Tierschutzgerechtes Töten von Labornagern: CO ist erlaubt, aber ist

Tierschutzgerechtes Töten von Labornagern:
CO2 ist erlaubt, aber ist es noch vertretbar?
12. September 2013
N. Marquardt
Institut für Pharmakologie und Toxikologie, FB Veterinärmedizin
[email protected]
Gliederung
Einführung
Unsere Studie
Mäuse*, Ratten und Hamster
Stammes und Speziesunterschiede
Ergebnisse
Fazit
* in Kürze erscheinende Dissertation „Vergleich der Belastungen durch Kohlendioxid (CO2), Isofluran und
Sevofluran in der Phase der Narkoseeinleitung bei Mäusen – ein Beitrag zum Refinement von
Tierversuchen“. Marquardt, 2013. Fachbereich Veterinärmedizin der Freien Universität Berlin.
Einführung
Versuchstierzahlen
Deutschland 2011
Berlin 2012
> 2,4 Mio. Labornager
> 427 000 Labornager
2 036 606 Mäuse
Bundesministerium für Ernährung,
Landwirtschaft und Verbraucherschutz
396 984 Mäuse
Landesamt für Gesundheit und Soziales,
Berlin
Versuchtierrichtlinie 2010/63/EU Anhang IV
Kohlendioxid (CO2)
Überdosis eines Betäubungsmittels
CO2-Euthanasie
Die Verwendung von CO2 zur Euthanasie ist weit verbreitet, jedoch
umstritten.
Es ist bekannt, dass CO2
Aversion
Reizung der Schleimhäute, Schmerzen
Azidose
Dyspnoe
Lungenödem und –blutungen
Angst
verursachen kann.
Inhalationsanästhetika
Inhalationsanästhetika werden als Alternative vorgeschlagen,
aber …
sie können die Schleimhäute irritieren.
sie sind hinsichtlich der Stressbelastung noch nicht
ausreichend charakterisiert.
Sind sie wirklich die bessere Wahl?
Unsere Studie
Unsere Studie
Umfassende Untersuchung der Stressbelastung
Verhalten einschl. Vokalisationen
Stresshormone (Adrenalin und Noradrenalin) und Glukose
Atembewegungen
Organpathologische Untersuchung
Stressrelevanter Zeitraum
Start Narkoseeinleitung bis Erreichen der chirurg. Toleranz
max. 300 s
Stressarme Applikation
Habituation und Simulation des Heimatkäfig
Verschiedene Narkosegase in unterschiedlichen Dosen
CO2, Isofluran und Sevofluran
Unsere Studie
Spezies- und Stammesunterschiede
Mäuse: NMRI und C57Bl/6
Ratten: Wistar und Sprague Dawley (SD)
Syrischer Goldhamster
Nur überzählige Tiere oder Kontrolltiere
Versuchsablauf
Narkosekammer
Verwirbelungsplatte
in Anlehnung an
Corbach 2006
Tiere und Behandlung
Behandlung
100% CO2
Einfüllrate
[Kammervol/min]
Abkürzung
Tiere
20%
CO2 20
40%
CO2 40
60%
CO2 60
M
R
100%
CO2 100
M
R
Iso 2%
M
2% Isofluran
M
R
5% Isofluran
71% (M)
Iso 5%
M
4,8% Sevofluran
59% (R,H)
Sevo 4,8%
M
Sevo 8%
M
R
air
M
R
8% Sevofluran
Luft = Kontrolle
100%
M Mäuse
2 x 8 x 16
R
2 x 6 x 16
Ratten
H Hamster
2x6
R
H
H
H
Narkosestadien
Analgesie
Exzitation
Bewusstseinsverlust:
 Verlust des Stellreflexes
Einleitung
Toleranz
1. Stufe
2. Stufe
3. Stufe
Asphyxie
Chirurgische Toleranz:
 Verlust des Zwischenzehenreflexes
Atemstillstand und
Herz-/Kreislauf-Versagen
Tiefe Narkose
Tod
Reflextestung
Ergebnisse
Wirksamkeit
Chirurgische Toleranz (CT) in < 300s
CT
in <300s CO2 20 CO2 40 CO2 60
[%]
CO2
100
NMRI
C57Bl/6
Iso 2% Iso 5%
Sevo
4,8%
Sevo
8%
25
--
100
93,8
62,5
100
62,5
87,5
31,3
--
93,8
100
87,5
100
81,3
100
Wirksamkeit
Chirurgische Toleranz (CT) in < 300s
CT
in <300s CO2 20 CO2 40 CO2 60
[%]
CO2
100
NMRI
Iso 2% Iso 5%
Sevo
4,8%
Sevo
8%
25
--
100
93,8
62,5
100
62,5
87,5
C57Bl/6
31,3
--
93,8
100
87,5
100
81,3
100
Wistar
--
100
100
100
--
100
--
100
SD
--
100
100
100
--
100
--
100
Hamster
--
100
--
--
--
100
--
--
Konzentrationsverläufe
Kammer-Konzentrationen von CO2 und Zeitpunkt der Bewusstlosigkeit
CO2 100
CO2 60
Concentration of CO2 [%]
100
80
CO2 20
60
Mäuse
40
20
0
0
50
100
150
200
250
300
[s]
ab 25% CO2: intranasale Noxe bei Ratten, Stimulation von Aδ- und C-Fasern
Konzentrationsverläufe
Kammer-Konzentrationen von CO2 und Zeitpunkt der Bewusstlosigkeit
CO2 100
CO2 60
Concentration of CO2 [%]
100
CO2 40
80
Ratten
Hamster
60
40
20
0
0
50
100
150
200
250
300
[s]
ab 25% CO2: intranasale Noxe bei Ratten, Stimulation von Aδ- und C-Fasern
Latenz bis zum Erreichen der CT
300
Mäuse
Latency to reach ST [s]
250
200
*
*
CO2 60
CO2 100
Iso 5%
Sevo 8%
150
100
Median,
0,25 und 0,75-Perzentile
Kruskal-Wallis-Analyse
gefolgt von Dunn‘s Method
* p<0,05
50
0
NMRI
C57Bl/6
Latenz bis zum Erreichen der CT
Ratten
Hamster
300
*
Latency to reach ST [s]
250
CO2 40
200
*
*
*
CO2 60
CO2 100
Iso 5%
Sevo 8%
150
100
Median,
0,25 und 0,75-Perzentile
Kruskal-Wallis-Analyse
gefolgt von Dunn‘s Method
* p<0,05
50
0
Wistar
SD
Hamster
Latenz bis zum Erreichen der CT
Stammesunterschiede
Speziesunterschiede
Mäuse
Ratten
Mäuse – Ratten
Hamster - Ratten
*
250
250
*
*
200
Latenz bis Erreichen CT [s]
Latenz bis Erreichen CT [s]
Sevo 8%
Iso5%, Sevo 8%
*
150
100
CO2 60
*
200
CO2 40
150
100
50
50
0
0
NMRI
CO2 40
CO2 60
CO2 100
Iso 5%
Sevo 8%
CO2 100
C57Bl/6
Wistar
SD
Hamster
Kruskal-Wallis-Analyse gefolgt von Dunn‘s Method
bzw. Mann-Whitney-Ranksummentest
NMRI
C57Bl/6
Wistar
SD
Hamster
Verhalten
Kontroll-Gruppen
Luft
Gehen, Laufen
Putzen
Rearings (A und B)
Hochspringen
Verhalten
Narkosegas-Gruppen
Gehen, Laufen (1A)
Putzen
Rearings
Hochspringen
CO2
Iso/Sevo
Schwanken, Ataxie
Hypotoner Gang (1B)
Exzitationen
Opisthotonus (2A und B)
Running excitement
Klonus
1
A
2
B
Änderung der Häufigkeit
Verhalten
Verhalten
CO2
Iso/Sevo
Gehen, Laufen


 kein Putzen

Rearings


Hochspringen


Schwanken, Ataxie


Hypotoner Gang

 kein hypot. G.
 keine Exzit.

Putzen
Exzitationen
Running excitement,
Klonus,
Opisthotonus
Mäuse
 keine Änderung
 geringere bzw.
 höhere Frequenz vergl.
mit der Luftkontrolle
Two way ANOVA
Kein eindeutiges Schmerz- oder Stress-anzeigendes Verhalten
Keine Vokalisationen
Verhalten
Verhalten
CO2
Iso/Sevo
Gehen, Laufen


 kein Putzen

Rearings


Hochspringen


Schwanken, Ataxie


Hypotoner Gang

 kein hypot. G.
H:  keine Exzit.
R: 

Putzen
Exzitationen
Running excitement,
Klonus,
Opisthotonus
Ratten
Hamster
 keine Änderung
 geringere bzw.
 höhere Frequenz vergl.
mit der Luftkontrolle
Two way ANOVA
Kein eindeutiges Schmerz- oder Stress-anzeigendes Verhalten
Einzelne 50-70 kHz-Vokalisationen bei Ratten, aber keine 22 kHz-Arlarmrufe
Mikroskopische Untersuchung
In Zusammenarbeit mit dem
Institut für
Veterinär-Anatomie
CO2
Iso/Sevo
Normal Luft
Mikroskopische Untersuchung
Gestaute Kapillaren
Blutaspiration
Blutung in Alveolarsepten/-raum
Mikroskopische Untersuchung
CO2
kollabierte Lungenabschnitte
 Absorptionsatelektase
Normal
Atelektase
Mikroskopische Untersuchung
CO2
Iso/Sevo
Luft
Keine Dekapitation:  „weniger Blut“ im Vergleich zu Mäusen
Keine Unterschiede zwischen Kontroll- und Behandlungsgruppen
Adrenalin im Plasma
Plasma adrenaline [ng/ml]
60
*
Mäuse
50
CO2 60
40
*
30
CO2 100
Iso 5%
Sevo 8%
Median,
0,25 und 0,75-Perzentile
Kruskal-Wallis-Analyse
gefolgt von Dunn‘s Method
* p<0,05
20
10
0
NMRI
C57Bl/6
Noradrenalin im Plasma
Plasma noradrenaline [ng/ml]
160
Mäuse
140
120
*
*
CO2 60
100
CO2 100
Iso 5%
Sevo 8%
80
60
Median,
0,25 und 0,75-Perzentile
Kruskal-Wallis-Analyse
gefolgt von Dunn‘s Method
* p<0,05
40
20
0
NMRI
C57Bl/6
Adrenalin im Plasma
Ratten
Hamster
Plasma adrenaline [ng/ml]
60
50
*
*
40
CO2 60
CO2 100
Iso 5%
Sevo 8%
30
*
Median,
0,25 und 0,75-Perzentile
Kruskal-Wallis-Analyse
gefolgt von Dunn‘s Method
* p<0,05
20
10
0
Wistar
SD
Hamster
Noradrenalin im Plasma
Plasma noradrenaline [ng/ml]
160
*
140
Ratten
Hamster
120
CO2 60
100
80
*
CO2 100
*
Iso 5%
Sevo 8%
60
Median,
0,25 und 0,75-Perzentile
Kruskal-Wallis-Analyse
gefolgt von Dunn‘s Method
* p<0,05
40
20
0
Wistar
SD
Hamster
Adrenalin im Plasma
Stammesunterschiede
Speziesunterschiede
Mäuse
Ratten
Mäuse – Ratten
CO2 100
*
60
60
CO2 100, CO2 60
40
Adrenalin [ng/ml]
Adrenalin [ng/ml]
50
*
50
CO2 100
*
30
20
CO2 60
40
30
20
10
10
0
0
NMRI
CO2 40
CO2 60
CO2 100
Iso 5%
Sevo 8%
*
C57Bl/6
Wistar
SD
Hamster
Kruskal-Wallis-Analyse gefolgt von Dunn‘s Method
bzw. Mann-Whitney-Ranksummentest
NMRI
C57Bl/6
Wistar
SD
Hamster
Noradrenalin im Plasma
Stammesunterschiede
Speziesunterschiede
Mäuse
Ratten
Mäuse – Ratten
Hamster - Ratten
*
140
140
*
alle Narkosegase
*
100
CO2 100, Sevo 8%
80
*
60
40
100
*
*
80
CO2 100
CO2 60
60
40
20
20
0
0
NMRI
CO2 40
CO2 60
CO2 100
Iso 5%
Sevo 8%
CO2 40
120
Noradrenalin [ng/ml]
Noradrenalin [ng/ml]
120
Iso 5%
C57Bl/6
Wistar
SD
Hamster
Kruskal-Wallis-Analyse gefolgt von Dunn‘s Method
bzw. Mann-Whitney-Ranksummentest
NMRI
C57Bl/6
Wistar
SD
Hamster
Zusammenfassung
CO2 40, CO2 60, CO2 100, Iso 5 und Sevo 8 erzeugten zuverlässig die CT
innerhalb 300s.
Sevo 8 wirkte am langsamsten, Iso 5 und CO2 60 gleich schnell und CO2
100 am schnellsten.
Die Änderungen des Verhaltens lassen keine eindeutigen Aussagen zur
Stressbelastung zu.
Das Verhalten unter CO2-Exposition war „ruhiger“ als das Verhalten unter
Iso/Sevo-Exposition bei Mäusen und Hamstern.
Zusammenfassung
Wir fanden pathologische Veränderungen in der Kontroll- und in allen
Behandlungsgruppen.
CO2-Exposition führte zu höheren Adrenalin- und Noradrenalinkonzentrationen als Iso/Sevo-Exposition.
Woher kommt der Stress?
Stress durch CO2
Aversion (Approach-Avoidance Test u.a.)
CO2  Warnsignal
Ratte:
Maus:
Schwelle 0,5% CO2
Schwelle ca. 0,066% CO2
Angst und Panik
Reizung von Nozizeptoren
Azidose  lebensbedrohlicher Zustand
Dyspnoe
Fazit
Fazit
Trotzdem die Euthanasie mit CO2 weitverbreitet ist,
sie erlaubt ist,
sie von außen betrachtet sanft und friedlich erscheint,
sie am schnellsten geschieht,
wird die Narkoseinduktion mit CO2 von einem massiven
Anstieg der Stresshormone Adrenalin und Noradrenalin
begleitet.
Unterstützung
Bundesinstitut für Risikobewertung
ZEBET
Zentralstelle zur Erfassung und Bewertung
von Ersatz und Ergänzungsmethoden zum
Tierversuch
FK 3-1328-429
DIAGNOSTICS BY HPLC & LC-MS/MS
Dahlem Research School
Innovationsfonds 2009
FEM - Forschungseinrichtung
für experimentelle Medizin
Danke!
Institut für Pharmakologie
und Toxikologie
•
•
•
•
•
Prof. Dr. H. Fink
Dr. B. Bert, Dr. Silke Dietze
Lena Menken und Alexandra Wistel (Approach-Avoidance Test)
Carmen Bohnwagner, Carola Kapfer, Jagoda Kuschka
alle anderen Mitarbeitern
Institut für
Veterinär-Anatomie
• Prof. Dr. J. Plendl
• Dr. H. Hünigen
• Karin Briest-Forch
Für Ihre Aufmerksamkeit!
Noch Fragen?
Man glaubt, was man sieht.
Man sieht, was man glaubt.
Redensart
Man sieht nur, was man weiß.
Goethe
Approach-Avoidance Test
zur Messung des Meideverhaltens und der Aversivität
Konflikt zwischen Belohnung und Gasexposition
Verlassen jederzeit möglich
Test basiert auf Studie von Makowska et al. 2009
C57Bl/6 und NMRI-Mäuse
Belohnung: gesüßte Kondensmilch
Videoaufnahme zur Verhaltensanalyse
Latenz bis zum Verlassen, Fresszeit u. -menge, Rearings, Laufen,
Narkosestadium
Substanzen
CO2, Isofluran, Sevofluran in unterschiedlichen Dosierungen,
Luftkontrolle
Approach-Avoidance Test
Ablauf
Gewöhnung an die Doppelkäfige und die Belohnung
Training auf ein Zeichen in den unteren Käfig zu gehen
Gewöhnung an den Luftstrom
 Trainingsziel: mind. 120 s im unteren Käfig, Belohnung auffressen
Versuch
Luftkontrolle
niedrige Dosis
mittlere Dosis
hohe Dosis
Versuch endet, wenn die
Maus die Kammer verlässt
oder nach max. 240 s
Futterbelohnung ↔ Gasatmosphäre
Verlassen jederzeit möglich
Approach-Avoidance Test
C57Bl/6
Narkosestadium und Gaskonzentration
beim Verlassen des Käfigs
CO2
Keine Maus zeigte Ataxie unter CO2-Exposition.
Konz. ca. 7-12% CO2
Iso/Sevo
9 von 10 Mäusen zeigten Ataxie unter Isofluran-Exposition.
8 von 9 Mäusen zeigten Ataxie unter Sevofluran-Exposition.
Konz. ca. 1,1% Iso
Konz. ca. 1,7% Sevo
 Im weiteren Verlauf verloren einige Mäuse das Bewusstsein.
Substanz
CO2
Isofluran
Sevofluran
niedrig
0
1
0
Dosis
mittel
0
0
0
hoch
0
4
4
Anzahl der Mäuse, die
das Bewusstsein
verloren
Glucose
18
Blood glucose [mmol/l]
16
*
*
rats
mice
14
CO2 40
12
CO2 60
10
CO2 100
8
Iso 5%
Sevo 8%
6
4
2
0
Wistar
NMRI
C57Bl/6
median,
0,25 and 0,75-percentile
Kruskal-Wallis-Analysis
followed by Dunn‘s
Method
* p<0,05
Latency to reach surgical tolerance
[s]
CO2 40
CO2 60
CO2 100
Iso 5%
Sevo 8%
NMRI
--
95
65
102
141
75 / 129
61 / 71
95 / 124
127 / 172
C57Bl/6
--
80
64
95
116
75 /86
61 / 67
84 / 102
109 / 123
Wistar
136
126
91
121
193
126 / 150
113 / 134
85 /99
114 /158
170 / 217
136
127
104
142
146
119 / 145
120 / 132
92 / 111
130 / 152
136 / 164
--
--
SD
Hamster
154
147 / 162
median
0,25 / 0,75-percentile
134
127 / 138
--
Formel
cin – c
cin – c0
=e
-(Q / V)t
Gaskonzentration in der Kammer zu einem best. Zeitpunkt =
-(EXP((-(Einfüllrate in [l/min]/60[s])/Kammervol.[l])*Zeitpunkt [s]))
*(Gaskonz.-Umgebungsgaskonz.)+Gaskonz.
Annhame:
völlige Durchmischung des Narkosegases mit dem in der Kammer befindlichen Gases während des Einfüllens
Was ist zu tun?

Narkoseeinleitung mit Isofluran oder Sevofluran
 rasche Anflutung gewährleisten
 tiefe Narkose aufrechterhalten
 Arbeitsschutz!

Spezies- und Stammesunterschiede beachten!
anschließende Tötung mit CO2 oder anderer Methode
 Tier muss sicher bewusstlos bleiben!
Genaue Dosierungen und Anwendungsformen sowie die Befeuchtung der
Gase müssen Gegenstand weiterführender Untersuchungen sein.
Technische Umsetzungen sind im Aufkommen.
Atmung
Atembewegungen im Verlauf der Narkoseeinleitung
CO2
Iso/Sevo
Tiefe: 
Frequenz : früh , später 
Tiefe: 
Frequenz: 
Dyspnoe
Schnappatmung
Atemdepression