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Département de Biotechnologie
Thèse de Doctorat en Microbiologie
Thème
Diversité taxonomique et symbiotique des
rhizobia associés aux Acacia sp. d’Algérie
Présentée par :
Boukhatem Zineb Faiza
Dirigée par : Mr BEKKI Abdelkader, Professeur à l’Université d’Oran.
Devant les membres de jury constitué de:
Présidente : FYAD Zohra, Professeur à l’Université d’Oran.
Examinateur : HADJAJ AOUEL Seghir, Professeur à l’Université d’Oran.
Examinateur : ABDELWAHED Djaml Eddine, Professeur à l’Université de Tlemcen.
Examinateur : de LAJUDIE Philippe, Directeur de recherches à l’IRD, France.
Co-Directeur de thèse : GALIANA Antoine, Directeur de recherches au CIRAD, France.
Dédicace
Je dédie ce travail à ma mère, ses sacrifices ont pavé mon chemin vers la
réussite, je ne saurais lui exprimer ma gratitude pour tout ce qu’elle a inculqué
en moi. J’espère que ce modeste travail récompensera en partie son
dévouement.
A feu mon père qui aura toujours une place dans mon cœur.
A mes trois trésors, mon mari ma fille et mon fils qui donnent un sens à ma vie.
A mon frère, mes deux sœurs ainsi que les prunelles de mes yeux, mes petites
nièces chéries.
A toute ma famille, ma belle famille et mes amis.
Remerciements
Remerciements
Merci tout d’abord à Dieu miséricordieux de m’avoir donné la force d’accomplir cette tâche.
Ce travail s’est déroulé en alternance au LBRAP (Laboratoire de Biotechnologie des
Rhizobiums et amélioration des plantes à l’université d’Oran, Es-Senia et au LSTM
(Laboratoire des Symbioses Tropicales et Méditerranéennes) de Montpellier, France.
Je remercie Pr. BEKKI Abdelkader d’avoir accepté d’encadrer ce travail et pour tous ses
conseils avisés.
Un grand merci au Dr. GALIANA Antoine pour tous les efforts fournis, pour ses approches
intéressantes et pour sa disponibilité qui lui a gâché bien des weekends et des vacances.
Ainsi qu’aux directeurs successifs du LSTM (Laboratoire des Symbioses Tropicales et
Méditerranéennes) de Montpellier : DREYFUS Bernard et LEBRUN Michel pour avoir accepté
ma candidature à des stages plus que fructueux qui m’ont permis d’avancer dans mon
travail.
Je tiens à remercier les membres du jury : Pr. FYAD qui a accepté sans hésitation de présider
ce jury, Pr. HADJAJ et Pr.ABDELWAHED qui m’ont accordé leur temps afin d’examiner ce
travail en cette fin d’année toujours surchargée, et enfin un grand merci au Pr. de LAJUDIE
qui répond toujours présent quant on a besoin de lui.
Je ne saurais remercier ma collègue et amie Dr MERABET Chahinez pour son aide précieuse
sur la construction phylogénétique, ainsi que pour son soutient et sa bonne humeur
contagieuse.
J’exprime aussi ma reconnaissance à tous mes collègues du département de biotechnologie,
enseignants, personnel technique et à l’équipe du laboratoire de Laboratoire de
Biotechnologie et Amélioration des Plantes, enseignants et post-graduants pour leurs
encouragements.
Je ne saurais oublier de remercier toute l’équipe du LSTM (Laboratoire des Symbioses
Tropicales et Méditerranéennes) de Montpellier ; Odile pour son aide précieuse, Christine
pour son humanisme, Philippe et tous les autres : chercheurs et doctorants qui m’ont aidé ne
serait ce que d’un mot, d’un sourire. Mes courts séjours m’ont beaucoup enrichi autant sur
le plan scientifique qu’humain.
Mes remerciements s’adressent aussi à la direction des forêts de toutes les wilayas que j’ai
visitées, les moyens généraux ainsi que l’INRF spécialement Salah, Mme Sahki ainsi que Réda
et Ibrahim, nos guides à Tamanrasset.
Enfin, j’exprime toute ma gratitude à toute ma famille, mes amis d’ici et d’ailleurs que j’ai
délaissés mais qui ont été compréhensifs et patients et à toutes les personnes qui m’ont
encouragées, soutenues durant les moments difficiles.
Une thèse est un investissement en temps, en énergie, en santé,
avec quelques manips qui ne vont pas dans le sens qu’on
aurait voulu, mais avant tout, c’est une grande expérience
humaine, alors MERCI à tous ceux qui y ont contribué.
Sommaire
Sommaire
Chapitre I : Recherche bibliographique
I : « Les rhizobia »
I-1- Définition des rhizobia…………………………………………….…………….
I-2- La symbiose légumineuse-rhizobium : définition et évolution…..……………
I-3- Formation des nodules……...……………………………………………………
I-4- Taxonomie des BNL……...……………………………………………………...
I-4-1- Outils de la taxonomie bactérienne………………………………...………….
I-4-2- Position taxonomique actuelle des BNL…..………………………..…………
I-4-3- Taxonomie des rhizobia associés aux Acacias………………………..……...
I-5- Spectre d’hôte des rhizobia associés aux Acacias…………………………….…
I-6- Effet des contraintes édaphiques sur la croissance des rhizobia…………….…..
01
02
03
05
05
09
12
19
19
II: « Les Acacias »
II-1- Généralités………………………………………………………………………
II-2- Origine et évolution de la nodulation chez les légumineuses…………………..
II-3- Taxonomie des Acacia………………………………………………………….
II-4- Répartition des Acacias dans le monde…………………………………………
II-5- Intérêts et importance des Acacias……………………………………………...
II-6- Les Acacias en Algérie………………………………………………………….
II-6-1- Description et répartition géographique des Acacias étudiés………………...
II-6-2- Utilisation et caractéristiques des Acacias étudiés…………………………...
II-7- Résistance des Acacias aux contraintes édaphiques……………………………
25
25
26
29
29
34
35
40
42
III: « La fixation d’azote atmosphérique »
III-1- Introduction…………………………………………………………………….
III-2- Comparaison entre les arbres et les plantes annuelles fixateurs d’azote ……...
III-3- Méthodes d’estimation de la fixation d’azote atmosphérique…………………
III-3-1- Méthodes indirectes………………………………………………………..
III-3-2- Méthodes directes (isotopiques)…………………………………………
III-4- Le potentiel fixateur de N2 des Acacias ……………………………………….
III-5- Classification des Arbres Fixateurs d’Azote selon leur potentiel de fixation du
N2………………………………………………………………………………………………………………………………
46
46
47
47
49
54
57
Chapitre II : Etude expérimentale
Partie I : Caractérisation des rhizobia associés aux espèces d’Acacia d’Algérie
Matériel et méthodes: Caractérisation des rhizobia
Introduction………………………………………………………………………….
Méthodologie…………………………………………………………………………
1-Echantillonnage…………………………………………………………………..
2-Analyse physico-chimique du sol………………………………………………..
3- Isolement des rhizobia…………………………………………………………..
3-1-Piégeage ………………………………………………………………….
3-2- Isolement et purification des souches …………………………………..
4- Test de nodulation et d’efficience ………………………………………………
5- Analyse statistique ………………………………………………………………
58
58
58
61
61
61
63
64
66
Sommaire
6- Caractérisation phénotypique des isolats………………………………………..
6-1- Tolérance à la température. …………………………………………….
6-2- Tolérance aux pH………………………………………………………..
6-3- Tolérance à la salinité……………………………………………………
7- Phénodendogramme…………………………………………………………….
8- Caractérisation génétique des isolats…………………………………………….
Résultats et discussion : Caractérisation des rhizobia
1- Distribution des Acacias………………………………………………….....
2- Caractérisation des sites et sols prospectés ………………………………….
3- Taux de germination des graines après les différentes méthodes de
désinfection et de scarification……………………………………………….
4- Impact de la profondeur d’échantillonnage dans les lits d’oueds desséchés
sur l’isolement des populations rhizobiennes………………………………...
5- Isolement, purification et statut symbiotique des souches ………………….
6- Caractérisation génétique par le séquençage partiel du 16S rARN………….
7- Détermination de la spécificité d’hôte des BNL isolées par AFC ……........
8- Tolérance des souches à la salinité, température et pH………………………
9- Tests
d’efficience
des
souches
d’Acacias……………………………………..
10- Caractérisation phénotypique des souches isolées d’Acacias phénodendogramme
67
67
67
67
67
69
73
75
77
79
82
88
98
100
108
115
Partie II : Potentiel fixateur d’azote des Acacia en Algérie
Matériel et méthodes : Potentiel fixateur d’azote des Acacia en Algérie
Introduction…………………………………………………………………………. 121
1- Méthode de la dilution isotopique par enrichissement du sol en15N …………… 122
a- Protocole d’échantillonnage sur le terrain……………………………................ 122
a-1 Description des sites de prélèvement …………………………………….. 122
a-2 Prélèvement du sol ………………………………………………………… 123
b- Protocole expérimental en serre………………………………………………… 123
c- Analyse du sol………………………………………………………………….. 127
2- Abondance naturelle en 15N………………………………………………………. 127
Résultats et discussion : Potentiel fixateur d’azote des Acacia en Algérie
1- Résultats des analyses du sol des trois sites étudiés…………………………….. 130
2- Effet du sol sur la croissance de trois espèces d’Acacia…………………………… 131
3- Effet de l’inoculation sur la croissance de trois espèces d’Acacia sur quatre types
de sols………………………………………………………………………………..... 136
4- Estimation du potentiel fixateur de trois espèces d’Acacia sur différents types
de sols par la méthode de la dilution isotopique en 15………………………................ 140
5- Estimation du potentiel fixateur in situ de trois espèces d’Acacia sur différents
types de sols par la méthode de l’abondance naturelle………………………….......... 146
Conclusion et perspectives………………………………………………………….. 152
Références bibliographiques
Annexes
Liste des tableaux
Tableau 1
Page
Classification des Bactéries Nodulant les Légumineuses (Weir, 10
2011).
Tableau 2
Classification des espèces de rhizobia nodulant les Acacias.
13
Tableau 3
Les classifications les plus importantes dans le genre Acacia de 27
Bentham (1875) à Maslin et al. (2003)
Tableau 4
Nom génériques et infragénériques de Acacia sens. lat.
28
Tableau 5
Classification d’Acacia sens. lat. dans le monde (Maslin et al., 29
2003).
Tableau 6
Caractéristiques morphologiques, distribution géographique et 35
conditions édaphiques des Acacias étudiés (Dommergues et al.,
1999 ; Baumer, 1999 ; Sahki et al., 2004 ; Hazem, 2009)
Tableau 7
Comparaison entre la tolérance de quelques espèces d’Acacia à la 44
salinité (Ansari et al., 2007)
Tableau 8
Estimation de l’azote fixé par les arbres au champ par les 56
méthodes isotopiques (d’après Galiana et al., 2004)
Tableau 9
Interprétation de la salinité du sol en fonction de sa texture et de sa 61
conductivité électrique de l’extrait aqueux au 1/5 en mS/cm, selon
le département d’agriculture et d’Alimentation d’Australie.
Tableau 10
Description climatique, écologique et situation géographique des 76
sites étudiés.
Tableau 11
Salinité et pH des sols échantillonnés.
77
Tableau 12
Taux de germination des graines de 08 espèces d’Acacia selon le 78
mode de scarification (chimique ou manuelle) en fonction du
temps d’immersion.
Tableau 13
Résultats du taux de nodulation du piégeage sur tubes Gibson et 81
dans les pots.
Tableau 14
Nombre d’isolats par espèce d’Acacia et par site prospecté.
83
Tableau 15
Liste des souches renodulantes, leur statut symbiotique et aspects 86
des nodosités.
Tableau 16
Comparaisons des séquences obtenues par séquençage partiel du 90
16S rARN avec les séquences de référence de la base de données
Genbank du site NCBI.
Tableau 17
Tolérance des souches à la température, salinité et Ph selon leur 100
provenance et leur plante hôte.
Tableau 18
Résultats du test d’efficience (poids sec, hauteur de la tige, nombre 109
des nodules) des différentes souches sur les différentes espèces
d’Acacia.
Tableau 19
Résistance intrinsèque aux antibiotiques et métaux lourds des 16 115
souches isolées de différentes espèces d’Acacia.
Tableau 20
Réduction des sucres et utilisation des acides aminés par les 116
Tableau 21
Croissance à différents pH, aptitude à hydrolyser l'urée et à réduire 117
les nitrates des 16 souches isolées de différentes espèces d’Acacia.
Tableau 22
Profil de tolérance à différentes concentrations de NaCl et à 117
différentes températures 16 souches isolées de différentes espèces
d’Acacia.
Tableau 23
Densité du sol prélevé dans chaque site d’études
125
Tableau 24
Résultats de l’analyse physico-chimique des trois sites étudiés
130
Tableau 25
Hauteur des plants et nombre de nodules obtenus chez les 131
différentes espèces d’Acacia testées, après 9 mois de culture en
serre dans des pots contenant du sol enrichi en
15
N provenant des
quatre sites étudiés.
Tableau 26
Poids sec des feuilles, tiges et racines des plants des différentes 134
espèces d’Acacia testées, après 9 mois de culture en serre dans
des pots contenant du sol enrichi en 15N provenant des quatre sites
étudiés.
Tableau 27
Excès isotopiques en
15
N et teneur en N total mesurés chez les 142
plants des différents traitements, et calcul du pourcentage de N
fixé et de la quantité de N total fixé chez les différentes espèces
d’Acacia après application d’azote minéral enrichi en
15
N et neuf
mois de croissance en serre sur différentes origines de sols.
Tableau 28
Teneur en N et excès isotopique en 15N dans les différents organes 144
(racines, tiges et feuilles) des Acacias non inoculés après
application d’azote minéral enrichi en
15
N et neuf mois de
croissance en serre sur différentes origines de sols.
Tableau 29
Teneurs en N et abondance naturelle en
15
N d’échantillons 149
foliaires d’espèces fixatrices de N2 et de plantes références nonfixatrices présentes dans les trois sites d’étude et calcul de la
proportion de N fixée par les Acacias in situ.
Liste des figures
Page
Figure 1
Aspect du rhizobium dans le sol
01
Figure 2
Aspect des bactéroides dans le nodule
01
Figure 3
Le dialogue moléculaire de la symbiose légumineuse-rhizobium
04
d’après Rosenberg (1997).
Figure 4
Pouvoir discriminant des différentes techniques de la taxonomie
07
polyphasique (d’après Vandamme et al. 1996, modifié par Zakhia et
de Lajudie, 2006).
Figure 5
Aspect d’A.tortilis : -a- Aspect général de l‘arbre (route de Taghit,
37
Béchar), BZF, 2004 ; -b- Branches et gousses (Oued Tassena,
Tamanrasset), INRF, 2003
Figure 6
Aspect d’A.nilotica : -a- Aspect général de l‘arbre (Oued Idekel,
37
Tamanrasset), BZF, 2004 ; -b- Fleurs et gousses, INRF, 2003
Figure 7
Aspect d’A.seyal : -a- Aspect général de l‘arbre; -b- Branches et
38
gousses, (Oued Taghemout, Tamanrasset), BZF, 2004
Figure 8
Aspect d’A.albida : -a- Aspect général de l‘arbre; -b- Branches et
38
gousses, (Oued Tassena, Tamanrasset), BZF, 2004
Figure 9
Aspect d’A.ehrenbergiana : -a- Aspect général de l‘arbre (Oued In-
39
Tounin Tssekra, Tamanrasset), BZF, 2004; -b- Branches et épines
(Tindouf, BZF, 2006)
Figure 10
Aspect d’A.saligna : -a- Aspect d’un jeune arbre (Les dunes d’El-
39
Mactaa, Oran, BZF, 2002)
Figure 11
Principe de la mesure de la quantité du N2 fixé en utilisant la
52
méthode de dilution isotopique après enrichissement du sol en 15N
(Peoples et al., 1989).
Figure 12
Carte topographique de l’Algérie d’après Oussedik et al., 2003.
60
Figure 13
Les grandes subdivisions phytogéographiques du Sahara d’après
Quezel et Simmoneau, 1963.
Schéma représentant le dispositif de mise en place des plantules dans
60
Figure 14
66
les tubes
Figure 15
Schématisation des différents cycles du programme de la PCR utilisé.
71
Figure 16
Figure 17
Position des amorces internes du gène ADNr 16S .
Répartition des Acacias autochtones et introduits en Algérie.
72
74
Figure 18
Aspect macroscopique de la souche SE2 après 48h d’incubation à
84
28°C.
Figure 19
Aspect macroscopique de la souche SE2 au grossissement X1000.
84
Figure 20
Effet PGPR (Plant Growth Promoting) de la souche SAB3.
88
Figure 21
Arbre phylogénétique des souches de rhizobia renodulantes associées
aux Acacias d’Algérie, basé sur le séquençage partiel du gène ARNr
16S obtenu par la méthode du Neighbor-Joining, en utilisant la
distance de Kimura. Les valeurs indiquées sont des valeurs de
bootstrap issues de 1000 répétitions.
96
Figure 22
Projection factorielle plane (AFC) entre les taxa bactériens, définis
98
selon la phylogénie basée sur le séquençage partiel du 16Sr-ARN et
les 04 espèces d’Acacia.
Figure 23
Analyse en composantes principales (ACP) représentant la relation
103
entre la tolérance in vitro des isolats rhizobiens au NaCl (NaCl
tolerance) et aux hautes températures (Tpre tolerance) et les
caractéristiques
édaphoclimatiques
des
sites
d’échantillonnage
correspondants, i.e conductivité du sol (soil CW) et la moyenne
maximale annuelle de température (Site Tpre).
Figure 24
Aspect des boîtes inoculées par étalement de souches résistantes aux
106
conditions de pH et de température extrêmes.
Figure 25
Aspect d’un plant inoculé avec la souche ASB5 après 48 jours
110
d’incubation. (1) : aspect général du plant inoculé comparativement
au plant non inoculé ; (2) : aspect des nodules au grossissement X20.
Figure 26
Résultats du test d’efficience des souches de rhizobium vis à vis de 6
111-113
espèces d’Acacia.
Figure 27
Phénodendrogramme illustrant les similarités phénotypiques entre 16
119
souches de rhizobia isolées de différentes espèces d’Acacia de
régions arides et semi-arides d’Algérie.
Figure 28
Aspect général des plants cultivés en pots sur sol enrichi en 15N et
132
disposition des différents traitements après neuf mois
d’expérimentation en serre.
Figure 29
Aspect des plants témoins non-fixateurs (Eucalyptus camaldulensis)
132
cultivés sur sols des quatre sites étudiés, après neuf mois de
croissance en serre et enrichissement du sol en
Figure 30
15
N.
Aspect des plants d’A. karroo non inoculés cultivés sur sols de la
136
Ferme de Messerghine (S1) et de la forêt de M’sila (S2), après neuf
mois de croissance en serre et enrichissement du sol en 15N.
Figure 31
Aspect de différents plants d’A. seyal et de l’espèce témoin non-
138
fixatrice E. camaldulensis cultivés sur sol de la Sebkha d’Oran
enrichi en
15
N après neuf mois de croissance en serre et
enrichissement en 15N.
Figure 32
Aspect de différents plants d’A. saligna et de l’espèce témoin non-
138
fixatrice E. camaldulensis cultivés sur sol de dunes d’El Mactaa
enrichi en 15N après neuf mois de croissance en serre.
Figure 33
Aspect de différents plants d’A. karroo et de l’espèce témoin non-
139
fixatrice E. camaldulensis cultivés sur sol de la Ferme de
Messerghine enrichi en 15N après 9 mois de croissance en serre.
Figure 34
Aspect de différents plants d’A. karroo et de l’espèce témoin non-
139
15
fixatrice E. camaldulensis sur sol de la forêt de M’sila enrichi en N
après neuf mois de croissance en serre.
Figure 35
Aspect de certaines plantes non fixatrices des régions étudiées : (1)
Quercus suber, (2) Ballota hirsuta Bentham, (3) Centaurea
calcitrapa, (4) Olea europaea
148
Abréviations :
-
Act: Acid tolerance.
-
ADN : Acide DésoxyriboNucléique.
-
AFN : Arbre Fixateur d’Azote.
-
ARA : Activité Réductrice d'Acétylène.
-
ARDRA: Amplified Ribosomal Restriction Analysis.
-
ASPs: Acid Shock Proteins.
-
BNL : Bactéries Nodulant les Légumineuses.
-
BZF : Boukhatem Zineb Faiza.
-
CIRAD : Centre de coopération International en Recherche Agronomique pour le
Développement.
-
CW: Conductivity of Water.
-
DO: Densité Optique.
-
dS : deci siemens.
-
Ei : excès isotopique dans la plante fixatrice.
-
Eo: excès isotopique dans la plante de référence.
-
EPS: Exopolysaccharides.
-
FAO: Food and Agriculture Organization.
-
FCA : Factorial Correspondence Analysis (analyse multifactorielle en composantes
principales).
-
G/C: Guanine/Cytosine.
-
GST: Glutathion S transferase.
-
HSPs: Heat Shock Proteins.
-
IAA : Indole-3-Acetic Acid.
-
IGS : Espace intergénique entre les gènes d’ADNr 16S et 23S.
-
INRF : Institut National de la Recherche en Foresterie.
-
IRD : Institut de Recherche pour le Développement.
-
IS: Insertion Sequences.
-
ITS: Internal Transcribed Spacer.
-
Kcal: Kilo Calorie.
-
LCOs : Lipochito-oligosaccharides.
-
LPS : Lipopolysaccharides.
-
LSTM : Laboratoire des Symbioses Méditerranéennes et Tropicales.
-
N: Azote.
-
NCCLS: National Committee for Clinical Laboratory Standards.
-
Ndfa : Azote dérivé de l’atmosphère (quantité de N2 fixé).
-
Ndffi : N dérivé de l’engrais marqué dans la plante fixatrice de N2.
-
Ndffo : N dérivé de l’engrais marqué dans la plante non fixatrice de N2 (de référence).
-
Ndfs : Azote dérivé du sol.
-
Ndfsi : N dérivé du sol dans la plante fixatrice de N2.
-
Ndfso : teneur en azote total de la plante de référence (témoin non fixateur).
-
NOPs : Nodulation Outer Proteins.
-
NPP : Nombre le Plus Probable.
-
Nt : Quantité de N total dans la plante fixatrice.
-
Pai : Ilots de symbiose correspondant aux Îlots de pathogénicité chez les bactéries
pathogènes.
-
PAR : Photosynthetically Active Radiation.
-
PCA : Principal Component Analysis (analyse en composante principale).
-
PCR: Polymerase Chain Reaction ou en français : Réaction de Polymérisation en
Chaîne.
-
PCR-RFLP : Polymorphisme de Fragments de Restriction.
-
PGPR: Plant Growth Promoting Rhizobacteria.
-
pSym: plasmide symbiotique.
-
rRNA :Acide ribonucléique ribosomique.
-
Sens.str: sensu strictu.
-
UFC : Unité Formant les Colonies.
-
YEMA: Yeast Extraxt Manitol Agar.
Introduction
Introduction et problématique
Les zones arides et semi arides couvrent approximativement quatre dixièmes des
régions terrestres du monde (Olivares et al, 1988) et selon la FAO (1993), 66% de ces
zones écologiques se situent sur le continent Africain. De même qu’en Algérie, l’étage
bioclimatique saharien couvre 89.5% de la superficie globale tandis que pour les régions
arides et semi arides, il est de 4.78% et 4.12% respectivement (Nedjraoui, 2001). La
réduction de la végétation et spécialement le remplacement des arbres périnéaux par des
plantes annuelles causent une diminution de la biomasse de la litière, des matières
organiques et de la fertilité des sols, et subséquemment mènent à l’érosion (Kirmse et
Norton, 1984). Ces facteurs conjugués aggravent le phénomène de désertification ; d’où la
nécessité d’un programme de revégétalisation réfléchi incluant des arbres robustes, adaptés
à la sécheresse (Nedjraoui, 2001) et fixateurs d’azote (Zahran, 1999). Les légumineuses
ligneuses font parties des espèces pouvant établir des symbioses bénéfiques en plus de leur
capacité à croître sur des sites arides qui sont inadéquats pour de nombreuses cultures
(Mohamed et al., 2000). L’Acacia en fait partie, c’est un bon candidat pour lutter contre la
déforestation des régions marginales souffrant de sécheresse et caractérisées par un niveau
de fertilité bas et/ou un haut degré de salinité car la plupart de ces espèces tolèrent la
sécheresse et la salinité (Piha, 1995). La plupart des Acacias sont capables de former des
nodules sur leurs racines en symbiose avec des bactéries appelées rhizobia. Dans ces
nodules, ces bactéries fixent l’azote atmosphérique et le transforment en une forme
disponible pour la plante hôte. Grâce à cette symbiose, ils sont capables de régénérer,
stabiliser, fertiliser et lutter contre l’érosion du sol (Lal et Khana, 1993; Zerhari et al.,
2000). Sans compter, qu’en plus de son haut potentiel fixateur d’azote, l’Acacia a des
usages et intérêts multiples, à titre d’exemple, il peut être utilisé comme source de
fourrage, de fuel et de tannins et il est même utilisé à des fins médicinales (Räsänen, 2000 ;
Midgley et al., 2001).
Dans les régions arides où l’humidité du sol et la faible fertilité souvent limitent les
récoltes ; la recherche des légumineuses ligneuses symbiotiques natives qui sont quelques
fois négligées constitue une base saine pour augmenter le rendement global dans ces
régions (Zahran, 1999). En effet, l’introduction d’arbres fixateurs d’azote atmosphérique
est largement acceptée comme étant l’une des méthodes les plus efficaces pour améliorer
la productivité des agrosystèmes à travers l’amélioration de la balance azotée du sol
(Galiana, 2004). C’est dans ce contexte que s’intègre notre travail. La diversité et la
topographie des Acacias ainsi que leurs symbiotes restent pauvrement documentée en
Algérie, sauf deux études menées sur des plants en pépinières sur A.saligna (Amrani et al.,
2010) et A.tortilis (Noureddine et al., 2010). C’est pour cela qu’un recensement des
espèces d’Acacia, spécialement dans les régions aride et semi arides dominantes sur le
territoire algérien s’impose, ainsi que la révélation de la diversité phénotypique,
symbiotique et taxonomique des rhizobia qui leurs sont associés in natura. L’étude de ces
Acacias et la diversité des rhizobia qui leurs sont associés encouragera l’exploitation des
espèces autochtones ou introduites qui ont prouvé leur robustesse, en symbiose avec des
souches performantes et tolérantes à diverses conditions pédo-édaphiques extrêmes dans
des projets de reforestation ciblés et spécifiques à chaque région, ce qui contribuera à
freiner le phénomène de désertification. De plus, la révélation de la population rhizobienne
spécifique à ces arbres participe à la valorisation de la biodiversité autant botanique que
microbienne de différentes régions d’Algérie. Sans compter que l’investigation du
potentiel fixateur contribuera à choisir l’essence forestière qui améliorera le plus la balance
azotée des sols à revégétaliser.
Cette thèse s’articule autour de deux volets, le premier est une analyse
bibliographique qui résume l’état de connaissance général des deux partenaires de la
symbiose végétale, à savoir les rhizobia d’un côté, avec la diversité qui leur est connue et
plus spécialement ceux associés aux Acacias, et d’un autre côté la plante hôte avec ses
spécificités et la description botanique des espèces étudiées ainsi que leurs intérêts. On
s’intéressera aussi dans cette recherche bibliographique à l’évaluation de la fixation
d’azote chez les ligneuses. Le chapitre qui suit est l’étude expérimentale proprement dite.
La première partie de ce travail s’intéresse à la diversité des rhizobia associés aux Acacias
par des méthodes phénotypiques (physiologiques et biochimiques) qui sont complétées par
des approches moléculaires (séquençage partiel du16S r-ARN). Le profil de résistance à la
salinité, aux hautes températures et différentes gammes de pH des souches isolées est
établi, tout en recherchant parmi ces dernières celles qui sont tolérantes et initiatrices de
symbioses efficientes. Ceci permettra l’élection de couples Rhizobium-Acacia
complémentaires ayant une grande tolérance face aux conditions extrêmes. La deuxième
partie de cette étude expérimentale s’intéresse au potentiel de fixation d’azote de trois
espèces d’Acacia largement répandues au nord ouest algérien en pépinière sur différents
sols par la méthode de dilution isotopique du 15N et sur champs par la méthode de
l’estimation de l’abondance naturelle δ15N, afin de définir l’espèce qui offre le potentiel le
plus élevé en terme de fixation d’azote. Cette thèse est clôturée par une conclusion
générale et des perspectives qui restent à réaliser dans un avenir proche.
Chapitre I :
Recherche
Bibliographique
Recherche bibliographique. I: « Les rhizobia »
I : « Les rhizobia »
I-1- Définition des rhizobia
Les rhizobia font partie des procaryotes appartenant aux α-Proteobacteria qui peuvent
convertir l’azote gazeux stable atmosphérique (N2) en une forme biologique utile
(Beijerinck, 1888). Cette conversion ne peut se faire que dans des organes spécialisés
racinaires ou caulinaires de légumineuses appelés nodosités. Ce qui résulte en une
interaction symbiotique exceptionnelle entre une bactérie du sol qui procure à la plante de
l’ammoniac assimilable et qui en contrepartie trouve un micro-habitat favorable et des
substrats carbonés issus de la photosynthèse (Dommergues et al., 1999). Cette association
symbiotique plantes-microorganismes est la plus importante sur le plan agronomique et
environnemental en terme de quantité d’azote fixé biologiquement (Bekki et al., 1987 ;
Zakhia et de Lajudie, 2001).
Les rhizobia constituent entre 0.1-8% de la flore bactérienne totale du sol (Sadowsky et
Graham, 1998). Ces bactéries vivent à l’état libre dans le sol et se présentent sous forme
de bâtonnets, Gram-négatif, aérobies et asporulées (Jordan, 1984 ; Bekki, 1986) et se
différencient en bactéroïdes à l’intérieur du nodule pour fixer l’azote (Figures 1 et 2).
5 µm
2 µm
©Copyright 1995, Frank dazzo
© E.H Newcomb, University of
Wisconsin.BPS
Figure 1 : Aspect du Rhizobium dans le sol
Figure 2 : Aspect des bactéroides dans le
nodule (microscope electronique à transmission)
(TEM : Transmission Electron Micrograph)
Cependant le terme rhizobia pourrait prêter à confusion avec le nom du genre
Rhizobium et en considérant la découverte d’une diversité grandissante des symbiotes
1
associés aux légumineuses, il est préférable de les désigner sous le nom de Bactéries
Nodulant les Légumineuses (BNL) (Zakhia et de Lajudie, 2006).
I-2- La symbiose légumineuse-rhizobium : définition et évolution
La symbiose est la forme la plus ancienne des interactions plantes-microorganismes,
cette dernière a pris plus de temps comparativement au processus pathogène car elle agit
sur les deux partenaires : la plante hôte et la bactérie. Cette évolution influe donc de façon
concomitante sur la plante qui fabrique de nouveaux tissus pour abriter les
microorganismes et acquière de nouvelles capacités métaboliques (fixation d’azote) et sur
la bactérie où des récepteurs spécifiques évoluent permettant une reconnaissance et un
attachement spécifique à la plante (Steinert et al., 2000). Elle inclut plusieurs genres
bactériens très éloignés, présente des caractéristiques phénotypiques diverses d’un couple
symbiotique à un autre et est soutenue par diverses stratégies génétiques (Boivin et al.,
2009). Il semble que l’acquisition du modèle de vie symbiotique soit apparu de façon
répétée et indépendante par le transfert horizontal de gènes de fonction clés (en particulier
les loci nod et nif) convertissant des bactéries du sol prédisposées en symbiontes avec des
stratégies de fixation d’azote (Martinez-Romero, 2009).
Ce point de vue est confirmé par quelques évidences: (i) des rhizobia et des non-rhizobia
coéxixtent dans l’arbre phylogénétique du 16S avec des génomes rhizobiens et nonrhizobiens très similaires (Amadou et al., 2008) ; (ii) les gènes essentiels nod et nif sont
localisés sur des plasmides symbiotiques ou des ilots qui sont transférables et présentent
des caractéristiques d’acquisition récente de matériel génétique (Sullivan et al., 2002 ;
Brom et al., 2004) ; (iii) le transfert des îlots ou plasmides symbiotiques confère une
capacité symbiotique de la bactérie receveuse sous conditions de laboratoire ou au champ
(Finan, 2002 ; Martinez et al., 1987); (iv) les gènes nodC sont monophylétiques (Chen et
al., 2003) et (v) le moment de l’apparition des légumineuses (il y a 60 millions d’années)
(Sprent et James, 2007) est celui où la nodulation a probablement déjà émergée et où les
différentes lignées rhizobiennes avaient déjà divergé (Turner et Young, 2000). Tout ceci
suggère que les ancêtres de rhizobia possédaient un potentiel d’infection latent et que les
fonctions locales ont été recrutées pour une expression totale de la symbiose (Boivin et al.,
2009). Cependant le mécanisme d’activation de ce potentiel d’infection demeure encore
inconnu. L’amélioration ultérieure de la symbiose chez les rhizobia émergeants, aussi bien
que l’adaptation à de nouveaux hôtes durant l’évolution s’est produite par des variations
2
allèliques, de paralogie, de recrutement et de néo-fonctionnalisation de nouveaux gènes
mais aussi par leur remplacement (Boivin et al., 2009). Sur le plan moléculaire, l’évolution
de la symbiose s’est accompagnée d’une amplification de séries de gènes particuliers et/ou
de réduction de génome. La réduction de la taille du génome ainsi que l’accumulation du
IS (Insertion Sequences) caractérisent souvent les bactéries qui ont passé récemment un
goulot d’évolution et se sont adapté à un environnement stable (Stinear et al., 2007). Les
ilots de symbiose constituent environ 10% du génome entier, ce qui est énorme
comparativement aux Pai (Ilots de symbiose correspondant aux Îlots de pathogénicité chez
les bactéries pathogènes) connus à ce jour (Steinert et al., 2000).
I-3- Formation des nodules
La symbiose chez les rhizobia se traduit par l’induction de la formation de nodosités
sur les racines ou les tiges des légumineuses. La nodulation commence quand les racines
initient un dialogue moléculaire avec des rhizobia compatibles du sol (Figure 3). La plupart
des
rhizobia
répliquent
en
secrétant
des
facteurs
de
nodulation
lipochitooligosaccharidiques qui leur permettent d’entrer dans la légumineuse. L’échange
moléculaire est continu, ce qui permet dans les interactions compatibles, aux rhizobia
d’envahir les cellules racinaires corticales, de se différentier en bactéroides et de là à fixer
l’azote (Deakin et Broughton, 2009).
Du point de vue physiologique et selon Dénarié et Cullimore, (1993) ; Dénarié et al.,
(1996) ; Parniske et Downie, (2003) ; plusieurs composés dérivés des plantes et des
bactéries jouent un rôle crucial dans l’établissement de l’association symbiotique (Figure
3). Les flavonoïdes libérés par les légumineuses et les lipochitooligosaccharides (LCOs) ou
facteurs de nodulation (facteurs Nod) secrétés par les rhizobia sont les deux principaux
signaux moléculaires impliqués dans l’établissement de la symbiose. Il existe cependant
d’autres composants tels que les exopolysaccharides (EPS), lipopolysaccharides (LPS)
attachés à la membrane bactérienne, les β-glucanes cycliques et les protéines externes de
nodulation (Nodulation Outer Proteins : NOPs) qui jouent un rôle intégral dans la
formation nodulaire. Cette pléthore de facteurs Nods, LPS, EPS et NOPs associée avec une
nodulation effective sur différentes plantes légumineuses indique qu’il y a une
combinaison spécifique de ces signaux chimiques qui permet l’union finale de la bactérie
avec la plante.
3
Figure 3 : Le dialogue moléculaire de la symbiose légumineuse-rhizobium d’après Rosenberg,
(1997).
Concrètement, la contribution de la plante au dialogue commence par une sécrétion
de flavonoïdes dans la rhizosphère (Redmond et al., 1986), ces métabolites secondaires
agissent conjointement avec le produit rhizobien exprimé constitutionnellement : le nodD
qui est un activateur transcriptionel de multiples gènes de nodulation avec les abréviations
suivantes : nod, nol, et noe. Du moment que le NodD se combine aux signaux flavonoïdes
à partir de légumineuses spécifiques et potentielles seulement, ils servent aussi à la
détermination du spectre d’hôte.
De point de vu génétique (Amadou et al., 2008), il existe 12 gènes symbiotiques
impliqués dans la nodulation (nodA, nodC and nodD) et dans la fixation d’azote (nifDKE,
nifN, nifB, fixA, fixC, fixX et fdxB). En plus du nodA, 03 gènes sont spécifiques aux
rhizobia : SMb21483, SMc03842 et SMa1329. Parmi d’autres gènes significativement
surexprimés chez les rhizobia sont rencontrés 3 gènes adenylate cyclase : cyaH, cyaG1 et
cyaG2 qui possèdent un domaine d’organisation similaire, l’expression du premier gène
cyaH est augmentée dans les nodules comparativement à l’état libre (Capela et al., 2006).
On reporte d’autres gènes d’intérêt tels que les nthA et nthB qui codent pour des enzymes
contribuant à la synthèse de phytohormones indole-3-acétique-acide (IAA) chez quelques
souches de Rhizobium et Agrobacterium (Kobayashi et al., 1995). De plus il y a le nrtA et
le SMa0585 qui sont des transporteurs de nitrates, ces derniers ont un effet inhibiteur sur la
nodulation et la fixation d’azote chez tous les rhizobia. Deux gènes sont très présents chez
les rhizobia, ils codent pour des glutathion S-transferase (GST) (Amadou et al., 2008). Il
4
faut savoir que la protection contre les dommages causés par l’oxydation est connue pour
être cruciale à différentes étapes des interactions symbiotiques, citons l’exemple de
Sinorhizobium meliloti qui possède une panoplie de 15 GSTs qui détoxifient les composés
générés durant l’interaction symbiotique (Capela et al., 2001).
Une des questions les plus fondamentales posée dans le domaine de l’évolution est
s’il existe un corps commun de génome pour les rhizobia ? La réponse est non ; ceci peut
être expliqué par le fait qu’il n’existe pas un gène qui soit en même temps commun et
spécifique à tous les rhizobia (Amadou et al., 2008). A ce jour tous les BNL, excepté les
Bradyrhizobium photosynthétiques possèdent deux gènes nod, NodA et nodH qui leur sont
spécifiques (Giraud et al., 2007). Les gènes nif ainsi que les gènes ccoNOP, ccoGIS et
fixABC sont communs à tout les rhizobia mais sont aussi présents chez certaines bactéries
non rhizobiennes ; de ce fait la symbiose des rhizobia avec les légumineuses n’a pas de
stratégie génétique commune (Amadou et al., 2008) . Ceci suggère que les stratégies
rhizobiennes ont émergé largement de façon indépendante pour chacun d’entre eux, même
si le transfert latéral a contribué à leur évolution, ce dernier étant prédominent chez des
microorganismes possédant la même taille de génome, avec une même composition en
G/C, utilisation du carbone et tolérance à l’oxygène (Jain et al., 2003).
I-4- Taxonomie des BNL
1-4-1- Outils de la taxonomie bactérienne
Les études taxonomiques traitent des relations naturelles existant entre les organismes
permettant leur classification. Selon Grimont (1998), la taxonomie comprend :
− La caractérisation des organismes ;
− La classification sur la base de la similitude ;
− La nomenclature pour donner un nom aux groupes ;
− L’identification d’organismes inconnus pour déterminer s’ils appartiennent ou non
à l’unité classée et ou nommée.
Le concept central de la taxonomie bactérienne est l’espèce. Le fait est que les
bactéries possèdent des caractéristiques morphologiques et physiologiques limitées
contrairement aux animaux et aux plantes, ce qui est insuffisant pour leur description
taxonomique. Il est maintenant reconnu que la classification bactérienne doit refléter aussi
étroitement que possible les relations phylogénétiques entre les bactéries par les
5
informations qui sont codées par les séquences du 16S ou du 23S rRNA (Woese, 1987). En
premier lieux, Colwell (1970) a établi les bases de la taxonomie bactérienne en
recommandant l’intégration de toutes les pièces d’informations obtenues à différents
niveaux de la cellule ; ADN, ARN, caractères exprimés et phénotypiques (protéines et
leurs fonctions, acides gras, marqueurs chimiotaxonomiques) évalués par diverses
techniques, contribuant à une taxonomie polyphasique qui probablement assurera une
classification plus stable. Par la suite, Wayne et al., (1987) ont proposé une définition
phylogénétique de l’espèce bactérienne basée sur diverses méthodologies incluant l’étude
du 16S ARN ribosomal et l’hybridation ADN/ADN, mais recommandent de prendre en
compte des caractéristiques phénotypiques pour nommer les nouvelles espèces. Cependant,
Vandamme et al., (1996) ont reformulé le concept phylogénétique de l’espèce bactérienne,
ils l’ont défini come étant un assemblage d’isolats qui ont pour origine une population
ancestrale commune dans laquelle une génération stable de diversité génétique résultent en
des clones avec différents degrés de recombinaison et caractérisés par : (i) un certain degré
de cohérence phénotypique, (ii) par un degré significatif d’hybridation ADN/ADN (70%)
et (iii) par plus de 97% de 16S rADN d’homologie de séquences.
Durant ces vingt dernières années, plusieurs techniques de caractérisation bactérienne
ont été développées à chaque niveau d’information, par ailleurs, il a été crée plus
d’équipements informatiques pour les analyses numériques des données. Chaque technique
utilisée en taxonomie a son propre pouvoir discriminant et son champ d’application (Figure
4). Le niveau de discrimination d’une technique peut varier selon le taxon bactérien étudié.
Dans une approche polyphasique, plusieurs techniques complémentaires avec différents
niveaux de discrimination sont choisies pour classer les souches. La conclusion devra être
établie à partir d’un consensus avec un minimum de contradictions (Zakhia et de Lajudie,
2001).
6
Figure 4 : Pouvoir discriminant des différentes techniques de la taxonomie polyphasique (d’après
Vandamme et al., 1996, modifié par Zakhia et de Lajudie, 2006).
On peut conclure qu’actuellement, les méthodes dominantes dans la taxonomie
moderne sont les méthodes génotypiques qui ciblent directement les molécules d’ADN et
d’ARNr. Les avantages qui ont encouragé leur utilisation sont la stabilité et la fiabilité des
systèmes de classification (Zakhia et de Lajudie, 2006). Parmi ces méthodes nous pouvons
citer :
7
Le séquençage de l’ADNr 16S :
Les ARN ribosomiques (5S, 16S et 23S) constituent un outil de choix pour étudier
les relations phylogénétiques grâce à leur présence chez toutes les bactéries, leur fonction
constante et la présence de zones très conservées ainsi que des parties à séquences
variables (Woese, 1987; Schleifer et Ludwig, 1989; Stackebrandt et Goebel, 1994). Ces
ARNr sont considérés comme des molécules qualifiées « d’horloges moléculaires
universelles », en particulier l’ARNr 16S, qui s’est vite imposé comme étant un bon
chronomètre moléculaire (Woese, 1987).
Les taxonomistes bactériens sont aujourd’hui unanimes pour considérer que le
séquençage de l’ADNr 16S reste le critère taxonomique le plus précieux de la
classification bactérienne, et qu’au niveau de l’espèce, il reste salutaire pour décider ou
non de l’opportunité de faire des hybridations ADN:ADN. Après l’analyse des séquences
disponibles dans les banques de données, il est actuellement bien établi que deux
microorganismes qui présentent moins de 97 % d’homologie de séquences d’ADNr 16S
n’associent pas leur ADN à plus de 60 % et dans ce cas, selon la définition de l’espèce
(Stackebrandt et Goebel, 1994), il n’est pas nécessaire de recourir à l’hybridation
ADN:ADN. Les deux microorganismes en question appartiennent donc à deux espèces
différentes. A ce jour la classification des BNL est basée majoritairement sur les séquences
de l’ADNr 16S (Willems, 2006).
Les méthodes de typage basées sur la PCR utilisées pour la classification des BNL:
Les méthodes de typage génétique utilisent généralement des techniques qui
permettent de classer les microorganismes étudiés en un nombre distinct de types
génotypiques. La PCR a permis le développement de nombreuses techniques de typage
génétique qui ont l’intérêt d’être universelles, simples et rapides. Elles ont beaucoup servi
pour la description de nouveaux taxons de BNL. Parmi elles :
- PCR-RFLP ou Polymorphisme de Fragments de Restriction :
La PCR combinant l’utilisation d’enzymes de restriction est une des méthodes de typage.
L’ADNr 16S ou 23S avec ou sans l’IGS (espace intergénique entre les gènes d’ADNr 16S
et 23S), ou bien d’autres gènes impliqués dans la symbiose ou la fixation d’azote, sont
amplifiés avec des amorces universelles définies en alignant les séquences disponibles. Le
produit de la PCR est ensuite digéré par des enzymes de restriction. Cette technique fournit
principalement des profils spécifiques (Gürtler et al., 1991; Jayaro et al., 1991;
8
Vaneechoutte et al., 1992; Ralph et al., 1993; Laguerre et al., 1994). Quand la région de
l’ADN amplifié correspond à l'opéron ribosomique, la technique est aussi appelée ARDRA
(Amplified Ribosomal Restriction Analysis). Dans l’étude des collections de BNL isolées
de nodules, la PCR-RFLP du gène codant pour l’ARNr 16S (ADNr 16S) est employée
pour grouper un grand nombre de souches. D’autres gènes peuvent être ciblés tels que les
gènes de nodulation nodC ou de fixation d’azote nifH (Laguerre et al., 2001). Cette
technique, très utilisée dans le passé, reste très performante, rapide, informative et
relativement accessible à de nombreux laboratoires (Zakhia et de Lajudie, 2006).
1-4-2 Position taxonomique actuelle des BNL
Les BNL présentent des groupes très diversifiés et leur classification subit
continuellement de grands remaniements grâce aux données phylogénétiques et
polyphasiques qui ont permis la description de nouveaux taxa (Young et Haukka, 1996).
C’est un domaine en pleine expansion car de plus en plus de rhizobia sont isolés chaque
jour, spécialement des régions tropicales et méditerranéennes qui restent à ce jour
faiblement documentés. Jusqu’aux années 80, toutes les bactéries symbiotiques fixatrices
d’azote isolées des légumineuses étaient classées en un seul genre Rhizobium incluant six
espèces : R. leguminosarum, R. meliloti, R. trifolii, R. phaseoli, R. lupini et R. japonicum.
Cette taxonomie se basait sur le concept d’inoculation croisée qui stipulait qu’une bactérie
d’une espèce donnée nodulait toutes les plantes d’un même groupe (Fred et al., 1932).
Mais ce concept n’a pas perduré car c’est un marqueur taxonomique peu fiable (Graham,
1964; Wilson, 1944). Par la suite, les espèces de Rhizobium ont été classées en deux
genres, le genre redéfini Rhizobium qui incluait les souches à croissance rapide et le
nouveau genre Bradyrhizobium qui incluait les souches à croissance lente (Jordan, 1982).
De nos jours, c’est la taxonomie polyphasique qui est de mise (Vandamme et al., 1996)
avec des données génétiques, phénotypiques, chimiotaxonomiques et phylogénétiques
combinées.
A ce jour (dernière actualisation en 2011 de Weir), la combinaison de toutes ces données a
permis de définir 93 espèces de BNL répartis en 13 genres (Tableau 1). Toutes ces espèces
sont incluses dans le phylum des Proteobacteria et la plupart font partie de la classe des αProteobacteria.
9
Tableau 1 : Classification des Bactéries Nodulant les Légumineuses (Weir, 2011).
Genre et espèce
Rhizobium
Rhizobium alamii
Rhizobium alkalisoli
Rhizobium cellulosilyticum
Rhizobium daejeonense
Rhizobium etli
Rhizobium galegae
Rhizobium gallicum
Rhizobium giardinii
Rhizobium hainanense
Rhizobium huautlense
Rhizobium indigoferae
Rhizobium leguminosarum
Rhizobium loessense
Rhizobium lusitanum
Rhizobium mesosinicum
Rhizobium miluonense
Rhizobium mongolense
Rhizobium multihospitium
Rhizobium oryzae
Rhizobium phaseoli
Rhizobium pisi
Rhizobium sullae
Rhizobium tibeticum
Rhizobium tropici
Rhizobium tubonense
Rhizobium undicola
Rhizobium vigna
Rhizobium yanglingense
Mesorhizobium
Mesorhizobium albiziae
Mesorhizobium alhagi
Mesorhizobium amorphae
Mesorhizobium australicum
Mesorhizobium camelthorni
Mesorhizobium caraganae
Mesorhizobium chacoense
Mesorhizobium ciceri
Mesorhizobium gobiense
Mesorhizobium huakuii
Mesorhizobium loti
Mesorhizobium mediterraneum
Mesorhizobium metallidurans
Mesorhizobium robiniae
Mesorhizobium opportunistum
Mesorhizobium plurifarium
Mesorhizobium septentrionale
Mesorhizobium tarimense
Meorhizobium temperatum
Mesorhizobium tianshanense
Références a
Frank, 1889
Berge et al., 2009
Lu et al., 2010
García-Fraile et al., 2007
Quan et al., 2005
Segovia et al., 1993
Lindström, 1989
Amarger et al., 1997
Amarger et al., 1997
Chen et al., 1997
Wang et al., 1998
Wei et al., 2002
(Frank., 1879); Frank., 1889
Ancien nom "Rhizobium huanglingense" Wei et al., 2003
Valverde et al., 2006
Lin et al., 2009
Gu et al., 2008
van Berkum et al., 1998
Han et al., 2008a
Peng et al., 2008
Ramírez -Bahena et al., 2008
Ramírez -Bahena et al., 2008
Ancien nom "Rhizobium hedysari" Squartin et al., 2002
Hou et al., 2009
Martinez-Romero et al., 1991
Zhang et al., 2011
"Allorhizobium undicola" de Lajudie, 1998a; Young et al.,2001
Ren et al., 2011
Tan et al., 2001
Jarvis et al., 1997
Wang et al., 2007
Chen et al., 2009
Wang et al., 1999
Nandasena et al., 2009
Chen et al., 2011
Wang et al., 2007
Velàzquez et al., 2001
"Rhizobium ciceri"(Nour et al., 1994); Jarvis et al., 1997
Han et al., 2008b
"Rhizobium huakuii" (Chen et al., 1991); Jarvis et al.,1997
"Rhizobium loti" (Jarvis, 1982); Jarvis et al., 1997
"Rhizobium mediterraneum"(Nour et al., 1995); Jarvis et al., 1997
Vidal et al., 2009
Zhou et al., 2010
Nandasena et al., 2009
de Lajudie et al., 1998b
Gao et al., 2004
Han et al., 2008b
Gao et al., 2004
"Rhizobium tianshanense" Chen et al., 1995; Jarvis et al., 1997
10
Tableau 1 (suite) : Classification des Bactéries Nodulant les Légumineuses (Weir, 2011).
Genre et espèce
Références a
Ensifer
Ensifer abri
Ensifer adhaerens
Ensifer americanum
Ensifer arboris
Ensifer fredii
Ensifer garamanticus
Ensifer indiaense
Ensifer kostiense
Ensifer kummerowiae
Ensifer medicae
Ensifer meliloti
Ensifer mexicanum
Sinorhizobium morelense
Ancien nom Sinorhizobium Willems et al., 2003; Young, 2003
Ogasawara et al., 2003
"Sinorhizobium morelense" (Wang et al., 2002); Young, 2003
Toledo et al., 2003
(Nick et al., 1999b) ; Young, 2003
"Rhizobium fredii" (Scholla et al., 1984); Young, 2003
Merabet et al., 2010
Ogasawara et al., 2003
(Nick et al., 1999b); Young, 2003
(Wei et al., 2002); Young, 2003
(Rome et al., 1996); Young, 2003
"Rhizobium meliloti" (Dangeard, 1926); Young, 2003
Lioret et al., 2007
Cette espèce se distingue de Ensifer adhaerens mais pas encore
nommé Ensifer. Voir Martens et al., 2007 pour détails,
"Sinorhizobium morelense" (Wang et al., 2002)
Merabet et al., 2010
Young, 2003
Li et al., 2010
(de Lajudie et al., 1994); Young, 2003
(Chen et al., 1988); Young, 2003
Jordan, 1982
Vinuesa et al., 2005
Kuykendall et al., 1992
Islam et al., 2008
"Rhizobium japonicum" (Kirchner, 1896); Jordan, 1982
Ramírez-Bahena et al., 2009
Xu et al., 1995
Ramírez-Bahena et al., 2009
Yao et al., 2002
Dreyfus et al., 1988
Dreyfus et al., 1988
"Azorhizobium johannae" Moreira et al., 2006
Ensifer numidicus
Ensifer saheli
Ensifer soja
Ensifer terangae
Ensifer xinjiangense
Bradyrhizobium
Bradyrhizobium canariense
Bradyrhizobium elkanii
Bradyrhizobium iriomotense
Bradyrhizobium japonicum
Bradyrhizobium jicamae
Bradyrhizobium liaoningense
Bradyrhizobium pachyrhizi
Bradyrhizobium yuanmingense
Azorhizobium
Azorhizobium caulinodans
Azorhizobium doebereinerae
Methylobacterium
Methylobacterium nodulans
Burkholderia
Burkholderia caribensis
Burkholderia cepacia
Burkholderia mimosarum
Burkholderia nodosa
Burkholderia phymatum
Burkholderia sabiae
Burkholderia tuberum
Cupriavidus
Cupriavidus taiwanensis
Devosia
Devosia neptuniae
Herbaspirillum
Herbaspirillum lusitanum
Jourand et al., 2004
Vandamme et al., 2002
Chen et al., 2006
Chen et al., 2007
Chen et al., 2008
Ancien nom "Wautersia" puis "Ralstonia"
(Chen et al., 2001); Vandamme et Coenye, 2004
Rivas et al., 2003
11
Tableau 1 (suite) : Classification des Bactéries Nodulant les Légumineuses (Weir, 2011).
Genre et espèce
Ochrobactrum
Ochrobactrum cytisi
Ochrobactrum lupini
Phyllobacterium
Phyllobacterium trifolii
Phyllobacterium ifriqiyense
Phyllobacterium leguminum
Shinella
Shinella kummerowiae
Références a
Zurdo-Piñeiro et al., 2007
Trujillo et al., 2005
Mantelin et al., 2006 *
Mantelin et al., 2006 *
Lin et al., 2008
* Bactéries isolées de nodules mais qui n’ont pas prouvé leur pouvoir de renoduler
a
Les parenthèses indiquent la publication originale, suivie de la référence de sa reclassification
1-4-3- Taxonomie de rhizobia associés aux Acacias
Les rhizobia associés aux Acacias sont présents à la surface du sol et en profondeur
jusqu’à 34 mètres (Dupuy et Dreyfus, 1992). Ils peuvent croitre sur tous types de sol sur
lesquels vivent les arbres, même dans des conditions extrêmes comme dans les sols arides
(Barnet et Catt 1991 ; Schulze et al., 1991; Dupuy et Dreyfus, 1992) ou sur le sable des
dunes (Barnet et al., 1985; Hatimi, 1999) .
Une large variété de rhizobia s’associe avec les Acacias pour initier la formation de
nodosités. Les Acacias Africains sont principalement compatibles avec Sinorhizobium,
Mesorhizobium et Rhizobium (Odee et al., 2002) et les Acacias australiens majoritairement
avec les Bradyrhizobium (Lafay et Burdon, 2001) (Tableau 2).
12
Tableau 2 : Classification des espèces de rhizobia nodulant les Acacias.
Genre et espèce
*Bradyrhizobium
Bradyrhizobium sp.
B. elkanii
B. japonicum
B. liaoningense
B. canariense
*Rhizobium
Rhizobium sp.
Plante hôte
Références
A. longifolia ; A. albida ;
A. nudica; A. cyclops ;
A. obliquinervia ; A. salicina,
A. stenophylla.
A. mangium ; A. albida ;
A. auriculiformis ; A. salicina ;
A. cincinnata; A. mearnsii,
A. longifolia.
Barnet et al., 1985; Dupuy et al., 1994 ;
Lafay et Burdon, 1998 ; Odee et al.,
2002 ; Mohamed et al., 2000 ; Hoque et
al., 2011.
Galiana et al., 1990; Le Roux et al.,
2009; Dupuy et al., 1994; Lafay et
Burdon, 2001; Odee et al., 2002; Joubert
et al., 2003 ; Rodríguez-Echeverría,
2010.
Dupuy et al., 1994, Mc lnroy et al.,
1999; Marsudi et al., 1999; Lafay et
Burdon, 1998.
A. albida; A. saligna ;
A. obliquinervia, A. decurrens,
A. cangaiensis, A. dealbata,
A. deanei, A. decurrens, A. fulva,
A. glaucocarpa, A. implexa,
A. irrorata, A. mearnsii,
A. melanoxylon, A. parramattensis,
A. parvipinnula.
A. mangium; A. saligna,
Clapp et al., 2001; Wolde-Meskel et al.,
A. albida; A. salicina.
2005; Hoque et al., 2011.
A. longifolia; A. saligna.
Rodríguez-Echeverría et al., 2007; 2011.
Bv phaseoli
A. auriculiformis ; A. senegal ;
A. tortilis; A. dealbata ;
A. salicina, A. stenophylla.
A. karroo; A. mearnsii,
A. melanoxylon;
A. auriculiformis; A. dealbata ;
A. tortilis.
A. tortilis.
A. tortilis.
A. senegal, A. salicina,
A. stenophylla; A. dealbata;
A. mearnsii.
A. saligna.
Bv tropici
A. saligna.
R. tropici
R. tropici IIA
R. tropici IIb
R. leguminosarum
Nuswantara et al., 1997; Nick et al.,
1999a; Joubert et al., 2003 ; WoldeMeskel et al., 2005; Hoque et al., 2011;.
Mc lnroy et al., 1999; Lafay et Burdon,
2001; Ngom et al., 2004; Noureddine et
al., 2010
Ben Romdhane et al., 2006.
Ben Romdhane et al., 2006.
Wolde-Meskel et al., 2005 ; Hoque et al.,
2011 ; Joubert et al., 2003.
Marsudi et al., 1999.
Marsudi et al., 1999 ; Lafay et Burdon,
2001.
de Lajudie et al., 1998a.
R. undicola
Acacia sp.
R. etli
A. albida; A. seyal.
R. giardinii
A. abyssinica.
R. gallicum
Amrani et al., 2009; Hoque et al., 2011.
R. mongolense
A. longifolia, A. melanoxylon,
A. saligna ; A. salicina,
A. stenophylla
A. salicina, A. stenophylla
R. rhizogenes
A. salicina
Hoque et al., 2011.
R. lusitanum
A. dealbata
Rodríguez-Echeverría, 2011.
Mc lnroy et al., 1999; Wolde-Meskel et
al., 2005.
Wolde-Meskel et al., 2005.
13
Hoque et al., 2011
Tableau 2 (suite) : Classification des espèces de rhizobia nodulant les Acacias.
Genre et espèce
Plante hôte
Références
A. polycantha,
A. xanthophloea; A. tortilis;
A. dealbata; A. salicina,
A. stenophylla.
Haukka et al., 1998; Odee et al., 2002;
Joubert, 2003; Hoque et al., 2011.
M. huakuii
A. arenaria; Acacia sp.
M. loti
A. senegal, A. tortilis subsp
heteracantha; A. catechu,
A. nilotica ; A. auriculiformis.
Haukka et al., 1998, Mc lnroy et al.,
1999 ; Jarvis et al., 1997.
Mc lnroy et al., 1999; Kumar et al.,
1999; Clapp et al., 2001.
M. plurifarium
A. seyal, A. senegal, A. tortilis,
A. laeta; A. senegal,
A. raddiana; A. salicina.
A. saligna, A. dealbata.
*Mesorhizobium
Mesorhizobium sp.
M. amorphae
*Ensifer
Ensifer sp.
E. kostiense
A. auriculiformis; A. cyanophylla,
A. gummifera, A. horrida;
A. raddiana; A. seyal,
A. senegal.
A. senegal; A. salicina,
A. stenophylla.
A. senegal.
E. saheli bv acaciae
Acacia sp.; A. seyal, A. tortilis.
E. terangae
A. laeta; A. seyal.
E. terangae bv
acaciae
A. horrida, A. mollisima;
A. raddiana; A. senegal;
A. tortilis.
Acacia sp.
E. arboris
E. americanus sp nov
E. fredii
E. medicae
E. meliloti
A. nilotica; A. seyal, A. tortilis;
A. tortilis.
A. mangium; A. longifolia,
A. melanoxylon; A. tortilis ssp.
raddiana; A. saligna;
A. tortilis.
de Lajudie et al., 1998b; Diouf et
al.,2007; Hoque et al., 2011.
Rodríguez-Echeverría et al., 2011.
Nuswantara et al., 1997;
Khbaya et al., 1998; Nick et al., 1999b;
Diouf et al.,2007.
Nick et al., 1999b; Hoque et al., 2011.
Nick et al., 1999b.
Boivin et Giraud, 1999; Wolde-Meskel et
al., 2005.
de Lajudie et al., 1994 ; Diouf et
al.,2007.
de Lajudie et al., 1994 ; Lortet et al.,
1996 ; Nick et al., 1999b ; Ba et al.,
2002.
Toledo et al., 2003.
Mc lnroy et al., 1999; Wolde-Meskel et
al., 2005; Hoque et al., 2011.
Clapp et al., 2001; Wolde-Meskel et al.,
2005; Ben Romdhane et al., 2006;
Amrani et al., 2009; Hoque et al., 2011.
E. meliloti bv. acaiea
E. morelense
A. salicina.
Ba et al., 2002.
Hoque et al., 2011.
E. adhaerens
Hoque et al., 2011.
14
Tableau 2 (suite) : Classification des espèces de rhizobia nodulant les Acacias.
Genre et espèce
Plante hôte
Références
A. karroo, A. tortilis, A. saligna;
A. seyal; Acacia abyssinica;
A. tortilis.
De Lajudie et al., 1999; Diouf et al.,
2007; Wolde-Meskel et al., 2005; Ben
Romdhane et al., 2006.
A. vitis
A. saligna.
Wolde-Meskel et al. 2005.
A. albertimagni
A. senegal, A. seyal.
*Burkholderia
A. stenophylla; A. pycnantha.
B. cepacia
A. seyal.
Hoque et al., 2011; RodríguezEcheverría, 2011.
Diouf et al.,2007.
* Allorhizobium
A. undicola
*Phyllobacterium
Acacia sp.
A. salicina.
de Lajudie et al., 1998a.
Hoque et al., 2011.
*Devosia
A. salicina.
Hoque et al., 2011.
*Agrobacterium
A. tumefasciens
*Tableau récapitulatif des souches renodulantes et dont la taxonomie est basée essentiellement sur le séquençage du 16S
rADN.
Etant donné l’importance de ces légumineuses ligneuses dans les programmes de
reforestation, plusieurs études sur la diversité des rhizobia associés aux Acacias ont été
menées par beaucoup d’équipes de recherche dans plusieurs pays.
En Afrique par exemple, des symbiotes isolés d’Acacia tortilis subsp. raddiana du
nord et du sud du Sahara appartiennent aux genres Mesorhizobium et Sinorhizobium (Ba et
al., 2002). Dans une autre étude, 82 souches isolées d’A. senegal et d’A. nilotica du
Sénégal et de la Mauritanie (Sarr et al., 2005) se sont révélées proches de Mesorhizobium
suite au séquençage de la région intergénique de l’ADNr 16S-23S. De plus Fall et al.,
(2008) ont rapporté qu’Acacia senegal (L.) Willd était nodulé par les genres
Mesorhizobium et Rhizobium, ces souches isolées du Sénégal ayant démontré leur capacité
à s’adapter à différents stress environnementaux telles que la température, la sécheresse et
la salinité.
En Tunisie, Ben Romdhane et al., (2006) ont démontré que les populations rhizobiennes
qui nodulaient spécifiquement et efficacement Acacia tortilis ssp. raddiana dans des sols
représentatifs en Tunisie sont dominées par les genospecies (espèce caractérisées
seulement au niveau du genre) proches de Ensifer.
15
Au Maroc, les souches associées à A. horrida, A. gummifera, A. radianna et
A. cyanophylla (A. saligna) sont subdivisées en trois groupes A, B et C ; A et B sont
proches de Sinorhizobium (S. meliloti et S. fredii) respectivement et le troisième groupe au
phylum Agrobacterium-Rhizobium galegae (Khbaya et al., 1998).
On note qu’A. albida espèce native de l’Afrique est préférentiellement nodulée par le genre
Bradyrhizobium (Galiana et al., 1990 ; Dupuy et Dreyfus,1992 ; Odee et al., 1997). Cette
dernière a été renommée Faidherbia albida dans la famille des Acaciae (Polhill et Raven,
1981) mais demeure largement nommée A. albida. Ceci indique que les légumineuses
ligneuses sont nodulées par des rhizobia à croissance lente même dans les régions
tropicales arides où prédominent les souches à croissance rapide ou intermédiaire
(Räsänen, 2000). Alors que la littérature rapporte que les Bradyrhizobium ont une
distribution essentiellement tropicale (Young et Haukka, 1996), beaucoup d’études faites
dans le bassin méditerranéen ont prouvé le contraire, comme en Espagne et aux Iles
Canaries où les légumineuses arbustives natives Spartium junceum et Chamaecytisus
proliferus respectivement étaient nodulées par des souches de Bradyrhizobium (Quatrini et
al., 2001 ; Vinuesa et al., 1998). Différents résultats sur la localisation des Bradyrhizobia
en méditerranée, en Afrique ainsi qu’en Amérique du nord (Parker, 1999) montrent une
aire de distribution plus large de cette lignée bactérienne s’étendant bien au-delà des zones
tropicales (Martinez-Romero et Caballero-Mellado, 1996). Ce qui demeure certain, c’est
qu’A. albida est nodulée in natura exclusivement par des Bradyrhizobia, ce qui ne
l’empêche pas de répondre à des inoculations avec certains genres rhizobiens, tels que
Sinorhizobium sp. du Mexique isolé de différentes légumineuses ligneuses, R. tropici
provenant d’Indonésie ou du Costa Rica (Bala et Giller, 2001) ainsi qu’Ochrobactrum
(Ngom et al., 2004). Quoique la phylogénie des rhizobia n’ait aucune relation avec celle
des légumineuses (Doyle, 1998), il a été rapporté que le mode de transport de l’azote fixé
chez A. albida (transport à amides) est le même que celui observé chez la plupart des
Acacia australiens (Van Kessel et al., 1988) qui sont eux nodulés majoritairement par des
Bradyrhizobia dans les zones tempérées d’Australie (Lafay et Burdon, 2001).
En Algérie, les seules études menées sur les rhizobia associés aux Acacias, ont été
menées sur A. saligna (Amrani et al., 2009) et A. tortilis (Noureddine et al., 2010). Pour la
première espèce, les souches bactériennes isolées de sols forestiers en pépinières ont révélé
que ces dernières étaient nodulées par des souches à croissance lente (échantillons prélevés
de régions humides et subhumides), proches de Bradyrhizobium betae, bactérie connue
16
pour provoquer des déformations tumorales sur les racines de la betterave sucrière et des
souches à croissance rapide proches de Sinorhizobium meliloti et Rhizobium gallicum
provenant de sols représentatifs des régions arides. En ce qui concerne A. tortilis subsp.
Raddiana, la caractérisation symbiotique de 51 souches de rhizobia qui lui étaient
associées a montré une prédominance du genre Ensifer et plus particulièrement de
Ensifer meliloti et dans une moindre mesure des espèces des genres Mesorhizobium et
Rhizobium. Ces souches ont montré leur capacité à renoduler d’autres espèces d’Acacia
propres aux régions désertiques, en particulier A. seyal Del. et A. ehrenbergiana Hayne.
Pendant longtemps, il a été établi que l’Australie hébergeait des souches
rhizobiennes à croissance lente de façon prépondérante (Barnet et Catt, 1991 ; Barnet
et al., 1985 ; Prin et al., 1993). Cependant des études ultérieures ont établi que des
génomospecies de Bradyrhizobium se trouvaient plutôt dans le Queensland (Liesack et
Stackebrandt. 1992 ; Lafay et Burdon, 2001), tandis que des génomospecies de Rhizobium,
Mesorhizobium, et Bradyrhizobium étaient plutôt représentés parmi les rhizobia associés
symbiotiquement avec des légumineuses indigènes dans l’ouest de l’Australie qui est une
région plus aride (Marsudi et al., 1999). Lafay et Burdon (1998) ont émis l’hypothèse que
la prédominance des Bradyrhizobia était due à leur résistance à l’acidité sévissant dans les
sols australiens. Par la suite, ces même chercheurs ont trouvé que pratiquement 96,6% des
souches nodulant les Acacias étaient des Bradyrhizobium à croissance lente et le reste était
affilié à R. tropici dans des régions possédant un climat qui variait de subtropical humide à
tempéré (Lafay et Burdon, 2001). Barnet et Catt (1991) ainsi que Nada et al. (1999) ont
conclu que les Acacias australiens étaient autant nodulés par les Bradyrhizobium à
croissance lente que par les rhizobia à croissance rapide. Ils ont ainsi émis l’hypothèse que
les Acacias provenant des régions chaudes étaient associés aux rhizobia à croissance rapide
alors que ceux des régions tempérées étaient nodulés par des souches à croissance lente.
Barnet et Cat (1991) ont supposé qu’en plus de l’effet du facteur d’aridité, la pauvreté du
sol influait aussi sur la prédominance des rhizobia à croissance rapide. Ces résultats sont
confortés par les travaux de Hoque et al., (2011) qui ont étudié la diversité des rhizobia
associés à deux espèces prédominantes en Australie : A. salicina et A. stenophylla. Cette
dernière étude a traité les sols de 58 sites différents de régions arides et semi-arides et 1285
souches ont été isolées. Le séquençage du 16S rARN des souches renodulantes a révélé
une prédominance des souches à croissance rapide, dont la majorité faisait partie du genre
17
Rhizobium, en plus des souches affiliées aux Bradyrhizobium, Mesorhizobium, Ensifer et
de Phyllobacterium, Devosia, Burkholderia et Achromobacter en plus faibles proportions.
Au Brésil, de nombreux chercheurs (de Faria et al., 1984; 1987 ; Moreira et al.,
1992; 1993) se sont intéressés aux microsymbiotes associés aux légumineuses de la forêt
tropicale et y ont révélé une grande diversité, les Acacias étudiés étaient nodulés plutôt par
les membres du groupe des bradyrhizobia. De nouveaux genres nodulent les espèces de
Mimosa tropicales comme Burkholderia représenté par différentes espèces telles que B.
mimosarum (Chen et al., 2006), B. nodosa (Chen et al., 2007) et B. sabiae (Chen et al.,
2008). Les Mimosoideae sont aussi largement nodulées par Burkholderia au Panama
(Craig et Parker, 2005), mais aussi par Cupriavidus, Burkholderia et Rhizobium sp. par
ordre de prévalence au Costa Rica (Craig et Parker, 2006).
Des souches indigènes de Sinorhizobium et Mesorhizobium ont été isolées à partir
d’Acacia sp. mexicains, ce qui a conduit par la suite à la caractérisation d’une nouvelle
souche de Sinorhizobium americanus qui a été isolée d’Acacia acatlensis (Toledo et al.,
2003).
Une équipe néozélando-japonaise, Ngom et al., (2004) a étudié la diversité des
bactéries nodulant A. mangium aux Philippines et en Thaïlande ; en plus de Rhizobium et
de Bradyrhizobium, ces chercheurs ont mis en évidence une souche qui nodulait et fixait
l’azote en association avec A. mangium et A. albida qui est proche de Ochrobacter. Les
néo-nodules formés ont toutes les caractéristiques d’un nodule classique.
En Chine, l'analyse taxonomique de 63 isolats correspondant à 21 espèces de légumineuses
d'une région tropicale, dont certaines espèces d'Acacia, montre également une grande
diversité avec 3 groupes de Bradyrhizobium et 3 groupes de souches à croissance rapide
(Gao et al., 1994) tandis qu’en Indonésie, les rhizobia associés avec A. mangium sont à
46% groupés avec B. elkanii, 50% avec B. liaoningensi et 4% avec S. meliloti (Clapp et al.,
2001).
Une autre étude comparative des rhizobia associés à A. mangium et A. auriculiformis dans
des pays répartis sur les quatre continents : la Malaisie, la Guyane française, la Côte
d’Ivoire et Hawaï, a révélé qu’ils appartenaient à un seul clade de B. elkanii (Le Roux et
al., 2009).
On peut conclure qu’une diversité importante d’espèces de Rhizobium existe dans les
différents sites occupés par différentes espèces d’Acacia et même au niveau de chaque
arbre chez une même espèce. Les diverses conditions existant entre microsites constituent
18
une source significative de variation parmi les souches collectées à partir de différents
lieux de prospection (Diouf et al., 2007). Grâce à leur large spectre d’hôte, les rhizobia
assurent leur survie dans les conditions adverses qui prévalent dans les régions arides et
semi-arides, en formant des nodules même inefficients sur les légumineuses ligneuses, ce
qui leur permet de survivre à l’intérieur d’une niche protectrice (Räsänen et al., 2001).
1-5- Spectre d’hôte des rhizobia associés aux Acacias
Selon l’analyse de Perret et al., (2000), la promiscuité (la non spécificité de
nodulation) est largement distribuée dans la nature. Elle n’est pas associée avec un groupe
taxonomique bactérien ou végétal particulier et n’est pas corrélée avec l’habitat de l’hôte.
Cependant, l’origine géographique paraît tout de même avoir un effet sur la diversité des
rhizobia qui nodulent les légumineuses ligneuses dans le sens où les microsymbiotes avec
des spectres d’hôte restreints sont limités à des niches spécifiques et représentent une
spécialisation des symbioses à large spectre largement distribuées et plus ancestrales. La
seule similitude entre les bactéries et les légumineuses à large spectre est leur
prédominance dans les milieux chauds ou tropicaux dans le monde.
La majorité des études réalisées sur la nodulation chez les Acacias montent leur
aptitude à établir des symbioses sur le terrain avec les souches à croissance lente et à
croissance rapide (Diouf et al., 2007; Dreyfus and Dommergues, 1981; Odee et al., 2002).
On peut ainsi les classer en trois groupes : (i) Acacia senegal, Acacia raddiana, et Acacia
cyanophylla sont nodulés par la branche Rhizobium-Sinorhizobium-Mesorhizobium (de
Lajudie et al., 1994 ; 1997 ; Khbaya et al., 1998 ; Nick et al., 1999b), (ii) Acacia albida,
Acacia mangium, et Acacia auriculiformis par Bradyrhizobium (Galiana et al., 1990 ;
Dupuy et Dreyfus, 1992) ; (iii) Acacia seyal par les deux types de rhizobia (Dreyfus et
Dommergues, 1981).
Par ailleurs, en plus de la variabilité de l’infectivité, l’efficience peut différer même parmi
un seul genre bactérien (Galiana et al., 1990; Murray et al., 2001; Thrall et al., 2000; Turk
et Keyser, 1992; Wolde-Meskel et Sinclair, 1998).
C’est pour cela qu’à court terme, la connaissance de la biodiversité des rhizobia et
celle des populations locales mènera à la mise au point de stratégies d'inoculation efficaces
(Lindström et al., 2010) d’autant que les gains provenant de la fixation d'azote ont surtout
été observés après inoculation avec des souches autochtones (Sutherland et al., 2000) et
19
que les meilleurs résultats concernant la restauration écologique des sites dégradés ont été
obtenus en utilisant un inoculum consitué de socuhes natives (Requena et al., 2001).
1-6- Effet des contraintes édaphiques sur la croissance des rhizobia
Il est bien connu que les facteurs environnementaux tels que la salinité, la sécheresse,
l'acidité, l'alcalinité, les engrais chimiques, les métaux lourds et les pesticides
compromettent la survie, la croissance et la capacité à fixer l'azote des rhizobia (Zahran et
al., 1994). l’Acacia est un genre cosmopolite représenté par diverses espèces adaptées aux
conditions environnementales extrêmes (Leary et al., 2006) et plusieurs études ont montré
que les rhizobia qui lui sont associés sont généralement plus résistants aux facteurs
environnementaux que ceux associés à d’autres légumineuses (Odee et al., 1997; Zhang et
al., 1991).
Pour répondre au choc hyperosmotique, situation présente dans la plupart des stress
environnementaux, la plupart des bactéries adoptent des mécanismes universels
d’osmoadaptation qui consistent en l’accumulation du potassium et/ou de petits solutés
organiques de faible poids moléculaire désignés sous le nom de « solutés compatibles »
(Bremer et Krämer, 2000). Ces derniers protègent les cellules et les macromolécules
biologiques non seulement du stress hyperosmotique mais aussi d’autres stress tels que la
chaleur, le froid et la dessication. Tous ces stress déclenchent une réduction importante de
la disponibilité de l’eau. L’accumulation de ces solutés élève donc leur concentration
intracellulaire pour contrebalancer la pression osmotique du milieu de croissance et
maintenir la turgescence cellulaire (Welsh, 2000).
En plus du tréhalose, d’autres solutés tels que le sucrose, l’ectoine et
l’hydroxyectoine sont connus pour leur rôle osmorégulateur (Leslie et al., 1995; Welsh,
2000 ; Manzanera et al., 2002). Les solutés compatibles ont une grande diversité
structurale, les plus abondantes étant les sucres non-réducteurs et leurs dérivatifs ainsi que
les aminoacides et leurs dérivés (Bremer et Krämer, 2000). L’accumulation de ces solutés
en réponse au stress se produit par une synthèse de novo et/ou par le transport actif à partir
de l’environnement immédiat. L’effet bénéfique de ces solutés n’est pas toujours lié à leur
accumulation, comme chez S. meliloti où l’ectoine (Talibart et al., 1994) et le sucrose
(Gouffi et Blanco, 2000) ne sont jamais accumulés mais plutôt catabolisés. Par conséquent
ils stimulent les capacités endogènes d’osmoprotection chez cette bactérie.
20
• Effet de la salinité sur la croissance des rhizobia
Les rhizobia d’Acacias différent dans leur capacité à tolérer le sel (Zhang et al., 1991;
Lal & Khanna 1994; Surange et al., 1997; Hashem et al., 1998). Le stress salin affecte
d’une manière délétère la croissance et la persistance des souches rhizobiennes dans le sol.
Ces dernières varient d’une espèce à l’autre et d’un type de sol à l’autre (El Sheikh et
Wood., 1989). En général, la plupart des rhizobia sont inhibés par des concentrations de
NaCl de l’ordre de 100 mM (Singleton et al., 1982). L’effet néfaste du sel est
essentiellement dû à l’augmentation de l’osmolarité du milieu environnant la bactérie.
Cette osmolarité entraîne un efflux d’eau entraînant une diminution du volume du
cytoplasme. Cette plasmolyse affecte le métabolisme de la cellule et le fonctionnement des
macromolécules et finalement conduit à l’arrêt de la croissance (Le Rudulier, 2005).
L’excès de sel peut également provoquer des modifications du contenu protéique (Soussi et
al., 2001) et de la synthèse des lipopolysaccharides (LPS), essentielles à l’initiation de la
nodulation chez des rhizobia (Lioret et al., 1995).
Plusieurs mécanismes peuvent être cités dans la réponse des rhizobia face au stress
salin, tels que la production de glutamate libre intracellulaire, comme c’est le cas chez R.
meliloti –renommée S. meliloti- (Le Rudulier et Bernard, 1986) ou plus encore la
modification dans l’expression des exoplysaccharides (EPS) et les lipopolysaccharides
(LPS) chez les symbiotes associés aux légumineuses herbacées (Zahran, 1992) ou
ligneuses (Zahran et al., 1994),
Parmi les souches isolées d’Acacia, les Bradyrhizobium ont été décrits comme
ayant un niveau de tolérance à la salinité généralement moins élevé que les autres genres
de rhizobia (Marsudi et al., 1999; Zou et al., 1995), mais cette règle a ses exceptions et
Thrall et al. (2008) ont aussi trouvé des Bradyrhizobium tolérants au sel.
Plusieurs souches rhizobiennes nodulant les légumineuses ligneuses comme
Acacia, Prosopis, et Leucaena, peuvent tolérer des concentrations de NaCl allant de 500 à
850 mM (Lal et Khanna, 1995. Zahran et al, 1994 ; Zhang et al, 1991).
Au Maroc, des tests in vitro ont montré que presque 50% des rhizobia obtenus par
piégeage des régions sahariennes du Sud-Est (sable sans végétation) et nodulant A.
raddiana et A. gummifera étaient capables de croître sur milieu YEM solide avec plus de 1
M de NaCl (Essendoubi et al., 2007). D’autres études menées au Maroc ont montré que les
souches associées à Acacia cyanophylla, A. gummifera, A. horrida et A. raddiana
tolèraient 510 mM de NaCl (Zerhari et al., 2000). D’autre part, des souches associées à A.
21
raddiana d’origines sénégalaises et tunisiennes se sont révélées tolérantes à 170 mM et
340 mM respectivement (Cacciari et al., 2003). En inde, des souches de Rhizobium isolées
d’A. farnesiana peuvent tolérer des concentrations de NaCl de plus 850 mM (Surange et
al., 1997).
Il existe une corrélation positive entre la tolérance au sel et l’adaptation au pH
alcalin comme cela a été démontré pour 600 souches de Sinorhizobium isolées de
Medicago sativa dans diverses régions d’Iran (Abolhasani et al., 2010). De plus, les
rhizobia tolérant le sel ont montré une plus haute efficience comparée à ceux qui y sont
sensibles chez l’espèce africaine A. nilotica sous conditions salines (Lal & Khanna, 1995).
Des résultats similaires ont été rapportés chez d’autres espèces par Zou et al., (1995);
Hashem et al., (1998); Shamseldin et Werner, (2005). Cependant, d’autres études n’ont
trouvé aucun effet bénéfique des rhizobia tolérant le sel sur les performances des plantes
sur sols salés (Lal & Khanna, 1994).
Les symbioses rhizobium-légumineuses et la formation des nodules sont plus
sensibles à la salinité que les rhizobia en culture pure (Zahran, 1991). Dans quelques cas, la
capacité à fixer l’azote peut chuter de 75% après augmentation de la salinité (Lal &
Khanna, 1994). Cependant d’autres souches peuvent maintenir leur capacité symbiotique à
plus de 200 mM de NaCl (Zou et al., 1995). De ce fait, la sélection des deux partenaires les
plus tolérants est une stratégie appropriée pour les programmes forestiers dans des zones
souffrant de conditions salines (Zhang et al., 1991).
• Effet de la température sur la croissance des rhizobia
Tous les microorganismes répondent à une soudaine augmentation de température
par l’induction de la synthèse d’un certain nombre de protéines protectrices contre le choc
thermique connues sous le nom de HSPs (Heat Shock Proteins) (Räsänen, 2000).
Pour la plupart des rhizobia, la température optimale de croissance se situe entre
28–31°C et beaucoup d’entre eux sont incapables de croitre à 38°C (Graham et al., 1992),
cependant quelques souches associées aux légumineuses ligneuses tels que Acacia et
Prosopis peuvent bien croitre à 40 et 44°C respectivement (Zahran et al., 1994).
Les rhizobia peuvent perdre leur infectivité sous une haute température, cela est dû à une
déformation de leurs plasmides ou une altération des polysaccharides cellulaires
nécessaires à l’infection (Zahran et al., 1994; Zahran, 1999). Par ailleurs, la température du
22
sol de l’ordre de 35-40°C est responsable de l’induction de nodules inefficients (Zahran,
1999).
Des études menés par Zhang et al., (1991) sur 60 isolats de nodules d'A. senegal et
de Prosopis juliflora du Soudan ont montré que ces derniers étaient caractérisés par une
température maximum de croissance élevée allant de 38 à 44°C ; toujours au Soudan, la
même constatation a été faite par Zahran et al., (1994) concernant des rhizobia isolés des
nodules racinaires d’A. senegal natifs de régions sèches qui ont une température maximum
de croissance de 44.2°C. D’autres souches isolées d’A. saligna et d’A. karroo isolées de
Lybie peuvent croitre à des températures de 44°C (Mohamed et al., 2000), tandis qu’au
Maroc, des souches associées à Acacia cyanophylla, A. gummifera, A. horrida et
A. raddiana tolèrent des températures qui variant entre 35 et 45°C (Zerhari et al., 2000).
Toutes ces études suggérent que les souches associées aux Acacia et isolées de régions
arides présentent une adaptation et des profils de tolérance aux températures élevées.
• Effet du pH sur la croissance des rhizobia
En se basant sur différents travaux (Lafay et Burdon 2001 ; Bala et al., 2003), il
semblerait que l’acidité ait un impact sur la population rhizobienne en diminuant leur
densité dans le sol et en favorisant en général la prolifération des rhizobia à croissance
rapide, surtout R. tropici (Martinez-Romero et al., 1991; Graham et al., 1994). Mais une
autre étude réalisée par Lesueur et al., (1996) atteste que les bradyrhizobia isolés d’A.
mangium et de F. albida étaient résistants à l’acidité et poussaient mieux sur pH acide que
sur pH alcalin. Ceci a été aussi rapporté par Marsudi et al., (1999) qui ont conclu que les
Bradyrhizobium étaient plus tolérants à l’acidité que les autres genres bactériens associés
aux Acacias. Il serait possible que la composition et la structure de la paroie externe
puissent aussi être des facteurs de tolérance au pH (Graham et al., 1994). Il existe une
réponse commune aux bactéries face au choc acide, ce sont les ASPs (Acid Shock
Proteins) qui contribuent à une protection face à l’acidité au niveau de la bactérie sans
altérer le pH interne de cette dernière (Foster, 1993). Il existe deux types d’ASPs : les
chaperones et les protéases ; les premières protègent les protéines du choc acide ou les
réparent si elles sont altérées tandis que les dernières détruisent les protéines endommagées
par l’acidité que les chaperones n’ont pas pu réparer (Foster, 1993 ; 2000). Au moins 20
gènes act (acide tolerance) ont été identifiés chez R. leguminosarum comme spécifiques de
la réponse au stress acide (Kurchak et al., 2001). Pour initier une réponse au choc acide, la
23
bactérie doit avoir des mécanismes de sensibilité (Glenn & Dilworth, 1994). De tels
systèmes de sensibilité environnementale et de réponse sont constitués de deux
composantes : un récepteur et un régulateur. Ce système a été trouvé chez S. meliloti; les
gènes actR et actS codent pour le régulateur et le récepteur respectivement (Tiwari et al.,
1996b). ActS est le produit de actS qui active ActR (produit de actR) à la détection d’une
extrême acidité via la phosphorylation. Ce dernier initie alors d’autres gènes de réponses à
l’acidité à l’intérieur de la bactérie (Tiwari et al., 1996b). D’autres recherches sur S.
meliloti ont aussi prouvé que le calcium pouvait jouer un rôle clé dans la tolérance à
l’acidité (Tiwari et al., 1996a), de même que le glutathion chez R. tropici (Riccillo et al.,
2000).
Toutes ces données laissent entrevoir de bonnes perspectives dans le domaine de
reforestation, de réhabilitation des sites dégradés ainsi que dans la lutte contre la
désertification. Les deux partenaires végétal et bactérien, avec Acacia, dont quelques
espèces sont connues pour leur bonne adaptabilité aux sols salins et acides (RodríguezEcheverría et Pérez-Fernández, 2005), et des souches rhizobiennes tolérantes et efficaces
pour les plantations en zones marginales (Thrall et al., 2005), peuvent s’associer et
s’établir dans des régions où prévalent des conditions adverses, en contribuant ainsi à
restaurer des sols pauvres en azote.
24
Recherche bibliographique. II: « Les Acacia »
II: « Les Acacias »
II-1- Généralités
Les légumineuses, regroupées dans la famille botanique des Fabaceae ou
Leguminosae, sont actuellement divisées en trois sous-familles : les Papilionoideae,
Mimosoideae et Caesalpinioideae (Lewis et al., 2001). Environ 97% des espèces recensées
chez les Papilionoideae et 90% chez les Mimosoideae sont capables de former des nodules
fixateurs d’azote tandis que 23% seulement des Caesalpinioideae possèdent cette aptitude
(Allen et Allen, 1981; de Faria et al., 1989).
Le nom botanique des Acacias dérive du grec « akis » qui signifie épine, ceci étant
plutôt une caractéristique des Acacias africains (Brockwell et al., 2005). La plupart des
Acacias sont des arbustes ou de petits arbres, rarement herbacés mais peuvent être des
arbres gigantesques (Menninger, 1962). Leur habitat peut varier de régions arides à basse
pluviométrie jusqu’à des forêts humides et des berges de rivières. Ils peuvent être
rencontrés dans toutes sortes de sols (Allen et Allen, 1981). Chez les Acacias d’origine
africaine et américaine, les feuilles sont petites et bipennées. Chez les Acacia Australiens
par contre, les feuilles sont réduites après le stade jeune de germination à un pétiole qui
s’élargit pour former des feuilles entières nommées phyllodes, et les arbres tendent à rester
toujours verts pendant la saison sèche (Roshetko, 2001). Exception faite pour les Acacia
australiens, cet arbre présente des épines qui peuvent limiter sa culture dans les fermes. Les
fleurs sont parfumées de couleur crème à jaune vif (Allen et Allen 1981 ; Hocking, 1993).
La longueur des gousses varie selon les espèces de 3 à 30 cm (Hocking, 1993 ; Roshetko,
2001).
II-2- Origine et évolution de la nodulation chez les légumineuses
La biogéographie est une science qui explique la distribution actuelle des organismes
vivants de point de vue de facteurs historiques et écologiques, surtout concernant les
légumineuses à large distribution (Doyle et Luckow, 2003). Les familles des légumineuses
fixatrices d’azote ne semblent pas partager un ancêtre commun, le phénomène de
nodulation est certainement apparu tout à fait indépendamment parmi et même à l’intérieur
de certaines familles. Certaines espèces d’Acacia du sous-genre Aculeiferum section
Monacanthea rencontrées en Amérique du sud, au Texas et à certains endroits en Afrique
25
ont perdu leur capacité à noduler (Sprent, 2001). L’analyse phylogénétique faite par Miller
et al., en 2003 montre que certaines de ces espèces non-nodulantes forment un clade très
distinct, suggérant qu’un seul événement a mené à la perte de la nodulation. Ceci illustre le
mode de séparation des espèces apparentées trouvées entre les continents qui se base sur
l’hypothèse d’une origine commune située au nord de la mer de Téthys, une étroite bande
de mer peu profonde qui séparait les deux principales masses terrestres, laquelle a
déterminé la distribution ultérieure des légumineuses (Schrire et al., 2005a, 2005b).
Sur le plan symbiotique, même si quelques espèces d’Acacia sp. sont capables de
noduler avec une large gamme de rhizobia, la littérature montre une différentiation entre le
sous-genre Phyllodineae qui nodule majoritairement avec les Bradyrhizobium et les sousgenres Acacia et Aculieferum qui nodulent préférentiellement avec les Mesorhizobium et
Sinorhizobium. Dans plusieurs études phylogénétiques, le sous-genre Phyllodineae montre
une relation étroite avec la tribu des Ingeae tandis que le sous-genre Acacia montre une
relation étroite avec la tribu des Mimoseae (Miller and Bayer, 2001; Miller et al., 2003;
Robinson et Harris, 2000). Parallèlement, plusieurs membres de la tribu des Ingeae (i.e.
Albizzia sp.) sont nodulés par des Bradyrhizobium tandis que d’autres membres de la tribu
des Mimoseae (i.e. Prosopis sp. et Leuceana sp.) sont nodulés par des Mesorhizobium et
Sinorhizobium (Doignon-Boucier et al., 1999; Haukka et Lindström, 1994; Lindström et
Zharan, 1993; Moreira et al., 1998; Zhang et al., 1991). Il apparaît donc y avoir
congruence entre la compatibilité symbiotique et les relations phylogénétiques parmi les
sous-genres.
II-3- Taxonomie des Acacia
Selon Ross (1973), Acacia a été nommé en premier lieu par Miller en 1858 en
décrivant un arbre épineux d’Egypte : A. nilotica qui est devenu l’espèce type du genre.
Acacia est le deuxième genre le plus important après Astragalus en nombre d’espèces dans
la famille des Leguminoseae. De plus, avec les outils moléculaires de plus en plus
développés, ce groupe ne cesse de s’élargir, les études génétiques et cladistiques récentes
prouvant également son statut polyphylétique (Chappill et Maslin, 1995 ; Clarke et al.,
2000 ; Robinson et Harris, 2000 ; Miller et Bayer, 2000, 2001 et 2003).
Il y a eu des remaniements constants dans la nomenclature des Acacias depuis Bentham en
1875, les plus importants étant ceux de Vassal (1972), Pedley (1978), Pedley (1986),
Maslin et al., (2003) qui sont résumés dans le Tableau 3.
26
Tableau 3: Les classifications les plus importantes dans le genre Acacia de Bentham (1875) à Maslin
et al., (2003)
Bentham (1875)
Vassal (1972)
Pedley (1978)
Pedley (1986)
Maslin
et al., (2003)
ACACIA
ACACIA
ACACIA
ACACIA
ACACIA
s Gummiferae
sg Acacia
sg Acacia
s Vulgares
sg Aculeiferum
sg Aculeiferum
SENEGALIA
SENEGALIA
sc Aculeiferum
sc Spiciflorae
sc Senegalia
sc Filicinae1
sc Filicinae
sc Filicinae
sc Monacanthea
s Filicinae
GENUS ‘X’
ACACIELLA
sg Phyllodineae
sg Phyllodineae
RACOSPERMA
RACOSPERMA
(syn. sg Heterophyllum)
s Botrycephalae
sc Botrycephalae
s Phyllodineae
ss Uninerves
sc Uninervea
sc Phyllodineae
sc Racosperma
ss Continuae
sc Alatae
ss Alatae
ss Pungentes
ss Calamiformes
sc Heterophyllum
ss Plurinerves
sc Plurinerves
sc Plurinervia
sc Juliflorae
ss Juliflorae
ss Brunioideae2
Ser Pulchellae
sc Pulchelloidea3
sc Lycopodiifoliae
sc Lycopodiifolia
sc Pulchellae
sc Pulchella
1
Définit dans Guinet & Vassal (1978)
Le type de la sous-série Brunioideae peut être référé à la sous-classe Phyllodineae, cependant la plupart des taxa que
Bentham inclus dans ce groupe peuvent être référé à la sc Lycopodiifoliae; aucune de ces espèces n’a été inclus dans la
classification de Vassal.
3
la sous classe Pulchelloidea inclus des sous-séries de Bentham : Pulchellae, Alatae, Continuae, Calamiformes, Plurinerves et
Uninerves
s= série ; ss= sous série ; sg= sous genre ; sc =sous classe
2
27
Au final, la proposition de Ochrad et Maslin (2003) de changer l’espèce type de
Acacia nilotica africaine pour une espèce australienne A. penninervis Sieber ex DC. a été
acceptée et par cette décision, le genre Acacia est attaché au groupe nommé subg.
Phyllodineae ou genre Racosperma dont la plupart des espèces sont australiennes, le genre
Acacia est renommé Vachellia Wight & Arn tandis qu’Acacia subg. Aculeiferum a été
renommée comme Senegalia (du Bocage et Queiroz, 2006).
A ce jour, Acacia est traité comme un seul genre mais cela pose quelques problèmes, tout
d’abord le précédent sous-genre Acacia qui incluait l’espèce type A. nilotica devra être
nommé Acacia subg. X, de plus le groupe « Acacia coultri» recevra bientôt le nom de
Meriousa. D’ici une position taxonomique unanime, Maslin (2006) propose un Tableau
récapitulatif clarifiant l’état des connaissances actuelles (Tableau 4).
D’un autre côté, le genre monophylétique Faidherbia (originaire d’Afrique et du moyen
orient) a été jusqu’à tout récemment classifié comme une espèce d’Acacia mais
aujourd’hui il est largement reconnu qu’il est distinct des autres Acacia sp. (Maslin et
Stirton, 1997), en conséquence, un grand nombre d’articles s’y réfèrent encore comme
étant A. albida.
Tableau 4: Nom génériques et infragénériques de Acacia sens. lat.
(Décision de la session de nomenclature du 17th International Botanical Congress (IBC) à Vienne pour adopter et ratifier les
recommandations du comité de Spermatophyta et le comité général de IAPT (International Association for Plant Taxonomy)
d’accepter la proposition de Orchard & Maslin (2003) pour retenir une autre espèce type pour Acacia )
Noms Pré-IBC
(Espèce type de Acacia : A. nilotica)
Noms post-IBC
(Espèce type de Acacia : A. penninervis)
Acacia sens. Lat traité
1
Acacia traité comme genre unique
comme genres multiples
1
VACHELLIA (161)
ACACIA
ACACIA
Subgenus Acacia
“subgenus x”
Subgenus Aculeiferum
Subgenus Aculeiferum
Section Spiciflorae
Section Spiciflorae
SENEGALIA (203)
Section Filicineae
Section Filicinae
ACACIELLA (15)
Groupe Acacia coulteri
“Acacia coulteri group”
“MARIOSOUSA”ms (13)
Subgenus Phyllodineae
Subgenus Acacia
ACACIA (960)
Nombre selon Maslin et al., 2003.
28
II-4- Répartition des Acacias dans le monde
Le genre Acacia est pantropical, avec un nombre estimé à 1350 espèces (Turnbull,
2004). Il a une large distribution dans les zones tropicales humides à arides (Norris, 1956)
et en Australie (Brenan, 1965). Une large majorité d’espèces sont natives d’Australie
(>940 espèces), mais le genre est aussi bien représenté aux Amériques (>180 espèces), en
Afrique (>140 espèces) qu’en Asie (>90 espèces) et reste rare en Europe (Maslin et Stirton
1997; Orchard et Maslin, 2003 ; Turnbull, 2004). Le Tableau 5 résume cette distribution
dans le monde :
Tableau 5: Classification d’Acacia sens. lat. dans le monde (Maslin et al., 2003)
Groupe
taxonomique
Sous-tribu Acacia
(Acacia; syn. Vachellia)
Sous-tribu Aculeiferum
sens.str. (Senegalia)
Section Filicinae
(Acaciella)
« Acacia coulteri »
(nouvelle tribu)
Sous-tribu Phyllodineae
(Racosperma)
Nombre total
d’espèces
Amérique Afrique
Asie
Australie
Nombre
&
total
Pacifique
d’espèces
60
73
361
9
163
97
69
432
23
203
15
/
/
/
15
13
/
/
/
13
/
24
10
9825
987
185
144
896
9937
1381
(1.)
(2.)
(3.)
(4.)
inclut 15 espèces trouvées aussi en Afrique.
inclut 7 espèces trouvées aussi en Afrique.
inclut 1 espèce trouvée aussi en Asie.
2 espèces de Madagascar, Réunion et L’île Maurice (Note : Du Puy& Villiers 2002, considèrent que seulement une
espèce de groupe trouvée dans cette région).
(5.) inclut 7 espèces trouvées aussi en Australie.
(6.) 975 espèces en Australie, et 7 espèces au Pacifique.
II-5- Intérêts et importance des Acacias
L’humanité a utilisé les Acacias pendant des milliers d’années, leur bois a été utilisé du
temps des pharaons pour la fabrication de leur sépulture (NAS, 1979). De nos jours ces
arbres gardent leur importance pour les habitants des régions arides et semi-arides.
Intérêt fourrager :
En Afrique, le feuillage et les gousses sont une source importante de fourrage autant
pour les animaux domestiques que pour les animaux sauvages du fait de la rareté des
29
pâturages (Ibrahim, 1988). Le brout est indispensable à tous les herbivores vivant en milieu
aride ou semi-aride, les graminées ne suffisant pas à satisfaire leurs besoins et à assurer
leur croissance (Wickens, 1996). La teneur moyenne en protéines digestibles est de 8 et
11,5% pour les feuilles et les gousses d’Acacias respectivement, de plus ils sont riches en
minéraux et les graines ont une teneur élevée en phosphore brut (Räsänen, 2000). En
Australie, le bétail se nourrit de phyllodes en saison sèche (Norton, 1994 ; Roshetko, 2001).
Cependant certaines feuilles et gousses d’Acacias sont toxiques pour le bétail car elles
contiennent des glycosides cyanogénétiques qui peuvent se transformer en alcaloïdes et des
acides hydrocyaniques toxiques (Allen et Allen, 1981). De même, le tannin contenu dans le
feuillage est une cause majeure de la diminution de son appétibilité et digestibilité (Makkar,
1993). Des études ont été menées sur la valeur fourragère des feuilles de certaines espèces
d’Acacia et ont prouvé leur teneur élevée en protéines brutes, c’est pour cela qu’elles
recommandent leur utilisation en complément diététique et non en apport exclusif (Degen,
1995 ; Abdulrazak, 2000). Cependant, ceci peut être vrai dans les élevages intensifs mais
dans le mode de transhumance et d’élevage extensif, l’animal lui-même trie ce qu’il peut
manger et les races caprines qui prévalent dans les régions arides digèrent mieux le tannin
que les ovins (Distel et Provensa, 1991). En plus du fourrage, cet arbre est une excellente
source de pollen et de nectar pour les abeilles. Le miel sauvage d'Acacias reste cependant
un aliment sous-exploité (Wickens, 1996).
Bois de chauffage :
En Afrique, les Acacias sont une source importante de bois de combustion (valeur
calorifique de 3000-5000 kcal/kg) et de charbon (Hocking, 1993). Acacia ehrenbergiana,
A. tortilis subsp. raddiana, et A. nilotica subsp. adstringens, nilotica et tomentosa ont un
fort pouvoir calorifique et une combustion sans fumée ni étincelles et de ce fait sont très
prisés (Guinko, 1991). Acacia seyal joue un rôle tout particulier dans l'approvisionnement
en charbon de bois des villes en expansion de la zone soudano-sahélienne, ce qui a
contribué à l'épuisement de vastes zones naguère recouvertes par des peuplements purs de
cette espèce (Wickens, 1996).
Le bois est généralement dur et dense et est utilisé pour la construction et la fabrication de
meubles et d’outils (Von Maydell, 1990 ; Hocking, 1993).
30
Intérêt industriel :
Le tanin toxique pour le bétail qui est trouvé en grande quantité dans les feuilles, les
gousses et l’écorce des Acacias est utilisé dans le tannage du cuir (Wickens, 1996). De plus,
la majorité des espèces exsudent de la gomme, produit caractéristique des plantes
supérieures, qui est composée de carbohydrates complexes très utilisés dans l’industrie
alimentaire et médicamenteuse (Anderson et al., 1971, 1984). L’espèce qui en produit le
plus est A. senegal, elle est la source de la gomme arabique, composé hautement
hydrosoluble à faible viscosité qui est un additif alimentaire des plus recommandés. Acacia
seyal produit aussi de la gomme mais cette dernière est utilisée pour un autre usage que la
production alimentaire et plutôt dans l’industrie textile et papetière (Allen et Allen, 1981 ;
Roshetko, 2001) ainsi que pour des spécifications pharmaceutiques. En cosmétique enfin,
elle sert d'agent adhésif dans la préparation de poudres et des masques faciaux et assure
l'onctuosité des lotions (Wickens, 1996). La gomme issue d’A. seyal ainsi que d’autres
gommes extraites d’A. xanthophloea, A. karroo et A. nilotica, qui contiennent des tanins,
ne sont plus autorisées dans l'alimentation et se vendent, par conséquent, moins cher, du
fait que le tanin est considéré comme cancérigène (Anderson, 1993).
Intérêt alimentaire :
Dans certaines régions, les graines séchées d’A. senegal (Hocking, 1993) ou les
gousses d’A. nilotica (Von Maydell, 1990) sont incluses dans le régime alimentaire des
habitants. On peut aussi citer à titre d’exemple que les natifs d’Australie se nourrissent des
graines de plus de 44 espèces d’Acacia (Thomson, 1992). Les gousses jeunes peuvent être
consommées crues ou cuites et les graines séchées peuvent se transformer en farine, base
de plusieurs plats (Rinaudo et Thomson, 1991). Une compilation de résultats publiée par
Orr et Hiddins (1987) indiquent que le taux protéique des graines d’Acacias est de 17-26%,
la matière grasse est de 3-16% et celui des carbohydrates est de 30-50%, ce qui constitue
une source nutritive non négligeable surtout dans les pays pauvres où les populations
souffrent de malnutrition.
Intérêt médicinal :
Les feuilles, l’écorce, la gomme, les racines, les gousses et les graines ont un usage
médicinal contre une large gamme de maladies, brûlures et blessures (Hocking, 1993). La
médecine traditionnelle fait grand cas des gommes qu'elle utilise depuis l'époque des
pharaons; elle s'en sert comme calmant et comme agent adoucissant. A usage interne, elles
entrent dans la préparation de médicaments destinés à calmer la toux, la diarrhée, la
31
dysenterie et les hémorragies; à usage externe, on en badigeonne les inflammations. Grâce
à ses propriétés astringentes, le tanin se révèle très utile pour soigner les hémorragies
bénignes (Brown, 1977). L’écorce d'A. tortilis subsp. raddiana, est utilisée en Somalie
contre l'asthme (Hagos et al., 1987). L'acide acétique, l'alcool et l'eau extraits des fruits d'A.
dudgeoni et d'A. nilotica subsp. adstringens et nilotica ont une activité molluscocide, de ce
fait la plantation de subsp. nilotica le long des cours d'eau pourrait aider à combattre la
schistosomiase (Ayoub, 1982, 1985; Kloos et McCullough, 1987).
Intérêt environnemental et fixation d’azote:
Les Acacia sont communément utilisés comme brise-vent, pour la stabilisation des
dunes et comme plantes ornementales. Les espèces épineuses sont aussi utilisées comme
haies défensives (Von Maydell, 1990 ; Hocking, 1993 ; Roshetko, 2001). La contribution
que peut apporter l’ombre des Acacia et des arbres en général est d’une grande importance
surtout dans les régions où prévaut une chaleur et un rayonnement importants, à titre
d’exemple, il a été rapporté par Grouzis et Akpo (2006) qu’environ 50 % de PAR
(Photosynthetically Active Radiation) du rayonnement est intercepté par l’arbre et réfléchi
vers l’atmosphère, ce qui diminue la température de 6°C à 1 m de profondeur dans les
biotopes sous couvert, comparativement à hors couvert (Grouzis et Akpo, 1993).
L’utilisation d’engrais azotés chimiques a des incidences économiques et
environnementales très néfastes alors que les potentialités des légumineuses qui sont sousexploitées dans l’agriculture aujourd’hui pourraient représenter une réelle alternative grâce
à la fixation biologique de l’azote qui fixe 70–100 millions de tonnes annuellement
(Brockwell et al., 1995). Etant donné que les espèces d’Acacia connues représentent
approximativement 6-7% des 20.000 espèces de légumineuses recensées et compte-tenu de
l’importante phytomasse qu’ils produisent, la litière en particulier, les Acacias devraient
avoir une contribution substantielle à la quantité d’azote fixé totale dans les agroécosystèmes terrestres. La littérature rapporte que les Acacias fixent moins que les autres
légumineuses, mais si on regarde de plus près, on se rend compte que ces résultats sont dus
aux particularités des écosystèmes étudiés plutôt qu’au potentiel fixateur de l’arbre, les
sites étudiés étant assez riches en azote, inhibant ainsi l’activité fixarice d’azote (Brockwell
et al., 2005). De même, dans les milieux très chauds, secs ou salés où les acacias abondent,
leur nodulation et leur fixation d'azote sont altérées (Danso et al., 1992). De plus, il existe
une variabilité génétique dans l’aptitude des Acacias à fixer l’azote, en plus de l’impact de
leur provenance (Gueye et N’Doye, 1998). On peut donc considérer que les arbres
32
augmentent la production des cultures et des herbages à travers les pratiques
agroforestières et sylvo-pastorales (Kessler et Breman, 1991) et ceci en améliorant les
disponibilités en eau et en augmentant la fertilité du sol (Grouzis et Akpo, 1997).
Cette contribution des espèces d'Acacia à la fertilité du sol est double; elle se fait d'abord
par le biais de la fixation de l'azote et ensuite par accumulation et décomposition de la
litière, en plus d’un rôle écologique complémentaire dans la fixation du sol grâce à son
système racinaire (Dommergues, 1994). L'apport de la litière tient au recyclage des
minéraux extraits du sol par le système racinaire (Radwanski et Wickens, 1967). L'apport
azoté est minime, le feuillage tombé au sol étant probablement soumis à deux cycles
successifs de décomposition rapide, le premier consiste en une déshydratation rapide de la
litière qui s'accompagne de la perte de tous les composés volatiles, de sorte qu'au terme de
la longue saison sèche, le second cycle de décomposition affectera la masse fibreuse et les
minéraux (Wickens, 1996). L'enrichissement du sol en azote à partir de la litière est un
processus complexe où intervient la qualité de cette dernière qui doit permettre
l'accumulation d'humus tout en assurant un taux de minéralisation de l'azote satisfaisant
pour la nutrition végétale (Palm et Sanchez, 1990 ; Cortes et al., 1996 ; Gower et Son,
1992). Les facteurs en jeu comprennent les facteurs climatiques, pédologiques et biotiques
(Bernhard-Reversat et al., 1998). La teneur en azote total du sol dépend fortement de sa
teneur en argile et, pour une même teneur de cet élément, on trouve de plus fortes teneurs
en azote sous Acacia que dans les autres végétations (Bernhard-Reversat et al., 1998). La
teneur en azote total du sol est également corrélée avec l'azote minéralisable, une
minéralisation plus forte sous Acacia pour une même teneur en azote de la matière
organique traduit un turn-over plus rapide (Rhoades, 1995).
Quant à l’utilisation des Acacias en agroforesterie, en association avec les cultures
céréalières, les résultats sont très variables. L’espèce d’Acacia la plus indiquée est Acacia
albida (Syn. Faidherbia albida) qui perd ses feuilles en saison humide donc en saison de
culture des céréales et de ce fait apporte par la décomposition de la litière les nutriments et
l’azote fixé par la légumineuse nécessaires au développement des cultures (Von Maydell,
1986). Le feuillage d’Acacia albida repousse en saison sèche, ce qui protège le sol de
l’évapotranspiration (Schoch, 1966), de plus le sol sous A. albida se caractérise par une
augmentation du carbone organique, de rétention hydrique ainsi que des échanges
cationiques (Jung, 1967 ; Charreau et Vidal, 1965). Cependant, les résultats sont
contradictoires : pour les uns il y a un gain en production pour le mil et le sorgho de 250%
33
et de 36% respectivement (Poschen, 1983 ; Charreau et Vidal, 1965) et pour d’autres il y a
une baisse de productivité comme pour l’association avec le maïs (Jam et Getahun, 1991).
Cependant, on note que les légumineuses ligneuses n’ont pas été inoculées et que la
population symbiotique native n’a pas été étudiée.
Des études plus précises et qui prennent en compte plusieurs facteurs interagissant tel que
le climat, la microflore du sol, les caractéristiques pédologiques et enfin le partenaire
végétal, sont nécessaires pour étudier l’impact réel des ligneux sur les pratiques
agroforestières, cela afin d’utiliser un modèle adéquat pour améliorer le rendement de
façon globale.
II-6- Les Acacias en Algérie
Selon Ozenda (1977), les vallées sèches à fond limoneux ou caillouteux hébergent
une formation à Acacias que l’on retrouve dans l’ensemble du désert. Au Sahara
septentrional, cette « steppe arborée » est caractérisée par Acacia tortilis associé à Panicum
qui remonte jusqu’à l’Atlas Saharien Oranais. Cette association est aussi décrite au
Zemmour (Sauvage, 1949), ainsi que dans la région de la Saoura (Guinet, 1953) et
s’observe dans tout le pourtour du Grand erg occidental (Guinochet et Quezel, 1954). Mais
c’est dans le Sahara central que cette formation atteint son plein développement. Au Sahara
septentrional, en plus d’A. tortilis, on retrouve A. nilotica et A. ehrenbergiana, cette
dernière a été longtemps confondue avec A. seyal, alors que cette espèce se trouve
seulement dans une station du Hoggar en Algérie (Sahki et Sahki, 2004) et au sud du
Sahara (Celles et Manière, 1980). Cependant, A. nilotica est rare au Sahara central alors
qu’A. ehrenbergiana s’étend du Sahara central jusqu’au Tadmait. De plus, il a été reporté
la présence d’A. albida dans le Sahara méridional qui remonte jusqu’au Hoggar, Tassili des
Ajier et au Tefedest ainsi que celle d’A. ehrenbergiana et enfin A laeta dans le Tibesti et
l’Aïr (Ozenda, 1983).
Depuis cette description d’Ozenda (1983), il y a eu plusieurs études sur la répartition des
Acacias en Algérie mais qui furent localisées à des endroits spécifiques, il manque à ce jour
une cartographie globale et récapitulative de la distribution de ces légumineuses ligneuses.
De nouvelles espèces introduites se sont adaptées telles que les espèces australiennes qui ont
été utilisées pour la fixation des dunes littorales et pour un usage d’ornementation tel qu’A.
saligna depuis 1870 (El Lakany, 1987) et A. karroo d’origine Sud-Africaine (Ross, 1973)
que l’on retrouve comme haies défensives dans tout le nord algérien.
34
II-6-1- Description et répartition géographique des Acacias étudiés
Les caractères morphologiques, l’origine et la répartition géographique des Acacias
étudiés sont résumés dans le Tableau 6 et illustrés dans les Figures 5, 6, 7, 8, 9, 10 et 11.
Tableau 6 : Caractéristiques morphologiques, distribution géographique et conditions édaphiques des
Acacias étudiés (Dommergues et al., 1999 ; Baumer, 1999 ; Sahki et al., 2004 ; Hazem, 2009).
A. karroo Hayne
A. saligna (Labill.)
H.Wend.
A. seyal Del.
Synonyme
Syn arabe
Syn Tamâhaq
Origine
Répartition
géographique
A. horrida
A. cyanophylla
Afrique du sud
Afrique du nord,
Libye et Arabie
Sud ouest d’Australie
Afrique du nord et du sud,
moyen Orient, Amérique,
Sud de l’Europe
Type
Hauteur (m)
Ecorce
Couleur
Arbre ou arbuste
8-15
Epineuse, fissurée
Rouge brun
Arbuste
2-5
Lisse
Rouge brun à gris foncé et
fissuré quand il est âgé
Epines
Longueur (cm)
Feuilles
Paires blanches
15
Bipennées
groupées en touffe
Vert sombre
8
Jaunes, très
parfumées,
groupées en
glomérules
sphériques,
pelucheux.
Phyllodes
A. fistula, A. stenocarpa
Tahl
Ouref
Sahélienne
Sénégal jusqu’au Soudan ;
de la Somalie au
Mozambique et en
Namibie
Buisson, arbuste ou arbre
12
Epineuse
Variable: Crème, jaune
verdâtre, brun rouge ou
noire.
Axillaires en paires
3-5
Bipennées
Vert foncé
8-25
Jaunes vifs, groupées en
glomérules sphériques
3-8
Jaunes d’or, groupées en
glomérules
Caractéristiques
Couleur
Longueur (cm)
Fleurs
Diamètre (cm)
Gousses
Longueur (cm)
Précipitation
annuelle (mm)
Sol
5-13
Supérieur à 250
7-8
Brun foncé à noires,
étroites, légèrement
arquées.
3-14
300-1000
Sablonneux
Sablonneux, salin, alcalin.
Noires, étroites,
aplaties.
35
1.5-2
Brun rougeâtre à maturité.
7-20
Supérieur à 350
Hydromorphe, pierreux,
argileux
Tableau 6 (suite) : Caractéristiques morphologiques, distribution géographique et conditions
édaphiques des Acacias étudiés (Dommergues et al., 1999 ; Baumer, 1999 ; Sahki et al., 2004 ; Hazem,
2009).
Acacia tortilis (Forsk.)
Hayne subsp raddiana
(Savi)
A. raddiana, A.
fasciculata
Syn arabe
Talha
Syn Tamâhaq Absegh
Origine
Afrique tropicale et
Arabie
Répartition
Sénégal jusqu’à
géographique l’Arabie
Caractéristiques
Synonyme
A. albida Del.
A. ehrenbergiana A. nilotica*L.
Hayne
Faidherbia albida
A. flava
A. arabica
Azara, Haraz
Ahtes
Afrique tropicale
Selem
Tamat
Nord sahélienne
Du Sénégal jusqu’à
l’Ethiopie et
Afrique Australe,
Moyen Orient et
Arabie
Arbre
12-35
Lisse puis
écailleuse à
maturité
Du Tibesti
jusqu’à l’Arabie
et du sud
marocain jusqu’à
la Mauritanie
Arbuste
4
Lisse se
détachant en
lambeaux comme
du papyrus
Brun vert avec un
aspect vernissé
Bipennées,
alternes
Amora, Tsent
Taggart
Régions arrosées par le
Nil
Du Sénégal au Soudan, la
péninsule arabique, l’Inde
et le Sahara central
Type
Hauteur (m)
Ecorce
Arbuste ou arbre
7-13
Epineuse
Couleur
Feuilles
Brun foncé, rameaux
âgés blanc ivoire
Bipennées
Bipennées, alternes
Couleur
Vert sombre
Vert bleuté
Grise à blanchâtre
Longueur (cm) 2.5-4
Epines
Axillaires en paires,
longues, blanches et
petites brunâtres et
courbées
0.5-1.2
Paires, fortes à la
base des feuilles
Longueur (cm) 2-10
Fleurs
Blanches à jaune
pâle, odorantes
0.2-3.2
Blanches puis
jaunes, axillaires
Diamètre
Gousses
1-2
Contorsionnées ou
spiralées
Longueur (cm) 8-12
Précipitation
100-1000
annuelle (mm)
Sol
Alcalin, dune de
sable
Arbre
10-20
Fissurée avec une gomme
rouge
Brun foncé presque noire
Bipennées
Vert gris
Paires, axillaires
longues et
petites
4-8cm
Acérées, blanches à la
base des feuilles
5
Jaune
0.7
Jaune vif, odorantes
1.2-1.5
Linéaires, parfois
légèrement incurvées
10-15
300-800
10-15
Etroites
légèrement
spiralées, rouges
vif à l’état jeune
7-10
-
Sablonneux
Graveleux
Sablonneux,
Salin, alcalin et argileux
Enroulées en
spirale, orange vif à
brun rouge
36
7-15
250-1500
b
a
Figure 5 : Aspect d’A. tortilis : -a- Aspect général de l‘arbre (route de Taghit, Béchar), BZF, 2004 ; b- Branches et gousses (Oued Tassena, Tamanrasset), INRF, 2003
b
a
Figure 6 : Aspect d’A. nilotica : -a- Aspect général de l‘arbre (Oued Idekel, Tamanrasset), BZF, 2004 ;
-b- Fleurs et gousses, INRF, 2003
37
b
a
Figure 7: Aspect d’A. seyal : -a- Aspect général de l‘arbre; -b- Branches et gousses, (Oued Taghemout,
Tamanrasset), BZF, 2004
a
b
Figure 8 : Aspect d’A. albida : -a- Aspect général de l‘arbre; -b- Branches et gousses, (Oued Tassena,
Tamanrasset), BZF, 2004
38
a
b
Figure 9 : Aspect d’A. ehrenbergiana : -a- Aspect général de l‘arbre (Oued In-Tounin Tassekra,
Tamanrasset), BZF, 2004; -b- Branches et épines (Tindouf, BZF, 2006)
Figure 10 : Aspect d’A. saligna : -a- Aspect d’un jeune arbre (Les dunes d’El-Mactaa, Oran, BZF,
2002)
39
II-6-2- Utilisation et caractéristiques des Acacias étudiés :
a- Acacia tortilis (Forsk.) Hayne subsp raddiana (Savi)
Cet arbre est considéré comme l’emblème des régions désertiques grâce à son port
en parasol caractéristique, il supporte l’aridité, la salinité ainsi que les sols rocailleux ; c’est
une espèce caractérisée par une faible consommation en eau et une optimisation relative du
rapport assimilation de CO2 / transpiration, cet arbre améliore la strate herbacée (Hazem,
2009) et peut être utilisé dans la fixation des dunes (Kavia et Harsh, 1993). Il est apprécié
comme bois de feu ou charbon de bois, de plus c’est une espèce très appétée par les
ruminants et entre même dans l’alimentation humaine (Sahki et al., 2004 ; Hazem, 2009) .
b- A. seyal Del.
A. seyal est considérée comme une espèce pionnière des terres inondées
(Dommergues et al., 1999), de plus il peut servir à des fins domestiques : comme source de
charbon de bois de qualité et comme bois de charpente car il est résistant aux chocs. C’est
un important arbre fourrager : feuilles, pousses fraîches et fruits. Sa gomme est de qualité
inférieure à celle d’A. nilotica. Il est aussi utilisé à des fins médicinales (Sahki et al., 2004 ;
Dommergues et al., 1999).
c- A. ehrenbergiana Hayne
Cette espèce est particulièrement xérophile, elle peut avoir un usage domestique
comme bois de chauffage et d’œuvre. Les fibres de l’écorce des jeunes rameaux servant à
la fabrication de cordes et l’écorce est productrice de tannin. Les feuilles et les fruits sont
consommés en période de disette (Sahki et al., 2004, Von Maydell, 1983).
d- A. nilotica L.
Cet arbre est utilisé pour réhabiliter les sols très salés ou alcalins à condition que la
teneur en sels solubles soit inférieure à 3% (Dommergues et al., 1999). Cette ligneuse ne
peut être utilisée en agroforesterie car elle entre en compétition avec les cultures et diminue
de 40 à 60% de la production en blé (Puri, 1992 ; Sharma, 1992). Cependant cet Acacia a
d’autres usages : il est utilisé comme bois dur et lourd, plus dense que le teck et c’est un
excellent combustible. L’écorce et les gousses contiennent du tannin, la meilleure qualité
est extraite des gousses vertes et la gomme n’a pas d’usage alimentaire, elle est utilisée
40
pour la fabrication de teintures (noire, jaune ou rouge). Les feuilles et les rameaux sont
appréciés par les chèvres, les dromadaires et les moutons. Les graines et gousses entrent
dans l’alimentation humaine. La gomme, la décoction d’écorce et de gousses (sans les
graines), les racines et les feuilles ont un usage médicinal (Sahki et al., 2004 ;
Dommergues et al., 1999 ; Von Maydell, 1983).
e- A. albida Del.
C’est un arbre assez exigeant en eau (Sahki et Sahki, 2004). Grâce à son système
phénologique inversé, il peut être associé aux cultures mais les résultats sont
contradictoires (Voir intérêt des Acacias). Il a différentes utilisations: c’est un excellent
combustible et son bois est utilisé en artisanat et charpente. Les feuilles et fruits sont
broutés par les chèvres et les dromadaires. La valeur nutritive des gousses est élevée. Les
fruits sont consommés par l’homme. L’écorce et les gousses ont un usage vétérinaire et
médicinal (Sahki et al., 2004 ; Dommergues et al., 1999) .
f- A. karroo Hayne
C’est un indicateur de présence d’eau dans le sol aussi bien en surface qu’en
profondeur (Palmer et Pitman, 1972). Il est surtout utilisé pour clôturer des parcs à bestiaux
en Afrique du sud, sinon il sert comme haies défensives autour des vergers. Il peut être
aussi utilisé comme un bon combustible, le charbon de bois est apprécié. Ce dernier peut
être utilisé pour la fabrication de meubles et d’outils agricoles et l’écorce est utilisée pour
le tannin. Les feuilles, gousses et fleurs sont consommés par les chèvres et les moutons. Sa
gomme est parfois utilisée comme confiserie et le miel dont il est issu est d’excellente
qualité (le Houérou et Pontanier, 1987).
g- A. saligna (Labill.) H.Wend.
A. saligna supporte des gelées très légères mais souffrent de températures
inférieures à -4C° (Crompton, 1992), de même qu’il résiste mal à la sécheresse. Cette
espèce peut être introduite en régions semi-arides, c’est un excellent stabilisateur de dunes
et brise-vent (Le Houérou et Pontanier, 1987). Cependant, cet arbre a un caractère
envahissant qu’il faut prendre en considération car il risque d’éliminer la végétation native
(Avis, 1989). Il donne un bois de feu assez médiocre mais sa gomme pourrait avoir un
41
intérêt industriel. Ses feuilles sont un excellent complément alimentaire fourrager (Degen,
1995).
II-7- Résistance des Acacias aux contraintes édaphiques
Les conditions adverses prévalant dans les régions arides obligent les espèces
végétales à des adaptations nécessaires à leur survie. Ces adaptations aux conditions de
milieu et leurs mécanismes ont été décrits dans tous les groupements végétaux (Frontier et
al., 2004).
Ces adaptations se traduisent par des régulations physiologiques et morphologiques qui
permettent aux plantes de palier à une alimentation en eau déficitaire s’opérant à
différentes échelles. Il faut dire que la majorité des stress se traduisent par un déficit
hydrique. Dès que ce dernier apparaît, la plante ajuste, rapidement et de façon réversible,
les flux d’eau qui la traversent par la fermeture de ses stomates. Des déficits hydriques plus
longs induisent des changements moins réversibles, notamment de morphologie tels que la
réduction des surfaces d’évaporation (Frontier et al., 2004). Dans les situations de
sécheresse très longue et sévère, cette réduction peut devenir complète (Scheromm, 2000).
Il se produit dans ces cas-là, des changements progressifs dans la structure de la plante qui
visent à réduire sa surface transpirante (surface foliaire, épaississement des cuticules),
parfois même les feuilles sont transformées en épines (Ozenda, 1977), mais tous ces
changements résultent également en une baisse de la production végétale (Scheromm,
2000).
Les espèces adaptées à la sécheresse sont qualifiées de végétaux xérophiles ou
xérophytes, elles se caractérisent par diverses adaptations. Face au stress hydrique, la
plante peut réduire son cycle végétatif (Dajoz, 2003) ou augmenter le rapport des parties
souterraines/parties aériennes (Frontier et al., 2004). Parmi les facteurs dépressifs affectant
la croissance des végétaux en général et les Acacias dans ce cas, la salinité et la
dessiccation (sécheresse et température) sont les plus importants:
• Effet de la salinité sur la croissance des Acacias :
La salinité affecte la croissance des plantes suite à l’effet de rétention d’eau du sol
provoqué par des concentrations élevées de sel. La plante privée d’eau réagit et se défend
en fermant les stomates présents au niveau des feuilles empêchant ainsi l’évaporation de
42
l’eau mais en conséquence entrave également la diffusion du CO2 nécessaire à la
photosynthèse affectant ainsi la croissance de la plante (Rhodes et Nadolska-Orczyk, 2001;
Reddy et al., 2004). Les sels présents en grande quantité dans le sol peuvent également
provoquer une intoxication de la plante par absorption déséquilibrée des cations, tel que le
Cl-, Na+ qui interfèrent dans l’assimilation d’autres ions par la plante et provoquent un
déficit nutritionnel critique, créant des sols stériles avec des quantités d’azote loin d’être
optimum, ce qui conduit à la nécessité d’enrichissement en fertilisants (Kijne et al., 1998).
La baisse de production de la biomasse est une réponse classique à la contrainte saline.
Néanmoins, la tolérance des plantes vis-à-vis de la salinité varie largement en fonction de
l’espèce, de la variété, du stade végétatif et des facteurs liés au milieu (température,
humidité, intensité de la lumière et fertilité du sol) (Cordovilla et al., 1995).
L’osmorégulation ainsi que la compartimentation des ions inorganiques sont parmi les
mécanismes d’adaptation de la plante au stress salin (Xlang Ming et al., 2000). Les
mécanismes développés par les plantes résistantes au sel sont basés sur l’exclusion des ions
de Cl- et de Na+ du cytoplasme : par l’inhibition de leur absorption et la stimulation de leur
excrétion par la cellule. Les plantes résistantes au sel peuvent être groupées en plantes
exclusives ou inclusives. Dans le premier groupe des exclusives, plusieurs mécanismes
d’adaptation tel que la sélectivité dans l’absorption de certains ions par les racines fait que
le sel atteint les parties aériennes seulement en petites quantités ; alors que celui des
inclusives absorbent le sel en grande quantité et le stocke dans leurs organes d’excrétion
(Cramer, 1984). En plus de ces mécanismes, la plante synthétise des solutés organiques
(Proline, Glycine, Sucres solubles, etc.…).
La famille des légumineuses a une large gamme de tolérance au sel, une de ses réponses au
stress est sa capacité d’exclure le Na+ de la tige et de l’absorber à partir du xylème
(Soliman et Pitman, 1983).
Les Acacias sont généralement tolérants à la salinité (Zhang et al., 1991) mais
Craig (1996) a démontré que la provenance des Acacia déterminait leur résistance au stress
salin, parmi dix espèces étudiées, celles issues de régions salées avaient un potentiel plus
élevé de supporter un apport externe en sel.
Selon Hussain (2008), l’espèce A. nilotica semble très résistante à un taux élevé de sel
allant jusqu’à 12.80 dS m-1 de sel dans l’eau et elle est recommandée pour être introduite
dans des sols arides. Par ailleurs, Acacia tortilis subsp. raddiana présente le pouvoir
germinatif le plus élevé sur milieu riche en sels (55 % de germination à une concentration
43
de NaCl de 4.3 M) comparativement à A. saligna et de ce fait, il se présente comme un
meilleur candidat face au stress salin (Jaouadi, 2008). Dans une étude menée au Pakistan
(Ansari et al., 2007), on a utilisé l’espèce africaine A. nilotica et des Acacia australiens sur
une durée de plus de trois ans dans des régions salées à modérément salées, les résultats
obtenus démontrent qu’A. nilotica croît sur des sols modérément salés (4-8 dSm-1) ainsi
qu’A. saligna, alors qu’Acacia ampliceps qui est une espèce australienne supporte plus que
16 dSm-1 (Tableau 7). Mais l’auteur recommande la plus grande précaution dans le choix
de la provenance des graines, elles doivent être issues de sites proches des conditions des
terres à restaurer ; en plus d’introduire l’essence forestière la plus profitable pour les
populations autochtones. Donc une approche réfléchie qui passe obligatoirement par des
expérimentations au laboratoire devra précéder une introduction d’espèce ligneuse
exotique pour la réhabilitation des zones souffrant de salinité.
Tableau 7 : Comparaison entre la tolérance de quelques espèces d’Acacia à la salinité (Ansari et al.,
2007).
-1
Salinité (Conductivité électrique d’extrait de sol saturé en dSm )
4-8
Acacia auriculiformis
8-16
Acacia salicina
>16
Acacia ampliceps
Acacia nilotica
Acacia machonochieana
Acacia saligna
Acacia stenophylla
Acacia tortilis
Remarques:
1. La provenance des espèces est d’une importance capitale dans la réponse des plantes à la salinité
-1
-1
2. 1 dSm = 1 mScm = 10 mM ou 0.06 % NaCl approximativement.
Il semblerait que l’inoculation d’Acacias et de légumineuses en général avec des souches
tolérantes à la salinité induit la formation de nodules effectifs sous conditions légèrement
salines (Craig et al., 1991 ; Zou et al., 1995 ; Lal et Khanna, 1995). Mais en fait, la
meilleure fixation symbiotique de l’azote ne pourra être obtenue que si on recherche deux
partenaires symbiotiques qui soient résistants à ce stress à toutes les étapes de leur
interaction (formation et activité nodulaire) (Georgiev et Atkias, 1993 ; Beecher, 1993 ;
Zahran et al., 1994).
44
• Effet de la température et de la sécheresse sur la croissance des Acacias
Peu de plantes supportent des températures excédant les 45°C, les températures
élevées inhibant la photosynthèse et la respiration (Räsänen, 2000). Parmi elles,
A.raddiana (A.tortilis) et A. nilotica supportent une température allant jusqu'à 50C° et A.
seyal jusqu’à 55°C (Räsänen, 2000).
Beaucoup de résultats mettent en avant la remarquable capacité d'adaptation d'A
tortilis qui survit, croît et se développe dans des zones très sèches malgré la forte
évapotranspiration et les précipitations limitées. Grouzis et Akpo (2006) ont rapporté que
cet arbre était caractérisé par une grande plasticité écologique puisqu’il colonise les régions
recevant entre 50 et 1000 mm de précipitations annuelles. Cette adaptation est à mettre en
relation avec une consommation en eau particulièrement faible et une certaine optimisation
du rapport assimilation de CO2 / transpiration. La consommation annuelle d'A. tortilis
évaluée dans le nord du Sénégal, est seulement de 66 mm, ce qui représente 44 % des
précipitations annuelles, la stratégie développée par cette espèce face aux fluctuations
pluviométriques interannuelles est un ajustement de sa surface foliaire transpirante pour
contrôler les pertes en eau (Grouzis et Le Floc’h, 2003).
Les Acacias présentent d’énormes potentialités économiques, agronomiques et écologiques
qui ont été largement détaillées dans la littérature (Sprent, 1983; Dommergues, 1987 ;
Giller et Wilson, 1991 ; Danso et al., 1992). Ils sont hautement tolérants à la sécheresse et
à différents degrés à la salinité, ils sont utiles en tant que source de fourrage et de bois, de
plus ils peuvent être utilisés pour des programmes ambitieux de reforestation dans les
écosystèmes désertiques (Toledo et al., 2003).
45
Recherche bibliographique. III : « La fixation de l’azote atmosphérique »
III : « La fixation de l’azote atmosphérique »
III-1- Introduction
La capacité à fixer l’azote moléculaire (N2) est un critère important en
agroforesterie mais extrêmement variable en fonction du génotype des plantes (Galiana
et al., 2004) et des micro-organismes. Il est donc essentiel avant toute introduction
d'espèces pressenties fixatrices du N2 dans les systèmes de production ou d'aménagement,
de vérifier leur potentiel de fixation d’azote atmosphérique (Sougoufara et al., 1990).
III-2- Comparaison entres les arbres fixateurs d’azote et les plantes annuelles
fixatrices d’azote
Les plantes annuelles et les arbres fixateurs d’azote contribuent à l’enrichissement
des différents écosystèmes, qu’ils soient fermés ou ouverts (Zahran, 1998, Dommergues,
1987). Selon Dommergues et al., (1999), l’écosystème fermé peut être défini comme un
système où la litière se décompose et l’azote est recyclé grâce à sa minéralisation et
devient disponible pour la plante fixatrice ainsi que pour toutes les autres essences
végétales associées ; contrairement au système ouvert où l’azote disponible du sol est très
faible. Cela a pour incidence directe probable que dans le système fermé, il y ait une
diminution de fixation du N2 au fur et à mesure que la minéralisation de l’azote atteint un
certain seuil, au contraire du système ouvert où la fixation perdure par manque d’azote
assimilable. L’impact positif pencherait plutôt du côté des espèces ligneuses que de celui
des espèces annuelles pour plusieurs raisons :
• Les nodules sont généralement indéterminés, annuels, ligneux et situés en
profondeur chez les arbres (Sprent, 2001), ce qui leur confère une activité prolongée par
rapport à ceux des espèces fixatrices annuelles. De plus, cette profondeur contribue à
maintenir une humidité relative entourant le nodule qui favorise son activité
symbiotique. De même, après une période de sécheresse, un nodule indéterminé sec
peut développer un lobe fonctionnel, ce qui nécessite moins d’énergie que d’en former
un nouveau (Reddell, 1993).
• Le système racinaire des arbres est plus développé que celui des plantes annuelles
et peut ainsi atteindre les nappes phréatiques, ce qui assure une activité racinaire
annuelle. Par ailleurs, chez certains arbres fixateurs d’azote, les nodules peuvent se
46
former à des profondeurs de 10 mètres tel que chez Prosopis juliflora (Felker et Clark,
1982) ou 30 m chez Faidherbia albida (Dupuy et Dreyfus, 1992).
Même si pour certains arbres la capacité à fixer l’azote diminue avec l’âge, surtout en
écosystème fermé due à l’accumulation de l’azote, cela n’a pas toujours été vérifié,
comme c’est le cas chez Casuarina equisetifolia au Sénégal (Ganry et Dommergues,
1995).
III-3- Méthodes d’estimation de la fixation d’azote atmosphérique
Différents auteurs, Danso, (1985, 1995); Hardarson et Danso, (1993) ont présenté
les méthodes actuellement disponibles permettant de mesurer, directement ou
indirectement la contribution de la fixation du N2 dans la nutrition azotée des plantes. Il
existe des méthodes indirectes qui ne différencient pas les différentes sources d’azote
prélevées par les plantes de façon précise, plus particulièrement l’azote dérivé de
l’atmosphère (Ndfa) et l’azote dérivé du sol (Ndfs) à l’inverse des méthodes directes qui
sont basées sur des mesures de l’isotope 15N (Danso, 1988 ; Dommergues et al., 1999).
III-3-1- Méthodes indirectes
Parmi les méthodes indirectes de mesure de la fixation du N2, les plus utilisées sont
les suivantes:
a- La différence de production de matière sèche (Sekhon et al., 1978) entre plants inoculés
et non inoculés avec des micro-organismes fixateurs du N2.
b- La mesure du nombre et de la biomasse des nodosités (Graham, 1981).
c- La méthode par différence (Talbott et al., 1982) :
Dans cette méthode, les plantes sont cultivées en serre ou en tubes placés en chambre de
culture sur un support stérilisé dépourvu d’azote où l’on mesure la différence entre la
quantité de N contenue chez des légumineuses inoculées avec celle obtenue avec les
mêmes légumineuses non inoculées. Cette méthode peut aussi s’appliquer en serre ou au
champ, en présence d’azote disponible dans le sol, en comparant l’azote total d’une
légumineuse fixatrice d’azote à une plante de référence non fixatrice, en assumant qu’elles
absorbent toutes deux les mêmes sources d’azote du sol, ou en comparant la légumineuse
fixatrice avec des plants de la même espèce où cette dernière est non inoculée ou inoculée
47
avec une souche inefficiente, ou bien lorsque le génotype de cette légumineuse de
référence (témoin) est un mutant non nodulant.
Cette méthode est fiable lorsque le sol est pauvre en azote (sol dunaire) (Ndoye et Dreyfus,
1988 et Sougoufara et al., 1990) ou que la litière n’a pas eu le temps de se décomposer et
d’interférer avec les résultats (Danso et al., 1992).
d- La technique de mesure de l'activité réductrice d'acétylène (ARA) (Hardy et al., 1968) :
basée sur le fait que la nitrogénase, enzyme impliquée dans la fixation d’azote est aussi
capable de catalyser la réduction de l’acétylène en éthylène : C2H2 +2H+ +2 e-
C2H4 [1]
De ce fait l’éthylène prélevé et mesuré sur chromatographie en phase gazeuse est corrélé à
l’activité de la nitrogénase ce qui permet de calculer l’azote fixé grâce à l’équation globale :
N2 + (6+n) e- + (6+n) H+ 2NH3 + n/2 H2 [2]
De l’équation [1] et [2] on conclut que la réduction d’une molécule de N2 implique (6+n) ealors que celle d’une molécule de C2H2 implique 2 e- . Le coefficient de conversion ƿ est
calculé comme suit :
ƿ = (6+n)/2
On admet souvent que n =2, la réaction globale est alors :
N2 + 4 e- + 8 H+ 2NH3 + n/2 H2
NB : ll se peut que la valeur de ƿ soit différente de 4, cette valeur changeant avec le
génotype de la plante, la température, l’irradiance, etc.… (Witty et Minchin, 1988).
L’ARA était la méthode la plus utilisée dans les années 70, grâce à son faible coût et à sa
simplicité (Danso, 1995), mais de nos jours elle est accueillie avec beaucoup de réserve,
surtout pour examiner la fixation de N sur une longue durée. Les principales critiques de
cette méthode étant que cette dernière s’étend sur une courte période de temps et que la
fixation subit des variations diurnes et nocturnes (Ayanaba et Lawson, 1977), en plus des
changements saisonniers (Zapata, 1987). De plus, l’activité nitrogénase est perturbée lors
du transport du plant du champ vers l’appareillage de mesure (Witty et Minchin, 1988) et il
est impossible de recouvrir 100% des nodules actifs lors du déracinement (Westermann et
al., 1981), le facteur ƿ de conversion reste imprécis, sans calibration préalable (Witty et
Minchin, 1988), et enfin l’incubation des échantillons devrait se faire dans un système
ouvert de flux continuel de 10% d’acétylène avec analyse d’éthylène dans le gaz effluent
(Witty et Minchin, 1988).
48
e- Analyse des composés azotés du xylème :
Cette méthode est basée sur la détermination de la composition des tissus végétaux ou du
N circulant dans la sève du xylème de la tige. Ce procédé a été développé pour différencier
l’azote fixé et l’azote dérivé des nitrates du sol (Mc Clure, 1979) mais seulement chez les
légumineuses exportatrices d’uréides où le N2 fixé est transporté sous formes d’allantoïne
ou d’acide allantoïque (uréides) alors que les nitrates absorbés directement du sol sont
transportés sous forme de NO3-. Cette méthode ne peut malheureusement pas être
appliquée aux légumineuses exportatrices d’amides où les produits qui proviennent de la
fixation de N2 et ceux qui proviennent des NO3- du sol sont essentiellement les mêmes.
Dans cette méthode, on prélève le xylème de la tige un peu au-dessus du sol ou on l’extrait
à partir des rameaux, puis on dose les uréides, les acides α-aminés et les NO3-. On convertit
le % d’uréides en % de Ndfa grâce à une courbe de calibration qu’on obtient avec la plante
étudiée inoculée avec une souche effective, dans des conditions contrôlées au laboratoire,
en présence de doses croissantes de NO3- et en mesurant d’une part le % d’uréides dans la
sève et d’autre part le Ndfa % déterminée par une autre méthode telle que la méthode de
dilution isotopique (Peoples et al., 1989).
Cependant, cette analyse est instantanée et nécessite la destruction de plusieurs plants pour
suivre l’évolution de la fixation (Dommergues et al., 1999), sans compter que la sécheresse
du sol entrave la collecte de sève (Herridge, 1982). De plus, la production substantielle
d’uréides est restreinte à un nombre limité de légumineuses tropicales et aucune
légumineuse tempérée n’a cette aptitude (Peoples et al., 1989), ce qui limite l’utilisation de
cette méthode spécialement dans le cas des arbres fixateurs d’azote (Dommergues et al.,
1999).
III-3-2- Méthodes directes :
Ces méthodes de mesure sont fondées sur la distribution de l'isotope
naturelle dans le cas de la méthode d'abondance naturelle du
méthode de la dilution isotopique du
fertilisants enrichis en
15
15
15
15
N, soit
N, ou artificielle par la
N, cette dernière nécessitant l'incorporation de
N dans le milieu de culture des plantes. Cependant l'approche
véritablement directe, bien que très peu pratique, est celle qui fait appel au traceur gazeux
azoté (15N2), mais cette méthode ne peut s’appliquer que sur une durée assez courte (Giller
et Wilson, 1991).
49
Le principe commun à ces trois méthodologies est que les plantes fixatrices de N2 croissent
dans un sol ou sous une atmosphère contenant un ratio 15N/14N mesurablement différent du
ratio constant de 0,3663% présent naturellement dans l’atmosphère. L’incorporation de N2
à partir de la fixation va de ce fait résulter en une différence de ratio 15N/14N entre le tissu
végétal et le substrat sur lequel croit la plante. Dans ce cas, les plantes fixatrices incubées
sous le gaz marqué 15N présenteront un azote avec un ratio 15N/14N significativement plus
élevé contrairement au cas où l’azote du sol disponible est marqué (Danso, 1995). En
d’autres termes, si la composition isotopique du sol diffère de celle de l’atmosphère
(naturellement ou artificiellement après enrichissement en 15N), on peut calculer chez une
plante fixatrice de N2 la quantité d’azote dérivée de chacune de ces deux sources, azote
dérivé de l’atmosphère, c'est-à-dire le N2 fixé (Ndfa), et azote dérivé du sol (Ndfs), en
déterminant les abondances isotopiques dans les échantillons de plantes non fixatrices et
fixatrices de N2 poussant dans le même pool d’azote disponible.
Notons que le N2 atmosphérique contient deux isotopes, le 15N et le 14N, et que l’isotope le
plus lourd 15N y est présent à une proportion constante de 0,3663%, l’isotope le plus léger
14
N restant représentant 99,6336% du N total (Dommergues et al., 1999).
a - Méthode de la dilution isotopique après enrichissement du sol en 15N :
Le principe de dilution isotopique et les équations impliquées ont été largement
développés et discutés dans la littérature, notamment par Rennie et al. (1978), Rennie et
Rennie (1983) et Danso et al. (1986). Son utilisation pour l’estimation du N2 fixé nécessite
l’application d’un même niveau d’azote et de 15N enrichi (exemple : pour 2g d’azote/m2 ou
0.5g/arbre, on ajoute un engrais enrichi de 10 à 20% atomes de 15N) en un fertilisant donné
(à une quantité non inhibitrice de la fixation biologique de l’azote) pour la plante fixatrice
d’azote étudiée et pour la plante de référence non-fixatrice adéquate (il est nécessaire que
l’architecture racinaire soit aussi proche que possible de la plante fixatrice et qu’elle
assimile les mêmes sources d’azote qu’elle). En principe, du moment que la légumineuse
et la plante de référence absorbent la même source d’azote au même endroit, on s’attend à
ce que le ratio de
15
N/14N de l’azote dérivé du sol soit le même chez les deux types
d’espèces (Figure 11). Cependant, en plus de l’azote dérivé du sol, la plante fixatrice de N2
assimile aussi le N2 atmosphérique donc avec un ratio 15N/14N plus faible que celui du sol.
Ceci résulte, au niveau de la plante entière chez l’espèce fixatrice de N2, en une dilution du
ratio
15
N/14N provenant de l’azote du sol, lequel est évalué à partir de la plante référence
50
non fixatrice. L’importance de la dilution du ratio
15
N/14N du sol reflète la magnitude de
l’efficience de la fixation du N2. Si on se base sur l’hypothèse que la plante fixatrice et la
plante de référence absorbent des proportions identiques (mais pas nécessairement des
quantités identiques) d’azote du sol et d’azote marqué, on aboutit à cette équation finale
(Danso, 1985) :
Ndfa% = 100 x (1 - Ei / E0)
où :
Ndfa% : Pourcentage de N2 fixé par la plante fixatrice
Ei : excès isotopique dans la plante fixatrice de N2
E0 : excès isotopique dans la plante non-fixatrice de référence
Si Nt est la quantité de N total dans la plante fixatrice, la quantité de N2 fixé est alors de :
Ndfa = Ndfa% x Nt / 100
Cependant il existe des sources d’erreur dans cette méthodologie, dont la différence
possible entre les architectures des systèmes racinaires de la plante fixatrice et de la plante
de référence, le décalage dans le temps dans l’absorption de l’azote marqué par les deux
plantes fixatrice et de référence et enfin le cas d’un sol très pauvre en azote où la plante de
référence aura du mal à pousser et où on est obligé d’augmenter la dose de l’engrais
marqué (méthode de la valeur A) (Fried et Boeshart, 1975).
51
Plante de
référence
Plante
fixatrice
Figure 11 : Principe de la mesure de la quantité du N2 fixé en utilisant la méthode de dilution isotopique après
enrichissement du sol en 15N. Le sol est enrichi assez fortement en 15N. La plante N2-fixatrice qui utilise deux
sources d’azote (N2 atmosphérique et azote du sol), dilue dans ses tissus l’azote du sol enrichi en 15N : elle
renferme donc moins de 15N que la plante de référence. Dans cette méthode, on néglige le 15N de l’air car son
abondance isotopique est seulement de 0.3663% atome (Peoples et al., 1989).
b - Abondance naturelle en 15N :
Il existe une augmentation de l’abondance du 15N dans la fraction azotée de la plupart des
sols parce que cet isotope est plus lourd que le
14
N et que les composés qui l’englobent
tendent à réagir plus lentement particulièrement dans le cas de réactions gazeuses. Dans les
études traitant des isotopes stables, les niveaux d’abondance naturelle sont souvent décrits
sous forme de valeurs delta (δ) exprimées en parts /cent ou /mille ("o/oo"). Les valeurs
delta ne sont pas des valeurs absolues d’abondance d’isotopes mais expriment les
différences entre les échantillons avec le standard d’abondance naturelle qui est considéré
comme delta = 0 (dans le cas du N2 atmosphérique : Atome% 15N =0,3663033).
Le pourcentage d’azote N2 fixé (Ndfa%) est calculé comme suit (Shearer et Kohl, 1986) :
Ndfa% = ([δ15N (pl. réf.) - δ15N (pl. fix.)] / [δ15N (pl. réf.) – β]) x 100
52
où :
δ15N (pl. réf.) : composition isotopique de la plante de référence non fixatrice.
δ15N (pl. fix.) : composition isotopique de la plante fixatrice de N2 .
β : coefficient de fractionnement isotopique (appelé aussi facteur d’enrichissement
isotopique).
Le coefficient β est calculé en mesurant la composition isotopique de la plante fixatrice de
N2 croissant sur un sol dépourvu d’azote combiné et fixant 100% d’azote (Mariotti, 1983).
Cette méthodologie donne une estimation cumulée de la fixation du N2.
Contrairement à la méthode de dilution isotopique, elle ne nécessite pas l’adjonction
d’engrais marqués onéreux et, de plus, évite le risque d’erreur dû à la décroissance souvent
rapide de l’excès isotopique exogène plus instable que celui du sol. Par ailleurs, le choix de
la plante de référence semble moins critique (Dommergues et al., 1999). Cependant cette
méthode est inutilisable dans le cas où le δ15N‰ du sol est inférieur à 4‰ (Peoples et al.,
1989). Par ailleurs, il faut disposer d’un spectromètre de masse à double introduction
capable de déceler des différences de 0.1 partie/mille (soit environ 0.00004% atome 15N).
III-4- Le potentiel fixateur de N2 des Acacias :
Il faut tout d’abord différencier la fixation du N2 potentielle et la fixation du N2
réelle (Dommergues et al., 1999 ; Galiana et al., 2004) :
- La fixation du N2 potentielle correspond à l’aptitude d’un système fixateur à fixer N2 en
l’absence de tout facteur limitant.
- La fixation du N2 réelle correspond à l’aptitude d’un système fixateur à fixer N2 en
présence de facteurs limitants qui interviennent toujours dans les conditions au champ.
Il existe une forte variabilité génétique dans l'aptitude d’une espèce à la nodulation
et à la fixation du N2 (Sanginga et al., 1990), la fixation de N2 potentielle étant intrinsèque
au système fixateur considéré au sein de l’interaction « génotype de l’arbre fixateur de
l’azote (AFN) x souches de symbiotes bactériens ». Ceci peut être réalisé en serre en
réunissant les conditions les plus favorables telles que l’inoculation avec une souche
efficiente, l’utilisation d’un sol pauvre en azote minéral et une irrigation suffisante
(Dommergues et al., 1999).
Le pouvoir fixateur, lequel varie en fonction des facteurs limitants externes, est
exprimé en Ndfa% (pourcentage d’azote provenant de la fixation dans une plante fixatrice),
et est déterminé au niveau de la plante entière ou d’un échantillon représentatif. Le pouvoir
53
fixateur est aussi exprimé en Ndfa (quantité de N2 fixé) et, si on connaît la biomasse totale
exprimée en azote total (Nt), il est exprimé en g N2 fixé.arbre-1.
Une étude réalisée en Namibie par Schulze et al., (1991) in situ sur des arbres
fixateurs d’azote en utilisant la méthode d’abondance naturelle
15
N a révélé que la
contribution de l’azote fixé par rapport à l’azote total Nt % était la plus élevée chez Acacia
mellifera (71%), suivi de Dichrostachys cinerea et Acacia hereroensis (49%), Acacia
karroo situé dans la moyenne (35%), Acacia tortilis (17%), tandis que Faidherbia albida
se positionnait en dernière place parmi les espèces étudiées avec seulement 2%. Cependant
l’âge des arbres n’est pas indiqué dans cette étude. les échantillons de feuilles ont été
prélevés en fin de saison humide pour ne pas surestimer l’azote fixé en rajoutant la valeur
de l’azote stocké qui remonte vers les nouvelles feuilles en début de saison.
Une autre étude menée par Sellstedt et al., (1993) a comparé le potentiel fixateur
d’azote entre différents arbres fixateurs d’azote : Faidherbia albida. Del, Leuceana
leucocephala
(symbiose
rhizobienne)
et
Casuarina
equisetifolia
(symbiose
actinorhizienne). Les différentes méthodes utilisées, à savoir la différence en N total,
l’ARA, la technique de dilution isotopique du
15
N ont révélé que la fixation d’azote était
plus élevée après quatre mois d’expérimentation en pots chez L. leucocephala (56.3 g N
plante-1) suivi de F. albida (30.7 g N plante-1) et enfin par C. equisetifolia (12.3 g N plante1
). Il se peut que chez cette dernière espèce, la fixation se fasse plus tardivement que chez
les deux légumineuses. Une autre expérimentation en pot a été faite par Ndoye et al. (1995)
qui ont utilisé la dilution isotopique du
15
N pour comparer le pouvoir fixateur d’azote de
quatre espèces d’Acacia simultanément. Les résultats obtenus cinq mois après la mise en
culture montraient que le Ndfa d’A. seyal était supérieur à celui des trois autres espèces
d’arbres: A. raddiana, A. senegal et A. albida, mais puisque le Ndfa% était le même pour A.
seyal et A. raddiana (63 et 62% respectivement) on pouvait classer ces deux espèces dans
la catégorie des AFN (arbre fixateur d’azote) à haut potentiel fixateur de N2. Alors qu’au
champ, Sanginga et al., (1995) ont estimé qu’A. mangium utilisé comme arbre de haie
pouvait fixer 100-300 kg N/hectare/an alors qu’A. albida et A. senegal fixaient un peu
moins de 20 kg N/hectare/an.
D’autres études estimant la fixation d’azote chez les arbres au champ par les
méthodes isotopiques sont résumées dans le Tableau 8. Ces résultats sont assez difficiles à
comparer, compte tenu da la différence d’âge des plantations, de climat et de facteurs
pédologiques. Mais d’une façon générale, il semblerait que le pourcentage d’azote fixé
augmente avec l’âge de la plantation (Ovalle et al., 1996). Il ressort des différentes études
54
faites sur Alnus incana que cette dernière ait une capacité à fixer l’azote atmosphérique qui
dépasse de loin celle des autres espèces (Hurd et al., 2001), exception faite de l’espèce
ligneuse Leuceana leucocephala (Parrotta et al., 1994 ; Sanginga et al., 1996).
Tableau 8 : Estimation de l’azote fixé par les arbres au champ par les méthodes isotopiques (d’après
Galiana et al., 2004).
Age de la
Espèces
Localisation plantation
%NDFa
en année
a
N total fixé
(kg/hectare)
01
14
0.5
02
86
9
Australie
05
-
Acacia holosericea
Sénégal
10
Acacia mangium
Côte d’Ivoire
Acacia caven
Chili
Acacia dealbata
Acacia melanoxylon
Acacia mucronata
Australie
Méthode
isotopique
utilisée
Références
b
DI
Ovalle et al., 1996
2-140
AN
May, 2001
39
NF
AN
Ndyaye et Ganry,1997
02
50
NF
AN
Galiana et al., 2002
2.25
43
<1
AN
2.25
48
<1
AN
Hamilton et al., 1993
Acacia senegal
Soudan
04
24-61
28.7-46.7
AN
Raddad et al., 2005
Alnus glutinosa
France
>15
94
NF
AN
Beaupied et al., 1990
USA
-
85-100
43/an
AN
Hurd et al., 2001
France
5-6
75
-
AN
Domenach et al., 1989
Australie
01
50
76
AN
Purwantari et al., 1996
Casuarina equisetifolia Porto Rico
02
42-67
82-94/an
DI
Parrotta et al., 1994
Casuarina equisetifolia
Sénégal
03
38
15/an
AN
Mariotti et al., 1992
Erythrina lanceolata
Costa Rica
01
0-53
0-72
AN
Salas et al., 2001
Faidherbia albida
Sénégal
01
15-23
NF
DI
Gueye et Ndoye, 2000
Flemingia macrophylla
Burundi
01
-
10
AN
Snoeck, 1995
10
0-17
NF
AN
10
0-22
NF
AN
02
70
103/an
DI
Parrotta et al., 1994
Alnus incana
spp.rugosa
Alnus incacana
Calliandra calothyrsus
Gliricidia sepium
Hardwickia binata
Sénégal
Leuceana leucocephala Porto Rica
Ndiaye et Ganry, 1997
Pterocarpus lucens
Sénégal
-
26-49
10.8-20.8
AN
Sylla et al., 2002
Leuceana leucocephala
Nigeria
3
62-75
98-119/an
DI
Sanginga et al., 1996
Prosopis alba
Chili
01
25
0.4
02
52
1.8
01
31
0.5
DI
Ovalle et al., 1996
02
70
02
Prosopis chilensis
Chili
Prosopis cineraria
Sénégal
10
21
NF
AN
Ndyaye et Ganry,1997
Prosopis glandulosa
USA
01
41-63
40
AN
Shearer et Kohl, 1991
Robinia pseudoacacia
Autriche
02
90
110/an
DI
Danso et al., 1995
55
Tableau 8 (suite): Estimation de l’azote fixé par les arbres au champ par les méthodes isotopiques,
d’après Galiana et al., (2004).
Age de la
Espèces
Localisation plantation %NDFa
a
en année
Dalbergia riparia
54-62
Lonchocarpus sp.
47-57
Machaerium
aristulatum
44-55
Mimosa pigra
42-53
Zygia inaequalis
Campsiandra
comosa
Albizia multiflora
Dalbergia inundata
41-52
Brésil
-
38-50
N total fixé
(kg/hectare)
isotopique
utilisée
NF
Références
b
AN
Kreibich et al., 2006
AN
de Freitas et al., 2006
31-48
35-48
6-24
Pterocarpus
amazonum
0
Crudia amazonica
Macrolobium
0
acaciafolium
Anadenanthera
42.3-60.4
1.2- 1.7
54.6-78.0
2.5-3.6
Piptadenia stipulacea
54.2-77.5
6.9-9.8
Robinia pseudoacacia
63-83
colubrina
Mimosa tenuiflora
Méthode
Brésil
Hippopha rhamnoides Allemagne
Genista scuparia
-
56
30.5-59.2
AN
Veste et al., 2012
79
a : - : Non Fait ; %NDFa : pourcentage de l’azote dérivé de l’atmosphère ; b : DI, dilution isotopique, AN, abondance
naturelle
III-5- Classification des Arbres Fixateurs d’Azote (AFN) selon leur potentiel de
fixation du N2
Le classement du potentiel de fixation de l’azote est basé sur le seuil établi par
Dommergues (1987), Sanginga et al., (1990) et Schulze et al., (1991) qui est de 30 g N2
fixé.arbre-1.an-1. Les espèces sont considérées à haut potentiel fixateur d’azote lorsqu’ils
dépassent cette limite.
En résumé, les espèces citées comme intéressantes pour leur capacité de fixation
azotée sont les suivantes (Ganry et Dommergues, 1995 ; Dommergues et al., 1999):
56
Espèces connues pour leur fixation de N2 potentielle élevée (> 30 g N2 fixé arbre-1
an-1) : Robinia pseudoacacia, Sesbania rostrata, Leucaena leucocephala, Casuarina
equisetifiolia, C. glauca, Albizia lebbeck, Gliricidia sepium.
Espèces ayant un potentiel de fixation de N2 moyen à élevé :
Acacia mearnsii, A. auriculiformis, A. seyal, A. crassicarpa, A. dealbata, A. galpinii, A.
mangium, A. saligna, Calliandra calothyrsus, Casuarina cunninghamiana, C.
junghuhniana,
Erythrina
poeppigiana,
Flemingia
macrophylla,
Inga
edulis,
Paraserianthes Falcataria mollucana, Prosopis tamarugo, P. juliflora, P. glandulosa.
Espèces connues pour leur fixation de N2 potentielle faible (< 30 g N2 fixé arbre-1
an-1) : Acacia senegal, Pterocarpus erinaceus.
Espèces à potentiel de fixation faible mais ayant des avantages importants en
matière de culture associée, d'élevage ou de lutte contre l'érosion :
Acacia raddiana, A. cyclops, Faidherbia albida.
Cependant tous les résultats d’expérimentation de la fixation d’azote sur une espèce
donnée doivent être pris avec beaucoup de recul et de précaution, que le test soit fait en
pépinière sous conditions contrôlées ou au champ. Dans le premier cas, les résultats
peuvent être hétérogènes pour une seule espèce selon la provenance des graines et de
l’efficience de la souche inoculée, comme cela a été rapporté pour A. saligna (Nasr et al.,
1999). Dans les conditions naturelles, l’interaction des facteurs environnementaux tels que
la fertilité du sol (Galiana et al., 2002), la pluviométrie (Hansen et Pate, 1987), la salinité
(Koreish et al., 1997) etc…, peuvent influer sur l’estimation de la fixation d’azote quel que
soit la méthode utilisée.
De plus chez les arbres et arbustes, d’autres contraintes concernant l’estimation du N2 fixé
sont prises en compte, à savoir : la croissance pérenne et les variations saisonnières et
annuelles (Ladha et al., 1993; Peoples et al., 1996).
A la lumière de toutes ces données, la meilleure approche pour utiliser un arbre
fixateur d’azote adéquat pour une région donnée est tout d’abord de tester cette ligneuse
sur le sol à revégétaliser, sous conditions contrôlées, avec une inoculation adéquate et avec
des graines de plusieurs provenances dont les conditions se rapprochent de la zone ciblée.
Cette étape constitue un préalable indispensable pour optimiser l’expression du potentiel
fixateur de la légumineuse ligneuse in situ.
57
Chapitre II :
Etude expérimentale
Chapitre II. Etude expérimentale. Partie I:: Caractérisation des rhizobia. Matériel et méthodes
Partie I : Caractérisation des rhizobia associés aux espèces d’Acacia étudiés
d’Algérie
Matériel et méthodes
Introduction
Des études ont été menées sur la flore des régions arides et semi-arides en Algérie,
mais aucune ne s’est intéressée exclusivement aux Acacias. Ces arbres offrent un potentiel
intéressant dans la réhabilitation, la régénération et la fertilisation du sol (Zahran, 1999).
Grâce à leur système racinaire développé, ils survivent dans des régions marginales arides et
semi-arides. De plus, ces derniers forment une symbiose avec des bactéries fixatrices d’azote
du sol qui donne naissance à des nodules où siège la fixation de l’azote atmosphérique
(Räsänen et al, 2001). De ce fait, répertorier les espèces d’Acacias autochtones et introduites
acclimatées à toutes les contraintes pédo-édaphiques de différentes régions arides et semiarides d’Algérie, ainsi que la mise en évidence de la diversité des souches bactériennes
fixatrices qui leur sont associées sont une première étape vers la conservation de la
biodiversité autant du partenaire végétal que microbien. L’étude des caractéristiques
phénotypiques et symbiotiques des isolats est un préalable indispensable à la sélection des
souches résistantes et efficientes. Ceci permettra d’utiliser le couple symbiotique plantemicroorganisme le plus performant dans la lutte contre la désertification et la réhabilitation
des zones dégradées.
Méthodologie
1-Echantillonnage
28 wilayas ont été prospectées pour la présence d’Acacias. Ici, sont reportées seulement
les wilayas des zones arides et semi-arides, classées en 4 zones climatiques (Figures 12 et 13)
selon Ozenda, (1977) :
•
Climat méditerranéen sec (région tellienne): Tlemcen, Sidi-Bel-Abbès, AinTemouchent, Oran, Mostaganem, Djelfa, Chlef, Blida, Sétif et Guelma.
•
Climat présaharien (région steppique et pré steppique): M’sila, Saida, Relizane, Tiaret,
Ain Sefra, El-Bayadh, Naâma.
•
Sahara septentrional (région saharienne) : El Oued, Béchar, Ghardaïa.
•
Sahara central (région saharienne) : Adrar, Tamanrasset.
58
Environ 500g-1 Kg de sol sont prélevés autour de plusieurs arbres/site, dans un
périmètre de 1m autour des arbres et à 20 cm de profondeur après dégagement de la litière.
Graines et nodules sont récoltés au niveau de chaque arbre quand elles sont présentes et
accessibles. L’échantillonnage a été effectué généralement en novembre et en mars. Le
prélèvement du sol dans les lits d’oueds desséchés a suscité une interrogation quant à la
profondeur optimum où persisteraient les souches rhizobiennes, du fait qu’après la saison des
pluies, une grande partie de sol est transportée par les flots. De ce fait, le sol a été prélevé à
20, 40 et 60 cm autour des arbres.
100km
Figure 12 : Carte topographique de l’Algérie d’après Oussedik et al., 2003.
Algérie
N
Figure 13: Les grandes subdivisions phytogéographiques du Sahara (d’après Quezel et Simmoneau, 1963).
59
2-Analyse physico-chimique du sol
2-a- Mesure de la conductivité et du Ph selon Aubert, (1978) ; Callot et Dupuis, (1980)
La détermination de la salinité d’un sol est basée sur le principe de l’extraction d’un
électrolyte dont ont mesurera la concentration (Robinson et Stockes, 1970), cette méthode
étant difficile on préférera estimer directement la capacité de cet électrolyte à conduire un
courant, ce paramètre est nommé conductivité électrique. Cette dernière est effectuée en
plongeant une cellule de mesure directement dans l’électrolyte (extrait aqueux), elle est
exprimé en mS/cm (1 dS.m-1 = 1 mS.cm-1 = 10 mM ou 0.06 % NaCl). A condition que la
température optimum pour cette mesure soit de 25°C (Montoroi, 1997). Le conductimètre (EC
215 Hanna instrument) utilisé, s’auto-calibre à cette température.
Le sol prélevé a été analysé pour le pH et la conductivité : une suspension de 1/5 (sol :
eau) est préparée puis mélangée pendant 1h, cette suspension est laissée à décanter pendant 5
min puis l’électrode du pH-mètre (H19024 HANNA instrument) et du conductimètre sont
immergées, 5 répétions sont faites et la moyenne est interprétée.
Selon l’échelle de salure internationale en millisiemens.cm-2 au 1/5 évaluée à l’aide de
l’échelle de Durand, 1983 :
Non salé
/
0.5
Peu salé
/
1
/
Salé
2
Très salé
/
4
Extrêmement salé
Le département d’agriculture et d’Alimentation d’Australie apporte plus de précisions
à cette échelle en rapport avec la texture du sol (Tableau 9).
Tableau 9 : Interprétation de la salinité du sol en fonction de sa texture et de sa conductivité électrique
de l’extrait aqueux au 1/5 en mS/cm, selon le département d’agriculture et d’Alimentation d’Australie
(URL : www.Department of Agriculture and Food - Salinity measures, units and classes [consulté le
10/04/2012]).
Taux de
salinité
sablonneux
Sablolimoneux
Limoneux
Argilolimoneux
Limoneux
argileux
Argileux
lourd
Non salé
<1.3
<1.7
<2.0
<2.2
<2.5
<3.3
Légèrement
salé
1.3-2.6
1.7-3.3
2.0-4.0
2.2-4.4
2.5-5.0
3.3-6.7
Salé
2.6-5.2
3.3-6.7
4.0-8.0
4.4-8.9
5.0-10.0
6.7-13.3
Très salé
5.2-10.6
6.7-13.3
8.0-16.0
8.9-17.8
10.0-20.0
13.3-26.7
Extrêmement
salé
>10.6
>13.3
>16.0
>17.8
>20.0
>26.7
60
2-b- Détermination de la texture du sol
Selon la dimension de ses particules, le sol est constitué de trois composants majeurs :
le sable (0.05 - 2 mm), le limon (0.002 - 0.05 mm) et l’argile (0.0002-0.002 mm) (Soil Survey
Staff, 1995).
La texture varie selon l’abondance de chaque composant (Annexe 1). Pour déterminer
la texture des échantillons des sols récoltés, une méthode simple a été utilisée: un échantillon
de sol est mélangé avec de l’eau remplissant les deux tiers d’un Becher, la suspension est
mélangée pendant 1h et laissée à décanter pendant une autre heure. Les différents composants
du sol se déposeront alors selon leur poids : cailloux et graviers, suivis du sable, du limon et
enfin de l’argile. Le pourcentage approximatif des trois éléments peut être évalué pour
déterminer la texture du sol étudié (FAO, 1992).
3- Isolement des rhizobia
Dans les zones arides et semi-arides prospectées, il était impossible d’accéder à des
nodules in situ, c’est pourquoi la méthode de piégeage in vitro a été utilisée pour révéler les
microsymbiotes des sols prélevés autour des différentes espèces d’Acacia.
3-1-Piégeage :
Chaque sol est piégé avec les plants des espèces d’Acacia qui y poussent afin d’obtenir
des nodules racinaires et d’isoler ensuite les souches rhizobiennes qui leur sont associées. Les
graines utilisées proviennent du site prospecté quand la saison s’y prêtait ou ont été fournies
gracieusement par l’INRF (Institut National de la Recherche en Foresterie -Tamanrasset-) et
le LSTM (Laboratoire de Symbiose Méditerranéenne et Tropicale –Montpellier-). Ces
dernières ont été triées, répertoriées et stockées à 4°C.
3-1-a- Désinfection et scarification des graines
Bien que le taux de germination des graines soit souvent lié à la date de leur récolte et les
conditions de leur stockage, il dépend aussi de la technique de scarification, c’est pour cela
que plusieurs méthodologies ont été testées.
•
Désinfection chimique à l’hypochlorite de sodium à différentes concentrations et
scarification mécanique :
61
Les graines sont désinfectées par immersion dans l’hypochlorite de sodium 32° pendant 6min,
16° pendant 10 min et 12° pendant 6 et 20 min. Elles sont rincées 8 fois avec l’eau distillée
stérile et trempées pendant 1h dans la dernière eau de lavage. Par la suite, les graines
scarifiées à l’aide d’un poinçon chauffé à blanc sont déposées aseptiquement dans des boîtes
de Pétri contenant de l’eau gélosée à 0.8% (Annexe 2) et placées inversées à l’obscurité dans
l’étuve à 28°C pendant 3 à 8 jours. Les boites ne doivent pas être surchargées pour minimiser
le risque de contamination.
•
Désinfection et scarification à l’acide sulfurique 98% :
Les graines sont trempées dans l’acide sulfurique pendant 20, 60 et 120 minutes pour chaque
espèce. Elles sont rincées à l’eau distillée stérile 10 fois afin d’éliminer toute trace d’acide
sulfurique. Lors du dernier rinçage, les graines sont immergées dans l’eau distillée stérile
pendant 1h avant de les placer aseptiquement dans des boites de Pétri contenant de l’eau
gélosée à 0.8%. Ces dernières sont placées à l’obscurité dans l’étuve à 28°C pendant 3 à 8
jours.
3-1-b- Mise en place des plantules :
Les plants avec les radicelles mesurant 2 à 3 cm sont transférés aseptiquement dans des pots
en plastiques désinfectés ou dans des tubes Gibson stérilisés :
•
Pots stérilisés :
Des pots en plastique, d’une contenance de 250 ml sont désinfectés avec de
l’hypochlorite de sodium à 12° puis rincés à l’eau distillée, ils sont par la suite remplis de
200g du sol de chaque site avant de repiquer trois plants d’Acacia par pot, les plants
correspondant à l’espèce d’Acacia spécifique à chaque site. Avant de transférer le sol,
l’échantillon global est homogénéisé. Les plants sont arrosés un jour sur deux avec une
solution nutritive pour plante dépourvue d’azote (Broughton and Dilworth, Annexe 3) et de
l’eau distillée stérile en alternance.
•
Tubes Gibson :
Des tubes Gibson (Gibson, 1980) sont préparés (Annexe 4). Les plants y sont introduits
par une petite ouverture (à l’opposé de l’ouverture fermée avec un embout) de façon à ce que
ne dépasse que la tige feuillée et que la racine soit immergée dans le milieu et supportée par la
62
gélose inclinée. Il y a 4 répétitions par site, par espèce et par profondeur. Les plants sont
recouverts de coton imbibé d’eau distillée stérile pour éviter leur desséchement. Après 24h,
les téguments sont enlevés et les tubes sont incubés dans une chambre de culture avec une
photopériodicité de 16h (lumière du jour) et 8h d’obscurité (nuit), à une température de 30 ± 1
°C, une humidité relative de 70 ± 5% et une radiation photosynthétiquement active de 120
mol/m2/s. Les tubes sont placés dans des bacs de façon à ce que les racines soient maintenues
à l’obscurité.
Après une semaine d’incubation les plants sont inoculés avec 1ml de suspension de sol à 10%
(Annexe 5). Des tubes non inoculés serviront de témoins. Les racines sont observées après 6
semaines de la germination des graines (Diouf et al., 2007) pour la présence de nodules.
3-2- Isolement et purification des souches :
3-2-a- Isolement :
Les nodules récoltés des racines des arbres in natura (lorsque cela était possible,
principalement en terrain sablonneux) ou obtenus par piégeage sont directement utilisés pour
l’isolement ; la majorité de ces nodules sont stockés dans du glycérol à 60% ou conservés secs
dans des tubes contenant du CaCl2 surmonté de coton cardé (Date, 1982). Au laboratoire, les
nodules sont réhydratés dans de l’eau distillée stérile (pendant une heure) dans des tubes
Eppendorf. Après avoir éliminé l’eau, les nodules sont désinfectés en surface par immersion
dans du H2O2 (56%) pendant 30-90 secondes, selon la taille du nodule. Les nodules, de tailles
et de formes différentes pour chaque espèce d’Acacia sont écrasés à l’aide d’une pince stérile.
Le broyat nodulaire obtenu est déposé sur du milieu YEMA (Yeast Extract Mannitol Agar)
additionné ou non de rouge Congo* (Annexe 6), ce dernier est étalé par méthode de stries et
les boites sont incubées jusqu'à 10 jours à 28°C.
* La majorité des rhizobia n’absorbent pas ou peu le rouge Congo et présentent un aspect
blanchâtre, transparent et à contour régulier (Vincent, 1970) ce qui permet de les différencier
des autres bactéries Gram négatifs (Agrobacterium sp., Klebsiella, Pseudomonas, etc).
Cependant, certaines souches de R. leguminosarum absorbent fortement ce colorant (Kneen et
Larue, 1983).
Les isolats sont repiqués jusqu’à obtention d’une culture pure.
63
3-2-b- Vérification de la pureté des isolats :
Vérification de la pureté des isolats par repiquage et microscopie :
La pureté des isolats est vérifiée par la méthode d’épuisement sur milieu YEMA
jusqu’à l’obtention de colonies isolées. Il est conseillé d’observer les colonies bactériennes à
l’aide d’une loupe binoculaire. De plus, cette pureté est vérifiée par observation
microscopique de préparations de cultures entre lames et lamelles à l’état frais, ce qui permet
de vérifier l’homogénéité des cellules, les différentes formes présentes, et leur mobilité.
Coloration de Gram :
La coloration de Gram (Annexe 7) permet de différencier sur la base de la composition
de la paroi cellulaire les bactéries Gram négatives (comme les rhizobia) des bactéries Gram
positives. L’observation microscopique au grossissement X100 avec huile à immersion
permet de voir si les cellules sont colorées en violet (Gram-positif) ou bien en rose (Gramnégatif).
Conservation des isolats :
Les isolats purifiés sont conservés selon les deux procédés suivants :
Pour une courte durée (<6 mois), on les repique sur le milieu YEMA incliné après une
incubation de 48-72 heures à 28°C, les tubes sont ensuite conservés au réfrigérateur à
4°C.
Pour une conservation de longue durée, les isolats sont conservés dans des cryotubes
contenant 0.75 ml de glycérol (50%) additionné de 0.75 ml de suspension bactérienne en
phase exponentielle. Le mélange homogénéisé est conservé à -80°C.
4- Test de nodulation et d’efficience
Les isolats obtenus à partir des broyats nodulaires ne peuvent être considérés comme
BNL (Bactéries Nodulant les Légumineuses) qu’après avoir vérifié leur aptitude à renoduler
leur plante hôte en conditions bactériologiques contrôlées. Ce test a été réalisé en plusieurs
étapes comme suit:
4-1- Désinfection des graines et mise en germination :
Le même protocole que celui décrit précédemment au §3-1-a a été appliqué
64
4-2- Transfert des plantules :
Après germination (3 à 5 jours selon l’espèce) les plantules obtenues sont transférées
dans :
- Des pots en plastique, désinfectés et remplis de sable autoclavé trois fois pendant 20 min à
120°C, à 24h d’intervalle, un premier pot est troué pour éviter la saturation du sol en eau, il
est doublé d’un autre pot pour éviter toute perte d’inoculum.;
- Des tubes (150 X 20 mm) contenant une languette de papier munie d’un support sur la
partie supérieure où sont déposées les graines germées et où est percé un trou permettant aux
racines de passer à travers et de se développer à l’intérieur du tube (Figure 14). Ces tubes sont
remplis avec 45 ml de milieu nutritif sans azote de Broughton and Dilworth (Annexe 3). Ils
sont fermés avec du papier aluminium serré avec des élastiques, puis sont stérilisés par
autoclavage pendant 20 min à 120°C. A la sortie de l'autoclave, on pratique un trou pour
introduire délicatement la radicelle de manière à ce que la partie racinaire soit accolée au
papier.
Cotylédons
Hypocotyle
Racines
Solution nutritive pour plantes
Languette de papier
Figure 14 : Schéma représentant le dispositif utilisé pour le test de nodulation.
4-3- Inoculation :
L’inoculation des plantes est réalisée une semaine après la mise en tube avec 1 ml de
culture bactérienne à une concentration de 1.5 x107 UFC/ml, équivalent au tube Mc Farland
65
05 (Annexe 8), en effectuant six répétitions par souche. Chaque essai comprend un témoin
négatif non inoculé.
4-4- Evaluation de l’efficience :
Après neuf mois de culture en tubes, le nombre de nodules, leur aspect, la hauteur de
la tige sont relevés. Le poids sec des nodules et de la plante entière sont mesurés après
séchage au four à 60°C pendant 3 jours.
5- Analyse statistique
• La PCA (Principal Component Analysis ou analyse en composantes principales) est
effectuée pour étudier la relation entre la conductivité du sol et la température
ambiante maximale des sites échantillonnés et la tolérance in vitro des souches isolées
des sites correspondant au NaCl et température. Les calculs et le graphe ont été
obtenus grâce au logiciel XLSTATTM (version 2010.5.04, Addinsoft, Paris, France,
http://www.xlstat.com) (Annexe B).
• La
FCA
(Factorial
Correspondence
Analysis
ou
analyse
factorielle
des
correspondances) est appliquée pour visualiser la relation entre les taxa rhizobiens
comme ils ont été définis par la phylogénie basée sur le séquençage partiel du 16S
rARN et l’espèce d’Acacia hôte, en utilisant le logiciel XLSTATTM (version
2010.5.04, Addinsoft, Paris, France, http://www.xlstat.com) (Annexe A).
• Dans le test d’efficience et pour chaque paramètre étudié, toutes les données collectées
ont été soumises à une analyse de variance à 1 facteur. Quand l’effet du facteur souche
de rhizobium a un effet significatif pour un paramètre donné, les moyennes obtenues
pour chaque souche sont classées par groupes homogènes en appliquant le test
multiple de classement des moyennes de Duncan (Dagnélie, 1975). L’analyse de
variance a été effectuée en utilisant le logiciel « SUPERANOVA software » (Abacus
concepts Inc., version 1989, CA) (Annexe C).
66
6- Caractérisation phénotypique des isolats
Tous les isolats sont testés pour leur tolérance aux pH, à la température et à la salinité.
Les colonies bactériennes sont ensemencées dans du YEM liquide, incubées jusqu’à une
turbidité équivalente au tube Mc Farland 0.5 (Annexe 8) à une concentration approximative
de 1.5 x107 UFC/ml. Par la suite, 10 µl de la suspension bactérienne obtenue est étalée sur les
boites de Petri contenant du milieu YEMA lesquelles sont soumises aux différents facteurs
testés :
6-1- Températures :
Les boites ensemencées et scellées sont placées en chambre froide ou en incubateurs à 4, 30,
35, 40, 45, et 50C° pendant 7 jours.
6-2- pH
Les isolats sont évalués pour leur tolérance au pH sur du YEM solide ajusté à des
pH de: 4, 9, 10, 11, 12 et 13. Après une semaine d’incubation à 28°C, la lecture est faite en
comparant la croissance des tapis bactériens des différents isolats à un témoin à pH 6.8.
6-3- Salinité
La croissance bactérienne est réalisée sur du milieu YEM solide, additionné de
différentes concentrations de NaCl : 0 , 0.5 , 1 , 2 , 3 , 3.5 , 4 , 5 , 6 et 7%.
7- Phénodendogramme
Les tests phénotypiques ont été étudiés sur 16 souches. Au total, 59 tests sont
réalisés selon le même protocole que celui décrit au §6.
7-1-Tolérance au sel : La croissance bactérienne est observée sur milieu YEM solide,
additionné de différentes concentration de NaCl : 0 , 0.5 , 1 , 2 , 3 , 3.5 , 4 , 5 , 6 et 7%.
7-2-Tolérance à la température : des boites de Petri contenant du milieu YEM solide
inoculées sont incubées pendant 7 jours à différentes températures : 4, 14, 19, 25, 28, 35, 39,
44, 46 et 50C° pendant 7 jours.
7-3-Croissance sur une gamme croissante de pH : les isolats sont cultivés sur du milieu
YEM solide, dont le pH est ajusté à : 3 , 3.5 , 4.5 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 et 12.
7-4-La résistance intrinsèque aux antibiotiques et aux métaux lourds : ce test est réalisé
dans des boîtes contenant du YEM solide sur lequel sont déposés des filtres stériles imprégnés
des antibiotiques et des métaux lourds suivants: Streptomycine (3 et 120 µg /ml),
Spectinomycine (5 et120 µg /ml), Kanamycine (10 et100 µg/ ml), Chloramphénicol (15 et
67
200 µg/ml), Erythromycine (30 et 66·6 µg /ml), CuCl2.2H2O (100 µg /ml), HgCl2 (5 µg /ml)
et CdCl2.2H2O (20 µg /ml).
Une souche bactérienne est considérée comme résistante si le diamètre de la zone d’inhibition
est supérieur ou égale aux diamètres reportés pour chaque antibiotique selon le NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards-, (2000).
Dans les tests qui suivent, le milieu synthétique (GMS) (Zevenhuizen, 1986) est utilisé
(Annexe 9).
7-5-Hydrolyse de l’urée : Les souches sont ensemencées sur du milieu solide contenant une
solution de sels salins GMS et 1 g/l NH4Cl au lieu du Na glutamate comme source d’azote,
2% d’urée et 0·012% de rouge phénol (Lindström et Lehtomäki, 1988).
7-6-Réduction de nitrates : Les bactéries sont cultivées sur milieu GMS pendant 4 jours,
additionné de 0·1% de KNO3 (Lindström et Lehtomäki, 1988).
7-7-Assimilation des sucres : L’utilisation des différents sucres a été évaluée sur un milieu
solide contenant une solution de sels salins GMS et 1 g/l NH4Cl au lieu du Na-glutamate
comme source d’azote. Du D-glucose, D-galactose, L-arabinose, D-fructose, D-xylose,
sucrose, lactose ou mannitol ont été ajoutés au milieu à une concentration finale de 1g/l. Le
milieu est additionné de bleu de bromophénol qui se colore en jaune lorsque le pH devient
acide (<4.5), ce qui indique l’utilisation des sucres.
7-8-Utilisation des sources d’azote : Le milieu GMS agar dépourvu de sodium glutamate a
été supplémenté par des solutions d’acides aminés stérilisés par filtration à une concentration
finale de 10 mM/L. Les acides aminés testés sont : DL-valine, L-proline, acide L-glutamique,
L-leucine, DL-phénylalanine, DL-serine, DL-tryptophane, L-méthionine et acide Laspartique. Le milieu GMS a été utilisé comme un control positif et le milieu GMS sans
source d’azote comme contrôle négatif.
7-9-Analyse numérique : Les données sont reportées sur Excel et traduites en code binaire: 0
pour une croissance négative et 1 pour une croissance positive. La matrice finale contient 16
isolats et 59 caractères. Le logiciel Statistica (Statistica version 5.1 ; eds 1997 -Annexe D-) est
utilisé pour interpréter les résultats. Les données sont utilisées pour une analyse de groupe
hiérarchique basée sur le carré des distances euclidiennes et une moyenne non pondérée des
groupes associés (Hack et al., 2004).
68
8- Caractérisation génétique des isolats
8-1- Extraction de l’ADN génomique :
Une colonie pure, fraîchement isolée sur milieu gélosé YEMA, est repiquée en masse,
sur milieu YEMA gélosé sur boîte de Petri. Après 48 heures d’incubation, le tapis bactérien
est lavé 2 fois à l’eau distillée stérile et la densité optique est mesurée. A 100 µL de
suspension cellulaire de DO (620nm) = 2, sont ajoutés 100 µL de Tris-HCl (10 mM, pH 8.3)
puis 20 µL de protéinase K à 1 mg/ml d’eau milliQ stérile (Boehringer). Le mélange est mis à
incuber 2 heures à 55°C, puis 10 min dans l’eau bouillante pour dénaturer la protéinase K. Les
tubes sont stockés à –20°C jusqu’à utilisation ultérieure.
Pour les souches très muqueuses, le milieu TY (Annexe 10) est utilisé pour la culture
bactérienne.
NB : Pour certaines souches, quelques colonies étaient suspendues dans 0.5 ml d’eau milliQ
stérile, les suspensions obtenues sont centrifugées à 12000 tours/min puis lavées deux fois à
l’eau milliQ stérile, le culot final étant resuspendu dans 50 µL d’eau miliQ. Les homogénats
sont stockés à -20°C pour une utilisation ultérieure.
8-2- Amplification par PCR :
La PCR (Mullis et Faloona, 1987) a été utilisée pour amplifier l’ADNr
16S.L’amplification est réalisée à partir de 2 µL d’ADN obtenu par traitement à la protéinase
K. Le volume du mélange réactionnel est de 25 µL et contient : 2 µL d’ADN, 5 µL de tampon
de réaction 5X (Gibco), 2 µL de dNTPs chacun à 2.5 mM (Sigma –ALDRICH, Allemagne),
1 µL à 20µM de chacune des deux amorces FGPS6-forward- (5’-GGA GAG TTA GAT CTT
GGC TCA G-3’) et FGPS1509-reverse (5’-AAG GAG GGG ATC CAG CCG CA-3’)
(Biotech AG) (Normand et al., 1992), 0.15 µl de Taq polymérase (Gibco) et 13.85 µL d’eau
milliQ stérile. Un contrôle négatif contenant 2 µL d’eau milliQ stérile au lieu de l’ADN est
inclus dans chaque réaction PCR. L’amplification est réalisée dans un thermocycleur de type
Gene Amp PCR system 2400 (Perkin Elmer, Nieuwerkerk a/d Ijssel, Hollande) avec le
programme suivant :
Un cycle de dénaturation initial à 94°C pendant 5 min; 36 cycles de dénaturation à 94°C
pendant 30 s ; hybridation à 56°C pendant 30 s ; élongation à 72°C pendant 2 min; et une
élongation finale à 72°C pendant 7 min (Figure 15).
69
Nombre de cycles : 36
T° 94°C
T° 94°C
T= 5 min
30 s
T° 72°C
T° 72°C
T° 56 °C
2 min
7 min
T° 20°C
30 s
Figure 15 : Schéma des différents cycles du programme de la PCR utilisé.
Les produits d’amplification sont visualisés par électrophorèse (cuve à électrophorèse
15,5 x 24,5 cm, Easy Cast, Electrophoresis system, Model #B1, OWI Scientific, Inc.) en
prenant 4 µL d’ADN amplifié de chaque souche avec une goutte de bleu de charge (bleu de
bromophénol 0.025 %, glycérol 3 %, EDTA 1 mM) sur un gel d’agarose 1 % (Agarose type
II : Medium EEO, Sigma, Allemagne, 12 x 13 cm) mélangé avec 2 gouttes de Bromure
d’Ethidium (solution à 0.625 mg/ml). La migration se fait dans du tampon TAE 1X (40 mM
Tris-acétate, 1 mM EDTA, pH 8.3). Le gel est photographié (perfect image V-5.3 Clara
Vision). La taille du produit d’amplification attendu varie suivant le gène amplifié.
La totalité de l’amplifiât est visualisé et découpé après migration sur gel d’agarose à
1 % à 100 volts. La bande correspondant à la taille du gène amplifié est découpée et purifiée à
l’aide d’un kit QIAquick Extraction Qiagen (Annexe 11). La quantité de l’ADN éluée est
ensuite évaluée sur un gel de 1% agarose dans du TAE 1X (mêmes conditions de gel que pour
découper les bandes), visuellement en le comparant aux bandes du Smart Ladder. Le Smart
Ladder est un marqueur de poids moléculaire qui sert d’étalon puisqu’il est composé de
fragments d’ADN double-brin linéaires de tailles connues, régulièrement réparties
respectivement entre 100 et 10000 pb. De plus il permet après migration, de quantifier
approximativement la quantité d’ADN déposé en fonction de l’intensité des bandes puisque le
mélange est composé d’une quantité connue de chaque fragment (Annexe 12).
70
8-3- Séquençage partiel de l’ADNr 16S :
L’étude de l’opéron ribosomique (codant pour les ARNr 5S, 16S et 23S) constitue un
outil de choix pour étudier les relations phylogénétiques (Woese, 1987 ; Schleifer et Ludwig,
1989 ; Stackebrandt et Goebel, 1994). Actuellement la plus importante base de données pour
le développement de la classification des BNL (Bactérie Nodulant les Légumineuses) et de
l’ensemble des bactéries est constituée par les séquences du gène codant pour l’ARNr 16S
(Figure 15).
Après l’amplification par PCR du gène codant pour l’ARNr 16S, l’ADN est utilisé (40
à 50 ng) pour une réaction de séquence en utilisant le kit de ABI Prism BigDye Terminator
(Applied Biosystems, Foster City, Calif.). 3 amorces sont utilisées : FGPS6 (5’-GGA GAG
TTA GAT CTT GGC TCA G-3’), FGPS1509 (5’-AAG GAG GGG ATC CAG CCG CA-3’)
et 16S-1080r -reverse- (GGG ACT TAA CCC AAC ATC T) (Sy et al., 2001). La réaction de
séquençage est ensuite analysée dans un séquenceur (Applied Biosystems model 310 DNA
sequencer). Les séquences d’ADN sont obtenues sous forme de pics colorés avec 4 couleurs
différentes correspondant chacune à une base de l’ADN. Elles sont ensuite corrigées à l’aide
de logiciels disponibles sur Internet tels que CLUSTALX ou CHROMAS-Pro et comparées
avec d’autres séquences stockées dans des bases de données GENEBANK.
FGPS6
16S
FGPS 1509
16S-1080r
Figure 16 : Position des amorces internes du gène ADNr 16S utilisés dans la présente étude.
8-4- Construction phylogénétique :
Pour l’exploitation des données de séquences, après corrections, ces dernières sont
comparées avec d’autres séquences stockées dans des bases de données GENEBANK. Cette
recherche est dite par « BLAST », du nom du programme informatique (Altschul et al., 1997)
et se fait via Internet (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast). Le résultat est donné sous forme
d’une liste des 100 séquences les plus proches de celle que l’on a soumises.
71
Les séquences corrigées doivent être ensuite alignées avec celles de souches de référence pour
le même gène. Cet alignement peut être réalisé automatiquement par CLUSTALX et amélioré
manuellement avec « GENDOC software » (Nicholas et al., 1997).
Le fichier d’alignement doit être transféré sous un format reconnaissable par le logiciel
de construction d’arbre phylogénétique. Les formats possibles sont FASTA, NEXUS ou PIR.
Le logiciel de construction d’arbres phylogénétiques utilisé est « MEGA 3.1
software ». La méthode de construction phylogénétique choisie était celle du maximum de
vraisemblance (Maximum-Likelihood) car cette dernière est plus probabiliste : en se basant
sur le taux de substitution pour chaque élément de base (nucléotide pour les séquences
d’ADN) au cours du temps, on estime la vraisemblance de la position et de la longueur des
branches.
En taxonomie actuelle, les méthodes du maximum de vraisemblance permettent une
meilleure optimisation des données de séquences et l’obtention de résultats de phylogénie les
plus robustes. Plusieurs études actuelles de diversité des rhizobia ont utilisé cette méthode
pour la construction d’arbres phylogénétiques (Vinuesa et al., 2005 ; Stepkowski et al., 2003).
72
Chapitre II. Etude expérimentale. Partie I:: Caractérisation des rhizobia. Résultats et discussion
Partie I : Caractérisation des rhizobia
Résultats et discussion
1-Cartographie des Acacias
Les espèces répertoriées lors des prospections sur sites étaient : Acacia
ehrenbergiana, A. seyal, A. tortilis, A. nilotica, A. albida et A. laeta considérées comme
espèces autochtones (Ozenda, 1977) alors que celles introduites étaient: A. farnesiana,
originaire d’Amérique (Berhaut, 1975), A. karroo, originaire d’Afrique du sud (Palmer et
Pitman, 1972) et enfin A. saligna et A. decurrens toutes deux originaires d’Australie
(Chopinet, 1951).
La Figure 17 montre que les espèces sont réparties de la façon suivante : A. karroo,
A. saligna, A. seyal, A. decurrens et A. farnesiana dans le nord ; A. ehrenbergiana et A.
tortilis dans tous les lits d’oueds desséchés du Sud Ouest et six espèces dans la wilaya de
Tamanrasset: A. ehrenbergiana, A. seyal, A. tortilis, A. nilotica, A. albida et A. laeta.
On ne s’est intéressé ni à A. decurrens, ni à A. farnesiana du fait que la première est
rencontrée dans la zone humide d’El-Kala et que la deuxième est une espèce exotique,
plutôt utilisée comme plante d’ornementation (Le Floc’h, 1988).
A. karroo et A. seyal sont très communs au nord où ils servent comme haies
défensives grâce à leurs épines acérées, tandis qu’A. saligna est utilisé surtout dans la
stabilisation des dunes côtières en plus de son emploi dans les espaces verts pour son
intérêt ornemental.
Les Acacias sont quasi-absents dans les hauts plateaux à l’exception de quelques
arbres plantés autour des potagers (Exemple à Labiodh Sidi El-Cheikh dans le potager d’un
des derniers jésuites dans la région). L’introduction d’A. saligna dans cette région où les
températures nocturnes peuvent atteindre -11°C a été un échec car cette espèce ne tolère
pas le gel.
En dehors des palmeraies, les lits d’oueds et vallées sont les seuls milieux où l’on
rencontre véritablement des arbres sous le nom de «steppes arborées» ou «forêts-steppes»
et les vallées sèches à fond limoneux ou caillouteux hébergent des formations d’Acacias.
Nos observations rejoignent celles d’Ozenda (1983) qui attestent de la présence d’A.
seyal ; A. tortilis ; A. arabica (A. nilotica) et A. albida au Sahara central et seulement A.
tortilis au Sahara septentrional. Néanmoins, A. seyal cité dans les travaux d’Ozenda n’était
73
autre qu’A. ehrenbergiana, ces deux espèces ayant été longtemps confondues (Celles et
Manière, 1980).
Dans la wilaya d’Adrar, A. nilotica est rarement rencontré tandis qu’A. albida y est
inexistant, contrairement à la région de Tamanrasset où sont rencontrés un nombre
important d’individus de ces deux espèces. Cette dernière héberge le nombre le plus
important d’Acacias en termes de diversité (Sahki et al., 2004). Outre les deux espèces
citées précédemment, on y rencontre : A. ehrenbergiana, A. seyal, A. tortilis et A. laeta. Il
existe un seul site à Tamanrasset (Oued Taghemsut) hébergeant A. seyal, l’aire de
distribution de cette espèce s’étend vers le sud en direction du Niger, par contre, elle est
introuvable dans tout le reste du sud Algérien.
Le sol algérien semble héberger une diversité intéressante d’espèces d’Acacia d’une
grande rusticité qui survivent dans des conditions pédoclimatiques extrêmes et qu’il serait
bon de réhabiliter et d’introduire dans des programmes de reforestation. L’espèce phare
mise en avant à ce jour est A. tortilis qui est considérée comme espèce protégée (Décret
exécutif n°93/285 du 23 novembre 1993), et les études faites à ce jour prouvent que son
taux de régénération naturelle est en équilibre « fragile » dans la région de la Saoura
(Bensaid et al., 1996). Ceci encourage sa protection et n’empêche pas d’envisager
d’utiliser les autres espèces répertoriées.
Abadllah
Tidikelt
Aoulef
A.tortilis
A.ehrenbergiana
A.seyal.
A.nilotica
A.karroo
A.laeta
A.Albida
A.saligna
Figure 17 : Répartition des Acacias autochtones et introduits en Algérie.
74
2- Caractérisation des sites et sols prospectés :
La position géographique, la description écologique ainsi que les moyennes des
précipitations annuelles et des températures minimales et maximales durant la période
d’échantillonnage de 2004 à 2009 sont reportés dans le Tableau 10. Il est à noter que
presque toutes les régions prospectées dépassent des températures maximales estivales de
40°C, avec un pic avoisinant les 50°C à Adrar et toutes connaissent des températures
négatives hivernales atteignant -5°C, spécialement à Labiod Sidi El Cheikh. La
connaissance des moyennes de température peut influencer les programmes de
reforestation car cela détermine le choix des essences forestières utilisées selon leur
résistance ou non aux températures extrêmes, ainsi, l’introduction d’A. saligna qui ne
supporte pas les gelées par la direction des forêts de Naâma (wilaya limitrophe d’ElBayadh) dans cette région a été un échec. Cependant, ces données ne reflètent pas les
conditions climatiques des lieux des sites d’échantillonnage, sachant que les relevés sont
effectués dans des stations météorologiques à des endroits bien précis. Comme les wilayas
ont des superficies importantes, on peut supposer qu’il y ait des différences de température
à différents endroits. A titre d’exemple, les habitants d’Oran ressentent une différence de
température entre la daïra d’Es-Senia, de Messerghine et d’Oran qui se situent dans la
même wilaya. Cependant, ces observations restent une bonne indication des conditions
climatiques sur les différents sites. Selon la classification des étages bioclimatiques en
Algérie, Oran et Mostaganem font partie des régions semi-arides (pluviométrie entre 300600 mm), M’sila et El Bayadh des régions arides (pluviométrie entre 300-100mm) et enfin
Adrar et Tamanrasset des régions sahariennes (pluviométrie <100mm).
75
Tableau 10 : Description climatique, écologique et situation géographique des sites étudiés.
T° moyenne :
Position
(2004 à 2009)
géographique
Plante hôte
Caractéristiques
Origine
(latitude,
associée
du site
T° min T° maxi
longitude,
°C
°C
altitude)
Sebkha
35°60.806 N,
500M d'une
Messerghine
A. seyal
000°65.746 W, dépression saline
-0,38
40,65
(Oran)
Alt 1640FT
(sebkha)
35°63.874 N,
Couvert végétal
Es-Senia (Oran)
A. seyal
000°61.399 W,
-0,38
40,65
important
Alt 1640FT
35°75.124 N,
Dunes de BomoA. saligna
0°82.921 W,
Dunes costales
-0,38
40,65
plage (Oran)
Alt 1640FT
35°62.144 N,
Forêt de M’sila
A. karroo
000°88.963 W,
Forêt de pin
- 0,38
40,65
(Oran)
Alt 6561FT
35°62.657 N,
Messerghine
Ferme de culture
A. karroo
000°64.905 W,
- 0,38
40,65
(Oran)
céréalière
Alt 3280 FT
35°45.05 N,
Dunes El-Mactaa
A. saligna
000°07.328 W,
Dunes costales
0,06
41,83
(Mostaganem)
Alt 2FT
35°42.980 N,
Khemaissa
Couvert végétal
A. saligna
4°24.535 E,
-2,6
44,71
(M'sila)
important
Alt 500FT
36°48.049 N,
Couvert végétal
Oued Jer (Blida)
A. saligna
2°83.390 E,
ND
ND
important
Alt 2000FT
Labiod Sidi El
32°89.465 N,
Cheikh
A. seyal
000°54.551 E,
Verger
-4,76
38,34
(El Bayadh)
Alt 500FT
27°89.966 N,
Ain Belbel
A. ehrenbergiana
1°16.716 E,
"Forêt" d'Acacia
-0,58
48,96
(Adrar)
Alt 1000FT
A. ehrenbergiana 22°56.004 N,
Oued In Deladg
005°52.851 E, "Forêt" d'Acacia
-1
38,56
A. nilotica
(Tamanrasset)
Alt 4554FT
A. albida
A. ehrenbergiana 22°35.218 N,
Oued Tin
Amezzegin (Tam)
-1
38,56
A. tortilis
Alt 3740FT
35°35.240 N,
Oued Tassena
A. ehrenbergiana 000°48.527 O, "Forêt" d'Acacia
(Tamanrasset)
-1
38,56
Alt 358FT
22°44.543 N,
Tamanrasset
A. tortilis
-1
38,56
Alt 4569FT
27°40N,
Arbres d'Acacias
Tindouf
A. tortilis
008°08 W,
ND
ND
très espacés
Alt 1414 FT
ND : Données non disponibles, FT : feet : pieds, T° : température, Min : minimale, Max : maximale
Moyenne de la
pluviométrie
annuelle
De 2004 à 2009
(mm)
372,3
369,8
369,8
369,8
369,8
369,8
184,8
ND
293,6
26,3
48,16
48,16
48,16
48,16
ND
La conductivité électrique, le pH ainsi que la granulométrie des sols sont reportés
dans le Tableau 11. Les analyses des différents sols prélevés révèlent que la plupart sont à
76
pH alcalin avoisinant 8 et qu’ils sont classés non salés selon l’échelle de Durand (1989);
seuls les sols prélevés de la daïra d’Es-Senia et de la Sebkha d’Oran sont considérés
comme légèrement salé et salé respectivement. Plusieurs types de sols des régions arides
et semi-arides contiennent du CaCO3, et lorsque de tels sols calcaires ont un excès d’ions
Na et un pH élevé ils sont appelés sols alkali et peuvent être peu fertiles (Gupta et Abrol,
1990).
Tableau 11 : Salinité et pH des sols échantillonnés.
Origine
Texture du sol
Sebkha Messerghine (Oran)
Es-Senia (Oran)
Dunes de Bomo-plage (Oran)
Messerghine (Oran)
Forêt de M’sila (Oran)
Dunes El-Mactaa (Mostaganem)
Khemaissa (M'sila)
Oued Jer (Blida)
Labiod Sidi El-Cheikh (El Bayadh)
Ain Belbel (Adrar)
Limoneux
Argileux
Sablonneux
Pierreux, limoneux, sablonneux
Argileux
Sablonneux
Limoneux
Argileux
Argileux, sablonneux
Pierreux, argileux, sablonneux
Pierreux, limoneux, sablonneux (A.
ehrenbergiana)
Limoneux, sablonneux (A. tortilis)
Sablonneux (A. nilotica)
Pierreux, argileux, sablonneux (A.
ehrenbergiana)
Pierreux, limoneux, sablonneux (A.
tortilis)
Oued In Deladg (Tamanrasset)
Oued Tin Amezzegin
(Tamanrasset)
Oued Tassena (Tamanrasset)
Tamanrasset
Oued Tan-Assennane
(Tamanrasset)
Tindouf
NS : non salé ; SS : légèrement salé ; S : salé
1,29
0.6
0,097
0,234
0,14
0,124
0,28
0,29
0,29
0,075
Interprétation
selon l'échelle
de Durand,
1989
S
SS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
0,105
NS
7.70
0,105
0,105
NS
NS
7.70
7.70
0,149
NS
7.80
0,149
NS
7.80
0,078
0,326
NS
NS
8.17
7.69
0,081
NS
7.04
0.440
NS
7.98
Conductivité
électrique du
sol mS/cm2
3- Taux de germination des graines après les différentes méthodes de désinfection et
de scarification
La majorité des graines des différentes espèces ont bien germé après désinfection à
l’hypochlorite de sodium à 16° pendant 10 minutes et à la scarification manuelle, avec au
minimum 95% de germination et même jusqu’à 100% de germination pour A. karroo
(Tableau 12), à l’exception des graines d’A. saligna qui ont mieux germé (75%) à une
concentration de 32° pendant 6 minutes. Cependant avec cette méthode de désinfection on
77
pH du
sol
7.92
7.94
8.17
8,01
8.19
8.16
8.12
8.17
7,79
7.66
note un taux plus au moins élevé de contamination selon la provenance des graines. Pour
des conditions optimales de récolte, les graines doivent provenir de gousses matures
prélevées sur l’arbre. La scarification manuelle donne d’assez bon taux de germination
selon la littérature (Doran et al., 1986) mais ne peut être utilisée que pour des quantités de
graines réduites.
Tableau 12 : Taux de germination des graines de huit espèces d’Acacia selon le mode scarification
(chimique ou manuelle) et en fonction du temps d’immersion.
Scarification manuelle
Espèce
d’Acacia
A. tortilis
A. seyal
A. albida
A. laeta
A. ehrenbergiana
A. nilotica
A. karroo
A. saligna
Scarification chimique
Désinfection à l’hypochlorite de sodium :
Désinfection à l’acide
Provenance
des graines degrés de chlorure/durée d’immersion (minutes) sulfurique à 98% (36N)
INRF
INRF
INRF
INRF
INRF
INRF
Oran
Oran
12°/6min
5%
15%
86%
33%
5%
26%
100%
69%
12°/20min
32%
20%
/
7%
36%
37%
100%
6%
16°/10min
95%
98 %
/
/
95%
98%
100%
69%
32°/6min
42%
31%
90%
35%
44%
50%
100%
75%
20min 60min 120min
/
30%
56%
96 % 34%
/
96%
/
/
/
/
/
90%
/
/
/
/
80%
19% 94% 100%
13% 94% 100%
/ : Absence de germination, INRF : Institut National de Recherche en Foresterie (Tamanrasset).
La scarification à l’acide sulfurique concentré donne différents résultats selon le temps
d’immersion qui est spécifique à chaque espèce. Le taux de germination est de 56% à 120
minutes pour A. tortilis alors qu’il a atteint 95% avec la scarification manuelle. Ce taux de
germination après scarification chimique est faible comparativement aux résultats obtenus
par Danthu (2003) qui a reporté des taux de 96, 97 et 97% après trempage dans du H2SO4
pendant 60, 120 et 240 min respectivement. Par contre, une immersion de 20 minutes dans
de l’acide concentré a donné un taux de germination supérieur à 90% pour A. seyal, A.
albida et A. ehrenbergiana, ce qui rejoint la littérature concernant A. seyal, dont le temps
de trempage est de 20-30 minutes (Lortet et al., 1996) et celui d’A. albida qui est de 20-60
minutes (Doran et al., 1986). Le temps de scarification n’a pas été étudié pour A.
ehrenbergiana. D’un autre côté, A. nilotica a germé à 80% après immersion dans du
H2SO4 pendant 120 minutes en accord avec Nas (1980) qui a donné l’intervalle de 60-120
minutes. Malheureusement, le taux de germination de A. laeta était très faible, surtout avec
la scarification chimique car selon la littérature, son temps d’immersion optimal est de 14
minutes, semblable à A. senegal, donc inférieur à 20 minutes (de Lajudie et al., 1994).
78
Contrairement à la germination d’A. karroo qui était de 100% après 120 minutes
d’immersion, ce qui rejoint les résultats de Mohamed et al., (2000) ; le même résultat est
obtenu pour A. saligna (100% de germination), on note qu’il est plus élevé que celui
obtenu par Shaybany et Rouhani (1976) qui était de 80%. Les graines provenant de ces
deux arbres ne dépassaient pas un an de stockage, ce qui confirme que le temps et les
conditions d’entreposage jouent un rôle important dans le taux de germination.
La scarification est une étape primordiale dans l’utilisation des plantules autant au
laboratoire qu’en pépinière. La levée de la dormance est indispensable pour optimiser la
germination des graines et par le même biais permet d’économiser ces dernières dont le
stock peut être limité, surtout si elles proviennent d’individus rares, ayant un génotype
tolérant des contraintes pédoclimatiques extrêmes.
4- Impact de la profondeur d’échantillonnage dans les lits d’oueds desséchés sur
l’isolement des populations rhizobiennes
Aucune nodosité n’ayant été rencontrée in natura en zone aride, le recours à une
étape intermédiaire de piégeage était indispensable, comme cela l’a été dans de nombreux
travaux qui ont utilisé cette méthode pour mettre en évidence la diversité des populations
rhizobiennes en particulier chez les légumineuses ligneuses (Odee et al., 1997 ; de Lajudie
et al., 1998b ; Diouf et al., 2007). De plus, la sécheresse est un facteur qui limite la
formation de nodosités même si le sol abrite des souches compatibles (Fagg & Allison,
2004). L’abondance de la population rhizobienne est elle-même fortement corrélée à
l’intensité de la nodulation et de la croissance de l’hôte (Thrall et al., 2007), sachant que
les végétaux dans les régions arides ne se développent que lorsque les conditions
favorables sont réunies (Dajoz, 2003 ; Frontier et al., 2004), en outre, ils privilégient le
développement végétal (principalement racinaire) au détriment de la formation nodulaire
qui est friande en énergie (Sprent et Vandamne, 2007).
La profondeur de l’échantillonnage du sol ne semble pas avoir un impact sur
l’abondance de la nodulation (Tableau 13), quoiqu’il y ait un nombre de nodosités
légèrement supérieur obtenus à la profondeur de 40 cm, peut être lié à son humidité
relative (Danso, 1992). L’abondance de la nodulation pourrait également être liée au
phénomène d’érosion, si l’on considère que pendant la période des crues, de grosses
quantités de substrat de sol sont transportées sur des distances importantes, bien que ces
changements d’état du sol soient difficilement estimables, et fluctuent selon sa composition
et des précipitations.
79
Les deux méthodes de piégeage ont réussi majoritairement dans trois sites (Tableau
13). Dans le cas du site Oued Taghemsut, le piégeage en pot était plus fructueux
contrairement au site Oued In Daladg où c’était plutôt l’utilisation des tubes Gibson. On ne
peut pas établir de conclusion générale quant à la meilleure méthode de piégeage, le
meilleur taux de nodulation semble plutôt lié à la bonne homogénéisation de l’échantillon
du sol qu’à la méthodologie elle-même.
On note l’absence de nodosités chez A. albida sur le sol de Oued Tassena
contrairement à celui de Oued In Daladg, ainsi qu’une pauvreté en nodosités chez A. laeta
sur le sol de Oued Tan-Assennane comparativement à celui originaire de Oued Tassena.
Dans le cas de A. nilotica, il y a eu peu de nodosités obtenus en général quelque soit le site.
Le meilleur taux de nodulation est observé chez A. ehrenbergiana suivi d’A. tortilis.
En général, les méthodes d’échantillonnage affectent l’évaluation de la diversité des
rhizobia, autant quantitativement que qualitativement (Bala et Giller, 2001). En ce qui
concerne cette étude, l’utilisation d’une dilution de 10-1 de sol a été fructueuse, sans les
complications de contaminations fongiques souvent rencontrées (Alberton et al., 2005),
ceci pourrait s’expliquer par la nature aride du site de prélèvement contrairement aux zones
tropicales. Cependant, il semble qu’une faible dilution privilégie les souches les plus
compétitives, alors qu’une forte dilution favorise la révélation d’une plus grande diversité,
dans le sens où les souches les moins compétitives peuvent induire la formation de
nodosités sans être entravées par les plus compétitives qui sont moins nombreuses (Bala et
al., 2001).
La dilution choisie dépend du but recherché par l’échantillonnage, on peut
s’intéresser à la diversité des populations rhizobiennes, ou bien alors on cible les rhizobia
les plus compétitifs et efficients qui seront utilisés pour une amélioration du rendement
ainsi qu’une meilleure survie au champ après le transfert des plants inoculés.
Quant à la forme et la croissance des nodosités, elles variaient de déterminées à
indéterminées quelque soit l’espèce et le site prospecté, alors que les nodosités des
légumineuses ligneuses, en particulier les Acacias ont une croissance indéterminée et sont
ligneuses (Dommergues et al., 1999).
80
Tableau 13: Résultats du taux de nodulation du piégeage sur tubes Gibson et dans les pots.
Site d'échantillonnage
Espèce hôte
A. albida
A. tortilis
Oued Tassena
(Tamanrasset)
A. leata
A.
ehrenbergiana
A.
ehrenbergiana
Oued Tin Amezzegin
(Tamanrasset)
A. nilotica
A. tortilis
Oued Idekel
(Tamanrasset)
A. nilotica
Oued Tan-Assennane
(Tamanrasset)
A. leata
A. albida
Oued In Daladg
(Tamanrasset)
A.
ehrenbergiana
A. nilotica
Profondeur
du sol
Nombre de
plants nodulés/4
Tubes Gibson
Nombre de
nodosités dans les
pots
20 cm
40 cm
60 cm
20 cm
40 cm
60 cm
20 cm
40 cm
60 cm
20 cm
40 cm
60 cm
20 cm
40 cm
60 cm
0
0
0
2
4
4
3
3
2
2
4
3
3
4
4
0
0
0
1
5
7
0
0
14
0
4
5
1
0
3
20 cm
2
0
40 cm
60 cm
20 cm
40 cm
60 cm
20 cm
40 cm
60 cm
20 cm
40 cm
60 cm
20 cm
40 cm
0
1
3
4
3
0
0
1
0
2
1
1
2
0
0
4
4
5
0
2
0
2
0
0
0
0
60 cm
20 cm
40 cm
60 cm
20 cm
40 cm
60 cm
2
4
2
3
0
2
2
0
0
0
0
0
0
0
81
Tableau 13 (suite): Résultats du taux de nodulation du piégeage sur tubes Gibson et dans les pots.
Site
d'échantillonnage
Oued In Tounin
Tassekra
(Tamanrasset)
Espèce hôte
Profondeur
du sol
A. tortilis
20 cm
40 cm
60 cm
A.
ehrenbergiana
A. seyal
Oued Taghemsut
(Tamanrasset)
A. seyal
A. tortilis
A. nilotica
A.
ehrenbergiana
Ain Belbel (Aoulef,
Adrar)
A.
ehrenbergiana
A. tortilis
Nombre de
plants
nodulés/4 Nombre de nodosité dans les pots
Tubes
Gibson
0
0
1
4
1
3
20 cm
2
4
40 cm
60 cm
20 cm
40 cm
60 cm
20 cm
40 cm
60 cm
20 cm
40 cm
60 cm
20 cm
40 cm
20 cm
40 cm
20 cm
40 cm
20 cm
40 cm
3
3
0
2
0
0
0
1
0
0
0
0
0
2
2
3
2
0
0
3
5
3
5
4
3
3
7
2
3
2
NF
NF
NF
NF
NF
NF
NF
NF
0: Pas de nodosités ; NF : Non fait
5- Isolement, purification et statut symbiotique des souches
Une totalité de 288 isolats ont été obtenus à partir de nodosités récoltés in situ ou
après piégeage: 61 associés à A. ehrenbergiana, 55 à A. saligna, 44 à A. seyal, 37 à A.
tortilis, 36 à A. karroo, 29 à A. nilotica, 16 à A. laeta et 10 à A. albida. La distribution des
isolats par espèce et par site géographique est illustrée dans le Tableau 14. Le nombre de
souches par site n’est pas homogène, malgré une large couverture des sites arides et semiarides, cela étant dû au fait que pour certaines zones de prospection, la quantité de sol
prélevé était insuffisante pour des piégeages à répétition et que le nombre de nodosités
obtenues était faible.
82
Tableau 14: Nombre d’isolats par espèce d’Acacia et par site prospecté.
Sites prospectés
Climat
100M de la sebkha de
Semi aride
Messerghine -Oran
Semi aride
Es-Senia -Oran
Dunes de Bomo-plage Semi-aride
Oran
Ferme de Messerghine Oran
Semi aride
Forêt de M’sila -Oran
Semi aride
Dune d'El MactaaZone côtière:
Mostaganem
méditerranéen
sec
Madagh -Oran
Aride
Khemais -Relizane
Semi aride
Oued Djer -Blida
Aride
Ain Defla
Verger (Labiod Sidi El
Aride
Cheikh) -El BayadhHauts plateaux
Ain Belbel (Aoulef-Adrar Aride
Aride
Oued In Deladg (Tam)
Oued Tin Amezzejin
Aride
(Tam)
Aride
Oued Tassena (Tam)
Aride
Potager (Tam)
Aride
Oued Idekel (Tam)
Oued Tan-Assennane
Aride
(Tam)
Oued (In Tounin)
Aride
Tassekra (Tam)
Oued Taghemsut (Tam)* Aride
Aride
Tindouf
Aride
Bechar
*: seul site avec A.seyal, Tam : Tamanrasset
Nombre d’isolats
A.
A.
A.
A.
A.
karroo saligna seyal tortilis ehrenbergiana
A.
laeta
A.
A.
albida nilotica
20
2
1
37
13
16
16
2
1
4
1
4
1
14
15
12
7
19
12
3
10
18
7
12
2
4
1
10
18
2
2
En général, l’abondance des rhizobia est corrélée négativement avec certains
facteurs pédologiques incluant l’azote et positivement avec le carbone organique et les
capacités d’échange cationique (Thrall et al., 2007), ce qui pourrait expliquer l’abondance
de la nodulation dans des sols provenant de certains endroits comme pour A. albida à Oued
In Daladg contrairement à Oued Tassena. L’abondance rhizobienne dans ces sols est aussi
fortement corrélée aux variations dans la nodulation et la croissance de l’hôte (Thrall et al.,
2007), alors comme cela a été évoqué dans le paragraphe §4, la nodulation est un
phénomène qui se produit sous certaines conditions en zones arides où la plante favorise
d’abord son développement végétal au dépend de la formation coûteuse en énergie de
nouveaux organes comme les nodosités.
83
2
La majorité des souches purifiées présentaient une couleur blanchâtre, crème ou
transparente, un aspect muqueux, quelques fois marbré (Figure 18). Les colonies isolées
avaient un contour régulier et étaient plus au moins bombées, de plus elles étaient sans
odeur et sans pigments. Sous microscopie, elles se présentaient sous forme de
coccobacilles ou de bâtonnets Gram négatif (Figure 19), ce qui est en accord avec les
caractères morphologiques et microscopiques déjà décrits pour les rhizobia dans la
littérature (Dommergues et Mangenot, 1970 ; Jordan et Allen, 1974). Les souches à
croissance lente présentaient un aspect plus « sec », les colonies étaient plus petites après
un temps d’incubation de 3 jours.
1µm
Figure 18 : Aspect macroscopique de la
souche SE2 après 48h d’incubation à 28°C.
Figure 19 : Aspect macroscopique de la
souche SE2 au grossissement X1000.
Cependant pour confirmer leur statut de BNL, les souches doivent renoduler leur
plante hôte, alors que cette condition n’a été remplie que par 83 souches, ce qui constitue le
quart des isolats listés dan le Tableau 15. Dans un premier temps les plantes inoculées ont
été comparées globalement aux plantes témoins : la hauteur, le développement général et la
couleur. Les souches considérées infectives (I) ont initié la formation de nodosités mais les
plantes inoculées ne présentaient aucune différence de croissance comparativement aux
témoins non inoculés contrairement aux souches considérées comme efficientes (E) qui ont
induit une croissance plus importante des parties aériennes. Le nombre de nodosités a été
reporté ainsi que leur aspect morphologique (Tableau 15). Elles se présentaient sous une
forme déterminée (ronde) ou indéterminée (allongée) et leur couleur variait de rose à
blanche et était même noirâtre. La forme indéterminée est caractérisée par un méristème
apical persistant tandis que la forme déterminée en est dépourvue, la première est allongée
car de nouvelles cellules sont constamment ajoutées à l’extrémité distale du nodule tandis
84
que la deuxième est arrondie du fait que les cellules s’élargissent et que leur division cesse
tôt (Hirch, 1991). D’après Allen et Allen (1981), les légumineuses ligneuses possèdent
généralement des nodosités indéterminées chez les Mimosoideae tandis que les nodosités
formées sur les racines des différents plants testés étaient déterminés et indéterminés, ceci
pourrait peut être s’expliquer par le fait que le méristème apical persistant n’est pas
facilement détectable chez les Acacias (Räsänen, 2002). La couleur rose révélant la
présence de leghémoglobine, un pigment transporteur d’oxygène et élément indispensable
à l’activité de la nitrogénase, semble être indicatrice de l’efficience du nodule (Kaminski et
al., 1998).
Les résultats du Tableau 15 démontrent qu’environ 56% des souches renodulantes
sont efficientes, améliorent nettement la masse de feuillage et sa couleur. Cette première
estimation étant légèrement subjective, les souches fixatrices seront retestées sous les
mêmes conditions en quantifiant le poids sec, le nombre et le poids des nodosités. Cela
permettra de mettre en évidence les souches les plus performantes, résultats §9, pp 108.
Notons que l’efficience est un critère majeur dans le choix de souches de rhizobia
utilisables dans le cadre de programmes de reforestation, cependant, l’étude de la
biodiversité des souches renodulantes associées aux Acacias reste de mise.
Le phénomène de la non-renodulation observé chez les 2/3 des souches purifiées
dans cette étude peut être expliqué par le fait que ces dernières ont pu perdu leur
information symbiotique notamment leurs gènes nod, durant la symbiose ou après des
repiquages successifs sur des milieux artificiels (Macharet, 1997). Il se peut également que
lors des purifications, les souches endophytes naturellement présentes dans les nodosités
(Rosenblueth et Martinez-Romero, 2006 ; Lin et al., 2008) aient été isolées au dépend de
souches de rhizobia nodulantes coexistantes. A noter que certaines souches non
renodulantes ont quand même permis l’amélioration de la croissance végétale
comparativement aux plantes non inoculées, présentant un effet PGPR (Plant Growth
Promoting Rhizobacteria) notable, comme c’est le cas de la souche SAB3 (Figure 20).
85
Tableau 15 : Liste des souches renodulantes, leur statut symbiotique et aspects des nodosités.
Souches
SE21a
SE21b
SE23bc
SE24a
SE24c
SE25a
SE25d
SE3
SE2
SAO2B
SABS
SABN1
SAB3*
SAB4a
SAB4b
SAB4c
SAB4
SAB5
SAB7
SAB9
SAB10
SAB11
SAB12b
SAB13
SAB8a
SAB8b
SAB15a
SAB15b
SAB17a
SAB17b
SABN1a
SABN1b
SABN1c
SABN2a
SABN2c
SABN4a
SABN4b
SABN5b
KHB
K31
K32a
K32c
K33b
K34a
Plante hôte
Origine
A. seyal
100M de la sebkha de Messerghine
(Oran)
A. seyal
Es-Senia (Oran)
A. saligna
Dunes de Bomo-plage (Oran)
A. karroo
A. karroo
Ferme de Messerghine
86
Statut
symbiotique
E
E
E
E
E
E
E
E
E
I
I
I
E
E
E
E
I
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
E
I
I
I
I
E
Nombre
moyen des
nodosités
3
4
6
8
3
3
4
2
1
1
1
1
0
7
3
3
/
4
3
7
8
5
/
3
6
13
2
3
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
6
3
2
5
5
3
Aspect des
nodosités
Bl Det
Bl Det
Bl Det
Bl Indet
Bl Det
Bl Det
Bl Det
RS Det
RS Indet
RS Indet
Bl Indet
Bl Indet
/
RS Det
Bl Det
RS Det
/
RS Det
RS Indet
RS Det
RS Det
RS Det
/
Rs indet
RS Det
RS Det
Bl Det
Bl Det
Bl Det
Bl Det
Bl Det
Bl Det
Bl Det
Bl Det
Bl Det
Bl Det
Bl Det
Bl Det
RS et Bl Indet
Bl Det
RS Det
RS Det
Bl Det
Bl Det
Tableau 15 (suite) : Liste des souches renodulantes, leur statut symbiotique et aspects des nodosités.
Souches
K1a
K1b
K2b
K2d
K4a
K4c
SA13b
SA14b
SA15b
KHML
KHMR
SAKS
KOH
KO1
SAAIS
SE243a
SE243b
SE243c
SE243d
Plante hôte
Origine
A. karroo
Forêt de M’sila
A. saligna
Dune d'El Mactaa (Mostaganem)
A. karroo
Madagh –Oran
A. saligna
Khemais (Relizane)
A. karroo
Oued Jer (Blida)
A. saligna
Ain Defla
A. seyal
Labiod Sidi El Cheikh (El Bayadh)
E231a
E231b
E231c
E232
N145
E134ab
E134b
E128Eb
A121
E60
E45
E39
E42
E47
T80
T18
E86
N8
N81
T82
T120
A. ehrenbergiana
Ain Belbel (Adrar)
A. nilotica
A. ehrenbergiana
Oued In Daladg (Tamanrasset)
A. albida
A. ehrenbergiana Oued Tin Amezzegin (Tamanrasset)
A. ehrenbergiana
Oued Tassena (Tamanrasset)
A. tortilis
A. ehrenbergiana
A. nilotica
A. tortilis
A. tortilis
E
E
I
E
I
I
E
E
E
E
I
E
I
E
E
E
E
E
E
Nombre
moyen des
nodosités
6
3
6
9
5
2
12
8
6
1
3
2
1
1
2
4
5
12
8
I
3
Statut
symbiotique
Djenen ben Mbarek (Tamanrasset)
Tindouf
Tamanrasset
Aspect des
nodosités
RS Indet
Bl Det
RS Det
RS Indet
RS Det
Bl Indet
RS Det
RS Det
RS Det
RS Indet
Bl Indet
RS Indet
Bl Det
RS Indet
RS Indet
Bl Det
Bl Det
Bl Indet
Bl Indet
Bl Det
E
5
Bl Det
E
I
I
E
E
I
E
I
I
I
I
I
14
1
1
4
11
4
1
3
3
2
2
2
Bl Det
Bl Det
Bl Det
RS Det
RS Det
RS Det
RS Det
Bl Indet
RS Det
Bl Det
Bl Det
Bl Det
I
2
Bl Det
E
I
I
I
I
I
1
1
2
2
3
2
Bl Indet
Bl Det
RS Indet
RS Indet
RS Indet
/
E : efficient, I : infectif ;RS : rose ; Bl : blanche ; Det : déterminé ; Indet :indéterminé ; / :Non reportés.
*SAB3 montre un effet PGPR important et a été gardée dans le Tableau des souches renodulantes, afin de l’inclure dans les
différentes analyses et caractérisation par séquençage partiel du 16s-ADN (Figure 20)
87
Témoin
03 plants inoculés avec SAB3 sans nodosités
Figure 20 : Effet PGPR (Plant Growth Promoting) de la souche SAB3.
6- Caractérisation génétique par séquençage partiel du 16S rARN
En plus des caractères morphologiques, microscopiques et le test de nodulation, le
séquençage du gène 16S-rARN a été effectué sur 60 souches choisies en fonction de
l’aspect macroscopique des colonies sur boîtes de Petri. Ce dernier critère est recommandé
généralement pour le typage et l’identification des bactéries au niveau spécifique et
générique (Gürtler et Stanisich, 1996 ; Vandamme et al., 1999). Pour mieux discuter des
résultats phénotypiques, la caractérisation moléculaire basée sur le séquençage partiel du
16S rARN est présentée ici en premier. Le résultat du BLAST (Basic Local Alignment
Search Tool) des séquences (Tableau 16) a révélé une grande diversité génétique ente les
différentes souches isolées avec une homologie toujours ≥98%. Les souches isolées
appartiennent aux 9 genres suivants: Rhizobium, Ochrobactrum, Agrobacterium, Ensifer,
Phyllobacterium, Mesorhizobium, Devosia, Bradyrhizobia et Burkholderia.
Sur la base des résultats du BLAST, les souches renodulant A. seyal appartiennent aux
espèces : Rhizobium leguminosarum bv. trifolii (4 souches) et bv.viciae (1), Rhizobium sp.
(3), Ochrobactrum sp. (2), montrant ainsi une prépondérance de Rhizobium. Celles
associées à A. saligna se rapprochent pour la plupart aux souches à croissance lente de
Bradyrhizobium sp. (10) et pour le reste des souches à croissance rapide de Rhizobium sp.
(6), Ensifer sp. (3), Mesorhizobium sp. (1), Phyllobacterium sp. (1), Devosia neptuniae (1)
et Agrobacterium tumefaciens (1), ainsi qu’à des souches bactériennes indéterminées
(quatre Uncultured bacteriu et une Uncultured alpha-proteobacterium). Quant à A.
ehrenbergiana, les souches qui lui sont associées sont affiliées à Ensifer terangae (1) et
88
Ensifer sp. (1), Mesorhizobium sp. (1), Burkholderia cepacia (1) et Devosia
yakushimanensis
(1)
ainsi
qu’une
souche
indéterminée
(Uncultured
alpha
proteobacterium). Concernant A. karroo, les souches associées sont classées comme
Ensifer meliloti (5) et E. fredii (1) ainsi que Rhizobium leguminosarum bv. trifolii (5). Les
souches isolées de nodosités d’A. tortilis et renodulantes sont Ensifer sp. (1) ; Burkholderia
cenocepacia (1) et Agrobacterium tumefaciens (1), celle isolée de A. nilotica se
rapprochant plutôt de Rhizobium sp. tandis qu’A. albida est associé à Mesorhizobium sp.
89
Tableau 16 : Comparaison des séquences obtenues par séquençage partiel du gène 16S rARN avec les
séquences de référence de la base de données Genbank du site NCBI.
Souches
Plante hôte
Résultat du BLAST du séquençage partiel du 16S
rARN à partir de la base de données NCBI
(National Center for Biotechnology Information)
genbank
% de similitude
SE21a
R. leguminosarum bv. trifolii
99
SE21b
SE23bc
SE24a
SE25a
SE25d
SE3
SE243a
R. leguminosarum bv. viciae
Rhizobium sp.
Rhizobium sp.
Ochrobactrum sp.
99
99
99
99
99
99
99
SE243c
Rhizobium sp.
99
SE243d
SAB3
SAB5
SAB9
SAB10
SAB11
SAB12b
Ochrobactrum sp.
Rhizobium sp.
Rhizobium sp.
Rhizobium sp.
Mesorhizobium sp.
Devosia neptuniae
Rhizobium sp.
99
99
99
99
99
99
100
SAB13
Ensifer sp.
100
SAB4a
Uncultured bacterium clone KPF200711-118
99
SAB4b
99
SAB8a
99
SAB8b
99
SAB15a
Phyllobacterium sp.
97
SAB15b
Rhizobium sp.
100
Ensifer sp.
100
SABN1a
Bradyrhizobium sp.
98
SABN1b
Bradyrhizobium sp.
99
SABN1c
Bradyrhizobium sp.
99
SABN2a
Bradyrhizobium sp.
98
SABN2c
Bradyrhizobium sp.
99
SABN4a
Bradyrhizobium sp.
SABN4b
Bradyrhizobium sp.
98
98
SABN5a
SAB17b
Bradyrhizobium sp.
Ensifer sp.
SAB17a
A. seyal
A. saligna
98
99
SA13b
Bradyrhizobium sp.
99
SA14b
Uncultured alpha proteobacterium
99
SA15d
Bradyrhizobium sp.
100
SAKS
Agrobacterium tumefaciens
99
SAAIS
Rhizobium sp.
99
90
Tableau 16 (suite) : Comparaisons des séquences obtenues par séquençage partiel du gène 16S rARN
avec les séquences de référence de la base de données Genbank du site NCBI.
K31
Rhizobium leguminosarum bv. trifolii
99
K32a
99
K32c
100
K33b
99
K34a
99
Ensifer meliloti
99
K1b
Ensifer meliloti
99
K2b
Ensifer meliloti
99
K2d
Ensifer fredii
100
K4a
Ensifer meliloti
99
K4c
Ensifer meliloti
99
K1a
A. karroo
N145
A. nilotica
Rhizobium sp.
99
A121
A. albida
Mesorhizobium sp.
99
E231a
Mesorhizobium sp.
99
E231b
Burkholderia cepacia
99
Ensifer sp.
99
E231c
A. ehrenbergiana
E134ab
Devosia yakushimanensis
98
E60
Ensifer terangae
99
E42
Uncultured alpha proteobacterium
99
T18
A. tortilis
Burkholderia cenocepacia
99
T82
T120
A. tortilis
Ensifer sp.
Agrobacterium tumefaciens
99
99
Pour élucider la position taxonomique des souches, les séquences alignées de ces
dernières ont été comparées à des espèces reconnues de BNL, d’Agrobacterium et d’autres
espèces phylogénétiquement proches, symbiotiques et non symbiotiques. On peut
distinguer 10 groupes bien distincts dans l’arbre de l’ARNr 16S obtenu (Figure 21) :
- Le premier groupe proche de Rhizobium comporte 18 souches : 10 d’entres elles sont
proches de R. leguminosarum : 5 isolées d’A. seyal (SE21a, SE23bc, SE24a, SE25a et
SE25d) et 5 d’A. karroo (K31, K32a, K32c, K33b et K34a). Il se détache de ce groupe la
souche SE21b associée à A. seyal avec un bootstrap de 87%. Notons qu’A. seyal est
généralement associé à Mesorhizobium plurifarium (de Lajudie et al., 1998b; Diouf et al.,
2007), à Ensifer sp. (Diouf et al., 2007), à E. saheli bv acaciae et E. fredii (Wolde-Meskel
et al., 2005) et à E. terangae (Diouf et al., 2007), sauf en Ethiopie où A. seyal a été décrit
comme étant associé à R. etli (Wolde-Meskel et al., 2005). En revanche, A. karroo, a été
rapporté comme étant associé symbiotiquement avec Rhizobium tropici au Kenya (Mac
Inroy et al., 1999) mais jamais avec R. leguminosarum. Les deux autres souches restantes
91
dans ce groupe sont SAAIS qui est associée à A. saligna et SE3 associée à A. seyal, la
première groupant avec R. tropici, comme décrit par Nada et al. (1999) et Amrani et al.
(2010), la seconde groupant avec Rhizobium sullae, cette affiliation différant de celles
observées chez A. seyal dans les études précédentes. Un sous-groupe fort (bootstrap à
99%) se détache de l’ensemble, incluant 5 souches associées à A. saligna isolées de Bomo
plage –Oran- (SAB15b, SAB5, SAB12b, SAB3 et SAB9). Afin de préciser la position
taxonomique de ce dernier groupe, le séquençage de gènes de ménage s’avère nécessaire.
- Le deuxième groupe comprend deux souches isolées d’A. seyal en provenance de Labiod
Sidi El Cheikh qui sont phylogénétiquement proches d’Ochrobactrum et groupées
séparément (Bootstrap 99%) des 3 souches d’Ochrobactrum renodulantes, à savoir :
O. lupini, O. cytisi et O. ciceri (Trujillo et al., 2006 ; Zurdo-Pinero et al., 2007 et Imran et
al., 2010). Ces souches SE243d et SE243a des régions arides de Labiod Sidi El-Cheikh,
sont hautement efficientes (Tableau 13). Une seule étude à ce jour, menée chez A.
mangium et A. albida, a prouvé la capacité d’Ochrobactrum à renoduler et fixer l’azote
chez des légumineuses arborées (Ngom et al., 2004).
- Le troisième groupe est proche d’Agrobacterium et compte 5 souches. Cependant, il
existe une grande disparité à l’intérieur même du clade, deux souches se détachant
d’Agrobacterium tumafeciens et A. radiobater, SE243C et T120 précisément, qui sont
associées à A. seyal et A. tortilis respectivement, et qui pour la première a été classée après
BLAST comme Rhizobium sp et évaluée comme efficiente (Tableau 13). Différentes
études de taxonomie des BNL (Bactéries Nodulant les Légumineuses) associées aux
Acacias ont déjà mis en évidence la présence d’Agrobacterium dans les nodosités (de
Lajudie et al., 1999; Khbaya et al., 1998). Cependant, ils formaient des nodules
inefficients, comme pour Agrobacterium tumafeciens associé à A. seyal (Diouf et al, 2007),
tandis que d’autres au contraire ne renodulaient pas du tout (Odee et al., 2002). Dans ce
groupe proche d’Agrobacterium se détache également la souche SA14b associée à A.
saligna et efficiente (Tableau 13), de même qu’un sous-groupe de deux souches, N145 et
E42, associées à A. nilotica et A. ehrenbergiana respectivement. Ces trois dernières
souches très proches (bootstrap 98 et 96%) sont groupées entre A. rubi et A. vitis. A noter
que N145 a été aussi classée comme Rhizobium sp. après BLAST (Tableau 13). Il ressort
de ces observations que le séquençage partiel ne permet pas une affiliation optimale des
souches nouvellement isolées et que l’analyse de la séquence complète du 16S, ainsi que
d’autres séquences comme celles de gènes de ménage, donnerait une position taxonomique
plus précise, d’autant que le groupe des rhizobia et des agrobacteria est considéré comme
92
étant monophylétique et dont les positions taxonomiques font l’objet de travaux et de
réflexions approfondis (Young et al., 2001 ; Sawada et al., 2003 ; Farrand et al., 2003).
Les uns militent pour renommer tous les agrobacteria en rhizobia tandis que les autres
refusent de grouper ensemble des bactéries symbiotiques fixatrices d’azote et des bactéries
pathogènes. De plus, il ressort des différentes études effectuées sur les Agrobacterium que
ces derniers sont très réceptifs au transfert latéral des gènes de nodulation, ce qui pourrait
expliquer leur capacité à réinfecter leur plante hôte (de Lajudie et al., 1999 ; Martinez et
al., 1987). Cet arbre phylogénétique démontre aussi que R. giardinii n’a aucune
appartenance stable avec l’un ou l’autre des groupes de Rhizobium ou d’Agrobacterium, ce
qui rejoint ce qui a été déjà évoqué par Young et al. (2001).
- Le quatrième groupe est proche d’Ensifer et englobe 13 souches. Le sous-groupe le plus
important incluant E. meliloti comporte 9 souches : SAB13, SAB17a et SAB17b associées
à A. saligna, ce qui est en accord avec les résultats de Amrani et al. (2010). K1a, K2b et
K4a sont associées à A. karroo, leur affiliation à E. meliloti diffèrant de ce qui a été
mentionné chez cette espèce d’Acacia au Maroc où les souches qui leur étaient associées
étaient groupées avec E. fredii et Ensifer sp. (Khbaya et al., 1998) ainsi qu’au Sénégal où
elles étaient proches de E. terangae biovar acaciae (de Lajudie et al., 1994). La septième
souche est E231c associée à A. ehrenbergiana, alors que les deux dernières K1b et K4c,
toutes deux associées à A. karroo se détachent de l’ensemble et forment un groupe à part,
ceci pouvant être dû à leur longueur de séquence trop courte. Plus haut dans l’arbre
phylogénétique, la souche E60 isolée des nodosités d’A. ehrenbergiana est proche de
E. terangae, alors que SAKS isolée d’A. saligna rejoint Ensifer kostiense. Il faut noter
que cette dernière rejoint Agrobacterium après BLAST (Tableau 13), et que le seul Acacia
qui soit associé à cette espèce bactérienne (Ensifer kostiense) est A. senegal (Nick et al.,
1999b). La souche T8 associée à A. tortilis se détache de la branche d’Ensifer kostiense.
Les rhizobia du groupe Ensifer associés à A. tortilis sont généralement caractérisés comme
E. fredii, E. medicae et E. saheli bv acaciae en Ethiopie (Wolde-meskel et al., 2005),
E. terangae bv acaciae (Ba et al., 2002) et E. meliloti en Tunisie et au Maroc (Ben
Romdhane et al., 2006; Khbaya et al., 1998).
La souche K2d isolée des nodosités
d’A. karroo est proche de E. fredii qui n’était décrit jusqu’alors qu’associé à A. nilotica A.
seyal, A. tortilis; A. salicina et A. stenophylla (Mc lnroy et al., 1999; Wolde-Meskel et al.,
2005; Hoque et al., 2011).
Une seule souche SAB15a isolée d’A. saligna fait partie du cinquième groupe des
Phyllobacterium, proche de P. bourgognense. Ce groupe pourrait être rattaché au groupe
93
des Mesorhizobium (Young et al., 2001) mais ils sont suffisamment distincts pour les
séparer (bootstrap 99%). Cette souche isolée de Bomo plage –Oran- forme des nodules
effectifs (Tableau 13). Les mêmes résultats ont été signalés par Van Veen et al. (1988) qui
a rapporté la formation de nodosités racinaires chez Vicia sativa par Phylobacterium
myrsinacearum après l’introduction du plasmide symbiotique (pSym) de Rhizobium
leguminosarum, indiquant que le gène chromosomal impliqué dans la formation nodulaire
est fonctionnellement présent chez la bactérie. D’autres chercheurs (Valverde et al., 2005)
ont récemment isolé une souche de Phyllobacterium qui forme des nodosités infectives sur
les racines de Trifolium pratense et Lupinus albus, ainsi que chez une légumineuse
ligneuse Dalbergia sp. à Madagascar (Rasolomampianina et al., 2005) et chez A. saligna
en Australie (Hoque et al., 2011).
- Le sixième groupe proche de Mesorhizobium renferme trois souches : SAB10 associée à
A. saligna qui est groupée avec Mesorhizobium mediterraneum et deux souches très
proches (bootstrap 99%) A121 et E231a associées à A. albida et A. ehrenbergiana
respectivement et qui sont groupées séparément des souches de Mesorhizobium de
référence utilisées. Le genre Mesorhizobium a prouvé sa capacité à renoduler A. saligna
(Amrani et al., 2010 ; Lafay et al. 2001), A. ehrenbergiana (Noureddine et al., 2010) et A.
albida (Odee et al., 2002) mais les souches correspondantes n’ont pas été isolées
directement à partir des nodosités de ces arbres sauf chez M. amorphae associée à A.
saligna (Rodríguez-Echeverría et al., 2011).
- Le septième groupe incluant Devosia comporte deux souches : SAB11, efficiente et
associée à A. saligna groupe avec le seule espèce de ce genre nodulant une légumineuse
aquatique : Devosia neptuniae (Rivas et al., 2003) et une autre souche à part, E134c
associée à A. ehrenbergiana efficiente elle aussi (Tableau 13). Les deux sites
d’échantillonnage sont très éloignés et contrastés, l’un étant situé sur des dunes côtières à
proximité d’Oran et l’autre sur un lit d’oued desséché, l’Oued In Deladg à Tamanrasset.
Des souches associées à A. saligna en Australie ont aussi été caractérisées comme Devosia
neptuniae (Hoque et al., 2011).
- Le huitième groupe incluant le genre Bradyrhizobium comporte exclusivement des
souches isolées d’A. saligna : SABN5a groupe avec B. elkanii alors qu’au Kenya,
A. saligna avait été décrit comme associé à B. liaoningense (Wolde-Meskel et al., 2005) et
en Australie à B. canariense (Rodríguez-Echeverría et al., 2011). Dans cet arbre, neuf
souches sont proches de B. betae. Ces résultats rejoignent ceux rapportés dans la littérature
qui montrent qu’A. saligna peut être nodulé à la fois par des rhizobia à croissance lente et à
94
croissance rapide avec une prédominance de ceux à croissance lente (Barnet et Catt, 1991;
Marsudi et al., 1999; Nada et al., 1999). Ces auteurs ont conclu que les souches isolées
des régions arides étaient à croissance rapide et qu’à l’opposé, celles isolées des régions
humides étaient plutôt à croissance lente. Plus précisément, Barnet et Catt (1991) ont
conclu que la proportion des souches rhizobiennes à croissance rapide était corrélée avec la
sévérité des conditions de dessiccation, de chaleur et de pauvreté en apports organiques.
Cette hypothèse pourrait expliquer la différence de populations entre les deux sites de
Bomo-plage (Oran) où prédominent les Rhizobium et Ensifer et d’El Mactaa
(Mostaganem) où sont rencontrés majoritairement les Bradyrhizobium. En effet, bien que
les deux sites soient localisés sur des dunes côtières, elles diffèrent au niveau édaphoclimatique avec une température plus élevée et un sol plus pauvre en éléments minéraux à
Bomo-plage par rapport à El Mactaa (Tableau 12). Amrani et al. (2010) ont également
isolé plusieurs souches de B. betae chez A. saligna mais n’étaient pas majoritaires comme
dans notre étude. Cette espèce bactérienne a été initialement isolée de racines de Beta
vulgaris, une betterave sucrière affectée par des déformations tumorales, mais aucune
souche ne possédait de gènes NodD ou NifH ni était considérée comme renodulante (Rivas
et al., 2004). A l’inverse, les souches isolées dans le cadre de ce travail étaient capables de
renoduler. Deux hypothèses peuvent être avancées: La première est que le séquençage
partiel du gène 16S rARN n’était pas bien adapté à une étude taxonomique des
Bradyrhizobium, certaines souches ayant des divergences de séquences de l’ordre de 0.1–
2.0% pour ce gène (Willems, 2006), et de ce fait peuvent ne pas appartenir à cette espèce.
Deuxièmement, ces souches peuvent être des souches renodulantes de B. betae, propriété
acquise après un transfert latéral des gènes de nodulation d’autres rhizobia (Amrani et al.,
2010).
- Le neuvième groupe proche de Burkholderia englobe deux souches : E231 et T18
associées à A. ehrenbergiana et A. tortilis respectivement qui sont groupées avec
B. cepacia. Des travaux de caractérisation de souches isolées de nodosités de Mimosa sp.
en Amérique du sud ont prouvé la capacité de Burkholderia à renoduler leur espèce hôte
(Chen et al., 2006) ainsi que deux souches isolées chez A. stenophylla (Hoque et al., 2011).
- Le dixième et dernier groupe comporte quatre souches isolées de A. saligna, i.e. SAB4a,
SAB4b, SAB8a et SAB8b, et constitue un groupe à part qui n’inclue aucune souche de
référence. A noter que toutes ces souches sont efficientes alors qu’elles ne rejoignent
aucune BNL caractérisée après BLAST (Tableau 13). La position taxonomique de toutes
les souches de bactéries indéterminées devraient être précisées par des analyses plus
95
poussées (hybridations ADN-ADN, Multilocus Sequence Analysis, …) afin de savoir si
elles peuvent constituer de nouvelles espèces de BNL.
96
Figure 21 : Arbre
phylogénétique des souches de
rhizobia renodulantes associées
aux Acacias d’Algérie, basé sur le
séquençage partiel du gène ARNr
16S obtenu par la méthode du
Neighbor-Joining, en utilisant la
distance de Kimura. Les valeurs
indiquées sont des valeurs de
bootstrap issues de 1000
répétitions.
01
02
03
04
05
06
07
08
09
10
97
A la lumière de ces résultats, on peut attester d’une grande diversité des rhizobia
nodulant les Acacias, isolées de différentes régions d’Algérie, lesquels incluent des
souches renodulantes appartenant aux ß-protéobactéries. Il est vrai qu’il existe une
hétérogénéité dans la représentativité des souches et de leur diversité d’un site à l’autre,
mais on peut voir que même s’il y a un groupe homogène de souches isolées d’un site
donné, leur profil d’efficience et de tolérance à la salinité, aux températures extrêmes et au
pH n’est pas le même. Beaucoup de souches isolées d’un seul site ayant formé des groupes
très homogènes, on peut supposer que la dilution de sol de 10-1 utilisée pour les piégeages
a révélé les BNL les plus compétitives. Néanmoins, plusieurs zones d’échantillonnage sont
présentes dans plusieurs groupes phylogénétiques. Ainsi, pour mieux comprendre la
relation qui peut exister entre les espèces végétales étudiées et la taxonomie des BNL qui
leurs sont associées, une Analyse Factorielle des Correspondances (AFC) a été réalisée
(Figure 22) :
7-Détermination de la spécificité d’hôte des BNL isolées par AFC
L’AFC (Analyse Factorielle des Correspondances –Annexe A-) a inclu les plantes
hôtes les plus représentatives en termes de nombre d’isolats, à savoir : A. saligna, A. seyal
A. karro et, A. ehrenbergiana, les autres espèces végétales ne l’ont pas été du fait du trop
faible nombre de souches isolées. Le graphique issu des calculs de l’AFC (Figure 22)
démontre que chaque espèce d’Acacia possède sa propre spécificité en termes
d’association préférentielle avec les groupes de bactéries renodulantes comme définie par
l’analyse phylogénétique mentionnée plus haut (Figure 21). Comme le montre la Figure 22
de la projection factorielle plane incluant les axes F1 et F2 qui représentent environ 80%
de la variabilité totale, A. saligna a le spectre d’hôte le plus large en étant associé à quatre
espèces qui lui sont propres, soit M. mediterraneum, R. tropici, Rhizobium sp. et
Bradyrhizobium sp., ainsi qu’à Ensifer meliloti et E. fredii, deux espèces bactériennes à
large spectre partagées avec A. karroo et A. ehrenbergiana. Par ailleurs, ces deux dernières
espèces d’Acacia s’associent avec R. leguminosarum et Mesorhizobium sp. respectivement.
Enfin, A. seyal est associé avec R. leguminosarum et deux groupes lui appartiennent
exclusivement, à savoir Ochrobactrum sp. et R. sullae.
En se basant sur cette analyse, A. saligna semble être l’espèce au plus large spectre d’hôte.
Ces résultats sont en accord avec la littérature, cette espèce pouvant en effet être nodulée
autant par des souches à croissance lente que des souches à croissance rapide (Rodríguez-
98
Echeverría et al., 2011; Hoque et al., 2011 ; Amrani et al., 2010; Wolde-Meskel et al.
2005; Marsudi et al., 1999). Ceci, contrairement aux Acacias africains qui eux ne sont
nodulés que par des rhizobia à croissance rapide et principalement par Sinorhizobium,
Mesorhizobium et Rhizobium (Noureddine et al., 2010; Amrani et al., 2010; Diouf et al.,
2007; Ben Romdhane et al., 2006; Wolde-Meskel et al., 2005; Odee et al., 2002 ; Ba et al.,
2002; Mohamed et al., 2000 ; Mc lnroy et al., 1999 ; Nick et al., 1999b; Khbaya et al.,
1998; de Lajudie et al., 1998a ; Lortet et al., 1996 ; de Lajudie et al., 1994).
Graphe symétrique
E. meliloti
E. fredii
Figure 22: Projection factorielle plane de l’AFC entre les taxa bactériens (cercles), définis selon la
phylogénie basée sur le séquençage partiel du gène 16S rARN et les quatre espèces d’Acacia (triangles).
Lorsque les taxa bactériens sont superposés sur un même point (cercle), ces mêmes points sont légèrement
décalés et alignés diagonalement pour une meilleure visibilité.
99
8- Tolérance des souches à la salinité, température et pH
Les résultats du Tableau 17 montrent que les deux souches SE24a et 60E isolées
respectivement de la région de la sebkha et de Oued Tin Amezzegin à Tamanrasset
résistent à une température de 50°C. On peut aussi remarquer que les hautes températures
extrêmes de ces deux régions n’atteignent pas ce seuil contrairement à la région de Ain
Belbel (Aoulef) à Adrar, alors que les deux seules souches originaires de cette dernière
région résistent seulement à 40°C, de même que des souches provenant du site ombragé de
la forêt de M’sila dont la thermotolérance atteint 45°C. D’une façon générale, on remarque
qu’au sein d’un même site d’échantillonnage, les souches présentent des profils de
résistance très variables allant de 35 à 45°C, avec une moyenne de 26% des souches
tolérant 45°C en conditions in vitro (Tableau 17).
Les résultats du Tableau 17 nous permettent de conclure que l’origine n’influe
apparemment pas sur la tolérance des souches aux hautes températures, ce constat étant
appuyé par l’analyse PCA (Principal Component Analysis ou Analyses en Composantes
Principales) de la Figure 23 qui montre qu’il n’y a aucune corrélation ente la température
atmosphérique maximale et la tolérance aux hautes températures des souches testées in
vitro (r=-0.162 –Tableau B2, Annexe B-). Il existe tout de même sur ce graphique de PCA
(Figure 23) une proximité entre les variables « Soil CW » (salinité du sol) et « Tpre
tolerance » (tolérance des souches aux hautes températures) malgré la faible corrélation
(r=0.247) entre ces deux paramètres (Tableau B-2 en Annexe B). Cependant, il n’y a pas
ici de relation de cause à effet entre la tolérance aux hautes températures et la conductivité
du sol malgré leurs corrélations élevées respectives avec le facteur F1 (0.698 et 0.738
respectivement, cf Tableau B-4 en Annexe B), d’autant que l’axe F3 qui représente 21% de
la variabilité totale n’est pas représenté sur le graphique.
100
Tableau 17 : Tolérance des souches à la température, à la salinité et au pH, selon leur site de
provenance et leur plante hôte d’isolement.
Souches
SE21a
SE21b
SE23bc
SE24a
SE24c
SE25a
SE25d
SE3
SE2
SAO2B
SABS
SABN1
SAB3
SAB4
SAB5
SAB7
SAB9
SAB10
Plante hôte
d’isolement
Température Max Intervalle de pH Seuil de tolérance
de croissance °C de croissance
au NaCl en mM
Site d’origine
45
45
35
50
40
45
45
35
40
35
40
45
40
35
40
40
45
35
04 - 13
04 - 13
04 - 13
04 - 13
04 - 13
04 - 13
04 - 13
03 - 11
03 - 11
05 - 09
03 - 11
03 - 11
04 - 12
05 - 11
05 - 11
03 - 11
04 - 13
04 - 13
340
860
170
860
510
680
680
1034
1034
170
860
340
860
860
860
340
510
340
35
04 - 12
40
03 - 12
680
860
40
05 - 10
860
SAB4a
40
04 - 13
SAB4b
35
04 - 13
680
510
SAB4c
35
04 - 13
510
35
04 - 13
SABN8b
40
04 - 13
680
510
SAB15a
45
04 - 13
510
SAB15b
45
04 - 13
510
A. seyal
100M de la sebkha
de Messerghine
A. seyal
Es-Senia (Oran)
SAB11
SAB12b
SAB13
A. saligna
Dunes de Bomoplage (Oran)
SAB8a
SAB17a
40
05 - 11
680
SAB17b
05 - 11
680
SABN1a
40
40
04 - 13
510
SABN1b
45
05- 11
SABN1c
40
SABN2a
45
05- 11
04 - 12
510
340
340
SABN2c
40
04 -13
340
SABN4a
45
04 -12
510
SABN4b
40
05- 11
510
SABN5b
KHB
40
05- 11
40
03 - 11
680
510
A. karroo
101
Tableau 17 (suite) : Tolérance des souches à la température, à la salinité et au pH, selon leur
Souches
Plante hôte
au NaCl en mM
40
06 - 10
680
Provenance
K31
K32a
35
04 - 10
1034
45
06 - 13
170
45
06 - 12
102
K34a
35
06 - 12
102
K1a
35
04 - 12
510
K1b
35
04 - 13
1034
45
06 - 10
340
K32c
A. karroo
K33b
K2b
K2d
A. karroo
Ferme de
Messerghine
(Oran)
Forêt de M’sila
35
04 - 13
K4a
40
06 - 12
680
1034
K4c
35
04 - 13
1034
35
04 - 13
35
04 - 13
340
860
35
04 - 12
860
40
03 - 11
170
45
03 - 11
170
40
03 - 11
170
35
04 - 10
170
40
03 - 11
340
40
03 - 11
340
45
04 - 13
1034
45
04 - 13
340
45
04 - 13
860
45
04 - 13
1034
E231a
40
04 - 13
680
E231b
40
04 - 12
340
40
04 - 13
1034
40
04 - 11
40
04 - 11
340
680
35
04 - 13
680
35
04 - 13
340
40
04 - 13
680
40
04 - 13
510
50
04 - 11
340
K13b
K14b
A. saligna
Dune d'El Mactaa
(Mostaganem)
K15b
KHML
KHMR
SAKS
KOH
KO1
SAAIS
A. karroo
Madagh (Oran)
A. saligna
Khemais (Relizane)
A. karroo
Oued Jer (Blida)
A. saligna
Ain Defla
SE243a
SE243b
SE243c
A. seyal
SE243d
E231c
A. ehrenbergiana
Labiod Sidi El
Cheikh
(El Bayadh)
Ain Belbel (Adrar)
E232
N145
A. nilotica
E134ab
E134b
A. ehrenbergiana
Oued In Daladg
(Tamanrasset)
E128b
A121
E60
A. albida
Oued Tin Amezzegin
A. ehrenbergiana
(Tamanrasset)
102
Tableau 17 (suite) : Tolérance des souches à la température, à la salinité et au pH, selon leur
Souches
Plante hôte
au NaCl en mM
45
04 - 11
1034
Provenance
E45
E39
E42
A. ehrenbergiana
Oued Tassena
(Tamanrasset)
E47
T80
T18
E86
N8
N81
T82
T120
A. tortilis
A. ehrenbergiana
Djenen Ben Mbarek
(Tamanrasset)
A. nilotica
A. tortilis
A. tortilis
Tindouf
40
04 - 11
340
45
04 - 13
40
04 - 11
860
340
40
04 - 11
340
45
04 - 13
680
40
04 - 11
340
35
35
40
40
04 - 11
03 - 11
03 - 11
04 - 11
1034
680
1034
340
On note que les deux principaux contributeurs de structuration de cette PCA en deux
dimensions, où les axes F1 et F2 représentent 60.22% de la variabilité totale, sont : (i) les
souches bactériennes originaires de la Sebkha d’Oran (indiqués par le symbole O3) qui
sont logiquement groupés le long de l’axe de la conductivité du sol (soil CW) et l’axe F1 ;
ainsi que (ii) les souches de Ain Belbel –Adrar- (indiquées par le symbole A) groupées le
long de l’axe de température du site (site temp). Ces deux sites d’échantillonnage de la
Sebkha d’Oran et d’Aïn Belbel étant caractérisés par une concentration en NaCl du sol
élevée et une température extrêmement élevée respectivement.
103
Figure 23: Analyse en composantes principales (ACP) représentant la relation entre la tolérance in
vitro des souches rhizobiennes au NaCl (NaCl tolerance) et aux hautes températures (Tpre tolerance) et
les caractéristiques édaphoclimatiques des sites d’échantillonnage correspondants, soit la conductivité du
sol (soil CW) et la moyenne maximale annuelle de température (Site Tpre). Chaque point correspond à un
seul isolat bactérien et son origine est indiquée par des symboles comme suit : O1: Es-Senia/Oran;
O2: Messerghine/Oran; O3: Sebkha, Messerghine/Oran; O4: Bomo-plage, dunes/Oran ; O5: Foret de
M’sila /Oran; M: El Mactaa dunes/Mostaganem; R: Khemaissa/Relizane; AD: Ain Defla; EB: Labiod
Sidi El Cheikh/El Bayadh; A: Ain Belbel/Adrar; T1: Oued In Deladg/Tamanrasset; T2: Oued
Tassena/Tamanrasset; T3: Oued Tin Amezzegin/Tamanrasset.
•
Tolérance des souches isolées des Acacias à la température
La température optimum pour la croissance des rhizobia en culture est de 28 à 31°C
et une une majorité de souches sont incapables de croître à 37°C (Graham, 1992).
Néanmoins, la tolérance des rhizobia associés aux Acacias varient en fonction des régions
d’échantillonnage et des espèces hôtes. Des rhizobia isolés d’A. senegal au Soudan et d’A.
104
saligna en Egypte pouvaient croître à environ 40°C (Zahran et al., 1994 ; Swelim, 1996)
ainsi que des souches associées à A. gummifera, A. karroo et A. raddiana au Maroc
(Zerhari et al., 2000). Des souches plus résistantes ont été isolées, comme une souche
associée à A. senegal au Soudan qui a pu croître à une température de 44°C (Zhang,
1991) ainsi que cinq souches originaires du Sénégal associées à A. tortilis subsp raddiana
qui ont supporté une température de 45°C (Cacciari et al., 2003). Le seuil des 45°C a été
dépassé par deux souches associées respectivement à A. cyanophylla (syn. A . saligna) et
F. albida en Libye qui ont toléré 46°C (Mohamed et al., 2000).
Si on analyse un lien éventuel entre le profil de tolérance des souches aux hautes
températures et leur position taxonomique (Tableaux 16 et 17), on remarque que les deux
souches qui présentent une croissance au seuil de 50°C, sont Rhizobium sp. (SE24a) et
Sinorhizobium sp. (E60). Selon la littérature, une seule souche associée à une légumineuse
ligneuse, Albizia lebbeck, a toléré 50°C (Surrange et al., 1997). De plus, les 26% des
souches rhizobiennes isolées qui tolèrent les 45°C appartiennent majoritairement au groupe
des souches à croissance rapide, et par ordre décroissant aux genres : Rhizobium qui est
majoritaire suivi de Ochrobactrum et Bradyrhizobium, puis Ensifer et Phyllobacterium.
Cependant, on ne peut pas faire de conclusion générale quant à une éventuelle corrélation
entre l’affiliation des souches et leur tolérance aux hautes températures car, même parmi
un genre qui semble globalement résistant, on peut trouver des souches qui ne le sont pas.
Cependant, beaucoup d’études ont prouvé que les Rhizobium possédaient un grand nombre
de Heat Shock Proteins (HSPs) comparativement aux autres genres (Michiels et al., 1994;
Wallington & Lund, 1994). Par exemple, R. leguminosarum possède trois copies du gène
HSP cpn60 (Wallington & Lund, 1994), ce qui pourrait expliquer sa grande tolérance aux
hautes températures. Néanmoins, il a été reporté qu’une souche sensible à la chaleur
associée au haricot possédait plusieurs HSPs tandis qu’une autre tolérante en possédait
seulement deux (Michiels et al., 1994).
•
Tolérance des souches isolées des Acacias à la salinité
Concernant la salinité, le seuil testé le plus élevé de la croissance bactérienne était
de 1034 mM (6% w/v de NaCl), ce dernier ayant été relevé pour environ 20% des souches
renodulantes isolées de sites non salés, excepté deux : E2 et E3 de la région d’Es-Senia
(Oran) dont le site est considéré comme légèrement salée. Chaque site présente des
souches natives avec différents profils de résistance à la salinité allant de 170 à 1034 mM
105
de NaCl. Tout comme la température, la tolérance à la salinité ne semblent pas être
corrélée avec la conductivité électrique du sol (Figure 23), (r=-0.004 –Annexe B-). Il est
reconnu que les rhizobia isolés des légumineuses ligneuses et des Acacias en particulier
sont généralement halotolérants (Diouf et al., 2008 ; Zahran, 1999; Zahran et al., 1994).
Néanmoins, cette tolérance varie en fonction des espèces hôtes et même entre les souches
associées au même arbre (Zhang et al., 1991; Lal & Khanna, 1994; Surange et al., 1997;
Hashem et al., 1998). Si on se réfère à la littérature, beaucoup d’études ont fait mention de
profils de résistance très intéressants. Merabet, et al. (2006) ont montré que des souches de
leur collection, associées à A. tortilis subsp. raddiana en provenance de Djanet (Algérie)
étaient capables de croitre à plus de 800 mM, d’autres associées à A. senegal en Inde
tolèrant 850 mM (Lal & Khanna, 1994). Par ailleurs, des souches associées à A. gummifera
et A. raddiana issues d’une région désertique du Maroc supportaient plus de 1000 mM de
NaCl (Essendoubi et al., 2006), de même que des souches associées à A. saligna isolées de
pépinières de régions désertiques également (Tamanrasset, Bechar et Djanet) et aride
(Tlemcen) en Algérie (Amrani et al., 2010). Un record de tolérance a été reporté pour une
souche de Libye associée à A. cyanophylla qui atteignait 1378 mM (8%) (Mohamed et al.,
2000), ce qui n’est pas courant chez les légumineuses ligneuses, seules une souche
associée à Lupinus sp. ayant pu croître à 10% de NaCl (Zahran et al., 1994) et une souche
associée au fenugrec qui a pu continuer à croître jusqu’à un seuil de 2,4 mM de NaCl
(14%) (Abdelmoumen et al., 1999).
Le plus haut profil de résistance qui est de 1034 mM se trouve majoritairement parmi les
souches appartenant au genre Ensifer (E. meliloti et Ensifer sp.) suivi de Rhizobium et
Ochrobactrum. Plusieurs études ont révélé la résistance notable que présente le genre
Ensifer à la salinité, il lui a été attribué une tolérance à 800 mM (Merabet et al., 2006),
1000 mM (Mashady et al. 1998) ou seulement 500 mM (Mohammad et Campbell, 1985 ;
Rome et al., 1996). Cependant, ce qui est remarquable, c’est que les souches isolées dans
notre étude se distinguaient par un seuil de tolérance minimum au NaCl de 340 mM.
•
Tolérance des souches isolées des Acacias à l’acidité
Quant au pH, environ 20% des souches étudiées résistaient à un pH de 3 tandis que la
majorité résistait à pH 4. Le pH de croissance le plus élevé atteignait 13 pour 46% des
souches. Il n’y a pas de rhizobia associés aux légumineuses ligneuses présentant une
croissance à un pH 3 dans la littérature. La plupart des souches isolées d’A. saligna et d’A.
106
tortilis au Maroc tolèrent un pH égal à 4 de même qu’une seule souche d’A. saligna isolée
en Libye (Zerhari et al., 2000; Mohamed et al., 2000). La majorité des souches tolérantes
au pH 3 faisaient partie des Rhizobium sp., ce qui rejoint une étude réalisée par Kurchak et
al. (2001) qui ont établi que R. leguminosarum possédait vingt gènes spécifiques en
réponse au stress acide appelés gènes act (acid tolerance). De plus, comme cela a été
suggéré
par
Cunningham
et
Munns
(1984),
il
semble
que
la
production
d’exoplysaccharides contribuerait à cette résistance, comme observé pour des souches à
croissance rapide. En ce qui concerne les souches à croissance lente, Fujihara & Yoneyama
(1993) ont reporté que Bradyrhizobium japonicum était dans l’incapacité de croître dans un
intervalle de pH de 4 à 9,5, ce qui est en contradiction avec nos résultats obtenus avec des
souches à croissance lente qui tolérent un pH allant de 4 à 13 comme limites extrêmes.
1
2
4
3
Figure 24 : Aspect des boites inoculées par étalement de souches résistantes aux conditions de pH et de
température extrêmes:
107
(1) : Aspect muqueux de la souche E231 sur du YEMA à pH 4 incubée 7 jours à 28°C ; (2) : Aspect de la
souche E42 sur milieu YEMA à pH12, incubée 7 jours à 28°C ; (3) : Aspect de la souche SE243 sur
milieu YEMA à pH13, incubée 7 jours à 28°C ; (4) : Aspect de la souche SE21b sur milieu YEMA
incubée 7 jours à 45°C.
Beaucoup d’études ont montré que les rhizobia isolés des Acacias sont
généralement plus résistants aux facteurs environnementaux extrêmes que les autres
bactéries fixatrices d’azote (Odee et al., 1997), ce qui conforte les résultats de cette étude
sur les rhizobia associés aux espèces d’Acacia introduites et autochtones des régions arides
et semi-arides d’Algérie.
9- Tests d’efficience des souches d’Acacias :
Le test d’efficience a été effectué en utilisant une sélection de souches qui avaient prouvé
leur efficience d’après l’aspect général des plantes lors du test de nodulation.
L’expérimentation a été refaite afin de quantifier le poids sec des plantes, leur hauteur ainsi
que le nombre et le poids sec des nodosités sur un plus grand nombre de plantes par souche
(Tableau 18, Figure 25). Les analyses statistiques de variance à un facteur ont été
effectuées pour chaque espèce. Seul le poids sec a été pris en considération pour estimer
l’efficience des souches. Sept semaines après inoculation, toutes les plantes testées étaient
nodulées. Toutes les souches étaient efficientes (le poids de la plante inoculée était
significativement supérieur à celui du témoin) vis-à-vis d’A. saligna et A. laeta (Figures
26-2 et 26-6), la majorité l’étaient chez A. seyal, A. karroo, A. ehrenbergiana (Figures 261, 26-3, 26-4) tandis que la souche associée à A. tortilis était seulement infective (Figure
26-5).
Chez A. seyal, SE243c est la plus efficiente, en améliorant presque de trois fois et
demi le poids sec des plantes témoins non inoculées. Elle est suivie du groupe SE243a et
SE243d, ces dernières ayant amélioré trois fois le poids sec de la plante inoculée
comparativement au témoin (Tableau 18, Figure 26-1, Annexe C1). Le troisième groupe
par ordre décroissant d’efficience inclut SE21a, SE21b, SE24a, SE243b, SE22a, SE25a,
SE24c et SE25d (Figure 26-1, Annexe C1). Le dernier groupe le moins efficient inclut
SE25d qui a légèrement amélioré le poids sec (0,032g) comparativement au témoin
(0,024g) (Tableau 18 et Annexe C1). La dernière souche SE24b groupe avec le témoin et
n’est donc pas efficiente mais juste infective car le poids sec de la plante inoculée par cette
souche (0,023g) et celui du témoin (0,024g) ne sont pas significativement différents
(Tableau 18, Figure 26-1). Chez A. saligna, les différences d’efficiences sont moins
108
marquées entre souches. Il y a trois groupes, dont deux efficients et un incluant le
traitement témoin. Dans l’ordre décroissant d’efficience, SAB15b, SA13b, SAB4a et
SAB3 ont amélioré de plus de trois fois et demi la croissance des plants comparativement
au témoin (Tableau 18, Figure 26-2), suivi de SAB5, SAB10, SAB9, SAB8b, SAB11,
SA15b, SA14b et SAB8a améliorant d’environ trois fois la croissance des plants inoculés
comparativement au témoin, tandis que SAB4b et SAB15a étaient les souches les moins
efficientes (Figure 26-2). Pour le test d’efficience des souches isolées d’A. ehrenbergiana,
ont été utilisées des graines d’A. karroo, dans la mesure où leurs spectres d’hôtes sont
proches et que nous n’avions pas de graines d’A. ehrenbergiana disponibles. Les souches
efficientes sont inclues dans deux groupes : E134ab, E134b et E231 qui ont amélioré de
presque quatre à trois fois le poids sec des plantes inoculées comparativement au témoin,
tandis que l’effet des souches E42 et E128b sur la croissance des plants comparativement
aux témoins non inoculés sont statistiquement non significatifs et sont donc considérées
comme inefficientes (Figure 26-3). Concernant A. karroo, Les deux souches les plus
efficientes qui se démarquent des autres sont K1a et K2d, ces dernières améliorant cinq
fois la croissance de la plante inoculée comparativement au témoin. Elles sont suivies du
groupe incluant les souches K34a, K1b, K2b, K33b et K4a, alors que K32c, K31 et K4c
peuvent être considérées comme infectives seulement puisqu’il n’y a pas de différences
significatives à p=0,05 entre la biomasse des plantes inoculées par ces différentes souches
et celle des témoins (Figure 26-4). Pour les deux dernières espèces d’Acacia testées, la
souche A121a associée à A. albida est efficiente et améliore deux fois et demie la
croissance de la plante inoculée comparativement au témoin (Figure 26-6) contrairement à
la souche 18T isolée d’une nodosité d’A. tortilis qui est groupée avec le témoin et donc
inefficiente (Figure 26-5).
109
Tableau 18 : Résultats du test d’efficience (poids sec, hauteur de la tige, nombre de nodosités) des
différentes souches sur les différentes espèces d’Acacia.
Moyenne du
poids sec
/plant (g)
Hauteur
moyenne des
tiges (cm)
Nombre moyen
de
nodosités/plant
Témoin
0,059
6
0
Moyenne du poids
sec de nodosités
/plant (g)
0
E134ab*
0,1
7,47
4
0,01
E134b*
0,106
6,5
11
0,011
E128Eb*
0,031
6,33
4
0,002
231E*
0,104
6,67
14
0,016
E 42*
0,0335
3,25
2
0,002
K1a
0,11
6
6
0,014
K1b
0,083
6,33
3
0,002
0,064
4,84
6
0,008
K2d
0,107
7,5
9
0,021
K4a
0,042
3,03
5
0,0077
K4c
0,0265
5,811
2
0,005
K31
0,03
7,4
3
0,0009
K32a
0,028
4,4
2
0,009
K32c
0,0325
2,75
5
0,009
K33b
0,047
5,4
5
0,0025
K34a
0,097
6,17
3
0,00445
Témoin
0,024
3,33
0
0
SE243a
0,073
4,8
4
0,007
SE243b
0,045
5,33
5
0,0055
SE243c
0,08
6,5
12
0,005
SE243d
0,0715
8,25
8
0,011
SE21a
0,0685
3,25
3
0,009
0,058
6
4
0,007
0,0443
6,5
6
0,007
SE23bc
0,067
7,1
0
0
SE24a
0,057
5,33
8
0,009
SE24b
0,024
4,33
0
0
SE24c
0,042
4,87
3
0,003
SE25a
0,043
4
3
0,009
SE25d
0,033
5,33
4
0,009
Souches
K2b
SE21b
SE22a
Plante hôte
A. karroo
A. seyal
110
Tableau 18 (suite) : Résultats du test d’efficience (poids sec, hauteur de la tige, nombre de nodosités)
des différentes souches sur les différentes espèces d’Acacia.
Moyenne du
poids sec
/plant (g)
Hauteur
moyenne des
tiges (cm)
Nombre moyen
de
nodosités/plant
Témoin
0,0065
3,9
0
Moyenne du poids
sec de nodosités
/plant (g)
0
SAB3
0,0427
5,67
0
0
SAB5
0,04
7
4
0,009
SAB9
0,0373
5,8
7
0,017
SAB10
0,04
6,5
8
0,02
SAB11
0,0406
5,86
5
0,014
SAB4a
0,043
7,8
7
0,012
0,03
7,27
3
0,0034
0,0303
5,03
3
0,004
SAB8a
0,0306
5,57
6
0,0153
SAB8b
0,0356
5,67
13
0,014
SAB15a
0,02
4,17
2
0,001
SAB15b
0,046
7,1
3
0,0046
SA13b
0,0453
6,67
12
0,02
SA14b
0,0343
6,17
8
0,014
SA15b
0,0343
5,53
6
0,014
0,025
4,2
0
0
0,028
5
1
0,0009
0,035
5
0
0
1
0,001
Souches
SAB4b
SAB4c
Témoin
T18
Témoin
Plante hôte
A. saligna
A. tortilis
A. albida
A121
0,142
10,5
Les souches isolées d’A. ehrenbergiana ont été testées avec des plantules d’A. karroo.
1
2
Figure 25: Aspect d’un plant inoculé avec la
souche ASB5 après 48 jours d’incubation. (1) :
aspect général du plant inoculé comparativement au
plant non témoin inoculé ; (2) : aspect des nodosités
Témoin
NI
au grossissement X20.
ASB5
111
1
2
112
3
4
113
6
5
Figure 26 : Résultats du test d’efficience des souches de rhizobium vis à vis de 6 espèces d’Acacia. (1) :
A. seyal ; (2) : A. saligna ; (3) : A. ehrenbergiana ; (4) : A. karroo ; (5) : A. tortilis ; (6): A. albida. Les
moyennes groupées sous les barres horizontales surmontées de lettres différentes sont significativement
différentes selon le test de Duncan à p=0,05.
Concernant A. seyal, le groupe d’efficience le plus fort est constitué de SE243c et
SE243a. Néanmoins la souche SE243a semble la plus intéressante compte-tenu de son
profil de tolérance : elle croît à une concentration de NaCl de 1034 mM et à une
température de 45°C ainsi qu’entre des pH de 4 à 13 et est proche de Ochrobactrum sp.
Pour A. saligna, quatre souches candidates forment un groupe d’efficience élevé, dont trois
sont à croissance rapide et une à croissance lente. En se basant sur leur profil de tolérance,
deux souches, SAB4 et SAB13, proches de Rhizobium sp. et Sinorhizobium sp.
respectivement, se distinguent des autres car elles tolèrent 860 mM NaCl, ce qui conforte
l’hypothèse qu’en zone aride, les souches à croissance rapide sont plus indiquées dans les
programmes d’inoculation que celles à croissance lente (Barnet et Catt, 1991). La
croissance d’A. karroo quant à lui est nettement améliorée par une seule souche candidate,
K2d proche d’Ensifer fredii, cette dernière montrant une tolérance moyenne au NaCl à 680
mM. Il en est de même pour A. albida dont la souche associée, proche de Mesorhizobium
sp., est tolérante à 510 mM de NaCl. Cependant, pour A. ehrenbergiana, la souche la plus
efficiente appartient au groupe des Devosia, dont certains auteurs avaient déjà rapporté la
capacité à renoduler A. saligna (Hoque et al., 2011) bien que leur profil d’efficience
n’avait pas été caractérisé. Ces souches offrent un potentiel intéressant d’efficience et de
114
tolérance aux conditions extrêmes telles que les hautes températures, la salinité ainsi que
les pH alcalin et acide, ce qui pourrait en faire des inocula performants.
10- Caractérisation phénotypique des souches isolées d’Acacias: phénodendogramme
Les résultats des tests phénotypiques sont présentés dans les Tableaux 19, 20, 21 et
22. Les observations sont interprétées en code binaire, 1 pour une croissance positive sur
des milieux aux différents pH, concentrations en NaCl, températures d’incubation,
croissance en présence de différents acides aminés, ou lorsque les souches expriment une
résistance aux métaux lourds ou aux antibiotiques, si le diamètre d’inhibition dépasse les
diamètres indiqués pour chaque antibiotique selon le NCCLS (2000) (National Committee
for Clinical Laboratory Standards), ou enfin lorsqu’il y a dégradation des sucres avec
virage de couleur, indicateur d’une baisse de pH. A l’opposé, 0 indique une absence de
croissance ou une sensibilité aux antibiotiques et aux métaux lourds.
Le Tableau 19 montre le profil de résistance aux antibiotiques et aux métaux lourds des 16
souches isolées : trois souches se démarquent avec une résistance à tous les agents
antimicrobiens : SAO2B, SAB1 et SAKS, toutes étant associées à A. saligna isolées
respectivement de Oued Jar, Bomo plage et Khemaissa. Les antibiotiques agissent selon
différents modes d’action et il est largement reconnu que les rhizobia résistent
différemment aux antibiotiques, c’est pour cela que le profil d’antibiorésistance est utilisé
comme critère de différenciation entre les souches (Jordan, 1984), ayant prouvé son statut
discriminant au même rang que l’approche moléculaire chez des souches associées au poischiche au Portugal (Alexandre et al., 2006). Ce profil de résistance intrinsèque aux
antibiotiques permet aussi de suivre une souche une fois inoculée au champ (Beynon et
Josey, 1980). Il semblerait que la Kanamycine soit la moins inhibitrice de la croissance des
rhizobia contrairement au Chloramphénicol (Zerhari et al., 2000 ; Diouf et al., 2008). Ceci
ne rejoint pas les résultats présentés ici, où l’on remarque que la majorité des souches était
sensible au Chloramphénicol à 15 et 200µg/l, alors que 30% des souches testées avaient
résisté à la Kanamycine à 100µg/l. Concernant les autres antibiotiques, les souches sont
majoritairement résistantes à la Streptomycine à 5µg/l, la Spectinomycine à 5 et 120µg/l et
l’Erythromycine à 30 et 66.6µg/l, contrairement au profil variable de résistance des
souches associées aux Acacias en Lybie vis-à-vis des mêmes antibiotiques (Mohamed et
al., 2000). Cependant, la résistance des souches libyennes est variable à la Streptomycine à
120µg/l comme pour les 16 souches isolées dans notre étude.
115
La majorité des souches sont résistantes au cadmium et au cuivre et un peu moins au
plomb, la même résistance ayant été rapportée pour les souches rhizobiennes isolées de
nodosités d’Acacia sp. au Maroc (Zerhari et al., 2000) et en Lybie (Mohamed et al.,
2000). Ceci suggère que ces souches pourraient être de bonnes candidates à utiliser comme
inocula pour la réhabilitation des sites pollués par les métaux lourds.
Tableau 19 : Résistance intrinsèque aux antibiotiques et aux métaux lourds de 16 souches isolées de
différentes espèces d’Acacia.
Souches
SAO2B
SAB1
SAO1
SABS
SAKS
KHO
KHB
KHMR
KHML
SAAIS
N8
N81
N82
T8
SE2
SE3
Streptomycine
3
120
1
1
1
1
1
0
1
0
1
1
1
0
1
0
1
0
1
1
1
0
1
0
1
1
0
0
1
1
1
0
1
1
Antibiotiques (µg/ml)
SpectinoKanaChlorammycine
mycine
phénicol
5
120
10
100
15 200
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
0
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
0
0
1
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
0
1
1
1
0
1
0
1
0
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
0
1
1
1
Erythromycine
30 66.6
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
0
1
1
1
1
1
1
1
1
0
0
1
1
1
1
1
1
Métaux lourds (µg/ml)
CuCl2
CdCL2
HgCL2
2H20
2H20
100
5
20
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
0
1
0
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
1
0
0
1
0
1
1
0
1
0
0
1
L’utilisation des sucres est un bon indicateur de l’adaptabilité des souches dans les
conditions adverses (Diouf et al., 2008). On a ainsi constaté que neuf souches sur les seize
isolées pouvaient utiliser la gamme des sept sources carbonées (Tableau 20), en plus du
mannitol qui est la source carbonée de choix pour les rhizobia (Vincent, 1970). Ces
résultats rejoignent ceux de Marsudi et al. (1999) qui trouvaient que les souches à
croissance rapide métabolisaient bien les disaccharides, de même que ceux de Mohamed et
al. (2000) rapportant que des souches d’origine libyenne associées aux Acacias utilisaient
23 sucres en plus des sept sources carbonées testées dans notre étude. A l’inverse, huit
souches à croissance rapide d’un même cluster associées aux Acacias au Maroc
n’assimilaient pas le sucrose, le maltose et le lactose (Zerhari et al., 2000).
Quant aux acides aminés, seuls la L-proline, l’acide L-glutamique ainsi que le l’acide Laspartique étaient utilisés par les 16 souches testées (Tableau 20). Ces résultats sont en
116
contradiction avec ceux obtenus chez des souches associées aux Acacias en Lybie qui
utilisaient majoritairement tous les acides aminés utilisés dans notre étude (Mohamed et
al., 2000), de même que huit souches de Mesohizobium sp. associées à A. seyal du Sénégal
(Diouf et al., 2008).
Tableau 20 : Réduction des sucres et utilisation des acides aminés par 16 souches isolées de différentes
espèces d’Acacia.
Réduction des sucres (1g/l)
Utilisation des acides aminés (10
mM/L)
Souches
Dglucose
Lactose
DGalactose
LArabinose
dFructose
dXylose
Sucrose
DLValine
LProline
L-Acglutamique
LLeucine
DLphenylalanine
DLSerine
DLtryptophane
LMethioNine
Lacaspar
tique
SAO2B
SAB1
SAO1
SABS
SAKS
KHO
KHB
KHMR
KHML
SAAIS
N8
N81
N82
T8
SE2
SE3
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
0
1
0
0
1
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1
1
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0
1
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1
1
1
1
1
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1
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0
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1
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1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
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0
1
1
1
1
1
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1
0
1
1
1
1
1
1
1
1
0
0
1
1
1
1
0
0
1
1
1
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
Concernant le nitrate, on constate que la moitié des souches les réduisaient alors
que onze souches sur les seize testées hydrolysaient l’urée (Tableau 21). Ces proportions
sont supérieures à celles obtenues par Zhang et al. (1991) qui trouvaient que 88% des 62
souches testées à croissance rapide associées à Acacia et Prosopis étaient incapables
d’hydrolyser l’urée tandis que seulement huit d’entre pouvaient réduire le nitrate.
Lindstrom et Lehitomaki (1988) ont obtenu des résultats plus proches des nôtres avec 30%
des 82 souches à croissance rapide testées qui pouvaient réduire le nitrate, tandis que 68%
d’entre elles hydrolysaient l’urée. Il est largement reconnu que l’apport de nitrate minéral
inhibe la nodulation, il serait peut être intéressant d’utiliser de telles souches dans des sols
enrichis en fertilisants chimiques, ne serait-ce qu’en assurant leur survie jusqu'au lessivage
de ces composés exogènes.
Le Tableau 21 montre que la majorité des seize souches testées toléraient une
gamme de pH allant de 3 à 11. Parallèlement, quatre de ces mêmes souches toléraient 6%
117
de NaCl et une seule poussait à 46°C (Tableau 22). La tolérance des rhizobia aux pH ainsi
qu’à différentes concentrations de NaCl a déjà été discutée précédemment.
Tableau 21 : Croissance à différents pH, aptitude à hydrolyser l'urée et à réduire le nitrate de 16
Croissance à différents pH
Souches
SAO2B
SAB1
SAO1
SABS
SAKS
KHO
KHB
KHMR
pH=3 pH=3.5
0
0
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
pH=4.5
1
1
1
1
1
1
1
1
pH=5 pH=6 pH=8 pH=9 pH=10
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
Réduction
de nitrate
Hydrolyse
de l'urée
1 g/l
20 g/l
1
1
0
0
1
1
1
0
1
1
0
0
1
1
1
1
pH=11
0
1
1
1
1
0
1
1
KHML
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
SAAIS
N8
N81
N82
T8
SE2
SE3
1
0
1
1
0
1
1
1
0
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
0
1
0
1
0
0
1
1
1
0
1
1
1
Tableau 22 : Profil de tolérance à différentes concentrations de NaCl et à différentes températures de
16 souches isolées de différentes espèces d’Acacia.
Concentrations de NaCl
Souches
Températures d’incubation
0.5% 1% 2% 3% 3.5% 4% 5% 6% 7% 4°C 14°C 19°C 25°C 35°C 39°C 44°C 46°C 50°C
SAO2B
SAB1
SAO1
SABS
SAKS
KHO
KHB
KHMR
KHML
SAAIS
N8
N81
N82
T8
SE2
SE3
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
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1
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1
1
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1
1
1
0
1
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1
0
0
1
1
0
1
1
1
1
0
1
1
0
0
0
1
0
0
1
1
0
0
1
1
1
0
1
1
0
0
0
1
0
0
0
1
0
0
1
1
1
0
1
1
0
0
0
1
0
0
0
1
0
0
1
1
1
0
1
1
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
1
0
1
0
1
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
1
0
1
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
118
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
1
1
1
1
1
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1
1
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1
1
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1
1
1
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1
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1
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0
1
1
1
1
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1
1
1
0
0
1
1
1
0
0
1
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Il est bien connu que les facteurs environnementaux tels que la salinité, la
sécheresse, l'acidité, l'alcalinité, les engrais chimiques, les métaux lourds et les pesticides
compromettent la survie, la croissance et la capacité à fixer l'azote des souches de rhizobia
(Zahran et al., 1994), d’où l’intérêt de connaître leurs caractéristiques phénotypiques et
biochimiques qui conditionnent leur survie, leur adaptabilité ainsi que leur compétitivité
une fois introduites, préalable indispensable à la réponse des plantes à l’inoculation au
champ (Zerhari et al., 2000 ; Diouf et al., 2008).
Au total, 58 caractères phénotypiques ont été pris en compte dans l’établissement
d’une matrice basée sur 16 observations (16 souches), laquelle a été utilisée pour une
analyse en groupes hiérarchiques basée sur le carré des distances euclidiennes et une
moyenne non pondérée des groupes associés (Statistica version 5.1 ; eds 1997, Annexe D).
Cette matrice a permis de dessiner un phénodendogramme (Figure 27) qui différencie trois
groupes distincts, groupe 1 (N82-A. nilotica et KHMR-A. karroo), groupe 2 (N8 et N81-A.
nilotica ; SE3, SE2-A. seyal et SABS-A. saligna) et enfin le groupe 3 qui renferme le plus
grand nombre de souches (KHML-A. karroo et SAKS-A. saligna ; SAAIS-A. saligna et
KO1-A. karroo ; KHB -A. karroo et SAB1-A. saligna ; T8-A. tortilis, KOH-A. karroo et
SAO2B-A. saligna. On constate d’une manière générale que les souches associées à une
même espèce d’Acacia n’appartiennent pas aux mêmes sous-groupes, ceci montrant une
grande diversité de phénotypes rhizobiens au sein d’une même espèce échantillonnée, à
l’instar des résultats obtenus par Zerhari et al. (2000) qui ont rencontré une diversité
phénotypique aussi élevée dans la rhizosphère d’une seule espèce d’arbre que dans celle de
deux espèces différentes présentes sur un même site d’échantillonnage.
119
Arbre de seize observations
Moyenne non pondérée des Groupes Associés
Rhizobium sp.
A.tumafeciens
Rhizobium sp.
Ensifer sp.
KHB
Figure 27: Phénodendrogramme illustrant les similarités phénotypiques entre 16 souches de rhizobia
isolées de différentes espèces d’Acacia de régions arides et semi-arides d’Algérie.
De plus, en essayant de jumeler les résultats du séquençage partiel du gène 16S
rARN qui malheureusement n’a pas été fait pour toutes les souches utilisées dans cet arbre
sauf pour quatre, on peut noter qu’Ensifer sp. est à part ainsi qu’Agrobacterium
tumafeciens. Au final, les deux Rhizobium sp. ne sont pas groupés dans le même cluster, ce
qui rejoint l’arbre phylogénétique basé sur le séquençage partiel du 16S-rARN (Figure 21)
qui révèle que SE3 est groupée avec R. sullae tandis que SAAIS rejoint R. tropici. Ces
résultats suggèrent que la caractérisation basée sur les traits phénotypiques est assez
discriminante et qu’elle rejoint la caractérisation moléculaire du séquençage partiel du
gène 16S rARN, contrairement aux résultats obtenus par Zerhari et al. (2000) et Khbaya et
al. (1998) qui trouvaient des résultats incongruants entre la caractérisation phénotypique et
génotypique. Cependant, la connaissance des caractères phénotypiques reste primordiale
pour la sélection du meilleur profil de tolérance des inocula candidats aux conditions pédoédaphiques extrêmes (Zerhari et al., 2000).
120
Conclusion
Les résultats obtenus démontrent une grande diversité autant phénotypique que
génétique des souches isolées associées aux espèces autochtones et introduites d’Acacia en
Algérie en région arides et semi-arides. Malgré le fait qu’il y ait une pauvre
représentativité des souches d’origines sahariennes, surtout des souches associées à A.
tortilis, A. laeta et A. nilotica dû à un phénomène de non-renodulation qui n’a pas été
rencontré chez les souches isolées des zones côtières, cette étude révèle une biodiversité
des plus intéressantes : un groupe phylogénétique très homogène basé sur le séquençage
partiel du 16S rARN regroupant des souches de Bradyrhizobium associées à A. saligna)
qui mériterait d’être caractérisé à l’aide d’outils moléculaires plus puissants, de même que
l’affiliation de certaines souches qui nécessiterait d’être affinée. Cette étude confirme que
les BNL associées aux Acacias africains sont exclusivement à croissance rapide, proche de
Ensifer, Rhizobium et Mesorhizobium ; tandis qu’A. saligna originaire d’Australie est
associé aux souches à croissance lente et rapide. Deux souches atypiques isolées d’A. seyal
de Labiod Sidi El Cheikh, proches d’Ochrobactrum se sont révélées efficientes, ainsi
qu’une souche associée à A. saligna isolée de Bomo-plage proche de Phyllobacterium ; la
renodulation et l’efficience chez ces espèces bactériennes demeurent des phénomènes
assez nouveaux (Hoque et al., 2010). La position phylogénétique des souches de rhizobia
isolées n’a aucune relation avec leur efficience, bien qu’on ait trouvé quelques souches très
performantes en conditions contrôlées associées à A. saligna, A. ehrenbergiana et A.
karroo qui triplaient le poids sec des plantes inoculées comparativement aux plantes
témoins non inoculées. En outre, cette phylogénie n’a aucune relation avec le profil de
tolérance des souches à la salinité et aux températures élevées. Ce profil est remarquable
comparativement à ce qui a été rapporté par la littérature concernant les souches isolées
d’Acacias des zones arides et semi-arides ; le seuil de tolérance le plus bas pour les
souches isolées étant de 340 mM de NaCl et de 35°C pour la température. De plus
l’étendue de la zone d’échantillonnage, avec des sites possédant des conditions
pédoclimatiques assez diverses, a aussi permis de montrer que ce profil de tolérance in
vitro était indépendant de l’origine géographique des souches isolées, de la conductivité du
sol échantillonné ainsi que de la température maximale enregistrée. Ces résultats
permettent de conclure que les souches utilisées comme inoculum pour la réhabilitation de
sites marginaux doivent être indigènes et sélectionnées préalablement sur la base de leur
efficience et de leur tolérance aux contraintes abiotiques dominantes dans ces régions.
121
Chapitre II. Etude expérimentale. Partie I : Potentiel fixateur d’azote des Acacia en Algérie. Matériels et méthodes
Matériel et méthodes
Introduction
L’utilisation des Arbres Fixateurs d’Azote (AFN) en foresterie et en agroforesterie est
devenue un atout indispensable dans les programmes de revégétalisation, il existe une longue
tradition d’approche biotechnologique d’inoculation pour augmenter la fixation biologique de
l’azote et la productivité, cependant, l’estimation de cette capacité de fixation d’azote est
soumise à différentes contraintes autant méthodologiques qu’inhérentes aux légumineuses.
La fixation de l’azote atmosphérique chez ces dernières dépend de plusieurs facteurs,
liés aux trois partenaires : la plante, le sol et le symbionte microbien. C’est pour cela qu’il faut
différencier entre deux concepts de fixation d’azote : la fixation potentielle d’un arbre qui
correspond à l’aptitude de ce dernier à fixer le N2 en l’absence de tout facteur limitant, et la
fixation réelle qui correspond à la fixation du N2 en présence de facteurs limitants
intervenants toujours dans les conditions au champ. On sait qu’il existe une forte variabilité
génétique dans l'aptitude d’une espèce à la nodulation et à la fixation du N2 (Sanginga et al.,
1990) et que la fixation de N2 potentielle est intrinsèque au système fixateur considéré au sein
de l’interaction « génotype de l’arbre fixateur de l’azote (AFN) x souches de symbiotes
bactériens ». Ceci peut être réalisé en serre en réunissant les conditions les plus favorables
telles que l’inoculation avec une souche efficiente, l’utilisation d’un sol pauvre en azote
minéral et une irrigation suffisante (Dommergues et al., 1999). La première approche de
dilution isotopique dans notre expérimentation se situe entre ces deux types de fixation, par le
biais de l’utilisation des sols des quatre sites étudiés avec leur caractères physico-chimiques
favorisant ou pas la croissance des végétaux, tout en en les soumettant à des conditions
optimum d’éclairage, de température et d’arrosage en serre, la seconde approche in natura
dans les conditions naturelles révèle la fixation réelle par la méthode d’abondance naturelle.
Le pouvoir fixateur est exprimé en Ndfa% (pourcentage d’azote provenant de la fixation dans
une plante fixatrice), il est déterminé pour la plante entière ou un échantillon représentatif (cas
de l’abondance naturelle), ce dernier n’est pas une caractéristique intrinsèque et varie en
fonction des facteurs limitant externes. Ce pouvoir fixateur peut aussi être exprimé en Ndfa
(quantité de N2 fixé) et, si on connaît la biomasse totale exprimée en azote total (Nt), il est
exprimé en g N2 fixé arbre-1.
122
Dans notre approche méthodologique, les variables étudiées, qui sont l’effet du facteur
‘inoculation rhizobienne’ chez les trois espèces d’Acacia testées (A. seyal, A. karroo et A.
saligna) et l’effet combiné de l’inoculation et du facteur ‘sol’ chez A. karroo uniquement,
tenteront de révéler tout d’abord la pertinence de l’utilisation du mélange d’inoculum
rhizobien sélectionné en fonction de chaque type de sol de même que leur compétitivité par
rapport aux souches de rhizobia autochtones mais aussi le potentiel fixateur de ces trois
espèces d’Acacia. L’expérimentation est réalisée à partir de sols prélevés dans quatre sites
d’étude de zones littorales dans la région d’Oran où la diversité rhizobienne a été caractérisée
(Chapitre I et Boukhatem et al., 2012): Sebkha d’Oran, Ferme de Meserghine-Oran; Dunes
d’El Mactaa-Mostaganem et Forêt de M’sila, Boutlilis-Oran. Cette approche de dilution
isotopique est complétée par une estimation de l’abondance isotopique des Acacia étudiés au
champ sur les sites cités préalablement sauf celui situé sur les rives de la Sebkha d’Oran,
dans la mesure où un seul pied d’Acacia était présent, a fortiori introduit et peu représentatif
du lieu. La méthode directe d’estimation quelle soit basée sur l’abondance naturelle du 15N ou
sur la méthode de la dilution isotopique du
15
N donnera une idée précise sur le potentiel
fixateur du partenaire végétal. L’estimation de ce dernier est un atout important dans l’action
introductive de couples symbiotiques dans différents écosystèmes.
1- Méthode de la dilution isotopique après enrichissement du sol en 15N
a- Protocole d’échantillonnage sur le terrain
a-1 Description des sites de prélèvement :
Les sites ont été sélectionnés sur la base se leur représentativité écologique, à savoir :
• Site n°1 : situé à 500 m du rivage de la sebkha (Daïra de Messerghine –Oran-) où
vivent seulement trois arbres d’Acacia seyal en plus de légumineuses herbacées.
L’arbre autour duquel le sol a été prélevé est développé et semble dépasser 10 ans
d’âge.
• Site n°2 : situé à 1 km de la sebkha (Daïra de Messerghine –Oran-), dans une ferme à
vocation céréalière, on y rencontre Acacia karroo utilisé comme haie défensive.
• Site n°3 : forêt de M’sila peuplée de chêne-liège et de pins, des terres ont été
récupérées pour la production agricole entourée de haies d’A. karroo.
123
• Site n°4 : zone côtière de Bomo-plage (Oran), les dunes ont été fixées par A. saligna
dans le cadre d’un programme de stabilisation des dunes initié par la direction des
forêts de Mostaganem. Le sol est sablonneux, les nodosités pouvant être ainsi
récoltées in situ, très près de la surface.
a-2 Prélèvement du sol :
La quantité de sol prélevé variait entre 1 à 2 Kg. Après enlèvement de la litière, le sol
a été prélevé dans la rhizosphère de l’arbre à une profondeur de 0 à 10 cm pour les sols
argileux ou limoneux et de 10 à 20cm pour les sols sablonneux. Les prélèvements ont été
effectués au pied de 05 arbres dans chaque site, avant de mélanger les différents souséchantillons pour constituer l’échantillon final représentatif de chaque site.
b- Protocole de l’expérimentation en serre
Quatre sites, soient quatre sols ont été sélectionnés pour quantifier le pouvoir fixateur
d’azote de trois espèces différentes d’acacias : A. seyal, A. karroo et A. saligna.
La densité de chaque sol a été calculée pour évaluer la quantité d’azote enrichi en 15N
à ajouter à chaque pot, cet apport d’azote n’étant pas inhibiteur de la nodulation. Eucalyptus
camaldulensis a été utilisé comme plante témoin non-fixatrice d’azote car elle présentait la
même vitesse de croissance ainsi que la même architecture racinaire qu’A. saligna (Nasr et
al., 2005) et par extrapolation a servi également de plante de référence non-fixatrice à A. seyal
et A. karroo.
Les pots utilisés avaient une contenance de 0.8 l. De la vermiculite stérilisée a été déposée
dans la moitié inférieure des pots, leurs moitié supérieures ayant été remplies de sol selon sa
densité (protocole §b-2). Pour chaque type de sol on a procédé à trois traitements différents:
-
1er pot : 5 plants d’Acacia.
-
2éme pot : 5 plants témoins non-fixateurs d’Eucalyptus camaldulensis.
-
3éme pot : 5 plants d’Acacia inoculé avec 04 souches efficientes* à raison de 5ml/pot
d’une suspension bactérienne à 107 CFU/ml.
On a préparé 3 pots pour chaque type de sol, soit 12 pots au total pour cette expérimentation.
*Les souches sélectionnées présentent un spectre d’hôte assez large qui a été testé au
préalable (Tableau n°1, annexe E), à savoir : SE3, T82, KHB et E60. Les souches ont été
ensemencées avant de les mélanger dans du YEM liquide et incubées jusqu’à obtention d’une
turbidité équivalente à 107 CFU/ml, les suspensions bactériennes sont utilisées à égales
124
proportions pour constituer le mélange de l’inoculum final. Les plants ont été inoculés avec ce
dernier à raison de 1 ml/plant.
b-1 Scarification des graines
•
Graines d’Acacias : les graines prélevées de chaque site ont été scarifiées
chimiquement à l’acide sulfurique (95%) pendant 30, 30 et 60 minutes respectivement
pour A. seyal, A. karroo et A. saligna. Elles ont ensuite été lavées abondamment à
l’eau distillée stérile et laissées 1 heure dans la dernière eau de rinçage. Puis elles ont
été mises à germer dans des boîtes avec de l’eau gélosée à 0,8% et incubées à
l’obscurité pendant 7 jours à 25°C. Les graines germées ayant développé une radicelle
de 2 cm ont été transférées ensuite dans les pots.
•
Graines d’Eucalyptus camaldulensis (lot CIRAD_Forêt n°93/9778N, Australie) : les
graines ont été désinfectées à l’hypochlorite de calcium (5%) pendant 20 minutes.
Elles ont été ensuite rincées dans 3 bains de lavage avec de l’eau distillée stérile. Les
graines ont été par la suite déposées dans des boîtes de Petri contenant de l’eau gélosée
à 0.8%, puis incubées à l’obscurité pendant 9 jours à 25°C.
b-2 Préparation de la solution isotopique N15
Il faut obtenir une concentration finale de 20 mg d’azote /kg de sol, le marquage se
faisant avec du NH4NO3 enrichi à 10% de 15N. Cette quantité d’azote n’affecte pas la fixation
de N2 et correspond à la dose standard utilisée chez les arbres pour la mesure de l’excès
isotopique 15N avec un spectromètre de masse (Sanginga, 1992).
Soit : (20x100)/35 = 57.14 mg de NH4 NO3 à 10% / kg de sol.
Pour évaluer la quantité de la solution d’azote marqué 15N à utiliser, il faut calculer la
densité de chaque sol.
Calcul de la densité des sols
*La densité apparente (da) exprimée en g/cm3 est le rapport du poids de sol sec (g) sur
le volume total de l'échantillon (cm3). En d'autres termes, elle représente la masse volumique
du sol sec.
125
Densité apparente (da)
=
Humidité volumique
q
=
Humidité pondérale
p
*L'humidité volumique (q) est égale au rapport du volume d'eau d'un échantillon sur le
volume total de l'échantillon.
Humidité volumique (q) =
Volume d’eau d’un échantillon
Volume total de l’échantillon
*L'humidité pondérale (p) est la relation de masse entre l'eau contenue dans un
échantillon et la matière sèche de cet échantillon.
Humidité pondérale (p) =
Masse d’eau
Masse de sol sec
Après avoir mesuré la densité, on calcule la quantité de sol nécessaire pour le
marquage :
Quantité de sol /site (kg) = Nombre de pots (3) x Quantité de sol par pot (0.4kg) x Densité
apparente (da).
La densité calculée pour chaque sol et la quantité du sol utilisée a été réalisée comme suit :
Tableau8 : Densité du sol prélevé dans chaque site d’étude et quantité du sol total estimée
p : humidité
q : humidité
pondérale
volumique
Bomo plage
0.026
0.034
1.3
1.56
Forêt de Msila
0.056
0.081
1.44
1,73
Ferme de Messerghine
0.25
0.27
1.09
1,31
Sebkha
0.22
0.22
1
1.2
Densité apparente
Quantité de
sol/site (kg)
Echantillon
Quantité du sol total
5.8
Un volume de 25 ml de la solution de dilution de l’azote marqué a été utilisé pour
chaque pot.
126
Le volume final de la dilution = nombre de pots x 25ml
= 12 X 25ml
= 300 ml
Quantité totale de NH4NO3 à 10% de
15
N = nombre de pots x quantité de sol par pot x da
x quantité de NH4 NO3 à 10% par kg de sol
(57.14 mg).
= quantité totale de sol x quantité de NH4 NO3 à
10% / kg de sol (57,14 mg).
= 5.8 kg x 57.14 mg /kg.
= 331,412 mg.
Finalement 331,4 mg de NH4 NO3 à 10% ont été dilués dans 300ml d’eau distillée et
25 ml ont été administré à chaque pot.
L’arrosage a été réalisé par nébulisation d’eau stérilisée (1 fois/semaine) pour éviter la
déperdition de la solution d’azote marqué par lessivage. Après une semaine d’adaptation, on a
administré aux plantes 25 ml de la solution de N15 préparée préalablement pour obtenir une
concentration de 25 mg d’azote marqué/kg de sol testé.
b-3 Dosage du 15N :
Après 9 mois de croissance en pépinière, les plantes ont été récoltées, Les nodules ont
été délicatement détachés, comptés, décrits et conservés par la suite dans du glycérol à 60% à
une température de -20°C.
La hauteur des plants a été mesurée et leur poids frais estimé. Ces derniers ont été mis à
sécher à l’étuve pendant 3 jours à 60°C, avant de les peser puis les broyer. Le broyat fin des
tiges, feuilles et racines a été analysé pour le dosage du 15N. L’excès isotopique des différents
échantillons a été déterminé par spectrométrie de masse pour le calcul du Ndfa% (N dérivé de
la fixation du N2 exprimé en pourcentage d’azote total dans la plante fixatrice) et du Ndfa (N2
dérivé de la fixation d’azote dans la plante fixatrice = N2 fixé total) selon les différents
traitements, ces valeurs ont été estimées au niveau de chaque partie des plantes après avoir
mélanger les cinq répétitions par traitement, afin de déterminer la quantité d’azote fixé selon
127
les différentes modalités testées et dans chaque partie de la plante. Les équations utilisées
sont (Peoples et al., 1989):
Ndfa% = 100 x (1 - Ndffi% / Ndffo%)
Ndffi : N dérivé de l’engrais marqué dans la plante fixatrice de N2,
Ndffo : N dérivé de l’engrais marqué dans la plante non-fixatrice de N2 (de référence).
En d’autres termes :
Ndfa% = [1- Ei / Eo] x 100
Ei : excès isotopique dans la plante fixatrice,
Eo: excès isotopique dans la plante de référence non-fixatrice de N2,
Alors que E = % atome du 15N dans l’échantillon du sol ou de la plante,
0.3663% : représentant l’abondance isotopique naturelle en
15
N contenu dans le N2
atmosphérique.
La quantité de N2 fixé est de :
Ndfa = Ndfa% x Nt / 100
Nt : Azote fixé total.
c- Analyse du sol :
Les différents échantillons de sol ont été envoyés à un laboratoire d’analyse
pédologique afin d’évaluer la teneur des sols en azote, phosphore, CEC et carbone.
2- Abondance naturelle en 15N :
Au niveau de chaque site d’étude existe un cortège floristique particulier. Pour évaluer
la fixation de l’azote par la méthode de l’abondance naturelle en
15
N, des échantillons
représentatifs des plantes entières ont été prélevés, à la fois de légumineuses et de plantes
non-fixatrices du même gabarit et un système racinaire d’une architecture et d’un
développement proches.
128
Ces conditions n’étant pas réunies au même endroit dans les quatre sites d’étude,
l’approche pragmatique fut de récolter des rameaux, feuilles de l’année sur cinq arbres de la
même espèce, espacés de 20 mètres en moyenne les uns des autres. Parallèlement, nous avons
prélevé des rameaux et feuilles d’espèces d’arbres non fixateurs, situés à proximité de chaque
arbre fixateur ainsi que de petites légumineuses et non-légumineuses herbacées, lorsqu’elles
étaient présentes.
-
Prélèvement de matériel végétal :
Afin d’évaluer la fixation de l’azote par les Acacias, les feuilles ont été prélevées sur
des rameaux vigoureux de l’année, une longueur de 20 cm à différentes hauteurs de branches
des Acacias étudiés. Trois sites ont été retenus : Bomo-plage, Forêt de M’sila et la Ferme de
Messerghine.
Après prélèvement, les échantillons végétaux ont été séchés à l’étuve pendant 3 jours à
60°C, broyés puis analysés au spectromètre de masse pour la détermination de l’abondance
naturelle en 15N.
Le pourcentage d’azote atmosphérique fixé (Ndfa%) est calculé comme suit (Shearer et Kohl,
1986) :
Ndfa% = ([δ15N (pl. réf.) - δ15N (pl. fix.)] / [δ15N (pl. réf.) – β]) x 100
où :
δ15N (pl.réf.) : composition isotopique de la plante de référence non fixatrice.
δ15N (pl. fix.) : composition isotopique de la plante fixatrice de N2 .
β : coefficient de fractionnement isotopique (appelé aussi facteur d’enrichissement isotopique)
est calculée en mesurant l’abondance naturelle en
15
N de la plante fixatrice de N2 inoculée
avec une souche rhizobienne efficiente et fixant 100% d’azote, croissant sur un substrat
dépourvu d’azote combiné (Mariotti, 1983).
129
Chapitre II. Etude expérimentale. Partie II:: Potentiel fixateur d’azote des Acacia en Algérie. Résultats et discussion
Résultats et discussion
1- Résultats des analyses du sol des trois sites étudiés
Les analyses de sols ont été réalisées à partir d’échantillons prélevés dans l’horizon
0-20 cm dans chacun des sites étudiés. Les résultats obtenus pour les trois sites sont
représentés dans le Tableau 24.
Tableau 24 : Résultats de l’analyse physico-chimique des trois sites étudiés.
Paramètres
Sites d’étude
Ferme St Anne,
Messerghine (Oran)
Dunes d’El Mactaa
(Mostaganem)
Forêt de M’sila,
Boutlilis (Oran)
N total (g.kg-1 sol)
0,34
0,44
0,42
Phosphore (g.kg-1 sol)
0,0167
0,0130
0,0109
* CEC (mEqH+.g-1 sol)
93,6
95,6
82,4
C (%)
5,83
1,13
3,43
M.O. (%)
10,05
1,95
5,91
* CEC : Capacité d’Echange Cationique, MO% (Matière Organique)= C% x 1,724
Le sol des dunes d’El Mactaa, bien que sablonneux, s’avère assez fertile si l’on
considère sa capacité d’échange cationique (CEC) (0,956 meq/100g.sol ) comparée aux
normes (Doucet, 2006 ; Annexe 13) et sa teneur en N total relativement élevée (0,44 g.kg-1
sol) très supérieure à 0,01 g.kg-1 qui est considérée comme la limite inférieure de carence
azotée (Boyer, 1983). Ces valeurs sont proches de celles des sols francs-limoneux (loams)
de la ferme de Messerghine et de la forêt de M’sila. Sachant que les sols sont considérés
comme carencés en P et en N lorsque ces teneurs sont inférieures à 0,030 et 0,01 g.kg-1sol
respectivement (Boyer, 1983), les sols des trois sites présentent un faible niveau en P mais
des teneurs en N assez élevées. Ces résultats sont assez étonnants pour les sols dunaires, si
on considère qu’en général ces derniers sont assez pauvres en éléments nutritifs (Sidda
130
Ould Dah et al., 2005 ; Hatimi et Tabrouche, 2007), cela est peut être du à la présence de
plusieurs légumineuses (une ligneuse et des herbacées) sur le site qui enrichissent le sol par
l’azote fixé grâce à la décomposition de la litière (Dommergues et al., 1999). Le taux de
matière organique est corrélé avec un indice de 1,724 (appelé facteur de Van Bemmelen)
(Broadbent, 1953) et après calcul de la matière organique de chaque site (M.O. %), on
conclu que le sol de la Ferme de Messerghine est le plus riche en matière organique suivi
du sol de la forêt de M’sila et enfin des dunes d’El Mactaa. Pour le sol de ce dernier site, le
faible taux de M.O n’est pas corrélé à la CEC laquelle est assez élevée (Tableau 24), la
matière organique ne participant probablement que d’une manière limitée aux échanges de
cations (Ben Hassin et al., 2008). Néanmoins le taux de M.O% traduit un pouvoir de
résistance à l’érosion (Leprun, 1988), ce qui loin d’être le cas pour les dunes en général.
De plus, il semble que la teneur élevée en N d’un sol donné comme c’est le cas des dunes
d’El Mactaa traduise la forte minéralisation de ce composé, ce qui est une caractéristique
des écosystèmes fermés (Dommergues et al., 1999).
2- Effet du sol sur la croissance de trois espèces d’Acacia
Trois espèces d’Acacia, i.e. A. karroo, A. seyal et A. saligna, ont été testées et
cultivées en serre sur quatre types de sols provenant de quatre écosystèmes différents. Pour
la première espèce, deux sites ont été sélectionnés : la Ferme de Messerghine à vocation
céréalière et la forêt de M’sila ; pour la deuxième espèce, un site proche de la Sebkha
d’Oran ; quant à la dernière, le sol utilisé provient des dunes côtières d’El Mactaa qui a été
l’objet d’un projet de stabilisation de dunes initié par la direction des forêts de
Mostaganem. Neuf mois après l’addition d’azote marqué
15
N à des doses non inhibitrices
de nodulation dans le but d’évaluer la quantité d’azote fixé par les trois espèces d’Acacia
sur les différents types de sols, et ceci à raison de 5 plants inoculés avec un mélange de 4
souches de rhizobium et 5 plants non inoculés par traitement, les plants cultivés sur le sol
de la forêt de M’sila étaient les plus développés, suivis par ceux cultivés sur le sol de la
Sebkha puis par ceux ayant poussé sur le sols de la Ferme de Messerghine et des dunes
d’El-Mactaa (Figure 28). Sachant que seul A. karroo était testé sur deux sols différents et
que les trois espèces d’Acacia testées avaient des vitesses de croissance propres variables,
ces résultats montrent seulement que le sol de la forêt de M’sila est plus fertile que celui de
la Ferme de Messerghine. La croissance des plants d’Eucalyptus camaldulensis utilisés
comme espèces d’arbres témoins non-fixateurs, cultivés dans les mêmes conditions variait
131
également selon le type de sol utilisé, on remarque aussi que la meilleure croissance était
obtenue sur le sol de la forêt de M’sila, comme l’ont montré les mesures de hauteur et de
poids sec moyen des parties aériennes (Figure 29, Tableaux 25 et 26 respectivement).
S4
I
S2
T
S3
NI
S1
Figure 28 : Aspect général des plants cultivés en pots sur sol enrichi en
15N
et disposition des
différents traitements après neuf mois d’expérimentation en serre.
S1 : sol de la ferme de Messerghine (A. karroo) ; S2 : sol de la forêt de M’sila (A. karroo) ; S3 : sol de la Sebkha d’Oran, (A. seyal) ; S4 : Sol des dunes d’El
Mactaa (A. saligna). I : Acacias inoculés avec rhizobia ; NI : Acacias témoins non inoculés avec rhizobia ; T : Plants témoins non-fixateurs (Eucalyptus
camaldulensis).
Figure 29 : Aspect des plants témoins nonfixateurs (Eucalyptus camaldulensis) cultivés sur
les sols des quatre sites étudiés, après neuf mois de
croissance en serre et enrichissement du sol en
15N.
S1 : sol de la ferme de Messerghine ; S2 : sol de la forêt de M’sila ; S3 : sol
de la Sekha d’Oran ; S4 : sol des dunes d’El Mactaa.
S1
S3
S2
S4
132
Tableau 25 : Hauteur des plants et nombre de nodules obtenus chez les différentes espèces d’Acacia
testées, après 9 mois de culture en serre dans des pots contenant du sol enrichi en 15N provenant des
quatre sites étudiés.
Site de prélèvement
Espèce
témoin nonfixatrice de N
Ferme de Meserghine
(site n°1)
Eucalyptus
camaldulensis
Moyenne
Forêt de M'sila
(site n°2)
Moyenne
Sebkha d’Oran
(site n°3)
Moyenne
Dunes d'El Mactaa
(site n°4)
Moyenne
Espèce d’Acacia non inoculée
Espèce d’Acacia inoculée avec
rhizobia
A. karroo
A. karroo
Hauteur tige
(cm)
Hauteur tige
(cm)
Nombre
nodules
Hauteur tige
(cm)
Nombre nodules
17,2±9,54
15,4±7,09
11±17,68
14,8±7,6
15±10,71
Eucalyptus
camaldulensis
A. karroo
A. karroo
Hauteur tige
(cm)
Hauteur tige
(cm)
Nombre
nodules
Hauteur tige
(cm)
Nombre nodules
39,3±20,41
54,8±25,03
8±4,93
44,6±31,08
53,4±124,16
Eucalyptus
camaldulensis
A. seyal
A. seyal
Hauteur tige
(cm)
Hauteur tige
(cm)
Nombre
nodules
Hauteur tige
(cm)
Nombre nodules
33,7±19,21
35,2±16,77
19±9,79
23,3±8,73
31±38,77
Eucalyptus
camaldulensis
A. saligna
A. saligna
Hauteur tige
(cm)
Hauteur tige
(cm)
Nombre
nodules
Hauteur tige
(cm)
Nombre nodules
28,2±34,97
10,37±7,57
35±26,56
7,2±1,52
18±6,76
133
Tableau 26: Poids sec des feuilles, tiges et racines des plants des différentes espèces d’Acacia testées,
après 9 mois de culture en serre dans des pots contenant du sol enrichi en 15N provenant des quatre sites
étudiés.
Site de
prélèvement
Ferme de
Messerghine
(site n°1)
Espèce témoin non-fixatrice
Espèce d’Acacia non
Espèce d’Acacia inoculée avec
de N
inoculée
rhizobia
A. karroo
A. karroo
Poids sec (g/plante)
Eucalyptus camaldulensis
feuilles
tiges
racines
plante
feuilles
tiges
racines
plante
feuilles
tiges
racines
plante
1,4
0,4
0,8
2,6
0,9
3,6
6,1
10,7
1,1
4,3
3,9
10,7
±0,7
±0,2
±0,4
±1,2
±0,15
±0,5
±1,5
±2,1
±0,2
±0,5
±0,6
±0,6
Moyenne
Forêt de
M'sila
(site n°2)
A. karroo
feuilles
tiges
racines
A. karroo
plante
feuilles
tiges
racines
plante
feuilles
tiges
racines
plante
2,5
4,7
4,2
12,4
5,4
13,0
7,7
26,2
4,2
11,9
5,4
21,5
±1,9
±1,1
±0,8
±3,46
±0,8
±1,8
±1,4
±4
±0,8
±2,4
±1,1
±4,2
Moyenne
Sebkha
d’Oran
(site n°3)
A. seyal
feuilles
tiges
racines
A. seyal
plante
feuilles
tiges
racines
plante
feuilles
tiges
racines
plante
4,2
1,6
2,4
8,2
2,9
6,8
7,5
17,2
2,0
4,0
4,1
10,1
±1,1
±0,4
±0,9
±2,4
±0,4
±0,9
±0,9
±2,1
±0,3
±0,6
±0,8
±1,8
Moyenne
Dunes d'El
Mactaa
(site n°4)
A. saligna
feuilles
1,5
tiges
0,4
racines
0,7
A. saligna
plante
feuilles
tiges
racines
plante
feuilles
2,6
3,1
1,6±
3,5
8,1
2,8
±0,21
±0,7
0,5
±0,9
±2,14 ±0,43
tiges
racines
plante
0,7
5,9
10,1
±0,06
±0,61
±1,04
Moyenne
±0,1
±0,03 ±0,08
134
Ainsi, comme le montre le Tableau 25, après neuf mois de croissance en serre, les
plants d’E. camaldulensis cultivés sur du sol de la forêt de M’sila ont une hauteur moyenne
(39,3cm) supérieure à celle de plants cultivés sur les sols de la Sebkha (33,7 cm), des
dunes d’El Mactaa (28,2cm) et surtout de la Ferme de Messerghine (17,2 cm), cependant
selon le test ANOVA à un seul facteur (Tanagra, 1,4) au seuil de 5%, il n y a pas de
différence significative entre les 04 sols (Annexe E-2), de même que pour la variable
‘Poids sec total des plants’ qui donne une indication plus fiable que celles de la hauteur de
la tige (Tableau 26) (Annexe E-2).
En ce qui concerne les plantes fixatrices, le poids sec des parties aériennes d’A.
karroo obtenu sur le sol de la forêt de M’sila était de loin supérieur à celui obtenu sur sol
de la Ferme de Messerghine, comme l’atteste le test de Student-Newman-Keuls qui montre
un effet significatif du facteur sol sur la croissance des plants au seuil de signification
P=0,95 (Annexe E-3 et Figure 30). Ces résultats sont en contradiction avec les analyses de
sols (Tableau 24) puisqu’on a constaté que leurs teneurs en N et C étaient plus élevés dans
le sol de la Ferme de Messerghine. Dans l’absolu, il n’est pas étonnant de trouver que le
sol prélevé de forêt soit plus riche, du fait de la richesse du cortège floristique qui prévaut
dans cette zone de Boutlelis. Le sol de la Sebkha offre aussi un potentiel intéressant bien
que cette région ait été transformée en décharge publique ces dernières années. Il est tout
de même étonnant de ne pas observer de différences de croissance significative entre les
plants cultivés sur sols de dunes côtières, pourtant connues pour leur pauvreté en éléments
nutritifs (Sidda Ould Dah et al., 2005 ; Hatimi et Tabrouche, 2007) même si nos analyses
de sol l’infirment, et ceux cultivés sur le sol de la Ferme de Messerghine.
135
Figure 30 : Aspect des plants d’A. karroo
non inoculés cultivés sur sols de la Ferme de
Messerghine (S1) et de la forêt de M’sila (S2),
après neuf mois de croissance en serre et
enrichissement du sol en 15N.
S1
S2
3- Effet de l’inoculation sur la croissance de trois espèces d’Acacia sur quatre
types de sols
L’inoculation de souches de rhizobium appropriées sur des substrats ayant des
teneurs faibles ou nulles en N minéral, a toujours un effet positif sur la croissance des
légumineuses, du moins en conditions contrôlées où le potentiel d’efficience des souches
rhizobiennes est pleinement exprimé en l’absence de facteurs limitant édapho-climatiques
(Dommergues, 1995). Cependant les modalités d’inoculation au champ doivent respecter
certaines règles, en particulier les critères de choix de la souche de rhizobium à utiliser
voire d’un mélange de souches, même si pour la première hypothèse le contrôle de qualité
est plus facile (Thompson, 1980). Certains auteurs comme Somasegaran et Bohlool (1990)
qui ont comparé l’effet d’inocula mono et multi souches, ont montré que la seconde option
était la plus efficace en raison des adaptations et compétitivités variables des souches selon
le type de sol de culture. D’autres auteurs (Thompson, 1980 ; Keyser et al., 1992 ;
Brockwell et Bottomley, 1995) ont aussi préconisé l’utilisation d’inocula multi-souches sur
la base de leur résistance aux différents facteurs environnementaux et d’un spectre d’hôte
assez large leur permettant de fixer l’azote avec le plus grand nombre d’espèces de plantes
136
hôtes possibles. Pour ces raisons, nous avons opté pour l’utilisation d’un mélange de quatre
souches sélectionnées, propre à chacune des trois espèces d’Acacia testées (Annexe E-1).
Les résultats indiquent que l’inoculation n’a aucun effet positif et significatif sur la
croissance des Acacias et que dans deux cas, elle diminuerait même le développement des
plantes de façon sensible (Tableau 26). Les résultats de poids sec entre A. karroo inoculés,
non inoculés de la ferme de Messerghine et de la forêt de M’sila sont proches, le test de
Student-Newman-Keuls sur l’effet inoculation (Annexe E-4) révélant qu’il n’y a pas de
différence significative au seuil P=0,95 entre traitement des plantes inoculées et non
inoculées (Figures 33 et 34, Annexe E-4). De même qu’on constate qu’il y a pas de
différence significative à P= 0,95 entre les plants inoculés et non inoculés d’A. seyal et d’A.
saligna (Annexe E-5 et Annexe E-6 respectivement) (Figures 31 et 32 respectivement).
Ces résultats révèlent la nécessité d’inoculer en pépinière avant transfert au champ,
les plants sur le sol du site où le couple symbiotique légumineuse-rhizobia sera introduit.
Les tests in vitro de nodulation et d’efficience en conditions contrôlées sont indispensables
pour juger de l’efficience de chaque souche, mais une fois que les souches efficientes
sélectionnées sont mélangées au sein d’un inoculum et entrent en compétition avec la
population rhizobienne autochtone de chaque type de sol, les résultats peuvent être très
aléatoires. Ces résultats sont en contradiction avec les travaux de Galiana et al., 1994 en
Côte d’ivoire, où l’inoculation avait eu un effet positif sur la croissance de Acacia
mangium pendant plus de trois ans après transfert des arbres en plantation, la souche
inoculée ayant été retrouvée 42 mois après l’expérimentation (Galiana et al., 1994), alors
que la fixation d’azote atmosphérique variait de 50 à 90% au sein de la parcelle (Galiana et
al., 1996). Le résultat positif obtenu chez A. mangium pourrait être attribué à la relative
spécificité de cette espèce vis à vis de certaines souches de bradyrhizobia, comme la
souche Aust13c qui a démontré son potentiel d’efficience et de compétitivité en Côte
d’Ivoire ainsi que dans d’autres pays d’introduction, malgré le spectre d’hôte relativement
large généralement observé chez les bactéries du genre Bradyrhizobium (Galiana et al.,
1994). Une autre étude de Lal et Khanna (1996) a aussi démontré une croissance améliorée
d’A. nilotica au champ après inoculation en Inde. Dans ce dernier cas, il a été montré que
la réponse positive à l’inoculation était due à la faible densité de la population rhizobienne
du sol, qui par ailleurs quand elle est trop basse, peut empêcher l’établissement des arbres
fixateurs d’azote (Thrall et al., 2001a). Une autre étude de Shetta (2010) a montré qu’A.
karroo répondait mieux à l’inoculation (en termes de biomasse totale et de fixation d’azote
estimée par la méthode ARA) avec des souches indigènes plutôt qu’avec une souche
137
exogène, probablement en raison de la meilleure adaptation des premières aux conditions
d’aridité locales et à leur meilleure compétitivité vis-à-vis des autres souches autochtones
déjà présentes dans le sol.
En conclusion, le recours à l’inoculation massive de différentes espèces d’Acacia
par des souches de rhizobium dans le cadre de programmes de plantation doit respecter un
certain nombre de règles et doit prendre en compte des indicateurs environnementaux et
édaphiques tels que : l’absence ou la présence d’autres espèces de légumineuses dans le
site à revégétaliser, le degré de dégradation du sol consécutif à la surexploitation de
l’écosystème d’origine (Allen et Allen, 1961), la teneur en N du sol ; mais également des
critères microbiologiques tels que la spécificité d’hôte des rhizobia (Roughley et
Brockwell, 1987) et la compétitivité des rhizobia indigènes vs celle des souches introduites
(Thies et al., 1991) qui est une propriété aussi importante que leur efficience (Triplett,
1990).
NI
I
NI
T
I
T
Figure 31 : Aspect de différents plants d’A.
seyal et de l’espèce témoin non-fixatrice E.
saligna et de l’espèce témoin non-fixatrice E.
camaldulensis cultivés sur sol de la Sebkha
camaldulensis cultivés sur sol de dunes d’El
d’Oran après neuf mois de croissance en serre.
Mactaa après neuf mois de croissance en serre.
I:
I : A. saligna inoculé ; T : témoin non-fixateur (E.
A.
seyal
inoculé ;
T:
témoin
non-
fixateur (E.camaldulensis) ; NI : A. seyal non inoculé.
camaldulensis) ; NI : A. saligna non inoculé
138
NI
I
T
NI
I
T
karroo et de l’espèce témoin non-fixatrice E.
karroo et de l’espèce témoin non-fixatrice E.
camaldulensis cultivés sur sol de la Ferme de
camaldulensis sur sol de la forêt de M’sila après
Messerghine après 9 mois de croissance en serre.
neuf mois de croissance en serre.
I : A. karroo inoculé ; T : témoin non fixateur (E.
I : A. karroo inoculé ; T : témoin non fixateur (E.
camaldulensis) ; NI : A. karroo non inoculé.
camaldulensis) ; NI : A. karroo non inoculé.
4- Estimation du potentiel fixateur de trois espèces d’Acacia sur différents types de
sols par la méthode de la dilution isotopique en 15N
Les plants une fois séchés ont été analysés suivant deux modalités : la première en
analysant l’excès isotopique en 15N et la teneur en N total de chaque plant, avec différents
traitements (inoculés, non inoculés), le deuxième en analysant l’excès isotopique en 15N et
la teneur en N total des mélanges des feuilles, tiges et racines des cinq plants non inoculés.
La comparaison entre ces deux approches, intégrant l’analyse du plant en entier ou du
mélange des différentes parties végétales (feuilles, tiges et racines) nous permettra de
sélectionner la meilleure approche pour le dosage de l’excès isotopique en 15N et en N total
des plants. La seconde approche (analyse du mélange) permet de quantifier l’excès
isotopique en %15N et %N dans les différents compartiments végétaux (feuilles, tiges et
racines).
Il faut rappeler que la dilution isotopique après enrichissement du sol en
dilution isotopique est fondée sur deux hypothèses : i) L’excès isotopique en
15
15
N ou
N de la
plante de référence non fixatrice d’azote est identique à celui du sol. Cette première
hypothèse est toujours satisfaite car la discrimination isotopique éventuelle au moment de
139
l’absorption par la plante peut être négligée dans le cas de cette méthode d’enrichissement
en
15
N. ii) La plante fixatrice de N2 et la plante de référence non fixatrice explorant le
même pool d’azote du sol ont la même abondance isotopique (la plante fixatrice et de
référence absorbent des proportions identiques de
15
N mais pas nécessairement des
quantités identiques de N minéral du sol et de N provenant de l’engrais enrichi en
Ainsi, en cas de fixation de N, l’enrichissement en
15
15
N).
N de la plante de référence non
fixatrice doit être plus élevé que celui de la plante fixatrice, le 15N de cette dernière étant
dilué par le N2 atmosphérique dans ses tissus. Comme l’indique le Tableau 27, ce dernier
cas de figure n’a été observé que chez A. saligna dans notre expérimentation où Eucalyptus
camaldulensis était l’espèce de référence non-fixatrice utilisée. Chez A. karroo cultivé sur
sol de la ferme de Messerghine et de la forêt de M’sila ainsi qu’A. seyal sur sol de la
Sebkha, le Ndffi % (excès isotopique en
15
N de la plante fixatrice de N2) est par contre
largement supérieur au Ndffo % (excès isotopique en 15N de la plante non fixatrice de N2).
Par ailleurs, l’excès isotopique en
15
N mesuré chez les différentes espèces d’Acacia varie
entre les plants inoculés et les plants non-inoculés de même que selon le type de sol chez
A. karroo, cette espèce étant présente sur deux types de sol, à savoir la ferme de
Messerghine et la forêt de M’sila, nous avons procédé à l’étude de l’effet sol sur la teneur
en N total et l’excès isotopique en
15
N, sur la base du test de Student à P=0.95, il y a un
effet significatif du sol de la forêt de M’sila avec un excès moins élevé chez les plants sur
ce sol comparativement à ceux de la ferme de Messerghine (Annexe F2), de même qu’une
teneur en azote total supérieure (Annexe F1). On peut toutefois considérer qu’A. karroo ne
fixe ni sur le sol de la forêt de M’sila ni sur celui de la ferme de Messerghine, l’excès 15N
de l’espèce non fixatrice inferieur à celui d’A. karroo sur sol de Messerghine étant dû à un
artefact expérimental ou à une erreur de mesure.
L’effet de l’inoculation sur les teneurs en azote total des trois espèces (A. karroo, A.
seyal et A. saligna) sur les quatre types de sol est statistiquement non significatif d’après
le test de Student à P=0,05 chez toutes les espèces testées (Annexes F-3, F-5, F-7,et F9), il n’est pas non plus significatif en ce qui concerne l’excès isotopique en 15N chez A.
karroo cultivé sur le sol de la forêt de M’sila (Annexe 6), alors que l’effet de
l’inoculation est statistiquement significatif sur les trois autres espèces des trois autres
sites (Annexes F-4, F-8 et F-10). L’excès en 15N est plus dilué chez A. seyal et A. saligna
non inoculés et chez A. karroo inoculé croissant sur le sol de Messerghine, ce qui sousentend que l’inoculation n’a un effet positif sur la fixation que dans le cas d’A. karroo
cultivé sur le sol de Messerghine.
140
Les plus faibles excès isotopiques en 15N observés chez la plante de référence nonfixatrice E. camaldulensis par rapport à ceux mesurés chez les Acacias cultivés sur les
sols de la Ferme de Messerghine et dans une moindre mesure de la Sebkha d’Oran
pourraient être attribués à la très faible croissance initiale d’Eucalyptus camaldulensis
observée sur ces deux types de sols, lesquels sont également moins développés
comparativement aux Acacias que ceux cultivés sur les sols de la Forêt de M’Sila et des
Dunes d’El Mactaa après 9 mois de croissance (Tableau 27). Les espèces d’Acacia
cultivées sur ces mêmes sols, i.e. A. karroo et A. seyal, sans doute plus adaptées à ces
deux types de sols puisque déjà naturellement présentes sur les deux sites correspondants,
contrairement
à
E.
camaldulensis
seulement
utilisée
pour
les
besoins
de
l’expérimentation, se sont donc bien mieux développées que les eucalyptus. Ayant pris
toutes nos précautions pour ne pas avoir de perte d’azote minéral enrichi en 15N (lequel a
été mélangé au substrat-sol à T0) pendant neuf mois de croissance des plants, notamment
à travers un arrosage régulier des plants au goutte-à-goutte, les pertes de
15
N par
lixiviation peuvent être considérées comme mineures. La vitesse de croissance trop faible
observée chez la plante de référence non-fixatrice par rapport à la plante fixatrice sur les
deux sols en question suffit à expliquer les faibles excès en
15
N obtenus chez les
premières. Bien que l’application de la méthode de dilution isotopique nécessite le choix
d’une espèce de référence non-fixatrice de N2 ayant la même vitesse et le même rythme
de croissance que la plante fixatrice étudiée (Dommergues et al., 1999), ces conditions
sont rarement réunies chez les arbres, a fortiori lorsqu’ils croissent sur du sol plutôt que
sur substrat artificiel en raison des capacités adaptatives très souvent différentes entre
espèces.
141
Tableau 27 : Excès isotopiques en 15N et teneur en N total mesurés chez les plants des différents
traitements, et calcul du pourcentage de N fixé et de la quantité de N total fixé chez les différentes
espèces d’Acacia après application d’azote minéral enrichi en 15N et neuf mois de croissance en serre sur
différentes origines de sols.
Origine du
sol
Espèce
d’arbre
Ferme
Messerghine
A. karroo
Traitementa
Poids sec
Excès
cumulé isotopique
des plants en 15N (%)
b
(g)
A. karroo
A. seyal
Dune El
Mactaa
0,61±0,09
0,06
Non
inoculé
10,7
5,46±0,37
0,62±0,14
0,07
2,6
1,93
0,5
0,01
Inoculé
21,5
1,12±0,31
0,69±0,12
0,18
Non
inoculé
26,2
1,00±0,25
0,64±0,25
0,24
12,4
1,10
0,44
0,06
Inoculé
10,1
2,23±0,05
0,84±0,31
0,10
Non
inoculé
17,2
1,46±0,12
0,9±0,25
0,11
8,2
1,05
0,51
0,04
Inoculé
5,9
5,55±0,48
1,31±1
0,08
45,43
0,035
Non
inoculé
8,1
4,14±0,11
1,03±1,14
0,08
59,35
0,049
2,6
10,17
0,61
2,6
E,
camaldulensis
aLes
plant) d
3,97±1,52
E.
camaldulensis
Acacia
saligna
N total
fixé (mg/
9,3
E.
camaldulensis
Sebkha
N total
Ndfa%
mg/
c
plant
Inoculé
E.
camaldulensis
Forêt de
M'Sila
Teneur
en
N total
(%)
0
0
0
0
-
-
0
0
0
0
-
-
0
0
0
0
-
-
plants d’Acacia ont été inoculés ou non par un mélange de 04 souches de rhizobium ( SE3, T82, KHB et E60) ; b L’excès
c
isotopique en 15N moyen a été mesuré au niveau des plants entiers à raison de 5 plants ou répétitions par traitement ; Le
pourcentage de N dérivé de la fixation atmosphérique a été calculé comme suit : Ndfa% = 100 x (1 - Ndffi% / Ndffo%,
Ndffi représentant l’excès isotopique en 15N mesuré chez la plante fixatrice de N2, (soient les différentes espèces d’Acacia
testées) et Ndffo ,l’excès isotopique en
15N
mesuré chez la plante de référence non-fixatrice de N2, (Eucalyptus
d
camaldulensis) ; La quantité moyenne de N total fixé par la plante fixatrice a été calculé comme suit : Ndfa
Ndfa = Ndfa% x Nt
/ 100.
142
Si l’on s’intéresse plus particulièrement à l’excès isotopique en
15
N et au N total
contenus dans les différentes parties végétales à savoir les racines, les feuilles et les tiges,
on note que majoritairement, la valeur en N est plus élevée au niveau des feuilles (Tableau
28). Cela est observé pour A. karroo sur les sols de Messerghine et de la forêt de M’sila et
A. seyal sur le sol de la Sebkha (1,24 ; 1,42 et 0,81 % N respectivement), à l’inverse d’A.
saligna sur le sol des dunes d’El Mactaa qui a une teneur plus élevée au niveau des racines
(0,75), ceci est sans doute dû à un caractère propre à cette espèce et à une légère carence
des feuilles en azote malgré une fixation de N active. Mais dans tous les cas et chez toutes
les espèces testées, le taux de N le plus bas est mesuré dans les tiges.
Concernant l’excès isotopique en
15
N, le taux le plus élevé se situe au niveau des racines
chez A. karroo cultivé sur sol de Messerghine et de la forêt de M’sila (7,19 et 1,22
respectivement, Tableau 28). On sait que les racines sont le site d’absorption du 14N (issu
du sol et de l’azote atmosphérique après fixation) et du
15
N (issu de l’engrais marqué), et
même si les racines sont le siège de la fixation d’azote atmosphérique via les nodules, tout
se passe comme si cette ligneuse gardait l’azote marqué au niveau des racines et
transportait l’azote fixé vers la tige et les feuilles. Quant à A. seyal sur le sol de la Sebkha,
il concentre l’azote marqué au niveau de la tige et des feuilles (2,48 et 2,26 respectivement,
Tableau 28) tandis qu’A. saligna le concentre majoritairement au niveau des feuilles
(4,53). On peut supposer que le transport de l’azote marqué se fait activement chez A.
saligna et A. seyal (d’où la concentration élevée en %15N au niveau des feuilles,) et
faiblement chez A. karroo. D’où la nécessité d’agir avec la plus grande prudence lorsqu’on
ne peut pas prélever toute la plante, notamment chez les arbres, sachant que les
échantillons de feuilles ne permettent pas d’estimer de façon précise le taux de fixation au
niveau de la plante entière.
143
Tableau 28 : Teneur en N et excès isotopique en 15N dans les différents organes (racines, tiges et
feuilles) des Acacias non inoculés après application d’azote minéral enrichi en 15N et neuf mois de
croissance en serre sur différentes origines de sols.
Origine du sol
Espèce
d'Acacia non
inoculée
Organe
Racines 1 à 5
Tiges 1 à 5
Feuilles 1 à 5
Racines 1 à 5
Tiges 1 à 5
Feuilles 1 à 5
Racines 1 à 5
Tiges 1 à 5
Feuilles 1 à 5
Racines 1 à 5
Tiges 1 à 5
Feuilles 1 à 5
Ferme Messerghine Acacia karroo
Forêt de M'Sila
Acacia karroo
Sebkha d’Oran
Acacia seyal
Dune El Mactaa
Acacia
saligna
Teneur en N
(%) moyenne
Excès
Teneur en de la plante
isotopique
N (%)
a
en 15N (%)
entière
0,44
0,37
1,24
0,75
0,51
1,42
0,70
0,40
0,81
0,75
0,42
0,60
0,48
0,77
0,6
0,64
7,19
5,79
5,42
1,22
1,06
0,89
1,79
2,48
2,26
3,760
3,72
4,53
Excès
isotopique en
15
N moyen (%)
de la plante
b
entière
6,5
1,07
0,38
4,09
a
N% moyen/plante= : [%N racines x Pds sec racines) + (%N tiges x Pds sec tiges) + (%N feuilles x Pds sec feuilles)] / Poids
sec de la plante entière
b
Excès en 15N % moyen/plante = : [%15N racines x Pds sec racines) + (%15N tiges x Pds sec tiges) + (%15N feuilles x Pds sec
feuilles)] / Poids sec de la plante entière
La plante de référence non fixatrice représentée par d’Eucalyptus camaldulensis
ayant un excès isotopique en
15
N inférieur à celui mesuré chez A. karroo et A. seyal, on
peut considérer que ces deux espèces ne fixent pas sur es sols correspondants avec un
Ndfa% nul, à l’inverse, le Nsfs% d’A. saligna estimé à 45,3% pour les plants inoculés et de
59,35% pour ceux non inoculés (Tableau 27). Si l’on se réfère à la littérature (Ganry et
Dommergues, 1995 ; Dommergues et al., 1999) A. saligna fait partie du groupe d’espèces
de légumineuses ligneuses à potentiel de fixation de N2 moyen à élevé. Ceci est confirmé
par la comparaison du Ndfa% d’A. saligna dans cette expérimentation avec ceux calculés
chez d’autres espèces comme Acacia caven, Prosopis alba et Prosopis chilensis qui, dans
une étude menée au Chili, atteignaient à l’âge de 1 an des valeurs moyennes de Ndfa%
nettement plus basses, soit 14, 25 et 31% respectivement d’après la méthode de dilution
isotopique (Ovalle et al., 1996). De la même façon, les valeurs de fixation (Ndfa%)
obtenues chez Faidherbia albida au Sénégal étaient inférieures à celles estimées chez A.
saligna dans notre étude, inoculés ou pas, puisqu’elles variaient de 15 à 23% à l’âge de 1
an d’après la méthode de dilution isotopique (Gueye et Ndoye, 2000).
144
La dilution isotopique a donné une bonne estimation de la fixation d’azote atmosphérique
chez A. saligna et les désavantages majeurs ont été contournés, tels que les pertes d’azote
enrichi en 15N par lessivage grâce à une irrigation en eau au goutte-à-goutte. Car l’une des
limitations majeures de cette méthode réside dans la baisse du ratio
temps après l’application initiale d’azote minéral enrichi en
15
15
N/14N au cours du
N (Fried et al., 1983). Par
ailleurs, si l’expérimentation avait été réalisée sur le terrain, d’autres contraintes plus
difficiles à surmonter auraient dû être levées, tel que l’épandage graduel et à intervalles
réguliers de l’azote enrichi en 15N (Danso et al., 1992 ; 1993) ou bien la nécessité d’avoir
un sol ou un substrat suffisamment drainant qui permette une diffusion homogène et
optimale de l’isotope (Fried et al., 1983, Witty et Ritz, 1984), conditions faciles à obtenir
en expérimentation en pots et en pépinière. Cependant le point crucial dans cette
méthodologie est le choix de la plante référence non fixatrice qui doit répondre à plusieurs
critères, comme ceux rapportés par Fried et al., 1983, notamment avoir une vitesse de
développement et un rythme de croissance similaires à ceux de l’espèce fixatrice de N2
étudiée, avoir le même taux d’absorption des différentes formes de N en le puisant dans le
même pool d’azote du sol. Or, on a vu que ce n’était pas le cas entre les deux espèces
fixatrices A. seyal, A. karroo et E. camaldulensis et que la nature du sol interagissait aussi.
Ndoye et al, (1995) ont déjà utilisé deux plantes non fixatrices pour A. seyal qui sont
Parkia biglobosa et Tamarindus indica, deux espèces de légumineuses de la famille des
Caesalpiniacées, la première ayant sous-estimé la fixation comparativement à la deuxième.
En revanche, aucune étude d’estimation de la fixation d’azote n’a été effectuée chez A.
karroo. La meilleure approche pour parer contre toute source d’erreur liée aux plantes de
référence non fixatrices est d’utiliser plusieurs plantes de références dans la même
expérimentation (Awonaike et al., 1993), même s’il existe une autre alternative basée sur
l’utilisation de modèles dépendants ou indépendants au champ basés sur l’analyse de
différents paramètres d’extrait du sol, à savoir l’azote marqué et l’azote total mais qui
nécessite d’autres mises au point prélables (Chalk et Ladha, 1999).
Les résultats obtenus pour A. saligna en pépinière sont très encourageants pour l’utilisation
de cette espèce d’arbre en tant qu’espèce pionnière à introduire dans le cadre de
programmes de revégétalisation, puisqu’elle est susceptible d’enrichir rapidement les sols
en azote.
Il ne faut tout de même pas oublier que les valeurs obtenues en pépinière doivent être
interprétés avec prudence, il semble que ces dernières soient très largement supérieures à
145
celles enregistrées sur le terrain. A titre d’exemple, les valeurs obtenues en pépinières ont
été estimées à 130-230 fois supérieures en matière sèche et 110-160 fois supérieures en
azote total comparativement aux paramètres obtenus au champ pour les deux espèces
Acaia alata et Acacia pulchella (Hansan et Pate, 1987).
5- Estimation du potentiel fixateur in situ de trois espèces d’Acacia sur différents
types de sols par la méthode de l’abondance naturelle
Sur chaque site, sur 5 individus par espèce et par site, les échantillons de feuilles
ont été prélevés chez les différentes espèces d’Acacia ainsi que chez trois à quatre espèces
de références non-fixatrices présentes sur le même site, ligneuses ou herbacées,
représentatives des différents sites en termes d’abondance (Figure 35). Ainsi, dans la ferme
de Messerghine ont été prélevées des feuilles d’A. karroo bien développées portées par de
jeunes rameaux, et des échantillons foliaires des trois espèces suivantes: Oxalis sp., Ballota
hirsuta Bentham.et Atriplex sp. Dans le site de la forêt de M’sila, les échantillons foliaires
étaient collectés sur des arbres d’A. karroo, des plants Oxalis sp., Ballota hirsuta ainsi que
d’Olea europaea et de Quercus suber. Enfin, sur les dunes d’El Mactaa où A. saligna a été
introduit depuis 2004, les échantillons foliaires ont été récoltés sur les 3 uniques espèces
présentes sur ce site : Retama monosperma, espèce de légumineuse arbustive spontanée,
Eucalyptus sp. planté au même moment que les A. saligna et Centaurea calcitrapa une
espèce d’Astéracée herbacée sauvage. Le choix d’espèces non ligneuses parmi les espèces
de référence non-fixatrices résulte du faible nombre d’espèces ligneuses disponibles dans
chaque site. Cependant, ces espèces herbacées peuvent constituer des espèces de référence
tout à fait adaptées à l’estimation de la fixation de N2 comme l’ont démontré plusieurs
auteurs qui observaient des abondances naturelles en 15N (δ15N‰) très proches entre arbres
fixateurs et espèces herbacées présents dans une même région (Van Kessel et al ., 1994 et
Boddey et al., 2000).
Les teneurs en N des plantes de référence non-fixatrices varient fortement à l’intérieur d’un
même site. Celles présentes à la fois sur les sites de la ferme de Messerghine et la forêt de
M’sila, soit Oxalis sp. et Ballota hirsuta Bentham ont des teneurs en N qui ne varient pas
significativement d’un site à l’autre, i.e. de 28,9 à 29,7 g.kg-1 et de 43,6 à 42,4 g.kg -1 chez
chacune de ces deux espèces respectivement (Tableau 29). Par contre, les abondances
naturelles en
15
N (δ15N‰) mesurées chez ces deux dernières espèces sont beaucoup plus
élevées sur le site de la Ferme de Messerghine que sur celui de la Forêt de M’Sila, i.e. 3
146
fois plus chez Ballota hirsuta Bentham et 2,5 fois plus chez Oxalis sp., de même que chez
A. karroo dont les valeurs de δ15N obtenues sont 2,7 fois plus élevées à Messerghine qu’à
M’Sila (9,4 et 3,5 ‰ respectivement). Parmi les espèces exclusives d’un site, O.europaea
et Q.suber, uniquement présentes sur le site de la Forêt de M’Sila, ont des valeurs de δ15N
basses et similaires à celles des autres espèces de ce site, i.e. 2,0 et 3,7‰ respectivement,
tandis que l’espèce arbustive Atriplex sp., seulement présente sur le site de Messerghine,
possède un δ15N très élevé (9,9‰) dont la valeur est proche de celles mesurées chez les
autres espèces de ce même site, herbacées ou même fixatrice de N2 comme A. karroo.
Globalement, on observe que les valeurs d’abondance en
15
N varient d’une espèce de
référence à l’autre, et ce, sur un même site et que certaines d’entre elles ont un δ15N
nettement supérieur à la moyenne, comme Oxalis sp., d’autres ayant un δ15N nettement
inférieur à la moyenne, comme Olea europaea (Tableau 29). Chez cette dernière espèce,
ceci a déjà été observé dans des travaux réalisés au Maroc (Galiana A., communication
personnelle).
On remarque une assez grande homogénéité entre les teneurs en N et δ15N chez les
différents individus d’une même espèce prélevés dans chaque site sauf pour Oxalis sp.
dans la ferme de Messerghine dont l’écart-type à la moyenne est élevé (6,5) et pour
Centaurea calcitrapa des dunes d’El Mactaa avec des valeurs d’écart-type de l’ordre de
18,53 et 6,99 pour la teneur en N total et l’abondance isotopique en
15
N respectivement
(Tableau 29).
La comparaison des valeurs de δ15N obtenues chez les espèces non-fixatrices de N2
et A. karroo dans ces deux derniers sites indiquent clairement que cette dernière espèce
d’Acacia ne fixe pas d’azote ou très peu dans les deux cas, comme le montrent les valeurs
de Ndfa% calculées en fonction de chaque espèce non-fixatrice de référence (Tableau 29).
Par contre, sur le site des Dunes d’El Mactaa, A. saligna a une abondance naturelle en 15N
proche de 0 et même négative (δ15N = -0,4), tout comme l’espèce de légumineuse arbustive
Retama monosperma (δ15N = -0,2), ce qui suggère des activités fixatrices de N2 élevées
chez ces deux espèces si on compare leurs abondances en
15
N avec celle de Centaurea
calcitrapa (δ15N = 3,3), seule espèce herbacée (annuelle) non-fixatrice présente sur le
même site (Tableau 29). Par contre, la valeur d’abondance en 15N mesurée chez l’arbre de
référence non-fixateur Eucalyptus sp. (δ15N = 0,1), également présent sur les Dunes d’El
Mactaa à proximité immédiate des A. saligna, contredit l’affirmation précédente. Plusieurs
hypothèses peuvent être émises : i) Les horizons de sol explorés par les deux espèces non147
fixatrices sont très différentes en raison de leur statuts herbacé et arboré respectivement.
Or, on sait que l’abondance naturelle en
15
N d’un sol varie avec la profondeur, laquelle
influe directement sur les valeurs de δ15N des espèces non-fixatrices de N2 (Högberg,
1997) ; ii) Les différentes espèces de plantes de référence non-fixatrices poussant sur un
même sol n’assimilent pas forcément les mêmes sources d’azote minéral, les ions nitrate vs
ammonium en particulier, lesquelles peuvent avoir des signatures isotopiques très
différentes ; iii) Il est possible qu’un transfert d’azote fixé se soit produit à partir de la
minéralisation de la litière des A. saligna qui s’est accumulée au pied des Eucalyptus,
baissant ainsi progressivement le δ15N de ces derniers arbres au cours du temps, d’autant
que la teneur en azote des sols sableux est en général très faible, surtout en profondeur et
donc que les sources de N extérieures sont rares ; iv) Chaque espèce de plante a également
son propre facteur discriminant en
15
N naturel, ce qui explique ces variations de δ15N
observées entre les différentes espèces non-fixatrices des sites de Messerghine et de la
forêt de M’Sila, mais qui restent assez faibles contrairement à El Mactaa.
1
2
3
4
148
Figure 35 : Aspect de certaines plantes non fixatrices des régions étudiées : (1) Quercus suber, (2)
Ballota hirsuta Bentham, (3) Centaurea calcitrapa, (4) Olea europaea.
Pour estimer de façon la plus fiable et précise possible la fixation de N2 par la
méthode de l’abondance naturelle, il faut que le δ15N de la plante référence soit différent de
zéro, que les variations du δ15entre les différentes plantes de références soient relativement
peu importantes et que la valeur du δ15N de la plante fixatrice se situe entre la valeur ß et la
valeur du δ15N de la plante de référence (Shearer & Kohl, 1986; Högberg, 1997; Boddey
et al., 2000). Les deux premières conditions ont été remplies (Tableau 29).
Tableau 29 : Teneurs en N et abondance naturelle en 15N d’échantillons foliaires d’espèces fixatrices
de N2 et de plantes références non-fixatrices présentes dans les trois sites d’étude et la proportion de N
fixée (Ndfa%) par les différentes espèces d’Acacias en fonction des différentes espèces non fixatrices
dans trois sites d’Algérie.
Site
Oxalis sp.
29,7±0,73
Ndfa% ª
ß=0 ß=-2
12,0±6,5 21,7 18,6
Atriplex sp.
46,3±2,7
9,9±0,05 5 ,0 4,2
Ballota hirsuta Bentham
42,4±0,8
8,6±3,26
/
Acacia karroo
20,2±0,18
9,4±0,19
-
Oxalis sp.
28,9±1,86
4,8±1,86 27,1 19,1-
Ballota hirsuta Bentham
43,6*
3,3*
/
/
Olea europaea
25,3±1,5
2±4,5
/
/
Quercus suber
23,8*
3,7*
Acacia karroo
19,1±1,49
3,5±2,3
Centaurea calcitrapa
29,5±18,53
3,3±6,99 112 69,8
Eucalyptus sp.
16,2±0,55
0,1±1,2
-
23,8
Retama monosperma
29,4±0,32
-0,2±1,56
-
-
Acacia saligna
27,7±1,26
-0,4±3,7
-
-
Teneur N (g/kg) δ15N‰
Espèce
Ferme de Messeghine
Forêt de M'sila
-
5,4 3,5
-
-
Dunes d'El Mactaa
a
Ndfa% calculé chez les acacias en fonction de la plante de référence non-fixatrice considérée et des deux valeurs β
(coefficient de fractionnement isotopique) extrêmes d’hypothèse.
*Un seul individu
149
Pour la dernière, il faut tout connaitre cette valeur ß qui correspond au δ15N de la plante
fixatrice, fixant 100% de N en absence de tout facteur contraignant (estimé sur un milieu
dépourvu d’azote et après inoculation avec une souche rhizobienne adéquate), lequel se
situe généralement entre -3 et 0‰ (Handley et Raven, 1992 ; Kurdali et al., 1993).
Cependant, la plupart des valeurs du δ15N chez les arbres semblent converger entre -2 et 1,4 (Domenach et al., 1992 ; Ladha et al., 1993 ; Nygren et al., 2000 et Yoneyama, 1987).
Comme les valeurs ß ne sont pas disponibles pour A. karroo et A. saligna, nous avons
utilisé les deux valeurs extrêmes de 0 et de -2 comme hypothèse de calcul du Ndfa% pour
couvrir l’intervalle probable le plus étendu possible (Koponen et al., 2003 ; Roggy et al.,
1999 et Shearer et Kohl, 1986).
Ainsi, on a pu calculer le Ndfa% pour A. karroo sur les deux sites seulement avec
les plantes de références dont le δ15N‰ était supérieur à celui de la plante fixatrice. Cette
condition était satisfaite chez Oxalis sp. et Atriplex sp. sur le site de la ferme de
Messerghine, ainsi que chez Oxalis sp.et Quercus suber sur le sol de la forêt de M’sila
(Tableau 29). Nos résultats montrent que les valeurs de Ndfa% calculées en fonction des
différentes hypothèses varient plus en fonction du δ15N de la plante de référence que la
valeur du facteur ß. Le Ndfa% varie peu en fonction de ce dernier facteur (β=0 vs β=−2)
quand les valeurs de Ndfa% sont basses, comme c’est le cas pour A. karroo, mais varient
beaucoup plus lorsque le Ndfa% est élevé, comme chez A. saligna. Malgré la variabilité de
l’abondance naturelle en
15
N chez les différentes espèces de référence non-fixatrices
échantillonnées sur un même site, nos résultats montrent clairement qu’A. karroo a un très
faible potentiel fixateur d’azote puisque, selon les différentes hypothèses, elle fixe très peu
de N2 ou pas du tout sur les deux sites choisis malgré leurs sols très différents. Par ailleurs,
l’utilisation d’Oxalis sp. comme plante de référence surestime la proportion de N2 fixé
chez A. karroo dans les deux sites et si l’on prend le δ15N moyen de toutes les espèces de
référence non-fixatrices d’un même site, le Ndfa% calculé chez A. karroo est quasi-nul
dans les deux sites. A l’inverse, A. saligna fixe de fortes proportions de N sur les dunes
d’El Mactaa, jusqu’à 100%, même si les résultats restent contradictoires puisque l’on
obtient des Ndfa% extrêmes selon l’espèce de référence non-fixatrice considérée (Tableau
29). Une seule étude d’estimation de la fixation a été réalisée chez A. karroo (Schulze et
al., 1991), laquelle révélait une proportion d’azote fixé de 25% d’après les mesures
d’abondance naturelle en
15
N des feuilles prélevées sur des arbres de zones arides en
Namibie.
150
Il est intéressant de constater que les valeurs des Ndfa% obtenues par la méthode
d’abondance isotopique sont finalement assez similaires à celles obtenues par dilution
isotopique (Tableaux 27 et 29) malgré des conditions expérimentales totalement
différentes. Ceci est d’autant plus remarquable que les valeurs de Ndfa% obtenues dans
l’expérimentation en serre par dilution isotopique en utilisant les sols rapportés des
différents sites ont été estimées à partir de plantes entières âgées de 9 mois tandis que le
Ndfa% des acacias in situ a été estimé par détermination de l’abondance isotopique en
15
N de feuilles collectées sur des arbres matures. Ceci montre la validité de cette dernière
méthodologie qui a été largement utilisée pour estimer la fixation de N2 par les
légumineuses dans les écosystèmes naturels en raison de la difficulté, et souvent
l’impossibilité chez des arbres âgés que représente la mesure du δ15N au niveau de l’arbre
entier (Schulze et al., 1991 ; Yoneyama et al., 1993 ; Bouillet et al., 2008). Globalement,
ceci confirme que l’abondance naturelle en
15
N varie en fonction d’un grand nombre de
facteurs environnementaux et physiologiques (Högberg, 1997 ; Galiana et al., 2004 ;
Pfautsch et al., 2008) qui donne souvent une estimation semi-quantitative de la fixation
de N2 (Pons et al., 2006) et que sa variabilité naturelle in situ nécessite un
échantillonnage assez intensif pour minimiser les variations individuelles chez les
différentes espèces de référence non-fixatrices de N choisies.
151
Conclusion et
Perspectives
Conclusion et perspectives
Conclusions et perspectives
Cette étude a permis de dresser une ébauche de recensement des Acacia sp. de la
région Nord Ouest et Sud algérien. Les espèces rencontrées sont pour la plupart xériques,
elles offrent une grande plasticité et une bonne adaptation dans les sites prospectés. On a
répertorié Acacia ehrenbergiana, A. seyal, A. tortilis, A. nilotica, A. albida et A. laeta
considérées comme espèces autochtones ainsi qu’A. karroo et A. saligna comme espèces
introduites.
Un assez faible nombre de BNL a été isolé des sols échantillonnés du Sud algérien,
ce qui a conduit à une pauvre représentation de la diversité rhizobienne d’A. nilotica et
Faidherbia albida exclusifs à la wilaya de Tamanrasset ainsi qu’A. tortilis. Seul un quart
des 288 isolats ont pu renoduler leur plantes hôtes. Cela peut être expliqué par la perte des
gènes de nodulation après des repiquages successifs, cela est prouvé dans le cas d’une
souche qui a suscité notre intérêt nettement en améliorant la croissance végétale de la
plante inoculée sans initier la formation de nodosités par son effet PGPR (Plante Growth
Promoting), après séquençage, cette dernière a prouvé son appartenance à l’espèce de
Rhizobia sp. Ce phénomène de non renodulation est peut être du aussi au repiquage des
endophytes qui ont proliféré sur les boites de Petri au détriment des rhizobia au nombre
plus faible. Cependant, cette absence de renodulation n’a été fréquente qu’en zones
désertiques au contraire des régions méditerranéennes où la majorité des isolats ont pu
initier la formation de nodosités chez leur plante hôte.
La collection des nouvelles souches a montré une grande diversité génétique qui a
formé 10 groupes phylogénétiques distincts, représentant cinq genres bactériens : Ensifer,
Mesorhizobium, Rhizobium, Bradyrhizobium et Ochrobactrum. La diversité génétique et
phénotypique ne reflètent pas une relation particulière entre la position phylogénétique des
souches bactériennes et i) leur tolérance à la salinité et ii) leur efficience envers leurs
plantes hôtes. De plus grâce à la variété des espèces hôtes et l’étendue géographique des
zones prospectées à travers l’Algérie, on a clairement démontré qu’il n y avait pas de
corrélation entre les tolérances in vitro des souches à la salinité et aux températures élevées
et les caractéristiques édapho-climatiques de leurs régions d’origine et plus précisément les
températures maximales et la conductivité électrique des sols échantillonnés. Néanmoins,
la tolérance des souches isolées à la salinité et hautes températures est très intéressante,
151
comparativement à ce qui a été rapporté par la littérature concernant les souches associées
aux Acacias, isolées d’autres pays en général et d’Afrique en particulier.
Le séquençage partiel du 16S rADN même s’il demeure un bon indicateur
d’affiliation, ce dernier ne révèle pas la position taxonomique exacte des souches
rhizobiennes, surtout concernant les souches de Bradyrhizobium qui nécessitent le
séquençage de leur 16S-23S rARN-ITS pour indiquer leur appartenance au niveau de
l’espèce. Par ailleurs, toujours en ce qui concerne la caractérisation bactérienne, le
phénodendrogramme établi à partir de 58 caractères phénotypiques a prouvé un haut
potentiel discriminant, cependant il demeure très insuffisant pour permettre une
identification.
La deuxième partie de cette étude a révélé la nécessité de conduire des essais
d’évaluation de l’efficience des inocula sélectionnés en pépinière ou au champ en
complément des essais in vitro pour évaluer leur comportement en conditions réelles face
aux contraintes biotiques et abiotiques se trouvant au niveau du site de leur introduction.
L’estimation de la fixation d’azote a révélé qu’A. saligna avait le plus haut potentiel
fixateur d’azote d’après la méthode de dilution isotopique en pépinière, de même que pour
le pouvoir fixateur d’azote réel qui a été évalué in situ par la méthode de l’abondance
naturelle en δ15N, comparativement à A. karoo et A. seyal. Ces résultats démontrent qu’A.
saligna est un bon candidat pour les essais de réhabilitation des zones dégradées.
En parallèle, on doit rechercher des provenances d’arbres tolérant des conditions
édaphoclimatiques particulières, notemment à partir de zones marginales. Ceci implique
des explorations in situ de matériel génétique pour des espèces de plantes d’intérêt afin
d’établir une base génétique plus large sachant que la distribution géographique des
Acacias en Algérie reste peu documentée. En outre, il faudrait rechercher des plantes de
référence non fixatrices spécifiques aux espèces d’Acacias répertoriées: A. karoo, A.
ehrenbergiana, A. seyal, A. tortilis, A. nilotica, A. laeta et Faidherbia albida et cela afin de
pouvoir estimer le potentiel réel de fixation de l’azote atmosphérique chez ces espèces
grâce à la méthode de dilution isotopique. En complément de l’expérimentation de
l’estimation du potentiel fixateur d’azote en serre, il faudrait évaluer le taux d’occupation
des nodules obtenus chez les trois espèces testées par les souches de l’inoculum mixte
utilisé comparativement aux souches indigènes à chaque sol. Cela pourra expliquer plus
clairement l’absence de l’effet inoculation sur la fixation d’azote.
Dans un futur proche, il faudrait préciser la position taxonomique d’un groupe
indéterminé mais très différentié de souches de BNL renodulantes, isolées de nodosités
152
d’A. saligna de Bomo Plage et qui ne sont apparentées à aucune souche de référence
incluse dans l’arbre phylogénétique. D’un autre côté, en complément du profil de tolérance
des rhizobia isolés, aux différents contraintes de salinité, de température élevée et de Ph,
on doit s’intéresser à l’étude de la symbiose Acacia-BNL dans les conditions adverses qui
prévalent dans les zones à revégétaliser.
Cette étude a révélé une diversité botanique et microbienne intéressante, avec un
potentiel d’efficience prometteur de certains symbiotes dans les conditions contrôlées pour
des souches associées principalement à A. seyal, A. saligna et A. karroo. Cependant, à ce
stade de connaissance, on peut conclure que la meilleure approche pour des programmes
de reforestation devrait se baser sur une étude approfondie du site à revégétaliser portant
sur les caractéristiques pédologiques, l’historique botanique et la caractérisation des
populations rhizobiennes indigènes du site. Une fois ces paramètres établis, il faudrait, sur
la base des résultats obtenus opter pour des souches rhizobiennes autochtones efficientes et
compétitives déjà associées aux espèces cibles provenant de conditions pédo-climatiques
similaires à la région à réhabiliter. Un programme de coopération doit être établi avec les
services de foresterie dans le futur afin de mener des projets de revégétalisation basés sur
la symbiose rhizobienne qui augmentera les chances de survie des plants transférés au
champ et favorisera leur pérennité. Ces résultats encouragent la valorisation des espèces
végétales autochtones hautement xérophiles et en faire des espèces protégées tel que cela a
été fait pour A. tortilis. Cela ouvrira le champ à la création d’entreprises spécialisées dans
le domaine de réhabilitation de sites dégradés qui pourront contribuer au programme de
lutte contre la désertification, en plus de l’utilisation des différents sous produits d’Acacia
sp. à des fins industrielles.
La symbiose Acacia-BNL inclus trois partenaires qui sont : la plante hôte, le
partenaire microbien et le sol ; pour des projets de réhabilitation réussis, ces trois acteurs
doivent être étudiés pour optimiser leur interaction visant un rendement fixateur d’azote
optimal.
153
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Annexe
Annexe 1
Triangle de texture: Classe de texture du sol fin (<2 mm) (Schoeneberger et al., 2002).
Clay: argile
Sand: sable
Loam:
Silt: Limon
Annexe 2 :
Eau gélosée
-
Agar 8g
-
Eau distillée 1L
Autoclavage pendant 20 min à 120°C
i
Annexe 3
Solution nutritive: (Broughton et Dilworth, 1971)
(Nitrogen-free nutrient solution for in vitro nodulation of Acacia)
solutions
Produits chimiques
Concentration
Volume de la solution stock/
Stock
g /l
volume final
ml/l
1
CaCl2,2H2O
294
0,5 ml
2
KH2PO4
196
0,5 ml
3
MgSO4,7H2O
123
0,5 ml
K2SO4
87
MnSO4 ,H2O
0,338
4
H3BO3
0,247
0,5 ml
ZnSO4 ,7H2O
0,288
CuSO4 ,5H2O
0,100
CoSO4,7H2O
0,056
Na Mo O2, 2H2O
0,048
5
Na Fe_EDTA
0,734
0,5ml
pH=6,7
Annexe 4 :
Préparation des tubes Gibson (Gibson, 1980) :
Les tubes (150 X 20 mm) contenant 25 ml de milieu de culture Jensen avec agar (Vincent,
1970) sont fermés avec de l’aluminium qui est serré avec des élastiques, ils sont stérilisés par
autoclavage pendant 20 min à 120°C. A la sortie de l'autoclave ils sont disposés de façon
inclinée le temps que la gélose se fixe en pente et ensuite ils sont remplis avec le milieu
liquide sans azote Jensen (60 ml par tube) à travers une ouverture qui est par la suite
rebouchée avec un embout de plastique stérile.
Annexe 5 :
Suspension de sol à 10% :
•
10 g de sol
•
90 ml de tampon salin stérile à pH 7 (0.15 M NaCl, 0.002 M de KH2PO4, 0.004 M de
Na2HPO4)
•
La solution est mélangée pendant 1 h.
ii
Annexe 6 :
•
Milieu Yeast Extract Mannitol -YEM- (Vincent, 1970)
La composition en g/L : mannitol : 10 g ; glutamate de sodium : 0,5 g ; K2HPO4 : 0,5 g ;
MgSO47H2O : 0,2 g ; NaCl : 0,05 g ; CaCl2 : 0,04 g ; FeCl3 : 0,004 g ; extrait de levure: 1 g.
Le pH du milieu est ajusté à 6,8 avec du HCl 0,1 N.
•
Le milieu gélosé (YEMA) correspondant est obtenu par addition de 20 g/L d’agaragar.
•
Le milieu est stérilisé par autoclavage pendant 20 min à 120°C.
•
Pour du YEMA à rouge Congo, rajouter 0,025g/l de colorant.
NB : Il faut noter que c’est un colorant hautement cancérigène surtout lorsqu’il est sous forme
de poudre, il est fortement recommandé de le manipuler sous hotte aspirante, avec un
personnel expérimenté.
Annexe 7 :
Protocole de la coloration de Gram
•
Une colonie est suspendue dans une goutte d’eau et étalée à l’aide de l’anse ;
•
Les cellules sont fixées à la flamme ;
•
Le frottis est coloré au violet de Gentiane pendant 1-2 minutes ;
•
Les bactéries sont fixées au lugol (iodure de potassium KI) pendant 30 secondes ;
•
La préparation est abondamment rincée à l’eau distillée afin d’évacuer l’excès de
colorant puis elle est décolorée (éthanol 95 %, 5 sec) et rincée de nouveau
abondamment à l’eau distillée ;
•
Une deuxième coloration avec de la fuschine ou safranine est réalisée (1-2 min) ;
•
La préparation est rincée à l’eau et séchée à température ambiante.
Annexe 8 :
Tube de Mac Farland n°0,5 (1,5 x107UFC/ml) (NCCLS, 2000)
BaCl2 (1,175%)
0,5ml
H2 SO4
99,5ml
iii
Annexe 9:
Milieu GMS (Zevenhuizen, 1986) : contient par litre : acide glutamique : 1g ; mannitol : 10g ;
KH2PO4 : 1g ; MgSO4 7H2O : 0,2g ; CaCl2 : 0,04.
Traces d’éléments : FeCl3 : 2,5mg ; H3BO3 : 0,01mg ; ZnSO4, 7H2O : 0,01mg ; CaCl2, 6H2O :
0,01 mg ; CuSO45H2O : 0,01 ; MnCl2 : 1mg ; Biotine : 10µl et Thiamine : 100µl.
Annexe 10:
Milieu TY (Beringer, 1974)
Il contient par litre : tryptone (oxoid) : 5 g; extrait de levure (oxoid) : 0,75 g;
KH2PO4 : 0,454 g ; Na2HPO4, 12 (H2O) : 2,388 g ; CaCl2, 2H2O (13,4 g / 100 mL) : 5 mL (ou
CaCl2, 6H2O à 20g /100 mL : 5 mL); Le pH est ajusté à 6,8 – 7,0. agar LabM : 20 g.
Annexe 11:
Protocole de purification du fragment amplifié, sur colonne avec le kit « QIAquick Gel
Extraction Kit » (Quiagen) :
•
Peser les fragments de gel d’agarose (dans les tubes).
•
Ajouter 3volume de tampon QG (µl) pour volume de gel (mg).
•
Incuber a 50°C pendant 10 minutes en agitant vigoureusement toutes les 2 minutes.
Ce tampon permet la solubilisation de l’agarose et augmente l’affinité de l’ADN pour
la membrane de la colonne QIAquick spin.
Lorsque le gel est complètement dissous, vérifier que la couleur du mélange est jaune.
Si la couleur est orange ou violet, ajouter 10 u1 de la solution d’acétate de sodium 3 M
PH 5 et mélanger. L’adsorption de l’ADN à la membrane QIAquick n’est efficace
qu’à un pH< 7 ,5. Le tampon QG contient un indicateur de pH qui vire au jaune pour
des pH<7,5 et devient orange ou violet pour des pH plus basiques.
•
Ajouter 1 volume d’isopropanol correspondant au volume du gel de départ et
mélanger. Ce produit fait précipiter l’ADN. ne pas centrifuger a cette étape.
•
Placer une colonne QIAquick sur un tube collecteur de 2ml.
•
Transférer a l’aide d’une pipette a mixture sur la colonne (volume maximum de
colonne 800 µl ; au delà, répéter l’étape suivant le nombre de fois suffisant).
•
Centrifuger pendant 1mn a 14000 tours par minute, puis vider le tube collecteur.
iv
•
Remettre la colonne sur le même tube, puis ajouter 0,5 ml de tampon QG. Ceci a pour
but d’éliminer les éventuels reste d’agarose.
•
Centrifuger pendant 1 mn a 14000 tours par minute. Le filtrat est jeté.
•
Ajouter 0,75 ml de tampon PE pour laver la colonne et laisser reposer 2 à 5 minutes.
•
Centrifuger pendant 1 mn à 14000 tours par minute, puis vider le tube collecteur.
•
Centrifuger a nouveau pendant 1 mn à 14000 tours par minute, puis placer la colonne
sur un tube Eppendorf de 1,5 ml.
•
Pour éluer l’ADN, ajouter 50 µl de tampon EB (10mM tris-Cl ph 8,5 au centre de la
membrane QIAquick, attendre 1 mn et centrifuger pendant 1 mn à 14000 tours par
minute.
•
Jeter la colonne.
•
L’ADN est conservé à –20°C.
Annexe 12 :
Le
smart
ladder:
2-LogDNA
Ladder
(0.1–10.0
kb) :
C’est un marqueur de taille. Il indique les poids moléculaire standards avec des enzymes de
restriction adéquats après électrophorèse sur gel d’agarose. L’ADN digéré inclue 19 bandes
de 100bp à 10kb. Les bandes de 0,5 ; 1,0 et 3,0 kb ont une intensité supérieure pour servir de
références. La masse approximative d’AND pour chaque bande (en assumant un dépôt de 1,0
µg) se compare au tableau suivant en comparant l’intensité.
v
Annexe 13 :
Annexe A
L’analyse factorielle des correspondances (AFC) est une méthode qui sert à représenter
graphiquement un tableau croisé. Elle vise à réunir les informations les plus utiles de façon à
donner une image claire de l’association de deux variables qualitatives. Dans l’analyse des
correspondances, les lignes représentent les catégories d’une première variable et les
colonnes, les catégories d’une deuxième variable. Dans l’analyse factorielle en composantes
principales, les colonnes sont nécessairement des variables et les lignes, des individus ; les
principaux résultats reposent sur les corrélations entre ces variables. La carte des
correspondances doit être interprétée en termes de territoire, de géographie de plan, où les distances
entre les catégories expriment l’un ou l’autre des qualificatifs propres aux couples des oppositions :
centre/périphérie ; éloignement/proximité ; ressemblance/dissemblance et attraction/répulsion.
Tableau A1 : représentation des variables en colonne (caractérisation génétique) et des individus en lignes
(espèce d’Acacia hôte) : répartition des espèces rhizobiennes selon les espèces d’Acacia.
R. leguminosarum bv trifolii
R. leguminosarum bv viciae
Rhizobium sp.
Ensifer terengae
Ensifer fredii
Ensifer meliloti
Ensifer sp.
Mesorhizobium sp.
Bradyrhizobium sp.
A. saligna
0
0
6
0
0
0
3
1
10
20
A. seyal
4
1
2
0
0
0
0
0
0
7
A. karroo
5
0
0
0
1
5
0
0
0
11
A.ehrenbergiana
0
0
0
1
0
0
1
1
0
3
Les résultats selon le logiciel XLSTAT (version 2010.5.04, Addinsoft, Paris, France,
http://www.xlstat.com) de l’Analyse Factorielle des Correspondances (AFC) :
vi
Tableau A2 : tableau de contingence (tableau initial)
R. leguminosarum bv trifolii
R. leguminosarum bv viciae
Rhizobium sp.
Sinorhizobium fredii
Sinorhizobium meliloti
Sinorhizobium sp.
Mesorhizobium sp.
Bradyrhizobium sp.
Somme
A. saligna
0,000
0,000
0,158
0,000
0,000
0,079
0,026
0,263
0,53
A. seyal
0,105
0,026
0,053
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,18
A. karroo
0,132
0,000
0,000
0,026
0,132
0,000
0,000
0,000
0,29
Somme
0,24
0,03
0,21
0,03
0,13
0,08
0,03
0,26
1,00
Figure A1 : vue 3D du tableau de contingence
Tableau A3 : Test d'indépendance entre les lignes et les colonnes (résumé)
Khi² (Valeur observée) 61,462
Khi² (Valeur critique) 40,113
DDL
27
p-value
0,000
alpha
0,05
La formule de distance du khi-carré servira donc à mesurer les systèmes d’opposition des éléments étudiés.
Interprétation :
• H0 : Les lignes et les colonnes du tableau sont indépendantes.
vii
•
•
•
•
Ha : Il existe un lien entre les lignes et les colonnes du tableau.
Etant donné que la p-value calculée est inférieure au niveau de signification seuil alpha=0,05, on peut rejeter
l'hypothèse nulle H0 et retenir l’hypothèse alternative Ha.
Le risque de rejeter l'hypothèse nulle H0 alors qu'elle est vraie est de 0.02%.
L’inertie totale est de 1.609
Tableau A4 : Valeurs propres et pourcentages d'inertie
Valeur propre
Inertie (%)
% cumulé
F1
0,824
51,237
51,237
F2
0,538
33,474
84,711
F3
0,246
15,289
100,000
I-Résultats pour les lignes :
Tableau A5 : poids, distances et distances quadratiques à l'origine, inerties et inerties relatives (lignes)
Rhizobium sullae
Rhizobium tropici
Rhizobium sp.
Ensifer meliloti
Ensifer fredii
Mesorhizobium sp.
Bradyrhizobium sp.
Ochrobactrum sp.
Poids (relatif)
0,131
0,026
0,026
0,132
0,209
0,079
0,026
0,026
0,266
0,079
Distance
1,336
2,060
0,905
0,890
0,902
1,100
0,905
3,426
0,875
2,079
Distance²
1,786
4,243
0,819
0,792
0,813
1,210
0,819
11,736
0,766
4,324
Inertie
0,23373
0,11191
0,02145
0,10445
0,17032
0,09523
0,02145
0,30716
0,20346
0,33949
Inertie relative
0,145
0,070
0,013
0,065
0,106
0,059
0,013
0,191
0,126
0,211
Tableau A6 : résultats des coordonnées principales, coordonnées standard, contributions et des Cosinus
carrés pour les lignes.
Coordonnées principales
Coordonnées standard
Contributions
Cosinus carrés
F1
F2
F3
F1
F2
F3
Poids (relatif)
F1
F2
F3
F1
F2
F3
1,271
-0,049
-0,409
1,400
-0,067
-0,825
0,131
0,257
0,001
0,089
0,905
0,001
0,094
Rhizobium sullae
1,911
0,560
0,527
2,105
0,763
1,063
0,026
0,117
0,015
0,030
0,861
0,074
0,066
Rhizobium tropici
-0,719
0,530
0,146
-0,792
0,722
0,295
0,026
0,016
0,014
0,002
0,631
0,343
0,026
Rhizobium sp.
-0,699
0,530
0,150
-0,770
0,723
0,301
0,132
0,078
0,069
0,012
0,617
0,355
0,028
Ensifer meliloti
-0,155
-0,639
-0,617
-0,171
-0,871
-1,245
0,209
0,006
0,159
0,325
0,029
0,502
0,469
Ensifer fredii
-0,222
-1,073
0,098
-0,244
-1,462
0,197
0,079
0,005
0,168
0,003
0,041
0,952
0,008
-0,719
0,530
0,146
-0,792
0,722
0,295
0,026
0,016
0,014
0,002
0,631
0,343
0,026
Mesorhizobium sp.
-0,256
-2,782
1,983
-0,282
-3,791
3,999
0,026
0,002
0,376
0,419
0,006
0,659
0,335
Bradyrhizobium sp.
-0,683
0,527
0,147
-0,752
0,718
0,297
0,266
0,150
0,137
0,023
0,609
0,363
0,028
Ochrobactrum sp.
1,923
0,572
0,546
2,118
0,779
1,100
0,079
0,352
0,048
0,095
0,856
0,076
0,069
viii
II- Résultats pour les colonnes :
Tableau A7 : Poids, distances et distances quadratiques à l'origine, inerties et inerties relatives (colonnes)
A. saligna
A. seyal
A. karoo
A.ehrenbergiana
Poids (relatif)
0,526
0,184
0,289
0,079
Distance
0,870
1,242
1,325
2,278
Distance²
0,758
1,542
1,757
5,187
Inertie
0,399
0,284
0,509
0,407
Inertie relative
0,335
0,238
0,427
0,253
Tableau A8 : Résultats des calculs de Coordonnées principales, Coordonnées standard, Contributions et
de Cosinus carrés pour les lignes
Coordonnées principales
F1
Coordonnées standard
Contributions
F2
F3
F1
F2
F3
Poids (relatif)
0,530
0,146
0,550
F1
F2
Cosinus carrés
F3
F1
F2
F3
A. saligna
0,984
0,984
0,984
-0,719
A. seyal
0,984
0,984
0,984
1,923
0,572
0,546
0,188
0,695 0,061 0,056 0,924 0,053 0,022
A. karoo
0,984
0,984
0,984
0,293
-0,980 -1,841
0,184
0,016 0,177 0,623 0,050 0,364 0,586
A.ehrenbergiana 0,984
0,984
0,984
-0,256 -2,782
0,079
0,005 0,607 0,309 0,010 0,803 0,186
1,983
0,284 0,154 0,012 0,731 0,260 0,009
Figure A2 : Graphiques symétriques
ix
Annexe B
L’Analyse en Composantes Principales (PCA) est une analyse exploratoire. C’est une
procédure mathématique qui utilise une transformation orthogonale pour convertir une série
d’observations de variables (exclusivement quantitatives) probablement corrélées et les
transformer en une série de valeurs de variables linéairement non corrélées appelées
composantes principales. Le nombre des composantes principales est égal ou moindre que les
variables originales. Cette transformation est définie de telle façon à ce que la première
composante principale ait la variance la plus large possible, et chaque composant qui suit ait à
son tour la variable la plus haute possible sous la contrainte qu’il soit orthogonal au
composant précédent. La PCA est garantie d’être indépendante seulement si la série de
donnés est distribuée normalement et conjointement.
La PCA peut être exécutée par la décomposition des valeurs Eigen ou les matrices de
covariance (ou corrélation), souvent après centrage de la moyenne. Les résultats de la PCA
sont souvent discutés en terme de scores de facteurs : valeurs de variables transformées à un
point de données particulier, ou bien de chargements (loadings) : le poids par lequel chaque
variable originale standardisée devait être multipliée pour avoir le score de la composante.
La PCA révèle la structure interne des données de telle façon que la variance des données est
la mieux expliquée.
Les résultats selon le logiciel XLSTATTM (version 2010.5.04, Addinsoft, Paris, France,
http://www.xlstat.com) de la Principal Component Analysis (PCA)
•
PCA type: Pearson (n).
•
Type of biplot: Correlation biplot / Coefficient =Automatic.
Tableau B1: Summary statistics: (Résumé statistique).
Variables
Tolerance to Tpre (°C)
Tolerance to salinity (mM)
Soil CW
Site Tpre
Obs
57
57
57
57
Obs. with
missing
data
0
0
0
0
Obs.
without
missing
data
57
57
57
57
Minimum
35,000
102,000
0,075
38,000
Maximum
50,000
1034,000
1,290
49,000
Mean
(moyenne)
40,789
622,842
0,298
40,421
Std.
Deviation
(écart type)
3,985
289,477
0,390
2,598
Tpre: température; CW: conductivité électrique; Obs: observation; Std : standard
x
Tableau B2 : Correlation matrix (Pearson (n)): Matrice des corrélations entre les variables
Variables
Soil CW
Site Tpre
Tol/ Tpre (°C)
1
-0,051
0,247
-0,162
Tol/salinity (mM)
-0,051
1
-0,004
-0,082
Soil CW
0,247
-0,004
1
-0,118
Site Tpre
-0,162
-0,082
-0,118
1
Tol: tolérance, Tpre : tempeérature
Dans ce tableau, plus le chiffre est élevé, plus la relation entre les variables est forte (1 = relation « totale » et 0 = relation nulle).
Ici les deux variables les plus corrélées sont la tolérance à la température et la conductivité électrique du sol : 0,247.
247. De plus, la
négativité de certaines corrélations indique que ces variables ne varient pas dans le même sens.
Analyse en Composantes Principales
Tableau B3 : Valeurs propres ; variances expliquée
F1
F2
F3
F4
Eigenvalue (valeurs propres)
1,357 1,052 0,855 0,737
Variability (%) (pourcentage de variance) 33,920 26,301 21,367 18,413
Cumulative % (cumul des pourcentages) 33,920 60,221 81,587 100,000
Interprétation : chaque colonne correspond à une variance virtuelle ; valeurs
valeurs propres : variance du facteur correspondant ;
pourcentage de variance : pourcentage de variance de chaque colonne par rapport au total.
Si on additionne toutes les valeurs propres : 1,357+1,052+0,855+0,737=4,001 qui représente la dispersion du nuage de points en
04 dimensions, on voit que toutes les composantes (facteurs) sont proches et doivent être représentées.
Tableau B4 : Corrélations entre variables et facteurs.
Soil CW
Site Tpre
F1
0,738
0,017
0,698
-0,569
F2
-0,217
0,897
-0,140
-0,426
F3
0,027
0,400
0,503
0,664
F4
0,638
0,188
-0,490
0,232
Interprétation : le premier facteur est fortement corrélé à deux variables (tolérance à la température et la conductivité électrique),
presque nul avec la troisième (tolérance à la salinité) et négativement à la dernière (température du site)
Figure B1 : Principaux axes des facteurs étudiés : tolérance à la salinité, tolérance à la température (hautes) ; salinité du sol
(CW) et température du site (températures maximales aériennes)
xi
Tableau B5: Contribution of the variables (%):
Soil CW
Site Tpre
F1
40,194
0,021
35,895
23,890
F2
4,459
76,452
1,858
17,230
F3
0,088
18,741
29,598
51,573
F4
55,259
4,786
32,648
7,307
Tableau B6: Squared cosines of the variables: cosinus carré des variables
Soil CW
Site Tpre
F1
0,545
0,000
0,487
0,324
F2
0,047
0,804
0,020
0,181
F3
0,001
0,160
0,253
0,441
F4
0,407
0,035
0,240
0,054
Les valeurs en gras correspondent pour chaque variable au facteur à partir duquel le cosinus au carré est le plus élevé
Figure B2 : Analyse en Composantes Principales (ACP) représentant la relation entre la tolérance in vitro
des isolats rhizobiens au NaCl (NaCl tolerance) et aux hautes températures (Tpre tolerance) et les
caractéristiques édaphoclimatiques des sites d’échantillonnage correspondants, i.e conductivité du sol (soil
CW) et la moyenne maximale annuelle de température (Site Tpre). Chaque point correspond à un seul isolat
bactérien et son origine est indiquée par des symboles comme suit : O1: Es-Senia/Oran;
O2: Messerghine/Oran; O3: Sebkha, Messerghine/Oran; O4: Bomo-plage, dunes/Oran ; O5: Foret de Msila
/Oran; M: El Mactaa dunes/Mostaganem; R: Khemaissa/Relizane; AD: Ain Defla; EB: Labiod Sidi El
Cheikh/El Bayadh; A: Ain belbel/Adrar; T1: Oued In Dalagd/Tamanrasset; T2: Oued
Tassena/Tamanrasset; T3: Oued Tin Amezzegin/Tamanrasset.
xii
Tableau B7 : Souches incluses dans l’ACP et résultats de l’analyse sur les individus
Symbole
des
souches
(observa
tions
Nomenclature des
souches
O3
O3
O3
O3
O3
O3
O3
O1
O1
EB
EB
EB
EB
O2
O2
O2
O2
O2
O5
O5
O5
O5
O5
O5
O4
A
A
A
A
T3
T1
T2
T2
T2
T1
T1
T2
T2
T2
T1
O4
O4
O4
O4
O4
O4
O4
O4
O4
O4
O4
O4
O4
M
M
R
AD
SE21a
SE21b
SE23bc
SE24a
SE24c
SE25a
SE25d
SE3
SE2
SE243a
SE243b
SE243c
SE243d
K31
K32a
K32c
K33b
K34a
K1a
K1b
K2b
K2d
K4a
K4c
KHB
E231a
E231b
E231c
E232
E60
N145
T80
T18
T82
E134b
E128b
E45
E39
E47
A121
SAB3
SAB5
SAB9
ASB10
SAB12b
SAB13
SAB15b
SAB17a
SABN1a
SABN2a
SABN4a
SABN5a
SAB17b
SA13b
SA15d
SAKS
SAAIS
Scores de facteurs (coordonnées des
individus)
Contribution des observations (%)
F1
2,277
2,303
0,663
3,106
1,483
2,294
2,294
-0,361
0,441
1,143
1,108
1,134
1,143
-0,143
-0,928
0,633
0,630
-0,975
-1,100
-1,074
0,496
-1,091
-0,271
-1,074
-0,364
-2,098
-2,113
-2,080
-2,115
1,503
-0,153
-0,177
0,607
-0,212
-0,973
-0,153
0,625
-0,212
-0,212
-0,153
-0,346
-0,346
0,438
-1,175
-0,346
-0,346
0,438
-0,356
-0,364
0,430
0,438
-0,356
-0,356
-1,513
-1,487
-1,047
0,445
F1
6,703
6,859
0,569
12,470
2,844
6,805
6,805
0,169
0,252
1,690
1,588
1,664
1,690
0,027
1,114
0,519
0,513
1,229
1,565
1,490
0,319
1,540
0,095
1,490
0,171
5,692
5,773
5,595
5,785
2,919
0,030
0,041
0,477
0,058
1,224
0,030
0,505
0,058
0,058
0,030
0,155
0,155
0,248
1,786
0,155
0,155
0,248
0,163
0,171
0,239
0,248
0,163
0,163
2,960
2,858
1,418
0,256
F2
-1,368
0,216
-1,352
-0,051
-0,583
-0,332
-0,332
1,524
1,257
1,421
-0,694
0,891
1,421
0,307
1,653
-1,515
-1,722
-1,187
0,089
1,686
-0,963
0,607
1,419
1,686
-0,163
-1,088
-1,990
-0,009
-2,124
-1,073
0,514
1,602
0,256
-0,513
-0,255
0,514
1,335
-0,513
-0,513
0,514
0,904
0,904
-0,430
-0,414
0,904
0,904
-0,430
0,355
-0,163
-0,948
-0,430
0,355
0,355
-0,746
0,839
-2,070
-0,458
F3
0,882
1,666
0,550
1,704
1,101
1,395
1,395
0,884
0,921
-0,035
-1,082
-0,298
-0,035
-0,128
0,369
-0,859
-0,962
-1,037
-0,554
0,237
-0,735
-0,297
0,274
0,237
-0,577
2,159
1,713
2,693
1,646
-0,964
-0,588
-0,092
-0,588
-1,139
-1,138
-0,588
-0,054
-1,139
-1,139
-0,588
-0,049
-0,049
-0,539
-0,871
-0,049
-0,049
-0,539
-0,320
-0,577
-0,796
-0,539
-0,320
-0,320
-0,275
0,510
0,562
-0,993
F4
-0,932
-0,535
-2,943
0,406
-1,743
-0,673
-0,673
-1,266
-0,325
0,864
0,335
0,731
0,864
-0,054
-0,725
0,498
0,446
-1,436
-0,986
-0,586
0,766
-0,856
0,354
-0,586
0,018
1,125
0,900
1,395
0,866
1,589
0,031
0,341
1,012
-0,188
-1,169
0,031
1,282
-0,188
-0,188
0,031
0,285
0,285
0,959
-1,052
0,285
0,285
0,959
0,148
0,018
0,830
0,959
0,148
0,148
-0,882
-0,486
0,014
-0,739
F2
3,123
0,078
3,048
0,004
0,567
0,184
0,184
3,873
2,634
3,368
0,803
1,323
3,368
0,157
4,556
3,825
4,944
2,350
0,013
4,741
1,548
0,615
3,357
4,741
0,044
1,974
6,604
0,000
7,524
1,919
0,440
4,279
0,109
0,439
0,109
0,440
2,970
0,439
0,439
0,440
1,362
1,362
0,309
0,285
1,362
1,362
0,309
0,210
0,044
1,499
0,309
0,210
0,210
0,927
1,174
7,142
0,350
F3
1,596
5,699
0,621
5,959
2,487
3,993
3,993
1,603
1,742
0,003
2,403
0,182
0,003
0,033
0,280
1,516
1,900
2,208
0,629
0,115
1,109
0,181
0,155
0,115
0,683
9,569
6,020
14,889
5,562
1,907
0,709
0,017
0,710
2,662
2,660
0,709
0,006
2,662
2,662
0,709
0,005
0,005
0,597
1,556
0,005
0,005
0,597
0,210
0,683
1,299
0,597
0,210
0,210
0,155
0,533
0,649
2,024
F4
2,069
0,683
20,636
0,392
7,238
1,078
1,078
3,816
0,251
1,778
0,267
1,274
1,778
0,007
1,253
0,590
0,474
4,911
2,316
0,819
1,398
1,747
0,299
0,819
0,001
3,017
1,928
4,637
1,787
6,013
0,002
0,277
2,440
0,084
3,255
0,002
3,915
0,084
0,084
0,002
0,194
0,194
2,192
2,637
0,194
0,194
2,192
0,052
0,001
1,640
2,192
0,052
0,052
1,853
0,561
0,000
1,301
Cosinus carré des
observations
F1
0,596
0,630
0,039
0,759
0,324
0,677
0,677
0,027
0,071
0,321
0,410
0,476
0,321
0,154
0,202
0,109
0,088
0,173
0,485
0,262
0,107
0,500
0,032
0,262
0,270
0,382
0,367
0,320
0,359
0,329
0,037
0,012
0,204
0,027
0,258
0,037
0,102
0,027
0,027
0,037
0,118
0,118
0,121
0,404
0,118
0,118
0,121
0,335
0,270
0,077
0,121
0,335
0,335
0,619
0,648
0,193
0,102
F2
0,215
0,006
0,163
0,000
0,050
0,014
0,014
0,480
0,579
0,496
0,161
0,294
0,496
0,703
0,642
0,623
0,661
0,256
0,003
0,647
0,403
0,155
0,880
0,647
0,054
0,103
0,325
0,000
0,363
0,168
0,416
0,943
0,036
0,160
0,018
0,416
0,466
0,160
0,160
0,416
0,800
0,800
0,117
0,050
0,800
0,800
0,117
0,335
0,054
0,374
0,117
0,335
0,335
0,150
0,206
0,752
0,108
F3
0,089
0,330
0,027
0,228
0,178
0,250
0,250
0,161
0,311
0,000
0,391
0,033
0,000
0,121
0,032
0,201
0,206
0,196
0,123
0,013
0,235
0,037
0,033
0,013
0,676
0,405
0,241
0,536
0,218
0,135
0,545
0,003
0,192
0,791
0,353
0,545
0,001
0,791
0,791
0,545
0,002
0,002
0,183
0,222
0,002
0,002
0,183
0,272
0,676
0,263
0,183
0,272
0,272
0,020
0,076
0,056
0,508
F4
0,100
0,034
0,771
0,013
0,448
0,058
0,058
0,331
0,039
0,183
0,037
0,198
0,183
0,022
0,124
0,067
0,044
0,375
0,389
0,078
0,255
0,308
0,055
0,078
0,001
0,110
0,067
0,144
0,060
0,368
0,002
0,043
0,568
0,022
0,372
0,002
0,430
0,022
0,022
0,002
0,080
0,080
0,580
0,324
0,080
0,080
0,580
0,058
0,001
0,286
0,580
0,058
0,058
0,210
0,069
0,000
0,281
Les valeurs en gras correspondent pour chaque observation au facteur pour lequel le cosinus au carré est le plus important
xiii
Annexe C:
Interprétation de l’efficience: Analyse de variance à 1 facteur sur la variable poids sec : Les
résultats sont obtenus grâce au logiciel XLSTAT : Test de Duncan New Multiple Range
C1: Acacia seyal
Type III Sums of squares
source
df
Sums of square
Strain
12
,012
Residual
22
,010
Dependent: plant dry weight
Mean square
F-value
P-value
,001
4,729E-4
2,062
,0681
Mean Table
Effect: strain
Dependent: Plant dry weight (g)
SE243d
SE243a
SE243b
SE243c
Control
SE22a
SE21a
SE21b
SE24a
SE24b
SE24c
SE25a
SE25d
Count
2
3
3
3
3
3
2
2
3
3
3
2
3
Mean
,071
,073
,045
,080
,024
,044
,069
,058
,057
,023
,042
,043
,032
Std.deviation
,012
,048
,024
,017
,008
,021
,016
,018
,025
,017
,010
,004
,011
Std.error
,008
,028
,014
,010
,005
,012
,011
,013
,015
,010
,006
,003
,006
Duncan New Multiple Range
Effect: Strain
Significance level : ,05
SE24b
Control
SE25d
SE24c
SE25a
SE22a
SE243b
SE24a
SE21b
SE21a
SE243d
SE243a
SE243c
Count
3
3
3
3
2
3
3
3
2
2
2
3
3
Mean
,023
,024
,032
,042
,043
,044
,045
,057
,058
,069
,071
,073
,080
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
b
b
b
b
b
b
b
b
b
b
c
c
c
c
c
c
c
c
c
c
Les moyennes sont obtenues à partir de trois répétitions par souches testées. Les moyennes suivies par différentes lettres dans la
même colonne sont significativement différents selon le test de Duncan.
xiv
C2: Acacia saligna
source
df
Sums of square
Strain
15
,003
Residual
31
,002
Mean square
F-value
P-value
2,116E-4
5,854E-5
3,614
,0012
Mean Table
Effect: strain
SAB10
SAB11
SAB15a
SAB15b
SAB3
SAB4a
SAB4b
SAB4c
SAB8a
SAB8b
SAB5
SAB9
Control
SABN13b
SABN14b
SABN15b
Count
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
2
3
3
3
Mean
,040
,036
,019
,046
,043
,043
,029
,030
,031
,036
,040
,037
,013
,045
,034
,034
Std.deviation
,005
,007
,002
,006
,016
,003
,004
,002
,004
,010
,010
,004
,008
,008
,013
,005
Std.error
,003
,004
,001
,003
,009
,001
,002
,001
,002
,006
,006
,002
,006
,004
,007
,0063
Effect: Strain
Significance level: ,05
Count
Control
SAB15a
SAB4b
SAB4c
SAB8a
SA14b
SA15b
SAB11
SAB8b
SAB9
SAB10
SAB5
SAB3
SAB4a
SA13b
SAB15b
Mean
2
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
,013
,019
,029
,030
,031
,034
,034
,036
,036
,037
,040
,040
,043
,043
,045
,046
a
a
b
b
b
b
b
b
b
b
b
b
b
c
c
c
c
c
c
c
c
c
c
c
c
c
xv
C3: Acacia ehrenbergiana
source
df
Sums of square
Strain
5
,016
Residual
13
,010
Mean square
F-value
P-value
,003
,001
4,041
,0196
Means Table
Effect: strain
E128b
E134ab
E134b
E231
E42
Control
Count
2
4
4
4
2
3
Mean
,031
,098
,090
,069
,033
,024
Std.deviation
,018
,020
,045
,029
,008
,008
Std.error
,013
,010
,023
,015
,005
,005
Effect: Strain
Control
E128b
E42
E231
E134b
E134ab
Count
3
2
2
4
4
4
Mean
,024
,031
,033
,069
,090
,098
a
a
a
a
b
b
b
xvi
C4: Acacia karroo
source
df
Sums of square
Strain
9
,027
Residual
17
,010
Mean square
F-value
P-value
,003
,001
5,085
,0020
Mean Table
Effect: strain
K1a
K1b
K2b
K2d
K31
K32c
K33b
K34a
K4a
K4c
Count
3
3
3
3
3
2
2
2
3
2
Mean
,110
,084
,064
,107
,029
,033
,047
,097
,042
,026
Std.deviation
,016
,015
,034
,029
,017
,028
,010
,041
,008
,008
Std.error
,009
,009
,020
,016
,010
,020
,007
,024
,004
,006
Effect: Strain
K4c
K31
K32c
K4a
K33b
K2b
K1b
K34a
K2d
K1a
Count
2
3
2
3
2
3
3
2
3
3
Mean
,026
,029
,033
,042
,047
,064
,084
,097
,107
,110
a
a
a
a
a
a
a
a
b
b
b
b
b
b
b
xvii
C5: Acacia tortilis
source
df
Sums of square
Strain
1
8,167E-6
Residual
4
3,827E-4
Mean square
F-value
P-value
8,167E-6
9,567E-4
,085
,7847
Means Table
Effect: strain
Count
3
3
18T
Control
Mean
,027
,025
Std.deviation
,011
,009
Std.error
,006
,005
Effect: Strain
Count
3
3
18T
Control
Mean
,027
,025
a
a
C6: Acacia albida
source
df
Sums of square
Strain
1
,010
Residual
4
,001
Mean square
F-value
P-value
,010
3,117E-4
32,890
,0046
Means Table
Effect: strain
A121a
Control
Count
3
3
Mean
,142
,059
Std.deviation
,009
,023
Std.error
,005
,013
Effect: Strain
Control
A121a0
Count
3
3
Mean
,059
,142
a
b
xviii
Annexe D:
Phenodendrogramme basé sur l’analyse de 58 caractères phénotypiques de 16 souches étudiés
associées à différentes espèces d’Acacia par l’utilisation du logiciel Statistica ((Statistica
version 5.1 ; eds 1997).
Tableau D-1 : Résumé de l’analyse statistique des groupes hiérarchiques
Tableau D-2 : Résumé de l’analyse du cas traité, (a) : la valeur est différente pour 1 et o ; (b) : la moyenne
des liaisons à l‘intérieur des groupes
xix
Tableau D-3 : Matrice de similitude
Tableau D-4 : Moyenne des liaisons entre groupes et groupage
xx
Tableau D-5 : Nombre des groupes
Figure D-1 : Phenodendrogramme illustrant les rapports de liaisons entre groupes (analyse hiérarchique de
groupe)
xxi
Annexe E
Annexe E-1 : Test de cross nodulation de quelques souches sur quelques espèces d’Acacia
Espèce d’Acacia testées
Souches
Plante hôte d’origine
SEE3
A. seyal
SABS
A. saligna
SAB1
A. saligna
SAKS
A. saligna
SAAIS
A. saligna
KHB
A. karroo
KO1
A. karroo
E45
A. ehrenbergiana
E47
A. ehrenbergiana
6E0
A. ehrenbergiana
E223
A. ehrenbergiana
T80
A. tortilis
T82
A. tortilis
A. karoo
Nod+
Fix +
Nod+
Fix +
Nod+
Fix +
Nod+
Fix +
Nod+
Fix +
Nod+
Fix Nod+
Fix -
A. saligna
A. seyal
A. nilotica
A. mangium
Nod+
Fix Nod+
fix+
Nod+
FixNod+
Fix +
Nod+
FixNod+
Fix +
Nod Fix Nod+
Fix +
Nod+
Fix +
Nod+
Fix +
Nod +
Fix+
Nod+
Fix +
Nod+
Fix +
Nod+
Fix Nod+
Fix +
Nod+
Fix +
Nod+
Fix -
A. tortilis
NodFix Nod+
Fix +
Nod+
Nod+
Fix +
Nod+
Fix +
Nod+
Fix -
Nod+
Fix -
Nod+
Fix -
Nod+
Fix Nod+
Fix -
Nod+: souche infective, Fix+: souche efficiente, Nod -: souche non infective, Fix-: souche inefficiente.
Annexe E-2 : Effet du sol dur la hauteur d’E. camaldulensis avec ANOVA à un facteur (Tanagra 1.4)
Tableaux des moyennes (E. camaldulensis)
Effet : sol
Variable : Hauteur de la tige
Seuil de confiance : 0,05
Répétition
Moyenne
Messerghine
3
17,2
M’sila
5
39,3
Sebkha
3
33,7
Mactaa
6
28,2
a
a
a
a
Ecart type
F-value
9,54
0,48
P-value
0,6
NS
20,41
19,21
34,97
NS : non significatif
Annexe E-3 : Effet du sol sur le poids sec d’E. camaldulensis avec ANOVA à un facteur (Tanagra 1.4)
Tableaux des moyennes (E. camaldulensis)
Effet : sol
Variable : poids sec
Seuil de confiance : 0.05
xxii
Répétition
Moyenne
Messerghine
3
2,6
M’sila
5
12,4 a
Sebkha
3
Mactaa
8,2
6
Ecart type
F-value
P-value
1,24
1,5
0,25 NS
a
3,46
a
2,6
2,38
a
0,21
NS : non significatif
Annexe E-4 : Effet site et inoculation sur le poids sec des parties aériennes: Test de StudentStudent-NewmanNewmanKeuls
Type III Sums of Squares
Source
df
Sum of Squares
F-Value
P-Value
Site
1
30,160
30,160
6,702
,0198
Inoculation
1
,117
,117
,026
,8739
Site * Inoculation
1
,490
,490
,109
,7456
16
72,004
4,500
Residual
Mean Square
Dependent: PS parties aériennes
Means Table
Effect: Site
Count
Mean
Std. Dev.
Std. Error
M'sila
10
3,452
2,779
,879
Messerghine
10
,996
,587
,186
Means Table
Effect: Inoculation
Count
Mean
Std. Dev.
Std. Error
+
10
2,148
2,439
,771
0
10
2,301
2,337
,739
Means Table
Effect: Site * Inoculation
Std. Dev.
Std. Error
M'sila, +
Count
5
3,219
Mean
3,193
1,428
M'sila, 0
5
3,685
2,654
1,187
Messerghine, +
5
1,076
,560
,250
Messerghine, 0
5
,916
,668
,299
Student-Newman-Keuls
Effect: Site
Count
Mean
Messerghine
10
,996
M'sila
10
3,452
a
b
All were significantly different at this level.
Student-Newman-Keuls
Effect: Inoculation
Count
Mean
+
10
2,148
a
0
10
2,301
a
None were significantly different at this level.
xxiii
Annexe E-5 : Effet de l’inoculation sur le poids sec d’A. seyal. Test Student
Tableaux des moyennes (A. seyal)
Effet : inoculation
Répétition
Moyenne
Inoculé
4
17
Non inoculé
5
10,1
Ecart type
Erreur standard
2,38
1,19
1,81
0,81
a
a
Seuil de signification unilatéral
0,141
NS
NS : effet non significatif
Annexe E-6 : Effet de l’inoculation sur le poids sec d’A. saligna. Test Student
Tableaux des moyennes (A. saligna)
Effet : inoculation
Répétition
Moyenne
Inoculé
4
8,1
Non inoculé
5
10,1
Ecart type
Erreur standard
2,14
1,07
1,04
0,46
a
a
0,228
NS
Annexe F
Annexe F-1 : Effet du site d’échantillonnage sur la teneur en N total d’A. karroo selon le test Student
Tableaux des moyennes (A. karroo)
Effet : site
Variable : Teneur en N total
Répétition
Moyenne
Messerghine
10
0,61
M’sila
10
0,87
Ecart type
0,11
0,001
a
b
S
0,19
Annexe F-2 : Effet du site d’échantillonnage sur l’excès isotopiques en 15N d’A. karroo selon le test
Student
Effet : site
Variable : l’excès isotopiques en 15N et Seuil de confiance : 0,05
Répétition
Moyenne
Messerghine
10
4,71
M’sila
10
0,87
Ecart type
a
1,3
a
0,19
0,000
S
xxiv
Annexe F-3 : Effet de l’inoculation sur la teneur en N total d’A. karroo sur le sol de Messergine
Effet : Inoculation
Répétition
Moyenne
A. karroo Messerghine Inoc
5
0,61
A.karroo Messerghine Non Inoc
5
0,62
Ecart type
Erreur standard
0,09
0,04
0,14
0,06
a
a
0,456
NS
Annexe F-4 : Effet de l’inoculation sur l’excès isotopiques en 15N d’A. karroo sur le sol de Messergine
Effet : Inoculation
Variable : l’excès isotopiques en 15N
Répétition
Moyenne
Messerghine Inoc
5
0,64
Messerghine Non Inoc
5
0,84
a
b
Ecart type
Erreur standard
0,12
0,05
0,25
0,12
0,032
S
S : effet significatif
Annexe F-5 : Effet de l’inoculation sur la teneur en N total d’A. karroo sur le sol de la forêt de M’sila
Effet : Inoculation
Répétition
Moyenne
A.karroo M’sila Inoc
5
1,12
A.karroo M’sila Non Inoc
5
1
a
a
Ecart type
Erreur standard
0,3
1,13
0,16
0,07
0,318
NS
Annexe F-6 : Effet de l’inoculation sur l’excès isotopiques en 15N d’A. karroo sur le sol de la forêt de
M’sila
Effet : Inoculation
Répétition
Moyenne
A.karroo M’sila Inoc
5
0,84
A.karroo M’sila Non Inoc
5
0,9
a
a
Ecart type
Erreur standard
0,25
0,11
0,16
0.07
0,228
NS
NS : Non significatif
xxv
Annexe F-7 : Effet de l’inoculation sur la teneur en N total d’A. seyal sur le sol de la Sebkha
Effet : Inoculation
Répétition
Moyenne
A.seyal Sebkha Inoc
5
0,69
A.seyal Sebkha Non Inoc
5
0,64
a
a
Ecart type
Erreur standard
0,05
0.02
0,12
0,05
0,245
NS
NS : Effet non significatif
Annexe F-8 : Effet de l’inoculation sur l’excès isotopiques en 15N d’A. seyal sur le sol de la Sebkha
Effet : Inoculation
Répétition
Moyenne
A.seyal Sebkha Inoc
5
2,23
A.seyal Sebkha Non Inoc
5
1,45
a
b
Ecart type
Erreur standard
0,31
0,14
0,004
0,25
0,11
S
S : Effet significatif
Annexe F-9 : Effet de l’inoculation sur la teneur en N total d’A. saligna sur le sol des dunes d’El
Mactaa
Effet : Inoculation
Répétition
Moyenne
A.saligna El Mataa Inoc
5
5,55
A.saligna El Mactaa Non Inoc
4
4,13
a
a
Ecart type
Erreur standard
1
0,45
1,14
0,57
0,13
NS
Annexe F-10 : Effet de l’inoculation sur l’excès isotopiques en 15N d’A. saligna sur le sol des dunes d’El
Mactaa
Effet : Inoculation
Répétition
Moyenne
A.saligna El Mataa Inoc
5
1,31
A.saligna El Mactaa Non Inoc
4
1,01
a
b
Ecart type
Erreur standard
0,48
0,35
0,11
0,05
0,0429
S
xxvi
Annexe G : Effet de la méthodologie d’analyse de l’excès isotopique 15N et du N total sur les résultats
du dosage
Tableaux des moyennes
Effet : Méthode d’analyse
Variable : Excès isotopique en 15N et Seuil de confiance : 0,05
Répétition
Moyenne
15
Moyennes de l’excès isotopique en N % (méthode
dosage du mix des différentes parties des plants)
Moyennes de l’excès isotopique en 15N % (méthode
dosage individuel des plants)
4
10,02
4
3,45
a
a
Ecart
Erreur
type
standard
6,66
3,33
2,52
1,75
Seuil de
signification
unilatéral
0,057
NS
Tableaux des moyennes
Effet : Méthode d’analyse
Variable : Teneur en N total et Seuil de confiance : 0,05
Répétition
Moyennes de N % (méthode dosage du mix
des différentes parties des plants)
Moyennes de N % (méthode dosage
individuel des plants)
Moyenne
a
4
2,12
4
0,735
b
Ecart
Erreur
Seuil de signification
type
standard
unilatéral
0,2
0,40
0,12
0,18
0,0004
S
xxvii

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