von Antikörpern gegen
Herden-Prävalenz
136
Influenzavirus H1N-seropositiv 131
scheinbare Herden-Prävalenz
96,32
(%)
Für die scheinbare Herden-Prävalenz von Influenzavirus H1N1 läßt sich ein Wert von
96,32 % ermitteln.
4.6.1.6 Scheinbare Herden-Prävalenz von Antikörpern gegen
Herden-Prävalenz
Influenzavirus H3N2-seropositiv
scheinbare Herden-Prävalenz
(%)
136
83
61,03
Die scheinbare Herden-Prävalenz von Influenzavirus H3N2 entspricht 61,03 %.
4.6.2 Einflußfaktoren auf die Intra-Herden-Prävalenzen
Von 107 Betrieben sind die Aufstallungsform und das Hygieneregime nach POPPE
(1997) bekannt, so dass nun die Berechnung von Risikofaktoren der verschiedenen
Managementsysteme vorgenommen werden kann. Im Einzelnen werden die
Einflüsse durch Betriebsgröße und –struktur sowie Art und Herkunft der Ferkel auf
die scheinbare Intra-Herden-Prävalenz (PN) geprüft.
Für die verschiedenen Risikofaktoren sind das relative Risiko (RR) sowie das „Odds
Ratio“ (OR) berechnet worden. Das relative Risiko ist definitionsgemäß das
Verhältnis des Risikos bei den Exponierten zum Risiko bei den Nicht-Exponierten. Es
gibt den Faktor an, um den sich die Erkrankungswahrscheinlichkeit erhöht, wenn
man einer definierten Exposition unterliegt. Das „Odds Ratio“ ist als der Faktor zu
interpretieren, um den die Chance zu erkranken steigt, wenn man exponiert ist.
Für die einzelnen Berechnungen sind die scheinbaren Intra-Herden-Prävalenzen
verwendet worden. In den Tabellen 9, 11, 13, 15 und 17 nehmen die Intra-HerdenPrävalenzen jeweils horizontal von links nach rechts bzw. von oben nach unten ab.
Das „Odds Ratio“ der vertikal aufgeführten im Vergleich zu den horizontal
aufgeführten Einflussfaktoren befindet sich in den Tabellen oben rechts, während
das relative Risiko der horizontal aufgereihten gegenüber den vertikal aufgereihten
Einflussfaktoren unten links in den Tabellen zu finden ist.
56
4.6.2.1 Anzahl und Einfluss der Mastplätze auf die
In der folgenden Tabelle sind die Häufigkeiten der Intra-Herden-Prävalenz in Bezug
auf die Anzahl der Mastplätze dargestellt. Aus Gründen der besseren Übersicht ist
die Intra-Herden-Prävalenz in fünf Klassen eingeteilt worden. Von den insgesamt 83
Betrieben sind nur 3 Betriebe seronegativ. Die meisten Betriebe haben eine Größe
von 301-900 Mastplätzen, davon besitzen 45 Bestände 301-600 und 22 Bestände
601-900 Mastplätze.
Tab. 25: Häufigkeiten der Intra-Herden-Prävalenz in Bezug auf die Anzahl der
Mastplätze
PN
0%
1-25 %
26-50 %
51-75 %
76-100 %
Summe
<300
0
0
0
1
5
6
301-600
1
4
4
5
31
45
601-900
2
2
0
1
17
22
> 900
0
0
0
1
9
10
Summe
3
6
6
8
62
83
PN: scheinbare Intra-Herden-Prävalenz
Anteile der Betriebe und der Intra-HerdenPrävalenz (PN) in Prozent
Abbildung 6 zeigt die Anzahl der Mastplätze der untersuchten Betriebe mit den
dazugehörenden Mittelwerten der scheinbaren Intra-Herden-Prävalenz.
100
90
80
70
60
Betriebe
PN
50
40
30
20
10
0
300
301-600
601-900
900
Anzahl der Mastplätze
Abb. 6: Mastplätze und scheinbare Intra-Herden-Prävalenz der untersuchten
Bestände
Für die Einflussgröße Anzahl der Mastplätze pro Betrieb in Bezug auf die IntraHerden-Prävalenz haben sich mittels WILCOXON-Test keine signifikanten
Unterschiede (p>0,05) ergeben.
57
Die Berechnungen des relativen Risikos (RR) und des „Odds Ratio“s (OR) zeigen,
dass z. B. für Ferkel in Betrieben mit mehr als 900 Mastplätzen das relative Risiko
um das 1,29fache höher ist, sich mit M. hyopneumoniae zu infizieren, als in
Betrieben mit 601-900 Mastplätzen und um das 1,26fache höher als in Betrieben mit
301-600 Mastplätzen. Die Chance steigt dabei um den Faktor 6,47 bzw. 5,79, dass
die Ferkel sich tatsächlich mit M. hyopneumoniae infizieren. Weiteres siehe Tabelle
26.
Tab. 26: Relatives Risiko (unten links) und „Odds Ratio“ (oben rechts) für Ferkel, sich
aufgrund der Anzahl der Mastplätze mit M. hyopneumoniae zu infizieren
> 900
(PN=94,6 %)
> 900
< 300
301-600
601-900
1,10
1,26
1,29
< 300
(PN=85,9 %)
2,88
1,14
1,18
301-600
(PN=75,9 %)
5,79
2,01
601-900
(PN=72,4 %)
6,47
2,24
1,12
1,03
PN: Mittelwerte der scheinbaren Intra-Herden-Prävalenzen
4.6.2.2 Anzahl und Einfluss der Mastplätze auf Infektionen mit
Der Großteil der untersuchten Betriebe hat eine Größe von 301-900 Mastplätzen.
Von diesen haben 62 Betriebe zwischen 301-600 Mastplätze und 27 Betriebe haben
601-900 Mastplätze.
Mastplätze
PN
0%
1-25 %
26-50 %
51-75 %
76-100 %
Summe
<300
0
0
0
2
4
6
301-600
2
14
13
8
25
62
601-900
2
2
7
3
13
27
> 900
0
2
3
3
4
12
Summe
4
18
23
16
46
107
Mittels WILCOXON-Test ließ sich für die Einflussgröße Anzahl der Mastplätze pro
Betrieb in Bezug auf die Intra-Herden-Prävalenz keine signifikanten Unterschiede
(p>0,05) errechnen.
Tabelle 28 ist zu entnehmen, dass das relative Risiko für Ferkel, sich mit
Influenzavirus H1N1 zu infizieren, in Betrieben mit weniger als 300 Mastplätzen
1,52fach höher ist als in Betrieben mit 301-600 Mastplätzen. Desgleichen steigt die
Chance, dass sich diese Ferkel in den Betrieben, die bis zu 300 Mastplätze
aufweisen, mit diesem Erreger infizieren um den Faktor 4,38 verglichen mit den
Ferkeln aus den Betrieben mit 301-600 Mastplätzen.
58
aufgrund der Anzahl der Mastplätze mit Influenzavirus H1N1 zu infizieren
< 300
(PN=85,0 %)
< 300
601-900
> 900
301-600
1,31
1,38
1,52
601-900
(PN=62,3 %)
3,01
1,06
1,16
> 900
(PN=60,7 %)
3,50
1,16
301-600
(PN=56,0 %)
4,38
1,46
1,25
1,10
4.6.2.3 Anzahl und Einfluss der Mastplätze auf Infektionen mit
Die Anzahl und Verteilung der Bestände auf die verschiedenen Betriebsgrößen ist für
Influenzavirus H3N2 genauso wie für Influenzavirus H1N1 (siehe unter 4.6.2.2,
Tabelle 27), nur die Anzahl der Betriebe innerhalb der Intra-Herden-PrävalenzKlassen ist unterschiedlich.
Mastplätze
PN
0%
1-25 %
26-50 %
51-75 %
76-100 %
Summe
<300
2
3
1
0
0
6
301-600
26
20
8
5
3
62
601-900
14
7
3
1
2
27
> 900
2
7
1
1
1
12
Summe
44
37
13
7
6
107
Die Beziehung zwischen Anzahl der Mastplätze pro Betrieb und Intra-HerdenPrävalenz ist mittels WILCOXON-Test überprüft worden. Es haben sich keine
signifikanten Unterschiede (p>0,05) ergeben.
Ferkel aus Betrieben mit mehr als 900 Mastplätzen haben ein um 1,97fach höheres
relatives Risiko, sich mit Influenzavirus H3N2 zu infizieren, als Ferkel aus Betrieben
mit weniger als 300 Mastplätzen (siehe Tabelle 30). Im gleichen Fall steigt die
Chance, dass sich Ferkel in Betrieben mit mehr als 900 Mastplätzen eher mit
Influenzavirus H3N2 infizieren als in Beständen mit weniger als 300 Mastplätzen, um
den Faktor 2,20.
59
aufgrund der Anzahl der Mastplätze mit Influenzavirus H3N2 zu infizieren
> 900
(PN=19,5 %)
> 900
601-900
301-600
<300
1,07
1,13
1,97
601-900
(PN=17,9 %)
1,09
1,06
1,84
301-600
(PN=17,2 %)
1,16
1,07
< 300
(PN=10,1 %)
2,20
2,02
1,89
1,74
4.6.2.4 Einfluss der Betriebsform auf die M. hyopneumoniae-Prävalenz
Die Beziehung zwischen der Intra-Herden-Prävalenz und der Betriebsform ist in der
folgenden Tabelle aufgeführt. Von den 83 untersuchten Betrieben werden 28 als so
genannte geschlossene Betriebe und 55 als reine Mastbetriebe bezeichnet.
Tab. 31: Beziehung zwischen der Intra-Herden-Prävalenz und der Betriebsform
PN
0%
1-25 %
26-50 %
51-75 %
76-100 %
Summe
Geschlossener
Betrieb
1
3
0
3
21
28
Mastbetrieb
Summe
2
3
4
5
41
55
3
6
4
8
62
83
Mittels WILCOXON-Test ist der Zusammenhang zwischen der Intra-HerdenPrävalenz und der Betriebsform überprüft worden. Da mit p>0,05 kein statistischer
Unterschied aufgetreten ist, ist ein Einfluss der Betriebsform auf die Intra-HerdenPrävalenz nicht gegeben.
Tabelle 32 zeigt, dass die Ferkel in Mastbetrieben einem 1,06fach höherem relativen
Risiko ausgesetzt sind, sich mit M. hyopneumoniae zu infizieren, als Ferkel in
geschlossenen Betrieben. Die Chance, dass sie sich infizieren, steigt dabei um den
Faktor 1,28.
aufgrund der Betriebsform mit M.hyopneumoniae zu infizieren
Mastbetrieb
(PN=78,9 %)
Mastbetrieb
geschlossener
Betrieb
geschlossener
Betrieb
(PN=76,1 %)
1,28
1,06
60
4.6.2.5 Einfluss der Betriebsform auf Infektionen mit
Unter den 107 untersuchten Betrieben befinden sich 69 Mastbetriebe und 38
geschlossene Betriebe.
PN
0%
1-25 %
26-50 %
51-75 %
76-100 %
Summe
Geschlossener
Betrieb
1
8
9
7
13
38
Mastbetrieb
Summe
3
10
14
9
33
69
4
18
23
16
46
107
Die Auswertung mittels WILCOXON-Test weist keine statistischen Unterschiede
innerhalb der Betriebsformen auf (p>0,05). Ein Einfluss der Betriebsform auf die
Intra-Herden-Prävalenz von Influenzavirus H1N1 kann daher ausgeschlossen
werden.
Die Chance, dass sich Ferkel in Mastbetrieben mit Influenzavirus H1N1 infizieren,
steigt um den Faktor 1,53 im Vergleich zu den Tieren aus geschlossenen Betrieben.
Gleichwohl sind diese Ferkel in Mastbetrieben einem 1,19fach höherem relativen
Risiko ausgesetzt, sich mit Influenzavirus H1N1 zu infizieren, als Ferkel in
geschlossenen Betrieben (siehe Tabelle 34).
aufgrund der Betriebsform mit Influenzavirus H1N1 zu infizieren
Mastbetrieb
(PN=63,0 %)
Mastbetrieb
geschlossener
Betrieb
geschlossener
Betrieb
(PN=54,3 %)
1,53
1,19
61
4.6.2.6 Einfluss der Betriebsform auf Infektionen mit
Auch hier ist nur die Anzahl der Betriebe in den einzelnen Intra-Herden-PrävalenzKlassen im Vergleich zu Influenzavirus H1N1 unterschiedlich.
PN
0%
1-25 %
26-50 %
51-75 %
76-100 %
Summe
Geschlossener
Betrieb
14
12
5
5
2
38
Mastbetrieb
Summe
30
25
8
2
4
69
44
37
13
7
6
107
Die beiden Betriebsformen in Beziehung zur Intra-Herden-Prävalenz sind anhand
des WILCOXON-Tests miteinander verglichen worden. Es traten keine statistischen
Unterschiede (p>0,05) auf.
Die Ferkel in geschlossenen Betrieben sind einem 1,40fach höherem relativen Risiko
ausgesetzt, sich mit Influenzavirus H3N2 zu infizieren, als Ferkel in Mastbetrieben
(siehe Tabelle 36). Die Chance, dass sie erkranken, ist dabei um den Faktor 1,50
erhöht.
aufgrund der Betriebsform mit Influenzavirus H3N2 zu infizieren
geschlossener
Betrieb
(PN=21,40 %)
geschlossener
Betrieb
Mastbetrieb
Mastbetrieb
(PN=14,9 %)
1,50
1,40
4.6.2.7 Einfluss der Einstallungsform auf die M. hyopneumoniae-Prävalenz
Die 83 untersuchten Bestände weisen unterschiedliche Einstallungsformen auf. Eine
davon ist die kontinuierliche Belegung, die nur in geschlossenen Betrieben zu finden
ist. Eine weitere ist das so genannte „Rein-Raus-Verfahren“. Hier werden entweder
sämtliche Stallungen des Hofes (hofweise rein-raus) vollständig ausgestallt, gereinigt
und desinfiziert, bevor die nächsten Ferkel eintreffen, oder aber nur einzelne Abteile
in den Stallungen (abteilweise rein-raus). Die Einstallungsform hofweise rein-raus
wird dabei nur in Mastbetrieben angewendet. Das abteilweise Rein-Raus-Verfahren
wird von beiden Betriebsformen genutzt. Die 39 hier untersuchten Betriebe dieser
Kategorie teilen sich dabei in 18 geschlossene Betriebe und 21 Mastbetriebe auf.
62
Beim Erzeuger-Mäster-Direktverkehr erhält der Mäster die Ferkel immer direkt vom
selben Ferkelerzeuger, die Einstallungsform ist jedoch nicht bekannt.
Tab. 37: Einfluss der Einstallungsform auf die Intra-Herden-Prävalenz
PN
kontinuierlich hofweise
rein-raus
0%
1-25 %
26-50 %
51-75 %
76-100 %
Summe
0
0
0
2
8
10
0
0
3
3
19
25
abteilweise Erzeuger-Mästerrein-raus
Direktverkehr
mit unbekannter
Einstallungsform
3
0
3
3
1
0
3
0
29
6
39
9
Summe
3
6
4
8
62
83
Die Auswertung mittels WILCOXON-Test weist keine statistischen Unterschiede
innerhalb der Einstallungsformen auf (p>0,05). Ein Zusammenhang zwischen der
Einstallungsform und der Intra-Herden-Prävalenz ist daher unwahrscheinlich.
Die Chance, dass sich Ferkel aus Betrieben mit kontinuierlicher Belegung mit M.
hyopneumoniae infizieren, steigt um den Faktor 3,07 im Vergleich zu den Tieren aus
Betrieben, die ihre Ferkel direkt vom Erzeuger beziehen. Gleichermaßen sind die
Ferkel aus Betrieben mit kontinuierlicher Belegung einem 1,28fach höherem relativen
Risiko ausgesetzt, sich mit M. hyopneumoniae zu infizieren, als Tiere aus den
Betrieben des Erzeuger-Mäster-Direktverkehrs. Weitere Informationen sind der
folgenden Tabelle zu entnehmen.
in verschiedenen Einstallungsformen mit M. hyopneumoniae zu infizieren
kontinuierlich
hofweise
rein-raus
abteilweise
rein-raus
Erzeuger-MästerDirektverkehr mit
unbekannter
Einstallungsform
hofweise
abteilweise unbekannter
kontinuierlich rein-raus
rein-raus
Einstallungsform
(PN=85,9 %)
(PN=82,3 %) (PN=75,6 %) (PN=67,5 %)
1,36
2,10
3,07
1,05
1,55
1,15
1,20
1,28
1,22
2,25
1,46
1,11
63
4.6.2.8 Einfluss der Einstallungsform auf Infektionen mit
Von den insgesamt 107 untersuchten Betrieben werden die 49 Betriebe, die mit dem
abteilweise Rein-Raus-Verfahren arbeiten, in 23 geschlossene Betriebe und 26
Mastbetriebe aufgeteilt.
PN
rein-raus
0%
1-25 %
26-50 %
51-75 %
76-100 %
Summe
1
1
3
3
7
15
0
4
6
5
17
32
Direktverkehr
mit unbekannter
Einstallungsform
2
1
11
2
12
2
7
1
17
5
49
11
Summe
4
18
23
16
46
107
Für die Einflussgrösse Einstallungsform in Bezug auf die Intra-Herden-Prävalenz
haben sich mittels WILCOXON-Test keine signifikanten Unterschiede (p>0,05)
gezeigt.
Die Berechnungen des relativen Risikos (RR) und der „Odds Ratio“ (OR) zeigen,
dass für Ferkel in Betrieben, die hofweise rein-raus einstallen, das relative Risiko um
das 1,29fache höher ist, sich mit Influenzavirus H1N1 zu infizieren, als in Betrieben
mit dem abteilweise Rein-Raus-Verfahren (siehe Tabelle 40). Die Chance steigt
dabei um den Faktor 1,96, dass sich die Tiere tatsächlich mit Influenzavirus H1N1
infizieren.
in verschiedenen Einstallungsformen mit Influenzavirus H1N1 zu infizieren
kontinuierlich Erzeuger-Mäster- abteilweise
hofweise
Direktverkehr mit rein-raus
rein-raus
unbekannter
Einstallungsform
(PN=69,7 %) (PN=62,6 %)
(PN=55,6 %)
(PN=53,6 %)
hofweise
rein-raus
kontinuierlich
Erzeuger-Mäster
Direktverkehr mit
unbekannter
Einstallungsform
abteilweise
rein-raus
1,38
1,11
1,19
1,06
1,29
1,16
1,61
1,96
1,17
1,43
1,22
1,09
64
4.6.2.9 Einfluss der Einstallungsform auf Infektionen mit
Die Einteilung der 49 Betriebe mit abteilweisem Rein-Raus-Verfahren in
geschlossene Betriebe und Mastbetriebe ist genauso, wie unter 4.6.2.8 beschrieben.
PN
rein-raus
0%
1-25 %
26-50 %
51-75 %
76-100 %
Summe
4
6
1
3
1
15
15
10
5
1
1
32
Direktverkehr
mit unbekannter
Einstallungsform
20
5
18
3
6
1
3
0
2
2
49
11
Summe
44
37
13
7
6
107
Die verschiedenen Einstallungsformen in Bezug auf die Intra-Herden-Prävalenzen
sind mittels WILCOXON-Test überprüft worden. Es zeigten sich keine statistischen
Unterschiede (p>0,05).
Tabelle 42 zeigt, dass das relative Risiko der Ferkel, sich mit Influenzavirus H3N2 zu
infizieren, in Betrieben mit kontinuierlicher Belegung 1,95fach höher ist als für Ferkel
in Betrieben mit hofweisem Rein-Raus-Verfahren. Im gleichen Fall steigt die Chance,
dass sich die Ferkel in den Betrieben mit kontinuierlicher Belegung eher mit
Influenzavirus H3N2 infizieren, um den Faktor 2,27 verglichen mit den Ferkeln in
Betrieben, die hofweise rein-raus einstallen.
in verschiedenen Einstallungsformen mit Influenzavirus H3N2 zu infizieren
kontinuierlich
unbekannter
Einstallungsform
abteilweise
rein-raus
hofweise
rein-raus
Erzeuger-Mästerkontinuierlich Direktverkehr mit
unbekannter
Einstallungsform
(PN=25,6 %)
(PN=23,9 %)
1,02
abteilweise
rein-raus
1,01
1,78
1,60
1,59
1,95
1,92
hofweise
rein-raus
(PN=15,9 %) (PN=13,1 %)
1,81
2,27
2,23
1,25
1,21
65
4.6.2.10 Einfluss der Ferkelherkunft auf die M. hyopneumoniae-Prävalenz
Die zu mästenden Ferkel lassen sich in vier Gruppen einteilen:
Betrieb aus bis zu 40 Ferkelerzeugerbetrieben aufgekauft und bis zu einem
Körpergewicht von ca. 28 kg (10.-12. Lebenswoche) aufgezogen, um sie
anschließend an die Mäster weiter verkaufen zu können. Das Ziel dieses
Verfahrens ist die Schaffung eines annähernd einheitlichen Immunstatus innerhalb
der Ferkelgruppe. Für die Mäster ist es dann von Vorteil, wenn sie die Ferkel
möglichst von nur einem Systemferkelaufzüchter beziehen.
der Mäster aber erwirbt sie von verschiedenen Ferkelerzeugern. Hierdurch weisen
diese Ferkel einen sehr uneinheitlichen Immunstatus auf.
-Mäster-Direktverkehr arbeiten der Ferkelerzeuger und der
Mäster sozusagen eng zusammen, da der Mäster die ca. 28 kg schweren und
über einen einheitlichen Immunstatus verfügenden Ferkel immer von demselben
Ferkelerzeuger erhält.
Tab. 43: Beziehung zwischen der Ferkelherkunft und der M. hyopneumoniae-IntraHerden-Prävalenz
PN
eigene
Ferkel
Systemferkel
Qualitätsferkel
0%
1-25 %
26-50 %
51-75 %
76-100 %
Summe
1
3
0
3
21
28
1
0
2
1
14
18
1
0
2
4
21
28
ErzeugerMästerDirektverkehr
0
3
0
0
6
9
Summe
3
6
4
8
62
83
Die verschiedenen Ferkelherkünfte in Beziehung zur Intra-Herden-Prävalenz sind
anhand des WILCOXON-Testes miteinander verglichen worden. Dabei sind keine
statistischen Unterschiede (p>0,05) sichtbar geworden.
Tabelle 44 zeigt, dass das relative Risiko für Qualitätsferkel, sich mit M.
hyopneumoniae zu infizieren, 1,22fach höher ist als für Ferkel aus den Betrieben des
Erzeuger-Mäster-Direktverkehrs. Außerdem steigt die Chance, dass sich
Qualitätsferkel eher mit M. hyopneumoniae infizieren als Tiere aus Betrieben, die ihre
Ferkel direkt vom Erzeuger beziehen, um den Faktor 2,30.
66
aufgrund verschiedener Ferkelherkünfte mit M. hyopneumoniae zu infizieren
Qualitätsferkel Systemferkel
(PN=82,5 %)
Qualitätsferkel
Systemferkel 1,04
Eigene Ferkel 1,10
ErzeugerMäster1,22
Direktverkehr
(PN=79,2 %)
1,23
Eigene Ferkel
(PN=76,1 %)
1,61
1,30
1,06
1,18
(PN=67,5 %)
2,30
1,86
1,43
1,11
4.6.2.11 Einfluss der Ferkelherkunft auf Infektionen mit
Tab. 45: Beziehung zwischen der Ferkelherkunft und der Intra-Herden-Prävalenz
PN
eigene
Ferkel
Systemferkel
Qualitätsferkel
0%
1-25 %
26-50 %
51-75 %
76-100 %
Summe
1
8
9
7
13
38
0
3
3
4
12
22
2
5
9
4
16
28
1
2
2
1
5
11
Summe
4
18
23
16
46
107
Auch hier wurden die verschiedenen Ferkelherkünfte in Beziehung zur Intra-HerdenPrävalenz anhand des WILCOXON-Testes miteinander verglichen, und es sind keine
statistischen Unterschiede (p>0,05) sichtbar geworden.
Die Chance, dass sich Systemferkel mit Influenzavirus H1N1 infizieren, steigt um den
Faktor 2,15 im Vergleich zu den eigenen Ferkeln aus geschlossenen Betrieben. Des
Weiteren sind die Systemferkel einem 1,33fach höherem relativen Risiko ausgesetzt,
sich mit Influenzavirus H1N1 zu infizieren, als die eigenen Ferkel (siehe Tabelle 46).
67
aufgrund verschiedener Ferkelherkünfte mit Influenzavirus H1N1 zu
infizieren
Systemferkel
(PN=71,1 %)
Systemferkel
Qualitätsferkel 1,17
ErzeugerMäster1,21
Direktverkehr
Eigene Ferkel 1,33
Qualitätsferkel ErzeugerMästerDirektverkehr
(PN=60,3 %)
(PN=55,6 %)
1,59
1,74
1,10
Eigene Ferkel
1,04
1,23
1,14
(PN=54,3 %)
2,15
1,35
1,10
4.6.2.12 Einfluss der Ferkelherkunft auf Infektionen mit
Tab. 47: Beziehung zwischen der Ferkelherkunft und der Intra-Herden-Prävalenz
PN
0%
1-25 %
26-50 %
51-75 %
76-100 %
Summe
eigene
Ferkel
Systemferkel
Qualitätsferkel
14
12
5
5
2
38
11
7
3
1
0
22
14
15
4
1
2
28
5
3
1
0
2
11
Summe
44
37
13
7
6
107
Bei der Einflussgröße Ferkelherkunft sind mittels WILCOXON-Test zwischen den 4
Klassen in Bezug auf die Intra-Herden-Prävalenz keine signifikanten Unterschiede
zum Vorschein gekommen (p>0,05).
Tiere aus den Betrieben des Erzeuger-Mäster-Direktverkehrs sind einem 2,52fach
höherem relativen Risiko ausgesetzt, sich mit Influenzavirus H3N2 zu infizieren, als
Systemferkel. Das „Odds Ratio“ beträgt dabei 3,03. Weiteres siehe Tabelle 48.
68
aufgrund verschiedener Ferkelherkünfte mit Influenzavirus H3N2 zu
infizieren
(PN=71,1 %)
eigene Ferkel 1,21
Qualitätsferkel 1,61
Systemferkel 2,52
eigene Ferkel
Qualitätsferkel Systemferkel
(PN=60,3 %)
(PN=55,6 %)
(PN=54,3 %)
1,28
1,81
3,03
1,42
2,37
1,67
1,33
1,87
1,56
4.6.2.13 Einfluss der Produktionsverfahren auf die
Wie aus Tabelle 49 ersichtlich, sind die 83 untersuchten Betriebe in 7 Klassen bzgl.
ihrer Managementsysteme bzw. Produktionsverfahren eingeteilt worden. Das
Produktionsverfahren ist dabei als eine Zusammenstellung von Betriebsstruktur,
Einstallungsform und Ferkelherkunft zu verstehen.
Tab. 49: Zusammenhang zwischen den Produktionsverfahren und der Intra-HerdenPrävalenz
1
hofweise
reinPN
raus;
Qu.ferkel
0%
0
1-25 % 0
26-50
1
%
51-75
2
%
76-100
10
%
Sum13
me
2
hofweise
reinraus;
Systemferkel
0
0
3
abteilweise
reinraus;
Qu.ferkel
1
0
Klassen
4
abteilweise
reinraus;
Systemferkel
1
0
2
1
1
5
6
geschl.
Betrieb;
kontinuierlich
0
3
0
0
7
geschl.
Betrieb;
abteilweise
reinraus
1
3
0
0
0
0
4
2
0
0
2
1
8
9
11
5
6
8
13
62
12
15
6
9
10
18
83
Summe
3
6
In Bezug auf den Einflussfaktor Produktionsverfahren sind mittels WILCOXON-Test
zwischen den 7 Klassen hinsichtlich der Intra-Herden-Prävalenz keine signifikanten
Unterschiede aufgetreten (p>0,05).
69
Abbildung 7 veranschaulicht den Einfluss der Managementsysteme auf die IntraHerden-Prävalenz von M. hyopneumoniae sowie auf die Mittelwerte der
Extinktionswerte pro Betrieb.
Tendenziell zeigten geschlossene Betriebe mit kontinuierlicher Belegung sowie
Betriebe mit hofweisem Rein-Raus von Qualitätsferkeln aus zahlreichen Herkünften
die höchsten Intra-Herden-Prävalenzen, die niedrigsten wiesen die Betriebe mit
Ferkelerzeuger-Mäster-Direktverkehr.
120
100
(%)
80
Prävalenz
Mw-OD
60
40
20
0
=5
=7
=2
=3
=4
=1
=6
Managementsysteme
Abb.7: Einfluss der Managementsysteme auf die Intra-Herden-Prävalenz und die
Mittelwerte der Extinktionswerte der 83 Betriebe
Zeichenerklärung:
1 = Mastbetrieb; hofweise rein-raus; Qualitätsferkel
2 = Mastbetrieb; hofweise rein-raus; Systemferkel
3 = Mastbetrieb; abteilweise rein-raus; Qualitätsferkel
4 = Mastbetrieb; abteilweise rein-raus; Systemferkel
5 = Mastbetrieb; Erzeuger-Mäster-Direktverkehr
6 = geschlossener Betrieb; kontinuierliche Belegung
7 = geschlossener Betrieb; abteilweise rein-raus
Mw-OD = Mittelwerte der gemessenen Optischen Dichten im ELISA
Die Berechnungen des relativen Risikos (RR) und des „Odds Ratio“ (OR) zeigen,
dass z.B. für eigene Ferkel aus den geschlossenen Betrieben mit kontinuierlicher
Belegung das relative Risiko, sich mit M. hyopneumoniae zu infizieren, 1,28fach
höher liegt als für Ferkel aus dem Erzeuger-Mäster-Direktverkehr und 1,25fach höher
als für eigene Ferkel aus den geschlossenen Betrieben mit abteilweiser Rein-RausBelegung (siehe Tabelle 50). Im gleichen Fall steigt für diese eigenen Ferkel die
Chance, sich mit M. hyopneumoniae zu infizieren, bis zum Faktor 3,07 verglichen mit
den Ferkeln aus dem Erzeuger-Mäster-Direktverkehr und bis zum Faktor 2,82
verglichen mit den Ferkeln aus den geschlossenen Betrieben mit abteilweisem ReinRaus-Verfahren.
70
bei verschiedenen Produktionsverfahren mit M. hyopneumoniae zu
infizieren
Klasse
6
(PN=
85,9 %)
Klasse 6
Klasse 1
Klasse 3
Klasse 4
Klasse 2
Klasse 7
Klasse 5
1,01
1,07
1,08
1,09
1,25
1,28
Klasse
Klasse
1
3
(PN=
(PN=
85,4 %) 79,9 %)
1,11
1,04
1,39
1,06
1,07
1,01
1,07
1,02
1,23
1,16
1,26
1,19
Klasse
Klasse
4
2
(PN=
(PN=
79,5 %) 79,1 %)
1,04
1,66
1,46
1,50
1,05
2,93
2,93
1,01
1,15
1,14
1,18
1,18
Klasse 1: Mastbetrieb; hofweise rein-raus; Qualitätsferkel
Klasse 2: Mastbetrieb; hofweise rein-raus; Systemferkel
Klasse 3: Mastbetrieb; abteilweise rein-raus; Qualitätsferkel
Klasse 4: Mastbetrieb; abteilweise rein-raus; Systemferkel
Klasse 5: Mastbetrieb; Erzeuger-Mäster-Direktverkehr
Klasse 6: geschlossener Betrieb; kontinuierliche Belegung
Klasse 7: geschlossener Betrieb; abteilweise rein-raus
Klasse
7
(PN=
70,6 %)
2,82
2,55
1,84
1,74
1,70
1,03
Klasse
5
(PN=
67,5 %)
3,07
2,77
2,00
1,89
1,85
1,09
71
4.6.2.14 Einfluss der Produktionsverfahren auf Infektionen mit
Auch die 107 Betriebe sind in 7 verschiedene Produktionsverfahren eingeteilt
worden.
1
hofweise
reinPN
raus;
Qu.ferkel
a, b
0%
0
1-25 % 1
26-50
3
%
51-75
2
%
76-100
11
%
Sum17
me
0
3
3
abteilweise
reinraus;
Qu.ferkel
b, c
2
4
Klassen
4
abteilweise
reinraus;
Systemferkel
c
0
0
3
6
3
2
hofweise
reinraus;
Systemferkel
5
c
6
geschl.
Betrieb;
kontinuierlich
c
1
2
1
1
7
geschl.
Betrieb;
abteilweise
reinraus
a, c
0
7
0
2
3
6
23
2
1
1
3
4
16
6
5
6
6
7
6
46
15
19
7
11
15
23
107
Summe
4
18
PN: scheinbare Intra-Herden-Prävalenz; a, b, c: mit gleichen Buchstaben gekennzeichnete
Klassen zeigen im WILCOXON-Test signifikante Unterschiede (p < 0,05)
Mit Hilfe des WILCOXON-Tests sind die einzelnen Produktionsverfahren statistisch
geprüft worden. Dabei hat sich gezeigt, dass die Mastbetriebe mit dem abteilweise
Rein-Raus-Einstallen von Systemferkeln signifikant höhere Intra-HerdenPrävalenzen aufweisen als Mastbetriebe mit dem abteilweise Rein-Raus-Verfahren
von Qualitätsferkeln (p < 0,05) und als Mastbetiebe, die mit dem FerkelerzeugerMäster-Direktverkehr arbeiten (p < 0,05), und als geschlossene Betriebe, die sowohl
das abteilweise Rein-Raus-Verfahren anwenden wie auch die kontinuierliche
Belegung (p < 0,05). Zudem zeigen die Mastbetriebe mit dem hofweise Rein-RausVerfahren von Qualitätsferkeln signifikant höhere Intra-Herden-Prävalenzen als
Mastbetriebe, die ihre Qualitätsferkel abteilweise rein-raus einstallen (p < 0,05) und
geschlossene Betriebe mit dem abteilweise Rein-Raus-Verfahren (p < 0,05).
Die Berechnungen für das relative Risiko und das „Odds Ratio“ haben gezeigt, dass
z. B. Systemferkel aus Betrieben mit dem abteilweise Rein-Raus-Verfahren ein
1,87fach höheres relatives Risiko besitzen, sich mit Influenzavirus H1N1 zu
infizieren, als Ferkel in geschlossenen Betrieben, die ihre Tiere abteilweise rein-raus
einstallen. Ebenso steigt die Chance der Systemferkel, sich mit Influenzavirus H1N1
zu infizieren, in Mastbetrieben, die mit dem abteilweise Rein-Raus-Verfahren
arbeiten bis zum Faktor 9,49 deutlich an gegenüber den geschlossenen Betrieben,
72
die abteilweise rein-raus einstallen. Weitere Informationen sind der Tabelle 52 zu
entnehmen.
bei verschiedenen Produktionsverfahren mit Influenzavirus H1N1 zu
infizieren
Klasse
4
(PN=
89,8 %)
Klasse 4
Klasse 1
Klasse 6
Klasse 2
Klasse 5
Klasse 7
Klasse 3
1,18
1,44*
1,44
1,53*
1,87*
1,86*
Klasse
Klasse
1
6
(PN=
(PN=
76,3 %) 62,6 %)
2,74
5,24*
1,91
1,22
1,22
1,00
1,30
1,06
1,59*
1,30
1,58*
1,30
Klasse
Klasse
2
5
(PN=
(PN=
62,3 %) 55,6 %)
5,27
6,14*
1,92
2,24
1,01
1,17
1,16
1,06
1,30
1,23
1,29
1,22
Klasse
7
(PN=
48,9 %)
9,49*
3,46*
1,81
1,80
1,55
0,99
*: Beziehungen, in denen zuvor signifikante Unterschiede statistisch
berechnet werden
konnten
Klasse
3
(PN=
46,0 %)
9,39*
3,43*
1,79
1,78
1,53
0,99
73
4.6.2.15 Einfluss der Produktionsverfahren auf Infektionen mit
PN
0%
1-25 %
26-50
%
51-75
%
76-100
%
Summe
3
abteilweise
reinraus;
Qu.ferkel
Klassen
4
abteilweise
reinraus;
Systemferkel
6
7
2
hofweise
reinraus;
Systemferkel
a
9
3
8
8
3
2
0
1
hofweise
reinraus;
Qu.ferkel
5
6
geschl.
Betrieb;
kontinuierlich
a
7
geschl. SumBetrieb; me
abteilweise
reinraus
2
4
5
3
4
6
10
6
44
37
1
1
1
1
4
13
1
1
0
0
3
2
7
1
0
1
0
2
1
1
6
17
15
19
7
11
15
23
107
PN: scheinbare Intra-Herden-Prävalenz; a: mit gleichem Buchstaben gekennzeichnete
Klassen zeigen im WILCOXON-Test signifikante Unterschiede (p < 0,05)
Bei der Überprüfung des Einflusses der Produktionsverfahren auf die Intra-HerdenPrävalenz (Tabelle 53) ergeben sich signifikante Unterschiede zwischen den Ferkeln
in geschlossenen Betrieben mit kontinuierlicher Belegung und den Systemferkeln,
die hofweise rein-raus eingestallt werden (p < 0,05). Die Auswertung verdeutlicht,
dass die Ferkel in geschlossenen Betrieben mit kontinuierlicher Belegung signifikant
höhere Intra-Herden-Prävalenzen aufweisen als die Systemferkel in den
Mastbetrieben mit hofweisem Rein-Raus-Verfahren.
Die Chance, dass sich die Ferkel in geschlossenen Betrieben mit kontinuierlicher
Belegung mit Influenzavirus H3N2 infizieren, steigt um den Faktor 2,70 im Vergleich
zu den Systemferkeln in Betrieben mit hofweiser Rein-Raus-Einstallung. Genauso
sind die Ferkel in den geschlossenen Betrieben mit kontinuierlichem
Einstallungsverfahren einem 3,28fach höherem relativen Risiko ausgesetzt, sich mit
Influenzavirus H3N2 zu infizieren, als Systemferkel in den Betrieben, die hofweise
ein- und ausgestallt werden (siehe auch Tabelle 54).
74
Tab. 54: Relatives Risiko (unten links) und „Odds Ratio“ (oben rechts) für Ferkel sich
bei verschiedenen Produktionsverfahren mit Influenzavirus H3N2 zu
infizieren
Klasse
6
(PN=
25,6 %)
Klasse 6
Klasse 5
Klasse 7
Klasse 1
Klasse 3
Klasse 2
Klasse 4
1,01
1,42
1,56
1,69
2,70*
2,27
Klasse
Klasse
5
7
(PN=
(PN=
23,9 %) 18,6 %)
1,02
1,56
1,54
1,40
1,54
1,10
1,67
1,19
2,67
1,90
2,24
1,60
Klasse
Klasse
1
3
(PN=
(PN=
16,1 %) 14,9 %)
1,75
1,93
1,72
1,90
1,12
1,23
1,10
1,09
1,73
1,60
1,46
1,34
Klasse
2
(PN=
9,6 %)
3,28*
3,23
2,10
1,88
1,70
Klasse
4
(PN=
9,4 %)
2,70
2,66
1,73
1,55
1,40
0,82
0,84
*: Beziehung, in der zuvor ein signifikanter Unterschied statistisch berechnet
werden konnte
4.7 Beziehung zwischen Lungenbefundung und dem jeweiligen Testsystem für
M. hyopneumoniae und den beiden Influenzavirus Subtypen (H1N1 und
H3N2)
4.7.1 Beziehung zwischen Lungenbefundung und
M. hyopneumoniae-Antikörpernachweisen
Von den 1392 serologisch mit dem Bommeli II Testsystem untersuchten Tieren sind
auf den Schlachthöfen 84 Lungenbefundungen durchgeführt worden. Hier soll nun
geprüft werden, ob eine Beziehung zwischen den Pneumonie- bzw. Pleuritisgraden
und der Anzahl sero-positiver Reagenten vorliegt. Sero-positiv heißt in diesem Fall,
dass die Tiere in der serologischen Untersuchung Extinktionswerte >20 % aufweisen.
Bei 66 der 84 Tiere (78,6 %) wurde eine mindestens geringgradige Lungenveränderung vorgefunden. 17 Tiere aus dem gleichen Pool (20,2 %) zeigten Anzeichen
einer Pleuritis.
75
Tab. 55: Anzahl der M. hyopneumoniae-seropositiven und -negativen Reagenten in
Bezug zum Pneumoniegrad
Pneumoniegrad
0
1
2
3
Summe
seropositiv
13
39
23
4
79
seronegativ
2
3
0
0
5
Summe
15
42
23
4
84
Die statistische Auswertung der Tabellen 55 und 56 mittels dem „exakten Test“ nach
Fischer weist keine signifikanten Zusammenhänge zwischen den Seroreagenten und
dem Pneumoniegrad bzw. dem Pleuritisgrad auf (p>0,05).
Tab. 56: Anzahl der M. hyopneumoniae-seropositiven und -negativen Reagenten in
Bezug zum Pleuritisgrad
Pleuritisgrad
0
1
2
3
Summe
seropositiv
62
7
6
4
79
seronegativ
5
0
0
0
5
Summe
67
7
6
4
84
2057 Schweine sind serologisch mit dem Hämagglutinationshemmungstest auf
Antikörper gegen Influenzavirus H1N1 untersucht worden. Von 237 Tieren dieser
Gruppe war eine Lungenbefundung auf dem Schlachthof vorgenommen worden.
Auch hier soll nun geprüft werden, ob eine Beziehung zwischen den Pneumoniebzw. Pleuritisgraden und der Anzahl seropositiver Reagenten nachgewiesen werden
kann.
Tab. 57: Anzahl der Influenza H1N1-seropositiven und -negativen Reagenten in
Pneumoniegrad
0
1
2
3
Summe
seropositiv
40
71
27
7
145
seronegativ
22
44
19
7
92
Summe
62
115
46
14
237
Mittels dem „exakten Test“ nach Fischer konnte keine Beziehung zwischen den
seropositiven Reagenten und dem Pneumoniegrad (Tabelle 57) bzw. zwischen den
seropositiven Reagenten und dem Pleuritisgrad (Tabelle 58) festgestellt werden
(p>0,05).
76
Tab. 58: Anzahl der Influenzavirus H1N1-seropositiven und -negativen Reagenten in
Pleuritisgrad
0
1
2
3
Summe
seropositiv
119
8
11
7
145
seronegativ
70
11
6
5
92
Summe
189
19
17
12
237
Hier wurden Blutproben von 2756 Mastschweinen serologisch mit dem
Hämagglutinationshemmungstest auf Antikörper gegen Influenzavirus H3N2
untersucht. Auch von diesen Tieren konnten von 237 Schweinen auf dem
Schlachthof Lungenbefundungen durchgeführt werden.
Tab. 59: Anzahl der Influenzavirus H3N2-seropositiven und -negativen Reagenten in
Pneumoniegrad
0
1
2
3
Summe
seropositiv
15
36
8
4
63
seronegativ
47
79
38
10
174
Summe
62
115
46
14
237
Die statistische Bearbeitung der Tabellen 59 und 60 mit Hilfe des „exakten Tests“
nach Fischer zeigt keinen Zusammenhang zwischen den seropositiven Reagenten
und dem Pneumoniegrad bzw. zwischen den seropositiven Reagenten und dem
Pleuritisgrad auf (p>0,05).
Tab. 60: Anzahl der Influenzavirus H3N2 seropositiven und -negativen Reagenten in
Pleuritisgrad
0
1
2
3
Summe
seropositiv
53
3
3
4
63
seronegativ
136
16
14
8
174
Summe
189
19
17
12
237
77
4.8 Geographische Verteilung einzelner Erreger respiratorischer
Erkrankungen bei Mastschweinen
Von 96 der 106 untersuchten Betriebe sind die Adressen bzw. mindestens der
Wohnort bekannt, so dass in diesen Beständen die räumliche Verteilung der
scheinbaren Intra-Herden-Prävalenzen von M. hyopneumoniae, Actinobacillus
pleuropneumoniae (A. pp.) nach POPPE (1997) und den beiden Influenzastämmen
A/swine/Bakum/5/95 (H1N1) und A/swine/Bakum/909/93 (H3N2) nach SCHENK
(2000) kartographisch dargestellt werden kann.
4.8.1 Geographische Verteilung von M. hyopneumoniae
Abb. 8: Räumliche Verteilung der scheinbaren Intra-Herden-Prävalenz von M.
hyopneumoniae in den bekannten Betrieben
Zeichenerklärung:
Kreuze:
• rot:
PN = 76-100 %
• Orange:
PN = 51-75 %
• grün:
PN = 26-50 %
• blau:
PN = 1-25 %
• schwarz:
PN = 0 %
In den Randbereichen der Erzeugergemeinschaften und Höhenzügen der
Waldgebiete befinden sich mehr grüne, blaue und schwarze Kreuze. Direkt in der
Nähe der schwarzen Kreuze liegen „rote Betriebe“.
Die nähere Aufschlüsselung dieser Betriebe ergibt folgendes:
78
1. Betriebe mit einer Intra-Herden-Prävalenz von 0 %
Zwei der drei Betriebe weisen 700 Mastplätze auf, einer davon liegt in der Ortschaft
Glandorf. Der 3. Bestand hat eine Größe von 500 Mastplätzen. Allen 3 Betrieben
gemeinsam ist das Arbeiten mit dem Einstallungsverfahren: abteilweise Rein-Raus.
2. Betriebe mit einer Intra-Herden-Prävalenz von 1-25 %
Die Größenordnung dieser 7 Betriebe liegt zwischen 400 und 750 Mastplätze. Es
handelt sich hier entweder um geschlossene Betriebe mit abteilweise Rein-RausVerfahren oder um Mastbetriebe mit Ferkelerzeuger-Mäster-Direktverkehr.
Alle 4 Bestände sind Mastbetriebe mit 350-500 Mastplätze. Die beiden Betriebe in
Ankum und Bad Rothenfelde mästen Systemferkel - die beiden anderen
Qualitätsferkel. Der Betrieb in Dissen arbeitet mit dem Einstallungsverfahren
abteilweise Rein-Raus, die übrigen mit dem hofweise Rein-Raus-Verfahren.
79
4.8.2 Geographische Verteilung von Actinobacillus pleuropneumoniae (A. pp.)
Abb. 9: Räumliche Verteilung der scheinbaren Intra-Herden-Prävalenz von
Actinobacillus pleuropneumoniae (A. pp.) in den bekannten Betrieben
Zeichenerklärung:
Kreuze:
• rot:
PN = 76-100 %
• orange:
PN = 51-75 %
• grün:
PN = 26-50 %
• blau:
PN = 1-25 %
• schwarz:
PN = 0 %
Die schwarzen Kreuze befinden sich im nördlichen Randbereich des
Wiehengebirges. Die blauen Kreuze liegen im Bereich der beiden bewaldeten
Höhenzüge und im Randbereich der Erzeugergemeinschaft. Dies sind:
Es handelt sich hierbei um 3 Betriebe mit 300-600 Mastplätzen. Die verwendeten
Einstallungsformen sind entweder hofweise Rein-Raus (ein Betrieb in Bohmte) oder
abteilweise Rein-Raus.
Diese 3 Betriebe liegen in einer Größenordnung von 350-500 Mastplätzen. Allen 3
gemeinsam ist das Arbeiten mit dem abteilweise Rein-Raus-Verfahren.
80
4.8.3 Geographische Verteilung des Influenzastammes
A/swine/Bakum/5/95 (H1N1) in den bekannten Betrieben
Zeichenerklärung:
Kreuze:
• rot:
PN = 76-100 %
• orange:
PN = 51-75 %
• grün:
PN = 26-50 %
• blau:
PN = 1-25 %
• schwarz:
PN = 0 %
Die schwarzen Kreuze sind in den Randbereichen der Erzeugergemeinschaften
angesiedelt. Im besonderen handelt es sich um folgende Betriebe:
Die Größenordnung der 3 Mastbetriebe, von denen mir Betriebsdaten vorliegen, liegt
zwischen 600 und 900 Mastplätzen. Der Mastbetrieb in Bissendorf bezieht seine
Ferkel direkt vom Erzeuger, die beiden anderen Betriebe in Bohmte und Melle
mästen Qualitätsferkel im abteilweise Rein-Raus-Verfahren.
81
4.8.4 Geographische Verteilung des Influenzastammes
A/swine/Bakum/909/93 (H3N2) in den bekannten Betrieben
Zeichenerklärung:
Kreuze:
• rot:
PN = 76-100 %
• orange:
PN = 51-75 %
• grün:
PN = 26-50 %
• blau:
PN = 1-25 %
• schwarz:
PN = 0 %
Hier nun befinden sich die roten und orangen Kreuze in der Minderheit. Sie liegen im
wesentlichen in den Randbereichen der Erzeugergemeinschaften. Aufgeschlüsselt
sind dies:
Von den 5 Betrieben verfügen 4 über 450-600 Mastplätze, der 5. Betrieb in
Fürstenau gelegen arbeitet mit 1000 Mastplätzen. Die verwendeten
Produktionsverfahren sind in den 2 Mastbetrieben in Georgsmarienhütte und in
Fürstenau das abteilweise Rein-Raus von Qualitätsferkeln und das hofweise ReinRaus von Systemferkeln und in den 3 geschlossenen Betrieben die kontinuierliche
Belegung und das abteilweise Rein-Raus-Verfahren.
82
Von den 4 Betrieben mit vorliegenden Betriebsdaten mästen 3 zwischen 360 und
800 Schweine und der Betrieb in Hunteburg mästet 1100 Schweine pro
Mastdurchgang. Die beiden Betriebe in Melle und Hunteburg arbeiten mit dem
Erzeuger-Mäster-Direktverkehr, der Betrieb in Bad Iburg benutzt das hofweise ReinRaus-Verfahren von Qualitätsferkeln und der Betrieb in Glandorf ist ein
geschlossener Betrieb mit abteilweise Rein-Raus-Verfahren.
4.9 Vergleich der Epidemiologie von M. hyopneumoniae mit denen
von Actinobacillus pleuropneumoniae (A. pp.) nach POPPE (1997) und
den beiden Influenzastämmen A/swine/Bakum/5/95 (H1N1)
und A/swine/Bakum/909/93 (H3N2) nach SCHENK (2000)
Tab. 61: Scheinbare Intra-Herden-Prävalenz (%) und scheinbare Herden-Prävalenz
(%) von M. hyopneumoniae, A. pp., Influenzavirus H1N1 und Influenzavirus
H3N2
scheinbare
Intra-HerdenPrävalenz (%)
scheinbare
HerdenPrävalenz (%)
M. hyo.
A. pp.
H1N1
H3N2
81,25
63,56
58,73
13,06
97,17
96,32
96,32
61,03
Bei dem Vergleich dieser 4 Erreger respiratorischer Erkrankungen liegt die
scheinbare Intra-Herden-Prävalenz von M. hyopneumoniae mit 81 % am höchsten
und die des Influenzastammes H3N2 mit 13 % am niedrigsten. Die scheinbare
Herden-Prävalenz beträgt für alle 96-97 % mit Ausnahme von Influenzavirus H3N2,
für den sie bei 61 % liegt.
Bei der Überprüfung der Einflussfaktoren auf die Intra-Herden-Prävalenz können nur
für die Einstallungsform bei A. pp. und für die Produktionsverfahren bei A. pp. und
den beiden Influenzastämmen signifikante Unterschiede ermittelt werden.
1. Einstallungsform
Nur bei A. pp. weisen die Betriebe mit kontinuierlichem Einstallungsverfahren
signifikant höhere wahre Intra-Herden-Prävalenzen auf als die Betriebe mit
abteilweisem Rein-Raus-Verfahren und dem Erzeuger-Mäster-Direktverkehr.
2. Produktionsverfahren
Bei A. pp. zeigen die geschlossenen Betriebe nach POPPE (1997) mit
kontinuierlicher Einstallung signifikant höhere wahre Intra-Herden-Prävalenzen als
die Betriebe, die ihre Ferkel über den Erzeuger-Mäster-Direktverkehr beziehen.
Weiterhin besitzen diese geschlossenen Betriebe mit kontinuierlichem
Einstallungsverfahren und Mastbetriebe, die sowohl hofweise rein-raus als auch
83
abteilweise rein-raus Qualitätsferkel einstallen signifikant höhere wahre Intra-HerdenPrävalenzen als die geschlossenen Betriebe mit abteilweisem Rein-Raus-Verfahren.
Bei Influenzavirus H3N2 zeigen die geschlossenen Betriebe mit kontinuierlicher
Belegung signifikant höhere Intra-Herden-Prävalenzen als Mastbetriebe, die
hofweise rein-raus Systemferkel einstallen.
Bei Influenzavirus H1N1 weisen Mastbetriebe mit hofweisem Rein-Raus von
Qualitätsferkeln signifikant höhere Intra-Herden-Prävalenzen auf, als geschlossene
Betriebe mit abteilweisem Rein-Raus-Verfahren und Mastbetriebe mit abteilweisem
Einstallen von Qualitätsferkeln.
Außerdem zeigen bei Influenzavirus H1N1 die Mastbetriebe mit abteilweisem ReinRaus von Systemferkeln signifikant höhere Intra-Herden-Prävalenzen als
Mastbetriebe mit dem abteilweise Rein-Raus-Verfahren von Qualitätsferkeln und als
Betriebe, die mit dem Erzeuger-Mäster-Direktverkehr arbeiten und als geschlossene
Betriebe, die sowohl mit kontinuierlicher als auch mit dem abteilweise Rein-RausVerfahren arbeiten.
Tendenziell zeigt M. hyopneumoniae in geschlossenen Betrieben mit kontinuierlicher
Belegung und in Betrieben mit dem hofweise Einstallen von Qualitätsferkeln die
höchsten Intra-Herden-Prävalenzen . Die Betriebe, die ihre Ferkel über den
Erzeuger-Mäster-Direktverkehr beziehen sowie in geschlossenen Betrieben mit
abteilweisem Rein-Raus-Verfahren sind die niedrigsten Intra-Herden-Prävalenzen zu
beobachten.
84
5 Diskussion
Ziel dieser Arbeit ist ein Vergleich verschiedener Nachweismethoden für
Mycoplasma hyopneumoniae, dem Erreger der Enzootischen Pneumonie. Weiterhin
folgt die epidemiologische Untersuchung über die Verbreitung von M.
hyopneumoniae an 1392 Schlachtschweinen im Weser-Ems Gebiet im Jahre 1996
sowie die Überprüfung einiger Einflussfaktoren auf die Intra-Herden-Prävalenz.
Abschließend werden diese Ergebnisse mit den Untersuchungen über zwei
Influenzavirusstämme und Actinobacillus pleuropneumoniae (A. pp.) aus dem
gleichen Probenpool von 1996 verglichen.
Anhand von 99 Serumproben aus dem Probenpool von 1996 erfolgt ein Vergleich
der vier serologischen Testsysteme: DAKO-, Chekit®-Hyoptest I (Bommeli I)-,
Chekit®-Hyoptest II (Bommeli II)- und dem TiHo- ELISA.
Nach LORENZ (1990) beschreibt die Sensitivität die Fähigkeit eines Tests, ein
positives Ergebnis zu erkennen, wenn das untersuchte Tier eine bestimmte
Krankheit hat. Wichtig ist dabei, dass die Sensitivität als der Anteil der kranken Tiere
mit positivem Testergebnis an der Gesamtheit der getesteten kranken Tiere zu
verstehen ist. Eine ungenügende Sensitivität des Tests führt zu falsch-negativen
Ergebnissen. Versucht man diese Diagnosen herabzusetzen, so bezahlt man dies
meistens mit der Abnahme der Spezifität.
Die Spezifität ist die Fähigkeit eines Tests, ein negatives Ergebnis zu liefern, wenn
das untersuchte Tier die betreffende Krankheit nicht hat. Die Spezifität wird dabei
durch den Anteil der nicht erkrankten Tiere mit negativem Testergebnis an der
Gesamtheit der getesteten nicht erkrankten Tiere gemessen. Eine ungenügende
Spezifität verursacht falsch-positive Testergebnisse. Auch hier führt eine
Verbesserung der Spezifität häufig zu einer Abnahme der Sensitivität.
Die exakte Bestimmung der Sensitivität und Spezifität ist schwierig. Ein praktikabler
Ausweg besteht darin, diesen Test mit einem anderen diagnostischen Test zu
vergleichen. Wichtig ist dabei, dass dessen Qualität bekannt ist und die Sensitivität
und Spezifität dieses so genannten „Standards“ Werte nahe bei 100 % haben, denn
sonst liegt die Anzahl der falsch-positiven und falsch-negativen Ergebnisse zu hoch.
Die meisten Untersuchungen liegen über den DAKO-ELISA vor. SØRENSEN et al.
(1997) haben für diesen ELISA auf individuellem Niveau eine Sensitivität von 98-100
% anhand der Proben von experimentell infizierten Schweinen und eine Spezifität
von 93-100 % mit Hilfe der Proben von SPF-Kontrolltieren ermittelt. Daher wurde er
hier als der „Golden Standard“ gewählt. Eine Berechnung von Sensitivität und
Spezifität des DAKO-ELISAs für chronisch infizierte Schweine ist der Literatur nicht
zu entnehmen. Internen Untersuchungen der Firma Intervet zufolge, liegt nach
Schelp2 die Spezifität des Bommeli II-ELISAs in negativen Herden bei 97,2 % und die
Sensitivität in akut infizierten Herden bei ca. 93 %, in chronisch infizierten Beständen
bei ca. 13 %. Es ist wahrscheinlich, dass sich der DAKO-ELISA mit Proben aus
chronischen Infektionsstadien ähnlich verhält, deshalb ist dies auch hier die
2
Persönliche Mitteilung von Dr. Chr. Schelp vom 27.06.03
85
eigentliche Sensitivität, mit der wir rechnen müssen. Das beinhaltet jedoch eine hohe
Anzahl falsch-negativer Ergebnisse in den eigenen Untersuchungen (siehe oben).
Laut Statistik sind verglichen mit dem DAKO-ELISA als „Golden Standard“ der
Bommeli I- und der TiHO-ELISA schlechter. Nur der Bommeli II-ELISA liefert ähnlich
gute Ergebnisse wie der DAKO-ELISA, trotz der geringen Übereinstimmung der
Testergebnisse von nur 16 %.
Für das Zustandekommen der unterschiedlichen Ergebnisse der hier geprüften vier
Testsysteme könnten folgende Gründe eine Rolle gespielt haben:
erdünnungsstufen der Seren und die Probenvolumina sind (ausgenommen
DAKO- und Bommeli II-ELISA) nicht einheitlich (siehe Tabelle 62).
oder polyklonale Antikörper (ausgenommen DAKO- und Bommeli II-ELISA, siehe
Tabelle 62).
Schlachtung zugeführt wurden. Anzunehmen ist dabei, dass es sich bei den
positiven Tieren in erster Linie um Trägertiere oder chronisch infizierte Tiere
handelte, die somit per se niedrige Antikörper-Titer aufweisen. Demzufolge sind
also die Schwellenwerte oder Grenzwerte für die Detektion der Antikörper der vier
Testsysteme unterschiedlich hoch.
Wie die Ergebnisse zeigen, ist es nicht möglich mit einem ELISA als „Golden
Standard“ andere serologische Testsysteme in den chronischen Stadien von M.
hyopneumoniae-Infektionen zu vergleichen. Dies liegt daran, dass mit Sicherheit
auch der DAKO-ELISA bei chronisch infizierten Tieren eine erhebliche
Sensitivitätsabnahme aufweist. Hinzu kommt, dass all diese Testsysteme als
Herdentests konzipiert sind und somit Vergleiche von Testergebnissen an einzelnen
Probanden problematisch sind.
Tab. 62: Verdünnungsstufen, Probenvolumina und Konjugate der
4 Testsysteme
Testsystem ProbenVerdünnung
DAKO
1:10
BO I
1:100
BO II
1:10
TiHo
1:10
DAKO
BO I
BO II
TiHo
Probenvolumen Konjugat
Peroxidase anti
Schwein monoklonal
Peroxidase Protein A
polyklonal
Peroxidase anti
Schwein monoklonal
Peroxidase anti
Schwein
polyklonal
= DAKO Mykoplasma hyopneumoniae-ELISA
= Chekit®-Hyoptest I-ELISA
=
„
„
II-ELISA
= TiHo-ELISA
Zusammenfassend lässt sich also sagen, dass sich die vier serologischen
Testsysteme nach wie vor nur für die Herdendiagnostik, nicht aber für die
86
Einzeltierdiagnostik eignen. Außerdem ist zu vermuten, dass diese Tests für die
Diagnostik von chronisch infizierten Herden, die weltweit den Hauptanteil der Herden
in der Welt ausmachen (ARMSTRONG 1994), nicht zuverlässig sind.
Vergleichende Untersuchungen an 111 Lungenschnitten mit dazugehörenden
Serumproben zeigen keinen Zusammenhang zwischen den Ergebnissen der beiden
Testmethoden: Bommeli II-ELISA und indirekter Immunfluoreszenz. Auf die
Einschränkungen bei der Beurteilung von ELISA-Ergebnissen bei chronischen Fällen
von M. hyopneumoniae wurde im vorangegangen Kapitel hingewiesen. Die
Sensitivität des Immunfluoreszenztests hängt im wesentlichen vom verwendeten
Antiserum ab. Das hier verwendete M. hyopneumoniae-Antiserum stammte aus dem
Institut für Mikrobiologie und Tierseuchen der Tierärztlichen Hochschule Hannover
aus eigener Herstellung. Eine gewisse Kreuzreaktion mit M. hyorhinis kann nicht
ganz ausgeschlossen werden. In den eigenen Untersuchungen diente der Schnitt mit
M. hyorhinis-Antiserum als Beispiel für eine positive Reaktion, da Schweine zu einem
sehr hohen Prozentsatz mit dieser Mykoplasmenart infiziert sind. Nach MEYLING
(1971) wird M. hyorhinis in pneumonischen Lungen von Ferkeln in der gleichen
Lokalisation gefunden, die auch für M. hyopneumoniae typisch sind. Auch das
Muster der Fluoreszenz ist ähnlich, es sieht aus wie ein glänzender, gelbgrüner
Überzug des Bronchialepithels, siehe Abbildung 6, es ist jedoch nicht identisch. Bei
M. hyorhinis ist die Fluoreszenz oft reichlicher und manchmal werden auch Herde
von Organismen im Alveolargewebe gefunden.
Nach SØRENSEN et al. (1997) liegt die Spezifität des Immunfluoreszenztests bei 93100 % bezogen auf die kulturelle Untersuchung als „Golden Standard“. Die
Sensitivität beträgt in akuten Stadien der M. hyopneumoniae-Infektion 86-100 % und
sinkt in chronischen Stadien (hier gemessen am 85. Tag post infektionem) auf 11-38
% ab. Nach FEENSTRA et al. (1994) könnte die geringere Sensitivität des indirekten
Immunfluoreszenztests in chronischen Infektionen an der geringen Anzahl von
Mykoplasmen liegen oder an Blocking-Effekten durch lokale Antikörper.
In den eigenen Untersuchungen zeigte der Bommeli II-ELISA bezogen auf den
Immunfluoreszenztest eine Sensitivität von nur 30 % und eine Spezifität von 75 %.
Ein höherer Wert für die Sensitivität wäre eigentlich zu erwarten gewesen. Nach den
Ergebnissen von SØRENSEN et al. (1997) sind die positiven ImmunfluoreszenztestErgebnisse diagnostisch signifikant, so dass hier mit großer Sicherheit von einer
Besiedelung und Infektion ausgegangen werden kann. Offenbar ist die
Antikörperaktivität in diesen chronischen Krankheitsstadien sehr gering und wird mit
dem verwendeten ELISA nicht detektiert. Negative Resultate sind aber nicht nur
beim ELISA sondern auch beim indirekten Immunfluoreszenztest laut ARMSTRONG
et al. (1984), FEENSTRA et al. (1994) und SØRENSEN et al. (1997) aufgrund der
unzureichenden Sensitivität nicht verlässlich.
Leider ist ein Vergleich der Serologie mit der Kultur nicht möglich gewesen, da in
keiner der untersuchten Kulturen M. hyopneumoniae nachgewiesen werden konnte.
Die kulturelle Nachweismethode hat sich am wenigsten effizient und praktikabel
gezeigt, da allein 53 % der Kulturen durch Kontamination mit anderen Keimen nicht
auswertbar gewesen sind. Dies ist wahrscheinlich in erster Linie auf die
anspruchsvollen Nährstoffbedingungen des Erregers zurückzuführen (ROSS 1992,
87
ROLLE und MAYR 1993, 2002) und die schwierigen Kultivierungsbedingungen
(WHITTLESTONE 1979, 1990). In 5 der 26 auswertbaren Kulturuntersuchungen
wurden M. hyorhinis bzw. andere Mykoplasma species nachgewiesen. Speziell M.
hyorhinis könnte anhand der schnelleren Adaptierung an das künstliche Medium
durch Überwucherung den Nachweis von M. hyopneumoniae verhindert haben
(L’ECUYER and BOULANGER 1970, WHITTLESTONE 1979).
VAN AKEN und GEERTS haben in ihren 1992 vorgenommenen Forschungsarbeiten
keine eindeutige Beziehung zwischen der Anwesenheit von M. hyopneumoniaeAntikörpern und der Pneumonie-Inzidenz bei wachsenden bzw. pneumonischen
Läsionen bei Schlachttieren gefunden. Übereinstimmend mit diesen beiden Autoren
konnte bei den eigenen Untersuchungen eine Korrelation zwischen den ELISATestergebnissen und den Lungenveränderungen der Schweine unterschiedlichen
Alters nicht festgestellt werden.
Dagegen haben YAGIHASHI et al. (1993) in Schlachtschweinen eine Korrelation
zwischen Seropositivität und dem Vorliegen von Lungenveränderungen gefunden,
der ELISA-Wert korrelierte jedoch nicht mit dem Grad der Lungenveränderungen.
Mögliche Gründe für das Vorliegen von Lungenläsionen ohne positiven AntikörperTiter könnten sein:
stimuliert nur die Produktion von niedrigen Antikörper-Titern
und diese sind dann wegen einer unzureichenden Sensitivität des Testsystems
nicht detektierbar.
-Antwort neigt sich dem Ende zu und damit
folgt eine Abnahme der Antikörper-Aktivität unterhalb des positiven Grenzbereichs
des Testsystems.
M. hyopneumoniae ist schon aus der Lunge entfernt worden, hierdurch erfolgt eine
Abnahme der Antikörper-Aktivität und Sekundärerreger sind für ein Fortbestehen
der Lungenläsionen verantwortlich.
Lokalisation relativ charakteristisch für die Enzootische Pneumonie sind, andere
Erreger, wie z. B. Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida oder Bordetella
bronchiseptica, ähnliche pneumonische Veränderungen hervorrufen können
(PLONAIT 1988, KOBISCH und TILLON 1989, SØRENSEN et al. 1997,
SIEVERDING 2000).
Mögliche Ursachen für das Auffinden von Antikörpern ohne pathomorphologische
Lungenveränderungen könnten sein:
Läsionen hervorzurufen.
Nach RUNNELS (1988) ist der Immunfluoreszenztest an verändertem Gewebe der
verlässlichste diagnostische Test zur Auffindung von M. hyopneumoniae-Infektionen.
Auch in den eigenen Untersuchungen zeigt sich der Immunfluorstenztest im
Vergleich zum Bommeli II-ELISA an typisch verändertem Lungengewebe in Form
von chronischen Lungenspitzenlappenveränderungen mit Pneumonie überlegen.
88
Hier liegt ein deutlicher signifikanter Unterschied zwischen den beiden Testmethoden
vor.
5.4 Epidemiologische Studie
Anhand der 1392 Serumproben von Mastschweinen aus 106 Betrieben zweier
Erzeugergemeinschaften ist die Intra-Herden-Prävalenz als der Anteil der mit M.
hyopneumoniae infizierten, test-positiven Tiere in einer Herde sowie daraus folgend
die Herden-Prävalenz der 106 Betriebe gemessen worden. Wie aus den
vorangegangen Ausführungen hervorgeht, ist die Sensitivität und Spezifität des
verwendeten ELISAs weit von 100% entfernt. Die mit diesem Testsystem ermittelte
Prävalenz ist aufgrund der geringen Sensitivität des ELISAs sicherlich zu niedrig
geschätzt. Da die Sensitivität und Spezifität des ELISAs im chronischen Stadium der
Infektion nicht genau bekannt ist, konnte die Prävalenzschätzung nicht korrigiert
werden. Der hier beobachtete Anteil der serologisch-positiven Schweine an der
Gesamtheit getesteter Tiere ist die scheinbare Prävalenz.
Den eigenen Untersuchungen zufolge liegt der Durchseuchungsgrad innerhalb der
untersuchten 106 Betriebe bei 81,25 %. Aus der Literatur liegen in Belgien IntraHerden-Prävalenzen von 76 % (MAES et al. 2000) vor. Im Süd-Osten Norwegens
variiert die Intra-Herden-Prävalenz nach FALK und LIUM (1991) in Herden mit
subklinischen bis moderaten respiratorischen Problemen und in Herden mit
schweren respiratorischen Problemen zwischen 21 und 83 %.
Der hier gemessene Wert für die Herden-Prävalenz der 106 Betriebe aus
Niedersachsen beträgt 97,17 %. Da auch HORST et al. (1997) eine relativ hohe
Herden-Prävalenz von 84,36 % für die Mastbestände in Niedersachsen ermittelt
haben, kann somit die hohe Infektionsrate deutscher Schweinebestände (BERNER
1995, PFÜTZNER und BLAHA 1995) bestätigt werden. Auch in Belgien liegt nach
MAES et al. (1999) eine mit 88 % hohe Herden-Prävalenz vor. Diese hohe M.
hyopneumoniae-Prävalenz zieht sich über den gesamten Schweinegürtel im
Nordwesten des europäischen Festlands von Weser-Ems über Holland, Belgien bis
nach Frankreich. In weniger mit Schweinen besetzten Gebieten wie z.B. in
Skandinavien sind die Prävalenzen deutlich geringer. In Dänemark haben
SØRENSEN et al. (1992b) eine Herden-Prävalenz von 30 % ermittelt und im Westen
Finnlands, in der Provinz von Vaasa, hat sie 1998 nach RAUTIAINEN 39 %
betragen.
Der 2. Teil der epidemiologischen Studie beinhaltet die Untersuchung einiger
Einflussfaktoren auf die Verbreitung von M. hyopneumoniae. Da die Aufstallungsform
und das Hygieneregime von 83 der 106 untersuchten Betriebe bekannt waren, wurde
versucht, die Risiken der verschiedenen Managementsysteme bezüglich der
Verbreitung von M. hyopneumoniae miteinander zu vergleichen.
Für die Anzahl der Mastplätze pro Betrieb, die Betriebsform (Unterscheidung
zwischen geschlossenen Betrieben und Mastbetrieben), die Einstallungsform
(kontinuierlich, hofweise rein-raus, abteilweise rein-raus und Erzeuger-MästerDirektverkehr mit unbekannter Einstallungsform), die Ferkelherkunft (eigene Ferkel,
Systemferkel, Qualitätsferkel und Ferkel des Erzeuger-Mäster-Direktverkehrs) sowie
für die 7 Produktionsverfahren (hofweise rein-raus bzw. abteilweise rein-raus von
89
Qualitätsferkeln bzw. Systemferkeln, Erzeuger-Mäster-Direktverkehr und Aufteilung
der geschlossenen Betriebe in die mit kontinuierlicher Belegung und die mit
abteilweisem Rein-Raus-Verfahren) in Bezug auf die Intra-Herden-Prävalenz haben
sich statistisch keine signifikanten Unterschiede ergeben.
Tendenziell lässt sich aber sagen, dass geschlossene Betriebe mit kontinuierlicher
Belegung sowie Betriebe mit hofweisem Rein-Raus von Qualitätsferkeln aus
zahlreichen Herkünften die höchsten Intra-Herden-Prävalenzen aufweisen. Die
niedrigsten Prävalenzen weisen die Betriebe mit Ferkelerzeuger-MästerDirektverkehr und geschlossene Betriebe mit abteilweisem Rein-Raus-Verfahren auf.
Die Berechnungen des relativen Risikos und der „Odds Ratio“ für die einzelnen
Einflussgrößen spiegeln diese Tendenzen wieder. So zeigt sich z. B., dass für
geschlossene Betriebe mit kontinuierlicher Belegung das relative Risiko, sich mit M.
hyopneumoniae zu infizieren, um das 1,28fache höher ist als in Mastbetrieben mit
Ferkelerzeuger-Mäster-Direktverkehr. Die Chance steigt dabei um den Faktor 3,07,
dass die Ferkel sich tatsächlich mit M. hyopneumoniae infizieren.
Die Gründe für das schlechte Abschneiden der zwei obengenannten
Produktionsverfahren sind folgende:
Erwerben die Mäster ihre Ferkel von verschiedenen Ferkelerzeugern, so liegt es in
der Natur der Sache, dass diese sogenannten Qualitätsferkel über einen sehr
uneinheitlichen Immunstatus verfügen und sich sozusagen von allen Seiten mit einer
Flut neuer auf sie einstürmender Antigene in Form von Krankheitserregern von
subklinisch infizierten Schweinen oder rekonvaleszenten Tieren, die aber noch
ausscheiden, auseinandersetzen müssen. Ähnliches gilt für die Betriebe mit
kontinuierlicher Belegung. Hier wird durch die kontinuierliche Einstallung naiver
Ferkel zu den älteren Tieren auf die jungen ein sehr hoher Infektionsdruck ausgeübt.
Nach erfolgter Infektion kommt es zu einer massiven Vermehrung und Ausscheidung
der Erreger und dadurch auch zur Übertragung auf bisher nicht infizierte Tiere.
Hierdurch kommen die hohen Intra-Herden-Prävalenzen zustande.
Der Vorteil des Ferkelerzeuger-Mäster-Direktverkehrs liegt in dem einheitlichen
Immunstatus der Ferkel, da sie ja sinngemäß alle aus dem gleichen Stall kommen,
begründet. Die Möglichkeit einer gesteigerten Ansteckung wird dadurch
ausgeschlossen. Gleiches gilt für die geschlossenen Betriebe, die mit dem
abteilweise Rein-Raus-Verfahren arbeiten, d.h. auch sie halten eine strikte Trennung
der Altersklassen aus seuchenhygienischen Gründen ein.
Da es sich hier aber um Tendenzen (die Tabellen 38 und 50 zeigen immerhin, dass
„Odds Ratios“ bis zum Faktor 3 möglich sind) und nicht um statistisch abgesicherte
Fakten handelt, scheinen die Managementsysteme, im Gegensatz zu den
Untersuchungen anderer Autoren wie DONE (1996), ROSS (1999) und
RAUTIAINEN et al. (2001), zumindest im Weser-Ems-Gebiet, nicht zu den
entscheidenden Faktoren für die Verbreitung von M. hyopneumoniae zu gehören.
Die Unterschiede zwischen den Haltungsformen sind hier wahrscheinlich deshalb so
gering, weil nahezu alle Bestände infiziert sind (siehe Herden-Prävalenz der
untersuchten 106 Betriebe) und aufgrund der insgesamt hohen Schweinedichte im
Nord-Westen Deutschlands. Nach STÄRK et al. (1992) sowie DONE (1996) gehört
eine hohe Schweinedichte im Bestand bzw. in der Region zu den prädisponierenden
Faktoren für die generelle Verbreitung von M. hyopneumoniae. Die Größe und die
Entfernung des nächsten infizierten Nachbarbetriebes stellt dabei ein besonderes
Infektionsrisiko dar. Weiterhin tragen auch das oft feucht-kalte Wetter im Norden
Deutschlands, die Möglichkeit der Luftübertragung über mehrere Kilometer, der
Zukauf subklinisch infizierter Tiere und v. a. der Tiertransport (GOODWIN 1985,
STÄRK et al. 1992, MAES et al. 2000, HEGE et al. 2002) zu der weiten Verbreitung
90
von M. hyopneumoniae im Weser-Ems Gebiet bei. Nach BESKOW et al. (1998)
scheint dabei die Schnelligkeit der Ausbreitung einer Mykoplasmeninfektion eher von
dem Antikörperstatus der Ferkel bei der Einstallung abhängig zu sein als z. B. vom
Stallklima. Diese These unterstützt wiederum die Ergebnisse der eigenen
Untersuchungen, d.h. bei M. hyopneumoniae laufen die Infektionen wahrscheinlich
früher ab als z.B. bei A. pp. Dies ist ein deutlicher Unterschied zu den Ergebnissen
von POPPE (1997). Aber auch tendenzielle Ähnlichkeiten (siehe unter 5.7, Seite 91)
liegen vor.
VICCA und Mitarbeiter (2002a,b) haben das Infektionsmuster von M.
hyopneumoniae anhand von fünf klinisch infizierten Herden mit guten und fünf
subklinisch
infizierten
Herden
mit
schlechten
Haltungsund
Managementbedingungen untersucht. Sie haben herausgefunden, dass die
Seroprävalenzen in den klinisch infizierten Herden höher gewesen sind und dass
sich die meisten Schweine dort in einem jüngeren Alter mit M. hyopneumoniae
angesteckt haben. Weiterhin haben diese Herden einen signifikant höheren Hustenund Lungenläsionen-score sowie eine intensivere Immunfluoreszenz und
histopathologische Veränderungen der Lungen im Vergleich zu den subklinisch
infizierten Herden gezeigt. Die Autoren schließen daraus, dass nicht die Haltungsund Managementbedingungen das Infektionsmuster dieses Bakteriums und den
klinischen Verlauf der Infektion hauptsächlich bestimmen, sondern die ziemlich hohe
Variation der Virulenz zwischen den Feldisolaten. Als möglichen Virulenzmarker
haben sie ein 5000 bp Fragment vorgestellt. Auch die Untersuchung der Virulenz der
Feldisolate im Weser-Ems Gebiet könnte noch mehr Aufschluss über die
Epidemiologie von M. hyopneumoniae bringen.
5.5 Lungenbefundung
Auf individueller Basis konnten keine Beziehungen zwischen den Pneumonie- bzw.
Pleuritisgraden der insgesamt 84 befundeten Lungen und der Anzahl seropositiver
Reagenten hergestellt werden.
Auf Herdenbasis besteht logischerweise eine enge Korrelation von r = 0,83 zwischen
den seropositiven Reagenten und den durchschnittlichen Extinktionswerten im ELISA
der untersuchten Bestände.
Anzumerken ist, dass auch bei hohen Extinktionswerten im ELISA nicht zwangsläufig
die für eine M. hyopneumoniae-Infektion charakteristischen pathologischen
Lungenbefunde erwartet werden dürfen (siehe auch unter 5.3, Seite 87).
BERTSCHINGER et al. (1972) sowie ARMSTRONG et al. (1984) kommen in ihren
Untersuchungen zu dem Schluss, dass die makroskopische Lungenuntersuchung als
alleinige Methode zum Ausschluss der Enzootischen Pneumonie nicht genügt.
Bei den eigenen Untersuchungen lagen für diese Frage zu wenig pathologisch
unveränderte Lungen (n=15) und zu wenig seronegative Reagenten (n=2) vor.
5.6 Geographische Verteilung von M. hyopneumoniae
Von 96 der 106 untersuchten Betriebe wurde die räumliche Lage im Weser-Ems
Gebiet festgestellt und in Beziehung zur scheinbaren Intra-Herden-Prävalenz des
jeweils untersuchten Erregers gesetzt. Da die Proben von Mitarbeitern des
Veterinäramtes des Landkreises Osnabrück auf den Schlachthöfen im Landkreis
entnommen worden waren, liegen die meisten Betriebe im Landkreis Osnabrück
91
bzw. in den angrenzenden Gebieten. Interessanterweise fällt bei M. hyopneumoniae
auf, dass sich fast alle Betriebe mit einer Intra-Herden-Prävalenz von 0-50 % im SüdOsten des Weser-EmsGebietes konzentrieren. Dies könnte vielleicht auch an der
geographischen Lage liegen, denn betrachtet man z. B. den Raum um Melle, so
sieht man, dass sich nördlich von Melle das Wiehengebirge entlang zieht und
südwestlich der Teutoburger Wald, sozusagen als natürliche Barriere für M.
hyopneumoniae. Möglicherweise liegen hier auch andere Handelsstrukturen als
weiter nördlich vor. Die Betriebe mit einer Intra-Herden-Prävalenz von 0-25 %, die
entweder mit dem abteilweise Rein-Raus-Verfahren oder dem FerkelerzeugerMäster-Direktverkehr
arbeiten,
liegen
in
den
Randbereichen
der
Erzeugergemeinschaften bzw. in den Höhenzügen der Waldgebiete in eher isolierter
Lokalisation. Hier ist aber anzumerken, dass die Anzahl der Betriebe mit 11 zu gering
ist, um daraus definitive Schlüsse zu ziehen. Aus der Literatur ist jedoch bekannt,
dass die Topographie zu den beeinflussenden Faktoren für die Verbreitung von M.
hyopneumoniae zählt (STÄRK et al. 1992, DONE 1996). Ein gewisser Schutz vor
einer Infektion mit diesem Erreger bilden dabei z. B. Standorte der Betriebe in
Hanglagen oder in isolierten Lokalisationen außerhalb einer Gemeinde.
Actinobacillus pleuropneumoniae nach POPPE (1997) und den beiden
Influenzavirusstämmen A/swine/Bakum/5/95 (H1N1) und A/swine/Bakum/909/93
(H3N2) nach SCHENK (2000)
Aus dem gleichen Blutprobenpool von insgesamt 136 Betrieben sind serologische
Untersuchungen auf Antikörper gegen M. hyopneumoniae, Actinobacillus
pleuropneumoniae (A. pp.) und Influenzaviren der Subtypen A (H1N1) und (H3N2)
durchgeführt worden. Die Gesamtstichprobenzahl beträgt dabei für M.
hyopneumoniae 1392, für A. pp. 2605, für den Influenzastamm H1N1 2057 und für
den Influenzastamm H3N2 2756. Bei den untersuchten Tieren handelte es sich um
klinisch gesunde Mastschweine, die der Schlachtung zugeführt wurden.
Der Durchseuchungsgrad innerhalb der Betriebe ist bei M. hyopneumoniae mit 81 %
am höchsten, es folgen A. pp. mit ca. 64 % und der Influenzastamm H1N1 mit rund
59 %. Für den Influenzastamm H3N2 ist eine Intra-Herden-Prävalenz von 13 %
ermittelt worden. Die Herden-Prävalenz liegt für M. hyopneumoniae, A. pp. und für
den Influenzastamm H1N1 zwischen 96 und 97 %, für den Influenzastamm H3N2
beträgt sie 61 %.
Nur für A. pp. und die beiden Influenzastämme ergeben sich signifikante
Beeinflussungen der Produktionsverfahren (für A. pp. auch der Einstallungsform) auf
die Intra-Herden-Prävalenz. In Bezug auf A. pp. zeigen sich statistisch gesicherte
Vorteile der Managementsysteme: Ferkelerzeuger-Mäster-Direktverkehr und
geschlossene Betriebe mit abteilweisem Rein-Raus-Verfahren. Für M.
hyopneumoniae geht zumindest die Tendenz auch in diese beiden Richtungen.
Bei A. pp. befinden sich die Betriebe mit einer Intra-Herden-Prävalenz von 0-25 % in
ähnlichen geographischen Lokalisationen wie die entsprechende Klasse bei M.
hyopneumoniae. Bis auf einen Betrieb arbeiten diese alle mit dem
Einstallungsverfahren abteilweise Rein-Raus.
92
Zusammenfassend kann festgestellt werden: Für A. pp. scheinen Handel- und
Einstallungsformen eine höhere Bedeutung zu haben, als dies bei M.
hyopneumoniae der Fall ist. Für den zuletzt genannten Erreger scheinen dagegen
natürliche Barrieren für die Ausbreitung bedeutender zu sein (STÄRK et al. 1992,
DONE 1996).
Für die Bekämpfung des Influenzastammes H3N2 scheinen die Mastbetriebe mit
hofweisem Rein-Raus-Belegen von Systemferkeln, statistisch gesehen am
geeignetsten zu sein. Die Mastbetriebe, die ihre Systemferkel abteilweise rein-raus
einstallen, zeigen ähnlich niedrige Intra-Herden-Prävalenzen, doch ein Unterschied
kann statistisch nicht abgesichert werden. Für diese niedrigen Intra-HerdenPrävalenzen des Influenzastammes H3N2 sind die Systemferkel auch
mitverantwortlich. Eine Begünstigung dieser Ferkel liegt in ihrem annähernd
einheitlichen Immunstatus begründet.
Bei dem Influenzastamm H1N1 scheint es komplizierter zu sein. Auf dem ersten Blick
scheinen die Produktionsverfahren, die in Bezug auf die Bekämpfungsstrategie mit
dem abteilweise Rein-Raus-Belegen von Ferkeln arbeiten, begünstigt zu sein, doch
die Betriebe, die mit diesem Verfahren Systemferkel mästen, fallen da ganz heraus.
Sie haben sogar signifikant höhere Intra-Herden-Prävalenzen als alle anderen
Produktionsverfahren, mit Ausnahme der Betriebe, die ihre Ferkel hofweise
einstallen. Da es sich hierbei aber um nur sieben Betriebe handelt, könnte man
vermuten, dass sie alle ihre Ferkel von demselben Systemferkelaufzüchter beziehen,
was zu überprüfen wäre.
Die Influenzavirus H1N1-negativen Betriebe, die abteilweise rein-raus einstallen oder
ihre Ferkel direkt vom Erzeuger beziehen, liegen in den Randbereichen der
Erzeugergemeinschaften, während beim Influenzavirus H3N2 in den gleichen
Randbereichen die Betriebe mit Intra-Herden-Prävalenzen von 50-100 % liegen.
Es zeigten sich keine Anhaltspunkte über mögliche Interaktionen zwischen den vier
untersuchten Erregern. Auch aus der Literatur sind darüber keine eindeutigen Belege
bekannt. Man geht zwar davon aus, dass Virusinfektionen beim Schwein den
Lungenschaden initiieren und M. hyopneumoniae die dann folgenden
Sekundärinfektionen verstärkt (CLARK 1999, THACKER et al. 1999, OPRIESSNIG
und HALBUR 2004). Untersuchungen von THACKER et al. (2001) zeigten jedoch,
dass zumindest eine Influenza-Virusinfektion nicht von M. hyopneumoniae potenziert
wird. Die Anfälligkeit der Schweine für Actinobacillus pleuropneumoniae (A. pp.) soll
dagegen durch eine M. hyopneumoniae-Infektion verstärkt werden (ROSS und
YOUNG 1993).
Wenngleich die epidemiologischen Untersuchungen nur Hinweise liefern, lassen sich
unter Zuhilfenahme der Literatur einige Empfehlungen für die Bekämpfung der
Enzootischen Pneumonie im Norddeutschen Raum ableiten. Anzustreben wäre eine
wirksame flächendeckende Impfung über mehrere Jahre, um einen ähnlichen hohen
Antikörperstatus der Schweinepopulation zu erreichen. Zur Minimierung der
Erregerübertragung sollte das Segregated early weaning (SEW)-Verfahren nach
DRITZ et al. (1996) flächendeckend eingesetzt werden. Auf der Basis fester
Ferkelerzeuger-Mäster-Beziehungen und konsequentem Rein-Raus-Verfahren
könnte eine deutliche Reduktion der Übertragung erzielt werden. Wie die
vorliegenden Daten zeigen, würde damit nicht nur die Enzootische Pneumonie
93
sondern auch Actinobacillus pleuropneumoniae und teilweise auch Influenza
bekämpft. Voraussetzung wäre aber eine noch konsequentere Änderung der
Handels- und Haltungsstrukturen. Wenngleich eine gerichtete flächendeckende
Impfung nicht durchgeführt wird, so gehört die Impfung gegen Mycoplasma
hyopneumoniae (GANTER et al. 1999) heute zum Standard-Impfprogramm in
Ferkelerzeugerbetrieben. Zum Zeitpunkt der Entnahme der hier untersuchten Proben
im Jahre 1996 wurden diese Impfungen noch nicht durchgeführt. Es wäre deshalb zu
erwarten, dass in wenigen Jahren die Enzootische Pneumonie zurückgedrängt
werden kann. Allerdings wäre mit einem koordinierten Vorgehen, das Impfung und
Produktionsbedingungen flächendeckend koordiniert, sicherlich mehr zu erreichen.
94
6 Zusammenfassung
Elke Hiltermann-Linden
Vergleich von Methoden zum Nachweis von Mycoplasma hyopneumoniaeInfektionen beim Schwein sowie epidemiologische Untersuchungen über die
Verbreitung der Enzootischen Pneumonie im Weser-Ems Gebiet im Jahre 1996
Ein Vergleich von vier Enzyme Linked Immunosorbent Assays (ELISAs) zum
Nachweis von Antikörpern gegen Mycoplasma hyopneumoniae, dem Erreger der
Enzootischen Pneumonie, wurde an denselben Proben durchgeführt. Die ELISAs,
Chekit®-Hypotest I und II nach Dr. Bommeli, DAKO Mycoplasma hyopneumoniae
und ein ELISA der Tierärztlichen Hochschule Hannover, die auf individuellem Niveau
miteinander verglichen wurden, bestätigten ihre Eignung für die Herdendiagnostik,
aber nicht für die Einzeltierdiagnostik. Für das Auffinden chronisch infizierter Tiere
sind sie nicht zuverlässig. Ein Zusammenhang zwischen dem indirekten
Immunfluoreszenztest (iIFT) und dem Chekit®-Hyoptest II bestand nicht. Auch eine
Korrelation zwischen den ELISA-Ergebnissen und den Lungenveränderungen der
Schweine lag nicht vor. Aber im Vergleich zum Chekit®-Hyoptest II zeigte sich der
iIFT an typisch verändertem Lungengewebe in Form von chronischen
Lungenspitzenlappenveränderungen mit Pneumonie überlegen (p< 0,05). Die
kulturelle Untersuchung auf M. hyopneumoniae war ineffizient, da allein 53 % der
Lungenproben wegen Kontamination mit anderen Keimen nicht auswertbar waren.
Das Hauptziel dieser Arbeit war die Erfassung der Verbreitung von M.
hyoppneumoniae im nord-westlichen Niedersachsen (Weser-Ems-Gebiet) mit
Überprüfung einiger Einflussfaktoren auf die Intra-Herden-Prävalenz. Die
serologische Untersuchung von 1392 Blutproben von Schlachtschweinen aus 106
Betrieben aus dem Jahre 1996 erfolgte mittels Chekit®-Hyoptest II. Zu dieser Zeit
sind noch keine Impfungen gegen M. hyopneumoniae durchgeführt worden. 97,17 %
der
untersuchten
Betriebe
waren
hiernach
seropositiv
mit
einem
Durchseuchungsgrad innerhalb der Betriebe von 81,25 %. Tendenziell zeigten die
geschlossenen Betriebe mit kontinuierlicher Belegung sowie Betriebe mit hofweisem
Rein-Raus-Belegen von Qualitätsferkeln aus zahlreichen Herkünften die höchsten
Intra-Herden-Prävalenzen. Die niedrigsten Intra-Herden-Prävalenzen konnten die
Betriebe mit Ferkelerzeuger-Mäster-Direktverkehr und geschlossene Betriebe mit
abteilweisem Rein-Raus-Verfahren aufweisen. Die Veranschaulichung der
geographischen Verteilung von M. hyopneumoniae deutete eine Beeinflussung der
Topographie auf die Intra-Herden-Prävalenz an.
Ein weiteres Ziel war der Vergleich dieser Ergebnisse mit den Untersuchungen über
Antikörper gegen Actinobacillus pleuropneumoniae (A. pp.) nach POPPE (1997) und
Influenza A/swine/Bakum/5/95 (H1N1) und Influenza A/swine/Bakum/909/93 (H3N2)
nach SCHENK (2000) aus dem gleichen Probenpool von 1996 wie die eigenen
Proben. Der Durchseuchungsgrad innerhalb der Betriebe war bei M. hyopneumoniae
am höchsten. Es folgten A. pp. mit ca. 64 %, Influenza A H1N1 mit rund 59 % und
Influenza A H3N2 mit 13 %. Die Herden-Prävalenz lag für M. hyopneumoniae, A. pp.
und Influenza A H1N1 zwischen 96 und 97 %, für Influenza A H3N2 betrug sie 61 %.
Für A. pp. ergaben sich eine signifikante Beeinflussung der Einstallungsform und
95
signifikante Beeinflussungen der Produktionsverfahren auf die Intra-HerdenPrävalenz (siehe POPPE 1997). Auch für Influenza konnten signifikante Einflüsse
der Produktionsverfahren auf die Intra-Herden-Prävalenz festgestellt werden.
Abschließend lässt sich sagen, dass mit festen Ferkelerzeuger-Mäster-Beziehungen
und einem konsequenten Rein-Raus-Verfahren bei der Belegung der Ställe die
Übertragung von M. hyopneumoniae, respektive A. pp. und zum Teil auch von
Influenza einschränken lässt.
96
7 Summary
Elke Hiltermann-Linden:
Comparison of diagnostic assays for Mycoplasma hyopneumoniae infections
of pigs and epidemiological investigations about the distribution of Enzootic
Pneumonia in the region of Weser-Ems of the year 1996
A comparison of four enzyme linked immunosorbent assays (ELISAs) for the
detection of antibodies against Mycoplasma hyopneumoniae, the causative organism
of Enzootic Pneumonia, was carried out using the same samples. The ELISAs
Chekit®-Hyoptest I und II by Dr. Bommeli, DAKO Mycoplasma hyopneumoniae and
the ELISA established by the University of veterinary medicine Hannover (TiHo)
tested on individual level have proven their ability for herd diagnostics, but not for
single animal diagnostics. They are not reliable for the detection of chronic infected
animals. A significant correlation between the indirect immunofluorescence (iIF) and
the Chekit®-Hyoptest II didn’t exist. A correlation between the results of the ELISA
and the gross lesions of the pigs wasn’t on hand either. The iIF applied to gross
lesions in terms of chronic alterations of the tips of the lobes appeared superior to the
Chekit®-Hyoptest II (p<0,05). Cultivation of M. hyopneumoniae was inefficient,
because 53 % of the lung samples were contaminated with other bacteria.
This investigation was mainly aimed at drawing a study on the distribution of M.
hyopneumoniae in the north-west of Lower Saxony (region of the Weser-Ems) and
checking of the influence of some specific factors of the farms on the intra-herdprevalence. 1392 blood samples from fattening pigs of 106 farms of the year 1996
were examined with the Chekit®-Hyoptest II. At that time vaccination of the pigs
against M. hyopneumoniae were not carried out. 97,17 % of all farms were
seropositive. The intra-herd-prevalence of M. hyopneumoniae in these farms were
81,25 %. Farrowing to finishing farms with continuous flow and farms with an all in/all
out practise of all barns with piglets from many different breeders tended to result in
the highest intra-herd-prevalence and farms with piglets from only one breeder and
farrowing to finishing farms with an all in/all out practise of units tended to result in
the lowest intra-herd-prevalence. The visualization of the geographical distribution of
M. hyopneumoniae indicated an influence of the topography on the intra-herdprevalence.
Another aim of this study was the comparison of these results with the investigations
of POPPE (1997) about antibodies against Actinobacillus pleuropneumoniae (A. pp.)
and of SCHENK (2000) about antibodies against influenza A/swine/Bakum/5/95
(H1N1) and influenza A/swine/Bakum/909/93 (H3N2) out of the same pool of
samples of 1996 like those examined here. The intra-herd-prevalence of M.
hyopneumoniae was the highest, A. pp. followed with approximately 64 %, then
Influenza A H1N1 with approximately 59 % and Influenza A H3N2 with 13 %. The
herd-prevalences of M. hyopneumoniea, A. pp. and Influenza A H1N1 ranged
between 96% and 97 %, and for Influenza A H3N2 it was 61 %. For A. pp. specific
factors of the farm significantly influenced the intra-herd-prevalence (see POPPE
1997). For influenza significant influences of the management systems on the intraherd-prevalence were found, too.
97
In conclusion of the study tight relations between breeders and finishing farms and
consequential all in/all out management systems will reduce the transmission of M.
hyopneumoniae, respectively A. pp. and of Influenza to some degree.
98
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Danksagungen
Mein herzlicher Dank gilt Herrn Prof. Dr. M. Ganter für die Überlassung des Themas,
für seine Unterstützung bei der Durchführung und nicht zuletzt für seine unendliche
Geduld.
Bei Herrn Dr. M. Runge bedanke ich mich ebenfalls für seine Hilfsbereitschaft und
freundschaftlichen Ratschläge.
Bei den Mitarbeitern des Instituts für Mikrobiologie und Tierseuchen, besonders bei
Frau S. Jeckstadt und ganz besonders bei Frau R. Schmidt möchte ich mich für die
stets freundlich gewährte Hilfe bei der Einführung in die Untersuchungstechniken
bedanken.
Auch den Mitarbeitern der Klinik für kleine Klauentiere, besonders Frau P. Röhrig
danke ich für ihre Mithilfe bei der Durchführung der labordiagnostischen
Untersuchungen.
Ein ganz besonderer Dank gilt meinen beiden Söhnen Elias und Jesse, ohne deren
meist großes Verständnis ich diese Arbeit nie zu Ende gebracht hätte.
Ganz herzlich möchte ich auch Uli Schwöppe, Irma Kleine-Hörstkamp, Sabine
Brinkmann und meinem Mann für die geduldige Durchsicht der Arbeit und kritische
Anmerkungen danken.
Im Besonderen danke ich meinen Eltern und Schwiegereltern, ohne deren
großzügige Hilfe das Erreichen dieses Ziels unmöglich gewesen wäre.
Der Firma Dr. Bommeli AG bin ich für die Bereitstellung der ELISA Chekit®-Hyoptest
I und II zu Dank verpflichtet.

Aus der Klinik für kleine Klauentiere und forensische Medizin und

Transcription

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