HPLC

Analytische Chemie I
HPLC
Betreuer:
Alexandra Barofsky, [email protected], 03641-948177
Matthew Welling, [email protected], 03641-948178
IAAC, Lehrstuhl Instrumentelle Analytik, Lessingstr. 8, Raum 302/306, 07743 Jena
Zu Beginn des Praktikums wird ein Antestat zu den Inhalten des Theorieteils
durchgeführt. Bitte beachten Sie dazu folgende Kontrollfragen:
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Was sind die Anwendungsgebiete der HPLC?
Wie ist eine HPLC-Apparatur aufgebaut?
Wofür ist die Präzision der Retentionszeit von Bedeutung?
Wofür ist die Präzision der Peakfläche von Bedeutung?
Welche Vorteile hat die Gradientenelution?
Bei Wiederholmessungen einer Gradientenelution wird eine Unpräzision der
Retentionszeit eines Analyten beobachtet. Geben Sie mögliche Ursachen an.
Nennen Sie eine Eigenschaft, die eine Substanz zur Totzeitbestimmung in der
RP- und in der NP-Chromatographie besitzen muss. Nennen Sie jeweils ein
Beispiel.
Was sind die Forderungen an einen internen Standard?
1. Einleitung
Chromatographie fasst physikalische Methoden zusammen, bei denen eine
Stofftrennung durch Verteilung zwischen einer stationären und einer mobilen Phase
erfolgt. Infolge unterschiedlicher Verteilungskoeffizienten verweilen (retardieren)
verschiedene Substanzen unterschiedlich lange an der stationären Phase und
durchlaufen daher mit unterschiedlicher Zeit die Trennstrecke. Bei der
Flüssigchromatographie wird als mobile Phase ein Gemisch aus zwei oder mehreren
flüssigen Komponenten verwendet.
Die HPLC (High Performance/Pressure Liquid Chromatography) wurde aus der
konventionellen Flüssigchromatographie durch Verwendung immer kleinerer Partikel
mit enger Korngrößenverteilung als stationäre Phase entwickelt. Damit kann eine
HPLC
höhere Auflösung, eine verkürzte Analysendauer, höhere Reproduzierbarkeit und eine
Verbesserung der Nachweisempfindlichkeit erreicht werden.
Die stationäre Phase befindet sich in einem Rohr, der Trennsäule. Am Ausgang der
Trennsäule werden mit einem Detektor die in zeitlicher Reihenfolge eluierten
Komponenten des Gemisches anhand substanzspezifischer Eigenschaften
nachgewiesen. Die graphische Darstellung der Signalintensitäten über der Zeit stellt das
Chromatogramm dar.
Bei der HPLC ist die Löslichkeit der Probe in der mobilen Phase eine Voraussetzung.
Da die HPLC praktisch auf alle löslichen Gemische anwendbar ist, erlaubt sie die
schonende Trennung, die qualitative und quantitative Analyse von anorganischen Ionen,
unpolaren und polaren organischen Verbindungen in allen Molekulargewichtsbereichen.
Einsatzgebiete der HPLC-Analyse sind z.B.:
-
Reinheits- und Produktkontrolle von Industriechemikalien
Bestimmung von Gehalt und Reinheit von Wirkstoffen und Arzneifertigwaren
Bestimmung von Umweltschadstoffen
Analyse der Molmassenverteilung von Polymeren
Trennung und Reinigung von Substanzen mittels präparativer HPLC
2. Aufbau einer HPLC-Apparatur
Eine
HPLC-Apparatur
besteht
aus
Eluentenvorratsgefäßen,
Degaser,
Hochdruckförderpumpen, Gradientenmischer, Injektor, Vor- und Trennsäule, Detektor
sowie Signalverarbeitung/Datendokumentation.
Kommunikation
Detektor
Säule
Pumpe A
Degaser
Abfall
Pumpe B
Injektion
Bild 1. HPLC aus dem Praktikum
2
HPLC
Eluenten
Auch wenn es einen erheblichen finanziellen Aufwand darstellt werden nur hochreine
Lösungsmittel verwendet, da sonst im Chromatogramm Verunreinigungen als
dominante Signale auftauchen und sich Verunreinigungen auf der Säule anreichern.
Gelöste Luft im Eluenten führt zu Problemen bei der Gradientenmischung in der HPLC
und erzeugt „Spikes“ in der Detektorzelle, da hier das zuächst auf hohen Druck
komprimierte Lösungsmittel wieder auf Normaldruck expandiert. Der Eluent ist deshalb
sorgfältig mit einem Degaser, in dem über eine Membran Vakuum anliegt oder durch
Spülen mit Helium zu entgasen. Außerdem ist der Eluent vor photolytischer
Veränderung zu schützen (braune Flaschen verwenden). Die Algenbildung wird
verhindert indem der wässrigen Phase Methanol oder Acetonitril in geringen Mengen
zugesetzt wird.
In der HPLC unterscheidet man die isokratische Arbeitsweise und die
Gradientenelution.
Während bei der isokratischen Arbeitsweise die Eluentenzusammensetzung konstant
bleibt, wird die Zusammensetzung des Eluenten in der Gradientenelution im Laufe der
Trennung verändert.
Injektion
Die Probeninjektion erfolgt entweder durch einen Autosampler oder durch
Handinjektion.
Das Injektionsvolumen wird durch eine auswechselbare Probenschleife (Loop)
bestimmt.
Bild 2. Handinjektion über eine Injektionsschleife (Links: Laden der Injektionsschleife. Rechts: Der
Inhalt der Schleife wird auf die Säule gespült).
Säulen
Oft werden Kombinationen aus Vorsäulen und Trennsäulen eingesetzt. Die kurze
Vorsäule ist dabei mit demselben Material gefüllt, wie die Trennsäule. Substanzen, die
die Säule nicht passieren reichern sich auf der Vorsäule an. Diese kann dann bei
Verschmutzung und Verringerung der Trennleistung getauscht werden, was erheblich
die Lebensdauer der teuren Trennsäule verlängert.
Bei der Säulenpackung wird zwischen Normal- und Umkehrphase unterschieden:
Die Normalphase (NP) besteht aus Partikeln an deren Oberfläche SiOH-Gruppen
gebunden sind. Als mobile Phase werden unpolare Lösungsmittel wie Heptan oder
3
HPLC
Hexan verwendet. Die Polarität wird durch einem geringen Anteil an 2-Propanol
eingestellt (Hilfsmittel s. Anhang: Lösungsmittelstärke der eluotropen Reihe).
Unter dem Sammelbegriff der Umkehrphase (reversed phase, RP) werden chemisch
modifizierte Kieselgele zusammengefasst, die hydrophile Gruppen wie n-Octadecyl, nOctyl, Methyl oder Phenyl tragen. Es werden Basiskieselgele mit mittleren Porenweiten
grösser als 6 nm mit Alkoxy oder Chorsilanen umgesetzt, wobei ca. die Hälfte der
ursprünglichen Hydroxylgruppen des Kieselgels ersetzt werden. Als mobile Phase
werden Mischungen aus Wasser und Acetonitril, Methanol oder THF verwendet.
O
O
Si
O
Si
O
O
O
Si
O
Si
O
O
Si
Si
O
O
O
O
O
Si
Si
O
O
O
Si
Si
O
O
O
OH
O
O
Si
O
Normalphase
Si-OH
OH
O
O
OH
Umkehrphase
RP C18
OH
O
Si
O
O
Si
O
Si
O
Bild 3.Vergleich von Normal- und Umkehrphase
Bei ionischen oder ionisierbaren Verbindungen (z. B. Säuren, Basen) können
Pufferlösungen zugesetzt werden. Die Veränderung der Elutionskraft des Eluenten
erfolgt durch die Änderung des Wasseranteils. Beachte: Wasser besitzt die geringste
Elutionskraft!
Die Einführung anderer funktioneller Gruppen am Kieselgel ermöglicht eine
Optimierung der Trennleistung für bestimmte Stoffklassen. Hier gibt es zahlreiche
verschiedene Ansätze und hunderte verschiedene Phasen sind kommerziell erhältlich.
Auch Kationen- oder Anionenaustauscher können in der HPLC zum Einsatz kommen.
Die maximale Massenbeladbarkeit von NP-HPLC-Säulen mit einem Material der
Partikelgröße dp = 10 µm liegt bei 10 µg Probensubstanz/ml Phase. Die Beladbarkeit
von RP-Phasen ist ca. 5- bis 10-mal größer als die von NP-Phasen. Höhere Beladungen
führen zur Verminderung der Auflösung.
4
HPLC
Detektoren
Der am weitesten verbreitete Detektor ist der UV/Vis-spektrophotometrischer Detektor,
der meist bei einer Wellenlänge die Absorbtion registriert. Dieser Detektor wird auch
im Praktikum verwendet. Der DAD (Diodenarraydetektor) erlaubt die Aufnahme von
UV/Vis-Spektren über den gesamten Wellenlängenbereich. Weit verbreitet ist auch der
Massenspektroskopische Detektor der die on line Aufnahme von Massenspektren
während der chromatographischen Auftrennung ermöglicht. Wichtige weitere
detektoren sind in Tabelle 1 aufgeführt.
Deuterium Lampe
Spiegel
SPA 10AV
Flusszelle
Wolfram Halogenlampe
Bild 4. UV/Vis-spektrophotometrischer Detektor im Praktikum
Tabelle 1
Wichtige (nicht spektroskopische) Detektoren für die HPLC
Detektor
Anwendung
Nachweisgrenze
Linarität
RI-D.
universell
(Brechungsindex-D.) kein Gradient!
Reflektion
interferometrisch
≈ 1 µg/mL
3 × 103
UV/VIS-D.
nahezu universell
Chromophor
(λmax > 195 nm!)
≈ 0,3 µg/mL
104
Fluoreszenz-D.
selektiv
nur fluoreszierende
Verbindungen oder
für Verbindungen
mit funktioneller
Gruppe für eine
Derivatisierung
(z. B. Veresterung
ROH mit RflCOCl)
≈ 0,8 pg/mL
103 - 104
5
HPLC
Elektrochemischer D. selektiv
≈ 1 pg/mL
nur oxidierbare oder
reduzierbare Verb.
für sehr komplexe
Matrices
(Bio-, Umweltanalytik)
-
≈ bis zu 0,2%
Unterschied in
der Leitfähigkeit
zweier Verb.
Leitfähigkeitsd.
ionenselektiv
ELSD
(Lichtstreud.)
für Substanzen ohne ≈ 0,3 µg/mL
Chromophor
(Zucker; Phosphatide)
einzige Forderung:
Analyt muß wesentlich
höher sieden als Eluent
≈ 104
3. Kennzahlen eines Chromatogramms
Rel. Int.
tR1
t0
W1/2
w
10%
a
b
t [min]
0
Bild 5. Kennzahlen eines Chromatogramms
Totzeit, to
Die Totzeit stellt die Zeit die für den Durchlauf des Eluenten durch die Trennsäule
benötigt wird dar. Sie wird mit einer nicht-retardierten Verbindung (eine Substanz
auszuwählen, die keine Wechselwirkung mit der stationären Phase zeigt) als Zeit von
der Probeninjektion (t = 0) bis zur Detektion gemessen. Sie setzt sich aus dem Beitrag
der Trennsäule (Säulentotzeit, to,S) und der apparativen Totzeit (to,app) zusammen.
6
HPLC
Bsp. für Substanzen zur Totzeitbestimmung:
- NP:
n-Hexan; Cyclohexan
Tetrachlorethylen; Benzen
-
RP:
Thioharnstoff; HCHO
D2O; CD3OH; CD3CN
(Detektor: Brechungsindex (RI))
(Detektor: RI; UV)
(Detektor: UV)
(Detektor: RI)
Zur Berechnung der Säulentotzeit, to,S:
to , S =
L L ⋅ q ⋅ εT
=
u
F
(1)
L - Säulenlänge in cm
u - lineare Strömungsgeschwindigkeit in cm/min
q - Querschnitt der Säule in cm2 (q = r2 ⋅ π)
εT - Porosität (das für die mobile Phase frei verfügbare Volumen in der Säule)
F - Flussrate in ml/min
Der Unterschied der berechneten zur experimentell bestimmten Totzeit ermöglicht
Rückschlüsse über die Güte der Säulenpackung und den Anteil der apparativen Totzeit.
Retentionszeit, tR
Die Retentionszeit ist die Verweildauer einer retardierten Substanz im
chromatographischen System. Sie wird in der Zeitskala im Peakmaximum abgelesen.
tR setzt sich additiv aus der Totzeit (t0) und der Verweildauer in der stationären
Phase (ts) zusammen.
Unter gleichen Bedingungen (Phasensystem, Flussrate, Temperatur) ist tR für eine
Substanz konstant. In der Realität beobachtet man geringe Abweichungen aufgrund von
oftmals minimalen Unterschieden im Phasensystem.
Nettoretentionszeit, ts
Die Nettoretentionszeit ist die Verweildauer einer Substanz in der stationären Phase.
ts = t R − t 0
(2)
Retentionsvolumen, VR
Für das Retentionsvolumen VR gilt:
VR = t R ⋅ F
(3)
Die Substanzidentifizierung kann durch Vergleich der Retentionszeiten tR oder besser
der Retentionsvolumina VR von Probe und Referenzsubstanzen erfolgen. Voraussetzung
sind identische chromatographische Bedingungen für Probe und Referenzsubstanz.
7
HPLC
Retentionsfaktor, k´
Der Retentionsfaktor ist das Verhältnis der Verweildauer einer Substanz in der
stationären Phase (ts) zur Totzeit (to).
k´=
t s tR − t 0
=
t0
t0
(4)
Der Retentionsfaktor ist eine fluss- und säulendimensionslose Größe zur
Kennzeichnung des Retentionsverhaltens einer Substanz in einem gegebenen
Phasensystem.
k´ bestimmt die Auflösung zweier benachbarter Peaks mit und ist daher ein wichtiger
Parameter für die Optimierung einer chromatographischen Trennung.
Die Werte für k´ steigen in der NP-Chromatographie
- mit steigender spezifischer Oberfläche der stationären Phase
- mit abnehmender Polarität der mobilen Phase
- mit steigender Polarität der Probensubstanzen
ges. KW < unges. KW < Aromaten < Ether < Nitroverbindungen < Ester <
Aldehyde/Ketone < Alkohole < Amine < Karbonsäuren
Gang der k´-Werte für RP: Die Substanzen werden nach zunehmendem hydrophoben
Charakter verzögert.
Säuren < Amine/Alkohole/Phenole/Ester < Ether/Aldehyde/Ketone < Aromaten
< Aliphaten
Der Retentionsfaktor k´ eliminiert weitgehend geringfügige Änderungen im
Phasensystem. Der Vergleich der k´-Werte von Probe und Referenzsubstanz ist daher
für die Substanzidentifizierung besser geeignet als der Vergleich von tR oder VR.
Bei der Analytik von definierten Gemischen wie in der Wirkstoffanalytik werden auch
relative Retentionszeiten (RRT) als Parameter für die Substanzidentifizierung
dokumentiert. Dabei werden die Retentionszeiten der Komponenten auf eine
Referenzsubstanz S im Gemisch bezogen.
RRT =
t R ,i
tR , S
(5)
Trennfaktor, α
Der Trennfaktor α ist das Verhältnis der Verweildauer zweier Substanzen an der
stationären Phase und daher das Verhältnis ihrer Retentionsfaktoren. Die später
eluierende Komponente steht im Zähler.
α =
(6)
t s ,2 k ′2
=
t s ,1 k ′1
8
HPLC
α ist ein Maß für die Selektivität, d. h. für die Trennfähigkeit eines
chromatographischen Systems für zwei Substanzen. α > 1 ist eine prinzipielle
Voraussetzung für die Trennung eines Gemisches. Bei α = 1 eluieren zwei Substanzen
bei der gleichen Retentionszeit. Die Optimierung von α ist die Hauptaufgabe bei der
Methodenentwicklung einer HPLC-Analyse.
Tailingfaktor, T
Die Peakasymmetrie wird durch das Tailing T beschrieben
T=
b
a
(7)
Die Strecken a und b werden bei 10 % der Peakhöhe gemessen (Bild 5).
Theoretische Bodenzahl (Trennstufenzahl), N
Theoretische Bodenhöhe (Trennstufenhöhe), H
Die theoretische Bodenzahl N bzw. die von der Säulendimension unabhängige
theoretische Bodenhöhe H (von HETP = Height Equivalent to a Theoretical Plate) ist
ein Maß für das Trennvermögen einer Säule. Gl. (8) gilt streng genommen nur für einen
symmetrischen Peak (Tailingfaktor T = 1).
2
2
⎛ tR ⎞
⎛ tR ⎞
⎛ hP ⋅ tR ⎞
N = 16 ⎜ ⎟ = 5,54 ⎜
⎟ = 2π ⎜
⎟
⎝ w⎠
⎝ w1 / 2 ⎠
⎝ AP ⎠
w
w1 / 2
hP
AP
H=
L
-
(8)
Peakbreite
Peakbreite in halber Peakhöhe
Peakhöhe im Maximum
Peakfläche
L
N
(9)
- Säulenlänge
H resultiert aus der modellhaften Beschreibung des Zusammenwirkens aller
peakverbreiternden Prozesse. Daher stellen Trennstufenzahl bzw. -höhe keine
Konstanten für eine Säule dar, sondern verändern sich mit der Retentionszeit. Zur
Kontrolle der Trennleistung einer Säule ist deshalb stets die gleiche Verbindung zu
verwenden.
Die theoretische Bodenhöhe H beschreibt die Breite eines Peaks.
Folgende Effekte tragen zur Peakverbreiterung bei:
Eddy-Diffusion
Die unterschiedlichen Wege der Substanz im Säulenbett. Sie ist abhängig von der
Teilchengröße, aber unabhängig von der Strömungsgeschwindigkeit.
9
HPLC
Längsdiffusion
Die radiale Diffusion der Substanz im Eluenten. Der Anteil am Gesamtwert für H ist
umgekehrt proportional zur Strömungsgeschwindigkeit u.
Stoffaustausch in mobiler und stationärer Phase
Die Statistische Verdünnung der Probenmoleküle in Längsrichtung der Säule. Sie ist
proportional zur Strömungsgeschwindigkeit u.
Zur Erreichung des Verteilungsgleichgewichtes müssen die Moleküle zwischen
stationärer und mobiler Phase wechseln. Da aber nur längs der Säule ein echter Fluss
herrscht, werden die Soluten in alle anderen Richtungen durch Diffusion transportiert,
welche durch die Viskosität und die Kollision mit den Partikeln behindert wird. Geringe
Viskosität und kleine Partikelgrößen wirken einer Bandenverbreiterung daher entgegen.
Infolge der Viskosität der Flüssigkeit erfolgt die Längsdiffusion in der HPLC-Säule
sehr langsam, und eine merkliche Bandenverbreiterung infolge der Längsdiffusion ist
nur bei sehr niedrigen Strömungsgeschwindigkeiten der mobilen Phase zu beobachten.
Der Stoffaustausch in der stationären Phase ist der einzige Effekt, der eine
Stofftrennung bewirkt. Da die Soluten unterschiedlich weit in die stationäre Phase
eindringen, trägt sie zur Peakverbreiterung bei. Je tiefer ein Solut eingedrungen ist,
desto länger benötigt er für den Rücktransport in den sich längs der Säule bewegenden
Eluentenstrom.
Die Van-Deemter-Funktion stellt den Zusammenhang zwischen theoretischer
Bodenhöhe (HETP) und der linearen Strömungsgeschwindigkeit für ein gegebenes
Phasensystem dar, H = f (u).
Van-Deemter-Funktion
H=A+B/u+C⋅u
(10)
A - Eddy-Diffusion
B - Längsdiffusion
C - Stoffaustausch in mobiler und stationärer Phase
H = A term + B term + C term
HETP
1
B
C
Optimale Trennstufenzahl
C
A
1
B
Lineare Strömungsgeschwindigkeit u [mm/sec]
Bild 6: Van-Deemter-Funktion
10
HPLC
Folgende Forderungen ergeben sich für die Minimierung einer Peakverbreiterung und
damit für die Erhöhung der Trennleistung:
-
Enge Korngrößenverteilung
Gleiche Form der Partikel (möglichst sphärisch statt irregulär)
Gleichmäßige Säulenpackung
Niedrigviskoser Eluent
Verwendung möglichst kleiner Partikel
Einfluss der Partikelgröße auf HETP
HETP
10 μm Partikel
1970er
5 μm Partikel
1980er
3.5 μm Partikel
1990er
Lineare Strömungsgeschwindigkeit u [mm/sec]
Bild 7. Einfluss der Partikelgröße auf HETP
Reduzierte Trennstufenhöhe, h
HPLC-Säulen können mit reduzierten, dimensionslosen Größen miteinander verglichen
werden.
h=
H
L
=
dp N ⋅ dp
h beschreibt die Höhe
Korndurchmessers dp.
(11)
einer
theoretischen
Trennstufe
in
Vielfachen
des
Reduzierte Strömungsgeschwindigkeit, ν
ν=
u ⋅ dp
Dm
=
L ⋅ dp
(12)
to ⋅ Dm
ν sagt aus, wie schnell die mobile Phase bezüglich des Korndurchmessers dp und
des Diffusionskoeffizienten Dm der Substanz fließt
11
HPLC
Reduzierter Strömungswiderstand, ϕ
ϕ=
Δp ⋅ d p 2
L ⋅η ⋅ u
==
Δp ⋅ d p 2 ⋅ t o
(13)
L2 ⋅ η
η - Viskosität in Ns/m2
u - lineare Strömungsgeschwindigkeit in m/s
Δp - Druckabfall in N/m2
Mit ϕ kann der Druckabfall auf übersichtliche Weise angegeben werden. Problematisch
ist die genaue Kenntnis der Viskosität η des Eluenten.
Apparatives Totvolumen, Vo,app
Das apparative Totvolumen einer HPLC-Anlage ist das Volumen der Apparatur von der
Injektion bis einschließlich der Detektorzelle - ohne Säule!
Das Totvolumen hat einen wesentlichen Einfluss auf die Peakschärfe und -form und
bestimmt daher ebenfalls die Trennleistung einer HPLC-Anlage.
Die experimentelle Bestimmung des apparativen Totvolumens erfolgt durch Ermittlung
der Zeit t, die eine Testsubstanz (z. B. Aceton) bei ausgebauter Säule vom Injektor zum
Detektor benötigt.
Vo,app = F ⋅ t
(14)
Auflösung, R
Die Auflösung R zweier benachbarter Peaks 1 und 2 wird aus einem Chromatogramm
nach folgender Beziehung berechnet:
R = 2⋅
t R ,2 − t R ,1
w1 + w2
= 1,18 ⋅
t R ,2 − t R ,1
(15)
w0,5(1) + w0,5(2)
Zur Definition von w und w0,5 siehe Bild 5. Eine vollständige Trennung zweier Peaks
(Basislinientrennung) ist erreicht bei R > 1,5. Allerdings hängt der Grad der
erreichbaren Trennung auch vom Höhenverhältnis A benachbarter Peaks ab. Je größer
der Höhenunterschied ist, desto größer muss R für eine Trennung sein.
Werte mit R ≥ 2 sind unerwünscht, da sie nur zu längeren Analysenzeiten und mehr
Eluentverbrauch führen.
R = 1,5, A = 1:1
Bild 8:
R = 1,0, A = 1:1
R = 0,8, A = 1:1
R = 1,5, A = 10:1
R = 1,0, A = 10:1
R = 0,8, A = 10:1
Auflösung R und Höhenverhältnisse A benachbarter Peaks
Die Optimierung der Auflösung R ist eine wesentliche Aufgabe in der
Trennungsmethodenentwicklung.
12
HPLC
R = 0,25 ⋅
α − 1 k ′2
⋅
⋅ N
1 + k ′2
α
(16)
R ist proportional zum Selektivitätsterm, zum Kapazitätsterm und zum Effektivitätstem.
Selektivitätsterm,
α −1
α
Der Selektivitätsterm wird allein durch das Phasensystem bestimmt. Schon geringfügige
Änderungen in der Zusammensetzung der mobilen Phase, der stationären Phase oder
der Temperatur können eine drastische Änderung von R bewirken. Durch Variierung
dieser drei Variablen kann eine HPLC-Methode optimiert werden.
Kapazitätsterm,
k ′2
1 + k ′2
Der Kapazitätsterm hat nur im Wertebereich 0 < k´ < 5 einen merklichen Einfluss auf R.
Mit steigendem k´-Wert nähert sich der Term asymptotisch an 1.
In der Methodenentwicklung stellt die Optimierung des Kapazitätsterms die erste
Aufgabe dar. Der optimale Bereich für k´ beträgt 2 bis 5. Ist dieser Optimalbereich für
das zu trennende Gemisch erreichbar, ist eine isokratische Arbeitsweise zu bevorzugen.
Liegen in einem Gemisch trotz Optimierung die k´-Werte im Bereich k´<1 und k´ > 10,
so ist eine Gradientenelution erforderlich.
Effektivitätsterm,
N
Der Effektivitätsterm wird durch die Trennstufenzahl der Säule bestimmt und kann
durch Veränderung der Säulenlänge L (siehe Gl. (9)), der Partikelgröße dp und der
linearen Strömungsgeschwindigkeit u optimiert werden. N geht jedoch nur mit der
Wurzel in Gl. (15) ein.
4. Quantitative Analytik
Die quantitative Analyse einer Substanz i erfolgt über deren Peakfläche Ai. Diese ist
über einen Bereich, der nach unten hin durch die Nachweisgrenze und nach oben hin
durch die Sättigung limitiert ist linear von der Konzentration des Analyten abhängig.
Ai = RFi ⋅ ci
(17)
RFi ist der sogenannte Responsefaktor des Analyten, der über die Kalibrationsfunktion
mit Standardlösungen bekannten Gehalts ermittelt wird. Es finden die
Einpunktkalibration und Mehrpunktkalibration mittels linearer Regression Anwendung.
Einpunktkalibration
Die Einpunktkalibration wird vorzugsweise angewendet, wenn der Gehalt in der Probe
in einem vorhersehbaren Bereich liegt, z. B. bei routinemäßiger Qualitätskontrolle von
Wirkstoffen. Die Konzentration der Kalibrierlösung muss im selben Bereich wie die der
13
HPLC
Probe liegen. Da bei dieser Methode als zweiter Punkt der Kalibriergeraden der
Nullpunkt festgelegt ist, darf sich die Differenz zwischen dem Gehalt an Probe und
Standard nur geringfügig unterscheiden.
a. Externer Standard
Die Kalibierlösung muss alle in der Probe zu bestimmenden Komponenten als
Reinsubstanzen in bekannter Konzentration enthalten.
RFi =
Ai
ci
(18)
Mit dem nach Gl. 18 ermittelten Responsefaktor RFi und der gemessenen Peakfläche
Ax,i kann die unbekannte Konzentration cx,i der Substanz i berechnet werden:
cx ,i =
A x ,i
RFi
(19)
Die erreichbare relative Standardabweichung (RSD) beträgt ca. 0,2 %. Die Präzision
wird vor allem durch eine exakte Probendosierung bestimmt.
Um gerätebedingte systematische Fehler zu minimieren, ist der Responsefaktor vor
jeder Analyse neu zu bestimmen.
b. Interner Standard
Die Kalibrierlösung enthält die gleichen Komponenten wie die Probe. Zusätzlich
werden allen Kalibrierlösungen und der Probe jeweils die gleiche Stoffmenge eines
internen Standards S zugesetzt. In der Praxis erfolgt dies durch Zugabe des jeweils
gleichen Volumens einer Lösung des internen Standards zu allen Kalibrations- und
Probelösungen.
Bei der Auswahl eines internen Standards sind folgende Forderungen zu
berücksichtigen:
- Er darf in der Probe selbst nicht enthalten sein.
- Er soll in der Nähe der zu bestimmenden Substanzen eluieren.
- Er darf nicht mit anderen Peaks überlappen.
- Er soll eine ähnliche Peakintensität wie die Probe aufweisen.
- Bei UV/Vis Detektion sollte er eine ähnliche Absorption wie die Probe besitzen.
- Er muss genügend stabil sein und in der erforderlichen Reinheit zur Verfügung
stehen.
(Geringfügige) Dosierfehler werden mit dieser Kalibrationsmethode ausgeschaltet. Die
erreichbare Präzision ist daher besser als mit externem Standard und beträgt ca. 0,1 %.
Für den Responsefaktor RF* (mit IS) gilt folgende Beziehung:
RF * =
Ai ⋅ cS
AS ⋅ ci
(20)
14
HPLC
Ai
AS
ci
cS
-
Peakfläche der Referenzsubstanz
Peakfläche des internen Standards
Konzentration der Referenzsubstanz
Konzentration des internen Standards
Zur Bestimmung einer unbekannten Konzentration cx,i der Substanz i, wird der
Probelösung die gleiche Menge an internem Standard zugesetzt.
Für die unbekannte Konzentration cx,i gilt die Beziehung:
Ax ,i ⋅ cS
AS ⋅ RF *
Mehrpunktkalibration mittels linearer Regression
cx ,i =
(21)
Wenn die zu bestimmende Konzentration in einem größeren Intervall liegen kann,
müssen die Kalibrierstandards den gesamten Konzentrationsbereich abdecken.
a.
Externer Standard
Die Kalibration erfolgt mit Standardlösungen des zu bestimmenden Analyten. Für die
Wertepaare (Konzentration; Peakfläche) lässt sich eine Regressionsfunktion ermitteln.
Für einen linearen Zusammenhang gilt die Beziehung:
Ai = ao , i + a1, i ⋅ ci
(22)
Die Steigung a1 stellt die Empfindlichkeit der Methode dar und sollte möglichst groß
sein. Der Achsabschnitt ao entspricht dem Blindwert. Aus Gl. 22 folgt die
Analysenfunktion, mit der die Konzentration unbekannter Proben berechnet werden
kann.
cx , i =
b.
Ax , i − ao ,i
(23)
a1, i
Interner Standard
Allen Kalibrierstandardlösungen sowie der Probelösung wird die gleiche Menge eines
internen Standards zugefügt.
Für die lineare Regression erhält man Gl. 24, woraus sich die Beziehung für die
Berechnung unbekannter Konzentrationen ableiten lässt (Gl. 25).
Ai
c
= ao′ ,i + a1′,i ⋅ i
As
cs
c x ,i
(24)
⎛ Ax ,i
⎞
⎜
− ao′ ,i ⎟
A
⎟⋅c
=⎜ s
⎜
⎟ s
a1′,i
⎜
⎟
⎝
⎠
(25)
15
HPLC
5. Praktikumsaufgaben
Versuch 1
1.1
Nennen Sie die Parameter der Säule und den Eluent.
1.2
Begründen Sie die Auswahl der Detektionswellenlänge von 270 nm.
1.3
Geben Sie 1 ml/min Flussrate (Hexan/2% i-Propanol) ein und messen Sie über
mindestens 3 min das Volumen, um die Flussrate zu überprüfen.
1.4
Berechnen Sie die relative Standardabweichung.
1.5
Injizieren Sie jeweils 20 μl, 50 μl und 100 μl einer Biphenyllösung und stellen Sie die
Retentionszeiten und Peakflächen tabellarisch dar.
1.6
Diskutieren Sie welches Injektionsvolumen bei der verwendeten 20 μl Probenschleife
reproduzierbare Retentionszeiten und Peakflächen liefert und wiederholen sie die
Injektion mit dem ausgewähltem Volumen 2 mal.
1.7
Bestimmen Sie mit einer geeigneten Verbindung die Totzeit.
Zur Auswahl stehen Lösungen folgender Verbindungen: Tetrachlorethan,
Tetrachlorethylen, Benzen. Begründen Sie die Eignung bzw. Nichteignung der
Substanzen.
1.8
Berechnen Sie die Totzeit mit den gegebenen Säulenparametern und geben Sie die
prozentuale Abweichung an. Berechnen Sie das apparative Totvolumen und geben Sie
Ursachen für ein zu großes Totvolumen einer HPLC-Apparatur an!
1.9
Welche Ursachen kommen in Betracht, wenn zwischen der berechneten und der
experimentell bestimmten Totzeit eine Differenz besteht?
Versuch 2
2.1
Nehmen
Sie
ein
Chromatogramm
einer
Lösung
aus
Biphenyl,
Dimethoxybenzaldehyd, Nitrobenzen, Ergosterol und 6-Methoxytetralon auf.
CHO
OCH3
CH3O
Biphenyl
NO2
Dimethoxybenzaldehyd
Nitrobenzen
O
CH3O
HO
6-Methoxytetralon
Ergosterol
16
HPLC
2.2
Ordnen Sie die Peaks den Komponenten des Gemischs zu und begründen Sie die
Reihenfolge.
2.3
Die Richtigkeit der Zuordnung ist für ausgewählte Peaks durch den Vergleich der UV
Spektren mit einer Spektrenbibliothek und/oder durch Aufnahme des Chromatogramms
der jeweiligen Reinsubstanz unter den gleichen chromatographischen Bedingungen zu
überprüfen.
2.4
Folgende Parameter sind für alle Peaks aus dem Chromatogramm zu ermitteln:
Retentionszeit, Nettoretentionszeit, Retentionsfaktor, Retentionsvolumen und Tailing.
2.5
Die theoretische Bodenzahl für Biphenyl, Dimethoxybenzaldehyd und Methoxytetralon
zu bestimmen!
Die Ergebnisse sind tabellarisch zusammenzustellen!
2.6
Welche Schlussfolgerungen ergeben sich daraus für die Wahl eines Stoffes bzw.
Stoffgemisches für die experimentelle Bestimmung der theoretischen Bodenzahl?
Versuch 3
Der Wirkstoff Dihydrotachysterol (DHT) kann aus Dihydrovitamin D2 (DHV) durch
jodkatalysierte Photoisomerisierung synthetisiert werden:
I2; hv
H3C
CH3
OH
HO
DHT
DHV
3.1
Nehmen Sie ein Chromatogramm des gegebenen Bestrahlungsgemischs auf und
geben Sie Retentionszeiten, Retentionsfaktoren, Tailingfaktoren und Auflösung an und
bewerten Sie die Kenngrößen.
Es sind Konzentration und Umsatz Xi an DHV in dem gegebenen Bestrahlungsgemisch
zu bestimmen! Die Konzentration von DHV vor der Bestrahlung betrug 41,92 μg/ml. Es
ist die Mehrpunktkalibration mit der Methode des internen Standards durchzuführen!
3.2
Es ist selbständig eine geeignete Referenzsubstanz für den internen Standard aus
folgendem Angebot zu wählen, und die Auswahl ist zu begründen!
R
HO
Vitamin D3
HO
Vitamin D2
HO
R1 = OH
R2 = CH3COO
Cholesterol
R1 = Ergosterol
R2 = Ergosterolacetat
17
Biphenyl
HPLC
3.3
Es sind aus der Stammlösung von DHV (c = 40 μg/ml) 4 Kalibrationslösungen
herzustellen denen jeweils 0,5 ml der internen Standardlösung zugesetzt werden.
Die Volumina der Kalibrationslösungen sollen 2 ml betragen und enthalten jeweils
0,25 ml, 0,5 ml, 0,75 ml oder 1 ml Stammlösung DHV.
3.4
Ermitteln Sie die Kalibrationsfunktion!
3.5
Berechnen Sie die DHV-Konzentration und den Umsatz des Bestrahlungsgemisches
indem Sie 1 ml des Bestrahlungsgemisches 0,5 ml der Standardlösung zusetzen und
auf 2 ml auffüllen.
3.6
Geben Sie die Konzentration des Standards, die Peakflächen von DHV und des
Standards sowie das Verhältnis von ADHV/AS in der Mischung an.
Aufgaben:
A1
HPLC-Analysen werden unter gleichen Bedingungen durchgeführt, es wird jedoch eine
veränderte Totzeit gemessen. Welche Informationen erhält man daraus?
A2
Eine Trennsäule mit den Maßen 250 x 3,2 mm ist mit Kieselgel (dp = 5 µm)
gefüllt. Mit dem Eluent n-Hexan (Viskosität η = 0,33 mPa s) wurde - mit einem
Druckabfall von 70 bar - eine Totzeit von to= 1 min gemessen.
Berechnen Sie die reduzierten Größen ν und ϕ!
A3
Das apparative Totvolumen ist mit folgenden Daten für eine HPLC-Anlage zu berechnen
und zu bewerten:
Testsubstanz: Aceton; Flussrate 0,2 ml/min
Gemessene Peakspitze bei t = 35 s
Welche Ursachen sind in Betracht zu ziehen, wenn das Totvolumen für eine
HPLC-Apparatur zu groß ist!
A4
Eine HPLC-Säule hat die Abmessung 250 x 4 mm.
Schätzen Sie ab, welche Mengen an Probesubstanz für eine analytische
Trennung aufgegeben werden kann bei Verwendung von a) einer NP-HPLC-Säule und
b) einer RP-HPLC-Säule!
A5
In welcher Reihenfolge eluieren Anilin, Benzoesäuremethylester, Ethylbenzen, Phenol,
Thioharnstoff, Toluen und p-Toluidin auf einer RP-Säule und warum?
A6
Welche Veränderungen sind zu erwarten, wenn eine Trennsäule mit der Porenweite von
60 Å anstelle von einer Trennsäule mit 10 nm Porenweite verwendet wird und warum?
18
HPLC
6. Anhang
Lösungsmittelstärke der eluotropen Reihe
Lösungsmittel
n-Hexan
Isooctan
Cyclohexan
Tetrachlorkohlenstoff
Isopropylether
Toluen
n-Propylchlorid
Benzen
Diethylether
Chloroform
Methylenchlorid
Tetrahydrofuran
Ethylendichlorid
Aceton
Dioxan
Essigsäureethylester
Amylalkohol
Dimethylsulfoxid
Nitromethan
Acetonitril
Iso- und n-Propanol
Pyridin
Ethanol
Methanol
Essigsäure
Wasser
Lösungsmittelstärke
0,01
0,01
0,04
0,18
0,28
0,29
0,3
0,32
0,38
0,4
0,42
0,45
0,49
0,56
0,56
0,58
0,61
0,62
0,64
0,65
0,82
0,71
0,88
0,95
groß
sehr groß
Literatur:
K. K. Unger, Handbuch der HPLC, Teil 1, 1995, GIT Verlag
Didaoui L, Touabet A, Ahmed AYBH, et al., Evaluation of dead time calculation in reversed-phase
liquid chromatography using a multiparametric mathematical method, HRC Journal of High Resolution
Chromatography, 22 (10): 559-564, 1999.
Wren SAC, Peak capacity in gradient ultra performance liquid chromatography (UPLC)
Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 38 (2): 337-343, 2005.
Bildnachweis:
www.waters.com
www.advancedscientifichealth.com
www.cibnor.mx
www.abc.net.au
http://users.utu.fi/juhrau/birch.jpg
Yokono T. Nakahara M, Makino, et al., Application of carbon microbeads for column packing for high
performance liquid chromatography, Journal of Materials Science Letters, 7 (8): 864-866, 1988.
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