Cailleaud K., 22/11/2006. Utilisation du copépode - GIP Seine-Aval

Transcription

N° d’ordre : 3265
THESE
UNIVERSITE BORDEAUX 1
ECOLE DOCTORALE DES SCIENCES DU VIVANT, GEOSCIENCES ET SCIENCES DE
L’ENVIRONNEMENT
Présentée par Kévin CAILLEAUD
Pour obtenir le grade de
DOCTEUR
Spécialité : ECOTOXICOLOGIE
Utilisation du copépode Eurytemora affinis pour étudier
l’écodynamique et les effets biologiques des principaux
contaminants organiques (PCB, HAP, Alkylphénols…)
en estuaire de Seine
Soutenue le 22 Novembre 2006
Après avis de :
M
Laurent. LAGADIC, Directeur de recherche, INRA
Mme Claude CASELLAS, Professeur, Université Montpellier2
Devant la Commission d’examen formée de :
M Laurent LAGADIC, Directeur de Recherche, INRA
Rapporteur
Mme Claude CASELLAS, Professeur, Université Montpellier2
Rapporteur
M Alain BOUDOU, Professeur, Université Bordeaux 1
Examinateur
M Louis Alexandre ROMANA, Directeur de Recherche, IFREMER
Examinateur
Mme Hélène BUDZINSKI, Directeur de Recherche CNRS, Bordeaux 1
Directeur de thèse
Mme Joëlle FORGET-LERAY, Maître de Conférence, Université du Havre Responsable scientifique
M Sami SOUISSI, Maître de Conférence, Université Lille 1
Responsable scientifique
"Soyez réalistes : demandez l’impossible"
Ernesto Rafael Guevara de la Serna
I
II
Avant propos
Bien que ce genre d’exercice n’est probablement pas celui dans lequel je suis le plus à
l’aise je tiens néanmoins à écrire ces quelques mots pour remercier tous les gens que j’ai eu la
chance de rencontrer avant ou bien au cours de cette thèse et qui m’ont permis d’atteindre mes
objectifs.
Pour commencer, j’aimerai remercier l’ensemble des personnes qui ont accepté de
participer à ce jury de thèse. Je remercie Madame Claude Casellas, Professeure à l’Université
Montpellier 2, et Monsieur Laurent Lagadic, Directeur de recherche à l’INRA, pour m’avoir
fait l’honneur d’accepter de juger ce travail en tant que rapporteurs et de l’avoir fait dans un
délai de temps très réduit.
Je tiens également à remercier Messieurs Alain Boudou, Professeur à l’Université
Bordeaux I et Louis Alexandre Romana, Directeur de recherche à Ifremer de m’avoir accordé
un peu de leur temps pour participer à ce jury de thèse. Merci également à monsieur Romana
qui est à l’origine de cette thèse puisqu’il a défendu notre projet et qu’il a accepté de le
financer lorsqu’il dirigeait le programme Seine-Aval.
J’aimerai remercier les différents directeurs de laboratoire qui ont accepté de
m’accueillir dans leur laboratoire : le Professeur François Leboulenger du LEMA, le
Professeur Jean-Claude Dauvin de la station marine de Wimereux, Philippe Garrigues,
Directeur de recherche CNRS puis Hélène Budzinski, Directeur de recherche CNRS au
LPTC.
Pendant ces quatre années, j’ai eu la chance de travailler avec des spécialistes dans
différentes thématiques de recherche et dans des atmosphères très variées. A ce titre, je tiens à
remercier Hélène Budzinski, Sami Souissi et Joëlle Forget-Leray, qui ont codirigé ces travaux
de thèse, pour m’avoir permis d’explorer un champ de recherche si riche.
En premier lieu, je te remercie Hélène de m’avoir fait confiance en acceptant de
m’encadrer d’abord en DEA puis en thèse, à un moment où pas grand monde aurait misé
quelque chose sur moi. C’est avec toi que j’ai réellement découvert le monde de la recherche
scientifique. C’est également toi qui m’as transmis la rigueur nécessaire pour mener à bien
une étude scientifique. Pour toutes ces choses je te remercie sincèrement.
J’aimerai associer à ces remerciements les "indispensables" du LPTC Karine
LeMenach Laurent "Lolo" Peluhet et Jacqueline Bellocq qui a depuis pris sa retraite, pour
leurs conseils et leur aide très précieuse. Je tenais également à remercier Sylvie Augagneur et
Sophie Lardy pour leur aide.
Merci Sami pour ton accueil à la station marine et pour ton soutien tout au long de ma
thèse. Cela aura été un véritable plaisir de travailler ensemble aussi bien du point de vue
scientifique que du point de vue humain. Mon séjour à la station marine restera inoubliable,
pas tellement pour les longues soirées d’hiver, mais plutôt pour les rencontres avec les
chercheurs du monde entier et pour les échanges pas seulement scientifiques mais également
culturels qu’elles ont suscité. Merci également au docteur François Schmitt pour son aide et
ses conseils sur l’analyse des séquences vidéo pour le comportement natatoire des copépodes.
Enfin, je voulais terminer en remerciant celle qui est à l’origine de cette thèse, Joëlle
Forget-Leray. Nous travaillons ensemble depuis la fin de mon DEA et pendant toutes ces
années tu m’as toujours fait confiance, tu m’as toujours soutenu et à mes yeux c’est vraiment
quelque chose d’important. Pendant ma thèse, tu as été très présente tout en me laissant une
grande liberté d’action ce qui tu le sais est vraiment important pour moi. Tu m’as également
donner la chance de beaucoup voyager en m’envoyant dans de nombreux congrès. Au cours
de toutes nos discussions, scientifiques et autres, nous avons toujours été très honnêtes et je
pense que c’est l’une des raisons pour lesquelles nous nous sommes si bien entendu. J’ai fait
III
ce métier par ce que je l’avais choisi et pour toutes les raisons que j’ai cité précédemment si
j’ai encore envie de continuer c’est en partie grâce à toi, merci joëlle.
J’aimerai également remercier mamie Agnès, une autre "indispensable" du LEMA.
Je tiens également à remercier ici le docteur Pascal Cosette du laboratoire PBM UMR
6522 de l’Université de Rouen pour son aide et ses conseils concernant la protéomique et plus
particulièrement l’identification des protéines.
Merci à tous mes amis qui m’ont soutenu pendant ces années : Stéphane et Julie et
leurs deux petits, Hina et Téau. Merci à Outman et à Vivier. Merci à mes cousins Sandie et
François qui ont facilité mon adaptation à la vie bordelaise et qui m’ont permis de me changer
les idées. Merci également à tous mes amis rencontrés dans les différents labo dans lesquels je
suis passés : Jérome le roi de la mauvaise foi (merci pour le jus d’orange!), Géraldine et
Hélène de feue la copépode team, Périnne (championne de France c’est pas rien), Xavier (pas
encore champion de France), Céline, Matthieu et Rich (la vérole) pour le LEMA, David,
Annabelle, Gaëtan, Catherine, Juan, Fernando et Gaël pour Wimereux et Emilie, Pipa, Pipo,
Ana au LPTC. Merci à Pierre, un jour j’espère nous travaillerons ensemble en France. Merci à
ceux avec qui j’ai partagé le bureau pendant ces quelques années, Joëlle, Fab et Julie. Merci à
tous les occupants actuels ou passés du mythique bureau B004, Christophe, Renaud, Jérome
Ca. et Jérome Co.
Enfin je terminerai en remerciant ma famille et plus particulièrement mes parents et
ma sœur parce qu’ils ont été là à tous les moments et qu’ils seront toujours là quoi qu’il arrive
et c’est probablement ce qui compte le plus. J’associe bien évidemment Greg à ces
remerciements qui avec ma sœur nous ont apporté notre petit Elouan.
IV
Sommaire
Sommaire
Liste des abréviations.......................................................................................................IX
Liste des figures .................................................................................................................XI
Liste des tableaux ............................................................................................................ XV
Introduction .......................................................................................................................... 1
Chapitre 1 : Synthèse bibliographique ........................................................................ 9
I. La qualité de l’eau .............................................................................................................. 11
I.1. Les critères de qualité ............................................................................................... 11
I.2. La contamination chimique....................................................................................... 12
II. Les contaminants organiques étudiés.............................................................................. 15
II.1. Les Polychlorobiphényles........................................................................................ 15
II.1.1. Réaction de synthèse et structure chimique................................................................... 15
II.1.2. Propriétés physico-chimiques et utilisation des PCB .................................................... 17
II. 1.3. Les PCB dans l’environnement .................................................................................... 18
II.1.4. Toxicité.......................................................................................................................... 19
II.1.5.Réglementation ............................................................................................................... 21
II.2. Les hydrocarbures aromatiques polycycliques........................................................ 22
II.2.1. Structure chimique et source des HAP .......................................................................... 22
II.2.2. Propriétés physico-chimiques........................................................................................ 23
II.2.3. Les HAP dans l’environnement..................................................................................... 23
II.2.4. Toxicité.......................................................................................................................... 25
II.2.5. Réglementation .............................................................................................................. 28
II.3. Les alkylphénols polyéthoxylés............................................................................... 28
II.3.1. Réaction de synthèse et structure chimique................................................................... 28
II.3.3. Les alkylphénols dans l’environnement ........................................................................ 30
II.3.4. Toxicité.......................................................................................................................... 32
V
Sommaire
II.4. Les Pesticides .......................................................................................................... 34
II.4.1. Structure chimique......................................................................................................... 35
II.4.3. Les pesticides dans l’environnement ............................................................................. 37
II.4.4. Toxicité.......................................................................................................................... 39
II.5. Les composés pharmaceutiques............................................................................... 42
II.5.1. Définition et généralités................................................................................................. 42
II.5.2. Structure chimique et propriétés physico-chimiques..................................................... 43
II.5.3. Les substances pharmaceutiques dans l’environnement ............................................... 43
II.5.4. Toxicité.......................................................................................................................... 45
III. L’utilisation des copépodes comme espèce modèle en écotoxicologie......................... 46
III.1. Biologie des copépodes .......................................................................................... 46
III.2. Tests de toxicité aiguë (DL 50) .............................................................................. 50
III.3. Tests de toxicité chronique..................................................................................... 50
IV. L’utilisation de biomarqueurs en écotoxicologie .......................................................... 51
IV.1. Généralités ............................................................................................................. 51
IV.2. L’activité acétylcholinestérase ............................................................................... 54
IV.3. L’activité glutathion-S-transférase......................................................................... 56
V. Etude protéomique et recherche de nouveaux biomarqueurs ...................................... 58
V.1. Définitions et généralités......................................................................................... 59
V.2. L’utilisation de l’outil protéomique ........................................................................ 60
Chapitre 2 : Matériels et méthodes ............................................................................. 63
I. La zone de l’étude et l’échantillonnage............................................................................. 65
I.1. L’estuaire de Seine.................................................................................................... 65
I.2. Les campagnes de prélèvements ............................................................................... 67
I.3. Préparation des échantillons ..................................................................................... 69
II. L’organisme modèle : Eurytemora affinis ....................................................................... 70
II.1. E. affinis en estuaire de Seine.................................................................................. 70
II.2. Technique de tri ....................................................................................................... 73
VI
Sommaire
III. Expériences au laboratoire ............................................................................................. 74
III.1. Exposition des copépodes à des variations de température et de salinité .............. 74
III.2. Exposition des copépodes à des contaminants organiques en flux continu ........... 76
IV. Analyse des contaminants organiques ........................................................................... 80
IV.1. Protocoles expérimentaux ...................................................................................... 80
IV.1.1. Extraction des PCB et des HAP ................................................................................... 81
IV.1.2. Extractions des alkylphénols polyéthoxylés ................................................................ 86
IV.1.3. Extraction des hormones stéroïdiennes........................................................................ 88
IV.1.4. Extraction des pesticides (Carbamates et Triazines).................................................... 90
IV.2. Analyse des contaminants...................................................................................... 91
IV.2.1. Chromatographie gazeuse en phase gazeuse (CPG) .................................................... 91
IV.2.2. Chromatographie en phase liquide (CPL).................................................................... 93
IV.3. Quantification des contaminants ............................................................................ 93
IV.3.1. Etalonnage interne........................................................................................................ 93
IV.3.2. Etalonnage externe....................................................................................................... 95
V. Mesure de deux biomarqueurs enzymatiques ................................................................ 95
V.1. Extraction des protéines .......................................................................................... 95
V.2. Dosage des protéines totales.................................................................................... 96
V.3. Dosage de l’activité acétylcholinestérase (AChE) .................................................. 96
V.4. Dosage de l’activité glutathion-S-transferase (GST) .............................................. 98
VI. Analyse de l’empreinte protéique................................................................................... 99
VI.1. Préparation et purification des échantillons ........................................................... 99
VI.2. Séparation des protéines par électrophorèse bidimensionnelle............................ 100
VI.3. Révélation des protéines ...................................................................................... 104
VI.4. Analyse des gels et sélection des protéines d’intérêts.......................................... 106
VI.5. Identification et séquençage des protéines........................................................... 107
VII. Etude du comportement natatoire de E. affinis en tant que biomarqueur
d’exposition à des contaminants organiques ..................................................................... 109
VII.1. Le principe .......................................................................................................... 109
VII.2. Mode opératoire.................................................................................................. 109
VII.3. Etude de la vitesse de nage ................................................................................. 111
VII.4. Etude de la trajectoire ......................................................................................... 112
VII
Sommaire
Chapitre 3 : Synthèse des travaux............................................................................. 115
I. Etude in situ des cycles biogéochimiques d’une sélection de contaminants organiques
présents en estuaire de Seine ............................................................................................... 118
I.1. Cycle biogéochimique des PCB et des HAP en estuaire de Seine ......................... 119
I.2. Cycle biogéochimique des alkylphénols polyéthoxylés en estuaire de Seine ........ 124
I.3. Variations saisonnières de la concentration en triazines et carbamates en estuaire de
Seine .............................................................................................................................. 128
II. Effets des variations des paramètres physico-chimiques sur la biodisponibilité des
contaminants organiques et sur l’expression de deux biomarqueurs enzymatiques ..... 129
II.1. Variations de la biodisponibilité et de la toxicité des PCB et des HAP pendant un
cycle de marée............................................................................................................... 130
II.2. Effets des variations de la température et de la salinité sur les activités
acétylcholinestérase et glutathion-S-transférase chez E. affinis.................................... 135
III. Etudes expérimentales pour évaluer la capacité de E. affinis à bioconcentrer et à
éliminer des contaminants organiques ............................................................................... 141
III.1. Transferts de contaminants hydrophobes de la phase dissoute vers E. affinis..... 141
III.2. Transferts de contaminants de type perturbateur endocrinien de la phase dissoute
vers E. affinis................................................................................................................. 146
IV. Effets biologiques des contaminants organiques chez E. affinis et recherche de
nouveaux biomarqueurs ...................................................................................................... 149
IV.1. Modification de l’expression protéique de E. affinis en réponse à des stress
chimiques ...................................................................................................................... 150
IV.2. Altération du comportement natatoire de E. affinis en réponse à l’injection de
contaminants dans son milieu ....................................................................................... 157
Conclusions & perspectives ......................................................................................... 163
Bibliographie..................................................................................................................... 171
Annexes .............................................................................................................................. 213
Publications ...................................................................................................................... 221
VIII
Liste des abréviations
Chapitre 1
4NP: 4 nonylphénol
ACh: acétylcholine
AChE: acétylcholinestérase
AFSSA: Agence Française de Sécurité Sanitaire des Aliments
AFSSAPS: L’Agence Française de Sécurité Sanitaire des Produits de Santé
AP: alkylphnéols
APEO: alkylphénols polyéthoxylés
BaA: benzo(a)anthracène
BaP: benzo[a]pyrène
BbF: benzo(b)fluoranthène
BCR-CEE : Bureau Communautaire de Référence des communautés Européennes
BuChE: butylcholinestérase
Commission OSPAR: Commission pour la protection du milieu marin de l’Atlantique NordEst
CSAH: Comité Scientifique de l’Alimentation Humaine
DaA: dibenz[a,h]anthracène
DAR: rapport dééthylatrazine sur atrazine
DCE: Directive Cadre Eau
DIREN: Directions régionales de l’environnement
DJA: Dose journalière admissible
DL 50: Dose létale 50%
DREES: Direction de la Recherche, des Etudes, de l'Evaluation et des Statistiques
EPA: Environmental Protection Agency
ERL: effect range-low
ERM: effect range-median
Fluo: fluoranthène
GST: glutathion-S-transférase
HAP: Hydrocarbure aromatique polycyclique
IARC: International Agency for Research on Cancer
IFEN: Institut Français de l'Environnement
INERIS: Institut National de l'Environnement Industriel et des Risques
IP: indénopyrène
NP: nonylphénols
NP1EC: acide phénoxy acétique
NP1EO et NP2EO: 4 nonylphénol mono- et diéthoxylé
NP2EC: acide phénoxy éthoxy acétique
NPE: nonylphénols polyéthoxylés
OCDE: Organisation de coopération et de développement économique
OMS: Organisation mondiale de la santé
PBDE: polybromodiphényléther
PCB: Polychlorobiphényle
PEC: Predicted Environnemental Concentration
PNEC : Predicted No Effect Concentration
Pyr: pyrène
IX
SAGE: Schémas d’Aménagement et de Gestion des Eaux
SDAGE: Schémas Directeurs d’Aménagement et de Gestion des Eaux
SEQ-eau: Seuils d’Evaluation de la Qualité physico-chimique des eaux
TBT: tributyle étain
TCDD: 2, 3, 7, 8 tétrachlorodibenzo-p-dioxine
TEF: facteur de toxicité équivalente
TEQ: Toxic Equivalent Quantity
UE: Union Européenne
UIPP: Union des industries de la protection des plantes
Chapitre 2
ACTC: acétylthiocholine iodide
CDNB: 1 chloro-2,4-dinitrobenzene
CL HP: chromatographie en phase liquide haute performance
CPG DCE: chromatographie gazeuse couplée à un détecteur à capture d’électrons
CPG SM: couplage de la chromatographie en phase gazeuse à la spectrométrie de masse
CPG/SM: chromatographie gazeuse couplée à un spectre de masse
CPL SM: couplage de la chromatographie en phase liquide à la spectrométrie de masse
DTE: dithioerythritol
DTNB: 5,5’-Dithiobis(2-nitrobenzoic acid)
DTT: DL-Dithiothreitol à 1 mM
E. affinis: Eurytemora affinis
EDTA: ethylenediamine tetra-acetic acid
GSH: glutathion réduit
HPLC: High Performance Liquid Chromatography
IEF: focalisation iso électrique
MSTFA: N-méthyl-N(triméthylsilyl)trifluoroacétamide
PSU: Practical Salinity Units
SDS: sodium dodecyl sulfate
SPE: extraction sur phase solide
TFA: trifuoro acetic acid
Chapitre 3
MES : matières en suspension
PD: phase dissoute
CE: colonne d’eau
FBC: facteurs de bioconcentration
BbF/BkF: benzo[b]fluranthène/ benzo(k)fluoranthene
EE2: 17α-éthynyloestradiol
NADPH: reduced form of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate
HSP: Heat-Shock Proteins
PDFs: Profils de Distribution des Fréquences
X
Liste des figures
Liste des Figures
Chapitre 1
Figure 1.1 : Structure générique des PCB et positions des substitutions des atomes de Cl .....14
Figure 1.2 : Réaction de synthèse des polychlorobiphényles .................................................15
Figure 1.3 : Nomenclature des PCB selon Ballschmitter et Zell ............................................15
Figure 1.4 : Liste des 7 PCB prioritaires ...............................................................................18
Figure 1.5 : Liste des HAP étudiés et leur facteur d’équivalence toxique (FET) pour des
effets cancérigènes ...............................................................................................................24
Figure 1.6 : Métabolisation du BaP en Bap 7,8-diol-9,10-époxide ........................................26
Figure 1.7 : Procédé de fabrication du nonylphénol ..............................................................28
Figure 1.8 : Voies de dégradation des alkylphénols polyéthoxylés .......................................30
Figure 1.9 : Orientation technico-économique des communes en Haute Normandie en
2000 .....................................................................................................................................34
Figure 1.10 : Liste des différents pesticides étudiés...............................................................34
Figure 1.11 : Détection des substances actives dans les eaux superficielles (a.) et les eaux
souterraines (b.) de Haute Normandie en 2003......................................................................37
Figure 1.12 : Devenir des substances pharmaceutiques et voies d’entrée dans
l’environnement ...................................................................................................................43
Figure 1.13 : Les différentes classes de copépodes................................................................45
Figure 1.14 : Forme générale des calanoïdes ........................................................................46
Figure 1.15 : Facteurs déterminants la production et la perception de signaux chimiques
par des organismes aquatiques..............................................................................................48
Figure 1.15 : Effets des contaminants à différents niveaux d’organisation biologique ...........50
Figure 1.16 : Hiérarchisation de la réponse biologique des organismes à des expositions à
des contaminants ..................................................................................................................51
Figure 1.17 : Les différents facteurs de stress influençant les réponses biologiques...............52
Figure 1.18 : Cycle de synthèse et d’élimination de l’acétylcholine et rôle de
l’acétylcholinestérase ...........................................................................................................54
Figure 1.19 : Métabolisme du glutathion...............................................................................55
Chapitre 2
Figure 2.1 : Carte de la zone d’étude et des sites de prélèvement ..........................................63
Figure 2.2. : Photographies de copépodes prises à la loupe binocculaire. ..............................68
Figure 2.3. : Stades de développement de Eurytemora affinis adapté de Katona (1970a, b)
par Souissi. N : stade nauplien, C : stade copépodite.............................................................69
Figure 2.4. : Etapes successives du tri des échantillons de plancton ......................................70
Figure 2.5. : Composition des échantillons de copépodes avant et après le tri au
laboratoire ............................................................................................................................71
Figure 2.6. : Dispositif expérimental.....................................................................................75
Figure 2.7: Protocoles d’extraction simultanée des PCB et des HAP en phase dissoute et
en phase particulaire .............................................................................................................79
XI
Liste des figures
Figure 2.8 : Protocoles d’extraction des PCB et des HAP chez E. affinis...............................80
Figure 2.9 : Protocoles d’extraction des alkylphénols polyéthoxylés en phase dissoute et
sur matrices solides ..............................................................................................................84
Figure 2.10 : Réaction enzymatique mise en jeu dans le dosage de l’activité AChE ..............94
Figure 2.11 : Réaction enzymatique mise en jeu dans le dosage de l’activité GST ................95
Figure 2.12 : Comparaison des deux techniques de coloration pour un même échantillon ...102
Figure 2.13 : Interface utilisateur du logiciel d’analyse d’image Melanie ............................104
Figure 2.14 : Interface du logiciel permettant d’analyser les images....................................107
Figure 2.15 : Schéma du déplacement d’un copépode dans l’espace ...................................108
Figure 2.16 : Schématisation des trajectoires d’un copépode...............................................109
Chapitre 3
Figure 3.1 : Variations saisonnières de la concentration total en (a) HAP parents et en (b)
PCB, dans la phase dissoute (ng.L-1) a.1&b.1, dans la matière en suspension (ng.g-1) a.2
&b.2 et chez E. affinis (ng.g-1) a.3&b.3...............................................................................115
Figure 3.2 : Résultats de l’analyse en composantes principales de la teneur en (a) HAP et
en (b) PCB accumulés par E. affinis en fonction de la contamination du milieu (PAH et
PCB adsorbés) et des paramètres environnementaux...........................................................116
Figure 3.3 : Empreintes de contamination moyenne par les HAP (a) observées dans la
phase dissoute (PD), dans les MES et chez Eurytemora affinis (EA). Les rapports
moléculaires Phe/An versus Fluo/Pyr (b) sont des indices caractéristiques de l’origine des
HAP dans la phase dissoute et dans la phase particulaire ....................................................117
Figure 3.4 : Empreintes de contamination moyenne par les PCB (a) observées dans la
phase dissoute (PD), dans les MES et chez Eurytemora affinis (EA). La Fig. b représente
l’abondance relative moyenne des principaux PCB (CBi) versus PCB 153 qui est le
congénère le moins métabolisé, dans la colonne d’eau (CE) et chez les copépodes .............118
Figure 3.5 : Variations saisonnières de la concentration totale en alkylphénols
polyéthoxylés et profils de distribution des différents composés dans la phase dissoute
(ng.L-1). La Figure b présente différents rapports moléculaires caractéristiques des voies
de métabolisation dans la phase dissoute ............................................................................119
Figure 3.6 : Variations saisonnières de la concentration totale en alkylphénols
polyéthoxylés et profils de distribution des différents composés dans la matière en
suspension (ng.g-1)..............................................................................................................121
Figure 3.7 : Variations saisonnières de la concentration en atrazine et simazine et de leurs
métabolites principaux en estuaire de Seine (phase dissoute) ..............................................123
Figure 3.8 : Variations saisonnières du rapport déséthylatrazine/atrazine ............................124
Figure 3.9 : Variations des activités AChE (a) et GST (b) (n = 4) chez des copépodes
prélevés en surface et près du fond pendant un cycle de marée ...........................................129
Figure 3.10 : Variations de l’activité AChE chez E. affinis après exposition à différentes
salinités (de 0 à 25 psu) ......................................................................................................132
Figure 3.11 : Variations de l’activité GST chez E. affinis après exposition à différentes
salinités (de 0 à 25 psu) ......................................................................................................133
Figure 3.12 : Variations de l’activité AChE chez E. affinis après exposition à différentes
températures pendant 18 heures ..........................................................................................134
Figure 3.13 : Variations de l’activité GST chez E. affinis après exposition à différentes
températures (4, 11, 18 et 25°C) .........................................................................................135
XII
Liste des figures
Figure 3.14 : Bioconcentration des PCB (a.1) et des HAP (b.1) chez Eurytemora affinis
après exposition à des eaux contaminées pendant 86 heures. L’élimination de chaque
PCB (a.2) et de chaque HAP (b.2) chez les copépodes non exposés (témoins) est
présentée depuis leur prélèvement dans le milieu jusqu’à la fin des expériences. Les
profils de distribution des PCB (c.1) et des HAP (c.2) après 86 heures d’exposition sont
comparés à ceux des copépodes non exposés et à ceux de l’eau à la fin de l’expérience ......138
Figure 3.15 : Evolution des profils de distribution des PCB (a) et des HAP (b) chez les
copépodes non exposés et chez les copépodes exposés depuis leur prélèvement dans
l’estuaire de Seine jusqu’à la fin des expériences en comparaison avec les profils de
distribution de ces contaminants dans le milieu d’exposition (phase dissoute).....................139
Figure 3.16 : Expression des facteurs de bioconcentration (FBC) de chaque PCB (a) et de
chaque HAP (b) chez les copépodes exposés en fonction du log Kow de chaque composé ...139
Figure 3.17 : Bioconcentration des alkylphénols (a) chez Eurytemora affinis après
exposition à des eaux contaminées pendant 86 heures. L’élimination du 4-NP et du
NP1EC (b) chez les copépodes non exposés (témoins) est présentée depuis leur
prélèvement dans le milieu jusqu’à la fin des expériences. Les concentrations en 4-NP et
en NP1EC (c) après 86 heures d’exposition sont comparées à celles des copépodes non
exposés et à celles de l’eau à la fin de l’expérience .............................................................142
Figure 3.18 : Expression de la concentration en 4-NP mesurée chez les copépodes non
exposés depuis leur prélèvement dans le milieu jusqu’à la fin des expériences en fonction
de la concentration en NP1EC chez ces mêmes organismes ................................................143
Figure 3.19 : Accumulation et élimination de l’éthynyloestradiol respectivement chez les
copépodes exposés et chez les non exposés depuis leur prélèvement dans le milieu
jusqu’à la fin des expériences .............................................................................................143
Figure 3.20 : Profils d’expression protéique typiques sur gels 2-DE obtenus à partir de
pools d’E. affinis exposés à différents contaminants organiques en flux continu. Le
premier gel (A) et le second gel (B) présentent (à titre d’exemple) les profils d’expression
protéique respectivement des copépodes exposés à un mélange 4 NP/NP1EC et des
copépodes non exposés.......................................................................................................146
Figure 3.21 : Proportions moyennes de chaque état de nage pour les femelles et pour les
mâles E. affinis, avant et après l’injection de la solution de contaminants ...........................153
Figure 3.22 : Profils de distribution des fréquences (PDFs) des vitesses de nage (en
transformation log-log) des femelles (a1) et des mâles (a2) avant et après l’injection de la
solution de contaminants. ...................................................................................................154
Figure 3.23 : Profils de distribution des angles de nage cumulés (PDF) (en transformation
log-log) pour les femelles (a.) et pour les mâles (b.) avant et après l’injection de la
solution de contaminants ....................................................................................................156
XIII
Liste des figures
XIV
Liste des tableaux
Liste des tableaux
Chapitre 1
Tableau 1.1 : Toxicité aiguë des différents pesticides étudiés sur différents groupes
d’organismes ............................................................................................................................ 38
Tableau 1.2 : Quantité de médicaments vendus dans différents pays européens..................... 41
Tableau 1.3 : Structure et propriétés physico-chimiques des médicaments étudiés ................ 42
Chapitre 2
Tableau 2.1 : Paramètres physico-chimiques mesurés au cours du suivi in situ...................... 65
Tableau 2.2. : Paramètres physico chimiques mesurés lors du cycle de marée ....................... 66
Tableau 2.3. : Composition et concentrations nominales des solutions de contamination ...... 74
Tableau 2.4. : Cinétiques de saturation des aquariums pour chaque classe de contaminants .. 76
Tableau 2.5. : Plan expérimental des expériences en flux continu .......................................... 77
Tableau 2.6 : Validation des protocoles d’analyse des HAP sur des matrices certifiées ......... 82
Tableau 2.7 : Validation des protocoles d’analyse des PCB sur des matrices certifiées ......... 82
Tableau 2. 8: Liste des PCB et HAP étudiés et de leurs étalons internes correspondants ....... 91
Tableau 2.9 : Composition du tampon d’extraction................................................................. 96
Tableau 2.10 : Composition du tampon de réhydratation ........................................................ 97
Tableau 2.11 : Composition du tampon de rééquilibration...................................................... 99
Tableau 2.12 : Composition des gels de polyacrylamide....................................................... 100
Chapitre 3
Tableau 3.1 : Détails des différentes campagnes de prélèvement.......................................... 113
Tableau 3.2 : Variations saisonnières de la concentration totale et des concentrations
individuelles en alkylphénols et en alkylphénols polyéthoxylés chez E. affinis.................... 122
Tableau 3.3 : Paramètres physico-chimiques mesurés lors de chaque prélèvement pendant le
cycle de marée........................................................................................................................ 126
Tableau 3.4 : Distribution des différents congénères de PCB et HAP dans la phase dissoute et
dans les MES (poids sec) de l’estuaire de Seine pendant un cycle de marée. ....................... 126
Tableau 3.5 : Distribution des PCB et des HAP dans la colonne d’eau de l’estuaire de Seine et
chez E. affinis pendant un cycle de marée. ............................................................................ 127
Tableau 3.6 : Variations des activités AChE et GST chez E. affinis pendant un cycle de marée
expérimental. .......................................................................................................................... 131
Tableau 3.7 : Nombre de protéines différentiellement exprimées (sur ou sous exprimées) pour
chaque condition d’exposition. .............................................................................................. 147
Tableau 3. 8 : Résultats de l’identification des protéines (nanoLC MSMS) différentiellement
exprimées chez les copépodes exposés aux différents contaminants par homologie de
séquence avec des protéines répertoriées dans les bases de données..................................... 149
XV
Liste des tableaux
XVI
Introduction
Introduction
1
Introduction
2
Introduction
Du fait de l’inégale répartition des réserves mondiales d’eau, l’accès et l’utilisation de
cette ressource sont devenus des enjeux majeurs pour le XXIème. Dans les régions frappées de
pénurie, l’utilisation comme la surexploitation des réserves sont et seront de plus en plus des
sources de conflits centrées sur des considérations économiques, écologiques et politiques. En
effet, outre l’aspect écologique, l’eau est à la base de nombreux domaines de l’économie, dans
l’agriculture (irrigation), comme matière première dans l’industrie (industrie électrique,
alimentaire…), en tant que réserve d’énergie (barrages hydroélectriques) et comme voies de
navigation. Désormais, des réflexions de fond doivent être menées sur l’efficacité de
l’utilisation et de la gestion de ces ressources ainsi que sur la recherche de nouvelles
techniques d’exploitation.
En France comme dans la plupart des pays de l’hémisphère Nord, les ressources
potentielles en eau sont importantes et permettent largement de faire face aux besoins annuels
(consommation de la population, irrigation agricole, industrie). Les réserves en eau sont donc
pour l’instant suffisantes et la qualité des eaux distribuées est bonne. Les préoccupations
concernent essentiellement les risques liés à la sécurité alimentaire et au maintien ou à la
restauration d’une bonne qualité écologique des écosystèmes menacés par des stress
chimiques et bactériologiques.
En effet, depuis l’explosion de l’industrie chimique au début du XXème siècle et
l’utilisation de produits de synthèse dans la vie quotidienne, des quantités croissantes de
substances chimiques d’origines industrielles, agricoles ou domestiques, n’ont cessé d’être
émises dans l’environnement. Quelles que soient les sources de pollution et le compartiment
de l’environnement dans lequel ces contaminants sont émis, les milieux aquatiques et
notamment les océans constituent le réceptacle ultime de ces substances. Ces contaminants
sont transférés vers les océans soit par des apports atmosphériques directs, soit par des apports
provenant des écosystèmes aquatiques continentaux et notamment des fleuves. Les milieux
estuariens qui assurent la transition entre les eaux douces continentales et les eaux marines
sont donc particulièrement exposés aux contaminants en général.
Les estuaires sont des écosystèmes complexes, caractérisés par des interactions entre
le milieu marin et les milieux dulçaquicoles continentaux qui sont à l’origine de variations
importantes des paramètres physico-chimiques (salinité, température, pH…). Ce sont des
écosystèmes écologiquement riches qui présentent une forte productivité biologique et qui
3
Introduction
possèdent un rôle clé dans l’équilibre de nombreux processus écologiques. En effet, ces
milieux constituent des zones de nourricerie pour de nombreuses espèces de poissons marins.
Les estuaires représentent également des lieux de transit essentiels dans les couloirs de
circulation des oiseaux migrateurs. Ces zones d’intérêt écologique majeur sont souvent sous
l’influence d’activités anthropiques qui contribuent à fragiliser ces écosystèmes par des
émissions conséquentes de substances chimiques de synthèse.
Depuis quelques décennies, la prise de conscience générale de la dégradation des
écosystèmes a conduit les scientifiques à mener des études sur les sources d’émission de
contaminants, sur leur devenir dans l’environnement (cycles biogéochimiques) et leurs effets
sur les biocénoses. Cependant, bien que les effets à court terme de nombreux contaminants
sur les organismes aquatiques aient été bien documentés, les effets à long terme sont en
revanche encore mal connus. Parmi les contaminants détectés dans les écosystèmes
aquatiques, certaines classes sont plus préoccupantes que d’autres. Ainsi, les polluants
organiques persistants (POPs) sont des substances chimiques faiblement biodégradables qui
possèdent des propriétés physico-chimiques qui leur confèrent un fort potentiel de
bioaccumulation par les organismes. Parmi ces composés, les polychlorobiphényles (PCB)
sont des molécules chlorés ubiquistes particulièrement rémanentes et bien qu’interdits depuis
la fin des années 1970 encore très présents à l’heure actuelle dans les écosystèmes aquatiques.
Les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) sont issus de la combustion de la
matière organique et sont connus pour leurs propriétés cancérogènes. Des contaminants plus
hydrophiles tels que des surfactants anioniques (alkylphénols polyéthoxylés) et des substances
pharmaceutiques (médicaments, hormones stéroïdiennes de synthèse) sont également
fréquemment détectés et ont été associés à des perturbations endocrines. Enfin, les produits
phytosanitaires (insecticides : carbamates; herbicides : triazines, diuron…) sont également
très présents dans les milieux aquatiques et représentent, bien que leur demie vie soit très
réduite, une toxicité importante (neurotoxicité, perturbation endocrine…).
Pour répondre à ces contraintes, des actions ont été menées visant à réduire les
émissions de ces contaminants au niveau de toutes les sources d’émission (industrielles,
agricoles et domestiques). De plus un cadre politique communautaire a été instauré au sein de
l’Union Européenne par la directive cadre eau (2000/60/CE) afin de développer une
législation commune aux états membres concernant la gestion des ressources en eau et la
restauration d’une bonne qualité des écosystèmes aquatiques.
4
Introduction
Le bassin versant de la Seine abrite près de 26% de la population française et 40% de
l’activité agricole et économique du pays principalement représentée par l’industrie
pétrochimique et pharmaceutique. Le fleuve et son estuaire sont donc soumis à une pression
anthropique très intense caractérisée par des apports importants de contaminants et
notamment de substances organiques de synthèse. Toutefois, en dépit de la contamination
élevée de l’estuaire, un micro crustacé zooplanctonique, le copépode Eurytemora affinis, s’y
est largement développé et domine la communauté méso zooplanctonique. Ce copépode peut
atteindre pendant la période maximale de production des concentrations équivalentes à dix
fois celles observées dans la plupart des autres estuaires Nord Atlantiques pourtant moins
pollués (1 000 000 individus.m-3).
Les travaux présentés dans ce manuscrit font partie d’un programme de recherche
pluridisciplinaire visant à étudier la qualité de l’eau de l’estuaire de Seine en se basant sur une
étude in situ de deux ans couplée à des expérimentations au laboratoire afin d’estimer les
effets toxiques des principaux contaminants organiques détectés dans ce milieu sur E. affinis,
copépode caractéristique de tous les estuaires Nord Atlantiques. A cet effet, la biodisponibilité
de ces contaminants dans la colonne d’eau, leur transfert (bioconcentration) ainsi que leur
élimination ont été étudiés chez E. affinis. De plus, les effets de ces contaminants ont été
étudiés à différents niveaux d’organisation biologique chez ce copépode, depuis le niveau
moléculaire jusqu’à l’échelle de l’organisme entier. Cette étude a également pour objectif de
fournir quelques éléments de réponse pour expliquer la formidable densité de cette espèce en
estuaire de Seine.
La première phase de ce projet qualifiée d’étude de terrain a consisté à détecter les
principaux contaminants organiques présents en estuaire de Seine et à caractériser leurs
concentrations respectives dans les différents compartiments de la colonne d’eau (phase
dissoute et phase particulaire). Les transferts de ces contaminants depuis le biotope vers la
biocénose ont également été étudiés par la mesure des quantités de contaminants accumulés
par Eurytemora affinis. Puis les variations du cycle biogéochimique des principaux
contaminants organiques de l’estuaire de Seine ont été étudiées à deux échelles de temps
différentes : à l’échelle des saisons sur deux années ainsi qu’à l’échelle d’un cycle de marée.
Deux biomarqueurs d’exposition, l’acétylcholinestérase et la glutathion-S-transférase ont
également été étudiés au cours d’un cycle de marée et lors d’expériences en laboratoire pour
5
Introduction
déterminer les effets des facteurs abiotiques (salinité et température) sur les variations de ces
activités enzymatiques chez E. affinis.
La deuxième phase du projet qualifiée d’étude expérimentale a été consacrée à l’étude
des transferts de contaminants organiques représentatifs de la contamination de l’estuaire de
Seine, depuis la phase dissoute vers Eurytemora affinis. Les contaminants sélectionnés ainsi
que les concentrations retenues pour les expositions ont été définies à partir des résultats
obtenus au cours de la première phase du projet afin de réaliser les expériences d’exposition
dans des conditions environnementales les plus réalistes. Ces expositions ont été réalisées en
flux continu à l’aide d’un protocole expérimental développé spécialement pour cette étude.
Enfin, au cours de la troisième et dernière partie du projet, des travaux ont été menés à
l’aide de nouvelles techniques d’analyse innovantes dans le but d’identifier et de proposer de
nouveaux biomarqueurs d’exposition à des contaminants organiques pour des concentrations
sub-létales. Pour cela, lors des expositions en flux continu, les effets des contaminants
organiques sur le protéome d’Eurytemora affinis ont été analysés. En effet, les techniques
d’électrophorèses bidimensionnelles couplées à des techniques de chimie analytique
permettent d’observer les variations d’expression protéiques impliquées dans des cascades de
réactions biochimiques en réponse à un stress chimique et permettent de ce fait de
sélectionner et d’identifier des marqueurs d’intérêts. Par ailleurs, le comportement natatoire
de ce copépode a été étudié en réponse à des injections de contaminants organiques dans leur
milieu. L’objectif de cette expérience est de valider l’utilisation du comportement natatoire
comme indicateur sensible de la contamination de l’eau.
La présentation de ces travaux s’articule selon le plan détaillé ci après. Le chapitre 1
présente dans un premier temps les critères de l’analyse de la qualité de l’eau fixés par la
Directive Cadre Eau. Les intérêts de l’utilisation d’études écotoxicologiques dans cette
démarche sont également présentés. Dans un deuxième temps, une synthèse bibliographique
présente l’état des connaissances actuelles sur les différents contaminants étudiés ainsi que sur
les biomarqueurs biochimiques utilisés au cours de cette étude. Les différentes techniques
analytiques et biochimiques utilisées au cours de ces travaux, ainsi que le site de l’étude et
l’organisme modèle, E. affinis, sont présentés dans le chapitre 2. Enfin, la synthèse des
différents résultats obtenus au cours de ces travaux est présentée dans le chapitre 3. Ce
chapitre reprend les résultats présentés dans une série d’articles soumis (acceptés ou
6
Introduction
actuellement reviewés) ou en préparation qui sont intégrés dans les annexes de ce manuscrit.
Dans ce chapitre 3, les cycles biogéochimiques saisonniers des PCB, des HAP (publication
n°1), ainsi que des alkylphénols polyéthoxylés (publication n°2) observés en estuaire de Seine
sont présentés. Une note présentant les variations saisonnières des concentrations en triazines
et en carbamates en estuaire de Seine est également détaillée. Les effets des paramètres
physicochimiques sur la biodisponibilité ainsi que sur l’expression de biomarqueurs
biochimiques sont également détaillés dans de 2 publications. L’article n°3 présente les
variations de la biodisponibilité des PCB et des HAP et leurs effets sur deux biomarqueurs
d’exposition, l’activité acétylcholinestérase (AChE) et la glutathion-S-transférase (GST), au
cours d’un cycle de marée. La publication n°4 concerne l’étude expérimentale des effets des
variations de la salinité et de la température sur l’expression des activités enzymatiques AChE
et GST. Le chapitre 3 reprend également les résultats de l’étude expérimentale de la
bioconcentration et de l’élimination des contaminants organiques chez Eurytemora affinis,
contaminants hydrophobes persistants dans le cadre de la publication n°5 et contaminants
oestrogéno-mimétiques dans le cadre de la publication n°6. Enfin, la dernière partie de ce
chapitre présente la recherche de nouveaux biomarqueurs suite aux expériences d’exposition
en flux continu. Ainsi, la publication n°7 concerne les effets des contaminants organiques sur
les variations d’expression des protéines et l’identification de certains processus biochimiques
mis en jeu. La publication n°8 présente la réponse comportementale des copépodes suite à des
injections de contaminants.
7
Introduction
8
Chapitre I : Synthèse bibliographique
Chapitre 1
Synthèse bibliographique
Ce chapitre présente synthétiquement l’état des connaissances actuelles sur les
différents contaminants étudiés au cours de ces travaux, leurs concentrations dans
l’environnement ainsi que leurs effets sur les organismes aquatiques. De plus, une
présentation des différents biomarqueurs analysés ainsi que leur utilisation dans différentes
études d’évaluation du risque chimiques pour les milieux aquatiques sont également
détaillées.
9
10
I. La qualité de l’eau
I.1. Les critères de qualité
Les politiques de l’eau des états membres de l’Union Européenne sont de plus en plus
encadrées au niveau européen. La France, comme tous les autres états membres, est tenue
d’appliquer ces réglementations. Pour cela les cadres fixant la politique de l’eau au niveau
européen ont été transposés en droit français par la loi n° 2004-338 du 21 avril 2004 et font
également l’objet d’un projet de loi sur l’eau et les milieux aquatiques (30 mai 2006). Ces lois
donnent les outils nécessaires à l’administration et aux collectivités locales pour atteindre les
objectifs fixés par la directive cadre européenne.
- La Directive Cadre Européenne 2000/60/CE (DCE)
Depuis le 23 octobre 2000, la directive cadre européenne sur l’eau (DCE) fixe des
objectifs ambitieux à atteindre par les états membres :
- établir un cadre pour la protection des eaux,
- reconquérir la qualité des eaux et atteindre en 2015 un bon état fixé par la DCE
(préservation des ressources en eau destinées à l’alimentation humaine, préservation
des activités liées à l’eau, préservation du bon état chimique et écologique des
milieux),
- élaboration de programmes visant à réduire, voire supprimer les rejets de substances
dangereuses (maintenir un bon état physico-chimique et microbiologique des milieux)
par la mise en place de valeurs limites d’émission et de normes de qualité
environnementale,
- faire participer le public à l’élaboration et au suivi des politiques,
- tenir compte du principe de récupération des coûts des services liés à l’utilisation de
l’eau.
Le cadre général de la DCE s’applique aux eaux intérieures, aux eaux souterraines,
aux eaux de transition et aux eaux côtières. La qualité des eaux en France n’a pas encore
atteint le bon état requis par la directive du fait des pollutions ponctuelles et diffuses
insuffisamment maîtrisées. Actuellement, le bon état écologique des eaux n’est notamment
11
atteint que sur la moitié des points de suivi des eaux superficielles. Pour atteindre ce bon état,
la loi française prévoit notamment d’utiliser les Schémas Directeurs d’Aménagement et de
Gestion des Eaux (SDAGE) et les Schémas d’Aménagement et de Gestion des Eaux (SAGE)
au sein d’une approche par bassin versant. Cette approche vise dans un premier temps à
dresser un état des lieux des milieux en déterminant l’incidence des activités humaines sur les
écosystèmes aquatiques par la mise en place de programmes de surveillance (mesures de base
de polluants, structurées au sein d’un plan de gestion). Cette évaluation permet d’établir et de
définir des zones protégées. Pour préserver la qualité physico-chimique et microbiologique
des cours d’eau et des eaux souterraines et suivant les risques présentés, des mesures
réduisant les émissions de polluants (substances prioritaires : nitrates, phytosanitaires,
oestrogéno-mimétiques, neurotoxiques; bactéries) sont à envisager. Dans un deuxième temps,
cette approche a pour but de préserver la qualité écologique des cours d’eau (aménagement
des écosystèmes) et d’améliorer la gestion quantitative des niveaux des eaux (étiages,
prélèvements d’eau).
I.2. La contamination chimique
- Les sources
Deux types de contaminants chimiques peuvent être présents dans les écosystèmes
aquatiques, les macropolluants et les micropolluants. Les macropolluants sont soit présents
naturellement dans les eaux soit introduits suite à des activités humaines et sont toxiques pour
des gammes de concentrations de l’ordre du mg.L-1. Trois groupes de macropolluants sont
répertoriés : les matières en suspension (biodégradables ou non), la matière organique et les
nutriments (essentiellement l’azote et le phosphore).
Les micropolluants sont majoritairement d’origine anthropique et sont introduits dans
les eaux soit directement par des sources diffuses, soit indirectement lors d’apports ponctuels.
Ces contaminants sont toxiques pour des gammes de concentrations de l’ordre du µg.L-1. On
distingue deux groupes de micropolluants chimiques : les métaux et les micropolluants
organiques. L’introduction des métaux dans l’eau peut provenir de l’érosion des sols mais est
majoritairement d’origine industrielle. Les micropolluants organiques sont soit d’origine
synthétique (des additifs de détergents : par ex. les alkylphénol polyéthoxylés; pesticides;
substances pharmaceutiques; composés chlorés : ex: Polychlorobiphényles (PCB)) soit liés à
la combustion des réserves fossiles du bois ou de la matière organique (Hydrocarbures
12
aromatiques polycycliques (HAP) et dioxines) et sont quasi exclusivement introduits dans
l’eau suite à des activités anthropiques.
- La biodisponibilité
Selon Ramade (2002), "la biodisponibilité d’un contaminant dépend de l’état physique
(solubilisé ou adsorbé) ou chimique (complexé ou ionisé) dans lequel se trouve un polluant et
conditionne son écotoxicité". De plus, la biodisponibilité est caractéristique de la fraction de
cette substance ayant la possibilité d’être absorbée et d’être utilisée par le métabolisme d’un
organisme vivant. La biodisponibilité joue un rôle très important dans la toxicité réelle d'un
contaminant.
L’analyse de la biodisponibilité des contaminants organiques dans les écosystèmes
constitue un aspect fondamental des études menées en écotoxicologie pour évaluer les risques
toxiques d’une/plusieurs substance(s) dans un écosystème. Cette notion de biodisponibilité se
situe à l’interface de plusieurs disciplines scientifiques. Elle dépend à la fois de la géochimie
et du devenir du contaminant dans le milieu, mais également de la biologie des organismes
exposés (physiologie/éthologie). Trois approches complémentaires peuvent être envisagées
pour estimer la biodisponibilité d’un contaminant :
- une approche chimique consistant dans un premier temps à déterminer la répartition
du contaminant dans les différents compartiments du biotope (phase dissoute et phase
particulaire/sédimentaire dans les milieux aquatiques et le rôle des substances
humiques) et d’autre part à mesurer la concentration en contaminant bioaccumulé(1)
par la biocénose au cours de l’exposition dans le cas où il n’y a pas de
biotransformation,
(1)
Le terme bioaccumulation désigne la capacité des organismes à concentrer et à accumuler des substances
chimiques à des concentrations bien supérieures à celles où elles se trouvent présentes dans l’eau qui les
environne. La bioaccumulation considère deux principales voies d’entrée des substances chimiques dans
l’organisme : l’eau par le biais de la respiration et la consommation d’aliments eux-mêmes contaminés. Les
substances ingérées sont susceptibles d’être éliminées de diverses façons. Il y a bioaccumulation lorsque les
quantités de substances apportées à l’individu dépassent les quantités éliminées. (http://www.ifremer.fr/delecen/projets/bioaccumulation/bioaccumulation.htm)
13
- une approche biologique consistant à mesurer la réponse biologique d’un organisme
ou d’une population suite à une exposition à un contaminant. En fonction de l’espèce
et du biomarqueur(2) utilisés, la réponse est proportionnelle à la concentration du
contaminant dans le milieu. En fonction du contaminant et de sa concentration dans le
milieu, deux types d’effets sont envisageables : une toxicité aiguë conduisant à la mort
de l’organisme (DL 50(3)) et une toxicité chronique produisant des effets à plus long
terme,
- une approche couplée (chimique et biologique), plus rigoureuse permettant d’évaluer
la réponse d’un organisme en fonction de la concentration d’un contaminant dans le
milieu et non pas, comme dans les deux premières approches, de déterminer l’un à
partir de l’autre.
Dans le cadre des deux premières approches, l’estimation de la biodisponibilité d’un
contaminant intègre des facteurs présentant une variabilité plus ou moins grande sans en tenir
compte. Ainsi l’analyse chimique des contaminants bioaccumulés est précise mais ne prend
pas en compte les variabilités intra- et interspécifiques des organismes (ex variabilité des
capacités de métabolisation des contaminants en fonction de l’état de l’organisme et de
l’espèce) et ne renseigne pas sur la toxicité de ces contaminants. L’approche biologique
permet d’estimer le risque lié aux contaminants mais est plus variable et plus difficile à
interpréter. Par exemple, les données de DL 50 des contaminants, classées en 3 catégories par
la Directive Européenne 93/67/EE (DL 50 < 1mg.L-1 : composé très toxique pour les
organismes aquatiques, 1 < DL 50 < 10 mg.L-1 : composé toxique pour les organismes
aquatiques, 10 < DL 50 < 100 mg.L-1 : composé nocif pour les organismes aquatiques) sont
difficilement exploitables pour des concentrations environnementales. De plus, la réponse des
organismes n’est pas toujours proportionnelle à la concentration en contaminants. A contrario,
l’approche couplée donne des informations précises sur la contamination et les risques
biologiques qui en découlent et permet une interprétation plus fiable et plus aisée.
(2)
Changement observable et/ou mesurable au niveau moléculaire, biochimique, cellulaire, physiologique ou
comportemental, qui révèle l'exposition présente ou passée d'un individu à au moins une substance chimique à
caractère polluant (Lagadic et al., 1997).
(3)
DL 50 : Dose létale pour 50 % de la population
14
Dans le cadre de ces travaux de thèse et dans le but d’évaluer le stress lié à la
contamination chimique en estuaire de Seine, différentes classes de contaminants ont été
étudiées sur des critères de concentrations élevées dans les milieux aquatiques, de
rémanence,
de
transferts
importants
vers
le
compartiment
biologique
(bioaccumulation/bioconcentration) et de toxicité élevée. Le paragraphe suivant est consacré
à la présentation des différents contaminants étudiés au cours de cette étude.
II. Les contaminants organiques étudiés
II.1. Les Polychlorobiphényles (PCB)
II.1.1. Réaction de synthèse et structure chimique
Les PCB représentent une famille de composés de haut poids moléculaire possédant
tous la même structure générique (C12H10-nCln) avec un nombre variable de substitutions par
des atomes de chlore (1≤ n ≤10) (Figure 1.1.).
2, 2’,6 ,6’ : ortho-substitutions
3, 3’,5 ,5’ : méta-substitutions
4,4’ : para-substitutions
Figure 1.1. : Structure générique des PCB et positions des substitutions des atomes de Cl
Ces molécules d’origine anthropique sont obtenues industriellement par deux étapes
successives consistant
dans un premier temps à synthétiser un biphényle par
déshydrogénation de deux molécules de benzène à 800°C, puis à substituer des atomes
d’hydrogène par des atomes de chlore sur le biphényle par des apports de chlore anhydre
(jusqu'à cinq atomes de chlore sur chaque phényle) en présence d'un catalyseur, le chlorure
ferrique (Figure 1.2.).
15
Figure 1.2. : Réaction de synthèse des polychlorobiphényles (Gervason, 1987)
En théorie, 209 congénères de PCB peuvent être synthétisés, et différenciés, en
fonction de leur degré de chloration et de la position des atomes de chlores sur le biphényle, et
sont décrits suivant la nomenclature proposée par Ballschmiter & Zell (1980) (Figure 1.3).
Cette classe de molécules comporte dix groupes d’isomères ayant de 1 à 10 atomes de Cl
substitués.
Figure 1.3 : Nomenclature des PCB selon Ballschmitter et Zell (1980)
Les PCB ont été utilisés et commercialisés sous forme de mélanges techniques
classifiés selon leur teneur moyenne en chlore. La plupart des pays industrialisés ont fabriqué
des solutions techniques de PCB (ex : Aroclor par Monsanto aux Etats-Unis). En France, deux
solutions ont été fabriquées et principalement utilisées, le Phénoclor et le Pyralène (Prodelec).
Parmi les 209 congénères de PCB théoriquement possibles, environ 150 sont présents dans
ces mélanges industriels.
16
II.1.2. Propriétés physico-chimiques et utilisation des PCB
Ce sont les caractéristiques structurales des PCB (nombre et positions des atomes de
chlore) qui déterminent les propriétés physico-chimiques de chaque congénère de PCB. Ces
molécules présentent une grande stabilité chimique, sont non hydrolysables, inertes vis-à-vis
des acides, des bases et d’autres produits chimiques corrosifs. Ces composés résistent
également à la chaleur (dégradation complète à partir de 1000°C) et à l’oxydation. Toutes ces
caractéristiques expliquent leur persistance exceptionnelle dans l'environnement. Par ailleurs,
les PCB sont des substances chimiques ininflammables possédant des caractéristiques
diélectriques excellentes et de bons pouvoirs adhésifs et plastifiants.
Enfin, ces composés sont très peu solubles dans l’eau (de 0,00049 mg.L-1 pour le PCB
206 jusqu’à 1,0 mg.L-1 pour le PCB 8) (Shiu et Mackay, 1986). Les composés sont d’autant
plus lipophiles que le nombre d’atomes de chlore substitués est important et que le coefficient
de partage octanol-eau (Log Kow) est élevé (de 5,1 pour le PCB 8 jusqu’à 9,6 pour le PCB
209) (Bruggenman et al., 1982). Ce facteur traduit également la capacité de ces polluants à
pénétrer la bicouche lipidique des membranes biologiques et donc à s’accumuler dans les
organismes vivants.
Les PCB ont été utilisés pour de nombreux domaines d’application du fait de leur
grande stabilité physico-chimique et de leur propriété d’isolant électrique. Les champs
d’application des PCB sont généralement distingués en trois catégories (selon l’OCDE 1973)
en fonction du risque de dispersion dans l’environnement :
- système clos contrôlable : transformateurs électriques, condensateurs (fortes
quantités de PCB nécessitant une récupération de ceux-ci),
- système clos non contrôlable : fluides hydrauliques (dans l’industrie minière…)
fluides caloporteurs (plastiques, raffineries de pétrole…). Ces systèmes peuvent
éventuellement présenter des fuites dans l’environnement,
- système ouvert non contrôlable : correspond à des utilisations dispersives
directement dans l’environnement (additifs stabilisants, lubrifiants, peintures
ignifugeantes pour les bateaux…).
17
II. 1.3. Les PCB dans l’environnement
Compte tenu de leurs propriétés physico-chimiques, les PCB sont des composés
persistants et ubiquistes. Ainsi, ces contaminants sont retrouvés dans tous les écosystèmes
(dans l’eau, dans l’atmosphère, dans les sols) ce qui augmente les voies d’exposition pour les
organismes. En général, les PCB sont d’autant plus persistants dans l’environnement qu’ils
possèdent un nombre élevé de substitutions chlorées. Ainsi, les mono- di- et trichlorobiphényles font l’objet d’une dégradation assez rapide alors que les tétrachlorobiphényles présentent une lente biodégradation et que les composés plus fortement
chlorés résistent à la biodégradation. Par ailleurs, étant donné qu’aucun autre mécanisme
important de dégradation n’a été mis en évidence, la biodégradation constitue le mécanisme
de dégradation ultime des PCB dans l’eau et dans les sols.
Lorsqu’ils sont émis dans les sols, les PCB ont tendance à s’adsorber, d’autant plus
que le degré de chloration augmente. Les PCB peuvent également se volatiliser à l’interface
entre le sol et l’atmosphère (le taux de volatilisation diminue avec l’augmentation du degré de
chloration) (Cousins et al., 1999). On observe ainsi un enrichissement des PCB faiblement
chlorés en phase atmosphérique et un enrichissement des PCB fortement chlorés dans les sols.
Des concentrations atmosphériques moyennes en PCB de 130 pg.m-3 et de 2 à 6 ng.m-3 ont
ainsi été relevées respectivement à Toronto (Shen et al., 2006) et à Paris (Granier et
Chevreuil, 1997).
Lorsqu’ils sont émis dans l’eau, les PCB s’adsorbent rapidement sur les particules en
suspension et le sédiment, d’autant plus que le degré de chloration est élevé. Les
concentrations en PCB des sédiments de la Seine sont comprises entre 0,005 et 22,9 µg.g-1
(Carpentier et al., 2002). Les sédiments marins et estuariens constituent donc un réservoir
important de PCB et une source de contamination non négligeable.
De plus, du fait de leur caractère lipophile, les PCB peuvent être accumulés de
manière importante par les organismes, cette bioaccumulation étant d’autant plus importante
que le degré de substitution des congénères augmente. Des concentrations en PCB comprises
entre 1545 et 7981 ng.g-1 (de lipides), entre 501 et 1173 ng.g-1 (de poids frais), entre 1,3 et 16
µg.g-1 (de poids frais), entre 5367 et 10465 ng.g-1 (de lipides) et 30 ± 4 ng.g-1 (de poids sec)
ont ainsi été mesurées respectivement chez des oiseaux (Borgå et al., 2005), chez des
mammifères marins (Weisbrod et al., 2001; Kucklick et al., 2002), chez des poissons
(Chevreuil et al., 1995; Muir et al., 2003), chez des mollusques (Roe et MacIsaac, 1998) et
18
chez des crustacés (Fisk et al., 2001). Par ailleurs, ces composés sont bioamplifiés dans les
chaînes trophiques par les espèces supérieures (Burreau et al., 2004).
Classiquement, le choix des congénères à analyser en priorité dans l’environnement
repose sur des critères de présence et d’effets (Duinker et al., 1988; Jones, 1988). De ce fait,
la prépondérance de certains congénères dans les mélanges techniques, ainsi que leur
rémanence dans l’environnement ont permis d’établir une liste restreinte de composés
préconisée par le Bureau Communautaire de Référence des Communautés Européennes
(1982) (Figure 1.4).
PCB 28
PCB 52
PCB 138
PCB 118
PCB 153
PCB 101
PCB 180
Figure 1.4 : Liste des 7 PCB prioritaires (selon le BCR-CEE)
II.1.4. Toxicité
Le nombre et la position relative des atomes de chlore dans la molécule déterminent
les propriétés physico-chimiques de ces composés et leur toxicité. De ce fait, deux catégories
de PCB peuvent être distinguées : les composés possédant au minimum deux atomes de
chlore en position ortho sont qualifiés de PCB globulaires alors que ceux ne possédant qu’un
seul atome de chlore au plus en position ortho, qui peuvent de ce fait adopter une
conformation plane, sont qualifiés de PCB coplanaires. La toxicité d’une molécule dépend
fortement de sa conformation stérique qui va conditionner des interactions éventuelles avec
des systèmes biologiques. Les PCB les plus toxiques sont les coplanaires qui présentent une
structure stéréochimique proche de celle des dioxines, c’est pourquoi ils sont appelés PCB
19
"dioxine-like". Ces composés peuvent se comporter comme le 2, 3, 7, 8 tétrachlorodibenzo-pdioxine (TCDD), composé fortement toxique présentant une affinité élevée pour les
récepteurs Ah. Parmi les 209 PCB, une douzaine sont considérés comme des PCB "dioxinelike" (Van Den Berg et al., 1997). L’OMS a fixé à chacun de ces composés un facteur de
toxicité équivalente (TEF) avec pour référence le 2, 3, 7, 8 TCDD ayant une TEF de 1 (ce qui
donne une TEF de 0,0001 pour le PCB 118).
-Toxicité aiguë
Aucune étude n’est disponible concernant la toxicité aiguë des PCB après inhalation,
contact cutanée ou ingestion dans la population. Les seules données disponibles sont basées
sur des expérimentations animales. De plus, l’évaluation de la toxicité globale des PCB est
compliquée par la composition variable en congénères des mélanges commerciaux.
Globalement, les PCB sont faiblement toxiques à court terme pour l’homme, la
principale voie d’exposition étant via le régime alimentaire. Les doses létales pour 50 % des
individus (DL 50) sont de l’ordre du gramme/kg de poids corporel (Lang, 1992; Millischer,
1987). Des irruptions cutanées ont également été observées quelques heures après exposition
en milieu professionnel (OMS IPCS, 1993). Pour les organismes aquatiques, des DL 50 allant
de 0,32 à 1000 mg.L-1 ont été respectivement rapportées chez des larves d’ Oncorhynchus
mykiss (Birge et al., 1978) et chez Crangon crangon (Portmann et Wilson, 1971).
- Toxicité chronique
Les PCB sont des composés fortement liposolubles qui sont accumulés par les
organismes et concentrés via les chaînes trophiques. Les principales études épidémiologiques
et expérimentales, menées suite à des expositions chroniques aux PCB sur des hommes et des
primates, ont montré une altération du développement neurocomportemental (Schantz et al.,
1991), une perturbation de la réponse immunitaire (Daniel et al., 2001), des infections
respiratoires (Nakanishi et al., 1985), des effets sur la reproduction (Bush et al., 1986; Buck et
al., 2000), des perturbations endocrines (Mendola et al., 1997; Langer et al., 1998) et des
troubles neurologiques (Lonky et al., 1996).
L’ensemble des études conduites chez l’homme (Bertazzi et al., 1987) ne fournit pas
suffisamment de preuve pour conclure à la cancérogénicité des PCB. Cependant les études sur
les animaux ont montré le caractère cancérogène de ces molécules (Mayes et al., 1998). Ces
20
contaminants sont classés comme étant probablement cancérigènes pour l’homme (IARC,
1987; US EPA (IRIS), 1997). Toutefois, les PCB n’ont pas été classés par l’Union
Européenne parmi les composés génotoxiques (JOCE, 2004).
Pour les organismes aquatiques, une diminution de la réponse immunitaire (Jepson et
al., 1999), des troubles de la reproduction (Reijnders, 1986) ainsi que des perturbations
endocrines (Jenssen et al., 1994) ont été rapportées notamment chez des cétacés suite à des
expositions chroniques aux PCB.
II.1.5. Réglementation
L’utilisation des PCB en système ouvert (encre d’imprimerie, adhésifs…) est interdite
en Europe depuis 1979. De plus, la vente et l’acquisition de PCB ou d’appareils contenant des
PCB, tout comme la mise sur le marché de tels appareils neufs, sont interdites en France
depuis le décret du 2 février 1987. Par ailleurs, le décret du 18 janvier 2001 (application de la
directive 96/99/CE de septembre 1996) prévoie un plan d’élimination total des PCB, pour les
installations encore en utilisation contenant des PCB, à échéance du 31 décembre 2010.
De plus, en raison du caractère toxique de ces composés aussi bien pour l’homme que
pour l’environnement, des seuils de concentration ont été définis dans différentes matrices en
fonction des voies d’exposition possibles. Ainsi, la principale voie d’exposition de l’homme
(hors accidents) étant d’origine alimentaire, l’OMS a inclus les PCB "Dioxine-like" (PCB 77,
81, 105, 114, 118, 123, 126, 156, 157, 167, 169 et 189) dans le calcul de la DJA (dose
journalière acceptable) concernant les dioxines et les furanes (1-4 pg TEQ/kg du poids
corporel/jour dans la ration alimentaire totale). De plus, le 30 mai 2001, le Comité
Scientifique de l’Alimentation Humaine (CSAH) de l’Union Européenne a établi une DHA
globale pour les dioxines et les PCB de type dioxines égale à 14 pg d’équivalent toxique
(WHO-TEQ) par kg de poids corporel. Cette DHA est compatible avec la dose mensuelle
admissible provisoire de 70 pg/kg de poids corporel définie par le comité mixte FAO/OMS
d’experts sur les additifs alimentaires (Rome, Mai 2001). De plus, l’AFSSA a proposé une
DJA de 0,01 µg/kg de poids corporel pour la somme des 7 PCB prioritaires qui
représenteraient, dans les aliments, au moins 50 % de la concentration totale en PCB.
En terme d’évaluation du risque environnemental causé par les PCB, aucune valeur de
PNEC (predicted no effect concentration) n’est préconisée, aussi bien au niveau national
(INERIS) qu’au niveau international (Environmental Protection Agency, Union Européenne).
Toutefois, une échelle des risques a été développée pour les PCB et les HAP adsorbés sur les
21
sédiments marins et estuariens (Long et al., 1995). Cette échelle fixe deux seuils pour chaque
congénère de PCB (pour la somme des PCB définie selon Long et al., 1995), un ERL (effect
range-low) et un ERM (effect range-median). Pour des concentrations inférieures aux ERL,
aucun effet biologique n’est observé; au-delà des ERM des effets biologiques sont fortement
probables et entre ces deux seuils, des effets peuvent occasionnellement être observés. Les
ERL et ERM définis pour la somme des PCB sont respectivement de 22,7 ng.g-1 et de 180
ng.g-1 de poids sec.
II.2. Les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP)
II.2.1. Structure chimique et source des HAP
- Structure chimique
Les HAP sont des molécules organiques composées au moins de deux cycles
benzéniques condensés, principalement sous forme linéaire ou angulaire. Ces molécules sont
constituées uniquement d’atomes d’hydrogène et de carbone et ont une structure plane au
niveau des cycles (Figure 1.5). Plus de cent HAP sont connus parmi lesquels les composés les
plus "mobiles" sont les plus étudiés dans l’environnement (du Naphtalène qui est le HAP
possédant la masse moléculaire la plus faible, 128 kDa, jusqu’au Coronène, 300 kDa). Ces
molécules sont présentes dans l’environnement sous forme de mélanges complexes.
- Source d’émission des HAP dans l’environnement
Les HAP sont soit d’origine naturelle soit d’origine anthropique. Trois sources
principales sont généralement mentionnées pour les HAP (Neff, 1979; McElroy, 1989). La
source la plus importante (majoritairement d’origine anthropique), qualifiée de source
pyrolytique, provient de la combustion incomplète de la matière organique à haute
température. Ces processus comprennent principalement la combustion du bois et des déchets
agricoles (chauffage, incendies…) et la consommation de la matière organique fossile dans les
véhicules et dans l’industrie (essence, charbon…). Les HAP peuvent également avoir une
origine pétrogénique et une origine diagénétique (minoritaire). Dans tous les cas, il s’agit soit
de sources diffuses soit de sources ponctuelles. Par ailleurs, chaque source génère une
empreinte moléculaire caractéristique puisque les températures et les temps de formation sont
22
propres à chaque source. Ainsi, dans le cas d’une origine pyrolytique des HAP, des composés
parents sont majoritairement formés (très peu de composés substitués). Dans le cas des
sources pétrogéniques, des mélanges plus complexes de HAP sont formés. Les composés
formés sont essentiellement des HAP de faible masse moléculaire (en général moins de 4
cycles) avec une présence plus forte de HAP substitués. Des indices moléculaires basés sur
les caractéristiques de formation des HAP ont été développés pour mettre en évidence
l’origine de ces composés. Ainsi, les rapports des concentrations phénanthrène/anthracène
(P/A) (Soclo, 1986) et fluoranthène/pyrène (Fluo/Pyr) (Sicre et al., 1987) permettent de
différencier les sources pyrolytiques et pétrogéniques. En effet, des rapports P/A<10 et
Fluo/Pyr>1 sont caractéristiques de mélanges de HAP d’origine pyrolytique alors que des
rapports P/A>10 et Fluo/Pyr<1 sont représentatifs de mélanges de HAP d’origine
pétrogénique (Budzinski et al., 1997; Baumard et al., 1998).
II.2.2. Propriétés physico-chimiques
Le devenir et la mobilité des HAP dans l’environnement dépendent de leurs propriétés
physico-chimiques. De plus, les propriétés physico-chimiques de ces composés dépendent
essentiellement de leur poids moléculaire et de leur structure. Selon leur nombre de cycles
benzéniques, ces composés sont classés en HAP "légers" (≤ 3 cycles, avec une masse molaire
comprise entre 120 et 180 g.mol-1) ou "lourds" (≥ 4 cycles, avec une masse molaire comprise
entre 200 et 280 g.mol-1). A l’exception de certains composés légers qui peuvent se volatiliser
(à la surface de l’eau ou du sol), les HAP sont relativement peu volatils (pression de vapeur de
7,2 pour le naphtalène à 20°C jusqu’à 1,3×10-8 pour le dibenz[a,h]anthracène à 20°C) et peu
solubles dans l’eau. En effet, excepté pour le naphtalène, la solubilité des HAP dans l’eau est
modérée (30 mg.L-1) à très faible (2,6×10-4 g.L-1) pour les HAP lourds. De plus, la solubilité
est fonction de la température et du coefficient de partage octanol/eau (Kow). Pour ces
composés, le log de Kow, varie de 3,37 à 6,5 (Mackay et al., 1992).
II.2.3. Les HAP dans l’environnement
Les origines très diverses et semi-diffuses des HAP font que ces molécules sont
retrouvées dans tous les écosystèmes (aquatiques, terrestres et aériens). Dans l’air, le sol et
l’eau, ces composés sont préférentiellement adsorbés sur les matières particulaires par
lesquelles ils sont transportés. A titre d’exemple, les teneurs en HAP atmosphériques de la
23
zone urbaine du Havre sont comprises entre 2,83 et 55,2 ng.m-3 (Motelay-Massei et al., 2006).
Ainsi, bien que la majorité des HAP soit émis dans l’atmosphère, le sol et les sédiments
constituent le principal réservoir environnemental de ces contaminants (Wild et Jones, 1995).
Par ailleurs, les milieux aquatiques constituent le réceptacle final pour ces contaminants
puisque les particules atmosphériques entraînées par les eaux de pluie, le lessivage des sols
(routes, industries…) et le ruissellement entraînent les HAP (16 prioritaires selon l’EPA) vers
ces milieux. Ainsi, les dépôts moyens de HAP atmosphériques sur la zone urbaine du Havre
sont estimés à 572 ng.m2 par jour (Motelay-Massei et al., 2006).
De plus, lorsque les HAP pénètrent les milieux aquatiques, du fait de leur caractère
hydrophobe, ces composés s’adsorbent rapidement sur les particules en suspension et se
concentrent dans les sédiments, et ce d’autant plus que ces molécules ont un poids
moléculaire élevé (OMS, 1996). Les concentrations en HAP des sédiments de la Seine et de
son estuaire sont respectivement comprises entre 1,4 et 84 µg.g-1 (Carpentier et al., 2002) et
entre 1 et 14 µg.g-1 (Fernandez et al., 1997) alors que les concentrations dans la phase
dissoute vont de 4 à 36 ng.L-1 (Fernandez et al., 1997).
Par ailleurs, compte tenu du caractère fortement lipophile de ces composés, les HAP
peuvent être accumulés par les organismes aquatiques. Ainsi, des concentrations comprises
entre 21 et 1093 ng.g-1 (poids sec), entre 14,7 et 49,6 ng.g-1 (poids sec) et entre 82,8 et 102
ng.g-1 (poids sec) ont notamment été rapportées respectivement chez des moules (Oros et
Ross, 2005), chez des poissons (Mullus barbatus) et des crustacés (Polybius henslowi)
(Baumard et al., 1998). De plus, Carls et al. (2006) ont suggéré que les copépodes tels que
Neocalanus plumchrus pouvaient bioconcentrer les HAP présents dans le milieu pour
atteindre des concentrations élevées comprises entre 0,61 et 1,31 µg.g-1 de poids sec.
Le choix des composés à étudier dépend essentiellement de leur toxicité et de leur
stabilité dans l’environnement. Parmi ces composés, seize HAP sont considérés comme
polluants prioritaires par l’US EPA. Certains composés n’appartenant pas à cette liste sont
également étudiés parce qu’ils sont utilisés dans les rapports moléculaires permettant de
déterminer l’origine des HAP (Benzo[e]pyrène, Pérylène), et d’autres parce qu’ils ne sont pas
séparés des contaminants prioritaires sur les colonnes chromatographiques classiquement
utilisées (triphénylène, benzo[j]fluoranthène, dibenz[a,c] anthracène). La liste des HAP
analysés au cours de cette étude est présentée dans la Figure 1.5.
24
Naphthalène
Acénaphthène
Acénaphthylène
Fluorène
0,001
0,001
0,001
0,001
Anthracène
Phénanthrène
Fluoranthène
0,01
0,001
0,001
Pyrène
Chrysène
Benzo(a)anthracène
Triphénylène
Benzo(b)fluoranthène
Benzo(j)fluoranthène
Benzo(k)fluoranthène
0,001
0,01
0,1
n.p.
0,1
n.p.
0,1
Pérylène
Benzo(a)pyrène
Benzo(e)pyrène
Dibenz(a,c)anthracène
Dibenz(a,h)anthracène
Indéno(1,2,3-c,d)pyrène
n.p.
1
n.p.
0,1
1
0,1
Benzo(g,h,i)pérylène
0,01
Figure 1.5 : Liste des HAP étudiés et leur facteur d’équivalence toxique (FET) pour des effets
cancérigènes (d’après Nisbet et LaGoy, 1992; modifiée par l’INERIS, 2006). (np : non
précisé)
II.2.4. Toxicité
La population est exposée à des mélanges de HAP et ce quelle que soit la voie
d’exposition. Les deux principales voies d’exposition sont l’alimentation (HAP formés lors de
la cuisson des aliments, dépôts atmosphériques sur les fruits et légumes qui sont ensuite
consommés (OMS, 2000)) et la respiration. Comme pour les PCB, l’évaluation de la toxicité
des HAP et de la dose-réponse induite par une exposition est délicate puisque la population et
les écosystèmes dans leur ensemble sont exposés à des mélanges de HAP, associés ou non à
d’autres composés. Deux concepts peuvent être envisagés pour évaluer la toxicité des HAP :
l’approche par substance (utilisation des facteurs d’équivalence toxique) et l’approche par
mélange (utilisation de l’analogie des mélanges soit par comparaison des potentiels toxiques
des mélanges soit en fonction de la quantité de benzo(a)pyrène dans le mélange).
25
- Toxicité aiguë
Peu d’effets à court terme des HAP ont été rapportés chez les organismes. La plupart
des effets sont par ailleurs mentionnés composé par composé et sont très variables suivant le
composé et l’espèce considérés. Chez l’homme, aucune donnée n’étant disponible, la toxicité
aiguë est basée sur l’expérimentation animale. Ainsi, chez la souris, les DL 50 mesurées par
voie orale sont supérieures à 1600 mg.kg-1 pour le benzo[a]pyrène (Awogi et Sato, 1989).
Pour les organismes aquatiques, des données de DL 50 sont disponibles pour plusieurs
espèces. Ainsi, des DL 50 de 1,5 µg.L-1 (Newsted et Giesy, 1987), de 95 µg.L-1 (Munoz et
Tarazona, 1993) et > 357 µg.L-1 (Vindimian, 2000) ont été rapportées respectivement pour le
benzo[a]pyrène, l’anthracène et l’indéno[1,2,3,-cd]pyrène, chez des daphnies. De même, une
DL 50 de 8 µg.L-1 a été rapportée pour l’anthracène chez des poissons (McCloskey et Oris,
1991). Par ailleurs, les organismes marins semblent être plus sensibles que les espèces d’eau
douce.
La toxicité des HAP dépend essentiellement de la structure moléculaire et de la
métabolisation de ces composés par les organismes. Du fait de leur caractère lipophile, les
HAP peuvent être accumulés par les organismes au niveau de leurs réserves lipidiques. La
plupart des organismes peuvent métaboliser les HAP selon deux voies majeures (la mono
oxygénation et l’oxydation mono électronique) pour faciliter leur excrétion. Cependant, la
remobilisation de certains métabolites peut être toxique pour les organismes. En effet, bien
que les voies de métabolisation de ces molécules, faisant intervenir des mono-oxygénases à
cytochrome P450, soient communes à tous les HAP, seuls certains présentent un potentiel
mutagène et cancérogène. De plus, l’étude des mécanismes moléculaires de la toxicité des
HAP a permis de mettre en évidence une caractéristique structurelle essentielle à l’expression
du pouvoir mutagène et cancérogène. L’importance de la formation de métabolites de type
diol-époxydes dans la "Bay-region" (Figure 1.6) de certains HAP et le rôle essentiel de ces
métabolites dans l’expression de la génotoxicité ont été démontrés. De plus, les HAP peuvent
réguler l’expression des gènes des mono-oxygénases à cytochromes P450 et de ce fait
augmenter la formation de certains de leurs métabolites génotoxiques. Ainsi, la
métabolisation du benzo[a]pyrène, classé comme le HAP le plus cancérigène entraîne la
26
formation du benzo[a]pyrène 7,8-diol-9,10-époxide considéré comme le cancérigène ultime
responsable de cette toxicité (Timbrell, 1991).
Bay-region
Cytochrome P450
Figure 1.6 : Métabolisation du benzo[a]pyrène en benzo[a]pyrène 7,8-diol-9,10-époxide
Selon l’International Association for Research on Cancer (IARC, 2006), le
benzo[a]anthracène, le benzo[b]fluoranthène, le benzo[a]pyrène, le dibenz[a,h]anthracène et
l’indénopyrène sont des HAP probablement cancérogènes pour l’homme. De plus, des études
épidémiologiques ont montré une augmentation de la mortalité induite par des cancers du
poumon chez des individus exposés aux émissions des fours à coke (Lloyd, 1971), aux
fumées de cigarettes (Maclure et MacMahon, 1980) ou aux émissions de goudron (Hammond
et al., 1976). Toutes ces personnes ont été exposées à des mélanges de HAP contenant du
benzo[a]pyrène, du chrysène, du benzo[a]anthracène, du benzo[b]fluoranthène et du
dibenz[a,h]anthracène. Chez des primates et des souris, des cancers cutanés ont également été
observés suite à des expositions prolongées respectivement au benzo[a]pyrène (Albert et al.,
1991) et au dibenz[a,h]anthracène (Platt et al., 1990). De plus, suivant l’Union Européenne
(JOCE, 2004), le benzo[a]pyrène est assimilé aux substances mutagènes. Les HAP et
notamment le benzo[a]pyrène peuvent également induire des troubles de la reproduction en
diminuant la fertilité des individus (Mackenzie et Angevine, 1981), des effets embryotoxiques
(Shum et al., 1979) et une diminution de la réponse immunologique (Xue et al., 1991).
De plus, des effets ont également été rapportés sur les organismes aquatiques. Ainsi
Lotufo (1997) a montré que des HAP adsorbés sur des particules inhibaient la prise de
nourriture et perturbaient la reproduction de copépodes estuariens. De même, le potentiel
immunotoxique (Reynaud et Deschaux, 2006) et génotoxique (par la formation d’adduit à
l’ADN) (Le Goff et al., 2006) des HAP ont été rapportés respectivement chez des poissons et
chez Dreissena polymorpha.
27
Dès 1976, ces molécules ont été ajoutées à la liste des contaminants prioritaires de
l’US EPA. De plus, l’ensemble des HAP appartiennent aux substances prioritaires définies
dans la Directive Cadre Européenne sur l’eau (200/60/CE).
En ce qui concerne les eaux destinées à la consommation humaine, le décret n° 20011220 du 20 décembre 2001 (à l'exception des eaux minérales naturelles) indique que la
somme des concentrations en benzo[b]fluoranthène, benzo[k]fluoranthène, benzo[a]pyrène,
benzo[ghi]pérylène et indénopyrène ne doit pas excéder 0,1 µg.L-1. De plus, la concentration
en benzo[a]pyrène ne doit pas dépasser la valeur de 0,01 µg.L-1. Pour l’OMS, le seuil limite
en fluoranthène dans l’eau potable est fixé à 5 µg.L-1, et à 0,7 µg.L-1 pour le benzo[a]pyrène.
En France, dans le cadre de la mise en place des Seuils d’Evaluation de la Qualité physicochimique des eaux (SEQ-eau), les concentrations en HAP (parmi d’autres contaminants) sont
prises en compte pour le classement des cours d’eau suivant leur capacité à maintenir un
équilibre biologique. Pour les milieux de très bonne qualité, les concentrations en HAP de
plus de 3 cycles doivent être inférieures à 25 ng.L-1, et inférieures à 0,03 ng.L-1 pour le
benzo[a]pyrène (Agence de l’eau, 1999). De plus, en terme d’évaluation des risques
environnementaux causés par les HAP, deux seuils sont fixés pour les sédiments marins et
estuariens (pour la somme des HAP définie selon Long et al., 1995), un ERL et un ERM (cf.
paragraphe II.1.5) respectivement de 4022 ng.g-1 et de 44 792 ng.g-1 de poids sec.
De même, un suivi des teneurs en HAP atmosphériques est mis en œuvre (Directive
96/62/CE, 1996) fixant une valeur limite pour le benzo[a]pyrène atmosphérique de 1 ng.m-3
d’air et un objectif à long terme de 0,1 ng.m-3 d’air) via les réseaux de surveillance de la
qualité de l’air. Enfin, aucune réglementation sur les teneurs en HAP des sols n’a été
développée en France.
II.3. Les alkylphénols-polyéthoxylés (APEO)
II.3.1. Réaction de synthèse et structure chimique
Les alkylphénols (AP) sont très généralement fabriqués à haute température par
réaction entre un phénol et une molécule de tripropylène en présence d’un catalyseur (résines
sulfoniques, BF3…) et servent d’intermédiaire dans la synthèse d’agents tensioactifs et de
résines phénoliques (Figure 1.7). L’une des principales sources d’alkylphénols est la
28
biodégradation des alkylphénols-éthoxylés (APEO). Les APEO sont formés par réaction
d’une molécule d’alkylphénol avec une ou plusieurs molécules d’oxyde d’éthylène en
présence d’un catalyseur (hydroxyde de potassium) et sont commercialisés essentiellement en
tant qu’adjuvants de formulations de pesticides, détergents dans l’industrie textile, pour les
traitements de surface, comme additif de désencrage dans l’industrie papetière, et comme
émulsifiant.
OH
Phénol
Catalyseur
C3H6
C9H18
Trimère Catalyseur
de
propylène
propylène
OH
Nonylphénol
Figure 1.7 : Procédé de fabrication du nonylphénol
Les nonylphénols et nonylphénols-éthoxylés sont des alkylphénols possédant une
chaîne ramifiée de 9 carbones. Il n’existe pas d’exemple de synthèse naturelle des AP et des
APEO. Leur présence dans les milieux aquatiques est donc uniquement d’origine anthropique.
Les consommations mondiales en AP et APEO sont estimées respectivement à 400
000 et 600 000 tonnes/an, dont 80 à 90 % de nonylphénols (NP) et 85 % de nonylphénolspolyéthoxylés (NPEO). En 1997, les consommations de NP et NPEO en Europe de l’ouest
étaient respectivement de 75 000 à 80 000 et de 120 000 tonnes/an (EU, 1999). Néanmoins, la
consommation en nonylphénols-polyéthoxylés a diminué de 4 à 5 % par an lors des 5
dernières années dans l’Union Européenne alors qu’elle a augmenté de 2 à 3 % aux USA. On
considère de ce fait que la demande mondiale globale est restée constante pendant cette
période (CMR, 1999).
Les alkylphénols et alkylphénols-polyéthoxylés sont des tensio-actifs organiques non
ioniques, molécules amphiphiles comportant au moins un groupement polaire hydrophile
(assurant la solubilité dans l’eau) et une chaîne carbonée apolaire (lipophile). Les
29
groupements hydrophile et hydrophobe sont respectivement représentés par la chaîne
polyéthoxylée et par l’alkylphénol. Les propriétés physiques de ces composés dépendent
essentiellement de leur structure amphiphilique. Leur propriété caractéristique est de se
concentrer aux interfaces (liquide-liquide, liquide-solide) et de réduire les tensions
superficielles.
Les alkylphénols sont des molécules peu volatiles (pression de vapeur < 10 Pa)
caractérisées par une solubilité faible dans l’eau (<15 mg.L-1). A contrario, les alkylphénolspolyéthoxylés sont des molécules très solubles dans l’eau. Leur solubilité dépend du nombre
de groupements polaires formant la partie hydrophile de la molécule. Ces molécules sont
d’autant plus solubles dans l’eau que leur nombre de groupements polaires est élevé. Les
propriétés physico-chimiques de ces composés vont déterminer leur devenir dans
l’environnement.
II.3.3. Les alkylphénols dans l’environnement
Du fait de la multitude d’applications et des produits commercialisés contenant des AP
et des APEO, leur présence dans l’environnement est ubiquitaire (EU, 1999). Par ailleurs, les
APs détectés dans l’environnement peuvent provenir soit de la dégradation des APEO soit
d’émissions directes de substances commerciales contenant ces molécules. Ces composés sont
introduits dans l’environnement principalement via les effluents des stations d’épuration
urbaines et industrielles (eaux usées et boues), mais également par épandages directs de
pesticides. Les APEO et leurs métabolites sont donc retrouvés dans tous les compartiments
des écosystèmes (l’eau, l’air et les sols). Selon le TemaNord (1996), la distribution théorique
du nonylphénol dans l’environnement est de > 60 % dans les sédiments, > 10 % dans les sols
et environ 25 % dans les eaux. De plus, les producteurs de ces composés estiment que 60 à 70
% des nonylphénols éthoxylés utilisés vont finalement être retrouvés dans les eaux usées
(Leisewitz, 1997).
Dans l’atmosphère, la présence de nonylphénols a été détectée. Ainsi, Dachs et al.
(1999) ont notamment rapporté des teneurs en nonylphénols atmosphériques dans la baie de
New York-New Jersey comprises entre 2,2 et 70 ng.m-3. La présence de ces composés a
également été rapportée dans des rivières, des lacs et dans des régions côtières partout dans le
monde (Ying et al., 2002). Les niveaux reportés dans les eaux douces de surface pour le
nonylphénol, le nonylphénol-1-éthoxylé et le nonylphénol-2-éthoxylé varient respectivement
30
entre < à la limite de détection et 644 µg.L-1, < à la limite de détection et 20 µg.L-1 et < à la
limite de détection et 21 µg.L-1 (Ying et al., 2002). Ces composés ont également été détectés
dans les eaux de mer côtières (Jonkers et De Voogt, 2003). Par ailleurs, les concentrations en
métabolites carboxylés des alkylphénols dans l’environnement sont faiblement documentées,
aussi bien pour les eaux de station d’épuration que pour les eaux de surface, bien que ces
molécules soient les métabolites présents parfois en plus grande quantité dans l’eau (John et
al., 1999).
De plus, les propriétés physico-chimiques déterminent le comportement et le devenir
des alkylphénols et des alkylphénols-polyéthoxylés dans les milieux aquatiques. En effet, ces
composés sont peu solubles dans l’eau (log Kow 3,9-4,5) et sont rapidement adsorbés sur les
particules et les sédiments. De ce fait, les concentrations mesurées dans ces compartiments
sont supérieures à celles mesurées dans les eaux et peuvent atteindre 13 700 µg.kg-1
(Vazquez-Duhalt et al., 2005). L’autre processus contrôlant le devenir de ces composés dans
l’environnement est leur biodégradation.
H2
C
O
C
H2
H2
C
O
OH
C
H2
R = C9H19 , nonyl
m
R
Alkylphénols polyéthoxylés (APmEO)
A
Acide Alkylphénoxy carboxylique
(APmEC)
H2
C
H2
C
O
C
H2
O
Alkylphénols polyéthoxylés (APnEO)
H2
C
O
O
C
H2
C
OH
m
R
B
R
H2
C
O
OH
C
H2
m-1
n = m-1
Réduction successive des chaînes éthoxylées
O
O
C
C
H2
H2
C
O
OH
C
H2
R
OH
R
Acide Alkylphénoxy acétique
(APmEC)
Alkylphénol monoéthoxylé (AP1EO)
OH
R
Alkylphénol (NP)
Clivage du cycle, oxydation de la chaîne alkylée
Figure 1.8 : Voies de dégradation des alkylphénols-polyéthoxylés ; (A) hydrolyse oxydative
(aérobie), (B) hydrolyse non oxydative (anaérobie) (Fenner et al., 2002).
31
La biodégradation des alkylphénols-polyéthoxylés se produit principalement au niveau
des stations d’épuration (Figure 1.8) et consiste en une réduction progressive de la chaîne
éthoxy jusqu’à une complète dé-éthoxylation conduisant à la formation d’alkylphénols. Deux
voies de dégradation sont mises en jeu, la dégradation aérobie, la plus fréquente (Brunner et
al., 1988) et la dégradation anaérobie. Les nonylphénols et les nonylphénols éthoxylés sont
éliminés efficacement dans les usines de traitement secondaire des eaux usées en bon état de
fonctionnement (taux d’élimination moyen de 95 %). Lorsque le traitement des effluents est
déficient ou insuffisant, les niveaux de ces contaminants dans l’environnement peuvent
atteindre des concentrations préoccupantes.
Par ailleurs, les alkylphénols qui sont des composés lipophiles peuvent également être
bioconcentrés par les organismes. En effet, plusieurs auteurs ont rapporté la présence de ces
composés bioaccumulés par une grande variété d’organismes aquatiques parmi lesquels des
algues (Ahel et al., 1993), des crustacés (Ferrara et al., 2005), des mollusques (Granmo et al.,
1991) et des poissons (Lewis et Lech, 1996).
Dans notre étude, 5 composés ont été analysés : le 4 nonylphénol-technique (4NP)
(mélange d’isomères), le 4 nonylphénol mono- et diéthoxylé (NP1EO et NP2EO), l’acide
phénoxy-acétique (NP1EC) et l’acide phénoxy-éthoxy-acétique (NP2EC).
II.3.4. Toxicité
La toxicité des alkylphénols et alkylphénols-polyéthoxylés dépend essentiellement de
la structure chimique de ces molécules. En effet, le caractère hydrophobe (Saarikoski et
Viluksela, 1982) et électrophile (Cronin et al., 2001) de ces composés sont les paramètres
responsable de leur toxicité.
- Toxicité aiguë
Des données de DL 50 sont disponibles chez de nombreux organismes,
essentiellement pour le nonylphénol. Ainsi, chez les organismes aquatiques, le nonylphénol
présente une toxicité aiguë de 0,15 mg.L-1 (96 heures), de 0,043 mg.L-1 (96 heures), de 0,13 à
0,9 mg.L-1 (96 heures), respectivement chez Hyalella azteca (Weeks et al., 1996), Mysidopsis
Bahia (Weeks et al. 1996) et Salmo salar (McLeese et al., 1981). Chez les mammifères (rat),
des DL 50 de 1475 mg.kg-1 ont été rapportées (De Jager et al., 2001).
32
Les alkylphénols sont répertoriés parmi les perturbateurs endocriniens (Colborn et al.,
1993). En effet, ils peuvent avoir des effets oestrogéniques sur les organismes en se liant
directement avec le récepteur aux oestrogènes et en mimant le mécanisme d’action du 17βoestradiol (White et al., 1994). Chez l’Homme, ils peuvent également avoir des effets sur les
hormones thyroïdiennes. Le nonylphénol est considéré, avec l’octylphénol, comme
l’alkylphénol potentiellement le plus oestrogéno-mimétique et est de ce fait le plus étudié.
Les Hommes peuvent être exposés aux alkylphénols essentiellement par la voie
alimentaire (ingestion de produits contaminés) et par contact dermique, et la toxicité
chronique est estimée via l’expérimentation animale. Ainsi, l’activité oestrogénique du
nonylphénol a été mise en évidence, chez les mammifères par Soto et al. (1991). D’autres
auteurs ont démontré que le nonylphénol pouvait également avoir des effets immunotoxiques
(Karrow et al., 2004), cancérogènes par l’induction de la prolifération cellulaire et par la
formation d’adduits à l’ADN (Seike et al., 2003).
Chez les organismes aquatiques, O’halloran et al. (1999) ont montré que des
expositions prolongées au nonylphénol réduisaient la diversité zooplanctonique. De plus, des
perturbations endocrines (réduction de la fertilité/augmentation de la fertilité, augmentation de
l’incidence des cas d’hermaphrodisme, perturbations du métabolisme stéroïdien) ont été
observées chez différentes espèces de crustacés (Daphnia magna, Corophium volutator,
Elminius modestus, Balanus amphitrite) et de mollusques (Crassostrea giga) suite à des
expositions au nonylphénol à des concentrations allant de 0,1 à 100 µg.L-1 (Forget et al.,
2003; Vazquez et al., 2005). Des expositions à de fortes concentrations en nonylphénol (44
µg.L-1) ont par ailleurs montré le caractère embryotoxique de ce composé chez les daphnies
(LeBlanc et al., 2000). Des phénomènes d’inter-sexe ont également été rapportés chez les
Medaka japonais suite à des expositions chroniques au nonylphénol (Gray et Metcalfe, 1997).
Enfin, des effets mutagènes du nonylphénol ont été décrits chez des crustacés par Atiezar et
al. (2002) pour des concentrations de 0,1 à 10 µg.L-1.
Les nonylphénols/nonylphénols polyéthoxylés ont été inclus en 1998, lors de la
réunion ministérielle OSPAR, dans la liste des substances nécessitant une action prioritaire
33
pour éliminer tous rejets, émissions ou pertes de ces composés dans l’environnement marin
d’ici 2020. Depuis, le nonylphénol a été classé en tant que substance dangereuse prioritaire
dans le cadre de la Directive Cadre Eau de l’Union Européenne. L’UE a fixé des valeurs de
PNEC pour le nonylphénol dans les eaux de surface de 0,33 µg.L-1 (phase dissoute) et de
0,039 mg.kg-1 (de poids humide) dans les sédiments (EU, 2002).
Par ailleurs, l’Union Européenne soutient une politique de restriction de l’utilisation et
de la commercialisation des nonylphénols/nonylphénols polyéthoxylés (Journal officiel de
l’Union Européenne, Juillet 2003). Ainsi, ces composés ne doivent pas dépasser 0,1 % de la
masse totale dans les substances commercialisées.
II.4. Les Pesticides :
Selon la directive 91/414/CEE, les produits phytosanitaires (également définis par le
terme de pesticides) désignent les substances actives et les préparations contenant une ou
plusieurs substances actives qui sont destinées à :
- protéger les végétaux contre tous les organismes nuisibles ou à prévenir leur action,
- exercer une action sur les processus vitaux des végétaux,
- assurer la conservation des végétaux,
- détruire les végétaux indésirables,
- détruire les parties des végétaux, freiner ou prévenir une croissance indésirable.
Suivant leurs spécificités et les parasites ciblés, ces pesticides sont classés en plusieurs
catégories : herbicides, insecticides, fongicides principalement. Les phytosanitaires sont
essentiellement utilisés dans l’agriculture (98,97 %, IFEN, 1998), mais également pour des
usages non agricoles (entretien des voiries, des rails de chemin de fer, usages privatifs) qui
sont souvent peu respectueux des règles propres aux épandages agricoles.
Les Herbicides sont les pesticides les plus utilisés et représentaient 50 % du tonnage
mondial en 2002, toutes cultures confondues (UIPP, 2004). En France, 6000 préparations de
produits phytosanitaires, composées d’environ 400 substances actives, sont fabriquées. Parmi
les phytosanitaires utilisés, le recours aux fongicides est prédominant (environ 50 % des
tonnages utilisés). Les herbicides représentent environ 30 % des tonnages utilisés tandis que
les insecticides correspondent à un faible pourcentage. Cependant, les proportions relatives de
34
chacune de ces trois classes de phytosanitaires sont variables à l’échelle nationale ou
régionale en fonction du type de culture (Figure 1.9).
Figure 1.9 : Orientation technico-économique des communes en Haute Normandie en 2000
(Site de l’Agreste, recensement agricole 2000).
II.4.1. Structure chimique
- Les herbicides
L’atrazine, la simazine (et leurs métabolites) sont des molécules organiques de
synthèse appartenant à la classe chimique des triazines. Les triazines possèdent un hétérocycle
aromatique analogue à un benzène avec trois atomes de carbone substitués par des atomes
d’azote (Figure 1.10).
Triazines
Carbamates
Phénylurées
Diuron
Carbaryl
Carbofuran
3,4 dichloro-aniline
Figure 1.10 : Liste des différents pesticides étudiés (regroupés par classe chimique)
35
Le diuron est un herbicide organique de synthèse appartenant à la classe chimique des
phénylurées. Les composés de type phénylurée sont des molécules dérivées de l’urée (H2NCO-NH2) avec un groupement phényle sur l’un des azotes. Ces composés diffèrent entre eux
par la nature des substitutions portées soit par le deuxième atome d’azote soit par le cycle
aromatique (Figure 1.10).
- Les insecticides
Le carbofuran et le carbaryl appartiennent à la classe chimique des carbamates. Les
carbamates constituent une classe de molécules organiques présentant un groupement
fonctionnel de formule chimique H2N-COOH. Ces molécules possèdent une fonction amide et
une fonction acide carboxylique. De plus, un groupement alkyle ou aryle peut être substitué
sur la fonction amide (Figure 1.10).
- Les herbicides
Les triazines sont des herbicides absorbés par les racines de la plante et qui inhibent la
photosynthèse au niveau du photosystème II du végétal. Ils bloquent le transport des électrons
et le transfert de l’énergie lumineuse.
L’atrazine présente une solubilité dans l’eau de 33 mg.L-1 à 25°C; elle n’est pas
accumulée par les organismes (log Kow de 2,61) et est faiblement volatilisée lors du traitement
(tension de vapeur : 3×10-5 Pa à 20°C). Cette molécule n’est pas facilement hydrolysée dans
les écosystèmes aquatiques (demie vie de 134 jours en eau douce) mais est biodégradée par
des microorganismes.
La simazine présente une solubilité dans l’eau de 6,2 mg.L-1 à 20°C; elle n’est pas
accumulée par les organismes (log Kow de 2,2-2,18) et est faiblement volatilisée lors de
l’épandage (tension de vapeur : 2,94×10-6 Pa). Cette molécule est faiblement hydrolysée,
faiblement dégradée par photolyse et difficilement biodégradable dans l’environnement
(demie vie de 77 jours en eau douce). Ces molécules sont principalement utilisées en
maïsiculture et en arboriculture.
36
Les urées substituées sont absorbées par les racines de la plante. Elles possèdent les
mêmes propriétés que les triazines mais inhibent le photosystème II au niveau d’un autre site
actif. Le diuron présente une solubilité dans l’eau de 42 mg.L-1 (à 25°C), n’est pas accumulé
par les organismes (log Kow de 2,8) et est faiblement volatilisé lors du traitement (tension de
vapeur : 1×10-5 Pa à 25°C). Cette molécule est faiblement hydrolysée dans les conditions
environnementales et peut être biodégradée (demie vie de 90 jours dans l’eau douce). Cette
molécule est essentiellement utilisée sur grande culture, en viticulture, sur les cultures
légumières et sur les surfaces non cultivées (voieries, voies ferrées).
- Les insecticides
Les carbamates sont des insecticides qui inhibent la transmission de l’influx nerveux
en inhibant l’enzyme acétylcholinestérase (cf. III.2). Le carbaryl présente une solubilité dans
l’eau de 40 à 120 mg.L-1 à 30°C, une pression de vapeur 0,67 Pa à 20°C et n’est pas accumulé
par les organismes (log Kow de 2,36). C’est une molécule instable qui peut être hydrolysée
(demie vie de 11-12 jours à pH 7).
Le carbofuran présente une solubilité dans l’eau de 700 mg.L-1 à 25°C, n’est pas
accumulé par les organismes (log Kow de 1,52) et est faiblement volatilisé lors de lors du
traitement (pression de vapeur 2,7×10-3 Pa à 33°C). Ce composé est stable et présente une
faible photolyse en conditions environnementales (demie vie de 50 jours).
II.4.3. Les pesticides dans l’environnement
Lors de l’utilisation de produits phytosanitaires, une grande partie de ces molécules
n’atteint pas sa cible (Pimentel, 1995) et se retrouve dans l’environnement, principalement
dans l’air sous forme de gouttelettes ou sur les sols. Ces composés sont alors soumis à
plusieurs processus : ils peuvent être retenus dans les sols, être entraînés vers les eaux de
surface ou les eaux souterraines par ruissellement ou lixiviation et être dégradés.
La dégradation des produits phytosanitaires peut être plus ou moins complète, de
façon biotique ou abiotique, dans tous les compartiments de l’environnement. Les liaisons
chimiques de ces molécules sont détruites par photodégradation, par hydrolyse aqueuse ou par
biodégradation (principalement microbienne). L’utilisation de rapports moléculaires entre les
composés parents et les métabolites constitue des indices géochimiques du temps de séjour
des produits phytosanitaires dans les sols ou une indication des apports récents dans les eaux
37
continentales. De ce fait, l’utilisation du rapport dééthylatrazine, produit de dégradation
principal de l’atrazine, sur atrazine (DAR) permet de comprendre le comportement
géochimique de l’atrazine (Pereira et Rostad, 1990). Ainsi, lors des périodes d’épandage, le
DAR est faible alors qu’il est plus élevé en dehors des périodes d’application en raison de la
dégradation de l’atrazine en dééthylatrazine.
Selon la DIREN Haute Normandie (2003), 100 % des points de mesure des eaux
superficielles et 87,5 % des points de mesure des eaux souterraines étaient touchés par les
pesticides en 2003. La liste des substances actives recherchées est ciblée en fonction des
usages régionaux et des risques de contamination des eaux et déterminée d’après la méthode
SIRIS.
a.
b.
Nombre de substances actives
différentes quantifiées
Nombre de substances actives
différentes quantifiées
0
0
de 1 à 4
de 1 à 4
de 5 à 9
5 et plus
de 10 à 14
15 et plus
Figure 1.11 : Détection des substances actives dans les eaux superficielles (a.) et les eaux
souterraines (b.) de Haute Normandie en 2003 (DIREN Haute Normandie, 2003).
Sur les 124 substances recherchées, 31 % d’entre elles ont été quantifiées au moins
une fois en 2003 dans les eaux de surface (Figure 1.11). Parmi ces substances, la plupart sont
des herbicides (55 %) et des insecticides (21 %). Dans les eaux souterraines, 10 % des 69
substances recherchées ont été quantifiées au moins une fois (71 % d’herbicides et 29 % de
métabolites). L’atrazine, la simazine, la dééthylatrazine et le diuron font partie des composés
les plus fréquemment rencontrés.
38
II.4.4. Toxicité
- Toxicité aiguë
La toxicité aiguë des différents pesticides, caractérisée par des valeurs de DL 50 de
chaque composé pour différents organismes, est détaillée dans le Tableau 1.1.
Tableau 1.1 : Toxicité aiguë des différents pesticides étudiés sur différents groupes
d’organismes.
Mollusques
> 30 mg.L
Atrazine
Crustacés
-1
Crassostrea virginica
94 µg.L
1
Poissons
-1
Acartia tonsa
8800 µg.L-1
Simazine
-1
Cerastoderma edule
1000 µg.L
9
-1
Daphnia magna
-1
4300 µg.L
8
-1
-1
Carbaryl
-1
Crassostrea virginica
2
8.13 µg.L
Cyprinodon variegatus
-1
510 mg.L
-1
Gammarus pseudolimaneus
2.4 mg.L
5
5
-1
-1
225-850 mg.kg
14
rat (voie orale)
2
Mugil cephalus
4.3 mg.L-1
4
Onchorynchus mykiss
3097µg.L
Carbofuran
-1
Lymnaea acuminata
10
59.9 µg.L
-1
Trigriopus brevicornis
44.2 µg.L
11
-1
-1
-1
-1
Carassius auratus
Diuron
Lymnae sp
12
1400 µg.L-1
Daphnia pulex
6.3 mg.L-1
13
Mugil cephalus
-1
300 mg.L
5300 mg.kg
10
rat (voie orale)
10
3400 mg.kg-1
15
rat (voie orale)
2
Lepomis macrochirus
1
2 mg.kg
souris 10 (voie orale)
10
Menidia menidia
10. 25 mg.L
15.3-33.2 mg.L-1
580-1390 mg.kg
10
rat (voie orale)
10
Pimephales promelas
> 2000 µg.L
672-3000 mg.kg
7
rat (voie orale)
850-1750 mg.kg-1
7
Souris (voie orale)
-1
20 mg.L-1
3
Pimephales promelas
6
Hyallella azteca
100 mg.L
520 µg.L
1
Mammifères
10
Ward et Ballantine, 1985; 2 Mayer, 1987; 3 Dionne, 1992; 4 Brown, 1978; 5 Mayer et Ellersieck, 1986; 6 Pape-
Lindstrom et Lydy, 1997; 7 Trotter et al., 1990; 8 Sanders, 1970; 9 Portman et Wilson, 1971;
Database – Chemicals,
Criteria Monographs;
15
11
Forget et al. 1998;
12
Christian et Tate, 1983;
13
Cope, 1966;
14
10
PAN Pesticides
Environmental Health
Hazardous Substances Databank. Bethesda.
Des expériences sur des animaux de laboratoire ont montré que l’atrazine pouvait
engendrer des perturbations endocrines chez des rats femelles, sans avoir d’action mimétique
mais en perturbant le contrôle hormonal hypothalamique (Cooper et al., 1996). De plus
l’atrazine peut également perturber la réponse immunologique et comportementale des souris
39
(Porter et al., 1999). Stevens et al. (1999) et Wetzel et al. (1990) ont également montré que
des expositions à l’atrazine et à la simazine favorisaient la prolifération de tumeurs chez des
rats.
Différentes études ont montré que le carbaryl avait des effets sur la reproduction des
mammifères en diminuant la fécondité (Collins et al., 1971). Cependant, la plupart des études
faites à ce jour n’ont pas indiqué d’effet mutagène, cancérogène, ou immunotoxique du
carbaryl sur les mammifères, du moins pour des concentrations sublétales.
Par ailleurs, Chauhan et al. (2000) ont montré le potentiel génotoxique du carbofuran
chez des souris, y compris pour des doses inférieures à la DL50.
Enfin, la plupart des expériences à long terme réalisées in vitro et in vivo ont montré
que le diuron n’avait pas d’effet mutagène, mais qu’il pouvait induire des anémies
hémolytiques, des néoplasmes de l’urothélium et perturber le développement chez des rats et
des carcinomes mammaires chez des souris (Source Dupont De Neumour, site internet
Agritox). Ce composé est classé comme ayant des effets cancérigènes suspectés mais non
prouvés chez l’Homme.
Quelques références sont également disponibles concernant la toxicité à long terme
des pesticides sur les organismes aquatiques. La plupart des études concernent l’atrazine étant
donné que ce composé est le pesticide le plus fréquemment rencontré dans l’environnement.
En effet, l’atrazine est mentionnée dans plusieurs études comme étant un perturbateur
endocrinien. Ainsi, Hayes et al. (2002) ont montré que l’atrazine pouvait induire une
féminisation des gonades chez des grenouilles mâles. De plus, Moore et Waring (1998) ont
montré que l’atrazine inhibait la sécrétion de testostérone dans les testicules de saumon et
pouvait également perturber chez les mâles le système olfactif de détection des phéromones
des femelles. Enfin, Dodson et al. (1999) ont montré que des expositions chroniques à
l’atrazine pouvaient entraîner une modification du sexe ratio chez Daphnia pulicaria.
Les effets d’autres pesticides ont également été étudiés. Par exemple, Carlson (1972) a
montré qu’une exposition prolongée au carbaryl diminuait la production d’œufs chez
Pimephales promelas. De plus, une diminution significative de la synthèse de gonadotropine a
été observée chez Channa punctatus suite à des expositions au carbaryl (Ghosh et al., 1990).
Enfin, suite à des expositions prolongées au carbaryl, des perturbations de l’activité natatoire
et une diminution de l’efficacité à capturer et à consommer les proies ont été observées chez
Onchorhynchus mykiss (Little et al., 1990).
40
Par ailleurs, Chatterjee et al. (1997) ont montré que des expositions au carbofuran
inhibaient la maturation des oocytes chez Heteropenustes fossilis. De plus, Saglio et Trijasse
(1998) et Saglio et al. (2003) ont indiqué que des expositions au carbofuran, à l’atrazine et au
diuron perturbaient le comportement natatoire et les interactions entre poissons. En outre,
selon Nebeker et Schuytema (1998), le diuron peut affecter la reproduction et la croissance
chez Daphnia pulex et Hyalella azteca.
Depuis leur développement en laboratoire jusqu’à leur utilisation, les produits
phytosanitaires sont soumis à des réglementations précises, les lois nationales devant être en
cohérence avec les directives européennes (Agence de l’Eau, 1998a).
La mise sur le marché de substances chimiques est régie par la Directive Européenne
91/414/CEE consistant en un examen drastique de la conformité toxicologique et
écotoxicologique de la substance auprès du Comité Phytosanitaire Européen, puis par
l’autorisation de la mise sur le marché accordée au niveau de chaque état. Ce texte est
complété par la Directive Européenne 199/45/EC spécifiant les lois et la régulation de la
classification, de la formulation et de la dénomination des préparations chimiques
dangereuses. En outre, l’utilisation de produits phytosanitaires en France doit faire l’objet de
précautions d’emploi (Journal officiel du 3/6/1987).
L’utilisation de l’atrazine a été interdite pour les usages non agricoles en 1997 et pour
les usages agricoles en septembre 2003. L’utilisation du diuron en préparation seule est
interdite depuis le 30 juin 2003. De même, l’utilisation de la simazine est interdite depuis
octobre 2003.
Par ailleurs, pour les eaux destinées à la consommation humaine, la législation en
vigueur est fixée par les directives européennes 98/83/CE, transposées en droit français dans
le décret n° 2001-1220 (J.O n° 297 du 22 décembre 2001 page 20381). La réglementation
impose que la concentration de chaque pesticide analysé ne doit pas dépasser 0,10 µg.L-1 et
que la somme de tous les pesticides analysés doit être inférieure à 0,50 µg.L-1. Dans les eaux
brutes utilisées pour la production d'eau destinée à la consommation humaine, les
concentrations individuelles et totales en pesticides ne doivent pas dépasser respectivement 2
µg.L-1 et 5 µg.L-1.
41
II.5. Les composés pharmaceutiques
II.5.1. Définition et généralités
La définition européenne du médicament est précisée dans la Directive 65/65/CEE du
26 janvier 1965. Ce texte a été transposé en droit français par 1'ordonnance du 23 septembre
1967, modifiée le 31 décembre 1971 et le 10 juillet 1975, et insérée dans l'article L.511 du
Code de la Santé Publique qui donne la définition suivante :
"On entend par médicament, toute substance ou composition présentée comme
possédant des propriétés curatives ou préventives à l'égard des maladies humaines ou
animales, ainsi que tout produit pouvant être administré à l'homme ou à l'animal en
vue d'établir un diagnostic médical ou de restaurer, corriger ou modifier leurs
fonctions organiques."
En 2001, près de 3200 médicaments différents ont été vendus en France dont 500
représentaient 83 % des ventes totales (AFSSAPS, 2003). Parmi les cinq plus gros marchés
européens du médicament (France, Allemagne, Royaume-Uni, Italie, Espagne), la France
arrive largement en tête en terme de quantité vendue par habitant (Tableau 1.2). De plus, la
France est le pays d’Europe où l’on consomme le plus d’antibiotiques et l’un de ceux où l’on
consomme le plus de tranquillisants et d’hypnotiques.
Tableau 1.2 : Quantité de médicaments vendus dans différents pays européens (source
DREES, 2006)
42
II.5.2. Structure chimique et propriétés physico-chimiques
La carbamazépine appartient à la classe chimique des Dibenzoazépines. C’est un
dérivé de l’iminostilbène qui est une amine tertiaire tricyclique. Ce médicament est utilisé
comme agent curatif pour ses propriétés antiépileptique et psychotrope.
Le 17α-éthynyloestradiol est un œstrogène de synthèse fabriqué à partir de l’oestrone.
Ce médicament est utilisé par voie orale comme contraceptif (inhibe l’ovulation) et comme
substitutif hormonal dans les traitements post ménopause.
La structure et les propriétés physico-chimiques de ces molécules sont présentées dans
le Tableau 1.3.
Tableau 1.3 : Structure et propriétés physico-chimiques des médicaments étudiés
Masse
molaire
(g.mol-1)
Solubilité
(mg.L-1)
Log Kow
Carbamazépine
236,27
112
2,45
17α-éthynyloestradiol
296,41
11,3 (à 27°C)
4,15
Composé
Structure chimique
II.5.3. Les substances pharmaceutiques dans l’environnement
Les principales voies d’entrée des substances pharmaceutiques destinées à l’utilisation
humaine, dans l’environnement, proviennent des usages personnels, à domicile ou à l’hôpital,
mais également dans un degré moindre de l’élimination des composés périmés. Les produits
ingérés sont excrétés dans les urines et les matières fécales sous forme de composés parents,
de métabolites, sous forme libre ou conjuguée et sont traités au niveau des stations
d’épuration où ils sont partiellement ou entièrement dégradés (Figure 1.12).
43
Figure 1.12 : Devenir des substances pharmaceutiques et voies d’entrée dans l’environnement
(d’après Jørgensen et Halling-Sørensen, 2000)
- La carbamazépine
Plusieurs études ont montré que ce composé n’était pas bien éliminé par les stations
d’épuration (Ternes, 1998) et qu’on pouvait le retrouver dans les écosystèmes aquatiques et
dans les eaux destinées à la consommation (Sacher et al., 2001). Ainsi, la carbamazépine est
fréquemment détectée dans les effluents de station d’épuration et dans les eaux de surface
(Ollers et al., 2001; Heberer, 2002). En France, la carbamazépine a été détectée dans des
effluents de station d’épuration à des concentrations de l’ordre de 1 µg.L-1 (Ferrari et al.,
2003). D’après les mêmes auteurs, ces concentrations présentent un risque pour les
organismes aquatiques (PNEC/PEC). De même, ce composé a été détecté à des concentrations
similaires dans des eaux de surface en Allemagne (Heberer, 2002b), en Grèce et en Suède
(Ferrari et al., 2003).
- Le 17α-éthynylestradiol
Le 17α-éthynylestradiol est rapidement et quasiment entièrement dégradé dans les
stations d’épuration (Johnson et Williams, 2004). Ce composé est présent à l’état de trace
dans les effluents de station d’épuration et dans les écosystèmes aquatiques (Ternes et al.,
44
1999; Heberer, 2002b), le plus souvent à des niveaux inférieurs aux limites de détection.
Cependant, ce composé a été détecté dans certains effluents de stations d’épuration, à des
niveaux inférieurs à 5 ng.L-1 et également dans des écosystèmes aquatiques à des
concentrations comprises entre 0,4 et 15 ng.L-1 (Lintelmann et al., 2003). En France, des
concentrations en 17α-éthynyloestradiol comprises entre 1 et 7 ng.L-1 ont été mesurées dans
des effluents de stations d’épuration et des eaux de surface (Cargouët et al., 2004). Par
ailleurs, des expériences menées par Liebig et al. (2005) ont montré que ce composé pouvait
être bioaccumulé par un oligochète d’eau douce, Lumbriculus variegatus.
II.5.4. Toxicité
Chez l’Homme, la carbamazépine peut avoir un effet sur le développement. De plus,
des effets de ce composé sur la respiration, des effets neurotoxiques ainsi que des effets
cardiovasculaires sont suspectés.
Le 17α-éthynylestradiol peut induire des cancers chez les personnes traitées par une
thérapie aux oestrogènes post ménopause, c’est pourquoi ce composé est classé parmi les
composés cancérigènes par l’IARC (1999). De plus, des effets cardiovasculaires et des effets
sur la respiration sont suspectés pour ce composé.
Par ailleurs, les données concernant l’écotoxicité des substances pharmaceutiques sont
limitées jusqu’à ce jour. Des études sont toutefois disponibles pour quelques composés sur un
nombre réduit d’espèces. Ainsi, des valeurs de DL 50 de la carbamazépine sont disponibles
pour différentes espèces. Selon Ferrari et al. (2003b), des DL 50 de 77,7 mg.L-1et > 13,8
mg.L-1 ont été mesurées respectivement chez Ceriodaphnia dubia et chez Daphnia magna. De
plus, Oetken et al. (2002) ont démontré la toxicité à long terme de la carbamazépine chez
Chironomus riparius selon un mode d’action dose dépendant.
Plusieurs études ont par ailleurs mentionné le potentiel de perturbateur endocrinien du
17α-éthynyloestradiol. Ainsi, Purdom et al. (1994) ont montré que des expositions à de
faibles doses induisaient la synthèse de vitellogénine chez des truites immatures. De plus,
Halbeck et al. (2004) ont montré une féminisation de Gasterosteus aculeatus suite à des
expositions au 17α-éthynyloestradiol. Par ailleurs, Jobling et al. (2004) ont montré que des
expositions à des faibles concentrations de 17α-éthynyloestradiol induisaient une
augmentation de la production d’embryons chez des mollusques (Potamopyrgus
antipodarum) alors que des expositions à fortes doses l’inhibaient. Des perturbations
endocrines ont également été notées chez des crustacés suite à des expositions à long terme au
45
17α-éthynyloestradiol (Vandenbergh et al., 2003). De même, Watts et al. (2002) ont montré
que des expositions prolongées au 17α-éthynyloestradiol pouvaient modifier le sexe ratio chez
Gammarus pulex.
Dans ces travaux de thèse, le transfert des contaminants organiques présentés dans le
paragraphe précédent, du milieu vers le compartiment biologique, et leur toxicité sur les
organismes estuariens ont été étudiés en estuaire de Seine. Pour cela, le copépode
majoritaire du mésozooplancton de l’estuaire de Seine, Eurytemora affinis, a été sélectionné
comme organisme modèle. Le paragraphe suivant décrit l’intérêt de l’utilisation des
copépodes en tant qu’espèce modèle dans des études en écotoxicologie.
III. L’utilisation des copépodes comme espèce modèle en écotoxicologie
III.1. Biologie des copépodes
- Généralités
Les copépodes représentent le groupe d’organismes le plus diversifié parmi les
crustacés. Environ 24 000 espèces de copépodes ont été décrites à ce jour et ce chiffre peut
potentiellement doubler si l’on considère les nombreuses espèces de copépodes parasites qui
n’ont pas encore été très étudiées. De plus, ils sont considérés comme le groupe d’organismes
pluricellulaires le plus abondant sur terre.
1
6
2
7
4
3
8
9
5
10
Figure 1.13 : Les différentes classes de copépodes (1 : platycopioida, 2 : calanoida, 3 :
misophrioida, 4 : gelyelloida, 5 : cyclopoida, 6 : harpacticoida, 7 : mormonilloida, 8 :
poecilostomatoida, 9 : siphonostomastoida, 10 : monstrilloida) (http://www.obs-vlfr.fr)
46
Les habitats et l’éthologie des copépodes sont variés puisqu’il existe des formes libres,
pélagiques ou benthiques, des formes symbiotiques ainsi que des formes parasites (internes ou
externes) (Figure 1.13). La taille moyenne de ces organismes, au stade adulte, est comprise
entre 1 et 2 mm. Il existe toutefois des espèces de toutes les tailles allant de 0,29 à 18 mm.
Ces organismes ont colonisé tous les écosystèmes aquatiques. Ils se sont adaptés à toutes les
salinités, des eaux douces jusqu’aux milieux hypersalins, et à toutes les températures, des
eaux polaires jusqu’aux eaux tropicales. De plus, ils présentent également une large gamme
de répartition verticale, puisqu’ils ont été détectés depuis des profondeurs de 9995-10002 m
dans la fosse des Phillipines (Wolff, 1960) jusqu’à une altitude de 5540 m dans des lacs
Himalayens (Löffler, 1968).
Ces organismes présentent une importance écologique évidente, en particulier les
calanoïdes et les cyclopoïdes qui représentent un maillon essentiel dans les réseaux trophiques
puisqu’ils sont les plus importants consommateurs primaires de phytoplancton et qu’ils
constituent la base des chaînes trophiques pélagiques, du régime alimentaire des poissons
plats et des saumons. De plus les déjections des copépodes (200/individu/jour) représentent
une source d’énergie importante pour les organismes détritivores.
- Comportement natatoire
Chez les copépodes planctoniques vivant en pleine eau, les antennules ont un rôle
essentiel dans la locomotion du fait de leur allongement et de la présence de nombreuses soies
plumeuses. La locomotion est assurée par des battements puissants des antennules d’avant en
arrière, généralement discontinus.
Chez les calanoïdes, les antennules sont segmentées en plus de 27 segments (Figure
1.14) portant chacun des récepteurs sensoriels de deux types : des soies et des aesthètes.
Prosome
Urosome
Métasome
Céphalosome
segment anal
segment génital
oeil nauplien
antennule
pattes natatoires
Figure 1.14 : Forme générale des calanoides
47
Les soies portent souvent une simple ou double rangée de poils fins leur conférant un
aspect plumeux et sont supposées être des récepteurs mécaniques. Les soies disposées sur les
segments distaux interviennent dans la portance des copépodes. Les aesthètes sont supposées
être des chémorécepteurs (Mauchline, 1998). Ces récepteurs sensoriels confèrent à
l’antennule des fonctions de détection de la nourriture, de la turbulence de l’eau et des
prédateurs. Ainsi, selon Yen et al. (1992), Lenz et Yen (1993) et Hartline et al. (1996) les
mécanorécepteurs sont capables de performances exceptionnelles aussi bien en sensibilité que
dans la fréquence de la réponse. Ils confèrent aux copépodes une vitesse de réponse très
rapide face aux stimuli environnementaux. Les antennules interviennent également dans la
reproduction, chez le mâle, par la détection chimique des phéromones émises par la femelle
(Chow-Fraser et Maly, 1988; Tsuda et Miller, 1998) lui permettant de suivre et de capturer la
femelle. Ces récepteurs sensoriels sont contrôlés par le système nerveux des copépodes et une
simple impulsion nerveuse peut induire une réaction chez l’animal. Le comportement
natatoire des copépodes dépend donc des stimuli environnementaux reçus par ses récepteurs
sensoriels.
La présence de contaminants dans le milieu peut perturber le comportement natatoire
des copépodes selon quatre principaux modes d’action :
- en masquant les signaux chimiques (phéromones) émis par les femelles et en
diminuant les probabilité de rencontre avec les mâles désorientés,
- par un comportement de fuite/d’évitement de la zone contaminée,
- par des altérations physiologiques au niveau du système nerveux, particulièrement
lors d’exposition à des neurotoxiques (inhibiteurs de cholinestérase) perturbant la
transmission de l’information et de la réponse,
- par un stress physiologique général diminuant les dépenses énergétiques allouées au
déplacement.
Les deux premiers mécanismes font partie de la réponse comportementale du
copépode face à un stress chimique alors que les deux derniers représentent des réponses
physiologiques induites par les contaminants et qui vont avoir une répercussion sur le
comportement natatoire des copépodes (Figure 1.15).
48
Signal chimique
Concentration
Structure
Production d’un
stimulus
Advection
Turbulence
Transport
physique
Réponse
comportementale
(ou
physiologique)
Figure 1.15 : Facteurs déterminants la production et la perception de signaux chimiques par
des organismes aquatiques (d’après Zimmer et Butman, 2000)
Des travaux étudiant les effets de contaminants sur le comportement natatoire des
organismes aquatiques ont ainsi été menés sur plusieurs espèces de poissons. Saglio et
Trijasse (1998) ont notamment montré que des expositions à l’atrazine et au diuron
perturbaient de manière significative le comportement natatoire et social des poissons. De
même, Kirkpatrick et al. (2006) ont mis en évidence une augmentation de l’activité natatoire
d’un crustacé (Corophium volutator) exposé à des sédiments contaminés par des pesticides.
De plus, des daphnies exposées à des doses subléthales de cuivre ainsi que des gammares
exposés à des concentrations en cadmium de 125 et 500 µg.L-1 ont montré une diminution de
la vitesse de nage (Untersteiner et al., 2003; Wallace et Estephan, 2004). D’ailleurs, plusieurs
auteurs suggèrent l’utilisation du comportement natatoire des microcrustacés en tant que
biomarqueur de la contamination aquatique (Roast et al., 2001; Faimali et al., 2006). A ce
jour, aucune n’étude n’a encore été conduite pour étudier les effets de la contamination de
l’eau sur le comportement natatoire des copépodes et notamment chez E. affinis. Toutefois, à
l’heure actuelle, des études du comportement natatoire des copépodes notamment dans les
processus de reproduction sont en plein essor.
49
III.2. Tests de toxicité aiguë (DL 50)
Au même titre que les cladocères (daphnie) les copépodes sont régulièrement utilisés
pour tester la toxicité aiguë de substances chimiques ou de matrices environnementales
contaminées. Ainsi, Forget et al. (1998), Lotufo (1998a), Hagopian-Schlekat et al. (2001) et
Christoffersen et al. (2003), ont étudié respectivement la toxicité de métaux lourds (Cd, As) et
de pesticides (atrazine, carbofuran, dichlorvos, malathion), de sédiments contaminés par des
HAP, de sédiments contaminés par des métaux lourds (Cu, Pb, Ni, Zn) et de surfactants
(alkylbenzène sulfonates), chez différentes espèces de copépodes. De plus Sánchez-Bayo
(2006) a répertorié toutes les études de toxicité aiguë des contaminants organiques réalisées
sur des crustacés et notamment sur des copépodes. Selon lui, la toxicité de dix contaminants
organiques a été testée sur le copépode Eurytemora affinis.
III.3. Tests de toxicité chronique
Les copépodes sont caractérisés par un cycle de développement très court de moins de
un mois (de la reproduction jusqu’au stade adulte). Ce sont donc des organismes intéressants
pour tester rapidement les effets des contaminants sur différents stades de développement et
sur plusieurs générations. D’ailleurs, des expériences sont couramment menées avec des
copépodes pour tester la toxicité à long terme des contaminants et des matrices contaminées.
Ainsi, Lindley et al. (1999), Lotufo (1997), Brown et al. (2003) et Wollenberger et al. (2003)
ont montré respectivement que le pentachlorophénol et le dichlorobenzène diminuaient la
viabilité des nauplii, que des sédiments contaminés par des concentrations subléthales en
HAP pouvaient diminuer la prise de nourriture et diminuer la production de nauplii, que des
expositions à des concentrations en lindane de 100 ng.L-1 augmentaient la durée du
développement et que de faibles concentrations de muscs synthétiques inhibaient le
développement des nauplii chez différentes espèces de copépodes.
Dans le paragraphe précédent les avantages de l’utilisation des copépodes comme
organisme modèle en écotoxicologie ont été présentés. De plus, ce paragraphe a permis
d’introduire l’intérêt de l’approche comportementale pour étudier les effets des contaminants
organiques sur les organismes aquatiques à l’échelle de l’individu, notamment dans les
processus de reproduction. Dans ces travaux de thèse, les effets des contaminants organiques
ont par ailleurs été analysés à différents niveaux d’organisation biologique. Le paragraphe
50
suivant décrit plusieurs biomarqueurs enzymatiques et l’intérêt de leur utilisation en
écotoxicologie.
IV. L’utilisation de biomarqueurs en écotoxicologie
IV.1. Généralités
Il est désormais convenu que l’évaluation du risque induit par la présence de
contaminants chimiques dans les écosystèmes ne peut être basée uniquement sur l’analyse
chimique de ces polluants. Pour cela, le recours à des indicateurs précoces, représentatifs des
effets biologiques des contaminants sur les organismes ou biomarqueurs, s’est beaucoup
développé ces dix dernières années. En effet, les effets à des niveaux hiérarchiques élevés
sont toujours précédés de changements précoces à des niveaux d’organisation biologique
inférieurs (Figure 1.16).
Molécule
Organite
Cellule
Tissue
Exposition à un
contaminant
Organe
Organisme
Population
Communauté
Ecosystème
Figure 1.16 : Effets des contaminants à différents niveaux d’organisation biologiques (Van
Der Oost et al., 2003, modifié de Bayne et al., 1985).
Par ailleurs, au-delà d’un certain seuil de contamination dépendant de la dose et de la
durée d’exposition aux polluants, des effets vont apparaître à des niveaux d’organisation
biologiques supérieurs (Figure 1.17).
51
Réponse
Effet néfaste
observable
Augmentation de
Perturbation de la probabilité de
la reproduction
dommage
Réduction de la
durée de vie
Effet néfaste
non
observable
Niveaux normaux Signaux précoces
d’expression des
biomarqueurs
biomarqueurs
d’exposition
Niveau d’exposition
(durée et dose)
Figure 1.17 : Hiérarchisation de la réponse biologique des organismes suit à des expositions à
des contaminants (d’après Van Der Oost et al., 2003).
Les biomarqueurs offrent donc un potentiel intéressant pour évaluer la qualité
environnementale. Les qualités d’un biomarqueur doivent être la sensibilité et la spécificité.
Toutefois, un nombre limité de biomarqueurs efficaces a été validé jusqu’à présent et la
question posée reste de savoir comment interpréter les informations fournies par ces
biomarqueurs.
Selon le NRC (1987) et WHO (1993), les biomarqueurs peuvent être subdivisés en 3
classes :
- des biomarqueurs d’exposition qui indiquent que les organismes ont été ou sont
exposés à des contaminants,
- des biomarqueurs d’effets qui indiquent de manière quantitative l’amplitude de la
réponse des organismes à des contaminants,
- des biomarqueurs de sensibilité qui indiquent la capacité innée ou induite d’un
organisme à répondre à une exposition à un contaminant spécifique incluant les
facteurs génétiques et les changements des récepteurs qui altèrent la susceptibilité
d’un organisme à cette exposition.
52
L’analyse du risque chimique sur les écosystèmes doit prendre en compte des
combinaisons variées entre les différents facteurs de stress environnementaux (Moore et al.,
2004) tels que les facteurs naturels (pH, salinité, température…) et les facteurs d’origine
anthropiques (contamination, aménagement du territoire, surpêche…) (Figure 1.18).
Stress
Densité
dépendance
Perturbation
Perte de l’habitat
Effets sur les
chaînes trophiques
Prédation
Exploitation
Espèce
Stress des
contaminants
Variabilité
environnementale
Réponses
Figure 1.18 : Les différents facteurs de stress influençant les réponses biologiques (d’après
Power et McCarty, 1997).
A cet effet, des mesures doivent être prises pour évaluer la robustesse des
biomarqueurs dans l’optique de valider leur utilisation dans des programmes d’analyse du
risque environnemental. Pour cela, Stegeman et al. (1992) ont précisé 6 critères de décision :
- les protocoles d’utilisation des biomarqueurs doivent être peu chers, facilement
utilisables et en accord avec les normes d’assurance qualité,
- la réponse du biomarqueur doit être sensible à une exposition/un effet du
contaminant,
- les niveaux de base des biomarqueurs doivent être bien définis pour pouvoir faire la
différence entre une variabilité naturelle et une variation induite par un stress,
- les impacts dus à plusieurs facteurs de stress doivent être bien établis,
- les relations entre la réponse du biomarqueur et l’exposition à un contaminant (temps
et dose) doivent être connues,
- la significativité de la relation entre la réponse biologique à long terme et l’impact
sur l’organisme doit être établie.
53
Par ailleurs, à l’heure actuelle, l’utilisation d’une batterie de biomarqueurs
significativement représentatifs d’une exposition ou d’effets sur une/des espèces(s)
sentinelle(s) appropriées est recommandée dans les programmes d’évaluation du risque
environnemental.
IV.2. L’activité acétylcholinestérase
Les cholinestérases ont été largement étudiées chez les vertébrés, ce qui a permis une
distinction entre les acétylcholinestérases (AChE) et les butylcholinestérases (BuChE) chez ce
groupe (Aldridge, 1953). Les acétylcholinestérases sont des enzymes qui hydrolysent les
esters de la choline. Les cholinestérases sont donc des estérases. Ce sont des enzymes
largement distribuées dans le règne animal avec une structure très conservée entre les
différents groupes. Elles ont été observées chez les vertébrés, chez les invertébrés terrestres et
aquatiques (Walker et Thompson, 1991).
L'acétylcholinestérase (AChE) ne joue aucun rôle dans la détoxication chez les
organismes. C’est une enzyme impliquée dans les mécanismes de transmission de l'influx
nerveux. Ainsi, au niveau de la membrane post synaptique des jonctions interneuronales et
neuromusculaires, la terminaison nerveuse libère un médiateur chimique, l'acétylcholine
(ACh), qui permet la transmission du message nerveux d'une cellule à l'autre. Une fois
l'information transmise, l'acétylcholine est rapidement inactivée par l'AChE, ce qui permet au
système de revenir à son état de repos (Figure 1.19).
De nombreuses molécules qualifiées de neurotoxiques peuvent interagir avec l’AChE
en se liant au niveau de son site actif ou non et de ce fait induire une inhibition de cette
enzyme. Cette inhibition entraîne une accumulation de l’acétylcholine dans la fente
synaptique. Cela a pour conséquence de maintenir les ionotropes ouverts (récepteurs
nicotiniques et muscariniques) ce qui entraîne une contraction musculaire permanente qui
conduit généralement à la tétanie musculaire et à la mort (Bocquené, 1996).
L’AChE est inhibée spécifiquement par les insecticides de la classe des
organophosphorés et des carbamates. Toutefois, Les formes thio (malathion, parathion…) des
organophosphates sont beaucoup moins inhibitrices des cholinestérases que les formes oxon
(paraoxon…). De plus, les inhibitions provoquées par les organophosphorés sont
généralement irréversibles alors que celle induites par les carbamates sont le plus souvent
réversibles (Bocquené et al., 1997).
54
Figure 1.19 : Cycle de synthèse et d’élimination de l’acétylcholine et rôle de
l’acétylcholinestérase (site internet "Le cerveau à tous les niveaux").
D’autres molécules telles que les triazines, les pyréthrinoïdes, les métaux lourds, ainsi
que certaines phytotoxines sont considérées comme des inhibiteurs potentiels de cette
enzyme. De ce point de vue, la mesure de l'activité AChE peut constituer un outil pouvant
fournir des informations sur la contamination des milieux aquatiques par toute une variété de
contaminants.
Des études in situ et expérimentales ont ainsi mis en évidence que l’AChE pouvait être
inhibée suite à des expositions de contaminants. Ainsi, Dellali et al. (2001), Forget et al.
(2003) et Schiedek et al. (2005) ont mis en évidence une inhibition de l’activité AChE chez
des moules, des copépodes, et chez des anguilles en relation avec la présence de contaminants
organiques dans le milieu (HAP, PCB, pesticides). Par ailleurs, Callaghan et al. (2002) ont
démontré expérimentalement que l’activité AChE de chironomes était inhibée de manière
dose dépendante par des pesticides organophosphorés. De plus, Kang et Fang (1997) ont mis
55
en évidence une inhibition in vitro de l’activité AChE purifiée d’anguille. En outre, un effet
additif du chlorpyrifos et de HAP sur l’inhibition in vitro de l’activité AChE purifiée
d’anguilles a été mentionné par Jett et al. (1999). De même, Nunes et al. (2006) ont montré
que des expositions à des substances pharmaceutiques telles que le diazepam inhibaient
l’expression de l’AChE chez un crustacé, Artemia parthenogenetica.
IV.3. L’activité glutathion-S-transférase
Le glutathion est un tripeptide (glutamate, cystéine, glycine) présent en concentration
assez élevée (1 ×10-10 mM) dans les cellules des animaux, des plantes et des champignons.
Grâce à la fonction thiol de la cystéine, le glutathion joue un rôle important dans le maintien
de l'état réduit de la cellule. Cette fonction thiol peut aussi interagir avec des molécules
électrophiles et intervient donc dans les mécanismes de détoxication des cellules vis-à-vis de
nombreux contaminants (Figure 1.20).
γ-Glutamylcystéine
synthétase (GSH I)
Glutathion synthétase
(GSH II)
Glutathion péroxydase
Glutathion S-transférase
(GST)
Glutathion réductase
Détoxification de
Lutte contre les stress
nombreux contaminants
oxydants
Figure 1.20 : Métabolisme du glutathion
56
Plusieurs enzymes sont impliquées dans le métabolisme du glutathion, notamment la
glutathion-S-transférase, et sont régulées selon les besoins de la cellule. Les glutathion-Stransférases (GST) représentent une famille d'enzymes multifonctionnelles essentiellement
cytosoliques, impliquées dans des opérations diverses de transport et de biosynthèse
intracellulaires (George, 1990).
Toutefois, la fonction des GST la plus étudiée, concernant les programmes de suivi
environnementaux, demeure leur activité de catalyse des réactions de conjugaison entre des
groupements hydrophiles endogènes (glutathion), et des molécules réactives comportant des
sites électrophiles, capables de réagir avec des macromolécules comme les acides nucléiques
(ARN, ADN). A ce titre, les GST font partie des mécanismes de défense des cellules contre
des stress chimiques et sont qualifiées d’enzymes de phase II parce qu’elles interviennent
généralement à la suite des enzymes de phase I (cytochrome P450) qui oxydent les
xénobiotiques les rendant parfois plus actif biologiquement (ex HAP). La catalyse de la
conjugaison du glutathion avec certains substrats représente une étape dans la formation de
composés qui seront moins toxiques et plus hydrosolubles que les molécules de départ
(Chatterjee et Bhattacharya, 1984) et qui peuvent être éliminés dans les urines ou la bile.
Cependant, ces mécanismes aboutissent aussi à la formation de produits génotoxiques
absorbables par les cellules cibles.
Une grande variété de composés chimiques induit les GST, parmi lesquels certains
inducteurs des cytochromes P450 tels que les HAP et les PCB. Dans l'état actuel de nos
connaissances sur les poissons et les invertébrés aquatiques, toutes les isoenzymes de la
famille des GST n'ont pas encore été individualisées (comme c'est le cas pour les cytochromes
P450) et leur activité spécifique demeure mal connue. Leur utilisation comme biomarqueur de
pollution caractéristique d'un type de polluant dans l'environnement reste encore à définir et
se rapproche encore aujourd'hui plus de celle d'un marqueur non-spécifique, témoin de l'état
de santé global des organismes qui peuplent les écosystèmes marins.
Des études in situ et expérimentales ont ainsi mis en évidence que les GST pouvaient
être induites par différentes classes de contaminants. Ainsi, Damiens et al. (2004) ont montré
que des expositions au malathion et au carbofuran induisaient l’expression de la GST chez des
larves d’huîtres. Selon Gowland et al. (2002) et Rocher et al. (2006), l’expression de la GST
respectivement dans l’hépatopancréas et dans les branchies de mollusques bivalves est
proportionnelle à la concentration en HAP dans les tissus. De plus, des expositions à
57
différentes doses de HAP induisent une augmentation de la GST chez une espèce de poisson,
Oreochromis mossambicus (Shailaja et D’Silva, 2003). A contrario, des études ont démontré
que des expositions au benzo[k]fluoranthène à des concentrations de 10 µg.L-1 pouvaient
inhiber l’expression de la GST chez Chlamys farreri (Pan et al., 2005). Enfin, Pérez-López et
al. (2002a et b) ont mis en évidence une augmentation dose dépendante de la GST suite à des
injections d’un mélange de PCB chez la truite arc-en-ciel et chez l’anguille.
Par ailleurs, des expérimentations ont également montré que le 17β-oestradiol pouvait
inhiber l’activité GST chez Dicentrarchus labrax (Vaccaro et al., 2005). De même, Wang et
al. (2005) ont démontré que des expositions à des mélanges de tributyle étain et de
benzo[a]pyrène à fortes doses inhibaient l’activité GST.
Les activités enzymatiques
présentées dans le paragraphe précédent sont des
biomarqueurs classiquement utilisés dans les programmes de biomonitoring des milieux
aquatiques. Cependant, la plupart des biomarqueurs utilisés à l’heure actuelle sont parfois
difficiles à interpréter par manque de sensibilité ou de spécificité et présentent de ce fait une
efficacité limitée. L’identification de nouveaux biomarqueurs est donc indispensable pour
pouvoir établir de façon fiable l’état physiologique des organismes aquatiques dans un milieu
contaminé. Les techniques de protéomique présentées dans le paragraphe suivant sont à cet
effet très prometteuses car elle permettent à la fois d’observer l’état physiologique général
d’un organisme soumis à un stress chimique mais également d’identifier des protéines
spécifiquement touchées par ce stress.
V. Etude protéomique et recherche de nouveaux biomarqueurs
V.1. Définitions et généralités
Le protéome se définit comme l’ensemble des protéines codées par un génome. La
protéomique permet d’identifier et de quantifier les protéines exprimées par une cellule à un
moment donné, à divers états de développement, dans des contextes physiologiques et
pathologiques variés. La protéomique est un domaine qui permet de mettre en relation la
séquence du génome et le comportement cellulaire. Son but est l'étude des produits protéiques
exprimés dynamiquement à partir du génome et leurs interactions à un moment donné ou sous
certaines conditions environnementales. La différence fondamentale entre le protéome et le
génome est que chaque organisme possède un génome unique invariant alors que le protéome
58
varie en fonction des conditions de la cellule ou de l’organisme. De plus, se sont les protéines
qui sont responsables du phénotype des organismes.
L’étude du protéome est utile pour comprendre les mécanismes cellulaires puisque les
protéines interviennent dans les principales fonctions cellulaires qui conduisent à la
croissance, la différenciation, la prolifération et la mort cellulaire. Ainsi, des aberrations des
structures protéiques ou des niveaux d’expression sont dans la plupart des cas des signaux
indiquant des pathologies ou des dérèglements cellulaires.
L’étude du protéome regroupe deux aires de recherche distinctes : l’expression des
protéines et le fonctionnement des protéines. L’étude de l’expression des protéines permet
d’établir des cartes d’expression protéique correspondant à des conditions cellulaires variables
alors que l’étude du fonctionnement des protéines permet de définir le rôle d’une protéine
précise et ses interactions avec les autres protéines.
La quantification précise des protéines est indispensable lorsqu’on cherche à suivre la
dynamique des protéomes en fonction de critères physiologiques ou génétiques
(différenciation, réponse à des variations environnementales, étude de mutants, etc…). Cette
quantification permet d’entreprendre des études comparatives de protéomes, études qui
constituent un moyen puissant pour analyser, au niveau moléculaire, la réponse dynamique à
un stress. Elle permet notamment d’analyser les cascades d’évènements physiologiques et
métaboliques mises en place par l’organisme pour lutter contre le stress chimique. De plus, la
protéomique permet de percevoir la réponse globale d’un organisme induite par la toxicité
d’un/plusieurs contaminant(s), mais également de distinguer les réponses spécifiques des
réponses génériques.
Le développement rapide de la protéomique a été favorisé par trois avancées
technologiques majeures :
- l’amélioration des techniques de séparation des protéines par gels bidimensionnels,
notamment par le développement de gels à gradient de pH qui a permis d’optimiser la
reproductibilité des électrophorèses,
- le développement et la démocratisation des techniques analytiques en spectrométrie
de masse,
59
- l’amélioration des algorithmes de recherche permettant de comparer les séquences
d’acides aminés dans les banques de données et l’accroissement des programmes de
séquençage des génomes.
La protéomique constitue par ailleurs un outil puissant de génomique fonctionnelle.
Ainsi, l’identification de nouvelles protéines grâce à l’outil protéomique représente un moyen
d’identifier de nouveaux gènes, en particulier pour les organismes dont le génome n’a pas
encore été séquencé.
V.2. L’utilisation de l’outil protéomique
Les techniques de protéomique se sont d’abord développées dans le domaine médical.
Ainsi, la protéomique à visée clinique peut être définie comme un ensemble d’activités du
domaine médical ayant pour but d’accélérer la découverte de marqueurs protéiques permettant
de diagnostiquer in vitro des maladies ainsi que de trouver de nouvelles applications pour les
médicaments. Ces techniques sont notamment utilisées en cancérologie pour définir des
profils protéiques caractéristiques ou pour découvrir des biomarqueurs précoces de ces
pathologies (Celis et al., 2004; Chen et al., 2005; Labaer, 2005; Xiao et al., 2005) ce qui
permettrait d’intervenir au plus tôt pour accroître les chances de survie des patients. La
protéomique est également utilisée pour d’autres types de pathologies (Vlahou et
Fountoulakis, 2005) telles que la maladie d’Alzheimer (Ho et al., 2005) ou dans la maladie de
Parkinson (Jin et al., 2006) par exemple.
De plus, de part son potentiel élevé, la protéomique suggère de nouveaux horizons de
recherche dans de nombreux domaines des sciences de la vie et notamment en écotoxicologie
(Moore, 2002, Dowling et Sheehan, 2006). Ainsi, récemment, l’approche protéomique a été
utilisée sur des organismes aquatiques afin de déterminer les effets de stress
environnementaux chez différentes espèces. Kimmel et Bradley (2001) ont ainsi pu observer
les effets des variations de température et de salinité sur le protéome du copépode Eurytemora
affinis. Ces techniques ont également été utilisées en aquaculture pour identifier des protéines
caractéristiques d’infections virales chez des poissons (Einer et al., 1998, Booy et al., 2005)
dans le but de limiter les facteurs permettant le développement d’épidémies. Dernièrement,
l’utilisation de la protéomique dans l’analyse du risque chimique environnemental a
également été suggérée par plusieurs études. Shepard et al. (2000) ont pu déterminer des
signatures d’expression protéique caractéristiques chez des moules suite à des expositions aux
PCB et au cuivre. De même, Apraiz et al. (2006) ont ainsi pu observer les effets de différents
60
contaminants (bisphénol A, phtalates, PBDE) sur les signatures protéiques de moules après
exposition. Enfin, Sylvestre et al. (2006) ont pu mettre en évidence, chez des crabes, une
surexpression de différentes protéines et notamment de la glutathion-S-transférase suite à des
expositions au cadmium.
Les travaux présentés dans les chapitres suivants s’intègrent dans une approche
pluridisciplinaire intégrée visant à déterminer l’impact de la contamination organique sur la
biocénose de l’estuaire de Seine. Cette étude a pour principal objectif de déterminer si les
fortes densités du copépode Eurytemora affinis observées en estuaire de Seine peuvent avoir
un lien quelconque avec la forte contamination de cet estuaire. Le second objectif est de
proposer de nouveaux biomarqueurs d’exposition à un stress chimique chez une espèce
estuarienne typique, le modèle animal Eurytemora affinis.
61
62
Chapitre II: Matériels et méthodes
Chapitre 2
Matériels et méthodes
Ce chapitre est dédié à la présentation de l’ensemble des techniques employées au
cours de cette étude. Les sites et les campagnes de prélèvements sont détaillés ainsi que les
expériences réalisées en laboratoire et le matériel utilisé.
63
64
I. La zone de l’étude et l’échantillonnage
I.1. L’estuaire de Seine
La Seine, longue de 776 Km, draine un bassin versant de 78 650 Km2 soit 14 % de la
superficie nationale abritant 16 millions d’habitants, soit 26 % de la population française
(dont 80 % en zone urbaine) et 40 % de l’activité économique industrielle et agricole
française, et débouche dans la Manche au niveau de l’un des trois plus grands estuaires
français (50 Km2). Selon l’Ifremer, un estuaire est "la partie terminale d’un fleuve, de forme
évasée et où la mer remonte. C’est une zone de mélange entre eaux douces et eaux marines.
Ce mélange induit un gradient très important des propriétés physico-chimiques des eaux,
variable dans l’espace et dans le temps" (http://www.ifremer.fr/francais/index.php). Pour
Fairbridge (1980), la définition d’un estuaire peut se résumer à une zonation de celui-ci en
plusieurs secteurs en fonction de l’influence de la marée :
-
un bas estuaire ou estuaire marin
-
un estuaire moyen, zone de mélange entre les eaux fluviales et les eaux marines
(sous influence de la marée saline)
-
un haut estuaire ou estuaire fluvial (sous l’influence de la marée dynamique).
L’estuaire de Seine est de type macrotidal (amplitude maximale de marée proche de 8
mètres) présentant une marée semi diurne. Le débit mesuré au barrage de Poses fluctue de 81
m3.s-1 en période d’étiage à 2000 m3.s-1 en période de crue (débit moyen de 410 m3.s-1).
L’importance des phénomènes de marée et le débit du fleuve conditionnent l’intrusion saline
et le mélange des masses d’eau. Ainsi, l’estuaire de Seine est qualifié d’estuaire partiellement
mélangé pouvant être délimité en trois secteurs similaires à ceux définis par Fairbridge (1980)
: le bas estuaire (de la baie de Seine à Honfleur); l’estuaire moyen (de Honfleur à Vieux-Port)
et le haut estuaire (de Vieux-Port à Poses). Par ailleurs, l’influence de la marée induit la
formation d’un gradient de salinité pouvant conditionner la répartition des organismes qui le
peuplent. Ainsi, certains auteurs ont montré une répartition des espèces zooplanctoniques,
dans l’estuaire, en fonction de la salinité (Collins et Williams, 1981; Laprise et Dodson,
1994). De fait, selon Mouny et Dauvin (2002), l’estuaire de Seine peut être divisé en trois
zones délimitées par le gradient de salinité : la zone polyhaline (salinité de surface supérieure
à 18 ‰), la zone mésohaline (5 ‰ < salinité de surface < 18 ‰) et la zone oligohaline
65
(salinité de surface < 5 ‰) (Figure 2.1.). Dans les estuaires, la répartition des espèces dépend
également d’autres facteurs abiotiques. Cependant, les mêmes auteurs précisent que la charge
particulaire de la colonne d’eau, bien qu’étant un facteur important pour la distribution des
organismes, joue en estuaire de Seine un rôle moins important que la salinité.
Le flux particulaire annuel moyen relevé en estuaire de Seine est de 650 000 t. De
plus, cet estuaire est caractérisé par une zone maximale de turbidité appelée "bouchon
vaseux" (plusieurs g.L-1) se déplaçant d’amont en aval (au niveau de l’estuaire moyen) en
fonction du débit du fleuve et de la période de la marée (Avoine, 1981; Dupont et al., 1996;
Brenon, 1997).
0°
0°30 E
L
a
Caudebec
PK 310
Tancarville
Le Havre
M
a
n
c
h
e
Zone
d’étude
49°30 ’N
1
2
PK 340
Honfleur
PK 355
Pont de Normandie
point kilometrique
sites industriels
0
5
10
zone euryhaline
limite de la marée saline
site de prélèvement
15 km
zone mesohaline
1° E
zone oligohaline
Figure 2.1 : Carte de la zone d’étude et des sites de prélèvement
Par ailleurs, de part sa position géographique et grâce à ses caractéristiques physiques,
l’estuaire de Seine est une zone présentant de multiples intérêts :
-
Pour son rôle dans l’épuration, le stockage, la transformation et la régulation des
apports amont (contaminants chimiques et microbiologiques)
-
c’est une zone de nourricerie ou de frayère où 60 % des poissons à intérêt
commercial passent une partie ou la totalité de leur vie
-
Pour son intérêt ornithologique (zone Natura 2000), en particulier la zone
intertidale (couloir de migration)
-
Pour son rôle économique (voie de navigation importante, à l'origine de
l'accélération du comblement estuarien et de l’expulsion du système vers la mer).
66
Pourtant, l’équilibre instable de cet écosystème est menacé en permanence par des
perturbations variées principalement d’origine anthropique (contaminations chimiques
industrielles
et
urbaines,
contaminations
agricoles,
contaminations
bactériennes,
aménagements des rives…).
L’estuaire de Seine est donc un écosystème présentant un intérêt écologique majeur
confronté aux réalités économiques d’une région très industrialisée et très peuplée.
I.2. Les campagnes de prélèvements
- Préparation du matériel
Avant chaque campagne de prélèvement, le matériel de prélèvement est préparé pour
satisfaire les critères propres à l’analyse de contaminants organiques à l’état de trace voir
d’ultra-trace. Ainsi, des bouteilles en verre ambré de 4 L sont nettoyées à l’aide de détergent,
subissent une attaque acide, puis sont neutralisées par des bases et rincées à l’eau ultra pure.
Ensuite, ces bouteilles sont calcinées à 450 °C pendant la nuit, puis fermées par du papier
aluminium recouvert par un bouchon téflonné. De plus, de petites barquettes en aluminium
destinées au stockage des copépodes sont également calcinées à 450 °C pendant la nuit.
- Etude in situ des variations saisonnières de la biodisponibilité et de la toxicité des
contaminants organiques
Tous les prélèvements réalisés au cours du suivi in situ ont été effectués dans la zone
oligo-haline de l’estuaire de Seine, au niveau du pk 337 à Tancarville (Figure 2.1.). Ces
prélèvements ont été réalisés depuis les pontons du port de Tancarville mais également à bord
du Zodiac du programme Seine-Aval avec le soutien technique du personnel de la Cellule du
Suivi du Littoral Haut-Normand. Les détails de ces différentes missions (dates, paramètres
physico-chimiques) sont présentés dans le Tableau 2.1.
Au cours de ces campagnes, des échantillons d’eau de surface ont été collectés (5
bouteilles de 4 L par mission) pour l’analyse de la contamination organique dans la phase
dissoute et la phase particulaire. Des échantillons de plancton ont également été prélevés par
plusieurs traits horizontaux (sub-surface) de filets WP2 (maille 200 µm) d’une durée de 5
minutes contre le courant juste après l’étale de haute mer, pendant le jusant. Les échantillons
de plancton ont ensuite été ramenés au laboratoire pour y être triés.
67
Des analyses de contaminants organiques (PCB, HAP et alkylphénols) ont été
réalisées sur ces échantillons de copépodes.
Tableau 2.1 : Paramètres physico-chimiques mesurés au cours du suivi in situ (Tancarville)
Missions
1
Dates
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
26/11/02 28/01/03 01/04/03 22/04/03 20/05/03 01/07/03 08/09/03 06/10/03 04/11/03 19/01/04 20/04/04 16/05/04 16/09/04 30/12/04 06/02/05
Débit (m3.s -1)
580
977
403
305
501
206
110
104
210
1199
339
508
251
559
477
Salinité (PSU)
1.5
0.1
0.2
1.4
0.2
0.6
1.9
2.2
6.5
0.7
4.3
1.3
2.2
1.2
2.0
Température (°C)
9.6
7.3
12.5
13.8
16.4
22.8
17.0
10.6
6.5
6.7
10.9
15.9
17.7
7.4
6.4
0.581
0.026
0.083
0.066
0.135
0.034
0.051
0.115
0.075
0.048
0.101
0.206
-
-
-
Turbidité
(mg.l-1 )
De plus, lors de chaque mission, quand la quantité de copépodes collectés était
suffisamment importante, une aliquote a été fixée dans du formol (Formaldéhyde 10 %,
Sigma) pour déterminer la composition de l’échantillon (stades de développement, sex-ratio,
biodiversité).
- Variations de la biodisponibilité et de la toxicité des contaminants organiques au cours d’un
cycle de marée
Dans le cadre de l’étude de l’influence d’un cycle de marée sur la biodisponibilité et la
toxicité des contaminants organiques, une campagne de prélèvements a été réalisée à bord du
navire scientifique "le Côte d’Aquitaine" au niveau de Honfleur (pk 364,75), dans la zone
mésohaline de l’estuaire, au cours de la mission en point fixe SAZOOTOX. Lors de cette
campagne, des échantillons d’eau ont été collectés en surface et au niveau du fond (à l’aide
d’une bouteille Niskin de 8 L) pour l’analyse de la contamination organique dans la phase
dissoute et la phase particulaire. Des échantillons de plancton ont également été prélevés par
plusieurs traits horizontaux (sub-surface) et obliques (fond) de filets WP2 d’une durée de 5
minutes contre le courant. Les échantillons de plancton ont été directement triés à bord puis
congelés dans de la carboglace. Des dosages d’activités enzymatiques (AChE et GST) ainsi
que des dosages de contaminants organiques (PCB et HAP) ont été effectués sur ces
échantillons de copépodes. Les détails de la mission sont présentés dans le Tableau 2.2.
68
Tableau 2.2. : Paramètres physico chimiques mesurés lors du cycle de marée réalisé au niveau
du pont de Normandie (Fcop : fraction de carbone organique particulaire, COD : carbone
organique dissous)
Profondeur Salinité
(m)
(PSU)
Temps
(heures)
10:15
Surface
Fond
12:15
Surface
Fond
14:15
Surface
Fond
7.56
18:05
Surface
Fond
5.54
10.79
9.55
T (°C)
Vitesse du
courant (cm.s-1)
Turbidité
(mg.l-1)
Fcop
(%)
COD
(mg.l-1)
15.27
14.35
40
99
3.361
2.20
22.02
13.41
30
75
2.335
2.30
12.13
14.83
25
48
3.989
3.05
22.88
13.28
35
56
3.539
4.70
2.79
16.03
80
52
3.286
3.40
18.06
13.81
100
444
3.377
2.95
0.43
15.52
34
154
3.405
3.65
0.48
15.49
80
398
2.706
3.40
I.3. Préparation des échantillons
Les prélèvements d’eau sont ramenés au laboratoire puis sont filtrés sur des unités de
filtration entièrement en verre surmontées de filtres en fibre de verre GFF d’une porosité de
0,7 µm (Whatman). Les filtres en fibre de verre et les unités de filtration sont préalablement
calcinés pendant une nuit à 450°C. Après la pyrolyse, les filtres sont pesés, référencés et
recouverts de papier aluminium jusqu’à leur utilisation. Avant filtration, les échantillons
d’eau sont homogénéisés afin de remettre en suspension les particules et d’obtenir ainsi une
concentration homogène en particules. Lors de la filtration, le volume d’eau passé sur chaque
filtre utilisé est mesuré pour pouvoir ensuite évaluer la charge particulaire de l’échantillon
d’eau. Les filtres sont ensuite placés dans des barquettes en aluminium, recouverts de papier
aluminium et congelés à -20°C.
De même, les copépodes sont ramenés et triés au laboratoire (cf. paragraphe II.2.) puis
sont concentrés par filtration sur des filtres à café en plastique. Une partie de ces échantillons
est alors transférée dans des barquettes en aluminium préalablement calcinées, recouvertes de
papier aluminium et congelées à - 20°C. Le reste de l’échantillon est transféré dans plusieurs
tubes Eppendorf et immédiatement congelé à – 80°C. Les copépodes congelés à -20°C et à 80°C sont respectivement utilisés pour la mesure des contaminants organiques bioaccumulés
et pour la mesure des activités enzymatiques et l’expression du protéome.
69
Les échantillons de particules et les copépodes destinés à la mesure des contaminants
organiques ont tous été lyophilisés avant analyse (lyophilisateur C.I.R.P. RP2V, Serail, Paris).
Cette étape facilite la conservation des échantillons à l’obscurité et à température ambiante et
permet de déterminer le poids sec exact des échantillons lors de l’analyse. Après
lyophilisation, les copépodes sont réduits à l’état de poudre à l’aide d’un pilon afin
d’homogénéiser au mieux le pool d’organismes mais également pour casser la cuticule
recouvrant entièrement le corps de cet animal.
II. L’organisme modèle : Eurytemora affinis
II.1. E. affinis en estuaire de Seine
II.1.a. Classification phylogénétique (Huys et Boxshall, 1991)
Les techniques de biologie moléculaire ont permis de faire évoluer la classification
actuelle qui distingue le groupe des pancrustacés qui réunit les insectes et les malacostracés.
II.1.b. Distribution
Eurytemora affinis est un copépode euryhalin (pouvant être localisé dans les eaux
marines, douces et saumâtres) dont la présence a été reportée dans les estuaires européens
(Roddie et al., 1984; Peitsch et al., 2000; Mouny et Dauvin, 2002), nord américains (Laprise
et Dodson, 1994; Morgan et al., 1997) ainsi que dans des systèmes lacustres asiatiques (Ban
et al., 1989). Ce copépode est une espèce libre en suspension dans la colonne d’eau présentant
70
des migrations journalières vers les eaux de surface ou vers le fond (Hough et Naylor, 1992;
Morgan et al., 1997). En Seine, ce copépode domine la communauté mésozooplanctonique de
l’estuaire toute l’année (entre 52 et 99,9 % dans la zone mésohaline et entre 73 et 99,9 % dans
la zone oligohaline) avec un maximum d’abondance à la fin de l’hiver et au début du
printemps (190 000 individus par m3) supérieur à ceux observés dans les autres estuaires
européens pour la même espèce (Mouny et Dauvin, 2002).
II.1.c. Régime alimentaire
En estuaire de Seine comme dans beaucoup d’estuaires européens, le régime
alimentaire de cette espèce est de type omnivore opportuniste (Heinle et Flemer, 1975;
Gasparini, 1997; David et al., 2006) (bactéries, phytoplancton, débris organiques) dépendant
principalement de la concentration des proies présentes dans le milieu et de leur dimension
(Bonnet et al., 2004). Les maxillipèdes créent des courants d’eau circulaires de l’avant vers
l’arrière et dès que du phytoplancton ou tout autre élément nutritif de son régime alimentaire
est détecté, la cavité buccale est ouverte.
II.1.d. Reproduction
Ce copépode présente une reproduction sexuée obligatoire (oviparité) toute l’année
avec accouplement entre mâles et femelles (Figure 2.2.c).
a.
b.
1
♀
c.
3
270 µm
♂
2
K. Cailleaud
K. Cailleaud
D. Devreker
Figure 2.2. : Photographies de copépodes prises à la loupe binoculaire (Leica); (a) Femelle
ovigère, (b) Mâle et (c) Accouplement. (1: antennule droite modifiée; 2:
spermatophore; 3: enroulement de l’antennule droite d’un mâle autour de l’antennule
de la femelle lors de l’accouplement)
71
Les mâles capturent et immobilisent les femelles en agrippant une antennule de cellesci grâce à leur antennule droite (en vue dorsale) différenciée en un organe préhensible munie
d’une articulation géniculée (Figure 2.2.b) puis fixent un ou plusieurs spermatophores
(réceptacle séminal) au niveau du "segment" génital des femelles par l’intermédiaire de la
cinquième patte thoracique modifiée en forme de pince.
Une femelle peut porter plusieurs spermatophores (Figure 2.2.c) et peut être de ce fait
fécondée plusieurs fois successivement sans nouvel accouplement. Une fois fécondée, les
femelles portent un sac ovigère unique.
II.1.e. Cycle de développement
Quelques heures après la fécondation, un sac ovigère est formé contenant des œufs (de
20 à 60). Après quelques jours, les œufs éclosent et le sac ovigère est ouvert.
Le cycle de développement de ce copépode comprend 3 phases successives présentant
des métamorphoses : la phase nauplienne (6 stades et 5 mues), la phase copépodite (5 stades
et 5 mues) avant d’atteindre la maturité sexuelle et le stade adulte (arrêt des mues) caractérisés
par un dimorphisme sexuel (Figure 2.3.) (Katona, 1970a, b).
Figure 2.3. : Stades de développement du copépode Eurytemora affinis adapté de Katona
(1970a, b) par Souissi. N : stade nauplien, C : stade copépodite.
D’une manière générale, la durée totale du cycle de développement du copépode E.
affinis est dépendant de la température de l’eau. Toutefois, en conditions optimales celle-ci
varie entre 18 et 20 jours (Devreker, données non publiées).
72
Au stade adulte, les femelles, comme chez la plupart des calanoïdes, présentent des
caractéristiques biométriques différentes de celles des mâles (taille : 920-1100 µm et 800-960
µm et poids sec; 12,8 µg et 8,0 µg respectivement chez les femelles et les mâles) (Mouny,
1998).
II.2. Technique de tri
Le choix d’une espèce de petite taille comme le copépode E. affinis (200< t <1000
µm) en tant qu’organisme modèle pour notre étude a nécessité quelques adaptations et
développement quand à la préparation des échantillons à analyser. Pour commencer la mesure
d’activités enzymatiques comme le dosage des contaminants organiques bioaccumulés par ce
copépode ont du être effectués à partir de pools d’individus (au moins 200 individus pour les
dosages biochimiques, au moins 1500 individus par classe de contaminants pour l’analyse
chimique). De plus, la préparation des échantillons de copépodes, utilisés pour le dosage des
contaminants bioaccumulés, a demandé une attention particulière. En effet, en raison du faible
maillage du filet utilisé lors des prélèvements, différentes espèces planctoniques ainsi que des
particules et des résidus végétaux ont été échantillonnés simultanément. Pour maintenir des
conditions identiques d’une saison à l’autre mais également pour s’assurer que la mesure des
contaminants est bien effectuée sur des échantillons d’Eurytemora affinis, une technique
fiable de tri a été mise au point.
Figure 2.4. : Etapes successives du tri des échantillons de plancton (E. affinis)
Pour cela, lors des prélèvements, les échantillons obtenus sont filtrés sur une série de
tamis de mailles décroissantes (1000, 500 et 250 µm) pour éliminer les prédateurs de
copépodes de tailles supérieures (Mysidacés, Gammares et alevins de poissons).
73
Puis les échantillons sont ramenés au laboratoire dans des conteneurs isothermes. Le
produit de la pêche est alors transvasé dans des béchers de 5 L et laissé quelques minutes au
repos pour que les particules sédimentent. Les débris végétaux flottant à la surface de l’eau
sont retirés à l’aide d’une pipette Pasteur, puis le milieu est éclairé par une lumière artificielle
pour attirer les copépodes par photo-attraction. Après quelques minutes, deux phases
distinctes apparaissent dans le bécher : le fond du bécher constitué des particules qui ont
sédimenté, et le surnageant contenant les copépodes, comme indiqué sur la Figure 2.4. Le
surnageant est alors filtré puis remis en suspension dans une eau minérale riche en sels
minéraux (Volvic) ajustée à la salinité du site de prélèvement par du sel de mer artificiel (Sera
PREMIUM, Heinsberg, France). Cette séquence, dilution/sédimentation/photo-attraction est
répétée plusieurs fois jusqu’à obtenir une eau limpide ne contenant plus que le copépode E.
affinis. Une aliquote de cette fraction est observée à la loupe binoculaire pour confirmer sa
composition et l’absence de particule (Figure 2.5.) puis les copépodes sont filtrés,
conditionnés et conservés soit au congélateur à -20°C soit à -80°C (échantillons dédiés à
l’analyse du protéome) jusqu’à leur analyse.
Figure 2.5. : Composition des échantillons de copépodes avant et après le tri au laboratoire
III. Expériences au laboratoire
III.1. Exposition des copépodes à des variations de température et de salinité
Les copépodes ont été prélevés au niveau du pont de Tancarville en Avril 2005. Une
fois triés (cf. II.2.), les copépodes sont transvasés dans un mélange composé de 300 mL d’eau
de l’estuaire et de 1500 mL d’eau minérale (Volvic) à une salinité ajustée à celle du site de
74
prélèvement (5 PSU) (Sera PREMIUM salt, Heinsberg, France). Puis les copépodes ont été
placés dans une enceinte climatisée à 11°C (LMS Cooled Incubator, Bioblock Scientific,
Illkirch, France) pour une période d’acclimatation aux conditions du laboratoire d’une
journée. Les copépodes ont été nourris une fois pendant la période d’acclimatation puis ont
été soumis à un jeûne pendant les expériences. Trois séries d’expériences ont ensuite été
menées sur ces copépodes.
La première consiste à évaluer les effets des variations de salinité observées au cours
d’un cycle de marée sur deux biomarqueurs enzymatiques classiques, l’AChE et la GST. Pour
cela, six béchers remplis de 300 mL d’eau de l’estuaire et de 1500 mL d’eau minérale et
ajustés à six salinités différentes (0, 5, 10, 15, 20, 25 PSU) ont été préparés et placés dans
l’enceinte à 11°C. Après une journée d’acclimatation, les copépodes sont transférés dans le
premier bécher à la salinité de 0 PSU pour une durée d’une heure. Puis, les copépodes sont
filtrés, transférés dans le second bécher et exposés à une salinité de 5 PSU pendant une heure
et ainsi de suite jusqu’à 25 PSU. Après chaque exposition d’une heure, un pool de copépodes
est prélevé pour doser les activités enzymatiques AChE et GST.
La seconde série d’expériences consiste à tester les effets d’expositions prolongées des
copépodes à différentes salinités, sur l’expression des activités AChE et GST. Pour cela les
copépodes ont été conditionnés et acclimatés au laboratoire comme pour la première
expérience, puis répartis de façon homogène dans 6 béchers, contenant 300 mL d’eau de
l’estuaire et 1500 mL d’eau minérale à six salinités différentes (0, 5, 10, 15, 20, 25 PSU). Les
copépodes sont exposés à ces différentes salinités pendant 72 heures à 11°C. Des copépodes
ont été échantillonnés dans chaque milieu après 1, 2, 4, 18 et 72 heures d’exposition pour
mesurer les activités AChE et GST.
Enfin, la troisième série d’expérience vise à évaluer les effets d’expositions prolongées
des copépodes à différentes températures, sur les activités enzymatiques AChE et GST. Pour
cela les copépodes ont été conditionnés et acclimatés au laboratoire comme pour la première
expérience, répartis de façon homogène dans 4 béchers, contenant 300 mL d’eau de l’estuaire
et 1500 mL d’eau minérale, ajustés à la salinité de 15 PSU et préalablement conditionnés à 4
températures différentes (4, 11, 18 et 25°C). Les copépodes sont exposés à ces différentes
températures pendant 18 heures. Des copépodes ont été échantillonnés dans chaque milieu
après 1, 2, 4 et 18 heures d’exposition pour mesurer les activités AChE et GST.
75
III.2. Exposition des copépodes à des contaminants organiques en flux continu
- Prélèvement/acclimatation des copépodes
Ces expériences d’exposition ont été effectuées sur des copépodes prélevés en estuaire
de Seine au niveau du pont de Tancarville (Figure 2.1.), pendant les périodes de plus forte
abondance caractérisées par des stades de développement avancés des copépodes. Le choix de
la période de prélèvement a été établi en fonction des résultats obtenus au cours du suivi insitu (d’une durée de deux ans) ayant précédé les expériences d’exposition. En effet, ce suivi a
permis de mettre en évidence que la structure de la population d’E. affinis était corrélée à la
température (avec un pourcentage d’adultes plus élevé en période de faible température). De
même, les plus fortes concentrations en contaminants bioaccumulés par cette espèce ont été
mesurées pour des températures nettement inférieures à 10°C (entre 6 et 7°C). Pour ces
raisons, les copépodes ont été prélevés au cours de plusieurs campagnes, entre Novembre et
Décembre 2004 (température entre 12 et 10°C), depuis un bateau de pêche professionnelle.
Les copépodes ont été triés à bord du bateau (cf. paragraphe II.2.), transférés dans des
conteneurs isothermes puis transportés à la station marine de Wimereux où ils ont été placés
dans un canal hydrodynamique de 300 L à une salinité de 15 PSU, dans une pièce climatisée à
10°C, pour une période de décontamination/adaptation de 3 jours et demi. Pendant cette
période, les copépodes ont été nourris 2 fois par jour avec un mélange d’algues en culture à la
station marine de Wimereux (Rhodomonas marina, Isochrysis galbana).
- Choix des contaminants organiques
Les contaminants ont été sélectionnés en fonction des résultats obtenus au cours de
l’étude du suivi in situ (antérieure aux expositions) de plus d’un an des contaminants dans la
colonne d’eau de l’estuaire de Seine et chez E. affinis. Ces contaminants et leurs
concentrations sont donc tous représentatifs de la contamination de la colonne d’eau de
l’estuaire de Seine (phase dissoute et phase particulaire) en polluants organiques. Ainsi, 6
classes de contaminants ont été sélectionnées parmi lesquelles des contaminants semi-volatils
hydrophobes, les PCB et les HAP, des contaminants hydrophiles, les Alkylphénols
Polyéthoxylés, la Carbamazépine, l’Ethynyloestradiol et le Diuron. La composition des
solutions de contaminants et leurs concentrations sont détaillées dans le Tableau 2.3. Les
76
solutions de contamination ont été préparées dans l’acétone (pur) pour sa faible toxicité et
pour ses propriétés de bonne miscibilité dans l’eau.
Tableau 2.3. : Composition et concentrations nominales des solutions de contamination (en
microgrammes de composé par gramme d’acétone)
- Dispositif expérimental et conditions d’exposition
Avant de commencer les expositions, différents tests ont du être effectués pour
s’assurer de réaliser les expériences dans de bonnes conditions. Pour commencer, des tests ont
été effectués pour déterminer à quelle température les expériences devaient être menées afin
de calibrer la durée des expériences (durées de la période de décontamination et de la période
d’exposition). En effet, la température influe sur la physiologie de ces copépodes. Ainsi, plus
la température est basse et plus le métabolisme d’E. affinis est réduit et de ce fait plus leur
espérance de vie est longue. Etant donné que les expositions ont été menées sur des
copépodes prélevés in situ, leur espérance de vie en laboratoire est inconnue. Après avoir testé
une température de 15°C, il s’est avéré plus judicieux d’exposer les copépodes à une
température plus basse (10°C) pour augmenter leur espérance de survie. Les copépodes ont
été exposés dans des eaux à 15 PSU, salinité optimale pour le développement de cette espèce
en laboratoire (Devreker et al., 2004).
Une fois les paramètres physico-chimiques des expositions déterminés le dispositif
expérimental d’exposition en flux continu a du être développé. Comme indiqué dans la Figure
2.6., le dispositif expérimental est composé de réservoirs contenant les eaux contaminées
(aquariums du haut), des milieux d’exposition contenant des eaux contaminées et les
copépodes (aquariums du centre) et une enceinte de recyclage des eaux usées (aquarium du
bas).
77
Figure 2.6. : Dispositif expérimental
Environ 15 µL des solutions de contamination préparées dans l’acétone sont pesées
dans des flacons en verre, introduits dans les réservoirs d’eau et les milieux d’exposition puis
homogénéisés dans les 25 litres d’eau des aquariums. Un contrôle massique des volumes
injectés a été réalisé afin d’assurer la reproductibilité des conditions d’exposition. Les
concentrations en contaminants dans les réservoirs d’eau et dans les milieux d’exposition sont
équivalentes. Une pompe péristaltique permet l’apport de l’eau contaminée des réservoirs vers
les milieux d’exposition et le refoulement du trop plein d’eau des milieux d’exposition vers
les bacs de recyclage des eaux usées. Lorsque les réservoirs sont vides, le système est arrêté
pendant 15 minutes une à deux fois par jour suivant le débit et les réservoirs sont remplis
d’eau. Ces volumes d’eau sont à nouveau contaminés suivant le protocole précédemment
mentionné.
Du fait de la faible taille des organismes modèles (de l’ordre du mm) des précautions
particulières ont dues être prises en compte pour éviter l’aspiration des copépodes dans le
circuit de refoulement de l’eau vers les aquariums de recyclage des eaux usées. De même, le
courant créé par le flux continu des réservoirs vers les milieux d’exposition perturbe les
copépodes. Pour pallier à ces problèmes, les tuyaux d’aspiration du trop plein et ceux de
l’arrivée du flux continu ont été obstrués par un filet de maille de 45 µm (ne laissant pas
passer les copépodes d’un stade avancé) puis recouvert d’une maille de 200 µm formant des
zones sphériques de protection d’environ 15 cm autour des tuyaux pour que les copépodes
78
évitent la zone de turbulence des cônes d’aspiration et de refoulement créés par le flux
continu.
Une fois ce système opérationnel, des tests en conditions réelles (mais sans
copépodes) ont été menés pour déterminer les conditions nécessaires pour atteindre des
concentrations stables et voisines des concentrations sélectionnées pour les expositions. Ainsi,
plusieurs cinétiques de saturation des aquariums avec différents débits ont été effectuées pour
chaque classe de contaminants, dans différents aquariums, afin de déterminer le temps
nécessaire pour saturer les parois des aquariums en contaminants. Les résultats de ces tests et
les conditions de saturation des milieux d’exposition pour chaque classe de contaminant sont
détaillés dans le Tableau 2.4.
Tableau 2.4. : Cinétiques de saturation des aquariums pour chaque classe de contaminants
Composés
Débit
(L.jour-1)
cinétiques de saturation
T0
24 H
40H
48 H
72 H
84H
117H
142H
Concentrations
nominales
320
241
nd
nd
nd
427
201
nd
nd
nd
500
250
1000
500
10
Concentrations (ng.L-1)
HAP
PCB
Alkylphénols
Carbamazépine
EE2
50
50
25
50
50
456
251
686
500
10
268
135
835
500
9
nd
nd
790
500
10
205
109
927
500
11
266
114
nd
nd
nd
321
171
nd
nd
nd
Une fois ces paramètres définis, trois séries d’expériences ont ensuite été réalisées
successivement. Les détails du mode opératoire des expériences d’exposition sont précisés
dans le Tableau 2.5.
Les copépodes après trois jours et demi de décontamination sont filtrés et répartis de
manière homogène dans les milieux d’exposition. La quantité de copépodes introduite dans
chaque aquarium est estimée de manière empirique à l’aide de filtres à café en plastique
alimentaire (4 fonds de filtre à café par aquarium ce qui équivaut à environ 15 g de copépodes
soit 1 million ± 200 000 copépodes par aquarium). Les expériences d’exposition sont lancées
pour une durée totale de 86 heures.
Pour chaque série d’exposition (chaque semaine), deux témoins ont été réalisés en
parallèle : un témoin normal et un témoin avec acétone. Pendant toute la durée des
expositions, les copépodes ont été soumis à un jeûne total. Des copépodes ont été
échantillonnés lors des prélèvements in situ, après la période de décontamination et après les
86 heures d’exposition pour doser les contaminants organiques bioaccumulés, pour mesurer
79
les variations d’expression protéique. Pour l’ensemble de ces mesures, trois réplicats ont été
effectués.
Tableau 2.5. : Plan expérimental des expériences en flux continu (concentrations exprimées
en ng.L-1 d’eau)
IV. Analyse des contaminants organiques:
IV.1. Protocoles expérimentaux
Lors de chaque série d’extraction, des "blancs" expérimentaux sont réalisés et tous les
résultats présentés sont corrigés en soustrayant la quantité de composés mesurée dans les
blancs. Toute la verrerie utilisée est préalablement nettoyée avec des détergents, rincée à l’eau
ultra pure puis calcinée toute la nuit à 450°C.
Tous les solvants organiques utilisés au cours de ces expériences sont de qualité HPLC
grade ou organic residue analysis et ont été obtenus chez Atlantic Labo (Eysines, France). La
silice (0,063-0,2mm) et l’alumine (0,063-0,2mm) sont achetées chez Merck (Darmstadt,
Germany); le sulfate de sodium anhydre (Na2SO4) (pureté>99%) est acheté chez Fluka
chemie (Buchs, Switzerland). Avant utilisation, la silice, l’alumine et le Na2SO4 sont rincés
plusieurs fois au dichlorométhane. La silice et l’alumine sont ensuite activées à 150°C
pendant une nuit.
80
IV.1.1. Extraction des PCB et des HAP
De manière générale, l’extraction des contaminants organiques semi-volatils, tels que
les PCB et les HAP, dans différentes matrices se fait suivant un mode opératoire standard
comprenant une étape d’extraction par un solvant (le dichlorométhane), suivi d’une ou
plusieurs étapes de purification pour éliminer les molécules organiques co-extraites et enfin
l’analyse des composés par des techniques chromatographiques associées, pour chaque classe
de contaminants, à un détecteur spécifique.
Dans notre étude, les teneurs en PCB et HAP ont été analysées dans 3 types de
matrices différentes (la phase dissoute, la phase particulaire et chez E. affinis). Pour certaines
matrices (phase dissoute et phase particulaire), ces deux classes de contaminants ont été
extraites simultanément par un protocole combiné (PCB/HAP) à partir du même échantillon
(Figure 2.7.). Pour d’autres matrices (E. affinis), ces deux classes de contaminants ont été
extraites séparément sur deux échantillons distincts (Figure 2.8.).
- Extraction des contaminants
Deux protocoles d’extraction ont été utilisés en fonction du type de matrice considéré.
Avant toute extraction, les matrices solides sont pesées (particules et E. affinis), les volumes
d’eau sont mesurés, et les étalons internes sont ajoutés. Pour les matrices solides (particules et
E. affinis) les PCB et les HAP sont extraits sous champ de micro-ondes à pression
atmosphérique (Soxwave 100 Prolabo, Maxidigest Mx 4350 Prolabo). Le solvant d'extraction
utilisé est le dichlorométhane, choisi pour sa température d'ébullition relativement faible
(39,4°C) et pour son bon pouvoir solvatant. Cette technique est basée sur les effets thermiques
des micro-ondes, vecteurs d'énergie capables d'absorber une partie de l'énergie
électromagnétique et de la transformer en chaleur (Figure 2.7).
Dans la phase dissoute, les PCB et les HAP sont extraits simultanément par extraction
liquide/liquide. Pour cela, un solvant d’extraction, le dichlorométhane, est ajouté à l’eau de
l’estuaire dans une ampoule à décanter et le mélange est énergiquement agité pour augmenter
les surfaces de contact entre les phases. Cette technique consiste à extraire un ou plusieurs
composés d’une solution par dissolution au contact d’un solvant dans lequel les composés
sont solubles. C’est une opération fondamentale de transfert de matière entre deux phases
liquides non miscibles sans transfert de chaleur (Figure 2.8).
81
- Purification des extraits
Les extraits organiques obtenus sont purifiés pour éviter tout problème d’interférence
(co-élution avec des composés à analyser, saturation du détecteur…) au moment de l’analyse
chromatographique. Deux types de purification peuvent alors être effectués suivant la matrice
de départ :
Phase particulaire
Phase dissoute
Extraction assistée par micro-ondes (30 W, 10 minutes)
Matrice (particules 200 mg)
40 ml de dichlorométhane
étalons internes
Extraction liquide/liquide 2L d’eau
(80 mL de dichlorométhane/L d’eau)
étalons internes
Agitation énergique (3 extractions successives)
Filtration sur coton
Purification par 10 mL d’acide sulfurique 18N sous champ de
micro ondes (10 min)
Neutralisation de l’extrait par ajout d’eau ultra pure
Élimination des traces d’eau sur Na2SO4
Reconcentration de l’extrait au flux d’azote (1 mL)
Conditionnement des micro colonne de silice (5mL du mélange pentane/dichlorométhane, 90/10, v/v)
Purification de l’extrait sur micro colonne de silice
Élution des composés par 3×5mL du mélange pentane/dichlorométhane (90/10, v,v)
Reconcentration de l’extrait au flux d’azote (90 µL)
Séparation des PCB et HAP en CLHP (injection de 90 µL)
Reconcentration de l’extrait au flux d’azote
Reprise de l’extrait dans l’iso octane (100 µ L)
Analyse des PCB en CPG/DCE
Analyse des HAP en CPG/SM
Figure 2.7. : Protocoles d’extraction simultanée des PCB et des HAP en phase dissoute et en
phase particulaire
82
Extraction des HAP chez les copépodes
Extraction des PCB chez les copépodes
Matrice (E. affinis 150 mg poids sec)
étalons internes
Matrice (E. affinis 100 mg poids sec)
étalons internes
Filtration sur coton
Conditionnement des micro colonne d’alumine (3×5mL de dichlorométahne)
Élution des composés par 3×4mL mL de dichlorométhane
Purification par 10 mL d’acide sulfurique 36N avec agitation
(jusqu’à obtenir un extrait incolore)
Neutralisation de l’extrait par ajout d’eau ultra pure
Élimination des traces d’eau sur Na2SO4
Reconcentration de l’extrait au flux d’azote (1 mL)
Conditionnement des micro colonne de silice (5mL du
mélange pentane/dichlorométhane, 65/35, v/v)
Élution des composés par 3×4mL du mélange
pentane/dichlorométhane (65/35, v,v)
Conditionnement des micro colonne de silice (5mL du
mélange pentane/dichlorométhane, 90/10, v/v)
Élution des composés par 3×5mL du mélange
pentane/dichlorométhane (90/10, v,v)
Reconcentration de l’extrait au flux d’azote
Reprise de l’extrait dans l’iso octane (100 µ L)
Analyse des PCB en CPG/DCE
Analyse des HAP en CPG/SM
Figure 2.8. : Protocoles d’extraction des PCB et des HAP chez E. affinis
- Une purification chimique par acide sulfurique concentré (36N) avec agitation
énergique pour éliminer les lipides et les macromolécules biologiques co-extraites. Ce
type de purification est adapté pour l’analyse de composés chimiquement stables comme
les PCB (extraction des PCB chez E. affinis). Elle doit être précédée d’une étape de
dilution (acide 18N) lors de l’extraction simultanée des PCB et HAP dans les particules
avec une agitation légère, mais ne peut pas être appliquée lors de l’extraction des HAP
chez E. affinis. De plus, les extraits organiques de particules sont élués sur des colonnes
de cuivre activé pour éliminer le soufre éventuellement présent. Le cuivre est activé par
de l’acide, puis est neutralisé avec de l’eau ultrapure et conservé dans du
dichlorométhane.
83
- Une purification par chromatographie d’absorption en percolant l’extrait sur une micro
colonne contenant une phase stationnaire préalablement conditionnée (par des solvants).
Pour les extraits organiques des particules contenant les PCB et les HAP ainsi que pour
les extraits organiques de copépodes contenant les PCB, une seule purification sur
colonne de silice est effectuée. Pour les extraits organiques de copépodes contenant les
HAP, une première purification sur colonne d’alumine (pour éliminer les composés
polaires) suivi d’une seconde purification sur colonne de silice (pour éliminer les
interférents apolaires : phtalates, pesticides) sont effectuées.
- Séparation des PCB et HAP par CLHP
L’extrait organique obtenu à partir des protocoles combinés d’extraction des PCB et
des HAP en phase dissoute et en phase particulaire est purifié par chromatographie en phase
liquide haute performance (CLHP) (couplée à un spectrophotométre UV détection à 254 nm)
équipée d’une colonne d’amino-silane (NH2 granulométrie : 5 µm, 250 mm × 4,6 d.i.;
Stagroma, Suisse) avec du pentane en tant que solvant d’élution. Deux fractions sont
collectées en sortie de colonne. La première fraction contient les PCB et la seconde fraction
contient les HAP (du phénanthrène jusqu’au benzo(g,h,i)pérylène). Les durées des deux
fractions sont calibrées par injection de solutions étalons de PCB 128 et de
dibenz[a,h]anthracene (DaA) qui absorbent à 254 nm. Le pic d’absorption UV du PCB 128
indique la fin de la fraction des PCB et le pic d’absorption UV du DaA indique la fin de la
fraction des HAP.
- Validation des protocoles sur différentes matrices certifiées
L’efficacité des protocoles expérimentaux a été validée avec les matrices de référence
SRM 1944 (sédiments) et SRM 2978 (moules) (Gaithersburg, MD, USA) (Tableaux 2.6. et
2.7.).
84
Tableau 2.6. : Validation des protocoles d’analyse des HAP sur des matrices certifiées.
sédiments
moules
SRM 1944
ng.g-1
E.T.
Protocole
ng.g-1
E.T.
(n = 6)
Rendement
%
E.T.
SRM 2978
ng.g-1
E.T.
Protocole
ng.g-1
Phe
An
3méthyl Phe
2méthyl An
2 méthyl Phe
9 méthyl Phe
1 méthyl Phe
Flu
Pyr
BaA
Triph+Chrys
BkF+Bbf
BeP
BaP
Per
IP
DaA+DaC
BP
5270
1770
2100
1900
580
1600
1700
8920
9700
4720
5900
6170
3280
4300
1170
2780
759
2840
220
330
100
60
40
200
100
320
420
110
370
620
110
130
240
100
82
100
4399
667
1932
1212
324
1644
799
7400
7566
4229
5166
6767
3093
3571
868
2760
742
2697
195
41
111
70
28
144
40
286
298
284
368
304
153
206
37
133
60
125
83
38
92
64
56
103
47
83
78
90
88
110
94
83
74
99
98
95
1.0
3.7
0.5
2.2
2.7
0.5
3.2
1.0
1.3
0.6
0.7
0.6
0.4
1.0
1.5
0.3
0.5
0.4
74
5.4
–
–
–
–
6.8
166
256
25
122
82.1
89.3
7
4.09
12.2
3.5
19.7
7
2.2
–
–
–
–
0.1
12
21
7
19
3.4
6.3
3
0.32
2.9
0.5
4.4
73
6
–
–
–
–
6
128
227
24
93
79
74
4
3
10
3
18
13
4
–
–
–
–
4
7
12
0
3
3
3
1
0
1
0
1
98
114
–
–
–
–
85
77
89
95
76
96
83
59
78
84
87
89
0.9
2.1
–
–
–
–
1.5
1.4
0.7
0.3
1.4
0.4
1.0
2.4
1.3
1.0
1.0
0.7
∑ HAP
65459
3652
55835
2881
82
1.2
873
89
748
52
86
1.2
E.T. Rendement
(n = 6)
%
E.T.
Tableau 2.7. : Validation des protocoles d’analyse des PCB sur des matrices certifiées.
sédiments
SRM 1944
ng.g-1
E.T.
8
18
29
50+28
52
104
44
66
101
87
154+77
118
188
153
105
138
126
187
128
200
180
170
195
206
209
22
51
–
81
79
–
60
72
73
30
–
58
–
74
25
62
–
25
–
–
44
23
4
9
7
∑PCB
799
moules
protocole
ng.g-1
E.T.
(n = 4)
Rendement
%
E.T.
SRM 2978
ng.g-1
E.T.
protocole
ng.g-1
2
3
–
3
2
–
2
4
3
4
–
4
–
3
1
3
–
1
–
–
1
1
0
1
0
22
50
–
73
62
–
47
70
62
18
–
48
1
3
–
3
9
–
1
1
2
2
–
1
97
99
–
90
79
–
78
97
85
62
–
83
0
0
–
0
1
–
1
0
0
1
–
1
1
0
0
–
0
–
–
1
1
0
1
0
–
–
–
8
18
–
12
–
36
10
–
35
–
57
11
36
–
17
–
–
8
2
–
–
–
–
–
–
1
3
–
1
–
2
0
–
1
–
4
0
2
–
1
–
–
1
1
–
–
–
–
–
–
6
14
–
9
–
36
7
–
34
–
47
10
38
–
17
–
–
5
1
–
–
–
–
–
–
0
0
–
0
–
1
1
–
2
–
2
3
1
–
1
–
–
0
0
–
–
–
–
–
–
72
81
–
74
–
100
72
–
96
–
82
90
106
–
103
–
–
67
59
–
–
–
–
–
–
1
1
–
1
–
0
1
–
0
–
1
0
0
–
0
–
–
1
1
–
–
–
52
23
60
–
25
–
–
36
19
4
8
7
2
1
1
–
1
–
–
0
0
0
1
0
71
96
97
–
100
–
–
81
82
105
89
98
39
687
28
87
0
249
15
224
13
83
1
E.T.
Rendement %
(n = 4)
E.T.
Les rendements d’extraction moyens pour les HAP et les PCB dans les sédiments, en
comparaison avec les concentrations certifiées, sont respectivement de 82 % (de 74 à 110 %)
avec toutefois des rendements plus faibles pour l’anthracène (38 %), et de 87 % (de 62 à 105
85
%). Les rendements d’extraction moyen des HAP et des PCB dans les moules, comparés aux
concentrations certifiées sont respectivement de 86 % (de 59 à 114 %) et de 83 % (de 59 à
106 %).
IV.1.2. Extractions des alkylphénols polyéthoxylés
Dans notre étude, les alkylphénols polyéthoxylés ont été analysés dans 3 matrices
différentes (phase dissoute, phase particulaire et E. affinis) suivant deux protocoles d’analyse.
- Principe de l’extraction sur phase solide (SPE)
L’extraction sur phase solide (SPE) est basée sur la distribution des composés entre
une phase solide (adsorbant) et une phase liquide (échantillon). Cette étape permet de
concentrer une molécule (ou plusieurs molécules d’une même classe chimique) dans un
mélange complexe. Les techniques de SPE consistent à percoler un échantillon aqueux sur un
support solide pour retenir les analytes recherchés par des interactions hydrophobes plus ou
moins spécifiques. Cette méthode est basée sur l’utilisation de supports d’extraction de nature
variée (silice greffée par des chaînes hydrocarbonées de type C18, polymères de styrène
divinylbenzène….) dont le choix est fonction des composés à analyser. La sélection d’un
adsorbant conduit pour les analytes recherchés à une forte rétention de ceux-ci (indispensable
quand il s’agit de percoler de grands volumes d’échantillons) sur un support pour lequel l’eau
présente une faible force éluante. Les interactions hydrophobes avec la phase étant peu
spécifiques, des interférents sont également retenus. L’adjonction d’une procédure de
purification peut donc s’avérer nécessaire (rinçage des cartouche par des solvants présentant
une faible affinité pour les molécules d’intérêt). Enfin, les molécules recherchées sont éluées
spécifiquement à l’aide de solvants (ou mélange de solvants) spécifiques.
- Mode opératoire
Le détail des protocoles d’analyse des alkylphénols polyéthoxylés en phase dissoute et
sur matrices solides est présenté dans la Figure 2.9. Les alkylphénols polyéthoxylés ont
d’abord été extraits des matrices solides (particules ou copépodes) sous champ de micro
ondes (30 W, 10 minutes) selon le protocole développé par Pan et al. (2006, soumis).
L’extrait obtenu est filtré, concentré puis repris dans 100 mL d’eau ultra pure acidifiée à pH 2.
86
Figure 2.9. : Protocoles d’extraction des alkylphénols polyéthoxylés en phase dissoute et sur
matrices solides
Les échantillons d’eau filtrée sont également acidifiés à pH 2 avant l’extraction.
Ensuite, les 100 mL des extraits aqueux des matrices solides ainsi que 500 mL des
échantillons d’eau acidifiés à pH 2 sont percolés sur des cartouches Varian BondElut C18
(Interchim, Montluçon, France) à un débit de 10 mL.min-1. Les cartouches sont rincées par la
suite par un mélange méthanol/ eau ultra pure à pH 2 et séchées pendant une heure. Les
87
alkylphénols polyéthoxylés sont alors élués par un mélange méthanol/ dichlorométhane et
concentrés sous flux d’azote dans 100 µL (pour les extraits des échantillons d’eau) ou dans
500 µL de méthanol (pour les extraits des matrices solides). Ces composés ont par la suite été
analysés en chromatographie en phase liquide couplée à un spectromètre de masse (cf.
IV.2.2).
- Validation du protocole sur matrice fortifiée
L’efficacité des protocoles expérimentaux a été validée sur des échantillons de 500 mL
d’eau ultra pure fortifiés par une solution d’étalons d’alkylphénols (dans le méthanol) de
concentrations connues. Les taux moyens de recouvrement par rapport aux concentrations
théoriques pour le 4 NP (100 ng.L-1), le NP1EC (850 ng.L-1), le NP2EC (850 ng.L-1), le
NP1EO (200 ng.L-1) et le NP2EO (200 ng.L-1) sont respectivement de 90 % ± 12, 68 % ± 5,
56 % ± 5, 90 % ± 3, 61 % ± 2 (n = 4).
IV.1.3. Extraction des hormones stéroïdiennes
Une hormone stéroïdienne de synthèse (le 17α-éthynyloestradiol) a été analysée dans
cette étude, lors des expériences d’exposition des copépodes en flux continu (cf. paragraphe
III.2.) sur deux matrices différentes (eau et copépodes) suivant 2 protocoles d’analyse.
- Mode opératoire
Avant la SPE, les cartouches OASIS HLB 200 mg (Waters) sont conditionnées en
faisant percoler 6 mL de méthanol puis 6 mL d’eau ultra pure. De plus, l’étalon interne
(éthynyloestradiol d4) est ajouté aux échantillons d’eau. Les échantillons d’eau filtrée sont
alors percolés sur les cartouches à un débit de 10-15 mL.min-1. Puis les cartouches sont
rincées par 5 mL du mélange méthanol/ eau ultra pure (60:40, v/v) et séchées pendant une
heure sous vide. Les stéroïdes sont ensuite élués par 8 mL de méthanol et concentrés au flux
d’azote (Labadie et Budzinski, 2006).
Les échantillons de copépodes sont broyés à l’aide d’un ultra turrax dans 9 mL d’un
mélange méthanol/ eau ultra pure (5:4, v/v). Les étalons internes sont ajoutés et les stéroïdes
sont extraits sous champ de micro ondes (30 W, 5 minutes). L’extrait obtenu est alors
centrifugé (4500 tr/min, 5 min). Le surnageant est récupéré et le méthanol est éliminé sous
88
flux d’azote à 60°C. L’extrait est alors purifié sur cartouche EnviChrom-P 500 mg (Supelco,
St Quentin Fallavier, France) préalablement conditionnée par 4 mL d’acétate d’éthyle, 4 mL
de méthanol et 4 mL d’eau ultra pure. La cartouche est alors rincée par 4 mL d’eau ultra pure
puis 4 mL de cyclohexane puis séchée sous vide pendant une heure. Les stéroïdes sont ensuite
élués dans une première fraction contenant les formes conjuguées par 10 mL d’un mélange
cyclohexane/diéthyléther (7 :3, v/v), puis évaporés à sec sous flux d’azote à 50°C. Les formes
libres des stéroïdes sont alors éluées dans une seconde fraction par 10 mL de méthanol,
évaporées à sec sous flux d’azote à 50°C et reprises dans un mélange acétate d’éthyle/
méthanol (80:20, v/v).
Les formes conjuguées de stéroïdes sont alors reprises dans 2 mL d’un mélange
acétate d’éthyle/ méthanol (80:20, v/v) puis purifiées sur cartouche NH2 500 mg (Supelco)
préalablement conditionnée par 4 mL d’acétate d’éthyle puis 4 mL du mélange acétate
d’éthyle/ méthanol. L’éluat est récupéré et les cartouches sont rincées par 2 mL du mélange
acétate d’éthyle/ méthanol. L’extrait est alors repris dans un tampon d’acétate de sodium 10-2
M à pH 5 puis purifié sur cartouche OASIS HLB 200 mg (Waters) préalablement
conditionnée par 4 mL de méthanol puis par 4 mL d’eau ultra pure. Les cartouches sont
rincées par 5 mL d’eau ultra pure puis les formes conjuguées des stéroïdes sont éluées par 5
mL d’un mélange méthanol/ eau (6:4, v/v) contenant de la triéthylamine (5×10-3 M dans le
mélange) et évaporées sous flux d’azote à 60°C. Les stéroïdes sont ensuite déconjugués par
solvolyse dans un mélange méthanol/ tétrahydrofurane/ acide trifluoroacétique (200 µL/ 800
µL/ 10 µL) et incubés 30 min à 45°C. Après neutralisation par ajout de Na2CO3 (400 µL à 0,2
M) les solvants sont évaporés sous flux d’azote à 50°C. Les échantillons sont alors repris dans
5 mL de tampon acétate de sodium (10-2 M, pH 5) avec 30 µL d’arylsulfatase/ βglucuronidase pour une déconjugaison enzymatique à 55°C pendant 3 heures. Le mélange est
ensuite percolé sur cartouches OASIS HLB 200 mg préalablement conditionnées par 4 mL de
méthanol et 4 mL d’eau ultra pure. Les cartouches sont ensuite rincées par 5 mL d’un
mélange méthanol/ eau ultra pure (6:4, v/v) contenant de la triéthylamine (5×10-3 M dans le
mélange) puis séchées sous vide. Les stéroïdes sont élués par 10 mL de méthanol et évaporés
à sec.
Les stéroïdes des 2 fractions sont repris séparément dans 2 mL d’un mélange acétate
d’éthyle/ méthanol (80:20, v/v), purifiés sur cartouches NH2 500 mg (Supelco) préalablement
conditionnées par 4 mL d’acétate d’éthyle et par 4 mL du mélange acétate d’éthyle/méthanol
(80:20, v/v). L’éluat est récupéré et les cartouches sont rincées par 2 mL du mélange acétate
89
d’éthyle/méthanol (80:20, v/v). Les extraits sont alors évaporés à sec, repris dans 30 µL de
dichlorométhane et 30 µL de réactif de dérivation et dérivés pendant 35 min.
- Dérivation des composés
Pour certaines molécules trop polaires et pas assez volatiles, une étape de dérivation
des fonctions polaires, en formant par exemple des dérivés silylés, est nécessaire pour
permettre leur analyse en CPG SM. Le réactif de dérivation utilisé dans notre étude, le
MSTFA (N-méthyl-N(triméthylsilyl)trifluoroacétamide), est capable de silyler les fonctions
cétones conjuguées et les alcools tertiaires en présence d’un catalyseur (association d’iodure
d’ammonium et de β-mercaptoéthanol). Le réactif de dérivation (250 µL de MSTFA + 10 mg
de NH4I + 15 µL de C2H60S) est d’abord chauffé à 65°C puis dilué 10 fois dans du MSTFA et
est ensuite ajouté à l’extrait organique obtenu et mis à incuber pendant 35 minutes à 65°C.
- Validation sur matrice fortifiée
L’efficacité des protocoles expérimentaux a été validée sur des échantillons d’eau ultra
pure fortifiés par une solution étalon de 17α-éthynyloestradiol (dans l’acétone) de
concentration connue (10 ng.L-1). Le taux moyen de recouvrement par rapport à la
concentration théorique attendue est de 85 % ± 6 (n = 4).
IV.1.4. Extraction des pesticides (carbamates et triazines)
Les carbamates et les triazines, comparativement aux contaminants organiques
persistants, sont des composés très hydrosolubles, présents dans les eaux de surface
majoritairement sous forme dissoute (Munschy, 1995). Pour ces raisons, au cours de notre
étude, ces composés ont été dosés uniquement dans la phase dissoute de l’estuaire de Seine.
L’extraction des pesticides est réalisée sur phase solide (Bakerbond speedisk® DVB,
J.T. Baker) à partir d’un volume d’eau de Seine filtrée de 1 L. Avant extraction, l’étalon
interne (la benzo(h)quinoléïne, 98 %, Lancaster) servant à quantifier les composés lors de
l’analyse est rajouté dans l’eau. Ensuite, la première étape consiste à conditionner la phase du
disque par une série de solvants de polarité croissante. Le disque est d’abord rincé par du
dichlorométhane puis du méthanol sous un vide léger. Puis la phase est conditionnée par
percolations successives de 10 mL d’acétonitrile, 10 mL de méthanol et enfin 10 mL d’eau
90
ultra pure, sans jamais laisser la phase aller à sec. L’eau à extraire est ensuite éluée sur le
disque. Une fois le disque séché (sous vide), les pesticides adsorbés sur la phase sont désorbés
par ajout de 9 mL d’acétonitrile. L’extrait obtenu est alors séché sur Na2SO4, concentré sous
flux d’azote et repris dans un mélange de solvants (cyclohexane/acétate d’éthyle, v/v) luimême concentré au flux d’azote jusqu’à 100 µL. Avant l’analyse en CG/SM, un étalon de
rendement d’extraction est ajouté, la quinoléïne (96 %, Lancaster).
IV.2. Analyse des contaminants
Les différents composés organiques étudiés ont été séparés par chromatographie qui
est une méthode physique de séparation des constituants d’un mélange en phase homogène
liquide ou gazeuse. Cette technique analytique repose sur l’équilibre de concentrations des
composés présents entre deux phases en contact : la phase stationnaire et la phase mobile qui
se déplace. La séparation est basée sur l’entraînement différentiel des constituants du mélange
injectés dans la colonne. Ces derniers parcourent la colonne en un temps propre proportionnel
à leurs propriétés intrinsèques et/ou leur affinité à l’égard des deux phases, la phase
stationnaire et la phase mobile. La quantification des différents composés en sortie de colonne
est assurée par un détecteur spécifique (relativement à la classe de contaminants à analyser).
Au cours de cette étude, plusieurs techniques d’analyse ont été utilisées : la
chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (CPG/SM) pour
l’analyse des HAP et de l’éthynyloestradiol, la chromatographie en phase gazeuse couplée à
un détecteur à capture d’électrons (CPG/DCE) pour l’analyse des PCB, et enfin la
chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse pour l’analyse des
alkylphénols polyéthoxylés. Les principes de ces différentes techniques sont présentés dans
les paragraphes suivants.
IV.2.1. Chromatographie en phase gazeuse (CPG)
C’est une technique de séparation qui s’applique aux composés volatils ou semi
volatils (à l’état gazeux ou susceptibles d’être facilement vaporisés par chauffage sans
décomposition). Le mélange à analyser est vaporisé à l’entrée d’une colonne capillaire (HP5
MS, 5 % phényl 95 % méthylsiloxane) renfermant une phase stationnaire solide (60 m × 0,25
mm, diamètre interne 0,25 µm) puis est conduit à travers la colonne, jusqu’au détecteur par un
gaz vecteur inerte (l’hélium). Dans le mélange analysé, les différents constituants vont
91
différer par leur pression de vapeur et leur capacité de rétention/désorption sur la phase
stationnaire de la colonne chromatographique. Chacun des composés du mélange est alors
caractérisé par un temps de rétention.
- Couplage à la spectrométrie de masse (SM)
C’est une technique d’analyse à la fois qualitative et quantitative permettant de
déterminer la structure moléculaire d’un composé. En sortie de colonne capillaire, les
molécules de l’extrait injecté sont ionisées dans la source du spectromètre par bombardement
électronique à 70 eV (collision des molécules de l’échantillon avec des électrons formés par
l’échauffement d’un filament de rhénium sous un champ magnétique perpendiculaire au
champ électrique). L’ion obtenu (ion moléculaire) permet la détermination de la masse
molaire du composé. Cet ion moléculaire est lui-même fragmenté en plusieurs ions
caractéristiques, qui séparés en fonction de leur rapport masse/charge, constituent le spectre
de masse de la molécule permettant l’identification de celle-ci. Le courant ionique total,
proportionnel au nombre de molécules dans la source, est mesuré à l’aide d’un électromètre et
permet de quantifier, en mode SIM (Single Ion Monitoring), la concentration de chaque
molécule. Les caractéristiques et les conditions d’analyse des HAP, de l’éthynyloestradiol et
des pesticides (triazines et carbamates) sont précisées respectivement dans les Annexes 1, 2 et
3.
- Couplage à un détecteur à capture d’électrons (DCE)
Une source radioactive (63Ni) émet en permanence des particules β qui ionisent les
molécules d’azote du gaz auxiliaire, produisant un nuage d’électrons libres dans le détecteur.
Ces électrons sont captés par une électrode qui convertit le courant résultant en un signal.
Quand ce courant est traversé par une molécule électronégative (comme tous les composés
halogénés tels que les PCB), celle-ci va capter une partie des électrons. Le passage de
composés électronégatifs va donc entraîner la diminution du courant électronique et cette
diminution se traduit par un signal (pic chromatographique) permettant de quantifier la
molécule. Les caractéristiques et les conditions d’analyse des PCB en CPG DCE sont
précisées dans l’Annexe 4.
92
IV.2.2. Chromatographie en phase liquide (CPL):
La chromatographie en phase liquide haute pression fait intervenir des mécanismes
d’échanges soluté/phase mobile /phase stationnaire basés sur les coefficients de partage ou
d’adsorption selon la nature des phases en présence. C’est une technique particulièrement
adaptée pour l’analyse des composés non volatils.
Le mélange à analyser est élué dans la colonne capillaire (Kromasil C18, Interchim,
France) par un mélange de solvants (eau/méthanol/acétate d’ammonium) sous haute pression
selon un gradient de polarité. Les propriétés physico-chimiques propres aux différents
constituants du mélange à analyser vont conditionner leurs interactions avec la phase
hydrophobe de la colonne. Les composés présentant des interactions avec la phase
stationnaire plus faibles que pour la phase mobile sont d’abord élués. Puis le pouvoir éluant
de la phase mobile s’accroît progressivement en augmentant dans celle-ci la proportion de
méthanol selon un gradient approprié pour entraîner les composés retenus par la colonne.
En mode électrospray (ESI), un champ électrique de quelques kV est appliqué entre le
capillaire et la chambre d’ionisation, entraînant la formation d’un nuage de gouttelettes
multichargées qui traverse simultanément un champ électrique et un gradient de pression dans
la direction du spectromètre de masse. La taille des gouttelettes diminue progressivement par
évaporation du solvant et par "explosions coulombiennes" successives (facilitée par un flux de
N2). Les ions formés à pression atmosphériques sont alors canalisés et pompés vers le
spectromètre de masse où règne un vide quasi. Les ions obtenus en mode positif et négatif
sont respectivement de type [M-Na]+ et [M-H]- , où M correspond à la masse moléculaire de
la molécule analysée. Les caractéristiques et les conditions d’analyse des alkylphénols
polyéthoxylés sont précisées dans l’Annexe 5.
IV.3. Quantification des contaminants
IV.3.1. Etalonnage interne
Cette technique permet de s'affranchir des problèmes de reproductibilité des volumes
injectés et des pertes d’analytes intervenant au cours de l’analyse. Un étalon interne doit
pouvoir subir les mêmes étapes de préparation que les composés analysés, sans perte ou
dégradation. Il doit avoir une réponse chromatographique comparable à celle des composés
analysés, sans coélution. Enfin, il ne doit pas être initialement présent dans l'échantillon à
93
analyser. Suivant les classes de contaminants analysés, les étalons internes correspondant sont
soient des composés deutérés soit des composés de structure proche.
Il est nécessaire de définir pour chaque analyte i, un facteur de réponse Ki. La méthode
de calcul est basée sur l’utilisation de mélanges étalons dans lesquels les concentrations
respectives en analytes (Ci) et en étalons internes (Ce) sont connues. A chaque pic
chromatographique est associé une aire (A) proportionnelle à une quantité de composé
injectée (m). Le facteur de réponse Ki d’un analyte i par rapport à un étalon e est obtenu par la
relation suivante :
Ki = (Ai/(Ci×mi))/(Ae/(Ce×me)
La quantité d’analyte m’i dans un échantillon inconnu est obtenue par la relation suivante :
m’i = (Ai×m’e)/(Ki×Ae)
avec m’e la quantité d’étalon interne e ajoutée dans l’échantillon.
Dans notre étude, 26 PCB et les 21 HAP sont quantifiés par étalonnage interne (Tableau 2.8.).
Tableau 2. 8. : Liste des PCB et HAP étudiés et de leurs étalons internes correspondants.
Étalons
PCB
Substitutions
en Cl
internes
HAP
m/z
Étalons
internes
m/z
8
2
PCB 30
naphthalène (Na)
128
naphthalène d8
136
18
3
PCB 30
acénaphthylène (Acy)
152
naphthalène d8
136
29
3
PCB 30
acénapthène (Acé)
154
naphthalène d8
136
44
4
PCB 103
50 + 28
4–3
PCB 103
fluorène (Flu)
166
naphthalène d8
136
phénanthrène (Phe)
178
phénanthrène d10
188
66
4
PCB 103
104
5
PCB 103
anthracène (An)
178
phénanthrène d10
188
5
PCB 155
fluoranthène (Fluo)
202
fluoranthène d10
212
87
101
5
PCB 155
pyrène (Pyr)
202
fluoranthène d10
212
154 + 77
6-4
PCB 155
228
fluoranthène d10
240
105
5
PCB 198
benz(a)anthracène
(BaA)
118
5
PCB 198
triphénylène (Triph)
+ chrysène (Chrys)
228
chrysène d12
240
252
benzo(b)fluoranthène
d12
264
126
5
PCB 198
128
6
PCB 198
138
6
PCB 198
benzo(b)fluoranthène (BbF)
+benzo(j)fluoranthène (BjF)
+benzo(k)fluoranthène (BkF)
153
6
PCB 198
benzo(e)pyrène (BeP)
252
benzo(e)pyrène d12
264
170
7
PCB 198
benzo(a)pyrène (BaP)
252
benzo(a)pyrène d12
264
180
7
PCB 198
187
7
PCB 198
pérylène (Per)
252
benzo(a)pyrène d12
264
indéno(1,2,3-cd)pyrène (IP)
276
benzo(g,h,i)pérylène
d12
288
benzo(g,h,i)pérylène (BP)
276
d12
288
dibenz(a,h)anthracène
+dibenz(a,c)anthracène (DaA)
278
d12
288
188
7
PCB 198
195
8
PCB 198
200
8
PCB 198
206
9
PCB 198
209
10
PCB 198
94
D’autres composés sont également quantifiés par étalonnage interne. Ainsi, le 17αéthynyloestradiol (m/z 425) est quantifié par rapport au 17α-éthynyloestradiol d4 (m/z 429),
l’atrazine (m/z 200), la simazine (m/z 201), la déséthylatrazine (m/z 172), la déséthylsimazine
(m/z 173), le carbofuran (m/z 164) et le carbaryl (m/z 144) par rapport à la
benzo(h)quinoléïne (m/z 179).
IV.3.2. Etalonnage externe
Dans cette étude, une classe de contaminants, les alkylphénols polyéthoxylés, a été
quantifiée par un étalonnage externe. Cette méthode est basée sur le fait que l’aire des pics
chromatographiques est proportionnelle à la quantité de produit injectée dans un domaine de
linéarité de réponse à déterminer pour chaque composé. L’étalonnage externe est donc réalisé
en analysant la réponse d’une gamme de dilution (comportant 5 points) de solutions étalons
de concentrations connues par l’équation : aire = f (masse de composé). Des gammes de
dilution pour des concentrations respectives de 0,1 à 0,8 µg.mL-1 pour le 4 NP (m/z 219), le
NP1EO (m/z 282) et le NP2EO (m/z 331) et de 0,2 à 2 µg.mL-1 pour le NP1EC (m/z 277) et
le NP2EC (m/z 321) ont été préparées lors de chaque série d’analyse. Des droites de
calibration ont pu être obtenues par régression linéaire à partir de la réponse de ces gammes
de dilutions. La linéarité des droites de calibration est alors vérifiée pour chaque composé (r2
≥ 0,995).
V. Mesure de deux biomarqueurs enzymatiques
V.1. Extraction des protéines
En raison de la faible taille des organismes, les échantillons de copépodes à analyser
sont constitués de pools d’organismes entiers conservés jusqu’à analyse au congélateur à 80°C. Les échantillons sont alors décongelés, pesés (environ 500 mg de poids frais), puis
broyés à l’aide d’un Ultra Turrax (Heidolph DIAX 900) pendant une minute, sur glace, en
présence d’un tampon phosphate 20 mM pH 7 (1/5; masse/volume) contenant un détergent de
type Triton X 100 (0,1 %), indispensable à la solubilisation des protéines à ancrage
membranaire comme les cholinestérases. L’homogénat obtenu est centrifugé une première
fois à 10 000 g pendant 5 minutes à 4°C. Le culot est alors remis en suspension, homogénéisé
95
puis à nouveau centrifugé à 10 000 g pendant 5 minutes à 4°C. Le surnageant contenant les
protéines cytosoliques est alors récupéré.
V.2. Dosage des protéines totales
La teneur totale en protéines de l’extrait de copépodes est mesurée par la méthode
colorimétrique de Bradford (1976). Cette méthode est basée sur la capacité de liaison par des
interactions non covalentes des protéines au colorant Coomassie® Brillant Blue G-250 dont le
coefficient d’absorption maximal augmente de 465 et 595 nm. Une lecture d’absorbance de
l’échantillon à 595 nm en présence de ce colorant sert d’unité de mesure pour la concentration
en protéines. Le mode opératoire de cette mesure est le suivant :
- Réaliser une gamme étalon de solution protéique commerciale, la BSA (sérum
d’albumine bovine) allant de 1 à 6 µg.µL-1 à partir d’une solution mère de BSA à 0,1
mg.mL-1 (Acros Organics)
- Diluer au 100ème les extraits protéiques (eau distillée)
- Déposer 50 µL de l’extrait protéique dilué au 100ème, compléter à 100 µL avec de
l’eau distillée
- Ajouter dans tous les puits 250 µl de réactif de Bradford (Bradfor Reagent, Sigma)
L’absorbance est mesurée à l’aide d’un spectrophotomètre équipé d’un lecteur de
microplaque (Elx 808, BIO-TEK INSTRUMENTS, INC) pour une longueur d’onde de 595
nm. La régression linéaire de la droite de calibration obtenue à partir de la gamme étalon de
BSA permet de calculer la concentration totale en protéines de l’extrait de copépodes. La
concentration en protéines de l’extrait est alors exprimée en µg.µL-1.
V.3. Dosage de l’activité acétylcholinestérase (AChE)
L’activité enzymatique acétylcholinestérase est mesurée à partir de l’extrait protéique
cytosolique de copépodes (cf. paragraphe IV.1.) par la méthode colorimétrique d’Ellman
(1961) modifiée par Bocquené et Galgani (1998) pour la lecture en microplaques 96 puits.
Cette méthode est basée sur la mesure du produit de l’hydrolyse d’un substrat,
l’acétylthiocholine iodide (ACTC, 98 % Sigma) par une enzyme, l’acétylcholinestérase, en
thiocholine et acide acétique selon la réaction présentée dans la Figure 2.10.
96
Figure 2.10. : Réaction enzymatique mise en jeu dans le dosage de l’activité AChE
Lorsque le substrat se trouve en excès, son hydrolyse enzymatique par
l’acétylcholinestérase est linéaire. Dans ces conditions, le nombre de moles de produit formé
est proportionnel à la quantité d’enzyme présent dans le milieu réactionnel. L’ajout d’un
réactif incolore, le 5,5’-Dithiobis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB, Sigma) qui va se fixer sur les
groupements thiols de la thiocholine entraîne la formation de deux produits, le 2nitrobenzoate-mercaptothiocholine et le nitro-2 mercapto-5 benzoate. Ce dernier, de couleur
jaune et dont l’intensité est proportionnelle à l’activité AChE, peut être mesuré par un
spectrophotomètre à 412 nm. Le mode opératoire utilisé pour mesurer cette activité
enzymatique est le suivant :
- Déposer 10µl de l’extrait protéique dans les puits de la microplaque
- Ajouter 20 µl de réactif DTNB à 0,01 M (dissous dans du tampon phosphate 20 mM
pH 9)
- Ajouter 310 µl de tampon phosphate 20 mM pH 7 + 0,1 % de Triton X 100
- La réaction est déclenchée dès l’introduction des 10 µl de substrat, ACTC à 0,1 M
(dissous dans de l’eau distillée)
- Lire l’absorbance en mode cinétique pendant 2 minutes à 412 nm à l’aide d’un
spectrophotomètre (par ailleurs, deux blancs sont également mesurés, un sans
substrat et l’autre sans extrait protéique)
L’activité AChE mesurée est exprimée, dans le but de standardiser les résultats, en
µmoles de produit formé par minute et par milligramme de protéines (coefficient d’extinction
molaire ε 12600 M-1.cm-1).
97
V.4. Dosage de l’activité glutathion-S-transférase (GST)
L’activité enzymatique glutathion-S-transférase est mesurée à partir de l’extrait
protéique cytosolique de copépodes (cf. paragraphe IV.1.) par la méthode colorimétrique de
Habig et al. (1974). Cette méthode est basée sur la mesure du produit de la conjugaison de
deux substrats, le glutathion réduit (GSH) (L-Glutathione reduced 98-100 %, Sigma) et le 1
chloro-2,4-dinitrobenzène (CDNB, 99 %, Acros Organics), catalysée par une enzyme, la
glutathion-S-transférase selon la réaction présentée dans la Figure 2.11.
Figure 2.11. : Réaction enzymatique mise en jeu dans le dosage de l’activité GST
Cette réaction conduit à la formation d’un thioéther qui absorbe à 340 nm. L’activité
GST peut donc être suivie en mesurant l’apparition du produit de la réaction à l’aide d’un
spectrophotomètre à 340 nm. Le mode opératoire utilisé pour mesurer cette activité
enzymatique est le suivant :
- Déposer 10 µl de l’extrait protéique dans les puits de la microplaque
- Ajouter 50 µl de réactif CDNB à 0,04 M (dissous dans l’éthanol)
- Ajouter 890 µl de tampon Tris 100 mM pH 7,5
- La réaction est déclenchée dès l’introduction des 50 µl de substrat, le glutathion
réduit (GSH) à 0,04 M (dissous dans du tampon tris 100 mM pH 7,5)
- Lire l’absorbance en mode cinétique pendant 2 minutes à 340 nm à l’aide d’un
spectrophotomètre (par ailleurs, un contrôle est également effectué, sans extrait
protéique)
L’activité GST mesurée est exprimée, dans le but de standardiser les résultats, en
moles de produit formé par minute et par milligramme de protéines (coefficient d’extinction
molaire ε 9,6 mM-1.cm-1).
98
VI. Analyse de l’empreinte protéique
VI.1. Préparation et purification des échantillons
Les protéines sont extraites sur glace en présence d’un tampon d’extraction (1/3,
poids/volume) à l’aide d’un Ultra Turrax pendant 40 secondes suivi d’une sonication pendant
10 secondes. Cette séquence broyage/sonication est répétée deux nouvelles fois.
Le tampon d’extraction est composé de tris HCl à 50 mM associé à du glycérol à 10
%, de l’acétate de magnésium à 5 mM, de l’ethylenediamine tetra-acetic acid à 2 mM
(EDTA), du DL-Dithiothreitol à 1 mM (DTT) ainsi que 10 µl d’aprotinine pour 10 ml de
solution (Tableau 2.9.).
Tableau 2.9. : Composition du tampon d’extraction
Composés
Fournisseur
Propriétés biochimiques
Tris
PlusOne® Tris (99,8-100 %)
Amersham Biosciences
Permet l’extraction des protéines en rendant
les membranes cellulaires perméables
(interaction avec les lipopolysaccharides
membranaires)
EDTA
Acros Organics
Augmente l’effet du Tris
Glycérol
PlusOne® Tris (86-88 %)
Agent protecteur pour les protéines extraites
maintient les protéines dépliées (limite
l’agrégation des protéines)
Acétate de
magnésium
Sigma Aldrich (min 99 %)
Protège les polysomes pendant l’extraction
DTT
Sigma Aldrich (99 %,
electrophoresis reagent)
Agent réducteur (permet de casser les ponts
disulfures des protéines)
Aprotinine
Sigma Aldrich (protease
inhibitor from bovine lung)
Agent protecteur contre la lyse enzymatique
provoquée par la libération de protéases lors
de la lyse cellulaire
L’extrait obtenu est centrifugé à 12 000 rpm pendant 15 minutes à 4°C. Le surnageant
est récupéré et transféré dans des tubes à ultracentrifugation. L’extrait est alors centrifugé à 42
000 rpm pendant une heure à 4°C (Discovery M120, Sorvall Centrifuges, Hitachi). Afin de
concentrer l’extrait protéique obtenu, le surnageant est récupéré et les protéines sont
précipitées pendant 45 minutes sur glace par ajout de TCA (trichloroacetic acid min 99 %,
electrophoresis reagent, Sigma) à 50 % (1/4, v/v). Après précipitations, l’extrait est centrifugé
à 13 000 rpm pendant 30 minutes à 4°C. Le surnageant est alors éliminé et le culot est
recouvert d’acétone (Distillerie Hauguel, Gonfreville l’Orchet, France) et centrifugé à 12 000
99
rpm pendant 15 minutes à 4°C. Par la suite, un second rinçage à l’acétone est effectué. Enfin,
l’acétone est éliminé et le culot est remis en suspension dans un tampon de réhydratation
composé d’urée (9 M), de Chaps (55 mM)et de dithioerythritol (DTE) (110 mM) dans de
l’eau distillée (Tableau 2.10.).
Tableau 2.10. : Composition du tampon de réhydratation
Composé
Fournisseur
Urée
PlusOne® Tris (99,5 %)
Agent dénaturant
Permet la solubilisation de la plupart des protéines
CHAPS
USB Corporation
Cleveland, OH, USA
Détergent zwitterionique permettant la
solubilisation complète des protéines
Limite les interactions hydrophobes entre
protéines
DTE
Acros Organics (99 %)
Agent réducteur (permet de casser les ponts disulfures des protéines)
La concentration totale en protéines de l’extrait obtenu peut alors être mesurée suivant
la méthode décrite dans le paragraphe IV.2.
VI.2. Séparation des protéines par électrophorèse bidimensionnelle
Cette technique est basée sur une double séparation des protéines par deux
électrophorèses successives : la première par focalisation isoélectrique des protéines suivie
d’une séparation sur gel SDS-Page (sodium dodécyl-sulfate).
VI.2.a. Séparation par focalisation iso-électrique (IEF)
- Le principe :
Une IEF est une technique d’électrophorèse permettant de séparer les protéines en
fonction de leur point isoélectrique (pI). En effet, les protéines sont des molécules amphotères
c'est-à-dire qu’elles portent des charges soit positives soit négatives ou neutres en fonction du
pH du milieu. La charge nette d’une protéine correspond à la somme des charges positives et
négatives des chaînes d’acides aminés qui la composent. Le pI d’une protéine correspond au
100
pH spécifique auquel la charge nette de la protéine est nulle. On obtient les relations suivantes
en fonction du pH du milieu :
- pH < pI : protéine chargée positivement
- pH = pI : protéine non chargée
- pH > pI : protéine chargée négativement
L’application d’un courant entre les électrodes va entraîner la migration des protéines
sur un gradient de pH jusqu’à atteindre leur pI. La résolution de la séparation des protéines
dépend du type de gradient de pH et du courant appliqué. Les meilleures résultats de
séparation de mélanges de protéines sont obtenus en conditions dénaturantes (les agents
dénaturants évitent l’agrégation des protéines et limitent les interactions hydrophobes).
- Le mode opératoire :
Un volume de l’extrait protéique correspondant à 150 µg de protéines est déposé dans
un tube Eppendorf. Le volume est ensuite supplémenté de 380 µL de tampon de réhydratation
préalablement mélangé à de l’IPG Buffer pH 3-10 (immobilized pH gradient, Amersham
Biosciences) (50 µL dans 5 mL de tampon de réhydratation) et à une pointe d’Orange G
(Sigma). L’IPG Buffer est un mélange d’ampholytes améliorant la séparation des protéines et
produisant également une conduction uniforme le long du gradient de pH. L’Orange G est un
témoin coloré permettant de visualiser le chargement de l’extrait protéique sur le gel.
Le mélange est ensuite homogénéisé sur vortex puis déposé sur une cassette de
réhydratation (Immobiline® Drystrip Reswelling Tray, Amersham Biosciences). Une
bandelette de gel à gradient de pH est alors déposée sur les échantillons. Un gel à gradient de
pH non linéaire compris entre 3 et 10 a été choisi compte tenu de la complexité de
l’échantillon pour augmenter la résolution entre les pH 5 et 7 (Immobiline™ Drystrip pH 310, 18 cm, Amersham Biosciences). Le tout est ensuite recouvert par 2 mL de cover fluid
(PlusOne® Drystrip cover fluid, Amersham Biosciences) et recouvert d’une plaque de
protection. L’extrait protéique est alors chargé sur les bandelettes de gel par adsorption lors de
la réhydratation de ceux-ci pendant une nuit.
Après réhydratation, les gels sont récupérés et installés sur la plaque "Immobiline
Drystrip Tray" (Amersham Biosciences) elle-même positionnée sur le Multiphor II
(Pharmacia Biotech). Des électrodes sont placées perpendiculairement aux gels à chaque
101
extrémité de ceux-ci (en contact) pour conduire le courant (des bandelettes de papier
humidifiées sont placées entre les gels et les électrodes) et les gels sont recouverts de cover
fluid pour limiter l’évaporation et la cristallisation de l’urée. Les gels sont alors soumis à un
programme caractérisé par un gradient croissant de voltage débutant par un voltage
relativement faible pour éviter l’agrégation de l’échantillon :
Phase 1 : de 0 à 500 V, 1 mA, 5 W pendant 1 minute
Phase 2 : 500 V, 1 mA, 5 W pendant 5 heures
Phase 3 : de 500 à 3500 V, 1 mA, 5 W pendant 5 heures
Phase 4 : 3500 V, 1 mA, 5 W pendant 9 heure 30
Le pI d’une protéine étant dépendant de la température, l’IEF est réalisée à une
température constante de 20°C (MultiTemp III, Pharmacia Biotech). Après l’IEF, les gels sont
récupérés et soumis à deux bains successifs dans un tampon de rééquilibration (Tableau 2.11.)
composé de tampon Tris à 10 mM pH 6,8, d’urée à 6 M, de sodium dodécyl-sulfate (SDS) à
1% et de glycérol à 26 % : un premier bain de 12 minutes dans le tampon de rééquilibration
supplémenté de DTT (250 mg/50 mL de tampon) suivi d’un second bain de 5 minutes dans le
tampon de rééquilibration supplémenté de iodoacétamide (2,25 g/50 mL de tampon). Cette
étape permet de saturer les gels en SDS nécessaire à la seconde électrophorèse.
Tableau 2.11. : Composition du tampon de rééquilibration
Composés
Fournisseur
Tris
Ajustement du pH des gels
Urée
PlusOne® Tris (99,5 %)
Augmente la viscosité du tampon
Améliore le transfert des protéines des gels de la
première dimension vers les gels de la seconde
dimension, en addition avec le glycérol
Glycérol
PlusOne® Tris (86-88 %)
Améliore le transfert des protéines des gels de la
première dimension vers les gels de la seconde
dimension, en addition avec l’urée
SDS
Acros Organics (98%)
Agent dénaturant les protéines
Forme des complexes SDS-protéines chargés
négativement
DTT
Sigma Aldrich (99 %,
electrophoresis reagent)
Agent réducteur (permet de casser les ponts
disulfures des protéines)
iodoacétamide
Sigma Aldrich
Agent protecteur contre la réoxydation des
protéines
102
VI.2.b. Séparation par électrophorèse sur gel SDS-Page
- Le principe
Le SDS Page est une technique d’électrophorèse permettant de séparer les protéines en
fonction de leur poids moléculaire en réponse à un courant électrique. Le sodium dodécyl
sulfate (SDS) est un détergent anionique qui dénature les protéines en formant un complexe
SDS-protéine (1,4 g de SDS/ g de protéine) ce qui confère aux protéines une charge globale
nette par unité de masse constante et négative. La migration sur gels de polyacrylamide, en
présence de SDS additionné à la présence d’agents réducteurs (DTT), dépend donc
essentiellement du poids moléculaire des protéines selon une relation approximativement
linéaire entre le logarithme du poids moléculaire de la protéine et la distance relative
parcourue sur le gel.
- Le mode opératoire
Les gels de polyacrylamide (Tableau 2.12.) sont coulés dans une cassette de
polymérisation (PROTEAN® plus Multi-casting Chamber, Bio-Rad) et la surface des gels est
lissée par ajout de 1 mL de Bleu de Bromophénol dans l’éthanol (cet indicateur coloré permet
de suivre le front de migration lors de la deuxième électrophorèse). Une fois polymérisés, les
gels sont récupérés, les strips rééquilibrés sont positionnés à la surface de ceux-ci et sont
scellés en les recouvrant d’agarose liquide (un marqueur de poids moléculaire est ajouté sur
un gel pour chaque série de douze gels).
Tableau 2.12. : Composition des gels de polyacrylamide
Composés
Fournisseur
Tris
Ajustement du pH des gels
Acrylamide
Ultrapure Protogel (30% Acrylamide,
0,8% Bis-acrylamide) National
Diagnostic, Hessle Hull, England
Forme des polymères
(polyacrylamide) en présence de
radicaux libres
SDS
Acros Organics (98%)
Agent dénaturant les protéines
Forme des complexes SDS-protéines
chargés négativement
APS
(persulfate
d’ammonium)
Ultrapure, ACS reagent grade
USB Corporation, Cleveland,OH, USA
Source de radicaux libres initiant la
polymérisation de l’acrylamide
Temed
Sigma Aldrich
Catalyse la décomposition des ions
persulfate
103
Les gels sont alors positionnés dans la cuve d’électrophorèse (Dodeca™ Cell,
PROTEAN® plus, Bio-Rad) contenant un tampon TGS 10× (Tris/glycine/SDS, Bio-Rad
Laboratories) dilué 10 fois, et la séparation des protéines dans la deuxième dimension, sous
l’action d’un champ électrique, est lancée suivant le programme suivant :
- 600 mA pendant 15 minutes (ampérage constant)
- 1 A pendant 15 minutes (ampérage constant)
- 200 V pendant 6 heures (voltage constant)
Pour améliorer la reproductibilité entre gels, la migration est réalisée à température
contrôlée (15°C) à l’aide d’un système d’eau circulante (Minichiller, Huber). Une fois
l’électrophorèse terminée, les gels sont récupérés et sont révélés par différentes techniques de
coloration.
VI.3. Révélation des protéines
La visualisation de la séparation des protéines de l’extrait préparé se fait par des
techniques de coloration qui doivent satisfaire différents critères :
- une sensibilité importante
- une linéarité importante de la réponse pour une bonne quantification
- une bonne reproductibilité
- une bonne compatibilité avec les techniques de spectrométrie de masse pour
l’identification des protéines
Plusieurs techniques de coloration sont disponible et présentent chacune des avantages
et des inconvénients. Dans notre étude, deux types de révélation ont été utilisées : révélation
au nitrate d’argent et révélation au bleu colloïdal. La différence de sensibilité des deux
techniques de coloration est présentée par la Figure 2.12.
104
b
a
Figure 2.12. : Comparaison des deux techniques de coloration (a. coloration au bleu colloïdal
et b. coloration au nitrate d’argent) pour un même échantillon
- Révélation par coloration au nitrate d’argent
La révélation au nitrate d’argent est la méthode la plus sensible permettant de
visualiser les protéines les plus faiblement exprimées (jusqu’à 0,1 ng). Cette technique
présente une bonne linéarité de réponse et est assez reproductible. Cependant, elle présente
deux principaux inconvénients : elle n’est pas toujours compatible avec la spectrométrie de
masse (due à la présence de glutaraldéhyde) et elle est longue.
Le mode opératoire utilisé pour révéler les gels au nitrate d’argent est le suivant :
- Fixation des protéines en incubant les gels dans un mélange éthanol /acide acétique/
eau distillée pendant 1 nuit
- Sensibilisation des gels en présence de thiosulfate et de glutaraldéhyde (Sigma)
- Rinçages à l’eau distillée
- Coloration des gels au nitrate d’argent (99 %, Sigma) pendant 40 minutes (en
présence de formaldéhyde (Sigma))
- Révélation/développement des protéines par une solution de carbonate de sodium
(Sigma)
- Arrêt du développement en incubant les gels dans une solution d’EDTA
- Rinçages à l’eau distillée.
105
- Révélation par coloration au bleu colloïdal
Cette technique présente une bonne linéarité de réponse, est très reproductible, mais
est peu sensible (jusqu’à 50 ng). Par ailleurs, cette coloration est compatible avec les
techniques de spectrométrie de masse utilisées pour le séquençage et l’identification des
protéines. Le mode opératoire utilisé pour révéler les gels au bleu colloïdal est le suivant :
- Fixation des protéines en incubant les gels dans un mélange éthanol/ acide
phosphorique/ eau distillée
- Equilibration des gels en incubant dans une solution de méthanol/ acide
phosphorique/ sulfate d’ammonium/ eau distillée
- Révélation des protéines en rajoutant du Bleu Colloïdal G250 (Sigma) dans la
solution précédente
VI.4. Analyse des gels et sélection des protéines d’intérêts
La première étape consiste à numériser les gels obtenus à l’aide d’un scanner
(ImageScanner, Amersham Pharmacia Biotech) équipé d’un pilote informatique permettant la
calibration et l’acquisition de l’image (ImageMaster Labscan v2003.01, Amersham
Biosciences). Puis les images obtenues sont traitées à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images
(Melanie, ImageMaster ™ 2D Platinium v5.0, Amersham Biosciences) permettant de détecter
toutes les protéines présentes, d’éliminer le bruit de fond (Figure 2.13.), de quantifier
l’intensité des spots et de comparer les différentes séries de gels pour mettre en évidence des
variations d’expression protéique d’une condition à l’autre. Pour chaque condition, six gels
ont été réalisés. Pour être prise en compte, chaque protéine devait être présente sur au
minimum 3 des 6 gels pour pouvoir observer des niveaux d’expression significativement
différents entre les différentes conditions. Ces différences d’expression entre les copépodes
exposés et les non exposés ont été déterminées par le test non paramétrique de Mann-Whitney
(p<0,05).
106
Figure 2.13. : Interface utilisateur du logiciel d’analyse d’image Melanie (Amersham
Biosciences)
VI.5. Identification et séquençage des protéines
- Excision et préparations des protéines
Les spots protéiques d’intérêt ont été excisés sur les gels de polyacrylamide à l’aide
d’un automate découpeur de spots (ProXcision, Perkin Elmer). Par la suite, les étapes de
biochimie sont réalisées à l’aide du robot Multiprobe II. Chaque morceau de gel est lavé avec
100 µL de tampon NH4HCO3 (25 mM) et déshydraté avec de l’acétonitrile. Cette opération
est répétée 2 fois. Quand cela n’a pas été réalisé précédemment, la réduction des cystéines est
accomplie par traitement pendant 1h dans le dithiothréitol à température ambiante. Pour
alkyler les cystéines ainsi réduites, il est alors ajouté une solution 25 mM d’iodoacétamide
pendant 45 min à température ambiante dans le noir. Des lavages répétés sont alors
nécessaires pour éliminer ces réactifs en excès. Les pièces de gel sont alors complètement
déshydratées au speedvac avant l’étape de digestion enzymatique à la trypsine. Typiquement,
pour la digestion, 10 µL de trypsine (15 ng/µL dans 25 mM NH4HCO3) sont ajoutés au
morceau de gel déshydraté et le clivage est réalisé pendant la nuit à 37 °C. Le surnageant est
107
récupéré et transféré dans une plaque 96 puits. Des étapes d’extraction des peptides sont alors
effectuées en ajoutant 30 µL de solution de TFA à 0,1 % (v/v), puis 30 µL d’acétonitrile.
Cette étape est répétée 2 fois et les surnageants sont combinés. Le volume de cet extrait
peptidique est alors réduit à quelques µL par passage au speedvac.
- Méthode d’analyse
Ces digestats sont alors analysés par nanochromatographie liquide couplée à la
spectrométrie de masse en tamdem. Les extraits peptidiques sont resuspendus dans 10 µL
d’une solution aqueuse à 5 % en acétonitrile et 0,2 % en acide formique. Cinq µL de chaque
échantillon sont injectés sur un système nanoLC Ultimate (Dionex-LCPackings). Les peptides
sont concentrés et dessalés sur une colonne de préconcentration à un débit de 30 µL/min
pendant 3 min avec une solution à 2 % d’acétonitrile. Puis, à l’aide d’un basculement de
vanne, ces peptides sont envoyés sur une colonne phase inverse C18 (75 µm ID x 15 cm) pour
la séparation. Un gradient linéaire de 45 min partant de 95 % de A (2 % d’acétonitrile dans
0,1 % d’acide formique) à 50 % de B (95 % d’acétonitrile dans 0,2 % d’acide formique) est
alors appliqué avec un débit de 200 nL/min. L’éluant est analysé sur un système Q-Trap
(Applied Biosystems) équipé d’une source nanospray. Les ions entrant dans le système sont
continuellement analysés et lorsqu’un peptide est détecté, le spectromètre de masse passe en
mode MS/MS et fragmente le peptide de façon automatisée. Les énergies de collision sont
établies à l’aide des profils de reconnaissance de l’état de charge (en général +2 et +3) et
optimisées en fonction de la gamme de masse de l’ion précurseur. Les données de masses sont
collectées à l’aide du logiciel Analyst 1.4.1.
- Identification des protéines
Pour l’identification des protéines, plusieurs méthodes ont été utilisées. La première et
la plus classique consiste en l’extraction des listes de pics de masse à partir des spectres de
fragmentation qui sont comparées à des données théoriques provenant de la digestion in silico
de banques de séquences protéiques à l’aide de l’outil MASCOT disponible sur le web. Cet
outil est utilisable lorsque les séquences sont parfaitement conservées. Dès qu’il y a une
substitution dans la chaîne peptidique, le logiciel n’est plus en mesure de retrouver la protéine
candidate. Dans ces cas où la divergence de séquence est assez marquée, il faut recourir à
l’utilisation de méthodes de séquençage dites « de novo ». Il est nécessaire d’établir les
108
séquences de façon plus ou moins automatisée et de faire une requête sur des outils de type
MSBLAST. Cet outil basé sur la comparaison de séquence peut être tolérant aux substitutions
selon les critères de recherche que l’on va fixer. Dans le cas présent avec un organisme dont
le génome ne figure pas dans les bases de données, cette seconde possibilité a été beaucoup
plus fructueuse.
VII. Etude du comportement natatoire du copépode E. affinis en tant que biomarqueur
d’exposition à des contaminants organiques
VII.1. Le principe
L’analyse du comportement natatoire du copépode E. affinis repose sur des techniques
de capture des mouvements du copépode par une caméra. Ce procédé qualifié de "video
tracking" permet, à l’aide d’un algorithme qui analyse les images de la vidéo, de transformer
ces images en repère mathématique bi-dimensionnel et d’associer à chaque pixel des
coordonnées géométriques. L’analyse numérique de ces coordonnées permet de travailler
directement sur différents paramètres caractérisant le comportement natatoire des copépodes.
En effet, les copépodes présentent des trajectoires structurées par des alternances
désordonnées de mouvements successifs rapides et lents d’amplitudes très intermittentes et
dans toutes les directions. Dans notre étude, deux types de paramètres caractérisant le
comportement natatoire des copépodes, la vitesse de nage et la trajectoire ont été étudiés.
VII.2. Mode opératoire
Les films sont réalisés à l’aide d’une caméra CCD infra rouge (Sony), dans une pièce
calfeutrée entièrement à l’obscurité. Les flacons contenant les copépodes (250 mL) sont
positionnés sur un faisceau de diodes émettant des infra-rouges, à l’intérieur d’une enceinte
hermétique à la lumière pour éviter toute altération du comportement natatoire des copépodes
par phototropisme induit par la présence d’une lumière artificielle.
Pour l’analyse du comportement natatoire, 15 mâles et 15 femelles sont triés. Dix de
ces mâles sont ensuite transférés dans un flacon en plastique contenant 217 mL d’eau et 10
femelles sont transférées dans un autre flacon. Les copépodes sont d’abord acclimatés à
l’obscurité, dans les flasques, pendant 30 minutes, puis l’enregistrement vidéo débute.
109
La réponse comportementale des copépodes suite à l’injection d’une solution
d’alkylphénols (NP et NP1EC) dans le milieu a été analysée. Pour cela, les copépodes ont été
filmés pendant 40 minutes (la moitié du film), puis 15 µL de la solution d’alkylphénols
(NP1EC : 15 µl.mL-1, 4-NP : 15 µl.mL-1 dans l’acétone) ont été injectés dans le milieu à
l’aide d’une micropipette en évitant de provoquer la moindre turbulence. La réponse
comportementale des copépodes a été enregistrée pendant 40 minutes à partir de l’injection.
Ces expériences ont été réalisées sur des mâles seuls, puis sur des femelles seules (en
triplicata pour chaque condition). En parallèle, des contrôles ont également été réalisés en
enregistrant la réponse comportementale des copépodes suite à une injection de 15 µL
d’acétone (pour les mâles seuls et les femelles seules).
Une fois les enregistrements terminés, les films sont transférés sur ordinateur où ils
sont transformés en une séquence d’images au format Bitmap elles même converties au
format JPEG à l’aide du logiciel Adobe Premier 6 LE. Puis les images sont analysées à l’aide
du logiciel TrackIt! v2.0 fourni par le Professeur Rudi Strickler (Figure 2.14.). Les
coordonnées des trajectoires visualisées et sélectionnées à l’aide de ce logiciel sont alors
enregistrées sous format CSV.
Figure 2.14. : Interface du logiciel permettant d’analyser les images
110
VII.3. Etude de la vitesse de nage
A partir de l’analyse d’images et de la calibration du logiciel (transformation des
pixels en données métriques), chaque déplacement du copépode est converti en coordonnées
bi-dimensionnelles (Xi, Yi) permettant ainsi de calculer des distances puis des vitesses de
déplacement (en mm.s-1) en ramenant au nombre d’images par seconde (25). La vitesse de
déplacement du copépode est calculée suivant la formule suivante :
√[(X(i+n)-Xi)2 + (Y(i+1)-Yi)2 ]
× nombre d’images/seconde
Z
Avec
X(i+n) et Y(i+n) sont les coordonnées du point d’arrivée
Xi et Yi sont les coordonnées du points de départ
n est le nombre d’images entre deux mouvements (n ≥ 1)
Z correspond à la conversion des pixels en données métriques
Figure 2.15. : Schéma du déplacement d’un copépode dans l’espace
Pour simplifier l’analyse des données de vitesse de déplacement, 3 états ont été définis
pour les copépodes en fonction de leur vitesse de déplacement : immobilité (vitesse nulle de 0
mm.s-1), vitesse moyenne (≤ 10 mm.s-1) et vitesse rapide (> 10 mm.s-1). Dans notre étude, les
profils de distribution des fréquences des vitesses de déplacement ont été étudiés entre les
contrôles et les individus exposés. De plus, les différences de déplacement entre individus de
sexe opposé ont également été étudiées.
111
VII.4. Etude de la trajectoire
L’étude de la trajectoire des copépodes est basée sur l’analyse de la direction et du
sens du déplacement des copépodes par la mesure des angles formés entre chaque
déplacement (Figure 2.15.). En effet, de multiples possibilités s’offrent à un copépode en
mouvement dans son milieu : soit il garde la même direction (dans le même sens vers l’avant
ou dans le sens contraire vers l’arrière) soit il change de direction (vers l’avant ou vers
l’arrière). Dans le cadre de notre étude, les déplacements des copépodes peuvent être
simplifiés en 5 trajectoires possibles (Figure 2.16.) :
- Déplacement dans la même direction et le même sens ( γ = 180°)
- Déplacements dans le même sens et dans une autre direction (90° < γ < 180°)
- Déplacement dans la même direction mais dans le sens contraire (γ = 0°)
- Déplacement dans le sens contraire et dans une autre direction (0° < γ < 90°)
- Déplacement vers la droite ou vers la gauche (γ = 90)
Figure 2.16. : Schématisation des trajectoires d’un copépode
La valeur de ces angles est calculée à partir du théorème d’Al Kashi :
c2 = a2 + b2 – 2abcosγ
d’où γ = arcos [(a2 + b2 – c2)/2ab]
112
Dans cette étude, les profils de distribution des fréquences des angles formés entre
chaque déplacement ont été étudiés pour les contrôles et pour les copépodes exposés. De plus,
les différences de trajectoires entre individus de sexe opposé ont également été étudiées.
113
114
Chapitre 3 : Synthèse des travaux
Chapitre 3
Synthèse des travaux
Ce chapitre présente l’ensemble des résultats obtenus au cours des travaux présentés
dans le paragraphe précédent. La plupart de ces résultats ont été intégrés dans des articles qui
sont, à l’heure actuel, acceptés ou soumis dans différentes revues internationales. Ces articles
sont par ailleurs présentés en annexes.
115
116
Dans ce chapitre, les principaux résultats sont présentés sous forme synthétique. Cette
thèse s’est articulée en trois parties, le premier objectif était d’établir un état des lieux de la
contamination en estuaire de Seine pour sélectionner certains contaminants organiques. Ces
contaminants ont été choisis en fonction de leurs propriétés physico-chimiques (rémanence,
faible (bio)dégradation dans l’environnement, hydrophobicité importante), de leur toxicité et
de leur utilisation importante dans l’industrie, l’agriculture ou lors des usages domestiques.
Les processus régissant les variations de concentration de ces contaminants ont été étudiés à
une double échelle de temps (à l’échelle des cycles saisonniers et à l’échelle d’un cycle de
marées). Dans un deuxième temps, les transferts des contaminants organiques les plus
représentatifs de la contamination en estuaire de Seine, ont été analysés expérimentalement
par des expositions en flux continu depuis la phase dissoute vers Eurytemora affinis. Les
capacités de ces copépodes à éliminer ces contaminants accumulés ont également été suivies
en parallèle. Enfin, la dernière partie de ces travaux a été consacrée à l’étude et à la recherche
de nouveaux biomarqueurs d’exposition à des stress chimiques chez E. affinis. Pour cela, les
effets de ces contaminants sur ce copépode ont été étudiés à différents niveaux d’organisation
biologique (physiologique, biochimique et comportemental).
Dans un premier temps, une étude in situ a été menée dans la zone oligohaline de
l’estuaire, à Tancarville pour analyser et comprendre les cycles biogéochimiques des
contaminants organiques choisis à l’échelle des saisons. Ces travaux ont fait l’objet de deux
publications acceptées dans Chemosphere (publications n°1 et 2) et d’une note.
Puis, les cycles biogéochimiques de ces substances ont été étudiés à une échelle de
temps plus réduite (cycle de marée). Les variations des paramètres physico-chimiques
observées lors d’un cycle de marée (température et salinité notamment) peuvent conditionner
la biodisponibilité de ces contaminants et donc leur toxicité. En parallèle, les effets de ces
variations de température et de salinité ont été mesurés expérimentalement chez Eurytemora
affinis sur l’expression de deux activités enzymatiques, classiquement utilisées en tant que
biomarqueurs d’exposition, l’acétylcholinestérase (AChE) et la glutathion-S-transférase
(GST). Ces travaux ont fait l’objet de deux publications, l’une soumise (publication n°3) et
l’autre acceptée dans Comparative Biochemistry and Physiology (publication n°4).
Par la suite, des études expérimentales ont été développées pour évaluer la capacité de
Eurytemora affinis à bioconcentrer et à éliminer des contaminants organiques. Pour cela, des
expériences en flux continu à des concentrations caractéristiques de la contamination en
117
estuaire de Seine ont été menées. Ces travaux ont fait l’objet de deux publications soumises
(publications n°5 et 6).
Enfin, la troisième étape s’est concentrée sur la recherche de nouveaux biomarqueurs
d’exposition chez Eurytemora affinis. Des techniques d’électrophorèse bidimensionnelle
couplée à des techniques de chimie analytique ont été utilisées pour analyser les effets
d’exposition des copépodes en flux continu à différentes classes de contaminants organiques
sur l’expression de leur protéome. L’utilisation de ces techniques permet en effet d’avoir une
vision générale des processus physiologiques et des cascades de réactions biochimiques mis
en jeu par un organisme soumis à différents types de stress. Par ailleurs, des techniques
cinématographiques associées à des techniques d’analyse d’images ont également été utilisées
dans le but d’étudier la réponse comportementale de E. affinis suite à des injections de
contaminants organiques dans leur milieu. Ces travaux font l’objet de deux publications, l’une
soumise (publication n°7) et l’autre en préparation (publication n° 8).
I. Etude in situ des cycles biogéochimiques d’une sélection de contaminants organiques
présents en estuaire de Seine :
La contamination de la colonne d’eau de l’estuaire de Seine (phase dissoute et phase
particulaire) et du compartiment biologique (Eurytemora affinis) a été étudiée au cours d’un
suivi in situ réalisé dans la zone oligohaline de l’estuaire de Seine (port de Tancarville) de
novembre 2002 à février 2005. Les différentes campagnes de prélèvements sont détaillées
dans le Tableau 3.1.
Tableau 3.1 : Détails des différentes campagnes de prélèvement (paramètres physico-chimiques)
Lors de ces campagnes, des échantillons d’eau et de copépodes ont été prélevés pour
analyser leurs teneurs en PCB, HAP et alkylphénols polyéthoxylés.
118
I.1. Cycle biogéochimique des PCB et des HAP en estuaire de Seine (publication n°1)
Les résultats obtenus au cours de cette étude montrent une contamination importante
de l’estuaire de Seine aussi bien en PCB qu’en HAP. Bien que ces contaminants aient été
détectés à la fois dans la phase dissoute (de 2 à 21 ng.L-1 pour les PCB, de 3 à 24 ng.L-1 pour
les HAP) et dans la phase particulaire (de 58 à 463 ng.g-1 pour les PCB, de 499 à 5819 ng.g-1
pour les HAP) de la colonne d’eau, la phase particulaire représente le principal réceptacle
pour ces contaminants (de 81 à 99 % de la contamination en HAP et de 47 à 89 % de la
contamination en PCB). Ces niveaux de concentrations sont caractéristiques d’un milieu
urbain très industrialisé et sont à titre indicatif dix fois supérieures aux concentrations
mesurées dans la Chesapeake bay (Gustafson et Dickhut, 1997) ou dans les eaux côtières de
Singapour (Wurl et Obbard, 2006). Des variations saisonnières de la contamination en PCB et
en HAP ont également pu être observées en estuaire de Seine, essentiellement pour le
compartiment particulaire. Ainsi, des augmentations de la teneur en PCB et HAP particulaires
ont pu être mesurées pour toutes les périodes hivernales correspondant à des périodes de crues
(Figure 3.1), accompagnées d’une remise en suspension importante du sédiment et d’un
apport particulaire du à des phénomènes d’érosion.
En se basant sur les seuils de toxicité définis par Long et al. (1995) pour les PCB et
HAP particulaires, les teneurs en HAP particulaires mesurées en période hivernale sont
fortement susceptibles d’occasionner des effets nocifs sur les organismes aquatiques. Suivant
les mêmes critères, les teneurs en PCB particulaires en estuaire de Seine sont susceptibles
d’occasionner des effets nocifs sur les organismes aquatiques pendant toute l’année (excepté
pour les dates suivantes : 27/11/02, 22/04/03, 20/05/03, 06/10/03).
Par ailleurs, des teneurs élevées en PCB et en HAP ont été mesurées chez Eurytemora
affinis (de 383 à 1785 ng.g-1 pour les PCB et de 165 à 3866 ng.g-1 pour les HAP). Des pics de
contaminations aussi bien en HAP que en PCB sont observés chez E. affinis pendant les
périodes hivernales. Ces teneurs particulièrement élevées en PCB et HAP caractérisent une
capacité importante de cette espèce à bioconcentrer ces classes de contaminants (facteur de
bioconcentration de 13 300 à 91 300 pour les PCB et de 960 à 17 200 pour les HAP). Les
concentrations en PCB et HAP mesurées chez ce copépode en estuaire de Seine sont bien
supérieures aux teneurs habituellement mentionnées pour ces contaminants chez les espèces
du microzooplancton (Harding et al., 1997; Abdel-Moati et al., 2001; Peters et al., 2001).
119
Figure 3.1 : Variations saisonnières de la concentration total (moyennes ± écart-type, n=3) en (a)
HAP parents et en (b) PCB, dans la phase dissoute (ng.L-1) a.1&b.1, dans la matière en suspension
(ng.g-1) a.2 &b.2 et chez E. affinis (ng.g-1) a.3&b.3. [Somme des HAP (ΣHAP): Phe, An, 1, 2, 3 et 9
méthylphénanthrène, 2 méthylanthracène, Fluo, Pyr, BaA, Triph + Chrys, (B[b+j+k]F), BaP, BeP, Per,
IP, DaA+DaC and BP. Somme des PCB (ΣPCB): congénères 8, 18, 29, 50+28, 52, 104, 44, 66, 101,
87, 154+77, 118, 188, 153, 105, 138, 126, 187, 128, 200, 180, 170, 195, 206 et 209]. (Les dates sont
indiquées par des chiffres correspondant aux campagnes d’échantillonnage mentionnées dans le
Tableau 3.1). Les pointillés indiquent la concentration moyenne calculée dans chaque matrice analysée
pour l’ensemble du suivi.
La composition de chaque pool d’organismes a été analysée (pourcentage relatif des
différents stades de développement, sex-ratio). Les résultats obtenus ont révélés un
pourcentage d’adultes plus élevé dans les échantillons d’hiver. D’autres auteurs ont montré
que l’espérance de vie des copépodes augmentait quand la température du milieu diminuait
120
(Devreker et al., 2005). Par ailleurs, une analyse en composantes principales a permis de
mettre en évidence une corrélation entre les pics de contamination en PCB et HAP mesurés en
périodes hivernales chez E. affinis et la contribution des copépodes adultes dans la
composition des échantillons analysés (respectivement corrélation de 0,89 pour les HAP et de
0,82 pour les PCB) (Figure 3.2). Les pics de contamination hivernaux sont dus à une
augmentation du temps d’exposition des copépodes, liée à l’allongement de leur espérance de
vie en période hivernale (diminution de la température de l’eau).
Figure 3.2 : Résultats de l’analyse en composantes principales de la teneur en (a) HAP et en (b) PCB
accumulés par E. affinis en fonction de la contamination du milieu (PAH et PCB adsorbés) et des
paramètres environnementaux (température, débit, turbidité et pourcentage d’adultes dans
l’échantillon). Le groupe I représente les périodes hivernales et le groupe II les autres saisons. (1, 2:
27/11/02; 3: 19/01/03; 4, 5, 6: 01/04/03; 7, 8, 9: 20/04/03; 10: 01/07/03; 11, 12: 06/10/03; 13:
19/01/04; 14, 15: 06/02/05).
Les profils de distribution des différents congénères de PCB et HAP, dans la phase
dissoute, dans la phase particulaire et chez E. affinis sont présentés dans les Figures 3.3 et 3.4.
Ces résultats indiquent des concentrations importantes en contaminants de haut poids
moléculaire adsorbés sur les MES et une prédominance des composés de plus bas poids
moléculaire dans la phase dissoute. L’analyse d’indices moléculaire tels que le rapport
121
phénanthrène/anthracène et le rapport fluoranthène/pyrène (Budzinski et al., 1997) permet
d’identifier une origine majoritairement pyrolytique pour les HAP adsorbés sur les MES et
dans la phase dissoute, une origine mixte des HAP (pétrogénique/pyrolytique) est retenue.
Figure 3.3 : Empreintes de contamination moyenne (moyenne ± écart-type, n= nombre de campagnes
de prélèvement) par les HAP (a) observées dans la phase dissoute (PD), dans les MES et chez
Eurytemora affinis (EA). Les HAP sont présentés en fonction de leur poids moléculaire croissant. Les
rapports moléculaires Phe/An versus Fluo/Pyr (b) sont des indices caractéristiques de l’origine des
HAP dans la phase dissoute et dans la phase particulaire (Budzinki et al., 1997).
Cette étude montre que les HAP majoritairement présents dans la colonne d’eau de
l’estuaire de Seine sont les composés à 4 cycles (pyr, triph/chrys et B[b]F/B[k]F/B[j]F). Ces
HAP à 4 cycles sont également les plus accumulés par E. affinis. Dans cette étude, les HAP
cancérigènes (BaA, B[b]F/B[k]F/B[j]F, BaP, DaA et IP, selon l’IARC 2003) représentent
entre 31 et 41 % de la contamination de la colonne d’eau par les HAP et entre 17 et 46 % de
la contamination des copépodes par les HAP. De plus, l’analyse des profils de distribution des
différents congénères de HAP indique des différences entre les différents compartiments
étudiés. Ces résultats suggèrent que les transferts de HAP de la colonne d’eau vers E. affinis
sont gouvernés par des mécanismes complexes et non simplement par adsorption ou par
transfert passif. Ces résultats suggèrent également une capacité à métaboliser les HAP chez
les copépodes, comme indiqué par Harris et al. (1977) et Lotufo (1998).
Pour les PCB, l’empreinte de la contamination dans la phase dissoute est dominée
essentiellement par des pentachlorobiphényles. Dans la phase particulaire, l’empreinte de
contamination est dominée par des penta- et des hexachlorobiphényles. Les profils de
122
distribution des PCB dans la colonne d’eau de l’estuaire de Seine sont représentatifs d’une
contamination au pyralène, le mélange commercial français de PCB.
Figure 3.4 : Empreintes de contamination moyenne (moyenne ± écart-type, n= nombre de campagnes
de prélèvement) par les PCB (a) observées dans la phase dissoute (PD), dans les MES et chez
Eurytemora affinis (EA). Les PCB sont présentés en fonction de leur poids moléculaire croissant. La
Fig. b représente l’abondance relative moyenne des principaux PCB (CBi) versus PCB 153 qui est le
congénère le moins métabolisé (Kannan et al., 1995b), dans la colonne d’eau (CE) et chez les
copépodes.
Les empreintes de la contamination par les PCB chez E. affinis, bien qu’également
dominées par les penta- et les hexachlorobiphényles, présentent des différences par rapport à
celles observées dans l’eau et les particules. Ces différences peuvent s’expliquer par une
accumulation spécifique de certains congénères ou par une la métabolisation préférentielle
d’autres PCB. Ces hypothèses sont confirmées quand chaque congénère est exprimé par
rapport au PCB 153 (ratio CBi/CB153), le congénère le moins métabolisable (Kannan et al.,
1995). En effet, les PCB de plus faible poids moléculaire présentent un ratio quasiment deux
fois plus faible chez E. affinis en comparaison avec celui calculé pour la colonne d’eau,
excepté pour le PCB 101. Les PCB de haut poids moléculaire présentent des ratios similaires
à ceux calculés pour la colonne d’eau. Ces résultats sont en accord avec ceux décrits par
Goerke et Weber (2001) qui ont rapportés une élimination sélective des différents congénères
de PCB, variable d’une espèce à l’autre, avec notamment une capacité plus importante chez
les crustacés décapodes à oxyder les PCB possédant moins de 6 atomes de chlore substitués.
123
I.2. Cycle biogéochimique des alkylphénols polyéthoxylés en estuaire de Seine (publication2)
La présence d’alkylphénols (APs) et d’alkylphénols polyéthoxylés (APEs) a été
recherchée en estuaire de Seine. Cette étude a été réalisée dans la zone oligohaline de
l’estuaire (port de Tancarville) de novembre 2002 à janvier 2004. Les différentes campagnes
de prélèvements sont détaillées dans le Tableau 3.1. Les résultats obtenus indiquent une
contamination importante de la phase dissoute de l’estuaire de Seine par les APs et les APEs,
avec une contamination totale comprise entre 399 et 2214 ng.L-1 (Figure 3.5). De légères
variations saisonnières ont été observées, avec en hiver et en été des concentrations plus
élevées et des concentrations plus faibles au printemps et en automne.
Figure 3.5 : Variations saisonnières de la concentration totale en alkylphénols polyéthoxylés
(moyenne ± écart-type, n=3) et profils de distribution des différents composés dans la phase dissoute
(ng.L-1). La Figure b présente différents rapports moléculaires caractéristiques des voies de
métabolisation dans la phase dissoute. (Les dates sont indiquées par des chiffres correspondant aux
campagnes d’échantillonnage mentionnées dans le Tableau 3.1).
Ces différences peuvent s’expliquer par des variations saisonnières de l’activité
bactérienne (Jonkers et al., 2005) mais également par des variations de l’efficacité du
124
traitement des eaux par la station d’épuration de Tancarville. De plus, les pics de production
biologique en estuaire de Seine sont liés aux variations de température et sont donc observés
au printemps et en automne. Les variations saisonnières de la concentration en APs et APEs
sont similaires à celles observées pour les PCB et les HAP ce qui peut suggérer l’implication
de processus physiques liés à l’hydrodynamisme (dilution, adsorption/désorption…) dans ces
variations.
Sur les cinq composés analysés, le 4-NP (de 15 à 386 ng.L-1)), le NP1EC (de 259 à
1455 ng.L-1), le NP1EO (de 41 à 149 ng.L-1) et le NP2EO (de 33 à 224 ng.L-1) ont été détectés
dans la phase dissoute lors de chaque campagne de prélèvement alors que le NP2EC n’a été
détecté qu’à trois reprises (Figure 3.5). Le composé majoritaire dans la phase dissoute est le
NP1EC qui représente toujours plus de 60 % de la contamination totale dans ce compartiment
de la colonne d’eau. Des concentrations du même ordre de grandeur que celles mesurées en
estuaire de Seine ont été rapportées par Jonkers et al. (2003) dans l’estuaire du Rhin (NPEO :
67-471 ng.L-1; NP : 63-90ng.L-1; 1139-1524 ng.L-1) et l’estuaire de l’Escaut (NPEO : 4911029 ng.L-1; NP : 588-934 ng.L-1; 8607-10879 ng.L-1), pour des gammes de salinité
équivalentes (0,2 à 6 psu). Blackburn et al. (1999) ont mentionnés des niveaux de
contaminations en 4-NP et NPEOs inférieurs à 1 µg.L-1 dans les estuaires Britanniques. Ces
résultats montrent que l’estuaire de Seine n’est pas seulement contaminé par les PCB et les
HAP mais également par les APs et les APEs.
Peu de variations sont observées dans les profils de distribution des différents
composés au cours des saisons, excepté pour les échantillons de juillet et novembre 2003 qui
présentent des concentrations plus faibles en NP1EO et NP2EO et des concentrations plus
élevées en NP1EC. L’utilisation des APs et des APEs est constante, ces variations sont donc
probablement dues à des variations de l’efficacité de la biodégradation de ces composés. Les
APEs sont fortement biodégradables et les voies de dégradation dépendent des paramètres
environnementaux (débit, température, oxygène…). Des indices moléculaires basés sur le
ratio entre les métabolites (APs) et les composés parents (APEs) ont été développés et
permettent d’identifier les processus de biodégradation impliqués dans les eaux de surface
estuariennes (Ferguson et al., 2001; Jonkers et De Voogt, 2003b; Jonkers et al., 2005). Le
ratio NPECs/NPEOs est toujours supérieur à 2 ce qui implique que la voie de dégradation
oxydative des APEs est la voie principale en estuaire de Seine.
Des concentrations élevées ont également été mesurées dans les particules (de 405 à
9636 ng.g-1). Des variations saisonnières des teneurs en APs/APEs ont été observées dans les
125
MES (Figure 3.6), avec des pics de contamination en hiver et des niveaux plus faibles pour les
autres saisons. Des résultats similaires ont été observés pour les PCB et les HAP. Parmi les
cinq composés analysés, le 4-NP (289-7105 ng.g-1), le NP1EC (18-514 ng.g-1), le NP1EO (40692 ng.g-1) et le NP2EO (21-757 ng.g-1) ont été détectés dans les particules en suspension lors
de chaque campagne de prélèvement alors que le NP2EC n’a jamais été détecté.
Contrairement à la phase dissoute, le 4-NP est le composé majoritaire et représente toujours
plus de 60 % de la contamination totale en APs/APEs dans les MES.
Figure 3.6 : Variations saisonnières de la concentration totale en alkylphénols polyéthoxylés
(moyenne ± écart-type, n=2) et profils de distribution des différents composés dans la matière en
suspension (ng.g-1). (Les dates sont indiquées par des chiffres correspondant aux campagnes
d’échantillonnage mentionnées dans le Tableau 3.1).
Des niveaux de contamination similaires ont été rapportés dans les particules de la
baie de la Jamaïque (NP : 4-8 µg.g-1; NP1EO : 2-18 µg.g-1; NP2EO : 1-18 µg.g-1) (Ferguson
et al., 2001), dans l’estuaire du Rhin (NP : 1,5-92 ng.g-1; NP1EO : <1,3-35 ng.g-1; NP2EO :
2,2-32 ng.g-1; NPECs : <0,3-185 ng.g-1) et dans l’estuaire de l’Escaut (NP : <0,4-1080 ng.g-1;
NP1EO : <1,3-17 ng.g-1; NP2EO : 0,3-26 ng.g-1; NPECs : <0,3-239 ng.g-1) (Jonkers et al.,
2003a). Ces résultats confirment que les sédiments de l’estuaire de Seine font parties des
sédiments les plus contaminés au monde pour cette classe de contaminants.
Le calcul d’un ratio entre la concentration d’un contaminant dans le milieu et sa valeur
de PNEC associée (définie à partir de valeurs de DL50 de la littérature) permet d’évaluer le
risque induit par cette substance sur les organismes aquatiques. En se basant sur les valeurs de
PNEC pour le 4-NP, définie par l’EU (2005) (0,33 µg.L-1), et définies par Fenner et al. (2002)
pour le NP1EC, le NP1EO et le NP2EO (2; 0,11; 0,11 µg.L-1), le risque associé à la présence
126
d’APEs et d’APs dans la phase dissoute de l’estuaire de Seine a pu être calculé. Au cours du
suivi effectué entre novembre 2002 et janvier 2004, le ratio entre la concentration en
AP/APEs dissous et leurs valeurs de PNEC respectives était toujours supérieur à 1. Le risque
global imputé aux APs/APEs dissous en estuaire de Seine est donc très important. De même,
à partir de la PNEC sédiment fixée par l’EU (2005) pour le 4-NP (180 µg.kg-1), le risque
associé aux particules a également pu être calculé. Sur la période étudiée, le ratio entre la
concentration en 4-NP dans les MES et la valeur de PNEC associée était compris entre 2 et
39. Le risque imputé au 4-NP adsorbé sur les particules, pour les organismes aquatiques est
très important et même supérieur au risque induit par les APs et APEs dissous.
Par ailleurs, le dosage de ces contaminants chez le copépode E. affinis a permis de
mettre en évidence un transfert important de ces substances vers le compartiment biologique.
Parmi les cinq composés analysés, le 4-NP (251-2477 ng.g-1) et le NP2EO (2890-6013 ng.g-1)
ont été détectés dans tous les échantillons analysés (Tableau 3.2). Peu de données sont
disponibles dans la littérature concernant la bioaccumulation des APs et APEs dans des
matrices naturelles, en particulier chez les invertébrés. Toutefois, Verslycke et al. (2005) ont
rapporté des teneurs en NP2EO comprises entre 220 et 981 ng.g-1 chez des mysidacés.
Tableau 3.2 : Variations de la concentration totale et des concentrations individuelles en alkylphénols
et en alkylphénols polyéthoxylés chez E. affinis (ng.g-1). n indique le nombre d’analyses effectuées
lors de chaque campagne (le NP1EC et le NP1EO n’ont jamais été détectés).
Les teneurs en APs/APEs mesurées dans les copépodes de l’estuaire de Seine sont très
nettement supérieures à celles mentionnées dans la littérature pour d’autres espèces de
crustacés (Ferrara et al., 2005). Si l’on considère les concentrations élevées en APs/APEs
mesurées à la fois chez E. affinis et dans la colonne d’eau de l’estuaire de Seine, des
perturbations physiologiques peuvent apparaître chez les copépodes et notamment des
127
modifications de la synthèse de vitelline comme décrit par Ghekiere et al. (2006) chez
Neomysis integer. De plus, ces fortes concentrations en APs/APEs accumulés par E. affinis
peuvent avoir des effets délétères sur leurs prédateurs. Des poissons intersexués ont été
échantillonnés en baie de Seine (Minier et al., 2000). Les fortes concentrations en APs/APEs
dans la colonne d’eau et chez les copépodes de l’estuaire de Seine pourraient constituer une
hypothèse expliquant l’apparition de ces perturbations chez les poissons.
I.3. Variations saisonnières de la concentration en triazines et carbamates en estuaire de Seine
La présence de triazines et de carbamates dans l’estuaire de Seine a également été
recherchée en estuaire de Seine. Les résultats de cette étude sont présentés dans la Figure 3.7.
Figure 3.7 : Variations saisonnières de la concentration en atrazine et simazine et de leurs métabolites
principaux en estuaire de Seine (phase dissoute).
De faibles concentrations en atrazine (de 23 ± 1 ng.L-1 à 65 ± 0 ng.L-1) et en simazine
(4 ± 2 ng.L-1 à 21 ± 7 ng.L-1) ont été mesurées en estuaire de Seine au cours de ce suivi. Pour
ces molécules, les résultats obtenus sont cohérents avec les concentrations relevées en estuaire
de Seine par Tronczynski et al. (1999) qui ont montré une diminution progressive de la
concentration en atrazine au niveau de Poses entre 1992 et 1998. Une légère augmentation de
l’atrazine a toutefois été détectée en juillet 2003 (période d’épandage). De plus, le calcul du
ratio de la concentration en déséthylatrazine et en atrazine (DAR) a été proposé comme un
indice géochimique des apports récents en atrazine dans les eaux continentales. Ainsi un
128
rapport DAR inférieur à 1 (la concentration en atrazine est supérieure à la concentration en
déséthylatrazine) est caractéristique d’apports récents en atrazine. Les résultats présentés en
Figure 3.8 confirment de légers apports en atrazine dans l’estuaire entre avril et juillet 2003
puisque le rapport DAR est inférieur à 1 pendant cette période.
Figure 3.8 : Variations saisonnières du rapport déséthylatrazine/atrazine
En revanche, très peu d’insecticides de la classe des carbamates ont été détectés dans
l’estuaire, probablement à cause de la stratégie d’échantillonnage trop espacée.
Les résultats obtenus au cours de cette étude montrent une faible contamination de
l’estuaire de Seine en triazines et en carbamates indiquant une amélioration de la situation
pour ces classes de contaminants. Ces résultats soulignent également l’efficacité des mesures
prises par les pouvoirs publiques visant à réduire les émissions de certains pesticides dans
l’environnement (interdiction de l’atrazine pour les usages agricoles en 1997 et pour les
usages non agricoles en septembre 2003, interdiction de l’utilisation de la simazine depuis
octobre 2003).
II. Effets des variations des paramètres physico-chimiques sur la biodisponibilité des
contaminants organiques et sur l’expression de deux biomarqueurs enzymatiques :
Au cours de la première partie de l’étude in situ, des variations saisonnières de la
concentration en PCB et en HAP ont été observées dans la colonne d’eau de l’estuaire de
Seine, en particulier dans le compartiment particulaire. Cette étude a montré que ces
variations étaient essentiellement dues à des facteurs climatiques et hydrodynamiques. De
129
plus, des variations saisonnières de la teneur en PCB et en HAP ont également été observées
chez E. affinis. Les niveaux de concentration en PCB et en HAP dans la phase dissoute, dans
la phase particulaire et chez E. affinis ont par la suite été étudiés à une échelle de temps plus
réduite, pendant un cycle de marée, pour observer les effets de ce processus hydrodynamique
sur la biodisponibilité de ces contaminants et sur leur toxicité pour E. affinis (publication n°
3). En parallèle, des expériences ont été menées en laboratoire pour déterminer les effets des
variations de paramètres physico-chimiques (salinité, température) sur deux activités
enzymatiques (AChE et GST) chez E. affinis (publication n° 4). Ces expériences ont été
réalisées pour définir l’influence de ces facteurs abiotiques in situ (variation de salinité
pendant le cycle de marée, variation de température pendant les saisons), en comparaison avec
les effets des contaminants, sur les variations des activités AChE et GST chez E. affinis. Ces
études constituent la première étape d’une démarche normative pour utiliser les activités
AChE et GST chez E. affinis en tant que biomarqueurs d’exposition à des stress chimiques.
II.1. Variations de la biodisponibilité et de la toxicité des PCB et des HAP pendant un cycle
de marée (publication n°3)
Les concentrations en PCB et HAP ont été déterminées dans la phase dissoute, la
phase particulaire et chez E. affinis au cours de la mission en point fixe SAZOOTOX de mai
2004 (au niveau du pont de Normandie), pendant un cycle de marée. Des échantillons d’eau et
de copépodes ont été prélevés en surface et en profondeur en fonction des variations de
salinité observées (Tableau 3.3).
Les niveaux de contaminations mesurés dans les différents compartiments analysés
sont présentés dans les Tableaux 3.4 et 3.5. Les résultats obtenus montrent de faibles
variations en PCB dissous, aussi bien en surface qu’en profondeur, au cours du cycle de
marée avec toutefois des concentrations toujours plus élevées en surface. Les concentrations
en PCB dissous sont maximales quand la salinité est la plus faible et inversement, les teneurs
en PCB dissous les plus faibles ont été observées quand la salinité était maximale. De plus, les
plus fortes concentrations en PCB dissous en surface et en profondeur, ont été mesurées
quand la charge particulaire de l’eau était maximale ce qui suggère des échanges entre la
phase dissoute et la phase particulaire lors de la remise en suspension des particules
sédimentées.
130
Tableau 3.3 : Paramètres physico-chimiques mesurés lors de chaque prélèvement pendant le cycle de
marée (Fcop: fraction de carbone organique particulaire, COD: carbone organique dissout).
Dans la phase particulaire, de faibles variations de la contamination en PCB ont été
observées au cours du cycle de marée, aussi bien en surface qu’en profondeur.
Tableau 3.4 : Distribution des différents congénères de PCB et HAP dans la phase dissoute et dans
les MES (poids sec) de l’estuaire de Seine pendant un cycle de marée. Les mesures ont été effectuées
en surface et en profondeur.
131
Comme pour les PCB, de faibles variations de la teneur en HAP dissous sont
observées pendant le cycle de marée, aussi bien en surface qu’en profondeur. La phase
dissoute prélevée en surface présentent néanmoins des niveaux de contamination en HAP plus
importants que celle du fond, particulièrement pour les composés de faibles poids moléculaire
tel que le naphtalène ce qui peut suggérer une source de contamination de l’estuaire de Seine
par des apports atmosphériques. De plus, comme pour les PCB dissous, une augmentation de
la concentration en HAP dissous a été observée quand la salinité diminuait ce qui est cohérent
avec les expériences réalisées par Means (1995) et Tremblay et al. (2005).
Tableau 3.5 : Distribution des PCB et des HAP dans la colonne d’eau de l’estuaire de Seine et chez
E. affinis pendant un cycle de marée. (nm: non mesuré, nd: non déterminé). Les mesures ont été
effectuées en surface et en profondeur.
Une augmentation de la teneur en HAP particulaires a été observée quand la salinité de
l’eau diminuait et quand la vitesse des courants était maximale aussi bien en surface qu’en
profondeur. Les profils de distribution des différents congénères de HAP ne présentent pas de
132
variations au cours du cycle de marée et sont similaires pour les échantillons prélevés en
surface et ceux prélevés en profondeur.
Les résultats présentés dans le Tableau 3.5 indiquent une différence de contamination
dans la colonne d’eau avec des eaux brutes (phase dissoute + phase particulaire) plus
contaminées en PCB et HAP en profondeur qu’en surface. La colonne d’eau de l’estuaire de
Seine est dix fois plus contaminée en HAP qu’en PCB, aussi bien en surface qu’en
profondeur. Par ailleurs, une nette augmentation de la contamination de la colonne d’eau
(phase dissoute + phase particulaire) en PCB et en HAP a été observée au cours du cycle de
marée, aussi bien en surface qu’en profondeur. Ces augmentations ont été mesurées pendant
la période de la marée où la vitesse du courant était maximale. Ainsi, lorsque la vitesse du
courant a augmenté, une augmentation importante de la charge particulaire a été observée
dans la colonne d’eau, notamment en profondeur. Ces variations de la charge particulaire de
l’estuaire induites par la remobilisation des sédiments sont essentiellement contrôlées par la
vitesse des courants. Des résultats similaires ont été rapportés dans d’autres estuaires par
différents auteurs (Sandford et al., 1991; Ko et al., 2003). En surface, la contamination en
PCB a augmenté d’un facteur 2 et la contamination en HAP d’un facteur 5. En profondeur,
des augmentations d’un facteur 5 et d’un facteur 10 ont respectivement été calculées pour les
PCB et les HAP. De plus, les profils de distribution des congénères de PCB ont présentés des
variations au cours du cycle de marée. Ainsi, pendant les périodes où le courant était
maximum, une augmentation des hexa- et des heptachlorobiphényles et une diminution des
des tétrachlorobiphényles ont été observées dans les eaux brutes (phase dissoute + phase
particulaire) prélevées en profondeur. Ces différences de profils de contamination par les PCB
peuvent indiquer une source de contamination de la colonne de l’estuaire liée à la remise en
suspension de sédiments. En surface, les profils de distribution des différents congénères sont
restés constants pendant tout le cycle de marée. De même, les profils de distribution des
différents congénères de HAP sont restés constants pendant tout le cycle, aussi bien en
surface qu’en profondeur.
Les copépodes prélevés en surface et ceux prélevés en profondeur ne présentaient pas
des niveaux de contamination différents en PCB au cours du cycle de marée, excepté lors du
premier prélèvement pour lequel les copépodes prélevés en surface étaient moins contaminés.
Des niveaux de contamination en PCB constants ont par ailleurs été mesurés pendant tout le
cycle, aussi bien chez les copépodes prélevés en surface que pour ceux prélevés en
profondeur. En opposition, des variations de la contamination en HAP ont été détectées chez
133
les copépodes pendant le cycle de marée, notamment pour ceux prélevés en profondeur.
Cependant, aucune relation n’a pu être établie entre les variations de concentrations en HAP
chez E. affinis et les concentrations de ces contaminants dans la colonne d’eau. Deux
explications peuvent être envisagées :
-
la durée de temps très faible entre chaque prélèvement qui ne permet pas
forcément d’observer les processus de transferts de contaminants (accumulation
/élimination) entre la colonne d’eau et les copépodes
-
l’échantillonnage pendant la marée qui peut mettre en jeu différentes populations
de copépodes qui ne sont pas exposées à des concentrations identiques en
contaminants.
Pour observer les risques induits par les variations de la biodisponibilité des HAP et
des PCB dans la colonne d’eau de l’estuaire de Seine sur la biocénose, des biomarqueurs
d’exposition, l’AChE et la GST ont été mesurés chez E. affinis (Figure 3.9). Une analyse
statistique des résultats obtenus (Kruskal-Wallis) a montré des différences significatives dans
les niveaux d’expression de ces deux biomarqueurs au cours du cycle de marée. L’activité
AChE la plus élevée a été mesurée lors du deuxième prélèvement chez des copépodes
prélevés en surface comme en profondeur. Alors que des niveaux d’activités AChE plus
faibles ont été mesurés lors des autres prélèvements.
Figure 3.9 : Variations des activités AChE (a) et GST (b) (n=4) chez des copépodes prélevés en
surface et près du fond pendant un cycle de marée (1, 2, 3, 4 = copépodes prélevés près du fond entre
10:15 et 18:05; 5, 6, 7, 8 = copépodes prélevés en surface entre 10:15 et 18:05). Les cercles noirs
indiquent les différences significatives (p<0,05).
Ces variations d’activité AChE peuvent être dues soit à des adaptations physiologiques
en réponse aux variations de la salinité, soit à la contamination de la colonne d’eau par des
134
inhibiteurs de l’activité AChE. En effet, les niveaux d’activité AChE les plus importants ont
été observés quand les concentrations en PCB et en HAP dans la colonne d’eau étaient les
plus faibles. De plus, les activités AChE mesurées chez les copépodes prélevés en surface
étaient toujours significativement supérieures à celles des copépodes prélevés en profondeur
(en moyenne de 31%). La différence maximale d’activité AChE entre les copépodes prélevés
en profondeur et ceux prélevés en surface a été observée lors du dernier prélèvement, lorsque
la concentration en HAP et PCB dans la colonne d’eau était maximale.
L’augmentation de la concentration en HAP et en PCB (voir d’autres contaminants)
observée lors de la remise en suspension du sédiment peut être une explication plausible de
l’inhibition de l’activité AChE chez ces copépodes, en particulier pour ceux prélevés en
profondeur. En effet, bien que l’inhibition de l’activité AChE soit généralement imputée à la
présence d’organophosphates et de carbamates (Bocquené et al., 1997; Forget et al., 2003) de
nombreuses autres études ont montré que cette activité enzymatique pouvait également être
inhibée par d’autres contaminants (Payne et al., 1996; Guilhermino et al., 1998).
L’activité GST a également été analysée au cours du cycle de marée chez les
copépodes prélevés en surface et en profondeur. Quelques variations ont été observées
excepté pour le dernier prélèvement pour lequel aussi bien les copépodes prélevés en
profondeur que ceux prélevés en surface présentaient des niveaux croissants d’activité GST
(respectivement +80% et plus 40%). L’activité GST est impliquée dans les mécanismes de
détoxication qui sont induits par des contaminants tels que les PCB et les HAP. De plus, les
niveaux les plus élevés d’activité GST chez les copépodes prélevés en surface et en
profondeur ont été mesurés quand les concentrations en HAP et en PCB dans la colonne d’eau
étaient maximales. Ces résultats sont en accords avec des études précédentes qui ont montré
une induction de l’activité GST chez Perna viridis et chez Mytilus edulis après une exposition
à des HAP (Cheung et al., 2002; Gowland et al., 2002).
II.2. Effets des variations de température et de la salinité sur l’expression des activités
acétylcholinestérase et glutathion-S-transférase chez E. affinis (publication n°4).
Deux biomarqueurs enzymatiques, les activités AChE et GST, ont été développés chez
E. affinis dans le cadre du suivi in situ de la qualité chimique des eaux estuariennes de
l’estuaire de Seine. Lors des mesures effectuées pendant le cycle de marée, des variations de
ces activités ont été détectées chez E. affinis. Les observations faites pendant cette étude in
135
situ nous ont conduit à réfléchir d’une part aux effets possibles des facteurs abiotiques
(température, salinité) et d’autre part aux effets de la biodisponibilité des contaminants dans la
colonne d’eau sur les activités AChE et GST chez E. affinis. Dans le but de déterminer dans
quelle mesure la variabilité naturelle des facteurs abiotiques pouvaient moduler les niveaux
des activités AChE et GST chez E. affinis, ces copépodes ont été exposés au laboratoire en
milieu contrôlé à différentes salinités, à différentes températures, et ont été soumis à un cycle
de marée expérimental.
Tableau 3.6 : Variations des activités AChE et GST (moyenne ± écart-type, n = 8: i.e. 2 réplicats
expérimentaux et 4 mesures enzymatiques/pool d’échantillon) chez E. affinis pendant un cycle de
marée expérimental. Les différences significatives entre les différentes expositions (p<0.05) sont
indiquées par des lettres (a, b, c, d, e, f et g qui représentent respectivement des salinités de 2,5, 0, 5,
10, 15, 20 et 25 psu).
La première expérience a consisté à exposer un pool de copépodes à une gamme de
salinité (de 0 à 25 psu) dans une durée de temps équivalente à celle d’un cycle de marée (6 h).
Des variations significatives à la fois de l’activité AChE et de l’activité GST ont été observées
après ces expositions (Tableau 3.6). Ces expériences ont permis d’observer un optimum de
salinité pour ces deux activités compris entre 5 et 10 psu. Ces observations amènent à
conclure que ce copépode est mieux adapté aux faibles salinités. Aucune étude de ce genre
n’ayant été réalisée jusqu’à présent, aucune comparaison ne peut être réalisée avec une autre
espèce estuarienne. On peut toutefois noter que ces résultats sont cohérents avec les données
de répartition géographique présentées par Mouny et Dauvin (2002) pour cette espèce qui ont
montré que les plus fortes densités d’E. affinis étaient observées dans la zone oligohaline de
l’estuaire de Seine.
136
Les effets d’expositions à plus long terme de ces copépodes à différentes salinités et à
différentes températures ont ensuite été étudiés. Eurytemora affinis a donc été exposé pendant
72 heures à six milieux différents, chacun ajusté à une salinité différente (eau minérale ajustée
à la salinité appropriée avec du sel de mer artificiel). Puis les copépodes ont été exposés au
cours d’une autre expérience à quatre températures différentes pendant 18 heures (milieux
contenant une eau minérale ajustée à 15 psu et placés dans quatre incubateurs réglés à
différentes températures). Les données obtenues après ces deux séries d’expériences montrent
que l’activité AChE de ces copépodes augmente une fois que les copépodes sont placés dans
l’eau minérale. A contrario, l’activité GST de ces copépodes diminue une fois que les
copépodes sont placés dans l’eau minérale. Ces résultats suggèrent la présence d’un ou
plusieurs facteurs (naturel ou chimique) dans l’estuaire de Seine pouvant soit altérer l’activité
AChE soit augmenter l’activité GST chez E. affinis. Des résultats similaires ont été rapportés
chez Crangon crangon après leur transfert du milieu naturel vers les conditions contrôlées du
laboratoire (Menezes et al., 2006).
Figure 3.10 : Variations de l’activité AChE chez E. affinis après exposition à différentes salinités (de
0 à 25 psu) (Moyennes ± écart-type, n = 8: i.e. 2 réplicats expérimentaux et 4 mesures
enzymatiques/pool d’échantillon). Les différences significatives entre deux temps d’exposition
(p<0,05) sont indiquées par des lettres (a, b, c, d, e et f qui représentent respectivement 0, 1, 2, 4, 18 et
72 heures d’exposition).
137
Des effets significatifs de la salinité ont été observés sur l’activité AChE chez E.
affinis après les expositions aux différentes salinités (Figure 3.10). Des niveaux croissants
d’activité AChE ont pu être observés et les augmentations les plus importantes ont été
mesurées pour des expositions à 10 psu. Ces résultats suggèrent, comme pour le cycle de
marée expérimental, une salinité optimale à 10 psu pour l’activité AChE chez E. affinis. Des
études ont montré les fortes capacités de E. affinis à osmoréguler (Roddie et al., 1984;
Kimmel et Bradley, 2001). De plus, en dehors de l’optimum de salinité, une augmentation de
la dépense énergétique de l’organisme allouée à osmoréguler peut être observée, au détriment
de l’énergie consacrée à l’activité AChE. Gylleberg et Lundqvist (1979) ont rapporté une
augmentation de la fréquence respiratoire chez plusieurs espèces de copépodes en dehors de
leur optimum de salinité et ont associé cette augmentation à l’accroissement de la demande
énergétique pour leur osmorégulation.
Figure 3.11 : Variations de l’activité GST chez E. affinis après exposition à différentes salinités (de 0
à 25 psu) (Moyennes ± écart-type, n = 4 mesures enzymatiques/pool d’échantillon). Les différences
significatives entre deux temps d’exposition (p<0,05) sont indiquées par des lettres (a, b, c, d, e et f qui
représentent respectivement 0, 1, 2, 4, 18 et 72 heures d’exposition).
Des effets significatifs de la salinité ont également été observés sur l’activité GST
chez E. affinis après exposition aux différentes salinités (Figure 3.11). Des niveaux
décroissants de cette activité enzymatique ont été mesurés pour toutes les conditions
d’exposition. La diminution la plus linéaire de l’activité GST a toutefois été mesurée pour
138
l’exposition à 15 psu. Pour les expositions à des salinités éloignées de l’optimum, une
variabilité plus importante de cette activité a été observée. Les effets de la salinité sur
l’activité GST sont malgré tout moins important que ceux observés sur l’activité AChE.
Les effets du second paramètre naturel étudié, la température, sur les variations des
activités AChE et GST chez E. affinis sont présentés dans les Figure 3.12 et 3.13. La
température est un facteur qui présente de légères variations lors d’un cycle de marée. Par
contre, ce facteur est très variable à l’échelle des saisons. L’étude expérimentale des effets de
ce facteur sur les activités AChE et GST est donc importante, surtout pour l’utilisation de ces
biomarqueurs dans des programmes de biomonitoring sur plusieurs saisons.
Figure 3.12 : Variations de l’activité AChE chez E. affinis après exposition à différentes températures
pendant 18 heures (4, 11, 18 et 25°C) (Moyennes ± écart-type, n = 8: i.e. 2 réplicats expérimentaux et
4 mesures enzymatiques/pool d’échantillon). Les différences significatives entre deux temps
d’exposition (p<0,05) sont indiquées par des lettres (a, b, c, d et e qui représentent respectivement 0, 1,
2, 4 et 18 heures d’exposition).
A ce jour, très peu d’études ont été menées pour mesurer les effets de la température
sur l’expression des biomarqueurs biochimiques chez des invertébrés (Scaps et Borot, 2000;
Pfeifer et al., 2005; Menezes et al., 2006). Il est toutefois admis que l’augmentation de la
139
température induit une augmentation de l’activité AChE. Les résultats présentés dans la
Figure 3.12 indiquent des effets significatifs de la température sur l’activité AChE chez E.
affinis. L’activité AChE maximale a été mesurée chez E. affinis pour l’exposition à 11°C.
Pour les copépodes exposés aux autres températures, un choc thermique été observé après une
heure d’exposition accompagné d’une diminution de l’activité AChE. L’hypothèse d’un court
temps d’adaptation d’une heure à la variation de la température peut être supposée. De plus,
Gyllenberg et Lundqvist (1979) et Pagano et Gaudy (1986) ont rapporté une réduction du
métabolisme chez différentes espèces de copépodes estuariens, pour des températures
éloignées de leur optimum thermique pour limiter les dépenses énergétiques.
Figure 3.13 : Variations de l’activité GST chez E. affinis après exposition à différentes températures
(4, 11, 18 et 25°C) (Moyennes ± écart-type, n = 8: i.e. 2 réplicats expérimentaux et 4 mesures
enzymatiques/pool d’échantillon). Les différences significatives entre deux temps d’exposition
(p<0,05) sont indiquées par des lettres (a, b, c, d et e qui représentent respectivement 0, 1, 2, 4 et 18
heures d’exposition).
Les effets de la température sur l’activité GST sont présentés dans la Figure 3.13. Ces
résultats montrent que la température induit des effets plus faibles sur l’activité GST en
140
comparaison avec ceux observés sur l’activité AChE. Une induction significative de l’activité
GST a toutefois été observée après une et deux heures d’exposition à 4°C. Des résultats
similaires ont été observés in situ chez Perna viridis (Lau et al., 2004). Les auteurs ont fait
l’hypothèse que cette augmentation de l’activité GST serait due à un effet de concentration lié
à la diminution du niveau en protéines totales pendant les saisons froides. Power et Sheehan
(1996) ont également rapporté des variations de l’activité GST chez la moule bleue en relation
avec les variations saisonnières de température.
Cette étude a permis d’identifier les effets de facteurs naturels (température, salinité)
sur les activités AChE et GST chez E. affinis et constitue la première étape permettant
d’utiliser ces biomarqueurs pour identifier la présence et les effets des contaminants
chimiques dans les estuaires.
III. Etudes expérimentales pour évaluer la capacité de E. affinis à bioconcentrer et à
éliminer des contaminants organiques.
Compte tenu des niveaux de concentrations élevés en contaminants organiques
mesurés chez E. affinis au cours du suivi in situ, des expériences d’exposition en milieu
contrôlé ont été réalisées au laboratoire dans le but d’identifier les mécanismes impliqués
dans ces transferts. Un dispositif expérimental a été développé à cet effet pour exposer les
copépodes à des contaminants organiques en flux continu et à des concentrations réalistes du
point de vue environnemental. Les copépodes utilisés pour ces expériences ont été prélevés en
estuaire de Seine, pendant les périodes les moins contaminées de l’année, puis ramenés au
laboratoire où ils ont été décontaminés durant trois jours. Puis ces copépodes ont été exposés
aux différents contaminants sur une durée de quatre jours. Des facteurs de bioconcentration
expérimentaux ont ainsi pu être calculés pour tous les composés auxquels ces copépodes ont
été exposés. Ces expériences ont également permis de mettre en évidence des capacités
importantes de ces copépodes à éliminer un grand nombre de contaminants. Ces expériences
ont fait l’objet de deux publications (publications n°5 et 6).
III.1. Transferts de contaminants hydrophobes de la phase dissoute vers E. affinis (publication
n° 5)
La première série d’expériences a conduit à exposer des copépodes, dans deux milieux
distincts, à un mélange de PCB (PCB 52, 101, 87, 118, 153, 138 et 180) puis à un mélange de
141
HAP (phénanthrène, pyrène, chrysène, benzo[b]fluoranthène/benzo[k]fluoranthène et
benzo[a]pyrène) à des concentrations respectives en phase dissoute de 300 ng.L-1 et de 500
ng.L-1. Des tests préalables ont été réalisés pour déterminer les conditions nécessaires pour
saturer les milieux d’exposition par ces contaminants.
Après l’exposition au mélange de PCB, les concentrations en PCB mesurées chez les
copépodes exposés étaient dix fois supérieures à celles mesurées chez les copépodes non
exposés. Un facteur de bioconcentration expérimental élevé (28 200) a été calculé pour la
somme des PCB chez les copépodes exposés. De même, des concentrations importantes en
HAP ont été mesurées chez les copépodes exposés au mélange de HAP, en comparaison avec
les copépodes non exposés (Figure 3.14).
Ces résultats indiquent une capacité importante de E. affinis à bioconcentrer les
contaminants organiques hydrophobes et plus particulièrement les PCB, y compris pour des
expositions à de faibles concentrations. En considérant les conditions d’exposition et les
teneurs en PCB et en HAP mesurées chez les copépodes exposés, les expériences ont mis en
évidence chez E. affinis des facteurs de bioconcentration pour la somme des PCB 25 fois
supérieurs à ceux mesurés pour la somme des HAP. Les différents niveaux d’accumulation
observés chez E. affinis entre les PCB et les HAP peuvent être expliqués par une
métabolisation plus efficace des HAP qui a été rapportée pour de nombreux organismes
(Harris et al., 1977; Leversee et al., 1982).
Plusieurs auteurs ont mentionné l’accumulation de contaminants organiques
hydrophobes par des crustacés. Harris et al. (1977) ont observé expérimentalement des
transferts importants des HAP en phase dissoute vers la même espèce de copépode. Des
études in situ ont également montré que des copépodes pouvaient accumuler des quantités
importantes de HAP dans des écosystèmes où la concentration en HAP en phase dissoute et
en phase particulaire était inférieure aux limites de détection (Carls et al., 2006).
Des études expérimentales ont rapporté les transferts importants de PCB en phase
dissoute vers des copépodes (Wyman et O’Connor, 1980; Wirth et al., 1994; Magnusson et
al., 2006). De plus, Landrum et al. (2003) et Wang et Wang (2005) ont mentionné une
accumulation importante de DDT et de HAP chez des copépodes et des amphipodes exposés à
des eaux contaminées.
142
Figure 3.14 : Bioconcentration des PCB (a.1) et des HAP (b.1) chez Eurytemora affinis après
exposition à des eaux contaminées pendant 86 heures (moyennes ± écart-type, n=3). L’élimination de
chaque PCB (a.2) et de chaque HAP (b.2) chez les copépodes non exposés (témoins) est présentée
depuis leur prélèvement dans le milieu jusqu’à la fin des expériences (moyennes ± écart-type, n=3).
Les profils de distribution des PCB (c.1) et des HAP (c.2) après 86 heures d’exposition sont comparés
à ceux des copépodes non exposés et à ceux de l’eau à la fin de l’expérience.
Les profils de distribution des différents congénères de PCB dans les milieux
d’exposition et chez les copépodes indiquent une accumulation sélective des PCB avec un
143
enrichissement des copépodes exposés au mélange, en PCB de haut poids moléculaire (Figure
3.15).
Figure 3.15 : Evolution des profils de distribution des PCB (a) et des HAP (b) chez les copépodes
non exposés et chez les copépodes exposés depuis leur prélèvement dans l’estuaire de Seine jusqu’à la
fin des expériences en comparaison avec les profils de distribution de ces contaminants dans le milieu
d’exposition (phase dissoute).
Ces résultats suggèrent que les PCB de haut poids moléculaire (PCB 180) sont
préférentiellement bioconcentrés par E. affinis comparés aux PCB de plus faible poids
moléculaire. Cette hypothèse est confirmée par la forte corrélation obtenue entre les facteurs
de bioconcentration de chaque congénère de PCB et leur log Kow respectif (Figure 3.16 a). Par
ailleurs, des concentrations en PCB 118 supérieures à ce que le log Kow de ce composé
pouvait suggérer ont été mesurées chez les copépodes exposés.
Figure 3.16 : Expression du facteur d’accumulation de chaque PCB (a) et de chaque HAP (b) chez les
copépodes exposés en fonction du log Kow de chaque composé.
144
La structure chimique du PCB 118, qui est un PCB coplanaire mono ortho-substitué, pourrait
expliquer les concentrations élevées mesurées chez les copépodes exposés. Willman et al.
(1999) ont en effet rapporté que les PCB coplanaires s’accumulaient plus chez le plancton que
leurs homologues non coplanaires.
Des profils de distribution différents ont été observés pour les HAP dans les milieux
d’exposition (phase dissoute) et chez les copépodes exposés. Ces différences suggèrent,
comme pour les PCB, une accumulation sélective des HAP chez E. affinis. En effet, les HAP
de haut poids moléculaire (BbF/BkF; BaP) semblent être préférentiellement accumulés par ce
copépode. Ces observations sont confirmées par la forte corrélation obtenue entre les facteurs
de bioconcentration de chaque HAP et leur log Kow respectif (Figure 3.16 b). Ces résultats
sont en accord avec les travaux de Woods et al. (1997) qui ont montré que des larves de
chironomes exposées à des sédiments contaminés par des HAP accumulaient principalement
les HAP de haut poids moléculaire.
Des concentrations en PCB et HAP non négligeables ont été détectées chez les
copépodes prélevés en estuaire de Seine. Le transfert de ces copépodes au laboratoire dans un
milieu non contaminé a également permis de mesurer les capacités de ces organismes (E.
affinis), à éliminer les contaminants organiques qu’ils avaient accumulés en estuaire de Seine.
Après les trois premiers jours de décontamination, les copépodes ont éliminés 18 % des HAP
initialement présents. Après une semaine entière de décontamination, la concentration en
HAP a chuté de 90 %. Ces résultats indiquent que ces copépodes (E. affinis) sont capables
d’éliminer rapidement les HAP accumulés quand ils sont placés en milieu non contaminé. De
plus, les HAP de faible poids moléculaire sont préférentiellement et plus rapidement éliminés
que les HAP de haut poids moléculaire. Ces résultats sont cohérents avec les données publiées
par Harris et al. (1977) qui ont rapporté la capacité de plusieurs espèces de copépodes à
biotransformer rapidement des HAP.
De faibles variations des concentrations en PCB ont été observées chez les copépodes
non exposés. Durant les trois premiers jours, quand les copépodes ont été nourris, une légère
diminution des PCB de faible poids moléculaire a été observée. Ces résultats sont en accord
avec ceux rapportés par Goerke et Weber (2001) qui ont mentionné une élimination sélective
des PCB avec une capacité importante de transformation oxydative des PCB possédant moins
de 6 substitutions chlorées chez des crustacés décapodes. Les trois jours suivants, lorsque les
copépodes n’ont plus été nourris, une légère augmentation de la concentration en PCB a été
observée chez E. affinis. Des observations similaires ont été faites par McManus et al. (1983)
145
qui ont observés que des copépodes nourris éliminaient plus rapidement les PCB accumulés
via les fécès que les copépodes non nourris.
Ces expériences au laboratoire ont permis de confirmer les fortes capacités de E.
affinis à bioconcentrer des contaminants organiques hydrophobes tels que les PCB et les
HAP. De plus, ce copépode est également capable, lorsqu’il est placé dans un milieu non
contaminé, d’éliminer rapidement les HAP qu’il avait accumulé dans l’estuaire de Seine.
III.2. Transferts de contaminants de type perturbateur endocrinien de la phase dissoute vers E.
affinis (publication n°6)
Lors de la deuxième série d’expériences, les copépodes ont été exposés dans deux
milieux distincts, à un mélange d’alkylphénols (4-NP/NP1EC) et à une hormone stéroïdienne
de synthèse, le 17α-éthynyloestradiol (EE2). Les concentrations d’exposition au mélange
d’alkylphénols et à EE2 ont été respectivement de 1000 ng.L-1 et de 10 ng.L-1 en phase
dissoute. Ces deux classes de polluants font partie des molécules suspectées de pouvoir
perturber les fonctions endocrines des organismes aquatiques. Comme pour la première série
d’expérience, des tests préalables ont été réalisés pour déterminer les conditions nécessaires
pour saturer les milieux d’exposition par ces contaminants.
A la fin de l’expérience, la concentration totale en alkylphénols mesurée chez les
copépodes exposés était quatre fois supérieure à celle mesurée chez les copépodes non
exposés (Figure 3.17 a). L’analyse des profils de distribution des différents composés chez les
copépodes exposés montrent une bioconcentration importante du NP1EC après 86 heures
d’exposition (facteur de bioconcentration de 3020). Les données de la littérature concernant
les possibles transferts des alkylphénols et des alkylphénols polyéthoxylés de la phase
dissoute vers les invertébrés aquatiques et plus particulièrement vers les crustacés sont rares.
La plupart des études ont été réalisées sur des poissons. De plus, bien que le NP1EC constitue
l’un des alkylphénol polyéthoxylé le plus fréquemment détecté dans les milieux aquatiques,
aucune étude à ce jour n’a été menée pour estimer son transfert vers le zooplancton. A notre
connaissance, seulement une étude a fait référence à des niveaux de contamination en NP1EC
chez des mysidacés prélevés dans l’estuaire de l’Escaut, mais ces organismes présentaient des
concentrations inférieures aux limites de détection (Verslycke et al., 2005). Pour le 4-NP,
quelques données sont disponibles pour plusieurs espèces. Ainsi, des facteurs de
bioconcentration de 1,4 à 2700 ont été rapportés pour les moules (McLeese et al., 1980;
146
Ekelund et al., 1990). Des facteurs de bioconcentration compris entre 90 et 110 ont été
observés chez les crevettes (Ekelund et al., 1990). Ces facteurs de bioconcentration pour le 4NP sont proches de ceux calculés chez E. affinis lors de notre étude (324) et également proche
de ceux observés classiquement chez les poissons (Brooke, 1993).
Figure 3.17 : Bioconcentration des alkylphénols (a) chez Eurytemora affinis après exposition à des
eaux contaminées pendant 86 heures (moyennes ± écart-type, n=3). L’élimination du 4-NP et du
NP1EC (b) chez les copépodes non exposés (témoins) est présentée depuis leur prélèvement dans le
milieu jusqu’à la fin des expériences (moyennes ± écart-type, n=3). Les concentrations en 4-NP et en
NP1EC (c) après 86 heures d’exposition sont comparées à celles des copépodes non exposés et à celles
de l’eau à la fin de l’expérience.
147
L’analyse de l’évolution de la concentration en NP1EC au cours de l’expérience chez
les copépodes non exposés montre une élimination progressive de ce composé. Après trois
jours en milieu non contaminé 54 % du NP1EC a été éliminé, puis 99 % après une semaine de
décontamination. En revanche, la concentration en 4-NP a augmenté progressivement chez les
copépodes non exposés pendant cette même période (Figure 3.17b).
Figure 3.18 : Expression de la concentration en 4-NP mesurée chez les copépodes non exposés
depuis leur prélèvement dans le milieu jusqu’à la fin des expériences (moyennes ± écart-type, n=3) en
fonction de la concentration en NP1EC chez ces mêmes organismes.
De plus, la diminution de la concentration en NP1EC et l’augmentation de la
concentration en 4-NP chez les copépodes non exposés sont linéairement corrélées (r2= 0,989)
ce qui suppose une élimination totale du NP1EC avec formation de 4-NP (Figure 3.18). Ce
type de réaction n’a jusqu’à présent été observé que dans des conditions anaérobie.
Figure 3.19 : Bioconcentration et élimination de l’éthynyloestradiol respectivement chez les
copépodes exposés et chez les non exposés depuis leur prélèvement dans le milieu jusqu’à la fin des
expériences (moyennes ± écart-type, n=3).
148
Ces expériences d’exposition ont également montré une accumulation du 17αéthynyloestradiol chez les copépodes exposés à ce composé (Figure 3.19). Une étude similaire
a montré une accumulation rapide d’oestrone chez des daphnies exposées à des eaux
contaminées par ce composé (Gomes et al., 2004). Labadie et Budzinski (2006) ont également
rapportés des niveaux croissant d’éthynyloestradiol chez des turbots (mâles et femelles) après
15 jours d’exposition à des eaux contaminées par ce composé. Ces auteurs ont par ailleurs mis
en évidence des perturbations hormonales chez les mâles qui présentaient une diminution de
la synthèse d’androgènes suite à ces expositions. Enfin, une accumulation importante d’EE2 a
également été observée chez lumbricus variegatus exposé à des sédiments artificiellement
contaminés par ce composé (Liebig et al., 2005).
Chez les copépodes non exposés, une élimination rapide de l’EE2 accumulé in situ a
été observée. Ainsi, après 3 jours de décontamination, la totalité de l’EE2 initialement présent
dans ces copépodes a été éliminée ce qui suggère un temps de demie vie pour ce composé
inférieur à 36 heures chez E. affinis. Chez l’homme, l’éthynyloestradiol peut être dééthylé
pour former de l’oestradiol ou être éliminé sans transformation sous forme conjuguée (Bolt,
1979). Dans notre étude, l’oestradiol n’a jamais été détecté ce qui suggère plutôt une
élimination de l’EE2 sous forme conjuguée. Des études ont ainsi montré que les mécanismes
d’élimination de l’EE2 chez des poissons et des algues impliquaient une induction de
l’activité GST (Larsson et al., 1999; Lai et al., 2002). Toutefois, les expériences réalisées sur
E. affinis n’ont pas permis d’identifier des formes conjuguées de l’EE2, ce qui peut cependant
être liée à la méthode de déconjugaison utilisée qui n’a peut être pas été efficace.
Les expériences présentées dans ce paragraphe ont permis de mettre en évidence une
rapide accumulation du NP1EC et d’EE2 chez E. affinis. De plus, la capacité importante de ce
copépode à éliminer rapidement ces composés a également été démontrée.
IV. Effets biologiques des contaminants organiques chez E. affinis et recherche de
nouveaux biomarqueurs :
Pour observer les stress physiologiques induits par les transferts de contaminants
décrits dans le paragraphe précédent, lors des expositions en flux continu, les protéomes des
copépodes exposés ont été analysés et comparés à celui des copépodes non exposés. Cette
étude a permis d’identifier des processus physiologiques altérés ou activés chez E. affinis en
réponse à la présence de contaminants. Les protéines mises en jeu dans ces réactions
149
biochimiques ont été identifiées par homologie de séquence avec les protéines des banques de
données dans le but de proposer de nouveaux biomarqueurs d’exposition à des stress
chimiques chez une espèce estuarienne.
En parallèle, des expériences d’injection de contaminants dans le milieu des
copépodes ont été réalisées afin d’étudier par des techniques cinématographiques la réponse
comportementale de ces organismes consécutive à ce stress chimique. L’objectif de cette
étude est de proposer de nouveaux biomarqueurs d’exposition très sensibles basés sur l’étude
du comportement comme alternative aux activités enzymatiques classiquement utilisées
jusqu’à présent. Ces deux approches développées dans ce paragraphe ont fait l’objet de deux
publications (publications n°7 et 8).
IV.1. Modification de l’expression protéique de E. affinis en réponse à des stress chimiques
(publication n°7)
Les profils typiques de distribution des protéines obtenus après électrophorèse
bidimensionnelle (2-DE), pour des copépodes exposés et non exposés, sont présentés dans la
Figure 3.20.
150
Figure 3.20 : Profils d’expression protéique typiques sur gels 2-DE obtenus à partir de pools d’E.
affinis exposés à différents contaminants organiques en flux continu. Le premier gel (A) et le second
gel (B) présentent (à titre d’exemple) les profils d’expression protéique respectivement des copépodes
exposés à un mélange 4 NP/NP1EC et des copépodes non exposés. Les protéines qui ont présenté des
niveaux d’expression différents chez les copépodes exposés, en comparaison avec les copépodes non
exposés et qui ont été identifiées par nanoLC MS/MS sont entourées d’un cercle. (les numéros des
protéines entourées font référence à ceux mentionnés dans le Tableau 3.8).
151
L’utilisation d’un logiciel d’analyse d’image a permis de comparer les gels obtenus à
partir des pools de copépodes exposés aux différents contaminants avec les gels obtenus à
partir des copépodes non exposés. Cette analyse a montré que tous les contaminants auxquels
E. affinis avait été exposé induisaient des modifications significatives de son protéome. Les
effets les plus importants ont été observés chez les copépodes exposés au diuron et les effets
les plus faibles ont été observés chez les copépodes exposés au mélange de PCB (Tableau
3.7). D’une manière générale, une tendance à la surexpression d’une majorité de protéines a
été observée chez les copépodes exposés au mélange de HAP et au diuron. A contrario, une
diminution des niveaux d’expression d’une majorité de protéines a été relevée chez les
copépodes exposés à l’EE2 et à la carbamazépine. Enfin, des quantités équivalentes de
protéines sur ou sous exprimées ont été observées chez les copépodes exposés au mélange de
PCB et au mélange 4-NP/NP1EC.
Tableau 3.7 : Nombre de protéines différentiellement exprimées (sur ou sous exprimées) pour chaque
condition d’exposition. Deux groupes de protéines sont définis en fonction de leur niveau de sur ou
sous expression chez les copépodes exposés par rapport à celui des copépodes non exposés : celles
présentant un ratio de sur ou sous expression compris entre 1,2 et 4 et celles présentant un ratio de sur
ou sous expression supérieur à 4. Les protéines communes à deux conditions d’exposition et qui
présentent des niveaux d’expression différentiels par rapport aux témoins sont également présentées.
Contaminants
Nombre
total de
spots
protéines
exprimées
différemment
HAP
481 ± 31
105
PCB
556 ± 19
59
AP
834 ± 48
122
Diuron
775 ± 21
278
EE2
761 ± 26
118
CBZ
352 ± 32
86
sur ou sousexprimées
Ratio moyen
(1.2-4)
Ratio moyen
(4<)
90
85
5
15
15
0
29
29
0
2
20
20
0
2
52
52
0
1
70
70
0
8
254
252
2
19
7
9
11
5
24
24
0
0
0
0
1
1
vs. PAHs
vs. PCBs
vs. APs
vs. Diuron
vs. EES
vs. CBZ
3
6
19
9
3
1
3
0
2
2
2
3
0
0
3
4
4
2
1
2
3
1
4
7
11
7
18
17
1
1
0
1
3
100
99
1
10
4
13
9
0
1
1
0
0
0
0
1
0
85
79
6
5
2
8
5
8
8
Parmi toutes les protéines qui présentaient des niveaux d’expression différents chez les
copépodes exposés en comparaison avec les copépodes non exposés, 87 ont été soumises à
une identification par homologie de séquence avec les séquences protéiques des banques de
152
données. Sur ces 87 protéines, 14 ont été identifiées avec une bonne homologie de séquence
(Tableau 3.8). Ces protéines pour lesquelles une identification a pu être obtenue interviennent
essentiellement dans trois processus cellulaires : le métabolisme énergétique, la régulation des
concentrations cellulaires en Ca2+ et les réponses cellulaires à différents stress.
Cinq protéines impliquées à différents niveaux dans la production d’ATP, l’aconitase
(cycle de Krebs), la créatine kinase (stockage de l’ATP cellulaire), l’arginine kinase (stockage
de l’ATP cellulaire), la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (glycolyse) et l’éthanol
déshydrogénase (glycolyse), ont notamment été identifiées. Ces protéines ont essentiellement
été sous exprimées après les expositions au mélange de PCB et à l’EE2. Par exemple, la sous
expression de la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase et de l’éthanol déshydrogénase,
deux enzymes impliquées dans la seconde phase de la glycolyse, ainsi que la sous expression
de l’aconitase impliquée dans le cycle de Krebs, peuvent indiquer un basculement des flux de
carbone vers la voie des pentoses phosphate qui permet la régénération du NADPH. En effet,
parmi les mécanismes cellulaires de défense contre le stress oxydant, la glutathion réductase
utilise le NADPH pour convertir le glutathion oxydé en glutathion réduit. De plus, plusieurs
études ont rapporté l’induction de stress oxydatifs chez des organismes aquatiques suite à des
expositions aux PCB ce qui implique une induction des systèmes de lutte contre ce stress
(Rodriguez-Ariza et al., 2003; Vega-López et al., 2006). Par ailleurs, d’autres protéines
intervenant dans le métabolisme énergétique, l’arginine kinase et la créatine kinase ont
présenté des niveaux d’expression plus faibles suite à l’exposition à l’EE2. La sousexpression de ces deux enzymes impliquées dans les mécanismes de stockage de l’ATP dans
les cellules en relation avec les transferts d’énergie peut suggérer une augmentation de la
demande cellulaire en énergie en réponse à un stress physiologique. Les variations
d’expression de ces cinq protéines impliquées dans le métabolisme énergétique représentent
donc des preuves de l’état physiologique général de ces copépodes après les expositions à de
faibles concentrations en contaminants.
153
PAHs Diuron EE2
CBZ
APs
noyau/
cytoplasme
Artemia
franciscana
Métabolisme
énergétique
mitochondrie
154
BVFFDVTADGAPVG
BHVVFGZVVEG
NNFEDENFALK
TNGSZFFLT
GSZFFLCTAK
79
77
75
55
36
71%
81%
81%
77%
60%
78%
90%
81%
100%
80%
RIISMQKGGDLK
BLLSMZZGGDVK
67
50%
91%
YDISNK
YDLSNK
44
83%
100%
-
ITDDPAAAK
GLDLWQVK
KHEQDIDCGGGYLK
FYALS
LTDDPAAAK
GLDLWZVK
BHEZNLNFAGGYVK
FYALS
61
55
49
36
9
88%
87%
42%
100%
100%
100%
78%
100%
Bombyx mori
Stockage du calcium
Réticulum
endoplasmique
-
KIGGSSEVEVNEK
RVTDALNATR
EEAGDGTTTATVLAR
RAAVEEGIVP
KVEYQDCLVLLCQK
KTLNDEMEVI
VGEVSITK
KAPGFGDNR
KDDTLFLRGK
VAVTLGPK
BLGGSSEVEVNEK
BVTDALNATR
EEATAGTTTTSVLAR
BGALEEGLVP
BVEYNDALVLFSEK
BTLDNDMELL
VGEVVLTK
BAPGFTANR
BDDSZFLNGK
VAVSPGPK
87
67
65
51
48
47
41
41
35
33
18
84%
90%
73%
60%
57%
40%
75%
66%
60%
75%
100%
100%
73%
80%
71%
90%
87%
77%
70%
75%
Anemonia
viridis
Protéines de défense
contre les stress
cellulaires
mitochondrie
-
-
-
(5) Arginine kinase
-
-
-
0.8
-
-
20
15
55
28
5
Maintien de la
structure des protéines
RVFFDVTVDDAPLG
RHVVFGNVVEG
NKFEDENFTLK
TNGSQFFIT
GSQFFITTVK
0.5
-
-
Bombyx mori
92%
100%
83%
100%
100%
85%
100%
80%
85%
100%
100%
-
0.8
noyau/
cytoplasme
80%
2.1
-
Maintien de la
structure des protéines
73%
76%
80%
66%
83%
50%
85%
66%
70%
71%
100%
50%
(4) Cyclophilin-like
protein
1.9
Danio rerio
79
72
69
57
46
43
41
39
39
36
33
33
-
-
mitochondrie
GDNFTNHDGTGGK
BHVVFGZVVE
BZVESFGSZSGK
FFLCTA
ZLVVADCG
TZWLDGK
GSZFFL
NAGNPTNGSZ
BHGGAGC
YGYK
BVLPGY
-
(7) HSP 60
Métabolisme
énergétique
BVFFDVTADGAPVGR
0.7
-
Chaetopterus
variopedatus
GGDFTNHNGTGGK
KHVVFGQVVE
KKVEGFGSSSGK
FFICTA
KIIIADCG
TSWLDGK
GSQFFI
NAGPNTNGSQ
KHTGAGC
YGYK
RVIPGF
-
0.7
cytoplasme
KVFFDLTAGGNPVGR
2.1
-
81%
80%
83%
Métabolisme
énergétique
69
43
37
-
-
81%
80%
83%
Chicken
LLWVNEEDZTR
WEFLW
AASLYY
(2) Creatine kinase
(length 409)
-
75%
100%
localisation
cellulaire
LVWVNEEDHTR
WEFMW
AAALYY
-
(6) Calreticulin
100%
41%
100%
Rôle physiologique
47
33
-
-
72%
Espèce
63
0.5
-
Substitution
positive
BLGYSEVELVZ
-
1.5
Identité
BLLSMZEGGDVK
SGFTL
-
-
Recouvrement
de la séquence
totale (%)
RLGFSEVELVQ
-
-
Score
RVISMQKGGNMK
SGFTL
(1) Creatine kinase
(l=180)
(3) Peptidylpropyl
isomerase F
Homologie avec les
séquences des banques de
données
Tableau 3.8 : Résultats de l’identification des protéines (nanoLC MSMS) différentiellement
PCBs
Fragments peptidiques
exprimées chez les copépodes exposés aux différents contaminants par homologie de
Contaminants
séquence avec des protéines répertoriées dans les bases de données.
(N° du spot) Nom
de la protéine
(8) Aconitase
0.4
PAHs Diuron
3.4
EE2
2.7
CBZ
APs
-
-
(9) Glyceraldehyde3-phosphate
deshydrogenase
0.78
-
1.3
-
-
-
(10) Elongation
factor 2
1.67
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
0.78
(12) Sarcoplasmic
calcium-binding
protein (beta chain)
-
-
2.1
0.8
0.5
0.8
(13) Ethylmalonic
encephalopathy 1
(ETHE1)
-
-
-
0.8
-
-
155
(14) Alcool
deshydrogenase
zinc-containing
0.6
-
-
0.7
-
-
Score
YSHLDDPSNQEIVR
YSHLDDPAGZDLVR
77
Recouvrement
de la séquence
totale (%)
4
Identité
Substitution
positive
64%
85%
KEVYNFLSTSGAK
BEVYDFLATAGAK
72
69%
84%
DYLVATER
DYLAATER
50
87%
87%
ASCTTNCLAPLAK
ASCTTNCLAPLAK
91
100%
100%
RVPVHDVSVVDLTCR
YVVESTGVFT
VVSTDFIGDN
WYDNEFG
KLVVNGHHIQVFSER
IGINGFGR
VHAITATQK
GVFTTLDK
LDYMVYMFK
KEASYDEI
TTVHA
PELNGK
AQNIIP
TVHAI
DGGAK
BVPTPDVSVVDLPCR
YVVESTGVFT
VVSTDFLGDD
WYDNEFG
BLVLDGHALDVFGER
LGLNGFGR
VHATTATZK
GVFTTLEK
LDYFVYFFK
BEPSYDNL
TTVHA
PELDGK
AZNLLP
TVHAL
DGGAK
75
74
65
62
60
53
51
50
48
38
36
36
36
34
33
73%
100%
80%
100%
53%
75%
77%
87%
77%
50%
100%
83%
50%
80%
100%
80%
100%
100%
100%
73%
100%
88%
100%
77%
75%
100%
100%
100%
100%
100%
KEGVLCDENMR
BEGVLCDENLR
73
81%
90%
RRGHVFEEGM
BZGHAAEESM
34
50%
60%
RYSFSLTTFSPSGK
BYSFSLTTFSPSGK
97
92%
100%
KASNGIVLATEKK
ESIEGE
EKRWNE
TPDIGM
BAGNGVVLATEZK
EALEGE
EMZWNE
TPALGM
69
35
34
34
69%
66%
66%
66%
92%
83%
66%
83%
RYMYDIDNDGFLDK
BYFYDLDLDGVLDK
62
64%
78%
KNDFECLAV
KDGEVTVDEF
VKEIDDAYDK
BTDFECLAV
BNGEVDSDEF
VZELDAAFSK
56
42
40
77%
60%
50%
88%
80%
80%
KEAILIDPVLEK
BEALLLDPVLEK
77
72%
90%
85%
100%
42
8
18
22
10
MNNLNLPKPK
MGDLNLPYPK
42
SGAAGAVGSIVGQIAK
SGAAGAVGHPVGZLAK
70
75%
87%
CGAISQYNNK
EIAGWL
CGALSTYTNK
ELAGWL
51
43
70%
83%
80%
100%
RMEGFVV
BLEGFVV
42
71%
85%
12
Espèce
Daphnia pulex
Rôle physiologique
localisation
cellulaire
Métabolisme
énergétique, protection Mitochondrie/
de l'intégrité de l'ADN
cytoplasme
mitochondrial
Daphnia pulex
Métabolisme
énergétique
Cytoplasme
Aurelia aurita
Métabolisme
énergétique
Cytoplasme
Saccharomyce
s cerevisiae
Dégradation des
protéines
intracellulaires
Noyau/
cytoplasme
Penaeus sp.
Homeostasie du
calcium
Sarcoplasme
(fibres
musculaires
striées)
Xenopus
tropicalis
Inactive l'apoptose
induite par des agents
dénaturants l'ADN
Noyau/
cytoplasme
Pseudomonas
putida
oxydation de l'éthanol
en acétaldéhyde
Cytoplasme
(11) 20S
proteasome subunit
Homologie avec les
séquences des banques de
données
Tableau 3.8 (suite) : Résultats de l’identification des protéines (nanoLC MSMS) présentant des
PCBs
Fragments peptidiques
variation d’expression entre les copépodes exposés aux différents contaminants et les copépodes non
Contaminants
exposés par homologie de séquence avec des protéines répertoriées dans les bases de données.
(N° du spot) Nom
de la protéine
Deux protéines impliquées dans l’homéostasie du calcium, une protéine de liaison du
calcium sarcoplasmatique et la calréticuline, ont également été identifiées. Des diminutions
d’expression de ces protéines ont été détectées après les expositions à l’EE2, à la
carbamazépine et au mélange 4-NP/NP1EC. Les diminutions d’expression de ces protéines
peuvent induire une augmentation de la concentration cellulaire en Ca2+ libre, ce qui active
des protéases qui vont hydrolyser les filaments d’actine et l’ancrage membranaire des
protéines. Les analyses des effets des contaminants sur les protéines contrôlant l’homéostasie
du Ca2+ permettent d’obtenir des informations complémentaires sur l’état physiologique des
copépodes.
Enfin, des protéines impliquées dans les mécanismes de défense cellulaire ont
également été induites par les expositions aux différents contaminants. Des niveaux
d’expression croissants en HSP 60, qui ont pour rôle de maintenir une conformation
fonctionnelle des protéines et d’éviter leur agrégation, ont ainsi été détectés chez les
copépodes exposés au mélange de HAP. Plusieurs auteurs ont rapportés des inductions de ces
protéines suite à des stress environnementaux (Gonzalez et Bradley, 1994) ou à des stress
chimiques (Steiner et Pickwell, 1993). Snyder et al. (2001) ont notamment mentionné une
induction des HSP 60 chez des moules exposés à des HAP. Les HSP 60, comme toutes les
HSP en général sont considérées comme des marqueurs généraux de stress multiples.
L’aconitase peut être associée à ces protéines intervenant dans les mécanismes de
défense cellulaire. En effet, une étude récente a mentionné une nouvelle fonction pour cette
protéine. Selon Chen et al. (2005), l’aconitase tient un rôle important dans le maintien de
l’intégrité de l’ADN mitochondrial. Ces auteurs ont montré qu’en présence de bromure
d’éthidium, un puissant mutagène, l’instabilité cellulaire pouvait être supprimée par une
surexpression de l’aconitase. Toutefois, cette activité fonctionnelle est indépendante de
l’activité catalytique de cette protéine intervenant dans le cycle de Krebs. Ces résultats
suggèrent que des génotoxiques environnementaux peuvent induire une augmentation des
niveaux d’aconitase mitochondriale. Dans notre étude, les expositions au mélange de HAP ont
eu pour conséquence une augmentation des niveaux d’aconitase chez E. affinis. De
nombreuses études ont par ailleurs rapporté la génotoxicité des HAP (Cachot et al., 2006).
Les propriétés génotoxiques des HAP pourraient donc représenter une explication plausible
pour l’augmentation des niveaux d’aconitase mesurée chez les copépodes exposés à ces
composés.
156
L’étude des variations d’expression protéiques chez E. affinis après les expositions aux
différents contaminants organiques a permis d’observer les effets de ces contaminants sur
différents processus physiologiques vitaux pour ces organismes. De plus, la mise en évidence
des effets des contaminants sur les niveaux d’expression de certaines protéines (sous
expression, surexpression) associée à l’identification de ces protéines peuvent permettre de
proposer des biomarqueurs d’exposition sensibles et efficaces pour des études de la qualité de
des eaux estuariennes. En effet, parmi les protéines identifiées, certaines pourraient être
facilement étudiées par des techniques classiquement utilisées en écotoxicologie (mesures
enzymatiques, western blot). C’est le cas notamment de l’aconitase qui pourrait constituer un
biomarqueur de stress oxydant et également un biomarqueur d’exposition à des génotoxiques
environnementaux.
IV.2. Altération du comportement natatoire de E. affinis en réponse à l’injection de
contaminants dans son milieu (publication n°8)
Plusieurs individus issus d’une population de copépodes élevés au laboratoire depuis
plusieurs générations ont été isolés, puis dix mâles et dix femelles ont été sélectionnés. Ces
copépodes ont été placés dans deux flacons distincts de 217 mL chacun (mâles et femelles
séparés) et acclimatés à l’obscurité et à la température de la pièce pendant 30 minutes. Ces
expériences ont été réalisées sous éclairage infrarouge, dans l’obscurité la plus complète pour
éviter toute pollution du comportement natatoire des copépodes qui ont naturellement un
phototropisme important. Le comportement natatoire des copépodes (dans deux dimensions) a
été enregistré à l’aide d’une caméra sensible aux infrarouges. Après les 40 premières minutes
du film, 15 µL d’une solution de 4-NP/NP1EC sont introduits dans le milieu afin d’obtenir
après diffusion des contaminants dans l’eau une concentration proche de celle observée en
estuaire de Seine (2 µg.L-1). La réponse comportementale des copépodes est enregistrée
pendant les 40 minutes suivantes.
Deux paramètres sont étudiés pour analyser le comportement natatoire des femelles et
des mâles E. affinis avant et après l’introduction des contaminants dans le milieu, la vitesse de
nage et la trajectoire. La trajectoire des copépodes est étudiée en mesurant l’angle formé entre
deux mouvements successifs. La vitesse de nage est calculée par la distance parcourue entre
deux mouvements successifs rapportés à la vitesse d’enregistrement de la caméra.
157
Les vitesses de nage peuvent également être classées en trois groupes permettant de
définir trois états de nage : l’état 1 pour lequel les copépodes sont immobiles, l’état 2 pour
lequel la vitesse des copépodes est supérieure à 0 et inférieure à 10 mm.s-1 et l’état 3 pour
lequel les copépodes présentent une vitesse supérieure à 10 mm.s-1. La représentation des
états de nage des copépodes avant et après l’injection des contaminants facilite l’analyse des
résultats. Les premiers résultats montrent qu’avant l’injection, les mâles et les femelles
présentaient des comportements natatoires différents, les mâles étant beaucoup plus actifs que
les femelles. En effet, avant l’injection, les femelles n’étaient actives que 20 % du temps alors
que les mâles étaient actifs 44 % de leur temps (Figure 3.21). Plusieurs études ont montré que
chez les copépodes, les mâles étaient plus rapides que les femelles dans les comportements
d’accouplement (Buskey, 1998; Nihongi et al., 2004). La plupart des données disponibles à
l’heure actuelle indiquent que se sont les mâles qui recherchent les femelles et aucune preuve
du contraire n’a été fournie (Katona, 1973; Uchima et Murano, 1988). Les mâles peuvent
ainsi, soit augmenter leur vitesse pour augmenter la fréquence des rencontres avec les
femelles (Buskey, 1998), soit augmenter leur vitesse après la détection de signaux chimiques
émis par les femelles (Doall et al., 1998; Nihongi et al., 2004).
Figure 3.21 : Proportions moyennes de chaque état de nage pour les femelles et pour les mâles E.
affinis, avant et après l’injection de la solution de contaminants. Les vitesses de nage sont classées en
trois états (a.) : état 1, copépodes immobiles; état 2, faible vitesse de nage (0< vitesse ≤10 mm.s-1); état
3, vitesse de nage rapide ou saut (vitesse > 10 mm.s-1). Les angles formés entre deux déplacements
sont également classes en trois catégories (b.) : catégorie 1, copépodes se déplaçant vers l’arrière (0° ≤
γ < 90°); catégorie 2, copépodes se déplaçant à droite ou gauche (γ = 90°); catégorie 3, copépodes se
déplaçant vers l’avant (γ > 90°). (FAv : femelles avant l’injection; FAp : femelles après l’injection;
MAv : mâles avant l’injection; MAp : mâles après l’injection).
158
Dans notre étude, les mâles et les femelles étant séparés, les différences d’activité
natatoire entre les mâles et les femelles pourrait s’expliquer par une différence de
comportement classique chez les copépodes, avec des mâles qui explorent leur milieu à la
recherche d’une femelle pour s’accoupler et des femelles peu actives.
Pour chaque condition testée, mâles avant et après l’injection et femelles avant et après
l’injection, des profils de distribution des fréquences (PDFs) des vitesses de nage ont été
représentés graphiquement (Figure 3.22). Ces résultats indiquent que l’injection du mélange
4-NP/NP1EC induit une modification des vitesses de nage aussi bien chez les mâles que chez
les femelles, en comparaison avec leurs vitesses de nage avant l’injection. Ces copépodes
étant une grande partie de leur temps immobiles, les modifications des vitesses de nage
observées après l’injection de la solution de contaminants sont plus marquées lorsque l’on
représente les PDFs en excluant les vitesses de nage proche de 0 (Figure 3.22 b1 et b2). Cette
représentation alternative montre que les vitesses de nage des femelles sont plus modifiées
après l’injection des contaminants que celle des mâles.
Figure 3.22 : Profils de distribution des fréquences (PDFs) des vitesses de nage (en transformation
log-log) des femelles (a1) et des mâles (a2) avant et après l’injection de la solution de contaminants.
Les PDFs des vitesses de nage des femelles (b1) et des mâles (b2) sont également présentés sans tenir
compte de la valeur minimale de nage.
159
Pour les mâles comme pour les femelles, une augmentation de l’activité natatoire est
observée après l’injection des contaminants. En effet, des diminutions de 13 % et de 12 % de
la fréquence de l’état de nage 1 ont été observées respectivement chez les femelles et chez les
mâles (Figure 3.21 a). A contrario, des augmentations de fréquence de l’état de nage 2 ont été
relevées chez les femelles (12 %) et chez les mâles (10 %). Des résultats similaires ont été
rapportés par Faimali et al. (2006) qui ont montré une augmentation de l’activité natatoire des
larves de Balanus amphitrite induite par de faibles concentrations de zinc pyrithione (biocide)
et de Cidial (pesticides). Charoy et Jensen (1999) n’ont observé aucune modification de
l’activité natatoire chez Brachionus calyciflorus après 5 minutes d’exposition au cuivre, au
pentachlorophénol et au lindane. Toutefois, à notre connaissance, aucune étude n’a été menée
pour étudier le comportement de fuite des copépodes suite à stress chimique. La plupart des
études comportementales effectuées sur des espèces zooplanctoniques ont été réalisées après
des expositions de quelques jours à des contaminants dissous dans l’eau. Roast et al. (2000)
ont notamment montré une augmentation de l’activité natatoire chez Neomysis integer après
une exposition de 7 jours à de faibles concentrations de chlorpyrifos. Cependant les
modifications du comportement natatoire après des expositions de plusieurs jours à différents
contaminants sont probablement liées à des effets à des niveaux d’organisation biologique qui
impliquent des mécanismes physiologiques et biochimiques (Weis et al., 2001). Dans notre
étude, les variations de l’activité natatoire sont clairement associées à une réponse
comportementale. Dans l’estuaire, une augmentation de l’activité natatoire pourrait augmenter
la vulnérabilité de cette espèce en augmentant les probabilités de rencontre avec des
prédateurs visuels. Dodson et al. (1995) ont ainsi rapporté une augmentation de la prédation
de Daphnia pulex après une exposition au carbaryl. Toutefois, la contamination du milieu
peut également altérer l’efficacité du prédateur.
Les trajectoires des copépodes semblent avoir été également modifiées suite à
l’injection de contaminants dans leur milieu. En effet, les PDFs des angles de nage sont
différents avant et après l’introduction des contaminants, chez les mâles comme chez les
femelles. Une différence plus nette a malgré tout été observée chez les mâles ce qui indiquent
que les trajectoires des mâles ont probablement été plus modifiées que celles des femelles.
Ces angles peuvent, comme les vitesses de nage, être classés en trois groupes
correspondant à trois types de trajectoire : catégorie 1 pour laquelle les copépodes se
déplacent vers l’arrière (0° ≤ angle < 90°), catégorie 2 pour laquelle les copépodes se
déplacent à droite ou à gauche (angle = 90°) et catégorie 3 pour laquelle les copépodes se
déplacent vers l’avant (angle > 90°).
160
Figure 3.23 : Profils de distribution des angles de nage cumulés (PDF) (en transformation log-log)
pour les femelles (a.) et pour les mâles (b.) avant et après l’injection de la solution de contaminants.
Les résultats présentés dans la Figure 3.21 b. montrent une diminution des angles de la
catégorie 1 et une augmentation des angles de la catégorie 2 chez les femelles. Pour les mâles,
une diminution des angles de la catégorie 1 ainsi qu’une augmentation des angles de la
catégorie 3 ont été observées après l’injection. Ces observations indiquent que les femelles,
après l’injection, se déplaçaient plus sur leurs côtés et moins vers l’arrière alors que les mâles
se déplaçaient plus vers l’avant et moins vers l’arrière. Ces résultats indiquent un
comportement de fuite chez les mâles suite à l’introduction des contaminants.
La communication chemo-sensorielle joue un rôle important chez les copépodes pour
leur accouplement. De nombreuses études ont montré que les perturbateurs endocriniens tels
que les alkylphénols pouvaient perturber la communication sexuelle chez les organismes
aquatiques, notamment les poissons. Par exemple, des expositions de guppies mâles à des
alkylphénols ont induit des modifications du comportement sexuel de ces organismes (Bayley
et al., 1999). De même, d’autres composés qui ne sont pas classés parmi les perturbateurs
endocriniens peuvent également perturber les communications chemo-sensorielles intersexe
lors de la reproduction. Par exemple, des expositions de Salmo salar à la cyperméthrine ont
réduit significativement la réponse des mâles aux phéromones émises par des femelles
matures (Moore et Waring, 2001). Il n’est donc pas impossible que la présence d’alkylphénols
dans l’eau puisse perturber la détection de signaux chimiques dissous ou adsorbés à la surface
des copépodes.
Ces expériences ont mis en évidence que l’introduction d’une faible dose d’un
mélange de 4-NP/NP1EC dans l’eau pouvait induire une modification du comportement
161
natatoire chez les mâles comme chez les femelles E. affinis. Deux paramètres caractéristiques
du comportement natatoire ont été analysés, l’activité de nage et les angles de nage. Ces deux
paramètres ont été modifiés après l’injection de contaminants. Ces résultats montrent que
l’analyse du comportement natatoire des copépodes et plus particulièrement l’activité de nage
peut être utilisé pour détecter des contaminants organiques dans l’eau, y compris pour de
faibles concentrations.
162
Conclusions &Perspectives
Conclusion générale
163
164
Le premier objectif de ces travaux de thèse était de déterminer les principaux
contaminants organiques présents en estuaire de Seine, de caractériser leurs niveaux de
concentrations respectifs dans les différents compartiments de la colonne d’eau (phase
dissoute et phase particulaire) et de mettre en évidence leurs transferts potentiels du milieu
vers l’espèce zooplanctonique la plus abondante de cet estuaire, le copépode Eurytemora
affinis. Le but était de caractériser le risque toxique pour E. affinis associé dans un premier
temps à la contamination organique de la colonne d’eau puis dans un second temps, celui
associé aux contaminants organiques accumulés par E. affinis qui représente l’une des sources
principales de nourriture pour les poissons planctonivores de l’estuaire et de la baie de Seine.
L’étude de terrain a permis de mettre en évidence une contamination importante de
l’estuaire en contaminants organiques hydrophobes. Des concentrations élevées en PCB, en
HAP et en alkylphénols/alkylphénols polyéthoxylés (APs/APEs) ont ainsi été mesurées dans
la phase particulaire de l’estuaire de Seine (de quelques centaines de ng jusqu’à plusieurs
µg.g-1 de particules). Des transferts importants de ces trois classes de contaminants ont
également été observés chez E. affinis. L’analyse des cycles biogéchimiques de ces
contaminants a montré des variations saisonnières principalement associées aux variations des
paramètres physico-chimiques de l’estuaire. Des pics de contamination en PCB, en HAP et en
APs/APEs ont ainsi été mesurés chaque année dans les particules en période de crue, en
relation avec l’augmentation du débit de la Seine. Par ailleurs, des pics de contamination en
PCB et en HAP ont été mesurés chaque année en période hivernale chez E. affinis, lorsque la
température de l’eau descendait en dessous de 10°C. En effet, le cycle de vie de ces
copépodes est fortement corrélé à la température de l’eau. Lorsque celle-ci diminue le cycle
de vie du copépode E. affinis est allongé ce qui augmente la durée d’exposition de ces
copépodes aux contaminants organiques de la colonne d’eau et donc l’accumulation de
contaminants organiques. De plus l’activité métabolique des copépodes est également
influencée par la température de l’eau. En effet, lorsque la température de l’eau décroît, le
métabolisme de ces organismes ralenti progressivement ce qui peut limiter la métabolisation
des contaminants accumulés. Dans la phase dissoute, des concentrations faibles en PCB et en
HAP ont été mesurées en estuaire de Seine (de l’ordre de la dizaine de ng.L-1). De même, des
concentrations faibles en triazines ont été détectées avec une quasi absence de pic de
concentration dans la phase dissoute pendant les périodes d’épandage. En revanche, des
teneurs élevées en alkylphénols et en alkylphénols polyéthoxylés ont été relevées dans la
phase dissoute de l’estuaire de Seine (de l’ordre de 1 à plusieurs µg.L-1).
165
Les concentrations en PCB, en HAP et en APs/APEs particulaires et les concentrations
en APs/APEs en phase dissoute mesurées au cours de cette étude étaient régulièrement
supérieures aux seuils de toxicité définis respectivement par Long et al. (1995) et par l’Union
Européenne. Le risque d’observer des effets toxiques induits par ces contaminants chez les
organismes aquatiques est donc élevé en estuaire de Seine, du moins en théorie si on se base
sur les seuils de toxicité précédemment mentionnés. Toutefois, cette contamination
importante ne semble pas avoir d’effet sur la démographie de E. affinis puisque ce copépode
présente des densités plus importantes que dans n’importe quel autre estuaire. Une autre
preuve de la tolérance de cet organisme à des concentrations importantes en contaminants
organiques est la capacité des cohortes hivernales, dont la densité chute par rapport au reste de
l’année et qui permettent de maintenir la population totale, à accumuler des concentrations
très élevées en contaminants. Par ailleurs, les fortes concentrations en PCB, en HAP et en
APs/APEs mesurées chez E. affinis peuvent potentiellement représenter un risque toxique
élevé pour les organismes planctonivores le consommant. En effet, l’estuaire de Seine est
caractérisé par une plus faible richesse spécifique, en comparaison avec les autres estuaires
français et européens. Ce paradoxe entre les fortes densités de E. affinis et les plus faibles
densités et variétés des prédateurs observées en estuaire de Seine peut donc éventuellement
être expliqué par la contamination et les différents degrés de tolérance des espèces
estuariennes à ces contaminants. Une analyse des variations saisonnières du régime
alimentaire des organismes planctonivores en estuaire de Seine permettrait d’identifier les
principaux prédateurs de ce copépode et d’observer d’éventuelles pathologies associées à leur
consommation. En effet, l’une des questions encore sans réponse est de savoir si E. affinis fait
l’objet d’une prédation importante ou non en estuaire de Seine, compte tenu des très grandes
densités observées dans cet estuaire. Une étude expérimentale des relations proies/prédateurs
avec une ou plusieurs espèces planctonivores permettrait de confirmer leurs taux de prédation
sur des populations d’E. affinis pélevées en estuaire de Seine, en comparaison avec leur taux
de prédation sur des proies non contaminées. Les densités importantes de ce copépode en
estuaire de Seine pourraient en effet être la conséquence d’une adaptation des mécanismes de
reproduction et de la productivité de cette espèce en réponse à une prédation importante.
L’étude du cycle biogéochimique des PCB et des HAP au cours d’un cycle de marée a
montré que l’augmentation de la vitesse du courant observée pendant la marée augmentait la
biodisponibilité de ces contaminants dans la colonne d’eau. Une augmentation de la teneur en
HAP particulaire a notamment été observée pendant la période de la marée où la vitesse du
166
courant était maximale. Par ailleurs, cette étude a montré une contamination de la colonne
d’eau en PCB et en HAP plus importante en profondeur qu’en surface principalement
associée à la charge particulaire.
Des variations des activités acétylcholinestérase et glutathion-S-transférase, caractéristiques
d’une exposition à des contaminants, ont été observées chez E. affinis en relation avec
l’augmentation de la biodisponibilité des PCB et des HAP dans la colonne d’eau mais
également avec les variations de la salinité de l’eau. Une étude expérimentale a donc été
menée pour identifier les effets des facteurs abiotiques sur les activités AChE et GST chez E.
affinis. Des effets significatifs de la température et de la salinité sur ces activités
enzymatiques ont été mis en évidence chez E. affinis, après exposition à différentes salinités
pendant 72 heures et à différentes températures pendant 18 heures. Des optimums de salinité
(entre 10 et 15 psu) et de température (11°C) ont été déterminés pour ces deux activités, chez
E. affinis. Par ailleurs, de faibles variations des activités AChE et GST ont été observées au
cours du cycle de marée expérimental. Ces derniers résultats indiquent que les variations des
activités AChE et GST observées pendant le cycle de marée étaient probablement liées à
l’augmentation de la biodisponibilité des contaminants organiques.
La deuxième phase de ces travaux a été consacrée à l’étude expérimentale des
transferts de plusieurs classes de contaminants organiques de la phase dissoute vers E. affinis.
Pour cela, les copépodes ont été exposés en conditions contrôlées à des flux continus de
contaminants organiques représentatifs de la contamination en estuaire de Seine et à des
concentrations réalistes du point de vue environnemental. Des facteurs de bioconcentration
particulièrement élevés ont pu être mesurés chez E. affinis pour tous les PCB. Les HAP de
haut poids moléculaire, le 17α-éthynyloestradiol et le NP1EC ont également été bioconcentrés
par E. affinis mais dans des proportions plus faibles que les PCB. Enfin, le 4-NP et les HAP
de faible poids moléculaire ont été faiblement bioconcentrés par ce copépode. Ces
expériences ont mis en évidence des niveaux d’accumulation différents pour les contaminants
testés ce qui peut suggèrer d’une part une accumulation sélective des contaminants organiques
chez E. affinis ou d’autres part des capacités de biotransformation différentes pour chaque
contaminant chez cet organisme. En parallèle des expériences d’exposition, des copépodes
prélevés en estuaire de Seine, qui présentaient des teneurs non négligeables en contaminants
organiques, ont été soumis à une dépuration d’une semaine au laboratoire en conditions
contrôlées. Ces expériences ont permis d’observer les capacités importantes de cet organisme
à éliminer rapidement différentes classes de contaminants organiques. Ainsi, les HAP que ces
167
copépodes avaient accumulé dans l’estuaire de Seine ont été rapidement entièrement éliminés,
les HAP de faible poids moléculaire ayant été plus rapidement éliminés que les HAP de haut
poids moléculaire. De même, la totalité du 17 α-éthynyloestradiol accumulé in situ par ces
copépodes a été éliminé après trois jours de dépuration. Concernant les alkylphénols
polyéthoxylés, la diminution progressive de la concentration en NP1EC associée à
l’augmentation de la concentration en 4-NP suggère une élimination totale du NP1EC chez
ces copépodes avec formation de 4-NP. En revanche, une faible élimination des PCB a été
observée chez E. affinis. Seuls les PCB de plus faible moléculaire ont présenté une légère
diminution.
Afin d’approfondir les mécanismes de transfert et d’élimination des différents
contaminants testés au cours de ces travaux de thèse, de nouvelles expériences d’exposition
pourraient être menées. L’aspect cinétique de l’accumulation des contaminants et de leur
biotransformation (identification et quantification des métabolites formés et des processus
biochimiques impliqués dans ces voies de dégradation) serait alors étudié simultanément. Ces
expériences complémentaires permettraient notamment de mieux comprendre les voies de
dégradation des alkylphénols, du 17 α-éthynyloestradiol et des HAP chez E. affinis.
La dernière partie de ces travaux avait pour objectif d’observer la toxicité de plusieurs
contaminants organiques et d’identifier de nouveaux biomarqueurs d’exposition à des stress
chimiques chez E. affinis. Les expériences d’exposition en flux continu ont montré que les
différents contaminants organiques induisaient des modifications spécifiques de l’expression
protéique chez E. affinis, y compris pour de faibles concentrations. L’analyse de ces
variations d’expression protéique a permis de mettre en évidence les effets des contaminants
organiques testés sur différents processus cellulaires et notamment sur le métabolisme
énergétique, sur l’homéostasie du calcium et sur les mécanismes de défense cellulaire contre
des stress. Parmi les protéines identifiées (par homologie de séquence avec des protéines des
banques de données) certaines peuvent constituer des biomarqueurs d’exposition potentiels.
L’expression de l’aconitase mitochondriale, par exemple, pourrait représenter un biomarqueur
d’exposition
à
des
substances
génotoxiques
environnementales.
Des
expériences
supplémentaires sont toutefois nécessaires pour valider l’utilisation de cette protéine en tant
que biomarqueur.
Le comportement natatoire des copépodes a également été étudié en réponse à
l’introduction d’une solution de contaminants dans leur milieu. Ces expériences ont montré
que l’activité natatoire des mâles comme des femelles augmentait après l’injection des
168
contaminants, avec des vitesses de nage légèrement plus importantes. Cette modification de
comportement en réponse à la présence de contaminants peut avoir des conséquences néfastes
en estuaire de Seine d’une part en perturbant les mécanismes de défense des copépodes
(fuites) face à leurs prédateurs ou d’autre part, en augmentant les probabilités de rencontre
entre ces copépodes et leurs prédateurs. Cette modification du comportement natatoire des
copépodes peut également perturber leur reproduction en modifiant les probabilités de
rencontre entre les mâles et les femelles. En effet, pour des organismes de cette taille, le
principal facteur limitant dans le processus de reproduction tient dans la probabilité de la
rencontre entre deux individus de la même espèce et de sexes opposés. L’augmentation de
l’activité natatoire en présence de contaminants peut augmenter ou diminuer les probabilités
de rencontre entre les copépodes. La présence de contaminants dans le milieu peut également
masquer les signaux hormonaux émis dans le milieu ou à la surface des copépodes pour
permettre et faciliter les rencontres entre mâles et femelles lors de la reproduction. Les
perturbations du comportement natatoire des copépodes induites par des contaminants
peuvent donc nuire au succès de la reproduction. Une hypothèse peut être formulée à partir
des résultats de cette dernière expérience. Les densités élevées du copépode E. affinis en
estuaire de Seine peuvent être dues à une augmentation de la production de cet organisme
pour compenser les perturbations de rencontre entre les sexes opposés dues à la
contamination. Des expériences supplémentaires sont toutefois encore nécessaires pour
valider l’utilisation du comportement natatoire en tant que biomarqueur d’exposition à un
stress chimique.
L’ensemble des résultats obtenus au cours de ces travaux souligne que E. affinis
présente une densité importante dans un milieu particulièrement contaminé, l’estuaire de
Seine. Ce copépode peut par ailleurs accumuler des quantités importantes de contaminants
organiques mais il peut également les métaboliser. En outre, différents effets biologiques ont
pu être mesurés chez E. affinis en réponse à des expositions à des contaminants organiques.
Certains de ces effets font, à l’heure actuelle, l’objet de recherches plus poussées afin de
développer des biomarqueurs d’exposition fiables. E. affinis, qui est une espèce
caractéristique des estuaires de l’Atlantique nord, présente donc de nombreux avantages pour
être utilisée en tant qu’espèce sentinelle dans des programmes de biosurveillance des milieux
estuariens.
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211
Bibliographie
212
Annexes
Annexes
213
Annexes
214
Annexes
Annexe 1
Références et conditions d’analyse des HAP en CPG SM
- Appareillage : Chromatographe HP model series 6890A (Agilent Technologies)
couplé à un spectromètre de masse 5973 de marque Agilent Technologies (Palo Alto,
USA)
- Solvant d’injection : iso-octane
- volume injecté : 1 µL
- Conditions d’injection : mode splitless; pression pulsée
- Mode d’analyse : sélection d’ions (temps d’accumulation 40 ms)
- Mode d’ionisation : impact électronique avec une énergie d’ionisation de 70 eV
- Colonne chromatographique : HP5-MS (5% phényle 95% méthylesiloxane); 30 m ×
0,25 mm d.i., 0,25 µm d’épaisseur de phase (Agilent Technologies)
- Gaz vecteur : Hélium Linde qualité 6,0 (99,9990%)
- Débit de gaz vecteur : 1 mL.min-1 constant
- Gradient de température : 50°C : 2 min; montée à 290°C (rampe de 5°C.min-1)
- Température de l’injecteur et de l’interface : respectivement 270°C et 290°C
- Température de la source : 100°C- multiplicateur d’électron : 1500 V
215
Annexes
Annexe 2
Références et conditions d’analyse des stéroïdes en CPG SM
- Appareillage : Chromatographe HP model series 6890A (Agilent Technologies)
couplé à un spectromètre de masse 5973 de marque Agilent Technologies (Palo Alto,
USA)
- Solvant d’injection : MSTFA + dichlorométhane (1:1, v/v)
- Volume injecté : 2,5 µL
- Conditions d’injection : mode splitless; pression pulsée (25.0 psi pendant 60s); purge
à 60 mL.min-1 après 1,5mL
- Mode d’analyse : sélection d’ions (temps d’accumulation 80 ms, 1,1 cycles.s-1)
0,25 mm d.i., 0,25 µm d’épaisseur de phase (Agilent Technologies)
- Gaz vecteur : Hélium Linde qualité 6,0 (99,9990%)
- Débit de gaz vecteur : 1 mL.min-1 (constant)
- Gradient de température : 90°C : 1 min; montée à 290°C (rampe de 7.5°C.min-1),
isotherme 5 min
- Température de la source : 230°C- multiplicateur d’électron : 1500-1800 V
216
Annexes
Annexe 3
Références et conditions d’analyse des triazines et carbamates en CPG SM
- Appareillage : Chromatographe HP model series 5890 (Agilent Technologies) couplé
à un spectromètre de masse de marque Agilent Technologies (Palo Alto, USA)
- Solvant d’injection : isooctane
- Volume injecté : 0.5 µL
- Conditions d’injection : mode splitless; pression pulsée
- Mode d’analyse : sélection d’ion (temps d’accumulation 80 ms, 1.1 cycles.s-1)
0.25 mm d.i., 0.25 µm d’épaisseur de phase (Agilent Technologies)
- Gaz vecteur : Hélium Linde qualité 6.0 (99.9990%)
- Débit de gaz vecteur : 1 mL.min-1 (constant)
- Gradient de température : 50°C : 2 min; montée à 250°C (rampe de 5°C.min-1),
isotherme 2 min
- Température de la source : 250°C multiplicateur d’électron : 1500
217
Annexes
Annexe 4
Références et conditions d’analyse des PCB en CPG DCE
- Appareillage : Chromatographe Hewlett-Packard (Avondale, MA, USA) 5890A
series II couplé à un détecteur à capture d’électrons (source 63Ni)
- Solvant d’injection : iso octane
- Volume injecté : 1 µL
- Temps de purge : 1 min
- Conditions d’injection : mode splitless; débit du gaz de purge à 60 mL.min-1
0,25 mm d.i., 0,25 µm d’épaisseur de phase
- Gaz vecteur : Hélium Linde qualité 6.0 (99.9990%)
- Débit en tête de colonne : 1 mL.min-1
- Gradient de température : 60°C : 2 min; montée à 120°C (rampe de 6°C.min-1),
isotherme 5 min; montée à 280°C à 2°C.min-1
- Température de l’injecteur : 280°C
- Température de la source : 290°C
218
Annexes
Annexe 5
Références et conditions d’analyse des Alkylphénols en CPL SM
- Appareillage : Chromatographe Agilent 1100 series (Agilent Technologies) couplé à
un spectromètre de masse 5973 de marque Agilent Technologies (Palo Alto, USA)
équipé d’un ionisateur électrospray
- Solvant d’injection : méthanol
- Volume injecté : 5 µL
- colonne chromatographique : Kromasil C18 (Interchim, France); 150 m × 2.1 mm
d.i.× 3 µm
- Mode d’analyse : sélection d’ions (conférer matériels et méthodes)
- Mode d’ionisation : électrospray à pression atmosphérique
- Débit en tête de colonne : 0,15 mL/min
- gradient :démarrage avec 40 % de A et 60 % de B (A : mélange eau/méthanol/acétate
d’ammonium, B : méthanol) pendant 2 min, montée à 80 % de B en 5 minutes, B maintenu à
80% pendant 28 min, diminution de B à 60% en 3 minutes, B à 60% pendant 14 minutes.
- Température de la chambre d’ionisation : 350°C
- Température de la colonne : 20°C
- Température de la source : 100°C
219
Annexes
220
Publications
Publications
221
Publications
222
Publications
Publication n° 1 :
Seasonal variations of hydrophobic organic contaminant concentrations in the watercolumn of the Seine Estuary and their transfer to a planktonic species Eurytemora
affinis (Calanoïda, copepoda). Part 1: PCBs and PAHs.
K. Cailleaud 1, 2, 3, J. Forget-Leray3, S. Souissi2, D. Hilde2, K. LeMenach1, H. Budzinski1
1. Université Bordeaux 1, CNRS, ISM-LPTC-UMR 5255 (Laboratory of Physico and Toxico-Chemistry), 351
cours de la Libération 33405 Talence, France.
2. Université des Sciences et Technologies de Lille, CNRS, UMR 8013 Ecosystèmes Littoraux et Côtiers, 32
avenue. Foch, 62930 Wimereux, France.
3. Faculté des Sciences et Techniques du Havre, LEMA-UPRES EA3222 (Laboratoire d’Ecotoxicologie-Milieux
Aquatiques), GDR IMOPHYS, 25 rue Philippe Lebon, 76058 Le Havre, France.
* corresponding author. Tel: 0033-5-40006998; fax: 0033-5-400069
E-mail address: [email protected] (H. Budzinski)
Abstract:
Hydrophobic organic contaminants (HOC) (i.e. PAHs and PCBs) were measured in the water column
and in Eurytemora affinis samples from the Seine Estuary collected from November 2002 to February 2005.
Results showed seasonal variations of both total PCB and PAH levels in the suspended particulate matter (SPM)
and in the copepods with maximum levels during winter times. PAH and PCB concentrations in the SPM ranged
from 499 to 5819 ng.g-1 and from 58 to 463 ng.g-1, respectively. Phenanthrene, pyrene and
benzo[b+j+k]fluoranthene (B[b+j+k]F) were the predominant PAH compounds in the water column, while CB
101, 118, 153 and 138 were the most abundant PCB congeners. PCBs and PAHs bioaccumulated by Eurytemora
affinis (EA) varied between 383-1785 ng.g-1 and 165-3866 ng.g-1. CB101, 153, 138 and B[b+j+k] were
respectively the major compounds of PCB and PAH fingerprints in EA. Thereby, the copepods could reach high
accumulation factor (ACF) (91,000 for PCBs and 17,000 for PAHs). The principal component analyses of
contaminant concentrations and environmental parameter data sets distinguished two groups of copepods. The
winter time cluster, with high percentage of adult copepods, which bioaccumulated the highest PCB and PAH
body-burdens, and the second cluster with juveniles showing the lowest HOC concentrations. Thus, PAH and
PCB concentrations in EA exhibited significant correlations with the percentage of adults making up the
samples.
Keywords: PAHs; PCBs; Seine Estuary, copepod; seasons
Chemosphere, In press
Publications
1. Introduction
During the last decade, the water quality has become one of the principal international concerns for the
ecological fate of ecosystems. Estuaries are among the most ecologically productive aquatic environments,
showing huge environmental and economic values because they are reproductive and nursery areas for several
commercial marine species. These ecosystems are highly variable types of environment and receive frequent
inputs of organic anthropogenic contaminants from various sources including industrial discharges, urban and
agriculture runoff, atmospheric deposition and other sources (Motelay-Massei et al., 2004, 2007).
The Seine river drains the fourth watershed area of France (78 650 Km2), and flows into the English
Channel in the North-West of France. The average annual water discharge is 453 m3 s-1, ranging from 100 to
2000 m3 s-1. The average annual solid discharge is estimated to be 0.2-1×106 t. This watershed is characterized
by a high density of urban population (16 millions inhabitants mainly in Paris and its suburbs) and supports
almost 40% of the French economic activity (principally through chemical industry). The Seine Estuary is the
largest megatidal estuary along the English Channel and is also an important commercial shipping route for
international exchanges, with the fifth largest European harbor. The increases in human population and industrial
activity (petrochemistry, automobile traffic, domestic heating) over the last 50 years in the Seine river basin have
resulted in increasing inputs of contaminants and particularly in micro-organic contaminants. In other respects,
ecological studies of the estuarine communities have reported a low biodiversity in the Seine Estuary, in
particular for planktonic species. Actually, the Seine Estuary is characterized by a dominant copepod species
(crustacean, calanoïd), Eurytemora affinis (size <250-900µm<), that represents more than 90 % of the
zooplankton biodiversity in the oligohaline zone and which could reach high densities in comparison to other
European estuaries (Mouny and Dauvin, 2002). Therefore, this species is fundamental in the ecological
equilibrium of the local food web and could contribute to the transfer of contaminants toward higher trophic
levels.
Among the most worrying contaminants, the hydrophobic organic contaminants (HOCs) which include
polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs), polychlorinated biphenyls (PCBs), alkylphenols (AP) and many
pesticides, have been detected at high levels in many North-Atlantic estuaries (Ko and Baker, 1995; Fernandez et
al., 1997; Minier et al., 2006) and have been included in the priority pollutant lists of the US-EPA and UN-ECE
POP Protocol (Lerche et al., 2002). The occurrence of high levels of PCBs and PAHs has been reported in the
Seine River and in its estuary (Fernandez et al., 1997; Motelay-Massei et al., 2002; Minier et al, 2006). Both
PAHs and PCBs are semi-volatile molecules and are consequently ubiquitous environmental contaminants
(McVeety and Hites, 1988; Lang, 1992). PCBs are anthropogenic molecules referred as persistent (Tanabe,
1988), bioaccumulative and particularly toxic to aquatic organisms with endocrine disrupting properties (Fossi
and Marsili, 2003). Due to these characteristics, PCBs have been banned since the end of the seventies in the
USA and the end of the eighties in France (Erickson, 2001). In Europe, equipments containing PCBs must be
decontaminated or disposed by 2010 at the latest.
PAHs are known to be carcinogenic mutagenic and genotoxic to both aquatic and terrestrial organisms
(Jones and Freundenthal, 1978; White, 1986; Phillips and Grover, 1994; Cachot et al., 2006). Two anthropogenic
sources are currently mentioned for PAHs in the aquatic environments (Budzinski et al., 1997; King et al., 2003);
the major one is a pyrolytic origin, the second one is a petrogenic origin (Merrill and Wade, 1985); besides these
two major ones there is a natural diagenetic origin. The concentrations, distribution and fate of these
contaminants in estuarine waters, sediments and biota are influenced by numerous factors (salinity, pH,
temperature, SPM, river flow, tidal currents…). However, most of the published data have been obtained without
any temporal monitoring and give imperfect indications of the temporal variations. Transfer mechanisms of these
contaminants from the water column to organisms, especially to planktonic species, which play a key role in the
exchange of organic matter in the local food web, are not well defined. Although some experimental studies have
reported the transfer of organic contaminants to zooplankton species (Harris et al., 1977; Magnusson et al., 2007)
there are very limited field data on HOCs bioaccumulated by copepods. Nevertheless, the understanding of these
phenomena is essential for toxicological risk assessments of contaminants on the biota.
The research presented in this series of two articles is a part of an interdisciplinary program focusing on
estuarine water quality. This work was conducted to explore the various factors (physicochemical and
ecological) controlling the seasonal variations of hydrophobic organic pollutant concentrations in the water
column of the Seine Estuary river and to improve our understanding of the transfers of these contaminants to EA,
a key role copepod species of this estuary. In this first paper, the results concerning PCB and PAH
contaminations are presented and discussed.
2. Material and methods
2.1. Sample collection
Publications
Samples were collected from November 2002 to February 2005 (Table 1) at the Tancarville station in
the oligohaline part of the Seine Estuary using the Seine-Aval Research Program boat (Fig. 1). During the first
year, water (SPM and dissolved phase) and copepod samples were collected in the same tidal conditions, after
the slack at the beginning of the ebb tide. During the second year, only copepods were sampled (Table1).
Zooplankton samples were collected on sub-surface with standard WP2 nets (200 µm mesh size; diameter: 1m)
towed horizontally for 5 minutes against the tide, 30 m away from the motor to prevent water disturbance
phenomena. Samples from the nets were immediately filtered with 500 µm sieves (to eliminate copepod
predators) and transferred into containers. Then, the copepods were transferred into the laboratory and sorted
quickly (< 3h) using several times the sequence: Dilution-Decantation-Photo attraction. Mineral clean water
adjusted to a salinity of 5 PSU was used to dilute the natural water samples. The phototropism of the copepods
was used to separate these organisms, from the underlying particles in order to make sure of the composition of
the matrix for the following chemical analysis. When exposed during a prolonged time to a salinity of 5 PSU,
both freshwater and marine zooplankton species died and only Eurytemora affinis species survived. Ultimately,
the copepods were filtered and placed in plastic cryo-vials and frozen at -20°C until their analysis. For each
sampling period, the abundance of each stage of Eurytemora affinis was identify in one sample, fixed with 5%
buffered formaldehyde (Sigma Aldrich, St Quentin Fallavier, France).
Water was collected during the tows, 1 m below the surface using 4l glass bottles cleaned with detergents, rinsed
with pure water, heated overnight and closed with PTFE screw caps. Then, water samples were taken to the
laboratory.
2.2. Analytical procedure
Internal standard mixtures were gravimetrically added before the solvent introduction, as reported
elsewhere (Budzinski et al., 1997; Thompson et al., 2002). PAHs are quantified using the response factors of
perdeuterated internal standards (phenanthrene d10 for phenanthrene (Phe) and anthracene (An), fluoranthene d10
for fluoranthene (Fluo) and pyrene (Pyr), chrysene d12 for benz[a]anthracene (BaA) and triphenylene+chrysene
(Triph+Chry), benzo[e]pyrene d12 for benzo[b] + benzo[j] + benzo[k] fluoranthene (B[b+j+k]F), benzo[e]pyrene
(BeP) and perylene (Per), benzo[a]pyrene d10 for benzo[a]pyrene (BaP) and benzo[ghi]perylene d12 for
indeno[1,2,3-cd]pyrene
(IP),
dibenz[a,h]anthracene
+
dibenzo[a,c]anthracene
(DaA+DaC)
and
benzo[ghi]perylene (BP)) and are obtained from Cambridge Isotope Laboratories (Cambridge, UK) and from
MSD isotopes (Montreal, Canada). PCBs are quantified according to the response factors of the following
internal standards PCB 30, 103, 155 and 198 (Promochem, Molsheim, France). All solvents were either HPLC
grade or Organic residue analysis grade and were purchased from Atlantic Labo (Eysines, France). Silica
(particle size 0.063-0.2mm) and alumina gels (0.063-0.2mm) were obtained from Merck (Darmstadt, Germany);
anhydrous sodium sulfate (NA2SO4) (purity>99%) was purchased from Fluka chemie (Buchs, Switzerland).
Before the use, silica, alumina and NA2SO4 are rinsed several times with dichloromethane of analysis grade and
activated at 150°C overnight.
- Water analyses
Water samples (2 L) were filtered using 0.7 µm GF/F glass microfiber filters (whatman). Dissolved
PAHs and PCBs were liquid-liquid extracted using dichloromethane. The particle fractions were freeze-dried
and both PAHs and PCBs were extracted by Micro-Wave Assisted Extraction (time: 10 min at 30 W)
(Maxidigest 350 PROLABO) with dichloromethane, then filtered, and purified with 15 ml of diluted sulfuric
acid (18 N) under gentle stirring and micro-wave field (10 min, 30W). The organic extract was neutralized with
de-ionized water. Then, all extracts were dried with anhydrous sodium sulfate and were eluted through silica and
activated copper micro-columns using 15 ml of a 90/10 pentane/dichloromethane mixture. The obtained extracts
were then reduced to 100 µL using rotary evaporation and nitrogen stream. PCB and PAH fractions were
separated by high pressure liquid chromatography (HPLC) on an aminosilane column with pentane as eluting
solvent (Thompson et al., 2002).
- Organism analyses
The copepods were freeze-dried and PCBs and PAHs were extracted from distinct samples by MicroWave Assisted Extraction (time: 10 min at 30W). Then, the organic extracts containing PCBs were filtered and
purified with 36N sulfuric acid, neutralized, and dried as for the SPM extracts. PAH extracts were eluted through
alumina (with 15 ml of n-pentane) and silica micro-columns (as described for the SPM extracts). PCB extracts
were eluted through silica micro-columns with 15 ml of a 90: 10 n-pentane/dichloromethane mixture. The PCB
organic extracts were finally purified using HPLC as previously described by Thompson et al. (1998).
Publications
- Quality assurance
Procedural blanks were regularly performed (representing less than 10% of the sample content) and all
results presented are adjusted for the minor contributions from the blanks. All glassware was cleaned with
detergent, rinsed with ultra-pure water followed by heating at 450°C overnight. The effectiveness of the different
analytical procedures was evaluated by analyzing NIST Standard Reference Material 1944 (sediment) and 2978
(mussels) for PCBs and PAHs (Gaithersburg, MD, USA). The mean recoveries of PAHs compared to the
certified concentrations were 82% (ranging from 74 to 110%) except for anthracene (38%) for SRM 1944, and
86% (ranging from 59 to 114%) for SRM 2978; standard deviation (SD) values for each compound were lower
than 4% (n=6). For PCBs, mean recoveries were of 104% (ranging from 79 to 124%) for SRM 1944 and of 83%
(ranging from 59 to 106%) for SRM 2978 (SD lower than 4%, n=4).
- GC analyses
PCBs analyses were performed on a Hewlett-Packard (Avondale, MA, USA) 5890A series II gas
chromatograph (GC) equipped with a 63Ni electron-capture detector (ECD), and an autosampler HP 7673. PCB
congeners were determined using a 60 m × 0.25 mm i.d. × 0.25 µm film thickness HP5-MS (5% phenyl 95%
methylsiloxane) capillary column (HP). The GC conditions were the same as previously described by Thompson
et al. (1998).
The PAHs were analyzed on an HP model series 6890A (Agilent Technologies) equipped with an
autosampler and a 30 m × 0.25 mm i.d. ×0.25 µm film thickness HP5-MS (5% phenyl 95% methylsiloxane)
capillary column (Hewlett-Packard). The GC was coupled to an Agilent Networks 5973 mass selective detector
(Agilent Technologies). The mass spectrometer was operated in Single-Ion-Monitoring (SIM) mode with the
molecular ions of the studied PAHs as reported by Baumard et al. (1998).
Concentrations of PCB and PAH congeners in each extract were calculated depending on the response factors
determined by injecting standard solutions spiked with the same solutions of internal standards that have been
introduced in the samples before the extraction (Thompson et al., 2002).
2.3. Statistical analyses
The principal component analysis (PCA) is a multivariate exploratory technique that provides few linear
combinations (loading) of original variables that summarize a data set. The seasonal variations of both PAH and
PCB levels in the water column of the Seine Estuary and in EA, related to environmental parameters (salinity,
temperature, the river flow, adult copepods contribution) were analyzed by PCA in order to identify groups with
similar PAH and PCB body-burdens. Only the two principal components (accounting for more than 79% of total
variance) are reported. Moreover, considering the few replicates, a non-parametric Spearman rank R correlation
test was performed (P<0.05) to assess relationships between matrix contamination and environmental
parameters. All statistical analyses were performed with STATISTICA Software v6.0.
3 Results and discussion
3.1. Ecological variability of the Eurytemora affinis population
The full life cycle of copepods is characterized by 3 successive main developmental groups of stages:
naupliar (6 stages), copepodites (5 stages), and adults with sexual maturity (Souissi et al., 2001). During the
sampling cruises, naupliar stages were not retained by our plankton net. Therefore, only copepodite and adult
stages of EA were sampled and classified using a binocular microscope. In addition, the absence of particle and
the mono-specific composition of each sample with the copepod EA (~ 100%) were confirmed. Fig. 2 shows
seasonal variations in the population of EA. The percentage of adult copepods in the samples ranges from 2 to
56%. The highest percentages of adults are observed during the 3 winter periods whereas the maximum density
of juveniles is measured for the maximum reproduction periods (spring and autumn). Furthermore, the
percentage of adult copepods in samples is significantly inversely correlated with water temperature (R = -0.7, P
< 0.00005). These results are in agreement with the data reported by Devreker et al. (2005) that mentioned strong
negative correlation between the survival of Temora longicornis (copepod) and water temperature variations.
Moreover, egg production significantly increases with temperature which implies that juvenile density is much
higher when water temperature increases as observed in this study.
3.2. Seasonal variations of total PCBs and PAHs in the Seine Estuary
Both total PCB (sum of the 27 compounds studied) and PAH (20 compounds) content measured in the
dissolved phase, in the SPM and in EA from November 2002 to February 2005 are shown in Table 2. Dissolved
PCBs and PAHs ranges respectively from 2.0 to 21.2 ng.l-1 and from 2.9 to 23.9 ng.l-1 with similar profiles. The
Publications
highest levels are observed in winters 2003 and 2004 and during the wet season in summer 2003. The lowest
levels are measured during the dry season in spring and autumn 2003. Triplicate samples yield satisfactory
coefficients of variance: 6-40 % for PCBs and 3-30 % for PAHs. Considering that mean concentrations (for all
sampling cruises taken together) of PCBs and PAHs for the studied period are 7.0 ng.l-1 and 11.1 ng.l-1 in the
dissolved phase, we conclude that the data indicate weak (PAHs) or no significant seasonal variations (PCBs).
This observation is also confirmed by the low differences between mean and median values. Maximum
contamination levels reported during winter periods could be linked to remobilization of the sediment content
consecutive to intensive flood periods (table 1) as reported by Kowalewska et al. (2003), by higher inputs of
combustion-derived PAHs from industrial and domestic processes (Motelay-Massei et al., 2007) or by
decreasing microbial and photodecomposition activities induced by lower temperatures (Witt, 1995). The High
PAH level in July 2003 could have been caused by atmospheric deposition (Motelay-Massei, 2002), surface
runoff brought in by important precipitations or by dredging activities. Furthermore, dissolved PAHs and PCBs
appear to be negatively correlated with salinity (R=-0.7, p < 0.0005, R= -0.6, p < 0.005). These results are in
agreement with the experiments of Tremblay et al. (2005) which demonstrated that increasing salinity,
encountered during the mixing between fresh riverine and coastal ocean water, influenced the sorption of
hydrophobic contaminants such as PAHs on estuarine SPM.
PAHs bound to particles vary between 499 and 5819 ng.g-1 with an average for the studied period of
3361ng.g-1. PCB concentrations in the SPM are 10 times lower than those measured for PAHs, ranging from 58
to 463 ng.g-1 with a mean of 227 ng.g-1. Increasing levels have been measured for both PAHs and PCBs during
winter 2003, 2004 and 2005, as a consequence of increasing flow inducing upstream erosion and re-suspension
of more contaminated particles. In comparison, the concentrations of contaminants during other seasons were
lower but constant (around the mean). Total particulate PAHs and PCBs contribute respectively to the
contamination of the water column for 81 to 99% and for 47 to 89%. Most of the samples indicate a preferential
sorption of the contaminants on the SPM and significant correlations between total PCB (R= 0.90, p<0.00001)
and PAH (R=1, p<0.00001) concentrations in the SPM and in the water column of the Seine Estuary. This study
pointes out that concentrations of PAHs and PCBs in the Seine Estuary are characteristic of an urban and
industrialized area with levels 10 times higher than those measured in the Chesapeake Bay (Gustafson and
Dickhut, 1997) or in Singapore coastal water (Wurl and Obbard, 2005), but comparable to levels reported in the
Venice Lagoon (Manodori et al., 2005).
Two effect-based guidelines for both PAH and PCB concentrations in marine and estuarine sediments
suggested by Long et al. (1995), effect range-low (ERL) and effect range-median (ERM) are suitable to evaluate
potential effects of these contaminants on the Seine Estuary organisms. According to Long et al. (1995)
deleterious biological effects rarely occur if the total PAH and PCB concentrations in sediments are below their
respective ERL value (4022 and 22.7 ng.g-1 respectively); below the ERM guidelines (44 792 and 180 ng.g-1
respectively) adverse effects are likely to occur; and effects would occasionally occur for concentrations equal to
and above the ERL but below the ERM guidelines. During the present study, adsorbed PAHs present a potential
risk for organisms in winter periods with concentrations above the ERL but below the ERM guidelines. Besides,
the risk associated to PAHs is essentially related to Phe, An, Chrys, DaA and Fluo. Furthermore, adsorbed PCB
concentrations are always above the ERL value and often above the ERM guidelines (except for the sampling
dates 27/11/02, 22/04/03, 20/05/03, 06/10/03). The risk associated to adsorbed PCBs is therefore important and
higher than for PAHs.
Reported values of PCB and PAH body-burdens in the copepod EA are in a comparable range,
respectively 383-1785 ng.g-1 (976 ng.g-1 as mean) and 165-3866 ng.g-1 (879 ng.g-1 as mean). For both
contaminant groups, maximum levels have been measured during winter periods. These particularly high
significant PAH concentrations are from 2 to 4 times higher with respect to the mean concentration, whereas
other sample values are 0.5 time lower than this mean. For the same periods, PCB levels in EA are also
significantly higher (from 1 to 2) than the mean concentration, compared to other period concentrations, 0.7 time
lower than the mean. These results reveal wide seasonal variations of PCB and PAH body-burdens in EA.
Representative accumulation factors corresponding to the ratio of total contaminant concentration in the water
column (HOCs adsorbed on particulate as well as dissolved are likely to be bioavailable to filter feeders) and in
EA are calculated to assess the uptake capacity of these organisms. For the studied period, ACFs are in the range
of 13 000 to 91 000 (for PCBs) and from 1000 to 17 000 (for PAHs), which is relatively high compared with
usual reported bioconcentration factor values for this kind of organisms (Fisk et al. 2001). Furthermore, there are
very limited data on HOCs bioaccumulated by zooplankton species in field studies, especially estuarine species,
and almost none for individual micro-zooplankton species. This void has certainly been caused by the difficulties
encountered in collecting sufficient supplies of micro-sized organisms to ensure accurate and precise
quantification of contaminant burdens. Therefore, most of the published data reported contaminant body-burdens
of mixed zooplankton, sorted by size, with no attention paid to the SPM contained in the samples. Harding et al.
(1997) and Peters et al. (2001), have notably reported low levels of PCBs (<100 ng.g-1) for marine species from
the southern Gulf of the St Lawrence and the southern North Sea. Concerning PAH bioaccumulation by
Publications
zooplanktonic species, field data are even scarcer. Nevertheless, Nour El-Din and Abdel-Moati (2001) have
mentioned PAH levels below 40 ng.g-1 in mixed marine copepods from the Arabian Gulf. In contrast,
contaminant body-burdens indicated in the present study are distinctly higher, probably caused by higher
exposition levels in estuarine ecosystems. Recent field studies have confirmed that marine copepods could
bioaccumulate and amplify PAHs in ecosystems where PAH concentrations in the dissolved phase and in the
suspended particulate matter are at or below method detection limits (Carls et al., 2006). These results are
consistent with the conclusions of Borga et al. (2005) that suggested higher BAF values for zooplanktonic
species than those previously described. Uptake and transfer mechanisms will be discussed later.
3.3. PAH and PCB patterns in the water column and in Eurytemora affinis: origins and fates
Fig. 3 a shows the mean typical patterns of PAHs in the dissolved phase, in the SPM and in EA for the
studied period. The predominance of 4-ring compounds, representing 38-46% of total PAHs, was clearly evident
in the water column of the Seine Estuary (sum of the dissolved phase and SPM). Besides, 4-ring compounds also
dominate PAH pattern in EA, in the range of 35 to 55% of total contamination. Among these compounds, the
concentration of carcinogenic PAHs (BaA, B[b+j+k]F, BaP, DaA and IP according to the International
Association for Research on Cancer 2003), represent 31-41% in the water column and 17-46 % of total
contamination in EA, which is of concern for the integrity of the local ecosystem. Considering the individual
contribution of PAHs, the most abundant compounds in the dissolved phase are Phe (mean: 15%) with levels of
0.5-3.8 ng.g-1, and Pyr (mean: 27%) varying between 0.8 ng.l-1 and 5.2 ng.l-1. Motelay-Massei et al. (2007) have
shown the same PAH profiles in bulk atmospheric deposition at Le Havre and Rouen in 2001 and 2002.
In the SPM, B[b+j+k]F contribute for a mean of 20% of total PAHs with a mean burden of 579 ng.g-1
(79-1124 ng.g-1). As largely reported in literature, the lowest molecular weight compounds (Phe, Fluo, Pyr) are
preferentially found in the dissolved phase (3, 4-ring), whereas the highest ones (B[b+j+k]F, BeP, BaP, IP, BP)
are bound to particles (4, 5, 6-ring). Furthermore, in addition to relative abundance, isomer ratios are useful
indicators of PAH sources. Particular source signatures for both dissolved and SPM-bonded PAHs have been
listed based on isomer ratios (Budzinski et al., 1997). Thus, plotting two PAH ratios, Phe/An versus Fluo/Pyr
suggests that PAHs of pyrolytic origin are characterized by Phe/An<10 and Fluo/Pyr>1, while Phe/An>10 and
Fluo/Pyr<1 reflect petrogenic sources (Manodori et al., 2005). Fig. 3.b shows that isomer ratios of all SPM
samples exhibit a constant pyrolytic contamination, while the contamination in the dissolved phase is significant
of mixed sources (petrogenic/pyrolytic). Motelay-Massei et al. (2007) have thus suggested several sources for
pyrolytic PAHs associated mainly with emissions from road traffic, with domestic heating in winter and with
industrial emissions in summer. Finally, the predominant compounds bioavailable in the water column are also
the major ones bioaccumulated by Eurytemora affinis. Thus, Pyr (14%) and B[b+j+k]F (13%) make up a
relatively large proportion of total PAHs in EA, with respectively mean values of 105 ng.g-1 (22-427 ng.g-1) and
120 ng.g-1 (15-559 ng.g-1). The differences observed between PAH fingerprints of SPM and the dissolved phase
compared to that of EA suggest that pollutant uptake by planktonic species is governed by particular
mechanisms and not only by adsorption and equilibrium partitioning between water and organisms. These results
also suggest metabolisation processes of PAHs in copepods, as reported by Harris et al. (1977) and Lotufo
(1998).
PCB patterns in the dissolved phase, in the SPM and in EA are shown in Fig. 4a. Low molecular weight
compounds (CB 28, 52, 101, 87, 118), particularly penta-CB (39-59% of total PCBs) are preferentially found in
the dissolved phase. Among those, CB 101 (0.30-3.53 ng.l-1) and CB 118 (0.53-2.97 ng.l-1) are the most
abundant. SPM pattern is dominated by penta- (30-39%) and hexa-CB compounds (27-40%), particularly by CB
101 (12.8-49.7 ng.g-1), CB 153 (7.5-128.8 ng.g-1) and CB 138 (8.1-55.6 ng.g-1). This profile is consistent with a
contamination by Pyralene mixture (the French commercial mixture used before the ban in the electric industry),
dominated by tri- to hexa-CB congeners. Thereby, the water column of the Seine Estuary is clearly contaminated
by penta-CB representing 40% on average of total PCB contamination (dissolved phase and SPM). In other
respects, the most abundant homologs bioaccumulated by EA are mainly penta-CB (25-44%) and hexa-CB (3146%), especially CB 101 (86-376 ng.g-1), CB 153 (83-373 ng.g-1) and CB 138 (83-316 ng.g-1). Furthermore,
different uptake or metabolisation pathways could account for the differences observed between the PCB
fingerprints in EA and in the water column. These mechanisms are pointed out when each PCB congener
concentration is expressed relatively to that of CB 153 (CBi/CB 153) which is the less metabolisable PCB
compound (Kannan et al., 1995), as presented in Fig. 4.b. Thus, all PCB congeners bioaccumulated by EA have
ratios lower than those measured in the water column, except CB 187. Besides, low molecular weight
compounds (CB 28, 52, 118) present ratios at least twice lower than those measured for the same compounds in
the water column, except CB 101, whereas higher molecular weight compounds have ratios close to 1 compared
to those of the water column, which implies that lower molecular weight compounds are less bioaccumulated or
more metabolisable than high molecular weight compounds. These results are close to those of Goerke and
Weber (2001) which have reported a compound-specific and a species-specific elimination of PCBs with a high
Publications
capability of oxidative transformation and excretion of PCB congeners ≤ 6 chlorine substitutions in many
decapods. Nevertheless, as other parameters such as feeding could influence PCB patterns, we should remain
cautious when deducing biotransformation from PCB patterns.
3.4. Principal component analysis (PCA)
PCA that defines the data structure explains respectively 80% and 79% of the variance in PAH and PCB
concentration data sets (Fig.5). Component 1 (PC1) explains 58% of the total PAH variance (Fig. 5.a.), the
percentage of adults (23%) and PAH concentrations in EA (27%) having the most important contributions.
Increasingly negative PC1 scores along this axis indicate increasing PAH concentrations in EA (correlation: 0.89) and increasing percentage of adults in the sample (correlation: -0.82). Furthermore, PAH body-burdens in
EA are significantly correlated with the percentage of adults in the sample (R= 0.54, p<0.05). PC2 explains 23%
of the total PAH variance with high contribution for PAHs adsorbed on SPM (85%). Increasingly positive PC2
scores describe increasing PAH levels in the SPM (correlation: 0.96) although no significant correlation could be
calculated between PAH burdens in the SPM and in EA. However, if the SPM sampled in November 2002 are
not taken into account a clear correlation appeared between PAHs adsorbed on the SPM and PAHs accumulated
by EA(R= 0.83, p<0.05).
Fig. 5.b presents PCA of PCB contents in EA. PC1 contributions explain 58% of the total PCB variance
with high contributions to the percentage of adults (29%) and to PCB levels in EA (31%). Increasingly negative
PC1 scores characterize increasing PCB levels in EA (correlation: -0.95) and increasing percentage of adults in
the sample (correlation: -0.92). Furthermore, PCB body-burdens in EA are significantly correlated with the
percentage of adults in the sample (R= 0.84, p<0.0001). PC2 explains 24% of the total PCB variance with high
contribution to PCBs bonded to SPM (73%). The lowest PC2 scores are significant of the lowest SPM
contaminations. The results presented in Fig.5.a and b. show that the PCA distinguishes two clusters of copepods
based on the magnitude and direction of the PC contributions. The first group consists of copepods presenting
high PAH and PCB levels during winter seasons. Thus, winter samples are characterized by a higher percentage
of adults compared to other seasons. For these periods, water temperature decreased what implies that copepod
life-cycle and also the adult stage were longer. Gyllenberg and Lundqvist (1979), Pagano and Gaudy (1986), and
Gaudy et al. (2000) have mentioned for different estuarine copepod species, metabolism reduced to a minimum
level to maintain the physiological activity at low temperatures which could imply low biotransformation of
contaminants during winter periods. Furthermore, Eurytemora affinis copepods are exposed during a longer
period and can bioaccumulate larger amounts of PCBs and PAHs. In this group, copepods exposed to more
contaminated SPM could be distinguished from the other ones. The second group is characterized by a majority
of juveniles in the samples which implies shorter exposition and lower contaminations by HOCs.
4. Conclusions
The results of this study point out that total PAH and PCB concentrations in the Seine Estuary exhibit
seasonal variations especially in the particles and in the copepod Eurytemora affinis. Furthermore, this study has
shown that EA could bioaccumulate large quantities of PAHs and PCBs (µg.g-1 range for maximum). These
highest levels have been measured for both contaminants during winter seasons, in the SPM (when the flow
increased) and in EA. For other seasons, contaminant concentrations were lower and quite regular. PAHs in the
SPM were mainly of pyrolytic origin, dominated by four ring-compounds, while PAH sources in the dissolved
phase were more diffuse and dominated by 3 and 4 ring compounds. The most bioavailable PAH compounds in
the water column were also the most bioaccumulated ones in EA. Besides, high proportions of carcinogenic
PAHs have been measured in the copepods.
PCB patterns in the water column were principally composed of penta-CB congeners, while the most abundant
congeners measured in EA were penta- and hexa-CB compounds.
Finally, the results of the principal component analysis have shown that the uptake of PCBs and PAHs by
Eurytemora affinis was a function of the time exposure since the highest concentrations of contaminants in EA
were measured for samples presenting the highest percentage of adults.
Acknowledgments
This work was supported by the multidisciplinary Seine Aval scientific program and by the Region HauteNormandie.
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Publications
Figure 1: Study area and sampling station in the Seine Estuary (surface water and copepods).
0°
0°30 E
T
h
e
Caudebec
PK 310
France
Tancarville
49°30 ’N
Le Havre
C
h
a
n
n
e
l
50 km
PK 340
Honfleur
PK 355
Kilometric point
Industrial sites
0
5
10
Euryhaline zone
Limit of the saline tide
Sampling site
15 km
Mesohaline zone
1° E
Oligohaline zone
25
J
06/02/05
01/12/04
19/01/04
06/10/03
01/07/03
20/05/03
50
22/04/03
01/04/03
75
28/01/03
A
100
27/11/02
Relative abundance (%)
Figure 2: Relative composition of samples in adult (A) and juvenile (J) stages of Eurytemora affinis.
0
Figure 3: Mean composition pattern of the most abundant parent PAHs (a) in the dissolved phase (DP), the SPM
and in Eurytemora affinis (EA), over the study. Mean values are shown with bars indicating the standard error
(seasonal variability). PAHs are presented with increasing molecular mass and grouped depending on the
number of aromatic rings (3, 4, 5 and 6 ring). Cross plot (b) of molecular ratio of Phe/An versus Fluo/Pyr in the
dissolved phase and in the SPM which are characteristic indices of PAH sources (Budzinki et al., 1997).
a.
DP
SPM
EA
20
16
SPM
b.
Phe/An
24
DP
Petrogenic origin
10
Pyrolytic origin
8
Petrogenic/Pyrolytic origin
0
phe
fluo
3
pyr
triph
chrys
4
B[ b+k+f]F
32
0
BeP
BaP
5
IP
BP
6
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
Fluo/Pyr
Publications
Figure 4: Mean composition pattern of the most abundant PCB compounds (a) in the dissolved phase (DP), the
SPM and in Eurytemora affinis (EA), over the study. Mean values are shown with bars indicating the standard
error (seasonal variability). PCBs are presented with increasing molecular mass and grouped depending on the
number of chlorinated substitutions (tri-, tetra-, penta-, hexa- and hepta-chlorinated). Fig. b represents the mean
relative abundances of the major PCB compounds (CBi) versus PCB 153 which is the less metabolized congener
(Kannan et al., 1995b), in the water column and in the copepods.
DP
a.
21
b.
1.5
SPM
EA
WTC
EA
CBi /CB 153
28
14
7
1
0.5
0
0
CB
28
3
CB CB
52 101
4
CB CB
87 118
5
28
CB CB CB
153 138 180
6
7
52
101 118 153 138 187 180
Figure 5: The loading plot of principal components analysis of (a) PAHs and (b) PCBs bioaccumulated by
Eurytemora affinis in relation to field contaminations (PAHs and PCBs in SPM) and to environmental
parameters (temperature, flow, turbidity and percentage of adults in the sample). Cluster I represents winter
periods and cluster II the other seasons. (1, 2: 27/11/02; 3: 19/01/03; 4, 5, 6: 01/04/03; 7, 8, 9: 20/04/03; 10:
01/07/03; 11, 12: 06/10/03; 13: 19/01/04; 14, 15: 06/02/05).
Factor 2: 21.67%
3
2
a.
Cluster I
Cluster II
13
1
15 14
12
11
5 6
7
10 98
4
0
3
-1
12
-2
-3 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1
Factor 1: 57.75%
3
b.
Factor 2: 23.75%
Cluster I
2
1
8
0
10
-2
4
12
7
13
3
Cluster II
2
1
-1
2
14
15
11
4
5
6
-5 -4 -3 -2 -1 0 1 2
Factor 1: 57.82%
3
4
Publications
Table 1: Physical and chemical parameters of each sampling cruise (+: analyses, -: no analysis).
Cruises
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Sampling dates
26/11/02
28/01/03
01/04/03
22/04/03
20/05/03
01/07/03
08/09/03
06/10/03
04/11/03
19/01/04
20/04/04
16/05/04
16/09/04
30/12/04
06/02/05
477
3 -1
Flow (m .s )
580
977
403
305
501
206
110
104
210
1199
339
508
251
559
Salinity (PSU)
1.5
0.1
0.2
1.4
0.2
0.6
1.9
2.2
6.5
0.7
4.3
1.3
2.2
1.2
2
Water temperature (°C)
9.6
7.3
12.5
13.8
16.4
22.8
17
10.6
6.5
6.7
10.9
15.9
17.7
7.4
6.4
Turbidity (mg.l-1)
0.581
0.026
0.083
0.066
0.135
0.034
0.051
0.115
0.075
0.048
0.101
0.206
–
–
–
Water analyses
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
–
–
–
–
–
SPM analyses
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
–
–
–
+
Copepods analyses
+
+
+
+
–
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Copepod samples
analyses
+
+
+
+
+
+
–
+
–
+
–
–
–
+
+
Table 2: PAH and PCB concentrations in the dissolved phase (ng.l-1), in the SPM (ng.g-1), in Eurytemora affinis
(ng.g-1) and in the water column (dissolved phase + SPM) (ng.l-1) of the Seine Estuary.
Dissolved phase (ng.l-1)
n = 10
SPM (ng.g-1)
n = 12
Eurytemora (ng.g-1)
n = 15
Water column (ng.l-1)
n = 10
Mean
Median
Min.
Max.
Mean
Median
Min.
Max.
Mean
Median
Min.
Max.
Mean
Median
Min.
Max.
CB 52
CB 101
CB 87
CB 118
CB 153
CB 138
CB 187
CB 180
0.6
1.4
0.5
1.3
0.7
0.8
0.1
0.2
0.6
1.1
0.4
1.1
0.5
0.6
0.1
0.1
n.d.
0.3
n.d.
0.5
0.1
n.d.
n.d.
n.d.
2.7
3.5
1.5
3.0
2.5
2.8
0.2
0.7
16
32
10
25
39
33
9
14
18
33
10
25
33
33
8
11
3
13
5
5
7
8
1
4
24
50
23
42
129
56
17
29
62
188
27
94
203
169
46
54
48
134
19
86
203
153
43
53
24
86
5
31
83
83
20
11
137
376
75
247
373
316
96
139
2.4
4.5
1.5
3.4
3.6
3.4
0.7
1.2
1.5
3.4
1.1
2.8
3.1
2.6
0.7
1
1.1
2.1
0.7
6.8
1.5
1.4
0.4
0.5
6.8
11.1
4.4
1.9
6.9
7.5
1.5
3.0
Σ PCB
7.0
5.6
2.0
21.2
227
223
58
463
976
788
383
1785
26.1
20.2
14.1
55.0
Phe
Fluo
Pyr
Triph+Chrys
BbF+BkF
B(e)P
B(a)P
IP
B(g,h,i)P
1.6
1.4
2.8
0.9
0.7
0.5
0.3
0.2
0.3
1.1
0.8
2.7
0.6
0.4
0.3
0.2
0.1
0.2
0.6
0.3
0.8
0.4
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
3.8
3.1
5.2
1.6
1.1
1.7
1.4
1.0
1.4
176
377
346
277
579
240
278
261
243
194
354
323
263
524
241
262
246
242
25
59
59
44
79
35
42
39
33
278
614
581
430
1124
394
513
505
406
78
70
105
82
120
64
54
53
54
29
37
73
53
59
45
22
34
34
5
14
22
16
15
11
9
n.d.
9
310
406
427
300
559
255
283
263
258
13
26
26
20
36
16
18
16
16
12
25
25
19
32
14
17
14
14
6
13
15
10
18
8
9
5
4
23
45
39
34
70
30
34
32
30
Σ PAH
11.1
8.1
2.9
23.9
3361
3130
499
5819
879
478
165
3866
227
211
123
407
Total PAHs (ΣPAHs) = Sum of Phe, An, 1, 2, 3 and 9 methylphenanthrene, 2 methylanthracene, Fluo, Pyr, BaA,
Triph + Chrys, (B[b+j+k]F), BaP, BeP, Per, IP, DaA+DaC and BP. Total PCBs (ΣPCBs) = congeners 8, 18, 29,
50+28, 52, 104, 44, 66, 101, 87, 154+77, 118, 188, 153, 105, 138, 126, 187, 128, 200, 180, 170, 195, 206 and
209.
n.d. = non detected
n = Number of sampling cruises
Publications
Publication n° 2 :
Seasonal variation of hydrophobic organic contaminant concentrations in the water-column of the Seine
Estuary and their transfer to a planktonic species Eurytemora affinis (Calanoïd, copepod). Part 2:
Alkylphenols polyethoxylates.
K. Cailleaud 1, 2, 3, J. Forget-Leray3, S. Souissi2, S. Augagneur1, H. Budzinski1
*
Abstract:
The occurrence and fate of alkylphenols in various matrices of the Seine River Estuary were studied.
Nonylylphenols (NP) and nonylphenol polethoxylates (NPEs) were monitored in surface dissolved water,
suspended particulate matter (SPM) and in a copepod, Eurytemora affinis from November 2002 to January 2004.
NPs, nonylphenol mono and diethoxylates (NP1EO, NP2EO) and nonylphenol-ethoxy-acetic-acid (NP1EC)
were detected and measured in all dissolved water and SPM samples whereas nonylphenoxy-acetic-acid
(NP2EC) was only found sporadically in dissolved water samples. Seasonal variation of total concentrations of
NPs and NPEs, ranging respectively from 399 to 2214 ng.l-1 and from 405 to 9636 ng.g-1, were measured in the
dissolved water and in the SPM. Significant decreases were observed in the water column during the maximum
biological activity periods in spring and autumn. Furthermore, increasing levels were observed in the SPM
during the winter period. High concentrations of NP1EO and NP were detected in all copepod samples, ranging
from 3423 to 6406 ng.g-1. This study is the first to report high levels of endocrine disruptors in estuarine
copepods.
Keywords: nonylphenol, crustacean, bioaccumulation, estuary, water column, alkylphenol polyethoxylates.
Chemosphere, In press
Publications
1. Introduction
Since the 1960s, increasing numbers of environmental organic contaminants have been found in aquatic
ecosystems, often with high and increasing concentrations. During recent decades, reproductive and
developmental diseases reported for a wide range of aquatic species (Krimsky, 2000; Vos et al., 2000; Yadetie
and Male, 2002), have shifted the attention slightly towards other sources of industrial and agricultural
contaminants. These adverse effects on the physiology and particularly on the hormonal regulation of exposed
organisms are generally ascribed to molecules so called endocrine disruptors. Depending on their molecular
structure, some of these chemicals have been listed as priority compounds by regulating bodies (European Union
and the Oslo and Paris Commission). Among all those contaminants, the harmful effects of many surfactants,
such as alkylphenol-polyethoxylates and their metabolites, are highlighted due to their endocrine-disrupting
properties and because of their increasing concentrations in aquatic ecosystems (Thomas et al., 1999; Ferguson
et al., 2003, Isidori et al., 2005).
Alkylphenol-polyethoxylates (APnEs), where n indicates the number of ethoxy units, are high
production volume nonionic surfactants, widely used in various industries and agriculture. Nonylphenolpolyethoxylates (NPnEOs) are by far, the most commonly used and synthesized APnEs, accounting for about
80% of total APnEs (Renner, 1997). The annual worldwide production is about 500,000 tons, with a European
annual usage of 73,500 tons (E.U., 1999). These molecules are used in numerous applications (detergents,
wetting agents, emulsifiers, pesticide formulations and many industrial sectors). To date, NPnEOs have not been
banned in Europe but their use and sale have been drastically restricted. Therefore, these compounds have been
entirely replaced by alcohol-ethoxylates in household detergents in the EU and in the USA.
These contaminants are released directly or through sewage plants, with or without treatment, into
aquatic ecosystems. NPnEOs are unstable in aquatic environment and subject to biodegradation. Some
degradation pathways have been proposed and studied both in field and laboratory experiments (Ying et al.,
2002, Hayashi et al., 2005). Thus, the biodegradation of NPnEOs results in successive formation of lower
ethoxylate congeners. On the one hand, during aerobic processes, the polyethoxylate chains are oxidized,
producing mainly nonylphenol-ethoxy-acetic-acid (NP1EC), nonylphenoxy-acetic-acid (NP2EC) and
nonylphenols (NP) (Ahel et al., 1994; Hayashi et al., 2005). On the other hand, during anaerobic processes,
polyethoxylate chains are hydrolyzed into various metabolites (NP1EO and NP2EO) as shown in figure 1. Final
degradation products (nonylphenol, octylphenol…) are more stable and more hydrophobic and thereby
preferentially adsorbed on the suspended particulate matter or in the sediments.
Most NPnEOs entering the environment are highly water soluble. Eighty percent of these compounds
are detected in the dissolved phase and 20% in the suspended particulate matter (Isobe et al., 2001). The
occurrence of NPnEOs in freshwater environments has been substantially reported (Thiele et al., 1997).
However, their occurrence, their fate and their transfer to organisms in estuarine systems are less known
(Heemken et al., 2001; Stachel et al., 2003). In this respect, microzooplanktonic organisms are key species in the
estuarine food-web which could ensure a principal role in the transfer of contaminants to top predators. In
addition, the organisms placed on top of food chains could be affected by the presence of APs in their food, as
well as in the dissolved phase and in the SPM. These aspects are of particular interest in the Seine River Estuary
(France), where organic as well as inorganic pollution from urban and industrial activities has been extensively
studied (Chiffoleau et al., 1994; Fernandez et al., 1997). However, no data is available about the contamination
by NP and NPnEO. Furthermore, these compounds are known to exhibit higher toxicity than their precursors,
and to mimic estrogens in the hormonal regulation. Thereby, NPnEOs, NPnECs and NPs are of toxicological
interest because of their potential bioaccumulation in organisms which could be exposed via sediments or via the
dissolved phase (Cross-Sorokin et al., 2003), and because of their acute and chronic toxicity (Brown et al., 1999,
Forget-Leray et al., 2005).
The present study, which is the second part of a series of two articles, focuses on the occurrence of NP1EOs,
NP
2
1-2ECs, and NPs in the water column of the Seine Estuary and their fate related to seasonal variation.
The analysis of various metabolites, and particularly NP/NPEOs and NP/NPECs ratios, gave insight into
biodegradation processes involved in this estuary. Besides the potential transfer of these chemicals to a dominant
copepod species in many North Atlantic estuaries, Eurytemora affinis, has been investigated to estimate the
possible endocrine disrupting hazard of such contaminants on estuarine invertebrates, and the threat to the local
food web integrity.
Surface water and copepod samples were collected from November 2002 to February 2005 at the
Tancarville station in the oligohaline part of the Seine Estuary (France) using the Seine-Aval Research Program
Publications
boat. All the samples were collected 150 m away from the Tancarville sewage treatment plant (STP). The
sampling strategy and the environmental parameters of each cruise have been detailed in the first part of this
series (Cailleaud et al., submitted). The numbers in all the figures referred to the sampling cruises (i.e.:
1=26/11/2002, 2=28/01/2003, 3=01/04/2003, 4=22/04/2003, 5=20/05/2003, 6=01/07/2003, 7=08/09/03,
8=06/10/2003, 9=04/11/2003, 10=19/01/2004) .
All solvents were either HPLC grade or Organic residue analysis grade and were purchased from
Atlantic Labo (Eysines, France). NPnEO and NPnEC (purity 99%) standards were obtained from LGC
Promochem (Molsheim, France) and NP (purity > 98%) standard was purchased from Sigma-Aldrich (St
Quentin Fallavier, France).
-Solid-Phase Extraction (SPE)
Water samples (500 ml) were filtered using 0.7 µm GF/F glass microfiber filters (Whatman). The
filtered waters were acidified to approximately pH 2 with 3.5 M HCL and the particle fractions, as well as the
copepod samples were freeze-dried and extracted by Focused Microwave-Assisted Extraction (Time: 10 min at
30 W) with a 3/1 methanol/dichloromethane mixture. The organic extracts were concentrated by rotary
evaporation and then dissolved into 100 ml of acidified ultra-pure water (pH 2). Then, the filtered water and the
water dissolved SPM and copepod extracts were eluted through a Varian BondElut C18 cartridge (Interchim,
Montluçon, France), previously conditioned with 5 ml of methanol, at a flow rate of 10 ml.min-1. After the
elution, the cartridges were washed with 3 ml of a methanol/acidified ultra pure water mixture (50/50, v/v).
Then, the aqueous phase was removed by drying the cartridge for 1 hour. At last, the organics were eluted by
passing 5 ml of a methanol/dichloromethane mixture (50/50, v/v) and concentrated to 100 µl (for water extracts)
and to 500 µl (for SPM and E. affinis extracts) by warming at 45°C under a gentle nitrogen stream.
- LC analyses
Alkylphenols and their metabolites were analyzed using a HPLC separation coupled to electrospray
mass spectrometry detection. The HPLC system consisted of an Agilent 1100 series (Agilent Technologies).
Chromatographic separation was performed using a reversed-phase analytical column (Kromasil C18, Interchim,
France) of 150 × 2.1 mm i.d. × 3 µm film thickness. NPnEOs and NPnECs +NPs were analyzed in separate runs.
NPnEOs (n= 1-2) were separated using a mixture of water/methanol/ammonium acetate (5 mM)(A) and
methanol (B) as mobile phase, while NPnECs (n=1-2) and NPs were separated using a mixture of
water/methanol/ammonium acetate (5mM) (A) and methanol (B) as mobile phase. The solvent program started
with an initial B concentration of 60% kept isocratic for 2 min, linearly increased to 80% in 5 min, kept isocratic
for 28 min and linearly decreased to 60% in 3 min, with constant flow rate (0.150 ml/min) and constant column
temperature (20°C). An Agilent Technologies mass spectrometer equipped with an electrospray (ESI) ion source
was used. The following operation parameters were used: source temperature, 100°C; desolvation temperature,
350°C; desolvation gas flow rate, 10 l/min; ESI+ and ESI- capillary voltage, 4.0 and 3.5 kV. Acquisition was
accomplished using the Selected Ion Monitoring mode (SIM). NPEOs were identified by confirming the
characteristic pattern showing [NPnEO-Na]+ ions in the positive ionization mode, while NPECs and NPs were
identified by their characteristic pattern showing [M-H]- ions in the negative ionization mode. The compounds
were also identified by co-injection of authentic standards.
- Quality assurance
Before the extraction, all glassware was cleaned with detergent, rinsed with ultra-pure water and
followed by heating at 450°C overnight. Besides, procedural blanks were regularly performed (representing less
than 10% of the sample content) and all results presented are adjusted for the minor contributions from the
blanks.
Quantification was performed using an external calibration method based on a five point quadratic
calibration curve. Calibration curves were generated using linear regression analysis within the investigated
concentration range (0.1-0.8 µg.ml-1 respectively for NP, NP1EO, NP2EO and NP2EC, and 0.2-2.0 µg.ml-1 for
NP1EC). The calibration curves of each analyzed standard (NP, NP1EO, NP2EO, NP1EC and NP2EC)
presented high linearity (r2 ≥ 0.995). The efficiency of the analytical procedure was determined by analyses of
ultra pure water spiked with an alkylphenol standard solution. The average recovery of NP, NP1EC, NP2EC,
NP1EO and NP2EO was 90% ± 12, 68% ± 5, 56% ± 5, 90% ± 3 and 61% ± 2, respectively.
Publications
3.1. Seasonal variation of total APs in the water column of the Seine Estuary
- APs in surface dissolved water
Total concentrations of dissolved APs measured from November 2002 to January 2004, including
NPECs, NPEOs and NP, are shown in Table 1. Dissolved AP concentrations ranged between 399 and 2214 ng.l-1
with . The highest concentrations were measured during winter and summer periods, whereas the lowest ones
were measured during spring and autumn periods. One possible explanation of the decrease of total AP
concentrations in the water could be a higher bacterial activity when water temperature increases and lower
biodegradation rates during winter seasons (Jonkers et al., 2005). Thus, when the water sample from July 2003
was not taken into account, water temperature and AP concentration in the dissolved phase showed a significant
negative correlation (R= -0.83, p=0.005). Maximum biological production in the Seine Estuary is temperature
dependant and is observed during spring and autumn. These results also suggest that the high dissolved
concentration measured in July 2003 may have been caused by recent local AP discharges. This local emission
probably originates from the Tancarville STP and from the industrial petrochemical site of Port-Jerome located
less than one kilometer upstream our sampling site. The Tancarville STP is not a new technology plant which
suggests that the wastewater is treated unadequatly. In addition, dissolved APs present seasonal variation, similar
to those observed for dissolved PAHs and PCBs (Cailleaud et al., submitted). These results suggest a general
hydrodynamic origin for the contaminant concentration variations (dilution, sorption/desorption…). Thus,
dilution was less important in summer due to decreasing river flow.
NP1EC (259-1455 ng.l-1) is the major compound in the dissolved phase, representing from 55 to 85% of
total APs (Fig. 2.a). NP1EO (41-149 ng.l-1), NP2EO (33-224 ng.l-1) and NP (15-386 ng.l-1) have also been
detected in all the samples, whereas NP2EC have been detected only in April and November 2003. Blackburn et
al. (1999) have reported total NP and NPEO concentrations in British estuaries below 1 µg.l-1. Jonkers et al.
(2003 a) have measured respectively NPEO, NP and NP1EC levels of 67-471, 63-90 and 1139-1524 ng.l-1 in the
Rhine Estuary and of 491-1029, 588-934 and 8607-10879 ng.l-1 in the Scheldt Estuary, for a water salinity
between 0.2 and 6.0 PSU. These concentrations are close to those obtained in our study. To compare, NP, NPEO
and NPEC worldwide surface water concentrations range from < 0.01 to 180 µg.l-1, from < 0.02 to 70 µg.l-1, and
from 2 to 116 µg.l-1, respectively (Thiele et al., 1997).
AP distribution patterns in surface water present almost no seasonal variation, except for July and
November 2003 samples, which are characterized by lower NPEO levels and increasing NP1EC levels. The use
of APs does not vary according to seasons. These compounds are biodegradable and the degradation rate and
pathways depend on environmental parameters (the river flow, temperature, oxygen…). Molecular ratios of
metabolites to “parent” compounds have been previously used to assess biodegradation pathways in estuarine
surface waters, and could indicate variations in these biological processes (Jonkers and De Voogt, 2003 b.;
Jonkers et al. 2005). Three ratios (NP/NPEC, NP/NPEO and NPEC/NPEO) are presented in Fig 2.b. These
results show that the NP/NPEC ratio is almost constant all over our study (0.05-0.3), in opposition to NP/NPEO
(0.12-2.25) and NPEC/NPEO (2.1-11.4) ratios that present a seasonal variation. The NPEC/NPEO ratio is
always greater than 2, which implies that oxidative hydrolytic transformation is the major route of AP
biodegradation in the Seine Estuary surface water. Degradation via the non-oxidative biodegradation pathway is
slightly higher in April, July and November 2003 in comparison with the other sampling dates, but still lower
than the oxidation pathway.
- APs in the SPM
Total concentrations of APs including NPECs, NPEOs and 4-NP measured in the SPM of the Seine
Estuary, from November 2002 to January 2004 are shown in Table 1. APs adsorbed on particles vary from 405
to 9636 ng.g-1 (dry weight). Total concentrations are almost constant all over the study, except during winter
periods (January 2003 and 2004). Thus, significant increases of total AP concentrations have been measured
during winter periods, similar to those observed for PAHs and PCBs adsorbed on particles for the same period
(Cailleaud et al., submitted). NP1EO (40-692 ng.g-1), NP2EO (21-757 ng.g-1), NP1EC (18-514 ng.g-1) and 4-NP
(289-7105 ng.g-1) have been detected in all the samples. 4-NP is the major AP compound measured in the SPM
and represents 66 ± 9% on average of total APs in the SPM (Fig. 2.b). These results are in agreement with those
reported in literature. For instance, 4-NP, NP1EO, NP2EO and NPEC levels ranging from 1.5 to 92, 1.3< to 35,
2.2 to 32 and 0.3< to 185 ng.g-1 were respectively reported in the Rhine Estuary and from 0.4< to 1080, 1.3< to
17, 0.3< to 26 and 0.3< to 239 ng.g-1 in the Scheldt Estuary (Jonkers et al., 2003 a.). Valls et al. (1990) and
Chalaux et al. (1994) have reported 4-NP levels in the Besos Estuary (Spain) and in the Nile Estuary (Egypt)
sediments respectively of 6.6 and 0.019-0.044 µg.g-1. Reviews on AP distributions have mentioned NP and
NPEO concentrations in sediments ranging respectively from < 0.003 to 72 µg.g-1 and 0.004 to 38 µg.g-1 (Thiele
Publications
et al., 1997; Ying et al., 2002), with higher NP proportions adsorbed on the SPM than dissolved in water because
of the hydrophobic nature of these compounds. These observations confirm that the Seine Estuary sediments are
among highly polluted ones by AP compounds for the period studied.
AP distribution patterns in the SPM are almost constant all over our study except in July and November
2003 (Fig. 2.b). For instance, increasing NP1EC proportions have been measured during these periods, in the
same way as in surface dissolved waters. These variations could also be explained by increasing microbial
biodegradation activity. Effluents of the Tancarville STP and/or industrial wastewater were probably the cause of
these variations.
Total AP contamination of the Seine Estuary water column (SPM+dissolved phase) ranges from 545 to
2390 ng.l-1 with a mean concentration of 1079 ± 372 ng.l-1 (Table 1). The SPM accounted for 3-32 % of total AP
contamination in the Seine Estuary water column (16 ± 8% as a mean). On the one hand, SPM contributes to 52
± 20% on average of total NP contamination of the water column of the Seine Estuary. On the other hand,
NP1EO, NP2EO and NP1EC are principally found in the dissolved phase (respectively 83 ± 9%, 90 ± 4% and 97
± 2%). The partition of the different AP compounds between particles and the dissolved phase is consistent with
databases. 4-NP has a pronounced lipophilic character and is therefore more likely associated with organic
matter on particles while NPEOs and more particularly NPECs are more hydrophilic compounds. Thus, the
partition between particles and dissolved water for the different AP compounds is close to the one described by
Jonkers et al. (2005) for the Dutch coastal zone.
3.2. Seasonal variation of total Alkylphenols bioaccumulated by copepods
Total and individual AP body-burdens in the copepod E. affinis are listed in Table 2. NP2EO and 4-NP
have been detected in all copepod samples while NPECs have never been detected. Total AP concentrations vary
from 3423 to 6406 ng.g-1. NP2EO (2890 to 6013 ng.g-1) is the most important compound bioaccumulated by E.
affinis.
NPEOs and NP bioconcentration factors in biological matrices are classically calculated using field
(caging) or laboratory experiments (McLeese et al., 1981; Ekelund et al., 1990; Smith and Hill, 2004). However,
the occurrence of NPEOs, NPECs and NP in natural biological matrices has been poorly reported. Among the
available data, AP concentrations in invertebrates have rarely been reported. Verslycke et al. (2005) have
reported high NP2EO (220-981 ng.g-1 lipid weight) and NP (206-435 ng.g-1 lipid weight) concentrations in
mysid crustacean species. Moreover, NP has been detected in Norway lobster and Spottail mantis shrimp from
the Adriatic Sea at levels ranging respectively from 274 to 399 and from 118 to 254 ng.g-1 fat weight (Ferrara et
al., 2005). Considering a 5 % dried weight lipid content (on average) in E. affinis, AP body-burdens measured in
this copepod sampled in the Seine Estuary, are superior to those reported in these articles for crustacean species
but also in fat fish. Since few data of the local contamination (dissolved phase and SPM) were detailed in these
articles, comparison with the data obtained in our study concerning interspecies bioaccumulation capacity should
be treated with some caution. Nevertheless, considering high AP levels measured in the water column and in the
copepods collected in the Seine Estuary, physiological disorders could occur.
PNEC value could be deduced by dividing the database LC50 of one compound (when no other aquatic
toxicity data is available) for the most sensitive species in the ecosystem by an extrapolation factor of 1000,
according to the EU TGD (*), in order to protect the largest proportion of the aquatic community from toxic
risks. NP1EC, NP1EO and NP2EO PNEC values are respectively of 2.0, 0.11, 0.11 µg.l-1 (Fenner et al., 2002).
The European Union (EU, 2005) proposed 0.33 µg.l-1 as PNEC value for nonylphenol (both for freshwater and
saltwater). In the Seine Estuary, total APs could account for a risk in water (total AP concentration /sum of each
compound PNEC) always greater than 1 (from 1.1 in September 2003 to 5.3 in January 2004) and must therefore
be considered as harmful. The 4-NP contribution to the overall risk ranged from 0.06 to 1.2, with also high risk
for NP1EO (0.4-1.4) and NP2EO (0.3-2.0). However, as no NOEC values are available for NPEO and NPEC
compounds, these risk values should be moderated. Besides, considering the proposed PNEC sediment value of
180 µg.kg-1 dry weight (according to the European Union 2005) with nonylphenol concentrations measured in
the SPM during our study, the risk imputed to this compound is always greater than 2 (2-39). The SPM of the
Seine Estuary are also potentially highly harmful to estuarine organisms.
Recent experimental studies have shown that 4-NP, at levels similar to those measured in our study,
affected the development time of Tigriopus japonicus (Marcial et al., 2003). Seo et al. (2006) have also observed
that sublethal 4-NP concentrations were toxic to copepods even at gene levels. Ghekiere et al. (2006) have
reported vitellin induction in the mysid Neomysis integer (crustacean) after exposure to low nonylphenol levels.
Endocrine disruptions were mentioned in the amphipod Corophium volutator exposed to high levels of
nonylphenol (Brown et al., 1999). Furthermore, high AP levels bioaccumulated by E. affinis could be harmful to
their predator but also endangered the local food web equilibrium, as this species ensures a key role in the Seine
Estuary. For instance, Pickford et al. (2003) have reported induced levels of vitellogenin mRNA in male fish
after exposure to nonylphenol via food transfer. Besides, intersex male fish have been sampled close to the Seine
Publications
Estuary (Minier et al., 2000) and in the river Seine. The occurrence of such hormonal diseases in male fish could
be explained by the high alkylphenol concentrations measured in the Seine Estuary.
4 Conclusions
APs were present at high levels both in the dissolved phase and in the SPM of the Seine Estuary from
November 2002 to January 2004. The dissolved phase and the SPM contributed respectively for 84 and 16 % of
total AP contamination in the water column. Total AP maximum levels in the dissolved phase and in the SPM
were observed during winter periods while significant decreases were observed during spring and autumn
periods. These declines could be ascribed to maximum biological activities during these seasons. Particularly
high NP and NP2EO concentration have also been measured in all E. affinis samples which gave insight into the
high capacity of this species to bioaccumulate APs. Besides, levels of APs measured in the water column were
always at levels that could present a risk for aquatic species. Thus, endocrine disruptions (inter-sex fish)
observed in the Seine River or in the Bay could be related to the high AP concentrations.
Acknowledgement:
Funding for this research was provided by the multidisciplinary Seine Aval scientific program, the Region
Haute-Normandie and by the GDR IMOPHYS.
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Figure 1: Biodegradation routes of alkylphenol polyethoxylates: (A) the oxidative hydrolytic (aerobic) pathway
and (B) the non-oxidative hydrolytic (anaerobic) pathway (according to Fenner et al., 2002).
H2
C
O
C
H2
R
H2
C
O
n
OH
C
H2
R = C9H19, nonyl
Alkylphenols polyethoxylate (APnEO)
A
Alkylphenoxy carboxylic
acid (APmEC)
H2
C
O
C
H2
H2
C
O
Alkylphenols polyethoxylate
(APnEO)
H2
C
O
O
C
H2
C
OH
n
R
B
H2
C
O
n-1
R
OH
C
H2
Successive shortening of ethoxylate chains
O
C
O
C
H2
H2
C
O
OH
C
H2
R
O
H
R
Alkylphenoxy acetic acid
(AP1EC)
OH
Alkylphenol monoethoxylate
(AP1EO)
R
Alkylphenol (NP)
Ring cleavage, oxidation of alkyl
chain
Publications
Figure 2: Alkylphenols distribution patterns in surface water (a), in the SPM (b) and in the water column (c) for
each sampling cruise (numbers refer to the sampling dates).
a.
Relative percentage
100%
75%
50%
25%
0%
b.
Relative percentage
100%
75%
50%
25%
0%
c.
Relative percentage
100%
75%
50%
25%
0%
1
NP1EC
2
3
NP2EC
4
5
6
4NP
7
8
NP1EO
9
10
NP2EO
Publications
Figure 3: Concentration ratios of alkylphenol metabolites indicative of metabolic pathways in the Seine Estuary
(numbers refer to the sampling cruises).
Ratios
15
10
5
0
2
1
3 4 5
4-NP/4-NPEOs
6
7 8 9
10
4-NP/4-NPECs
NPECs/NPEOs
Table 1: Average alkylphenol concentrations in the dissolved phase (ng.l-1), in the SPM (ng.g-1), and in the
water column (dissolved phase + SPM) (ng.l-1) of the Seine Estuary.
n = 10
SPM (ng.g-1)
n = 10
Water column (ng.l-1)
n = 10
Mean
Median
Min.
Max.
Mean
Median
Min.
Max.
Mean
Median
Min.
Max.
NP1EC
NP2EC
NP1EO
NP2EO
4-NP
647
24
69
78
110
536
0
57
56
79
259
n.d.
41
33
15
1455
147
149
224.0
386
204
n.d.
231
167
1672
183
n.d.
110
50
850
18
n.d.
40
21
289
515
n.d.
692
757
7105
661
24
86
89
215
544
0
82
59
168
278
n.d.
45
37
78
1480
147
183
260
467
Σ APEs
929
843
399.0
2214
2434
1173
405
9636
1079
1133
545
2390
Total Alkylphenols (ΣAPEs) = Sum of 4-NP, NP1EO, NP2EO, NP1EC and NP2EC.
n.d. = not detected
n = Number of sampling cruises
Table 2: Seasonal variation of total and individual concentrations of alkylphenol compounds in E. affinis (ng.g1
). n indicates the number of analyses (NP1EC and NP1EO have never been detected).
ng.g-1 (dry weight)
Sampling dates
n
NP
NP2EO
Total AP
26/11/02
1
654
4823
5477
01/04/03
2
393±6
6013±94
6406±911
22/04/03
3
251±23
5026±1213
5277±1246
01/07/03
1
533
2890
3423
08/09/03
4
819±142
06/10/03
2
997±24
3174±76
4171±174
04/11/03
2
2477±0
3190±1083
5667±1083
3399±81
4218±458
Publications
Publication n° 3 :
Tidal influence on the distribution of hydrophobic organic contaminants in the Seine
Estuary and on their biological effects on the copepod Eurytemora affinis.
K. Cailleaud 1, 2, 3, J. Forget-Leray3, L. Peluhet1, K. LeMenach1, S. Souissi2, H. Budzinski1*
Abstract:
To elucidate tidally related variations of hydrophobic organic contaminant (HOCs) bioavailability and
the impact of these contaminants on estuarine ecosystems, both PCB and PAH concentrations were investigated
in the dissolved phase and in the suspended particulate material (SPM) of the Seine Estuary. Thus, both PAH
and PCB highest levels were observed in surface and bottom water column (dissolved phase + SPM) when SPM
remobilizations were at maximum, in relation to higher speed currents.
In parallel, acetylcholinesterase (AChE) and glutathione-S-transferase (GST) activities were
investigated in the copepod E. affinis for tidal cycle variations. Significant decreasing AChE levels were
measured during the tidal cycle and between surface and bottom copepods related to salinity variations and to
HOC concentration variations in the water column. Significant increasing GST levels were also observed when
HOC concentrations in the water column were the highest. This study underlined the need to standardize
sampling procedures for biomonitoring studies in order to avoid interfering factors that could modify biomarker
responses to chemical exposure.
Keywords: PAH, PCB, bioavailability, biomarkers, saline tide
Soumise à Environmental Pollution
Publications
1. Introduction
PCBs and PAHs are among the most ubiquitous HOCs and have caused worldwide concern as toxic
environmental contaminants. Therefore, they have been included in the priority pollutant lists of the US-EPA
and UN-ECE POP Protocol (Lerche et al., 2002).
PCBs are synthetic organic compounds considered as the most representative industrial persistent organic
pollutants (POPs) (Breivik et al., 2004). Their concentrations in aquatic ecosystems have progressively
decreased since the regulation of their use in the early 1970’s (Erickson, 2001), and their final ban. Nevertheless,
due to their persistence (Tanabe, 1988) and their acute and long term toxicities on aquatic organisms (Jones,
1991; Tanabe et al., 1994), PCBs may still represent a risk.
PAHs constitute another major group of organic contaminants which arise mainly from the incomplete
combustion of fossil fuels and organic materials (NRC, 1983). Because of their high concentrations in aquatic
environments (Cailleaud et al., in press) as well as their carcinogenic and mutagenic properties (Neff, 1979),
PAHs are a major concern.
In natural waters, like estuaries, HOCs such as PCBs and PAHs may be free in the dissolved phase,
bound to dissolved organic matter, or sorbed to suspended particulate matter and sediment. Nevertheless, HOC
exchange between SPM and the surrounding water has been shown to be a reversible process (Gschwend and
Wu, 1985). HOCs accumulated in sediments, which act as a sink, can penetrate back into the water column by
resuspension of in-place sediments with potential for redistribution from the SPM to the dissolved phase or by
diffusive fluxes of dissolved species (Eggleton and Thomas, 2004). For instance, Boehm (1983) has shown that
PCB and PAH concentrations could fluctuate by a factor of ten during one tidal cycle in the New York Bight.
Moreover, inputs resulting from PCB resuspension in the Hudson River Estuary were significantly the dominant
source compared to fluvial inputs or wastewater and atmospheric depositions (Achman et al., 1996). In estuaries,
tidal currents and wind are the major factors that determine the duration and magnitude of sediment resuspension
and deposition (Sandford, 1994). Macrotidal estuaries are clearly tidally dominated (Uncles and Stephens, 1989)
that is why the influence of surface waves and wind-forced currents could be neglected in particle removal
processes. Moreover, estuaries are mixing areas for fresh riverine and coastal ocean water masses featuring
temporal and spatial gradients of physical and chemical parameters known to affect HOC solubility in water
(Whitehouse et al., 1984). Among these parameters, some present small scale temporal variations such as salinity
during tidal events while others present large scale temporal variations such as temperature over seasons. Batch
sorption experiments have shown a linear correlation between HOC sorption on particles and salinity (Means,
1995), while field data have shown either weak correlation (Zhou et al., 1999) or even the opposite (Zhou et al.,
1998).
For these reasons and owing to HOC physical and chemical properties, suspended particles and
underlying sediments constitute long-term reservoirs and secondary sources for PCBs and PAHs in estuaries.
The release of contaminants into the water column by remobilization can deteriorate the water quality and have
deleterious effects on the biota. The degree of ecological stress that HOCs exert on the aquatic environment is
directly related to their toxicological properties, their bioavailability, the residence time in each compartment
(i.e. mainly the dissolved phase, the suspended particulate matter and sediments), and the rate of exchange
between compartments. Therefore, both benthic organisms which feed on sediments and pelagic species which
feed on resuspended materials can bioaccumulate HOCs and suffer from acute or chronic sub-lethal effects
(Cheung et al., 2002; Geffard et al., 2003). However, little field data are available to assess tidal flux impact on
HOC phase association in estuaries. Both PAHs and PCBs have been detected in the Seine Estuary (Cailleaud et
al., in press) with particularly high levels adsorbed on the SPM. Nevertheless, geochemical processes and
transport of these contaminants during tidal cycles are not well described. However, an understanding of these
chemical and physical processes is essential to assess the water quality of the estuary and to predict toxic effects
of pollutants on the ecosystem.
The combined use of chemical analyses and biochemical and cellular responses to pollutants, is a sound
procedure for assessing the impact of anthropogenic contaminants in aquatic ecosystems (Schlenk et al., 2003).
Measures of AChE inhibition and of GST induction are two of the more widely used biomarkers in
environmental biomonitoring studies. The AChE is the enzyme that hydrolyses the neurotransmitter
acetylcholine in vertebrate and invertebrate cholinergic synapses, and is strongly and specifically inhibited by
various insecticides (Forget et al., 2003). Nevertheless, non-specific AChE inhibitions by organic contaminants
other than pesticides have been increasingly reported (Guilhermino et al., 1998). The GSTs are enzymes
involved in detoxification processes, induced by a wide range of synthetic and natural molecules, which catalyze
the conjugation and potential excretion of xenobiotics (Georges, 1994).
The copepod E. affinis appears to be the ideal candidate to estimate the water quality variations of the
Seine Estuary during tidal cycles. As a matter of fact, E. affinis is the dominant species of the Seine Estuary
representing more than 90% of the zooplankton biodiversity. Moreover, this organism presents tidally oriented
Publications
vertical distribution and is characterized by a full vertical and horizontal distribution all over the estuary.
Therefore, this copepod is exposed to sediment as well as to the overlying SPM and dissolved phase.
The objective of this study was to provide quantitative information regarding PCB and PAH distribution
and phase association in the Seine Estuary water column during one tidal cycle in order to determine the
bioavailability of these compounds and their bioaccumulation by a planktonic species. Biological effects of these
pollutants were also investigated by measuring AChE and GST expression variations during the tidal cycle.
2.1. Study area and sample collection
The Seine Estuary is the largest megatidal estuary along the English Channel with an area of 150 km2 at
high tide. The Seine river drains a watershed area of 78 650 km2, and flows into the English Channel in the
North-West of France.
All the samples were collected in May 2004 near the “Pont de Normandie” station (Figure 1) in the mesohaline
part of the Seine Estuary, during the SaZooTox scientific cruise at ebb tide. All the samples have been collected
in a fixed location during one tidal cycle. Water and copepod samples have been collected systematically in
surface and bottom water column. Both surface and bottom waters were sampled using 5l Niskin bottles while
copepods were sampled using standard WP2 plankton nets (200 µm mesh size; diameter: 1m). Plankton nets
were towed during 5 minutes at subsurface and bottom levels (using ballasted net). Then, plankton samples were
directly sorted on board as previously described (Cailleaud et al., 2007). Water samples were also immediately
filtered on board using pre-heated (450 °C) and pre-weighed GF/F Whatman glass fiber filters under vacuum
conditions. Then, water samples were conditioned in pre-heated 4 l glass bottles and stored at 4°C in the
laboratory and the filtered SPM were frozen at -20°C until their analysis. Water and copepod samples were
processed for PCB and PAH analysis and biomarker measurements. Physical and chemical parameters of each
sampling time are listed in Table1.
- Extraction procedures and GC analyses
Extraction and quantification methods for PAHs and PCBs are described elsewhere in details
(Budzinski et al., 1997; Cailleaud et al., in press). Briefly, internal standard mixtures were gravimetrically added
before the solvent introduction. Dissolved PAHs and PCBs were liquid-liquid extracted. Both PAHs and PCBs
accumulated in E. affinis and sorbed on the SPM were extracted by micro-wave assisted extraction during 10
min at 30 W (Maxidigest 350 PROLABO). The organic extracts were then purified (Cailleaud et al., in press).
Concentrations of PCBs and PAHs were monitored respectively using GC/ECD (Hewlett-Packard
5890A series II GC (Avondale, MA, USA) equipped with a 63Ni electron-capture detector) and GC/MS
(Hewlett-Packard model series 6890A GC and an Agilent Networks 5973 mass selective detector (Agilent
Technologies)). The mass spectrometer was operated in Single-Ion-Monitoring (SIM) mode with the molecular
ions of the studied PAHs as reported by Budzinski et al. (1997). PAHs and PCBs are quantified using the
response factors of internal standards (Cailleaud et al., in press).
- Quality assurance
Previous to the analyses, all glassware was cleaned with detergent, rinsed with ultra-pure water and
followed by heating at 450°C overnight. Procedural blanks were regularly performed (representing less than 10%
of the sample content) and all results presented are adjusted for the minor contributions from the blanks. The
effectiveness of the different analytical procedures was evaluated by analyzing NIST Standard Reference
Material 1944 (sediment) and 2978 (mussels) for PCBs and PAHs (Gaithersburg, MD, USA) as previously
described (Cailleaud et al., in press).
2.3. Biomarker assays
A pool of whole-body E. affinis was used to determine both AChE and GST activities. These enzymes
were extracted as previously described (Cailleaud et al., 2007). AChE activity measurements were performed
using the colorimetric method of Ellman (1961), modified by Bocquené and Galgani (1998) at 412 nm, with
acetylthiocholine iodide (AcSCh) as substrate and dithio-bis-nitrobenzoate as reagent at a controlled temperature
of 20°C. GST activity was evaluated as the conjugation between glutathione and 1 -chloro-2,4-dinitrobenzene
(CDNB) at 340 nm (Habig et al., 1974). Proteins for standardisation of these biomarkers were determined using
Publications
Bradford’s method (1976) modified by Bocquené and Galgani (1998). All assays were performed in
quadruplicate. All chemicals were purchased from Sigma-Aldrich (St Quentin Fallavier, France).
Biomarker measurements are expressed as means ± standard deviation. All data were statistically
analyzed by the STATISTICA Software v6.0 (Statsoft. Inc., 2002). To assess multiple comparisons between the
different sampling times (10:15, 12:15, 14:15 and 18:05) and between the two locations in the water column
(surface and bottom), a non parametric Kruskal-Wallis ANOVA by ranks was performed both on AChE and
GST data. To compare two groups, the non parametric Mann-Whitney U test was used. In all cases, the level of
significance (p) was set to 0.05.
3.1. HOC distribution in the water column
- PCB contamination
Total PCB concentrations and concentrations of the seven priority congeners in the Seine Estuary water
column (dissolved phase + SPM) are presented in Table 2. The global PCB contamination of the water column
ranges from 25 to 64 ng.l-1 and from 23 to 108 ng.l-1 respectively in surface and bottom waters. These
concentrations are in the same range as those measured in the Newark Bay Estuary (Dimou et al., 2006) and
slightly higher than in the Chesapeake Bay (Foster et al., 2000; Ko and Baker, 1995). These results show
increasing levels of total PCB as well as individual PCB congener concentrations, both in surface (2 orders of
magnitude) and bottom waters (5 orders of magnitude), during maximal mixing periods when SPM
concentration in the water column are the highest. Moreover, PCB contamination in the bottom water is much
higher than in surface water during maximum resuspension periods, when current speeds are the highest. In
contrast, slight differences are measured during low current speed times. PCB distribution patterns in the surface
water column are constant during the tidal cycle, dominated by tetra-, penta- and hexachlorobiphenyls. The
major PCB homologs measured both in surface and bottom water column are CB 101 (1.9-8.6 ng.l-1), CB 118
(1.8-7.7 ng.l-1), CB 153 (1.6-10.8 ng.l-1) and CB 138 (1.4-10.3 ng.l-1). PCB patterns in the bottom water column
are similar to those observed for surface water column except during resuspension periods when increasing
levels of heptachorobiphenyls and decreasing levels of tetrachlorobiphenyls are measured. Differences in
homolog distributions between low and high speed current periods may indicate a PCB source during the tidal
cycle probably related to sediment resuspension. Thus, speed and direction of tidal currents drive sediment
resuspension. Indeed, maximum SPM concentrations are associated with peaks in tidal current speed which is
consistent with observations of sediment resuspension in other estuaries (Ko et al., 2003; Sandford et al., 1991).
This physical parameter ensures a major role in the variations of SPM concentration and therefore in PCB
distribution in the water column. Therefore, particulate PCBs make up a larger fraction of total PCB
contamination of the water column, especially in bottom water. Thus, SPM could account respectively for 59 ±
9% and 66 ± 20% of total PCB contamination in surface and bottom water column. Besides, increasing fractions
of particulate PCBs are observed during resuspension periods with however much higher increases in bottom
waters than in surface waters.
Total PCB concentrations and concentrations of the seven priority homologs in the dissolved phase and
in the SPM are summarized in Table 3. Low variations are observed in total PCB concentrations, both in surface
and bottom SPM during the tidal cycle. Total PCB concentrations range respectively from 240 to 342 ng.g-1 and
from 144 to 229 ng.g-1 in surface and bottom SPM. Moreover, surface SPM presents always higher PCB levels
than bottom SPM. However, although HOC concentrations in SPM are generally correlated to particulate
organic carbon (foc), in this study, increasing PCB levels in the SPM are not related to increasing foc. These
results are consistent with data from Foster et al. (2000) in the Chesapeake Bay which suggest that the diverse
erosional PCB sources interfere with clear relationship between increasing PCB concentrations with increasing
foc in the SPM. PCB congener patterns in surface and bottom SPM are also constant during all the tidal cycle but
are dominated by high molecular weight congeners (mainly tetra-, penta-, hexa and heptachlorobiphenyls).
Total dissolved PCBs show low variations during the tidal cycle with concentrations ranging respectively from
13.0 to 20.2 and from 11.5 to 17.4 ng.l-1 in surface and bottom dissolved phases. Besides, surface and bottom
dissolved PCB levels are close with however higher concentrations for surface dissolved water. These
observations are consistent with those reported by Wurl and Obbard (2005) that mention PCB enrichment toward
the surface in the water column of Singapore’s coastal environment. The highest dissolved PCB concentrations
are measured during the lowest salinity period, both in surface and bottom water, when freshwater influence is
maximal. On the contrary, the lowest concentrations of PCB in the dissolved phase are observed during the
Publications
highest salinity period, when the marine influence is maximal. Moreover, the highest PCB concentrations in
surface and bottom dissolved phase are observed when water currents and SPM concentrations are the highest,
suggesting phase exchange of PCBs during resuspension events. PCB congener distribution in the dissolved
phase is relatively constant during all the tidal cycle, both in surface and bottom water, with higher proportions
of lighter congeners than in the SPM (di-, tri-, tetra- and pentachlorobiphenyls).
The vertical distribution patterns in the water column suggest that contaminated sediment resuspension
processes may be a major source of PCBs in the Seine Estuary during a tidal cycle. However, atmospheric
depositions of contaminants indicated by surface water PCB enrichments may act as secondary source.
- PAH contamination
Total and individual PAH concentrations in surface and bottom water column of the Seine Estuary are
listed in Table 2. Total PAH concentrations in surface and bottom water column range respectively from 126 to
702 ng.l-1 and from 140 to 1754 ng.l-1. These concentrations are several orders of magnitude higher than those
measured in the mesohaline Chesapeake Bay (Ko and Baker, 1995) and in the San Francisco Estuary (Ross and
Oros, 2004) but lower than in the Pearl River Delta (Luo et al., 2004). These results indicate total PAH
increasing levels as well as individual PAH concentrations both in surface (5 orders of magnitude) and bottom
water (10 orders of magnitude) during maximum resuspension periods when SPM concentrations in the water
column increase. Moreover, as observed for PCB contamination, bottom waters are much more intensively
contaminated by PAHs than surface waters (2-10 orders of magnitude higher) during maximum sediment
remobilization periods, when current speeds are the highest, while low differences are measured during
minimum sediment remobilization periods. PAH patterns are constant both in surface and bottom water column
during the tidal cycle. Moreover, surface and bottom waters present similar PAH profiles, dominated by three,
four and five-ring compounds. The major PAH compounds measured both in surface and bottom waters are
Fluoranthene (13-195 ng.l-1), Pyrene (12-163 ng.l-1), Chrysene (12-243 ng.l-1) and benzo[b]fluoranthene /
benzo[b]fluoranthene / benzo[j]fluoranthene (19-260 ng.l-1). Finally, PAHs adsorbed on SPM contribute to a
large amount of total PAH contamination in the water column. Thus, SPM could account for 91 ± 5% and 94 ± 5
% of total PAH contamination respectively in the surface and bottom water column. Besides, the fraction of
PAH sorbed to SPM increases during resuspension events, especially in the bottom water column.
Total and individual PAHs in the dissolved phase and in the SPM are presented in Table 3.
Concentrations of PAHs associated to SPM vary from 2183 to 4377 ng.g-1 and from 2126 to 4366 ng.g-1
respectively in surface and bottom SPM. Moreover, total PAH increasing levels as well as individual PAHs
sorbed to particles are measured when water salinity decreases, both in surface and bottom SPM. In the same
way, the highest PAH contaminations in the SPM are measured when speed currents increase, both in surface
and bottom SPM. Nevertheless, in the same way as for PCB levels in the SPM, no correlation is found between
PAH levels in the SPM and particulate organic carbon content. Similar results have been reported by Zhou et al.
(1999) in the Humber Estuary who argued that PAHs associated with particles were present in the form of soot
or soot-like particles that were not subjected to equilibrium between SPM and dissolved phase.
Low differences are observed in PAH contamination between surface and bottom SPM. PAH distribution
patterns in the SPM are constant during the tidal cycle and no difference is observed between surface and bottom
SPM. These PAH distribution profiles are dominated by high molecular weight compounds, four to six ring
PAHs representing more than 80% of total PAH contamination. The major PAH compounds sorbed to the SPM
are Fluoranthene (233-464 ng.g-1), Pyrene (183-403 ng.g-1), Chrysene (232-623 ng.g-1) and benzo[b]fluoranthene
/ benzo[j]fluoranthene / benzo[k]fluoranthene (329-800 ng.g-1).
Like dissolved PCBs, total dissolved PAHs show low variations during the tidal cycle with
concentrations ranging respectively from 20.6 to 26.9 ng.l-1 and from 16.3 to 22.8 ng.l-1 in surface and bottom
dissolved phases. Surface and bottom dissolved PAHs present low differences with higher concentrations in
surface dissolved water such as dissolved PCBs, especially for low molecular weight compounds and
particularly Naphthalene (6.2-13.2 ng.l-1). These observations could indicate a PAH source in surface water like
atmospheric wet and dry depositions. Previous studies (Cailleaud et al., in press) have shown that the Seine
Estuary PAH contamination was mainly of pyrolytic source (proximity of industrial areas, and vehicle traffic).
Moreover, PAH levels in the dissolved phase are always slightly higher than PCB levels both in surface and
bottom dissolved phases. In the same way as dissolved PCBs, the highest dissolved PAH concentration in
surface water is measured during the lowest salinity period with the maximal freshwater influence. The lowest
one is measured during the highest salinity period. These results are consistent with studies of Means (1995) and
Tremblay et al. (2005) who demonstrated that salinity increases increased the fraction of PAHs sorbed to
particles. Besides, highest PAH levels both in surface and bottom waters are observed when water currents and
SPM concentration are the highest which suggests, in the same way as PCBs, adsorbed PAH remobilisation
during resuspension periods. PAH distribution patterns in the dissolved phase present low variations during the
tidal cycle and between surface and bottom waters. These profiles are dominated by lower molecular weight
Publications
compounds compared to PAH profiles in the SPM, especially by two, three and four-ring compounds
(Naphthalene, Phenanthrene, Fluoranthene and Pyrene). Two-ring and three-ring compounds represent from 72
to 80% and 58 to 72% of total PAH contamination respectively in surface and bottom dissolved phase.
Decreasing levels of two-ring compounds and increasing levels of four-ring compounds are observed between
surface and bottom dissolved phase. Besides, increasing levels of two-ring compounds are observed in surface
water during the tide what could confirm light PAH atmospheric inputs in surface water.
3.2. HOC distribution in E. affinis
PCB and PAH concentrations in copepods range respectively from 353 to 1115 ng.g-1 and from 61 to
975 ng.g-1 (Table 4). No difference is measured in PCB bioaccumulation between surface and bottom copepods
except for the first sampling when surface copepods present lower PCB body-burdens than bottom copepods. In
the same way, PCB concentrations in surface and bottom copepods are almost constant during all the tidal cycle
with however a lower level measured in surface copepods for the first sampling. In opposition, PAH
concentration variations are observed in bottom copepods during the tidal cycle. Moreover, surface copepods
which are less contaminated by PAHs than bottom copepods (3 to 7 orders of magnitude lower), present lower
PAH levels (5 to 8 orders of magnitude lower) compared to PCB levels. No relation is shown between HOCs
bioaccumulated by the copepods and concentrations of these contaminants in the water column. A previous
study (Cailleaud et al., in press) has indicated that the longer E. affinis is exposed to PCBs as well as PAHs (the
older the copepods were), the more this copepod could bioaccumulate HOCs. In the present study, no relation is
established between the ecological composition of samples (Table 4) and HOC concentrations in E. affinis.
However, chemical and ecological analyses of E. affinis are performed on copepods sampled with different
capture techniques (respectively WP2 net and Niskin bottles). In addition, Mouny (1998) has reported
differences in sample composition obtained with Niskin bottles and WP2 plankton net. Thus, nauplii and first
stage copepodites are not retained by WP2 plankton net and adult copepods can avoid the net. Therefore,
extrapolating a relationship between ecological data and contaminant concentrations appears to be difficult.
These data indicate that E. affinis population is not homogeneously spread in the Seine Estuary water column,
with differences in the repartition of developmental stages between surface and bottom and during the tidal
cycle. This study shows that the copepod population is also not homogeneously contaminated by PCBs and
PAHs.
3.3. Biomarker variations
Both AChE and GST activities present variations during the tidal cycle (Figure 2). The Kruskal-wallis
ANOVA by ranks reveals significant differences in both biomarker expressions according to the position in the
water column and the sampling time (respectively H=29.55682 with p= 0.0001 for AChE; H=24.67238 with p =
0.0009 for GST). For surface copepods, the significantly maximum AChE level is measured during the second
sampling (12.13 PSU). Then, significantly lower AChE levels are observed before and after this sampling time,
with a significant minimal level (p<0.05) measured in copepods from the first sampling (15.27 PSU). For bottom
copepods, the maximum AChE level is measured during the second sampling in the same way as for surface
copepods and is significantly higher than other AChE levels measured in bottom copepods. Moreover,
significant lower levels are measured in copepods sampled during the first and the last sampling times. These
variations could relate in the one hand to salinity variations as reported by Cailleaud et al. (2007) in laboratory
experiments. These experiments have shown that salinity has effects on AChE levels in E. affinis. Moreover, the
maximum AChE level in these experiments was measured for an intermediate salinity between 5 and 10 PSU
which is thought to be the optimum salinity for this species. In addition, the maximum AChE levels during the
tidal cycle are measured for a salinity close to this optimal salinity. On the other hand, the differences observed
in AChE expression during the tidal cycle could also be related to HOC concentration variations. Thus, the
higher AChE levels are measured during the second sampling when PAH and PCB concentrations in the water
column are the lowest. Furthermore, surface copepods present always significantly higher AChE levels than
bottom copepods. Indeed, the mean AChE activity depletion observed between surface and bottom copepods is
31% with a maximum depletion during the last sampling (41%) and a minimum one during the first sampling
(29%). Besides, AChE activity depletion between surface and bottom copepods increases during the tidal cycle.
These differences could be related to increases of HOCs in the water column since maximum depletion is
observed for the highest PAH and PCB levels in the water column. Although AChE activity reduction is
generally attributed to direct and specific neurotoxic effects particularly due to organophosphate and carbamate
pesticides (Forget et al., 2003), several studies mention that AChE could also be inhibited by other contaminants
(Guilhermino et al., 1998; Payne et al., 1996). Furthermore, in vitro AChE activity inhibition by high molecular
weight PAHs has been demonstrated (Kang and Fang., 1997). In any case, according to the US EPA (1998),
statistically significant inhibition by 20% or more represents a clear toxicological effect. In this field study,
Publications
AChE inhibition is related to a general pollution gradient and to physical and chemical variations due to the tidal
cycle.
Similar GST levels are measured both in surface and bottom copepods during the tidal cycle except for
the last sampling which presents significant increasing levels (+40% and +80% respectively for surface and
bottom copepods) compared with the other samplings (p<0.05). GST is a phase II enzyme conjugating and
detoxifying metabolites formed by phase I enzymes and is induced by chemicals including PAHs and PCBs.
Besides, the highest GST levels in both surface and bottom copepods are measured during the last tidal cycle
sampling when PAH and PCB concentrations are the highest in the water column. These results are in agreement
with previous studies which have shown GST activity inductions after exposure to high molecular weight PAHs
in Perna viridis and in Mytilus edulis exposed to PCBs (Cheung et al., 2002; Gowland et al., 2002). However, no
significant difference of GST levels is measured between surface and bottom copepods.
4. Conclusion
The results do suggest the important role of physical mixing processes and particle/water interactions in
affecting hydrophobic organic contaminant distribution between water and particles in estuarine environments.
Indeed, both PAH and PCB concentrations present variations, in dissolved water as well as in SPM during the
tidal cycle, depending mainly on salinity and current speed variations. Moreover, differences in HOC
concentrations were also observed depending on the location of the sample in the water column (surface and
bottom position) which is mainly related to SPM concentration. Furthermore, significant variations were also
measured in biomarker expression in E. affinis. Thus, variations were observed during the tidal cycle and
between surface and bottom copepods for AChE expression, with lower expression when HOC concentrations in
the water column were the highest. Water salinity also seems to act on the expression of this activity. Moreover,
GST expression was significantly induced when HOC concentrations were the highest in the water column.
E. affinis is a proposed sentinel species for estuarine environments because of its distribution all among the Seine
Estuary. This work underlines the importance of physical and chemical parameters for biomonitoring studies in
fluctuant ecosystems such as estuaries. Thus, the best way to avoid the potential factors which could interfere
with biomarker signals, is to standardize sampling procedures by selecting a time during the tidal cycle (ebb tide
or flow tide), a position in the water column (surface, middle or bottom water column) and constant physical and
chemical parameters (especially salinity).
Acknowledgements
The authors thank D. Devreker (UMR 8013 CNRS, Lille University) for informations on the
distribution of the different developmental stages of E. affinis during the tidal cycle and Dr. H. Etcheber (UMR
5805 EPOC-OASU, Bordeaux1 University) for dissolved organic carbon and particulate organic carbon
analyses. This study received financial support from the multidisciplinary Seine Aval scientific program, from
the Region Haute-Normandie and from the GDR IMOPHYS.
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Figure 1: Study area and sampling station in the Seine Estuary.
0°
0°30 E
T
h
e
Caudebec
PK 310
Tancarville
Le Havre
C
h
a
n
n
e
l
1
Study area
49°30 ’N
2
PK 340
Honfleur
PK 355
Pont de Normandie
Kilometric point
Industrial sites
0
5
10
Euryhaline zone
15 km
Mesohaline zone
Limit of the saline tide
Sampling site
Oligohaline zone
1° E
Publications
Figure 2: Variations of the expression of the AChE and GST (n=4) activities in surface and near bottom
copepods during one tidal cycle (1, 2, 3, 4 = bottom samples from 10:15 to 18:05 and 5, 6, 7, 8 = surface samples
from 10:15 to 18:05). Black circle indicates significant differences (p<0.05).
Table1: Physical and chemical parameters of the sampling times (HT: high tide, Foc: fraction of particulate
organic carbon, DOC: dissolved organic carbon).
Time
(hours)
10:15
(HT)
12:15
(HT + 2h)
14:15
(HT + 4h)
18:05
(HT + 8h)
Depth (m)
Surface
Bottom
Surface
Bottom
Surface
Bottom
Surface
Bottom
10.79
9.55
7.56
5.54
Salinity
(PSU)
15.27
22.02
12.13
22.88
2.79
18.06
0.43
0.48
Temperature Current speed
(°C)
(cm.s-1)
14.35
13.41
14.83
13.28
16.03
13.81
15.52
15.49
40
30
25
35
80
100
34
80
Turbidity
(mg.l-1)
Foc (%)
DOC
(mg.l-1)
99
75
48
56
52
444
154
398
3.36
2.34
3.99
3.54
3.29
3.38
3.41
2.71
2.20
2.30
3.05
4.70
3.40
2.95
3.65
3.40
Publications
Table 2: PCB and PAH distribution in the water column of the Seine Estuary during one tidal cycle (D:
dissolved phase, P: suspended particulate matter, n.d. = not detected).
Water colum (D + P) (ng.l-1)
Time
10 : 15
12 : 15
14 : 15
18 : 05
Sampling position
S-B
S-B
S-B
S-B
4.4 - 2.3
2.3 - 2.2
3.9 - 2.7
3.2 - 2.6
3.3 - 2.5
3.6 - 2.4
1.1 - 0.8
1.8 - 2.5
1.8 - 1.5
2.1 - 1.9
1.9 - 1.8
1.8 - 1.6
1.8 - 1.4
0.6 - 0.5
2.1 - 6.1
2.8 - 5.3
3.4 - 8.2
2.8 - 6.8
2.5 - 10.8
2.2 - 9.7
0.8 - 5.1
3.3 - 6.3
4.2 - 5.6
5.3 - 8.6
5.8 - 7.7
5.8 - 10.7
5.0 - 10.3
2.1 - 4.9
41 - 29
25 - 23
33 - 102
64 - 108
4 rings
11 - 9
2-1
7-2
6-2
20 - 11
6-5
39 - 25
35 - 22
19 - 12
59 - 30
10 - 8
1-1
2-2
2-3
6-7
3-3
13 - 15
12 - 14
4-6
12 - 19
1 - 27
nd - 4
nd - 10
nd - 17
9 - 73
4 - 43
15 - 170
13 - 157
7 - 91
22 - 237
20 - 27
2-8
7 - 22
9 - 27
35 - 94
18 - 44
72 - 185
64 - 163
35 - 91
97 - 243
4 rings
53 - 38
22 - 19
31 - 251
124 - 260
4 rings
5 rings
27 - 16
27 - 17
7-5
23 - 14
9 - 10
8 - 10
3-3
8-9
14 - 128
12 - 136
4 - 58
11 - 115
48 - 130
53 - 144
21 - 53
45 - 124
5 rings
4-2
1-1
1 - 19
7 - 19
6 rings
25 - 15
9 - 10
12 - 116
45 - 122
371 - 227
126 - 140
160 - 1652
702 - 1754
99 - 75
48 - 56
52 - 444
154 - 398
50 + 28
52
101
118
153
138
180
4 cl
4 cl
5 cl
5 cl
6 cl
6 cl
7 cl
Total PCBs
Naphthalene
Acenaphthylene
Acenaphtene
Fluorene
Phenanthrene
Anthracene
Fluoranthene
Pyrene
Benzo[A]anthracene
Triphenylene+Chrysene
Benzo[k]fluoranthene+
Benzo[b]fluoranthene
Benzo[e]pyrene
Benzo[a]pyrene
Perylene
Indenopyrene
Dibenzo[a]anthracene+
Dibenzo[c]anthracene
Benzo[g,h,i]perylene
Total PAHs
-1
Turbidity (mg.l )
2 rings
3 rings
3 rings
3 rings
3 rings
3 rings
3 rings
4 rings
4 rings
5 rings
5 rings
Total PAHs = Sum of the 20 PAHs analyzed.
Total PCBs = congeners 8, 18, 29, 50+28, 52, 104, 44, 66, 101, 87, 154+77, 118, 188, 153, 105, 138, 126, 187,
128, 200, 180, 170, 195, 206 and 209.
Publications
Table 3: PCB and PAH distribution in the dissolved phase and in the suspended particulate matter (dry weight)
of the Seine Estuary during one tidal cycle (nd: not detected).
SPM (ng.g-1)
Time
10 : 15
12 : 15
14 : 15
18 : 05
10 : 15
12 : 15
14 : 15
18 : 05
Sampling position
S-B
S-B
S-B
S-B
S-B
S-B
S-B
S-B
4 cl
4 cl
5 cl
5 cl
6 cl
6 cl
7 cl
3.42 - 1.59
0.97 - 1.41
0.74 - 1.04
0.91 - 1.31
0.62 - 0.80
0.64 - 0.86
0.07 - 0.10
1.19 - 1.88
1.23 - 1.19
0.96 - 1.24
1.15 - 1.22
0.68 - 0.77
0.74 - 0.75
0.06 - 0.07
1.31 - 1.19
1.87 - 1.34
1.43 - 0.99
1.46 - 0.90
0.82 - 0.68
0.63 - 0.32
0.09 - 0.07
0.95 - 0.89
1.73 - 1.75
1.60 - 1.21
2.54 - 1.54
1.26 - 0.92
0.90 - 0.92
0.13 - 0.11
10 - 11
14 - 10
32 - 21
23 - 17
27 - 22
29 - 20
10 - 9
12 - 12
12 - 6
23 - 12
16 - 10
22 - 14
22 - 12
11 - 7
16 - 11
18 - 9
39 - 16
25 - 13
31 - 23
30 - 21
13 - 11
15 - 14
16 - 10
24 - 19
21 - 15
29 - 25
26 - 24
13 - 12
13.0 - 12.7
13.3 - 14.9
15.1 - 11.5
20.2 - 17.4
287 - 214
240 - 144
342 - 203
287 - 229
2 rings
3 rings
3 rings
3 rings
3 rings
3 rings
3 rings
4 rings
4 rings
4 rings
7.94 - 6.62
1.13 - 0.14
1.58 - 1.10
1.87 - 0.24
1.47 - 0.19
0.32 - 0.17
1.54 - 2.15
3.27 - 3.81
0.21 - 0.33
0.68 - 1.02
8.74 - 6.75
0.54 - 0.83
1.56 - 1.79
1.43 - 1.68
0.71 - 0.84
0.17 - 0.16
1.60 - 1.84
3.29 - 3.48
0.24 - 0.25
0.94 - 0.74
nd - 8.45
nd - 0.48
nd - 1.04
nd - 0.66
nd - 0.22
nd - 0.10
nd - 2.16
nd - 5.76
nd - 0.30
nd - 1.02
13.18 - 6.20
0.75 - 0.70
2.51 - 1.88
2.19 - 1.10
1.73 - 0.90
0.24 - 0.09
1.01 - 0.82
2.59 - 2.22
0.21 - 0.21
0.89 - 0.87
29 - 27
13 - 10
53 - 17
46 - 24
184 - 147
53 - 60
381 - 299
322 - 243
187 - 155
592 - 390
27 - 23
8-7
10 - 9
20 - 16
114 - 104
52 - 49
229 - 233
183 - 188
85 - 105
232 - 316
25 - 43
6-8
18 - 21
36 - 37
169 - 164
71 - 95
291 - 377
254 - 340
131 - 204
432 - 531
47 - 53
11 - 19
29 - 51
42 - 64
216 - 233
115 - 110
458 - 464
398 - 403
222 - 229
623 - 609
4 rings
0.28 - 0.67
0.50 - 0.58
nd - 0.59
0.53 - 0.40
525 - 491
444 - 329
581 - 563
800 - 653
4 rings
5 rings
5 rings
5 rings
0.25 - 0.39
0.06 - 0.12
0.04 - 0.06
0.08 - 0.12
0.36 - 0.30
0.09 - 0.08
0.06 - 0.05
0.11 - 0.06
nd - 0.58
nd - 0.20
nd - 0.07
nd - 0.33
0.43 - 0.37
0.10 - 0.08
0.03 - 0.03
0.16 - 0.11
273 - 208
276 - 228
74 - 86
234 - 185
188 - 174
174 - 180
53 - 49
161 - 150
261 - 288
226 - 304
84 - 130
215 - 257
306 - 324
345 - 360
137 - 132
290 - 310
5 rings
0.02 - 0.03
0.03 - 0.03
nd - 0.01
0.05 - 0.03
39 - 30
25 - 24
29 - 43
46 - 47
6 rings
0.15 - 0.17
0.18 - 0.15
nd - 0.81
0.30 - 0.24
255 - 199
177 - 170
240 - 259
292 - 306
Total PAHs
20.9 - 17.3
20.6 - 19.6
nd - 22.8
26.9 - 16.3
3536 - 2781
2183 - 2126
3067 - 3665
4377 - 4366
Turbidity (mg.l-1)
99 - 75
48 - 56
52 - 444
154 - 398
99 - 75
48 - 56
52 - 444
154 - 398
50 + 28
52
101
118
153
138
180
Total PCBs
Naphthalene
Acenaphthylene
Acenaphtene
Fluorene
Phenanthrene
Anthracene
Fluoranthene
Pyrene
Benzo[A]anthracene
Benzo[e]pyrene
Benzo[a]pyrene
Perylene
Indenopyrene
128, 200, 180, 170, 195, 206 and 209.
.
Publications
Table 4: PCB and PAH concentrations in E. affinis versus the developmental stage repartition of the population
of this copepod species in surface and bottom water during one tidal cycle (nd: non detected).
Eurytemora affinis (ng.g-1)
Time
10 : 15
12 : 15
14 : 15
18 : 05
Sampling position
S-B
S-B
S-B
S-B
5 - 29
67 - 148
58 - 253
19 - 78
64 - 203
60 - 154
16 - 53
nd - 30
nd - 130
nd - 220
nd - 97
nd - 189
nd - 166
nd - 54
38 - 34
159 - 125
230 - 186
72 - 56
171 - 145
137 - 117
37 - 33
26 - 24
129 - 204
201 - 228
65 - 54
177 - 188
140 - 161
44 - 54
353 - 1077
nd - 1115
1057 - 890
965 - 1101
4 rings
5 - 14
11 - 26
6 - 14
9 - 19
2-9
5 - 28
nd - 71
nd - 41
nd - 58
nd - 53
nd - 13
nd - 29
17 - 11
2-1
10 - 8
19 - 14
5-4
15 - 13
5 - 85
2 - 74
9 - 60
13 - 82
6 - 43
13 - 76
4 rings
7 - 38
nd - 44
18 - 18
35 - 192
4 rings
nd - 5
nd - 51
nd - 5
nd - 19
12 - 10
6-5
3-1
7-6
17 - 89
12 - 72
4 - 23
14 - 78
50 + 28
52
101
118
153
138
180
4 cl
4 cl
5 cl
5 cl
6 cl
6 cl
7 cl
Total PCBs
Phenanthrene
Anthracene
Fluoranthene
Pyrene
Benzo[A]anthracene
Benzo[e]pyrene
Benzo[a]pyrene
Perylene
Indenopyrene
3 rings
3 rings
3 rings
4 rings
4 rings
5 rings
5 - 19
3 - 14
1-3
3 - 13
5 rings
1-5
nd - 4
2-3
3 - 22
6 rings
4 - 17
nd - 20
9-8
15 - 80
Total PAHs
61 - 219
nd - 412
126 - 105
148 - 975
Naupliar stage (%)
Copepodite stage (%)
Adult stage (%)
96 - 14
2 - 38
2 - 48
100 - 68
0 - 19
0 - 13
50 - 33
49 - 50
1 - 17
85 - 86
14 - 13
1-1
5 rings
5 rings
128, 200, 180, 170, 195, 206 and 209.
Publications
Publications
Publication n° 4 :
Effects of salinity and temperature on the expression of enzymatic biomarkers in
Eurytemora affinis (Calanoida, Copepoda).
K. Cailleaud 1, 2, 3, G. Maillet3, H. Budzinski1, S. Souissi2, J. Forget-Leray3*
1. Laboratoire de Physico-ToxicoChimie des systèmes naturels (UMR 5472 CNRS), Université Bordeaux 1, 341
2. Ecosystèmes Littoraux et Côtiers (UMR 8013 CNRS), Université des Sciences et Technologies de Lille, 32
av. Foch, 62930 Wimereux, France.
3. Laboratoire d’Ecotoxicologie-Milieux Aquatiques (UPRES EA3222), GDR IMOPHYS, Faculté des Sciences
et Techniques du Havre, 25 rue Philippe Lebon, 76058 Le Havre, France.
E-mail address: [email protected] (J. Forget-Leray)
Comparative Biochemistry and Physiology, part A 147 (2007) 841-849
Publications
Comparative Biochemistry and Physiology, Part A 147 (2007) 841 – 849
www.elsevier.com/locate/cbpa
Effects of salinity and temperature on the expression of enzymatic
biomarkers in Eurytemora affinis (Calanoida, Copepoda)
K. Cailleaud a,b,c , G. Maillet c , H. Budzinski a , S. Souissi b , J. Forget-Leray c,⁎
a
b
Université Bordeaux 1, CNRS, LPTC-UMR 5472 (Laboratory of Physico- and Toxico-Chemistry), 351 crs de la Libération, 33405 Talence, France
Ecosystèmes Littoraux et Côtiers (UMR 8013 CNRS), Université des Sciences et Technologies de Lille, 28 avenue Foch, 62930 Wimereux, France
c
Laboratoire d'Ecotoxicologie-Milieux Aquatiques (UPRES EA3222), GDR IMOPHYS, Faculté des Sciences et Techniques du Havre,
25 rue Philippe Lebon, 76058 Le Havre, France
Received 21 July 2006; received in revised form 24 September 2006; accepted 26 September 2006
Available online 30 September 2006
Abstract
In order to establish effective enzymatic biomarkers that could provide in situ early warning of contaminant exposure in estuarine ecosystems,
the potential effects of the principal abiotic factors (temperature and salinity) were investigated on common biomarkers, the acetylcholinesterase
(AChE) and the glutathione S-transferase (GST) in Eurytemora affinis. Short term salinity stress effects simulated during an experimental tide
indicated that enzymatic activities of this species are characterized by maximum expression related to an optimal salinity range (between 5 and
15 psu). Moreover, longer time exposure to various salinity tanks confirmed the effects of this factor on both AChE and GST activities. Therefore,
optimal AChE activity was measured at 10 psu, while optimal GST activity was measured at 5 psu. Furthermore, significant effects of temperature
were also recorded, particularly for AChE expression (slight effects were measured on GST expression) with an optimal condition at 11 °C. These
experiments indicated a more pronounced effect of salinity over temperature especially on the AChE expression and confirmed the need to
standardize sampling procedures in relation with environmental parameters for biomonitoring studies based on enzymatic analyses.
© 2006 Elsevier Inc. All rights reserved.
Keywords: AChE; GST; Physicochemical parameters; Estuary; Invertebrate
1. Introduction
In order to assess the water quality of various aquatic
ecosystems and to estimate the stress encountered by the
different populations that inhabitate these environments, the
concentrations of a number of organic contaminants (PAHs,
PCBs…) as well as trace metals (Hg, Cd, Pb, Cu, Zn) have been
regularly monitored in many contaminated locations in the
world. Nevertheless, chemical analyses alone are not sufficient
to describe the effects of pollutants at contaminated areas.
During the past years, many studies focusing on the biological
effects of these contaminants have been conducted on several
aquatic species, especially on fish and mollusks. Indeed, several
contaminant effect indicators have been developed (Van der
⁎ Corresponding author. Tel.: +33 2 32744379; fax: +33 2 32744314.
E-mail address: [email protected] (J. Forget-Leray).
1095-6433/$ - see front matter © 2006 Elsevier Inc. All rights reserved.
doi:10.1016/j.cbpa.2006.09.012
Oost et al., 2003). Thus, a number of promising and sensitive
early warning signals, or biomarkers, that reflect adverse
biological responses consecutive to anthropogenic contaminants
and environmental toxin exposure and stress, have been
identified (McCarthy and Shugart, 1990). Therefore, a wide
range of biomarkers and particularly enzymatic activities, that
provide information on uptake, biotransformation and detoxification patterns (Livingstone, 1993; Snyder, 2000), has been
developed, tested and proposed for application in monitoring
and assessing deleterious effects of chemical stress on organisms
(Handy et al., 2003; Lam and Gray, 2003). Besides, the use of a
battery of biomarkers in combination with chemical analyses is
recommended (Cajaraville et al., 2000).
Among the most reliable biomarkers, the acetylcholinesterase enzymatic activity (AChE) is one of the most frequently
used in Ecotoxicology. AChE is responsible for the breakdown
of acetylcholine in cholinergic synapses, preventing continuous
nerve firings, which is vital for normal cellular neurotransmitter
842
K. Cailleaud et al. / Comparative Biochemistry and Physiology, Part A 147 (2007) 841–849
functioning (Payne et al., 1996). As an indicator of exposure to
contaminants, the inhibition of this biomarker is commonly
used to detect environmental pollution caused by neurotoxic
compounds and is particularly specific of organophosphate and
carbamate contaminations (Galgani and Bocquené, 1990;
Forget et al., 2003). These compounds, that bind in reversible
or irreversible manner to the catalytic site of the enzyme, cause
the free unbound acetylcholine to accumulate at cholinergic
receptor sites and thus result in the overstimulation of
muscarinic and nicotinic cholinergic receptors in the central
and peripheral nervous system. In addition to anticholinesterase
insecticides, other contaminants such as PAHs (Kang and Fang,
1997), surfactants (Guilhermino et al., 2000), and pharmaceuticals (Nunes et al., 2006) have been shown to cause AChE
inhibition.
Other enzymatic biomarkers related to the detoxification
potential of the studied organisms are also of great interest.
Among these enzymatic activities, GSTs are a group of widely
distributed enzymes that catalyze the conjugation of reduced
glutathione (GSH) with compounds having reactive electrophilic groups (especially xenobiotics), generating less toxic and
more hydrophilic molecules (Olsen et al., 2001). This metabolic
pathway allows the protection of nucleophilic groups in
macromolecules such as proteins and nucleic acids. GSTs
were determined as effect biomarkers induced by different
natural and synthetic compounds such as organochlorine
pesticides, PAHs and PCBs (Lee et al., 1988; Fitzpatrick et al.,
1997; Hoareau et al., 2001).
Although these biomarkers reflect adverse biological
responses to anthropogenic contamination, they could also be
related to natural environmental temporal and spatial variations.
Thus, several studies have investigated the seasonal variations
on some biochemical biomarkers, linking them to seasonal
abiotic parameter variations such as temperature, salinity,
turbidity and food availability (Sheehan and Power, 1999; Lau
et al., 2004; Leiniö and Lehtonen, 2005). Estuaries in particular
present marked physicochemical small scale changes (mainly
salinity, turbidity and current flow) associated with tidal cycles
(Chapman and Wang, 2001) and large scale seasonal variations
(essentially temperature and food bioavailability). Therefore,
ecotoxicological in situ studies in estuaries constitute a challenge
to integrate and distinguish biomarker responses to natural
abiotic factor variations from contaminant-induced effects. To
manage pollution monitoring in such ecosystems, the principal
issues are to select an appropriate sentinel species and suitable
biomarkers.
E. affinis is a common estuarine copepod species, widely
distributed in world estuaries, particularly in the Seine River
Estuary where it represents between 90 and 100% of the
zooplankton biomass (Mouny and Dauvin, 2002). This
euryhaline and eurythermal species is distributed all over the
estuary, with a well known biology characterized by a short life
cycle (Katona, 1970); it is abundant all year round and is easily
sampled; this copepod is omnivorous, playing a key role in the
estuarine food web, and could therefore ensure transfers and
bioaccumulation of contaminants from dissolved water and
organic material to upper organisms in the food chain. Besides,
this species could be easily kept in laboratory. For these reasons
E. affinis is an ideal candidate for ecotoxicological studies.
The principal objectives of this work were to investigate
experimentally the potential effects of the main physicochemical
variations (salinity and temperature) that occurred in naturally
fluctuating ecosystems such as estuaries, which could induce
variable responses on biochemical biomarkers and bias
pollution-caused alterations of these biological indicators. This
study is the first step in the development of an in situ estuarine
bioassay using E. affinis as sentinel species. Indeed, it could
allow to minimize biomarker response variability in field studies
related to physicochemical variations by normalizing sampling
procedures focusing on salinity and temperature.
2. Materials and methods
Several sampling were conducted in spring 2005. The
copepods E. affinis were collected using subsurface tows of
WP2 plankton net (200 μm mesh size) at ebb tide, in Tancarville
Station in the oligohaline part of the Seine Estuary (Fig. 1).
Immediately after sampling, copepods were sorted using 500 μm
sieves in order to eliminate predators (especially Mysidacea and
Gammaridae), then transferred into containers using filtered
estuarine water and brought back to the laboratory for further
precise sorting. Then, the copepods were sorted quickly (b 3 h)
using several times the sequence: Dilution–Decantation–Photo
attraction. To dilute the natural samples, mineral clean water
(adjusted to the sampling site salinity) was used. The objectives
were to separate the copepods attracted by the light on the water
surface, from the underlying particles in order to make sure of
the composition of the matrix for the following experiments.
2.2. Experimentation
After sorting by photo-attraction, copepods were kept in the
laboratory for an acclimatization period of one day in glass
beakers, with a mixture of 300 ml of filtered estuarine water and
1500 ml of mineral water adjusted to the salinity of the sampling
site at controlled temperature (11 °C) in a climatic chamber
(LMS Cooled Incubator, Bioblock Scientific, Illkirch, France).
The copepods were fed one time during the acclimatization
period with Isochrysis galbana, and then kept starving during
the experiments in order to limit feeding movements which
could enhance the AChE activity.
2.2.1. Experimental tide
The Seine Estuary is characterized by two tidal cycles a day.
Each one lasts approximately 12 h and is composed of an ebb
tide during which freshwater influence increases with a salinity
scale ranging from 25 psu to 0 psu, and a flow tide dominated by
marine influence with a salinity reaching back 25 psu. Salinity
variations during the tide depend on the location in the estuary
and are maximum in the euryhaline part of the estuary. In the
laboratory, such small scale salinity variations were preliminarily tested during one simulated flow tide. Therefore, different
843
Fig. 1. Map of the sampling location.
2-l tanks filled with 300 ml of filtered estuarine water and
1500 ml of mineral water were adjusted at the following selected
salinities, 0, 5, 10, 15, 20 and 25 psu with Sera PREMIUM salt
(Heinsberg, France) and kept at a controlled temperature of
11 °C. Then, the copepods which were acclimatized during one
day to the laboratory conditions were transferred into the first
beaker containing water at 0 psu and kept 1 h in this tank. After
that, the copepods were filtered and transferred to the second
beaker at 5 psu and kept in this tank during one hour and so on
until the last beaker with a water salinity of 25 psu. Pools of
approximately 200 mg (wet weight) of copepods were sampled
after 1 h in each tank at the different salinities for AChE and GST
activity analyses (two replicate samples for each sampling time
and each exposure condition).
2.2.2. Effects of salinity
The E. affinis population is not homogeneously distributed in
the Seine Estuary. Therefore, all copepods are not submitted to
the same salinity range according to their location in the different
zones of the estuary (oligohaline, mesohaline and euryhaline).
Thus, copepods distributed in zones under maximal marine or
freshwater influences (oligohaline and euryhaline zones) are
submitted to slighter salinity variations than copepods from the
mesohaline zone. Besides, these copepods are submitted to a
short scale salinity variation but during a longer time. In order to
test the effects of salinity on AChE and GST enzymatic
activities, different water tanks filled with 300 ml of filtered
estuarine water and 1500 ml of mineral water were adjusted at
the following selected salinities, 0, 5, 10, 15, 20 and 25 psu and
kept at 11 °C in a climatic chamber. After the acclimatization
period of one day in the laboratory, the initial pool of copepods
was divided into 6 homogeneous groups and each group was
transferred to one of the tanks previously prepared, containing
the different salinity waters. At the beginning of the experiment
and after 1, 2, 4, 18 and 72 h, pools of approximately 200 mg of
copepods were sampled in each tank at the different salinities for
AChE and GST activity analyses (two replicate samples for each
sampling time and each exposure condition for the AChE
activity).
2.2.3. Effects of temperature
The copepod E. affinis is present in the Seine Estuary during
all the year. Therefore, the successive copepod populations are
submitted to variable temperatures depending on the season
(from 4 °C in winter to 25 °C in summer periods). To study the
effects of temperature on AChE and GST enzymatic activities,
different water tanks filled with 300 ml of filtered estuarine
water and 1500 ml of mineral water were adjusted at 15 psu and
kept at the following selected temperatures representative of the
annual temperature range in the Seine Estuary: 4, 11, 18 and
25 °C in 4 climatic chambers. After the acclimatization period
of one day in the laboratory, the initial pool of copepods was
divided into 4 homogeneous groups and each group was
transferred to one of the tanks previously prepared, kept at the
different temperatures. At the beginning of the experiment and
after 1, 2, 4, 18 h, pools of approximately 200 mg of copepods
were sampled in each tank at the different temperatures for
AChE and GST activity analyses (two replicate samples for
each sampling time and each exposure condition). In comparison to salinity experiments, there were not sufficient amounts
of copepods after 72 h to measure both AChE and GST activities for all the exposure conditions.
2.3. Biomarker assays
A pool of approximately 200 mg of whole-body E. affinis
was used to determine both AChE and GST activities. A pool of
copepods was homogenized on ice, in ice-cold 0.02 M pH 7
phosphate buffer+/0.1% Triton X100 (1/4, volume/weight)
using an Ultra-Turax homogenizer. The homogenates were then
centrifuged two successive times at 10,000 ×g for 5 min at 4 °C,
with an intermediate shaking. Measurements of AChE activity
were performed using the colorimetric method of Ellman et al.
(1961), modified by Bocquené and Galgani (1998) at 412 nm,
with acetylthiocholine iodide (AcSCh) as substrate and dithiobis-nitrobenzoate as reagent at a controlled temperature of
20 °C. GST activity was evaluated as the conjugation between
glutathione and 1-chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB) at 340 nm
(Habig et al., 1974). The extinction coefficients used to
844
determine GST and AChE specific activities were respectively
9.6 × 10− 3 M− 1cm− 1 at 340 nm and 12,600 M− 1cm− 1 at
412 nm. AChE and GST activities are expressed respectively as
μmol min−1 mg−1 protein and as mol min− 1 mg− 1 protein.
Proteins for standardisation of the above biomarkers were
determined using Bradford's (1976) method modified for use
with a micro-plate reader (Bocquené and Galgani, 1998). All
assays were performed in quadruplicate. All chemicals were
purchased from Sigma-Aldrich (St Quentin Fallavier, France).
All biomarker results are expressed as mean ± standard error
of the mean (SEM). One-way analysis of variance (ANOVA)
was used, after testing the variable normality (Kolmogorov–
Smirnoff test) and the variance homogeneity (Levene test), to
compare both AChE and GST activities between the different
exposure conditions, with salinity, time and temperature as
factors. These analyses were followed by Tukey's multiple
comparison tests to discriminate significantly different treatments. The significance p-level used was set to 0.05. When
normal distribution and homogeneity of the variances were not
verified (for experimental tide, and effect of temperature), non
parametric Kruskal–Wallis ANOVA by ranks was performed
both on AChE and GST data followed by the non parametric
Mann–Whitney U test to identify significant differences
between groups ( p b 0.05). All data were statistically analyzed
by the STATISTICA Software v6.0 (Statsoft. Inc., 2002).
3. Results
3.1. Experimental tide
Data obtained during the experimental tide related to AChE
and GST activities are reported in Table 1. Average AChE and
GST activities range respectively from 765 to 1023 μmol min− 1
mg− 1 protein and from 622 ± 82 to 842 ± 42 mol min− 1 mg− 1
protein. Besides, the Kruskal–Wallis test indicates a significant
effect of salinity variations during the experimental tide both on
AChE and GST activities (respectively, H = 59.76, p b 0.00001,
df = 6; and H = 22.97, p b 0.0008, df = 6). Therefore, during the
experimental tide, AChE levels increase from 0 psu to 10 psu
exposures then decrease for all the following salinity exposures
until 25 psu. Thus, the highest AChE level is measured for
10 psu salinity while the lowest one is measured for 25 psu.
Moreover, AChE level for 10 psu is significantly higher than
AChE levels for all other salinities ( p b 0.05), while AChE
levels for 20 and 25 psu salinity are significantly lower than all
other AChE levels ( p b 0.005).
In the same way, during the experimental tide, GST levels
increase from 0 to 5 psu exposures and then decrease for all the
following salinity exposures until 25 psu. Moreover, the highest
GST level is measured for a salinity exposure of 5 psu and is
significantly higher than GST levels for all other salinity
exposures ( p b 0.05) except for 0 and 10 psu. Furthermore, the
significantly lowest GST levels are measured for salinity
exposures of 20 and 25 psu ( p b 0.05).
3.1.1. Effects of salinity
AChE activity variations in E. affinis after exposure to
different salinities are presented in Fig. 2. Average AChE
activities range respectively from 583 to 728, 546 to 962, 528 to
1156, 565 to 849, 583 to 813 and 444 to 738 μmol min− 1 mg− 1
protein for 0 to 25 psu. Besides, significant effects of salinity
over the time of exposure on AChE activity are recorded
(ANOVA; p b 0.00025, F = 4.92, degree of freedom: 5). High
AChE activities are measured during all the experiments in
copepods exposed to 10 psu water, particularly after 18 and 72 h
of exposure when increases are significant ( p b 0.00005).
Therefore, after 72 h of exposure, AChE level is enhanced by
98% in copepods exposed to 10 psu water. Besides, AChE
activity increases significantly in copepods exposed to 15 and
20 psu between 4 and 18 h of exposure ( p b 0.00005) after
which the activity remains constant at 20 psu or decreases
significantly at 15 psu ( p b 0.00005). AChE activities measured
in copepods kept at 5 and 25 psu show a higher variability and
no significant increase during the experiments. Finally,
copepods exposed to 0 psu present slightly increasing AChE
levels between 1 and 2 h of exposure in comparison to the other
experiments, then decreasing levels until 18 h; no copepod has
survived at the end of the experiments after 72 h.
Moreover, after one hour of exposure, the highest AChE
levels are measured for copepods exposed to 5 psu water. Then,
after 2 and 4 h of exposure, slight differences are measured in
AChE levels between the different experimental exposures.
After 18 and 72 h of exposure, the highest AChE levels are
measured for copepods exposed to 10 psu water ( p b 0.00005),
and these AChE levels are the highest ones measured during all
the experiments.
GST activity variations in E. affinis after exposure to different
salinities are presented in Fig. 3. Average GST activities range
respectively from 700 to 125, 1138 to 60, 700 to 108, 700 to 122,
700 to 175 and 700 to 132 mol min− 1 mg− 1 protein for 0 to
25 psu. Besides, significant effects of salinity over the time of
exposure on GST activity are recorded (ANOVA; p b 0.0003,
F = 5.13, degree of freedom: 5). Therefore, a linear significant
Table 1
Variations of AChE and GST activities (means values ± SEM) in E. affinis during
the experimental tide
Exposure
time
T0 In situ
1H
2H
3H
4H
5H
6H
Treatment salinity
(PSU)
2.5
0
5
10
15
20
25
Enzymatic activities
AChE
GST
μmol min− 1 mg− 1
protein
mol min− 1 mg− 1
protein
818 ± 64b, c, d, e
894 ± 73a, d, f, g
945 ± 52a, d, f, g
1023 ± 79a, b, c, e, f,
906 ± 44a, d, f, g
810 ± 54b, c, d, e
765 ± 57b, c, d, e
622 ± 8c, d
718 ± 121
842 ± 42a, e,
822 ± 58a, e,
725 ± 45c, d
685 ± 66c, d
690 ± 123c
g
f, g
f
Means (n = 8: i.e. 2 experimental replicates and 4 enzymatic measures/pooled
samples) and standard deviations are mentioned. Significant differences between
salinities (p b 0.05) are indicated using letters (a, b, c, d, e, f and g which refer
respectively to 2.5, 0, 5, 10, 15, 20 and 25 psu).
845
Fig. 2. AChE activity variations in the copepod E. affinis after exposure to different salinities (from 0 to 25 psu). Means (n = 8: i.e. 2 experimental replicates and 4
enzymatic measures/pooled samples) and standard deviations are mentioned. Significant differences between sampling times ( p b 0.05) are indicated using letters (a, b,
c, d, e and f which refer respectively to 0, 1, 2, 4, 18 and 72 h of exposure).
GST decrease is recorded during all the experiment in copepods
exposed to 15 psu ( p b 0.05). After 72 h of exposure to 15 psu
water, GST level decreases to reach 17% of the GST level of the
beginning of the experiment. In the same way, non linear
decreasing GST levels are measured at 20 psu. Besides,
copepods exposed to 0, 10 and 25 psu waters present the same
GST variation pattern: significant decreases during the first hour
of the experiments ( p b 0.0005), then non significant GST
variation until the 18th hour of experiment and finally significant
decreases until the 72nd hour of the experiment ( p b 0.05).
Fig. 3. GST activity variations in the copepod E. affinis after exposure to different salinities (from 0 to 25 psu). Means (n = 4 i.e. 4 enzymatic measures) and standard
deviations are mentioned. Significant differences between sampling times ( p b 0.05) are indicated using letters (a, b, c, d, e and f which refer respectively to 0, 1, 2, 4,
18 and 72 h of exposure).
846
Fig. 4. Effects of temperature on AChE activity expression during 18h of experimental exposure. Means (n = 8: i.e. 2 experimental replicates and 4 enzymatic
measures/pooled samples) and standard deviations are mentioned. Significant differences between sampling times (p b 0.05) are indicated using letters (a, b, c, d and e
which refer respectively to 0, 1, 2, 4 and 18 h of exposure).
Moreover, GST activities measured in copepods kept at 5 psu
show a higher variability compared to that of copepods exposed
to other salinities. Indeed, a significant increasing GST level
( p b 0.0005) followed by a significant decrease ( p b 0.0005) are
measured at the beginning of the experiment. Then no significant
variation is recorded between 2 and 18 h of exposure and finally
the GST activity significantly decreases again ( p b 0.0005).
3.1.2. Effects of temperature
Average AChE activity of E. affinis exposed to an 11 °C
water temperature increases during all the experiment from 716
to 875 μmol min− 1 mg− 1 protein (Fig. 4). The total increase of
AChE activity between the beginning and the end of the
experiment represents 22%. Furthermore, after two hours of
exposure and until the end of the experiment AChE levels in
copepods exposed to this temperature condition are significantly
higher than AChE level at the beginning of the experiments
( p b 0.05). In addition, after 1, 4 and 18 h of experiment, AChE
levels in copepods exposed to an 11 °C water temperature are
significantly higher than AChE levels measured in copepods
exposed to the other water temperature conditions at the same
time of the experiment. For all other temperature conditions,
AChE levels are more variable. Moreover, for 4, 18 and 25 °C
conditions, AChE levels at the beginning and at the end of the
experiment are not statistically significant. In relation to a high
mortality after 4 h of exposure, there was no sufficient quantity
of copepods to measure both AChE and GST activities at the end
of the experiment, after 18 h of exposure to an 18 °C water
temperature. The lowest AChE activities are measured in
copepods exposed to the highest water temperature (25 °C)
Fig. 5. Effects of temperature on GST activity expression during 18 h of experimental exposure. Means (n = 8: i.e. 2 experimental replicates and 4 enzymatic measures/
pooled samples) and standard deviations are mentioned. Significant differences between sampling times ( p b 0.05) are indicated using letters (a, b, c, d and e which
refer respectively to 0, 1, 2, 4 and 18 h of exposure).
during all the experiment. Besides, the higher the water
temperature is, the lower the AChE level is. Furthermore,
Kruskal–Wallis tests indicate significant influence of both
temperature (H = 67.6, p b 0.00001, df = 3) and time (H = 26.13,
p b 0.00001, df = 4) factors on AChE activity variations.
No significant GST activity variations are recorded after
exposure at 4, 18 and 25 °C between the beginning and the end of
the experiment (Fig. 5). Besides, GST activity is quite constant
all over the experiment at 18 and 25 °C, while this enzymatic
activity is more variable at 4 °C with significant increase during
the first hours of the experiment (p b 0.0005) and then significant
decrease at the end of the experiment to reach back the initial
level. In opposition, slight (17%) but significant increasing
levels (p b 0.0) are recorded after exposure at 11 °C between the
beginning and the end of the experiment. Furthermore, Kruskal–
Wallis tests confirm significant effects of the temperature factor
(H = 26.1, p b 0.00001, df = 3) at each sampling time. Significant
effects of the time of exposure factor (H = 15.19, p b 0.0043,
df = 4) are also measured at 4 and 11 °C temperature conditions.
4. Discussion
In order to use biochemical biomarkers for assessing pollution effects in variable ecosystems like estuaries, the natural
variability of these biomarkers has to be studied. However, few
experimental or in situ studies have reported the effects of
temperature and salinity factors on enzymatic biomarker activities. Besides, reported data concern mainly vertebrate and
especially marine fish species while effects on estuarine
invertebrates have been poorly investigated. Nevertheless,
effects of both temperature and salinity have been reported for
different species including blue mussels (Galgani and Bocquené,
2000; Pfeifer et al., 2005), Nereis diversicolor (Scaps and Borot,
2000) and brown shrimps (Menezes et al., 2006). The data
obtained in this study indicate an increase of AChE levels under
controlled conditions (Fig. 2) which suggests the presence of
and/or multiple inhibiting factors in the field (contaminants as
well as natural parameters like temperature or salinity). Besides,
decreasing GST levels are recorded (Fig. 3) during the experiment in the laboratory which implies the occurrence of inducing
factors in the field which could be the same as those responsible
for the inhibition of the AChE activity in the case of an environmental contamination. Similar results have been reported in the
shrimp Crangon crangon after maintaining the field collected
animals in the laboratory (Menezes et al., 2006). Furthermore,
the results of the effects of an experimental tide on both AChE
and GST activity expression indicate significant variations even
at small time scale. Besides, these results indicate an optimal
physiological salinity range for E. affinis between 5 and 10 psu
related to the enzyme, beyond which the enzymatic activity
expression decreased. Moreover, these results show that this
species is better adapted to low salinity zones as the highest
biomarker levels are measured for the lowest salinity and because
the highest salinity induces the maximal inhibition. To our
knowledge, no work has studied up to now the effects of tidally
related salinity variations on AChE and GST activities. Therefore,
no comparison can be made with other estuarine species.
847
The copepod E. affinis shows strong osmoregulation abilities
to maintain the population distribution in all the Seine Estuary
(Roddie et al., 1984; Kimmel and Bradley, 2001). However,
deviation from the optimal salinity range previously described can
be stressful and the cost of osmotic regulation, at the molecular
level, could directly affect biological molecules such as enzymes
like AChE and GST activities. These observations make sense
especially in longer time exposure as shown in Figs. 2 and 3.
Thus, significant effects of salinity are recorded after the
experiment. Therefore, increasing AChE levels are observed
during the experiments and the most pronounced ones are
measured for the exposition to 10 psu water salinity. These results
confirm an optimal salinity around 10 psu as previously
mentioned since the maximum increase in AChE activity is
measured in copepods exposed to 10 psu water. Moreover,
differences observed with the other exposition conditions could
be explained by a decrease in energetic cost allocated to AChE
activity and increasing energy devoted to osmotic regulation.
Moreover, Gyllenberg and Lundqvist (1979) and Gaudy et al.
(2000) specified that increasing respiration rates have been
observed respectively in Eurytemora hirundoides and in Acartia
tonsa and Acartia clausi when salinity conditions diverge from
the optimal salinity zone of these species and that this increase of
respiration is related to the need of supplementary energy for
osmoregulation. Furthermore, Scaps and Borot (2000) have
reported similar effects of salinity on Nereis diversicolor with
however, adaptation for higher salinity zone.
In addition, decreasing GST levels (Fig. 3) are measured
during the experiment which could result from the combination
of the transfer into non contaminated water with the effect of
salinity stress. The most linear decrease is reported for 15 psu
water exposition. Besides, for salinity different from the optimal
one, more variable GST activities are measured (decreasing
levels alternate with increasing levels). These results suggest that
salinity stress could interfere with oxidative stress responses in
E. affinis. However, as no similar study is available, no comparison could be made with other estuarine species. Nevertheless, we could hypothesize that salinity stress could modify antioxidative biomarker activities with however slighter effect than
for AChE activity.
To date, the effects of temperature on biochemical
biomarkers have been essentially studied in vertebrate species
and especially fish (Hazel, 1969; Hogan, 1970). However, some
recent works have been performed with invertebrate species
(Scaps and Borot, 2000; Pfeifer et al., 2005; Menezes et al.,
2006). Thus, it is well established that the increase of water
temperature induces significantly the expression of the AChE
activity. Furthermore, temperature can directly affect the
activity of enzymes by changing their physical structure and
thereby changing their catalytic efficiency or binding capacity
(Hochachka and Somero, 1984). Our experiments show that the
maximum AChE levels are obtained at the 11 °C water condition (Fig. 4). Besides, significant increases of AChE activity
at this temperature are recorded during the experiment. For the
other water temperature conditions, rapid heat-shock responses
resulting in a decrease of AChE levels, are observed after one
hour of exposure. Then, AChE activity increases again for all
848
temperature conditions. According to these results, the hypothesis of a short adaptation time to water temperature transitions
could be made. Furthermore, Gyllenberg and Lundqvist
(1979), Pagano and Gaudy (1986), and Gaudy et al. (2000)
have mentioned, in different estuarine copepod species, metabolisms reduced to a minimum to maintain the physiological
activity at low temperatures and to save energy at high temperatures. These observations are consistent with the results
obtained in this study.
Concerning GST activity, slighter significant effects of
temperature are observed compared to those on the AChE activity. The highest differences are measured for the first two hours
of the experiment for the exposure condition of 4 °C. Similar
higher anti-oxidative activities are detected in in situ studies on
Perna viridis (Lau et al., 2004). The authors hypothesized that
these increases could be due to concentrating effects related to the
general decrease in protein level during cold seasons or to stress
induced by a chemical contamination of the sampling site. In the
same way, GST activity variations related to seasonal variations in
temperature have been reported in the blue mussel (Power and
Sheehan, 1996). In opposition, Lushchak and Bagnyukova (2006)
have reported no effect of temperature increase in the GST activity
of goldfish. However, as no similar experimental study has been
previously performed, no comparison could be made.
To conclude, the results of this study constitute the first step
before using biochemical markers such as AChE and GST
activities to assess contaminant exposure of the copepod E. affinis
in estuarine ecosystems. Indeed, attention should be paid to the
effects of abiotic environmental parameters and particularly
salinity and temperature variations for in situ biomonitoring
programs based on enzymatic activity studies. Moreover, a
minimum reduction or activation of 30% of respectively AChE
and GST activities are advisable to conclude on contaminant
exposure. Furthermore, E. affnis is a fundamental species in the
estuarine food web and presents a wide world distribution.
Besides, enzymatic activities of this species are sensitive to
chemical exposition and changes in water temperature do not
appear to be an important source of enzymatic activity alteration
(especially for GST activity). In opposition, salinity variations
significantly modulate these enzyme activities, which require for
biomonitoring projects to repeat sampling in the same salinity
conditions during all the study in order to avoid fluctuations of
enzymatic activities related to environmental parameters. According to these observations, E. affinis represents a promising
sentinel species in estuarine ecosystems.
Acknowledgements
This work was financially supported by the multidisciplinary
Seine Aval scientific program by the Regi on Haute-Normandie
and by the PNETOX scientific program.
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Publications
Publications
Publication n° 5 :
Uptake and elimination of hydrophobic organic contaminants in estuarine copepods: an
experimental study.
K. Cailleaud 1, 2, 3, H. Budzinski1, K. Le Menach1, S. Souissi2, J. Forget-Leray3*
Abstract:
Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) are considered to be rapidly biotransformed by organisms
whereas polychlorinated biphenyls (PCBs) are strongly bioaccumulated. In the present study, the estuarine
copepod Eurytemora affinis was exposed in a continuous flow through system to dissolved PAH (500 ng.L-1)
and PCB (300 ng.L-1) mixtures for 86 hours whereas control groups were placed in a continuous flow through
system with clean water. Both PCB and PAH body residues were measured and compared in exposed and in
non-exposed copepods to assess the uptake and the elimination of these two contaminant classes in this copepod
species. After the exposure, exposed copepods exhibit concentration factors (CFs), based on dry weight basis, of
25 750 and 1200 respectively for total PCBs and PAHs. The higher decreasing levels of background PAHs
compared to the low variations of PCB levels in the samples from the non-exposed copepods suggest a higher
rate of metabolism of PAHs compared with PCBs and could explain the differences observed in the
accumulation. Furthermore, uptake as well as elimination of both PCBs and PAHs are compound selective in E.
affinis. Therefore, higher molecular weight PCBs and PAHs are preferentially accumulated whilst lower
molecular weight compounds are preferentially eliminated. These results suggest the importance of copepods in
the biogeochemical cycles of hydrophobic organic contaminants (HOCs) in estuarine ecosystems.
Keywords: PAH, PCB, exposure, Eurytemora affinis, biotransformation, accumulation
Soumise à Environmental Toxicology and Chemistry
Publications
1.
Introduction
Most estuarine water columns located near urban and industrialized areas are highly contaminated
especially by HOCs which are mainly associated to the suspended particulate matter but also dissolved in the
water [1; 2]. The presence of HOCs in aquatic environments has been associated with adverse impacts on
organisms and communities [3; 4]. Two classes are of particular concern, PCBs and PAHs which have been
detected at high levels in many North-Atlantic estuaries [1; 5] and have been included in the priority pollutant
lists of the US-EPA and UN-ECE POP Protocol [6].
These semi volatile molecules are highly lipophilic chemicals, ubiquitous in coastal and estuarine
waters [1; 2; 5]. Furthermore, these contaminants can penetrate the lipophilic membranes of organisms,
accumulate in tissues [7; 8], and can also be directly toxic to aquatic organisms. Thus, owning to the endocrine
disrupting properties of PCBs [3] and to the carcinogenic and mutagenic effects of PAHs on organisms [9; 10],
these contaminants represent a threat to aquatic ecosystems both at individual and population levels.
The acute toxicity of PAHs and PCBs has been reported for several crustacean species especially for
copepods [11]. However, although their lower aquatic trophic levels copepods play a key role in biogeochemical
exchanges between sediments and the water column and therefore represent important entrances for HOCs from
water into the local food web [8; 12], the uptake of these compounds in zooplankton species and particularly in
copepods is poorly documented. Additionally, very little information exists on the metabolism of both PCBs and
PAHs in copepods. Moreover, the risk induced by chronic exposure to these contaminants on zooplanktonic
populations is not well characterized.
The major route of transfer of contaminants from the field to the biota is not easily identified especially
in estuarine ecosystems. Thus, these ecosystems are characterized by daily mixing of fresh and saline waters
which increases turbulence and sediment resuspension. These particular hydrodynamic conditions affect the
bioavailability of HOCs by inducing reversible processes of exchange between the SPM and the surrounding
water [13; 14]. Even if sediments constitute long-term reservoirs for HOCs and a source of exposure especially
to benthic organisms, the dissolved phase also represents a non negligible way of exposure to HOCs for
organisms living in estuarine ecosystems [15].
Experimental exposures provide useful tools to examine the potential of organisms to accumulate waterassociated contaminants. Moreover, the use of continuous flow through system exposure is more representative
of environmental stress. Nevertheless, there are inherent challenges in the study of flow through system exposure
using copepods due to the difficulty of working with such tiny organisms in water circulating systems.
The objectives of this investigation were to develop a method to study in a continuous flow through
system, the real transfers of HOCs, under environmental realistic exposure conditions, from the dissolved phase
to E. affinis. Thus, in spite of the particularly high contamination of the Seine Estuary [1], E. affinis dominates
the mesozooplankton communities of this estuary and presents particularly high density in this estuary in
comparison to other North-Atlantic estuaries. In this paper, representative PCB and PAH body burdens in E.
affinis were quantified after exposure and compared.
The research presented in this article is a part of an interdisciplinary program focusing on estuarine water quality
study based on in situ and experimental investigations to assess the ecotoxicological impact of selected organic
contaminants by considering chemical bioavailability, contaminant accumulation, and their biological effects at
molecular, cellular, individual and at population levels on a zooplanktonic copepod species, Eurytemora affinis.
2.1. Material design
The experimental system described in Figure 1 is composed of three compartments: the water reservoirs
(25L), the exposure tanks (25L) containing the copepods and a recycling tank to remove contaminants from
water using activated carbon. All the tanks used during the experiments are glass material disinfected and
washed before the use. The three compartments are linked together by a peristaltic pump that draws up
contaminated water from the water reservoirs to the exposure tanks and eliminates excess water from the
exposure tanks into the recycling tank. Contaminant concentrations in water reservoirs and in exposure tanks are
identical. Furthermore, in order to avoid copepods to be pumped out into the peristaltic pump, a volume of 125
cm3 around rubber tubing extremities was capped with 50 µm mesh.
2.2. Collection of experimental organisms
According to Cailleaud et al. [1], the bioaccumulation of HOCs in E. affinis presents seasonal
variations. Therefore, copepods were sampled during the lowest impacted period, in autumn 2004. Copepods
were collected using subsurface tows of WP2 plankton net (200 µm mesh size) at ebb tide, in Tancarville Station
Publications
in the oligohaline part of the Seine Estuary. Immediately after sampling, the copepods were sorted using 500 µm
sieves in order to eliminate predators (especially Mysidacea and Gammaridae), then transferred into isotherm
containers using filtered estuarine water and brought back to the laboratory for further precise sorting in order to
exclude particulate matter from the sample as previously described [16]. After sorting, the copepods were
maintained in the laboratory for an acclimatization period of three days in a 300 L hydrodynamic canal under
controlled conditions (salinity: 15 PSU, temperature: 10 °C, photoperiod: 12/12H). The hydrodynamic canal
contained freshly filtered sea water (GF/C Whatman filter, 0.45 µm) sampled in the English Channel mixed with
ultra-pure water in order to reach the selected salinity of 15 PSU. The same water preparation was used for the
exposure experiments. During this period, copepods were fed twice a day with algal mixtures (Rhodomonas
marina and Isochrysis galbana). Then, around 1000 copepods/L which correspond to the maximum density
observed in the Seine Estuary, were transferred into the experimental continuous flow through system.
2.3. Experimental setups
The present study is concerned primarily with the uptake of organic contaminants in E. affinis exposed
to low levels of dissolved PCBs and PAHs. To ensure that the real exposure concentrations were within an
acceptable range from the selected nominal concentrations during all the experiments, preliminary tests were
performed with the exposure system, before the exposure started, to saturate the tanks and the rubber tubing with
contaminants. Thus, an appropriate flow rate and a saturation period were characterized for each contaminant
class (Table 1). The stock solutions of contaminants were prepared at high concentrations in acetone in order to
introduce low volumes of solvent in the water (> 15 µL of acetone/L of water). Contaminant solution was
weighed in glass vial and manually introduced in the water reservoirs and in the water of the exposure tanks at
the beginning of the saturation period using glass pipette. The same quantity of the contaminant solution was
introduced in the waters of the reservoirs and of the exposure tanks in order to reach the same contaminant
concentrations. Then the water was gently stirred and the flow through system was activated. When the
reservoirs were empty, once or twice a day depending on the flow rate fixed for each contaminant (Table 1), the
peristaltic pump was stopped for 15 minutes in order to refill the reservoirs with water. The water of the
reservoirs was then contaminated as previously described and the peristaltic pump was primed again.
Two copepod groups were exposed simultaneously in separate aquariums, after the saturation period of
142 hours, to a PCB mixture (CB 52: 45 ng.L-1, CB 101: 65 ng.L-1, CB 87: 25 ng.L-1;CB 118: 50 ng.L-1, CB 153:
50 ng.L-1, CB 138: 50 ng.L-1, CB 180: 15 ng.L-1) and to a PAH mixture (phenanthrene: 60 ng.L-1, pyrene: 95
ng.L-1, chrysene: 95 ng.L-1; benzo[k]fluoranthene/ benzo[b]fluoranthene: 170 ng.L-1, benzo[a]pyrene: 80 ng.L-1)
for 86 hours. In parallel, a control group was maintained in clean water using a continuous flow through system.
Contaminant concentrations for the experiments were selected according to PCB and PAH levels measured in a
two year study in the water column of the Seine Estuary [1]. During exposure experiments, food was not
provided to the copepods and therefore was not a source of sorption and another route of transfer for HOCs to
the copepods. Some copepod aliquots (n=3) were sampled and immediately frozen in liquid nitrogen in situ at
sampling time, after 3 days in clean water and at the end of exposure experiments for chemical analyses.
Prior to the extraction, both liquid volumes and freeze-dried copepod samples were weighed. Internal
standard mixtures were gravimetrically added before the solvent introduction, as reported elsewhere [17; 18].
PAHs were quantified using the response factors of perdeuterated internal standards (phenanthrene d10 for
phenanthrene (Phe), fluoranthene d10 for pyrene (Pyr), chrysene d12 for chrysene (Chry), benzo[e]pyrene d12 for
benzo[b] + benzo[k]fluoranthene (B[b+k]F), benzo[a]pyrene d10 for benzo[a]pyrene (BaP)) and were obtained
from Cambridge Isotope Laboratories (Cambridge, UK) and from MSD isotopes (Montreal, Canada). PCBs were
quantified according to the response factors of the following internal standards PCB 30, 103, 155 and 198
(Promochem, Molsheim, France). All solvents were either HPLC grade or Organic residue analysis grade and
were purchased from Atlantic Labo (Eysines, France).
- Extraction procedures and GC analyses
Extraction and quantification methods for PAHs and PCBs are described elsewhere in details [1; 17].
Briefly, dissolved PAHs and PCBs were liquid-liquid extracted using dichloromethane. Both PAHs and PCBs
accumulated in E. affinis were extracted by micro-wave assisted extraction during 10 min at 30 W (Maxidigest
350 PROLABO). The organic extracts were then purified [1].
Concentrations of PCBs and PAHs were monitored respectively using GC/ECD (Hewlett-Packard
5890A series II GC (Avondale, MA, USA) equipped with a 63Ni electron-capture detector) and GC/MS
(Hewlett-Packard model series 6890A GC and an Agilent Networks 5973 mass selective detector (Agilent
Publications
Technologies)). The mass spectrometer was operated in Single-Ion-Monitoring (SIM) mode with the molecular
ions of the studied PAHs [17].
- Quality assurance
Procedural blanks were regularly performed (representing less than 10% of the sample content) and all
results presented are adjusted for the minor contributions from the blanks. All glassware was cleaned with
detergent, rinsed with ultra-pure water followed by heating at 450°C overnight. The effectiveness of the different
analytical procedures was evaluated by analyzing NIST Standard Reference Material 1944 (sediment) and 2978
(mussels) for PCBs and PAHs (Gaithersburg, MD, USA). The mean recoveries of PAHs compared to the
certified concentrations were 82% (ranging from 74 to 110%) for SRM 1944, and 86% (ranging from 59 to
114%) for SRM 2978; standard deviation (SD) values for each compound were lower than 4% (n=6). For PCBs,
mean recoveries were of 104% (ranging from 79 to 124%) for SRM 1944 and of 83% (ranging from 59 to 106%)
for SRM 2978 (SD lower than 4%, n=4).
3. Results
3.1. Water stability
Before starting the exposures, the flow through system was saturated with contaminants in order to
minimize adsorption phenomena during the exposures. Both dissolved PCBs and PAHs reach approximately the
expected water concentrations of respectively 300 and 500 ng.L-1 within ± 15 %, knowing that the mass of stock
solutions introduced in the water reservoirs varies within ± 5% (Table 1).
3.2. Uptake of HOCs in E. affinis
The accumulation of total as well as individual PCBs and PAHs in E. affinis was estimated as the
difference between PCB and PAH concentrations in the exposed group and in the non-exposed group at the end
of the exposure. Both PAHs and PCBs concentrated by E. affinis are expressed as mean ± standard error of the
mean (SEM, n=3) (Fig. 2).
After 86 hours of exposure, copepods exposed to HOCs present increasing contaminant body burdens. Thus,
total PCB concentration in exposed copepods at the end of the experiment is ten times higher (8,470 ± 265 ng.g-1
dry weight) in comparison to non-exposed copepods (811 ± 42 ng.g-1 dry weight). The calculated concentration
factor (CF) taking into account the total PCB concentration in the copepods after 86 hours of exposure and the
total PCB concentration in the water to which they were exposed (ng.kg-1 dry weight copepods per ng.L-1 in
water) is 28,200 (Fig. 3). Comparable results are observed after PAH exposure since PAH level in exposed
copepods (613 ± 40 ng.g-1 dry weight) is substantially higher than the one of the non-exposed copepods (9.5
ng.g-1 dry weight). However, total PAH concentration in copepods exposed to PAHs is almost 15 times lower
than total PCB concentration in copepods exposed to PCBs, although the dissolved PAH level (500 ng.L-1) is
higher than the dissolved PCB level (300 ng.L-1) in their respective exposure tanks. Thus, copepods exposed to
PAHs present a calculated CF of 1,230 for total PAHs after 86 hours of exposure.
These experiments reveal that the four highest detected congeners in exposed copepods are PCB 101
(1,533 ± 73 ng.g-1 dry weight), PCB 118 (1,419 ± 47 ng.g-1 dry weight), PCB 153 (1,776 ± 38 ng.g-1 dry weight)
and PCB 138 (1,881 ± 52 ng.g-1 dry weight) which are also the major PCB compounds dissolved in water
(Figure 2.c.1). The higher molecular weight compounds (PCB 153, PCB 138 and PCB 180) represent a larger
proportion of total PCB contamination in the copepods (50 %) in comparison with the water contamination (38
%). These results suggest that higher molecular weight compounds are preferentially concentrated by copepods,
rather than low molecular weight compounds. In addition, a strong linear relation, as determined by r2 (0.8606),
is observed between individual PCB CFs and their respective log Kow (Figure 3.a). The highest and the lowest
calculated CFs are respectively observed for PCB 180 (36,300) and for PCB 52 (12,700).
Similar results are observed for individual PAHs (Figure 2.c.2). The two major PAH compounds
detected in exposed copepods are BbF/BkF (306 ± 12 ng.g-1 dry weight) and the less accumulated compound is
Phe (30 ± 3 ng.g-1 dry weight). These compounds are respectively the major and the less important PAH
compounds dissolved in water. The higher molecular weight compounds (BbF/BkF and BaP) represent 66% of
the total PAH contamination in the copepods whereas these compounds represent 50 % of the total water
contamination. In the same way as for PCBs, higher molecular weight compounds are preferentially
concentrated by copepods, rather than lower molecular weight congeners. A linear relation (r2=0.7946) is also
observed between individual PAH CFs and their respective log Kow (Figure 3.b). Thus, the highest and the
lowest calculated CFs are respectively observed for BbF/BkF (1,770) and for Phe (530).
Publications
3.3. Elimination of HOCs in E. affinis
The elimination of total as well as individual PCBs and PAHs in E. affinis are estimated as the
difference between PCB and PAH concentrations in copepods at the in situ sampling time and in the copepods at
the end of the experiment in the control group (T 86H). Both PAH and PCB levels in E. affinis are expressed as
mean ± standard error of the mean (SEM). Total PCB concentrations in the copepods at the in situ sampling time
(745 ± 83 ng.g-1 dry weight), after 3 days in clean water (668 ± 17 ng.g-1 dry weight) and after one week in clean
water (811 ± 42 ng.g-1 dry weight) are presented in Fig. 2.b.1. Total PCB body burdens decrease slightly in the
copepods fed and maintained 3 days in clean water. Thus, PCB 52, PCB 101 and PCB 118 present respectively
decreasing levels of 29%, 10% and 44%, in comparison with concentrations of these compounds measured in
copepods at the in situ sampling time. After 7 days in clean water, PCB 52 and PCB 118 concentrations decrease
respectively of 24% and 15 % compared with concentrations of these compounds measured in copepods at the in
situ sampling time. The distribution patterns of the PCB congeners are approximately the same in copepods
sampled in the Seine Estuary and in copepods maintained one week in clean water (Figure 4.a), dominated by
PCB 101, PCB 153 and PCB 138.
Total PAH concentrations in the copepods at the in situ sampling time (97 ± 11 ng.g-1 dry weight), after
3 days in clean water (80 ng.g-1 dry weight) and after one week in clean water (9.5 ng.g-1 dry weight) are
presented in Figure 2.b.2. The copepods maintained in clean water present slight decreasing levels of total PAH
body burdens after 3 days (18 % of total PAHs), when they are fed. After one week in clean water, the copepods
have eliminated almost all PAHs (90 % of total PAHs) from their body. For individual compounds, Phe is totally
eliminated after 3 days in clean water whereas Pyr, Chrys, BbF/BkF and BaP levels decrease respectively by
20%, 11%, 7% and 30%. After 86 more hours in clean water, Pyr and Chrys which are the most abundant
compounds accumulated in the copepods in the Seine Estuary (respectively 34 ± 4 and 27 ± 3 ng.g-1 dry weight),
are totally eliminated. For the higher molecular weight compounds depuration is less efficient. Nevertheless the
major part of BbF/BkF (79 %) and half of BaP are eliminated (46 %). As observed in these results, the
elimination coefficients decline with increasing log Kow. After one week in clean water, only three compounds
are still detectable in copepod bodies, BbF/BkF and BaP (respectively 5.3 ng.g-1 and 4.2 ng.g-1). The PAH
distribution patterns in the copepods sampled in the Seine Estuary, dominated by the lower molecular weight
compounds and the one of copepods after 86 more hours in clean water, dominated by heavier molecular weight
compounds are therefore totally different (Figure 4.b).
4. Discussion and conclusion
Landrum et al. [4] and Wang and Wang [19] have reported that copepods and amphipods could
concentrate high amounts of DDT and PAHs through experimental contaminated water exposures. In the present
study, at the end of the experiments, both copepods exposed to PCB and PAH mixtures present increasing
contaminant body burdens compared with the non-exposed copepods. Our experiments give evidence that E.
affinis could uptake organic contaminants from the dissolved phase and accumulate high amount of HOCs even
for low concentration exposures representative of environmental conditions. Harris et al. [20] have reported
similar results with the same copepod species. These authors have shown experimentally that E. affinis could
accumulate naphthalene through water exposure in a dose dependant way. Similarly, recent field studies have
confirmed that marine copepods could bioaccumulate and amplify PAHs in ecosystems where PAH
concentrations in the dissolved phase and in the suspended particulate matter are at or below method detection
limits [8]. Furthermore, information on the specific congener distribution suggest that E. affinis also selectively
bioconcentrates PAH compounds. Thus, for this species, higher molecular weight PAHs show higher CFs than
the lower molecular weight compounds. These observations are consistent with those made by Woods et al. [21]
that indicate that larvae of Chironomus tentans show striking affinities for BbF, BkF and BaP after exposure to
contaminated sediment. In addition, Landrum et al. [4] have reported higher BCFs in amphipods for pyrene, the
highest molecular weight compound they were exposed to, than for phenanthrene and naphthalene.
Several authors have experimentally characterized PCB transfers from water to copepods even at low exposure
concentrations [15; 22]. Magnusson et al. [23] have reported that the marine copepod, Calanus Finmarchicus,
could accumulate PCBs after exposure to contaminated water. They have calculated a BCF of 11×106 in this
species for PCB 101 after exposures to a concentration of 68 ng.L-1. These results are close to those obtained in
our study since we have observed that E. affinis could concentrate PCB 101 (20,900) after exposures to a
mixture of PCBs containing PCB 101 to a concentration of 65 ng.L-1. Moreover, exposed copepods are enriched
with the highest chlorinated PCB compounds that they were exposed to. The selective accumulation of PCBs in
E. affinis is also indicated by the high calculated CF of PCB 118, higher than its log Kow suggested it would be.
One explanation could be the chemical structure of PCB 118 which is a coplanar mono-ortho-substituted
congener. Thus, Willman et al. [24] have reported that ortho substitution affects the accumulation by plankton.
They have demonstrated that for zooplankton, coplanar PCB congeners accumulate to a greater extent than their
Publications
homologs for tri- to pentachlorobiphenyls. The same authors have reported in an in situ study similar results
showing the influence of the degree of chlorination on the accumulation patterns of PCBs in zooplankton [24].
These experimental data support previous field studies which have shown that this estuarine copepod species
could bioaccumulate high PCB and PAH amounts in the Seine Estuary [1] with dissimilar patterns from those of
the water and the particulate matter they were exposed to, which suggests selective accumulation processes.
Furthermore, considering the exposure conditions and PAH and PCB body burdens in exposed copepods, these
experiments show that the CF for total PCBs in E. affinis is 25 times higher than the corresponding PAH factor,
although these contaminants have similar Kow. This difference might be explained by the higher rate of
metabolism of PAHs in many biological organisms [21; 25].
In invertebrate species, different routes are suspected for the elimination of HOCs. Indeed, these
contaminants could be metabolized to improve their excretion. However, some authors have mentioned other
routes of excretion for non-metabolized PAHs, via the respiration membranes [26] and via fecal pellet [27]. Our
results indicate a rapid elimination of PAHs in copepods since comparing background concentrations measured
in copepods from the Seine Estuary, with concentrations in the same population after one week in clean water,
90 % of total PAH amounts are lost. Moreover, the lower molecular weight compounds are preferentially and
more rapidly eliminated which is expected since elimination rates of contaminants have been classically shown
to be inversely proportional to the compound hydrophobicity [27; 28]. A rapid biotransformation of PAHs has
also been reported by Harris et al. [20] in marine copepods. After an exposure to naphthalene and a following
period of 24 hours in clean water, 90 % of the PAH is eliminated by these copepod. In other respect, Lotufo [29]
has reported that two benthic copepod species have limited ability to biotransform fluoranthene but has also
suggested that these copepods could eliminate very efficiently parent compounds.
Concerning PCB body burdens in the non exposed copepods, slight variations are observed between the
copepods sampled in the Seine Estuary and the copepods of the same population after one week in clean water.
Metabolism by cytochrome P450 enzymes may influence PCB biotransformation in aquatic organisms and may
cause decreasing PCB levels [30]. However, during the first three days in clean water, when the copepods are
fed, the lower molecular weight compounds present decreasing levels. These results are close to those of Goerke
and Weber [31] which have reported a compound-specific elimination of PCBs with a high capability of
oxidative transformation and excretion of PCB congeners (≤ 6 chlorine substitutions) in many decapods. In our
experiments, the elimination of PCB stops when no more food is provided during the following 86 hours in clean
water. These results are in agreement with those presented by McManus et al. [32] which demonstrate that
Acartia tonsa fed during depuration eliminates PCBs more rapidly in the fecal pellets than unfed copepods.
To conclude, the role of species, exposure media and routes of uptake, metabolism, and physicochemical properties of the contaminants are factors that could account for transfer and accumulation of HOCs in
estuarine copepods. In addition, these results confirm that the concentration and elimination of HOCs by
estuarine copepods are not negligible phenomena and that these mechanisms may play an important role in the
biogeochemical cycles of HOCs in estuarine water column. Furthermore, the bioaccumulation of HOCs and their
metabolites in estuarine copepods may represent a risk to higher trophic levels in aquatic ecosystems since these
organisms constitute an important prey item in the diet of numerous juvenile fish species. These results highlight
the potential for deleterious effects as biotransformation products are often more toxic and bioactive than their
parent compounds, especially for PAHs. Thus, development and survival during the juvenile life stage could be
impaired by frequent ingestion of contaminated food.
Acknowledgements
This work was financially supported by the multidisciplinary Seine Aval scientific program and the
Region Haute-Normandie. The authors thank A. Bonnard and D. Devreker for their assistance during the
exposures experiments.
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Table 1: Experimental conditions to saturate the aquariums with the contaminant solutions and to maintain
constant dissolved PCBs and PAHs to the targeted concentrations (n=3).
Compounds
Water flow
(L.day-1)
Sampling time
T0
24 H
48 H
72 H
117H
142H
Nominale
concentrations
325 ± 5
241 ± 10
453 ± 25
260 ± 5
500 ± 25
300 ± 10
84H
Total PAHs
Total PCBs
50
50
490 ± 40
272 ± 21
249 ± 24
127 ± 7
237 ± 32
122 ± 13
267 ± 3
124 ± 10
331 ± 9
171 ± 3
Figure 1: Schematic view of the laboratory flow through system. (P: peristaltic pump, Ctrl: control)
Publications
Figure 2: Comparison of total PCB (a.1) and total PAH (a.2) uptake in E. affinis after exposure via contaminated
water during 86 hours. The concentrations of individual PCB (b.1) and PAH (b.2) compounds in the control
group are presented from the in situ sampling time to the end of the experiment. The distribution profiles of PCB
(c.1) and PAH (c.2) compounds after 86 hours of exposure are compared with those of the control groups and
those of water. Means are shown with bars indicating the standard error (n = 3).
Publications
Figure 3: Cross plot of concentration factors (CF) of individual PCB compounds (a) and individual PAH
compounds (b) in the exposed copepods versus the log Kow of each chemical.
CF
a.
CF
60 000
b.
BaP
2 000
180
R2 = 0.8606
40 000
118
138
Pyr
1 000
87
20 000
R2 = 0.7949
1 500
153
101
BbF/BkF
Chrys
500
52
Phe
0
0
5.5
6.5
Log Kow
7.5
5.5
6.5
Log Kow
7.5
Figure 4: Evolution of the mean distribution patterns of PCB (a) and PAH (b) compounds in the non-exposed
copepods and in the exposed copepods from the in situ sampling in the Seine Estuary to the end of the
experiment in comparison with the patterns of dissolved PCBs and PAHs.
Publications
Publication n° 6 :
K. Cailleaud 1, 2, 3, H. Budzinski1, S. Lardy1, S. Augagneur1, S. Souissi2, J. Forget-Leray3*
Abstract:
In recent years, anthropogenic chemicals which can disrupt the hormonal (endocrine) systems of both
humans and wildlife have been raised to a major cause of concern. In this study, the dominant copepod species
of the Seine Estuary, Eurytemora affinis, was exposed at environmental relevant concentrations under laboratory
controlled conditions to selected waterborn contaminants, which could cause endocrine disruptions,: a mixture of
4-nonylphenol (4 NP)/nonylphenol acetic acid (NP1EC), and a synthetic estrogen ethinylestradiol (EE2). The
uptake and the elimination of these contaminants by E. affinis have been studied. The results show that at the end
of the uptake period, both 4 NP and NP1EC but also EE2 were accumulated in exposed copepods with respective
concentration factors (CFs) of 324, 3,020 and 5,383. A rapid elimination of these compounds was also observed
in copepods placed in clean water since 54 % of total NP1EC and 100 % of EE2 amounts have been lost after 3
days. These results demonstrate that E. affinis has the potency to accumulate but also to eliminate endocrine
disrupters which suggests a non negligible role of this copepod species in the biogeochemical cycles of these
contaminants in estuarine ecosystems. Hence, these results also suggest that a transfer of 4 NP, NP1EC and EE2
to copepod predators and subsequently that secondary poisoning of these organisms might be possible.
Keywords: 4 NP, NP1EC, EE2, crustacean, estuary, flow through system
Soumise à Environment International
Publications
1.
Introduction
Over the last 15 years, concern has grown concerning hormonal system disturbances in aquatic
organisms related to anthropogenic contaminant releases. These chemicals, so called endocrine disrupters, have
potential effects on the reproductive system (Metzler and Pfeiffer, 2001), especially by mimicking the natural
female hormone estrogen through interaction with the estrogen receptor present in mammals and other
vertebrates. Thus, the occurrence of reproductive abnormalities has been frequently reported (Jobling et al.,
1996; Petrovic et al., 2002). Although the number of published data about endocrine disruption in wild species
has substantially increased during the last 10 years for both vertebrate and invertebrate animals (DeFur et al.,
1999; Larsson et al., 1999; Oberdörster and Cheek, 2000), studies on the specific mechanism by which the
endocrine system can be disrupted are scarce. However, some potential hormone-disrupting chemicals have been
listed as priority pollutants, depending on their molecular structure, by regulating bodies such as the European
Union (EU) and the Oslo and Paris Commission (OSPARCOM). Many chemicals which have endocrine
disrupting potential, share a common chemical structure with steroid hormones and fall into different categories
in relation to their chemical properties (Routledge and Sumpter, 1997). At present, the groups of endocrine
disrupters which are of major concern are the environmental estrogens and anti-estrogens since experiments have
shown their toxicity on vertebrates. Among these contaminants, alkylphenol polyethoxylates (APEs) and natural
and synthetic steroid hormones are two well known groups of environmental endocrine disrupters.
Akylphenol polyethoxylates are widely used as non ionic surfactants in various industrial, commercial
and household detergent formulations. Nonylphenol-polyethoxylates (NPEs) are by far the most commonly used
and synthesized APEs, accounting for about 80% of total APEs (Renner, 1997). These molecules are used in
numerous applications, principally as detergents and industrial products (coatings, paints, fuels, plastics,
paper…). The annual worldwide production of APEs in 1997 exceeded 500,000 metric tons (Renner, 1997) with
an estimated 60% of this production ending up in water. Thus, the occurrence of high levels of APEs and
especially of NPEs in coastal, estuarine and freshwaters has been extensively documented (Thiele et al., 1997;
Ying et al., 2002 b). Furthermore, a complex microbial degradation of APEs, which produces metabolites that
are more toxic than the parent compounds, has been characterized (Fenner et al., 2002) and these metabolites are
frequently detected at high levels in aquatic ecosystems.
Numerous studies have also suggested the occurrence of steroid estrogens in aquatic environments
(Ying et al., 2002 a; Williams et al., 2003; Noppe et al., 2006). The most potent steroid, 17α-ethinylestradiol
(EE2), a synthetic estrogen widely used as a female contraceptive agent (Purdom et al., 1994) has been detected
in different worldwide sewage treatment plant effluents at levels ranging between 0.2-42 ng.L-1 (Ying et al.,
2002 a). In UK, a threshold of 0.1 ng.L-1 in water has been therefore proposed for this compound based on
chronic toxicity tests (Desbrow et al., 1998).
In relation to their high octanol-water partition coefficients (log Kow > 4) both NPEs and EE2 tend to adsorb to
organic material and to accumulate in biota. In order to determine the actual impact of these compounds on the
aquatic environment and to predict the potential for biomagnification of these compounds through the food
chain, it is essential to elucidate their transfers and their metabolic fate in aquatic organisms (Wang et al., 1996).
Nevertheless, the majority of the studies have focused on vertebrate species and especially on fish (Staples et al.,
1998; Arukwe et al., 2000). Thus, both nonylphenol and EE2 have shown to be experimentally bioconcentrated
(Uguz et al., 2003; Labadie and Budzinski, 2006) and bioaccumulated by fish species. In addition, hormonal and
physiological diseases observed in exposed fish were related to increasing endocrine disrupter levels in fish
tissues. However, although planktonic crustaceans constitute an important energetic resource in the aquatic food
webs and play a key role in biogeochemical exchanges between sediments and the water column, little attention
has been paid concerning their potency to accumulate estrogenic compounds. However, both EE2 and 4 NP have
been shown to exhibit endocrine disruptions in copepods (Forget-Leray et al., 2005). In addition, transfer of
accumulated estrogenic contaminants from the lower trophic levels to top predators may occur and result in
secondary poisoning of these predator species.
The Seine Estuary is highly contaminated by organic contaminants, especially by 4NP and NP1EC (Cailleaud et
al., in press). Furthermore, natural sex steroids have been frequently detected in this estuary at levels ranging
from 1.8 to 8.3 ng.L-1 while synthetic steroids such as EE2 were always at or below the detection limit or the
quantification limit (Labadie and Budzinski, 2005). E. affinis is the copepod species that dominates the
microzooplankton community of this estuary and, in spite of the high contaminant levels, presents particularly
high density in this estuary in comparison to other North-Atlantic estuaries.
The aim of the present work was to determine the concentration factors of the two major alkylphenols of the
Seine Estuary (4NP and NP1EC) and of the synthetic estrogen, EE2, in E. affinis after exposure in a continuous
flow through system under environmental realistic conditions. Moreover, the elimination of these compounds in
copepods from the Seine Estuary has been investigated by measuring concentrations after one week in clean
water in comparison to background levels.
Publications
The research presented in this article is a part of an interdisciplinary program focusing on an estuarine water
quality study based on in situ and experimental investigations to assess the ecotoxicological impacts of selected
organic contaminants by considering chemical bioavailability, contaminant accumulation, and the molecular,
physiological and ecological effects of these contaminants on a zooplanktonic copepod species, Eurytemora
affinis.
The experimental system described in Figure 1 is composed of three compartments: the water reservoirs
(25L), the exposure tanks (25L) containing the copepods and a recycling tank to remove contaminants from
water using activated carbon. All the tanks used during the experiments are glass material disinfected and
washed before the use. The three compartments are linked together by a peristaltic pump that draws up
contaminated water from the water reservoirs to the exposure tanks and eliminates excess water from the
exposure tanks into the recycling tank. Contaminant concentrations in water reservoirs and in exposure tanks are
identical. Furthermore, in order to avoid copepods to be pumped out into the peristaltic pump, a volume of 125
cm3 around rubber tubing extremities was capped with 50 µm mesh.
2.2. Collection of experimental organisms
According to Cailleaud et al. (in press), the bioaccumulation of HOCs in E. affinis presents seasonal
variations. Therefore, copepods were sampled during the lowest impacted period, in autumn 2004. Copepods
were collected using subsurface tows of WP2 plankton net (200 µm mesh size) at ebb tide, in Tancarville Station
in the oligohaline part of the Seine Estuary. Immediately after sampling, the copepods were sorted using 500 µm
sieves in order to eliminate predators (especially Mysidacea and Gammaridae), then transferred into isotherm
containers using filtered estuarine water and brought back to the laboratory for further precise sorting in order to
exclude particulate matter from the sample as previously described (Cailleaud et al., 2007). After sorting, the
copepods were maintained in the laboratory for an acclimatization period of three days in a 300 L hydrodynamic
canal under controlled conditions (salinity: 15 PSU, temperature: 10 °C, photoperiod: 12/12H). The
hydrodynamic canal contained freshly filtered sea water (GF/C Whatman filter, 0.45 µm) sampled in the English
Channel mixed with ultra-pure water in order to reach the selected salinity of 15 PSU. The same water
preparation was used for the exposure experiments. During this period, copepods were fed twice a day with algal
mixtures (Rhodomonas marina and Isochrysis galbana). Then, around 1000 copepods/L which correspond to the
maximum density observed in the Seine Estuary, were transferred into the experimental continuous flow through
system.
The present study is concerned primarily with the uptake of organic contaminants in E. affinis exposed
to low levels of dissolved PCBs and PAHs. To ensure that the real exposure concentrations were within an
acceptable range from the selected nominal concentrations during all the experiments, preliminary tests were
performed with the exposure system, before the exposure started, to saturate the tanks and the rubber tubing with
contaminants. Thus, an appropriate flow rate and a saturation period were characterized for each contaminant
class (Table 1). The stock solutions of contaminants were prepared at high concentrations in acetone in order to
introduce low volumes of solvent in the water (> 15 µL of acetone/L of water). Contaminant solution was
weighed in glass vial and manually introduced in the water reservoirs and in the water of the exposure tanks at
the beginning of the saturation period using glass pipette. The same quantity of the contaminant solution was
introduced in the waters of the reservoirs and of the exposure tanks in order to reach the same contaminant
concentrations. Then the water was gently stirred and the flow through system was activated. When the
reservoirs were empty, once or twice a day depending on the flow rate fixed for each contaminant (Table 1), the
peristaltic pump was stopped for 15 minutes in order to refill the reservoirs with water. The water of the
reservoirs was then contaminated as previously described and the peristaltic pump was primed again.
Two copepod groups were exposed simultaneously in separate aquariums to a mixture of alkylphenols
(NP1EC 520 ng.L-1, 4 NP 480 ng.L-1) and to EE2 (10 ng.L-1) for 86 hours. In parallel, a control group was
maintained in clean water using a continuous flow through system. Contaminant concentrations for the
experiments have been selected according to the alkylphenol levels measured in a two years study in the water
column of the Seine Estuary (Cailleaud et al., in press) and in relation to worldwide occurrence for EE2. During
the exposure experiments, food was not provided to the copepods and therefore was not a source of sorption and
another route of transfer of contaminants to the copepods. Some copepod aliquots (n=3) were sampled and
Publications
immediately frozen in liquid nitrogen at the in situ sampling time, after 3 days in clean water and at the end of
the exposure experiments for chemical analysis.
2.4. Chemicals
All solvents were either HPLC grade or Organic residue analysis grade and were purchased from
Atlantic Labo (Eysines, France). NP1EC (purity 99%) was obtained from LGC Promochem (Molsheim, France)
and Technical 4-NP (purity > 98%) standard was purchased from Sigma-Aldrich (St Quentin Fallavier, France).
EE2 was supplied by Sigma-Aldrich (St Quentin Fallavier, France). Deuterated steroid (17α-ethinylestradiol-d4,
purity > 99%), used as internal standard, was obtained from C/D/N Isotopes (Montreal, Canada). Triethylamine
(TEA) (purity >99%) was used for some SPE procedures (Sigma Aldrich, St Quentin Fallavier, France).
Trifluoroacetic acid (TFA) (reagent grade, purity >99%) was obtained from Fisher Scientific Labosi (Elancourt,
France). MSTFA (N-Methyl-N(trimethylsilyl)trifluoroacetamide, >97%; Acros Organics, Noisy-Le-Grand,
France) was used as silylation agent for GC/MS analysis, in combination with mercaptoethanol (purity > 99%)
and ammonium iodide (purity > 99%), both provided by Acros Organics. Pure water was obtained with a MilliQ system (Millipore, Molsheim, France). β-glucuronidase-aryslsulfatase from Helix pomatia (glucuronidase:
100,000 Sigma units ml-1 and sulphatase: 7,500 Sigma units ml-1) was supplied by Sigma-Aldrich. Sodium
acetate tri-hydrate (purity > 99%, Sigma-Aldrich) and acetic acid (purity > 99.5%, VWR International,
Strasbourg, France) were used for the preparation of acetate pH buffer.
2.5. Alkylphenols Extraction (SPE)
Prior to the extraction, freeze-dried copepods were weighed (150 mg dry weight (dw) of a homogenized
pool of E. affinis) and water volumes were measured (500 mL). NP1EC and 4 NP were extracted from E. affinis
by Focused Microwave-Assisted Extraction (10 min at 30 W) with a methanol/dichloromethane mixture as
solvent (3/1, v,v). Organic extracts were concentrated by rotary evaporation and then dissolved into 100 ml of
acidified ultra-pure water (pH 2). Before the SPE, the water samples were acidified to approximately pH 2 with
3.5 M HCL. The cartridges Varian BondElut C18 (Interchim, Montluçon, France) were preconditioned with 5 ml
of methanol followed by 5 ml of ultra pure acidified water (pH 2). Then 500 ml of the water sample and 100 ml
of the water accommodated copepod extracts were eluted through the cartridge at a flow rate of 10 ml.min-1.
After the elution, the cartridges were washed with 3 ml of a methanol/acidified ultra pure water mixture (50/50,
v/v). Then, the aqueous phase was removed by drying the cartridge for 1 hour. At last, the organics were eluted
by passing 5 ml of a methanol/dichloromethane mixture (50/50, v/v) and concentrated to 100 µl (for water
extracts) and to 500 µl (E. affinis extracts) by warming at 45°C under a gentle nitrogen stream.
2.6. EE2 extraction
- Water samples
Water samples from the exposure tanks (500 mL) were spiked with EE2-d4 and extracted on Oasis
HLB cartridges (flow rate 15 ml min-1), previously conditioned with 6 ml methanol and 6 ml Milli-Q water
(Labadie and Budzinski, 2006). The sorbent was rinsed with 5 ml of methanol/water (60/40, v/v), and analytes
were eluted with 8 ml of methanol. Extracts were taken to dryness under a stream of nitrogen at 50 °C, prior to
the silylation step. The derivatisation reagent was prepared as follows: a mixture of 250 µl of MSTFA, 15 µl of
mercaptoethanol and 10 mg of NH4I was left for about 10 min at 65 °C. Thereafter, this mixture was diluted 10
times with MSTFA to obtain the derivatisation reagent, 30 µl of which were added to each extract and samples
were kept at 65 °C for 30–40 min. Then, 30 µl of dichloromethane were added prior to GC/MS analysis.
- Copepod samples
Copepod samples were combined with 2 ml sodium acetate buffer (pH 5.0, 10-2 M) and spiked with
EE2-d4. Samples were then homogenised using an Ultra-Turrax® T25 Basic dispersing tool (IKA® Werke,
Staufen, Germany) for 1 min at 6,000 rpm, in 30 ml of methanol/Milli-Q water (55:45, v/v). EE2 was then
extracted by Focussed Microwave Assisted Extraction (Microdigest 301, Prolabo, Fontenay-sous-Bois, France):
30 W, 5 min, 10 ml of methanol/Milli-Q water (55:45, v/v). Extracts were centrifuged at 4,500 rpm for 5 min, at
room temperature. The supernatant was transferred to a vial and the methanol content of the extracts was
evaporated at 60 °C under a nitrogen stream. The extract was then fractionated and purified according to the
method developed by Labadie and Budzinski (2006) presented in Fig. 2.
The conjugated fraction was subjected to both solvolysis and enzymatic hydrolysis. Dried Oasis HLB extracts
were incubated at 45 °C for 30 min in trifluoroacetic acid/methanol/ tetrahydrofuran (10 µl/200 µl/800 µl). After
neutralisation with 0.2 M Na2CO3, the organic solvents were evaporated at 60 °C under a gentle nitrogen stream.
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Sodium acetate buffer (pH 5.0, 10-2 M) and β-glucuronidase-arylsulphatase were added and samples were further
incubated at 55 °C for 3 h. These extracts, containing only free steroids, were purified using Oasis HLB and
aminopropyl SPE cartridges (Fig.2). The purpose of this second Oasis HLB step was to switch from aqueous
buffer to organic solvent, but also aimed at providing a first clean-up of the extract. Then, samples were
derivatised as previously described for the determination of EE2 in water before the analysis by GC/MS
- LC MS analyses
Alkylphenols and their metabolites were analyzed using an HPLC separation coupled to electrospray
mass spectrometry detection. The HPLC system consisted of an Agilent 1100 series (Agilent Technologies).
Chromatographic separation was performed using a reversed-phase analytical column (Kromasil C18, Interchim,
France) of 150 × 2.1 mm i.d. × 3 µm film thickness. NP1EC and 4 NP were separated using a mixture of
water/methanol/ammonium acetate (5mM) (A) and methanol (B) as mobile phase. The solvent program started
with an initial B concentration of 60% kept isocratic for 2 min, linearly increased to 80% in 5 min, kept isocratic
for 28 min and linearly decreased to 60% in 3 min, with constant flow rate (0.150 ml/min) and constant column
temperature (20°C). An Agilent Technologies mass spectrometer equipped with an electrospray (ESI) ion source
was used. The following operation parameters were used: source temperature, 100°C; desolvation temperature,
350°C; desolvation gas flow rate, 10 l/min; ESI+ and ESI- capillary voltage, 4.0 and 3.5 kV. Acquisition was
accomplished using the Selected Ion Monitoring mode (SIM). NPE1C (m/z 277) and 4 NP (m/z 219) were
identified by their characteristic pattern showing [M-H]- ions in the negative ionization mode. The compounds
were also identified by co-injection of authentic standards.
- GC MS analyses
Separation and detection of the analytes were achieved using an Agilent Technologies gas
chromatograph system (6890 series) coupled with an Agilent Technologies mass spectrometer detector (5973
series), used in electron impact mode (70 eV), with the electron multiplier voltage set at 1500–1800 V and the
source temperature set at 230 °C. The separation was performed on an Agilent HP-5MS capillary column
(length: 30 m; internal diameter: 250 µm; stationary phase thickness: 0.25 µm), with the following oven
parameters: from 90 °C (1 min) at 7.5 °C min-1 to 290 °C (isothermal 5 min). Helium 6.0 (Linde, Bassens,
France) was used as the carrier gas (constant flow: 1 ml min-1). The injection was performed in splitless mode (1
µL injected). The injector temperature was set at 250 °C, and the purge flow was set at 60 ml min-1 after 1.5 min.
For each series of analyses, blank samples were run and EE2 was never detected (<0.05 ng/blank sample).
Analyses were run in SIM mode. The ions used for the quantification of EE2 and EE2-d4 were m/z 425 ([MCH3]+) and 429 (M+), respectively. Furthermore, EE2 molecular ion, m/z 440, was used to confirm the peak
attribution to EE2: for a given peak, the area ratio m/z 425 to m/z 440 was compared to that obtained with an
authentic EE2 standard prior to definitive attribution of the peak.
- Quality assurance
For NPE compounds, quantification was performed using an external calibration method based on a five
point quadratic calibration curve. Calibration curves were generated using linear regression analysis within the
investigated concentration range (0.1-0.8 µg.ml-1 for NP and 0.2-2.0 µg.ml-1 for NP1EC). The calibration curves
of each analyzed standard (NP, NP1EC) presented high linearity (r2 ≥ 0.995). The efficiency of the analytical
procedure was determined by analyses of ultra pure water spiked with an alkylphenol standard solution. The
average recoveries of NP and NP1EC were respectively 90% ± 12, 68% ± 5 (n = 4). In the same way, the
efficiency of the analytical procedure for EE2 extraction was estimated by analysing ultra pure water spiked with
an EE2 standard solution and the average recovery for this compound was 85 % ± 6 (n = 4).
Before the extraction, all glassware was cleaned with detergent, rinsed with ultra-pure water and followed by
heating at 450°C overnight. Besides, procedural blanks were regularly performed (representing less than 10% of
the sample content) and all results presented are adjusted for the minor contributions from the blanks.
3. Results
3.1. Water stability
Before the start of the exposures the flow through system was saturated by contaminants in order to
minimize adsorption phenomena during the exposures and both dissolved NPEs and EE2 have reached
approximately the expected water concentrations of respectively 1000 (480 ng.L-1 for 4-NP and 520 ng.L-1 for
NP1EC) and 10 ng.L-1 within ± 5 %, knowing that the mass of stock solutions introduced in the water reservoirs
varied within ± 5% (Table 1).
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3.2. Uptake of estrogenic compounds in E. affinis
The accumulation of total as well as individual NPEs and EE2 in E. affinis is estimated as the difference
between NPE and EE2 concentrations in the exposed group and in the non-exposed group at the end of the
exposure. Both NPEs and EE2 concentrated by E. affinis are expressed as mean ± standard error of the mean
(SEM, n = 3).
After 86 hours of exposure, copepods exposed to estrogenic compounds present increasing contaminant body
burdens. Thus, total NPE concentration in exposed copepods at the end of the experiment is almost four times
higher (2,423 ± 144 ng.g-1 dry weight) in comparison with non-exposed copepods (676 ± 64 ng.g-1 dry weight)
(Fig. 3.a). Moreover, the calculated concentration factor (CF) related to the total concentrations of NPEs in the
copepods after 86 hours of exposure (Table 2) in comparison with the concentration in the water to which they
were exposed (ng.kg-1 dry weight copepods per ng.L-1 in water) is 1,715. NP1EC is the most accumulated NPE
in E. affinis since the final concentration in exposed copepods is 1813 ± 115 ng.g-1 dry weight (CF 3020) while
few amounts are measured in non-exposed copepods (3 ± 2.5 ng.g-1 dry weight) (Fig. 3.c). Furthermore,
increasing levels of 4 NP are observed in the exposed copepods (610 ± 29 ng.g-1 dry weight) at the end of the
experiment when compared with the copepods at the beginning of the experiment (454 ng.g-1 dry weight) and
those at the in situ sampling time (78 ± 4 ng.g-1 dry weight). However, similar concentrations of 4 NP are
observed both in exposed (610 ± 29 ng.g-1 dry weight) and non-exposed copepods (674 ± 62 ng.g-1 dry weight)
after 86 hours of exposure. Therefore, a low CF of 324 is calculated for 4 NP (Table 2).
In the same way, bioconcentration of EE2 is also observed in exposed copepods to an extent of 54 ± 1 ng.g-1 dry
weight whereas EE2 is not detected in the non-exposed copepods at the end of the experiment (Fig. 5). The mean
concentration factor calculated in E. affinis for this compound is 5,383 (Table 2). In addition, all EE2 amounts
detected during this study were free steroids. Conjugated steroids have never been detected.
3.3. Elimination of estrogenic compounds in E. affinis
The elimination of total as well as individual NPEs and EE2 in E. affinis is estimated as the difference
between NPE and EE2 concentrations in copepods at the in situ sampling time and in the copepods at the end of
the experiment (T 86H control group). Both NPE and EE2 levels in E. affinis are expressed as mean ± standard
error of the mean (SEM, n = 3).
Total NPE concentrations in the copepods at the in situ sampling time (627 ± 171 ng.g-1 dry weight), after 3 days
in clean water (708 ng.g-1 dry weight) and after one week in clean water (676 ± 64 ng.g-1 dry weight) are
presented in Fig. 3.a. The copepods maintained in clean water present almost similar total NPE levels after one
week in comparison with the background levels observed in the copepods at the in situ sampling time. However,
individual compounds present differential fate (Fig. 3.b). Thus, decreasing NP1EC levels are observed during
this period. The mean concentrations of NP1EC in the in situ copepods, after 3 days in clean water and after one
week in clean water are respectively 549 ± 167 ng.g-1 dry weight, 255 ng.g-1 dry weight and 3 ± 2.5 ng.g-1 dry
weight (Fig 3.b). After the first three days in clean water, 54% of NP1EC amounts are eliminated by the
copepods when comparing with background levels. After one week, almost all NP1EC amounts (99%) are lost.
On the opposite, increasing 4 NP levels are observed during this period. The mean concentrations of 4 NP in the
in situ copepods, after 3 days and after one week in clean water are respectively 78 ± 4 ng.g-1 dry weight, 454
ng.g-1 dry weight and 610 ± 29 ng.g-1 dry weight. Thus, 4 NP levels are around 6 times higher after three days of
depuration and nine times higher after one week of depuration in comparison with background levels measured
in the copepods at the in situ sampling time. Furthermore, total amounts of NP1EC eliminated by the copepods
placed in clean water (547 ± 165 ng.g-1 dry weight) are equivalent to those of 4 NP that are accumulated by these
copepods during the same depuration period (596 ± 58 ng.g-1dry weight). In addition, increasing 4 NP levels
during the depuration are strongly correlated (r2 = 0.9889) to the decreasing NP1EC levels in the non-exposed
copepods (Fig. 4).
EE2 concentrations in the copepods at the in situ sampling time (49 ng.g-1 dry weight), after 3 days in
clean water (< limit of detection) and after one week in clean water (< limit of detection) are presented in Fig. 5.
These results show a rapid elimination of EE2 in copepods placed in clean water since all EE2 amounts are lost
after three days. All EE2 compounds detected during this study were free steroids.
4. Discussion and conclusion
4.1. NPE uptake and depuration in E. affinis
Alkylphenol polyethoxylates are ubiquitous and persistent organic contaminants detected in aquatic
ecosystems at concentrations which could reach hundred nanograms per liter (Thiele et al., 1997; Ying et al.,
2002b). In this study, copepods were exposed to a mixture of 4 NP and NP1EC at environmental relevant
Publications
concentrations, based on the Seine Estuary contamination (Cailleaud et al., submitted). The 86 hour exposure
experiments revealed that NPEs were bioconcentrated by E. affinis. Our results also indicate that NP1EC was
highly accumulated by this copepod, rather than 4 NP. Published data are scarce concerning the possible transfer
of NPEs to invertebrates and especially to zooplanktonic crustaceans. Most of the works have focused on fish
species. Besides, at the present time, no experimental work and almost no in situ study have focused on the
possible transfer of NP1EC from the water column to planktonic crustacean species, although this compound is
probably one of the major dissolved compounds detected in aquatic ecosystems, in relation to its hydrophilic
properties (Cailleaud et al., submitted). Only one reference (Verslycke et al., 2005) has mentioned NP1EC
levels, but below the limit of detection, in mysid shrimps of the Scheldt Estuary, without indicating NP1EC
concentrations in water, which does not allow to estimate transfer via the dissolved phase. With invertebrates,
most studies have been conducted on the transfer of 4 NP to mussels. These organisms exhibit bioconcentration
factors ranging from 1.4 to 2700 (McLeese et al., 1980; Ekelund et al., 1990) in experimental studies. For
crustaceans, Ekelund et al. (1990) have reported experimental BCFs for shrimp species ranging from 90 to 110.
Besides, Cross-Sorokin et al. (2003) have experimentally shown that Gammarus pulex could uptake 4nonylphenol both from water and from food. These authors have also suggested that in the case of continuous 4
NP discharges into water, uptake from water was predominant because of the large volume of contaminated
water transferred across the gills to satisfy the organism’s oxygen demand. These data of BCFs for crustacean
species are in the same range as those reported in our study for 4 NP (BCF 324) and comparable with those
generally calculated for fish species that range from 0.9 to 741 (Brooke, 1993).
Our experiments also indicate a high capacity for E. affinis to eliminate NPEs since 54 % and 99 % of NP1EC
amounts were lost after respectively three days and one week in clean water while increasing 4 NP levels were
measured in non-exposed copepods. The linear correlation observed between the elimination of NP1EC and the
increasing 4 NP levels in non-exposed copepods suggest a total transformation of NP1EC by E. affinis in 4 NP.
This mechanism has the time being only been observed for anaerobic conditions (Giger et al., 1984). Moreover,
these results suggest a rapid depuration half-life of 72 hours for NP1EC. Indeed, the assumption that total 4 NP
amounts at the end of the depuration result from the metabolisation of NP1EC leads to conclude that total 4 NP
background amounts have been eliminated, which suggests a lower depuration half-life for 4 NP than for
NP1EC. To compare, depuration half-lives for 4 NP of 9 hours (Tsuda et al., 2001) and 62 hours have been
reported respectively for killifish and Gammarus pulex (Cross-Sorokin et al., 2003). Furthermore, 4 NP is
commonly biotransformed in fish into its conjugated form by the glutathione-S-transferase enzyme (Hughes and
Gallagher, 2004) which has also been found in E. affinis (Cailleaud et al., submitted) and which could explain
the elimination of 4 NP by this copepod.
These experiments show that NPEs could be accumulated but also rapidly biotransformed and eliminated in the
copepod E. affinis. These results suggest the non negligible role played by this copepod species, which presents
particularly high density in the Seine Estuary, in the biogeochemical cycle of NPEs in estuarine ecosystems.
4.2. Uptake and elimination of EE2 in E. affinis
In parallel to NPE exposures, the copepods were exposed to EE2 at environmental realistic
concentrations, based on the concentration range of this compound in worldwide sewage treatment plants. The
86 hour exposure experiments revealed that EE2 was bioconcentrated by E. affinis. On the other hand, copepods
placed in clean water for depuration show a rapid elimination of EE2 in 3 days which suggests a depuration halflife of at most 36 hours. Ethinylestradiol could be de-ethinylated to estradiol in the human liver although most of
it is excreted from humans unchanged in conjugated form (Bolt, 1979). Nevertheless, no estradiol was detected
in exposed copepods, which suggests an elimination pathway for EE2 probably through its conjugate form which
might involve GST enzyme although only unconjugated EE2 was detected in exposed copepods. Similar results
have been reported in fish (Larsson et al., 1999) and in algae (Lai et al., 2002). This absence of conjugated EE2
in exposed copepods could be related to a poor efficiency during the sovolysis or the enzymatic hydrolysis steps
of the extraction protocol.
The data of both exposure experiments and field accumulation of EE2 are scarce which makes the comparison
difficult. However, Labadie and Budzinski (2006) have reported increasing levels of free EE2 both in male and
female turbots after a 15 day exposure via contaminated water. These authors have also shown hormonal
diseases especially in males which showed decreasing androgen synthesis after the exposure. High uptake of
EE2 has also been reported in Lumbriculus variegatus exposed to spiked sediment (Liebig et al., 2005). These
authors have observed a depuration half-life of 10 days for EE2 in this species which is longer than the
elimination rate observed in our study for E. affinis. This difference in the elimination rate of EE2 between these
two species could be explained by the exposure route and also by a more diffuse contamination in the tissues of
this oligochaete species after feeding on contaminated food. Furthermore, Gomes et al. (2004) have reported a
rapid accumulation of estrone, a natural steroid hormone, in Daphnia magna exposed to contaminated water.
Moreover, they have suggested that EE2 uptake via the trophic route was less significant compared to
Publications
bioconcentration from the aqueous medium. These authors have also suggested that this rapid bioconcentration
of estrone could be attributed to an acclimatization lag phase before the beginning of depuration. In addition,
after 24 hours, the BCF decreased in relation to the depuration.
The data presented here indicate a rapid bioconcentration of both NPEs and EE2 in E. affinis, an
ecologically important species in the Seine Estuary food web. The high potency to eliminate these compounds
has also been demonstrated. These results suggest the important role of this copepod species in biogeochemical
cycles of non ionic surfactants as well as synthetic steroids in estuarine ecosystems. Furthermore, the possible
rapid biotransformation of NP1EC into 4 NP in estuarine copepods may present a risk for higher trophic levels in
aquatic ecosystems since these organisms constitute an important prey item in the diet of numerous juvenile fish
species. These results highlight that E. affinis could be a non-negligible route of exposure for juvenile fish and
underline the potential for deleterious effects on copepod predators. Thus, development and hormonal balance
during the juvenile life stage could be impaired by frequent ingestion of contaminated food
Acknowledgements
This work was financially supported by the multidisciplinary Seine Aval scientific program, the Region
Haute-Normandie and the Region Aquitaine.
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Table 1: Experimental conditions to saturate the mesocosms with the contaminant solutions and to maintain
constant dissolved alkylphenol and EE2 concentrations at the targeted concentrations.
Sampling Time
Compounds
Flow of water
(L.day-1)
T0
T 24H
T 42H
T 50H
T 72H
Nominal
concentrations
NP1EC
4NP
EE2
25
50
327
419
318
419
467
520
360
416
472
508
520
480
9.9
9.1
10.1
10.6
-
10
Publications
Table 2: Concentration factors of each chemical used in the experiments
Mesocosm 1
Mesocosm 2
Comppounds
BCF
Log Kow
4 NP
324
4.48
NP1EC
3020
n.d.
Total NPEs
1715
EE2
5383
4.15
Figure 1: Schematic view of the laboratory flow through system. (P: peristaltic pump, AP: alkylphenol, EE2: 17α-ethinylestradiol, Ctrl: control)
Publications
Figure 2: Analytical procedure for the determination of unconjugated and conjugated EE2 in copepod samples
(Labadie and Budzinski, 2006).
Sample
EE2-d4
Fractionation Oasis HLB
MeOH/H2O
(60/40, v/v) +
TEA
MeOH
Conjugated steroids
Free steroids
EE2-d4
Cleavage
NH2
Oasis HLB + NH2
Derivatisation
Analysis by GC/MS
Figure 3: Concentrations of total alkylphenols (a) in Eurytemora affinis after exposure via contaminated water
during 86 hours. The elimination of 4 NP and NP1EC (b) in the control group are presented from the in situ
sampling time to the end of the experiment. 4 NP and NP1EC patterns in exposed copepods after 86 hours of
exposure (c) are compared with those of the non exposed copepods and those of water. Means are shown with
bars indicating the standard error (n=3).
Publications
Figure 4: Variations of 4 NP concentrations plotted against the variations of NP1EC concentrations in the nonexposed copepods during the depuration period.
Figure 5: Accumulation of EE2 in exposed copepods and depuration in non exposed copepods during the
exposure experiment.
Publications
Publication n° 7 :
Proteomic investigation of biomarkers in disease caused by organic contaminant exposures on an
estuarine copepod species
K. Cailleaud 1, 2, 3, P. Cosette4, H. Budzinski1, S. Souissi2, J. Forget-Leray3
2. Ecosystèmes Littoraux et Côtiers (UMR 8013 CNRS), Université des Sciences et Technologies de Lille, 32
av. Foch, 62930 Wimereux, France.
4. Bacteria Immobilization, Biofilms and Resistance Group, UMR 6522 CNRS, Université de Rouen, 76821
Mont-Saint-Aignan, France.
Abstract:
Finding powerful biomarkers suitable for biomonitoring studies in order to clearly assess the water
quality and the physiological status of aquatic organisms constitutes a primordial challenge for the next years in
ecotoxicology. Proteomics has been used in Eurytemora affinis as a preliminary screening of protein expression
modifications induced by organic contaminants. The copepods were exposed in a continuous flow through
system during 86 hours to environmental relevant concentrations of single class contaminants representative of
the Seine Estuary’s pollution (PAH mixture: 500 ng.L-1, PCB mixture 300 ng.L-1, Diuron: 500 ng.L-1,
ethinylestradiol: 10 ng.L-1, carbamazepine (CBZ): 500 ng.L-1, alkylphenol (APs) mixture: 1000 ng.L-1). Twodimensional gel electrophoresis (2-DE) of whole body copepod extracts revealed that all contaminants tested
induced modifications in protein expression. In total, 105, 59, 122, 278, 118 and 86 proteins were differentially
expressed in copepods respectively after PAH, PCB, diuron, AP, EE2 and CBZ treatments. From these proteins,
87 were excised and 14 were identified using MS/MS micro-sequencing and MS BLAST database searches. The
results indicate that short term exposure to organic contaminants at environmental relevant concentrations altered
protein expression in copepods through energetic metabolism, cell defense mechanisms and Ca2+ homeostasis.
Among the identified proteins, HSP 60 and aconitase might represent valuable biomarkers to be used in the
assessment of the water quality.
Keywords: Eurytemora affinis, Organic contaminants, Protein identification, Biomarkers
Soumise à Molecular and Cellular Proteomics
Publications
1. Introduction
Most of human activities introduce organic micro-pollutants into aquatic environments, particularly in
North-Atlantic estuaries which are generally under high anthropic pressure because of their strategic
geographical position and their economical importance. Thus, estuaries receive large quantities of organic
contaminants from various sources including industrial discharges, urban and agriculture runoff, atmospheric
deposition and other sources (Motelay-Massei et al., 2004). The detection of these contaminants in aquatic
ecosystems could cause deleterious effects in aquatic biota and have been frequently associated with biochemical
and physiological diseases in aquatic organisms (Fossi and Marsili, 2003; Landrum et al., 2003) which might
represent a risk for these populations and the local food web. Therefore, in recent years, there has been
considerable interest in the development of biomonitoring programs in order to identify the incidence of
exposure and effects caused by xenobiotics. Most of ecotoxicological research is usually based on the study of
biochemical biomarkers (UNEP, 1997) which are define as a “biochemical sublethal change resulting from an
individual exposure to xenobiotics” (Lagadic et al., 1994). Thus, biomarkers can be used to assess the health
status of aquatic organisms and to detect early warning responses of environmental risks (Payne et al., 1987).
However, at that time, most of the biomarkers have been developed under laboratory controlled toxic conditions,
in general very different of those observed in the field. Moreover, such approaches are frequently discussed
because of the deficiency or the specificity of the selected biomarkers in relation to the diversity and the
variability of the contaminants and the abiotic factors (Wu et al., 2005; Forbes et al., 2006). For these reasons,
the use of a battery of biomarkers of contaminant exposure and effects are recommended in biomonitoring
programs (Cajaraville et al., 2000). Besides, most of the biomarkers which have been developed present, at that
time, a great instability of response and some of them are not applicable to invertebrates because sufficient
material cannot be obtained for analysis.
In order to observe and to understand the physiological and biochemical effects of organic contaminants on
aquatic organisms but also to identify new biomarkers of contaminant exposure, a proteomic approach may
constitute a good alternative to classical biomarkers. Thus, adaptation to environmental stress, which could be
induced by contamination, includes changes in protein expression which may be due to transcriptional,
posttranscriptional and posttranslational modifications (Stegeman et al., 1992; Bradley et al., 1994). The
proteome consists of all the proteins produced from all the genes of the genome (Anderson and Anderson, 1998).
According to Lottspeich (1999), a proteome represents the bulk of proteins of an organism, a cell, an organ, or
even a body fluid, determined quantitatively at a given moment and under precise conditions. Proteomic opens
new horizons in many research areas of life sciences. This is particularly true for research efforts in the field of
medicine (Ho et al., 2005; Vlahou and Fountoulakis, 2005) but also in ecological and ecotoxicological programs
(Apraiz et al., 2006). Therefore, the proteome is increasingly being studied to identify key molecules involved in
normal physiological pathways, as well as in disease (William and Hochstrasser, 1997).
Several studies have reported the strong contamination of the Seine Estuary by organic micro-pollutants
especially by neurotoxic, carcinogenic and estrogen like compounds (Fernandez et al., 1997; Cailleaud et al.,
submitted). In spite of this high chemical stress, a planktonic micro-crustacean species, Eurytemora affinis,
characteristic of all north-Atlantic estuaries, dominates the zooplankton community and presents particularly
high levels in the Seine Estuary which could be ten times higher than those observed in other estuaries (Mouny
et al., 2002). This copepod species may therefore constitute a potential sentinel species for biomonitoring studies
in estuarine ecosystems.
The objectives of this study were to observe the effects of selected contaminants, detected in the Seine Estuary,
on E. affinis at the protein level after experimental exposure at environmental realistic concentrations in a
continuous flow through system, and to find new perspectives and new biomarkers to use in water quality
assessment.
The research presented in this article is a part of an interdisciplinary program focusing on an estuarine water
quality study based on in situ and experimental investigations to assess the ecotoxicological impacts of selected
organic contaminants by considering chemical bioavailability, contaminant accumulation, and the molecular,
affinis.
According to Cailleaud et al. (submitted), the bioaccumulation of contaminants in E. affinis presents
seasonal variations. Therefore, low contaminated copepods were sampled during the lowest impacted period, in
autumn 2004. The copepods E. affinis were collected using subsurface tows of WP2 plankton net (200 µm mesh
size) at ebb tide, in Tancarville Station in the oligohaline part of the Seine Estuary. Immediately after sampling,
Publications
the copepods were sorted using 500 µm sieves in order to eliminate predators (especially Mysidacea and
Gammaridae), then transferred into isotherm containers using filtered estuarine water and brought back to the
laboratory for further precise sorting in order to exclude particulate from the sample.
The experimental system described in Fig. 1 is composed of three compartments: the water reservoirs,
the exposure tanks containing the copepods and a recycling tank to remove contaminants from water using
activated carbon. All the tanks used during the experiments are glass material disinfected and washed before the
use. The three compartments are link together by a peristaltic pump that draws up contaminated water from the
water reservoirs to the exposure tanks and eliminates excess water from the exposure tanks into the recycling
tank. Contaminant concentrations in the water reservoirs and in the exposure tanks are identical. Furthermore, in
order to avoid aspiration of copepods by the peristaltic pump, a volume of approximately 5 cm3 around rubber
tubing extremities were capped with 50 µm mesh.
The present study is concerned primarily with the effect of organic contaminants in E. affinis exposed to
low levels of dissolved PAHs, PCBs, nonylphenol (4NP) /nonylphenol acetic acid (NP1EC), ethinylestradiol
(EE2), carbamazepine (CBZ) and diuron. Because of the highly hydrophobic properties of these compounds,
concentrations in the water may differ from nominal concentrations. To ensure that the real exposure
concentrations are within an acceptable range from the selected nominal concentrations during all the
experiments, preliminary tests have been performed with the exposure system before the exposure start in order
to determine the appropriate experimental conditions to saturate the tanks and the rubber tubing with
contaminants. Before each exposure experiment, the system is saturated using the experimental conditions. The
stock solutions of contaminants were prepared at high concentrations in acetone in order to introduce low
volumes of solvent in the water (≈ 15 µL of acetone/L of water). Contaminant solution was weighed in glass vial
and manually introduced in the water reservoirs and in the water of the exposure tanks at the beginning of the
saturation period using glass pipette in order to reach the appropriate experimental concentrations. The same
quantity of the contaminant solution (in acetone) was introduced in the waters of the reservoirs and of the
exposure tanks in order to reach the same contaminant concentrations. Then the water was gently stirred and the
flow through system was activated. When the reservoirs were empty, the peristaltic pump was stopped for 15
minutes in order to refill the reservoirs with water. The water of the reservoirs was then contaminated with the
contaminant solution as previously described and the peristaltic pump was primed again.
After sorting by photo-attraction as previously described (Cailleaud et al., accepted), the copepods were
maintained in the laboratory for an acclimatization period of three days in a 300 L hydrodynamic canal under
controlled conditions (salinity: 15 PSU, temperature: 10 °C, photoperiod: 12/12H). The hydrodynamic canal
contained freshly filtered sea water (GF/C Whatman filter, 0.45 µm) sampled in the English Channel mixed with
ultra-pure water in order to reach the selected salinity of 15 PSU. The same water preparation was used for
exposure experiments. During the detoxification period, copepods were fed twice a day with algal mixtures
(Rhodomonas marina and Isochrysis galbana). Then, copepods were transferred into the experimental
continuous flow through system. Six copepod groups were exposed simultaneously in separate microcosms to a
mixture PAHs (Phenanthrene: 60 ng.L-1, Pyrene: 95 ng.L-1, Chrysene: 95 ng.L-1; Benzo[b,k]Fluoranthene: 170
ng.L-1, Benzo[a]pyrene: 80 ng.L-1), a mixture of PCBs (52: 45 ng.L-1, 101: 65 ng.L-1, 87: 25 ng.L-1;118: 50 ng.L1
, 153: 50 ng.L-1, 138: 50 ng.L-1, 180: 15 ng.L-1), a mixture of alkylphenols (NP1EC 520 ng.L-1, 4 NP 480 ng.L1
), to EE2 (10 ng.L-1), to carbamazepine (500 ng.L-1) and to diuron (500 ng.L-1) during 86 hours. In parallel, a
control group was maintained in a continuous flow through system in clean water. Contaminant concentrations
for the experiments have been determined according to contaminant levels measured in a two years study in the
water column of the Seine Estuary (Cailleaud et al., submitted). During the exposure experiments, food was not
provided to the copepods and therefore was not a source of sorption and another route of transfer for
contaminants to the copepods. Some copepod aliquots (exposed and non-exposed organisms) were sampled and
immediately frozen in liquid nitrogen at the end of exposure experiments for proteomic analysis.
2.4. Protein extraction
- Preparation of protein extracts
Proteins were extracted according to the method developed by Forget-Leray et al. (submitted). Briefly,
pools of approximately 500 mg wet weight of whole-body copepods were homogenized on ice, in ice-cold tris
HCl buffer 50 mM pH 7.5 (1/3, v/w) composed of EDTA (2 mM), glycerol (10 %), magnesium acetate (5 mM),
dithiothreitol (DTT) (1 mM) and aprotinin (0.1 %) using an Ultra-Turax homogenizer followed by
Publications
ultrasonication. Cellular debris were then removed by centrifugation (9,000 × g for 15 min at 4°C). Then,
supernatants were collected and centrifuged at 105,000 g for 1 hour at 4 °C. Final supernatants were collected
and precipitated with trichloroacetic acid (50%) for 45 min. The precipitated proteins were centrifuged at 9,000 g
for 30 min at 4 °C, washed with acetone and then resuspended in a hydratation buffer composed of 9 M urea, 55
mM CHAPS and 110 mM DTT. The protein amounts in the extracts were then evaluated according to the
method of Bradford (1976).
- Two-dimensional gel electrophoresis
Depending on the final staining techniques, 150 µg of total protein extracts (silver nitrate staining) or
750 µg of total protein extracts (blue colloidal staining) in hydratation buffer were then added to an IEF buffer
composed of 1 % (v/v) IPG carrier ampholytes (pH 3.5–10; Sigma) and 0.4 % (w/v) Orange G (Sigma). The first
dimension gel separation was carried out with nonlinear Immobiline Dry Strips (18 cm, pH 3–10, nonlinear,
Amersham Pharmacia Biotech) using a Multiphor II apparatus (Amersham Pharmacia Biotech). IEF was
performed using the following parameters: increase to 500 V in 1 minute, 500 V for 5 hours, increase to 3500 V
in 5 hours and 3500 V for 9 h 30 (1 mA, and 5 W constants) for a total of 53.3 kV. The second dimension
consisted of SDS–PAGE using 12 % (w/v) polyacrylamide resolving gels using a Protean Plus Dodeca Cell
(BioRad) (width, 19 cm; length, 20 cm; thickness: 0.75mm). After migration, proteins were visualized by silver
nitrate staining (developing time: 10 min) for gel analysis.
- Gel analysis
Four to six gels were realized for each exposure condition. Gels were scanned using the ImageScanner
(Amersham Pharmacia Biotech) and analyzed using the Melanie software (ImageMaster™ 2D Platinium version
5.0; Amersham). The four to six 2-DE gel replicates were matched together to form a standard (synthetic) image
consisting of spots present in at least three of the six (or four) replicate gels. Standard gels of exposed copepods
were then compared to the one of non-exposed copepods for differential expression analysis. The quantification
of each spot was expressed as volume on a Gaussian image (area of the spot multiplied by the density). The
differences between protein expression in non-exposed copepods and in copepods exposed to the selected
contaminants were statistically analyzed by the STATISTICA Software v6.0 (Statsoft. Inc., 2002). To compare
two groups, the non parametric Mann-Whitney U test was used. In all cases, the level of significance (p) was set
to 0.05.
- Trypsin digestion and mass spectrometry
After 2-DE, protein spots were visualized by staining with 0.1% (w/v) Coomassie brilliant blue G-250.
Spots of interest were excised from the polyacrylamide gel. Gel plugs were washed two times with 100 µL of
NH4HCO3 buffer (25 mM) and then dried with acetonitrile (ACN). After DTT reduction, these plugs were
incubated in the dark with iodoacetamide (25 mM) for 45 min at room temperature and totally dried using a
SpeedVac centrifuge for a few minutes before the trypsin solution, 10 µl of 15 ng/µL sequencing-grade trypsin
(Boehringer–Mannheim, Mannheim, Germany) in 25 mM NH4HCO3 buffer, was added. After rehydration with
the enzyme solution, buffer solution was added to cover gel pieces and digestion was allowed to proceed
overnight at 37 °C. Peptides were extracted by adding two times 30 µL of trifluoroacetic acid (TFA, 0.1 %, v/v)
and 30 µL of ACN. These fractions were pulled, concentrated to few µL in a vacuum centrifuge and then
redissolved in 10 µl of a buffer containing 5 % of ACN (v/v) and 0.2 % of formic acid.
Sequence fragments were determined using automated nanoLC/MS/MS. Injections of 5 µL of the
sample were performed onto a LC Packings Ultimate nanoLC (Dionex-LCPackings). Peptides were enriched and
desalted on a reversed-phase analytical column (RP-C18) and the chromatographic separation was performed
using a C18 Pep-Map column (75 µm i.d. × 15 cm). Peptides were separated using a mixture of ACN (2
%)/formic acid (0.1%) (A) and a mixture of ACN (95 %)/ formic acid (0.2 %) (B) as mobile phase. The solvent
program started with an initial B concentration of 5 % linearly increased to 50% in 45 min with a constant flow
rate of 200 nl/min. The eluent was analyzed on a Q Trap equipped with a nanospray source (Applied
Biosystems). The peptide fingerprints were matched against protein database using MASCOT software.
Moreover, the amino-acid sequences obtained were used to carry out a MS BLAST search to identify proteins by
sequence similarity against the available sequence database.
3. Results
3.1. Protein expression
Using a proteomic approach, the response of E. affinis to six organic contaminant exposures at
environmental realistic concentrations (PCBs: 250 ng.L-1; PAHs: 500 ng.L-1; diuron: 500 ng.L-1; EE2: 10 ng.L-1;
Publications
carbamazepine: 500 ng.L-1; and a mixture of 4-nonylphenol/NP1EC (APs): 1000 ng.L-1) was investigated.
Typical protein patterns obtained after 2-DE are presented in Fig. 2 (one gel obtained for copepods exposed to
AP mixture (A) and one gel for non-exposed copepods (B)). On average, 640 ± 169 protein spots per gel were
detected using silver nitrate staining and ImageMaster™ 2D Melanie Software (880 ± 22, 390 ± 18, 787 ± 21,
819 ± 25, 472 ± 25, 566 ± 36 for non exposed copepods; 481 ± 31; 556 ± 16; 834 ± 40; 775 ± 21; 761 ± 26 and
352 ± 28 for copepods exposed respectively to PAHs, PCBs, APs, diuron, EE2 and CBZ). The semi quantitative
analysis of the gels using computer assisted image analysis allowed to compare differential protein expression
between non-exposed copepods and copepods exposed to the selected contaminants. Statistical analyses (Man
Whitney U test) were applied to compare the average ratios of expression from the spots in the control copepods
and in the exposed copepods. Moreover, in order to determine non ambiguous differential protein expression
between non-exposed and exposed copepods, a cutoff value set to 20 % (for both up and down regulation) was
selected that allows to cleanly separating the two populations. Therefore, only proteins which present significant
up- or down-regulation higher than 20 % were considered in this study. Thus, the analysis of the gels showed
that all contaminants induced significant changes in protein expression profiles. A total of 105, 59, 122, 278, 118
and 86 proteins were reported to be significantly either over- or under-expressed (p<0.05 and up- or downregulation > 20 %) respectively after PAH, PCB, diuron, AP, EE2 and CBZ treatments. The exposure to diuron
induced the highest number of changes whereas exposure to PCBs caused the lowest effects on protein
expression.
Changes in the protein expression patterns induced after exposure to PAHs, PCBs, APs, diuron, EE2
and CBZ are presented in Table 1. As a general tendency, copepods exposed to PAHs and diuron showed
increasing protein expression levels in comparison with non-exposed copepods. Among the proteins which
presented differential expression levels, 86 % and 91 % were up-regulated in copepods exposed respectively to
PAHs and diuron. In total, 85 and 252 proteins, respectively after PAH and diuron treatments, presented an
increase in expression between 1.2 to-4 fold. Besides, 5 and 2 proteins in copepods exposed respectively to
PAHs and diuron were up-regulated over 4-fold. The down-regulated set was formed by 15 and 24 spots
respectively after PAH and diuron exposures, and all of them exhibited decreasing protein expression between
1.2- and 4-fold.
An increase tendency has been observed in copepods exposed to EE2 and CBZ, with a reduction in protein
expression levels in comparison with non-exposed copepods. Thus, among proteins which presented altered
expression levels, 85 % and 99 % were down-regulated in copepods exposed respectively to EE2 and CBZ.
Reduction of protein expression levels after EE2 and CBZ treatments was distributed as follows: 99 and 79
proteins were down regulated between 1.2- and 4-fold respectively for copepods exposed to EE2 and CBZ.
Furthermore, 1 and 6 proteins were highly under-expressed (over 4-fold) in copepods exposed respectively to
EE2 and CBZ.
Copepod exposed to PCBs and APs presented a similar number of proteins up- and down-regulated. Among the
proteins that presented significantly altered levels after PCB exposure, 49 and 51 % of them were respectively
up- and down-regulated with increasing and decreasing expression levels between 1.2- and 4-fold. In addition,
43 % and 57 % of statistically differentially expressed proteins of copepods exposed to APs were respectively
over- and under-expressed, all of them with up- and down-regulation between 1.2- and 4-fold.
Studying in parallel the effect of each contaminant exposure indicated that these treatments had significant
effects in specific proteins for each contaminant exposure but also effects in proteins in common to all
contaminant exposures (Table 1). Thus copepods exposed to diuron and PAHs presented the highest quantity of
spots in common (19 spots) with only up-regulated proteins. In contrast, copepods exposed to CBZ and PCBs
shared the lowest number of spots (2 spots) which were all down-regulated. Besides, some spots were found to
be significantly differentially expressed in more than two exposure conditions (Table 2). Two sets of 5 and 15
proteins were significantly up- or down-regulated respectively by 4 and 3 tested contaminants (Table 2).
However, most of the proteins had significant altered expression in only one direction.
3.2. Protein identification
New 2-DE gels were realized using colloidal Coomassie Blue-G250 staining for protein identification.
In comparison to silver staining nitrate between 25 to 40 % of spot proteins were not detected when revealing
proteins using colloidal Coomassie Blue G250 staining. A total of 87 spots among the 768 protein spots that
were differentially expressed after exposure to the selected contaminants were excised. A total of 14 spots were
identified using nanoelectrospray MS/MS micro-sequencing and MS BLAST search by sequence similarity
(Table 3). The name and the characteristic of the identified proteins are described in Table 3. Among the
remaining unidentified proteins, the majority could not be identified due to poor MS/MS data, or for some
others, to the lack of correction between fragmentation data and sequences present in protein databases.
The data from 14 identified spots corresponding to 13 different proteins are summarized in Table 3. Sequence
information of several peptides has been obtained and submitted for homology searches in available databases.
Publications
The proteins identified in this work are in the one hand specific of one contaminant exposure or in the other hand
in common to several contaminants tested. Among the identified proteins, 7 out of a total of 14 were specific of
one contaminant tested: spot 1, 4, 5, 6, 10, 11 and 13 (Table 3). The first spot (number 1) has been identified as
creatine kinase by homology to a Chicken protein and was down-regulated after exposure to EE2. The spot
number 4 has been identified as being related to cyclophilin-like protein of Bombyx mori and was up-regulated
after exposure to PCBs. The spots number 5, 6, 10, 11 and 13 have been identified respectively as arginine
kinase, calreticulin, elongation factor 2, 20S proteasome subunit and ethylmalonic encephalopathy 1 (ETHE1)
by homology to the respective proteins of Artemia franciscana, Bombyx mori, Aurelia aurita, Saccharomyces
cerevisae and Xenopus tropicalis. These proteins were respectively down-regulated after exposure to EE2 (spot 5
and 6), up-regulated after exposure to PCBs (spot 10), down-regulated after exposure to APs (spot 11) and
down-regulated after exposure to EE2 (spot 13).
The others identified proteins were in common to two or more contaminants. The spot 2 was up-regulated after
exposure to PAHs and down-regulated after exposure to EE2 and was identified as creatine kinase by homology
to Chaetopterus variopedatus protein. Spots 3 (up-regulated by diuron and down-regulated by APs), 7 (upregulated by PAHs and down-regulated by EE2), 8 (down-regulated by PCBs and up-regulated by both PAHs
and diuron), 9 (down-regulated by PCBs and up-regulated by diuron), 12 ( up-regulated by diuron and downregulated by EE2, CBZ and APs) and 14 (down-regulated by both PCBs and EE2) were identified respectively
as peptidylpropyl isomerase F by homology to Danio rerio proteins, HSP 60 by homology to Anemonia viridis,
aconitase by homology to Daphnia pulex, glyceraldehyde-3-phosphate deshydrogenase by homology to Daphnia
pulex, sarcoplasmic calcium-binding protein by homology to Penaeus sp and as alccol deshydrogenase zinccontaining by homology to Pseudomonas putida.
Among differentially expressed proteins, the 14 identified proteins exhibited essentially three cellular
functions: energetic metabolism (arginine kinase, creatine kinase, glyceraldehyde-3-phosphate deshydrogenase,
aconitase), Ca2+ homeostasis (calreticulin, sarcoplasmic calcium-binding protein) and cellular stress responses
(20S proteasome subunit, HSP 60).
4. Discussion
The adaptation to environmental pollution, in the same way as to other biological stress, involves
changes in protein expression which can be induced specifically in response to a particular contaminant and also
in a dose-dependant manner (Bradley et al., 1996). To date, few works have reported changes in protein
expression patterns in organisms exposed to environmental contaminants (Shepard and Bradley, 2000; Shepard
et al. 2000; Bradley et al., 2002; Meiller and Bradley, 2002; Shrader et al., 2003; Apraiz et al., 2006; Jonsson et
al., 2006). The proteomic approach developed in the present study shows that organic contaminants can alter
protein expression profiles in a copepod species, even at environmental relevant concentrations. To date, few
works have reported the effects of environmental pollutants on aquatic invertebrate proteins, the majority of the
studies being conducted on mollusk species (Apraiz et al., 2006; Jonsson et al., 2006). To our knowledge, only
one study has reported effects of contaminant exposure on the proteome of a crustacean species (Sylvestre et al.,
2006). Kimmel and Bradley (2001) have used the proteomic approach to observed altered protein expression
profiles induced by salinity stress in E. affinis. However, these authors have studied only the variations of the
protein expression profiles and no protein has been individually identified using micro sequencing techniques.
The present study shows that in the one hand some proteins could be specifically up- or down-regulated
by one contaminant, which is the case for the majority of the proteins. In the other hand, some other proteins can
also be altered in a similar or a different manner by several contaminant exposures. Our experiments indicated
that diuron exposures induced the highest protein expression variations with almost 3-fold more proteins altered
in comparison to other contaminant treatments, while PCB exposures present the lowest effects on the copepod
protein expression. However, few proteins among the significantly altered ones by contaminant exposure, either
specific or in common to several contaminants, have been identified so far.
Among the cellular pathways altered by organic contaminant exposures, three metabolic processes were
principally involved: cellular energetic supply, Ca2+ homeostasis, and stress-mediated cell damages. Thus, 5
proteins involved in the cellular energetic metabolism, the aconitase (Krebs cycle), the arginine kinase (cellular
ATP buffering), the creatine kinase (cellular ATP buffering), the glyceraldehyde-3-phosphate deshydrogenase
(glycolysis) and the alcool deshydrogenase zinc-containing (glycolysis), which expression were altered by
contaminant exposures, have been identified. These enzymes involved at different levels of ATP supply were
essentially down-regulated after exposure to EE2 and PCBs. The decreasing levels of alcool deshydrogenase
zinc-containing observed in E. affinis exposed to PCBs and EE2 might be related to a diminution of the
metabolic activity as reported by Agarwal et al. (1982) in mice exposed to phtalates. The down regulation of
glyceraldehyde-3-phosphate deshydrogenase/ alcool deshydrogenase zinc-containing, two enzymes involved in
the second phase of the glycolysis, and of aconitase, involved in the tricarboxylic acid cycle (Krebs cycle), could
also indicate a redirection of carbon flux from glycolysis to the pentose phosphate pathway which resulted in
Publications
NADPH regeneration. PCB exposures could induce oxidative stress which implies the use of NADPH as
reducing equivalents by the thioredoxin and glutaredoxin antioxidant systems (Godon et al., 1998; Grant et al.,
1999; Shenton and Grant, 2003). Previous studies have reported the induction of oxidative stress response and
antioxidant defense in marine organisms consecutive to PCB exposures (Rodriguez-Ariza et al., 2003; VegaLópez et al., 2006). Among these oxidative stress defense mechanisms the glutathione reductase uses the
NADPH to convert oxidized glutathione into its reduced form. In addition, both mitochondrial and cytosolic
aconitase are targets of oxidants in cells due to the oxidant-mediated loss of Fe from the 4Fe-4S cluster.
Different oxidants can inactivate aconitase, resulting in a decreasing energy production in mitochondria.
Moreover, some studies have indicated that aconitase constitute a sensitive marker of oxidative damage during
aging, Parkinson’disease and iron deficiency anemia (Gardner and Fridovich, 1992; Yan et al., 1997). A simple
spectrophotometric assay is also available in order to measure the aconitase enzymatic activity. This result
constitutes an interesting perspective in the identification of new biomarkers of chemical stress which could be
easily applied to environmental biomonitoring program.
In opposition to the first observations made for PCB exposures, the glyceraldehyde-3-phosphate
deshydrogenase exhibited slight increasing levels after diuron exposure. This contaminant exposure could induce
cellular stress associated with a higher activity of defense mechanisms which increase the cellular energy
demand.
Furthermore, both arginine kinase and creatine kinase, two enzymes which catalyze the buffering of
ATP in cell in relation with energy transactions, were down-regulated after exposure to EE2. These enzymes are
involved in the transfer of a phosphoryl group between ATP and an “energy storage” phosphagen (creatine,
arginine) which protect the cell from ATP levels that would not sustain other essential functions. The decreasing
levels of these enzymes induced by EE2 exposure might indicate an increase of cellular energy demand which
might be induced by a physiological stress. The expression variations of the proteins involved in the energetic
metabolism constituted evidences of the general physiological status of the copepods after exposure to
environmental relevant contaminant concentrations.
A sarcoplasmic calcium-binding protein and calreticulin, two proteins involved in Ca2+ homeostasis
were down-regulated after exposures to EE2, CBZ and APs. Calreticulin, a major Ca2+ binding chaperone in the
endoplasmic reticulum, is a key component of the calreticulin/calnexin cycle which is responsible for the
modulation of Ca2+ levels in the endoplasmatic reticulum and in the cytosol (storage and release), for the folding
of newly synthesized proteins and glycoproteins and for quality control pathways in the endoplasmic reticulum
(Marechal et al., 2004). The sarcoplasmic calcium-binding protein is a similar protein localized in muscular cells
of both vertebrates and invertebrates. Previous studies have reported that the oxidative-stress mediated alteration
of Ca2+ homeostasis could induce actin cytoskeleton disruption (Dalle-Donne et al., 2001; Gómez-Mendikute et
al., 2002). The decreasing levels of calreticulin and sarcoplasmic calcium-binding protein observed after EE2,
CBZ and AP exposures induced increasing levels of free Ca2+ concentrations which activate some protease
which could hydrolyse the actin filaments and the proteins anchoring to the cell membranes. These protein
expression variations gave complementary information on the physiological status of the copepods after organic
chemical stresses.
Finally, contaminant exposures induced stress-mediated protein responses in the estuarine copepod E.
affinis. Heat shock proteins (HSPs) act as molecular chaperones, promoting the initial folding of other proteins at
the ribosome and the refolding of unfolded proteins when they are partially denaturated. Increasing levels of
HSPs are observed in response to environmental stresses (Gonzalez and Bradley, 1994) as well as to chemical
exposures (Steiner and Pickwell, 1993). These proteins act to prevent protein aggregation and to maintain the
functional conformations of the proteins. Thus, HSP 60, such as all HSPs in general, is a general marker of
multiple stress exposures. Snyder et al. (2001) have reported significant induction of HSP 60 in mussels exposed
to hydrocarbons. Similar results were obtained in our study since PAH exposures induced in a 2-fold manner the
level of HSP 60. These protein variations can be easily studied in biomonitoring studies using immuno-detection
techniques (Western Blot) analysis and constitute therefore a potential biomarker of environmental organic
pollutant exposures.
Furthermore, recent data have shown new functions for the aconitase protein which is also involved in
the mitochondrial DNA (mtDNA) maintenance and inheritance (Chen et al., 2005). These authors have shown
that the suppression of mtDNA instability of cells was related to the aconitase expression. Moreover,
experiments with ethidium bromide (E.B.) (a powerful mutagen) have shown that the E.B. hypersensitivity of
cell can be suppressed by over-expression of aconitase. This functional property of aconitase is independent of
the aconitase catalytic activity. This protein switches between an enzymatic and RNA binding form on the basis
of the assembly or disassembly of the 4Fe-4S cluster. According to these results, environmental genotoxicants
might induce the increase of the mitochondrial aconitase level. In the present study, both PAH and diuron
exposures induced increasing aconitase levels. Many studies have reported the genotoxicity of PAHs (Cachot et
al., 2006) which might explain the variations of aconitase concentrations in order to prevent mtDNA from these
highly reactive molecules. The analyses of the aconitase levels can be easily conducted using Western Blot
Publications
technique and represent also a susceptible biomarker in order to detect the presence of some specific genotoxic
in aquatic ecosystems.
One other protein of interest, the proteasome complex subunit, was identified and presented downregulation after exposure to APs. This enzymatic complex is involved in the proteolysis of proteins and plays a
crucial role in the maintenance of appropriate levels of short-lived proteins and regulatory proteins involved in
cellular metabolism, heat shock, stress response and cell cycle regulation… Some studies have reported that
chemical exposures generate abnormal proteins and that exposed organisms face it by increasing the level of
enzymes able to degrade these proteins, among which the proteasome subunit might play an important role
(Sylvestre et al., 2006). However, our results are difficult to interpret since this protein was down-regulated after
exposure to APs.
The last protein of interest, the ethylmalonic encephalopathy 1, was down-regulated after exposure to
EE2. This protein suppresses p53-induced apoptosis induced by DNA damaging agents (Higashitsuji et al.,
2002) which is considered as the ultimate tumor suppressor gene. These results suggest an increase of cellular
p53-induced apoptosis after exposure to EE2 which underlines a cellular stress which might imply cell apoptosis.
To conclude, this study demonstrates that exposure to organic contaminants at environmental relevant
concentrations can altered protein expression of copepods. Besides, the high resolution of 2-DE enhanced the
detection of novel biomarkers which might be suitable and powerful in estuarine water quality assessment.
However, relevant biomarkers may be present at very low concentration and masked by much more abundant
unrelated proteins. New protein separation methods and improved software may help to solve some of these
challenges.
Acknowledgements
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Figure 1: Schematic view of the laboratory flow through system. (P: peristaltic pump, AP: alkylphenol, EE2: 17α-ethinylestradiol, CBZ: carbamazepine, Ctrl: control). Concentrations in the reservoir tanks and in the exposure
tanks are identical.
Publications
Figure 2: Typical protein expression profiles in 2-DE gels obtained from pools of E. affinis exposed to selected
contaminants in a flow through system. One gel of copepods exposed to the mixture of 4 NP and NP1EC (A) and
one gel of the non exposed copepods are presented as example. The differentially expressed proteins in the
exposed copepods in comparison to the non-exposed copepods which have been identified using nanoLC
MS/MS are overlapped. (spot numbers refer to those reported in Table 3 with the associated protein
identification).
Publications
Table 1: Number of spots differentially expressed in the six exposure conditions organized by total number of
spots differentially expressed in each group, number of spots up- or down-regulated classified in two groups (1.2
to 4-fold and more than 4-fold) and number of up- or down-regulated spots that are common between two
exposure conditions.
Contaminants
Total
spots
proteins
differentially
expressed
PAHs
481 ± 31
105
PCBs
556 ± 19
59
APs
834 ± 48
122
Diuron
775 ± 21
278
EE2
761 ± 26
118
CBZ
352 ± 32
86
Up or down- Average ratio Average ratio
vs. PAHs
regulation
(1.2-4)
(4<)
vs. PCBs
vs. APs
vs. Diuron
vs. EES
vs. CBZ
90
85
5
3
6
19
9
3
15
15
0
1
3
0
2
2
29
29
0
2
2
3
0
0
20
20
0
2
3
4
4
2
52
52
0
1
1
2
3
1
70
70
0
8
4
7
11
7
254
252
2
19
7
9
11
5
24
24
0
0
0
0
1
1
18
17
1
1
0
1
3
0
100
99
1
10
4
13
9
8
1
1
0
0
0
0
1
0
85
79
6
5
2
8
5
8
Table 2: List of the protein which exhibit common significant variations between all the exposure conditions
(positive data represent up-regulated proteins and negative data represent down-regulated proteins).
Treatments
diuron
AP
PAH
PCB
EE2
CBZ
-1.3
-2.1
average ratio
Diuron vs AP vs PAH vs PCB
1.5
-1.3
Diuron vs AP vs EE2 vs CBZ
2.1
-1.3
Diuron vs AP vs EE2 vs PAH
2
-1.5
2
diuron vs EE2 vs PAH vs carba
1.3
-2
-1.4
-1.9
4.2
4.3
1.4
diuron vs PAH vs CBZ
1.6
1.4
diuron vs EE2 vs carba
-1.4
AP vs PAH vs PCB vs CBZ
diuron vs PAH vs PCB
diuron vs EE2 vs PAH
2
1.5
-2.3
1.8
-1.3
-2.4
-2
-2
2
2.2
-1.3
1.7
1.9
1.3
diuron vs AP vs PAH
1.4
diuron vs PAH vs PCB
2.7
diuron vs AP vs EE2
1.8
-1.3
-1.8
-2.1
1.6
3.4
-2.4
1.3
1.6
AP vs EE2 vs PAH
-1.6
-1.6
AP vs PAH vs CBZ
1.6
-2.1
AP vs EE2 vs CBZ
-1.4
-1.7
-4
-2.1
-1.4
-1.9
AP vs EE2 vs PAH
-1.3
AP vs EE2 vs PCB
-1.3
2
-1.5
AP vs PCB vs CBZ
-1.3
-1.6
-2.9
-2.4
-1.2
-1.7
-2.6
Contaminants
Peptide fragments
PCBs
PAHs
Diuron
EE2
CBZ
APs
(1) Creatine kinase
(l=180)
-
-
-
0.5
-
-
(2) Creatine kinase
(length 409)
-
2.1
-
0.7
-
(3) Peptidylpropyl
isomerase F
-
-
1.5
-
-
BLGYSEVELVZ
63
BLLSMZEGGDVK
SGFTL
47
33
-
LVWVNEEDHTR
WEFMW
AAALYY
LLWVNEEDZTR
WEFLW
AASLYY
69
43
37
0.5
KVFFDLTAGGNPVGR
GGDFTNHNGTGGK
KHVVFGQVVE
KKVEGFGSSSGK
FFICTA
KIIIADCG
TSWLDGK
GSQFFI
NAGPNTNGSQ
KHTGAGC
YGYK
RVIPGF
BVFFDVTADGAPVGR
GDNFTNHDGTGGK
BHVVFGZVVE
BZVESFGSZSGK
FFLCTA
ZLVVADCG
TZWLDGK
GSZFFL
NAGNPTNGSZ
BHGGAGC
YGYK
BVLPGY
79
72
69
57
46
43
41
39
39
36
33
33
RVFFDVTVDDAPLG
RHVVFGNVVEG
NKFEDENFTLK
TNGSQFFIT
GSQFFITTVK
BVFFDVTADGAPVG
BHVVFGZVVEG
NNFEDENFALK
TNGSZFFLT
GSZFFLCTAK
79
77
75
55
36
RIISMQKGGDLK
BLLSMZZGGDVK
67
YDISNK
YDLSNK
44
-
ITDDPAAAK
GLDLWQVK
KHEQDIDCGGGYLK
FYALS
LTDDPAAAK
GLDLWZVK
BHEZNLNFAGGYVK
FYALS
61
55
49
36
-
KIGGSSEVEVNEK
RVTDALNATR
EEAGDGTTTATVLAR
RAAVEEGIVP
KVEYQDCLVLLCQK
KTLNDEMEVI
VGEVSITK
KAPGFGDNR
KDDTLFLRGK
VAVTLGPK
BLGGSSEVEVNEK
BVTDALNATR
EEATAGTTTTSVLAR
BGALEEGLVP
BVEYNDALVLFSEK
BTLDNDMELL
VGEVVLTK
BAPGFTANR
BDDSZFLNGK
VAVSPGPK
87
67
65
51
48
47
41
41
35
33
-
-
-
-
-
(5) Arginine kinase
-
-
-
0.8
-
-
(7) HSP 60
-
-
1.9
-
-
0.7
0.8
-
-
Sequence
coverage
(%)
Species
Functional pathways
Subcellular
localization
Chicken
energy metabolism (catalyze the buffering
of ATP in cell)
cytosol
81%
80%
83%
Chaetopterus
variopedatus
of ATP in cell)
mitochondria
55
73%
76%
80%
66%
83%
50%
85%
66%
70%
71%
100%
50%
80%
92%
100%
83%
100%
100%
85%
100%
80%
85%
100%
100%
Danio rerio
protein folding process
nucleus/
cytosol
28
71%
81%
81%
77%
60%
78%
90%
81%
100%
80%
Bombyx mori
protein folding process
nucleus/
cytosol
Artemia
franciscana
of ATP in cell)
mitochondria
Identities
Positive
substitution
72%
100%
41%
100%
75%
100%
15
81%
80%
83%
20
50%
91%
83%
100%
9
88%
87%
42%
100%
100%
100%
78%
100%
Bombyx mori
Calcium ion storage activity
Endoplasmic
reticulum
18
84%
90%
73%
60%
57%
40%
75%
66%
60%
75%
100%
100%
73%
80%
71%
90%
87%
77%
70%
75%
Anemonia
viridis
cell stress chaperones
mitochondria
5
Publications
RLGFSEVELVQ
2.1
-
Score
RVISMQKGGNMK
SGFTL
(4) Cyclophilin-like
protein
(6) Calreticulin
Homology to protein
Table 3: Data obtained from the peptide mass fingerprinting analysis of E. affinis proteins altered by exposure to
the selected contaminants (nanoLC MSMS). Spot numbers refer to those mentioned in Table 1.
Spot number protein
name
(8) Aconitase
Contaminants
PCBs
PAHs
Diuron
0.4
3.4
2.7
EE2
CB Z
APs
-
-
(9) Glyceraldehyde-3phosphate
deshydrogenase
0.78
-
1.3
-
-
-
(10) Elo ngation
factor 2
1.67
-
-
-
-
-
(11) 20S proteasome
subunit
-
-
-
-
-
0.78
-
-
2.1
0.8
0.5
0.8
(13) Ethylmalonic
encephalopathy 1
(ETHE1)
-
-
-
0.8
-
-
(14 ) Alcool
deshydrogenase zinccontaining
0.6
-
-
0.7
-
-
Homology to protein
Score
YSHLDDPSNQEIVR
YSHLDDPAGZDLVR
77
KEVYNFLSTSGAK
BEVYDFLATAGAK
72
Sequence
coverage
(%)
Identities
64%
85%
4
69%
84%
Positive
substitution
DYLVATER
DYLAATER
50
87%
87%
ASCTTNCLAPLAK
ASCTTNCLAPLAK
91
100%
100%
RVPVHDVSVVDLTCR
YVVESTGVFT
VVSTDFIGDN
WYDNEFG
KLVVNGHHIQVFSER
IGINGFGR
VHAITATQK
GVFTTLDK
LDYMVYMFK
KEASYDEI
TTVHA
PELNGK
AQNIIP
TVHAI
DGGAK
BVPTPDVSVVDLPCR
YVVESTGVFT
VVSTDFLGDD
WYDNEFG
BLVLDGHALDVFGER
LGLNGFGR
VHATTATZK
GVFTTLEK
LDYFVYFFK
BEPSYDNL
TTVHA
PELDGK
AZNLLP
TVHAL
DGGAK
75
74
65
62
60
53
51
50
48
38
36
36
36
34
33
73%
100%
80%
100%
53%
75%
77%
87%
77%
50%
100%
83%
50%
80%
100%
80%
100%
100%
100%
73%
100%
88%
100%
77%
75%
100%
100%
100%
100%
100%
KEGVLCDENMR
BEGVLCDENLR
73
81%
90%
RRGHVFEEGM
BZGHAAEESM
34
50%
60%
RYSFSLTTFSPSGK
BYSFSLTTFSPSGK
97
92%
100%
KASNGIVLATEKK
ESIEGE
EKRWNE
TPDIGM
BAGNGVVLATEZK
EALEGE
EMZWNE
TPALGM
69
35
34
34
69%
66%
66%
66%
92%
83%
66%
83%
RYM YDIDNDGFLDK
BYFYDLDLDGVLDK
62
64%
78%
KNDFECLAV
KDGEVTVDEF
VKEIDDAYDK
BTDFECLAV
BNGEVDSDEF
VZELDAAFSK
56
42
40
77%
60%
50%
88%
80%
80%
KEAILIDPVLEK
BEALLLDPVLEK
77
MNNLNLPKPK
MGDLNLPYPK
42
SGAAGAVGSIVGQIAK
SGAAGAVGHPVGZLAK
70
CGAISQYNNK
EIAGWL
CGALSTYTNK
ELAGWL
51
43
RMEGFVV
BLEGFVV
42
42
8
18
22
72%
90%
85%
100%
10
12
75%
87%
70%
83%
80%
100%
71%
85%
Species
Functional pathways
Subcellular
localization
Daphnia pulex
energy metabolism (Krebs cycle),
mitochondrial mtDNA maintenance
mitochondria/
cytosol
Daphnia pulex
second phase of glycolyse
cytosol
Aurelia aurita
Tran slational regulatory activity in protein
metabolism
cytosol
Saccharomyces
cerevisiae
multicatalytic protease complex
(degradation of intracellular protein)
nuclear/ cytosol
Penaeus sp.
Calcium homeostasie
sarcoplasm
(striated muscle
fiber)
Xenopus
tropicalis
inactivate apoptosis induced by DNA
damaging agents
nucleus/
cytosol
Pseudomonas
putida
oxid ation of eth anol to acetaldehyde
cytosol
Publications
(12) Sarcoplasmic
calcium-binding
protein (beta chain)
Peptide fragments
Table 3 (bis): Data obtained from the peptide mass fingerprinting analysis of E. affinis proteins altered by
exposure to the selected contaminants (nanoLC MSMS). Spot numbers refer to those mentioned in Table 1.
Spot number protein
name
Publications
Publication n° 8 :
Swimming behavioural response of Eurytemora affinis to the injection of potentially endocrine disrupting
compounds
K. Cailleaud 1, 2, 3, H. Budzinski1, J. Forget-Leray3, L.C. Tzeng4, J.S. Hwang4, F.G. Schmitt2 and S. Souissi2*
2. Ecosystèmes Littoraux et Côtiers (FRE 2816, CNRS), Université des Sciences et Technologies de Lille, 28
avenue Foch, 62930 Wimereux, France.
4. Institute of Marine Biology, National Taiwan Ocean University, Keelung 202, Taiwan.
* corresponding author. Tel: 0033-2-; fax: 0033-2E-mail address: [email protected] (S. Souissi)
Abstract:
In this study, changes in the swimming behaviour of the estuarine copepod Eurytemora affinis were
studied in response to the injection of low doses of an alkylphenol solution in water. The behavioural responses
were determined by image analysis using video-tracking systems. The swimming activity the swimming speeds
and the swimming angles were defined as biological endpoints. The swimming behaviour responses of the test
copepods were analyzed under normal conditions and after the injection of the alkylphenol solution (4nonylphenol/ nonylphenol-ethoxy-acetic-acid). After the injection of the contaminant solution increasing
swimming activities were observed in both males and females. The injection of the contaminants also altered the
swimming trajectories of both male and female copepods. Our results highlight the value of the swimming
behavioural disruption as a sensitive indicator of environmental contamination.
Keywords: swimming activity, trajectory, alkylphenols, copepods, escape
En préparation pour Water Research
Publications
1. Introduction
During recent decades, reproductive and developmental diseases reported for a wide range of aquatic
species (Krimsky, 2000; Vos et al., 2000; Yadetie and Male, 2002), have shifted the attention slightly towards
sources of industrial and agricultural contaminants which affect the development and physiology of exposed
organisms by interfering with the normal hormonal regulation and especially with the endocrine system.
Although all the mechanisms have not been clarified, and in spite of the lack of evidence, some potential
hormone-disrupting chemicals have been listed as priority compounds, depending on their molecular structure,
by regulating bodies such as the European Union (EU) and the Oslo and Paris Commission (OSPARCOM).
Among these molecules so called endocrine-disrupting chemicals (EDCs), alkylphenol-polyethoxylates and their
metabolites, exhibit more threatening endocrine-disrupting properties, especially due to their important toxicity
and because of their increasing concentrations in aquatic ecosystems (Thomas et al., 1999; Ferguson et al., 2003,
Isidori et al., 2006). These contaminants have become ubiquitous in the aquatic environment and are found in the
tissues of aquatic organisms (Ferrara et al., 2005; Verslycke et al., 2005). Most researches on EDCs have
focused on developmental and physiological effects. However, these contaminants can also affect sexual and
reproductive behaviour of the organisms (Howell et al., 1980; Bayley et al., 1999). Much of the evidences of
such disrupting effects come from studies on fish (Steinberg et al., 1995; Saglio and Trijasse, 1998; Clotfelter
and Rodriguez, 2006) and little is known about zooplanktonic groups although their key role at lower trophic
levels of aquatic ecosystems.
Chemosensory communication play an important role in the sexual and social behaviour of most
vertebrates, and hormones influence the development and expression of scent-producing glands and olfaction
which explains that EDCs can have adverse effects on these behaviours. Furthermore, recent studies have shown
that both mechanoreception and chemoreception were also implied in the sexual behaviour of zooplanktonic
crustacean species such as copepods (Doall et al., 1998; Strickler, 1998). Thus, a prerequisite in sexual
reproduction is to locate (or be located) a potential mate of the same species and opposite sex. For small aquatic
organisms like copepods, one of the most abundant and diverse zooplanktonic groups of crustaceans, locating
and identifying mates in large dilute volumes of water require sensory systems keenly tuned to environmental
signals. Among the three known sensory reception systems developed by copepods (photoreception,
mechanoreception and chemoreception), chemoreception is usually considered as the most likely sensory
modality to be used in mate recognition (Katona, 1973; Snell and Morris, 1993; Nihongi et al., 2004). Copepods
use dissolved and surface-bound chemical cues for mate recognition (Lonsdale et al., 1998). Thus, glycoproteins
bound to harpacticoid copepod exoskeleton surfaces (anntenule, genital pore and caudal ramus) involved in the
species and sex recognition have been characterized (Snell and Carmona, 1994; Ting et al., 2000). According to
these observations, changing external conditions like the burden of its habitat with toxic compounds induces a
stress situation by disturbing the normal functions and may possibly affect the key ecological processes
occurring at small scales (i.e. encounter rate and mating success). Such interactions are particularly relevant
since they influence population distribution and persistence.
Several European and North American estuaries are highly polluted by organic contaminants (Jonkers et
al, 2003). Among these aquatic environments, the Seine Estuary has been reported to be strongly contaminated
by organic micro-pollutants especially by neurotoxic, carcinogenic and estrogen like compounds (Fernandez et
al., 1997; Cailleaud et al., submitted). High levels of the endocrine-disrupting contaminants alkylphenol
polyethoxylate and its metabolites have been measured in the water column of the Seine Estuary and
bioaccumulated by copepods (Cailleaud et al., submitted). In spite of this high chemical stress, a planktonic
micro-crustacean species, Eurytemora affinis (calanoid copepod), characteristic of all north-Atlantic estuaries,
dominates the zooplankton community and presents particularly high levels in the oligohaline zone of the Seine
Estuary with a maximum density period in spring (>200 adult copepod/liter) (Mouny and Dauvin, 2002).
In this paper, the behavioural responses of E. affinis to the injection of EDCs were investigated. The
analysis of the behaviour of aquatic organisms in response to contaminant exposure provides a better
understanding of the likely consequences of toxic contamination than lethal effects, especially if behaviour is
disrupted at environmentally relevant concentrations. The main objective was to evaluate the potential of
dissolved EDCs to disturb individual behaviours by measuring swimming parameters of simultaneous swimming
copepods (activity, speed, angles).
This work is a part of an interdisciplinary program focusing on an estuarine water quality study based
on in situ and experimental investigations to assess the ecotoxicological impacts of selected organic
contaminants by considering chemical bioavailability, contaminant accumulation, and the molecular,
affinis.
Publications
2.1. Test contaminants
Nonylphenol-ethoxy-acetic-acid (NP1EC; purity 99%) standard was obtained from LGC Promochem
(Molsheim, France) and 4-nonylphenol (4-NP; purity > 98%) standard was purchased from Sigma-Aldrich (St
Quentin Fallavier, France). The test solution was gravimetrically prepared in acetone at respective concentrations
of 15 µg.mL-1 for both 4-NP and NP1EC. The total concentration of the test solution was of 30 µg.mL-1.
2.2. Test organisms
The copepod E. affinis was chosen as model organism because of its large distribution in all NorthAtlantic estuaries, its key ecological importance in estuarine food web and because of its high density in the
Seine Estuary in comparison to other estuaries, especially during the maximum production period in spring time
when it could reach 1,000,000 of individuals/m3 (Mouny and Dauvin, 2002).
For our experiments we used the copepod E. affinis collected in the Seine Estuary and maintained in the
Marine Station of Wimereux for several generations. This laboratory copepod species was cultured under
controlled conditions, with constant salinity (15 psu) and temperature (15 °C). Sea water collected in the
Channel was filtered using GFF microfiber filter (Whatman) and diluted in deionized water to reach the selected
salinity of 15 psu. The cultured copepods were fed with Rhodomonas sp. and Isochrysis galbana (Devreker et
al., 2006). For the exposure experiments, only adult copepods were selected.
2.3. Experimental design
The experimental set up used to track the 2D swimming behaviour consisted of a CCD infrared
sensitive video camera (DV Sony DCR-PC120E) which records the paths of a sample of 10 copepods swimming
at 25 images.s-1 in a 217 mL Plexiglas container (size: 8.5×8.5×3cm) which presents transparent sides. This
system makes it possible to obtain front side views. In order to minimize reflection, all the sides of the container
were covered with black dull plastic film to increase the contrast between the copepods and the container
background. Considering the high natural phototropism of E. affinis, the experimental system was realised in a
dark chamber to entirely exclude external sources of light in order to avoid any contamination of the observed
behaviour by any light-induced phototropism. The recording chamber was monitored under infrared spotlight
(IRS). Each IRS unit is composed of an array of 72 high power infrared light emitting diodes (LEDs) mounted
on a circuit board (9.3 cm long and 4.9 cm wide) connected to a 12 volts DC power supply. Horizontal and
vertical rulers provide the relation between pixels and millimetres.
Before the experiments, the organisms were dark-adapted at room temperature for 30 minutes. Then, ten
males and ten non ovigerous females of E. affinis were placed gently into separate 217 mL vessels at 15 psu. For
each experiment, 10 copepods/vessel were used to increase the number of copepod trajectory available in one
videotape. Each vessel was filmed for 80 minutes using the previously described experimental system in order to
observe the behavioural patterns of the copepods in the dark. The first 40 minutes of the videotape were
considered as a control and after 40 minutes, 15 µl of an alkylphenol solution was injected directly into the water
vessel without stopping the videotape in order to reach a concentration of 2 µg.L-1 close to the one observed in
the Seine Estuary.
Swimming behaviour in darkness at room temperature was digitally recorded from the videotape onto
the hard-drive of the computer with a frequency of 25 frames/s. The video was converted to bitmap files using
Adobe Premier 6 LE software in order to track the trajectory of each copepod frame by frame using the image
processing software Track-It (Iguana Gurus, Milwaukee, WI) in order to obtain individual path-tracks and the
measurement of swimming speed (mm.s-1) and swimming angles (γ) for each copepod.
2.4. Quantitative analysis
The swimming speed of copepods, V, was calculated from two points in two dimensions, (Xi, Yi)
according to the formula:
V = 1/T √[(xi+1 – xi)2 + (yi+1 – yi)2]
where T represents the number of frames per second. Therefore, 1/T is the time interval 40 ms between the two
successive positions. Swimming speeds of male and female copepods were presented by state classification.
Thus, the different swimming speeds have been classified into three states: immobility (S = 0 mm.s-1), slow
swimming (S < 10 mm.s-1), fast swimming or jump (S> 10 mm.s-1). The swimming speed frequencies were also
presented by grouping the swimming speeds into speed classes regularly separated by 5 mm.s-1 (range 1: S = 0
mm.s-1; range 2: 0 < S ≤ 5mm.s-1; range 3: 5 < S ≤ 10 mm.s-1 and so on).
2.5. Swimming angles
Publications
Each copepod’s swimming angle (γ) was calculated between two vectors, A and B. Vector A consisted
of the positions of the copepod at the time n-1 and n, vector B consisted of the copepod’s position at the time of
n+1 and n and vector C consisted of the positions of the copepod at the time n+1 and n-1. The angles are
calculated according to the formula:
γ = acos [(║A║2 + ║B║2 – ║C║2)/(2║A║║B║)]
where
A = [Xn–Xn-1, Yn–Yn-1]
B = [Xn+1–Xn, Yn+1–Yn]
C = [Xn+1–Xn-1, Yn+1–Yn-1]
The swimming angles of male and female copepods were presented by state classification. Thus, the
different swimming angles have been classified into three states: γ < 90°C indicating that copepods are moving
backward, γ = 90°C indicating that copepods are moving on their sides, γ > 90°C indicating that copepods are
moving forward. The swimming angle frequencies were also presented by grouping the swimming angles into
ranges of 10° (range1: γ = 0°; range 2: 0 < γ ≤ 10°; range 3: 10 < V ≤ 20° and so on).
3. Results
The swimming behaviour was studied in male and non ovigerous female E. affinis before and after
injections of potential endocrine disrupting compounds. In order to analyze the behavioural response of the
copepods to the introduction of organic contaminants in their field, the swimming speeds and the trajectories of
both males and females have been studied. The copepod trajectories were studied by analyzing the swimming
angles formed between two successive movements and provided information on the copepod direction. For these
study, 10 paths representing 56,228 frames, 15 paths representing 51,362 frames, 10 paths representing 21,458
frames and 15 paths representing 17,583 frames were respectively analyzed for female behaviour before and
after the injection and for male behaviour before and after the injection.
The probability distribution functions (PDFs) of the swimming velocity of female and male copepods,
before and after the injection of the contaminant solution, are respectively shown in Fig. 1.a and Fig. 1.b. These
results indicate that the injection of an alkyphenol solution in the water induced a modification of the swimming
speeds of both males and females in comparison to their swimming speed before the injection. The female
velocities were altered higher than those of males after the injection. In addition, the copepod trajectories were
also altered after the injection of the contaminants, in comparison with control copepods, since the PDFs of
copepod swimming angles were different before and after the injection, both in male and female E. affinis.
According to these results male trajectories were more modified than female ones.
The swimming behaviour of females were compared to that of males before (Fig. 2.b) and after the
injection (Fig. 2.b). Male and female copepods presented dissimilar swimming velocities both before and after
the injection. Before the injection, female copepods were immobile most of the time and active 20% of their time
while males were much more active (44 % of their time). Besides, the male swimming speeds were higher than
those of females since 34 % of their movements were made at speeds comprise between 5 and 10 mm.s-1, which
were the minimum speeds observed in males, while the minimum speeds observed in females were comprised
between 0 and 5 mm.s-1, which represented 7 % of their movements. After the injection, females were active 33
% of their time while males were active 56 % of their time. The male swimming speeds were also higher than
those of females.
The effects of the injections on the swimming speeds are detailed in Fig. 3.a and Fig 3.b respectively for
female and male E. affinis. These results indicate similar effects of the contaminant injection on both female and
male swimming velocity. Thus increasing proportions of the swimming activity were recorded both in females
and males. The swimming activity increased from 20 to 33 % and from 44 to 56 % respectively in females and
males after the injection. For females, increasing proportions were recorded for all the swimming speed ranges
whereas for males, increasing frequencies were observed essentially for speeds comprised between 5 and 10
mm.s-1.
The differences observed in male and female trajectories before and after the injection are respectively
presented in Fig. 4.a and Fig. 4.b. Before the injection, female and male trajectories presented slight differences.
Thus, males moved more forward than females with respective frequencies of 11% and 19% for swimming
angles of 0° in males and females. After the injection, female and male trajectories were more different than
before the injection and males were still moving more forward than females.
The effects of the injection on the swimming trajectories of both females and males are respectively
presented in Fig. 5.a and Fig. 5. b. For females, slight variations were observed before and after the injection.
However, slight increasing frequencies of swimming angles of 140° (from 11 % to 12 %) and 180° (from 18 %
to 20 %) were recorded in female copepods after the injection while decreasing proportions of swimming angles
of 0° (from 19 % to 16 %) were observed. Besides, slight increasing proportions were also observed for
Publications
swimming angles of 90° (from 26 % to 31 %). For males, more variations were observed in the swimming
trajectories in comparison with female ones. After the injection, increasing proportions of swimming angles of
130° (from less than 1 % to 17 %), 150° (from 1 % to 6 %) and 160° (from 3 % to 26 %) were recorded. In
opposition, decreasing frequencies of swimming angles of 0° (from 11 to 8 %), 140° (from 14 % to 1 %) and
180° (from 24 % to less than 1%) were observed.
The presentation of the swimming speeds and the swimming trajectories of female and male
Eurytemora affinis according to their state classification as shown in Fig.6 make easier to observe the effects of
the injection of the contaminant solution on the copepod swimming behaviour. Thus, for females, decreasing
proportions of the state 1 swimming velocity (from 80 % to 67 %) were recorded after the injection while
increasing proportions of the state 2 swimming velocities (from 16 % to 28 %) were observed (Fig. 6.a). Almost
no variations were observed for the state 3 swimming velocity. These data indicate that the injection of
alkylphenols in the water induced an increasing swimming activity for female Eurytemora affinis. For males,
decreasing frequencies were also recorded for the state 1 swimming speeds (from 56% to 44 %) while increasing
frequencies were observed for the state 2 swimming speeds (from 34 % to 44 %). Besides, slight increasing
proportions of the state 3 swimming velocity were also recorded. These results show that in the same manner
than for the female swimming behaviour, the injection of alkylphenol in the water induced an increasing
swimming activity for males, with however lower effects than those observed in females.
The results presented in Fig 6.b indicate that increasing proportions of the state 2 swimming angles
(from 26 % to 31 %) and slight increase of the state 3 swimming angles were observed in females after the
injection while decreasing proportions of the state 1 swimming angles (from 37 % to 31 %) were recorded.
These results indicate that after the injection, females were moving more on their side and slightly more forward
than before the injection. For males, decreasing frequencies of the state 1 swimming angles (from 23% to 18 %)
were measured while increasing proportions of the state 3 swimming angles (from 48 % to 54 %) were observed.
Almost no variations of the state 2 swimming angles frequencies were recorded. These analyses show that after
the injection, males were moving more forward than before the injection. Besides, these results indicate that the
injection of an alkylphenol solution altered the copepod trajectories in a different manner for males and females.
4. Discussion
This study shows that the video-camera tracking system and related image analysis software are
powerful tools to analyze the swimming behaviour of small-size organisms (1mm size) such as Eurytemora
affinis which is our model organism. Characterizing the movement of organisms has a long lasting history (Bell,
1991) especially in entomological studies (Wiene and Milne, 1989). However, the analyses of movement
behaviour in aquatic organisms are less common than in terrestrial organisms. Besides, behavioural studies of
tiny aquatic organisms require the use of sophisticated video system (Strickler, 1998). Video-tracking systems
associated with fully-automated image analysis software used to extract the videotape behavioural information
are still under development for small size organisms in our laboratory. For this reason, a semi automated
procedure using a partially computer-controlled track of individuals was used in this study.
The first objective of this study was to describe the natural swimming behaviour of copepods cultured
under laboratory conditions. Then the natural swimming behaviours of both male and female copepods were
compared. Swimming behaviour in copepods has been shown to play an important role in several ecological key
processes such as mate-searching processes (Buskey, 1998), foraging activities (Yen and Okubo, 2002; van
Duren et al., 2003) and escape and predator avoidance by early detection (Yen and Fields, 1992). These
swimming behaviours are detected by various structures controlled by sensory reception and motion
(photoreception, mechanoreception and chemoreception). Our study focused on the potential disturbance of the
copepod chemoreception by the introduction of contaminants in their field.
The results show that the natural male swimming activity in clean water was more important than
female one. Thus, females were immobile 80 % of the time and when they were active, their swimming
velocities were lower than those of males. Some studies have demonstrated that males were more active than
females in mate-searching behaviour of copepod species (Buskey, 1998; Nihongi et al., 2004). To date, all
observations indicate that it is males that search for females and there is no evidence for female copepods
searching for mates (Katona, 1973; Uchima and Murano, 1988). One possibility is that males increase their
swimming activity to increase the encounter rates between males and females. Therefore, in some species males
may swim ≈ 2 times faster than females (Buskey, 1998). Doall et al. (1998) and Nihongi et al. (2004) have
reported that males track and detect females by chemoreception and when they encounter the chemical cues,
released by females, their swimming speed increase. They have also reported that males swim around to detect
females and when they increase their speeds, the distribution of the turning angles of the males shifted to wider
distributions. For E. affinis, the higher swimming activity proportions observed in males in comparison to female
ones might confirm that males were more active than females in mate-searching behaviours. As males and
Publications
females were placed in different vessels, the males might explore their field to detect the presence of females to
mate. Besides, females might exhibit a low swimming activity since there was no male in their field.
After the injection of the contaminant solution, both male and female E. affinis presented increasing
swimming activities. These increasing swimming activities were characterized by increasing proportions of the
normal swimming speeds (0< V ≤10 mm.s-1) in both females and males with also a slight increase of the high
swimming speeds or jumps in male behaviour (< 10 mm.s-1). Similar results have been reported in previous
studies (Faimali et al., 2006) where the swimming activity of larvae of Balanus amphitrite were induced after
exposure to low concentrations of zinc pyrithione (antifouling biocide) and cidial (insecticide). This
phenomenon, known as hormesis, suggests that exposures to low concentrations of contaminants induce
metabolic as well as a behavioural responses of the exposed organisms in relation to the stress. To our
knowledge, few studies have observed the behavioural response of the injection of contaminants on
microcrustaceans. Charoy and Jensen (1999) have reported no significant effect on the swimming activity of the
planktonic rotifer Brachionus calyciflorus after a 5 minute exposure to copper, pentachlorophenol and lindane.
Most of the others studies on zooplanktonic species have studied the swimming behaviours of these organisms
after short term exposure to contaminants dissolved in water. For instance, Roast et al. (2000) have described
increasing swimming activity in Neomysis integer after a 7-day exposure to low concentrations of chlorpyrifos.
The same authors have reported that a 7-day exposure of Neomysis integer to low concentrations of cadmium
disrupted their swimming behaviour resulting in fewer mysids moving forward into the current (Roast et al.,
2001). Decreasing swimming activities were also observed in Gammarus lawrencianus (Wallace and Estephan,
2004) and in Gammarus pulex (De Lange et al., 2006) respectively after exposures to cadmium and
pharmaceuticals. In opposition, Kirkpatrick et al. (in press) have reported increasing swimming activities in
Corophium volutator in response to Bioban (lipophilic biocide) exposure. However, the alteration of the
swimming behaviours consecutive to short term exposures to various contaminants are certainly related to
impacts at lower levels of biological organization which implies physiological and biochemical mechanisms
(Weis et al., 2001). Thus, the decreasing swimming activities in relation to contaminant exposures might be
related to a redirection of the energetic resources in other mechanisms that muscle activity. For instance, an
increase of the energy allocated to detoxification processes is generally associated with pollution-induced
alterations in behaviour (Rowe, 1998). These decreasing swimming activities might also be due to the
impairment of respiratory enzymes (Neuberger-Cywiak et al., 2003) and of the neurological enzyme
acetylcholinesterase which control cholinergic neural pathways involved in locomotion. In our study, the
variations of the swimming activity were clearly associated with behavioural processes as a consequence of
escape mechanisms involved in the response to the presence of chemical stressor in their field.
The PDFs of swimming angles were also altered both in females and males after the injection.
However, the injection of the contaminant solution disturbed the swimming trajectories in a different manner in
males and females. The proportion of the swimming angles comprised between 0° and 90° decreased both in
females and males but increasing proportions of the 90° swimming angles were observed in females while
increasing frequencies of the swimming angles comprised between 90° and 180° were measured in males. These
results indicate that males were moving more forward after the contaminant injection. Females were moving less
backward and more on their sides after the injection. These results might indicate escape behaviours in males
consecutive to the introduction of pollutants in their field. As the contaminants were injected in the water, there
was time before that these contaminants were homogeneously diffused into the all water volume and therefore
males increased their swimming activities in order to move to place which were not under chemical stress.
Moreover, the alteration of the swimming angles in males shows that their trajectories were different than those
before the injection which might indicate a possible disorientation of males. In comparison, females were also
affected by the presence of contaminants in their field and increased their swimming activity, more than males,
as an escape behaviour response. However, female trajectories appeared to be less altered than male ones after
the injection.
Possible consequences of disrupting swimming behaviours related to the presence of contaminants in
the estuary include alterations of mate-searching behaviours and predator-prey interactions. Thus, the increasing
swimming activity of E. affinis as a behavioural response to contaminant exposure might increase the
vulnerability of those organisms by increasing their encounter frequencies with visual predators as reported in
Daphnia pulex after exposure to carbaryl (Dodson et al., 1995). However, the contamination of the field might
also alter the predator efficiency.
Chemosensory communication has also shown to be important in the copepod mate-searching processes. It is
therefore not surprising that EDCs such as alkylphenols can have effects on sexual communication. For instance,
the exposure of male guppies (Poecilia reticulate) to alkylphenols showed significant changes in sexual
behaviour (Bayley et al., 1999). Moreover, the exposure of Salmo salar to cypermethrin, a pesticide known as an
EDC, significantly reduced the response of males to a priming pheromone released by ovulating females (Moore
and Waring, 2001). The introduction of alkylphenols in water might therefore impair the detection of dissolved
and surface-bond chemical cues involved in copepod mate recognition mechanisms.
Publications
As a conclusion, the results of the present study show that the introduction of alkyphenols in water
induces a measurably alteration of the swimming behaviours of both male and female E. affinis. Two
characteristic components of these swimming behaviours, the swimming activities and the swimming angles
were affected after the injection of sublethal doses of alkylphenols and seemed to be a valid biological endpoints.
These behavioural responses observed in both male and female copepods are interpreted as typical escape
patterns characterized by an increase of the swimming activity. These results show that the use of the copepod
swimming behaviour and especially of the swimming activity alteration could be a powerful tool to detect
contaminants in water at low concentrations comparable to environmental ones.
Acknowledgements
Region Haute-Normandie. The authors thank D. Devreker and A. Bonnard for the laboratory cultures of
Eurytemora affinis. We thank Rudi Strickler for his advice to make the experimental setup and for providing the
Track-It software. This paper is a contribution to the bilateral CNRS-NSC Taiwan project n° 17473 entitled
‘Study of behavioural activity and spatial and temporal distribution of copepods in two contrasting
ecosystems: temperate (France) and sub-tropical (Taiwan)’.
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Figure 1: Probability distribution functions (PDF) (log-log transformed) of female swimming speeds (a1) and
male swimming speeds (b1) before and after the injection of the contaminant solution. The PDF of female
swimming speeds (a2) and male swimming speeds are presented without taking into account the minimal speed
value.
Figure 2: Probability distribution functions (PDF) (log-log transformed) of female swimming angles (a.) and
male swimming angles (b.) before and after the injection of the contaminant solution.
Figure 2: Histogram of the relative percentage of the copepod swimming speeds. The swimming speeds of male
and female copepods are compared before the injection of the contaminant solution (a.) and after the injection
(b.).
Publications
Figure 3: Histogram of the relative percentage of the copepod swimming speeds. The swimming speeds of the
copepods before the injection of the contaminant solution and after the injection are compared in female (a.) and
in male (b.).
Figure 4: Histogram of the relative percentage of the copepod swimming angles. The swimming angles of male
and female copepods are compared before the injection of the contaminant solution (a.) and after the injection
(b.).
Publications
Figure 5: Histogram of the relative percentage of the copepod swimming angles. The swimming angles of the
copepods before the injection of the contaminant solution and after the injection are compared in female (a.) and
in male (b.).
Figure 6: Mean proportions of each swimming states exhibited by female and male Eurytemora affinis, before
and after the injection of the contaminant solution. The swimming speed states are presented (a.) with state 1,
immobile copepods; state 2, low swimming speed behaviour (0< speed ≤10 mm.s-1); state 3, fast swimming
speeds or jump (speed > 10 mm.s-1). The swimming angle states are presented (b.) with state 1, copepods move
backward (0° ≤ γ < 90°); state 2, copepods move on its sides (γ = 90°); state 3, copepods move forward (γ >
90°). (FB: female before the injection; FA: female after the injection; MB: male before the injection; MA: male
after the injection).

Cailleaud K., 22/11/2006. Utilisation du copépode - GIP Seine-Aval

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