Autologes - TiHo Bibliothek elib - Stiftung Tierärztliche Hochschule

Tierärztliche Hochschule Hannover
Autologes konditioniertes Serum als Behandlung einer
persistierenden post-breeding Endometritis bei Stuten
INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin
der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae ( Dr. med. vet. )
vorgelegt von
Pia Harnacke
Vreden
Hannover 2012
Wissenschaftliche Betreuung: Apl.-Prof. Dr. Sabine Meinecke-Tillmann, Institut für
Reproduktionsbiologie
1. Gutachterin: Apl.-Prof. Dr. Sabine Meinecke-Tillmann, Institut für Reproduktionsbiologie
2. Gutachter: Prof. Dr. Harald Sieme, Reproduktionsmedizinische Einheit der Kliniken
Tag der mündlichen Prüfung: 05.11.2012
Meiner Familie
INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG .................................................................................................................... 1
2
LITERATURÜBERSICHT .............................................................................................. 4
2.1
Der weibliche Geschlechtsapparat beim Pferd ............................................................... 4
2.1.1 Anatomie .............................................................................................................................. 4
2.1.2 Histologie des equinen Uterus ............................................................................................. 5
2.1.3 Immunologische Reaktion des Uterus auf die Besamung ................................................... 6
2.1.4 Bedeutung des mikrobiologischen und zytologischen Status
des Endometriums für die Fruchtbarkeit im haustierartlichen Vergleich ............................ 8
2.2
Persistierende post-breeding Endometritis (pPBE)...................................................... 13
2.2.1 Klassifizierung ................................................................................................................... 13
2.2.2 Prädisponierende Faktoren ................................................................................................ 16
2.2.3 Einfluss auf die Fertilität der Stuten .................................................................................. 17
2.2.4 Herkömmliche Therapieansätze ........................................................................................ 20
2.3
Autologes konditioniertes Serum (ACS) ........................................................................ 27
2.3.1 Herstellung und Wirkungsmechanismus ........................................................................... 27
2.3.2 Relevanz in der Pferdemedizin .......................................................................................... 28
2.3.3 Möglicher therapeutischer Nutzen bei zu pPBE neigenden Stuten ................................... 29
2.4
Aspekte für den therapeutischen Einsatz des ACS bei Mensch, Maus und Rind ..... 30
2.4.1 Einfluss des Interleukin-1 auf den weiblichen Geschlechtsapparat
der Frau und der Maus ....................................................................................................... 30
2.4.2. Einfluss eines therapeutischen Einsatzes von Serum oder Glucocorticoiden.................... 31
2.4.3 Einfluss des Interleukin-1 und anderer Zytokine auf den weiblichen Geschlechtsapparat
beim Rind ........................................................................................................................... 33
3
EIGENE UNTERSUCHUNGEN ................................................................................... 35
3.1
MATERIAL UND METHODEN ................................................................................... 35
3.1.1
Stuten............................................................................................................................ 35
3.1.1.1 Auswahlkriterien ........................................................................................................... 35
3.1.1.2 Vorversuche .................................................................................................................. 35
3.1.1.3 Gruppeneinteilung ......................................................................................................... 37
3.1.1.4 Versuchsaufbau ............................................................................................................. 39
3.1.1.5 Allgemeinuntersuchung ................................................................................................ 43
3.1.1.6 Klinisch-gynäkologische Untersuchung ....................................................................... 43
3.1.1.7 Ultrasonographische Beurteilung des Endometriumödems
und der intrauterinen Flüssigkeit................................................................................... 44
3.1.1.8 Endometriumtupfer und mikrobiologische Untersuchung ............................................ 45
3.1.1.9 „Cytology brush“ und zytologische Untersuchung ....................................................... 47
3.1.1.10 Terminierte Besamung nach hCG-Applikation ............................................................ 48
3.1.1.11 Behandlung nach Abschluss der Probenentnahme ....................................................... 49
3.1.1.12 Trächtigkeitsuntersuchung ............................................................................................ 49
3.1.2
Hengste ......................................................................................................................... 50
3.1.2.1 Auswahlkriterien ........................................................................................................... 50
3.1.2.2 Vorversuche .................................................................................................................. 50
3.1.3
Statistische Auswertung ............................................................................................. 53
3.2
ERGEBNISSE ............................................................................................................. 55
3.2.1 Vorversuche ...................................................................................................................... 56
3.2.1.1 Einfluss der intrauterinen ACS-Gabe auf den Ovulationszeitpunkt parallel zur
intravenösen hCG-Injektion ............................................................................................ 56
3.2.1.2 Beurteilung des ACS-Einflusses auf die Samenqualität des verdünnten Frischsamens
der Hengste ...................................................................................................................... 57
3.2.1.2.1 Einfluss des ACS auf die Morphologie und den Anteil toter Spermien des
verdünnten Frischsamens .............................................................................................. 57
3.2.1.2.2 Einfluss des ACS auf die Motilität des verdünnten Frischsamens............................... 61
3.2.2
Auswertung der allgemeinen Versuchsbedingungen ............................................... 66
3.2.2.1 Einfluss des Hengstes auf das Trächtigkeitsergebnis ................................................... 66
3.2.2.2 Saisoneller Einfluss auf das Trächtigkeitsergebnis ....................................................... 67
3.2.2.3 Einfluss des Stutenalters auf das Trächtigkeitsergebnis ............................................... 68
3.2.2.4 Homogenität der Gruppen (ACS, Prednisolonacetat, Ringer-Lösung)
hinsichtlich der Altersverteilung ................................................................................... 70
3.2.2.5 Vergleichbarkeit der Gruppen hinsichtlich der Trächtigkeitsrate ................................. 71
3.2.2.6 Ergebnisse der klinisch-gynäkologischen Untersuchung ............................................. 73
3.2.3
Zytologische Auswertung .......................................................................................... 77
3.2.3.1 Allgemeiner Vergleich der Ergebnisse der zytologischen Untersuchung zwischen den
einzelnen Gruppen (autologes konditioniertes Serum, Prednisolonacetat und RingerLösung) ......................................................................................................................... 78
3.2.3.2 Vergleich der jeweils ersten und letzten zytologischen Probe in den Gruppen ............ 81
3.2.3.3 Einfluss des ACS auf das Ergebnis der zytologischen Untersuchung .......................... 82
3.2.3.4 Zusammenhang zwischen dem Ergebnis der zytologischen Untersuchung
und dem Trächtigkeitsergebnis ..................................................................................... 82
4
DISKUSSION .............................................................................................................. 84
4.1
Vorversuche ................................................................................................................. 85
4.2
Gegebene Versuchsbedingungen ............................................................................... 87
4.3
Zytologische Untersuchung ........................................................................................ 97
5
ZUSAMMENFASSUNG .......................................................................................... 101
6
SUMMARY ............................................................................................................... 104
7
LITERATURVERZEICHNIS ................................................................................. 106
8
ANHANG ................................................................................................................... 126
Abkürzungsverzeichnis
ACS
autologes konditioniertes Serum
ad us. vet.
ad usum veterinarium
a.i.
ante inseminationem
bakteriolog.
bakteriologisch
bspw.
beispielsweise
bzw.
beziehungsweise
CEG
Crude Equine Gonadotropin
CL
Corpus luteum
cPGES
cytosolic Prostaglandin E Synthase
Ct1
zytologische Probe am Tag der hCG-Applikation
Ct2
zytologische Probe 4 bis 6 Stunden post
inseminationem
Ct3
zytologische
Probe
24
Stunden
post
Probe
48
Stunden
post
inseminationem
Ct4
zytologische
inseminationem
d.h.
das heißt
DNA
Desoxyribonucleic acid
E2
17-beta-Estradiol
E. coli
Escherichia coli
Et1
endometriales Ödem zum Zeitpunkt der hCGGabe
Et2
endometriales Ödem 4 bis 6 Stunden post
inseminationem
Et3
endometriales Ödem 24 Stunden post
inseminationem
Et4
endometriales Ödem 48 Stunden post
inseminationem
et al.
et alii
evtl.
eventuell
Fa.
Firma
Ft1
intrauterine Flüssigkeitsansammlung zum
Zeitpunkt der hCG-Gabe
Ft2
intrauterine Flüssigkeitsansammlung 4 bis
6 Stunden post inseminationem
Ft3
intrauterine Flüssigkeitsansammlung 24 Stunden
post inseminationem
Ft4
intrauterine Flüssigkeitsansammlung 48 Stunden
post inseminationem
g
Erdbeschleunigung
GLM
General Linear Models
GnRH
Gonadotropin-Releasing-Hormon
HAF
Hemorrhagic Anovulatory Follicle
HPF
High power field
HSD
Honestly Significant Difference
I.E.
Internationale Einheiten
IFN-γ
Interferon-gamma
IL-1
Interleukin-1
IL-1α
Interleukin-1-alpha
IL-1ß
Interleukin-1-beta
IL-1-Ra
Interleukin-1-Rezeptorantagonist
IL-1Rt1
IL-1-Rezeptor des Typs 1
IL-2
Interleukin-2
IL-4
Interleukin-4
IL-6
Interleukin-6
IL-8
Interleukin-8
IL-10
Interleukin-10
i.m.
intramuskulär
IRAP
Interleukin-1-Rezeptorantagonist-Protein
i.u.
intrauterin
i.v.
intravenös
IVF
In-vitro-Fertilisation
KB
künstliche Besamung
kg
Kilogramm
LH
Luteinisierendes Hormon
LIF
leukaemia inhibiting factor
L-PGDS
Lipocalin-type Prostaglandin D Synthase
LPS
Lipopolysaccharid
LSD
Least Significant Difference
LUF
Luteinized Unruptured Follicle
MCWE
Mykobacterium-phlei-Zellwandextrakt
MHz
Megahertz
mg
Milligramm
ml
Milliliter
mm
Millimeter
mPGES-1
microsomal Prostaglandin E Synthase-1
mPGES-2
microsomal Prostaglandin E Synthase-2
mRNA
messenger ribonuclein acid
ng
Nanogramm
NK-Zellen
Natürliche Killerzellen
NO
Stickstoffmonoxid
NSAID
Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drug
oIFN-τ
ovines Interferon-tau
OTR
Oxytocin-Receptor
p.c.
post conceptionem
PGD2
Prostaglandin-D2
PGE2
Prostaglandin-E2
PGF2α
Prostaglandin-F2 alpha
p.i.
post inseminationem
PIS
povidone-iodine solution (Povidon-Jod-Lösung)
PMN
Polymorphkernige neutrophile Granulozyten
p.o.
post ovulationem
pPBE
persistierende post-breeding Endometritis
RM
resistant mare/s (resistente Stute/n)
RT-PCR
Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion,
real-time Polymerase Chain Reaction
SAID
Steroidal Anti-Inflammatory Drug
SAS
Statistical Analysis System
SCSA
Spermien-Chromatin-Struktur-Assay
SGK1
Serum- und Glucocorticoid-regulierte Kinase 1
SM
susceptible mare/s (empfängliche Stute/n)
spp.
species pluralis
TNF-α
Tumornekrosefaktor alpha
TU
Trächtigkeitsuntersuchung
u.a.
unter anderem
vgl.
vergleiche
z.B.
zum Beispiel
<, >
kleiner als, größer als
≤, ≥
kleiner gleich, größer gleich
°C
Grad Celsius
EINLEITUNG
1 EINLEITUNG
Endometritis ist eine Hauptursache für Unfruchtbarkeit bei Stuten und hat dadurch einen
ernstzunehmenden Einfluss auf die Pferdezucht (TROEDSSON 1997, WATSON 2000,
LIU 2011). Dabei spielt die persistierende besamungsinduzierte (persistierende post-breeding)
Endometritis, pPBE, eine große Rolle, da sie bei 10 bis 15 % der Stuten (ZENT et al. 1998)
zu beobachten und nur schwer zu behandeln ist.
Nach AURICH und KOLM (2005) ist die pPBE durch eine 24 Stunden post inseminationem
(p.i.) ultrasonographisch darstellbare Uterusfüllung mit anechogener bis echogener
Flüssigkeit charakterisiert. ALLEN und PYCOCK (1988), LEBLANC et al. (1989) und
CAUSEY (2006) beobachteten bei solchen Stuten, die als pPBE-empfänglich eingestuft
werden, eine intrauterine Flüssigkeitsansammlung und ein über 3 bis 5 Tage anhaltendes
endometriales Ödem post inseminationem (p.i.).
Nach der Belegung entweder durch Natursprung oder künstliche Besamung (KB) entsteht
physiologischerweise eine Entzündungsreaktion des Endometriums (WATSON 2000) auf die
Spermien (KOTILAINEN et al. 1994) und das Seminalplasma, Spermaverdünner oder
Verdünnerzusätze (PARLEVLIET et al. 1997, TROEDSSON et al. 2001). Die maximalen
Entzündungsanzeichen zeigen sich nach 12 Stunden, wobei eine gesunde Stute in Rosse
schon 24 bis 48 Stunden p.i. oder Inokulation eines anderen Materials keine klinischen
Anzeichen einer Entzündung mehr aufweist (AURICH und KOLM 2005, KATILA 2008).
Bei gestörten uterinen Abwehrmechanismen und herabgesetzter uteriner Clearance kann die
Entzündungsreaktion wesentlich länger andauern. ALGHAMDI et al. (2001) konnten
nachweisen, dass Entzündungsnebenprodukte sich schädlich auf die Spermatozoen und ihre
Motilität auswirken. Nach LEFRANC et al. (2008) ist ein funktionsfähiges Endometrium
sowohl für die gesamte Trächtigkeit als auch insbesondere während des Zeitraumes der freien
Beweglichkeit der Frucht und der Implantationsphase von elementarer Bedeutung. Der
Embryo gelangt 5 bis 6 Tage post conceptionem (p.c.) in das Uteruslumen. Für einen Erhalt
der Trächtigkeit und ein Überleben des Conceptus sollte der Uterus bis zu diesem Zeitpunkt
frei von Entzündungsanzeichen sein (BATTUT et al. 1997).
1
EINLEITUNG
Eine andere Ursache für einen Trächtigkeitsverlust kann in diesem Zusammenhang die
vorzeitige Luteolyse auf Grund entzündungsbedingter erhöhter PGF2α-Freisetzung des
Endometriums sein.
Nach LEBLANC (2003a) sind solche Stuten als empfänglich für eine pPBE anzusehen, die in
zytologischen Proben des Uterus eine über 36 Stunden p.i. anhaltende Entzündungsreaktion
und mehr als 2 mm intrauterine Flüssigkeit aufweisen.
Unter dem Aspekt, dass die angeborene Immunabwehr bei der Entwicklung und der Fortdauer
einer pPBE die entscheidende Rolle spielt, ist durch FUMUSO et al. (2003) eine Studie
bezüglich der Effekte des Immunmodulators Mykobacterium-phlei-Zellwandextrakt (MCWE)
auf die endometriale mRNA-Expression bei für pPBE empfänglichen Stuten angefertigt
worden. Dabei wurde die Hypothese aufgestellt, dass eine MCWE-Therapie eine Hilfe zur
Wiederherstellung des homöostatischen Mechanismus der lokalen Entzündung und dadurch
in der Prophylaxe der pPBE bei Stuten sein könnte.
Autologes konditioniertes Serum (ACS), das beim Menschen eine bis zu 140-fache
Anreicherung des IL-1-Rezeptorantagonisten (IL-1-Ra oder auch IRAP) im Vergleich zum
unbehandelten Serum aufweist, wird im Bereich der Orthopädie erfolgreich und vor allem
ohne wissenschaftlich nachweisbare, negative Effekte zur Behandlung der Osteoarthritis
verschiedener Gelenke beim Pferd angewendet (FRISBIE et al. 2005).
Der Ansatz für die therapeutische Nutzung des ACS bei zu pPBE neigenden Stuten ist die
Abmilderung
einer
über
den
physiologischen
Zeitraum
hinaus
anhaltenden
Entzündungsreaktion.
In einer aktuellen Studie von CHRISTOFFERSEN et al. (2012) konnte beobachtet werden,
dass für pPBE empfängliche Stuten im Vergleich zu resistenten Stuten nach intrauteriner
Inokulation von Escherichia coli eine verlängerte und anhaltende Genexpression der proinflammatorischen Zytokine IL-1β und IL-1-Ra sowie ein höheres IL-1β/IL-Ra-Verhältnis in
endometrialen Bioptaten zeigen.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden, welchen Einfluss eine
Behandlung der zu pPBE neigenden Stuten mit dem Immunmodulator ACS im Vergleich zu
2
EINLEITUNG
der Anwendung von Prednisolonacetat und Ringerlösung auf die Trächtigkeitsrate, die
Ansammlung von intrauteriner Flüssigkeit und die PMN-Zahl in Uteruszytologieproben
nimmt.
Ob die intrauterine Behandlung der zu pPBE neigenden Stuten mit ACS einen ähnlich
positiven Einfluss auf die Fertilität der Stuten hat wie MCWE oder ob die Applikation des
Serums vielmehr eine Dysregulation der endometrialen Entzündungsreaktion bewirkt, gilt es
in dieser Studie zu untersuchen.
3
LITERATURÜBERSICHT
2 LITERATURÜBERSICHT
2.1 Der weibliche Geschlechtsapparat beim Pferd
2.1.1 Anatomie
Der weibliche Geschlechtsapparat besteht aus den paarig anlegten Eierstöcken und
Ovidukten, der Gebärmutter, dem inneren und äußeren Muttermund, der Scheide, dem
Scheidenvorhof und der Scham (KAINER 1993, LEISER 1999). Dabei teilt er sich
funktionell in keimbereitende (Ovarien), keimleitende (Eileiter) und keimbewahrende
(Uterus) Organe auf (BUDRAS 2004).
Pferde sind unipar und überwiegend saisonal polyöstrisch. Im Allgemeinen zeichnet sich der
Sexualzyklus der Stute dadurch aus, dass sowohl die Dauer des durchschnittlichen Zyklus
(19 bis 23 Tage), des Östrus (5 bis 7 Tage) als auch die Trächtigkeitsdauer (310 bis 410 Tage)
stark variiert (LEISER 1999).
Die Stute hat im haustierartlichen Vergleich sehr große, bohnenförmige Eierstöcke, die im
Durchschnitt 50 bis 80 mm lang und 20 bis 40 mm dick sind. Diese sind größtenteils von
Peritoneum bedeckt, wobei die Keimdrüsenepithel tragende Ovulationsfläche in die Fossa
ovarii verlegt ist. Diese anatomische Besonderheit des Pferdes entwickelt sich erst nach der
Geburt bis zum 2. beziehungsweise 3. Lebensjahr (LEISER 1999).
Die circa 150 mm langen Mesovarien halten die Eierstöcke etwa handbreit kaudal der Nieren
in der Lendengegend in Position. Als Verbindung zwischen der Extremitas uterina des Ovars
und dem Uterushorn ist das Ligamentum ovarii proprium zu nennen. Als Abspaltung der
lateralen Fläche des Mesovariums bildet die Mesosalpinx zusammen mit dem Ovarium, dem
Mesovarium und dem Ligamentum ovarii proprium die ellipsoide Bursa ovarica, in der sich
der große Eierstock befindet. Das trichterförmige Infundibulum liegt mit seinem Ostium
abdominale tubae uterinae der Ovualtionsgrube gegenüber. Hierdurch wird die Eizelle nach
ihrer Freisetzung aus dem Follikel in den stark gewundenen Ovidukt aufgenommen
(LEISER 1999).
Der Eileiter ist etwa 200 bis 300 mm lang und teilt sich auf in das eierstockseitige,
fächerförmige Infundibulum tubae uterinae, in dessen Tiefe das Ostium abdominale tubae
4
LITERATURÜBERSICHT
uterinae in den erweiterterten Anfangsteil, Ampulla tubae uterinae, mündet. Daran schließt
sich der schmale, mäanderartig gewundene Isthmus tubae uterinae an, der mit dem Ostium
uterinum tubae und der bei der Stute besonders markierten Papille den Anschluss an das
Uteruslumen darstellt (KAINER 1993).
Der Uterus des Pferdes ist durch Cornua mit einer Länge von etwa 220 bis 250 mm und ein
Corpus uteri von ca. 180 bis 200 mm Länge gekennzeichnet, wobei das Endometrium hohe,
zum Teil blattförmige, nicht verstreichbare Falten aufweist (LIEBICH und KÖLLE 2010).
An die etwa 50 bis 70 mm lange Cervix uteri schließt sich die Vagina an, wobei die Portio
vaginalis uteri weit in die Scheide hineinragt. Ihre Form und ihr Öffnungsgrad unterliegen
zyklusabhängigen Veränderungen von zapfenartig bis verlaufend bzw. fest verschlossen bis
zu für mehrere Finger passierbar (LEISER 1999).
Die Vagina weist eine kutane Schleimhaut auf, die direkt vor der Mündung der Harnröhre
eine starke Querfalte bildet, die Scheidenklappe, die als Rest des Hymens angesehen werden
kann. Kaudal schließt sich das Vestibulum vaginae an. Die Vulva bildet den äußeren Anteil
des weiblichen Geschlechtsapparates und wird durch zwei ausladende Schamlippen mit einem
spitzen dorsalen und einem runden ventralen Schamwinkel gebildet. Die Klitoris der Stute
befindet sich im ventralen Schamwinkel und ist deutlich ausgeprägt (KAINER 1993).
2.1.2 Histologie des equinen Uterus
Die Gebärmutterwand teilt sich nach LIEBICH und KÖLLE (2010) in eine:
-
Tunica mucosa (Endometrium) mit dem Epithelium simplex columnare und der
Lamina propria mucosae (Stroma endometrialis),
-
Tunica muscularis (Myometrium),
-
Tela subserosa
-
Tunica serosa/Tunica adventitia (Perimetrium).
5
LITERATURÜBERSICHT
Die vom Uteruslumen ausgehend erste Schicht, das Endometrium, fügt sich aus dem
einschichtigen Epithel und der drüsenreichen Lamina propria mucosae zusammen und
durchläuft zyklusabhängige Umbauprozesse. Die Epithelzellen zeigen eine endokrin
beeinflusste sekretorische Aktivität: Zur Zeit der Proliferationsphase werden unter Einfluss
von Östrogen Sekrete abgegeben wohingegen die Zellen am Ende der Sekretionsphase
zerfallen und zu Bestandteilen des Rosseschleims werden. Etwa die Hälfte der Zellen trägt
Zilien (KENNEY 1978, KAINER 1993). Die auf das Epithelium simplex columnare folgende
Schicht, die Lamina propria (Stroma endometrialis), setzt sich aus spinozellulärem
Bindegewebe zusammen und enthält viele tubulär verzweigte Uterindrüsen (KAINER 1993,
LIEBICH und KÖLLE 2010). Das spinozelluläre Gewebe hat einen entscheidenden Anteil an
den speziellen Stoffwechselvorgängen des Endometriums während der Trächtigkeit und der
Entwicklung der Plazentarschranke und weist sowohl Immunzellen der angeborenen wie auch
der erworbenen Immunität auf (LIEBICH und KÖLLE 2010, NASH et al. 2010).
Das Myometrium besteht aus einer inneren, zirkulären Schicht von glatten Muskelzellen,
einer mittleren Gefäßschicht und einer äußeren Längsschicht glatter Muskulatur
(KAINER 1993).
Die äußerste, aus einer Tela subserosa und einer Tunica serosa gebildete Schicht der
Gebärmutterwand, das Perimetrium, steht in Verbindung mit dem Ligamentum latum uteri
und ist dadurch ein Anteil des Aufhängungsapparates des weiblichen Geschlechtstrakts
(LEISER 1999).
2.1.3 Immunologische Reaktion des Uterus auf die Besamung
Um eine physiologische Entfernung von beispielsweise Bakterien oder überflüssigem Sperma
nach der Besamung aus dem Uterus zu gewährleisten, stehen der Stute vielfältige
immunologische und mechanisch-anatomische Abwehrmechanismen zur Verfügung. Ein
Ungleichgewicht oder eine Dysfunktion dieser Vorgänge bedroht den Befruchtungs- und
Trächtigkeitserfolg der Belegung der Zuchtstute.
6
LITERATURÜBERSICHT
Zu den immunologischen Instrumenten der Abwehr gehören Immunglobuline (humorale
Immunität), PMN (zelluläre Immunität) und das Komplementsystem (ASBURY et al. 1984,
WATSON 1987, TROEDSSON et al. 1993c).
Während des Östrus steigt der Gehalt an IgA und IgG im Vergleich zur Gelbkörperphase,
wohingegen der IgM-Spiegel zum Zeitpunkt der Rosse absinkt (WIDDERS et al. 1985).
Wird das Endometrium mit Bakterien konfrontiert, werden diese durch Makrophagen
aufgenommen. Diese Zellen setzen dabei Komplement-Faktoren, Prostaglandine und
Zytokine wie IL-1 und Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-α) frei (WATSON 1987). Die
Einwanderung von PMN in das Gewebe wird durch Chemotaxis erhöht (KATILA 2001). Die
durch Antikörper (insbesondere IgG) und Komplement markierten Bakterien werden durch
die PMN phagozytiert, was nach MATTOS et al. (1997a, 1997b) eine der wichtigsten
Abwehrfunktionen des Endometriums gegen eine intrauterine Bakterienbesiedlung darstellt.
Bei der Besamung der Stute ist mit einer sogar noch stärkeren Entzündungsreaktion und einer
noch deutlicheren PMN-Ansammlung im Endometrium zu rechnen als beim alleinigen
Kontakt mit Bakterien (KOTILAINEN et al. 1994).
Der erste Neutrophileneinstrom vom Gefäßsystem in das Gewebe ist nach TROEDSSON
(1997) innerhalb von ungefähr 30 Minuten p.i. zu erwarten, was zudem durch eine verbesserte
Gefäßpermeabilität begünstigt wird (TROEDSSON et al. 2005).
Nach KATILA (1995) findet man bei gesunden Stuten die ersten neutrophilen Granulozyten
im Uterus etwa 1 Stunde p.i., die höchste Anzahl ist 6 bis 12 Stunden p.i. zu erwarten und
nach 24 bis 48 Stunden sind nur noch wenige PMN übrig. Sind die Stuten nicht dazu in der
Lage, die Entzündungsreaktion nach diesem Zeitraum wieder herunter zu regulieren, gelten
sie als empfänglich für eine pPBE.
7
LITERATURÜBERSICHT
2.1.4 Bedeutung des mikrobiologischen und zytologischen Status des Endometriums für
die Fruchtbarkeit im haustierartlichen Vergleich
Im Jahr 1964 führte KNUDSEN die exfoliative Endometriumszytologie als diagnostisches
Verfahren im Rahmen der Zuchtstutenuntersuchung ein. Dabei beschrieb der genannte Autor
eine enge Beziehung zwischen bakteriologischem und zytologischem Ergebnis bei bakteriell
bedingten Gebärmutterentzündungen. BROOK (1985) hat sich in einer Studie mit dem
mikrobiologischen und zytologischen Status des Endometriums bei Zuchtstuten in
verschiedenen Zyklusstadien, im Zusammenhang mit einer Besamung und nach dem
Abfohlen befasst. Dabei zeigten 20 % der Stuten sowohl Bakterien als auch neutrophile
Granulozyten (PMN) in ihrer Probe, wobei ein hoher Prozentsatz erst kürzlich abgefohlt hatte
oder besamt wurde. Ein Großteil der Stuten, bei denen nur Bakterien und keine PMN
nachgewiesen
werden
konnten,
zeigten
keine
eindeutigen
Rosseanzeichen
(Endometriumödem, Rosseverhalten am Hengst). Der am häufigsten isolierte Keim war E.
coli. Darüber hinaus fiel auf, dass bei den Stuten, die kürzlich abgefohlt hatten, das Ausmaß
der bakteriellen Besiedlung und der Neutrophilenzahl stark variierte. Bei Problemstuten
konnten im Gegensatz zu gesunden Stuten durchschnittlich länger als 24 Stunden Bakterien
nachgewiesen werden.
Der
optimale
Zeitraum
zur
Entnahme
zytologischer
und
bakteriologischer
Endometriumsproben wird von verschiedenen Autoren von Mitte des Östrus (BRUNER 1951,
COLLINS 1964,
BAIN
1966;
BRANDT
1970,
GADD
1975;
RICKETTS
und
MACINTOSH 1987; WAELCHLI et al. 1993) bis 24 bis 96 Stunden post ovulationem
anberaumt (CARD 2005), da die Cervix innerhalb dieses Zeitfensters geöffnet ist
(CONBOY 1978), das Risiko einer iatrogenen Infektion des Uterus deutlich geringer ist als
im Diöstrus (GANJAM et al. 1982, WAELCHLI et al. 1993), und durch eine vermehrte
endometriale Sekretion reichlich Probenmaterial gewonnen werden kann.
In einer weiteren Studie beobachteten PURSWELL et al. (1989), dass bei Stuten kurz nach
dem Abfohlen sehr selten anaerobe Bakterien isoliert werden konnten, und wenn sie
nachgewiesen wurden, die Stuten diese schnell aus dem Genitaltrakt entfernten. Somit
erschien eine Infektion mit anaeroben Bakterien für Stuten nach der Geburt als
unproblematisch.
8
LITERATURÜBERSICHT
Nach KATILA (1995) findet man bei gesunden Stuten die ersten neutrophilen Granulozyten
im Uterus etwa 1 Stunde post inseminationem (p.i.), die höchste Anzahl ist 6 bis 12 Stunden
p.i. zu erwarten und nach 24 bis 48 Stunden sind nur noch wenige PMN übrig.
BOURKE et al. (1997) vergleichen in einer Studie die Eigenschaften eines ZytologieBürstchens und eines Zytologie-Tupfers in Bezug auf Zellgehalt, Neutrophilenzahl in Prozent,
Keimnachweis in Korrelation zum histopathologischen Befund. Dabei kristallisierte sich
heraus, dass das Bürstchen einen signifikant höheren Zellgehalt pro „High power field“
(abgekürzt als HPF, d.h. Gesichtsfeld) als der Tupfer enthielt. Darüber hinaus entstanden
durch den Tupfer signifikant vermehrt deformierte Epithelzellen als bei der Bürste. Anhand
der Neutrophilenzahl kann jedoch nicht klar statuiert werden, ob die Zytologie-Bürste dem
Tupfer vorzuziehen sei, da keine der beiden Techniken konstant einen höheren Anteil an
PMN hatte als die andere. Insgesamt sollte der „Cytology brush“ als Methode der Vorzug
gewährt werden, wenn es um die Beurteilung der Epithelzellmorphologie im Zusammenhang
mit chronischen Entzündungsprozessen oder Neoplasien geht.
NEUBERG (2009) kam im Vergleich zwischen Knudsen-Kathetern, Uteruskulturtupfern und
Zytologiebürstchen ebenfalls zu dem Ergebnis, dass das letztgenannte System das
zweckmäßigste zur Probenentnahme für die exfoliative Endometriumszytologie bei
Zuchtstuten ist.
BARLUND et al. (2008) haben verschiedene Untersuchungstechniken für den Nachweis einer
postpartalen Endometritis bei Milchkühen verglichen und die „Cytobrush cytology“ als die
bewährteste und somit als Referenzmethode ausgewählt.
Auch KASIMANICKAM et al. (2005) präferierten im direkten Vergleich zwischen der
Cytobrush- und der Lavage-Methode die erstgenannte. Zum einen war bei 17 % der
Spülversuche keine Flüssigkeit zurückzugewinnen, mittels der Cytobrush konnte jedoch bei
jedem Versuch eine verwertbare Probe gewonnen werden. Weiterhin ergaben sich bei der
Cytobrush-Technik während des Zeitraumes vom 20. bis 33. Tag in Laktation signifikant
höhere PMN-Prozentanteile als bei der Lavage-Methode. Es konnte allgemein eine in-situProbe des Endometriums genommen werden, die den entzündlichen Charakter des
Endometriums besser einzufangen vermag als die verdünnte Probe der Lavage. Zuletzt
konnten
die
Autoren
auch
geringere
Fomrveränderungen
durch
die
Cytobrush-
Probenentnahme verzeichnen. AGUILAR et al. (2006) wiesen auf die Gefahr von falsch
9
LITERATURÜBERSICHT
positiven zytologischen Untersuchungsergebnissen hin, die durch digitales Kratzen am
Endometrium gewonnen werden: Diese Proben zeigten auf Grund einer Kontamination mit
vaginalen PMN im Vergleich zu Präparaten, die mittels eines doppelt geschützten Tupfers
entnommen wurden (7,3 % der Proben mit PMN), deutlich häufiger neutrophile Granulozyten
(87,8 % der Proben) an. In einer Studie über die Durchführung und Interpretation einer
uterinen Zytologie bei der Stute stellten DASCANIO et al. (1997) fest, dass im Vergleich
zwischen einer Lavage- und einer Tupfer-Probe die erste Methode zwar eine bessere
Zellqualität und genauere Ergebnisse zur Folge habe, sie allerdings für im Felde
praktizierende Tierärzte zu „beschwerlich“ in der Anwendung sei. LEBLANC et al. (2007)
beschrieben für endometriale Spülproben zur bakteriologischen bzw. zytologischen
Diagnostik eine Sensitivität von 71 bzw. 80 %, BRANDIS et al. (2010) dokumentierten eine
vergleichbare Sensitivität von 65 Prozent.
Eine Schwäche der bakteriologischen und zytologischen Untersuchung des Endometriums
sind
falsch-negative
Ergebnisse
durch
zu
oberflächlich
gewonnenes
Material
(NIELSEN 2005): Bakterienspezies wie Streptococcus equi subspecies zooepidemicus
(PETERSEN et al. 2009) oder Escherichia coli (NIELSEN et al. 2012) siedeln sich in tieferen
Schichten des Endometriums an und können dadurch in Bioptaten des Gewebes eher
nachgewiesen werden als durch Spülproben oder Bürstchen-Abstriche. Aus diesem Grund
empfehlen
NIELSEN et al. (2012),
bakteriologische
und
zytologische
Proben
aus
Uterusbiopsien anzufertigen und die Bestimmung des gynäkologischen Gesundheitsstatus der
untersuchten Stute als Mosaik aus den Befunden der Biopsie, Zytologie, Mikrobiologie und
klinischen
Untersuchung
zu
verstehen.
Eine
Kombination
der
verschiedenen
Untersuchungsverfahren trägt nach Ansicht der Autoren dazu bei, möglichst viele an
Endometritis erkrankte Tiere zu erkennen.
BROOK (1985) konnte eine positive Korrelation zwischen dem Nachweis von Bakterien und
Neutrophilen beobachten, wobei davon ausgegangen wird, dass im Uteruslumen gesunder
Stuten keine Neutrophilen anzutreffen sind und dass ihr Nachweis ein Entzündungsindikator
ist. Es wurde eine semiquantitative Einschätzung der Neutrophilenzahl angesetzt:
10
LITERATURÜBERSICHT
negativ
keine
PMN
auf
10
Gesichtsfelder
bei
einer
400-fachen
Vergrößerung
fragwürdig
1 bis 5 PMN auf 10 Gesichtsfelder bei einer 400-fachen
Vergrößerung
positiv
mehr als 5 PMN auf 10 Gesichtsfelder bei einer 400-fachen
Vergrößerung
Beim Großteil der chronisch infizierten Stuten konnten im Diöstrus wiederholt keine
Bakterien in der Kultur und der Zytologie nachgewiesen werden, wohingegen im Östrus mit
beiden Verfahren positive Nachweise erfolgten, was es aus Sicht des Autors sinnvoll
erscheinen lässt, nur während des Östrus bei diesen Stuten Proben zu entnehmen.
BUCCA et al. (2008) verwendeten in einer Studie bezüglich pPBE bei Stuten als Färbung der
zytologischen Untersuchung einer „small volume lavage“ Diff-Quick® und bewerteten unter
dem Mikroskop mindestens 10 Gesichtsfelder bei 1000-facher Vergrößerung. Dabei galten
PMN, Erythrozyten, Epithelzellen, Lymphozyten, eosinophile Granulozyten, Zelltrümmer
(Debris), Bakterien, Mukus, Hefen und Pilze als Beurteilungsparameter. Die PMN- und
Epithelzellenzahl wurden jeweils als Anteil an 100 gezählten Zellen dokumentiert. Außerdem
verglich man den Trübungsgrad der uterinen Spülflüssigkeit der behandelten Stuten mit der
der Kontrollgruppe. Dabei ließ sich beobachten, dass eine einmalige Verabreichung von
Dexamethason zum Besamungszeitpunkt den Trübungsgrad signifikant reduziert. Allerdings
zeigte sich kein signifikanter Unterschied in der PMN-Zahl nach der Besamung zwischen der
behandelten und der Kontrollgruppe.
In einer Untersuchung der Marker-Entzündungszellen während einer besamungsinduzierten
Endometritis bei der Stute stellten NASH et al. (2010) fest, dass bei einer zytologischen
Analyse neben PGF2α die PMN-Zahl den genauesten Entzündungsparameter darstellt.
WESTERMANN et al. (2010) konnten in ihrer Studie bei Milchrindern eine signifikante
Korrelation zwischen der PMN-Zahl und dem Nachweis von Arcanobacterium pyogenes
nachweisen.
Nach
KASIMANICKAM
Endomtriumszytologie
et
al.
(2004)
sind
bei
Milchrindern
eine
positive
oder im Uterus darstellbare Flüssigkeit mit einer herabgesetzten
11
LITERATURÜBERSICHT
relativen Trächtigkeitsrate verbunden und fungieren als Marker für Kühe mit subklinischer
Endometritis.
In einer Studie bezüglich der postpartalen Endometriumszytologie bei Fleischrindern haben
SANTOS et al. (2009) folgende Beobachtung gemacht: Kein zytologischer Parameter konnte
signifikant den späteren Trächtigkeitserfolg oder den Tag der Befruchtung vorhersagen.
Darüber hinaus erhöhte eine vorausgegangene Zwillingsträchtigkeit das Risiko einer
subklinischen Endometritis, wobei dies keinen Einfluss auf die Wahrscheinlichkeit einer
Trächtigkeit hatte. Die Autoren folgern daraus, dass Fleischrinder in der Lage sind, die uterine
Entzündung zu überwinden, sobald sie ihren Zyklus wieder aufgenommen haben.
DRILLICH et al. (2012) untersuchten die endometriale PMN-Zahl bei superovulierten Kühen
am Tag der ersten von 3 künstlichen Besamungen (KB) (Tag -1 = Tag der ersten
Besamung und Verabreichung eines GnRH-Analogons zur Ovulationsinduktion bei
zyklussynchronisierten Tieren; Tag 0 = Tag der Ovulation) und vor der Embryospülung
(Tag 7) mit Hilfe von Cytobrush-Proben. Zwischen der PMN-Zahl und dem endometrialen
Gesundheitsstatus wurde folgende Beziehung beobachtet: Tiere, die am Tag -1 keine PMN in
der zytologischen Probe aufwiesen (0 %- Gruppe), hatten eine signifikant höhere Anzahl an
tastbaren Gelbkörpern (14.1 gegen 7,2) und übertragbaren Embryos (6,8 gegen 3,7) im
Vergleich zu Kühen, die eine positive zytologische Probe (PMN > 0 %) aufwiesen. Ein
deutlicher Anstieg der PMN-Anzahl zwischen Tag -1 und Tag 7 wurde bei den Kühen der
0-%-Gruppe als physiologischer Prozess in Folge der großen Gelbkörperanzahl angesprochen.
Erhöhte Werte der neutrophilen Granulozyten in der zytologischen Untersuchung vor der
Ovulation und niedrigere, aber immer noch positive PMN-Zahlen am Tag 7 wurden
wiederum als Abweichung von der reproduktiven Leistungsfähigkeit der Kühe betrachtet.
12
LITERATURÜBERSICHT
2.2 Persistierende post-breeding Endometritis (pPBE)
2.2.1 Klassifizierung
Endometritis ist eine der Hauptursachen bei Unfruchtbarkeit bei Stuten (TROEDSSON 1997,
WATSON 2000, LIU 2011). Nach ZENT et al. (1998) ist bei 10 bis 15 % aller Zuchtstuten
der Reinigungsmechanismus des Uterus nach einer Besamung/Belegung gestört und führt zu
einer pPBE mit ernstzunehmenden Folgen für die Fruchtbarkeit. Dabei spielt der Zeitfaktor
eine zentrale Rolle: Bei Stuten mit einem funktionierenden Abwehrsystem werden die
Entzündungsprodukte innerhalb von 24 bis 48 Stunden aus dem Uterus entfernt
(KATILA 1995). HUGHES und LOY (1969) berichteten erstmalig von jungen fertilen Stuten,
die eine natürliche Resistenz gegenüber einer experimentell ausgelösten bakteriellen
Endometritis zeigten. Es wurde beobachtet, dass diese Stuten das im Östrus intrauterin
eingegebene Inoculum mit Streptococcus zooepidemicus subspecies zooepidemicus schnell
entfernen konnten. Die Bakterien-Clearance war mit einer akuten Entzündung der Vagina und
Cervix sowie mit einem erhöhten Uterustonus verbunden. Pluripare und güste Stuten
hingegen waren nicht in der Lage, das bakterielle Inoculum zu entfernen, hatten eine
verlängerte
Entzündungsreaktion und einen sackartigen, verdickten Uterus bei der
transrektalen Untersuchung. Auf Grundlage dieser Befunde wurden die Stuten als entweder
„susceptible“ (empfänglich) oder „resistant“ (resistent) für pPBE klassifiziert.
Nach KATILA (2005) haben die für pPBE empfänglichen Stuten kein Problem damit, dass
sie stärker auf eine Besamung reagieren und GÜVENC et al. (2005) beobachteten, dass
empfängliche Stuten keine signifikant stärkere uterine Entzündungsreaktion als resistente
Tiere aufwiesen. Es wird angenommen, dass grundsätzlich eine heftige Entzündungreaktion
p.i. zur Reinigung des Uterus benötigt wird (KATILA 2005).
LEBLANC et al. (2003b) postulierten, dass solche Stuten als empfänglich für eine pPBE
anzusehen sind, die in zytologischen Proben des Uterus eine über 36 Stunden post
inseminationem (p.i.) anhaltende Entzündungsreaktion aufweisen. BRINSKO et al. (2003)
sahen die Anwesenheit von mehr als 2 cm Höhe an ultrasonographisch darstellbarer
intrauteriner
Flüssigkeit
während
der
Östrus
als
einen
deutlichen
Hinweis
auf
Empfänglichkeit für pPBE. Laut PYCOCK und NEWCOMBE (1996) besteht jedoch die
13
LITERATURÜBERSICHT
Schwierigkeit in der Praxis darin, die empfänglichen Stuten (susceptible mares = SM) zu
identifizieren, da nicht alle SM nach der Besamung intrauterine Flüssigkeit zeigen.
PANSEGRAU et al. (2008) konnten nachweisen, dass ein positiver Zusammenhang zwischen
der Kontraktionsaktivität des Uterus und dem Trächtigkeitsergebnis besteht, somit eine
verringerte Uterusmotilität als eine Ursache von suboptimaler Fertilität bei Stuten anzusehen
ist. Es wurde keine signifikante Korrelation zwischen der myometrialen Aktivität und den
Ergebnissen der bakteriologischen und zytologischen Untersuchungen des Endometriums
beobachtet. Weiterhin dokumentierten sie eine Anregung der Uterusmotilität durch Besamung
mit deutlicher Steigerung bei aufeinanderfolgenden Besamungen. Bei subfertilen Stuten
bestand generell eine geringere Myometriumsaktivität. Zudem zeigte die Studie, dass
zytologische Proben des Uterus, die 48 Stunden p.i. genommen werden, einen signifikanten
Zusammenhang mit Trächtigkeitsraten haben und diese deshalb ein probates Mittel sind, um
die Gravidität vorauszusagen. Somit hat eine verzögerte uterine Clearance einen negativen
Effekt auf die Fruchtbarkeit der Stuten. Es wird angenommen, dass sowohl die Ansammlung
von Stickstoffmonoxid (NO) im Uteruslumen (ALGHAMDI et al. 2005) als auch ein
übermäßiger
Elastosegehalt
der
uterinen
Gefäße,
der
eine
verminderte
Gebärmutterdurchblutung zur Folge hat (NAMBO et al. 1995, GRUNINGER et al. 1998,
ESTELLER-VICO et al. 2010), eine ursächliche Rolle für eine herabgesetzte myometriale
Aktivität spielen.
In der Humanmedizin konnte ein Zusammenhang zwischen einer gesteigerten Intensität und
Frequenz der myometrialen und subendometrialen Peristaltik und der fortschreitenden
Follikelphase hergestellt werden, was für die Autoren den Schluss zuließ, dass der
beschleunigte Spermatozoentransport unter der endokrinen Kontrolle des dominanten
Follikels steht (KUNZ et al. 1996). Darüber hinaus stellten sie fest, dass der
Spermientransport bevorzugt in Richtung des Eileiters erfolgte, der ipsilateral zu dem
dominanten Follikel lag. In einer weiteren Studie stellten LEYENDECKER et al. (1996) bei
der Frau fest, dass eine Hyperperistaltik und Dysperistaltik des Uterus in der späten
Follikelphase durch Störung des Spermientransports zu einer herabgesetzten Fruchtbarkeit
führen kann.
14
LITERATURÜBERSICHT
RIGBY et al. (2001) machten die Beobachtung, dass bei einer Stimulation mit Oxytocin bzw.
PGF2α sowohl bei jungen, gesunden Stuten als auch bei Stuten mit herabgesetzter uteriner
Clearance das Myometrium eine geringere Spannung aufbauen konnte als das Myometrium
älterer Stuten. Dies könnte eine altersabhängige Umbildung des Rezeptor-Second MessengerSignalmechanismus bedeuten, der der intrazellulären Ca2+-Freisetzung nachgeschaltet ist.
Zusammenfassend scheint bei Stuten mit einer herabgesetzten uterinen Clearance ein
intrinsischer Defekt der Myometriumskontraktiliät vorzuliegen, der zu einer reduzierten
Uteruskontraktilität nach der Besamung beiträgt.
Ein weiteres Problem, das sich aus einer verzögerten uterinen Clearance ergibt, ist eine
verminderte
Lymphdrainage
(LEBLANC 2003b).
SCHOON et al. (1999)
konnten
in
Endometriumbiopsien von Stuten Anzeichen degenerativer Veränderungen des Gefäßsystems
in Form von Sklerosen (Angiosen) der uterinen Venen, Arterien und Arteriolen verzeichnen.
Der Schweregrad der Veränderungen war bei älteren, pluriparen Stuten deutlich höher als bei
vergleichsweise jüngeren Stuten. Die Angiosis scheint indirekt die Fruchtbarkeit zu
reduzieren, indem sie zu einer verminderten endometrialen Durchblutung und einem
Fortbestehen
des
Endometriumödems
post
ovulationem
(p.o.)
führt.
Nach
LEBLANC et al. (2003b) enthält die uterine Flüssigkeit der SM neutrophile Granulozyten,
Immunglobuline, Proteine, Samen und Bakterien. Die Abfallprodukte der Leukozyten sind
hochgradig schädlich für das Gewebe, in welches sie gelangen. Es kann sich ein Teufelskreis
aus diesen Gegebenheiten entwickeln, bei dem das Endometrium durch die persistierende
Flüssigkeit gereizt wird und die Flüssigkeit sich kontinuierlich im Uteruslumen oder als
Ödem im Gewebe ansammelt. Entwickelt sich eine chronische Entzündung, entstehen
Fibrosen und Narbengewebe (MACLACHLAN 1997), was eine unwirtliche Umwelt für den
Embryo bedeutet.
Dauert die Entzündung über den Zeitpunkt des Transports des Embryos in den Uterus
zwischen Tag 5 bis 6 p.o. hinaus an, hat dies embryonalen Fruchttod zur Folge. Ein Grund
dafür kann einerseits die Beeinträchtigung des Corpus luteum durch die entzündungsbedingte
Freisetzung von PGF2 sein, andererseits hat das entzündliche Milieu einen nachteiligen
Einfluss auf die Implantation des Embryos (CAUSEY 2006, TROEDSSON et al. 2008).
15
LITERATURÜBERSICHT
2.2.2 Prädisponierende Faktoren
Die Ursachen für eine pPBE sollen im fortgeschrittenen Alter der Stuten sowie in einer
erhöhten Anzahl an Geburten (ASBURY und LYLE 1993), chronischen Veränderungen am
Endometrium (TROEDSSON et al. 1993a), intrauteriner Flüssigkeitsansammlung während
des
Diöstrus
(TROEDSSON 1995),
(TROEDSSON et al. 1993b)
und
mangelhafter
Radiokolloidclearance
intrauteriner
innerhalb
von
Bakterien2
Stunden
(NEUWIRTH et al. 1995, LEBLANC et al. 1998) liegen.
Eine umfassende Auflistung der „Risikofaktoren“, die eine pPBE anzeigen können, bieten
BUCCA et al. (2008):
A: abnormaler Fortpflanzungsvorbericht
B: positive endometriale Kultur
C: ≥ 2 cm endometriale Flüssigkeit vor der Besamung
D: abnormale perineale Konformation
E: abnormale Cervix
F: endometriale Flüssigkeit nach der Besamung > 1,5 cm < 2 cm
H: endometriale Flüssigkeit nach der Besamung ≥ 2 cm
N: Caslick-Vulvoplastik, die nach einer Episiotomie nicht wieder operativ versorgt wurde
R: Anomalien des Reproduktionstrakts
Z: sechsunddreißig Stunden nach Besamung bestehende intrauterine Flüssigkeit
LEBLANC und CAUSEY (2009) postulierten, dass Defekte der Genitalanatomie
(LEBLANC et al. 1998), der myometrialen Aktivität, der Lymphdrainage, der mukoziliären
Clearance und des Cervixschlusses, zudem Gefäßdegeneration und sogenanntes „Inflammageing“ (FRANCESCHI et al. 2000, DE MARTINIS et al. 2005, GIUNTA 2006) der
Empfänglichkeit für eine pPBE bei Stuten zu Grunde liegen.
16
LITERATURÜBERSICHT
CAUSEY (2006) maß Geburtsverletzungen des Perineums eine stark prädisponierende
Bedeutung für Infektionen bei.
CARNEVALE und GINTHER (1992) schreiben allgemein dem fortgeschrittenen Alter der
Stuten (15 Jahre und älter)
eine erhöhte endometriale Entzündungsreaktion, geringere
Trächtigkeitsraten und eine erhöhte Embryo-Verlustrate zu. Sie konnten feststellen, dass bei
den alten Stuten eine herabgesetzte Uteruskontraktilität vorlag und der Embryo sich im
Vergleich zu jüngeren Stuten später in das Endometrium einnistete.
Nach CAUSEY (2007) spielt das Vorhandensein eines intakten Mukusfilms, der das
Endometrium bedeckt, eine entscheidende Rolle bei der Elimination des entzündlichen
Materials, so dass ein schlecht ausgebildeter Mukusfilm ebenfalls als prädisponierend für eine
pPBE anzusehen ist.
2.2.3 Einfluss auf die Fertilität der Stuten
Die für die persistierende besamungsinduzierte Endometritis pathognomonische, über
48 Stunden hinaus anhaltende Entzündungsreaktion hat schwerwiegende Folgen für die
embryonale Implantation: Einerseits schädigt der hohe Gehalt an proteolytischen Enzymen
und toxischen Stoffwechselprodukten im Gebärmutterlumen den Embryo direkt. Andererseits
wird auf Grund des entzündlichen Milieus vermehrt PGF-2α ausgeschüttet, welches die
Rückbildung des Gelbkörpers bewirkt und dadurch einen frühzeitigen Abbruch der Gravidität
verursacht. Diese Faktoren gehören zu den Hauptursachen des frühembryonalen Fruchttodes
(CAUSEY 2006, TROEDSSON et al. 2008).
In einer Studie über embryonalen Fruchtverlust beim Pferd zeigten BALL et al. (1986), dass
beim Vergleich von fertilen zu subfertilen Stuten die subfertilen Stuten am Tag 14 post
ovulationem (p.o.) eine Trächtigkeitsrate von ungefähr 20 % aufwiesen, wohingegen bei 80 %
der fertilen Tiere ein Embryo aufgefunden werden konnte. In Eileiterproben, die am
Tag 2 p.o. gewonnen wurden, zeigten beide Stutengruppen noch ähnlich hohe Prozentsätze an
Furchungsstadien.
17
LITERATURÜBERSICHT
In einer aktuellen Studie von CHRISTOFFERSEN et al. (2012) konnte beobachtet werden,
dass für pPBE empfängliche Stuten im Vergleich zu resistenten Stuten nach intrauteriner
Inokulation von Escherichia coli eine verlängerte und anhaltende Genexpression von IL-1β
und IL-1-Ra sowie ein höheres IL-1β/IL-Ra-Verhältnis in endometrialen Biopsien zeigten.
Die oben genannten Forscher nehmen an, dass die endometriale mRNA-Expression proinflammatorischer Zytokine als Antwort auf eine Endometritis bei resistenten Stuten einer
sehr feinen Abstimmung unterliegt. Bei empfänglichen Tieren scheint eine mangelnde
Feinabstimmung der endometrialen Genexpression eine wichtige Rolle für die Entstehung
einer persistierenden Endometritis zu spielen. FUMUSO et al. (2003, 2007) stellten einen
Unterschied in der mRNA-Expression verschiedener Zytokine beim Vergleich RM mit SM
als
Reaktion
auf
künstliche
Besamung
und
Applikation
des
Immunmodulators
Mycobacterium-phlei-Zellwandextrakt (MCWE) fest: Wurde intrauterin weder Samen noch
MCWE appliziert, hatten SM signifikant höhere basale mRNA-Levels der Zytokine IL-β,
Interleukin-6 (IL-6), Interleukin-8 (IL-8) und Tumornekrosefaktor alpha (TNF-α). Post
inseminationem unterschieden sich SM von RM lediglich durch eine höhere IL-8-Expression.
Im Diöstrus wiesen resistente Stuten dann jedoch niedrigere mRNA-Expression von IL-1β,
IL-8 und TNF-α als die empfänglichen Stuten, was sich mit den Beobachtungen von
CHRISTOFFERSEN et al. (2012) deckt. Verabreichte man zeitgleich zur Besamung MCWE,
so war kein Unterschied zwischen der Zytokin-Genexpression bei RM und SM darstellbar.
Das führte die Autoren zu der Annahme, dass die intrauterine Verabreichung des
Immunmodulators MCWE bei SM den homöostatischen Entzündungsmechanismus als
Reaktion auf eine Besamung wiederherstellen und damit als prophylaktische Behandlung bei
Stuten mit Neigung zu pPBE von Nutzen sein könnte.
GALVÃO et al. (2012) untersuchten die Rolle der Interleukine IL-1α und IL-1β im
Zusammenhang mit einer physiologischen Keimabwehr oder einer beeinträchtigten
endometrialen Sekretion bei der Stute. Anhand des neuen Denkmodells der „Netosis“ im
Rahmen der intrauterinen Infektionsbekämpfung wurde angenommen, dass neutrophile
Granulozyten (PMN) als Antwort auf einen infektiösen Stimulus extrazelluläre Netzwerke
bilden, um Pathogene zu binden und abzutöten. Dieser Mechanismus könnte von großer
Bedeutung für die erste Keimabwehr sein, jedoch hätte er aber auch eine Beeinträchtigung der
endometrialen Sekretion und die Entstehung einer Fibrose zur Folge. Die nächste
18
LITERATURÜBERSICHT
Arbeitshypothese der Wissenschaftler war, dass Zytokine sowohl durch Entzündungszellen
als auch durch Stroma- und Epithelzellen des Endometriums produziert würden. Damit wurde
IL-1α und IL-1β eine wichtige para-/autokrine Rolle für die Regulierung der endometrialen
Funktion beigemessen. SZOSTEK et al. (2011a) beobachteten eine Beziehung zwischen der
mRNA-Expression der Interleukine IL-1α und IL-1β sowie ihrer Rezeptoren (IL-RI, IL-RII)
und der Rosse, verschiedenen Entzündungsgraden und Fibrose. Es wurde vermutet, dass ein
durch eine IL-1β-Stimulation hervorgerufener erhöhter Prostaglandin-F2α-Gehalt bei Stuten
mit einer Endometriumsbiopsie der Kategorie III (nach KENNEY und DOIG 1986) für eine
Luteolyse, dadurch bedingten Progesteronmangel und zuletzt Abort verantwortlich sein
könnte. Interleukin IL-1β wurde danach als Entzündungsmarker gewertet, IL-1α als
Fibrosemarker
(GALVÃO
et
al.
2012).
Beide
Zytokine
sollen
sich
nach
SZOSTEK et al. (2011b und 2012) an der Prostanoid-Synthese (wie z.B. PGE2 und PGF2α)
beteiligen. Weiterhin sollten Endometritis und eine Fibrose des Endometriums mit einer
abnormalen Enzymaktivität in Bezug auf die Synthese von PGE2 und PGF2α einhergehen, was
für einen frühen Embryoverlust verantwortlich sein könnte (SZOSTEK et al. 2011b,
SKARZYNSKI et al. 2012).
ZMIJEWSKA et al. (2012) konnten nachweisen, dass IL-1β die Prostaglandin-Synthese und
-Sekretion durch das Corpus luteum (CL) in der Frühträchtigkeit und bei zyklischen Sauen
reguliert. Dabei sezerniert der Gelbkörper selbst IL-1ß und beeinflusst auf diese Weise
autogen die luteale Funktion.
Weiterhin stellten CAILLAUD et al. (2005) die Hypothese auf, dass IL-1β die
Wiederaufnahme
der
Meiose
der
equinen
Oozyte
regulieren
(vergleiche
auch
MARTORIATI et al. 2003), jedoch keinen Einfluss auf die zytoplasmatische Reifung
ausüben könnte. Daraus würden für eine Befruchtung ungeeignete Oozyten resultieren. Die
Autoren unterstellen IL-1β in einer anderen Hypothese einen zytotoxischen Effekt auf die
Eizellen, der zwar eine Befruchtung derselben erlauben, jedoch eine nachfolgende
embryonale Entwicklung verhindern würde. Diese Vorstellung wird durch eine In-vitroStudie an equinen Oocyten mit IL-1 bekräftigt, bei der IL-1 in vitro keinen Einfluss auf die
Reifung, Befruchtung oder erste Furchung der Eizellen hatte, aber die embryonale
Entwicklung im Zweizellstadium stagnierte (CAILLAUD et al. 2008). HANEDA et al. (2009)
19
LITERATURÜBERSICHT
ordneten der endometrialen mRNA-Expression des IL-1-Ra eine wichtige Rolle in der
Etablierung der equinen Trächtigkeit zwischen Tag 19 und 25 post ovulationem zu. Die IL-1Ra-Genexpression
wurde
in
vitro
durch
die
Verabreichung
von
10 mg/ml
Estradiol-17-beta (E2) und 10 ng/ml Progesteron erhöht. Außerdem beobachteten die Autoren
am Tag 25 der Trächtigkeit ebenfalls erhöhte mRNA-Mengen von IL-1α und IL-6 sowie in
geringem Ausmaß von IL-1β, die durch IL-1-Ra reguliert würden. Es konnte keine Erhöhung
der Gen-Expression der genannten Zytokine durch Steroidbehandlung hervorgerufen werden,
was die Autoren vermuten ließ, dass im graviden Endometrium angesammelte Immunzellen
(Makrophagen) die Quelle des IL-1α, IL-1β und IL-6 sein könnten. Die Autoren sprachen den
Interleukin-1-Rezeptorantagonisten als eine Art regulierenden Gegenspieler zu der durch E2
oder IL-1 erhöhten endometrialen Prostaglandinproduktion (vergleiche JACOBS und
CARSON 1993, RAUK und CHIAO 2000, STOUT und ALLEN 2001, JANA et al. 2008)
während der Implantationsphase des Conceptus in der Stute an.
2.2.4 Herkömmliche Therapieansätze
Grundsätzlich gilt bei Stuten mit Neigung zu einer pPBE, dass man die intrauterinen
Manipulationen auf ein möglichst geringes Maß reduzieren sollte. Dazu empfiehlt
TROEDSSON (1997) eine terminierte Besamung, wobei in regelmäßigen Abständen bei der
rossigen Stute ultrasonographische Kontrollen der Follikelreifung durchgeführt werden und
gegebenenfalls
eine
Ovulationsinduktion
mittels
einer
hCG-Applikation
erfolgt.
SCHÄFER (2001) konnte in einer Studie zur Optimierung des Besamungszeitpunktes bei
Stuten die größten Inseminationserfolge mit Frischsamen dokumentieren, wenn die Besamung
der mit hCG behandelten Stuten im Bereich von 0 bis 12 Stunden nach oder 24 bis 0 Stunden
vor der Ovulation durchgeführt wurde. Besamte man die Stuten früher als 24 Stunden vor
dem Eisprung, sank die Trächtigkeitsrate von 57,6 % auf 20,7 %. Abhängig von der
Samenqualität des jeweiligen Hengstes beträgt nach SIEME (2005) die durchschnittliche
Überlebensdauer der Spermien im weiblichen Genitaltrakt zwischen 24 Stunden bis 6 Tagen.
20
LITERATURÜBERSICHT
Bei der Auswahl der Besamungsform ist dem verdünnten Frischsamen der Vorzug zu
gewähren, um wiederum das Ausmaß der Entzündungsreaktion so gering wie möglich zu
halten (KOTILAINEN et al. 1994, GÜVENC et al. 2005).
Als Standardmethode zur Behandlung einer pPBE hat sich die p.i. durchgeführte uterine
Lavage mit physiologischer Natriumchloridlösung durchgesetzt (TROEDSSON 1995,
PYCOCK 2003). Bei der Anwendung einer physiologischen Natriumchloridlösung liegt ein
klarer
Vorteil
bspw.
gegenüber
der
Gebärmutterspülung
mit
Povidon-Jodlösung
(WATSON 1987) in der guten Gewebeverträglichkeit. Dabei sollte darauf geachtet werden,
dass die Lösung Raumtemperatur besitzt, da dies wahrscheinlich einen positiven Einfluss auf
die Uteruskontraktilität ausübt (ASBURY und LYLE 1993).
Nach BRINSKO et al. (1991) kommt es bei der Uteruslavage p.i. vor allen Dingen darauf an,
wann diese stattfindet. Dabei beziehen sich die Autoren auf einen Vergleich der
Trächtigkeitsraten nach einer uterinen Lavage 4 Stunden p.i. mit einem Liter physiologischer
Kochsalzlösung, oder einem Liter einer 0,05 prozentigen Povidon-Jod-Lösung (povidoneiodine solution = PIS) und einer Kontrollgruppe ohne Spülung. Die drei verschiedenen
Gruppen zeigten sehr ähnliche Trächtigkeitsraten, was für die Autoren den Schluss zuließ,
dass es eher auf das „Timing“ als auf die Art der Spüllösung ankommt. In einem früheren
Versuch konnten BRINSKO et al. (1990) verringerte Trächtigkeitsraten nachweisen, wenn
Stuten in einem Zeitraum von einer halben Stunde bis zu zwei Stunden nach der Besamung
gespült wurden. Diese Beobachtung wird durch BADERs (1982) Versuch bekräftigt, in dem
er Stuten zwischen 0 bis 6 Stunden p.o. besamte und diese 2, 4 oder 6 Stunden p.i. schlachten
ließ, um daraufhin die Spermienzahl im Eileiter zu bestimmen. Es konnten signifikante
Unterschiede zwischen den Zeitintervallen beobachtet werden, wobei die höchste Anzahl an
Spermien 4 Stunden nach der Besamung gezählt wurde.
Eine Kombination aus einer Uterus-Lavage und dem parallelen Einsatz von Oxytocin wird
regelmäßig
in
der
KNUTTI et al. 2000).
Praxis
angewendet
(RASCH et al. 1996,
BLISS und CAMPBELL (2008)
konnten
im
TROEDSSON 1997,
Vergleich
zweier
Oxytocin-Dosierungen als Therapie einer pPBE feststellen, dass sowohl bei einer
intravenösen Verabreichung von 20 I.E. als auch von 30 I.E. Oxytocin signifikant die Menge
an intrauteriner Flüssigkeit reduziert werden konnte.
21
LITERATURÜBERSICHT
Nach LEBLANC et al. (1994) fördert Oxytocin die uterine Clearance des Radiocolloids
Technetium 99m Albumin (99mTc-microAA), was einen Einsatz bei Stuten mit
eingeschränkter uteriner Clearance sinnvoll erscheinen lässt.
Auch RISCO et al. (2009) bestätigen den positiven Effekt von Oxytocin auf die Elimination
intrauteriner Flüssigkeit und PMN post inseminationem, was die Dauer der post-breedingEntzündung verkürzt. In der gleichen Studie gingen die Autoren in einem Vergleich zwischen
einer Behandlung mit Oxytocin oder Flunixin-Meglumin auch auf die uterine Kontraktilität
ein, die sich zwischen den beiden Gruppen ebenso wenig wie die Trächtigkeitsrate
unterschied. Weiterhin konnte 8 Stunden p.i. bei der Flunixin-Meglumin-Gruppe eine erhöhte
PMN-Zahl im Uteruslumen im Vergleich zur Kontrollgruppe verzeichnet werden. Nach
25 Stunden waren die PMN-Konzentrationen bei allen 3 Gruppen niedrig.
Der Einsatz von mit Antibiotika versetzten Spüllösungen wird kontrovers diskutiert:
TROEDSSON (1997) konnte im Vergleich zu einer reinen Therapie mit physiologischer
Kochsalzlösung keinen Vorteil bei den mit Antibiotikalösung behandelten Stuten
verzeichnen, ASBURY und LYLE (1993) betonen weiterhin die Gefahr einer Pilz- und
Hefeninfektion als Folge der Antibiose.
Hingegen beobachteten PYCOCK und NEWCOMBE (1996) bei der 72 Stunden p.i.
durchgeführten Behandlung mit intrauterin applizierten Antibiotika zusammen mit einer
Oxytocininjektion deutlich verbesserte Trächtigkeitsraten.
In einer Studie bezüglich der oralen Verabreichung des Cyclooxygenase-2-spezifischen nichtsteroidalen Antiphlogistikums (im Englischen: Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drug,
NSAID) Vedaprofen zur Behandlung der pPBE im Vergleich zu einer Kontrollgruppe
konnten
ROJER und AURICH (2010)
verzeichnen.
In
einem
Vergleich
tendenziell
von
verbesserte
natürlich
Trächtigkeitsergebnisse
auftretenden,
hämorrhagischen
anovulatorischen Follikeln (Hemorrhagic Anovulatory Follicle, HAF) und experimentell
durch systemische hoch dosierte Gabe des NSAIDs Flunixin-Meglumin induzierten
luteinisierten, nicht rupturierten Follikeln (Luteinized Unruptured Follicle, LUF) konnten
CUERVO-ARANGO und NEWCOMBE (2012) ähnliche ultrasonographische Charakteristika
darstellen: Diese wurden als intrafollikuläre Einblutung, Durchmesserzunahme des Follikels,
22
LITERATURÜBERSICHT
Luteinisierung der Follikelwand ohne Ausfließen des Follikelinhalts trotz LH-Peak,
ansteigenden Progesteronwerten und nachlassendem endometrialen Ödem benannt. Die
Flunixin-Meglumin-Gabe
erfolgte
nach
dem
von
CUERVO-ARANGO
und
DOMINGO-ORTIZ (2011) beschriebenen Schema, wodurch in 83 % der Zyklen die
Ovulation während der erwarteten periovulatorischen Periode verhindert werden konnte.
BUCCA et al. (2008) haben Versuche mit einer einmaligen Dexamethasonapplikation
(50 mg i.v.) parallel zum Besamungszeitpunkt durchgeführt. Dabei wurden im Vergleich
zwischen behandelter und Kontrollgruppe folgende Beobachtungen gemacht: Bei einmaliger
Verabreichung von Dexamethason zum Besamungszeitpunkt konnte eine signifikante
Reduktion der endometrialen Flüssigkeitsansammlung, des endometrialen Ödems sowie des
Trübungsgrades der „Low-volume-Spülflüssigkeit“
und ein signifikanter Anstieg der
Trächtigkeitsrate, wenn mindestens 3 Risikofaktoren (s. 2.2.2 Prädisponierende Faktoren,
BUCCA et al. 2008)
vorhanden
waren,
verzeichnet
werden.
Sowohl
DELL`AQUA et al. (2006) als auch PAPA et al. (2008) konnten gute Therapieerfolge im
Zusammenhang mit einer mehrfachen Prednisolonacetat-Gabe bei Stuten verzeichnen, die
bereits mit besamungsinduzierten Endometritiden aufgefallen waren. Es wurde ein
signifikanter Anstieg der Trächtigkeitsrate bei den derartig behandelten Tieren beobachtet.
Bei einer mehrfachen intravenösen Dexamethason-Applikation im Vergleich zu einer
mehrfachen oralen Gabe von Prednisolon und einer Kontrollgruppe beobachteten
FERRIS und McCUE (2010) hingegen sinkende LH-Spiegel und in Folge dessen eine hohe
Rate anovulatorischer Zyklen. Die Prednisolon-Gruppe zeigte in 83 % der Zyklen eine
erfolgreiche Ovulation und im Vergleich zur Kontrollgruppe normale LH-Spiegel (vor
GnRH-Gabe: 4,5 ± 1,3 ng/ml; nach GnRH-Gabe: 14,4 ± 3,8 ng/ml). In einer Studie zur
Verträglichkeit von verschiedenen steroidalen Antiphlogistika (im Englischen auch abgekürzt
als Steroidal Anti-Inflammatory Drug, SAID) mit verdünntem Frischsamen stellten
FIORATTI et al. (2012) bei allen SAIDs (inklusive Prednisolonacetat) bis auf Dexamethason
einen ausgeprägten Motilitätsverlust der Spermien (innerhalb von 2 Stunden < 10 %
Gesamtmotilität) fest. Die Autoren schlugen vor, dass man zur Behandlung von Stuten mit
einer Neigung zu persistierender post-breeding Endometritis dem verdünnten Frischsamen
das Dexamethason direkt hinzufügen solle, um bessere Trächtigkeitsergebnisse zu erzielen.
23
LITERATURÜBERSICHT
Dabei sollte ein Vorteil der lokalen Anwendung im Uterus eine Umgehung der systemischen
Nebenwirkungen des Dexamethasons sein. MORRIS und EDEN (2008) dokumentierten bei
einer sehr kleinen Population von „Problemstuten“ (21 Tiere inklusive Placebo-Gruppe)
durch eine mehrfache orale Verabreichung von Prednisolon (200 mg Prednisolon zweimal
täglich) signifikant höhere Trächtigkeitsraten (P < 0,05) als bei unbehandelten Tieren.
JONES und LEY (2001) beschrieben ein vermindertes Rosseverhalten in Folge von
dauerhafter
Glucocorticoid-Therapie
bei
einer
Araberstute,
die
auf
Grund
einer
Lebererkrankung permanent unter Prednisolon-Behandlung stand.
Unter dem Aspekt, dass die angeborene Immunabwehr bei der Entwicklung und der Fortdauer
einer pPBE die entscheidende Rolle spielt, ist durch FUMUSO et al. (2003) eine Studie
bezüglich der Effekte des Immunomodulators Mykobacterium-phlei-Zellwandextrakt
(MCWE) auf die endometriale mRNA-Expression bei für pPBE empfänglichen Stuten
angefertigt worden. Hier zeigten zu pPBE neigende Stute (sog. „susceptible mares“ = SM) im
Diöstrus eine erhöhte endometriale mRNA-Expression der proinflammatorischen Zytokine
Interleukin-1-beta (IL-1ß) und Tumornekrosefaktor alpha (TNF-α) im Vergleich zu gegen
pPBE resistenten Stuten (sog. „resistant mares“ = RM). Es konnte dargestellt werden, dass
über eine Behandlung der SM mit MCWE zum Zeitpunkt der künstlichen Besamung (KB)
eine signifikante Absenkung der mRNA-Expression des IL-1 erreicht wird. Dies könnte eine
Hilfe zur Wiederherstellung des homöostatischen Mechanismus der lokalen Entzündung und
dadurch in der Prophylaxe der pPBE bei Stuten sein. SHARMA und DHALIWAL (2010)
untersuchten die Wirkung einer kombinierten Behandlung subfertiler Stuten, die sich aus der
intrauterinen Gabe von 100 µg Escherichia-coli-Lipopolysaccharid (LPS) 6 Stunden post
inseminationem (p.i.) und einer zweifachen intravenösen Oxytocin-Applikation (12 und
24 Stunden p.i.) zusammensetzte. Im Vergleich zu einer Kontrollgruppe zeigten diese Stuten
signifikant höhere Trächtigkeits- und Abfohlraten (P < 0,001). SINGH et al. (2000)
beobachteten
nach
einer
einmaligen
intrauterinen
Gabe
von
Escherichia-coli-
Lipopolysacchariden bei Kühen mit einer bakteriell bedingten Endometritis eine Stimulation
der uterinen Abwehrmechanismen und eine daraus resultierende Bewältigung der Infektion
innerhalb eines Brunstzyklus‘. In einer späteren Studie erzielten SINGH et al. (2008) sehr
gute Trächtigkeitsraten (91,67 %) bei Kühen mit subklinischer Endometritis durch eine
24
LITERATURÜBERSICHT
intrauterine Behandlung mit 100 µg E. coli LPS und 5 ml autologem Serum 12 Stunden nach
der künstlichen Besamung. Den Behandlungserfolg führten die Autoren auf eine Förderung
der nicht spezifischen uterinen Immunität zurück.
Auch der Immunmodulator Propionibacterium acnes soll einen positiven Einfluss auf die
Fruchtbarkeit zu pPBE neigender Stuten haben: ZINGHER (1996) behandelte SM intravenös
mit 0,4 mg Propionibacterium acnes pro 113,3 kg Körpergewicht an den Tagen 1, 3 und 7
nach der Feststellung einer endometrialen Entzündungsreaktion und verglich diese mit einer
Kontrollgruppe. Dabei wiesen die behandelten Stuten 10 Tage nach Feststellung von äußeren
Rosseanzeichen
nur
in
8,3
%
der
Fälle
ein
positives
endometriales
Zytologieuntersuchungsergebnis auf, im Vergleich zu 93,8 % der Stuten aus der
Kontrollgruppe. In einer nachfolgenden Studie konnten ROHRBACH et al. (2006) den
fertiliätssteigernden Effekt der wiederholten intravenösen Behandlung mit Propionibacterium
acnes bestätigen: Die behandelten Stuten wurden 3,7-mal häufiger tragend als die Tiere aus
der Placebo-Gruppe (verdünntes Liposyn).
PIRES NEVES et al. (2007) haben in einer Studie vier Behandlungsmethoden mit
unterschiedlich aufbereiteten Leukozyteninfusionen für eine artifiziell erzeugte Endometritis
durch Streptococcus zooepidemicus bei resistenten und empfänglichen Stuten verglichen.
Dabei fiel auf, dass die resistenten Stutengruppen unabhängig von der Behandlung die gleiche
Zeit zur Elimination der Bakterien benötigten. Bei den resistenten Stuten gehen die Autoren
davon aus, dass ein gesunder Selbstreinigungsmechanismus der Bakterienelimination zu
Grunde liegt und die Infusionen keinen Effekt auf den benötigten Zeitraum hatten. Bei den
empfänglichen Stuten waren die Eliminationszeiten für Bakterien bei frischen und gefrorenen
Leukozyten ähnlich. Diese bakteriziden Infusionen waren wahrscheinlich effektiv und somit
verantwortlich für die schnellere Entfernung der inokulierten Bakterien. Frische Leukozyten,
die zusammen mit opsonisierenden Faktoren eingegeben wurden, hatten die schnellsten
Reinigungsergebnisse zur Folge. Dabei nehmen die Autoren an, dass Blutplasma als AuftauAgens für gefrorene und gelöste Leukozyten eine effektivere Opsonisierung bewirkt und
dadurch eine schnellere Bakterienelimination bedingt.
In einer weiteren Studie verglich PASCOE (1995) den Einfluss auf die Fruchtbarkeit von
Stuten nach Behandlung mit autologem Plasma in Kombination mit einer lokalen Antibiose
25
LITERATURÜBERSICHT
des Uterus mit einer lokalen antibiotischen Behandlung allein und einer Kontrollgruppe.
Dabei stellte sich heraus, dass der Zusatz des autologen Plasmas bei güsten und Fohlenstuten
eine Erhöhung der Trächtigkeitsrate pro Zyklus zur Folge hat. Da das autologe Plasma in
Verbindung mit uterinen Sekreten der für die pPBE empfänglichen Stuten zu einer
verbesserten
Phagozytose
und
Chemotaxis
der
uterinen
PMN
führt
(TROEDSSON et al. 1993c), scheint das autologe Plasma sowohl als Opsonin als auch als
chemischer Lockstoff zu wirken (ASBURY 1984, PASCOE 1995).
COLBERN et al. (1987) untersuchten den Einfluss einer alleinigen intrauterinen PlasmaTherapie auf eine künstlich induzierte Endometritis und dokumentierten keinerlei
Verbesserung des endometrialen Entzündungsstatus im Vergleich zu einer Kontrollgruppe.
ASBURY et al. (1984) beobachteten, dass die Zugabe einer kleinen Serummenge zu equinen
uterinen Sekreten in vitro zu einer signifikant erhöhten Phagozytose von Streptococcus
zooepidemicus durch die equinen PMN führt. Wurde das Serum zuvor durch
Hitzebehandlung bei 56 °C, Zugabe von EDTA oder C3-Entzug beeinflusst, konnte wiederum
eine verminderte Phagozytose der Bakterien festgestellt werden. Das deutete für die Autoren
darauf hin, dass der positive Effekt des Serums auf die Phagozytoseleistung der neutrophilen
Granulozyten Komplement-abhängig sei.
Dabei scheint ursprünglich nicht etwa ein Komplementdefizit die Ursache für eine
herabgesetzte Opsonisierung der Keime zu sein, sondern eher ein beschleunigter Zerfall von
Komplementfaktoren in den uterinen Sekreten (CAUSEY 2007).
26
LITERATURÜBERSICHT
2.3 Autologes konditioniertes Serum (ACS)
2.3.1 Herstellung und Wirkungsmechanismus
Nach MEIJER et al. (2003) spielen Zytokine wie Interleukin-1 (IL-1) eine wichtige Rolle bei
degenerativen muskuloskelettalen Erkrankungen (z.B. Osteoarthritis) beim Menschen. Stoffe,
die eine hemmende Wirkung auf pro-inflammatorisches Zytokine wie IL-1 haben, bergen
deshalb ein hohes therapeutisches Potential bei der Behandlung akuter und chronischer
orthopädischer Erkrankungen. Die oben genannten Autoren entwickelten eine neue Methode,
den
Interleukin-1-Rezeptorantagonisten
(IL-1-Ra).
und
andere anti-inflammatorische
Zytokine aus Vollblut anzureichern: Zuerst wird dem Patienten mit Hilfe eines eigens für die
Herstellung des autologen konditionierten Serums entworfenen Spritzensystems venöses
Vollblut abgenommen. In der 60-ml-Spritze befinden sich speziell behandelte Glasperlen
(sogenannte „medical grade glass beads“, vgl. WEHLING et al. 2007). Das auf diese Art
gewonnene Vollblut wird bei 37 °C über 24 Stunden in der Spritze inkubiert. Im Anschluss
daran wird das Serum steril entnommen und bei 2100 x Erdbeschleunigung (g) für
10 Minuten zentrifugiert.
Im Zuge dieser Behandlung ergibt sich ein schneller und heftiger Anstieg der Synthese
verschiedener anti-inflammatorischer Zytokine [Interleukin-4 (IL-4), Interleukin-10 (IL-10)],
insbesondere jedoch des Interleukin-1-Rezeptorantagonisten (IL-1-Ra). In humanen
Blutproben steigt die Konzentration bis auf das 140-fache Maß an. Es erfolgt kein Anstieg der
pro-inflammatorischen Zytokine IL-1β und Tumornekrosefaktor alpha (TNF-α).
Von Interleukin-1 (IL-1) nimmt man an, dass es der Hauptentzündungsmediator
(FRISBIE et al. 2005)
im
Zusammenhang
mit
Gelenkerkrankungen
ist,
laut
POLISSON (2001) ist IL-1 bei Osteoarthritis beim Menschen eine große Bedeutung
beizumessen. WEHLING et al. (2007) beschreiben die Behandlung mit ACS beim Menschen
sowohl in Fällen von Osteoarthritis des Knies als auch bei Ischialgie mit unilateraler,
radikulärer Lumbalkompression als effektiv und gut verträglich. Durch die lokale Anwendung
eines IL-1-Ra (auch als IRAP bezeichnet) wird die IL-1-Aktivität herabgesetzt und somit ein
Fortschreiten der Gelenkerkrankung abgemildert. IRAP hat eine schmerzstillende,
entzündungshemmende
und
abschwellende
27
Wirkung
auf
das
behandelte
Gelenk.
LITERATURÜBERSICHT
AUW YANG et al. (2008) werteten den Behandlungserfolg einer Kniegelenksosteoarthritis
beim Menschen nach sechsfach wiederholter, intraartikulärer ACS-Gabe im Vergleich zu
einer
Placebo-Gruppe
durch
2
verschiedene,
auf
den
Patienten
bezogene
Selbsteinschätzungsfragebögen aus [den Western Ontario and McMaster Universities
Osteoarthritis Index (WOMAC®-Index) und den Knee injury and Osteoarthritis Outcome
Score (KOOS)]. Dabei konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen ACS und Placebo
hinsichtlich des WOMAC®-Index, jedoch eine signifikante Verbesserung des KOOS
Symptome (P = 0,002) und KOOS Sport (P = 0,042) dokumentiert werden. Nach
WRIGHT-CARPENTER et al. (2004) wird die Genesungszeit von Muskelzerrungen bei
professionellen Sportlern durch eine lokale Behandlung mit ACS verkürzt. Die Autoren
beobachteten in einem Vergleich wiederholt durchgeführter magnetresonanztomographischer
Untersuchungen (am Tag der Zerrung und 14 bis 16 Tage nach der festgestellten Verletzung)
einen nahezu vollständigen Rückgang der muskulären Einblutung und Ödematisierung.
Dahingegen betrug bei einer Kontrollgruppe (Behandlung mit einem deproteinisierten
Haemoderivat aus Kälberblut in Kombination mit einem homöopathischen Medikament) die
durchschnittliche Heilungsdauer 22,3
± 1,2 Tage, wobei lediglich eine geringgradige
Reduktion der ödematösen Schwellung und Einblutung dargestellt werden konnte.
2.3.2 Relevanz in der Pferdemedizin
FRISBIE et al. haben 2005 eine Studie an artifiziell an Osteoarthritis der mittleren
Karpalgelenksreihe erkrankten Pferden durchgeführt, die vergleichend einerseits mit ACS
andererseits als Kontrolle mit physiologischer Kochsalzlösung behandelt wurden. Pferde, die
mit ACS behandelt wurden, zeigten im Vergleich zur Placebo-Gruppe eine signifikant
verbesserte Funktion der Gliedmaße, die künstlich per Arthroskopie der mittleren
Karpalgelenksreihe mit einer Osteoarthritis versehen wurde. Darüber hinaus konnte bei der
ACS-Gruppe eine signifikante Reduktion der Synovialmembranhyperplasie festgestellt
werden.
28
LITERATURÜBERSICHT
FRISBIE et al. konnten 2007 in einer weiteren Studie die oben geschilderten, positiven
Effekte auf experimentell an Osteorarthritis erkrankten mittlere Karpalgelenke beim Pferd
nachweisen.
In
einer
retrospektiven
Studie
durch
MARCHAT
(2010)
ließen
sich
ebenfalls
vielversprechende Resultate durch eine Behandlung verschiedener Gelenkserkrankungen
(insbesondere Huf-, Fessel-, Sprung- und Kniegelenke) sowie der Bursa podotrochlearis mit
IRAP beobachten.
Inzwischen hat ACS sich als gängige Therapieform zur Behandlung von Osteoarthritiden in
der Sportpferdemedizin etabliert und erhält auf Grund der Eigenschaft, als „Doping-negativ“
auch bei Turnierpferden bedenkenlos eingesetzt werden zu dürfen, wachsende Bedeutung im
Vergleich zu Glucocorticoiden (persönliche Kommunikation mit Dr. Jan-Hein Swagemakers,
Tierklinik Lüsche, Deutschland, 09.07.2009).
2.3.3 Möglicher therapeutischer Nutzen bei zu pPBE neigenden Stuten
Nach FUMUSO et al. (2003) zeigen zu pPBE neigende Stute (sog. susceptible mares = SM)
im Diöstrus eine erhöhte endometriale mRNA-Expression der pro-inflammatorischen
Zytokine IL-1ß und Tumornekrosefaktor alpha (TNF-α) im Vergleich zu gegen pPBE
resistenten Stuten (sog. resistant mares = RM). Es konnte in der zugehörigen Studie
dargestellt werden, dass über eine Behandlung der SM mit dem Immunomodulator
Mycobacterium-phlei-Zellwandextrakt (MCWE) zum Zeitpunkt der künstlichen Besamung
(KB) eine signifikante Down-Regulation der mRNA-Expression des IL-1 erreicht wird. Dies
könnte eine Hilfe in der Wiederherstellung des homöostatischen Mechanismus der lokalen
Entzündung und dadurch in der Prophylaxe der pPBE bei Stuten sein. Wie in Kapitel „2.2.3
Einfluss
auf
die
Fertilität
der
Stuten“
bereits
erwähnt,
konnten
CHRISTOFFERSEN et al. (2012) beobachten, dass für pPBE empfängliche Stuten im
Vergleich zu resistenten Stuten nach intrauteriner Inokulation von Escherichia coli eine
verlängerte und anhaltende Genexpression von IL-1β und IL-1-Ra sowie ein höheres IL1β/IL-Ra-Verhältnis in endometrialen Biopsien zeigten. Die oben genannten Forscher nehmen
an, dass die endometriale mRNA-Expression pro-inflammatorischer Zytokine als Antwort auf
29
LITERATURÜBERSICHT
eine Endometritis bei resistenten Stuten einer sehr feinen Abstimmung unterliegt. Bei
empfänglichen Tieren scheint eine mangelnde Feinabstimmung der endometrialen
Genexpression eine wichtige Rolle für die Entstehung einer persistierenden Endometritis zu
spielen. CAILLAUD et al. (2005) konnten in vivo bei Stuten nachweisen, dass eine
intrafollikuläre
Injektion
von
rekombinantem,
humanem
IL-1β
eine
ähnlich
ovulationsinduzierende Wirkung hat wie die intravenöse Gabe von ungereinigtem equinem
Gonadotropin (Crude Equine Gonadotropin, CEG) und dass eine intrafollikuläre Injektion
von humanem IL-1-Ra eine zeitabhängige Hemmung der Ovulationsinduktion durch CEG
bewirkt. Diese Wirkung des IL-Ra beobachteten bereits SIMÓN et al. (1994b) bei Ratten, die
2 Stunden vor der ovulationsauslösenden hCG-Gabe eine Injektion des IL-Ra in die Bursa
ovarica erhielten. Injizierte man IL-Ra 6 Stunden vor oder parallel zu der hCG-Applikation,
hatte dies keinen Einfluss auf die Ovulationsinduktion. LOVE et al. (2002) konnten in vitro
bei equinem verdünnten Frischsamen in Abhängigkeit von der Lagerungsdauer einen
signifikant erhöhten Anteil an denaturierter DNA im Spermien-Chromatin-Struktur-Assay
(SCSA)
bei
einer
Aufbewahrungstemperatur
von
37°C
im
Vergleich
zu
einer
Lagerungstemperatur von 5°C feststellen.
2.4 Aspekte für den therapeutischen Einsatz des ACS bei Mensch, Maus und Rind
2.4.1 Einfluss des Interleukin-1 auf den weiblichen Geschlechtsapparat der Frau und
der Maus
In der humanmedizinischen Literatur finden sich Hinweise auf die Bedeutung des
Interleukin - 1 für die Manifestation einer Schwangerschaft bei der Frau bzw. der Trächtigkeit
bei der Maus und die negativen Auswirkungen einer intraperitonealen Verabreichung eines
Interleukin-1-Rezeptorantagonisten während der Tage 3 bis 6 der Trächtigkeit auf den Erhalt
einer Trächtigkeit
bei Mäusen (SIMÓN et al. 1994a und 1998, HESS et al. 2008). Diese
Beobachtungen werden durch eine Studie an Mäusen in Frage gestellt, die einen genetisch
bedingten Mangel an IL-1-Rezeptoren des Typs 1 (IL-1Rt1) aufweisen: Es wurden lediglich
geringgradig verkleinerte Wurfzahlen im Vergleich zu einer „gesunden“ Kontrollgruppe
nachgewiesen. Darüber hinaus konnten weder beim Wildtyp noch bei den IL-1Rt1defizienten
Mäusen
bei
wiederholter
30
intraperitonealer
Injektion
eines
LITERATURÜBERSICHT
IL-1-Ra bzw. des monoklonalen Antikörpers 35F5 (blockiert ebenfalls die Ligandenbindung
an den IL-1Rt1) negative Effekte auf die Embryoimplantation registriert werden
(ABBONDANZO et al. 1996).
Nach KRÜSSEL et al. (2003) hat IL-1 einen wichtigen Einfluss auf die embryonale
Einnistung in das Endometrium, was sowohl die Invasion als auch die Angiogenese betrifft.
Es wird angenommen, dass eine präimplantatorische Produktion von IL-1-Ra durch den
Embryo
zu
einer
verzögerten
Entwicklung
desselben
führt.
Auch
VAN MOURIK et al. (2009) statuieren, dass IL-1 als proinvasives Zytokin eine essentielle
Rolle bei der Einnistung des humanen Embryos spielt. Beim Menschen ist eine
Hochregulation von Chemokinen und Cytokinen (u.a. IL-1) im ersten Trimester der
Schwangerschaft die Grundlage für eine erfolgreiche Umbildung des Endometriums zu einer
Decidua (SEGERER et al. 2009). CHAOUAT et al. (1995) stellten in einer Studie fest, dass
IL-1 die Produktion des Leukaemia inhibiting factor (LIF) positiv beeinflusst. Ein Mangel an
LIF scheint bei unfruchtbaren Frauen trotz erfolgreicher In-vitro-Fertilisation (IVF)
wiederholt die Implantation eines Embryos zu verhindern. In einer Studie von
VILLANI et al. (2010) zeigten Stuten in Bioptaten des Endometriums und des Trophoblasten
am Tag 21 der Trächtigkeit im Vergleich zu Gewebeproben des Östrus, Diöstrus und der
Tage 7 und 14 der Trächtigkeit eine signifikant erhöhte LIF-mRNA-Expression. Darüber
hinaus stieg in Trophoblastproben des Tages 21 der Trächtigkeit die Genexpression des LIFRezeptors signifikant an. Daraus schlossen die Autoren, dass LIF eine Rolle bei der
Anlagerung und Anheftung des Embryos als Vorbereitung für die Implantation spielen
könnte.
2.4.2. Einfluss eines therapeutischen Einsatzes von Serum oder Glucocorticoiden
Ein weiterer Aspekt aus der Humanmedizin ist die Rolle des Enzyms Serum- und
Glucocorticoid-regulierte Kinase 1 (SGK1). FEROZE-ZAIDI et al. (2007) konnten bei
ungeklärt
infertilen
Frauen
einen
erhöhten
Spiegel
des
Enzyms
in
der
Gebärmutterauskleidung nachweisen, wobei wiederum herabgesetzte Werte der SGK1 bei
Frauen mit Fehlgeburten gemessen wurden. Es wurde angenommen, dass ein zu niedriger
Enzymlevel die Fähigkeit der Deciduazellen, sich gegen oxidativen Stress zu schützen,
31
LITERATURÜBERSICHT
herabsetzt. Zu hohe Konzentrationen der SGK1 verhindern nach Ansicht der Autoren die
Implantation entweder durch eine Dysregulation des Elektrolyt- und Wassertransportes der
Zellen oder durch Prävention einer lokalen Apoptose. Wie der Name des Enzyms bereits
suggeriert, haben sowohl Serum als auch Glucocorticoide einen positiven Einfluss auf die
mRNA-Expression der SGK1. Behandelt man nun mit einem der beiden Wirkstoffgruppen,
wäre eine Erhöhung des SGK1-Spiegels zu erwarten.
MICHAEL und PAPAGEORGHIOU (2008) weisen auf die sowohl positiven (Unterdrückung
der uterinen NK-Zellen, Unterstützung der Trophoblastproliferation und -invasion) als auch
negativen Einflüsse einer Glucocorticoidbehandlung in der Frühschwangerschaft (Induktion
einer Decidua-/und Plazentaapoptose, Beeinträchtigung des plazentalen Nährstofftransportes)
bei der Frau hin. In einer aktuellen Studie von NANCY et al. (2012) wird bei Mäusen auf das
sogenannte Gen-Silencing (Gen-Stilllegung) von T-Zell-anlockenden Chemokinen (TNF-α
und Interferon-gamma, IFN-γ) in decidualen Stromazellen im Bereich der fetomaternalen
Kontaktfläche hingewiesen, von dem angenommen wird, dass es ein wichtiger Bestandteil der
fetomaternalen Immuntoleranz sei. Bereits wenige aktivierte T-Zellen könnten die
Entwicklung oder Funktion der fetomaternalen Kontaktfläche stören, darum folgerten die
Autoren, dass eine Dysregulation des Gen-Silencing zu einer erhöhten Infektanfälligkeit der
Decidua führen könnte.
Stuten haben einen vollkommen anderen Plazentationstyp (Placenta diffusa completa,
Semiplacenta diffusa nach GROSSER 1959, RÜSSE 1998) als Menschen und Mäuse
(Placenta discoidalis, Placenta deciduata nach GROSSER 1959, RÜSSE 1998) und die
Implantation des equinen Embryos findet deutlich später statt: Das Stadium der frei im
Uteruslumen schwimmenden Blastozyste ist zwischen den Tagen 6. bis 15 post ovulationem
anzusiedeln (vgl. RÜSSE 1998), zwischen dem 15. und 17. Graviditätstag erfolgt die Fixation
des Conceptus (GINTHER 1985) und die Implantation beginnt nach RÜSSE (1998) am
36. Tag der Trächtigkeit mit der Invasion von Choriongürtelzellen in das maternale
Endometriumgewebe (Bildung der Schleimhautkrater, endometrial cups). Beim Menschen
beginnt die Implantation am Tag 6 nach der Ovulation und ist etwa 9 ½ Tage p.o. vollendet
(JONES 1992).
32
LITERATURÜBERSICHT
2.4.3 Einfluss des Interleukin-1 und anderer Zytokine auf den weiblichen
Geschlechtsapparat beim Rind
Da das Rind einen ähnlichen Plazentationstyp wie das Pferd aufweist (GROSSER 1959,
RÜSSE 1998), soll im Folgenden der Einfluss von IL-1 und anderen pro-inflammatorischen
Zytokinen auf den bovinen weiblichen Geschlechtsapparat beschrieben werden.
In einer Studie von LEUNG et al. (2001) wurde in vitro über 48 Stunden die Wirkung von (i)
Lipopolysaccharid (LPS) und Dexamethason, (ii) ovinem Interferon-tau (oIFN-τ) und (iii)
humanem, rekombinanten Interleukin-1-alpha (IL-1α), -2 oder 6 auf bovine endometriale
Proben untersucht. Dabei stimulierte LPS die PGF2α-Produktion, wohingegen Dexamethason
allein oder in Kombination mit LPS sowohl PGE2 als auch PGF2α hemmte. Keine der
Behandlungen nahm einen Einfluss auf die Oxytocin-Rezeptor(OTR)-mRNA-Expression.
Ovines IFN-τ setzte die OTR-mRNA-Expression herab, stimulierte jedoch sowohl PGE2 als
auch PGF2α. Bei den pro-inflammatorischen Zytokinen IL-1α, -2 oder 6 war die Wirkung auf
den OTR und die Prostaglandine abhängig von der Zyklusphase, zu der die
Endometriumproben entnommen wurden: In der späten Lutealphase (mittlerer Zyklustag 15,4
± 0,5) hemmten alle drei Zytokine die OTR-Genexpression und IL-1α und IL-2 regten die
PGE2-Produktion an. Dagegen übten die Interleukine während der frühen Luteolyse (mittlerer
Zyklustag 16,4 ± 0,24) keinen Einfluss auf die OTR-mRNA-Expression aus. Lediglich IL-2
erhöhte die PGE2-Produktion. Daraus schlossen die Autoren, dass IL-1 und -2 sowie LPS
wahrscheinlich keine Luteolyse hervorrufen, jedoch im Rahmen einer uterinen Infektion für
erhöhte
PGF2α-Spiegel
sorgen.
Von
PGE2
(EMOND
et
al.
2000)
und
PGD2
(SAITO et al. 2002) wird angenommen, dass sie bei der Etablierung der Trächtigkeit beim
Rind eine wichtige Rolle als Immunmodulator spielen, um eine Abstoßung des Embryos zu
verhindern. GABLER et al. (2009) untersuchten in diesem Zusammenhang die mRNAExpression verschiedener Zytokine (IL-1α, IL-1-Ra) und PGE-Synthasen (cPGES, mPGES-1
und -2) sowie einer PGD-Synthase (L-PGDS) in bovinen Endometriumproben von Kühen mit
unterschiedlichem Geschlechtsgesundheitsstatus 21 bis 27 Tage post partum. Es wurden
3 Gruppen (mit jeweils 9 Tieren) verglichen: Gruppe 1 umfasste gesunde Kühe ohne
Anzeichen einer Endometritis (Kontrollgruppe), in Gruppe 2 waren Kühe mit einer
subklinischen Endometritis und Gruppe 3 enthielt Tiere mit einer klinischen Endometritis. Per
Echtzeit-PCR (real-time PCR, RT-PCR) konnte bestimmt werden, dass Tiere mit einer
33
LITERATURÜBERSICHT
subklinischen oder klinischen Endometritis eine signifikant höhere mRNA-Expression von
L-PGDS, IL-1α und IL-1-Ra als die Kontrollgruppe zeigten. Kühe mit einer subklinischen
Endometritis wiesen eine zweifach geringere cPGES-Genexpression (P < 0,05) als die
gesunden Kühe auf. Diese Beobachtungen führten die Autoren zu der Annahme, dass eine
subklinische oder klinische Endometritis verantwortlich für ein dysreguliertes PGE2- und/oder
PGD2-Profil wären und L-PGDS, IL-1α und möglicherweise IL-1-Ra als lokale Marker zur
Diagnostik einer subklinischen Endometritis genutzt werden könnten.
SINGH et al. (2008) erzielten sehr gute Trächtigkeitsraten (91,67 %) bei Kühen mit
subklinischer Endometritis durch eine intrauterine Behandlung mit 100 µg E. coli LPS und
5 ml autologem Serum 12 Stunden nach der künstlichen Besamung. Den Behandlungserfolg
führten die Autoren auf eine Förderung der nicht spezifischen uterinen Immunität zurück.
34
MATERIAL UND METHODEN
3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN
3.1 MATERIAL UND METHODEN
3.1.1 Stuten
3.1.1.1 Auswahlkriterien
Für die Studie wurden Warmblutstuten ausgewählt, die seit mindestens einem Jahr güst
waren, somit schieden grundsätzlich Maiden- und Fohlenstuten aus. Außerdem handelte es
sich um Tiere, die in der letzten Saison erfolglos künstlich besamt wurden, bei denen eine
Neigung zu einer pPBE durch den Haustierarzt bereits dokumentiert wurde (in der
Zuchtsaison 2010 und/oder in vorangegangenen Jahren länger als 48 Stunden p.i.
Ansammlung von intrauteriner Flüssigkeit, Umrossen trotz eines unauffälligen endometrialen
Tupfers) und die klinisch allgemeingesund (siehe Kapitel „3.1.1.5 Allgemeinuntersuchung“)
waren.
3.1.1.2 Vorversuche
Bevor der Ablauf der Studie geplant werden konnte, mussten im Vorhinein zwei zentrale
Fragen bezüglich des optimalen Applikationszeitpunktes des autologen konditionierten
Serums (ACS) geklärt werden: 1. Hat die intrauterine Verabreichung des ACS parallel zur
hCG-Gabe einen Einfluss auf den Ovulationszeitpunkt? 2. Übt das ACS eine schädliche
Wirkung auf Motilität und Morphologie sowie den Anteil toter Spermien des verdünnten
Frischsamens aus? Die zweite Fragestellung wird im Zuge des Kapitels „3.1.2 Hengste“
thematisiert und entwickelt.
Um einen möglichen Einfluss des ACS auf den Ovulationszeitpunkt auszuschließen, wurde
im Sommer/Herbst (Juli bis Oktober) 2010 bei 3 klinisch gesunden, güsten Stuten im Östrus
die intrauterine Applikation von 4 ml ACS parallel zu der intravenösen Gabe (Vena jugularis
externa) von 2500 I.E. hCG (Ovogest 5000®, Intervet GmbH, Unterschleißheim,
Deutschland) durchgeführt. Zuvor musste ultrasonographisch (Digital Ultrasonic Diagnostic
Imaging System, Model: Magic 2200, Fa. Eickemeyer Tuttlingen, Deutschland, 7,5 MHz
Linearschallkopf) ein mindestens 35 mm großer dominanter Follikel nachgewiesen werden,
35
MATERIAL UND METHODEN
und die Stuten sollten ein nachvollziehbares Rosseverhalten am Hengst (vgl. HANDLER und
AURICH 2005) und ein geringgradiges bis hochgradiges Endometriumsödem (vgl. Kapitel
3.1.1.7) zeigen. Die intrauterine Injektion des ACS erfolgte durch eine sterile
Besamungspipette (Besamungspipette UNIVERSAL für Pferde, 57 cm, Fa. Minitüb,
Tiefenbach, Landshut, Deutschland). Das äußere Genitale wurde zunächst mit Papiertüchern
gereinigt und danach mit einem Hautdesinfektionsmittel (Kodan® Tinktur Forte farblos,
Fa. Schülke & Mayr GmbH, Norderstedt, Deutschland) desinfiziert. Die Besamungspipette
wurde unter Handschutz mit einem sterilen Rektalhandschuh (Fa. cp-Pharma, Burgdorf,
Deutschland), der mit sterilem destillierten Wasser (Aqua dest, Fa. B. Braun, Melsungen,
Deutschland) befeuchtet wurde, durch den Cervikalkanal in den Uterus eingeführt, das ACS
bzw. die Ringerlösung intrauterin appliziert und etwa 10 ml Luft durch eine mit Luft
aufgezogene
nachinjiziert,
Einmalspritze
um
zu
(Inject®
gewährleisten,
Solo,
dass
Fa. B. Braun,
das
gesamte
Melsungen,
Deutschland)
Injektionsvolumen
das
Gebärmutterinnere erreicht.
Vierundzwanzig Stunden nach der hCG-Gabe und danach im Abstand von 12 Stunden
wurden transrektale Ultraschallkontrollen (Digital Ultrasonic Diagnostic Imaging System,
Model: Magic 2200, Fa. Eickemeyer Tuttlingen, Deutschland, 7,5 MHz Linearschallkopf) des
dominanten Follikels bis zum Nachweis der Ovulation vorgenommen. Diese Prozedur wurde
bei jeder Stute während drei aufeinanderfolgenden Zyklen wiederholt (Ergebnisse siehe
Kapitel „3.2.1.1 Einfluss der intrauterinen ACS-Gabe auf den Ovulationszeitpunkt nach hCGInjektion“).
Die im ersten Vorversuch gewonnene Erkenntnis, dass durch ACS die Ovulation nicht
verhindert und der Zeitraum zwischen der intravenösen Verabreichung von hCG und dem
Ovulationszeitpunkt des dominanten Follikels nicht über 48 Stunden post injectionem
verlängert wird, führte zu der Entscheidung, die erste von zwei geplanten intrauterinen ACSApplikationen parallel zur hCG-Gabe vorzunehmen.
36
MATERIAL UND METHODEN
3.1.1.3 Gruppeneinteilung
Die Studie wurde in der Zuchtsaison des Jahres 2011 im März beginnend und im September
endend durchgeführt (Tierschutz-Aktenzeichen: 33.9-42502-10A018).
Dabei wurden sowohl Stuten eingesetzt, die auf Grund von Subfertilität durch eine pPBE auf
einer privaten Hengststation im Südoldenburger Raum (16/54) oder in der tierärztlichen
Klinik für Pferde in Lüsche vorgestellt wurden (20/54), als auch solche Stuten, die mit einem
entsprechenden Vorbericht speziell für die Studie im westlichen Münsterland durch dortige
Haustierärzte vorgeschlagen wurden (18/54).
Insgesamt wurden 54 klinisch allgemeingesunde Warmblutstuten im Alter von 7 bis 30 Jahren
(Mittelwert  = 14,72 Jahre, Median M = 14 Jahre) untersucht. Alle Stuten wurden einmal pro
Rosse mit dem verdünnten Frischsamen eines von vier Hengsten, die zuvor auf
gleichermaßen gute Samenqualität und ähnlichem Stutenzulauf selektiert wurden (vergleiche
Kapitel „3.1.2 Hengste, 3.1.2.1 Auswahlkriterien“), künstlich besamt (vergleiche Kapitel
„.3.1.1.10 Terminierte Besamung nach hCG-Applikation“) Es wurde versucht, die Stuten
gleichmäßig auf die Hengste aufzuteilen, wobei der individuelle Besitzerwunsch zu
berücksichtigen war. Dabei entfielen 16 Stuten auf Hengst 1, 13 Stuten auf Hengst 2,
10 Stuten auf Hengst 3 und 15 Stuten auf den vierten Hengst. Die künstliche Besamung (KB)
erfolgte 24 oder 48 Stunden nach der intravenösen hCG-Gabe. Dieser Zeitraum wurde an
Stelle eines festen Zeitpunktes (z.B. 24 Stunden nach hCG-Gabe) gewählt, damit Stuten, die
besonders zu Beginn der Zuchtsaison in die Studie aufgenommen wurden und eine langsame
Follikelreifung zeigten, nicht zur Einhaltung des Behandlungsprotokolls zu früh nach der
hCG-Applikation besamt werden mussten, sondern, falls bei der ultrasonographischen
Follikelkontrolle es ratsam erschien, noch einen Tag mit der Besamung zu warten, auch erst
48 Stunden nach Ovulationsinduktion besamt werden durften.
Die Tiere wurden randomisiert auf 3 Gruppen verteilt (siehe Abbildung 2), so dass jede
Gruppe 18 Stuten umfasste. Grundsätzlich wurde erst dann mit der Behandlung begonnen,
wenn die Stuten einen mindestens 35 mm großen dominanten Rossefollikel sowie eine
ultrasonographisch darstellbare, geringgradige bis hochgradige Ödematisierung des
Endometriums
(vergleiche
Kapitel
„3.1.1.7
Ultrasonographische
Beurteilung
des
Endometriumödems und der intrauterinen Flüssigkeit“) und zusätzlich ein deutliches
37
MATERIAL UND METHODEN
Rosseverhalten am Hengst demonstrierten (HANDLER und AURICH 2005).
Die erste Gruppe (G1) erhielt parallel zur hCG-Applikation und ein zweites Mal 4 bis
6 Stunden nach der Besamung jeweils eine Gabe von 4 ml ACS intrauterin. Gruppe 2 (G2)
wurde zu den oben genannten Zeitpunkten an Stelle des ACS mit 4 ml steriler Ringer-Lösung
(B. Braun Melsungen, Deutschland) i.u. behandelt. Außerdem wurden ab der hCG-Gabe und
danach alle 12 Stunden bis zur Besamung 0,1 mg Prednisolonacetat (Prednisolonacetat
Injektionssuspension ad us. vet., Fa. cp-Pharma, Burgdorf, Deutschland) pro kg
Körpergewicht i.m. verabreicht (PAPA et al. 2008). Die dritte Gruppe (G3) erhielt lediglich
zweimal 4 ml Ringer-Lösung intrauterin zeitgleich zu den beiden vorangegangenen Gruppen
und ansonsten keine weitere Behandlung.
Güste Stuten mit Neigung zu einer pPBE (n = 54)
Hengst 1
Gruppe 1
(n = 5)
Gruppe 2
(n = 5)
Gruppe 3
(n = 6)
Hengst 2
Gruppe 1
(n = 3)
Hengst 4
Hengst 3
Gruppe 1
(n = 3)
Gruppe 2
(n = 5)
Gruppe 1
(n = 7)
Gruppe 2
(n = 3)
Gruppe 3
(n = 5)
Gruppe 3
(n = 4)
Gruppe 2
(n = 5)
Gruppe 3
(n = 3)
Abbildung 2: Schema der Gruppeneinteilung der insgesamt 54 an der Studie beteiligten
Stuten auf die 4 Hengste und der innerhalb der Hengstgruppen vorgenommenen Aufteilung
auf die Gruppen 1 bis 3 (Gruppe 1 = ACS; Gruppe 2 = Prednisolonacetat; Gruppe 3 = RingerLösung)
38
MATERIAL UND METHODEN
3.1.1.4 Versuchsaufbau
Am Tag der Erstvorstellung wurde zunächst ein gynäkologischer Vorbericht der Stute
aufgenommen, wobei speziell das Alter der Stute, die Anzahl der vorangegangenen
Trächtigkeiten/Abfohlungen, eventuell in der Vergangenheit durchgeführte chirurgische
Eingriffe (z.B. Caslick-Scheidenplastik), bisherige pathologische Befunde (z.B. einer
Endometriumsbiopsie), die Güstzeit (in Jahren), die Art der letzten Belegung/Besamung (z.B.
Natursprung, Tiefgefriersperma) und der zuletzt ausgewählte Hengst erfragt wurden. Danach
wurde
eine
kurze
Allgemeinuntersuchung
(vergleiche
Kapitel
„3.1.1.5
Allgemeinuntersuchung“) durchgeführt, da ausschließlich klinisch allgemeingesunde Tiere
für die Studie zugelassen waren. Im Anschluss daran erfolgte eine klinisch-gynäkologische
Untersuchung
der
Stute
(vergleiche
Kapitel
„3.1.1.6
Klinisch-gynäkologische
Untersuchung“), um das aktuelle Zyklusstadium zu ermitteln. Handelte es sich um eine Stute,
die randomisiert der Gruppe 1 (ACS) zugeordnet worden war, so wurde unter aseptischen
Bedingungen mittels eines 50-ml-Spezialspritzensystems (irap® 50 ml Blood sampling
Syringe Set, Fa. Orthogen Veterinary GmbH, Düsseldorf, Deutschland) Blut aus der Vena
jugularis externa entnommen, das unmittelbar nach der Gewinnung 24 Stunden bei 37°C im
Spritzensystem senkrecht stehend in einem durch einen Gummistopfen nach außen
abgeschlossenen Glascontainer (Orthotherapeutics Fa. Orthogen Veterinary GmbH,
Düsseldorf, Deutschland) in einer Wärmebox (Modell „Kb 38“, T. 37°C, Inhalt: 36 Liter,
Leistung: 50 Watt, Fa. HCP-Technology GmbH, Nortrup, Deutschland) inkubiert wurde. Zur
Überwachung
der
korrekten
Inkubationstemperatur
von
+
37°C
wurde
ein
Quecksilberthermometer, das zusätzlich zum integrierten Thermostat in die Wärmekiste
gelegt wurde, vor Beschicken der Box und nach 12 bzw. 24 Stunden abgelesen. Die
Aufbereitung des Serums erfolgte im Anschluss daran: Zunächst wurde das wie oben
beschrieben inkubierte Blut in der Spritze für 10 Minuten bei 2100 x Erdbeschleunigung (g)
zentrifugiert (Zentrifuge Hermle Z 300, Fa. HERMLE Labortechnik GmbH, Wehingen,
Deutschland). Danach wurde das Serum steril mit einer 20-ml-Spritze (Inject® Solo,
Fa. B. Braun, Melsungen, Deutschland) durch eine sterile Kanüle (Sterican® Tiefintramuskulär, Fa. B. Braun, Melsungen, Deutschland) aus der 50-ml-Spritze abgesogen, in
ein steriles Gefäß (SPL 50-ml-Zentrifugen-Röhrchen, steril, Fa. Semadeni (Europe) AG,
Düsseldorf, Deutschland) überführt, das danach mit einem Schraubverschluss verschlossen
39
MATERIAL UND METHODEN
wurde, und wiederum für 5 Minuten bei 2100 x g zentrifugiert. Das nun doppelt zentrifugierte
Serum wurde mit einer 20-ml-Spritze aus dem sterilen Gefäß aufgezogen und durch sterile
Bakterienfilter (Sterifix® Injektionsfilter, 0,2 µm, Fa. B. Braun, Melsungen, Deutschland) in
sterile 5-ml-Spritzen (Inject® Solo, Fa. B. Braun, Melsungen, Deutschland) umgefüllt (4 ml
ACS pro Behandlungsportion). Die Spritzen wurden vorne mit einer sterilen 18-GaugeKanüle inklusive Schutzhülle (Sterican® Standardkanülen, Fa. B. Braun, Melsungen,
Deutschland) abgedeckt. Das so gewonnene, portionierte Serum wurde entweder bei minus
18°C eingefroren oder, wenn es innerhalb der nächsten 7 Tage eingesetzt werden sollte, bei
plus 4°C im Kühlschrank gelagert.
Konnten bei den Stuten ein mindestens 35 mm großer dominanter Follikel, eine
ultrasonographisch darstellbare, geringgradige bis hochgradige Ödematisierung des
Endometriums
(vergleiche
Kapitel
„3.1.1.7
Ultrasonographische
Beurteilung
des
Endometriumödems und der intrauterinen Flüssigkeit“) und zusätzlich ein deutliches
Rosseverhalten am Hengst (HANDLER und AURICH 2005).beobachtet werden, wurden
2500 I.E. hCG i.v. (Ovogest 5000®, Intervet GmbH, Unterschleißheim, Deutschland) in die
Vena jugularis externa zur Ovulationsinduktion verabreicht. Abhängig von dem transrektal
palpierten und ultrasonographisch darstellbaren Reifungszustand des dominanten Follikels
(beurteilt nach dem modifizierten Befundschlüssel nach Götze 1949, siehe HANDLER 2005)
wurde zwischen 24 und 48 Stunden nach der Injektion besamt. Parallel zu der hCG-Gabe
wurden von jeder Stute eine zytologische und eine mikrobiologische Probe des Endometriums
entnommen (siehe Kapitel 3.1.1.8 und 3.1.1.9). Im Anschluss daran wurde die erste
Behandlung entweder mit 4 ml ACS intrauterin (i.u.) (Gruppe 1, G1), 0,1 mg
Prednisolonacetat (Prednisolonacetat-Injektionssuspension ad us.vet. 10mg, Fa. cp-Pharma,
Burgdorf, Deutschland) pro kg Körpergewicht alle 12 Stunden i.m. bis zur Besamung
kombiniert mit 4 ml steriler Ringerlösung (Fa. B. Braun, Melsungen, Deutschland) i.u.
(Gruppe 2, G2) oder nur 4 ml Ringerlösung (Fa. B. Braun, Melsungen, Deutschland) i.u.
(Gruppe 3, G3) durchgeführt. Die intrauterine Injektion des ACS bzw. der Ringerlösung
erfolgte durch eine sterile Besamungspipette (Besamungspipette UNIVERSAL für Pferde, 57
cm, Fa. Minitüb, Tiefenbach, Landshut, Deutschland). Das äußere Genitale wurde zunächst
mit Papiertüchern gereinigt und danach mit einem Hautdesinfektionsmittel (Kodan® Tinktur
Forte farblos, Fa. Schülke & Mayr GmbH, Norderstedt, Deutschland) desinfiziert. Die
40
MATERIAL UND METHODEN
Besamungspipette wurde unter Handschutz mit einem sterilen Rektalhandschuh (Fa. cpPharma, Burgdorf, Deutschland), der mit sterilem destillierten Wasser (Aqua dest,
Fa. B. Braun, Melsungen, Deutschland) befeuchtet wurde, durch den Cervikalkanal in das
Uteruslumen eingeführt, das ACS bzw. die Ringerlösung intrauterin appliziert und etwa 10 ml
Luft durch eine mit Luft aufgezogene Einmalspritze (Inject® Solo, Fa. B. Braun, Melsungen,
Deutschland) nachinjiziert, um zu gewährleisten, dass das gesamte Injektionsvolumen das
Gebärmutterinnere erreicht.
Die nächste transrektale Ultraschallkontrolle der Ovarien und des Uterus erfolgte 24 Stunden
nach der hCG-Applikation. Abhängig von dem transrektal palpierten und ultrasonographisch
darstellbaren Reifungszustand des dominanten Follikels (beurteilt nach dem modifizierten
Befundschlüssel nach Götze 1949, siehe HANDLER 2005) wurde jetzt (abgeflachte,
polygonale Form und weiche Fluktuation des dominanten Follikels) oder erst weitere
24 Stunden später (kreisrunde Form und deutlich gespannte Fluktuation des dominanten
Follikles) mit einer Portion des für die Stute ausgewählten, verdünnten Frischsamens besamt.
Vier bis 6 Stunden post inseminationem (p.i.) wurde wiederum eine transrektale
Ultraschallkontrolle des Uterus und der Ovarien, sowie die Entnahme einer Cytobrush-Probe
und die zweite intrauterine Behandlung mit 4 ml ACS (G1) oder 4 ml steriler Ringerlösung
(G2 und G3) vorgenommen.
Die nächste transrektale Palpation und Ultrasonographie des Uterus und der Ovarien wurde
zusammen mit einer erneuten zytologischen Probenentnahme 24 Stunden p.i. durchgeführt.
Die letzte transrektale Ultraschallkontrolle des Uterus und der Ovarien und CytobrushProbenentnahme erfolgte 48 Stunden nach der Besamung.
Die transrektal ultrasonographisch und palpatorisch durchgeführte Trächtigkeitsuntersuchung
zwischen Tag 15 und 18 p.i. bildete die Abschlussuntersuchung für die an der Studie
beteiligten Stuten. Die Tiere, die zwischen Tag 15 und 18 p.o. tragend waren, wurden bis
Tag 25
p.o.
weiterhin
auf
Trächtigkeitsanzeichen
„3.1.1.12 Trächtigkeitsuntersuchung“).
41
hin
untersucht
(vgl.
Kapitel
MATERIAL UND METHODEN
Erstvorstellung der Stute
Allgemeinuntersuchung
Klinisch-gynäkologische Untersuchung
bakteriolog. Endometriumtupfer
Blutabnahme zur ACS-Gewinnung
Follikel ≥ 35 mm
Follikelkontrolle
24 bis 48 h a.i.
2500 I.E. hCG
Cytobrush 1, bakteriolog. Tupfer
Behandlung mit ACS (G1),
Prednisolonacetat + RingerLösung (G2) oder RingerLösung (G3)
0h
Follikelkontrolle
Besamung
4 bis 6 h p.i.
Follikelkontrolle
Cytobrush 2
24 h p.i.
Behandlung mit ACS (G1),
Prednisolonacetat + RingerLösung (G2) oder RingerLösung(G3)
Follikelkontrolle
Cytobrush 3
48 h p.i.
Follikelkontrolle
Cytobrush 4
15 bis 18 Tage p.i.
Trächtigkeitsuntersuchung
Abbildung 3: Schema des Versuchsaufbaus; der Besamungszeitpunkt gilt als 0 Stunden (h)
(ACS = autologes konditioniertes Serum; hCG = humanes Choriongonadotropin)
42
MATERIAL UND METHODEN
3.1.1.5 Allgemeinuntersuchung
Damit ausschließlich allgemein gesunde Tiere an der Studie teilnehmen, wurden zunächst
folgende Parameter erhoben:
• Identität, Alter der Stute und Anamnese des Reproduktionsstatus
• Ernährungs- und Pflegezustand
• Herz- und Atemfrequenz
• Schleimhautfarbe und kapilläre Füllungszeit der Gingiva
• Körperinnentemperatur rektal gemessen
• Nasenausfluss/Husten?
• Beschaffenheit der Lymphonodi mandibulares
Erst wenn die oben genannten Befunde im physiologischen Bereich lagen (vergleiche
GLITZ und DEEGEN 2002), wurden die Stuten in den Versuch aufgenommen.
3.1.1.6 Klinisch-gynäkologische Untersuchung
Um sich einen Überblick über den aktuellen reproduktionsmedizinischen Zustand der Stuten
zu verschaffen, wurde nach der Allgemeinuntersuchung sowohl eine Adspektion des äußeren
als auch eine transrektale palpatorische und ultrasonographische Untersuchung des inneren
Geschlechtsapparates durchgeführt.
Dabei lag der Fokus bei der Untersuchung des äußeren Genitale besonders auf der Stellung
und dem Schluss der Vulva sowie auf eventuellen Sekretspuren im Bereich der Scham, der
Schenkelinnenflächen und der Schweifunterseite. Die Vaginalschleimhaut wurde unter
manueller Spreizung der Labia vulvae inspiziert.
Unter Nutzung von Einmal-Rektalhandschuh (cp-Pharma, Burgdorf, Deutschland) und
Gleitgel (WDT, Garbsen, Deutschland) wurden der Uterus und die Ovarien transrektal
palpiert und ultrasonographisch (Digital Ultrasonic Diagnostic Imaging System, Model:
Magic 2200, Fa. Eickemeyer Tuttlingen, Deutschland, 7,5 MHz Linearschallkopf) dargestellt.
Die Lage, Größe, Symmetrie und Konsistenz der genannten Organe sowie die Kontraktilität
43
MATERIAL UND METHODEN
des Uterus wurden nach KLUG (1999) beurteilt und der Diameter der Follikel und der Grad
der Ödematisierung der Gebärmutter verzeichnet.
3.1.1.7 Ultrasonographische Beurteilung des Endometriumödems und der intrauterinen
Flüssigkeit
Wie bei der klinisch-gynäkologischen Untersuchung bereits geschildert wurde, erfolgt eine
ultrasonographische Untersuchung des Uterus. Zur Beurteilung des Zyklusstadiums und
eventueller
entzündlicher
Reaktionen
des
Endometriums
wurde
hierbei
auf
die
Ödematisierung und mögliche intrauterine Flüssigkeitsansammlungen geachtet. Dabei wurden
die Uterushörner im Querschnitt zur Beurteilung der beiden oben genannten Parameter
transrektal ultrasonographisch untersucht.
Die Abstufung der Ödematisierung erfolgte nach McKINNON et al. 1987a und 1987b:
-
: kein endometriales Ödem
+
: geringgradiges endometriales Ödem
++
: mittelgradiges endometriales Ödem
+++
: hochgradiges endometriales Ödem
Die
Abstufung
der
intrauterinen
Flüssigkeit
wurde
nach
dem
Schema
nach
BRINKSO et al. (2003) vorgenommen:
-
: keine intrauterine Flüssigkeit
+/-
: intrauterine Flüssigkeit < 2 cm Höhe
+
: intrauterine Flüssigkeit > 2 cm Höhe
Bei der Beurteilung der im transrektalen Ultraschallbild dargestellten intrauterinen Flüssigkeit
galt eine Ansammlung von mehr als 2 cm Höhe für die Stuten als ein deutlicher Risikofaktor,
für eine pPBE empfänglich zu sein.
44
MATERIAL UND METHODEN
3.1.1.8 Endometriumtupfer und mikrobiologische Untersuchung
Für jeden untersuchten Zyklus wurde eine Tupferprobe parallel zur hCG-Applikation
genommen. Das äußere Genitale wurde zunächst mit Papiertüchern gereinigt und danach mit
einem Hautdesinfektionsmittel (Kodan® Tinktur Forte farblos, Schülke & Mayr GmbH,
Norderstedt, Deutschland) desinfiziert. Ein steriler doppelt geschützter Einmaltupfer
(Equivet®, Kruuse UK Ltd., Sherburn Elmet, United Kingdom) wurde unter Handschutz mit
einem sterilen Rektalhandschuh (cp-Pharma, Burgdorf, Deutschland), der mit sterilem
destillierten Wasser (Aqua dest, B.Braun, Melsungen, Deutschland) befeuchtet wurde, in
seiner äußeren Hülle in den Cervikalkanal eingeführt, dann die zweite Hülle durch die vordere
Kappe gestoßen, um mit dem innen liegenden Tupfer eine Probe des Endometriums zu
entnehmen. Nach dem Zurückziehen des Tupfers in die äußere und innere Hülle wurde das
gesamte System aus dem Genitaltrakt zurückgezogen. Danach erfolgte das Ausstreichen des
Tupfers auf Columbia-Agar mit Blut, Columbia-CAP-Agar, Gassner-Agar und SabouraudGlucose-Agar (jeweils Fa. Oxoid, Basingstoke, England). Die so beschickten Nährböden
wurden bei + 37 °C in einem Brutschrank (CO2-Brutschrank INCOmed, Fa. Memmert GmbH
+ Co. KG, Schwabach, Deutschland) bei Raumatmosphäre und -luftfeuchtigkeit bebrütet und
über einen Zeitraum von 48 Stunden alle 24 Stunden abgelesen. Im Falle eines
Bakterienwachstums wurden eine Ausdifferenzierung der Kulturen und die Erstellung eines
Antibiogramms durchgeführt. Dazu wurden eine Kolonie oder wenn vorhanden mehrere
Kolonien des entsprechend als pathogen identifizierten Keimes steril mit einer zuvor
abgeflammten Öse von dem Nährboden entnommen und auf einem Diagnostic Sensitivity
Test Agar (D.S.T.-Agar, Fa. Oxoid, Basingstoke, England) ausgestrichen. Danach wurden
steril verschiedene Antibiotika-Testplättchen (Fa. Oxoid, Basingstoke, England) mit einer
Pinzette auf den D.S.T.-Agar in einem Mindestabstand von 2,5 cm ebenmäßig verteilt
aufgelegt, 24 Stunden bei + 37°C wie oben beschrieben bebrütet und danach wiederum
abgelesen.
45
MATERIAL UND METHODEN
Ein
Tupfer
galt
als
„positiv“,
wenn
folgende
Keime
nachgewiesen
wurden
(BUSCH und KLUG 1999):
Jeder Nachweis von:
• β-hämolysierenden Streptokokken
• Klebsiellen
• Staphylococcus aureus
• Pseudomonas aeruginosa
• Bordetella bronchiseptica
• E. coli var. haemolytica
Nachweis von mehr als 3 Kolonie-bildenden Einheiten bei klinischer Erkrankung (intrauterine
Flüssigkeit > 2 cm):
• E. coli
• Coliforme Keime
• Proteus
Nachweis von mehr als 3 Kolonie-bildenden Einheiten von:
• Pseudomonas spp.
• Hefen
• Schimmelpilzen
Ein positives Tupferergebnis führte zum Ausschluss der jeweiligen Stute aus der Studie. Bei
einem Nachweis eines pathologischen Keimgehaltes wurde ein Resistenztest durchgeführt
und die betroffenen Stuten nach Ausscheiden aus der Studie mit einem Antibiotikum
behandelt, gegen das der entsprechende isolierte Keim sensibel war.
46
MATERIAL UND METHODEN
3.1.1.9 „Cytology brush“ und zytologische Untersuchung
Mit Bezug auf die in Kapitel 2.1.4 aufgeführten Ergebnisse der verschiedenen Studien wurde
die zytologische Untersuchung des Endometriums auf folgende Art und Weise vollzogen:
Die erste Probenentnahme erfolgte zum Zeitpunkt der hCG-Applikation sowie im Anschluss
sechs, 24 und 48 Stunden nach der Besamung.
Das äußere Genitale wurde, wie zuvor bei der Entnahme des Uteruskulturtupfers beschrieben,
gereinigt und desinfiziert.
Es wurde jeweils eine 20 cm lange „Celltip“-Abstrichbürste (Servoprax® GmbH, Wesel,
Deutschland), die ursprünglich zur Entnahme eines cervikalen Abstriches bei der Frau dient,
manuell mit der in die Vagina eingeführten, wie bei der Tupferprobenentnahme beschrieben,
handschuhgeschützten Hand durch den Cervikalkanal in das Uteruslumen eingebracht, bis
zum Erreichen des Endometriums vorgeschoben, um 180° gedreht und wieder aus dem
Genitaltrakt entfernt.
Danach wurde das Bürstchen auf einem entfetteten Objektträger (Fa. Heiland, Hamburg,
Deutschland) abgerollt und dieser an der Luft getrocknet.
Die Fixation
und
Färbung des Ausstrichs
erfolgte mittels
Diff-Quick-Färbung®
(Fa. Medion Diagnostics AG, Düdingen, Schweiz) durch fünfmaliges, jeweils 1 Sekunde
andauerndes und in der folgenden Reihenfolge durchgeführtes Eintauchen des Objektträgers
in jede der 3 Lösungen: Diff-Quick Fix, Diff-Quick I und Diff-Quick II. Zu
Zuletzt wurde die Rückseite des Objektträgers durch vorsichtiges Abtupfen mit einem
weichen Einmalpapiertuch (Fa. Heiland, Hamburg, Deutschland) entfeuchtet und der
Objektträger für einen Tag luftgetrocknet.
47
MATERIAL UND METHODEN
Die mikroskopische Beurteilung wurde mit einem Lichtmikroskop (Fa. Olympus, Hamburg,
Deutschland) bei 400-facher Vergrößerung durchgeführt, wobei die Anzahl der PMN
in 10 zufällig ausgewählten Gesichtsfeldern nach dem differenzierten Schema von
BROOK (1984) addiert und ausgewertet wurde:
-
keine PMN
(+)
1 bis 5 PMN
+
6-10 PMN
+(+)
11-20 PMN
++
21-50 PMN
++(+)
> 50 PMN
+++
> 50 PMN und Pyozyten (Granulozyten mit phagozytiertem Material)
Eine beobachtete Anzahl von 0 bis 5 PMN in 10 Gesichtsfeldern galt als negativ, wohingegen
mehr als 5 neutrophile Granulozyten als Anzeichen für eine entzündliche Reaktion des
Endometriums gewertet wurden.
3.1.1.10 Terminierte Besamung nach hCG-Applikation
Es wurde grundsätzlich bei den Stuten der Gruppen 1 bis 3 2.500 I.E. hCG (Ovogest 5000®,
Intervet GmbH, Unterschleißheim, Deutschland) intravenös in die Vena jugularis externa
appliziert, sobald ein mindestens 35 mm großer dominanter Follikel nachgewiesen werden
konnte und die Stute ein deutliches Rosseverhalten am Hengst und Endometriumsödem
zeigte.
Die Besamung wurde nach 24 bzw. 48 Stunden post hCG-Gabe mit einem Inseminatvolumen
von 12 ml mit 500 Millionen vorwärtsbeweglichen Spermien vorgenommen (Art und Ort der
Samenentnahme siehe Kapitel 3.1.2.2). Dafür wurde das äußere Genitale zunächst mit
Papiertüchern gereinigt und danach mit einem Hautdesinfektionsmittel (Kodan® Tinktur
Forte farblos, Fa. Schülke & Mayr GmbH, Norderstedt, Deutschland) desinfiziert. Die
Besamungspipette wurde unter Handschutz
mit einem sterilen Rektalhandschuh
(Fa. cp-Pharma, Burgdorf, Deutschland), der mit sterilem destillierten Wasser (Aqua dest,
48
MATERIAL UND METHODEN
Fa. B. Braun, Melsungen, Deutschland) befeuchtet wurde, durch den Cervikalkanal in das
Uteruslumen eingeführt, der verdünnte Frischsamen intrauterin appliziert und etwa 10 ml Luft
durch eine mit Luft aufgezogene Einmalspritze (Inject® Solo, Fa. B. Braun, Melsungen,
Deutschland) nachinjiziert, um zu gewährleisten, dass das gesamte Inseminatvolumen das
Gebärmutterinnere erreicht.
3.1.1.11 Behandlung nach Abschluss der Probenentnahme
Nachdem die letzte Cytobrush-Probe (48 h post inseminationem) entnommen wurde, wurde
keine weitere Behandlung der Stuten eingeleitet, auch wenn die Stuten nachweislich
intrauterine Flüssigkeit angesammelt hatten. Der Grund für dieses Vorgehen war, einen
möglichen Zusammenhang zwischen einer Behandlung nach Protokoll der Gruppe ACS,
Prednisolonacetat bzw. Placebo und einer positiven Trächtigkeitsuntersuchung einwandfrei
herstellen zu können. Eine zusätzliche Therapie außerhalb des vorgegebenen Protokolls hätte
dies verhindert.
3.1.1.12 Trächtigkeitsuntersuchung
Die Trächtigkeitsuntersuchung (TU) wurde zwischen dem 15. und 18. Tag post ovulationem
entweder durch den Haustierarzt oder auf der Deckstation durchgeführt. Die Gravidität wurde
bei gleichzeitigem Vorhandensein eines Corpus luteum, einer sich ultrasonographisch
hypoechogen
darstellenden
Fruchtblase,
einer
Asymmetrie
und
einer
erhöhten
Kontraktionsbereitschaft des Uterus bestätigt. Anhand dieser Befunde wurde die
Trächtigkeitsrate der Stuten bestimmt (vgl. Kapitel „3.2 ERGEBNISSE“). Die Stuten, die
zwischen Tag 15 und 18 p.o. tragend waren, wurden bis zum 25. Tag p.o. alle hinsichtlich
eine vorhandenen Trächtigkeit weiter überwacht. Danach wurden die tragenden Tiere
entweder durch den Haustierarzt weiter betreut, oder – wie im Falle der klinikeigenen Stuten
der Tierklinik Lüsche – die Trächtigkeit durch Luteolyse durch intramuskuläre Applikation
von 500 µg Cloprostenol pro Tier (Estrumate® ad us. vet., Injektionslösung, Fa. Intervet,
Unterschleißheim, Deutschland) beendet.
49
MATERIAL UND METHODEN
3.1.2 Hengste
3.1.2.1 Auswahlkriterien
Die Auswahl der vier an der Studie beteiligten Warmbluthengste richtete sich nach deren
guten Samenqualität, die regelmäßig durch die Deckstation überprüft und bestätigt wurde
(mindestens 70 % vorwärtsbewegliche, mindestens 75 % gesamtbewegliche Spermien bei
mikroskopischer Untersuchung direkt nach der Samenentnahme; saisonale Trächtigkeitsraten
zwischen 75 und 85 %), und einer gleich hohen Stutenfrequentierung. Alle 4 Hengste
gehörten derselben Südoldenburgischen Hengststation an und wurden in der Zuchtsaison
2011 sowohl für den Deckeinsatz als auch im Sport genutzt. Dabei handelte es sich um
jeweils 2 Hengste, die einen dressur- bzw. springbetonten Pedigree aufwiesen. Zwei der
Hengste entstammten dem Oldenburgischen (Jahrgang 2003 bzw. 2005), jeweils ein Hengst
dem Holsteinischen (Jahrgang 2006) bzw. dem Rheinischen Warmblut-Zuchtgebiet (Jahrgang
2002). Der allgemeine sowie der geschlechtsspezifische Gesundheitszustand der Hengste
wurde durch die Stationstierärztin zusammen mit der Hengststation in regelmäßigen
Kontrollen
gemäß
der
geltenden
EU-Richtlinien
und
des
„Handbuchs
Pferdebesamungsstationen: Leitlinien für die Zulassung, Überwachung und den Betrieb von
Pferdebesamungsstationen,
Samendepots,
Embryo-Entnahmeeinheiten“,
Stand
2010
(http://www.landwirtschaftskammer.de/landwirtschaft/tierproduktion/pferdehaltung/pdf/hand
buch-besamungsstationen.pdf) überprüft.
3.1.2.2 Vorversuche
Um den idealen Zeitpunkt für die zweite Behandlung der Stuten mit ACS zu ermitteln, galt es
zuvor zu klären, ob das autologe konditionierte Serum einen schädigenden Einfluss auf die
Qualität des verwendeten verdünnten Frischsamens der Hengste hat. Dabei konnte zum
Zeitpunkt der Vorversuche lediglich der Frischsamen der Hengste 1, 3 und 4 getestet werden,
da Hengst 2 auf Grund seines Einsatzes im Sport nicht zur Verfügung stand.
Das Frischsperma wurde sowohl für die Vorversuche als auch für die eigentliche Studie
täglich an einem Phantom mit einer künstlichen Scheide „Modell Hannover“ (Fa. Minitüb,
50
MATERIAL UND METHODEN
Tiefenbach, Deutschland) gewonnen. Direkt nachdem das Ejakulat aseptisch aufgefangen
wurde, wurde es makroskopisch hinsichtlich des Aussehens (Farbe und Konsistenz) und des
Volumens beurteilt. Als Grundlage der Einteilung der Besamungsportionen dienten die
photometrische Bestimmung der Samendichte, die Berechnung der Gesamtspermienzahl und
die
mikroskopische
Schätzung
der
Spermienmotilität.
Vor
der
Verdünnung
mit
Eigelbverdünner (EVD®, Spervital, Toldiyk, Niederlande) wurde der Samen 15 Minuten bei
5000 x g zentrifugiert (Zentrifuge „Rotofix 32“, Fa. Andreas Hettich GmbH & Co.KG,
Tuttlingen, Deutschland). Eine Besamungsportion enthielt 500 Millionen vorwärtsbewegliche
Spermien und wurde in 12 ml Portionen bei + 5°C bis zur Besamung im Kühlschrank (Modell
KG39EAI40X, Fa. Siemens Electrogeräte GmbH, München, Deutschland) gelagert.
Pro Hengst wurden 3 unterschiedliche Ejakulate folgendermaßen mit dem ACS gesunder
Stuten in vitro behandelt:
Es wurden pro Ejakulat 3 Spermienbehandlungsgruppen gebildet: Die erste Gruppe A enthielt
eine 12-ml-Portion verdünnten Frischsamens (FS) (500 Millionen vorwärtsbewegliche
Spermien), der 4 ml ACS zugesetzt wurden. In Gruppe B wurde zu einer Portion verdünnten
FS 0,4 ml ACS hinzugefügt. Die dritte Gruppe C enthielt eine Portion verdünnten FS ohne
jegliche Zusätze. Diese Proben wurden jeweils homogen durch mehrfach wiederholtes
Schwenken vermischt und zu gleichen Teilen (6 ml) auf jeweils 2 Samenröhrchen aufgeteilt,
so dass von jedem Probenansatz ein Teil im Kühlschrank (Modell KG39EAI40X,
Fa. Siemens Electrogeräte GmbH, München, Deutschland) bei + 5°C und ein Teil bei + 37°C
im Brutschrank bei 5 % Kohlendioxid (CO2) und 95 % Luftfeuchtigkeit (CO2-Brutschrank
INCOmed, Fa. Memmert GmbH + Co. KG, Schwabach, Deutschland) aufbewahrt wurde.
Jede Probe wurde eine halbe Stunde, 2, 4, 8 und 24 Stunden nach der jeweiligen Behandlung
hinsichtlich der Motilität (Vorwärts- und Gesamtbeweglichkeit) bzw. kurz nach der
Behandlung und wiederum 24 Stunden später hinsichtlich der Morphologie und des Anteils
toter Spermien beurteilt. Dabei wurde die Spermienmotilität mikroskopisch bei 200-facher
Vergrößerung und durch ein speziell zur Beurteilung des Samens mit einem auf + 37°C
beheizbaren Objektträger versehenen Lichtmikroskop (Typ Cx31, Fa. Olympus, Hamburg,
Deutschland) ausgewertet. Die Proben für die Morphologie wurden mit der Spermac Stain™
(Fa. Minitüb, Tiefenbach, Deutschland) als „morphologisch normal“ oder „verändert“
51
MATERIAL UND METHODEN
(vergleiche WABERSKI und SIEME 2005)
beurteilt
(Färbeanleitungen
siehe
Kapitel „8 ANHANG“). Außerdem wurden Proben mit der Nigrosin-Eosin-Färbung (Fa.
Minitüb, Tiefenbach, Deutschland) bearbeitet, in der die Spermien als „lebend“ oder „tot“
(vergleiche WABERSKI und SIEME 2005) ausgezählt wurden. Dabei galt es zu klären, wie
sich ACS bzw. Lagerungsart und –temperatur auf die Qualität des verdünnten Frischsamens
auswirken.
Verd.
FS +
4 ml
ACS
Kühlschrank
Verd.
FS +
0,4 ml
ACS
Brutschrank
Kühlschrank
Brutschrank
Verd.
FS
ohne
Zusatz
Kühlschrank
Brutschrank
Abbildung 4: Schema des Probenansatzes pro Hengst und Ejakulat (Verd. FS = verdünnter
Frischsamen; ACS = autologes konditioniertes Serum)
52
MATERIAL UND METHODEN
3.1.3 Statistische Auswertung
Zur statistischen Auswertung der Studie wurde das SAS-Programm® (‚Statview‘ 9.1, SAS
Statistical Analysis System) des Instituts für Biometrie und Epidemiologie der Stiftung
Tierärztliche Hochschule Hannover genutzt.
Mit dem Student’s t-Tests (t) und dem Wilcoxon Signed Rank Test (S) wurde der Einfluss des
autologen konditionierten Serums auf den Ovulationszeitpunkt nach einer parallelen Gabe
von ACS und hCG bei 3 Stuten in jeweils 3 Rosseperioden überprüft.
Zur Beurteilung eines möglichen Unterschiedes der Samenqualität hinsichtlich Morphologie,
Anteil toter Spermien und Motilität zwischen den Hengsten wurden der Wilcoxon-Test bzw.
der Kruskal-Wallis-Test mit dem Mittelwerten der Messwerte (Merkmal 1 = Anteil toter
Spermien in der Nigrosin-Eosin-Färbung; Merkmal 2 = Anteil veränderter Spermien in der
Spermac Stain™-Färbung; Merkmal 3 = Vorwärtsbeweglichkeit der Spermien in Prozent;
Merkmal 4 = Gesamtbeweglichkeit der Spermien in Prozent) durchgeführt. Bezogen auf die
Gesamtpopulation (hier 9 Ejakulate von 3 Hengsten; cave: eigentlich handelt es sich nur um
3 statistische Einheiten) wurden mit dem t-Test die Differenzen der Mittelwerte zu den
jeweiligen Messzeitpunkten getrennt nach Merkmal und Lagerungsart (K = Kühlschrank;
B = Brustschrank) verglichen.
Die allgemeinen Versuchsbedingungen (Hengst-, Saison- und Alterseinfluss sowie
Altersverteilung und Trächtigkeitsrate in den Gruppen) wurden hinsichtlich der Unterschiede
in der Häufigkeitsverteilung mit dem Fisher’s-Exact-Test analysiert.
Bei der Auswertung der Befunde der klinisch-gynäkologischen Untersuchung wurden mit
dem Wilcoxon-Two-Sample-Test und dem Kruskal-Wallis-Test jeweils die Messwerte des
endometrialen Ödems zu einem Zeitpunkt (z.B. die Probe zum Zeitpunkt der hCGApplikation, Et1) zweier Gruppen (Vergleich Gruppe 1 mit Gruppe 2, Gruppe 1 mit Gruppe 3
und Gruppe 2 mit Gruppe 3) miteinander verglichen. Der Tukey’s-Studentized-Range-Test
(HSD) und der t-Test (LSD) wurden zum Vergleich der 3 Gruppen miteinander zwischen den
Mittelwerten
der
Messzeitpunkten
Messwerte
eingesetzt.
des
Zur
endometrialen
Beurteilung
53
Ödems
eventueller
zu
den
verschiedenen
Unterschiede
in
der
MATERIAL UND METHODEN
Häufigkeitsverteilung hinsichtlich zwischen Behandlungsgruppe und Güstzeit diente der
Fisher’s-Exact-Test.
Die Ergebnisse der Proben der zytologischen Untersuchung wurden mit dem Tukey’sStudentized-Range-Test hinsichtlich eines Unterschiedes zwischen den Mittelwerten  der
jeweils 4 Messzeitpunkte der
3 Behandlungsgruppen analysiert. Außerdem wurden die
Unterschiede der neutrophilen-Granulozyten-Zahl zweier verschiedener Messzeitpunkte mit
dem gepaarten t-Test miteinander in Abhängigkeit von der Behandlungsgruppe verglichen.
Mittels einer einfaktoriellen Varianzanalyse (Prozedur GLM) wurde ein möglicher
Zusammenhang zwischen der Anzahl der neutrophilen Granulozyten (PMN) 48 Stunden nach
der Besamung (Ct4) und dem Trächtigkeitsergebnis überprüft.
Als statistisch signifikant wurde eine Irrtumswahrscheinlichkeit von P ≤ 0,05 festgelegt.
54
ERGEBNISSE
3.2 ERGEBNISSE
An der Studie waren 54 Stuten beteiligt, die den gleichen Auswahlkriterien unterstanden: Es
handelte sich um Warmblutstuten, die seit mindestens einem Jahr güst waren, somit schieden
grundsätzlich Maiden- und Fohlenstuten aus. Außerdem handelte es sich um Tiere, die in der
letzten Saison erfolglos künstlich besamt wurden, bei denen eine Neigung zu einer pPBE
bereits dokumentiert wurde und die klinisch allgemeingesund waren. Diese Stuten wurden
randomisiert auf die 3 Behandlungsgruppen autologes konditioniertes Serum (ACS),
Prednisolonacetat und Ringerlösung aufgeteilt und nach Ovulationsinduktion mit dem
verdünnten Frischsamen von 4 fruchtbaren Hengsten derselben Südoldenburgischen
Deckstation besamt. Der Einfluss des ACS auf den Ovulationszeitpunkt nach hCG-Injektion
und auf die Samenqualität des verdünnten Frischsamens wurde vor dem Beginn der Studie
überprüft.
Auf Grund der starken Eingrenzung der sich für die Studie qualifizierenden Stuten durch den
Ausschluss von Maiden- und Fohlenstuten, den genau definierten Vorbericht und die
Festlegung auf 4 spezielle Hengste konnte nur eine kleine Stutenpopulation mit jeweils
18 Tieren pro Behandlungsgruppe zusammengestellt werden.
Umso wichtiger war es, zu Beginn zu prüfen, ob auch weitere Ausgangsbedingungen eine
Homogenität aufwiesen, was bei der Analyse der allgemeinen Versuchsbedingungen
hinsichtlich des Hengst-, Saison-, Alterseinflusses und der Altersverteilung in den Gruppen
und der Trächtigkeitsrate ausgewertet wurde.
Im Anschluss daran wurden die Resultate der zytologischen Untersuchung beurteilt.
55
ERGEBNISSE
3.2.1 Vorversuche
3.2.1.1 Einfluss der intrauterinen ACS-Gabe auf den Ovulationszeitpunkt parallel zur
intravenösen hCG-Injektion
Um festzustellen, ob die intrauterine Verabreichung des ACS parallel zur hCG-Gabe einen
Einfluss auf den Ovulationszeitpunkt ausübt, wurden wie in Kapitel 3.1.1.2 („Vorversuche“)
geschildert 3 Stuten in jeweils 3 aufeinander folgenden Zyklen untersucht. Dabei muss jedoch
kritisch angemerkt werden, dass eine Auswertung von insgesamt 9 Zyklen von 3 Stuten nur
eine Tendenz andeutet und nicht den Anspruch auf statistische Evidenz erheben kann.
Darüber hinaus wurden keine Kontrollzyklen ohne ACS-Gabe überwacht. Es konnte sowohl
mittels des Student’s t-Tests (t) als auch durch den Wilcoxon Signed Rank Test (S)
festgestellt
werden,
dass
die
ACS-Gabe
keinen
signifikanten
Einfluss
auf
den
Ovulationszeitpunkt hat (P (t) = 0,74; P(S) = 0,91). Der Mittelwert  betrug 50,67 ±
23,07 Stunden, der Median M lag bei 48 Stunden, die maximale Zeit bis zur Ovulation war
96 Stunden, die minimale Dauer von der hCG-Applikation bis zur Ovulation betrug
24 Stunden. In Abbildung 1 (detaillierte Messwerte siehe Tabellenanhang Tabelle 1) werden
die Ergebnisse der insgesamt 9 Zyklen nach den jeweiligen Stuten aufgeschlüsselt dargestellt.
56
ERGEBNISSE
Abbildung 1: Graphische Darstellung des Ovulationszeitpunktes nach der parallelen
Verabreichung von 2500 I.E. hCG (intravenös) und 4 ml ACS (intrauterin) an Stuten in
3 Rosseperioden
(ACS = autologes konditioniertes Serum; hCG = humanes Choriongonadotropin)
Da durch ACS die Ovulation nicht verhindert und der Zeitraum zwischen der intravenösen
Verabreichung von hCG und dem Ovulationszeitpunkt des dominanten Follikels nicht über
48 Stunden post injectionem verlängert zu werden schien, wurde die erste von zwei geplanten
intrauterinen ACS-Applikationen parallel zur hCG-Gabe durchgeführt.
3.2.1.2 Beurteilung des ACS-Einflusses auf die Samenqualität des verdünnten
Frischsamens der Hengste
3.2.1.2.1 Einfluss des ACS auf die Morphologie und den Anteil toter Spermien des
verdünnten Frischsamens
Vorweg ist kritisch anzumerken, dass durch den sehr kleinen Umfang statistischer Einheiten
(3 Hengste mit jeweils 3 Ejakulaten) die Wertigkeit der Ergebnisse der Tests fraglich ist. Da
es sich jedoch um Vorversuche handelte, sollte auch zumindest eine tendenzielle
57
ERGEBNISSE
Einschätzung der Wirkungsweise des autologen konditionierten Serums (ACS) dokumentiert
und für dessen optimalen Einsatzzeitpunkt in der Hauptstudie genutzt werden. Zur
Beurteilung eines möglichen Unterschiedes zwischen den Hengsten wurden der WilcoxonTest bzw. der Kruskal-Wallis-Test mit dem Mittelwerten der Messwerte (Merkmal 1 = Anteil
toter Spermien in der Nigrosin-Eosin-Färbung, vgl. Tabelle 2 (Tabellenanhang) und
Abbildung 5; Merkmal 2 = Anteil veränderter Spermien in der Spermac Stain™-Färbung, vgl.
Tabelle 3 (Tabellenanhang) und Abbildung 6) durchgeführt. Dabei deutete sich außer bei dem
Mittelwert der Probe „verdünnter Frischsamen mit 4 ml ACS“ 24 Stunden nach ACS-Zugabe
und Brutschranklagerung (P = 0,05) zu keinem Zeitpunkt ein signifikanter Unterschied an.
Hengst 1 wies einen Wilcoxon-Score-Wert (Rangsumme) von 13, Hengst 2 von 8 und Hengst
3 von 24 auf. Auf Grund des sehr geringen Umfanges an statistischen Einheiten ist dieser
Ausnahme wahrscheinlich keine entscheidende Bedeutung beizumessen.
Abbildung 5: Graphische Darstellung der in Tabelle 2 (Tabellenanhang) detailliert
aufgeführten Messwerte des Anteils toter Spermien in Prozent (Mittelwert aus 9
verschiedenen Ejakulaten) in der Nigrosin-Eosin-Färbung (Merkmal 1 = M 1), getrennt nach
Probenansatz bei Kühlschrank- und Brutschranklagerung (Kühlschrank = K; Brutschrank =
B)
sowie
nach
Verdünnungsstufe
mit autologem konditionierten Serum (ACS)
Portion verdünnter Frischsamen mit 4 ml ACS = A; Portion verdünnter Frischsamen mit 0,4 ml ACS = B;
Portion verdünnter Frischsamen ohne Zusatz = C; gemessen zu den Messzeitpunkten direkt nach Probenansatz
(Zeitpunkt 0 = t0) und 24 Stunden später (Zeitpunkt 24 Stunden = t24)
58
ERGEBNISSE
Bezogen auf die Gesamtpopulation (hier 9 Ejakulate von 3 Hengsten; cave: eigentlich handelt
es sich nur um 3 statistische Einheiten) wurden mit dem t-Test die Differenzen der
Mittelwerte zu den jeweiligen Messzeitpunkten getrennt nach Merkmal und Schranktyp
verglichen. Dabei fiel auf (siehe Abbildung 5 und 6), dass sowohl die Lagerungsart als auch
die Verdünnungsstufe mit ACS 24 Stunden nach Probenansatz Einfluss auf die
Spermienmorphologie und den Anteil toter Spermien nahmen: Je höher der Anteil an ACS in
der Probe war, desto höher war auch der Anteil an toten (Tabelle 2 im Tabellenanhang) bzw.
veränderten Spermien (Tabelle 3 im Tabellenanhang). Erwartungsgemäß zeichnete sich ein
ebenfalls negativer Einfluss auf die Morphologie und den Anteil der toten Spermien bei
Brutschranklagerung im Vergleich zu den gekühlten Proben ab (siehe Tabelle 2 und 3 im
Tabellenanhang). Die Verschlechterung der Samenmorphologie und die erhöhten Anzahl toter
Spermien durch Zusatz von ACS wird bei den kühl gelagerten Proben deutlicher als bei den
Brutschrankansätzen (siehe Tabelle 1). In der Spermac Stain™-Färbung konnten nur in der
Gruppe
C
(Kühlschrank:
nahezu
16
identische
%,
Anteile
veränderter
Brutschrank
59
15
Spermien
%
beobachtet
veränderte
werden
Spermien).
ERGEBNISSE
Abbildung 6: Graphische Darstellung der in Tabelle 3 (Tabellenanhang) detailliert
aufgeführten Messwerte des Anteils veränderter Spermien in Prozent (Mittelwert aus 9
verschiedenen Ejakulaten von 3 Hengsten) in der Spermac Stain™-Färbung (Merkmal 2 = M
2), getrennt nach Probenansatz bei Kühlschrank- und Brutschranklagerung (Kühlschrank = K;
Brutschrank = B) sowie nach Verdünnungsstufe mit autologem konditionierten Serum (ACS)
Portion verdünnter Frischsamen mit 4 ml ACS = A; Portion verdünnter Frischsamen mit 0,4 ml ACS = B;
Portion verdünnter Frischsamen ohne Zusatz = C; gemessen zu den Messzeitpunkten direkt nach Probenansatz
(Zeitpunkt 0 = t0) und 24 Stunden später (Zeitpunkt 24 Stunden = t24)
Tabelle 1: Auswertung des Einflusses des autologen konditionierten Serums (ACS) auf die
Samenmorphologie in vitro: Prävalenzen der Unterschiede zwischen den Gruppen, aufgeteilt
nach Verdünnungsstufe mit autologem konditionierten Serum (ACS)
Differenzen
zwischen den
Gruppen zum
Messzeitpunkt t
Anteil toter Spermien/morphologische Merkmale
M1K
M1B
M2K
M2B
ABt24
0,06
0,06
**
0,06
ACt24
***
*
***
*
BCt24
**
*
**
*
Portion verdünnter Frischsamen mit 4 ml ACS = A; Portion verdünnter Frischsamen mit 0,4 ml ACS = B;
Portion verdünnter Frischsamen ohne Zusatz = C; getrennt nach Anteil toter Spermien in der Nigrosin-EosinFärbung (Merkmal 1 = M 1) und Anteil veränderter Spermien in der Spermac Stain™-Färbung (Merkmal 2 =
M 2) sowie nach Probenansatz bei Kühlschrank- und Brutschranklagerung (Kühlschrank = K; Brutschrank = B)
zum Messzeitpunkt 24 Stunden nach Probenansatz (t24)
* = P ≤ 0,05; ** = P ≤ 0,01; *** = P ≤ 0,001
60
ERGEBNISSE
3.2.1.2.2 Einfluss des ACS auf die Motilität des verdünnten Frischsamens
Mit dem Wilcoxon-Test für die gepaarte Beobachtung unabhängiger Stichproben bzw. dem
Kruskal-Wallis-Test wurden die Mittelwerte der verschiedenen Messzeitpunkte der jeweils
drei Ejakulate gebildet und zwischen den drei Hengsten getrennt nach Aufbewahrungsart
(K = Kühlschrank;
B
=
Brustschrank)
verglichen.
Dabei
wurde
sowohl
die
Vorwärtsbeweglichkeit (Merkmal 3 = M 3) als auch die Gesamtbeweglichkeit der Spermien
(Merkmal 4 = M 4) in Prozent als Merkmal erfasst. Bei diesem Vergleich der Hengste
untereinander war zu keinem Zeitpunkt ein Hinweis auf signifikante Unterschiede
festzustellen. Aus diesem Grund wurden die jeweils 3 Ejakulate der 3 Hengste zu einer
Gesamtpopulation von n = 9 zur Auswertung der Motilität zusammengelegt. Es wurden mit
dem t-Test die Differenzen der Mittelwerte zu den jeweiligen Messzeitpunkten getrennt nach
Merkmal und Schranktyp verglichen. Hier sollte ebenfalls lediglich begutachtet werden, ob
das autologe konditionierte Serum tendenziell einen Einfluss auf die Samenqualität hat.
Dabei galt genauso wie bei der Beurteilung der morphologischen Ergebnisse (Kapitel
„3.2.1.1 Einfluss des ACS auf die Morphologie und den Anteil toter Spermien des verdünnten
Frischsamens“), dass der Umfang der statistischen Einheiten sehr gering und darum die
Aussagekraft beschränkt bzw. vorsichtig zu bewerten war.
61
ERGEBNISSE
Abbildung 7: Graphische Darstellung der in Tabelle 4 (Tabellenanhang) detailliert
aufgeführten Messwerte des Anteils vorwärtsbeweglicher Spermien in Prozent (Mittelwert
aus 9 verschiedenen Ejakulaten von 3 Hengsten) (Merkmal 3 = M 3), getrennt nach
Probenansatz bei Kühlschrank- und Brutschranklagerung (Kühlschrank = K; Brutschrank =
B)
sowie
nach
Verdünnungsstufe
mit
autologem konditionierten Serum (ACS)
Portion verdünnter Frischsamen mit 4 ml ACS = A; Portion verdünnter Frischsamen mit 0,4 ml ACS = B;
Portion verdünnter Frischsamen ohne Zusatz = C; gemessen zu den Messzeitpunkten eine halbe Stunde
(Zeitpunkt 05 = t05), 2 Stunden (t2), 4 Stunden (t4), 8 Stunden (t8) und 24 Stunden nach Probenansatz (t24)
Wie in Abbildung 7 und 8 graphisch veranschaulicht, schien das autologe konditionierte
Serum in dem am höchsten konzentrierten Probenansatz (1 Portion FS mit 4 ml ACS), der der
in der Studie verwendeten Menge an ACS pro Behandlung entspricht, einen negativen
Einfluss auf die Motilität der Spermien zu haben. Dieses Phänomen war, wie zuvor bei der
morphologischen Auswertung bereits angesprochen, bei den Kühlschrankproben deutlicher zu
verzeichnen als beim Brutschrankansatz. Die Verdünnung des Frischsamens mit 0,4 ml ACS
unterschied sich wiederum kaum merklich von der Probe ohne Zusatz (siehe auch Tabelle 4
und 5 im Tabellenanhang).
62
ERGEBNISSE
Abbildung 8: Graphische Darstellung der in Tabelle 5 (Tabellenanhang) detailliert
aufgeführten Messwerte des Anteils gesamtbeweglicher Spermien in Prozent (Mittelwert aus
9 verschiedenen Ejakulaten von 3 Hengsten) (Merkmal 4 = M 4), getrennt nach Probenansatz
bei Kühlschrank- und Brutschranklagerung (Kühlschrank = K; Brutschrank = B) sowie nach
Verdünnungsstufe mit autologem konditionierten Serum (ACS)
Portion verdünnter Frischsamen mit 4 ml ACS = A; Portion verdünnter Frischsamen mit 0,4 ml ACS = B;
Portion verdünnter Frischsamen ohne Zusatz = C) zu den Messzeitpunkten eine halbe Stunde (Zeitpunkt 05 =
t05), 2 Stunden (t2), 4 Stunden (t4), 8 Stunden (t8) und 24 Stunden nach Probenansatz (t24)
63
ERGEBNISSE
Tabelle 2: Auswertung des Einflusses des autologen konditionierten Serums (ACS) auf die
Samenmotilität in vitro: Prävalenzen der Unterschiede zwischen den Gruppen (aufgeteilt nach
Verdünnungsstufe mit autologem konditionierten Serum (ACS)
Differenzen
zwischen den
Gruppen zu den
Messzeitpunkten t
Motilitätsmerkmale
M3K
M3B
M4K
M4B
ABt05
**
*
**
0,08
ACt05
*
*
**
0,07
BCt05
0,10
*
0,08
0,35
ABt2
**
**
*
*
ACt2
**
***
*
**
BCt2
0,08
0,1
*
0,1
ABt4
***
**
**
**
ACt4
***
**
**
*
BCt4
0,07
**
0,07
*
ABt8
***
0,2
**
*
ACt8
***
0,06
**
*
BCt8
*
0,17
0,22
0,06
ABt24
***
-
***
0,35
ACt24
***
-
***
0,35
BCt24
**
-
0,2
0,35
Portion verdünnter Frischsamen mit 4 ml ACS = A; Portion verdünnter Frischsamen mit 0,4 ml ACS = B;
Portion verdünnter Frischsamen ohne Zusatz = C) getrennt nach Anteil vorwärtsbeweglicher Spermien
(Merkmal 3 = M 3) und Anteil gesamtbeweglicher Spermien (Merkmal 4 = M 4) sowie nach Probenansatz bei
Kühlschrank- und Brutschranklagerung (Kühlschrank = K; Brutschrank = B) zu den Messzeitpunkten eine halbe
Stunde (Zeitpunkt 05 = t05), 2 Stunden (t2), 4 Stunden (t4), 8 Stunden (t8) und 24 Stunden nach Probenansatz
(t24)
* = P ≤ 0,05; ** = P ≤ 0,01; *** = P ≤ 0,001; - = keine Differenz
64
ERGEBNISSE
Auf Grund des tendenziell negativen Einflusses des ACS auf die Samenqualität
(vgl. Tabelle 2) wurde der Zeitpunkt für die zweite intrauterine Behandlung der Stuten mit
dem Serum nicht parallel zur künstlichen Besamung, sondern erst 4 bis 6 Stunden post
inseminationem gewählt. Diese Maßnahme sollte für Chancengleichheit hinsichtlich einer
erfolgreichen Befruchtung der Stuten in der Behandlungsgruppe „ACS“ im Vergleich zu den
anderen beiden Gruppen sorgen.
65
ERGEBNISSE
3.2.2 Auswertung der allgemeinen Versuchsbedingungen
3.2.2.1 Einfluss des Hengstes auf das Trächtigkeitsergebnis
Wegen der oben geschilderten, strengen Auswahlkriterien für die zur Teilnahme an der Studie
zugelassenen Stuten musste mit dem verdünnten Frischsamen von insgesamt 4 verschiedenen
Hengsten gearbeitet werden, um eine akzeptable Stutenanzahl pro Behandlungsgruppe zu
erlangen. Da bei der Auswahl des Hengstes für die beteiligten Stuten der Besitzerwunsch
ausschlaggebend war, konnte keine vollkommen gleichmäßige Verteilung der 4 Hengste auf
die 54 Stuten erreicht werden. Zum Ausschluss eines direkten Hengsteinflusses wurde der
Zusammenhang zwischen Hengst und Trächtigkeitsergebnis überprüft (vgl. Tabelle 3).
Tabelle 3: Zusammenhang zwischen Hengst und Trächtigkeitsergebnis nach der Besamung
Stuten
n/%
TU positiv
n/%
TU negativ
n/%
Hengst 1
16 / 29,63 %
4 / 25 %
12 / 75 %
Hengst 2
13 / 24,07 %
4 / 30,77 %
9 / 69,23 %
Hengst 3
10 / 18, 52 %
3 / 30 %
7 / 70 %
Hengst 4
15 / 27,78 %
2 / 13,33 %
13 / 86,67 %
gesamt
54 / 100 %
13 / 24,07 %
41 / 75,93 %
TU = Ergebnis der Trächtigkeitsuntersuchung zwischen Tag 15 und 18 post ovulationem
Hengst 1 erhielt insgesamt 16 Stuten, von denen 4 Stuten tragend (Trächtigkeitsuntersuchung
zwischen Tag 15 und Tag 18 post ovulationem (TU) positiv) wurden und 12 güst blieben (TU
negativ) Das Verhältnis von tragenden zu güsten Stuten war 1 : 3 Tiere. Der verdünnte
Frischsamen (FS) des 2. Hengstes wurde für insgesamt 13 Stuten verwendet (4 Tiere TU
66
ERGEBNISSE
positiv, 9 Tiere TU negativ; Verhältnis 1 : 2,25). Der 3. Hengst erhielt die wenigsten Stuten
mit insgesamt 10 Tieren (3 Tiere TU positiv, 7 Tiere TU negativ; Verhältnis 1 : 2,33) und der
4. Hengst hatte 15 Stuten (2 Tiere TU positiv, 13 Tiere TU negativ; Verhältnis 1 : 6,5).
Mit dem Fisher’s-Exact-Test konnte kein signifikanter Einfluss zwischen der Wahl des
Hengstes und dem Trächtigkeitsergebnis beobachtet werden (P = 0,71).
Auf Grund dieser Erkenntnis wurden bei den folgenden Untersuchungen die einzelnen
Versuchsgruppen der vier Hengste zu je einer großen Gruppe zusammengelegt.
3.2.2.2 Saisoneller Einfluss auf das Trächtigkeitsergebnis
Die Studie wurde Anfang März der Zuchtsaison 2011 begonnen und Ende August 2011
abgeschlossen. Es wurden 54 Stuten in jeweils einer Rosse mit je einer Portion verdünntem
Frischsamen terminiert besamt. Dabei wurden im März die wenigsten und im August die
meisten Stuten besamt. Dies lässt sich durch den vermehrten Stutenzulauf zum Ende der
Saison erklären, als die Bereitschaft als „Ultima Ratio an einer Studie teilzunehmen“ deutlich
größer war als zu Beginn der Zuchtperiode (vgl. Tabelle 4). Im Juni waren mit 12,5 % (1/7)
die wenigsten tragenden Stuten zu beobachten. Die höchste Trächtigkeitsrate war im März
mit 75 % (3/4) zu verzeichnen, wobei im Vergleich der Monate April bis August mit März
mittels des Fisher’s-Exact-Test kein signifikanter Unterschied nachgewiesen werden konnte
(Vergleich März/April P = 0,19; Vergleich März/Mai P = 0,12; Vergleich März/Juni P = 0,07;
Vergleich März/Juli P =.0,08; Vergleich März/August P = 0,1). Auch bei Betrachtung aller
Versuchsmonate konnte mit dem Fisher’s-Exact-Test kein signifikanter Zusammenhang
zwischen dem Besamungsmonat und dem Trächtigkeitsergebnis hergestellt werden
(P = 0,34), was allerdings wegen der nur geringen Versuchstierzahl pro Monat vorsichtig zu
bewerten ist.
67
ERGEBNISSE
Tabelle 4: Einfluss des Besamungsmonats auf das Trächtigkeitsergebnis nach Besamung
Besamungsmonat
TU
März
positiv
April
Mai
Juni
Juli
August
Stuten (n)
3 23 %
1 7,5 %
3 23 %
1 7,5 %
2 16 %
3 23 %
13
75 %
17 %
25 %
12,5 %
18 %
23 %
24 %
5 12 %
9 22 %
7 17 %
9 22 %
10 25 %
41
25 %
83 %
75 %
87,5 %
82 %
77 %
76 %
4 7%
6 11 %
12 22 %
8 15 %
11 21 %
13 24 %
54
100 %
100 %
100 %
100 %
100 %
100 %
100 %
negativ 1 2 %
gesamt
gesamt
Stuten (n)
100%
100 %
100 %
TU = Ergebnis der Trächtigkeitsuntersuchung zwischen Tag 15 und 18 post ovulationem; Prozentangaben
vertikal = Anteil bezogen auf die Anzahl der untersuchten Stuten im jeweiligen Monat; Prozentangaben
horizontal = Anteil bezogen auf die Gesamtzahl der untersuchten Stuten
3.2.2.3 Einfluss des Stutenalters auf das Trächtigkeitsergebnis
Das Alter der untersuchten Stuten lag zwischen 7 und 30 Jahren. Bei der Aufteilung der
Stuten in 3 Altersgruppen waren 44 % (24/54) zwischen 7 und 13 Jahren alt, zu der Gruppe
der 14- bis 20-Jährigen gehörten 37 % (20/54) und 19 % der Stuten (10/54) waren 21 Jahre
und älter. Das mittlere Alter betrug  = 14,72 Jahre, wobei der Median M bei 14 Jahren
anzusiedeln war.
Bei den 7- bis 13-jährigen Stuten wurden 29 % (7/24), von den 14- bis 20-jährigen Tieren
25 % (5/20) und bei den 21 bis 30 Jahre alten Tieren nur noch 10 % (1/10) tragend. Zwischen
den ersten beiden Altersgruppen und der Gruppe der Überzwanzigjährigen lag ein
tendenzieller Unterschied hinsichtlich der Trächtigkeitsrate zu Gunsten der „jüngeren bis
mittelalten“ Tiere, weshalb sich ein Zusammenhang zwischen dem Alter der Stuten und der
positiven Trächtigkeitsuntersuchung angenommen werden kann.
Bei Aufteilung der Gesamtpopulation am Median M (14 Jahre) konnten identische Anteile der
jeweiligen Gruppe an tragenden Stuten beobachtet werden (Tabelle 5). Dies lässt sich durch
68
ERGEBNISSE
die Gruppe der 14-jährigen Stuten erklären: Insgesamt 5 Stuten waren 14 Jahre alt und keine
einzige
verzeichnete
ein
positives
Trächtigkeitsergebnis.
Dadurch
wurde
die
Trächtigkeitsrate, die in der Gruppe der 7- bis 13-jährigen Tiere immerhin noch bei 29 %
(7/24) lag, auf 24 % (7/29) gesenkt. Indem die 14-jährigen Stuten aus der ursprünglichen
Gruppe der 14- bis 20-jährigen mit einer Trächtigkeitsrate von 25 % (5/20) entfernt wurden,
konnte selbst eine Verbindung mit der Gruppe der Überzwanzigjährigen mit nur 10 %
tragenden Stuten (1/10) der durchschnittlichen Trächtigkeitsrate der Übervierzehnjährigen
von 24 % (6/25) im Vergleich zu den 14 Jahre alten und jüngeren Stuten keinen Abbruch tun.
Tabelle 5: Zusammenhang zwischen Alter und Trächtigkeitsergebnis nach Besamung
Stuten
TU
Altersgruppe
≤ 14 Jahre
n/%
Stuten
gesamt
n/%
> 14 Jahre
n/ %
negativ
22
76 %
54 %
19
76 %
46 %
41
76 %
100 %
positiv
7
24 %
54 %
6
24 %
46 %
13
24 %
100 %
gesamt
29
100 %
54 %
25
46 %
100 %
54
100 %
100 %
TU = Ergebnis der Trächtigkeitsuntersuchung zwischen Tag 15 und 18 post ovulationem; Prozentangaben
vertikal = Anteil bezogen auf die Anzahl der untersuchten Stuten der jeweiligen Altersgruppe; Prozentangaben
horizontal = Anteil bezogen auf die Gesamtzahl der untersuchten Stuten
69
ERGEBNISSE
3.2.2.4 Homogenität der Gruppen (ACS, Prednisolonacetat, Ringer-Lösung) hinsichtlich
der Altersverteilung
Die insgesamt 54 Versuchstiere wurden randomisiert auf die drei verschiedenen
Behandlungsgruppen verteilt, d.h. jede Gruppe enthielt 18 Stuten.
Dabei lag das Alter der Tiere in Gruppe 1 (autologes konditioniertes Serum, ACS) zwischen
7 und 30 Jahren, der Mittelwert betrug  = 14,39 Jahre, der Median M lag bei 13 Jahren. In
Gruppe 2 (Prednisolonacetat) war die jüngste Stute 9, die älteste Stute 24 Jahre alt. Das
mittlere Alter  siedelte sich bei 14,61 Jahren an, der Median M bei 14 Jahren. Gruppe 3
(Ringer-Lösung) wurde durch Stuten im Alter zwischen 7 und 26 Jahren repräsentiert. Das
durchschnittliche Alter war  = 14,67 Jahre und der Median M = 15,5 Jahre.
Damit konnte eine sehr homogene Altersverteilung sowohl im Vergleich der 3 Gruppen
miteinander (vgl. Tabellen 6 und 7), als auch wenn man diese jeweils dem mittleren Alter  =
14,72 Jahre und dem Median M bei 14 Jahren der Gesamtpopulation gegenüberstellt,
beobachtet werden.
Tabelle 6: Häufigkeitsverteilung zwischen Behandlungsgruppen und Altersgruppen
Behandlungsgruppe
Stuten (n)
Alter
ACS
Prednisolonacetat
Ringer-Lösung
gesamt
Stuten
(n)
≤ 14 Jahre
11
61 %
38 %
10
56 %
35 %
8
44%
27 %
29
100 %
54 %
> 14 Jahre
7
39 %
28 %
8
44%
32 %
10
56 %
40 %
25
100 %
46 %
gesamt
18
100 %
33,3%
18
100%
33,3 %
18
33,3 %
100 %
54
100 %
100 %
ACS = autologes konditioniertes Serum; Prozentangaben vertikal = Anteil bezogen auf die Anzahl der
untersuchten Stuten der jeweiligen Behandlungsgruppe; Prozentangaben horizontal = Anteil bezogen auf die
Gesamtzahl der untersuchten Stuten
70
ERGEBNISSE
Tabelle 7: Häufigkeitsverteilung zwischen Behandlungsgruppe und Alter in Jahren
Alter
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
24
25
26
30
gesamt
ACS
3
2
2
0
1
1
0
2
2
0
0
0
0
0
1
0
1
1
2
Behandlungsgruppe
Stuten (n)
Prednisolonacetat
0
0
4
1
0
1
1
3
1
1
1
1
1
1
1
1
0
0
0
Ringer
2
1
2
1
1
1
0
0
1
3
0
2
0
1
1
0
1
1
0
gesamt
Stuten (n)
5
3
8
2
2
3
1
5
4
4
1
3
1
2
3
1
2
2
2
18
18
18
54
ACS = autologes konditioniertes Serum; Ringer = Ringer-Lösung
3.2.2.5 Vergleichbarkeit der Gruppen hinsichtlich der Trächtigkeitsrate
In
Tabelle
8
ist
die
Häufigkeitsverteilung
3 Versuchsgruppen aufgetragen:
71
der
Trächtigkeitsrate
für
jede
der
ERGEBNISSE
Tabelle 8: Häufigkeitsverteilung zwischen Behandlungsgruppe und Trächtigkeitsergebnis
TU
Behandlungsgruppe
positiv
gesamt
Stuten (n)
negativ
ACS
3
23 %
17 %
15
37 %
83 %
18
33,3 %
100%
Prednisolonacetat
3
23%
17 %
15
37 %
83 %
18
33,3 %
100%
Ringer-Lösung
7
54 %
39 %
11
26 %
61 %
18
33,3 %
100%
gesamt
13
100 %
24 %
41
100 %
76 %
54
100 %
100 %
TU = Trächtigkeitsuntersuchung zwischen Tag 15 und 18 post ovulationem; ACS = autologes konditioniertes
Serum; Prozentangaben vertikal = Anteil bezogen auf die Anzahl der untersuchten Stuten getrennt nach Ergebnis
der TU; Prozentangaben horizontal = Anteil bezogen auf die Gesamtzahl der untersuchten Stuten
Behandlungsgruppe 1 (autologes konditioniertes Serum) und 2 (Prednisolonacetat) wiesen
hinsichtlich der Anzahl tragender Stuten identische Werte auf (17 %; 3/18), wohingegen die
Placebo-Gruppe (Ringer-Lösung) eine Trächtigkeitsrate von 39 % (7/18) verzeichnen konnte.
Mit dem Fisher’s-Exact-Test konnte jedoch kein signifikanter Zusammenhang zwischen der
Trächtigkeitsrate und der jeweiligen Gruppe beobachtet werden (P = 0,24).
Als Besonderheit der Gruppe 1 war jedoch anzumerken, dass jede der 3 Fruchtanlagen zum
Zeitpunkt der Trächtigkeitsuntersuchung (TU) für ihr Alter zu klein war und zwischen Tag 18
und 25 post ovulationem (p.o.) resorbiert wurde: Bei der ersten Stute (Versuchstiernummer
13) wurde die TU am Tag 18 nach dem Eisprung durchgeführt und eine 22 mm große
Fruchtanlage (zwischen Tag 17 und 26 zu erwartender Durchmesser der Fruchtanlage: 25 bis
28 mm, HOFFMANN et al. 2005) beobachtet, die am Tag 21 p.o. ebenso groß und am Tag 25
p.o. nicht mehr bei der transrektalen ultrasonographischen Untersuchung darstellbar war. Bei
Versuchstier 25 wurde die TU am Tag 16 p.o. durchgeführt und der Diameter der
Fruchtanalage mit 18 mm dokumentiert (zwischen 15 und 16 zu erwartender Durchmesser der
Fruchtanlage: 22 bis 24 mm, HOFFMANN et al. 2005), am 19. Tag p.o. war die Fruchtanlage
nur noch 16 mm groß und am Tag 25 p.o. konnten keine Anzeichen einer Trächtigkeit mehr
72
ERGEBNISSE
nachgewiesen werden. Die Stute mit der Versuchstiernummer 42 wurde auf Grund einer
Doppelovulation bereits am Tag 15 p.o. auf Trächtigkeit untersucht. Dabei maß die
Fruchtanlage 18 mm im Diameter. Am 18. Tag p.o. war diese nur unwesentlich größer
geworden (19 mm im Durchmesser) und am Tag 25 war keine Fruchtanalage mehr
ultrasonographisch darstellbar.
3.2.2.6 Ergebnisse der klinisch-gynäkologischen Untersuchung
Bevor die klinisch-gynäkologische Eingangsuntersuchung durchgeführt wurde, galt es, einen
ausführlichen
gynäkologischen
Vorbericht
zu
erheben
(siehe
Kapitel
„3.1.1.4 Versuchsablauf“). Dabei flossen die erhobenen Daten über die Güstzeit (Zeitraum
zwischen dem ersten erfolglosen Besamungsversuch und der Zuchtsaison 2011) und eine
eventuell durchgeführte Caslick-Scheidenplastik in die statistische Auswertung mit ein. Nach
Behandlungsgruppen aufgeschlüsselt ergab sich dabei folgendes Bild (siehe Tabelle 9):
Tabelle 9: Häufigkeitsverteilung zwischen Behandlungsgruppe und Güstzeit in Jahren
Güstzeit in
Jahren
1
2
3
4
5
6
10
12
gesamt
Behandlungsgruppe
Stuten (n tragend/n gesamt)
ACS
2/6
1/5
0/2
0/1
0/1
0/2
0/1
0/0
3/18
Prednisolonacetat
2/3
1/8
0/3
0/2
0/2
0/0
0/0
0/0
3/18
Ringer
5/7
1/5
0/2
1/1
0/1
0/0
0/1
0/1
7/18
gesamt
Stuten
(n tragend/
n gesamt)
9/16
3/18
0/7
1/4
0/4
0/2
0/2
0/1
13/54
ACS = autologes konditioniertes Serum; Ringer = Ringer-Lösung
73
ERGEBNISSE
Die Stuten, die mit autologem konditionierten Serum (ACS = Gruppe 1) behandelt wurden,
waren zwischen 1 und 10 Jahren güst. Dabei lag der Mittelwert  bei 2,89 Jahren, der Median
M bei 2 Jahren. Die Tiere der Prednisolonacetat-Gruppe (Gruppe 2) wiesen eine Güstzeit
zwischen 1 und 5 Jahren auf, wobei der Mittelwert  = 2,56 Jahre und der Median M, wie in
Gruppe 1, 2 Jahre betrug. Die Güstzeit der 3. Gruppe (Ringer-Lösung) variierte zwischen
1 und 12 Jahren. Die mittlere Zeitspanne zwischen erster erfolgloser Besamung und der
Zuchtsaison 2011  war 3 Jahre lang, der Median M war, wie bei den ersten beiden
Behandlungsgruppen bereits beobachtet, 2 Jahre. Es konnte demnach von einer großen
Homogenität der Häufigkeitsverteilung zwischen Behandlungsgruppe und Güstzeit der
Versuchstiere ausgegangen werden (vgl. Tabelle 10). Splittete man die Gesamtpopulation am
Median (2 Jahre) (vgl. Tabelle 11), so erkannte man mit dem Fisher’s-Exact-Test einen
signifikanten Unterschied (P = 0,02) zwischen der Trächtigkeitsrate der Stuten, die 2 Jahre
oder kürzer güst waren, und der der Stuten, die 3 Jahre und länger erfolglos belegt worden
waren. Etwa 63 % der Versuchsstuten waren zwischen 1 und 2 Jahren güst (92 % aller
tragenden Tiere stammten aus dieser Gruppe). Lediglich eine einzige Stute, die länger als
2 Jahre güst war, konnte ein positives Trächtigkeitsergebnis verzeichnen.
Tabelle 10: Häufigkeitsverteilung zwischen tragenden Tieren in den Behandlungsgruppen und
Güstzeitgruppen
Behandlungsgruppe
tragende Stuten (n)
Güstzeit
ACS
Prednisolonacetat
Ringer-Lösung
gesamt
tragende Stuten
(n)
≤ 2 Jahre
3
25 %
100 %
3
25 %
100 %
6
86 %
> 2 Jahre
0
0%
0
0%
0%
1
100 %
14 %
1
100 %
8%
23 %
7
54 %
100 %
13
100 %
100 %
gesamt
0%
3
23 %
100 %
3
100%
50 %
12
100 %
92 %
ACS = autologes konditioniertes Serum; Prozentangaben vertikal = Anteil bezogen auf die Anzahl der
untersuchten Stuten der jeweiligen Behandlungsgruppe; Prozentangaben horizontal = Anteil bezogen auf die
Gesamtzahl der untersuchten Stuten
74
ERGEBNISSE
Tabelle 11: Zusammenhang zwischen der Güstzeit
Trächtigkeitsuntersuchung bezogen auf die Gesamtpopulation
und
dem
positiv
≤ 2 Jahre
12
92,3 %
> 2 Jahre
1
7,7 %
gesamt
13
100%
der
gesamt
Stuten (n)
TU
Güstzeit
Ergebnis
negativ
35 % 22
53,7 %
65 % 34
63 %
100 %
5 % 19
46,3 %
95 % 20
37 %
100 %
76 % 54
100 %
100 %
24 % 41
100 %
TU = Trächtigkeitsuntersuchung zwischen Tag 15 und 18 post ovulationem; Prozentangaben vertikal = Anteil
bezogen auf die Anzahl der untersuchten Stuten getrennt nach dem Ergebnis der TU; Prozentangaben horizontal
= Anteil bezogen auf die Gesamtzahl der untersuchten Stuten
Zum Zeitpunkt der Eingangsuntersuchung war bei 13 Stuten, die in einer vorangegangenen
Saison
mit
einem
mangelhaften
Schamschluss
Typ
III
(vgl.
HANDLER 2005,
HEMBERG et al. 2005) aufgefallen waren, eine Scheidenplastik nach Caslick bereits
durchgeführt worden (vgl. Tabelle 12). Im Rahmen der Studie wurde keine Caslick-OP an
Stuten
mit
einem
mäßigen
HEMBERG et al. 2005)
Schamschluss
vorgenommen,
um
(Typ
II,
zusätzliche
vgl.
vgl.
HANDLER 2005,
Einflussfaktoren
auf
die
Trächtigkeitsrate zu minimieren. Zudem zeigten nur 3 Stuten (1 Stute aus Gruppe 1, 2 Stuten
aus Gruppe 3) einen mangelhaften Schamschluss vom Typ III, bei denen bislang keine
chirurgische Versorgung stattgefunden hatte.
75
ERGEBNISSE
Tabelle 12: Häufigkeitsverteilung zwischen Behandlungsgruppe und durchgeführter CaslickScheidenplastik
Behandlungsgruppe
Stuten (n tragend/ n gesamt)
gesamt
Stuten
(n tragend/n gesamt)
CaslickScheidenplastik
ACS
ja
1/6
0/4
0/3
1/13
nein
2/12
3/14
7/15
12/41
gesamt
3/18
3/18
7/18
13/54
Prednisolonacetat Ringer-Lösung
ACS =Autologes konditioniertes Serum; Ringer = Ringer-Lösung
Das endometriale Ödem wurde im Zuge der transrektalen Ultraschalluntersuchung des Uterus
zum Zeitpunkt der hCG-Applikation (Et1), 4 bis 6 Stunden (Et2), 24 Stunden (Et3) und
48 Stunden (Et4) nach der Besamung dokumentiert. Sobald ein dominanter Follikel von
mindestens 35 mm Durchmesser und zumindest ein geringgradiges endometriales Ödem
(nach McKINNON et al. 1987a und 1987b) beobachtet werden konnten, erfolgte die
intravenöse hCG-Applikation. Zu diesem Zeitpunkt zeigten 31 Stuten ein geringgradiges,
13 Stuten ein mittelgradiges und 10 Stuten ein hochgradiges endometriales Ödem.
Innerhalb der ersten 24 Stunden nach der Besamung (post inseminationem, p.i.) hatten
44 Stuten bereits ovuliert [13 Tiere bei der nachfolgenden Trächtigkeitsuntersuchung (TU)
tragend], die restlichen 10 Stuten hatten zwischen 24 und 48 Stunden p.i. ihren Eisprung
(keines der Tiere bei der nachfolgenden TU tragend, ACS: 3 Tiere; Prednisolonacetat: 5 Tiere,
Ringer-Lösung: 2 Tiere). Der Mittelwert des Ovulationszeitpunktes  nach hCG-Applikation
betrug bei Gruppe 1 und 2 (ACS bzw. Prednisolonacetat) 45 Stunden, bei Gruppe 3 (RingerLösung) 40 Stunden. Der Median M war bei allen 3 Gruppen 48 Stunden. Unabhängig von
der Behandlungsgruppe war die minimale Zeitspanne zwischen hCG-Gabe und Ovulation war
24 Stunden, die maximale 72 Stunden.
Das Ödem der Gebärmutterschleimhaut war 24 Stunden p.i. bei 11 Stuten (20 %) nicht mehr
vorhanden, bei 24 Stuten (44 %) geringgradig, bei 17 Stuten (32 %) mittelgradig und 2 Stuten
(4 %) hochgradig ausgebildet. Achtundvierzig Stunden nach der Besamung wiesen 27 Tiere
76
ERGEBNISSE
(50 %) kein, 21 Tiere (39 %) ein geringgradiges und 6 Tiere (11 %) ein mittelgradiges
endometriales Ödem auf. Zu diesem Zeitpunkt hatten alle Stuten ovuliert, wovon 42 Tiere
(78 %) keine, 7 Tiere (13 %) unter 2 cm Höhe und 5 Tiere (9 %) über 2 cm Höhe intrauterine
Flüssigkeit zeigten. Zu den Tieren mit mehr als 2 cm Flüssigkeitshöhe im Uterus gehörten
2 Tiere zu der Gruppe ACS, 1 Tier zu der Gruppe Prednisolonacetat und 2 Tiere zu der
Ringer-Lösung-Gruppe.
Bei der Beurteilung der im transrektalen Ultraschallbild dargestellten intrauterinen Flüssigkeit
galt eine Ansammlung von mehr als 2 cm Höhe für die Stuten als ein deutlicher Risikofaktor,
für eine pPBE empfänglich zu sein.
Mit dem Wilcoxon-Two-Sample-Test und dem Kruskal-Wallis-Test wurden jeweils die
Messwerte des endometrialen Ödems zu einem Zeitpunkt (z.B. die Probe zum Zeitpunkt der
hCG-Applikation, Et1) zweier Gruppen (Vergleich Gruppe 1 mit Gruppe 2, Gruppe 1 mit
Gruppe 3 und Gruppe 2 mit Gruppe 3) miteinander verglichen. Dabei konnte zu keinem
Zeitpunkt ein signifikanter Unterschied zwischen den Messwerten beobachtet werden (P von
0,22 bis 0,96). Es konnte mit dem Tukey’s-Studentized-Range-Test (HSD) und dem t-Test
(LSD) beim Vergleich der 3 Gruppen miteinander ebenfalls kein signifikanter Unterschied
zwischen den Mittelwerten der Messwerte des endometrialen Ödems zu den Messzeitpunkten
Et1 bis Et4 erfasst werden(t- und Tukey-Gruppierung in jedem Fall: A; Mittelwerte mit
demselben Buchstaben werden als nicht signifikant unterschiedlich angesehen). Somit hatte
die Art der Behandlung keinen Einfluss auf die Ausprägung des endometrialen Ödems.
3.2.3 Zytologische Auswertung
Die Auswertung der zytologischen Probenuntersuchung bezog sich zuerst auf den Vergleich
der Proben der Gesamtpopulation zu den verschiedenen Entnahmezeitpunkten (Cytobrush
zum Zeitpunkt x = Ct; Ct1 = Probe am Tag der hCG-Applikation; Ct2 = Probe 4 bis
6 Stunden post inseminationem, p.i.; Ct3 = Probe 24 Stunden p.i.; Ct4 = Probe 48 Stunden
p.i.). Danach wurde die jeweils erste mit der jeweils letzten Probe in den
3 Behandlungsgruppen verglichen. Anschließend wurde der Einfluss des autologen
konditionierten Serums auf das Ergebnis der zytologischen Untersuchung beleuchtet und
77
ERGEBNISSE
zuletzt ein möglicher Zusammenhang zwischen dem Ergebnis der zytologischen
Untersuchung und dem Trächtigkeitsergebnis untersucht. Die Grundlage der Beurteilung der
zytologischen Probenuntersuchung war das differenzierte Schema nach BROOK (1984), siehe
auch Kapitel 3.1.1.9.
Eine beobachtete Anzahl von 0 bis 5 PMN in 10 Gesichtsfeldern galt als negativ, wohingegen
mehr als 5 neutrophile Granulozyten als Anzeichen für eine entzündliche Reaktion des
Endometriums gewertet wurden.
3.2.3.1 Allgemeiner Vergleich der Ergebnisse der zytologischen Untersuchung zwischen
den einzelnen Gruppen (autologes konditioniertes Serum, Prednisolonacetat und
Ringer-Lösung)
Insgesamt wurden 216 Cytobrush-Proben entnommen. Pro Stute erfolgte je eine
Probenentnahme
zum
Zeitpunkt
der
intravenösen
hCG-Applikation
(Ct1),
dann
4 bis 6 Stunden nach der Besamung (Ct2), 24 (Ct3) und 48 Stunden post inseminationem
(Ct4). Mit dem Tukey’s-Studentized-Range-Test konnte kein signifikanter Unterschied
zwischen den Mittelwerten  der 4 Messzeitpunkte im Vergleich zwischen den
3 Behandlungsgruppen
festgestellt
werden
(vgl.
Tabelle
6
(Tabellenanhang)
und
Abbildung 9). Zu jedem der vier Messzeitpunkte wiesen die Mittelwerte  der
Versuchsgruppen ACS, Prednisolonacetat und Ringer-Lösung dieselbe Tukey-Gruppierung
mit dem Buchstaben A auf. Dabei gilt, dass Mittelwerte mit demselben Buchstaben sich nicht
signifikant unterscheiden.
78
ERGEBNISSE
Abbildung 9: Graphische Darstellung des Verlaufs der in Tabelle 6 (Tabellenanhang)
detailliert aufgeführten Mittelwerte  der Anzahl der neutrophilen Granulozyten (PMN) in
den zytologischen Proben bei 400-facher Vergrößerung in 10 zufällig ausgewählten
Gesichtsfeldern zu den verschiedenen Messzeitpunkten Ct1 bis Ct4 zwischen den
Behandlungsgruppen
ACS (n = 18), Prednisolonacetat (n = 18) und Ringer-Lösung (n = 18); ACS = Autologes konditioniertes Serum;
Ct1 = Probe am Tag der hCG-Applikation; Ct2 = Probe 4 bis 6 Stunden post inseminationem (= p.i.); Ct3 =
Probe 24 Stunden p.i.; Ct4 = Probe 48 Stunden p.i.
Vergleicht man allerdings die PMN-Zahl zweier verschiedener Messzeitpunkte mit dem
gepaarten
t-Test
miteinander,
so
unterscheiden
sich
diese unabhängig von
der
Behandlungsgruppe signifikant voneinander (Tabelle 13).
Von der ersten zytologischen Proben (parallel zur hCG-Gabe) bis zur zweiten Probe (4 bis
6 Stunden p.i.) vervielfachte sich die mittlere Anzahl der PMN bei Gruppe 1 (ACS) 7,8-fach,
bei Gruppe 2 (Prednisolonacetat) sogar 39,8-fach und bei Gruppe 3 (Ringer-Lösung)
13,5-fach (vergleiche Tabelle 6 im Tabellenanhang). Beim Vergleich der Mittelwerte ersten
und letzten zytologischen Probe (siehe Tabelle 6 im Tabellenanhang) ist die Anzahl der
neutrophilen Granulozyten 48 Stunden nach der Besamung bei den mit ACS behandelten
Tieren nur noch 1,7-mal höher, bei der Prednisolonacetat-Gruppe immerhin noch 9,8-fach
erhöht und bei einer Behandlung mit Ringer-Lösung 1,9-mal höher als zum Zeitpunkt der
intravenösen hCG-Applikation.
79
ERGEBNISSE
Tabelle 13: Zytologische Auswertung bei Trennung nach Gruppen:
Signifikante Unterschiede zwischen den einzelnen Messzeitpunkten
Differenzen
zwischen den
Messzeitpunkten
ACS
Prednisolonacetat
Ringer-Lösung
Ct1Ct2
***
***
***
Ct1Ct3
***
***
***
Ct1Ct4
**
**
**
Ct2Ct3
***
***
***
Ct2Ct4
***
***
***
Ct3Ct4
***
***
**
Behandlungsgruppen
Stuten (n) pro Behandlungsgruppe: n = 18; ACS = Autologes konditioniertes Serum; Ct1 = Probe am Tag der
hCG-Applikation Ct2 = Probe 4 bis 6 Stunden post inseminationem (= p.i.); Ct3 = Probe 24 Stunden p.i.; Ct4 =
Probe 48 Stunden p.i.; Beispiel: Ct1Ct2 = Differenz zwischen der Anzahl der neutrophilen Granulozyten zum
Zeitpunkt Ct1 und Ct2
* = P ≤ 0,05; ** = P ≤ 0,01; *** = P ≤ 0,001
Betrachtet man die in Tabelle 13 zusammengefassten Ergebnisse, so konnte unabhängig von
der Behandlungsgruppe eine hochsignifikant geringere Anzahl von PMN (P ≤ 0,001) vor der
Besamung (Ct1) im Vergleich zum Zeitpunkt 4 bis 6 Stunden nach der Besamung (Ct2)
beobachtet werden. Außerdem war ein hochsignifikanter Abfall (P ≤ 0,001) PMN-Zahl
während des Zeitfensters 4 bis 6 Stunden und 24 Stunden post inseminationem (p.i.) und auch
ein hochsignifikantes (Gruppe 1 und 2: P ≤ 0,001) bzw. signifikantes Absinken (Gruppe 3:
P ≤ 0,01) der neutrophilen Granulozyten zwischen 24 und 48 Stunden p.i. zu verzeichnen.
80
ERGEBNISSE
3.2.3.2 Vergleich der jeweils ersten und letzten zytologischen Probe in den Gruppen
Um von einer erfolgreichen Elimination der Entzündung post inseminationem (p.i.) sprechen
zu können, sollte die Anzahl der neutrophilen Granulozyten (PMN) in der zytologischen
Probe zum Zeitpunkt Ct4 (48 Stunden p.i.) bei maximal 5 PMN bei 400-facher Vergrößerung
in 10 zufällig ausgewählten Gesichtsfeldern liegen. Diesen als „negativ“ zu wertenden Status
wiesen zu Beginn des zytologischen Untersuchungszeitraumes, zum Zeitpunkt der hCGApplikation (Ct1) 74 % (40 / 54), zum Zeitpunkt der letzten Probenentnahme (Ct4) nur noch
26 % (14 / 54) der Stuten auf (s. Kapitel 3.2.3.4, Tabelle 15). Bei der zytologischen
Auswertung mit Trennung nach Gruppen wurden mittels des gepaarten t-Tests wurden
signifikante Unterschiede zwischen den Messzeitpunkten Ct1 und Ct4 beobachtet (P ≤ 0,01).
Dies deutete auf eine Verschiebung des Anteils „gesunder“ Stuten hin mit einer PMNZahl ≤ 5 bei 400-facher Vergrößerung in 10 zufällig ausgewählten Gesichtsfeldern zum
Zeitpunkt Ct1 (Tabelle 14) hin zu einem höheren Anteil an Stuten mit einem entzündlichen
intrauterinen Milieu (PMN > 5) zum Messzeitpunkt Ct4.
Tabelle 14: Häufigkeitsverteilung zwischen Behandlungsgruppen und der Anzahl der
neutrophilen Granulozyten (PMN) in der zytologischen Probe bei 400-facher Vergrößerung
in 10 zufällig ausgewählten Gesichtsfeldern zum Zeitpunkt Ct1 (hCG-Applikation)
Behandlungsgruppen
gesamt
Stuten (n)
Stuten (n)
PMN-Zahl
ACS
≤5
10
Prednisolonacetat
25%
55 %
>5
5*/8
18
40 %
89 %
57 %
45 %
gesamt
16
2*/2
100 %
18
14
35 %
78 %
14 %
11 %
33,3 %
Ringer-Lösung
2*/4
100 %
18
100 %
ACS = Autologes konditioniertes Serum
* = ≥ 50 PMN
81
100 %
74 %
29 %
22 %
33,3 %
40
9*/14
100 %
26 %
33,3 %
54
100 %
100 %
ERGEBNISSE
3.2.3.3 Einfluss des ACS auf das Ergebnis der zytologischen Untersuchung
Die in Tabelle 6 (Tabellenanhang) und Abbildung 9 veranschaulichten Daten der mittleren
Anzahl ( ± s) der neutrophilen Granulozyten (PMN) in den zytologischen Proben bei 400facher Vergrößerung in 10 zufällig ausgewählten Gesichtsfeldern zu den verschiedenen
Messzeitpunkten Ct1 bis Ct4 zwischen den Behandlungsgruppen zeigten zwar jeweils zu den
einzelnen Messzeitpunkten tendenziell höhere PMN-Zahlen in der Gruppe „Autologes
konditioniertes Serum“ im Vergleich zu den beiden anderen Gruppen, jedoch konnte mit dem
Tukey’s-Studentized-Range-Test kein signifikanter Unterschied nachgewiesen werden. Dies
führte zu der Annahme, dass die Behandlung der Stuten mit autologem konditioniertem
Serum keinen Einfluss auf das Ergebnis der zytologischen Untersuchung ausübt.
3.2.3.4 Zusammenhang zwischen dem Ergebnis der zytologischen Untersuchung und
dem Trächtigkeitsergebnis
Wie beim Vergleich der mittleren Anzahl ( ± s) der neutrophilen Granulozyten (PMN) in
den zytologischen Proben zu den verschiedenen Messzeitpunkten Ct1 bis Ct4 zwischen den
Behandlungsgruppen (siehe Kapitel 3.2.3.1, Tabelle 6 (Tabellenanhang) und Abbildung 9)
nachvollzogen werden konnte, zeigten die Stuten unabhängig von der Art der Behandlung
einen sehr ähnlichen Verlauf der PMN-Zahl über den gesamten Untersuchungszeitraum. Von
besonderem Interesse war mit Blick auf das Ergebnis der Trächtigkeitsuntersuchung die
zuletzt entnommene zytologische Probe (Ct4, 48 Stunden post inseminationem), die Auskunft
über eine bewältigte oder noch vorhandene Entzündungsreaktion im Uterus geben sollte. Mit
Bezug auf das differenzierte Schema nach BROOK (1984) (siehe auch Kapitel 3.1.1.9)
konnte nur etwa ein Viertel der Stuten (siehe Tabelle 15) ein negatives Ergebnis der
zytologischen Untersuchung (weniger als oder 5 neutrophile Granulozyten bei 400-facher
Vergrößerung in 10 zufällig ausgewählten Gesichtsfeldern) aufweisen. Ein Drittel der
Gesamtpopulation (18 / 54) zeigte sogar eine hochgradige PMN-Anzahl (≥ 50 PMN) in der
Probe Ct4, was auf ein stark entzündliches intrauterines Milieu schließen ließ (s. Tabelle 15).
82
ERGEBNISSE
Tabelle 15: Häufigkeitsverteilung zwischen Behandlungsgruppen und der Anzahl der
neutrophilen Granulozyten (PMN) in der zytologischen Probe bei 400-facher Vergrößerung in
10 zufällig ausgewählten Gesichtsfeldern zum Zeitpunkt Ct4 (48 Stunden post
inseminationem)
Behandlungsgruppen
gesamt
Stuten (n)
Stuten (n)
PMN-Zahl
ACS
≤5
5
Prednisolonacetat
36%
28 %
>5
5*/13
32,5 %
72 %
gesamt
18
33,3 %
100 %
5
36%
Ringer-Lösung
4
28 %
22 %
7*/13
32,5 % 6*/14
72 %
78 %
18
33,3 %
100 %
18
100 %
28 %
14
100 %
26 %
35 % 18* /40
100 %
74 %
33,3 %
54
100 %
100 %
ACS = Autologes konditioniertes Serum
* = ≥ 50 PMN
Mittels einer einfaktoriellen Varianzanalyse (Prozedur GLM) konnte kein signifikanter
Zusammenhang zwischen der Anzahl der neutrophilen Granulozyten (PMN) 48 Stunden nach
der Besamung (Ct4) und dem Trächtigkeitsergebnis hergestellt werden. Die mittlere PMNZahl zum Zeitpunkt Ct4  lag bei den tragenden Stuten (13 / 54) bei 73,7 ± 108,8, bei den
nicht-tragenden Stuten (41 /54) bei 76,6 ± 112,6. Somit war die Trächtigkeitsrate der
Gesamtpopulation unabhängig von der PMN-Zahl der letzten Cytobrush-Probe.
Wie in Tabelle 18 (siehe Kapitel 3.2.3.1) bereits verdeutlicht und mittels t-Test nachgewiesen,
lag kein signifikanter Unterschied zwischen den Mittelwerten der PMN-Zahl der
verschiedenen Behandlungsgruppen zum Zeitpunkt Ct4 vor, was darauf schließen ließ, dass
kein Zusammenhang zwischen der Behandlungsgruppe und dem Ergebnis der letzten
zytologischen Probe bestand.
83
DISKUSSION
4 DISKUSSION
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden, welchen Einfluss eine
Behandlung der zu persistierender post-breeding Endometritis (pPBE) neigenden Stuten mit
dem Immunmodulator ACS im Vergleich zu der Anwendung von Prednisolonacetat und
Ringerlösung auf die Trächtigkeitsrate, die Ansammlung von intrauteriner Flüssigkeit und die
Anzahl der neutrophilen Granulozyten als Markerzellen für eine Entzündungsreaktion des
Endometriums in der Zytologie nimmt.
Es wurden 54 Stuten in 54 Zyklen untersucht. Dabei handelte es sich um Warmblutstuten, die
seit mindestens einem Jahr güst waren, somit schieden grundsätzlich Maiden- und
Fohlenstuten aus. Es wurden ausschließlich Tiere ausgewählt, die in der letzten Saison
erfolglos künstlich besamt wurden, bei denen eine Neigung zu einer pPBE bereits
dokumentiert wurde (in der Zuchtsaison 2010 und/oder in vorangegangenen Jahren länger als
48 Stunden p.i. Ansammlung von intrauteriner Flüssigkeit, Umrossen trotz eines
unauffälligen endometrialen Tupfers) und die klinisch allgemeingesund (siehe Kapitel
„3.1.1.5 Allgemeinuntersuchung“) waren.
Die Verteilung der Versuchstiere auf die 3 Behandlungsgruppen (autologes konditioniertes
Serum (ACS) = Gruppe 1, Prednisolonacetat = Gruppe 2 und Ringer-Lösung = Gruppe 3)
erfolgte randomisiert. Die Auswahl des zu verwendenden verdünnten Frischsamens der 4 für
die Studie hinsichtlich ihrer guten Fertilität selektierten Hengste unterlag der Entscheidung
des Stutenbesitzers. Bevor eine Stute für die Teilnahme an der Studie zugelassen wurde,
wurde mittels eines sterilen Endometriumstupfers der mikrobiologische Status des Uterus
überprüft.
Bei allen Stuten wurden zum Zeitpunkt der intravenösen hCG-Gabe, 4 bis 6 Stunden nach der
Besamung, sowie 24 und 48 Stunden post inseminationem Proben für die zytologische
Untersuchung entnommen.
Bevor die Studie begonnen werden konnte, musste ermittelt werden, zum welchem Zeitpunkt
das autologe konditionierte Serum idealerweise intrauterin appliziert werden sollte. Dabei galt
84
DISKUSSION
es zum einen zu klären, ob das ACS einen schädigenden Einfluss auf die Samenqualität des
verdünnten Frischsamens ausüben könnte und zum anderen, ob der Ovulationszeitpunkt nach
der intravenösen Gabe von hCG beeinflusst würde. Die Ergebnisse der Vorversuche, die sich
mit den beiden oben genannten Fragestellungen auseinandersetzen, werden im Folgenden
diskutiert. Im Anschluss wird auf die gegebenen Versuchsbedingungen eingegangen. Danach
werden die Ergebnisse der zytologischen Untersuchung beleuchtet.
4.1 Vorversuche
Der Vorversuch bezüglich der Fragestellung einer möglichen Beeinflussung des
Ovulationszeitpunktes nach intravenöser Verabreichung von 2.500 I.E. hCG durch die
simultane intrauterine Gabe von 4 ml ACS muss wegen der sehr geringen Stutenanzahl und
mangelnder Kontrollgruppen kritisch betrachtet werden. Die gewonnene Erkenntnis, dass
durch ACS die Ovulation nicht verhindert und der Zeitraum zwischen der intravenösen
Verabreichung von hCG und dem Ovulationszeitpunkt des dominanten Follikels nicht über
48 Stunden post injectionem verlängert zu werden scheinen, führte zu dem Entschluss, die
erste von zwei geplanten intrauterinen ACS-Applikationen parallel zur hCG-Gabe
vorzunehmen. Auch in der Hauptstudie gab es keinen Hinweis auf eine verzögerte
Follikelreifung durch ACS: Gruppe 1 (ACS) wies eine mittlere Zeitspanne  von 45 Stunden
zwischen der hCG-Injektion und der Ovulation auf. Im Vergleich dazu dauerte es in Gruppe 2
(Prednisolonacetat) ebenfalls durchschnittlich 45 Stunden und in Gruppe 3 (Ringer-Lösung)
40 Stunden, bis der Eisprung nach hCG-Injektion eintrat (vgl. Kapitel „3.2.2.6 Ergebnisse der
klinisch-gynäkologischen Untersuchung“). Um signifikante Werte zur Bestätigung dieser
Beobachtungen zu erhalten, wären größere Versuchstier- und Zykluszahlen und die
Gegenüberstellung von Kontrollgruppen notwendig. Der Zeitpunkt und die Art der IL-RaApplikation von scheinen von entscheidender Bedeutung für die Wirkung auf die Eizelle zu
sein: Nach CAILLAUD et al. (2005) erzielte eine intrafollikuläre Injektion von
rekombinantem, humanem IL-1β eine ähnlich ovulationsinduzierende Wirkung wie die
intravenöse Gabe von ungereinigtem, equinem Gonadotropin (Crude Equine Gonadotropin,
CEG). Darüber hinaus stellten die Autoren nach einer intrafollikulären Injektion von
humanem IL-1-Ra eine zeitabhängige Hemmung der Ovulationsinduktion durch CEG fest.
85
DISKUSSION
Eine ähnliche Wirkung des IL-Ra beobachteten bereits SIMÓN et al. (1994b) bei Ratten im
Zusammenhang mit einer Injektion in die Bursa ovarica 2 Stunden vor der hCG-Applikation.
CUERVO-ARANGO und NEWCOMBE (2012) konnten in einem Vergleich von natürlich
auftretenden hämorrhagischen anovulatorischen Follikeln (Hemorrhagic Anovulatory
Follicle, HAF) und experimentell durch systemische hoch dosierte Gabe von FlunixinMeglumin, einem nicht steroidalen Antiphlogistikum (im Englischen: Non-Steroidal AntiInflammatory Drug, NSAID), induzierte luteinisierte, nicht rupturierte Follikel (Luteinized
Unruptured Follicle, LUF) ähnliche ultrasonographische Charakteristika darstellen, wobei
durch Flunixin-Meglumin in 83 % der Fälle eine Ovulationsverhinderung erreicht wurde (vgl.
CUERVO-ARANGO und NEWCOMBE 2012). Vor diesem Hintergrund werden weitere
Untersuchungen notwendig sein, um herauszufinden, ob sich die Wirkung von autologem
konditioniertem Serum (mit einem hohen Gehalt an IL-Ra) im Vergleich zu humanen IL-RaPräparaten generell unterscheidet und wie die Applikationsart (intrafollikulär, intrauterin) und
–dosis bzw. der Injektionszeitpunkt die Eizellreifung und den Ovulationszeitpunkt
beeinflusst.
Im zweiten Vorversuch sollte in vitro der Einfluss des ACS in 2 verschiedenen
Verdünnungsstufen im Vergleich zu einer Kontrollgruppe auf die Qualität des verdünnten
Frischsamens bei Lagerung im Kühl- und Brutschrank überprüft werden. Die Ergebnisse
dieses Experiments sind ebenso wie die des vorangegangenen Vorversuchs vorsichtig zu
interpretieren, da es sich um 3 Hengste (3 statistische Einheiten) und jeweils 3 Ejakulate
handelte und kein Anspruch auf statistisch evidente Resultate erhoben werden kann. Sowohl
die Lagerungsart als auch die Verdünnungsstufe mit ACS 24 Stunden nach Probenansatz
beeinflussten die Spermienmotilität und -morphologie sowie den Anteil toter Spermien: Je
höher der Anteil an ACS in der Probe war, desto höher war auch der Anteil an toten bzw.
veränderten Spermien. Bei einem Probenansatz des verdünnten Frischsamens mit 0,4 ml ACS
konnte nahezu kein Unterschied hinsichtlich des Anteils vorwärts- und gesamtbeweglicher
Spermien im Vergleich zu der Probe ohne Zusatz verzeichnet werden, so dass in diesem Fall
davon ausgegangen werden kann, dass eine solche Konzentration keinen schädigenden
Einfluss auf die Samenmotilität nimmt. Erwartungsgemäß zeichnete sich ein ebenfalls
negativer Einfluss auf die Motilität, Morphologie und den Anteil der toten Spermien bei
86
DISKUSSION
Brutschranklagerung im Vergleich zu den gekühlten Proben ab. Diese Beobachtung ist im
Einklang mit den Ergebnissen einer Studie von LOVE et al. (2002), die in vitro eine
signifikant erhöhte DNA-Denaturierung des equinen verdünnten Samens durch eine Lagerung
bei 37°C im Vergleich zu einer Aufbewahrung bei 5°C über 24 Stunden messen konnten. Die
Verschlechterung der Samenmotilität und -morphologie sowie die erhöhte Anzahl toter
Spermien durch Zusatz von ACS zeigten sich bei den kühl gelagerten Proben deutlicher als
bei den Brutschrankansätzen. Dies lässt sich wahrscheinlich dadurch erklären, dass die
Brutschranktemperatur eine stärker spermienschädigende Wirkung hat als das Serum. Es sind
weitere Untersuchungen mit größeren Fallzahlen nötig, um die spermienschädigende Wirkung
des ACS auf den verdünnten Frischsamen statistisch evident zu verifizieren. Auf Grund der
negativen Einflussnahme des ACS auf die Qualität des verdünnten Frischsamens in vitro
wurde die zweite intrauterine Behandlung der Stuten mit 4 ml ACS erst 4 bis 6 Stunden nach
der Besamung und nicht parallel zur Insemination vorgenommen.
4.2 Gegebene Versuchsbedingungen
Die an der Feldstudie beteiligten Stuten wurden sowohl auf der südoldenburgischen
Deckstation, von der auch die für die Studie ausgewählten Hengste stammten, in der
tierärztlichen Klinik für Pferde in Lüsche und auf einem privaten Zuchthof in Südoldenburg
(Niedersachsen), sowie im Westmünsterland (Nordrhein-Westfalen) untersucht und
behandelt. Trotz der verschiedenen Standorte zur Untersuchung und Behandlung waren die
Haltungsbedingungen der Tiere vergleichbar, da alle Versuchsstuten während der Rosse
aufgestallt wurden, tagsüber Weidegang oder Bewegung im Paddock genossen und über
Nacht
im
Stall
verblieben.
Zwischen
der
letzten
Probenentnahme
und
der
Trächtigkeitsuntersuchung 15 bis 18 Tage post ovulationem verließen die Stuten, die initial in
der
Klinik
oder
auf
der
Deckstation
vorgestellt
und
behandelt
wurden,
den
Untersuchungsstandort und wurden wieder im Heimatstall untergebracht. Die Versuchstiere,
die auf dem privaten Pferdezuchtbetrieb im Oldenburger Münsterland (Niedersachsen) und im
Westmünsterland
behandelt
wurden,
verblieben
dort
permanent.
Die
Trächtigkeitsuntersuchung fand je nach Besitzerwunsch entweder zu Hause (z.T. durch den
entsprechenden Haustierarzt durchgeführt) oder auf der Deckstation bzw. in der Klinik statt.
87
DISKUSSION
Diese heterogenen Standorte wurden in Kauf genommen, um eine akzeptable Anzahl Stuten
pro Behandlungsgruppe erreichen zu können.
Es wurde mit verdünntem Frischsamen von vier Hengsten gearbeitet, die eine vorberichtlich
gute Fruchtbarkeit aufwiesen, um möglichst viele Stuten in die Studie aufnehmen zu können.
Dabei handelte es sich um jeweils 2 Hengste mit spring- bzw. dressurbetontem Pedigree. Da
der Pferdebesitzer und nicht die Untersucherin den Hengst für die jeweilige Stute auswählen
durfte,
konnte
keine
vollkommen
homogene
Verteilung
der
Hengste
auf
die
Behandlungsgruppen erfolgen. Weil jedoch kein statistisch signifikanter Unterschied
zwischen den Hengsten und der von ihnen erreichten Trächtigkeitsrate beobachtet werden
konnte, wurden die entsprechenden Versuchsgruppen der 4 Hengste zu jeweils einer
zusammengeführt.
Es war kein signifikanter Zusammenhang zwischen der Behandlungsgruppe und der
Trächtigkeitsrate herzustellen. Dieses Ergebnis stellt einen Kontrast zu den Beobachtungen
durch DELL`AQUA et al. (2006) und PAPA et al. (2008) dar, die gute Therapieerfolge und
einen signifikanten Anstieg der Trächtigkeitsrate im Zusammenhang mit einer mehrfachen
Prednisolonacetat-Gabe
bei
Stuten
dokumentieren
konnten,
die
bereits
mit
besamungsinduzierten Endometritiden aufgefallen waren. Nach MORRIS und EDEN (2008)
bewirkt eine mehrfache orale Verabreichung von Prednisolon (200 mg Prednisolon zweimal
täglich) signifikant höhere Trächtigkeitsraten (P < 0,05) im Vergleich zu unbehandelten
Tieren. Dabei muss die sehr geringe Anzahl statistischer Einheiten (21 Stuten einschließlich
Kontrollgruppe) für die Aussagekraft dieser Ergebnisse kritisch in Betracht gezogen werden.
Auch andere Autoren stellten positive Auswirkungen einer systemischen GlucocorticoidTherapie bei Stuten mit Neigung zu pPBE fest: BUCCA et al. (2008) führten Versuche mit
einer einmaligen Dexamethasonapplikation (50 mg i.v.) parallel zum Besamungszeitpunkt
durch
und
dokumentierten
eine
signifikante
Reduktion
der
endometrialen
Flüssigkeitsansammlung, des endometrialen Ödems sowie des Trübungsgrades der „Lowvolume-Spülflüssigkeit“ und einen signifikanten Anstieg der Trächtigkeitsrate. Zudem
konnten BUCCA und CARLI (2011) keine hemmende Wirkung der einmaligen intravenösen
Dexamethason-Gabe auf eine Ovulationsinduktion durch hCG feststellen. Bei einer
mehrfachen intravenösen Applikation des Dexamethasons im Vergleich zu einer mehrfachen
88
DISKUSSION
oralen
Gabe
von
Prednisolon
und
einer
Kontrollgruppe
beobachteten
FERRIS und McCUE (2010) hingegen sinkende LH-Spiegel und in Folge dessen eine hohe
Rate anovulatorischer Zyklen. JONES und LEY (2001) beschrieben ein vermindertes
Rosseverhalten in Folge von dauerhafter Glucocorticoid-Therapie bei einer Araberstute, die
auf Grund einer Lebererkrankung permanent unter Prednisolon-Behandlung stand. Dabei
handelt es sich jedoch um die Beschreibung eines einzelnen Falles, welcher vorsichtig
bewertet werden sollte.
In einer Studie zur Verträglichkeit von verschiedenen steroidalen Antiphlogistika (SAID) und
verdünntem Frischsamen konnten FIORATTI et al. (2012) bei allen SAIDs (inklusive
Prednisolonacetat) bis auf Dexamethason einen negativen Einfluss auf die Motilität der
Spermien verzeichnen. Zur Behandlung von Stuten mit einer Neigung zu persistierender postbreeding Endometritis empfahlen die Autoren darum, das Dexamethason dem verdünnten
Frischsamen direkt beizufügen, um bessere Trächtigkeitsergebnisse zu erreichen. Die lokale
Anwendung im Uterus sollte systemischen Nebenwirkungen des Dexamethasons vorbeugen,
wobei BUCCA et al. (2008) keinerlei negative Auswirkungen durch die systemische
Dexamethason-Verabreichung beobachten konnten. Ob sich die negative Wirkung der SAIDs
(exklusive Dexamethason) auf die Spermienmotilität auf den direkten Kontakt mit dem
Samen beschränkt oder ob sie auch bei systemischer Anwendung bei Stuten in Erscheinung
tritt, erfordert weitere Untersuchungen.
Die Stuten, die in der vorliegenden Studie mit Prednisolonacetat therapiert wurden, erhielten
eine dicht an der Studie von PAPA et al. (2008) orientierte Behandlung in den gleichen
Intervallen und in derselben Dosis pro Kilogramm Körpergewicht, so dass ein mangelnder
Therapieerfolg nicht einer abgeänderten Behandlungsart geschuldet ist. Es wurde eine
ähnliche Stutenanzahl untersucht: Dabei stehen 15 Stuten pro Behandlungsgruppe bei
PAPA et al. (2008) jeweils 18 Stuten pro Gruppe in der ACS-Studie gegenüber. Ob die
unterschiedliche Art der Besamung [PAPA et al. (2008) nutzten tief intrauterin appliziertes
Tiefgefriersperma] einen Einfluss auf das Trächtigkeitsergebnis genommen haben könnte, ist
fraglich. Weitere Studien mit größeren Stutengruppen werden notwendig sein, um die
Wirksamkeit des Prednisolonacetats im Vergleich zu ACS als Behandlungsmöglichkeit einer
pPBE zu untersuchen.
89
DISKUSSION
In diesem Zusammenhang ist ein Aspekt aus der Humanmedizin bezüglich der Wirkung von
Glucocorticoiden
auf
den
weiblichen
Geschlechtsapparat
zu
diskutieren:
FEROZE-ZAIDI et al. (2007) konnten bei ungeklärt infertilen Frauen einen erhöhten Spiegel
des
Enzyms
Serum-
und
Glucocorticoid-regulierte
Kinase
1
(SGK1)
in
der
Gebärmutterauskleidung nachweisen, wobei wiederum herabgesetzte Werte der SGK1 bei
Frauen mit Fehlgeburten gemessen wurden. Es wurde angenommen, dass zu niedrige
Enzymlevels die Fähigkeit der Deciduazellen, oxidativen Stress zu bewältigen, herabsetzen.
Zu hohe Konzentrationen der SGK1 verhindern nach Ansicht der Autoren die Implantation
entweder durch eine Dysregulation des Elektrolyt- und Wassertransportes der Zellen oder
durch Prävention einer lokalen Apoptose. Wie der Name des Enzyms bereits suggeriert,
haben sowohl Serum als auch Glucocorticoide einen positiven Einfluss auf die mRNAExpression der SGK1. Behandelt man nun mit einem der beiden Wirkstoffgruppen, wäre eine
Erhöhung des SGK1-Spiegels zu erwarten, was die Wahrscheinlichkeit für eine Störung der
Fruchtbarkeit erhöhen könnte.
MICHAEL und PAPAGEORGHIOU (2008) stellten bei der Frau die positiven Auswirkungen
(Unterdrückung der uterinen NK-Zellen, Unterstützung der Trophoblastproliferation und
-invasion)
den
negativen
Einflüssen
einer
Glucocorticoidbehandlung
in
der
Frühschwangerschaft (Induktion einer Decidua-/und Plazentaapoptose, Beeinträchtigung des
plazentalen Nährstofftransportes) gegenüber. Dabei muss eine wichtige Beobachtung der
zunächst tragenden Tiere aus Gruppe 1 (autologes konditioniertes Serum) hervorgehoben
werden: Jede der 3 Fruchtanlagen war zum Zeitpunkt der Trächtigkeitsuntersuchung (TU) für
ihr Alter zu klein und wurde zwischen Tag 18 und 25 post ovulationem (p.o.) resorbiert.
CAILLAUD et al. (2005) schlossen aus den Ergebnissen ihrer Studie, dass in vivo
intrafollikulär appliziertes, rekombinantes humanes IL-1β die Wiederaufnahme der Meiose
der equinen Oozyte reguliert (vergleiche auch MARTORIATI et al. 2003), jedoch keinen
Einfluss auf die zytoplasmatische Reifung ausüben könnte. Daraus würden sich für eine
Befruchtung ungeeignete Oozyten ergeben. Weiterhin sollte IL-1β einen zytotoxischen Effekt
auf die Eizellen haben. Die zuletzt geschilderte Annahme wird durch eine In-vitro-Studie an
equinen Oocyten durchgeführte Behandlung mit IL-1 bestärkt, bei der embryonale
Entwicklung
im
Zweizellstadium
stagnierte
(CAILLAUD et
al.
2008).
Nach
HANEDA et al. (2009) spielt die endometriale mRNA-Expression des IL-1-Ra eine wichtige
90
DISKUSSION
Rolle in der Etablierung der equinen Trächtigkeit zwischen Tag 19 und 25 post ovulationem.
Nach CHRISTOFFERSEN et al. (2012) bedarf es einer sehr feinen Abstimmung der
endometrialen mRNA-Expression pro-inflammatorischer Zytokine als Antwort auf eine
Endometritis, wobei eine mangelnde Feinabstimmung dieser Genexpression eine wichtige
Rolle für die Entstehung einer persistierenden Endometritis bei empfänglichen Tieren (SM)
zu spielen scheint. Bereits FUMUSO et al. (2003,2007) konnten einen Unterschied in der
mRNA-Expression verschiedener Zytokine beim Vergleich RM mit SM als Reaktion auf
künstliche Besamung und Applikation des Immunmodulators Mycobacterium-phleiZellwandextrakt (MCWE) beobachten. Es wurde angenommen, dass die intrauterine
Verabreichung
des
Immunmodulators
MCWE
bei
SM
den
homöostatischen
Entzündungsmechanismus als Reaktion auf eine Besamung wiederherstellen und damit als
prophylaktische Behandlung bei Stuten mit Neigung zu pPBE von Nutzen sein könnte.
SHARMA und DHALIWAL (2010) erzielten mit einer kombinierten Behandlung subfertiler
Stuten (intrauterine Gabe von 100 µg Escherichia-coli-Lipopolysaccharid (LPS) 6 Stunden
post inseminationem (p.i.) und eine zweifache intravenöse Oxytocin-Applikation 12 und
24 Stunden p.i.) im Vergleich zu einer Kontrollgruppe signifikant höhere Trächtigkeits- und
Abfohlraten (P < 0,001). SINGH et al. (2000) beobachteten nach einer einmaligen
intrauterinen Gabe von Escherichia-coli-Lipopolysacchariden bei Kühen mit einer bakteriell
bedingten Endometritis eine Abwehr der Infektion innerhalb eines Brunstzyklus. In einer
weiteren Studie verzeichneten SINGH et al. (2008) sehr gute Trächtigkeitsraten (91,67 %) bei
Kühen mit subklinischer Endometritis durch eine intrauterine Behandlung mit 100 µg E. coli
LPS und 5 ml autologem Serum 12 Stunden nach der künstlichen Besamung.
ZINGHER (1996) behandelte SM intravenös mit Propionibacterium acnes an den
Tagen 1, 3 und 7, nachdem eine endometrialen Entzündungsreaktion dokumentiert wurde,
und verglich diese mit einer Kontrollgruppe. Dabei konnte bei den behandelten Tieren anhand
der zytologischen Befunde eine verbesserte Bewältigung der Entzündungsreaktion
verzeichnet werden (siehe auch ROHRBACH et al. 2006). Es gilt in zukünftigen Studien zu
untersuchen, inwiefern die Immunmodulatoren MCWE, E. coli LPS und Propionibacterium
acnes im Gegensatz zu ACS vermögen, geeignete Ausgangsbedingungen für die Etablierung
einer equinen Trächtigkeit zu schaffen.
GALVÃO et al. (2012) nehmen an, dass Zytokine sowohl durch Entzündungszellen als auch
91
DISKUSSION
durch Stroma- und Epithelzellen des Endometriums produziert werden sollen. Weiterhin
unterstellten die Autoren den Interleukinen IL-1α und IL-1β eine wichtige para-/autokrine
Rolle für die Regulierung der endometrialen Funktion. SZOSTEK et al. (2011a) beobachteten
einen Beziehung zwischen der mRNA-Expression der Interleukine IL-1α und IL-1β sowie
ihrer Rezeptoren (IL-RI, IL-RII) und der Rosse, verschiedenen Entzündungsgraden und
Fibrose. Sowohl IL-1α als auch IL-1β sollen sich an der nach an der Prostanoid-Synthese (wie
z.B. PGE2 und PGF2α) beteiligen [SZOSTEK et al. (2011b und 2012)]. Weiterhin scheinen
Endometritis und eine Fibrose des Endometriums mit einer abnormalen Enzymaktivität in
Bezug auf die Prostanoid-Synthese (wie z.B. die Synthese von PGE2 und PGF2α)
einherzugehen,
was
für
einen
frühen
Embryoverlust
verantwortlich
sein
könnte
(SZOSTEK et al. 2011b). HANEDA et al. (2009) wiesen an equinen Endometriumproben in
vitro nach, dass eine Behandlung mit E2 und Progesteron zu einer erhöhten IL-1-RaExpression führen. Weiterhin wiesen die Autoren dem Interleukin-1-Rezeptorantagonisten
eine Rolle als regulierenden Gegenspieler zu der durch E2 oder IL-1 erhöhten endometrialen
Prostaglandinproduktion
(vergleiche
JACOBS
und
CARSON
1993,
RAUK und CHIAO 2000, STOUT und ALLEN 2001, JANA et al. 2008) während der
Implantationsphase des Conceptus in der Stute zu.
Nach ZMIJEWSKA et al. (2012) reguliert IL-1β die Prostaglandin-Synthese und –Sekretion
durch das Corpus luteum (CL) in der Frühträchtigkeit und bei zyklischen Sauen. Dabei soll
der Gelbkörper selbst IL-1ß ausschütten und so autogen die luteale Funktion beeinflussen.
Auch in der Humanmedizin wird Interleukin-1 eine wichtige Rolle bei der Manifestation einer
Schwangerschaft bei der Frau bzw. der Trächtigkeit bei der Maus zugesprochen: Es wurden
negative
Effekte
einer
intraperitonealen
Verabreichung
eines
Interleukin-1-
Rezeptorantagonisten während der Tage 3 bis 6 der Trächtigkeit auf den Erhalt einer
Schwangerschaft/Trächtigkeit
nachgewiesen (SIMÓN et al. 1998, HESS et al. 2008),
wohingegen ABBONDANZO et al. (1996) bei Knock-out-Mäusen keinerlei negative Effekte
auf die embryonale Entwicklung und Implantation verzeichneten.
KRÜSSEL et al. (2003) ordneten IL-1 eine entscheidende Funktion im Rahmen der
embryonalen Einnistung in das Endometrium zu. Die Autoren nahmen an, dass eine
präimplantatorische Produktion von IL-1-Ra durch den Embryo zu einer verzögerten
92
DISKUSSION
Entwicklung desselben führt (vgl. auch VAN MOURIK et al. 2009). NANCY et al. (2012)
betrachteten bei Mäusen das sogenannte Gen-Silencing (Gen-Stilllegung) von T-Zellanlockenden Chemokinen (TNF-α und Interferon-gamma, IFN-γ) in decidualen Stromazellen
im Bereich der fetomaternalen Kontaktfläche als einen wichtigen Bestandteil der
fetomaternalen Immuntoleranz. Eine Dysregulation des Gen-Silencing sollte zu einer
erhöhten Infektanfälligkeit der Decidua führen. CHAOUAT et al. (1995) stellten in einer
Studie fest, dass IL-1 die Produktion des Leukaemia inhibiting factor (LIF) positiv
beeinflusst. Ein Mangel an LIF scheint bei unfruchtbaren Frauen zu wiederholten
Implantationsfehlversuchen trotz erfolgreicher In-vitro-Fertilisation (IVF) zu führen. Da
Stuten einen grundsätzlich unterschiedlichen Plazentationstyp (Placenta diffusa completa,
Semiplacenta diffusa nach GROSSER 1959, RÜSSE 1998) aufweisen als Menschen und
Mäuse (Placenta discoidalis, Placenta deciduata nach GROSSER 1959, RÜSSE 1998), ist
fraglich, ob die intrauterine Behandlung mit Serum oder Glucocorticoiden einen ähnlich
negativen Effekt auf die Fruchtbarkeit der subfertilen Stuten hätte, zumal der
Applikationszeitpunkt parallel zur hCG-Gabe im Kontrast zu einer Verabreichung an den
Tagen 3 bis 6 der Trächtigkeit (siehe SIMÓN et al. 1998, HESS et al. 2008) steht. Weiterhin
ist kritisch anzumerken, dass der Implantationszeitraum der equinen Gravidität [nach RÜSSE
(1998) zwischen den Tagen 36 und 60 der Trächtigkeit] im Vergleich zum Menschen
(zwischen den Tagen 6 und 9 ½ post ovulationem, vgl. JONES 1992) deutlich später
anzusiedeln ist.
VILLANI et al. (2010) konnten beim Pferd sowohl in Gewebeproben des Endometriums als
auch des Trophoblasten am Tag 21 der Trächtigkeit im Vergleich zu Uterusbioptaten während
des Östrus, Diöstrus und der Tage 7 und 14 der Trächtigkeit eine signifikant erhöhte LIFmRNA-Expression nachweisen. Bei Trophoblastproben des Tages 21 der Trächtigkeit konnte
außerdem ein signifikanter Anstieg der Genexpression des LIF-Rezeptors dokumentiert
werden. Auf Grund dessen vermuteten die Autoren, dass LIF eine Rolle bei der Anlagerung
und Anheftung als Vorbereitung für die Implantation spielt.
Um die lokale endometriale Immunität zur Verbesserung der Fruchtbarkeit subfertiler Stuten
zu beeinflussen, wurde der Einsatz von autologem Plasma und Serum untersucht:
PASCOE (1995) beobachtete in Folge einer intrauterinen Plasmabehandlung bei güsten und
Fohlenstuten eine Erhöhung der Trächtigkeitsrate pro Zyklus. Da das autologe Plasma in
93
DISKUSSION
Verbindung mit uterinen Sekreten der für die pPBE empfänglichen Stuten zu einer
verbesserten
Phagozytose
und
Chemotaxis
der
uterinen
PMN
führt
(TROEDSSON et al. 1993c), scheint das autologe Plasma sowohl als Opsonin als auch als
chemischer Lockstoff zu wirken (ASBURY 1984, PASCOE 1995). Im Gegensatz dazu
konnten COLBERN et al. (1987) bei alleiniger intrauteriner Plasma-Therapie einer künstlich
induzierten Endometritis keinerlei Verbesserung des endometrialen Entzündungsstatus im
Vergleich zu einer Kontrollgruppe dokumentieren. ASBURY et al. (1984) beobachteten, dass
die Zugabe einer kleinen Serummenge zu equinen uterinen Sekreten in vitro zu einer
signifikant erhöhten Phagozytose von Streptococcus zooepidemicus durch die equinen PMN
führt. Wurde das Serum zuvor durch Hitzebehandlung bei 56 °C, Zugabe von EDTA oder
C3-Entzug beeinflusst, konnte wiederum eine verminderte Phagozytose der Bakterien
festgestellt werden. Das deutete für die Autoren darauf hin, dass der positive Effekt des
Serums auf die Phagozytoseleistung der neutrophilen Granulozyten Komplement-abhängig
sei. Dabei scheint ursprünglich nicht etwa ein Komplementdefizit die Ursache für eine
herabgesetzte Opsonisierung der Keime zu sein, sondern eher ein beschleunigter Zerfall von
Komplementfaktoren in den uterinen Sekreten (CAUSEY 2007).
Zieht man nun die oben dargestellten Beobachtungen in Betracht, könnte die Beeinflussung
des IL-1-Gehalts im intrauterinen Milieu durch das autologe konditionierte Serum (ACS)
zweierlei Effekte auf den Geschlechtsapparat der Stuten ausüben:
1. Durch eine intrauterine Verabreichung des IL-1-Rezeptorantagonisten (IL-1-Ra) wird
Einfluss auf die endometriale Funktion und somit auf die Prostanoid-Synthese
genommen. Günstigstenfalls bedeutet dies, dass bei Stuten ein ursprünglich hoher
Gehalt an IL-1β gemindert wird und die PGF2α-Konzentration im Gewebe und
dadurch ein erhöhtes Luteolyse- und Abortrisiko gesenkt werden. Es besteht ebenfalls
die Möglichkeit, die Entstehung einer Fibrose zu verhindern oder zu zumindest zu
verringern.
2. Im
negativen
Fall
bewirkt
die
ACS-Behandlung
eine
Dysregulation
der
physiologischen Entzündungsreaktion und bringt die sensible Abstimmung zwischen
endometrialen Zellen und den Zytokinen in ihrer para-/autokrinen Funktion in ein
Ungleichgewicht. Der Einsatz eines IL-1Ra könnte sogar zu einer Durchbrechung der
94
DISKUSSION
antimikrobiellen Verteidigungslinie des Endometriums durch Zytokine und NETs
beitragen, was eine intrauterine Infektion begünstigen und zum Verlust des Embryos
führen könnte. Es ist ungeklärt, wie lange intrauterin verabreichtes ACS und damit
hohe Konzentrationen an IL-1-Ra auf das Endometrium und den Embryo wirken: Ein
zu hoher Gehalt an IL-1-Ra könnte eine Fehlregulierung der IL-1-Signaltransduktion
zwischen Tag 19 und 25 post ovulationem verursachen und damit zu einem
Fruchtverlust führen.
Welchen Effekt die wiederholte intrauterine Behandlung der Stuten mit ACS genau auf das
Endometrium, das Corpus luteum und den Embryo selbst ausgeübt hat, kann in dieser Studie
nicht nachvollzogen werden und erfordert weitere Untersuchungen.
Weiterhin wurde ein Zusammenhang zwischen Besamungsmonat und der Trächtigkeitsrate
überprüft: Die Studie wurde Anfang März der Zuchtsaison 2011 begonnen und Ende August
2011 abgeschlossen. Dabei wurden im März die wenigsten und im August die meisten Stuten
besamt. Dies lässt sich durch den vermehrten Stutenzulauf zum Ende der Saison erklären, als
die Bereitschaft an einer Studie teilzunehmen deutlich größer war als zu Beginn der
Zuchtperiode. Im Juni waren mit 12,5 % (1/7) die wenigsten tragenden Stuten zu beobachten.
Die höchste Trächtigkeitsrate war im März mit 75 % (3/4) zu verzeichnen, wobei im
Vergleich der Monate April bis August mit dem März kein signifikanter Unterschied
nachgewiesen werden konnte. Auch bei Betrachtung aller Versuchsmonate konnte kein
signifikanter Zusammenhang zwischen dem Besamungsmonat und dem Trächtigkeitsergebnis
hergestellt werden, was allerdings wegen der nur geringen Versuchstierzahl pro Monat
ohnehin vorsichtig zu bewerten ist.
Insgesamt war eine sehr homogene Altersverteilung der Stuten in den einzelnen
Behandlungsgruppen zu verzeichnen. Bei der Untersuchung, ob die Trächtigkeitsrate vom
Alter der Stuten abhängig war, war zu beobachten, dass mit einer breit gefächerten
Altersverteilung der untersuchten Stuten (zwischen 7 und 30 Jahren) gearbeitet wurde. Bei
der Aufteilung der Stuten in 3 Altersgruppen waren 44 % zwischen 7 und 13 Jahren alt, zu der
Gruppe der 14- bis 20-Jährigen gehörten 37 % und 19 % der Stuten waren 21 Jahre und älter.
Zwischen den ersten beiden Altersgruppen und der Gruppe der Überzwanzigjährigen lag ein
95
DISKUSSION
tendenzieller Unterschied hinsichtlich der Trächtigkeitsrate zu Gunsten der „jüngeren bis
mittelalten“ Tiere, weshalb sich ein Zusammenhang zwischen dem Alter der Stuten und der
positiven Trächtigkeitsuntersuchung angenommen werden kann, jedoch kein signifikanter
Unterschied in der Verteilung der Trächtigkeitshäufigkeit zu Gunsten der „jüngeren“ Stuten
beobachtet werden konnte, wie von CARNEVALE und GINTHER (1992) beschrieben
wurde. Dies hängt wahrscheinlich damit zusammen, dass ausschließlich „Problemstuten“ für
die Studie ausgewählt wurden und dadurch der Altersfaktor als Gradmesser für die Fertilität
der Stuten nicht wie bei einer nicht vorselektierten Stutenpopulation zum Tragen kommt.
Bei Aufteilung der Gesamtpopulation am Median M (14 Jahre) konnten identische Anteile der
jeweiligen Gruppe an tragenden Stuten beobachtet werden (siehe Kapitel 3.2.1.3 Einfluss des
Stutenalters auf das Trächtigkeitsergebnis, Tabelle 3). Dies lässt sich durch die Gruppe der
14-jährigen Stuten erklären: Insgesamt 5 Stuten waren 14 Jahre alt und keine einzige
verzeichnete ein positives Trächtigkeitsergebnis. Dadurch wurde die Trächtigkeitsrate, die in
der Gruppe der 7- bis 13-jährigen Tiere immerhin noch bei 29 % lag, auf 24 % gesenkt.
Indem die 14-jährigen Stuten aus der ursprünglichen Gruppe der 14- bis 20-jährigen mit einer
Trächtigkeitsrate von 25 % entfernt wurden, konnte selbst eine Verbindung mit der Gruppe
der Überzwanzigjährigen mit nur 10 % tragenden Stuten der durchschnittlichen
Trächtigkeitsrate der Übervierzehnjährigen von 24 % im Vergleich zu den 14 Jahre alten und
jüngeren Stuten keinen Abbruch tun. Vergleicht man die Trächtigkeitsraten der
3 Behandlungsgruppen mit einer Studie von BALL et al. (1986), bei der die subfertilen Stuten
am Tag 14 post ovulationem (p.o.) eine Trächtigkeitsrate von ungefähr 20 % aufwiesen,
wohingegen bei 80 % der fertilen Tiere ein Embryo aufgefunden werden konnte, so zeigen
Gruppe 1 (ACS) und 2 (Prednisolonacetat) jeweils eine Trächtigkeitsrate von etwa 17 %
(3/18) und Gruppe 3 (Ringer-Lösung) von etwa 39 %.(7/18). Die ersten beiden Gruppen
entsprechen in etwa der von BALL et al. (1986) angegebenen Trächtigkeitsrate, Gruppe 3
zeigt einen fast doppelt so hohen Anteil, der sich jedoch wie bereits erwähnt nicht signifikant
von der Trächtigkeitsraten der Gruppe 1 und 2 unterscheidet. Die Aussagekraft dieses
Ergebnisses ist auf Grund der geringen Tierzahl pro Gruppe vorsichtig zu bewerten.
Innerhalb der ersten 24 Stunden nach der Besamung (post inseminationem, p.i.) hatten
44 Stuten bereits ovuliert (13 Tiere bei der nachfolgenden Trächtigkeitsuntersuchung (TU)
96
DISKUSSION
tragend), die restlichen 10 Stuten hatten zwischen 24 und 48 Stunden p.i. ihren Eisprung
[keines der Tiere bei der nachfolgenden TU tragend, ACS: 3 Tiere (17 %); Prednisolonacetat:
5 Tiere (27 %), Ringer-Lösung: 2 Tiere (11 %)]. Der Mittelwert des Ovulationszeitpunktes 
nach hCG-Applikation betrug bei Gruppe 1 und 2 (ACS bzw. Prednisolonacetat) 45 Stunden,
bei Gruppe 3 (Ringer-Lösung) 40 Stunden. Der Median M war bei allen 3 Gruppen
48 Stunden. Unabhängig von der Behandlungsgruppe war die minimale Zeitspanne zwischen
hCG-Gabe und Ovulation 24 Stunden, die maximale 72 Stunden. SIEME (2005) siedelte die
Überlebensdauer equiner Spermien im Geschlechtstrakt der Stute je nach Hengst zwischen
24 Stunden
und
6
Tagen
an.
Nach
SCHÄFER (2001)
lassen
sich
die
besten
Inseminationserfolge mit Frischsamen erzielen, wenn die mit hCG behandelten Stuten im
Bereich von 0 bis 12 Stunden nach oder 24 bis 0 Stunden vor der Ovulation besamt werden.
Wurden die Stuten früher als 24 Stunden ante ovulationem inseminiert, sank die
Konzeptionsrate von 57,6 % auf 20,7 %. Ein Zusammenhang zwischen der zu früh
vorgenommenen Besamung (Ovulation zwischen 24 und 48 Stunden p.i.) und der schlechten
Konzeptionsrate
(0
%)
FERRIS und McCUE (2010)
erscheint
vor
diesem
verzeichneten
nach
Hintergrund
einer
als
mehrfachen
wahrscheinlich.
intravenösen
Dexamethason-Applikation im Vergleich zu einer mehrfachen oralen Gabe von Prednisolon
und einer Kontrollgruppe sinkende LH-Spiegel und in Folge dessen eine hohe Rate
anovulatorischer Zyklen (60 %). Die Prednisolon-Gruppe wies in 83 % der Zyklen eine
erfolgreiche Ovulation auf und zeigte im Vergleich zur Kontrollgruppe normale LH-Spiegel
(vor GnRH-Gabe: 4,5 ± 1,3 ng/ml; nach GnRH-Gabe: 14,4 ± 3,8 ng/ml). Die Stuten der
Kontrollgruppe ovulierten in 100 % der Fälle. Da die Stuten dieser Studie lediglich mit
zeitlicher Verzögerung ovulierten und es sich damit nicht um anovulatorische Zyklen
handelte, ist fraglich, ob die jeweilige Therapie einen Einfluss auf Cortisol- oder
LH-Serumspiegel und damit die ovarielle Funktion genommen hat. Diese Fragestellung sollte
durch weitere Untersuchungen geklärt werden.
4.3 Zytologische Untersuchung
Insgesamt wurden 216 Cytobrush-Proben entnommen. Die Anzahl der neutrophilen
Granulozyten (PMN) im zytologischen Abstrich des Endometriums wurde pro Versuchstier
97
DISKUSSION
zu vier Messzeitpunkten (Ct = Zytologische Probe zum Zeitpunkt x) bestimmt: Am Tag der
hCG-Applikation (Ct1), 4 bis 6 Stunden post inseminationem (p.i.) (Ct2), 24 Stunden p.i.
(Ct3) und
48 Stunden p.i. (Ct4). Das Abstrichbürstchen wurde auf einem entfetteten
Objektträger ausgerollt, der Ausstrich mittels Diff-Quick-Färbung angefärbt (siehe Kapitel
3.1.1.9 „Cytobrush und zytologische Untersuchung“) und die PMN nach dem differenzierten
Schema nach BROOK (1984) ausgezählt. Eine beobachtete Anzahl von 0 bis 5 PMN in zehn
Gesichtsfeldern galt als negativ, wohingegen mehr als 5 neutrophile Granulozyten als
Anzeichen für eine entzündliche Reaktion des Endometriums gewertet wurden.
Mit dem Tukey’s-Studentized-Range-Test konnte kein signifikanter Unterschied zwischen
den
Mittelwerten

der
4
Messzeitpunkte
im
Vergleich
zwischen
den
drei
Behandlungsgruppen festgestellt werden, die Therapieform schien also keinen Einfluss auf
Entzündungsverlauf zu nehmen. Verglich man hingegen die PMN-Zahl zweier verschiedener
Messzeitpunkte mit dem gepaarten t-Test miteinander, so unterschieden sich diese
unabhängig von der Behandlungsgruppe signifikant voneinander (s. Kapitel 3.2.2.1
„Allgemeiner Vergleich der Ergebnisse der zytologischen Untersuchung zwischen den
einzelnen Gruppen (Autologes konditioniertes Serum, Prednisolonacetat und RingerLösung)“, Tabelle 12). Der Ablauf der Entzündungsreaktion stellte sich wie in Diagramm 1
(s. Kapitel 3.2.2.1) demonstriert bei jeder Gruppe so dar, dass zu Beginn (Ct1) entweder keine
oder sehr wenige PMN vorhanden waren, vier bis sechs Stunden nach der Besamung ein Peak
zwischen durchschnittlich etwa 300 und 450 neutrophilen Granulozyten erreicht wurde
(maximaler PMN-Einstrom in das Endometrium) und sich nach 24 Stunden die Anzahl der
PMN auf ein durchschnittliches Niveau zwischen 150 und 200 bzw. nach 48 Stunden im
Bereich von 50 bis 100 ansiedelte. Aus diesen Beobachtungen ließ sich ableiten, dass
unabhängig von der Behandlungsgruppe auch 48 Stunden post inseminationem ein
hochgradig positives zytologisches Probenergebnis und damit ein entzündliches intrauterines
Milieu anzutreffen war. Es konnten zwar tendenziell höhere PMN-Zahlen zu den
verschiedenen Messzeitpunkten bei Gruppe 1 (ACS) dokumentiert werden (s. Kapitel 3.2.2.1,
Tabelle 11), dabei konnte mit dem Tukey’s-Studentized-Range-Test aber kein signifikanter
Unterschied zwischen den Gruppen nachgewiesen werden. Dies führte zu der Annahme, dass
die Behandlung der Stuten mit autologem konditioniertem Serum keinen Einfluss auf das
Ergebnis der zytologischen Untersuchung ausübt.
98
DISKUSSION
Bei dem Vergleich der PMN-Werte zum ersten (Ct1) und letzten Messzeitpunkt (Ct4) mit
Trennung nach Gruppen wurden mittels des gepaarten t-Tests signifikante Unterschiede
zwischen den Messzeitpunkten Ct1 und Ct4 beobachtet (P ≤ 0,01).
Nach KATILA (1995) findet man bei gesunden Stuten die ersten neutrophilen Granulozyten
im Uterus etwa 1 Stunde post inseminationem (p.i.), die höchste Anzahl ist 6 bis 12 Stunden
p.i. zu erwarten und nach 24 bis 48 Stunden sind nur noch wenige PMN übrig.
LEBLANC et al. (2003b) sahen solche Stuten als empfänglich für eine pPBE an, die in
zytologischen Proben des Uterus eine über 36 Stunden post inseminationem (p.i.) anhaltende
Entzündungsreaktion aufwiesen. Damit unterstreichen die Ergebnisse der zytologischen
Untersuchung, dass es sich bei den ausgewählten 54 Stuten nicht etwa um „gesunde“ oder
resistente Tiere (RM) handelte, sondern tatsächlich um
für eine persistierende
besamungsinduzierte Endometritis empfängliche Stuten (SM), die unabhängig von der
Behandlungsform nicht dazu in der Lage waren, die durch die Besamung hervorgerufene
Endometritis zu eliminieren. Beim Rind stellt sich der Ablauf der physiologischen
Entzündungsreaktion post inseminationem anders als bei der Stute dar: In einer aktuellen
Studie von DRILLICH et al. (2012) wurde die endometriale PMN-Zahl bei superovulierten
Kühen am Tag der ersten von 3 künstlichen Besamungen (KB) , der als Tag -1 angesprochen
wurde (Tag 0 = Tag der Ovulation), und vor der Embryospülung (Tag 7) durch CytobrushProben bestimmt. Ein deutlicher Anstieg der PMN-Anzahl zwischen Tag -1 und Tag 7 wurde
bei den Kühen, die in der ersten zytologischen Endometriumprobe keine neutrophilen
Granulozyten aufwiesen, als physiologischer Prozess in Folge der großen Gelbkörperanzahl
angesprochen. Bei einer positiven zytologischen Probe vor der Ovulation und niedrigeren,
aber immer noch positive PMN-Zahlen am Tag 7 gingen die Autoren von einer Abweichung
von der reproduktiven Leistungsfähigkeit der Kühe aus.
In Hinblick auf das Ergebnis der Trächtigkeitsuntersuchung war die zuletzt entnommene
zytologische Probe (Ct4, 48 Stunden post inseminationem) von besonderem Interesse, da sie
Auskunft über eine bewältigte oder noch vorhandene Entzündungsreaktion im Uterus geben
sollte. Es konnte nur bei etwa einem Viertel der Stuten (siehe Kapitel 3.2.2.4, Tabelle 14) ein
negatives Ergebnis der zytologischen Untersuchung beobachtet werden. Ein Drittel der
Gesamtpopulation (18/54) zeigte sogar eine hochgradige PMN-Anzahl (≥ 50 PMN) in der
99
DISKUSSION
Probe Ct4, was auf ein stark entzündliches intrauterines Milieu schließen ließ (s. Kapitel
3.2.2.4, Tabelle 13).
Mittels einer einfaktoriellen Varianzanalyse (Prozedur GLM) konnte kein signifikanter
Zusammenhang zwischen der Anzahl der neutrophilen Granulozyten (PMN) 48 Stunden nach
der Besamung (Ct4) und dem Trächtigkeitsergebnis hergestellt werden. Die mittlere PMNZahl zum Zeitpunkt Ct4  lag bei den tragenden Stuten (13/54) bei 73,7 ± 108,8, bei den
nicht-tragenden Stuten (41/54) bei 76,6 ± 112,6. Somit war die Trächtigkeitsrate der
Gesamtpopulation unabhängig von der PMN-Zahl der letzten Cytobrush-Probe. Diese
Beobachtung ist jedoch vorsichtig zu interpretieren, da es sich bei den für die Studie
ausgewählten Stuten ja um solche handelte, die eine bereits dokumentierte Neigung zu pPBE
hatten. Somit ist zwar die zytologische Probenauswertung 48 Stunden nach der Besamung bei
empfänglichen Stuten (SM) kein geeignetes Mittel, um die Wahrscheinlichkeit einer
Trächtigkeit vorauszusagen, aber doch ein zuverlässiger Entzündungsindikator. Bei einem
positiven zytologischen Ergebnis sollte zur Verbesserung der Trächtigkeitschancen eine
Behandlung
der
Stuten
eingeleitet
werden
(siehe
Kapitel
2.2.4
„Herkömmliche
Therapieansätze“). TROEDSSON (1995) beobachtete, dass geschlechtsgesunde Stuten die
Entzündungsreaktion auf eine Besamung hin innerhalb von 96 Stunden p.i. eliminieren
konnten, was für die vorliegende Studie eine Entnahme von ein bis zwei weiteren
zytologischen Endometriumsproben z.B. 72 und 96 Stunden nach der Besamung erfordert
hätte.
Ob
zwischen
diesen
zusätzlichen
zytologischen
Proben
und
der
Trächtigkeitsuntersuchung eine Korrelation bestanden hätte, ist ungewiss, die Überlegung
sollte aber als Denkanstoß für eventuelle Nachfolgeuntersuchungen im Rahmen zukünftiger
Studien dienen.
100
ZUSAMMENFASSUNG
5 ZUSAMMENFASSUNG
Pia Harnacke (2012):
Autologes konditioniertes Serum als Behandlung einer persistierenden post-breeding
Endometritis bei Stuten
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden, welchen Einfluss eine
Behandlung der zu persistierender post-breeding Endometritis (pPBE) neigenden Stuten mit
dem Immunmodulator autologes konditioniertes Serum (ACS) im Vergleich zu der
Anwendung von Prednisolonacetat und Ringerlösung auf die Trächtigkeitsrate, die
Ansammlung von intrauteriner Flüssigkeit und die Anzahl neutrophiler Granulozyten in der
Zytologie des Endometriums nimmt.
Für die Studie standen 54 Warmblutstuten zur Verfügung, die in 54 Zyklen untersucht
wurden. Dabei handelte es sich um Tiere, die seit mindestens einem Jahr güst waren, somit
schieden grundsätzlich Maiden- und Fohlenstuten aus. Es wurden ausschließlich Stuten
ausgewählt, die in der letzten Saison erfolglos künstlich besamt wurden, bei denen eine
Neigung zu einer pPBE bereits dokumentiert wurde und die klinisch allgemeingesund waren.
Bevor eine Stute für die Teilnahme an der Studie zugelassen wurde, wurde mittels eines
sterilen
Endometriumstupfers
der
mikrobiologische
Status
des
Uterus
überprüft.
Die Verteilung der Versuchstiere auf die 3 Behandlungsgruppen (autologes konditioniertes
Serum, ACS = Gruppe 1, Prednisolonacetat = Gruppe 2 und Ringer-Lösung = Gruppe 3)
erfolgte randomisiert. Die Auswahl des zu verwendenden verdünnten Frischsamens der vier
für die Studie hinsichtlich ihrer guten Fertilität selektierten Hengste unterlag der
Entscheidung des Stutenbesitzers (Besamungsdosis 500 x 106 vorwärtsbewegliche Spermien
in 12 ml Inseminatvolumen). Die Ovulationsinduktion erfolgte bei ultrasonographischem
Nachweis eines Follikels mit einem Durchmesser von mindestens 35 mm durch intravenöse
Applikation von 2500 IE hCG, wobei die Stuten zwischen 24 und 48 Stunden post
injectionem künstlich besamt wurden. Bei allen Stuten wurden zum Zeitpunkt der
intravenösen hCG-Gabe (t1), 4 bis 6 Stunden nach der Besamung (t2), sowie 24 (t3) und
48 Stunden post inseminationem (t4) Proben für die zytologische Untersuchung entnommen
101
ZUSAMMENFASSUNG
und transrektal ultrasonographische Kontrollen durchgeführt, um die Ansammlung
intrauteriner Flüssigkeit zu dokumentieren. Die Trächtigkeitsuntersuchung wurde zwischen
dem 15. und 18. Tag post ovulationem durchgeführt.
Folgende Ergebnisse wurden erarbeitet:
1.
Es
bestand
kein
Zusammenhang
zwischen
der
Behandlungsgruppe
und
der
Trächtigkeitsrate der Stuten. Dabei konnte bei den Stuten, die mit autologem konditionierten
Serum behandelt wurden (n = 18), beobachtet werden, dass jede der insgesamt
drei Fruchtanlagen (drei tragende Stuten) zum Zeitpunkt der ultrasonographischen
Trächtigkeitsuntersuchung für ihr Alter zu klein war und zwischen Tag 18 und 25 post
ovulationem resorbiert wurde.
2. Zum Zeitpunkt 48 Stunden post inseminationem zeigten 42 Tiere (78 %) keine, 7 Tiere
(13 %) unter 2 cm Höhe und 5 Tiere (9 %) über 2 cm Höhe intrauterine Flüssigkeit. Zu den
Tieren mit mehr als 2 cm Flüssigkeitshöhe im Uterus gehörten 2 Tiere zu der Gruppe ACS,
ein Tier zu der Gruppe Prednisolonacetat und 2 Tiere zu der Gruppe, die mit Ringer-Lösung
behandelt wurde.
3. Bei dem Vergleich der Mittelwerte der Anzahl an neutrophilen Granulozyten (PMN) zu
den vier Messzeitpunkten konnten bei Gruppe 1 (ACS) tendenziell, jedoch nicht signifikant,
höhere Neutrophilen-Zahlen als bei den anderen beiden Behandlungsgruppen nachgewiesen
werden. Damit schien die Therapieform keinen Einfluss auf den Entzündungsverlauf zu
nehmen.
4. Verglich man hingegen die PMN-Zahl zweier verschiedener Messzeitpunkte miteinander,
so unterschieden sich diese unabhängig von der Behandlungsgruppe signifikant voneinander.
Bei der Gegenüberstellung der PMN-Werte zum Zeitpunkt der hCG-Gabe und 48 Stunden
post inseminationem sollte überprüft werden, ob und wie viele Stuten eine erfolgreiche
Entzündungselimination post inseminationem (maximal 5 PMN bei 400-facher Vergrößerung
in 10 zufällig ausgewählten Gesichtsfeldern) erreichen konnten: Unabhängig von der
Behandlungsgruppe war auch 48 Stunden nach der Besamung bei einem Großteil der Stuten
ein hochgradig positives zytologisches Probenergebnis und damit ein entzündliches
intrauterines Milieu anzutreffen.
102
ZUSAMMENFASSUNG
5. Es konnte kein Zusammenhang zwischen der Anzahl der neutrophilen Granulozyten
48 Stunden nach der künstlichen Besamung (Ct4) und dem Trächtigkeitsergebnis hergestellt
werden.
Aus den Ergebnissen der vorliegenden Studie lässt sich schließen, dass sowohl durch eine
Behandlung mit ACS als auch mit Prednisolonacetat im Vergleich zu einer Placebo-Gruppe
keine zufriedenstellende anti-inflammatorische Wirkung auf das intrauterine Milieu und
damit auch keine Verbesserung der Fruchtbarkeit der zu pPBE neigenden Stuten erreicht
werden konnte. Es werden weitere Untersuchungen notwendig sein, um die genaue Funktion
des Interleukin-1 im Zusammenhang mit der Etablierung einer Trächtigkeit bei der Stute zu
erfassen.
103
SUMMARY
6 SUMMARY
Pia Harnacke (2012)
Autologous conditioned serum as a therapy of persistent post-breeding endometritis (pPBE)
in mares
The aim of the present study was to investigate the influence of administering the
immunomodulator autologous conditioned serum (ACS) to mares with a disposition to
persistent post-breeding endometritis (pPBE) on pregnancy rates, intrauterine fluid
accumulation and polymorphonuclear neutrophils (PMN) count in endometrial cytology in
comparison to prednisolone acetate and Ringer’s-solution.
Fifty-four warmblood mares were examined in 54 cycles. These horses were barren for at
least a year, which excluded mares with foal and maiden mares in general. Only mares were
included in this study which were inseminated unsuccessfully and reported to be disposed to
pPBE and were sound after general examination. Before entering the study, the
microbiological status of each mare was documented by a sterile culture swab of the uterus. A
randomized distribution of the animals into 3 treatment groups was performed (autologous
conditioned serum (ACS) = group 1, prednisolone acetate = group 2 and Ringer’s solution =
group 3). The fresh semen of four stallions with high fertility was chosen by the owner of the
mare (500 x 106 progressive motile spermatozoa in 12 ml insemination volume). The
spontaneously cycling mares were intravenously treated with 2500 IU hCG when the
dominant follicle showed a diameter of at least 35 mm in transrectal ultrasound examination
and were artificially inseminated 24 to forty-eight hours after hormone application.
Microbiological and cytological samples were collected and transrectal ultrasound
examinations with regard to intrauterine fluid accumulation were performed at the time of the
hCG-administration (t1), 4 to 6 hours post-mating (t2), 24 (t3) and 48 hours post
inseminationem (t4). Pregnancy diagnosis was performed ultrasonically between day fifteen
and eighteen post ovulationem.
The following results were obtained:
104
SUMMARY
1. There was no correlation between treatment and pregnancy rates. However all three
embryos in group 1 (ACS) (3 pregnant mares/18) appeared to be too small in proportion to
their age and embryo loss was observed between day 18 and 25 after ovulation.
2. Forty-eight hours after mating, 42 mares (78 %) showed no fluid, 7 mares (13 %) less than
2 cm height and 5 mares (9 %) more than 2 cm height of intrauterine fluid accumulation.
Among these animals, which showed more than 2 cm height of fluid, 2 mares had been
treated with ACS, 1 mare had received prednisolone acetate and 2 mares had been treated
with Ringer’s solution.
3. Comparing the average PMN count of the 3 treatment groups in relation to the different
times of evaluation, PMN counts of group 1 (ACS) tended to be higher, however not
significantly higher than the other groups. These findings indicate that the inflammatory
process was not correlated to the treatment.
4. The results of the evaluation following the above mentioned time-schedule showed
significant differences regardless of treatment group. By comparing PMN count at the time of
hCG-administration and PMN 48 hours post-mating, elimination of the inflammatory process
was evaluated: Regardless the treatment, even 48 hours after insemination the mares were still
dealing with a severely positive cytological result and therefore with intrauterine
inflammation.
5. There was no correlation between PMN count 48 hours post-mating (Ct4) and pregnancy
rates.
The study revealed, that both treatment with ACS and prednisolone acetate in comparison to a
placebo group had no satisfactory anti-inflammatory influence on the intrauterine milieu and
failed therefore to improve fertility of mares with a disposition to pPBE. Further
investigations are needed to investigate the exact function of Interleukin-1 in the context of a
successful establishment of pregnancy in the mare.
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125
ANHANG
8 ANHANG
Firmenverzeichnis
Fa. Andreas Hettich GmbH & Co.KG, Tuttlingen
Zentrifuge „Rotofix 32“
Fa. B. Braun, Melsungen
Aqua dest, sterile Ringerlösung,
Sterifix® Injektionsfilter, Inject®
Solo Einmalspritzen, Sterican®
Kanülen
Fa. cp-Pharma, Burgdorf
Einmalrektalhandschuhe,
Prednisolonacetat
Injektionssuspension ad us. vet.
Fa. Eickemeyer Tuttlingen
Digital Ultrasonic Diagnostic
Imaging System, Model: Magic
2200, 7,5 MHz Linearschallkopf
Fa. Equivet Kruuse UK Ltd.,
Sherburn Elmet, United Kingdom
Einmaltupfer Equivet®
Fa. HCP-Technology GmbH, Nortrup
Wärmebox
Fa. Heiland, Hamburg
Objektträger, Einmalpapiertücher
Fa. HERMLE Labortechnik GmbH, Wehingen
Zentrifuge Hermle Z 300
Fa. Intervet Unterschleißheim
hCG (Ovogest 5000®)
Cloprostenol (Estrumate® ad us.
vet)
Fa. Medion Diagnostics AG, Düdingen, Schweiz
Diff-Quick-Färbung®
Fa. Memmert GmbH + Co. KG, Schwabach
CO2-Brutschrank INCOmed
Fa. Minitüb, Tiefenbach, Landshut
Künstliche
Scheide
Modell
Hannover, Besamungspipetten
Fa. Olympus, Hamburg
Lichtmikroskop Typ Cx31
Fa. Orthogen Veterinary GmbH, Düsseldorf
irap® 50 ml Blood sampling
Syringe Set, Glascontainer zur
Inkubation der Spritzen in der
Wärmebox
Fa. Oxoid, Basingstoke, England
Bakteriennährböden
126
ANHANG
Fa. Schülke & Mayr GmbH, Norderstedt
Kodan® Tinktur Forte farblos
Fa. Semadeni (Europe) AG, Düsseldorf
sterile Zentrifugenröhrchen mit
Schraubverschluss
Fa. Servoprax GmbH, Wesel
Abstrichbürstchen Celltip®
Fa. Siemens Electrogeräte GmbH, München
Kühlschrank-Modell
KG39EAI40X
Fa. Spervital, Toldiyk, Niederlande
Eiweißverdünner EDV®
Fa. WDT, Garbsen
Gleitgel
Färbeanleitungen
Spermac Stain™
Zuerst wird ein hauchdünner Spermienausstrich mit einem
Tropfen des verdünnten Frischsamens angefertigt. Dieser sollte
maximal 5 Minuten trocknen. Danach wird der so beschickte
Objektträger für 5 Minuten in einem Coplin-Glas in die
Fixierlösung gestellt. Die Lösung wird durch vorsichtiges,
fünfmal wiederholtes Eintauchen in destilliertes Wasser
abgespült. Das überschüssige Wasser wird durch das schräge
Abstellen des Objektträgers für 5 Sekunden auf einem
saugfähigen Papiertuch (Fa. Heiland, Hamburg, Deutschland)
entfernt. Die 3 Färbelösungen (A, B und C) werden jeweils in
Coplin-Gläser gefüllt. Nun wird der Spermienausstrich wie
folgt gefärbt: 1 bis 2 Minuten in Färbung A halten, Abspülen
wie bei der Fixierlösung beschrieben, 1 Minuten in Färbung B
halten, Abspülen wie bei der Fixierlösung beschrieben, 1
Minute in Färbung C geben, Abspülen wie bei der Fixierlösung
beschrieben, Objektträger für einen Tag lufttrocknen.
Nigrosin-Eosin-Färbung
Zunächst 1 Tropfen verdünnten Frischsamen mit 2 Tropfen
Eosin-Nigrosin-Färbelösung auf einem Objektträger gut
vermischen (z.B. Flüssigkeiten zusammen mit einer Pipette
mehrfach ansaugen und wieder abgeben). Innerhalb von
30 Sekunden einen kleinen Tropfen der gemischten Lösung auf
einen weiteren Objektträger geben und einen hauchdünnen
Ausstrich anfertigen und diesen lufttrocknen.
127
ANHANG
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1:
Graphische Darstellung des Ovulationszeitpunktes nach der
parallelen Verabreichung von 2500 I.E. hCG (intravenös) und 4
ml ACS (intrauterin) an Stuten in 3 Rosseperioden
(ACS = autologes konditioniertes Serum; hCG = humanes
Choriongonadotropin)
Abbildung 2:
Schema der Gruppeneinteilung der insgesamt 54 an der Studie
beteiligten Stuten auf die 4 Hengste und der innerhalb der
Hengstgruppen vorgenommenen Aufteilung auf die Gruppen 1
bis 3 (Gruppe 1 = ACS; Gruppe 2 = Prednisolonacetat;
Gruppe 3 = Ringer-Lösung)
Abbildung 3:
Schema des Versuchsaufbaus; der Besamungszeitpunkt gilt als
0 Stunden (h)
(ACS = autologes konditioniertes Serum; hCG = humanes
Choriongonadotropin)
Abbildung 4:
Schema des Probenansatzes pro Hengst und Ejakulat (Verd. FS =
verdünnter Frischsamen; ACS = autologes konditioniertes Serum)
Abbildung 5:
Graphische Darstellung der in Tabelle 2 detailliert aufgeführten
Messwerte des Anteils toter Spermien in Prozent (Mittelwert aus
9 verschiedenen Ejakulaten) in der Nigrosin-Eosin-Färbung
(Merkmal 1 = M 1), getrennt nach Probenansatz bei Kühlschrankund Brutschranklagerung (Kühlschrank = K; Brutschrank = B)
sowie nach Verdünnungsstufe mit autologem konditionierten
Serum (ACS) (Portion verdünnter Frischsamen mit 4 ml ACS =
A; Portion verdünnter Frischsamen mit 0,4 ml ACS = B; Portion
verdünnter Frischsamen ohne Zusatz = C) zu den
Messzeitpunkten direkt nach Probenansatz (Zeitpunkt 0 = t0) und
24 Stunden später (Zeitpunkt 24 Stunden = t24)
Abbildung 6:
Graphische Darstellung der in Tabelle 3 detailliert aufgeführten
Messwerte des Anteils veränderter Spermien in Prozent
(Mittelwert aus 9 verschiedenen Ejakulaten) in der Spermac
Stain™-Färbung (Merkmal 2 = M 2), getrennt nach Probenansatz
bei Kühlschrank- und Brutschranklagerung (Kühlschrank = K;
Brutschrank = B) sowie nach Verdünnungsstufe mit autologem
konditionierten Serum (ACS) (Portion verdünnter Frischsamen
mit 4 ml ACS = A; Portion verdünnter Frischsamen mit 0,4 ml
ACS = B; Portion verdünnter Frischsamen ohne Zusatz = C) ) zu
den Messzeitpunkten direkt nach Probenansatz (Zeitpunkt 0 = t0)
und 24 Stunden später (Zeitpunkt 24 Stunden = t24)
128
ANHANG
Abbildung 7:
Graphische Darstellung der in Tabelle 5 detailliert aufgeführten
Messwerte des Anteils vorwärtsbeweglicher Spermien in Prozent
(Mittelwert aus 9 verschiedenen Ejakulaten) (Merkmal 3 = M 3),
getrennt
nach
Probenansatz
bei
Kühlschrankund
Brutschranklagerung (Kühlschrank = K; Brutschrank = B) sowie
nach Verdünnungsstufe mit autologem konditionierten Serum
(ACS) (Portion verdünnter Frischsamen mit 4 ml ACS = A;
Portion verdünnter Frischsamen mit 0,4 ml ACS = B; Portion
verdünnter Frischsamen ohne Zusatz = C) zu den
Messzeitpunkten eine halbe Stunde (Zeitpunkt 05 = t05),
2 Stunden (t2), 4 Stunden (t4), 8 Stunden (t8) und 24 Stunden
nach Probenansatz (t24)
Abbildung 8:
Graphische Darstellung der in Tabelle 6 detailliert aufgeführten
Messwerte des Anteils gesamtbeweglicher Spermien in Prozent
(Mittelwert aus 9 verschiedenen Ejakulaten) (Merkmal 4 = M 4),
getrennt
nach
Probenansatz
bei
Kühlschrankund
Brutschranklagerung (Kühlschrank = K; Brutschrank = B) sowie
nach Verdünnungsstufe mit autologem konditionierten Serum
(ACS) (Portion verdünnter Frischsamen mit 4 ml ACS = A;
Portion verdünnter Frischsamen mit 0,4 ml ACS = B; Portion
verdünnter Frischsamen ohne Zusatz = C) zu den
Messzeitpunkten eine halbe Stunde (Zeitpunkt 05 = t05),
2 Stunden (t2), 4 Stunden (t4), 8 Stunden (t8) und 24 Stunden
nach Probenansatz (t24)
Abbildung 9:
Graphische Darstellung des Verlaufs der in Tabelle 18 detailliert
aufgeführten Mittelwerte  der Anzahl der
neutrophilen
Granulozyten (PMN) in den zytologischen Proben bei 400-facher
Vergrößerung in 10 zufällig ausgewählten Gesichtsfeldern zu den
verschiedenen Messzeitpunkten Ct1 bis Ct4 zwischen den
Behandlungsgruppen ACS (n = 18), Prednisolonacetat (n = 18)
und Ringer-Lösung (n = 18); ACS = Autologes konditioniertes
Serum; Ct1 = Probe am Tag der hCG-Applikation; Ct2 = Probe
4 bis 6 Stunden post inseminationem (= p.i.); Ct3 = Probe
24 Stunden p.i.; Ct4 = Probe 48 Stunden p.i.
129
ANHANG
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1:
Auswertung des Einflusses des autologen konditionierten Serums
(ACS) auf die Samenmorphologie in vitro: Prävalenzen der
Unterschiede zwischen den
Gruppen (aufgeteilt nach
Verdünnungsstufe mit autologem konditionierten Serum (ACS):
Portion verdünnter Frischsamen mit 4 ml ACS = A; Portion
verdünnter Frischsamen mit 0,4 ml ACS = B; Portion verdünnter
Frischsamen ohne Zusatz = C) getrennt nach Anteil toter
Spermien in der Nigrosin-Eosin-Färbung (Merkmal 1 = M 1) und
Anteil veränderter Spermien in der Spermac Stain™-Färbung
(Merkmal 2 = M 2) sowie nach Probenansatz bei Kühlschrankund Brutschranklagerung (Kühlschrank = K; Brutschrank = B)
zum Messzeitpunkt 24 Stunden nach Probenansatz (t24)
* = P ≤ 0,05; ** = P ≤ 0,01; *** = P ≤ 0,001
Tabelle 2:
Auswertung des Einflusses des autologen konditionierten Serums
(ACS) auf die Samenmotilität in vitro: Prävalenzen der
Unterschiede zwischen den
Gruppen (aufgeteilt nach
Verdünnungsstufe mit autologem konditionierten Serum (ACS):
Portion verdünnter Frischsamen mit 4 ml ACS = A; Portion
verdünnter Frischsamen mit 0,4 ml ACS = B; Portion verdünnter
Frischsamen ohne Zusatz = C) getrennt nach Anteil
vorwärtsbeweglicher Spermien (Merkmal 3 = M 3) und Anteil
gesamtbeweglicher Spermien (Merkmal 4 = M 4) sowie nach
Probenansatz bei Kühlschrank- und Brutschranklagerung
(Kühlschrank = K; Brutschrank = B) zu den Messzeitpunkten
eine halbe Stunde (Zeitpunkt 05 = t05), 2 Stunden (t2), 4 Stunden
(t4), 8 Stunden (t8) und 24 Stunden nach Probenansatz (t24)
* = P ≤ 0,05; ** = P ≤ 0,01; *** = P ≤ 0,001; - = keine Differenz
Tabelle 3:
Zusammenhang zwischen Hengst und Trächtigkeitsergebnis nach
der Besamung (TU = Ergebnis der Trächtigkeitsuntersuchung
zwischen Tag 15 und 18 post ovulationem)
Tabelle 4:
Einfluss des Besamungsmonats auf das Trächtigkeitsergebnis
nach Besamung (TU = Ergebnis der Trächtigkeitsuntersuchung
zwischen Tag 15 und 18 post ovulationem)
Tabelle 5:
Zusammenhang zwischen Alter und Trächtigkeitsergebnis nach
Besamung (TU = Ergebnis der Trächtigkeitsuntersuchung
zwischen Tag 15 und 18 post ovulationem)
Tabelle 6:
Häufigkeitsverteilung zwischen Behandlungsgruppen
Altersgruppen (ACS = Autologes konditioniertes Serum)
130
und
ANHANG
Tabelle 7:
Häufigkeitsverteilung zwischen Behandlungsgruppe und Alter in
Jahren
Tabelle 8:
Häufigkeitsverteilung
zwischen
Behandlungsgruppe
und
Trächtigkeitsergebnis (TU = Trächtigkeitsuntersuchung zwischen
Tag 15 und 18 post ovulationem; ACS = Autologes
konditioniertes Serum)
Tabelle 9:
Häufigkeitsverteilung zwischen Behandlungsgruppe und Güstzeit
in Jahren (ACS = Autologes konditioniertes Serum; Ringer =
Ringer-Lösung)
Tabelle 10:
Häufigkeitsverteilung zwischen tragenden Tieren in den
Behandlungsgruppen und Güstzeitgruppen
(ACS = autologes konditioniertes Serum; Prozentangaben vertikal
= Anteil bezogen auf die Anzahl der untersuchten Stuten der
jeweiligen Behandlungsgruppe; Prozentangaben horizontal =
Anteil bezogen auf die Gesamtzahl der untersuchten Stuten)
Tabelle 11:
Zusammenhang zwischen der Güstzeit und dem Ergebnis der
Trächtigkeitsuntersuchung bezogen auf die Gesamtpopulation
(TU = Trächtigkeitsuntersuchung zwischen Tag 15 und 18 post
ovulationem)
Tabelle 12:
Häufigkeitsverteilung
zwischen
Behandlungsgruppe
und
durchgeführter
Caslick-Scheidenplastik
(ACS =
Autologes konditioniertes Serum; Ringer = Ringer-Lösung)
Tabelle 13:
Zytologische Auswertung bei Trennung nach Gruppen:
Signifikante
Unterschiede
zwischen
den
einzelnen
Messzeitpunkten
Stuten (n) pro Behandlungsgruppe: n = 18; ACS = Autologes
konditioniertes Serum; Ct1 = Probe am Tag der hCG-Applikation
Ct2 = Probe 4 bis 6 Stunden post inseminationem (= p.i.); Ct3 =
Probe 24 Stunden p.i.; Ct4 = Probe 48 Stunden p.i.; Beispiel:
Ct1Ct2 = Differenz zwischen der Anzahl der neutrophilen
Granulozyten
zum
Zeitpunkt
Ct1
und
Ct2
* = P ≤ 0,05; ** = P ≤ 0,01; *** = P ≤ 0,001
Tabelle 14:
Häufigkeitsverteilung zwischen Behandlungsgruppen und der
Anzahl der neutrophilen Granulozyten (PMN) in der
zytologischen Probe bei 400-facher Vergrößerung in 10 zufällig
ausgewählten Gesichtsfeldern zum Zeitpunkt Ct1 (hCGApplikation)
ACS = Autologes konditioniertes Serum
* = ≥ 50 PMN
Tabelle 15:
Häufigkeitsverteilung zwischen Behandlungsgruppen und der
Anzahl der neutrophilen Granulozyten (PMN) in der
131
ANHANG
zytologischen Probe bei 400-facher Vergrößerung in 10 zufällig
ausgewählten Gesichtsfeldern zum Zeitpunkt Ct4 (48 Stunden
post inseminationem)
ACS = Autologes konditioniertes Serum
* = ≥ 50 PMN
132
ANHANG
Tabellenanhang
Tabelle 1: Zeit in Stunden bis zur Ovulation nach der parallelen Verabreichung von 2500 I.E.
hCG (intravenös) und 4 ml ACS (intrauterin) an Stuten in 3 Rosseperioden
Ovulationszeitpunkt nach ACS- und hCG-Gabe
in Stunden
Stute Nr.
Zyklus 1
Zyklus 2
Zyklus 3
1
60
48
36
2
48
96
24
3
48
72
24
(ACS = autologes konditioniertes Serum; hCG = humanes Choriongonadotropin)
Tabelle 2: Anteil der toten Spermien in Prozent (Mittelwert aus 9 verschiedenen Ejakulaten)
in der Nigrosin-Eosin-Färbung (Merkmal 1 = M 1), getrennt nach Probenansatz bei
Kühlschrank- und Brutschranklagerung (Kühlschrank = K; Brutschrank = B) sowie nach
Verdünnungsstufe mit autologem konditionierten Serum (ACS)
Probenansätze getrennt
nach Lagerungsart und
Verdünnungsstufe
Anteil toter Spermien in Prozent zu den
Messzeitpunkten t
t0
t24
M 1 K -A-
7
24
M 1 B -A-
7
57
M 1 K -B-
7
20
M 1 B -B-
7
51
M 1 K -C-
7
11
M 1 B -C-
6,2
46
Portion verdünnter Frischsamen mit 4 ml ACS = A; Portion verdünnter Frischsamen mit 0,4 ml ACS = B;
Portion verdünnter Frischsamen ohne Zusatz = C; gemessen zu den Messzeitpunkten direkt nach Probenansatz
(Zeitpunkt 0 = t0) und 24 Stunden später (Zeitpunkt 24 Stunden = t24)
133
ANHANG
Tabelle 3: Anteil der veränderten Spermien in Prozent (Mittelwert aus 9 verschiedenen
Ejakulaten von 3 Hengsten) in der Spermac Stain™-Färbung (Merkmal 2 = M 2), getrennt
nach Probenansatz bei Kühlschrank- und Brutschranklagerung (Kühlschrank = K;
Brutschrank = B) sowie nach Verdünnungsstufe mit autologem konditionierten Serum (ACS)
Probenansätze getrennt nach
Lagerungsart und
Verdünnungsstufe
Anteil veränderter Spermien in Prozent zu
den Messzeitpunkten t
t0
t24
M 2 K -A-
13
24
M 2 B -A-
13
30
M 2 K -B-
13
18
M 2 B -B-
13
28
M 2 K -C-
13
16
M 2 B -C-
13
15
Portion verdünnter Frischsamen mit 4 ml ACS = A; Portion verdünnter Frischsamen mit 0,4 ml ACS = B;
Portion verdünnter Frischsamen ohne Zusatz = C; gemessen zu den Messzeitpunkten direkt nach Probenansatz
(Zeitpunkt 0 = t0) und 24 Stunden später (Zeitpunkt 24 Stunden = t24)
Tabelle 4: Anteil der vorwärtsbeweglichen Spermien in Prozent (Mittelwert aus
9 verschiedenen Ejakulaten von 3 Hengsten) (Merkmal 3 = M 3), getrennt nach Probenansatz
bei Kühlschrank- und Brutschranklagerung (Kühlschrank = K; Brutschrank = B) sowie nach
Verdünnungsstufe mit autologem konditionierten Serum (ACS)
Probenansätze
getrennt nach
Lagerungsart und
Verdünnungsstufe
Anteil der vorwärtsbeweglichen Spermien in Prozent
zu den Messzeitpunkten t
t05
t2
t4
t8
t24
M 3 K -A-
68
47
34
22
19
M 3 B -A-
56
41
25
6
0
M 3 K -B-
73
73
68
59
51
M 3 B -B-
73
67
41
6
0
M 3 K -C-
75
73
69
60
54
M 3 B -C-
74
68
46
6
0
Portion verdünnter Frischsamen mit 4 ml ACS = A; Portion verdünnter Frischsamen mit 0,4 ml ACS = B;
Portion verdünnter Frischsamen ohne Zusatz = C; gemessen zu den Messzeitpunkten eine halbe Stunde
(Zeitpunkt 05 = t05), 2 Stunden (t2), 4 Stunden (t4), 8 Stunden (t8) und 24 Stunden nach Probenansatz (t24)
134
ANHANG
Tabelle 5: Anteil der gesamtbeweglichen Spermien in Prozent (Mittelwert aus
9 verschiedenen Ejakulaten von 3 Hengsten) (Merkmal 4 = M 4), getrennt nach Probenansatz
bei Kühlschrank- und Brutschranklagerung (Kühlschrank = K; Brutschrank = B) sowie nach
Verdünnungsstufe mit autologem konditionierten Serum (ACS)
Probenansätze
getrennt nach
Lagerungsart und
Verdünnungsstufe
Anteil der gesamtbeweglichen Spermien in Prozent zu den
Messzeitpunkten t
t05
t2
t4
t8
t24
M 4 K -A-
72
62
55
47
44
M 4 B -A-
63
52
37
11
0,2
M 4 K -B-
78
77
72
68
62
M 4 B -B-
76
69
48
19
0,1
M 4 K -C-
78
77
71
63
57
M 4 B -C-
78
74
52
16
0
Portion verdünnter Frischsamen mit 4 ml ACS = A; Portion verdünnter Frischsamen mit 0,4 ml ACS = B;
Portion verdünnter Frischsamen ohne Zusatz = C; gemessen zu den Messzeitpunkten eine halbe Stunde
(Zeitpunkt 05 = t05), 2 Stunden (t2), 4 Stunden (t4), 8 Stunden (t8) und 24 Stunden nach Probenansatz (t24)
Tabelle 6: Vergleich der mittleren Anzahl ( ± s) der neutrophilen Granulozyten (PMN) in
den zytologischen Proben (pro Behandlungsgruppe und Messzeitpunkt 18 Proben) bei 400facher Vergrößerung in 10 zufällig ausgewählten Gesichtsfeldern zu den verschiedenen
Messzeitpunkten Ct1 bis Ct4 zwischen den Behandlungsgruppen
Mittelwert  ± s der PMN-Anzahl
Messzeitpunkte
ACS
Prednisolonacetat
Ringer-Lösung
Ct1
53,4 ± 87,1
9,3 ± 25,5
24,5 ± 62,6
Ct2
413,9 ± 200,3
370,3 ± 148,1
330,9 ± 196,3
Ct3
201,7 ± 163.9
159,1 ± 153,9
163,7 ± 195,6
Ct4
89,9 ± 128,4
90,7 ± 132,9
47,1 ± 51,9
ACS = Autologes konditioniertes Serum; Ct1 = Probe am Tag der hCG-Applikation; Ct2 = Probe 4 bis 6
Stunden post inseminationem, p.i.; Ct3 = Probe 24 Stunden p.i.; Ct4 = Probe 48 Stunden p.i.;  ± s = Mittelwert
± Standardabweichung
135
ANHANG
Untersuchte Parameter bei allen Stuten (n = 54) (außer endometriales Ödem, Anzahl der
neutrophilen Granulozyten (PMN) in der zytologischen Untersuchung und intrauterine
Flüssigkeitsansammlung) getrennt nach Behandlungsgruppe.
136
ANHANG
Tabelle 7: Gruppe 1 autologes konditioniertes Serum
Stute Hengst
Alter
güst
Caslick- Bes.M
on.
Nr.
OP
Emb.
UD
Ov. 24h
p.i.
Ov. p.
hCG
TU
30
2
11
2
2
6
2
1
48
2
25
4
8
1
1
6
1
1
48
1
10
2
14
1
1
6
2
2
72
2
13
1
7
1
2
5
1
1
24
1
22
1
7
2
2
5
2
1
24
2
19
4
7
1
1
5
2
1
48
2
16
3
30
6
2
5
2
1
48
2
7
3
9
3
2
5
2
1
24
2
1
1
26
4
2
4
2
2
72
2
4
4
30
6
1
3
2
2
72
2
33
2
9
2
1
7
2
1
48
2
39
4
14
1
2
7
2
1
24
2
42
4
15
1
2
7
1
1
48
1
36
1
12
2
1
7
2
1
24
2
45
4
21
5
2
8
2
1
48
2
48
1
25
10
2
8
2
1
48
2
51
4
8
3
2
8
2
1
48
2
54
3
15
1
2
8
2
1
48
2
Alter: in Jahren; güst: seit n Jahren; Caslick-OP: 1 = Scheidenplastik durchgeführt; 2 = Scheidenplastik nicht
durchgeführt; Bes.Mon. = Besamungsmonat; TU = Ergebnis der Trächtigkeitsuntersuchung (durchgeführt
zwischen dem 15. und 18. p.o.): 1 = positiv; 2 = negativ; EmbUD = embryo under-developed, also zu klein;
1 = ja, 2 = nein; Ovulation 24h p.i. = Ovualtion hat 24 h post inseminationem stattgefunden: 1 = ja; 2 = nein,
Ovulation hat innerhalb von 48 h p.i. stattgefunden
Ovulation p. hCG = Zeitpunkt der Ovulation nach der hCG-Gabe in Stunden
137
ANHANG
Tabelle 8: Gruppe 2 Prednisolonacetat
Stute Hengst
Alter
güst CaslickNr.
OP
Bes.M
on.
Emb
.UD
Ov.
24h
p.i.
Ov. p.
hCG
TU
31
1
13
3
2
6
2
1
24
2
29
2
9
4
1
6
2
1
24
2
23
2
9
2
2
6
2
1
24
2
26
1
19
2
1
6
2
2
72
2
14
1
14
2
1
5
2
1
24
2
17
2
9
1
2
5
2
1
24
1
20
4
14
5
2
5
2
1
48
2
11
2
15
1
2
4
2
2
72
2
2
1
21
2
2
3
2
1
24
1
5
3
24
3
2
4
2
2
72
2
8
3
9
2
2
4
2
2
72
2
46
1
16
1
2
7
2
1
48
1
37
2
10
3
2
7
2
1
48
2
43
4
20
2
1
7
2
1
24
2
40
4
18
5
2
8
2
1
48
2
49
4
12
2
2
8
2
2
72
2
52
4
14
2
2
8
2
1
48
2
34
3
17
4
2
8
2
1
48
2
Alter: in Jahren; güst: seit n Jahren; Caslick-OP: 1 = Scheidenplastik durchgeführt; 2 = Scheidenplastik nicht
durchgeführt; Bes.Mon. = Besamungsmonat; TU = Ergebnis der Trächtigkeitsuntersuchung (durchgeführt
zwischen dem 15. und 18. p.o.): 1 = positiv; 2 = negativ; EmbUD = embryo under-developed, also zu klein;
1 = ja, 2 = nein; Ovulation 24h p.i. = Ovualtion hat 24 h post inseminationem stattgefunden: 1 = ja; 2 = nein,
Ovulation hat innerhalb von 48 h p.i. stattgefunden
Ovulation p. hCG = Zeitpunkt der Ovulation nach der hCG-Gabe in Stunden
138
ANHANG
Tabelle 9: Gruppe 3 Ringer-Lösung
Stute Hengst
Alter
güst
Nr.
Caslic
k-OP
Bes.
Mon.
Emb.
UD
Ov. 24h
p.i.
Ov. p.
hCG
TU
28
1
8
3
1
6
2
1
24
2
24
1
9
2
1
5
2
1
48
2
21
3
7
1
2
5
2
1
48
1
15
1
12
1
2
5
2
1
24
2
12
1
20
3
2
5
2
1
24
2
3
1
10
1
2
3
2
1
24
1
6
4
15
2
2
4
2
2
72
2
9
3
7
1
2
3
2
1
48
1
18
2
16
1
2
4
2
1
48
1
35
1
26
10
2
7
2
1
48
2
38
2
25
5
2
7
2
1
24
2
41
4
11
2
2
7
2
2
72
2
32
4
21
1
1
7
2
1
48
2
27
2
18
2
2
8
2
1
24
1
47
2
16
4
2
8
2
1
24
1
44
3
9
1
2
8
2
1
24
1
50
2
16
12
2
8
2
1
48
2
53
3
18
2
2
8
2
1
48
2
Alter: in Jahren; güst: seit n Jahren; Caslick-OP: 1 = Scheidenplastik durchgeführt; 2 = Scheidenplastik nicht
durchgeführt; Bes.Mon. = Besamungsmonat; TU = Ergebnis der Trächtigkeitsuntersuchung (durchgeführt
zwischen dem 15. und 18. p.o.): 1 = positiv; 2 = negativ; EmbUD = embryo under-developed, also zu klein;
1 = ja, 2 = nein; Ovulation 24h p.i. = Ovualtion hat 24 h post inseminationem stattgefunden: 1 = ja; 2 = nein,
Ovulation hat innerhalb von 48 h p.i. stattgefunden
Ovulation p. hCG = Zeitpunkt der Ovulation nach der hCG-Gabe in Stunden
Endometriales Ödem und intrauterine Flüssigkeitsansammlung zu den einzelnen
Messzeitpunkten (Et1 bis Et4, Ft1 bis Ft4) bei allen Stuten (n = 54) getrennt nach
Behandlungsgruppe.
139
ANHANG
Tabelle 10: Gruppe 1 autologes konditioniertes Serum
Stute
Et1
Et2
Et3
Et4
Ft1
Nr.
30
1
3
2
0
0
Ft2
Ft3
Ft4
1
0
0
25
1
1
1
0
0,5
1
1
0
10
1
1
1
0
0
2
1
1
13
2
1,5
0
0
0
1
0
0
22
1
0,5
0
0
1
1
1
0
19
2
2
2
1
0
1
0
0
16
2
1
1
1
0
2
2
3
7
1
0,5
0
1
0
1
0
0
1
1
1
1
2
0
1
1
0
4
1
0,5
1
1
1
3
3
2
33
1
1
0
0
0
1
1
0
39
2
2,5
2
0
0
2
0
0
42
1
2
1
0
0
2
2
0
36
3
2,5
2
1
0
2
2
1
45
2
1
1
1
0
2
1
0
48
1
2
3
2
0
1
0
0
51
1
2
1
1
0
1
0
0
54
2
2
1
1
0
1
0
0
Ultrasonographisch darstellbares Endometriumsödem (Abstufung nach McKINNON et al. 1987a und 1987b):
0 = kein endometriales Ödem (-); 1 = geringgradiges endometriales Ödem (+); 2 = mittelgradiges endometriales
Ödem (++); 3 = hochgradiges endometriales Ödem (+++); Et1 = endometriales Ödem (e.Ö.) zum Zeitpunkt der
hCG-Applikation; Et2 = e.Ö. 4 bis 6 Stunden post inseminationem, p.i.; Et3 = e.Ö. 24 Stunden p.i.; Et4 = e.Ö.
48 Stunden p.i.
Ultrasonographisch darstellbare intrauterine Flüssigkeitsansammlung (IUF) (nach BRINKSO et al. 2003):
0 = keine Fluktuation (-); 1 = geringgradige Fluktuation (+/-); 2 = mittelgradige Fluktuation (+); 3 = hochgradige
Fluktuation (+); Ft1 = IUF zum Zeitpunkt der hCG-Applikation; Ft2 = IUF 4 bis 6 Stunden post
inseminationem, p.i.; Ft3 = IUF 24 Stunden p.i.; Ft4 = IUF. 48 Stunden p.i.
140
ANHANG
Tabelle 11: Gruppe 2 Prednisolonacetat
Stute
Et1
Et2
Et3
Nr.
31
1
0,5
1
Et4
Ft1
Ft2
Ft3
Ft4
0
1
1
1
0
29
1
1,5
1
0
0
1
0
0
23
2
2
2
0
0
1
0
0
26
1
1
1
0
1
1
1
1
14
2
1,5
1
1
0
0
0
0
17
1
1,5
2
0
0
1
0
0
20
1
1
1
1
1
3
3
3
11
3
2,5
3
2
0
1
0
0
2
3
2,5
2
0
0
1
1
0
5
1
2
2
1
0
1
1
0
8
1
1
2
2
0
1
1
0
46
1
1
2
1
0
2
1
0
37
1
2
2
1
0
1
1
0
43
2
1
1
0
0
1
0
0
40
3
2
1
0
0
2
1
1
49
1
1
1
1
0
1
0
0
52
1
1
0
0
0
1
0
0
34
1
1
1
0
0
1
0
0
Ultrasonographisch darstellbares Endometriumsödem (Abstufung nach McKINNON et al. 1987a und 1987b):
0 = kein endometriales Ödem (-); 1 = geringgradiges endometriales Ödem (+); 2 = mittelgradiges endometriales
Ödem (++); 3 = hochgradiges endometriales Ödem (+++); Et1 = endometriales Ödem (e.Ö.) zum Zeitpunkt der
hCG-Applikation; Et2 = e.Ö. 4 bis 6 Stunden post inseminationem, p.i.; Et3 = e.Ö. 24 Stunden p.i.; Et4 = e.Ö.
48 Stunden p.i.
Ultrasonographisch darstellbare intrauterine Flüssigkeitsansammlung (IUF) (nach BRINKSO et al. 2003):
0 = keine Fluktuation (-); 1 = geringgradige Fluktuation (+/-); 2 = mittelgradige Fluktuation (+); 3 = hochgradige
Fluktuation (+); Ft1 = IUF zum Zeitpunkt der hCG-Applikation; Ft2 = IUF 4 bis 6 Stunden post
inseminationem, p.i.; Ft3 = IUF 24 Stunden p.i.; Ft4 = IUF. 48 Stunden p.i.
141
ANHANG
Tabelle 12: Gruppe 3 Ringer-Lösung
Stute
Et1
Et2
Et3
Nr.
28
3
1,5
1
Et4
Ft1
Ft2
Ft3
Ft4
2
1
2
1
2
24
1
1
0
0
0
3
1
1
21
1
2
0
0
0
1
1
0
15
2
1
0
0
0
1
0
0
12
1
1
0
0
0
1
1
0
3
2
3
2
1
0
1
0
0
6
1
0,5
0
0
1
1
2
2
9
1
1
1
0
0
1
2
0
18
2
2
2
2
0
1
0
0
35
1
2
2
1
0
2
0
0
38
3
2
1
0
0
1
2
1
41
3
2
2
1
0
1
1
0
32
1
2
2
1
0
1
0
0
27
3
2
1
1
1
1
1
0
47
3
2
2
1
1
2
2
1
44
1
1
0
0
0
1
0
0
50
2
2
1
1
0
1
0
0
53
3
2
1
0
0
1
0
0
Ultrasonographisch darstellbares Endometriumsödem (Abstufung nach McKINNON et al. 1987a und 1987b):
0 = kein endometriales Ödem (-); 1 = geringgradiges endometriales Ödem (+); 2 = mittelgradiges endometriales
Ödem (++); 3 = hochgradiges endometriales Ödem (+++); Et1 = endometriales Ödem (e.Ö.) zum Zeitpunkt der
hCG-Applikation; Et2 = e.Ö. 4 bis 6 Stunden post inseminationem, p.i.; Et3 = e.Ö. 24 Stunden p.i.; Et4 = e.Ö.
48 Stunden p.i.
Ultrasonographisch darstellbare intrauterine Flüssigkeitsansammlung (IUF) (nach BRINKSO et al. 2003):
0 = keine Fluktuation (-); 1 = geringgradige Fluktuation (+/-); 2 = mittelgradige Fluktuation (+); 3 = hochgradige
Fluktuation (+); Ft1 = IUF zum Zeitpunkt der hCG-Applikation; Ft2 = IUF 4 bis 6 Stunden post
inseminationem, p.i.; Ft3 = IUF 24 Stunden p.i.; Ft4 = IUF. 48 Stunden p.i.
142
ANHANG
Anzahl der neutrophilen Granulozyten (PMN) in den zytologischen Proben des
Endometriums zu den verschiedenen Messzeitpunkten (Ct1 bis Ct4) bei allen Stuten (n = 54)
getrennt nach Behandlungsgruppe.
Tabelle 13: Gruppe 1 autologes konditioniertes Serum
Stute Nr.
Ct1
Ct2
Ct3
Ct4
30
0
492
242
2
25
158
544
385
290
10
155
313
229
47
13
8
430
3
1
22
264
668
47
11
19
115
202
80
9
16
0
184
73
14
7
0
545
73
4
1
20
594
7
27
4
0
667
186
43
33
21
638
380
25
39
0
447
99
5
42
0
72
431
278
36
0
610
233
13
45
0
212
552
392
48
218
281
221
195
51
2
90
356
258
54
0
461
33
4
Ct1 = Probe am Tag der hCG-Applikation; Ct2 = Probe 4 bis 6 Stunden post inseminationem, p.i.; Ct3 = Probe
24 Stunden p.i.; Ct4 = Probe 48 Stunden p.i.
143
ANHANG
Tabelle 14: Gruppe 2 Prednisolonacetat
Stute Nr.
Ct1
Ct2
Ct3
Ct4
31
85
537
48
18
29
1
187
30
2
23
2
250
513
349
26
0
501
267
333
14
3
305
81
14
17
0
582
173
4
20
73
493
218
98
11
0
283
23
161
2
1
21
6
5
5
0
309
78
2
8
0
172
19
16
46
0
432
316
10
37
0
489
333
389
43
0
356
218
7
40
0
498
402
159
49
1
388
40
11
52
0
449
89
52
34
1
414
9
3
Ct1 = Probe am Tag der hCG-Applikation; Ct2 = Probe 4 bis 6 Stunden post inseminationem, p.i.; Ct3 = Probe
24 Stunden p.i.; Ct4 = Probe 48 Stunden p.i.
144
ANHANG
Tabelle 15: Gruppe 3 Ringer-Lösung
Stute Nr.
Ct1
Ct2
Ct3
Ct4
28
240
386
37
2
24
5
280
67
2
21
44
416
19
49
15
0
372
188
45
12
0
128
60
35
3
0
19
10
4
6
1
21
150
35
9
0
172
14
7
18
0
423
33
0
35
0
300
13
9
38
12
414
300
110
41
0
604
578
61
32
3
748
489
102
27
3
237
319
117
47
133
429
67
187
44
0
489
28
6
50
0
83
540
58
53
0
435
34
18
Ct1 = Probe am Tag der hCG-Applikation; Ct2 = Probe 4 bis 6 Stunden post inseminationem, p.i.; Ct3 = Probe
24 Stunden p.i.; Ct4 = Probe 48 Stunden p.i.
145
ANHANG
Untersuchte Parameter der Samenqualität der Hengste 1,2 und 3 getrennt nach Merkmal zu
den verschiedenen Messzeitpunkten.
Tabelle 16: Anteil der toten Spermien in Prozent in der Nigrosin-Eosin-Färbung (Merkmal 1
= M 1), getrennt nach Probenansatz bei Kühlschrank- und Brutschranklagerung (Kühlschrank
= 1; Brutschrank = 2) sowie nach Verdünnungsstufe mit autologem konditionierten Serum
(ACS)
Hengst Ejakulat Schranktyp
At0
At24
Bt0
Bt24
Ct0
Ct24
1
1
1
9
28
9
33
9
10
1
2
1
3
24
3
25
3
15
1
3
1
7
16
7
14
7
8
2
1
1
13
38
13
13
13
9
2
2
1
2
23
2
23
2
12
2
3
1
10
12
10
6
10
5
3
1
1
6
21
6
20
6
10
3
2
1
4
25
4
18
4
13
3
3
1
10
27
10
24
10
19
1
1
2
9
63
9
30
9
22
1
2
2
3
47
3
26
3
16
1
3
2
7
23
7
20
7
14
2
1
2
13
32
13
40
13
17
2
2
2
2
24
2
22
2
30
2
3
2
10
22
10
17
2
13
3
1
2
6
100
6
100
6
100
3
2
2
4
100
4
100
4
100
3
3
2
10
98
10
100
10
100
Portion verdünnter Frischsamen mit 4 ml ACS = A; Portion verdünnter Frischsamen mit 0,4 ml ACS = B;
Portion verdünnter Frischsamen ohne Zusatz = C; gemessen zu den Messzeitpunkten direkt nach Probenansatz
(Zeitpunkt 0 = t0) und 24 Stunden später (Zeitpunkt 24 Stunden = t24)
146
ANHANG
Tabelle 17: Anteil der toten Spermien in Prozent in der Spermac Stain™-Färbung (Merkmal 2
= M 2), getrennt nach Probenansatz bei Kühlschrank- und Brutschranklagerung (Kühlschrank
= 1; Brutschrank = 2) sowie nach Verdünnungsstufe mit autologem konditionierten Serum
(ACS)
Hengst Ejakulat Schranktyp
At0
At24
Bt0
Bt24
Ct0
Ct24
1
1
1
7
26
7
16
7
11
1
2
1
15
26
15
23
15
21
1
3
1
18
21
18
17
18
18
2
1
1
9
28
9
8
9
9
2
2
1
28
12
28
17
28
23
2
3
1
10
18
10
20
10
24
3
1
1
10
30
10
22
10
12
3
2
1
9
32
9
20
9
14
3
3
1
7
21
7
18
7
14
1
1
2
7
21
7
35
7
20
1
2
2
15
35
15
13
15
6
1
3
2
18
41
18
23
18
19
2
1
2
9
57
9
50
9
14
2
2
2
10
17
10
5
10
11
2
3
2
28
38
28
11
28
5
3
1
2
10
16
10
20
10
12
3
2
2
9
19
9
22
9
21
3
3
2
7
25
7
77
7
25
Portion verdünnter Frischsamen mit 4 ml ACS = A; Portion verdünnter Frischsamen mit 0,4 ml ACS = B;
Portion verdünnter Frischsamen ohne Zusatz = C; gemessen zu den Messzeitpunkten direkt nach Probenansatz
(Zeitpunkt 0 = t0) und 24 Stunden später (Zeitpunkt 24 Stunden = t24)
147
ANHANG
Tabelle 18: Anteil der vorwärtsbeweglichen Spermien in Prozent (Merkmal 3 = M 3), bei
Kühlschrank- und Brutschranklagerung (Kühlschrank = 1; Brutschrank = 2) bei einem
Probenansatz von einer Portion verdünntem Frischsamen mit 4 ml autologem konditionierten
Serum (ACS)
Hengst
1
Ejakulat Schranktyp
1
1
t05
65
t2
65
t4
55
t8
50
t24
35
1
2
1
75
40
35
35
30
1
3
1
60
30
30
0
0
2
1
1
60
15
0
1
15
2
2
1
85
40
30
30
25
2
3
1
60
30
30
15
15
3
1
1
70
65
35
0
0
3
2
1
70
70
60
50
45
3
3
1
70
65
30
15
10
1
1
2
60
50
30
5
0
1
2
2
65
45
10
0
0
1
3
2
60
30
30
0
0
2
1
2
5
5
3
10
0
2
2
2
85
75
40
0
0
2
3
2
60
50
40
10
0
3
1
2
50
45
25
0
0
3
2
2
60
35
15
5
0
3
3
2
60
30
30
25
0
Anteil der vorwärtsbeweglichen Spermien in Prozent gemessen zu den Messzeitpunkten eine halbe Stunde
(Zeitpunkt 05 = t05), 2 Stunden (t2), 4 Stunden (t4), 8 Stunden (t8) und 24 Stunden nach Probenansatz (t24)
148
ANHANG
Tabelle 19: Anteil der gesamtbeweglichen Spermien in Prozent (Merkmal 4 = M 4), bei
Kühlschrank- und Brutschranklagerung (Kühlschrank = 1; Brutschrank = 2) bei einem
Probenansatz von einer Portion verdünntem Frischsamen mit 4 ml autologem konditionierten
Serum (ACS)
Hengst
1
Ejakulat Schranktyp
1
1
t05
70
t2
70
t4
65
t8
50
t24
45
1
2
1
80
65
60
60
50
1
3
1
60
60
60
25
15
2
1
1
65
15
2
2
20
2
2
1
85
80
60
55
55
2
3
1
65
50
50
50
50
3
1
1
75
70
70
65
55
3
2
1
75
75
65
60
50
3
3
1
75
70
60
60
60
1
1
2
70
55
40
8
0
1
2
2
75
60
20
0
0
1
3
2
65
50
40
0
0
2
1
2
5
5
5
15
0
2
2
2
85
80
55
5
0
2
3
2
65
65
60
25
2
3
1
2
60
55
40
2
0
3
2
2
65
40
20
15
0
3
3
2
75
60
55
25
0
Anteil der gesamtbeweglichen Spermien in Prozent gemessen zu den Messzeitpunkten eine halbe Stunde
(Zeitpunkt 05 = t05), 2 Stunden (t2), 4 Stunden (t4), 8 Stunden (t8) und 24 Stunden nach Probenansatz (t24)
149
ANHANG
Tabelle 20: Anteil der vorwärtsbeweglichen Spermien in Prozent (Merkmal 3 = M 3), bei
Kühlschrank- und Brutschranklagerung (Kühlschrank = 1; Brutschrank = 2) bei einem
Probenansatz von einer Portion verdünntem Frischsamen mit 0,4 ml autologem
konditionierten Serum (ACS)
Hengst
1
Ejakulat Schranktyp
1
1
t05
75
t2
70
t4
60
t8
60
t24
55
1
2
1
75
70
70
65
60
1
3
1
60
65
60
25
25
2
1
1
70
70
70
65
40
2
2
1
85
85
75
75
60
2
3
1
70
70
60
40
40
3
1
1
75
75
75
70
60
3
2
1
75
75
70
60
50
3
3
1
75
75
75
70
70
1
1
2
70
60
20
0
0
1
2
2
75
65
0
0
0
1
3
2
65
65
60
0
0
2
1
2
70
70
55
0
0
2
2
2
85
70
55
0
0
2
3
2
75
75
70
20
0
3
1
2
75
70
20
0
0
3
2
2
70
60
35
5
0
3
3
2
75
65
55
25
0
Anteil der vorwärtsbeweglichen Spermien in Prozent gemessen zu den Messzeitpunkten eine halbe Stunde
(Zeitpunkt 05 = t05), 2 Stunden (t2), 4 Stunden (t4), 8 Stunden (t8) und 24 Stunden nach Probenansatz (t24)
150
ANHANG
Tabelle 21: Anteil der gesamtbeweglichen Spermien in Prozent (Merkmal 4 = M 4), bei
Kühlschrank- und Brutschranklagerung (Kühlschrank = 1; Brutschrank = 2) bei einem
Probenansatz von einer Portion verdünntem Frischsamen mit 0,4 ml autologem
konditionierten Serum (ACS)
Hengst
1
Ejakulat Schranktyp
1
1
t05
80
t2
75
t4
65
t8
65
t24
65
1
2
1
80
70
75
70
65
1
3
1
65
70
70
45
45
2
1
1
75
75
60
70
45
2
2
1
85
85
80
80
75
2
3
1
75
75
65
65
65
3
1
1
80
80
80
75
65
3
2
1
80
80
75
70
55
3
3
1
80
80
80
75
75
1
1
2
65
55
25
0
0
1
2
2
80
70
5
0
0
1
3
2
70
55
45
10
0
2
1
2
75
75
60
50
0
2
2
2
85
75
65
10
0
2
3
2
80
80
80
50
1
3
1
2
75
75
40
5
0
3
2
2
75
65
45
10
0
3
3
2
80
75
65
40
0
Anteil der gesamtbeweglichen Spermien in Prozent gemessen zu den Messzeitpunkten eine halbe Stunde
(Zeitpunkt 05 = t05), 2 Stunden (t2), 4 Stunden (t4), 8 Stunden (t8) und 24 Stunden nach Probenansatz (t24)
151
ANHANG
Tabelle 22: Anteil der vorwärtsbeweglichen Spermien in Prozent (Merkmal 3 = M 3), bei
Kühlschrank- und Brutschranklagerung (Kühlschrank = 1; Brutschrank = 2) bei einem
Probenansatz von einer Portion verdünntem Frischsamen ohne Zusatz
Hengst
1
Ejakulat Schranktyp
1
1
t05
75
t2
75
t4
75
t8
65
t24
60
1
2
1
75
70
70
70
65
1
3
1
70
65
65
30
30
2
1
1
70
70
70
70
50
2
2
1
85
85
75
75
70
2
3
1
80
75
60
40
40
3
1
1
70
70
65
60
50
3
2
1
75
75
65
60
50
3
3
1
75
75
75
70
70
1
1
2
75
70
35
0
0
1
2
2
75
65
10
0
0
1
3
2
70
65
65
0
0
2
1
2
70
70
60
25
0
2
2
2
85
80
55
0
0
2
3
2
80
75
75
20
0
3
1
2
70
70
35
0
0
3
2
2
70
60
20
5
0
3
3
2
75
60
55
5
0
Anteil der vorwärtsbeweglichen Spermien in Prozent gemessen zu den Messzeitpunkten eine halbe Stunde
(Zeitpunkt 05 = t05), 2 Stunden (t2), 4 Stunden (t4), 8 Stunden (t8) und 24 Stunden nach Probenansatz (t24)
152
ANHANG
Tabelle 23: Anteil der gesamtbeweglichen Spermien in Prozent (Merkmal 4 = M 4), bei
Kühlschrank- und Brutschranklagerung (Kühlschrank = 1; Brutschrank = 2) bei einem
Probenansatz von einer Portion verdünntem Frischsamen ohne Zusatz
Hengst
1
Ejakulat Schranktyp
1
1
t05
80
t2
70
t4
80
t8
70
t24
65
1
2
1
80
75
75
75
70
1
3
1
70
70
70
50
50
2
1
1
75
75
75
75
60
2
2
1
85
85
80
80
75
2
3
1
80
80
70
65
65
3
1
1
75
75
40
5
0
3
2
1
80
80
70
70
55
3
3
1
80
80
80
75
75
1
1
2
80
75
45
5
0
1
2
2
80
70
20
0
0
1
3
2
70
65
60
5
0
2
1
2
75
75
65
30
0
2
2
2
85
85
60
10
0
2
3
2
80
80
80
55
0
3
1
2
75
75
40
5
0
3
2
2
75
65
35
10
0
3
3
2
80
75
65
20
0
Anteil der gesamtbeweglichen Spermien in Prozent gemessen zu den Messzeitpunkten eine halbe Stunde
(Zeitpunkt 05 = t05), 2 Stunden (t2), 4 Stunden (t4), 8 Stunden (t8) und 24 Stunden nach Probenansatz (t24)
153
ANHANG
DANKSAGUNG
Zuerst gilt Frau Prof. Dr. Meinecke-Tillmann ein besonders herzliches Dankeschön für die
stets verantwortungsvolle und freundliche Unterstützung der Dissertation und den treffenden
Hinweis, dass vor dem Erfolg Blut, Schweiß und Tränen auf mich warten.
Ich danke den Partnern der Tierärztlichen Klinik für Pferde in Lüsche und vor allem
Dr. Jan-Hein Swagemakers, der die Studie anregte, für die fachliche Beratung, die stets
unkomplizierte Bereitstellung der Materialien und Geräte sowie der reichlichen „Zeit für
wissenschaftliche Arbeit“.
Auch meinem Betreuer Dr. Julio Reinecke aus Düsseldorf gilt großer Dank für sein
Engagement und die großzügige Bereitstellung der „wichtigsten Zutat“ für die Studie.
Ein liebes Dankeschön an Edita Podhajsky aus dem Institut für Reproduktionsbiologie in
Hannover, die alle meine Fragen beantworten konnte und mich immer wieder neu motiviert
hat.
Herrn Dr. Beyerbach aus dem Institut für Biometrie und Epidemiologie der Tierärztlichen
Hochschule Hannover danke ich für seine geduldige Unterstützung und die aufmunternden
Worte bei der Anfertigung der Statistik.
Vielen Dank auch an die Mitarbeiter der Deckstation Böckmann und insbesondere an Tönne
Böckmann und Wibke Hammermann für die unkomplizierte Zusammenarbeit und generöse
Bereitstellung der Hengste und Stuten.
Ein riesiges Dankeschön gilt den Züchtern, die mir ihr Vertrauen im Umgang mit ihren Stuten
geschenkt haben. Besonders Bernhard Deitert und seinen „Damen“ gebührt größter Dank!
Ich möchte auch allen Mitarbeitern und Praktikanten der Tierärztlichen Klinik für Pferde in
Lüsche danken, die mir bei meiner Doktorarbeit geholfen haben. Besonders bedanke ich mich
bei meiner Betreuerin Dr. Ute Pansegrau, die mir alle wichtigen praktischen Fähigkeiten für
die Studie beigebracht hat und mir stets geduldig mit Rat und Tat zur Seite stand. Ein großes
154
ANHANG
Dankeschön spreche ich meinen lieben Kollegen und Kolleginnen aus dem AssistenzärzteTeam aus: Ohne euch hätte ich es niemals durchgehalten!
Vielen Dank an die Leitung der Tierklinik Hochmoor für ihre Flexibilität zum Wohle der
Fertigstellung der Dissertation und an meine tollen Kolleginnen, die immer für mich
eingesprungen sind, wenn es nötig war.
Nicht genug danken kann ich meinem lieben Arne für die mentale Unterstützung, die Geduld
und die Korrektur – du gibst mir so viel Kraft und Motivation – Danke!
Wenn an dieser Stelle zwar zuletzt genannt, gebührt doch meiner Familie und insbesondere
meinen lieben Eltern der größte Dank: für die liebevolle, ausdauernde, bedingungslose
Unterstützung, das Vertrauen und den unermüdlichen Zuspruch während meiner gesamten
tierärztlichen Ausbildung und der Doktorarbeit. Es war nicht immer leicht, aber zusammen
haben wir das Ziel erreicht!
Vielen Dank!
155