Management of Neuromuscular Diseases - Letter 5

Management of Neuromuscular Diseases - Letter 5
Molekulargenetische Diagnostik der progressiven
Muskeldystropie Typ Duchenne und Becker
Tiemo Grimm und Wolfram Kress
1.Einleitung
Die Muskeldystrophie Typ Duchenne (DMD) ist eine der häufigsten Muskelerkrankungen. Die ersten
klinischen Beobachtungen stammen aus dem vorigen Jahrhundert (Duchenne, 1868; Gower, 1879).
Becker und Kiener (1955) beschrieben, daß es neben der schweren DMD noch einen leichter
verlaufenden X-chromosomen Typ gibt. Dieser erhielt später den Namen Muskeldystrophie Typ Becker
(BMD). Schon in seiner Erstbeschreibung vermutete Becker (1955), daß beide Muskeldystrophien
allelisch sind. Einen sehr guten historischen Überblick geben Emery und Emery in ihrem Buch „The
History of a Genetic Disease" (1995).
2.Molekulare Pathologie
Bereits Gowers (1879) beobachtete, daß bei der Muskeldystrophie im Kindesalter überwiegend Knaben
betroffen sind und weitere Erkrankte nur in der mütterlichen Verwandtschaft vorkommen. Becker (1940)
hat als erster klar zwischen der autosomal dominanten (=Fazioskapulohumerale Muskeldystrophie), der
autosomal rezessiven (=Gliedergürtelmuskeldystrophie) und der Form der progressiven Muskeldystrophie
mit X-chromosomaler Vererbung unterschieden.
2.1.Dystrophin-Gen und sein Genprodukt
Die Beobachtung von Mädchen mit einer chromosomalen X-Autosomen Translokation, die an einer
Muskeldystrophie erkrankt waren (Greenstein et al., 1977), und Kopplungsanalysen mit einer DNA-Sonde
(RC8 am Genort DXS9; Murray et al., 1982) erlaubten die Lokalisation des Genortes der
Muskeldystrophie Duchenne auf den kurzen Arm des X-Chromosoms (Xp21). Bald standen flankierende
und intragene DNA-Sonden zur Verfügung, um eine indirekte Genotypdiagnostik in DMD-Familien
durchführen zu können (Davies et al., 1983; Müller et al., 1985).
Worton und Mitarbeiter (1984) untersuchten die DNA einer an DMD erkrankten Frau mit einer X21
Translokation. Es gelang ihnen Teile des DMD-Gens zu klonieren. Kunkel und Mitarbeiter (1985)
klonierten mit Hilfe einer großen Deletion im DMD-Gen eines Patienten weitere Genabschnitte. Sie
benutzten dabei die sog. Phenol Enhanced Reassociation Technique (=PERT). Die dabei gewonnenen
intragenen DNA-Sonden (PERT87 am Genort DXS 164) erlaubten bei etwa 6,5% der DMD-Patienten
eine Deletion im DMD-Gen nachzuweisen (Kunkel et al., 1986). Inzwischen ist die gesamte cDNA des
DMD-Gens kloniert worden.
Das DMD-Gen besteht aus 79 Exons, die
sich auf über 2300 kb verteilen (Den
Dunnen et al., 1989). Das DMD-Gen ist
damit genomisch das bisher größte
bekannte menschliche Gen. Die 14 kb
mRNA des DMD-Gens wird in ein Protein
übersetzt, welches aus 3685 Aminosäuren
mit einem Molekulargewicht von etwa 427
kD besteht. Dieses Protein hat den
Kunstnamen „Dystrophin" erhalten
(Hoffmann et al., 1987). Danach bezeichnet
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man das DMD-Gen auch als
Dystrophin-Gen (Abb.1). Der Anteil des
Dystrophins am Gesamtprotein im normalen
Muskel beträgt nur 0,002%.
Das Dystrophin-Molekül besteht aus vier funktionellen Einheiten (Domänen):
der N-terminalen Aktin bindenden Domäne,
25 repetitiven tripelhelikalen Abschnitten,
einer zysteinreichen Region
und dem C-terminalen Ende.
Innerhalb der Muskelzelle liegt Dystrophin
an der Innenseite des Sarkolemms. Mit dem
C-terminalen Molekülende ist es an einem
Komplex von dystrophin assoziierten
Glykoprote-inen (Sarkoglykane,
Dystroglykane) gebunden. Mutationen in
den sog. Sarkoglykanen führen zu
autosomal rezessiven Muskeldystrophien
(Passos-Bueno et al.,1996) Dystrophin wird
nicht nur in der Muskulatur exprimiert,
sondern es gibt auch mehrere Isoformen
wie z.B. im Gehirn. Seine Funktion im
Gehirn ist noch nicht bekannt. Einen Zusammenhang könnte es mit der Beobachtung geben, daß ein Teil
der DMD-Patienten geistig retardiert ist.
2.2.Mutationen im Dystrophin-Gen
Bei etwa 60% der DMD- und BMD-Patienten kann mit Hilfe der cDNA-Hybridisierung von
Southern-Blots eine Deletion einzelner oder mehrerer Exons nachgewiesen werden (Read et al., 1988);
Duplikationen werden bei etwa 5–10% der Patienten gefunden (Den Dunnen et al., 1989). Mit dem
Nachweis von Strukturanomalien im Dystrophin-Gen gelang auch der endgültige Beweis, daß DMD und
BMD allelisch sind. Diese Mutationen sind nicht gleichmäßig über das Gen verteilt, sondern bilden zwei
„hot spots" im Bereich der Exons 3–19 (etwa 30% der Deletionen) und der Exons 44–52 (etwa 70% der
Deletionen) (Abb.2).
Die Größe der Deletion hat i.d.R. keinen
Einfluß auf den klinischen Verlauf der
Krankheit. Monaco und Mitarbeiter (1988)
fanden eine molekulargenetische Erklärung
für den unterschiedlichen klinischen Verlauf
bei DMD und BMD, die sog. Frame-shiftTheorie. Deletionen, die das Leseraster des
Triplet-Codes unterbrechen, erzeugen
danach in der Regel ein Stopcodon. Es kann
dann nur noch ein instabiles funktionsloses
Protein gebildet werden. Bei
DMD-Patienten werden daher mit
Dystrophin-Antikörpern nur noch Spuren
oder überhaupt kein Dystrophin in der
Skelettmuskulatur nachgewiesen, gut
vereinbar mit dem schweren
Krankheitsverlauf. Falls die Deletion jedoch das Leseraster aufrecht erhält, entsteht ein verändertes
Protein (im Molekulargewicht, in der Menge), welches wahrscheinlich noch Restfunktionen wahrnehmen
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kann.
Im Vergleich zu DMD-Patienten zeigen BMD-Patienten daher einen milderen Krankheitsverlauf (Abb.3).
Diese Frame-Shift-Theorie stimmt in über 90% der Fälle. Beobachtete Ausnahmen konnten durch
alternatives Spleißen erklärt werden (Malhotra et al., 1988). Punktmutationen und Mikrodeletionen von
wenigen Basenpaaren machen den Rest der Mutationen bei DMD- und BMD-Patienten aus. Auch die
kleinen Mutationen stehen in der Regel im Einklang mit der Frame-shift-Theorie (Roberts et al.,1994).
3.Genetik
3.1.Erbgang
Die Muskeldystrophie Duchenne und Becker wird X-chromosomal rezessiv vererbt. Die heterozygoten
Frauen sind in der Regel gesund. Die Hälfte der Söhne von Überträgerinnen erkranken. Die Töchter von
Heterozygoten sind in der Regel alle gesund, aber 50% sind wiederum Konduktorinnen. Bei der BMD
haben Patienten Nachkommen, die alle gesund sind; die Töchter sind obligate Überträgerinnen. Etwa
2,5% der heterozygoten Frauen können auch klinische Symptome zeigen (Norman und Harper, 1989).
3.2.Inzidenz
Die Inzidenz der DMD (=neu aufgetretene Fälle bezogen auf alle Neugeborenen in einer bestimmten
Bevölkerung; bei DMD bezogen auf die männlichen Neugeborenen) liegt bei etwa 30x10–5 (Emery,
1991). Aufgrund von genetischer Beratung, Heterozygotendiagnostik und Pränataldiagnostik könnte die
Inzidenz sich gering verringern (Van Essen et al., 1992 b). Die Inzidenz der BMD liegt bei etwa 1,4x10–5
(Emery, 1991).
3.3.Mutationsrate
Als Mutationsrate (µ) bezeichnet man die Zahl der Neumutationen pro Genort und Generation. Indirekte
Schätzungen der Mutationsrate für DMD ergeben einen Wert von µ = 10–4 der deutlich höher liegt als bei
anderen Erbkrankheiten. Für die BMD wird die Mutationsrate auf µ =5,4x10–6 geschätzt. Ein
Geschlechtsunterschied konnte für die Mutationsrate von DMD nicht nachgewiesen werden (Müller et al.,
1992). Berücksichtigt man jedoch die unterschiedlichen Mutationstypen (z.B. Deletionen, NichtDeletionen) findet man Geschlechtsunterschiede für die Mutationsraten. Deletionen entstehen eher in der
Oogenese und Nicht-Deletionen (z.B. Punktmutationen) eher in der Spermatogenese (Grimm et al., 1994).
3.4.Keimzellmosaik
Eine Mutation während der Keimzellentwicklung kann zu einem gewissen Prozentsatz von Oozyten oder
Spermatozyten führen, welche die Mutation tragen. Dieser Vorgang stellt die Grundlage eines
Keimzellmosaiks dar. Mit Hilfe von molekulargenetischen Methoden konnten bei der Muskeldystrophie
Duchenne und Becker Keimzellmosaike nachgewiesen werden (Grimm et al., 1990; Van Essen et al., 1992
a). Während Überträgerinnen ein Wiederholungsrisiko von 50% haben, liegt das Risiko für Frauen mit
einem nachgewiesenen Keimzellmosaik im Durchschnitt bei ca. 15%, einen Sohn mit DMD zu bekommen.
Mütter eines DMD-Patienten, die nachgewiesen keine Überträgerin sind, haben aufgrund des
Keimzellmosaikes eine Wahrscheinlichkeit von etwa 10% für einen Sohn, der an DMD erkrankt (Van
Essen et al., 1992 a).
4.Genetische Beratung und Diagnostik
Jede molekulargenetische Familienuntersuchung sollte in eine genetischen Beratung eingebunden sein.
Grundlage einer genetischen Beratung ist die Sicherung der Diagnose beim Indexpatienten. Bei DMD und
BMD müssen differentialdiagnostisch besonders die autosomal rezessiven Muskeldystrophien in Betracht
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gezogen werden. Klinisch können sie kaum von der X-chromosomalen DMD bzw. BMD unterschieden
werden.
Neben der klinischen Untersuchung ist eine
molekulargenetische Analyse oder eine
Muskelbiopsie erforderlich. Zuerst sollte an
einer EDTA-Blutprobe ein
Deletionsscreening im Dystrophin-Gen
durchgeführt werden. Etwa 98% aller
Deletionen im Dystrophin-Gen sind mit
Hilfe der PCR-Technik leicht nachweisbar
(Beggs et al., 1990). Die restlichen 2%
müssen mit der Southernblot-Technik und
cDNA-Proben nachgewiesen werden. Der
Nachweis von Duplikationen erfordert in
der Regel einen quantitativen Southernblot
(Bettecken und Müller, 1989).
Punktmutationen oder sehr kleine
strukturelle Veränderungen erfordern bei
der Größe des Dystrophin-Gens sehr
aufwendige Untersuchungstechniken (z.B.
SSCP-Analyse und Sequenzieren), die im
Moment nicht für die Routine geeignet sind.
Falls keine Mutation beim Patienten nachweisbar ist, kann zur Diagnosesicherung eine Muskelbiopsie
erfolgen, um Dystrophin mit Hilfe der Immunzytochemie und des Westernblots zu untersuchen (Arahata
et al., 1989; Hoffmann et al., 1987). DMD-Patienten zeigen in der Regel kein Dystrophin in der
Muskulatur, bei BMD-Patienten ist das Dystrophin im Westernblot qualitativ und/oder quantitativ
verändert, während Patienten der autosomal rezessiven Muskeldystrophien in der Regel einen normalen
Dystrophin-Befund zeigen. Das folgende Diagnoseschema (Abb.4) erläutert ein sinnvolles diagnostisches
Vorgehen bei Patienten mit der Verdachtsdiagnose DMD/BMD.
Schwieriger ist die Diagnostik bei den fraglich heterozygoten Frauen. Diese Diagnostik sollte ebenfalls
immer im Rahmen einer genetischen Beratung durchgeführt werden. Die Problematik liegt darin, daß eine
Frau zwei X-Chromosomen hat. Bei den heterozygoten Frauen wird bei fast allen Untersuchungen die
Mutation durch die normale Gensequenz des anderen X-Chromosoms überdeckt. Die günstigste Situation
liegt vor, wenn beim Indexpatient – z.B. durch eine Deletion bedingt – eine mutationsspezifische
Zusatzbande (junction fragment) in der cDNA-Analyse gefunden worden ist. Dies dürfte bei etwa 17%
der Patienten der Fall sein (Den Dunnen et al., 1989).
Der quantitative Nachweis einer halben Gendosis im Southernblot bei einer fraglich heterozygoten Frau
mit Deletion ist sehr aufwendig. Eine bekannte Deletion in einer Familie kann in den Hotspot-Regionen
mit der FISH-Technik nachgewiesen werden (Lichter et al., 1988). Häufig kann jedoch nur die
molekulargenetische Familienuntersuchung (Haplotypanalyse) und eine anschließende Risikoschätzung
mit Hilfe des Bayesschen Theorems zur Heterozygotendiagnostik herangezogen werden (Emery und
Morton, 1968).
Die Molekulargenetischen Methoden haben in den letzten Jahren entscheidende Fortschritte im
Verständnis der X-chromosomalen Muskeldystrophien gebracht und Hoffnungen auf neue
Therapiemöglichkeiten in der nahen Zukunft gesetzt. Andererseits hat aber auch jeder Wissenszuwachs
bei den Dystrophinopathien neue ungeklärte Fragestellungen der Genetik aufgeworfen.
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ISSN 0949–1503
3. Jahrgang
DGM · Deutsche Gesellschaft für Muskelkranke e.V.
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Anschriften der Verfasser:
Prof. Dr. med. Tiemo Grimm
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Herausgeber der Schriftenreihe:
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