ETUDE DES PROGRAMMES VACCINATX REALTSES EN

ETUDE DES PROGRAMMES VACCINATX REALTSESEN AVICULTURE AU SENEGAL
Arbelot Brigiftel, Dayon Jean François2,Mérouani Nadia2,Kaboré Yalacé3
2MissionFrançaisede coopération,
Sénégalaisde RechercheAgricole, BP 2057, Dakar Hann, Sénégal,
'Ecole Inter
étatsde Scienceset MédecineVétérinaire,BP 5077
ProjetPRODEC,BP 2014,Dakar, Sénégal,
Dakar, Sénégal
llnstitut
Résumé
Une enquêteserologiquea été effectuéeau Sénégalpour connaîtreI'efficacité desprogramrnesde prophylaxie
mis en oeuvred'une part contrela maladiede Newcastle,la maladiede Gumboroet la bronchite infectieuseen
avicultureindustrielle, d'autre part contrela maladiede Newcastleen aviculturevillageoise.
Dansla zonedu Cap-Verq53 bandesde pouletsde chair et 34 bandesde poulettesont fait I'objet d'un suivi
sérologique.A 45 jours, la majorité des lots de poulets de chair ne sont protégésni contre la maladie de
Newcastle(83% des lots) ni contre la maladiede Gumboro(89% des lots). Pour les pondeuses,62%odes
élevagesà I'entrée en ponte sont insuffrsammentprotégés contre la maladie de Newcastle.La couverture
vaccinale des poulettes d'un mois contre la maladie de Gumboro est insuffrsante pour 95% des lots' La
protection vaccinale contre la bronchite infectieuseest insufrsante poul tous les lots I'entree en ponte. La
èomparaisondesprognmmes de vaccinationsmontre que seulsles lots vaccinésavecle vaccin inactivé huileux
contre la maladiede Newcastlesont tous correctementprotégés(que ce soit pour les pouletsde chair ou pour
les pondeuses).Pour la maladie de Gumboro. cette étude ne permet pas de différencier les programmesdc
vaccinations.La vaccinationdespondeusescontre la bronchite infectreuseest inefficacetelle qu'elle est réalisee
au Sénégal.Le taux de réussitedesvaccinsadministrésdansI'eau de boissonest doncfaible.
Pour leJvohilles de brousse,une enquêteconduite dans 6 villages de la zone de Kaolack (sur 519 volailles
vaccinéespar injecton d'un vaccin inactivé huileux et 366 volailles non vaccinées)montre que les ttres IHA
desvolaiflès vaccinéessont significativementsupéneursà ceux desvolailles non vaccinées.La comparaisonde
(152 volailles) et de volailles uniquementvaccinées(145 volailles)montre
volaillesvaccinéeset déparasitees
une haussesignificatve destitres IHA quandla vaccinaton est associeeau déparasitage.Ceci est probablement
lié à I'effet immunostimulantdu lévamisoleentrant dansla composiûondu déparasitantutilise'
Introduction
1. Matériet et méthodes
Afin d'evaluerla qualitéde la protectiondesvolailles
vaccinéesselon les programmesmis en oeuvre au
Sénégal,une enquête sérologiquea été réalisée
durantI'annee95-96.
1.1.Prélèvements
En aviculture semi-intensive, les volailles sont
vaccineescontre la maladiede Newcastle,la maladie
de Gumboroet la Bronchite infectieuse(uniquement
pour les pondeuses).En aviculture villageoise, seule
la vaccination contre la maladie de Newcastle est
effectuéedanscertainesz)nes.
En aviculture industrielle, les prélèvementspar prise
de sang à la veine alaire ont été réalisésd'août 95 à
juin 96 dans la zone périurbaine de Dakar (zone du
Cap-Vert). Les élevagesenquêtésont été choisis en
fonction de la présencede lots d'âge voulus. Au total,
51 bandesde volailles de chair ont été prélwees à 30
et 45 jours et 34 bandesde poulespondeusesI'ont été
à 30, ?0 et 130jours (15 à 20 prisesde sang/bande).
Le programme vaccinal appliqué à chacune des
bandesprélwês a étérelevé.
La qualité de la protection vaccinale est estiméepar
En aviculture villageoise, les prélèvementsont été
le ttrage des anticorps sériques (inhibiton de
réalises dans 6 villages encadréspar " Vétérinaires
à
Même
si
la
résistance
Elisa).
et
I'hémagglutination
sansfrontieres" (VSF) dans la zone de Kaolack de
l'éprewe virulente est le seul moyen de mesurer la
protection globale des oiseaux, la recherche des janvier à mars 1996. tæs villages enquêtes,choisis
antcorps permetde mettre en âridenceindirectement par les agentsde VSF en fonction de leurscontraintes
de ttanail, ont fait I'objet d'une campagne de
ure infection ou rme prise vaccinale (Fournier et al,
1995;Picaultet al., 1993).Vu les moyensdisponibles vaccination annuelle (vaccin inactivé huileux
au Sénégal,les analyses serologiquesapparaissent Ilanew). Dans la me$tre du possible, toutes les
volailles emplumeesont été préleveesdans chaque
oornme un bon moyen de contrôle de la prise
village, au minimum 3 semainesaprèsla campagne
vaccinaledescheptels.
de vaccinaton. Chaque prélwement a été identifié'
DeuxiÀrnesfournées de ta RechercheAvicole, Tours, &10 avrûl1997
individuellement (date de prélèvement,village et
volaille vaccinée ou non selon les dires du
propriétaire) Au total, 884 sérums dont 519
provenantde volailles vaccinéeset 366 de volailles
non vaccinéesont étéprélevés.
Les donnéesont ététraitéesà I'aide deslogicielsEpiinfo et Excel.
2. Rézultats
2.1.Protectionvaccinaleen avicultureindustrielle
Afin d'étudier I'effet du déparasitage,5 lots situés
dans 5 villages différents ont été constitués.Les
volaillesont étéidentifiéesindividuellement(à I'aide
de rubansnumérotés).Danschaquelot, la moitié des
animaux a été vaccinée et déparasitée(Vermifuge
PolyvalentVolailles), I'autre moitié a été vaccinée
seulement. Les prélèvements sanguins ont été
effectués 3 semaines après vaccination (et
déparasitage).Au total. I45 volailles ont éré
vaccinéeset 152ont étévaccinéeset déparasitées.
1.2.Analysesde laboratoire
En aviculture industrielle, les titres en anticorps
sériques ont été déterminés par I'inhibition de
I'hémagglutinationpour le titragedesanticorpsantiNewcastle (Picault, 1993), les kits Immunocomb
trivalentspour le titrage desanticorpsanti-Bronchite
infectieuse(Anonyme.1994b)et les kits ELISA KPL
pour le titrage des anticorps anti-Gumboro
(Anonyme,1994a) D' utilisationrelativementsimple.
les kits Immunocombtrivalents permettentde titrer
conjointement les anticorps anti-Newcastle,antiGumboro et anti-Bronclute infectieuse: mais leur
gammede lectureest plus restreinteque I'ELISA ou
I'IHA. Cesdeux dernierstestsont donc été réalisés.
ce qui à permisen outre de comparerles drfférentes
méthodesd'analyses.Cettecomparaisonn'étant pas
l'objet de cet article, nousprésenterons
seulementles
titres en anticorpsanti-Bronchiteinfectieuseobtenus
grâceaux kits.
Les sérumsdesvolaillesvillageoisesont été analysés
uniquement selon la technique d'inhibition de
I'hémagglutnation.
1.3. Interprétation des résultats et analyse des
données
En avicultureindustrielle,la qualité de la protection
des cheptelsest esûméeen fonction des résultats
individuels par lots (Anonyme, 1995) Un taux
d'immunisationd'au moins 907odu cheptel devant
être atteint (Fournieret al, 1995),la protectionest
bonnesi au moins90% desvolaillesprélwéesont un
titre supérieurau seuil de protection, limite si 50 à
89% desvolailles ont un ttre supérieurau seuil, ou
insuffrsantesi moins de 50%o
desvolailles ont un ttre
supérieurau seuil.
En aviculturevillageoise,les titres IHA individuels
sont regroupésen trois classes: ttres nuls, moyenset
forts. Ceci permet de comparer leurs répartitions
selon les différentespopulations(d'après le calcul du
Chi deux)(l-Lzaret al., 1987).
2.1.1. Protection vaccinalecontre la maladie de
Newcastle
Les résultatsconcernantles pondeusessoff présentés
dansle tableaul. Les meilleursrésultatssontobtenus
avec les prograrnmesassociantdes vaccins inactivés
huileux (VIH) Itanew, Imopestou New Cavac (à un
jour et à I'entrée en ponte) et des vaccinsI'ivants
HitchnerBl et La Sota(figure l).
Pour les pouletsde chair, les résultatssont présentés
dansle tableau2 La meilleureprotectionest obtenue
avecle vaccin inactivéà un jour associéà un vacciu
vivant HBl en trempagedu bec(figure 2)
('2,)
TABLEAU l: Répartitiondeslots de pondeuses
qualité
protection
fonction
la
la
vaccinale
en
de
de
contrela maladiede Newcastle
Protection
Titre IHA seuil
Bonne
Limite
Insuffrsante
30 iours 70 iours 130iours
t/16
Il16
t/5t2
40
68
38
l5
23
25
9
JI
45
FIGURE l: Evolutiondestitres IHA moyensdeslots
de pondeusesen fonction des programmes de
vaccination
204tr
1792
= 12At
,a 1OA
E
É
76s
s12
256
0
30
rge o38rst
130
Légendes:
A: VIH + HBI à l jour, La Sotaà 3 et l0 semaineset
VIH à 18 semaines.
B: HBI à 4 jours, La Sotaà 3 et l0 semaineset VIH
à 18 semaines.
C: HBI à 4 jours,La Sotaà 3, I0 et l8 semaines.
TABLEAU 2: Répartition des lots de poulets de
chair (%o)en fonction de la qualité de la protection
vaccinalecontrela maladiede Newcastle
Protection
Titre IHA seuil
Borure
Limite
Insuffisante
30 iours
U16
23
26
51
45 iours
t/t6
t7
27
56
FIGURE 2: Evoluûon destitres IHA moyensdeslots
de poulets de chair en fonction des programmesde
vaccination
128
112
2.1.3.Protection des cheptelsde pondeusescontre
la Bronchite infectieuse
La vaccination est réalisée pour 16%o des lots
enquêtés(1, 2 ou 3 administrationsde Hl20 dans
I'eau de boisson vers 4, 30 eUou 70 jours). La
protection induite est insufrsante pour tous les
à 30,70 et 120jous.
élevages
=80
pË
2.2. Protection contre la maladie de Newcastleen
aviculture villageoise
Ës2
16
0
to og" (lours) /15
Légendes: A: VIH + HBI à I jour. B: HBI à 3 jours,
La Sotavers 2 semaines
2.1.2. Protection vaccinale contre la maladie de
Gumboro
Les résultats relatifs aux pondeusessont présentés
dans le tableau 3, ceux des poulets de chair dans le
tableau4.
Pour les pondeuses, l/3 des lots ont reçu trois
administraûonsde vaccin en eaude boisson(à I, l0
et 30 jours), tous ces lots sont bien protégés. Les
autres lots ont reçu une ou deux administraûons (l
etlou l0jours).
Parmi les lots de pouletsde chair bien protégésà 45
jours, 2/3 ont eu un vaccin buvablevers l0 jours et
l/3 en a reçudeuxvers9 et 20jours.
Les souchesvaccinalesutlisees sont le Bur 706, le
Gumboral CT ou une souche américaine nommée
Bursal GumboroVaccine.
TABLEAU 3: Répartition des lots de poules
pondeuses(o/ù en fonction de la qualité de la
protectionvaccinde contrela maladiede Gumboro
Protection
Titre Elisa seuil
Bonne
Limite
Insufrsante
30iours 70 iours
3000
3000
t7
74
2l
78
f
5
TABLEAU 4: Répartition des lots de poulets de
chair (7o) en fonction de la qualité de la protection
vaccinalecontrela maladiede Gumboro
Protection
Titre Elisa seuil
Bonne
Limite
Insufrsante
30iours 45 iours
3000
3000
ll
9
91
26
63
Avec une majorité de volailles présentantdes titres
IHA moyens et élevés, la population vaccinée est
significativementdifférente(p<0,01)de la population
non vaccinéedont les titres sont plus faibles (55%
desvolailles non vaccinéesont destitres nuls) (figure
3).
La population vaccinée et déparasitéeprésentedes
titres IHA significativement supérieurs à la
populationvaccinéemais non déparasitée(p<0.01)
(figure 4).
X'IGURE 3: Répartition des
populatonsvaccinéeset non vaccinées
IHA
des
60
50
/O
o/.30
20
10
0
16-256
512.t096
IHA
Légendes:W: volailles vaccinées.VNV: volailles
non vaccinées
FIGURE 4: comparaisondes titres IHA desvolailles
vaccinéesdéparasitéeset des volailles vaccinéesnon
déparasitées
80
60
n/o
40
20
0
16'256
512-1006 Tltres lllA
Légendes:WD: volailles vaccineeset deparasitees'
WtW: volailles vaccinéesnon deparasitees
Discussion
Pour les poussins ponte et les poulettes. les
programmesde vaccination contre la maladie de
Newcastlecomprenantun vaccin inactivé huileux à
un jour donnent une couverture saûsfaisante.Au
contraire, les vaccins administrés dans I'eau de
boisson- mêmes'ils le sonten nombresuffisant- ne
protègentpas suffisammentles lots dans la majorité
des cas. A I'entrée en ponte, 620Âdes lots ont des
titres IHA trop faibles pour garanûr une protection
contre I'apparition des symptômesliés au virus
(Ganièreet al.. 1984).Les lots primovaccinés
avecun
vaccin inactivé sont les mieux protégés. Ceci
souligne I'importance des primovaccinations
(Anonyme.1984a).
Chez les poulets de chair. l'associationdu vaccin
inactivéà un jour et du vaccinvivant en trempagedu
becestégalementla plus effrcace
La réponsesérologiquemesuréepeut être induite par
(Alexander,1988) Cependant,les
desvirus sauvages
trtresIHA post-infectieu\(>1164)sontsupérieursaux
titres post-vaccinauxinduits par I'administrationde
vaccinbuvable(l/16) Ceci permetde différencierle
virus vaccinaldu virus sauvage,sauflors d'utilisation
de raccin inacûr,é(Anonyme.l9EE). Parmi les lots
enquêtés.la maladie de Newcastlea été observée
cliniquementsur unebandede pouletsde chair, leurs
titres. anormalementélevéspar rapport aux vaccins
vivants administrés, ont confirmés la suspicion
cliniqueet ce lot a étéécartéde l'étude.
administrationsde vaccinsdansI'eau de boissonsont
mieux protégéspursqu'ils sont tous classésdans la
catégorie " bien protégés". Cependant,la présence
du virus sauvagedans la zone et les différencesde
pratiques entre les éleveurs sont telles qu'il est
difficile de conclure.On peut seulementafrrmer que
durant la periodesensible(à 30 jours), 95% des lots
de poulettessont dépounusde protection.
L'immunité induite par la vaccinaton contre la
Bronchite infectieusetelle qu'elle est réalisée au
Sénégal est nulle. La fragilité du vaccin vivant
@icault et al., 1984) et la non conformité du
prognmme appliqué au Sénégal(Anonyme, 1984)
peuventexpliquerceséchecs.
Ces donnéesmettent en evidenceles diffrcultés liées
à I'administrationdesvaccinsdansI'eau de boisson.
Plusieurs hypothèsespeuvent expliquer les échecs
observés : mauvaise conservation du vaccin,
mauvaise concentration vaccinale, présence de
désinfectants dans I'eau utlisée, abreuvoirs mal
nettoyés,utilisaûon de vaccirs reconditionnés,.... I
est donc souhaitabled'initier les éleveursaux bonnes
praûquesde vaccination(Fournier et al., 1995) et
d'adopter les vaccins inacûvés injectablespour la
maladie de Newcastle (Bermejean et al., 1978;
Anonyme,1994c,Anonyme,1995).
Quel que soit le programmeet la souchevaccinale,
les titres en anticorpsanti-Gumborosontinsuffrsants
pour tousles lots de pouletsde chair à 30jours. A 45
jours. seuls ll% des lots ont des titres élevés.
L'évolution des titres par rapport aux dates de
vaccination montre que pour 2/3 de ces lots,
l'augmentationdu titre Elisa est liée au passaged'un
virus sauvage.En effet, après I'administraûon du
vaccinvers l0 jours, il n'y a pasde séroconversion
à
30 jours; donc, en I'absencede rappel vaccinal, la
séroconversionimponante constatéeà 45 jours est
liée à un virus sauvage.L'effet protecteurdu vaccin
existe donc peutétre pour seulement40Â des lots.
Très peu de lots se distinguantpar la qualité de leur
couverturevaccinale, nous ne pouvons observer de
différencesnotablesentrelesprograrnmes.
En primo-vaccination, le vaccin inactivé huileux
donnedesttres IHA moyensde 11256à l/512 (avec
des exlrêmesde lll28 à l/4096) (Anonyme, 1988;
Anonyme, 1994c; Anonyme, 1995; Picault et al.,
1993).En aviculturevillageoise,on observeune plus
large drspersiondestitres desvolaillesvaccinées.On
peut supposer que le virus sauvageentraîne une
haussedes titres chez ces dernièrescomme le ferait
une primo-vaccination(Saunders,1994).Le virus de
la maladie de Newcastle est effectivement présent
dans tous les villages enquêtéscornme le prouvent
des titres IHA>8 chez les volailles non vaccinées.
Ceci est courant en Afrique sub-saharienne(Agbede
et al., 1990;Grundleret al.,
et al., 1992',Courtecuisse
1988).
Les ûtres nuls obsenés chez quelques volailles
vaccinées peuvent être liés à des erreurs
d'identification(confusionentrevolaille vaccinéeou
non). car les vaccinsinactivéshuileux entraînentune
à 100%(Rajeswaret al., 1992).
séroconversion
Pour les poulettes,les résultatssont meilleurs à 70
jours avecune protectioncorrectede74%odeslots. Si
le vaccin peut effectivementêtre responsablede la
hausse du titre Elisa pour les lots ayant eu 3
administratronsde vaccins dont I'une après le
prélevementde 30 jours (soit pour 1/3 d'entre eux);
pour les autres,la séroconversionà 70 jours est plus
probablementliée au passagede vrrus sauvagepour
la même raison que pour les poulets de chair. A
priori, tous les lots de poulettes recevant 3
Le déparasitageaugmentede manière significative
les ûtres IHA. La vermifugaûon au moment de la
vaccinaûon est généralement recomrnandée afin
d'améliorer l'état sanitaire des oiseaux ce qui
favorise la réponse immunitaire (Verger, l9E6;
Saunders,1984). L'augmentation significative des
titres chez les volailles déparasitéesest également
probablement liée à I'effet immunostimulant du
levamisole enûant dans la composition du
utilisé @lanchart,1995)
déparasitant
80
Conclusion
Dans les élevagesintensifs,les pouletsde chair sont
insuffisammentou mal vaccinéscontre la maladie de
Newcastleet la maladie de Gumboro. La technique
de vaccinaûondans I'eau de boisson sembledonc
défaillante. Etant donné la situation sanitaire de la
zone(épizootiede Newcastledejanvier à juin 95), il
est essentield'adopterla vaccinationdes poussinsà
un jour avec le vaccin inactivé huileux, seul capable
de donnerune protecûonhomogèneet suffisante.
Pour les élevagesde pondeuses,les résultats des
vaccinatons contre la maladie de Newcastle sont
légèrementmeilleurs, du fait du rappel de vaccin
inactivé avant l'entrée en ponte. Cependant,cette
protection est insuffrsante dans 620Â des cas pour
protéger les lots contre les chutes de ponte liées au
virus. La protectiondes cheptelsde pondeusescontre
la Bronchite infectieuseet la maladiede Gumboroest
égalementinsuffrsante.
En aviculturevillageoise,la vaccinationpermetune
haussesigmficativedes anûcorpssériques,d'autant
plus si lesvolarllessontdéparasitées
Remerciements
Les auteursremercientle projet PRODECpour le
financementclecette étude,Mr Lancelot,Mr Bonnet
et Mr Diallo du CIMD-EMIT, Jean ClaudeGueye,
JimmyEvali et le personnelde l'ISM-LNERI'.
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N)ENOVIRUS DE LA DINDE
FORME SUBCLINIQUE DE L'ENTERITE IIEMORRAGIQUE,
NOUVELLES METHODES DE DIAGNOSTIC LESIONNEL ET SEROLOGIQUE
Jean Léorat r, Pierre Chéritel
2
I SelvetConseil.56500Bignan.t
Bio ChêneVert,35220Châteaubourg
Résumé
Les adénoviruschez la dinde de chair sont devenustrès fréquents avec des manifestationssubclimquesde
I'entéritehémorragique.
Validé par Bio ChêneVert. un kit Elisa spécifiquepermetde confirmerle diagnostic
aprèsl'apparitiondes troubleset I'observationdes lésions sur les animaux Aussi. à l'avenir, nous devons
identifier et caractériserle virus responsablede ces adenovirosessubcliniquesainsi que développerdes
techniquesdevaccinationpermettantune meilleureprotectlon.
Abstract
Adenovirusesget frequently encounteredin growing turkey. with subclinical troubles of hemorragic
cnteritis. A specrficELISA test. testedby Bio ChêneVert. can be used to confirm the diagnosisafter the
corningout of troublesand the observationof lesions.Therefore.we must exactlyidentifr the virus responsible
for that subclinicalenteritis.anddwelop somer,'accirntionproceedings
allowing a betterprotection
lntroduction
Depuis enr.iron l0 ans . l'adénovirosesubclinique
concernele grand ouest de la France avec une
recrudescence
depuis 1996 sur I'ensemblede la
Bretagneet desPaysde Loire et propagationvers le
Centreet le Nord de la France
L'entéritehémorragiquesoussa forme suraiguëest
encore présentedans la mémoire des éleveurs de
dindesdesannées70 et 80. La mise à dispositionpar
Rhône Mérieux d'un vaccin expérimentalpuis du
r,accin Dindoral SPF@avait permis de réduire de
façon importante les conséquences
économiquesde
cetteaffection
Lors de I'apparitionde la Rhinotrachéitede la dinde.
autre affectionvirale, tous les acteursde la frlière
ier à leurs dépensles effets négatifs
avalent pu apprecrer
avaleil
I'associationdu
de
de I'association
du pneumovirusde la RTI et de
l'adénovirus de I'entérite hémonagique. Une
meilleure vaccination avec le vaccin Dindoral SPFG)
associéeà un grand effort de désinfection et de
désinsectisation.
avait permis de réduire I'incidence
de la RTI.
l. L'adénovirosesubaiguë
il est fréquent que des troubles respiratoires
les septà dixjours survantle début
apparaissentdans
de la maladie. Cette adénoviroseest très fréquente
mais son diagnostic de certitude est difficile à
réaliser.Les lésionssont aussiévocatricesdu rouget.
du syndromelymphoprolifératifet
de la pasteurellose,
suraiguës.
tumoral.et descolibacilloses
Le diagnostic de certitudepeut être poséau molnellt
des troubles, après observation des lésions
au niveaude la rate.
caractéristiques
microscopiques
2. Identification de I'adénovims
2.I. TestElisa
bonne spécilicité (capacité à détecter les seuls
anticorps de cette affection) ainsi qu'une bonne
reproductibilité (capacité à donner des valeurs peu
ditsérenteslors de répetition du test sur un même
sérum).
L'effet dosedémontrela quâlité de ce test : echellede
valeur étendueet bonne linéarité lors des dilutions
d'un mêmesérum
decroissantes
L'expressionsuraiguëdu qndrôme de I'enténte,bien
connue,caractériseepar une dianhee hémorragique
entmînantune mortalité rapide et parfois importante
a fait place depuis quelques années à une forme
2.2. Confirmation serologiquedu passageviral
subaiguëentraînant des mortalités vers sept à dix
semainessans diarrhée hémorragique. Cette forme
apparaîtdans une partie du bâtiment et évolue vers
les autrespartiesdansles trois à quâtrejours et ceci,
malgréla miseen placefréquented'antibiotiques.
Cefte forme insidieuse, que nous appelleronspour
plus de facilité de compréhension I'adénovirose
subclinique, est actuellementune des composantes
à quatresemainesplus tard.
majeuresdes grands syndromespathologiquesde la
dinde. Les autopsiesrevèlent des foies et des rates Le tableau ci-après montre les résultatsde ces tests
sérologiques.
hypertrophiés. La mortalité en I'absence de
complicationsbactériennesest inférieure à 57o,mais
DeuxièrnesJournéesde la RechercheAvicole, Tours, E-10Avril 1997
83
Ele. I
Ele.2
Ele. 3 bat. 2
Ele. 3 bat I
Ele.4
Ele 5
Ele.6
Movenne
Coeffrcientde
Titre moyen3 à
Coeffrcientde
titre moyenau
en'Zo
variation
les
après
4
sem.
variationen 7o
débutdes
troubles
troubles
30
t4l5l
177
3029
f
I 8167
23e
1698
(,
t7787
155
1745
-1
1 8 2r 5
12r
3246
26
1581il
8l
6936
83
720
'7
t0-t()3
96
539
l3
t5767
136
2559
Les deurièmessériesde prisesde sangmontrent une
Cette affection n'aurait pâs de conséqrtettces
économiquestrès gravessi elle n'était très souvelll
initiatricé de troubles respiratoiresell assoclatloll
avec des passages de virus de h RTI otl
d'affectiolts
d'Ornithobacierium. compliqués
colibacillaires.
Lors de cetteenquête.dansquatreélevagessttr srr' il
estapparurapidemefidestroublesresplratolres,
3. Adénovilus et vaccination
Tout ceci nous a amenéii nous interroger : qttels
dansl'élevage.
étaientles titres d'anticorpssur les dindonneausd'ttn
Des examens sérologiques s'avèrent donc une jour '/ Qu'en estril de la décroissancede ccs
méthodeplus appropriéepour poserle .,liagnostic.Ils
anticorps?
doiræntêtre effectuésau début des troubles et trois à
Le tabieau est une ébauchede réponsesit ces
plus tard.
quatresemaines
questions.[l persistepeu d'ânticorpsaprès2l lortrs
Le cumul des résultats des examens sérologiques zur desdindonneauxporteursd'un fort taux à tttt.iottr
Ceci pourrait être confirmé ou infirmé par d'autres
telle quela séroneutralisatiou
techniquessérologiques
et ouvrirait peutétrè la voie à ttne vaccinatiottpltts
precoce.
Ne faut-il pas améliorerou modifier les tecluriqttes
'l
diagnostic
de vaccinationavecle vaccinDindoral SPFG'
I iour
LOT I
LOT 2
LOT 3
LOT 4
LOT 5
LOT 6
137E2
t6206
r4643
9103
r5929
r5497
Une étudeesten coursavecI'aidede nospartenaires'
Elle comprend : une technique de vaccination
améliorée, des prises de sang et contrôles
sérologiquesavant et après la vaccination, le recueil
des si[n^escliniques éventuelsou la recherched'un
d'autresvaccinations.
Il sepeut égalementque les taux d'anticorpsobsewés
sur lés dindonneauxii'un jour ne résultent pas de la
seule immunité conféree aux reproducteurspar les
vaccinseffectuéssur cesderniers.
14 iours
6868
t722
2252
3594
2167
t229
28jours
90
27
376
t2l
157
219
Conclusion
de dindes".
84
ETUDE SEROLOGIQUEANEMIE INFECTIEUSEA L'ABATTOIR
EN RELATION AVEC LES PERFORMANCES TECHNIQUES EN POULETS DE CIIAIR
Billard Sylvier,Gardin Yannick2
rlabovet,
2lntervetS.A..43. AvenueJoxé.49100Angers
Z.I , lesPetitesPlaces,49600Beaupréau,
Résumé
Les objectifsde cetteétudeétaientde déterminerla prévalencesérologiqueà I'abattoirde l'anémieinfectieuse
chezdespouletsde chair élevésen Paysde Loire, et d'établirun lien entreles séroconversions
et les
observées
performances
techniques.en référenceà l'étudede Mac Nulty (1991).Sur l'échantillonanalysé(20 lots de 35
jours environpris au hasarda l'abattoir),la prevalencesérologiquede l'anémieinfectieuseen pouletsde chair
est de 10 %o.Les lots présentantune séroconversion
à I'abattoiront des performancestechniquesinférieures
Une sérologieanémieinfectieusepositiveà I'abattoirrévèleune contaminationhorizontaleprécocepar le virus
de I'anémieinfectieuse.Une protectionimmunitaired'originematernellede mauvaisequalitéetlouune pression
virale forte en élevagesontà l'origine de cetteinfectionsubcliniqueaux conséquences
néfastes,
économiques
Introduction
L'anémieinfectieusedu poulet (ChickenInfectious
Anemia ou C.I.A.) est une maladie résultant de
I'infectiondejeunessujetspar un circovirusappelé
CAV (Chicken Anemia Virus) ou plus
commurÉmentCAA (C.A. Agent) (Mc Nulty.
l9er).
L'expressioncliniquevarie en fonctionde l'âgeà la
contamination et du potentiel immunitaire du
poussin(Mc Nulty. l99l).
Dans le cas d'une contamination précoce
(transmission
verticale.ou horizontaleau coursdes
tous premiersjours de vie). on observeune anémie
aplasiquesévèrequi évolue entre 12 et 30 jours
d'âge avec mortalité. déplétion lymphoide er
rmmunodépression
(Drouin et al.. 1992: Mc Nulgl99l : Picaultet al.. 1992: Yieljtz. 1989).
Une résistancenaturelle se développeavec l'âge
(Hu er al. 1993: Mc Nulty. l99l) er cetteforme
clinique ne peut être reproduiteexpérimentalement
sur dessujetsâgésde plus de 2 semaines.
Dans le cas d'une contamination plus tardive.
I'infection s'exprimede façon subcliniquepar une
détérioration substantielle des indices de
performancestechnicoéconomiques,probablement
d'autant plus importante que I'infection est plus
précoce(Mc Nulty et al.. l99l).
L'infection simultanéepar d'autresvirus (Marek,
Gumboro, Réûculo-endothéliose)en réduisant le
potentiel immunitaire peut modifier ces données
sur la sensibilitéet I'expressionclinique (Vielitz,
1989; Rosenberger,
1992).
Les anûcorps spécifiquespost-infectieux ou postvaccinaux sont protecteurs.En quantité, il mettent
la reproductrice à I'abri d'une transmission
verticaledu vinrs (Malo et al., 1995)et assurentles
poussinsd'une immunité passiveélevée.Celle-ci
retardel'âge d'une eventuellecontamination
horizontaleet empêchel'apparition de la fonne
cliniquede la maladie(Otakiet al.. 1992)
Dans les conditionsfrançaisesactuelles.la grande
maiorité des troupeaux reproducteurs est
globalement séropositive. L'anémie infectieuse
maisla possibilité
cliniqueestdoncexceptionnelle.
d'uneforme subcliniquetelle que rapportéepar Mc
Nulty et al. en 1991 est souventévoquéepour
ou éclairer des
expliquerdes contre-performances
tableauxcliniquesconfirs.
Le but de cetteétudeétait d'apprécierla réalitédu
phénomènesur une productionde pouletsde chair
de type standardélevésdansune mêmerégion : les
Paysde Loire.
Une enquête sérologiquea ainsi été menée à
l'abattoirsur des lots âgésd'environ 35 jours afin
de détecterceuxayantsubiune infectionprécoceet
de comparerleurs performancesde productiottà
cellesdeslots non infectés.
I - Matériel et méthodes
I.1. Choix desélevages
Notre travail a porté sur 20 élevagesde poulets de
chair industriels.d'une même organisation.situés
en Paysde Loire.
Les élevagesétudiés ont été pris au hasard du
l5/ll/95 au 9ll2l95 en fonction du planning
d'abattage.
L2. Sérotogieanémieinfectieuse
I.2.1.Collectedesprisesde sang
Les prisesde sang de chaqueélevagesélectionné
ont été effectuéespar le sendcequalité de l'abattoir
par lot.
à raisonde l0 prélèvements
Deuxièmes fournées de la Recherche Avicole, Tours, 8'10 avril 1997
85
IL2. Résultatszootecbniques
I 2.2.Traitementdesprélwements
La détectiondes anticorps sériquesanti-anémie
infectieuseau poulet a été réaliséepour tous les
lots. le mêmejour. dans un mêmelaboratoire,en
utilisanl le kit ELISA : Flock screen tt CIA
AntibodyElisa kit de chezBehring (référenceVO
80).
L'interprétationdu résultatsefait en fonctionde la
valeur s/p. Les sénuns sont considéréscomme
négatifsquandle s/p est inférieurà 0,10 et positifs
quand il dépasse0.25 Les sémmsprésentautun
et ne
s/p cornprisentre0.lo et 0.25 sont suspects
peuveut eu aucun cas être considéréscomrne
positifs.De nouvellesprisesde sangdevraientalors
être effectuéesl0 à 15 jours plus tard pour
détenniuerla positivitédu lot considéré
Dirns notre étude.un lot a été considérécomme
positif quand au rnoins un sérun s'était rér'élé
positif à l'anal'r'se Les lots possédantun ou
phsieurssérumssuspeclssanssérumpositif ont été
considérés
commenégatifs.
I.3. Collecte des perlbrmanceszootechniqueset
desrésultatsd'abattoir
La collecte des donnéesa été faite à partir des
hchesd'élevage.Cesdernièresnousont permispar
ailleurs.de r'érifier qu'ancundes lots retenusdans
l'étude u'avait présenté de pathologie clinique
particulière(Gumboropar exernple).Ont ainsi été
retenusles paramètressuiyants: poids moyen à
I'abaltage. indice de consomrnation.mortalité
totaleet taux de saisies
I.4. Analysesstatistiques
L'analvsestatistiquea étéréaliséeen considérantle
de :
lot comrneunité statistiqueet au mo-ven
- T-tests pour le poids moyen et l'indice de
consomrnation.c:lr ces 2 paramètressont des
tnovennes.
- testsde la Rank Sum (testsnon paramétriques)
pour le taux de saisieet la mortalité.car lesvaleurs
pour ces paramètres n'étaient pas distribuées
normalementTouteslesanalysesont étéeffectuées
à I'aidedu logiciel Statistix.
II - Résultats
II. l. Résultatssérologiquesanémieinfectieuse
Sur les 20 lots étudiés.18 ont été trouvésnégatifs
(14 lots avec10/10négatrfset 4 lots avec9 négatifs
et I suspect)et 2 positifs (l lot avec9 négatifset I
positif et un lot avec 4 négatifs. 4 suspectset 2
positifs).
Pour desraisonsde confidentialité,les valeursdes
performanceszootechniquessont présentéessous
une forme indrcee.les performancesmoyennesde
I'ensemblede l'échantillonétant égalesà 100 (cf.
tableauI et figure l).
II.3. Comparaisondes résultatszootechniqueset
sérologiques
Les lots positifs en anémie infectieuseprésentent
un poidsmoyenà I'abattageinférieur,un indice de
consommation.un pourcentagede saisie et une
mortalitétotalesuffrieurs.
La différence observéeest sigruficative entre les
lots positifs et négatifs pour le pourcentagede
salsle.
III - Discussion
Dans cette étude, la prévalencesérologiquede
I'anémieinfectieuseobservéeen pouletsde chair à
35jours est de l0 pour 100.Une sérologiepositive
à l'abattoir révèle une contamination horizontale
du virus. Dans la plupart descas,les poussinssont
issusde reproducteursporteursd'anticorpsanémie
infectieuse et possèdent donc une protection
immunilaired'originematernelle.Celleri est plus
ou moins éleveeet retarde l'âge d'une éventuelle
contamination horizontale. En moyenne. la
disparition des anticorps maternelss'effectuedans
les l0 premiersjours de vie L'anémie infectieuse
sub-clinique est due à une contamination virale
après épuisementdes anûcorps maternelssachant
qu'à partir de 5 semaines.les conséquencesde
waisemblablement
très
I'infection
sont
négligeables.Suite à une infection par le virus de
I'anémie infectieuse. les premiers anticorps
apparaissentl0 jours aprèsla mise en contactavec
le virus et au bout de 5 semaines,la sérologie
donne100% de positifs.
Un résultat sérologiquepositif à 35 iours a pour
origine une infection qui s'estoperéeau plus tard
vers 25 jours. Dans cette étude, un lot a été
considérécomme positif si au moins un des l0
prélèvementsétait positif. Dans l'étude de Mc
Nulty. le critère de positMté reposait sur la
positifs sur
présenced'au moins 6 prélèvements
l0 mais l'âge à la prise de sang était plus tardif
(40-41jours).
de
Un résultat positif à 35 jours s'accompagne
performances zootechniques altérées ce qui
confirme I'etude de Mac Nulty (Mc Nulty et al.'
leel) .
Cette étude avait mis en évidenceun effet néfaste
significatif de t'anémie infectieusesubclinique sur
le poids. I'indice de corsommaton, et la marge
brute ainsi qu'un effet non significatif sur la
86
mortalitéet les problèmeslocomoteursDans cene
étude-ciest observée.de façon non significative,
une détérioration du poids. de I'indice de
consommationet de la mortalité et. de façon
signifrcatire.une augmentationdu taux de saisie.
Malgré la faiblessedu nombrede lots positifs. et
par conséquentla faiblessedes conclusionsqur
peul€nt en être tirées. les résultatsobtenusvont
dans le mêmesensque ceux de l,enquêtede Mc
Nultl.
L'anérnie infectieuse sub-clinique a des
conséquencesfâcheusesqui résultent soit de
I'irfection proprementdite despouletspar le CAV.
soit d'unediminutionde leur potentielimmunitarre
du fait d'autres infections virales (Gumboro.
Marek.Réovirus.adénovirusetc ..) qui en magnifie
les effets (Rosenberger. 1992). Un resultat
sérologiquepositif en anémieinfectieusedoit donc
corrduire le clinicien à pousserplus avant ses
investigatious et à s'intéresser aux autres
contâmlnants
virauxde l'élevage.
Un coutrôlesérologiqueprécoceà 35 jours permet
d'une part d'évaluer I'incidence de I'anémie
infectieuseet d'autreparî d,expliquerles mauvarses
performances
d'un lol
L'âge de 35 jours est précoce et conduit
certainementà sous-estimer
I'incidencede I'anémie
infecûeuse.En effet, le nombrede sérumspositifs
dansun lot au débutde la seroconversionest faible.
Pour diminuer ces faux négatifs, il conviendrait
d'augmenter le nombre de prélwements
sérologiqueset de retarder le contrôle à 42 jours
quandIa datede I'abattageIe permet.
Références
Drouin P.. Picault J.P. et coll., 1992.Rec. Med.
Vet..168(5),331-339.
Hu L. Lucio B.. SchatK.A., 1993.Av Dis., 37,
ts'l-169.
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ll. l-5.
Mc Nulty M.S., Mc Ilroy S.G.et coll., 199I. Av.
Dis.. 35. 263-268.
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Otaki Y.. SaitoK. et coll.. 1992.Av. Path..21.
t47-15t.
PicaultJ.P..Toquin D. et coll.. 1992.Rec. Med.
Vet..168(10).815-822.
RosenbergerJ.K.. 1992. Poultry digest, January.
36-38
Yielitz E.. 1989.PoultrvMisset.34-35.
87
deslots en tbnctionde leru statutsérologiqueà I'abattagevis-à-visde I'anérnie
zootechniques
TABLEAU I : pertbrmances
du coetlicient de variation CV en %)
intèctieuse(valerusildicées accompagnées
Ensemble(n = 20)
Lots négatit's(n = l8)
Lotspositilis(n = 2)
o'f 1
Poids moyen
(cv)
100
(3.54)
| 00.3
(3.56)
(2.3I )
Indice de consommation
(CV)
100
(e.38)
100.0
(e.36)
tol.7
( 13,36)
Mortèlilé k)tale
100
( 31 . 8 e )
98.9
(2e.9o)
(5e.r 5)
(c\)
* diftérence:n
I 10.1
0.05
ù
FIGIJRE I : Représeltatiol graphique des pertbnnances zoolechniques des lots en tbnction de letrr staltlt sérologiqtle
I'abaftagevis-à-vis de I'arÉmie iutèctieuse
ffi tots négatlfs I tots positlfs
Polcls
lncllce
n,|orta
I lté
Salsles
MISE AU POINT D'UN TEST PCR POUR LE I'IAGNOSTIC DE LI\ MALI\DIE DE MAREK CEII,Z
LEPOULET
Jay Marielaure,
ChausséAnneMarie, Dambrine Ginette et Coudert Françoise
INRA, Stationde PathologieAviaire et de Parasitologie,Laboratoirede Virologie. 373s0, Nouzilly, France.
Résumé
La maladie de Marelq chez le poulet, est induite par un virus du groupe herpès : le virus de la maladie de
Marek (t!DD. Cette maladie peut apparaitre difficile à diagnostiquerdu fait de la variabilité des signes
cliniques, de la forte parenteantgénique qui existeentre les virus oncogèneset vaccinauxet enfin de l'absénce
de signescliniques caractéristiqueslors de I'infection par des soucheshypewirulentesapparuesnouvellement
sur le terrain. Afin de disposerd'un diagnosticfiable, specifiqueet simple à réaliser nous mettonsau point un
test PCR qui permettra de mettre en fuidence le génomeviral dans des prélwements de sang d'ànimaux
inoculéspar diftrents sérotypesde virus MDV.
- Nous avonspu détecterspecifiquementle génomede virus MDV de sérotypeI chezdesanimaux inoculés.
- Les leucocSrtes
du sang periphérique semblentêtre un matériel plus approprié que le sang total pour la
détectiondu virus
- La vaccinationsemblediminuer la possibilitéde détectiond'un virus virulent inoculé aprèsvaccination.
Abstract
Setting up a PCR test to diapose Marek's diseasein chicken
Marek's diseasein chicken is inducedby an herpesvirus : the Marek's diseasevirus (MDg. This diseasemay
apPf,ar.litrcult to diagnosebecauseof the wide variety of clinical signs, becauseoncogenic and vaccinal
strainsare antigenically higtrly relatedand becauseinfection with the newly appearedhypervirulent strains do
not induce classical clinical signs. In order to provide a reliable, specific and simple mean to diagnosethe
disease,we are setting up a PCR test to detectthe viral genomein blood samplesfrom chickensinfected with
different À/DV serotypes.
- We havespecifically detectedviral genomèfrom chickensinfectedwith IvIDV serotlpe I virus
- Leucocytesfrom peripheralblood seemto be more suitablethan whole blood cell for the detectionof the virus
- Vaccinaton seemsto reducethe possibility to detecta virulent virus inoculatedafter vaccination.
Introduction
La maladie de lvlarek, chez le poulet, est induite par
un virus du groupeherpÈs: le vinrs de la maladiede
Marek (t!D$.
ElIe se caractérise sur le plan
clinique par le developpementd'un lymphome T et
une paralysie des animaux (Calnek et Witter l99l).
Cette maladietrès contagieuseentraine zur le terrain
des pertesqui pewent être sevères.Dans les annees
70, la mise en place d'une vaccination a permis de
lutter de façon efrcace contre cettepathologie.Cette
vaccination consiste en I'inoculaton de souches
virales vivantes non oncogènespour le poulet A qui
protègent oontre le développementdes tumeurs.
Récemment des souches virales hypewirulenûes
conte lesqælles la vaccination semblepeu efficace
sont appanEs sur le ærrain. ces souchesentraînent
une apparition des sigpes caractéristiquesde la
maladie. Iæ diagnostic de la natadie de ldarek
s'efiectue généralementpar autopsie des animaux
serotlpe l. Dans un premier ûempsnousavonsutrlisé
desamoroesqui permenentd'ampliûer une séqrænce
situeedans le gèneICP4 (Li et aI. 1994)des souches
de sérotypeI (pathogènes+ attenuées);oes amoroes
morts; cette observation macroscopiquepeut être
complétéepar une étudehistologiquedes nerfs. Face
à la difficulté d'effectuer ce type de diagnostic dans
le cas des souches hypervirulentes il semble
necessairede dwelopper de nouvelles techniques
pour détecterla présencedu virus oncogènechez les
animaux. Les techniques sérologiquesde mise en
évidenced'antigènes viraux semblent peu adaptees
en raison de la parenté antigénique des souches
pathogèneset des souchesvaccinales. Face à ces
difrcultés la mise en âridencedu génomeviral par la
techniquede PCRpourrait être la solution permettant
d'identifier sans ambiguTtéet de façon rapide la
présencede soucheshypewirulentes utlisees pour la
vaccination.
Dans ce but no|Is mettons au point un test de
diagnostic PCR qui permettra de distinguer les
souchesvaccinalesde sérotypeI atténuées(Rispens)
et de sérotpe 3 (H\If) des souchespathogènesde
ne reconnaissentpas le vinrs HVT. Nous avons ici
étudié qælle est la fraction du sang la plus
appropriê à ce tpe de test et I'effet de la vaccination
sur la détection du vinrs pathogène.Il convient de
DeurièmesJouméesde la RechercheAvicole, Tours,6-10 avril 1997
89
représentequ'environ l/100 des cellules. Dans les
conditions que nous avons utilisé, la proportion
relatve de lyrnphocytesT hébergeantle virus dans le
sang total n'est donc pas suffisante pour permettre
Matériel et méthodes
une amplification en PCR. Par ailleurs il faut noter,
Poulets: Lignée Leghorn blanc homogènepour le dans cette expériencemais égalementdans d'autres
complexe majeur d'histocompatbilité d'haplotype non decrites ici, que tous les animaux inoculés ne
813 qui est très sensible au dweloppement des présentent pas d'amplificaton en PCR. Cette
observationpounait correspondreà une différencede
tumeursinduitespar MDV.
charge virale chez les animaux inoculés. L'absence
pourrait refléter un
stade
par
la
d'amplificaton
Souchesvirales : Les animaux ont étévaccinés
faible,
precoce
virale
serait
la
charge
oir
pathologique
L'infection
d'épreuve
souchede sérotype3 GIVT) .
a été réaliséepar RBI-B : souchehy'pervirulentede en effet il sembleque le niveau de détectionest plus
élevé chez les animaux présentant des signes
sérotype1.
cliniques que chez ceux n'en présentant pas.
Amorces pour la PCR : Nous avons utilisé les Alternativement la différence de charge virale
amorcessuivantes: Pl : 5'-GAT CGC CCA CCA pourrait correspondreà des degrésde résistanceau
CGA TtA CTA CCT-3' et P2 : 5'-AAT GAG CGA développementde la maladie de Marek différents
ACT GCC TCA CAC AAC-3'. Les Produits entre les animauxpositifs et négatifs.
d'amplification ont été analyséspar migraton en gel Effet de la vaccinationsur la détection
d'électrophorèse. La specificité des ftagments Nous avonsénrdié si la vaccinationjoue un rôle sur
d'amplification a été vérifiee par hybridaûon avec la détection d'un virus pathogène.Deux gloupes
d'animaux ont été râlises : l'un a été vaccinépar
une sondeICP4.
IIVT puis 4 jours plus urd inoculé par la souche
hypervinrlente RBI-B, le second a été uniquement
Résultatset discussion
inoculé par la soucheRBI-B. Pour l'ensembledes 2
goupes desprélèvementsont été effectuésentre 6 et
Naturedu prélèvementà effectuer.
qui
ne
8 jours aprèsI'inoculation de FAI-B et la présence
Le sangest un prélèvementsimple à realiser
qui
permet
virus a été analyseepar PCR sur de I'ADN extrait
du
nécessitepas de sacrifier I'animal ce
partir
prélwements
de la fraction leucocytaire.Les résultatssont
plusieurs
à
éventuellement d'effectuer
présentés
dansle tableau2.
d'amplification
signal
du
afin d'étudier I'evolution
pathologiques.
Nous
stades
des
différents
au cours
avonsexaminé si diftrentes fractions du sang sont TABLEAU 2
equivalentespour la détectiondu virus. Nous avons
analysé chez des animaux inoculés par la souche
Trartement
pathogène F.BI-B la détection du signal
d'amplification sur I'ADN extrait à partir du sang
Niveau de détection
total (erythrocytes + leucocytes) ou à partir des
RBI.B
HVT
leucocytes. Les résultats sont présentés dans le
tableaul.
noter que les résultatsprésenæssont préliminaires et
nécessitentd'être confirmés.
3/ll*
TABLEAU 1
8/8*
Fraction cellulaire
Niveau de détection
On observeque dans ces conditons la vaccination
diminue de façon notablela possibilité de détecterle
t0l12*
Leucocytes
génome d'un virus infectieux inoculé après
2l12*
Sangtotal
vaccinaton. Cette différence pourrait également
refléter rme différencede chargevirale entre anirnaux
*
puis infectés et animaux uniquement
vaccinés
un
lesquels
chez
: Représentele nombred'animaux
La vaccination pourrait limiter la
infectés.
le
nombre
sur
détecté
est
signal d'nmplification
multiplication du vinrs infectieux qui ne serait pas
d'animaux inoculéstestés.
détecté en PCR. Il oonvient de vérifier cette
observation en effectuant en particulier des
Le niveau de detection est meilleur lorsque I'on
plus tardives que 8 jours
utiliæ de I'ADN provenantde la fraction leucocytaire prélevementsà des dates
pour
determiner si chez les
inoculation
après
que du sang total. Ce rézultat traduit
pas simplement d'un
il
ne
s'agit
vaocinés
animeux
waisemblablementle fait que le virus a pour cible le
donc
dâns la détectiondu
et
l'appariton
dans
retard
lymphocyte T qui est largement représentédans ta
pathogène.
virus
il
ne
fraction leucocytairealors que dansle sangtotal
90
infectés, Par ailleurs le niveau de résistance au
développementdes tumeurs de la maladie de Marek
pounait déterminer des charges virales différentes
Nous avonsmis en place les premiers élémens pour chez les animaux infectés même en l'absence de
la realisaton d'un diagnosticde la maladiede Marek vaccination. Chez le poulet des lignês
par PCR. Grâce à des amorces specifiques il est génétiquementrésistantesou sensiblesà la maladie
possible de détecter les virus de serotype 1. de ldarek ont été dweloppees;nous nous attacherons
Cependant à I'aide de ces amorces, il n'est pas à déterminer s'il existe, entre ces lignées, une
possiblede différencier à I'intérieur du serotypeI les diftrence de chargevirale lors de l'infection par une
virus atténuésutilisés pour la vaccinaton des virus
souche pathogène. Ces études sur I'effet de la
pathogènes.L'atténuation des virus pathogènespar vaccinationet sur I'influence de la sensibilitéà la
passagesen culture successifs s'accompagne de maladie de Marek sur la détectiondu virus et sur la
l'amplification d'une séquencede 132pb; les souches chargevirale permettrontde préciserles mecanismes
pathogènesprésententde I'ordre de 2 répétitionsde mis en jeu dans la protection vaccinale et dans la
la séquencede 132 pb alors que les souches résistance.
vaccinales présentent de I'ordre d'une dizaine de
La mise au pornt d'un diagnostic simple et fiable
répettons de la même séquence.En utlisant des conjuguer à une meilleure compréhension des
amorces qui flanquent cette sequencede 132 pb mécanismesde résisAncepermettrontd'améliorer de
Davidson et al. ont pu mette en e\ddence cette façonefficacela lutte contre la maladiede Marek.
par
amplificaton
migration des produits
d'amplification en gel d'agarose.Nous introduirons Références
cettenowelle PCRafin de préciserle diagnosticet de
différencier les animaux vaccinés par une souche Calnek, B.W. et Witter, R.L. 1991. Neoplastic
atténueede serotypeI des animaux infectéspar une diseases: Marek's diseasein Diseaseof Poultry ninth
souchepathogènede mêmeserotype.
edition,
ed.
Calnek,
Wolfe
Publishing
Tous les animaux infectés par une soucheMDV de Ltd,Ames,Iowa
: pp 342-385.
serotype I ne présententpas une amplification en
PCR. L'absence de signal pourrait correspondreà Davidson,I., Borovskaya,A., Perl, S., et Malkinson,
une différence de charge virale chez les animaux M., 1995.AvianPath.,24, 69-94.
infectés. Au moins 2 facteus sont susceptiblesde
modifier cette charge virale. D'une part la Li, D. S., Pastorek,J., Zelnik,V., Smith, G. D., et
vaccination puisque I'on obserye un nombre plus Ross,L. N. J., 1994.J. Gen.Virol.75, L7l3-1722.
élevé de PCR négativeschez les animaux vaccinés
puis infectés que chez les animaur uniquement
Conclusionset perspectives
9l
DURÉED'IMMUNITÉ coxTÉnÉn pan UN VAccIN DE LA MALADIE DE MARDK.
Le Gros tr'rançois-Xavier,
GoutebrozeSylvain
RhôneMérieux,Laboratoire
deLyonGerland,254rueMarcelMérieux,69007Lyon
Résumé
Vingt huit poussinsreproducteurs
chairsfurent vaccinésau couvoir au moyend'un vaccin associéà souches
Rispenset HVT. Ils furent maintenusen conditions protégéesjusqu'à l'âge de 18 semaines.A cettedate, une
épreuvefut praûquéepar voie intrapéritonéaleau moyende la souchehypervirulenteRBIB. Dix témoinsEOPS
furent ajoutéscommetémoinsd'éprewe.
Après l0 semainesd'observation, les animaux survivants furent sacrifiés et autopsiéspour recherchedes
lésionsde la maladiede Marek. 80% des animaux témoinsse révélèrentsensiblesà l'éprewe, alors que la
totalitédesanimauxvaccinésfurent protégés.
Le caractèredurable de I'immunité conféréepar la vaccination de la maladie de Marek à l'âge de I jour est
confirmé.
Introduction
2. Résultats
Les donnéesadmisesquant à la durée d'immunité
conféreepar la vaccinaûonde la maladiede Marek à
l'âge de I jour ont été recemmentremisesen cause
par des observaûonsfaites en élevage. conduisant
certainsà pratiquerdesvaccinationsrepétéesà l'âge
de I jour puis de 7 ou2ljours (Payne"1993; Vielitz
et al.. 1993) Cet essai visait à confirmer que la
vaccination pratiquéeà l'âge de I jour et non suivie
de rappel.està I'origine d'une immunitétrès durable
(Calneket al.. l99l).
2.1. Sérologie
l. Matériel et méthodes
Un lot de 500 poulettesJVl5 (ISA) vaccineesà l'âge
de I jour au couvoir par injection mécaniqued'une
dosede vaccin CRYOMAREX-HVT(lot 53Al16) et
CRYOMAREX-RISPENS0or 53F166)a été mis en
place immédiatementdans les animaleriesprotégées
de Rhône Mérieux. Une recherche d'immunité
parentale fut effectueesur 15 de ces animaux par
réactiond'immunofluorescenceindirecte $u un tapis
cellulaire fixé, de fibroblastesd'embryon de poulet
infectéspar le virus HVT FCl26.
A l'âge de lE semaines,29 animaux de ce groupeont
ététransférésen locaux d'épreuvepour y recevoirpar
voie intrapéritonéale un inoculum de virus RBIB
(groupe Gl). A cette date, la même épreuve fut
pratiquee$u un secondgroupe de l0 poulets EOPS
âgés de 4 semaines (groupe G2), ce groupe
constituant le témoin d'éprewe. Ultérieurement, les
animaux furent observésquotdiennement pendant
T0jours pour recherchedes symptômeset lésions de
la maladiede Marek.
Sur les 15 semmstestés,13furent clairementpositifs
à la dilution l/30, un douteuxet un négatif.
2.2. Observationssur le groupeGl
Un animal du groupe Gl fut trowé mort sanssigne
cliniqueprealable,49jours aprèsépreuve.L'autopsie
pratiquée n'a pas revélé de lésion macroscopique
autre qu'une légèreaérosacculite;I'actvité ovarienne
était normale à cet âge (25 semaines), I'animal
présentantde nombreuxfollicules en développement
et un oeuf formé dans I'oviducte. Des observations
histologiquesconduitessur le proventricule,le coeur,
la rate, le foie, le rein, un plexus sciatiquen'ont
montré qu'une discrète lésion de myocardite à
infiltrat cellulaire polynucléaire.
Lors de l'autopsie de fin d'essai, 70 jours après
épreuve,aucunelésion macroscopiquene fut relevée
sur les 28 sujets restants, qui montraient tous une
actvité de ponte normale et une surchargegraisseuse
importante. 7 d'entre eux, pris au hasard fuent
l'objet de prélèvements histologiques (plenrs
sciaûque,foie, rate, rein).
Seules, les coupes hepatiques revèlèrent une
surcharge lipidique associée à une discrète
infiltration inflammatoire desespacesportes.
2.3. Observations $rr le groupe G2
6 sujetsmoururententre 43 et 61 jours aprèsépreuve,
présentantindifférernmentde la splémomégalie,des
tumeurs spléniques, rénales ou myocardiques.La
figure I indique l'évolution de la moralité cumulée
sur ce groupe.Lors de l'autopsie de fin d'essai,deux
DeuxièmesJournéesde Ia RechercheAvicolc, Tours, 8-10avril 1997
93
FIGURE I : Evolution de la mortalité cumulée du
groupe
g
4. Conclusion
n
,--
ailleurs de confirmer que cettemortalité était due à la
maladie de Marek. Nous proposonsdonc d'exclure
cet animal de I'essai. f,e scorede protection observé
dans ces conditions fut donc de 28 animaux sur 28.
En effet, les imageshistologiquesrelevéesn'woquent
aucunesuspicionde maladiede Marek, et furent très
probablement la conséquence du programme
d'alimentationqd libitum pratiqué,à I'origine d'un
phénomènede stéatosehépatrque Un rationnement
eut été préférable sur ces animaux de souchechair.
commeil estd'usageen élevageindustriel.
)A
La très longuedurée d'immunité suivant I'injection
vaccinalepratiquéeà l'âge de I jour a été confirmée
dans cet essai.L'utilité de rappelsvaccinauxn'est
pas expérimentalementProuvée
Références
Anonyme. 1994. Pharmacopée Européenne.
sqets présentaientde I'ascite ou une splénomégalie. monographien" 589.
alors que les deux restantsne manifestaientaucune Calnek8.W.. Witter R.L.. 1991.Diseaseof Poultn
anomalievisible.
(9th Ed.). Iowa StateUniversirv".
E.. 1991.L'Aviculteur(519).
CoudertF.. Guinebert
3. Discussion
t5'7.
PayneL.N.. 1993.PoultryInt.,32 (13).32-36
La vaccination pratiquée à l'âge de I jour dans cet
Vielitz E.. VossM.. 1993.WorldPoult.Misset.9 (3).
pratique
:
représentatve
de
la
usuelle
essai fut
4649.
vaccirntion individuelle de rnasse utilisant un
appareil automatique, présence d'anticorps
maternels. Ullérieurement, les animaux ayant été
élevés en animalerie protégee, une contaminaûon
naturelle farsant office de rappel était très
improbable. L'épreuve pratquée à l'âge de 18
semainesa donc bien constitué un test de durée
d'immunité après I'injection vaccinale du premier
jour. La présenced'animaux EOPS (groupeG2) se
révélantsensiblesà l'épreuve,pratiqueeau moyende
la soucheRBIB, a confirmél'intensité et la validité
de cette dernière. La souchequi fut utilisée est par
ailleurs réputée pour un pouvoir pathogène
important, excedant à ce jour celui des souches
naturellement présentesen France (Coudert et al.,
1991).De plus,la dureed'observationde 70 jours qui
fut retenue après éprewe est en accord avec les
nonnes proposéespar la PharmacopeeEuropéenne
(Anonyme,1994).
Elle a excedéd'environ 15jours le délai nécessaireà
I'obtenton de I'effet 50olozur les témoins du groupe
G2. Cette durée était donc sufftsanteà I'observation
d'une éventuellesensibilité à l'épreuve des animaux
vaccinésdu groupeGl.
Sur ceuxæi, seul un animal a succombé après
épreuve.Aucun des signes relevésn'a permis par
94
IMPACT DU VIRUS DE LA MALADIE DE MAREK
EN PRODUCTION DE POULET STANDARI)
AlaphilippeAnner,Balloy Dominique2,
Billard Sylvie2,GuillaumeJean-Michelr.
I SASO.30, cheminde la MenudeZl en lacca31770Colomiers*
2 LABOVET. ZAC la Buzenière85500Les Herbiers*
3 ANILAB. ZI le Tirpen 56140Malestroit*
x Cestrois structuresappartiennentau RESEAUCRISTAL
Résumé
De nouvellesformesde maladiede Marek. caractérisées
par la précocitéd'apparitiondessymptômes.
sont apparuessur le terrain. L'application de mesuressanitairesstrictes.le respectdes normesd'élevageou
encorela vaccinationau couvoiront donnétoute satisfactionface à ce problème.La vaccinationdoit bien srir
resterle <<dernierrecours>. mais les essaiscomparatifsque nousavonseffectuésprouventbien qu'elle restela
seulesolutionpour maintenirdesperformances
correctesdansdesmilieux trèscontaminéspar le virus Marek
Introduction
La maladie de Marek est bien connue
depuisde nombreusesannéeschez la poule et le
poulet label. soussa forme classique: apparition
des symptômesà partir de 6 semainesd'âge avec
paralysieprogressivedespattes.desailes et parfois
du cou- mortalité brutale ou amaigrissement
progressif conduisant à la mort ; des lésions
tumorales des viscèrespeuvent être découvertesà
I'autopsie. Signalons enfin la forme cutanée
particulière au poulet label, et entraînantdespertes
économiques
préjudiciables.
La maladie de Marek est actuellementen
recrudescence
sur le territoire français. et a fait son
appariûon chezle poulet de chair sousdeu.rformes
nouvelles ayant pour point commun la précocité
d' apparition dessymptômes.
Une modification du pouvoir pathogène
vital (hypervirulenceou au contraire atténuation).
une pressionvirale plus forte, une contamination
précocedès l'éclosion mais aussi une interaction
avec les virus de I'anémie infectieuseeVou de la
maladiede Gumboropeuventexpliquer pour partie
I'apparitionde cesnouvellesformes.
I - Forme précoceaiguë
Cette forme apparaît dès deux semaines
d'âge. Au débutde la maladie,on note en élevage
une mortalité brutale sanssymptômepuis au bout
de quelquesjours, certains sujets présententune
paralysieprogressivedespattes,desailes et du cou.
Le lot devient hétérogène.L'expressionclinique
peut être plus ou moins typique du fart de
I'infection concomitante très fréquente avec
d'autres virus. L'autopsie des animau.rparall'ses
ne rer,Èleaucunelésion macroscopique
tumorale
La mortalitétotaledu lot estde 5 à 15 - 20 %ovofie
plus s'il y a infection simultanéepar le virus de
I'anémieinfectieuseou de la maladiede Gumboro
ce qui est fréquemment rencontré du fatt de
I'immunodépressioninduite par le virus Marek.
Les performances techniques sont fortement
détériorées.Le diagnosticde certitudepassepar
une histologie sur despouletsen fin de bandearant
le départà l'abattoir.
2 - Forme precoceatténuée
Il s'agit d'une forme plutôt atypique.
puisqu'elle ne présenteen effet aucun des aspects
cliniques évocateursde la forme precoceaiguë (pas
de mortalités brutales.ni de paralysies).Toutefois.
les animaux peuvent présenter transitoirement
durant la deuxième semaine de vie, un aspect
fébrile (ailes légèrement écartées, démarche
ébrieuseou (( sru les oeufsD).L'autopsiedessujets
ne revèle alors que des lésions secondaireset très
fragilité
type
osseuse.
inconstantes de
vitellus.
dyschondroplasie. persistance du
pericardite. entérite. L'examen histologique des
différents organes,notammentdes nerfs fémoraux
confirme le passagedu virus Marek.
La mortalité totale sur les troupeaux
atteints varie de 3 à I Vo avec des < dérapages>
fréquentsen fin de lot (entéritesaspécifiquessans
mortalité). Les performances techniques sont
évidemmentmédiocres(pertes trop élwées, poids
Deuxièmesfournées de la RechercheAvicole, Tours, &10 avril 1997
95
souvent insuffrsant. et
consommation
élevé).
surtout indice
de
3 - Les solutions
Faceà cesnouvellesformesde maladiede
Marek. différentsprocédésont permisd'obtenir de
bons résultats sur les lots suivants. sans
réapparitiondes s_vmptômes
décritsprécédemment
a) Nettol'agesoigné.doubledésinfectionet
videsanitairestrict
b) Passage
à la bandeuniquelorsquecela
n'était pas déjà le cas. accompagné
des mesures
sanitarres
décritesprécédemmenl
c) Vaccinationassociéeà une prophylaxie
samlaireadaptéedansles élevagessituésen (<zone
ii risque>. el ori la pressionvirale restetrès forte
rnalgrérmegestionsanitairecorrectedeslocaux.
Dansce derniercas,les essaiscomparatifs
de vaccination que nous avons effectuésmontrent
une améliorationnotabledesperformancessur les
lots vaccinés(voir le tableaude synthèse).Malgré
son coût economique, le vaccin reste donc une
solutionde sécuritéen milieu contaminé.
Conclusion
L'impact de la maladie de Marek en
élevageavicole est en nette augmentation: les
productionsstandard,jusqu'ici épargnées,sont de
plus en plus régulièrement touchees.Le nombre
croissant de formes precocesrépertoriéessur le
terrain nousconduit à reconsidérerI'importance de
cette affection : l'âge n'est pas plus le facteur
limiunt de I'expressionde la maladie.
Il convientdonc d'être vigilant, et de ne
plus éliminer EystématiquementI'hypothèse
< Marek > en élevagede poulets de chair de type
industriel et de faire tout pour que les conditions
d'hygiène s'améliorent au risque dans le cas
de vacciner.
contrairede voir s'étendrela nécessité
96
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ETUDE DE L'ANTIGENICITE DE LA PROTEINE CAP27 DES RETROVIRUS AVIAIRES :
INTDRET DANS LA CONCEPTION DE NOIIVEAIIX OUTILS DE DIAGNOSTIC
GuyonnetFranckl', Minta ZÉnonzrlasserretr'rédéricl,LescureFlorencer,Baudon pascaler,
GrosclaudeJeanne3,Barin Francisa,Goudeaualaina, Dambrine Ginetter
I Virologie et OncologieAviaire. PAP, INRA. 37380Nouzilly, France
2 Institut Vétérinaire,Al. Partyzantow57. 24100pulawy,pologne
3 Virologie et ImmunologieMoléculaires,INRA. 78352Jouy-en-Josas.
France
4 Virologie.URA CNRS 1334,CHU Breronneau.37044Tours.France
Résumé
La protéine de capsideCA p27 des rétrovirus aviaires est le support immunogèneessentielde cesvirus et la
réponseimmunitaire dirigée contre cette protéinevirale joue un rôle majeui dans le contrôlede l'infection
virale. C'est pourquoi nous avons entrepris l'étude de I'antigénicité de cette protéine et l'établissementde sa
carte épitopique.A cet effet plusieurs stratégiescomplémentairesont été misesen oeuvre Nous avonsproduit
des anticorps monoclonaux contre cette protéine et nous avons analysé leur specificité par dei tests
lmmunoenrymatiques
utlisant diftrentes souchesvirales. La ptupart des anticorpsreconnaissent
l'ensemble
dessouchesutilisées: deuxgroupesprésententdesspecificitésrestreinteset peuventêtrejudicieusement
utilisés
pour améliorerles testsde détectiondesvirus appliquésà I'heureactuelle.La cartographieépitopiquede la
protéine CA p27 a été effectuéepar l'étude des interactionsantigène-anticorps
mesuréepar résonance
plasmoniquede surfaceavecle systèmeBIAcore.Cetteétudea permisde déterminerI'existenced'aumoinshuit
épitopesdistinctssur la protéineCA p27 . Une approchecomplémentaire
a été effectuéeà I'aide de peptides
rynthéûquesmimant deux régionsde I'extrémitéC terminale de la protéine CA p27 qui se sont revélées
fortement antigéniques.L'ensemblede ces résultats devrait aboutir à la conceptionde nouveauxtests
sérologiques
hautementrapideset fiableset présentantde meilleuresperformancesque les testsactuellement
disponibles.
Introduction
L'infection par les rétrovirus aviaires est un
phénomènefrequentqui peut entraînerdesbaissesde
performanceszootechniques(Gavora et al., 1980)
préjudiciablesà la rentabilitédesélevagesavicolesou
être à I'origine du développementde néoplasies
(Reruede Payneet Purchase,1991).L'observationau
cours de ces dernières annês de plusieurs cas de
myélocytomatose, provoqués par rur nouveau
rétrovirusaviaire @ayneet al., l99la, b), entraînant
dans les troupeaux de production des taux de
mortalité pouvant atteindre 600Â, obligent à
poursuivre les efforts visant à l'éradication de ces
virus. Dans ce contexte,la mise au point de nouveaux
outils de diagnosticconstitueun facteur de progrès.
La coruraissancede l'antigénicité de la protéine de
capside CA p27 de ces virus doit permettre de
pawenir à cet objectif. En effet, la protéine CA p27
qui est le composantmajeur de la capsidevirale porte
la majorité des déterminantsantigéniquesde groupe
(Bolognesi et al., 1975 ; Guyonnet, 1993) et sa
révélation permet de démontrer la présence d'un
rétrovinrs aviaire, independammentde son sousgroupe. De plus, la protéine CA p27 est fortement
immunogène (Smith, 1977) et elle est produite en
grande quantité dans les fluides biologiques des
poules infectées (Clark et Doughe4y, l9E0 ;
Crittendenet Smith, 1984).LaprotéineCAp27 est
responsable
de I'inductionde réponsesimmunitaires
contrôlantle développement
de I'infectionvirale
qui préexistentsous
L'expressionde virus endogènes
forme d'une copie d'ADN dans le patrimoine des
poules saines non infectees peut conduire à la
production d'une protéine CA p21
endogène.
L'expressionde cetteprotéinepourrait être à l'origine
d'un phénomènede tolérance. favorisant I'infection
par un virus exogène et facilitant ainsi le
developpementdespathologiesassociées.
Les connaissancesrelatives à I'anûgénicité et à
I'immunogénicité de la protéine CA p21 étaient
paradoxalementtrès fragmentaireset c'est pourquoi
nous avons mis en oeuvre différentes stratégies
complémentairespour caractériserles épitopesde la
protéineCAp27 desrétrovirusaviaires.
d'anticorps
Imlement
d'une
collection
monoclonaux (AcMn) specifiques de la protéine
CAp27 exogène
Des souris BALB/C ont été immunisees par des
injections répeteesde protéine CA p27 purifiee par
électrophorèsepréparatve à partir d'une souchede
rétrovirus aviaire exogène que I'on peut aisément
Deuxièmes Journées de la Recherche Avicole. Tours. 8-10 ovril 1997
99
produire en quantité importante. la souchede vrrus
(Avian
AMV
Myeloblastosis Virus)-MAV
(Myeloblastosis
B
AssociatedVirus) de sous-groupe
expériences
indépendantes
fusions
de
Quatre
cellulaires ont été effectuéesentre les splénocytesde
souris immuneset le myélomeX-63-Ag653. Une
collectionde 320 hYbridomessécrétantdesanticorps
dirigéscontrela protéineCAp27 d'AMV (MAV)B a
étéobtenue
s'écouleen continu à la surface du biocapteur. La
liaison entre les deux molécules entraîne une
modificaûon de l'indice de réfraction du milieu
présentà la surf,acedu biocapteuret la conceptionde
l'appareil permetl'enregistrementd'un phénomènede
résonanceplasmoniquede surface(expriméen Unités
de Résonance).
Un signal de 1000 Unités de Résonance(UR)
correspondapproximativementà un changementde
par
Caractérisation des AcMn
dosages concentrationde surfacede I nglmm2 et traduit ainsi
immunoenzymatiques
la liaison éventuellede la moléculeen solutionavec
le ligand immobilisé.
Afin de préciserla spécificitéde reconnaissance
des
AcMn isolés. différentes souches de rétrovirus Deux stratégresdifférentes ont été mises en oeuwe
pour établir la topogaphie épitopiquede la protéine
aviaires appârtenantà plusieurs sous-groupesde
vrrus exogèneainsi que la soucheprototyflede virus
CAp27.
endogèneRAVO ont été utiliséesà titre d'antigène
dans des dosages immunoenry-matiques
de type Nous avons utilisé, dans une première étude, le
(Enn:me
ELISA
linked immunosorbentassay).Les biocapteur fourni par le fabricant qui reconnaît les
souchesAMV(MAV)B. RSV (Roussarcomavirus)AcMn de souris. quelle que soit leur specificité.
PragueB. RAV (Rous associatedvirus)-l de sous- L'étape limitante de cette stratégie pour
groupeA et la soucheRSV-SchmidtRuppin D ont
d'unecarteépitopiquerésidedansles
l'établissement
ététestéesi\ titre devinrs exogène
capacités de capture de I'antigène par les AcMn
obtenus.Dans notre cas, l'AcMn DCI interagissant
La plupart des AcMn réagissentavec les difiérentes avec le biocapteur s'est avéré capablede se lier de
manièrestableavecla protéineCAp27 présentedans
souchesvirales utiliséesdans les tests ELISA :
I'intensitédes réactionsobsenéesest très variable le milieu fluide.
d'un AcMn à I'autre. suggérant I'existence de
plusieursépitopessur la protéineCA p27 . L'un des Dans une deutème approche,nousavonsimmobilisé
AcMn reconnaîtuniquementla protéineCA p27 de
la protéine CA p27 sur le biocapteur, de manière
la souchevirale avantsen'i à irnmuniserles souris: il
covalente. par I'intermédiaire des groupements
défurit ainsi une spécificitéde souchesur la protéine amlne.
de capsideCA p21 qui n'avait jamais été décrite
aupara\,'ant.Neuf AcMn réagissentexclusivement
ar.ecles souchesviralesdessous-groupes
exogèneset
FIGURE I: Topographiedesépitopesreconnuspar
pourraientêtre utilisés pour discriminer les formes les AcMn dirigéscontrela protéineCAp27
esogèneet endogènede la protéine CA p27 des
rétrovirusaviaires.
Cartographie épitopique de la protéine CA p27
par I'utilisation du systèmeBIAcore
Des AcMn représentatifs
de la collectionisoléeont
des
été utilisés pour déterminers'ils reconnaissaient
idenûquesou différents
épitopestopographiquement
Le sl'stèmeBIAcoreest aulourd'huile rystèmele plus
performant,utilisable dans ce domaine(Jôussonet
al.. l99l). I permet en effet de quantifier des
interactions moléculaires,en temps réel, par Ia
mesure d'un phénomèneplasmonique de surface
L'appareil est muni de trois éléments: un biocapteur.
une microplaquettefluidique et une unité optique.
L'un des réactifs (ex. protéine CA p27 ) est
immobilisé par liaison covalentesur une couche de
dextranfixée sur le biocapteur.L'autre réactif (ex :
AcMn dirigé contrela protéineCAp27 ) est introduit
par le systèmemicrofluidique dans une solution qui
/;:
I
NLJ
'
G)
L'injection des AcMn a ensuiteété effectuéeafin de
quantifier les interactionsdes différents AcMn avec
la protéine CA p27 captee par l'AcMn DCl ou
immobilisée sur le biocapteur. L'amplitude de ces
100
interacûons se traduit par un signal exprimé en
unités de résonance.
FIGURE tr : Régionsde la protéineCAp27 utilisees
pour la synthèsed'oligopeptdes.
- Région 137-191 : -synthèse de 3 peptdes
Des injectionsséquentielles
d'AcMn ont été réalisês
chevauchants :
séquences correspondantes
afin d'établirles relationsexistantentreles différents soulignées.
épitopesreconms par les AcMn. Des phénomènes - Région157-185= MHR (Major HomologyRegion),
d'additivité(augmentation
du signalde résonance)
ou
italique.
au contraired'inhibition de liaison ont été observés. - Région 206-230 : - synthèse de 3 peptides
L'additivité traduit une indépendancedes épitopes chevauchantsainsi que d'un peptide correspondantà
reconnuspar les AcMn utilisésalors que I'inhibition la séquencecomplète.
rérèle I'existenced'unerelationentrecesépitopes.
154,
L'ensemble des résultats obtenus par les deux
stratégiesa permis de mettre en elidence I'existence
de huit épitopesindépendants.parmi ceuxæi. deux
groupes d'AcMn semblent définir deux familles
d'épitopesapparenrés
(Fig. I).
v
NH2.-.SAL OAFREVARLAEPAGPWADIN,IOG
A
I
137
159
t75
v
S1'nthèse
d'oligopeptidesmimant des régions de la
protéine CA p27 potentiellementimmunogènes
La synthèsed'oligopeptides
(Van Regenmortelet al..
1988) constitue une stratégrecomplérnentaireaux
investigationsprécédentes
pour définir les régionsde
la protéine CA p27 responsables
de I'induction de
réactionimmunitaires.
PSE:;FI' DFANRLIKA Iry GSDLPPS,4RAPVIID
1
185
t9l
230
I
206
J
QLI RTAPSTLTTPGEIIKYVLDRQKTAP--COOH
ô^
I
206
2t7
I
2t2
L'analvsede la réactivité des AcMn vis à vis de
fragurents peptidiques de la protéine CA p2i
résultantde clivage clumique avait montré que la
plupart d'entreeux étaientdirigés contre l,extrémité
C tenninale de la protéine (Guyonnet. 1993).
L'identification des fragments reconnus par ces
anticorps et I'application de programmes de
prédictionsépitopiquesavaient conduit à identffier
une région sittÉe entre les résidus 206 et 230
comportantdeuxépiropespotentiels(Fig II).
La deuxièmerégion que nousavonschoisi d'étudier
s'étend des résidus 137 à I9l et comporte une
séquence
dénomméeMHR (Major HomoloryRegion)
qui est très consen'eedans toute la famille des
rétrovirus.incluant aussibien les virus leucosiques
aviairesque les virus humainscommele virus HIV
(Human immunodeficiencyvirus). Cette région
semblejouer un rôle majeur dans la maturation des
virions chez les rétrovinrs aviaires (Craven et al..
1995)et les sérumsde sujetshumainsinfectéspar le
virus HIV
réagissent contre des peptides
correspondant à cette région. D'où lintérêt
d'entreprendreson étude dans le cas des rétrovirus
avlalfes.
223
219
Des oligopepûdeschevauchantsont été synthétisés
pour ces deux régions et la râctivité de sérumsde
poulets immunisés contre la protéine CA p27 on
expérimentalementinfectéspar les rétrovirus aviaires
a été recherchéepar des tests ELISA. La specificité
des réactions observéesa été vérifiee par un test
ELISA de compétitionen milieu liquide (Baillou et
al.. 1993). Les résultats obtenus montrent que
chacune des deux régions analyséescomporte des
peptides reconnuspar de tels serums. Ces peptides
représentent donc des épitopes sequentiels de la
protéineCAp27.
De plus. des injections répeteeschez la poule du
peptide 206-230 comportant une cystéine NH2
terminale conduit à la production d'anticorps
specifiquesqui reconnaissentégalementla protéine
CA p21. Cette observaûonrévèle non seulementque
ce peptide comporte des épitopes séquentielsmais
égalementqu'il est immunogènesans necessiterde
couplage à une protéine porteuse. Les anticorps
obtenuspeuventêtre mis en âridence dans le sérum
despoulesimmuniséeset leur purificaton à partir du
jaune d'oeufest égalementréalisable(TableauI).
101
TABLEAU I Reconnaissance
de la protéineCA p27
par les anticorpsdirigéscontrele peptide206-230
Absorbance
Sérum de poule
Dilution
prelmmun
lmmun
I , /1 0 0
1 ,1i 0 0 0
015
0.96
0.12
0.42
IgY purifiées à partir des
iaunesd'oeufs
non
spécifiques
snécifirnes
| ?s
0.0
11-7
0.0
contre la protéine CA p27 des rétrovirus aviaires.
Seulesdesméthodesde séroneutralisationnécessitant
la mise en oeuvre de cultures cellulaires sont
Celles-cipernettentde rechercherles
envisageables.
d'un groupe de virus donné
specifiques
anticorps
mais ne conduisentpas à la mise en évidenced'une
réponse sérologiquede groupe. La conception d'un
test reposantsur I'utilisation des peptidesque nous
avons étudiés serait un moyen de combler cette
lacune.
Enfin. la productiond'IgY de poulesspécifiquesdu
d'être isoléespendant
peptide 206-230.susceptibles
jours
après la dernière
pénode
270
de
une
L'isolementd'AcMn reconnaissantexclusivementla
protéine CA p27
la
reconnaissant
immunisation.
protéineCA p27 exogènenous a permis d'envisager
judicieuse
particulièrement
alternative
une
constitue
la conceptionde tests de détection des rétrovirus
protéine
CA
la
contre
production
d'anticorps
pour
la
aviaires plus spécifiques que le test ELISA
à
facile
peptide
206'230
de
p27
L'utilisation
test
courammentutilisé. Celui-ci est en effet un
ELISA de qpe sandwichdanslequel la phasesolide wnthétiserde manièrestrictementreproductibleévite
la purification fastidieuseet aléatoirede la protéine
est sensibiliséepar un sérum polyclonal de lapin
dirigé contre la protéine CAp27 exogènequi sert CA p27 C'est un exemple d'application
complémentairede I'intérêt des oligopeptidesde
pour
égalementde conjugrré.coupléà la perox-vdase.
qu'il convientde souligner.
révéler la présence de protéine CA p27 dans svnthèse
l'échantillonanalysé.Ce test ELISA sandwich est
facile à réaliser.rapide.sensibleet il est utilisé dans Références
les programmesd'éradicationdes vints leucostques
BaillouA.. BrandD.. DenisF. MboupS - ChoutR.
aviaires.Toutefois.il ne permetpas de distinguerIa
Goudau A - Barin F.. t993. AIDS researchand
protéine CA p27 résultant d'une infection par un
9. 1203-1209
rétrovirusexogèneet la protéineCA p27 provenanl humanretroviruses.
BolognesiD P. Ishizaki R.. Huper G.- Vanaman
de I'expressiond'une séquenceendogèue.Panni les
T C.. SmithR E.. 1975.Virology.64.34e-357
AcMn reconnaissantexclusivementla protéine CA
R.M.. 1980.J Gen Virol..
p27 exogène.nous avons choisi de déterminerles Clark D P. Doughert-v
+
7
.
2
8
3
2
9
1
caractéristiquesprécises des AcMn produits par
A.E . WeldonR.A Jr .
CravenR.C.. Leure-du-Pree
I'hybridome le plus stable La spécificité de
69.4213-4227
J.
Virol.
J.W.
1995
Wills
reconnaissânce
de l'AcMn QAI a ainsi étéconfirmée
et nousavonspoursuiviles essaisafin de déterminer CrittendenL.B. SrnithE.J. 1984.Avian Dis . 28.
1057-1070
les conditionsd'utilisationde cet AcMn dansun test
J.S..SpencerJ L.. GoweR.S. Harris D.L Gavora
ELISA sandwich Plusieurscombinaisonsd'AcMn.
1980.Poult.Sci..59, 2165-21',78
choisies en fonction des résultats fournis par la
F. 1993 Thèsede l'UniversitéFrançois
topographie épitopique obtenue par le système Gu,vonnet
283 pages.
Tours.
Rabelais.
BIAcore ont été éprouvéesafin de présener la
L G.. Ivarsson 8., and
Fâgerstam
U."
sensibilitédu test tout en améliorant sa spécificité. Jônsson
11.62O427.
BioTechniques.
1991.
B
Johnsson
.
Les résultatspréliminairesque nous avons obtenus
In : Diseasesof
1991.
H.G.'
Purchase
L.N.,
Payne
avec des échantillonsde troupeauxexpérimentaux
Ltd. Ame
Publishittg
(Calnek
Wolfe
edit.).
Poultry.
sont conformesà notre attenteet nousavonsentrepns
pp
386.
Iowa.
desessaisà plus grandeéchellesur des troupeauxde
PayneL N.. Brown S R.. BumsteadN.' Howes K production.
FrazierJ.A, ThoulessM.E., l99la. J Gen.Virol--72'
L'étude de la réactivité des oligopeptidesde synthèse 801-807
PayneL N., GillespieA.M., HowesK., l99lb' Vet.
ouvre la voie à la concepton de nouveaux tests de
Rec.,129.447'448.
diagnosticutilisablesen sérologieaviaire.En effet, la
producûonde ces peptidesest facile à réaliser,peu SmithE J., 1977.Avian Dis., 2I, 290-299.
J.P., Muller S..
coûteuse; I'utilisation de ces peptidesdans des tests Van RegenmortelM.H.V., Briand
Techruquesin
Laboratory
1988.
Plaue
S.,
and
immuno-enzymaûquesne pose pas de problème
Elsevier,
Biology,
Molecular
and
Biochemistry
majeur.A I'heureactuelle,on ne disposepas de tests
19:1.
Amsterdam.
sérologiquespour la détection d'anticorps dirigés
Conceptionde nouveauxtestsde diagnostic
PNEUMOVIROSE ET BRONCIIITE INFECTIEUSE : ESSAI CLIMQUE DE VACCINATION SUR
POULETS DE CHAIR
Sylvain Goutebroze,ClaudeRoux, DominiqueFournier
RHONE MERIEUX, Laboratoirede Lyon Gerland,254,rue Marcel Mérieuç 69007Lyon, France.
Résumé
Un essaiclinique de vaccinationassociantrm pneumovirusaviaire et un coronavirusvariant aviaire (vaccins
NEMOVAC ND et BIORAL CR88 ND) a étéréalisésur le terrain chezle poulet de chair. Cet essaia étéeffectué
sur environ 800 000 poulets,les bâtimentsconcernésont été randomisésen deux groupeset wr placebo a été
administréenaveugledansI'un desgrolpes.Iæsvaccinsont étéadministnés
à l'âge de 14jours. La vaccinations'est
traduite par un retard d'apparition despathologiesrespiratoires.A I'abattage,une diminution relative de 33% du
nombrede bâtim€ntsayantprés€ntédesqmptômesrespiratoiresen coursd'élevagea étéconstatéedansle groupe
vacciné.Parailla:rs, lesmoyennesdu pourcentage
de saisie,du poidsmoy€nà I'abattage,du gain moyenquotidien
(GMQ), de I'indice de consommation
économique(ICe = poidsde I'rliment consommé/ [poids total - poids saisi])
ainsi que I'indice de performance(IP = viabilité x GMQ / ICE) sontamélioréssuite à la vaccination.
Introduction
Le pneumovirus aviaire et le coronavinrs de la
bronchiteinfectieuseaviairesonttousdeu:<impliques
dans les pathologies respiratoires du poulet. Le
premier est incriminé dansle SyndromeInfectieux
des GrossesTêtes (SIGT) (Alexander l99l). Le
secondinduit desinfectionsrespiratoireshauternent
contagieuses reconnues pour lew gravité
économique.Le virus de la bronchiteinfectieusese
caractâisepar ailleurspar sonoctêrne variabilité et
il a étémonnéqu'un vaccinde typeMassachusetts
ne
protégeait pas contre une épreuvedue à certaines
souchesvariantes@arsonset coll. l99tD.n étattdonc
intéressantd'évaluersur le terrain I'efficacité d'une
vaccination associant lm pneumovirus et un
coronavirusvariant chezle poulet de chair
Méthode
Trente-sixbâtimentsd'élevagede poulets de chair
mis en place sr:r une période de nois semaineset
représentantenviron 800 000 animarx ont été
randomisés en derur groupes. Des signes de
pathologierespiratoireavaie,lrtétéobservésdanstous
ces élevagessur les bandesde poulets précédant
I'essai. Les pouleB de I'ur des groupesont été
vaccinesà l'âge de 14jous avecNEMOVAC ND et
BIORAL CRSt ND. Ces deu:<vaccinscontie,nne,nt
respective,ne,lrtla souche de pneumovirtrs PL2l
isoléedu poulet,et le coronavirusvariantCR88l2l.
Lespouletsdu secondgroupeont roçu dew.placebo
à l'âge de 14jor.uségalement.
L'administrationdes
vaccinsou desplacebo s'est faite en aveugle.Le
vaccinNEMOVAC ND et le placeboconespondant
ont été distribuésdars I'eau de boisson.Le vaccin
BIORAL CR88 ND et son placebo ont été
arlministréspar nébulisationà I'aide d'un appareil
assurant la distribution à pression constante de
gouttelettes
comprisesentre50 et 250 pm. Lesdeux
vaccirs finent administrésà desdosesreprésentantla
doseminimale.
Les élevagesont été mis en observationaprèsla
vaccinationet tous les symptômescliniquesont été
relevés. Après I'abattage, les indices technicoéconomiquessuivantsont étécalculés:
- por.ucentage
de mortalité,
- powcentagede saisie,
- poidsmoyenà I'abattage,
- gain moyenquotidien(GMQ),
- indicede consommationéconomique(ICE) :
ICE = poids de I'aliment consommé/
[poidstotal - poidssaisi],
- indice de performance(IP) :
IP = viabilité x GMQ / ICE.
Résultats et discussion
L'analyse des résultas cliniques montre que
I'administration des vaccins NEMOVAC ND et
BIORAL CREEND a retardéde façon sigrificative
I'apparitiondespathologiesrespiratoires.Cet effet se
traduitpar unediminutionrelativede 33%du nombre
de bâtiments ayant prése'nté des symptômes
respiratoiresdans le groupe vacciné. Ces résultats
dansla Figue l.
sont prése,ntés
Deuxièmes
Journéesde la ReclercheAvicole,Tours,8-10awil 1997
103
respiratoiresont étéobservésentre I'administration
FIGIJRE 1 : Effectifscumulésdesbâtimentsoù des symptômes
desvaccinsou desplaceboet I'abattage.
I
J
E
=u
()
o
c)
(t)
o
o
o10
o
L
oo
E Bâtimentsnon vaccinés
IBâtiments vaccinés
9e
-
- l
l - -
{
I
-
-
a F
-
- ! l -
-
I
-
-
l F
-
- l -
- l -
-
lI--l
{
|
-
-
-
o
I
E
lo
o-6
-
-
{ }
-
- l l -
- - l l - - <
-
{}
-
-ll-
-
-
- -
E
o
q)
E4
Ut
- -l
l-
-
{
| -
-l
l-
-
{
b
I
-
{
}
-
-
-
'6
o2
o
c
c)
E
((û
(D
21
22
23
24
Jours d'âge
FIGURE 2 : Résultats
technico-économiques
desbâtimentsnon vaccinéset desbâtimentsvaccinés(pourcentage
de mortalité,poucentagede saisieet poidsmoyenà I'abattage).Unélevageayantprésentéunemortalité importante
de mortalité
associée
à dessymptômes
locomoterusa étéécartédu goupe vaccinépour le calculdu pourcentage
moyen.
3,43
3,35
po urc€ntagôdo mo rialité
104
FIGIJRE 2 (suite) : Résultatstechnico-économiques
desbâtimentsnon vaccinéset desbâtimentsvaccinés(gain
moyenquotidien(GMQ), indice de consommationéconomique(ICE) et indice de performance(IP)).
40,8
184
tB1
40,6
40,4
EFâtiments non vaccinés
Fâtiments vaccinés
\2
GMQ
rcE
D'autrepart,torx les indices technico-économiques,
exceptéle pourcentage
demortalité,sonten faveurdu
groupe vacciné. L'indice de performance,
notamment,est supérieurde 32 points en moyenne
dans les bâtiments d'animaux vaccinés, soit une
augmentationrelative de l,5o/o par rapport aux
bâtimentsd'animarx non vaccinés.Le pourcentage
demortalitéestle seulresultatdéfavorabledu groupe
vacciné. Cet indice est cependantfaussé par un
pourcentagede mortalité particulierement élevée
associénon pasà des symptômesrespiratoiresmais
à destroubleslocomoteurs.Si cet élevageest écarté,
le poucentagede mortalité devientinferieur dansle
groupevaccinécomparativementau groupetémoin.
L'ensemble des indices technico-économiques
moyens des deux groupes sont présentésdans la
Figure2.
NEMOVAC
L'efficacitéd'une vaccinationassociée
ND et BIORAL CR88 ND dansla lutte contreles
affectionsrespiratoiresdu poulet de chair est donc
démontréesur le terrain.
Références
of Poulûry,9th.
AlexanderB. J.,l99l.In Diseases
edition,Iowa StâteUniversityPress,669-673.
D., CookJ. K. A.,
Parsons
D, Ellis M. M., Cavanagh
1992.Y et.Rec.,131, 408.
105
I}IALADIE DE NEWCASTLE CHEZ LE GIBIER : FAISANS ET PERDRD(
ESSAI DE PREVENTION AVEC DIFFERENTS TYPES DE VACCIN
Guittet Michèle, Le Coq Hervé, Picault Jean-Paul,Yannick Morin
CNEVA-Ploufragan.B P 53. 22440Ploufragan
Résumé
L'iuuocuité et l'effrcacitédesvaccinsde la rnaladiede Nervcastleà virus vivants (tIBl et La Sota)et à virus
inactir,ésout été évaluéeschez le faisan de 6 semainesainsi que chez les perdrix grises et rougesde l0
selnalnes.
quelsque soientles r,accins.L'efficacitétestéesuiteà une épreuvevirulente 18
L'inuocuité a été satisfaisante
Lesvaccinsà virus vivantsont
lours aprèsla vaccinationa étédifférenteen fonctiondesvaccinset desespèces.
la
parmi toutescesespèces,
que
noter
Il
est
à
inactivés.
que
le
vaccin
à
virus
colféré unc ureilleureimmunité
perdrix rougeest la moinssensibleau virus pâthogènede la maladiede Newcastle.
Abstract
Safetl' and ellicacy of Newcastlediseasevaccinesin gamebirds
The safen'and effrcaq'of live vaccines(F{BI andLa Som)and inactivatedoil adjuvantedvaccinewereassessed
and in l() rveek-oldgrel' and red partridges.Whateverthe vaccineusedthe safetywas
in (r-ueek-oldpheasants
sarisfâcto[' Tire effrcaq' was testedbJ.challenge18 days after the vaccination.the results were different
accordiugto the I'acciriesand the bird species Live vaccineshave afforded a better immunity than the
to Newcastlevrrus than the
inactivatedone.It hasto be underlinedthat the red panridgeis the lesssusceptible
tested.
otherspecies
Introduction
La rnaladie de Newcastle représenteun nsque
sanitaire et économiquemajeur pour l'aviculture
industrielle Des fo-verssurgissentça et là dans
différents pa1'sde l'Union Européenne.le dernier
étânt celui localiséen Angleterrequi a concernéun
élevagede pouletsde chair fin décembre1996.Par
ailleurs. il doit être rappelé que lors de la dernière
épizootie qui a sévi dans divers pays du nord de
l'Europe de 1992 à 1995. touchant les oiseaur
élevées
puis
les
volailles
d'ornement
industriellement.un renforcementdes mesuresde
prophylaxie médicalea été appliqué en France chez
les espèces: poule.dinde.pintadeet pigeon.Mais en
ce qui concernele gibier. les oiseauxd'ornementet
de volière.celan'a pu êtreréellementle cas.En effet,
les vaccins actuellementdisponiblessur le marché
ont une indicaton pour les volailles. et non pour
toutes les especesd'oiseau.t. Ceci irnplique, qu'il
n'existe pas de données en ce qul concerne
I'innocuité ni I'acûvité de ces vaccins pour les
especes<<non domestiques>. C'est la raison pour
laquelle. il a été entrepris à la demandedes Services
Vétérinairesune étudechez le gibier, qui par le fait
de son élevageen plein air, représenteun risque de
contaminationet/oude réservoirimportant.
Ainsi la sensibilitédesfaisans,desperdrix rougeset
grisesau virus pathogènede la maladiede Newcaste
a été évaluéepar épreuvevimlente. En outre l'étude
de l'innocuilé et de l'effrcacité des vaccinsvivants
(HBl. La Sota)et inactivésa étéétudiee.
l. Matériel et méthode
1.1.Oiseaux
Quatre-vingts faisans de 5 semaines,quatre-vingts
perdrix grises et quatre-vingts perdrix rouges de 9
semaines ont été élevés dans des élevages
conventionnelsou ils n'ont subi aucunevaccinaûon
contre la maladie de Newcastleavant leur transfert
dansles locaur expérimentaux.
Quarante poulets exempts d'organismespathogènes
specifiés(EOPS)ont seni de témoin.
Deuxièmeslournées de la RechercheAvicole, Tours, &10 avrtl 1997
1.2.Locauxd'expérience
Les animauxont été répartisen 4 lots identiqueset
en cagedansquatreanimaleriesprotégéesà air filtré
(IIEPA) à l'entrée et à la sortie. Cf Dispositif
expérimentaltableauN" l.
1.3.Périodede quarantaine
S'agissantd'animaux conventionnelsde différentes
provenantde différentsélevageset regroupés
espèces.
en animalerie" une pénode d'obsen'ation d'une
semaine a été respectée avant le début dc
l'expérimentation. afin de dépister toute intercontaminationéventuelleet d'être sfrr d'avoir des
animauxsainslorsde la vaccination.
inhibant
anticorps
recherche
des
La
l'hémagglutination (IHA) a été réalisée selon la
technique IS280 du prognmme 109 ImmunoSérologie du COFRAC. utilisant la souche La Sota
comme antigène avec 4 unités hémagglutinantes
Cette recherchea été effectuéeal'ant vaccination pour
s âssurer de l'absence d'anticorps et le Jour de
l'épreuve pour ér,aluer !'immunité induite par lit
vacclnatlon
1.7.2. Protection
Les morbidités el mortalités out été cnregrstrées
quolidieunementâprès l'épreuvc vtntleulc
2.
Résultats
1.4.Vaccinset moded'administration
2.1.Innocuité
Tous les vaccins utilisés ont été des produits
rmmunologiques
âyantune autorisâtionde mise sur
le marchéen France
Vaccinsà virus vivants : Les souchesHitclmerBl
(HBl) et La Sotaont été administréespar instillation
oculaireà raisond'une dosepar sujetsousun volume
de0.03ml.
Vaccin à virus inactivés : Ce vaccin en adjur.'ant
huileuxa étéadministrépar injectionintramusculaire
au niveau du bréchet à raison d'une dose par
sutet(0.3ml)
rl vrnls vivanls (FlBl ou La Sota)
Aucun des'n'accirts
chez
ni zi virus inactir'és l'a clrtraîné de s1'rnptônres
de
l'obtet
faisant
espèces aviaires
les
l'expérimentatiou
2.2.EIIïcacité
2.2.1. Sérologie(TableauN" 2)
1.5.Epreuve
Le virus de la maladie de Newcastleutilisé pour
l'épreuvea été la souchePloufragan.isoléeen 1972
dont l'indice de pathogénicitéintracérébraleest de
1.9 Cettesouchea été administréel8 jours aprèsla
r,accinationpar voie intramusculaireà raison de l0'
DL50^).5ml par su1et.
l.6.Innocuité
Les symptômesclimques et les mortalités ont été
enregistrésquotidiennement
aprèsla vaccination.
1.7.Efficacité
1.7.1. Sérologie
Ar,ant la vacciuation. aucune des espèces ne
présentaitd'anticorps spécifiquesde la maladie de
Newcastle
Dix-huit jours après la vaccination.les poulets ottt
présentéles titres en anticorpsles plus élevésquels
que soientles vaccins.en comparaisondesfaisanset
lesperdrix.
Les vaccinsà virus vivantsont induit desanticorpsa
des titres plus élevésque le vaccin à virus inactivés
chez les faisanset les perdrix Les perdrix griseset
rougesont répondude façon identiqueaux vaccrns
HBI et La Sota.Bien qu'il n'y ait pas d'analyse
statistiquede réaliseeles perdrix grises ont présenté
les titres les plus faibles en anticorps après la
vaccinationHBI, comparéà touteslesautresespèces.
faisanet perdnx
Il doit être soulignéque les espèces
ont présenté des titres très faibles après
l'admimstrationdu vaccinà virus inactivés.comparé
au poulet.
2.2.2. Protection (TableauN"3)
Références
Les oiseauxnon vaccinésont tous été sensiblesau
virus d'épreuvel 1007ode mortalité a été observé
chez les poulets.faisanset perdrix grises:seul 647n
de mortalitéà été enregistréchez les perdrix rouges.
le restedes animaux ayant présentédes symptômes
nerveux.
Les pouletsont été entièrementprotégésqrtels qtte
soientlesvaccins.
Les faisansvaccinésavecla soucheHBI ont monlre
durant une seulejournée de très légers s1'ntptômes
d'abattement.Ceux vaccinésavecla soucheLa Sota
protégés.Par contreceuxayanl
ont étécomplètement
reçule vaccininactivéont présenté22oÂde mortalité.
totalementavec
Les perdrix grisesn'ont étéprotégées
aucundesvaccins.
avec
Les perdrix rougesont étéentièrementprotégées
les vaccinsvivants.par contre57od'entre ellesavant
reçu le vaccin inactivé.ont manifestédes s1'ntptômes
nerveux.
3. Discussion-Conclusion
Cette étude a permis de démontrerque les vaccius
vivants (HBt. La Sota)et inactivésprésentaientune
totaleinnocuitépour les faisanset perdrix à l'âge de
6 et l0 semaines.
la vaccination.soit respectivement
Par rapport à une observationdécntepar Willemart
précisantque le vaccin HBI ne présentaitpas une
bonne innocuité pour les perdrix et particulièrement
les perdrix rouges. des essais complémentaires
réalisésdans des conditionsstrictesd'isolement.sur
desoiseauxplus jeunesdevraientêtre entreprispour
confirmer ou non cetteobservation.
L'estimationde la duréeconféréepar chaquetype de
vaccin n'a pu être évaluéeau cours de cette étude
puisquel'épreuvea été réaliseetrès tôt. soit 18jours
aprèsla vaccination.
Dans les conditions de cette expérimentationi!
apparaît que le vaccin irnctivé ne confère pas la
meilleure immunité, ni la meilleure protection.Ce
résultat est peutétre lié au fait que I'intervalle de
temps qui a separéla vaccination de l'épreuven'a été
que de l8 jours. Durée qui pourrait être jugee trop
courte pour que le vaccin inactivé induise des
anticorps à un niveau élevé. Toutefois ce vaccin
pourrait être utilisé en rappel des vaccins vivants
corrme il est fait pour I'especepoule et permettait
peut-êtred'allongerla periodede protection.
WiliemartJ.P..1968Bul Acad.Vet Fr. . 41. :i25329
MeulemansG.. 19E8.in : Develop in Vet Viro.Newcastledisease.(FlurverAcademrcPublishers)pp
:jl8
AlesanderD J. l99l in : Drs. of Poult. Neu'castle
(lou'aSlateUniv PressUSA) pp -196
Disease.
TABLEAU I : Dispositif expérimental
Traitement
Vacciné
La Sota
t8
20
l8
I0
Vaccrné
HBI
20x
Faisan
PerdrixG
PerdrixR
Poulet
In
t6
l0
Vacciné inactivé
I dose
Non vacciné
l8
t9
l8
l0
l9
l9
11
l0
* Nombre de sutetsrcsl:ull aprèsh périodede quârantâlne
TABLEAU 2 : Sérologrc(lHA) - Mo1'ennegéométrique(Log2)
Trrritcurcnl
i
Non
vaccrné
Vacciné
lllactl\ e
Avallt Vaccrnatlon
Espècc
Farsan
Perdrix G
Pcrdrir R
Poulet
Faisan
Perdri.rG
Perdrx R
Poulet
<2
<2
/1
\L
2.3
<2
Vlcciné
La Sota
<2
<2
<2
2.3
J.J
/1
\Z
<2
2.8
).J
z--)
8.5
6.9
4.5
6.1
7.4
4.9
4.4
6.1
/\ a
Z
Faisan
PerdrixG
Perdrx R
Poulct
Faisau
PerdrirG
PerdrixR
Poulel
Vaccnrc
HBI
Après vaccination
2
<2
z- -)
<2
2.3
<2
2.3
t-J
TABLEAU J : Pourceulagcde tnorbidité et de ruortalité
Darede début
et fin des
s]-mptômes
Trallenrent
Faisan
PerdrixG
PerdrixR
Poulet
0
0
5.5
010
|
I
I
22.2
ti9.{
(i
(5 - l8)
(2 - 17)
(r3 - 24)
Faisan
PerdrisG
PerdrixR
Poulet
(3 - 18)
INJECTION IN OVO
APPLICATION A LA VACCINATION DE L'EMBRYON
Jean Michel Blanchartl, Frans DavelaaÉ
lFort DodgeSantéAnimale,BP 13l l, 64 rue Delffrier, 37013TourscedexI
2FortDodgeAnimat Health,PO Box 900,1380DA Weesp- Holland
Résumé
La vaccination de I'embryon de 18 jours contre la maladie de N{arek avec les souchesHVT, SBl, 30llB/l et
R223, seulesou associées,se montre aussi efficace que la vaccination du poussin d'un jour avec ces mêmes
souches.D'autre part, leur administration in ovo a plus de dix fois la doseminimum protectriceestbien toléree
et n'affecteni I'eclosabilité.ni la croissance.
La vaccinationin ovo contre la maladiede Marek est déjà devenueune pratique coumntedanscertainspays.
Des travaux recentsmontrent que cette possibilité de vaccinaton de I'embryon pourrait s'étendreà d'autres
antigènesen particulier à la vaccinationcontre la maladiede Newcastle.
Abstract
In ovo injection - application to embryo vaccination
18 days old embryovaccinaton against Marek diseasewith strains HVT. SBl, 30lfBll and R223. alone or
combined,is shownto be as efficious as the chicken day old vaccinaton with the samestrains.
Administration of thesestrainsat more tlnn l0 times the minimum protectivedosisdoesnot affect hatchability
nor growth rate.
In ovo vaccinationagainstMarek diseaseis alreadyroutinely applied in somecountries.
Recentresultsshowthat in ovo vaccinaton could be extendedto someother antgens, ie to ND vaccination.
Intrcduction
Si la possibilité d'administrer des substancesà
I'embryon est à l'étude depuis longtemps, c'est la
mise au point du système INOVOJECT
(commercialisepar la sociétéEmbrex) qui permit
ces dernières années la mise en pratque de la
méthoded'injection in ovo.
Cette méthode peutétre utilisee avec difrérentes
-nutriments),
substances (ant-infectieuses
@obineau B.) mais elle se dweloppe
particulièrementpour ladministration desvaccins.
l. Principe de la méthode
Il reposed'abordzur le fait que I'embryonde poulet
devient progressivement immunocomfftent à
partir de l'âge de 14 jours et qu'il est possible
d'obtenir une re,ponsevaccinaleà partir de l'âge de
17 à 18 jours, sans efret négatif zur l'éclosabilité
(SharmaJ.M et al, 19E4).
Le vaccin doit être reoonstituédansune quantté de
solvant tel que le volume contenant la dose
vaccinale soit de 0,05 ml, quantté que délivre le
systèmeINOVOJECT avocune précisionde 2o/o.
Après perforaton de la coquille audessus du sac
aérien, la doæ vaccinale est administrée dans le
liquide amniotique.
2. Vaccination in ovo contre la maladie de
Marek
Depuis le début des annees70, lia vaccinaûondes
poussinsd'un jour, avecdesvaccinsà virus IIVT a
été largement appliquee dans le monde pour
protéger les productions avicoles des pertes
économiçes occasionneespar la maladie de
Marek.
L'immunité induite par la vaccinationmet quelques
jours à s'installer et les poussinspewent être en
contact avec un milieu infecté dès leur mise en
place.
Les contaminatons précooessont donc sowent
responsablesdes echecsde vaccination contre la
maladie de Marek et on a toujours cherché à
limiter cette Sriode critque pendant laquelle les
animaux vaccinésne sont pas encoreprotégésface
à un risquedéjà présent.
C'estce qui a conduit à investiguerdèsle débutdes
années1980(SharuraJ.M. et BurmsterB.R., 1985)
les possibilités de vacciner l'embryon 3 à 4 jours
avant la date d'éclosion pour installer plus
Dewiàtnes lournées fu b RechercheAvbole, Tows, &10 avrû|1997
lll
précocementla protection contre la maladie de
Marek chezle poussin
Notre groupe ayant une gamme importante et
toujoursen développementde vaccinsMarek, nous
nous sommes logiquement investis dans des
expérimentationssur leur applicationin ovo.
Nous nous limiterons à la présentationsynthétique
de 3 essais, deux concernant l'innocuité, un
l'éffrcacité.
2.1.Innocuité
Cetteinnocuitéa étéétudiéeà la fois dansun cadre
experimentalet sur le terrain.
2.1.1.Essaide laboratoire
Les vaccinssouchesHVT" HVT + 30IIB/I, R223
ont été inoculés à trois groupes (1,2 et 3
respectivement)d'oeufs SPF embryonnés. au
l8èmejour d'incubation.deuxgroupesd'oeufs(4 et
5) non inoculésservantrespectivement
de témoins
négatifet positif.
Les poussinsissus des groupes I à 4 ont été
observés jusqu'à l'âge de l2O jours puis
euthanasiés
Les poussinsissus du groupe 5 (non vaccinéséprouvés)ont été suivisjusqu'à l'âge de 50 jours.
où les animaux encore en vie ont été également
euthanasiés.
Le tableau I présente les résultats de ces
observationsen ce qui concerneles lésions de
maladie de Marek observéessur tous les groupes
d'animauxpendantla périoded'essaiet les poids
desanimauxdesgroupesI à 4 à 120jours.
Les résultats de cette expérimentationmettent en
évidencequela vaccinationin ovo a desdosesplus
de l0 fois supérieuresaux doses vaccinales
minimales , n'affecte ni l'éclosabilité ni la
croissance des animaux pendant la periode
d'observationde 120 jours. Elle n'induit aucune
lesion de maladie de Marek zur des animaux
sensibles,puisquele taux de lésions atteint 76% à
l'âge de 50 jours chez les animaux non vaccinés
éprouvés.
Les résultats (tableau 2) montrent que pour les
paramètresobservés,il n! a pas de différences
significativesentre les voies in ovo et souscutanée.
La vaccination in ovo à 18 jours d'incubation ne
modifie, ni l'eclosabilité,ni les performances.
2.2. Efficacité
L'efficacité de la voie in ovo a été testée avec
différentes souches d'épreuves vis à vis de
différentessoucheset associatonsvaccinales.
Les essaisles plus significatifs sont ceu( qui ont
étudié le pouvoir protecteurvis à vis de la souche
hypewirulenteRBIB.
L'un de cesessaisa énrdiéle pouvoir protecteurde
la soucheHVT, de I'associationHVT+30UB/1 et
de la soucheR223, administréesau l8ème jour
d'incubation,vis à vis d'une épreuvevirulente avec
la soucheRBIB au 5èmejour aprèsI'eclosion.
Les résultats (tableau 3) prennent en compte
I'incidence de la maladie de Marek répertoriee
pendant la periode d'observationde 50 jours, au
bout de laquelle tous les animaux encore vivants
sont euthanasiéset autopsiés.
Les indices de protection obtenus, calculés par
rapport au lot témoin qui ne reçoit que du solvant,
sont conformes à ceux procurés par les mêmes
vaccinsadministrésà l jour par voie souscutanée.
3. Vaccination in ovo contre la maladie de
Newcastle
Si la vaccination in ovo contre la maladie de
Marek a été largement décrite. les publicaûons
concernantla vaccination in ovo contre la maladie
de Newcastlesont beaucoupplus rares.
Ahmad et Al, ont decrit des essaisde vaccination
de I'embryonavecla soucheNDV-BI modifiee par
I'action d'Ethyl Méthane sulfonate(EMS), afin de
lui enlever son caractère létal pour I'embryon.
d'envisager
Cependant, il
était difficile
ladministraton en rouûne d'une souchemodifiee
par I'action d'une substance(EMS) ayant un effet
mutagène.D'autre part, il est apparu que I'ecart
entre la dose minimale efficace. et la dose
maximale toléree était trop faible pour powoir
produire en routine un vaccin à un ttre s'inscrivant
dansceslimites.
2.1.2.Essaisrr le terrain
Parmi les essaisréalisés,nous en avons retenu un
qui permet de comparerI'injection in ovo à la voie
souscutanée.
L'associationvaccinaleHVT/SBI a été administree
soit par voie in ovo à 27500 oeufs, soit par voie
souscutanéeà27500poussinsd'unjour.
Ayant mis au point un vaccin vivant administrépar
voie orale à fâge d'un jour, nous avons eu
I'opportunitéd'adaptercette souchevaccinale,dans
le vaccin PoulvacOVOline ND à la vaccinaton de
I'embryonde lE jours par injection dans le liquide
amniotique, selon la méthodedécidéepar Sharma
et Bamester.
tt2
3.1. Dose maximale toléree sur oeuf avec
anticorpsd'origine maternelle
dosevaccinale (gloupe 2), le groupe 3 servant de
témoin.
La dosemaximale toléree sur oeufsavec anticorps
d'origine maternelle, a été déterminéeen injectant
des dosescroissantesà 8 groupesdoeufs, tels que
decrit dâns le tableau 4 qui indique égalementles
résultats concernant le pourcentaged'eclosabilité
pour chaquegroupe.
Il apparaitqu'audelàde 100fois la dosevaccinale,
on constateune dégradationde I'eclosabilité.
éoreuve : souche Hertz 33156de la maladie de
Newcastle 2rlministree à l0' DIO à tous les
poussinsà l'âge de 3 semaines.
naramètres suivis: Titres HI à 3 semaines et
pourcentagede mortalité aprèséprewe.
Les résultats (Tableau 5) montrent que la
vaccination in ovo est efficace et ne semble pas
influencê par la présenced'anticorpsd'origine
maternelle.
3.2. Efficacité de la vaccinationin ovo
A partir desessaisrealiséssur oeufsSPF,ceux mis
en oeuvre pour définir la dose vaccinale
comprenaientdes groupesrecevantun dixième et
cent fois la dose et étaient réalises sur oeufs avec
anûcorpsmaternels.selonle protocoleci-après.
4. Conclusion
La possibilité d'injecter des vaccins à I'embryon
s'estlargementappliquê dansun premier tempsà
la maladiede Marek pour laquellela vaccinationin
ovoestdéjàdunusagecourantdanscertainspays.
sont en cours,vaccrnatron
D'autresdéveloppements
contrela maladiede Newcastleet contrela maladie
de Gumboro...,dont l'aboutssementconditionnera
l'avenir de cettevoie d'administration.
Oeufs : issus de "reproducteurschair dont les
poussinsà un jour ont des titres HI en anticorps
Newcastlede 5,1 (log 2).
vaccin : Poulvac OVOline ND administré à cent
fois la dosevaccinale(groupel), à un dixièmede
TABLEAU I : Innocuitépar voie in ovo desvaccinssouchesI{VT, HVT + 301/8/1,R223
Poidsmoyen(g) à 120iours
inoculée
Souche/dose
Groupe
* HVT-
I
16162Pfu
** IIVT-12
2
7o lésions
Marek
465Pnr
0
0
1
30llBll -7
femelles
t587 t.99
N=18
14591143
N=15
total
l9ll r 311
N=46
1825+ 315
N=48
1505t l17
1990+ 195
N=25
N=22
1492t85
2077+ 177
N=21
N=24
à
euthanasiés
t732 + 289
N:47
mâles
2120+ 203
N=28
I99t X2I6
N=23
974Pfir
3
*** R223_ 14248Ptu
0
1
Non inoculés-Non
éprorryés
0
)
Noninoculés
à un
éprouvés
Poussins
Jour
(souche
GN22\
76
t804 + 324
N=45
50jours
* vaccinsMD Vac CA ** W MD Vac *** MD one Vac
TABLEAU 2 : tnnocuiæclinique compareepar voie in ovo ou souscutaneeà I jow du vaccin HVT/SBI
HVT/SBI
rn ovo
86.5
Poids
moyen/hg
7o de Mortalité
Eclosabilité
(%)
ICr
o/ode srisie
Lcsions
cutanées
total
à 7 jours à 14 jors
Totale
1.33
3.62
2.330
1.96
0.07
0.84
r,27
3,99
2,303
1,95
0,03
0,11
1.03
HVT/SB1
0,98
86,5
sous-cutanee
I iour
* IC : Indice de Consommaton
113
TABLEAU 3 : Eclosabilitéet Indice de Protectionvis à vis de la soucheRBrB, aprèsvaccinationin ovo avec
les souchesHVT, HVT + 30llBll.R223
Nombre
d'animaux
Sanslésions Morls de la
maladie de
Marek
Vaccins
Eclosabilité
(%\
HVT
HVT+
301/B/l
97
93
24
30
R223
97
97
29
I
Témoins
(solvant)
*IP : Indicede protection
4
2
Avec lésion
de maladie
de Marek à
I'autonsie
6
J
J
25
f
Incidence
maladiede marek
[r*
10/34-+ 29 %;o
3/33 -+ 9 oÂ
70
90.7
6/35 -+ 17 o/o
3Ûl3l -->97 %o
82.s
TABLEAU 4 : PoulvacOVOline ND - dosemaximaletoléreein ovo
GrouDe
I
2
J
4
5
6
'l
l0'
dose
dosevaccinale
l0
l0
l0
l0
l0'
t
8
témoin
Nombre d'oeufs
50
50
50
50
50
50
50
50
éclosabilite(7o)
Titre HI (en log 2)
à 3 semainesd'âge
Pourcentagede
mortalité aprèsune
épreuve de 3 semaines
d'âse
0
0
100
68
70
74
76
9l
84
96
88
TABLEAU 5 . doseefficacein ovo
Groupe
I
j
J
Dose
' 'dose
l0
vaccinale
''
l0
dosevaccinale
témoin
Références
Ahmadet Al., "US patent"54 277 9l
RobineauB., ul-'injection automatiséedes oeufs à
couver par le systèmeINOVOJECT de la société
Embrex". p. 197 : comptes rendus, rencontres
internatonalesde producûonavicolesle O4/lOl95
à Nantes.
Sharma J.M. et Burmster B.R., "Embryo
vaccination with infectious Bu$al disease virus
alone or in combination with Marek's disease
vaccine."vol 29 no4 "Avian disease"29 ll55 lL67
68 (le8s)
to
SharmaJ.M. et Burmster8.R., u Resistance
Marek's diseaseat hatching in chickensvaccinated
asembryoswith the Turkey Herpewirus " vol 26
nol "Avian disease"26 (I) 134 149
3-9
2.4
1.0
WakenellP.S.,
LeeL F.,
Sharma J.M.,
"Comparative viral and pathologic responsesof
chickens inoculatedwith herpewirus of turkeys as
embryosor at hatch." Am J Vet Res,vol 45. no8,
1984.
SYNDROME DE MORTALITE BRUTALE DU CANETON REPRODUCTION EXPERIMENTALE PAR INJECTION DE STREPTOCOCCUSBOVIS
I
Cluzel Bnrnol, HervouetPhiliPPe
t
' Réseau
Beaucouzé
Cristal.ZACLaBuzenière.85500LesHerbiers. glOVRC. AngersTechnopole.4907I
Avec la collaboration du personnel de BIOVAC
Résumé
PendanfI'année1991.dansla régionRhône-Alpes.sontapparussur deslots dejeunescanetonsde Barbariedes
casde mortalité "précoceet fugaceprécedéede signesnerveux"dits "mortalité du 7èmejour".
Cettenouvelleentité pathologiqueclairementdéfinie(âged'apparition,morbidité.mortalité, symptômes)est
jusqu'àl'âge de 2l jours.
devenueen l'espacede cinq ansla principalepathologiede la periodedu démarrage.
Pour comprendrele rôle exact du Strcptococcusbo,visconstammentisolé au laboratoiredans les cas de
Svndromede Mortalité Bmtale du Caneton.une expérimentationen animaleriecontrôléea été conduite.Le
a un rôle
protocoleexpérirnentalet l'analysestatistiquedes résultatsmettenten évidenceque ce streptocoque
pilthogène
certaindanscesconditions.
Abstract
Brutal DeathSyndromein YoungDuck Demonstrationof a pathotogical experiment in the use of bovine Streptococcus
Duriug 1991.in Rhone-Alpes.therewereseveralgroupsof young Barbaryducklingswhich "died early and
rapidll'preceded
b1,signsofnen'ousness"-called ( 7th daydeath>.
-1èç'
parhologidl enti\' which is clearly defined(agewhen it first appears,deathrate, symptoms)has
ftris
become.inrhe spaieoffive years.the principlepatholog)in the openingstage,up to the ageof2l days.
which was constantlybeing isolatedin the caseof
To understandrire preciserôte of boi'ine Sirepiococcus
erperimentwas carried out. The experimental
animal
a
conttolled
Duck.
in
Young
Bmtal Death Sl'ndrôme
hasa provedpathologenicrole in
protocoland the statisticâlanall'sii ofthe resultsshorvthat this streptococcus
theseconditions.
Les diversesinvestigationspour mettre en évidence
une interventionvirale sont restéessanssuccèsà ce
Jour.
Introduction
L'analvse de l-50 cas de S-vndromede Mortalité
Brutaledu Canetonen 1995et 1996a permisd'isoler
Strcplococc:us
bovi.rdansl-19cas.
Danscetteétudeportantsur descanardsde Barbarie.
étaientla moelle osseuse.le
les organesensemencés
sang intracardiaqueet le foie. prélevés sur des
canetonsmortsrécemment(moinsde 8 heures).
Streptococcus âovi.n était le seul contaminant
bactériendans93 casde l'échantillon
Alors que ce germe était considéré comme non
pathogènepour les volailles" il a été identifié
régulièrementdepuis 1993 dans les épisodesde
Syndrome de Mortalité Brutale du Caneton. Ce
dernier semblait donc avoir une qluse évidente:
Dovls.
Streptococcu.s
l. Définition du Syndromede Mortdité Brutale du
Caneton
1.1.Définition clinique
Le déroulementde la maladie dans un élevage de
canetons de Barbarie ou de canetons mulards est
asseztypique.Elle a fait l'objet d'une descripûonPar
le CNEVA-LCRAP qui conespond à la synthèse
d'observationsde vétérirnires réunis en gloupe de
travail.
La maladieapparaîtchezdescanetonsâgésde 5 à l0
jours (canetonsde Barbarie) ou de 12 à 15 jours
(canetons mulards). Les lots concernés sont
généralementde beaux zujets, n'ayant connu aucun
Deuxièmcs rournées de la Recherche Avicole, Tours, E-10 avril 1997
I 15
troubleà la miseen placeet sontapparemmentsains
quandla pathologies'installe
La mortalité apparaîtbrutalement.sans prodrome.
L'el'olution est courteet s'étendsur 15 à 30 minutes
pour un canetonatteint
Les signescliniquessont quasi inexistants.La phase
agoniqueprésentedes s_vmptômes
inconstants. une
chute de la tête. un épiphora et quelquefoisdes
tremblementsainsi que desconvulsionsjuste avantla
mort Cettedescriptionest surtouttypiqued'un agent
pathogène agressif. d'évolution rapide vers la
septicémie
L'ensembledu lot n'est généralement
pasabattu.Les
signes classiquesde fièvre ou de maladie sont
absents-les canetonsne se groupent pas sous les
points de chauffageet les consommationsd'eau et
d'aliment sontmaintenuesà un niveaunormal
La phased'état de la maladiene modifie pas I'aspect
dtt lot. mais le taux de mortalité quotidien peut
atteindre5 '% du lot. La mortalités'étaleen général
sur 5 jours et peut drsparaîtreaussi brutalernent
qu'elles'estétablie
Au total. ce sont 5 ri 20 % descanetonsqui meurent.
surtout pour les canetonsde Barbarie Le taus de
mortalité est souventplus faible pour les cânetons
mulardset n'excèdequetrèsrarernentles 5 %o.
1.2.Définitionanatomopathologique
A I'autopsie. une lésion constante peut être
mentionnée.Il s'agitd'unesplénornégalie
importante.
La rate est réactionnelle,elle est le plus souvent
décrite comme <boueuse.granuleuse>. avec des
foyers de nécrose nuliaires. Elle apparaît très
congestiveà hémorragiqueet dans les évolutionsles
plus rapides-elle peut être eclatéeavec des caillots
sanguinsdansle parenchymeet sousla capsule
Le caractèregranuleuxde la rate est suffrsamment
t-vpiquepour qu'ellesoit décritecommeune ( rate en
salami>. Cet aspect est assez différent dans la
plupart des cas. des splénomégaliesgranuleuses
accompagnantles infectionsvirales à reovirusou à
parvovlrus. Les lésions de la rate sont quasiment
pathognomoniques.
Une autre série de lésions specifiquessont décrites.
Elles sont moins systématiquessurtout en début
d'évolution du Syndrome de Mortalité Brutale du
Caneton.
La plus caractéristique
estune entériteet une typhlite
congestiveà hémonagiquequi s'aggraveen avançant
depuisle duodénumvers les caeca.La muqueusea un
aspectcongestionné
diffirs. Les contenusintestinaux
présententéventuellement
du sangen nature,souvent
en quantitéplus importanteau niveaudu colon et des
caeca. Cette atteinte intestnale est généralement
beaucoupmoinsnetteauiourd'huiqu'en 1993.
Le foie a fréquemmentun aspectmarbré de couleur
< feuille morte>>.Les tons de jaune pale (couleur
normale pour un foie de jeune caneton)dominent
avec des plages plus sombres allant du rouge
vermillon au marron verdâtre Le foie est alors
légèrementhlpertrophié et un piquetéblanc discret
est notable L'atteinte hépatique s'accompagne
souventde stasebiliaire : la vésiculeest dilatée. le
foie à la coupelaisseécoulerde la bile.
Enfin. le tableau nécropsique est celui d'une
septicémiebrutale : les carcassesont un âspect
congeslifirrégulier. La congestions'obsen'esur les
muscles (bréchet et cuisses essentiellement).les
musclessont rougesaugen surfaceet en profondeur
L'encéphalea un âspecthyperfrophié.oedémateux
el
bleuté: les reins sont égalernentconcernéspar la
congestion.Les pétéchieset les suffirsionsau niveau
du péricardesont rares.en revanchela présenced'un
hydropericarde
n'estpasexceptionnelle
1.3. Définition bactériologique
L'anal1'sebactériologiqueisole Streptococcusbtn,is
au laboratoireavec
danstousles organesensemencés
runeidentification par galerie API constante: code
,1650450.
àoyisdetypeII.
c'e$ à dire ^\1.
Dans,16cassur 150.dessalmonelles
sontégalernent
isolées (16 fois Salntonellutvphimurium dans les
caeca. toutes les autres étant des sérovars
secondaires).
Si on exclut les salmonellesmajeures.,\1 ôovi.sde
rype II est donc la seuleexplicationau S1lrdrontede
Mortalité Brutaledans 133casdes l-50étudiés
2. Reproductionexpérimentale
Une inoculaûon de S ôovi.sen animalerie protégée
est praûquée pour détenniner le rôle exact de ce
germe.
2.1. Protocoleexpérimental
2.1.1. Souchesbactériennes
Deu:i souchesde Streptococcusàovis (identifiées
52358et 52361\isoléessur le terrain sont retenues.
Elles proviennent d'élwage de canards de Barbarie
situé en Vendée où elles ont provoqué des taux
mortalité très irnportants.respectivement17,9 7o et
l0.l oÂ.
souches 52358 et 52361 en IM subissent
systématiquementune analyse bactériologique sur
foie et moelle osseuseen direct sur géloseTCS et
en bouillon TCS.
aprèsenrichissement
Elles sont comparéesà une souchede Streptococcus
/hecalis (identifiée 150882). Ce streptocoque 2.2. Résultatsexpérimentaux
dépounu de pouvoir pathogènepermetde testeret de
comparer les techniquesd'inoculationsretenueset
l'effet de l'administration d'une grande quantité L'enregistrementdesmortalitésest regroupédansles
tableauxsuivants:
d'antigène
La doseinfectantechoisieestde 0.5 108bactériespar
inoculat Cette concentration est vérifiée par
spectrophotométrie
et par dénombrementaprès 24
heuresde culturesur gélose.
2.1.2.Yoied' inoculation
Deux
testées:
voies
d'inoculation sont
l'administration intramusculaire (notée IM) et
(notéeIO).
l'administrationintroesophagienne
2.1.3.Déroulementdesexpérimentations
Au total. 105 canetonsmâles de Barbarie et 105
canetonsfemellesde Barbariesont utilisés. Ils sont
répartispar groupede l5 Les conditionsd'entretien.
d'hébergement
et de monitoringsont les mêmespour
tous.
15 mâles52358IM. 15 mâles52358IO. 15 mâles
52361IM. 15 mâles52361IO. 15 mâles150882IM
(témoinspositifsIM). 15 mâles150882IO (témoins
positifsIO) ' idem pour les femelles Enfin 15 mâles
et 15femellesne sontpasinoculéset sontles témoins
négatifs
Deux expériencessimilaires sont conduites pour
testerle facteurâgedescanetonsLa premièreest un
challengeà ll jours d'âge (avec 210 canetons).la
secondeà 4 jours (avec210 canetonségalement).
Les canetonsentrent en animalerieà 3 et 5 jours
d'âge.journeenotéeJ0 sur le prolocole
Le challengea donclieu à J+l pour les plusjeuneset
à J+6 pour les seconds.Le suivi clinique est quotidien
et chaque mortalité enregistrée donne lieu à une
autopsie et à une recherchebactériologique du ,5'.
àovis sur le foie et la moelle osseusepar culture
directesur géloseTCS (Trypto-CaséineSoja).
A J+9 pour I'inoculation à 4 jours et J+14 pour
l'inoculaûon à ll jours, tous les animaux survivants
sont euthanasiéset les lots expérimentations des
TABLDAU l: résultatsde l'inoculationà 4 iours
LOT
I
t
3
+
:l
6
7
I
9
l0
ll
t2
l3
l4
Nbre Souche Sexe
suiets
52358 F
l5
52358 M
l5
,5235E F
l5
52358 M
l5
52361 F
l5
l5
52361 M
_52361 F
l5
l5
52361 M
150882 F
l5
150882 M
l5
I50882 F
l5
150882 M
l5
F
l5
M
l5
Voie morts
IM
IM
IO
IO
IM
IM
IO
IO
IM
IM
IO
IO
-)
-t
o
0
2
()
0
0
()
o
0
o
0
0
o/o
2l)
20
o
0
l3
+o
o
o
o
0
0
0
o
0
TABLEAU 2 : résultatsde l'inoculationà ll jours
LOT
I
2
3
I
3
6
7
8
9
l0
lt
t2
13
t4
Nbre Souche Sexe
suiets
523_58 F
l5
52358 M
l5
52358 F
l5
52358 M
l5
52361 F
l5
52361 M
l5
52361 F
l5
52361 M
l5
l5
150882 F
I 50882 M
l5
150882 F
l5
150882 M
15
F
l5
M
l5
Voie morts
IM
IM
IO
IO
IM
IM
IO
IO
IM
IM
IO
IO
I
0
0
0
I
0
0
0
0
0
0
0
0
I
o/o
6.6
0
0
0
6.6
0
o
0
0
0
o
0
0
6.6
Læssouchesde S. hovis provoquentde la mortalité
par voie IM à l'âge de 4 jours. S- faecalis ne
provoquejamais de mortalité.
TABLEAU 3 : Comparaisondes résultatsenrre les
lots IM et témoinsnégatifsen fonction du sexe.de
l'âge d'inoculationet de la soucheinoculée(Mort =
mortalité. Bact
isolement bactériologiquede
,\1.liot,i.r).
à ll jours
Souche I Sexe lVlort.
52J58
F
6.6011l
M
52J61
F
M
1508E2 F
M
Témoins F
M
0,,/i
à 4 jours
Bact.
Mort.
Bact.
0
0
21lo
l0OVo
201'Â
100%
6.6(r"^
0
13"/,,
50ol'
0rY0
0
+00Â
llt%,
()
(1"1,
100'Zo
(ryo
0,,/t
o
o
Oo/o
0,JÂ
0,,1t
0"/o
00
6.60tr1,
0
0rN,
0Vo
germeapparaîtclairementétabli aprèsl'inoculation
expérimentale: il provoqueune mortalité spécifique
des canetonsde Barbarie inoculés quel que soit leur
sexe.mais qui varie en fonction de leur âge, ce qui
corrobore la description de la maladie et son
épidémiologie.
Malgré des examens histologiques et serologiques
répetés.rien du côté viral n'a pu être mis en évidence
à ce jour. Le Syndrome de Mortalité Brutale du
Caneton serait une streptococcieaiguë et spécifique
desjeunescanetonsde Barbarie,mulardset Pékin.
Cette affection est atypique dans la famille des
streptococciesavicoles par son caractère non
sporadique.les rymptômes qu'elle provoque sont
actuelles
néanmoinsconformesà nos connaissances
desstreptocoques.
2.J. Interprétation
L'arrall'seslalistiqueâu seuil de()5'1,indique :
I ) la voie d'inoculation IM â ulle influence
significative Elle reproduit la nrortalité. la voie IO
r)'a aucun effel
2) le se\e des canetous u â pas d'inlluence
significatiresur le résuhal Le mêrneeffetde ,\'.âr.,r,j.s
csl obsen'épar inoculationIM sur les mâleset les
feurelles.
.3) aucunedifférencesignificativen'est obsen'able
e[tre les deux S bor,l.rtestés La mortalité est
statistiqueurent
identique pour les deux souches
inoculées
à descanetous
de 4.jours.
{) la ntortalitéobsen'éeest significativementconélée
ri .\l ôrrli.s S. /irccalis ne provoqueaucun effet La
turortalitén'est pasliée :i une administrationlnassi\€
d'antigène
5) L'âge est un facteur important. La différence
obsenéeentreles résultatsà { jours et à II jours est
significative.Les canetonsde 4 lours sontsensiblesà
l'inoculationde .\'.àovis.les canetonsà I I jours sont
insensibles
3. Conclusion
Le Syndrornede Mortalité Brutale du Canetonest
bien une nouvellepathologieclairementdéfiniedans
sesaspectscliniqueset anatomopalhologrques.
ôovi^s
Sarelational'ecle Streptococcu.s
typeII estune
constanteau laboratoired'analysesvétérinaires Par
ailleurs. le poul'oir pathogèneintrinsèque de ce
l18
ORNITHOBACTERIUM RHINOTRACHEALE
ACTUALITES, EXTENSION EPIDEMIOLOGIQUE
APPROCEE SYMPTOMATIQUE ET THERAPEUTIQUE
Jean Léorat t, Marie-France Roger 2, I)amien Martin I
I
SelvetConseil.56500Bignan.2 Bio ChêneYert,35220Châteaubourg
Equipeassociée: Labofarm.22603Loudéaccedex,Laboratoiredu Moulin. 85140L'Oie
Résumé
: 1993chezdesdindesde plus de 25 jours atteintesde
rux importanteru gonflementdes sinuspérioculaires).
rrofonde.La caractéristique
essentiellede cetteaffection
neumoniepurulente. Les techniquesbactériologiques
is une meilleure connaissance
de la biologie de cette
ptomatiqued'identificaûonet de nouvellesthérapies
Abstract
Suddenmortalities have been observedsince October 1993 on more than 25 days old turkq's suffering from
;nificant coughneitherswollenorbital sinus).Only the
r. The essentialcaracteristicof this affection is the
rmonia. The bacteriologicaltechniques(bacreriological
vledgeof the biologv of this bacteriumas well as the
and new specifictherapies.
Introduction
Depuis le mois d'octobre 1993. une forte
recrudescence
destroublesrespiratoireschez la dinde
est enregistréedans le Grand-Ouestde la France.La
seule présence du virus de la Rhinotrachéite
lnfectieuse ou de colibacilles n'expliquait que
-de
drfficilement la mortalité subite, l'absence
prodrome.une torl\ faible sanssinusite et le tableau
lésionnelobservé.
L'isolementde Pasteurelleshæmolyticane pounait
expliquer totalement la mortalité résiduellè après
trâitement des colibacilles de surinfection. une
mortalité pouvant âtteindre 2vo par jour malgré une
morbiditéfrustre.
L'amélioration des méthodesde culture, le suivi de
nombreux lots sur le terrain, les connaissances
fondamentalesde la bactérie et les essais de
molécules lors des traitements nous ont permis
d'avoir une approcheplus sereinede cette bàctérie
identifiéecommeagentpathogèneprimaire.
1. Ornithobacterium rhinotracheale : Actualités.
épidémiologie
La mise au point d'un milieu spectfique nous a
permis d'augmenterle nombrede souchesisolees
* Sensibilité:
L'Ornithobacterium Rhinotracheale s'est révélé
résistant à la colisûne et au triméthoprime sulfa sur
tous les antibiogrammes. Pour les autres
antibiotiques, des pourcentages variables de
sensibilitéont étécalculés.(cftableau)
* Identificaûon:
présente
Rhinotracheale
L'Ornithobacterium
certaines caractéristiquesbiochimiques constantes:
catalase-, orydase+, urée+. Pourconfirmerles tests
a
biochimiques,Bio ChêneVert (35 Châteaubourg)
mis au point un sérum anti Ornithobacterium
Rhinotracheale.Ce sérum correspondà I'un des 5
sérory'pes
conmrs:
I sérotypecorrespondà une soucheaméricaine
4 sérotypescorrespondentà une soucheeuropéenne
dont 3 sérot1'pessont isolés en France (dont I
sérotypeparticulièrement dans le Morbihan). Nous
travaillons actuellementsur la fabrication d'autres
sérumsanti OrnithobacteriumRhinotracheale.
l. l. Actualitésdeslaboratoires:
1.2.Epidémiologie
* Isolementet culture :
L'Ornithobacterium rhinotracheale est un bacille
gram-négaûfprésentant5 serotypesdifférentsisolésà
ce jour. Les meilleures conditions d'isolement pour
I'OrnithobacteriumRhinotracheale sont des cultures
sur géloseau s:rng sous atmosphèremicro-ærophile
(5-10%CO2). Après48 heuresd'incubationà37"C,
les colonies grisâtresont un aspectde goutte rosê.
* Localisationgeographique:
La plupart des cas ont été enregistrés dans les
secteursconcentrésen élevagede dindes de chair.
Les élevagesconcernéssont situésessentellementen
Bretagneet Paysde Loire mais aussi dans I'Aude et
le Centre.Le nombrede casisolésestcroissant.
Deuxiàmesfournées de la RechercheAvicole, Tours, 8-10a,ril 1997
* Animaux sensibles:
L'essentieldessouchesest isolé sur la dinde de chair
(car on rechercheI'OrnithobacteriumRhinotracheale
essentiellementsur cette espèce) mais aussi des
prélèvementsse révèlentpositifs sur pouletsde chair,
poulesreproductriceset gibiers à plume
2. Approche symptomatique
En lumière normale,la morbiditéest quasi-nulle,la
recherchedesanimauxprostrésestdiffrcile. En semiobscuritéla morbidité estbeaucoupplus apparente: 2
à lO'yodeszujetssontprostrés,cou rétracté.La toux
est peu productive, inconstânte. profonde et
reproductible.Le larmoiementet les sinusitessont
rarementobservables.Les consommationsd'eau et
d'aliment sont normales,les animaux ne sont pas
fiévreux. La mortalité au sein du lot apparaîtde façon
brutale,pouvantatteindre20 à 100zujetsparjour sur
la
un lot de 8 000 (la mortalitéà lieu essentiellement
nult).
Deux lots ont présentésune symptomatologietrès
différente des autres lots : prostration intense,
congestion de la sphère respiratoire supérieure.
mortalité très importante sans complication
bactériennesecondaire(colibacille) : dansces2 cas.
une souched'Ornithobacteriumrhinotrachealea été
isolée.
L'autopsie doit permettre de réaliser une bonne
obsewation de I'ensemblede I'appareil respiratoire
(sinus,trachée.poumonset sacsaériens)et de bons
prélèvements
pour I'analyse.Elle est primordialecar
elle permet d'orienter l'analyse bacténologique
(techniquesde prélwement, d'ensemencementet de
culture). Le choix de l'échantillon doit être rigoureux
: au minimum 3 sujetsmorts récemmentet 2 sujets
légèrementprostrés
Lesprincipaleslésionssontles suivantes:
%
Amoxicilline
Tiamutine
Gentamicine
Oxytétracycline
Spiramycine
Spectinomycine
Colistine
Ac. Oxolinique
Fluméquine
Enrofloxacine
Geftiofur
Tvlosine
Plusieurs lésions inconstantesont égalentent été
notées comme la péri-hépatitefibrineuse-l'ostéite
purulenteau niveau des os de la tête et la sintlsrle
iurulente avecinflammationdesconlets.
faible de I'organisttte
généralement
La déshydratation
esten relationavecla mortalrtébrutale.
4. Approchethérapeutique
3. Approche lésionnelle
ESPECE
Nombrede souches
- Une aérosacculite (al'ec fibrine etlou dépôts
caséeur)
- Une pneumonieimportante:à la coupe-le pottmon
présenie 2 zones d'aspect très drfférent eÎ
relativementbien délimitées:
- une zone souple. rosée , c'esl le lisstt
normal.
- une zone plus consistante,violacéeavec
parties
indurées (d'aspect très différent du
des
poumbnde bois provoquépar Pasteurellamultocidit)
Au sein du parenchyne pulmonaire. on petlt
retrouverdesflammèchesde caséum
Le poumon présente sur la face dorsale (d'ou
de la
I'importancede décollerle bloc coeur-poumons
un exsudatpurulentpouvantse solidifreren
carc-asse)
caséum.
Les lésions tustologiques montrent ulle forte
congestionavecune thromboseet une irflammatiou
des-vaisseauxsanguinset des bronchesde gros
calibres.
- Une péricarditepurulente
s
La mise en place des traitemerts présente des
diffrcultés majeures étant donné la présence
permanented'infectioncolibacillaireconcomltanteet
les différencesde sensibilitéaux antibiotiquesde ces
2 bactéries.En pratique"les associationsiniectables
sont
colistine-ampicillineou colistine-spectinoml'cine
les plus efftcaces. Lors d'isolement précoce
d'Ornithobacteriumrhinotracheale.les trailementsà
base de macrolides ou d'orytetrarycline Belalactaninedonnentsatisfaction.
RHINOTRACHEALE
ORNITHOBACTERIUM
DINDE
POULE
228
29
R
I
100
100
0
29
14
100
0
79
76
97
100
100
0
0
0
31
7
0
0
3
14
3
0
0
0
0
100
40
79
0
100
17
10
0
0
0
R
I
S
100
99
0
64
2E
100
0
77
75
90
100
100
0
0
0
16
14
0
0
1
5
10
0
0
0
1
100
20
58
0
100
22
20
0
0
0
ETUDE DE LA DIVERSITE GENETIQUE DE SOUCHESD'ORNITHOBACTERIUM
RHINOTRACHEALE ISOLEES D'ELEVAGES AVICOLES
Leroy-Sétrin Sabine,Flaujac Géraldine, ThenaisyKarine, Chaslus-DanclaElisabeth
INRA, centrede Tours-Nouzilly, Station de PathologieAviaire et Parasitologie,37380Nouzilly
Résumé
Depuis 1993,l'isolementd'Ornithobacteriumrhinotrachealelors de pathologierespiratoireest en progression
dans I'Ouest de la France, principalement en élevagede dinde. La caractérisationphénotypiquedes souches
d'O. rhinotrqcheale n'est pas suffrsantepour mettre en évidenceune diversité entre ces souches.Vingt trois
souchesont été canctérisês par deux méthodesgénotypiques: la ribotypie et l'analyse du polymorphismedes
fragments d'ADN ampliliés par PCR à partir d'amorces oligonucléotidiques aléatoires (RAPD). Ces 2
méthodesont mis en evidencedesdifférencesau sein de ces souches.L'analyse des résultatsa permis d'établir
un dendrogramme,représentatifdes relations génétiquesentres les souchesd'O. rhinotracheale isolées de
diftrentes especesaviaires, montrant la présencede plusieurs clones bactériens.La majorité des souches
isoleesde dinde et de poulet étaientgénétiquementtrès proches.Les souchesisoleesde faisan, de perdrix ou de
pintade étaient différenteset distinctesde I'ensembledes autressouches.Nous pouvonsconclure à la présence
de plusieursclonesdansles élevagesde volaillles,et émetûeI'hypothèsed'une diffirsiondanscertainsd'entre
eux.
Introduction
Matériel et Méthodes
Les premières souches d'Ornithobacterium
rhinotracheqle ont *é isoleesen Franceà partir de
1993. Depuis cette date, leur isolement est en
progression,principalementdansI'Ouest et dansla
filière dinde. Un premier bilan @udouyt et a/.
1995)présentait,lors des premièresjourneesde la
Recherche Avicole, les propriétés culturales et
biochimiques, et les données cliniques et
épidémiologiquesde cesbacténes.
L'étude a porté sur un echantillonde 23 souches
d'O. rhinotracheqleisolees,collecteeset identrfiées
par le laboratoireBio ChêneVert (Ctr"âteaubourg).
Ces souchesont été choisies parmi une collection
de 180 souches,en foncton de leur ongine
géographiqueet animale, pour être représentatives
de la diversitédessouchescollectéesen Francepar
ce laboratoire.Elles ont été isolées.entre 1994et
1995, de différentesespecesaviaires: dinde (15
poulet(4), faisan(2), pintade(l). perdrix
souches),
(l).
Toutes proviennent de prélèvements
pathologiques,la plupart ont été isoleesau niveau
despoumonsou de la trachée.
A partir de ce bilan, un échantillonde23 souchesa
été constitué. Elles provenaient d'animaux de
différentes espècesaviaires élevés sur des sites
geographiquesindependants.
Nous avons réalise la caractérisationgénétiquede
ces souchesafin de mettre en evidencele degré de
parenté généûque entre les souches et une
éventuellediffirsion de clones bactériensdans ces
élevages.Deux méthodescomplémentairesont été
utilisees pour réaliser le t'?age moléculairede ces
souches: la ribotypie, méthodede réference,qui est
basee sur l'étude du polymorphisme de gènes
correspondant à des séquences hautement
conservéesdu génome codant pour les ARN
ribosomaux (Grimont et Grimont, 1986) et la
RAPD (RandomAmplified PolymorphicDNA) qur
est basee sur le polymorphisme de fragments
d'ADN amplifies par PCR à partir d'amorces
oligonucleotdiqueschoisiesde manièrealeatoireet
powant s'hybrider n'importe oir sur le génome
(Welsh et McClealland, 1990; Williams et
al,l99O\.
Afin de déterminer les ribotypes des souches,
I'ADN bactérien total a été preparé selon la
technique de Wilson (1987) puis digéré avec -l
enzymesde restriction '. Dral, HindII, Hindlll et
Pvull. I-es fragments d'ADN obtenus ont été
en gel d'agaroseà0,8oÂ
separéspar électrophorèse
et transféréssur membranede nylon. CesADN ont
été hybridés avec une sonde ribosomalemarquée,
obtenue par transcripûon de I'ARN 16+23S
d'E. coli en présencede digoxigénine-lldUTP.
Les profils de restriction des gènescodantpour les
ARN ribosomaux (ribotypes) ont éæ révélés par
autoradiographie, puis analysés par la méthode
LJPGMA (unweighted pair-group method with
arithmetc averages algorithm), les distances
génétiques étant calculees selon I'indice de
Jaccard. Cette analyse permet de déterminer la
parentéentre les souchesétudiees.
Deuxiànnesfournées de ls RechercheAvicolc, Tours, &10 aûl 1997
r2l
FIGURE I : Dendrogrammemontrant les résultatsde I'analyse par UPGMA des ribotypeset RAPDtypesdes
souchesd'Ornithobacteriumrhinotrachealeisoléesde différentesespèces
aviarres
tm8
st t{to
Ër laè,
Ë{ t+t 0
tf{ la06
3i{tto,
3t{la0l
g1{a6tÉ
st tat a
lË
-({ to
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Értrt
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eN93t3
t
d
(1
BH*IZ
s
I
|
l0
|
|
50
|
|
60
|
|
I
?0
Pourla techniquede RAPD. I'ADN bactériena été
préparé à partir d'extrait de culnre porté à
ébullition et purifié par centrifugation. Quarante
décanucléotides
ont été arbitrairementchoisisafin
de senir d'amorceà la réactiond'amplificationpar
PCR. Parmi celles-ci.8 amorcesont été retenues
pour étudier les relations génétiquesentre les
souches. Les produits d'amplification ont été
par électrophorèse
séparés
en gel d'agaroseà 30Âet
les profils obtenus (RAPDtypes)ont été analysés
cornmedécrit pour les ribotypes.
Résultatset discussion
Parmi les 23 souchesd'O. rhinotrachealeétudiées,
8 ribotypes différents ont été déterminés après
digestion par 4 enzymesde restrictron.Les profils
obtenusaprèsdigestionparHindlll et Pvull se sont
révélésêtre les plus discriminants.Sept des 23
souchesappartenaientau ribotype 1. Les ribotypes
I et 2 étarentproches.Les ribotypes3, 4 et 5
étaient également proches mais parfaitement
distincts des précédents.Les riboffis 6, 7 et 8
étaient très différents et étaient chacun représentés
par seulementune souche.
Dix septRAPDtypesont été mis en évidence.Les
profils de I à 6 étaientproches.Les profils 9, l0 et
ll, distincts des precédents,étaient également
proches.Les autres profils étaient représentéspar
une seulesoucheet étaienttrès différents.
|
80
|
r
90
I
tz
rimitilité
Les résultats de ces deux méthodes étaient
concordants,la RAPD s'étant revéleela méthode
la plus discriminante pour les souches
d'O. rhinotracheale. L'analyse par la méthode
UPGMA des résultats obtenus par ribotypie et
RAPD a permis d'établir un dendrogramme
représentatif des parentés génétiques entre les
souchesd'O. rhinotracheale(FIGLJREl). Onze
des 23 souches sont génétiquementproches et
forment un grcupe homogène (groupe l). Ce
groupecomprend9 des 15 souchesisoleesde dinde
et 2 de poulet. Les 2 autres souchesisolees de
poulet sont généûquementproches (groupe 2) et
montrent plus de 80% de similarité avec le groupe
l. Un autre ensemble distinct, le groupe 3,
regroupetrois souchesde dinde. Les autressouches
isoléesde dinde, de faisan, de pintade et de perdix
sont différenteset génétquementéloignées.
Pour suiwe la diffirsion de souches,il est important
de disposer de marqueursmoléculairesefficaces.
Cette étude sur les souchesd'O. rhinotracheale
montre l'apport de la RAPD sur cette espece
baclérienne.Nous avions déjà montré I'intérêt de
cette méthode rapide pour la caractérisationdes
E. coli, Salmonella Enteritidis, et Pasteurella
isolésde différentesespècesanimales(æroy-Sétrin
et ql, 1995; Millemann et al, L996; ChaslusDanclaet al,1996\.
122
Cette étude a permis de montrer que la
présenced'O.rhinotracheale
relèved'événements
épidémiologiques
différentsmêmesi la présencede
prochesdans la filière de
souchesgénétiquement
production de dinde et de poulet peut zuggérerla
diffirsionde clones.
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t23
ROLE DES FIMBRIAE DAI\IS LA PATHOGENICITE T'F;SESCHERICHU COLI AVIAIRES :
CONSTRUCTION ET ANALYSE DE MUTAI\TS ISOGENIQUES FIM.ET FIMHMarc Daniel, Arné Pascal,Brée Annie & Dho-Moulin Maryvonne
Stationde PathologieAviaire et de Parasitologie.
INRA - Centrede TOURS,37380NOUZILLY, France
Résumé
Parmi les facteursde virulence descolibacillespathogènesaviaires,les fimbriae de type I sont souventproposes
comme facteur de colonisation. et pouraient égalementêtre impliqués dans la modulation de la réponse
immunitaire de I'hôte. Alin de testerin vivo I'implication desfimbriae dansla pathogénie,nousavonsconstruit
par échangeallélique" à partir de la souchepathogèneaviaire MT78 (O2:Kl), deux mutants isogéniquesau
locusfnr modifié. Le pouvoir pathogènedesdeux mutantsa ététestédansune reproductionexpérimentalede la
colibacillosesur poussinsde 15 jours. Nos résultatsindiquent que, si les fimbriae ne sont pas indispensables
dans la colonisationde I'appareil respiratoired'animaux axéniques,ils pourraientfavoriserl'établissement
d'une population d'E coli en présenced'une flore SPF.En outre, les animaux infectéspar les deux mutants
montrent régulièrementun gain de poids plus élevé que ceux infectéspar la soucheparentale,traduisantune
pathogénicitémoindre.
lntroduction
La colibacilloseaviaire est responsablede pertes
importantesen élevagesavicoles Associéeà des
souchesd'Escherichiacoli de sérogroupes
Ol, 02 et
O78. cettealfection respiratoiretoucheles pouletsde
3 à l0 semaines. après une infection virale ou
mvcoplasmique.Les lésions d'aérosacculite. de
pericarditeet de perihépatiteoccasiomentdes pertes
importantes"et dans certainscas I'arumal meurt de
septicémie(Gross. l99l). Parmi les facteurs de
virulence des E coli aviaires, I'expression de
fimbriae (ou pili) de type I est observéechez la
majorité dessoucheset sembleassocieeà la virulence
(Dho & Lafont, 1984, Naveh et al., 1984). Les
fimbriae de type I permettentaux bactériesd'adhérer
aux muqueuses (Gyimah & Panigrahy. 1988.
Krogfelt. 1991),et favoriseraientla colomsationde
l'appareil respiratoire.Il a égalementété montréque
les fimbriae de type I interagissentavec la réponse
immunitaire non-specifiquede l'hôte.
délétions ont été introduites dans la région clonée
contenantI'operon. Dans une premièreconstruction,
la totalité de I'opéron fim a été enlevée,tandis que
seul le gènefmH, codant pour I'adhésine, a été
enlevé dans la secondeconstruction.Dans les deux
cas.les régionschromosomiquesen amont et en aval
de la délétion ont été conservées,puis cloneesdans
un vecteurzuicide,pCYD442 @onnenberg& Kaper,
l99l). Ce vecteur permet I'echange allélique:
I'IGURE I : Principe de l'echangeallélique par une
double recombinaisonhomologue, en amont et en
aval du gène cible dans le chromosomebactérien,
celui-ci est substtuépar saversion modifiéein vitro.
chromosome
Le but de notre étude était de déterminer in vivo.
chez le poulet, I'importance des fimbriae dans la
colonisation de l'appareil respiratoire et dans la
pathogénicité,par une reproduclionexperimentalede
la colibacilloseaviaire utilisant deux mutantsdérivés
d'une souchepathogène
1. Résultatset discussion
chromosome
1.1. Constmction des mutants DM34 (fim-) et
PA68 (furrH-\.
La soucheMT78 (O2:K1:H+) a été isolee de la
tracheed'un poulet atteint de colibacillose @ho &
Lafont, 1982). Elle ne produit que des fimbriae de
type l. L'ofiron fim de MT78 a été cloné et
sequence (Marc & Dho-Moulin, 1996), et deux
gènedéléæ
introduit dans la soucheparentaleMT78, il permet
de srbstituer dans le chromosomele gène cible par
sa version modifiée, par une double recombinaison
homologue(FIGURE l).
Deuxièmesfournées de la RechercheAvicole, Tours, &10 avril 1997
t25
Le génogpe des deux mutants a été vérifié par des
testsde PCR utilisant des amorcessituéesde part et
d'autrede la délétion,ou à I'intérieur du gènedélété.
La région chromosomique
fim des deux mutantsest
représentée
en FIGURE 2. Des testsd'agglutination
avec des érythrocytesde poulet ont montré que les
deux mutants avaient perdu leur phénotype
d'hémagglutination
sensible au
mannose,
caractéristiquedesfimbriae de type l.
FIGURE 2 : Représentationschématiquede la
ré$onfim deMT78et desmutants
DM34et PA68
I'appareilrespiratoire.L'absencede différencesentre
souchesdansla colonisationde l'appareilrespiratoire
de poulets axémques pourrait être dû au statut
axéniquedes animaux, chez lesquelsles bactéries
inoculées trouvent un terrain vierge pour s'établir,
sansentrer en compétition avec une microflore déjà
installée. Nos résultats larssent suggérer que les
fimbriae participent effectivementà la colonisation
de l'appareil respiratoireen conditions naturelles.
c'est à dire en présenced'une microflore déjà
présente.
Pathogénicitédesmutantsfim
MTTt
D]N!.31(fn-)
PA6a (fnII
-t
frnB
E
la quasi-totalité
de I'opéron
pourDM34.
fim a éIéenlevée
Seulle gènede I'adhésine,
a
été
supprimé
dans
JimH,
PA681. 2. Caractérisationdesmutants
Colonisationde I'appareil respiratoire
Suivant un schémaexpérimental decrit par Brée et
al. (1989), les propriétés de colonisation et la
pathogénicitédes mutants ont été comparéesà celle
de MT78 par inoculation intra-trachéale à des
pouletsde 15 jours aprèsinoculationdu virus de la
Bronchite Infectieuse. Les animaux sont pesés
régulièrement,et autopsiésà la fin de I'expérience.
Un indice lésionnel est établi; les bacténes sont
dénombreesdans un poumon entier broyé, dans la
trachée broyee, et leur présence recherchée par
culture dans les sacsaériens,le liquide pericardique,
le sangdu coeuret le foie.
Dans une première experienceréalisee sur poulets
SPF,le mutant DM34 (ftm-) a été comparéà MT78
et à la souchenon pathogèneEC79.Les numérations
bactériennessont moins élevéesdans les poumons
des poulets inoculés avec DM34 que chez ceux
inoculésavecMT78. On n'obsewepasde différences
entre DM34 et MT78 dans les numérations
bactériennesde la trachée,ou quant à la présencede
bactéries dans les organes profonds. Dans une
seconde expérience, les mutants DM34 (/îm-) et
PA68 tfimH-) ont été comparés à MT78 sur des
poulets axéniques. Nous n'avons pas observé de
différencesentre les trois lots quant à la présencede
bactériesdans les poumons,les sacsaériens, ou les
organesprofonds.
L'observation que le mutant DM34 était moins
abondant dans le poumon d'animaux SPF que la
soucheparentaleMT78 est un argunent de plus en
faveur du rôle des fimbriae dans la colonisaûon de
La pathogénicitédes mutantsa d'abord été évaluée
par déterminationde la DL50 sur poussinsd'un jour
Bien que ce modèle ne puisse se substituer à la
colibacilloseexpérimentale,il permet d'évaluer les
propriétés d'invasion s-vstémiquedes souches.
propriétés qui ne sont pas altérées par les
modificationsde I'opéronfm. commeen témoignela
DL50 similaire observéechez les deux mutants et
MT78 (-103bactéries)
Les mutantsDM34 et PA68 ont ensuiteétécomparés
à MT78 dans le modèle de colibacillose
expérimentaledécrit plus haut. Dans une première
DM34 a étécomparéà MT78 et à la
expérimentation.
souchenon pathogèneBC79sur despouletsSPF.Les
pouletsinoculésavecDM34 ont montré un gain de
poids superieur à ceux inoculés par la souche
parentale MT78, restant cependant inferieur aux
gainsde poidsobservés
avecla souchenon pathogène
EC79. Les lésions de péricardite et perihépatite
étaientplus fréquentesavecMT78 qu'avecle muanl
DM34. Dans une secondeexpériencecomparantles
deux mutants à la souche MT78 sur des poulets
poids étaient
axéniques, les garns de
significaûvement plus élevés chez les animaux
inoculés par les mutants DM34 ou PA68 que chez
ceux inoculéspar MT78. La comparaisondes indices
lésionnels dans cette expériencen'a pas montré de
diftrences significatives entre les animaux infectés
par les trois souches.
Ces observationsmontrentque DM34 et PA6E sont
moins pathogènesque MT78, cornmeen témoignent
les gains de poids régulièrementplus élevéschez les
animarx inoculéspar les mutants.De plus, bien que
l'on n'ait pas observéde différencesentre DM34 et
MT78 dans la colonisation d'organes profonds chez
les animaux SPF, les lésions de péricardite et de
perihepatite sont plus frequentes chez les poulets
infectés par la souches:rwage. Cette diftrence n'a
cependant pas été observee chez les animaux
axéniques.Il faut remarquer que nous n'avons pas
évalué la réponse immunitaire chez les animaux
inoculés. L'un des aspectsde cefte réponse est la
phagocytose des bactéries par les macrophages,
laquelle serait, selon les auteurs,favorisee(Malaviya
t26
(Keith et al ,
et al. 1994b) ou au contraireempêchee
1990) par la présencede fimbriae. Les résultars
obtenusjusqu'à présentne nous permettentpas de
pour I'interaction
faroriserI'une ou I'autre hypothèse
desfimbriae avecla phagocytosein vivo.
respiratoire des poulets,mais pourraient faroriser
l'établissementd'une populationd'8. coli dansles
conditions naturelles.Les différencesde gains de
poids chez les animaux experimentalement
infectés
montrent une pathogénicitéréduite des mutantsfin
pour préciser
D'autreserpériencesserontnécessaires
pathogénique
Par ailleurs.d'autresauteursont montré récemment les étapesdu processus
danslesquelles
que les fimbriae de type l, et particulièrement lesfimbnaesontimpliqués.
l'adhésineFimH, suscitentune réponseimmunitaire
en activantles mastocltes,et en provoquantI'afflux
Références
de neutrophiles(Malariya et al., 1994a1996).Si ce
mécanismese réalisein vivo, les animaux inoculés BréeA, Dho M, LafontJP, 1989,Avian Dis 33, 134par les mutants devraient présenter une réponse 39
inflammatoirediminuee, laquelle pourrait se traduire
Proc Natl Acad Sci USA, 93:
Connellet a1..1996,
par une atténuation des signes cliniques. C'est 9827-32
d'ailleurs ce que certains auteurs ont observéchez Dho. M. LafontJP, 1982,Avian Dis 26:787-797
des souris expérimentalement infectées par une
Dho, M, LafontJP, 19E4,Avian Dis 28: 1016-25
soucheuropathogèned'8. coli ou son mutantrtntil
MS, Kaper.JB,InfectImmun59:4310Donnenberg,
(Connellet al., 1996).Il est donc waisemblableque
t7
la différencede pathogénicitéobservéeentreMT78 et
of poultry(Calnek.Bames,
GrossWB. -1nDiseases
partie
les deux mutantsrésulteen
de différencesdans Beard,Reid,Yoderedit.) 9th edn.Ioua StateUniv.
la réponse inflammatoire. D'autres expériences Press,
Ames.Iowa,1991:pp138'144
seront nécessairespour étudier I'importance de la
Gyimah,JE. PanigrahyB, 1988,Avian Dis 32:74réponse immunitaire dans la déterminaûon de la
78
pathogénicitéchez le poulet, et pour preciser le rôle
Keith et al.. 1990.Infect Immun 58: 3448-54
desfimbriae à ce niveau.
Krogfelt,KÀ 1991.RevInfectDis 13:721-35
Malaviyaet al.. 1996.Nature381: 77-80
Conclusion
Malaviyaet al.. 1994a,J Clin Invest93: 1645-53
Malaviyaet al., l99.lb. J Immunol 152:1907-14
En conclusion, nos résultats montrent que les
Marc, D. Dho-Moulin M, 1996, J Med Microbiol
fimbriae de type I ne sont pas strictement 1996,44:444-52
indispensablesà la colonisation de I'appareil
Navehet al.. 1984.AvianDis 28 : 651661
t27
LOCALISATION DE L'E)QRDSSION IN WVODE FIMBRIAE T'1ET P LORS DE COLIBACILLOSE
E)QERIMENTALE CHEZ LE POULET
Fairbrother John2
Dho-MoulinMaryvonnel,Brée Anniel, PourbakhshSeyedAIi2,DesautelsClarisse2,
IINRA, Centrede Tours-Nouzilly,Staton de PathologieAviaire et Parasitologie,37380Nouzilly, 2Facultéde
MédecineVétérinaire,Universitéde Montréal,St Hyacinthe,Québec,J2S7C6 Canada
Résumé
Les souchesd'Escherichiacoli pathogènesaviairesexpriment in vitro desfimbriae Fl, et certainesd'entreelles
qynthétisentégalement des fimbriae P qui pourraient être impliqués dans la colonisation bactérienne et
l'infectionde I'animal.
Dans une premièreexperimentatior\ des lots de poules axéniquesélevésen isolateur ont été inoculésavecdes
souchesd'8. coli pathogènes
de génotypeconnuet l'évoluton du taux d'antcorpsdirigéscontreles fimbriaeFl
et P a été suivie à I'aide d'un test ELISA. Dans une deuxième expérimentation, des lots de poulets
conventionnelsont été inoculésavecces mêmessouchesd'E. coli et I'expressiondes fimbriae Fl et P a été
recherchéedansdifférents organespar immunofluorescence
sur coupesde tssus congelés.
L'apparition d'anticorps anti-fimbriae Fl et ant-fimbriae P dans le sérum des poulets, 15 jours après
I'inoculation, a permis de confirmer I'expressiondes fimbriae in vivo au cours d'une colibacillose
experimentale.L'examendes coupesde tissuscongelésa par ailleurs mis en évidenceque les fimbriae Fl
étaientexprimésuniquementdansles voiesrespiratoires,essentiellement
au niveaude la trachée,alors que les
fimbriae P étaientexprimésdansles voies respiratoiresinférieureset certainsorganesprofonds.
Ces résultatsdevraient permettre d'étudier plus precisémentle rôle des fimbriae aux différentes étapesde la
colibacilloseaviaire.
Introduction
Les Escherichiacoli pathogènesdes volailles sont
responsables
d'infections
extra-intestinales.
systémiques, dues atu( propriétés invasives des
souchesen cause.Le point de départde cesinfections
est le plus sowent respiratoire(GrossW.8., 1991).
Plusieurs facteurs potentels de virulence ont été
identifiés in vitro chez les souches d'E.coli
pathogènes pour les volailles, sur la base de
corrélationsavec le powoir pathogèneexperimental
pour le poussin : expressionde fimbriae (de tne Fl
et P) à la surface des bactéries, synthèse d'un
sidérophore bactérien (l'aérobactine), présence de
certains polysaccharides capsulaires capables
d'induire une résistanceau powoir bactéricide du
sérum, activité cytotoxique @ho-Moulin M., 1993).
Les fimbriae sont des filaments protéiques extracellulaires, connus pour être impliqués dans
I'adhésiondes bactériesaux cellules épithéliales par
I'intermédiaire de récepteursspecifiques.Ils pewent
égalementinterférer avec les défensesimmunitaires
de I'hôte. Il a été monûé, par des testsin vifro, que
les fimbriae de type Fl exprimés par les E coli
pathogènes aviaires étaient responsables de
I'adhésionaux cellules épithéliales pharyngienneset
trachealesdu poulet, et pourraien! de ce fait, être
impliqués dans la colonisation de l'appareil
respiratoire, première étape de la maladie (Dho M.
and J.P. Lafont, l9S4; Gyimah I.E. et al., 1988).Par
ailleurs, certaines souches d'E.coli pathogènespour
12yefnille, expriment égalementinvitro desfimbriae
de type P (van den BoschJ.M. et a/., 1993),sans
qu'un rôle in vivo n'ait pu encoreleur être attribué.Il
est connu que I'expression des fimbriae est
dépendante de facteurs de I'environnement
(temperanre, pll, nuuiments disponibles) et des
variationsde phaseont ainsi été observeesin vitro
pour les fimbriae de type Fl et P (Dozois C.M. et al..
1995).
Le but de cette étude était de rechercher et de
localiser I'expressiondes fimbriae Fl et P in vivo,
chez des poulets infectésexpérimentalementpar une
souchepathogene{E.coli. Ce travail constinnit un
préliminaire indispensableà la recherchedu rôle des
fimbriae dansle dweloppementde la colibacillose.
Matériel utilisé
Souchesbactériennes: 2 souchespathogènesd'E.coli
d'oriFns aviaire : MT78 (o2:Kl:H+), qui ne peut
produire que des fimbriae Fl (génotypertm+, Pap-),
et TK3 (Ol:Kl:H7) qui peut produire desfimbriae Fl
et P (génoffi fim+, pap+), @ozois C.M. et al.,
1994).
Anticorps polyclonaux : serums spécifiques de
chaque type de fimbriae (Ft et P) obtenus par
immunisaton de lapins avec des fimbriae purifiés
@ho-Moulin M. et al.,l99O).
Animaux : (l) poulets a:réniques,issus de Leghorn
Blanches, souchePAl2 de la Station de Pathologie
aviaire et Parasitologie; (2\ poulets conventonnels,
issus d'un élevage de St Hyacinthe, Québ€c.
Dewièmesjournées de Ia RechercheAvicole, Tours, 8'10 avril 1997
129
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ou P à leur surface a été déterminé à I'aide d'un
microscopeà fluorescence.
Des bactéries correspondantaux souches d'E.coli
inoculéesont été misesen évidencedans chacun des
tssus examinésainsi que dans le sanget le liquide
Deux groupes de poulets axéniques élevés en
la
isolateursont été inoculés par voie intra-trachéale péricardique.Les fimbriaeFl, produitspar souche
par
exprimés
étaient
TK3,
par
la
souche
jours
ou
trrftZg
avecla soucheMT78, ou la soucheTK3, deux
la
présentes
dans
bactéries
proportion
des
forte
une
aprèsavoir été inoculéspar le virus de la bronchite
par
les
bactéries
fréquemment
moins
et,
trachée,
comme
infectieuse @I, souche Mass4l), utilisé
présentesdans les sacsaérienset dans les poumons
facteurdéclenchantde la colibacillose@réeA. et al.,
les
1989).Un troisièmegroupede poulets,uniquement Gig. Ze). Aucune des bactériesprésentesdans
Fl.
fimbriae
autresorganesn'exprimaitde
inoculéspar le virus BI, consttuaitle témoin.
de sang(J0, J3, J'7,JlO, Jl4, 122, Les fimbriae P, produitspar la soucheTK3, ont été
Neuf prélèvements
mais
JZS,J3l. J36)dont le premier(J0) avantI'inoculaton observésmajoritairementdans les sacsaériens,
le
liquide
rein,
le
poumons,
les
dans
aussi
bactérierure,ont permis de déterminer l'évolution du
des
taux d'anticorps anti-fimbriae dans le sérum de ces pericardique et te sang (Fig. 2B). Aucune
la
trachée,
présentes
dans
TK3,
la
souche
de
ùactéries
fimbriae
poulets, par test ELISA, en utilisant des
la rate ou le péricarden'exprimait de fimbriae P.
purifiéscornmeantigènes.
des
spécifiques
d'antcorps
Des taux significatfs
fimbriaeFl ont étédétectésdansle sérumdespoulets Conclusion
inoculésavec MT78, ou avec TK3, à partir de 14
Cetteétude(PourbakhshA-S. ef al.' 1997)a permis
jours aprèsinoculationbactérienne@ig. lA et lC).
par la détection
Des taux significatifs d'anticorps spécifiques des de démontrer indirectemenl
I'expressioniz
fimbriae'
des
specifiques
fimbriae P ont été détectésuniquementdansle senrm d'anticorps
par
P
des souches
Fl
et
de
type
fimbriae
vivo
des
despouletsinoculésavecla soucheTK3 @ig. lB et
plus, la
De
pour
la
volaille.
pathogènes
il
n'a
d'E.coli
(non
inoculés),
lD). Chezles pouletstémoins
par
immunofluorescence
fimbriae
des
visualisaton
les
fimbriae
contre
pasétéobservéd'anticorpsdirigés
P. Cependant,un faible taux d'anticorpsanti-Fl a été sur coupes de tssus congelés a mis en évidence
I'existenced'unevariaton de phasein vivo, résultant
observéchez ces pouletstémoins,jusqu'à 10 jours
en une expression différente de chaque t)æe de
après inoculation, qui pourrait être dû à la
fimbriaeselonle tissucolonisé.
transmissiond'anticorpsmaternels.
L'observation de I'expression préférentelle des
Les résultats ELISA ont été confirmés par
fimbriae Fl dans la trachéeest à mettre en relation
immunodotet Western-blot.
avecI'implicaton desfimbriaeFl dansI'adhésionin
virro aux cellulestrachéales.Elle conforteI'hypothèse
vivo
in
Localisation de I'expressiondes fimbriae
d'un rôle probabledesfimbriae Fl dansles premières
inoculation
chez des poulets conventionnelsaprès
étapesde la colibacilloseaviaire.
dansles sacsaériens
L'absenced'expressiondesfimbriae P dansla trachée
Trois groupesde pouletsont été inoculésdans les est en parfait accord avec les tests in vitro ayant
montré que les fimbriae P ne sont pas impliquésdans
sacsaériensavecla soucheMT78, ou la soucheTK3,
poulet (van den
ou un volume équivalent de P.B.S. stérile. Deux I'adhésionaux cellules trachéalesdu
l'expressiondes
Cependant,
L993).
et
al.,
J.M.
pouletsde chaquegroupeont étéautopsiésà3,6, 12, Bosch
profondsouwe
les
organes
dans
P
observée
fimbriae
24 et 48 heures suivant I'inoculation. Différents
rôle possible
leur
sur
recherche
perspectives
de
des
prélèvementsde tissus ont été effectuéssur chaque
I'infection.
de
ultérieur
le
dweloppement
dans
péricarde'
foie,
poulet (trachee,poumon,sacsaériens,
des rutants
rate et rein), ainsi que desprélèvementsde sanget de Des infections expérimentales,utilisant
isogéniqueslm-Q{arcD. et al',1997) ou pap-, de
liquidepéricardique.
pour but de préciser
Après congélaton, des coupes de tiszus ont été souihespathogènesd'E coli, ont
de fimbriae r{ensle
types
le rôle respectifde cesdeux
effectuéesavecun cryostatet montéessur lames.Les
bactériesont été identifiees par immunofluorescence processuspathogénique.
en utilisant des sénrms spécifiquesanti{l et antiRéférences
02, pour détecter les souches TK3 et MT78
respectivement. Par ailleurs, des antcorps antBréeA. , Dho M. , LafontJ.P.,f989. Avian Dis', 33'
fimbriae Fl et ant-fimbriae P ont été utilisés pour
134-139.
Un
bactéries.
détecter les fimbriae à la surface des
M.. Lafont J.P., 1984.Avian Dis', 28, 1016Dho
la
fluorescéine'
à
marqué
anti-sérumanti-Ig de lapirl
a ensuite permis la visualisation des anticorps 1025.
Dho-MoutinM. van den BoschJ.M., GirardeauJ'P''
specifiques fixés, selon le protocole decrit
Brée A., Barat T., Lafont J-P.Infect. Immun., 1990,
précédemment@ozois C.M. et al-, f994). Le
58,740:745.
pourcentagede bactériese4primant des fimbriae Fl
Mise en évidencede I'expressiondes fimbriae F1
et P in viua après infection expérimentale de
pouletsaxéniques
Dho-Moulin M., 1993.Ann. Méd. Vét, 137, 353357.
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Infect.Immun.,6 l, 800-806.
typeP (B) dansles différents
FIGURE 2. proportionde bactériesexprimantdesfimbriae de typeFl (A), ou de
TK3 (/im+, pap+) dansles
organes,aprèsinoculationde la souched'E.coliMT78 (fim+, p"i) ou de la souche
ont étévisualiséspar
erprimés
Les cellulesbaciérienneset les fimbriae
sacsaériensde pouletsconventionnels.
congelés'
tissus
sur descoupesde
à I'aidede sérumsspécifiques,
immunofluorescence
L
r=
c)
7
o
o
.o
I
I
I
L
Trachée
TIC3
Poumons
TI(3
Sacsaériens
TIC3
Trachée
MT78
Poumons
MT?8
80
iTo
'i
É60
g
i5
50
e
E40
3so
<,
.o
uai
I
c)
:èD
10
g
=
o
9r
Trachée
TI(3
Poumons
TI(3
Sacsgériens
TIcl
Liq. péricar.
TI(3
Sacsaériens
MT78
INFECTION E)QERIMENTALE DD,POULE,TSET DE CANARDS A L'AIDE DE LA SOUCIIE
MYC OPI./I SMA I M I TANS 4229
Ifumpf Isabelle, Gesbert X'ebienneet Guittet Michèle
CNEVA- Ploufragan,Unité de Mycoplasmologie- Bactériologie,Zoopnle,BP 53. 22440Ploûragan
Résumé
L'especeMycoplasmaimitans (MI), initialement isolê à partir de canard.oies et perdrix est serologiquement
distnAe des autres espècesde mycoplasmesà I'excepton de Mvcoplasma gallisepticum. ces deux espèces
présentant40 à 46 7o d'homologiesau niveau génétique.Les travaux decrits ici visaient donc à étudier le
pouvoir pathogènede cette espècemycoplasmiquepour le canard et pour le poulet et à connaître les
d'une infection par ce mycoplasmevis-à-vis des programmesde dépistagessérologiquedes
êonséquences
infectionsàMycoplasmagallisepticun.Danscebut, I'infection expénmentalede canardset de pouletsexempts
cliniquessont
specifiésa étéréaliséeà I'aide de la soucheNII 4229.Les conséquences
d'organismespathogènes
peu importanteschez le canard comme chez le poulet. L'infection peut être mise en évidencepar culture ou
âgglutination rapide sur lame (ARL) réaliséesur les sérumsdilués et non dilués à l'aide de I'antigène
agglutinantM. imitans. Quelquesréactionscroiséesvis-à-vis de M. gallisepticum sont notéesquandles sérums
du commerce
de canardou de pouletssonttestéspar ARL ou à I'aide de deux testsimmuno-enrymaûques
Abstract
Experimental infection of ducks and chickenswith Mycoplasmaimitans 4229
Mycoplasmaimitans (tldl) type strain 4229 was isolated from the turbinate of a duck with respiratorydisease.
fire jpeciesis serologicaltydistinct from other mycoplasmaspeciesexæptM. gallisepticum (MG) to which it is
geneticallyrelatedat a levet of approximately40 to 46 oÂ.In order to determinewhetherM. imitans represents
i pathogenfor ducks or chickens or may complicate serological testing proglams for MG, an experimental
iiection of specific pathogenfree ducks and chickens was performed. Result showedthat MI could detect
positivebirds but it wàs neôessaryto test duck seraundiluted and diluted. Moreoverwhen serawere testedwith
VtG antigen, either with SA test or commercial ELISA tests, a few cross reactions to MG antigen were
observed.
Introduction
Matériel et méthodes
La soucheMycoplasma imitans 4229 a été isolée
de I'appareil iespiratoire de canardsprésentantdes
qf*piO-*.r respiratoires. L'espèce Mycoplasma
imitans est sérôlogiquementdistincte des autres
espèces de mycoplasmes à t'exception de
Mlcoplasma gàlliiepttcum, ces deui espèces
pier.ntuot 40- à 46% d'homologies au niveau
génetique Les travaux decrits ici visaient donc à
ètoAi"i le powoir pathogène de cette espece
mycoplasmiquepour È ca"arA et pour le podèt et
a ônnaitre tès ônsequencesd'uné infectiôn par ce
mycoplasmevis-à-vis desprogrcrnmesde depistage
à Mycoplasma
seiotôgique des infeûioÀ
gallisàpiicum
Vingl-cinq canardsEOPSâgésde quatorzejours et
vingl-cinq poulets EOPS du même àge sont
inoculés par voie intra-trachéaleà I'aide de 0,2m]
d'une culture de la soucheM. imitans titrant l0'
unités changeantcouleurpar millilitre. OrtE:e,3I,
42 et 52jours après infection @I), les symptômes
respiratoiressont relwés. Des écouvillonnagesde
trachées sont réalisesà partir de quinze canardset
quinze poulets et des écouvillonnagesde cloaques
sont effecûrésà partir de dixrcanardset dix poulets
et mis en fllture sur milieu FM4 pour la recherche
de mycoplasmes.Aux mêmesdates, des prises de
sang sont realisees.Les anticorps specrfiquesde
Mycoplasrna imitans sont recherchés selon la
méthoded'agglutnaton rapide sur lame (ARL) à
l'aide de l'antgène M- imitans (Sanofi, France)'
De plus, les anticorps dirigés contre M'
gallisepticum sont recherchéspar ARL à I'aide de
I'antigène M. galtisepticum (Intewet' France)' Les
serumssont testésnon dilués puis aprèsdilution au
Dans ce but, I'infection expérimentalede canards
et de poulets exempts d'ôrganismes pathogènes
spécifiéi (EOPS)a éié réalisée
Deuxièmesfournées de b RechercheAvicole, Tours, &10 avrtl U97
l/5èmeen solutiontamponnéeau phosphate0. Les
anticorps anti M. gallisepticum sont recherchés
dans les sérums de poulets à I'aide d'un test
(MG
immuno+nzymatque indirect
KPL,
Gaiterburg) selon les recommandaûons du
fabriquant ; enfin les sérums de poulets et de
canardssonttestésvis-à-visde MG à I'aide d'une
méthode immunoenzymaûque par blocage
(Svanovir,Suède)réaliséeselonles indicationsdu
fournisseur.Les oiseauxsont sacrifiés52 jours PI
et les lésionssontrecherchées.
Résultats
Signescliniques
Aucun symptômerespiratoiren'est observé. Les
lésions observeesà J52 sont peu importanteset se
limitent à de légères aérosacculitesprésentessur
six canardset un poulet et à une pericardite notée
surun canard.
Réisolementde Mycoplasmaimilans
Les résultatsdes cultureseffectuéesll. 31. 42 et
52jours PI sontprésentés
dansle tableau1.
De Jll à J42. 9/15 à l5l15 des ecouvillonsde
trachéede canardssont trouvéspositifs en culture.
Seulun ecouvillon de cloaquede canard est positf
à J42. Les cultures de mycoplasmeseffectueesà
partir des écouvillons de trachéesou de cloaques
prélevéssur les pouletsàùll ou J3l sontnégatives
A J42. un écouvillonde trachéede poulet et un
écouvillonde cloaqueprovenantd'un autre poulet
sontpositifsen culture.
Réponse sérologique vis-à-vis de Mycoplasma
imirans
Avec le test ELISA KPL, la plupart des sérumsde
poulets testéssont négatfs. Seul un poulet donne
un résultatdouteuxà J3l et J42. Avec le test MG
Svanovir, tous les sérumsde poulets sont négatifs,
ainsi que la plupart des sérums de canards. Un
canardparait douteuxà J42et positif à J52.
Discussion
Dans nos conditions expérimentales,Mycoplasma
imitans peut infecter durablementle canard mais
s'implante plus difficilement chez le poulet. Les
consequences
cliniques de cette infection semblent
Des
observations similaires sont
limitées.
rapportéespar Ganapathyet Bradbury. Cependant
les travaux de cesauteursmontrent égalementque
M. imitans peut exacerberle powoir pathogènede
virus à tropisme respiratoiretels que le virus de la
bronchite infectieuse.Ainsi les lésions de sinusite,
trachéiteet aérosacculitesont plus sevèreschezdes
poussins experimentalementinfectés à I'aide de
vins et de mycoplasmescomparésaux oiseaux
inoculésavecle seulvirus.
Conclusion
Les résultats obtenus au cours de I'infection
expérimentaledecrite ici montrent que I'infeaion
peut être détecteechez le canard soit par culture,
soit par ARL réalisee à I'aide de I'antgène
agglutinant specifique Mycoplasma imitans. Il
semble cependant necessairede tester tous les
sérums dilués et non dilués. Quelques réactons
croisées vis-à-vis de Mycoplasma gallisepticum
pewent être observéeslorsque les sérums sont
testés à I'aide de la technique ARL ou de kits
immunoenzymatiques.
Références
Les résultats des ARL M. imitans sont présentés
dansle tableau2.
A Jll. trois des 25 sérumsde canardstestésnon
dilués sontpositifs. Cependantaprèsdilution, vingt
sérumsagglutinentI'antigène.A J3l, la plupart
dessérumsnon dilués ou dilués paraissentpositifs.
A J42 et à J52, I'ARL effectueeavec les sérums
testésnon dilués donne 24125positrts; lll25 et
17125 sérurrs respectivement réagissent encore
aprèsdiluton. Pour les serumsde poulets,de 2/25
à 6/25 serumsseulementsont positifs non dilués de
Jll à 142. Après dilution 2125 serums au
maximum reagissentavecI'antgène MI.
Bradbury J.M., O.M. Saed AMul-Wahab, C.A.
Yavari, J.P. Dupiellet et J.M. Bové, Int. J. of
SystematicBacteriology,1993,43,72I-7 28.
GanapathyK. and J.M. Bradbury.Pathogenicityof
Mycoplasma imitans in dual infection with
infectious bronchitis virus in chicks. Abstract of
Internatonal Congress of the
the llth
International Organization for Mycoplasmology,
Orland,Florida,July 14-191996
Réponse sérologique vis-à-vis de Mycoplusma
gallisepticum
Lorsque les sérums sont testés par ARL avec
I' arûigèneMycoplasmagal lisepticum, deux sérums
de canardsréagissent,diluésou non dilués,à Jll.
Tous les autressérumssont négatifs
134
TABLEAU I : réisolement de lv'lycopl anta imi tans
JOur
ecouvillonsde
tracheede
canards
Jlr
9tL5*
J3l
J42
I52
l0/15
l5/15
0/15
écouvillons
de cloaquede
canards
0/10
0/10
l/10
0/10
écouvillonsde
tracheede
ooulets
0/15
0/15
U15
0/15
ecouvillonsde
cloaquede
ooulets
0/10
0/10
l/10
0/10
* : nombred'oiseauxpositifs en culture/nombred'oiseaux testés
TABLEAU 2 : Agglutnation rapidezur lamevis-à-vis de I'antgène Mycoplasmaimitans
ærunsdepoulets
senmrsde canards
l:5
non dilués
iour PI
Jll
J3l
20t25
22t25
tU25
t1t25
3125*
24125
t42
t52
24t25
25t25
non dilués
l:5
6125
2125
5t25
2125
2125
v25
v25
u25
* : nombred'echantillonspositifs/nombred'echantillons testes
TABLEAU 3 :Agglutination rapidesur lamevis-à-vis de I'antigène Myoplasma gallisepticum
iorPI
Jll
J3l
142
t52
senrnrdecanards
l:5
nondilw
u25*
ot25
ot25
ot25
u25
ol25
ot25
ot25
* : nombred'echantllonspositifVnombre
d'échantillonstesés
poules
serumsde
non dihré
l:5
ol25
ot25
on5
ot25
ot25
ot2s
ol2s
ot25
COMPARAISON DE L'INFECTION EXPERIMENTALE A MYCOPL./IS
MA GALLISEPTICUM CIfiiEZ
LE POULET ET CHEZ LE CANARI)
Kempf Isabelle,Gesbert Fabienneet Guittet Michèle
CNEVA-PLOLJFRAGAN- Unité de Mycoplasmologie-Bactériologie
BP 53,Zoopole -22440 Ploufragan
Résumé
Despouletset descanardsexemptsd'organismespathogènes
specifiéssontexpérimentalement
infectésà I'aide
d'une souchede tr'[ycoplasmagallisepticum igoléede poulets. Les slmptômes et lésions observéschez les
canardssont nettementmoins sévèresque ceux présentéspar les poulets.IuI.gallisepticumestrégulièrement
réisoléà partir d'écouvillonstrachéauxdans les deux espèces.L'agglutination rapide sur lame permet de
détecterlespouletsinfectésmaisles sérumsde canardsdiluésau 1/5èmerestentnégàtifsseloncettetechnique.
Cependantune technique immunoænrymatique par blocage permet de montrer la présenced'anticorps
specifiquesde14.gallisepticutn chezles pouletset chezles canards.
Abstract
Comparisonof experimentalinfection of Mycoplasmagallisepticun in chickensand ducks
Specificpathogenfree chickensand ducks were experimentallyinfected with lt[ycoplasmagallisepticum. The
results of this experiment showed that chicken isolates may infect ducks. However in our experimantal
conditions,only very limited respiratorys.vmptomsand lesionscould be observedin ducks comparedto those
recordedin chickens.Moreoverslide agglutinationtest withM. gallisepticum antigenwas unableto detectMG
infectionin ducks.Duck andchickenserawerepositiveaccordingto a commercialblockingELISA test.
Introduction
symptômesrespiratoires.Une secondeinoculation
est réaliséde la même manièreseptjours plus tard.
Sept, 12, L8,24,39 et 45 jours aprèsla prenière
inoculalion @I), les symptômes respiratoires sont
recherchés. Des écouvillons de trachée sont
prélevés pour recherche de mycoplasmes. Des
séntms sont prélevés el analyséspar agglutination
rapide sur lane avec I'antigène MG (Inlervet,
France) et I'antigène M. imitans (Sanofi, France)
ainsi que par lests immuno-enzymatiquesà I'aide
de kits commerciaux (KPL, USA et Svanovir,
Suède)selon les recommandationsdes fabriquants.
Mycoplasma gallisepticun est responsablechez le
poulet et chez la dinde de la maladie respiratoire
chronique, à I'origine
de graves pertes
économiques. Chez le canard domestique, MG
peut être isolé aiusi que d'autres espèces
mycoplasmiques(telles que M. imitans, M. anatis,
M. cloacale...). Cæpendanl
le rôle pathogènede ce
mycoplasme est peu connu chez le canard. Cætte
étude fut donc entreprise afin de comparer les
effets d'une infection expérimenlale réalisée à
l'aide d'une souchede MG chez des poulets er des
canards exempts d'organismes pathogènes
spécifiés.
[æs oiseaux sont sacrifiés à J45 el les lésions de
I'appareil respiratoiresont relevées.
Matériel et méthodes
Résultats
Dix-neuf poulets EOPS âgés de 16 jours er vingt
canards EOPS âgés de 18 jours sont inoculés par
voie intra-oculaire (0,05m1)et intra-trachéale(0,2
ml) à I'aide d'une cuhure de la soucheMG 4l-91
titrant 1.0' unités changeaûtcouleur par millilitre.
La souche MG 41-91 avail précédemment éré
isolée de trachées de poulets présentant des
Sipes cliniques : des symptômes respiratoires sont
observés chez les poulets mais non chez les
canards, el des lésions de trachéite et d'
aérosacculitesont observéeschez les poulets mais
non chez les canards.
Deuxièmes Journées de la Recherche Avicole, Tours, 8-10 avril 1997
137
Réisolementde Mycoplasma gallisepticum
Références
Les résultats dcs réisolements de Mycoplasnu
gallisepticum sont présentés dans le tableau 1.
MG est réisoléde 18 et 7 poulets à J12 et Jl8 PI,
mais les cuhures effectuées par la suite restent
négatives. Pour les canards, 1.9, 10, 5, 2 et 0
animaux sont trouvés porteurs de MG à J12, J18,
J24, J39 et J45 respectivement
Amin M.M. andJordanF.T.W., 1978.Res.Vet.
Sci.25.86-88.
BencinaD., Dorrer D. and Tadina T., Avian
Pathol.,17,441-449.
Kempf I., 1990. Recueilde Med. Vet.,166 (12)
1111-1r15.
Sérologie
Les résultats des aÊ€lutinations rapides sur lame
vis-à-vis de I'antigène Mycoplasma gallisepticum
sont présentés dans Ie tableau 2. Selon cplte
technique et I'interprêtation classique (un sérum
est considéré comme positif si I'agglutination est
encore positive après dilution au 1/5èmc), la
plupart des poulets sont positifs dès J12 et jusqu'à
la fin de I'expérimentation alors que les canards
restent négatifs. [æs poulets testés à I'aide de
I'antigène Mycoplasma imitans sont négatifs ators
que quelques sérums de canards dilués ou non
dilués agglutinent c€t antigène. [æs résultats
obtenus selon les kits ELISA sont donnés dans le
tableau 3. I-e test ELISA KPL détecte les premiers
poulets douteux à J18 et les premiers poulets
positifs sont notés à J39. Pour le test Svanovir,
trois poulets et un canard paraissent positifs dès
JL8 et les nombres de poulets et de canardspositifs
auÊmententpar la suite.
Discussion
I-es résultats de cette expérimentation montrent
que des souchesde MG isolées de poulets peuvent
infecter le canard. Dans nos conditions
expérimentales,les symptômes et lésions observés
chez les canards sont très réduits en comparaison
des signes cliniques relevés chez les poulets. Le
test d'agglutination rapide sur lame effectué à
I'aide de I'antigène Mycoplasma gallisepticum ne
permet pas de détecter les canards infectés. Ceux
ci peuvent néanmoins être dépistés à l'aide d'un
test immuno-enzymatique de blocage.
Conclusion
Ainsi, si Mycoplasama gallisepticum semble peu
pathogène chez le caaard, le dépistage de I'
infection par cette espècemycoplasmique cbez le
canard doit être basé sur la recherche de ct germe
par culture ou la nise en évidencp d'oiseaux séropositifs à I'aide de tests immuno-enrymatiques de
blocage.
138
TABLEAU 1 : RéisolementdeMycoplasmagallisepticum
écouvillons de
lrachée de poulets
jour PI
112
J18
J24
J39
145
écouvillons de
trachée de
canards
18/19*
7t1,9
0/L9
19t20
10/10
st1,0
2n0
ol79
o/1,9
o/20
* nombre d'oiseauxpositifs/nombred'oiseaux testés
TABLEAU
2 : Agglurination rapide sur lame vis-à-vis de l'antigène Mycoplasma gallisepticum
poulets
iour PI
JL2
J18
J24
J39
J45
canards
L : 5 **
sérumsnon dilués
19lt9*
L9l19
sérum non dilué
tst19
8120
0t20
ot20
ol20
0120
T7/T9
T9/L9
19179
19ftg
t9tt9
L9/1,9
19l19
1:5
0/20
ot20
a/20
0120
ot20
* nombred'echantllons positfVnombre d'échantillons testés
*x sérumsdiluésau 1/5ème
TABLEAU 3 : Résultatssérologiquesobtenusà I'aide de testsimmuno+nzymaûquesvis-à-vis deMycoplasmtt
gallisepticum
iourPI
Jt2
Jl8
J24
139
145
Doulets: test KPL
10N
3D.7N
9D. IN
6P.4D
NF
poulets: test Svanovir
12N
3P.65.9N
10P I S IN
t2P
l8P
canards: test Svanovir
1lN
l P . 3 5 .1 3 N
lP.25.9N
8 P . 3 5 .l N
llP.2s.6N
139
ISOLEMENT ET CARACTERISATIONDE SOUCHESPATHOGENESDE MYCOPLASMA
PALLORUM.
Moalic Pierre-Yresr, Kempf Isabeller,GesbertFabienneret Laigret Frédéric2.
'C}'IEVA-PLOUFRAGAN.
B.P. 53. ZOOPOLE.22+,10PLOUFRAGAN.
U.R. Mlcoplasrnologie-Badériologie.
TINRA.
Laboratoirede biologieôellulaireet moléculaire.33883VILLENAVE D'ORNON Cedex.
Résumé
Deuxsouches
de rn1'coplasme
out étéisoléessur le terraind'embnonsde dindonnqlu\ lnorts.L'étudedes
caractères
bioclrirniques
et sérologiques
a montréquecesisolatsétaientprochesdetrIvatplasmopullorum.un
jusqu'à préseutlirnité à I'espècepouleet ilon pâthogène
m1'coplasme
pour cetteespèce.Afin de mieux
caractériser
cesdeuxsoucheset de situer.lI. pullorumdansla ph1'logénie.
la détenninationet l'anal1'sedes
séquences
Les
desgènesd'ARN l(rS dessonches
du terrainet de la souchede référenceont étéréalisées.
résultatsconfirmentl'appartenance
pullorun. Le porloir pathogène
de cesdeux
desdeuxisolatsà l'espèce-,11
isolatsa étéétudiéaprèsûroculationà l'oeuf embryomré
de poule.
Abstract
Identitication of two pathogenicavian mycoplasmasas strains oTMycoplasmupullorum.
Trvomvcoplasrna
They'werettot
strainsrvereisolatedfrom deadturkel'embryosfreeof otherknou'npathogens.
relatedto !lI. gulliscpticwn.\1. s.vnoviae.
)1. nteleagritû.s
and,ll. iovoe. known to be pathogenicfor turkevs.
Becarrse
biochernicaland serologicalpropertiesshou'edthat thesestrainswere relatedto !l[. pullorurrr.a non
pathogenicavianmvcoplasrna.
rvedecidedto evaluatethe pathogenicpropertiesof thesestrainsand determine
tlrephylogeneticpositionof tll. pulktruzr andthe trvo field isolates
Introduction
Matériel et méthodes
^lIvatplosma ga|Ii,'cpticurn(MG). fI. svnot,iae(MS).
^lI. nrelcagrirli.s (MM) et A[. i<m'ae (MI) sont les
mvcoplasrnes pathogènes majeurs des volailles.
D'autres mvcoplasrnespeu\,€nt également être isolés
à partir des volailles mais ne sont pas considérés
comrnepathogènes(À1.cloacale. )tI. gallinarum- JI
gallopnonis. lI. iners on À1.lipo/itciens..) (Jordan.
1989). Nous avons récernment isolé deux souchesde
mvcoplasmesà partir d'embryons de dinde morts en
l'absenced'autre agentpathogène
Après étude des caractères biochimiques el
sérologiques. ces isolats sernblaient apparentés à
.Ilvcoplanna pullorum. uu mycoplasme noll
pathogène.isolé habituellement à partir de poulet
Pour r,érifrer leur appartenance à l'espèce ,lI.
pullorum et pour élablir la position ph-vlogénétiquede
:\1. pullu'utn uous avons décidé de séquencer les
gènesd'ARNl6S de cesdeui isolats.
Le pouvoir pathogène de trois souches de :\l
pullorun (I souche de référeuce et deux souches
isolées du terrain) a égalernent été étudié sur des
oeufs embr-r'onnésde poule
Les souchesÀ1. anotis 1340r (ATCC 25524).ll
columbinumMMP-l (ATCC 29257).:\[. gullinac:eum
DD (ATCC 33350). lt[. gallinarum PGl6 (ATCC
WRI (ATCC 3355I).]L
19708)-)[. gallopavonls
gallisepticunrATCC 15302. II. glvcophilttttt186
(ATCC 352'77).ltI. iowae695 (ATCC 33552).,\l
pulloruntCKK (ATCC 33553).\1. *ttoviae WW
1853(ATCC 25204)et !r.1.meleagritlis17529(ATCC
25291)ont étéutilisées
La souche91254a étéisoléeà partir de dindoruteaux
de MG. MS.
nrortsissusd'un lot de dindesexemptes
MI et MM La souche95098GCa été isoléed'un
autretroupeauà partir d'embryonsde dindesmorts.
Ces souchesont été isoléesà partir du vitellus des
ernb4onsmis en culturesur milieu FM4 (Freyet al..
l96tt). Chaquesouchea été clonéetrois fois avant
anall'se (Cornité International de S1'stétttatique
1995)
Bactérienne.
Des tests biochirniques(fermentationdu glttcose.
hvdrolvsede l'arginine. sensibilitéà Ia digitonitte.
I)euxièmes Journées de la Rcchcrche Avicole, 8-10 avril 1997
l{l
FIGIIRE I : Arbre phylogénetique du groupe de M. hominis.
M.M
rl?. qgasrrif
M. ofuarlùan
ç. H311O
M.qcb
M.tMffis
lunùgs.
.gabac
M. ilgùtff
M.futfue
M.htËtffi
æuffimt
it.nffi
trdvl
M.pthnan
+
M.ærgt,pd
M.læpûrrrc
îrt. ft,b
M.ffiæ
M.ga&ffizlrrl
M. ryrcv*n
M.geumr
*l.lcryfilrryrgls
M.lb&fantnt
M.q*b
.ffi
M. buSwttûan
1t1.fu
M.cûffint
M. fættultl*æ
M.S@m,
réduction des sels de tétrazolium. activité i'ABLEAU I : Caractères
biochimiquesdessouches
phosphatase.productiou de films et spots et tr[. pullorumATCC.9.1254
et 95098GC.
croissanceen l'absencede NAD et de L-c-vstéine)
et
sérologiques(dot-inununobinding.test d'inhibition
de croissance.
test d'inhibitiondu métabolisme)
ont
été réalisés selon des procéduresprécédernrnent
décrites(Nougare-vde.
1985.Cl1'de.1981i.poumarat
e ta l . .l 9 9 l ) .
Une anplifrcation ena'matique des gènes d'ARN
165de .lI. pull<>rum
CKK. 9+25-ter 95098GCa été
réaliséearec les amorcesde Weisburg(Weisburget
al. l99l). specifiques
desgènesd'ARN 165 de la
plupartdeseubactériesLa réacrionPCR est réalisée
selon des condirionsdéjà décrites(Moalic et al..
leeT).
Après clonagedans Ie vecteurPGEM-T (prornega.
Madison.WI. USA). les produirsarnplifiésonr éré
séquencés
selonla méthodede Laneet al. en utilisant
desarnorcesuniverselles
<fonvard>et <rer.erse>
ainsi
quedesalnorcesuniversellesinternesau gèned'ARN
165(Laueet al . 1985)
Les séquences
obtemresont ensuiteété conrparées
à
celles disponiblesdans les bauquesde donnéesde
biologiemoléculaireGenbanket EMBL en urilisant
les logiciels<Blast>(Altshulet â1. 1990)et <Fasta)
(Wilburet al . 1983).Les séquences
les plusproches
ont cusuiteétéalignéesà l'aide du logiciel<pileup>
(Devererx et al. 198:t). Une séquencede l33l
nucléotideséquivalenteà la séquence
du gèned'ARN
165de iI. pull<truna ainsiétédéterrninée
.\1. pullu.utrt a ensuite été placé dans l'arbre
phr,logénétique
Les étudesde pouvoirpathogèneont été réaliséessur
des oerfs eurbnonuésde poule âgés de 7 jours.
inoculésavec0.1 ml de cultruede m-"-coplasme
dans
le sacr.itellin Pour chacunedes souchestestées.:ll
pullu'am CKK- 9-125+er 95098GC_
rrois dilutions
( 10.103.105uuitéschangeant
couleur(UCC))ont été
inoculées
à 20 oeufs.Lesoeufsollr élémirésjusqu'au
l'errre jour d'incubation. La lnortalité a été
enregistréeTouslesembryonsont étéautopsiéset les
lésionsout éténotéesLe vitellusa étémis en culture
pour recherchede mvcoplaslnes.
Résultats
Les résultatsdesanalvses
biochimiques
sontdonnées
dansie tablearrl.
Les propriétésbiochirniques
des souches9:1254et
9-5098GC
sontidenriques
ii cellesde lI. pullorum et
)1. gollinaceum.
Une réactionpositive a été obtenuepour le test de
dot-immunobindingréalisésur les souches94254et
9-5098GC avec le sénrm anti-ld. pullorum
L'inlribition de la croissancedes souches94254 et
95098GC a été obtenue avec un sérum anti-M.
pullttrunt
Les résultatsdesanalysesphylogénétiques
ont montré
que les séquences
des gènesd'ARN 165 des deux
isolats du terrain et de ,l.l pullorum CKK étaient
identiques.Les séquences
obtenuesont été déposées
dansla banquede donnéesGenbanksousle numéro
d'accession
U58504.
La comparaisonde la séquence
du gèned'ARN 165
de ltI. pulloru,n ayec celles d'autres mycoplasmes
présentesdans les banquesde donnéesa permis la
(Fig I).
réalisationd'un arbrephylogénétique
L'espèce\[. pullorunr appartientau groupe z/e l{
homini.çselonles critèresdéfinispar Weisburget al..
Les étudesdu pouvoir pathogèlteont montré que la
mortalité des oeufs embryonnésnon inoculés ou
inoculésavecdu rnilieu stérileétait inférieureà 15"/o
alors que les embnons inoculés avec les souches
91251.95098GC
et CKK ont montréentre30 et 65.%
de mortalité selon la soucheet la concentrationde
I'inoculum. Les résultatssont présentéssur les
figures
2.3 el1.
FIGURES 2, 3, ! : Eyolution de lâ mortalité
embnonnaireen fouctioude la soucheinoculéeet du
titre de l'inoculum FigrrreI : -'ll pullorum CKK.
Fig 2 : souche9425.1.Fig. 3 : souche9509SGC.
Triangles.l0 UCC/ml. ronds.103UCC/ml. carrés.
l0'ggç7u,1.
reconnusresponsablesde mortalités embryonnaires
commeMI.
Pourtant. selon certains auteurs,!,[. pullonun ne
semblaitpas.jusqu'à présent.une espècehabituelle
de la dindeet sonpoutoir pathogèneparaissaitlimité
@ierk et al.. 1967)(Kleckner, 1960)(Yoder er al.,
r964).
FIGURE 2
Des études complérnentaires devront donc être
engagéesafin de mieux apprécierI'importancedu
pouvoirpathogène
de I,I. pullorum sut l'espècepoule
et l'espècedinded'autantque,sur le terrain.d'autres
souches présentant les mêmes caractères
biochimiques et antigéniques ont récemment été
isolees à partir de divers troupeaux de dindes
reproductricesou d'embryonsde dindonnearl\ morts
(Kempfet al.. 1996).
6)-89
,drN
+È
dlùiilriùl
Référencesbibl iographiques
FIGURE 4
{56
IotF er*
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Conclusion
Cemeénrdedémontredonc clairementl'appartenance
desdeuxsouchesisoléesd'embryonsde dindesmorts
en I'absence d'autre agent pathogèneconnu à
l'espece,]1L
pullu.um
La mortalitédesoeufsembrlonnésde pouleinoculés
avec ces 2 isolats semblesignifrcativemais moins
lmportânte toutefois que d'autres m1'coplasmes
144
MISE AU POINT ET EVALUATIOND'UNE TECHNIQUEPCRPOURLE DEPISTAGEDE
MYCOPLASMAM ELEAGRIDIS.
Moalic Pierre-Yves,GesbertFabienneet Kempf Isabelle.
CNEVA-PLOUFRAGAN.
B.P.53.ZOOPOLE.22-t-10
PLOUFRAGAN.
U.R.Mrcoplasmologie-Brctériologie.
Résumé
.\lv'cnplasmameleagridis(MM) infecte uniquementla dinde et est responsable
d'infectionstranstnisespar
l'oeuf qui entraînentprincipalementdes retardsde croissance.des aérosacculites
et des ostéod1'strophies
Actuellement.le diagnosticdesinfectionsà MM reposeprincipalementsur l'isolementdu germeen cultureou
snr les testssérologiques(Agglutinationrapidesur lame et ELISA). Du fait des diffrcultésinhérentesà la
crtlturedes mvcoplaslnes.
nous avonsenvisagéla mise au poiut d'un test de lnise eu évidencede MM par
amplificationen chaînepar la polvmérase(PollrneraseChain Reaction: PCR) Nous avonscomparéles
résuhatsoblenusà I'aidedes techniquessérologiques
et de détectionde MM par culture ou par PCR lors du
suivi de troupeauxde dindes Les résultatsont montré que la PCR appliquéeau dépistagede MM est uue
techttiquerapide.aussispécifiqueet plus sensibleque la culture.L'utilisationdu contrôleinternedurant
l'aurplifrcatiou
permetde garantirla valeurdu résultat.
Abstract
Derelo;rmentand Evaluation of Poll-meraseChain Reaction for Detection oî Mycoplusmameleagridis
Inl'ectionin Turkeys.
)lvcoplasna mcleagridis(MM) is clmracterized
for its pathogenicitfin cornmercialturkel's As cultureis time
consutningand expensiveand serologvlacks sensitivityand specificitv.a polymerasechain reaction(PCR)
based-test
for MM detectionrvaserraluated
and cornpared.under field conditions.to conventionnalmethods
includingmycoplasma
statusof turke-vflocks.
cultureand serologr'.to checkthe rnycoplasma
Introduction
Matériel et méthodes
La Franceest le premierpayse\portateurmondial
de viande de dinde. Or. les infections à
-\Ivcoplasnu meleogridis (MM) entraînent de
grâ\'esperteséconomiques
pour cetteproductionen
raisondes retardsde croissance
et des saisiesen
abattoirs. L'éradication de ces infections à
transmissionr,erticale nécessilede disposer de
méthodesde dépistagetrès fiables permettantde
contrôlerle statutmycoplasmique
destroupeauxde
reproducteurs.
Du fait de la qualitéinsuffrsantedes
tecluriquessérologiques
actuelleset de la lenteuret
des diffrcultés inhérentes à la culture des
m1'coplasmes.
nous nous sornmesintéressésà la
miseau point d'un testde miseen ér'idencede MM
par amplification en chaîne par la poll'rnérase
(Polvmerase
Chain Reaction= PCR) Les résultats
obteuusavec chacunedes techniquesont ensuite
été cornparéslors du dépistagede l'infection
tnvcoplasurique
dans un troupeâude dindes du
terralll
l. Souches bactériennes et ;rrélèvements du
terrain
I [v,coplonn meleagridi s
Les sorrclres de référence : ATCC n"25294 er
8M92. sont utilisées ainsi que 3 souches"terrain"
isoléesen France '. 1754. JLC et 9460lB.
Autrcs m!,coplasmer^
Les espèceset souchessuivantes sont utilisées : -'ll
svttovioeWW 1853. 86122- K870: ,1^/.iowoe : 3
souches de référeuce et 16 souches terrain: ll
itttitons 4229. lL
gullinarum PG16, II.
colomhinnn MMPI, )1. lipofhcienlRlTl, JI. incrs
glycophilttm 486, -\I
ATCC
15969, lI.
gallopm,onis WRL,,lcholeplasntu laicllqvii PG8,
.1. axonthum 5'713
Pré | èventent.sdu terrain
Une série de prélèr,ements a été réalisée sur tln
troupeau de dindes exempt d'organisntes
pathogènes spécifiés (EOPS) : -[0 écouvillons
trachéaux el -10prises de satrgont été récoltés
Deuxièmes Journécs de lu Rechcrche Avicolc. Tours. ll-10 avril 1997
Deux sériesde prélèr'ements
ont été réaliséesdans
un élevageoù les animarx présentaient
des signes
érocateursd'une infectionà MM La première
sériea été réaliséesur les oiseauxalors âgésde 62
.jourset la secondesur les oiseauxdu rnêmelot
âgés de 85 jours soit eur.iron 3 semainesaprès.
Lors de chaque série. uor$ a\ ons préler'é -t0
oiseauxet sur chacunde ces oiseaux.nous avons
réaliséun écouvillonnagetrâchéâlet une prise de
sâng.
2. Traitementdeséchantillons
2-l Analysessérologiques
Les séruns sont récoltésaprès centrifugationà
2(XX)g pend.rntl5rnu puis sont testésd,unepart
par agglutination rapide sur lanre (ARL). non
diluésou dilnés au l/Sènre.avecun antigèneMM
(Sanofi. France). Seuls les sérumspositifs après
dilution au l/5ème sont corsidérés reellernent
positifs.
D'âutrepârt. lessérunssontlestés:i I'aided,un test
lurumuroenz],nutique ELISA
(Kit
KPL
PToFLOCKRllvcoplasrna nrcleogridis Turkel,s.
LSI. Sarignl'. France)selou les recommandations
du fournisseuret I'interprétation(positif. douteus.
négatif) est réaliseeselon les indicationsfournies
par le fabricant.
4. Conditionsd'amplification
Les amorcesretenues.MM90f et MM469r. sont
choisiesaprèsalignementdesséquences
desgènes
d'ARN ribosomiques165de MM et desprincipaux
mlcoplasmesde volailles(Bo1'leet al.. 1995).
La réacûonde PCRest realiseedansun volumede
50pl coutenant. 3 pl de l1'satcellulaire.dNTP :
0.2urM.amorces: 0.8 pM. tamponenz;-umtique.I
(BoehringerManheim)et
unité de Taq Polymerase
l(XX)Ude contrôleinterne.
Les conditions d'amplificâtion retenues sont :
dénaturation
: l5s à t)SoC.amelage: 20sà 58oC.
extension l5s à 75"C. pendant .t0 crvcles.La
r*rction est acher'éepar un annelagede ,[5s et une
élongationde 5mn.
De I'eaudistillee stérileest utiliseecommetémoin
négatifet de I'ADN purifréde MM ATCC no25294
prép'aréselonRazin et al. (1983). oommetémoin
positif.
Le thermocycleurPerkiu Ehner 9600 est utilisé
pour la réactiond'amplifrcation.
Les ADNs amplifiés sont visrnlises. après
électrophorèse
de l0 pl du mélangePCRsur un gel
d'agaroseà l%o.souslurnièreU.V. aprèscoloration
par le bromured'éthidium(BET).
Résultats
2-2 Préparationdeslysatscellulaires
Dix microlitres du milieu de transport des
écouvillonssont mis en cuhure sur milieu gélose
FM{ (Frey er al.. 1968) à 37"C Les colonies
isolées sont identifiées par leurs caractères
biochimiques
et antigéniques
Desl1'satscellulairessontpréparésà partir de I ml
de culture des soucheslistéesprécédemment
et à
pârtir du milieu de transportdesécouvillonsselon
la méthode de Kellog er al. (1990). Après
centrifugâtion des cultures ou du rnilieu de
trânsportà l(XXX)gpendant20 minutes.le culot esr
reprisdans5tX)pl de tamponde lysecontenantde
la proteinaseK et du NonidetP {0. L'ensernble
est
tnis en incubation I heureà 60 "C. puis 5 mn à
95"C. Les lysats aiusi obteuus sont ensuire
consen'és
à -20oCjusqu'àla PCR
t. Optimisationdesconditionsde PCR
r-l Spécificité.
La specihcitéde la réactionPCRest évalueevis-àvis des souchesde mycoplasmesprecédemment
citees.Seul I'ADN des souchesde MM testéesest
amplifié.
l-2 Sensibilité.
La sensibilitéde la PCR est d'abord ér,aluéesur
ADN purifié: la limite de détectionest atreinte
pour 500fgd'ADN de MM ajoutépar échantillon.
La sensibilitéest ensuite évaluéesur des lysats
cellulairesréaliséssur des dilutions décimales
snccessives
de cultrre de MM. Le seuilde détection
est atteint pour I unité changeantcouleur (UCC)
ajoutéepar échantillon
J. Contrôle interne
Un contrôleinterneesl coustruitde manièreà être
arnplifiéavecle mêurecoupled'arnorcesque celles
utiliséespour MM. Brièr'ement.le produit amplifié
de MM est cloné et sa taille est modifiée par
insertiond'un fragmentd'ADN du phagelarnbda
d'environ500 pairesde basesL'arnplificationdu
mélangematriceplus contrôleiuterneproduitdonc
deuxfragmentsde taille différentes.r.isiblessur gel
(Moalic.nonpublié)
d'agarose
l-3 Contrôle interne (CI)
La sensibilitéet la spécifrcitéde la PCR arec CI
ainsi que la quantitéde CI à ajouterdans chaque
tube ont été ér'aluées.Une diminution de la
sensibilité(environ I Log) sans modification de
specificitéest observéelorsqu'on ajoute environ
1000 copiesde CI par tube. Nous avons décidé
d'aiouter 1000copiesde CI par tubepour la suite
desamplifications.
l116
2. Résultatsobtenus sur les prélèvementsdu
troupeauEOPS
Tous les écouvilloustrachéaurréaliséssur les
oiseauxEOPSsont négatifsen cuhnreet en PCR.
Tous les sérums.testéseu ARL et en ELISA vis-àvis de MM sontnégatifs.
J. Résultatsobtenus sur les prélèrementsdu
trouperu infecté
Trente neuf écouvillors trachéau\ sur 1(l (97'Yo)
soutpositifsen culturelors de la premièresériede
prélèr'enrents.Seulement 32 5'Y" (13/-t0) des
écouvillons sont positifs en culture lors de lil
deuxièmesérie.
Les lvsatsréaliséssur le urilicude transponde ces
écouvillonssont positifs en PCR pur 77.5"/,,et
95'2,d'entre erN respecti\.elnent
pour la prernière
et la deuxièuresériede prélèr'eurents.
L'utilisation
du CI permetde contrôlerl'absenced'inhibiteurs
dans les échantillonsnégatifs: ceux-ci sont donc
considérés
colnlre des<r'rais-uégatifs))
Les agglutinationsrapidessur lalne sont négatives
pour les deuxsériesde prélèr'ernent.
Le testELISA
estpositifà J62elà J85avecrurnombrede positifs
plusimportantà J85(l/-lt):i J(r2et 28/-t0à Jtt5)
La figure 3 représente
l'ér'olutioudespourcentages
d'échautillonspositifs obtenusavec chacunedes
techniqueslors desdeuxsériesde prélèrements
FIGURE 3 : Histogrammelnonlranl l'ér'olutiondu
pourcentagede positifsen fonctioude la rnéthode
rutilisée
au poiut et estajoutédanschaqueéchantillonar,'ant
En absenced'amplificationdu CI.
arnplifrcation.
avant d'être
l'échantillonest dilué au 1/100èrne
réamplifié. Dans notre étude. les échantillous
négatifs en PCR sont de <vrais-négatifs>.
L'esistence d'ecouvillons positifs en culture et
négatifsen PCRpeutêtredue à une perteou à une
lors de la
dégradationde I'ADN par les ttucléases
préparation de l'échantillon. Il setttble donc
nécessaire
d'incorporerdes contrôlesdans chaque
échantillonpour s'assurerde la bome préparation
deslvsalscellulaires.
Pour évaluerla sensibilitéet la specificitédu test
PCR appliqué à des prélèr'ententsréalisés sur
anirnaux du terrain. nous avorls défini comnte
réellernentinfectéun oiscauposilif eu culture. ou
en ARL etlouen ELISA.
Dans un premier tenrps. nous colnparons les
résultatsobtenusen cultrueet en PCR.
Selonnotredéfinition.le nombred'oiseauspositifs
en MM est de 39/40 (97.5%)lors de la première
lors de
et de 3I/40 (77.5o/o)
sériede prélèr,ements
les
la
specificité.
La
Ia deuxième.
sensibilité.
vaieurs prédictivespositives (VPP) et rÉgattves
(VPN) de ia culture et de la PCR ont donc été
dansle tableaul.
calculéesel sontprésentées
TABLEAU I : Sensibilité. specificité. raleur
prédictive positive (VPP) et valeur prédictive
négative(VPN) de la cultureet de la PCR réalisées
sur les écouvillonstracheauxlors de la premièreet
deuxièlnesériesde prélèvemeuts
PCR
CULTURE
Discussion
l. Optimisationrlu testPCR
Les testsde spécifrcitéde la réactionPCR utilisée
vis-à-r'isdes culturesout montréque l'utilisation
des arnorcesMM90f et MM{69r penlrettait la
détectionspécifiquede l.,IM Le seuil de détection
de la PCR. I UCC par échantillon.ar,oisinela
sensibilitéthéoriquede la cuhure.
2. Evaluationde la PCR dans les conditionsdu
terrain
Lorsquela PCR esl utiliséeen diagnostic.il est
nécessaire
réellernent
de distinguerleséchantillons
négatifsde ceuxpouvantêtreinhibés Pourdétecter
les <faux-négatifs)).
r.ulcoutrôleiutemea été uris
lère
2èrne
I ère
sene
sene
serre
Sensibilité(%)
l(x)
12
79.4
100
Spécificité (%)
l(x)
l(x)
100
l(x)
vPP (%,)
l(x)
t(x)
100
100
VPN ('Zo)
l(x)
83
1(X)
La spécificitéde ces deux techniquesappliquées
atteint lfi)7o
lors de chaquesériede prélèr,ements
Les écouvillons trachéaux mis ell culture se
rérèlent positifs à J62 et J85. Cependant.une
diminution du pourcentaged'écouvillonspositifs
lors de la deuxième série de prélèvementsest
alorsquele nombred'écouvillonspositifs
constatée
en PCR ne diffère pas significativemententre les
(Chi 2 =3-7" p : 0.04)
deuxsériesde prélèvements
de la culturepassede l(X)7olors de
Si la sensibilité
à 12"1'lors de la
la prernièresériede prélèvernents
t47
deuxième.la sensibilitéde la PCRaugrneutede 80
à 100%. De nombreux facteurs peuvent gêner
l'isolement des mvcoplasmes : prélèr'ernents
consenés dans de mauraises conditiors.
contaminationpar d'autres bactéries.traitement
antibiotiquerécent des animaux..(Romeroet al..
1995) La diminution du nombre de cultures
positireslors de la deuxièrnesériede prélèr'ernents
peutêtredue au traitelnentantibiotiqueadurinistré
aux anirnauxentreles derx sériesde prélèr'erneuts
ou ri d'autres facteurs (présenced'anticorps.
d'autresbactéries...)
différantentreles deuxséries
de prélèvernents
et susceptibles
d'exercerun effet
negatifsur I'aptitudedesrnl.coplasrnes
ii être isolés
en cultrre.
Certains inhibiteurs de la PCR (mucus.
hérnoglobine.phénol. SDS...) peuvent entraluer
des résultats fausselnent négatifs après
antplification(Roux. 1995.Ursi et al.- 199-t).Nos
résultalsmoutrent que le traiternentantibiotique
adrninistréaux oiseauxn'influencepas le nombre
d'échantillonspositifs en PCR et les résultats
obtenusii J85 montrentla graudesensibilitéde la
méthodePCR.
La VPPcalculéepour les deu\ testsatteint l()0%'et
indique qu'un résultat positif correspondà un
oiseauinfecté.La VPN de la culture.calculéelors
de la prernièresérie de prélèvenrents
est égale à
l(X)Yoalors qu'elle n'est que de 70%ôlors de la
deuxièuresériemontrantainsi l'incertitudeexistant
sur url résultatnégatif.La VPN de la PCR atteint
l(n% à J62 et J85. ce qui signifiequ'un résultat
négatif en PCR correspondavec certitude à un
oiseaunon irfecté.
Ire dépistagesérologiquede MM par ARL ne nous
a pas permis de mettre en évidencede sénlnr
positifs Ce résultat est sans doute du à des
problèmesde sensibilitéde cetteméthodepouvant
êtreliés à la qualitéde certainslots d'antigènesou
à desproblèmesde consen'ationdessérums
lorsqu'elle esl appliquée sur les écouvillons
provenantdu terrain Si les culturesdoivent être
gardéesau moins 3 semaines
pour s'assurerd'un
résultatnégatif.la PCR donneun résultatnégatif
ou positifen quelquesheures.
L'avantage
de la PCRsurI'ELISA estla possibilité
de rnettreen él'idenceMM dès le premierjour de
l'infection.
La déceutralisationde cette techniquer,ers les
laboratoiresde diagnostic sera rendue possible
après automatisationde certaines étapes du
protocolede traitementdes échantillonset de
rér'élationdesproduitsauplifiés.
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Microbiol
Les résultatsque nous alons obtenusen ELISA
lnonlrent une très nette augmentationdu nourbre
de sérurnspositifs lors de la deuxièmesérie de
prélèr'enrents
(l sénrmpositif lors de la première
série et 17 sérumspositifs lors de la deuxième
série). soit environ ,+ à 5 semaines après
I'apparition des premiers q'mptômes Cette
méthode permet donc de mettre en ér'idence
I'apparition d'anticorps. rnais de manière assez
tardir,e.
Conclusion
En conclusiou. la PCR pour le dépistage de
.\Ivcoplosna meleap'idis est une techniqueaussi
spécifique que la cuhure rnais plus sensible
148
EVALUATION DE L'EFFICACITE DE LA TILMICOSINE POUR LA PREVENTION DE
L'INFECTION A MYCOPLASMAGALLISEPTICUM CHEZ LE POULET
Reeve.IohnsonLloydl, Kempf Isabelle2,GesbertFabienne2et Guittet Michèle2
lElanco Animal ScienceResearch.Kingsclere Road.Basingstoke.Hampshire,RG2l 6XA United Kingdom
_
2CXeVe- Ploufragan,Unité de MycoplÀmologie - Baaériol6gie.ZoopoleLes croix. BP 53, 2244}Ploufragn
Résumé
L'efftcacité de la tilmicosine pour la prévention d'une m,vcoplasmoseexpérimentale à Mycoplanna
gallisepticum(MG) a été évalueechezle poulet exemptd'organismespathogènesspecifiés.Les oiseauxont été
inoculésà dixjours d'âge(Jl0) et la tilmicosinea étéoffertedansI'eau deboissonaux dosesde 50, 100.200 ou
30OmgÂitre
de J8 à Jl3. Les critèresd'efficacitéétaientles symptômes.les lésionsùI2L,la croissanceet le
nombre d'oiseaux positifs en culture et en sérologie à J2l. Les résultats ont montré que la tilmicosine a
significativementréduit les pertes de poids et les slmptômes respiratoiresdus à l'infection. Une réduction
significative des lésions des sacsaérienset des peritonitesa été obtenueavec les trois dosesles plus élevees.
Une diminution significative du nombrede pouletsporteursde MG est observeedès la dosede 5Omgflet avec
positif à J21 alors que 46 des 58
les dosesde 200 ou 300 mg/I, aucunoiseaun'est trouvé sérologiquement
oiseauxinfectésnon trartéspossèdentdesanticorpsspecifiquesde MG à cettedate.
Abstract
Eflicacy of Tilmicosin in the control of experimenttl Mycoplasmagallisepticuneinfection in chickens
This study was conducted to waluate the efficacy of five day 'ln water " tilmicosin medication for the
preventionof experimentalMycoplasmagallisepticrurz(MG) diseasein specific pathogenfree chickens.Birds
were inoculatedat ten daysof age and were given 50. 100. 200 or 300mg4itre of tilmicosin from day 8 to day
13. The resultsshowedthat tilmicosin medicationat dose levels of 50 to 300mg/l significantly decreased
growth lossesand respiratorysymptomsdue to MG infection. Significant reduction in air sac and peritonitts
lesionswere obtainedby treatmentwith 100, 200 or 300mg/l for five days. A significant reductionin the
proportionof MG culturallypositivebirds wasobtainedat a doselevel of 50mg/1.Increasingthe doseresulted
in a further decreasein the numberof MG sheddingchickensto the extent that with the two highestdosesof
tlmicosin, no bird wasserologicallypositiveon day 2 I comparedto 46158positiveinfectednon treatedbirds.
Introduction
L'infection à Iv[ycoplastnagallisepticzrr (MG) est
responsable
de lourdesperteséconomiquesdansles
élevages de poulets de chair, en raison des
mortalités, retards de croissance et sarsies à
I'abattoir.Cetteétudevise à erraluerI'efficacitéde
la ûlmicosine,un antibiotiquede la famille des
macrolides(Charlestonand Reeve-Johnson.
1996;
Kirst et al, 1989),pour le contrôled'une infection
expérimentale à MG chez le poulet exempt
pathogènes
specifiés(EOPS).
d'organismes
Matériel et méthodes
Trois cent soixante poulets EOPS sont répartis à
l'âge de six jours en six groupes de soixante
oiseauxselon un histogrammede poids. Ils sont
maintenus en cages dans des animalenes
protégées.
A dix jows d'âge (JlO), les pouletsdeslots infecté
non rraité(INT), et infectéstraités(ITl à IT4) sont
inoculéspar voie intra-trachéale(0,2m1)et dansle
sinus(0.05m1)à l'ai$e d'une culture de la souche
MG R-P10titrant l0' unitéschangeantcouleur.Le
groupe témoin non infecté non traité (NINT) est
inoculéavecdu milieu stérile(Kempfet al , 1988).
De J8 à J13,les oiseauxdeslots ITl, IT2, IT3 et
IT4 reçoivent de la tilmicosine dans I'eau de
boissonaux dosesrespectivesde 50, 100, 200 ou
3O0mg/litred'eau.
A Jl3, Jl6 et J20,les symptômesrespiratoiressont
observéset notés de 0 à 3 en fonction de leur
intensité et un indice moyen est calculé par lot et
parjour d'observation.Les oiseauxsont sacrifiésà
J2l et les lésionsdes sacsaérienset du péntoine
sontnotéesde 0 à 4 en fonctionde leur sévéritéet
de leur étendue et des cultures de mycoplasmes
sontréaliséesà partir destrachées.De J8 à Jl3, la
ou non de
consommationd'eau médicamenteuse
Deuxièmes fournées de la Recherche Avicole, Tours, 8-10 avrtI 1997
chaquelot est enregistrée.Les oiseauxsont pesés
individuellement
à J6. JI3 et J20 et les gains de
poids de chaquelot sont comparés.La recherche
d'anticorps specifiquesde MG est effectuéepar
agglutination rapide sur lame sur les sérums
prélevésà J2l.
Pour les cultures de mycoplasmes.un segment
d'environ un centimètrede long est prélevé au
niveau du tiers inférieur des trachéesde tous les
oiseaux morts ou sacrifiés. est mis dans un
millilitre de milieu de transportpuis ensemecé
sur
mulieuFM4 (Frey'etal. 1968). Les culturcssont
incubéesà 37'C et des passagessont effectuésà
partir des milieux liquides lors de changementde
couleurdu milieu ou. en l'absencede changement
de couleur. après huit jours d'incubation.
L'identification des colonies est realisee par
détermination des caractères biochimiques
(Nougarayde
et al. 1985).
La comparaisonde I'effrcacitédes traitementsest
basée sur des différences statistiquement
significativesentrela mortalité,les symptômes.
les
gainsde poids,les lésions.le réisolementde MG et
la réponsesérologique.L'analysede rariance est
utilisee pour comparer les gains de poids. La
mortalité.les symptômes,les lésions,les nombres
de sujets porteurs de MG ou ayant des anticorps
anti-MG sontcomparéspar le testde Chideux.
Résultats
Mortalité . les nombresde pouletsmorts dans les
lots NINT, INT et ITI à IT4 sont respectivement
0, 2. 0- 0. 0 et 3 et ne diffèrentpasstatistiquement.
Symptômes: aucun signe clinique n'est observé
dans le groupe NINT. Dans le groupe INT, les
premierssignesrespiratoires
consistanten dyspnée
et éternuements, apparaissent à Jl6. Ces
persistentdansce groupejusqu'à la fin
s-vmptômes
de I'essai,mais ne sontque très rarementobservés
dansles lots infectéstraités.
Les indices cliniques moyensdes différents lots
sontdonnésdansle tableaul. L'analysestatistique
montre des différences significatives entre les
groupesNINT et tous les groupesinfectésà Jl3,
J16et J20.Lessymptômes
desoiseauxinfectésnon
plus sévèresque ceux
traitéssontsignificativement
desoiseauxtraitésà Jl3, Jl6 et J20,mis à part le
lot ITI à Jl3. A toutesles dates.aucunedifférence
significative n'est mise en &idence entre les
symptômesdu groupeITI et ceux des groupesIT2
et IT3. maisles symptômes
du groupeIT4 difÏèrent
significativementde ceux du groupe ITI : les
pouletsde ce dernierlot ont moinsde symptômesà
Jl3, maisparaissentplus affectésà J16 et J20. Les
symptômesdes lots IT2 et IT3 ne diffèrent pas
statistiquement.
Lésions: les indiceslésionnelsmoyenssontdonnés
dans le tableauI. L'analysestatistiquerévèleque
les aérosacculitesdes oiseaux infectés non traités
ne diffèrent pas de celles des oiseaux du groupe
ITl, de mêmeque cellesdu groupeIT2 comparees
au groupe IT3 et celles du groupe IT3 comparées
au groupeIT4. Les trcis dosesles plus éleveesde
tilmicosine réduisentsignificativementles lésions
des sacsaérienspar rapport au:i pouletsinfectés
non traités.De plus.les lésionsdessacsaériensdes
oiseaux ayant reçu 300mg/l de tilmicosine sont
significativementmoins importantesque celles des
pouletsdesgroupesITI et IT2.
Les lésions de peritonite sont significativement
réduites par les différents traitements.Le groupe
présente des lésions de peritonite
ITI
significativement plus gmves que les autres
groupestraités.
Consommationd'eau : les consommationsd'eau
des groupesNINT, INT et ITI à IT2 de JE à J13
15,2,11,7,12,5.12,1.ll,6 et
sontrespectivement
10,8 litres. Si I'on considèreque les poulets
présententune croissancelinéaireentre J6 et Jl3,
les dosesde tilmicosine reçuespar les poulets des
groupesITI à IT4 sontrespectivement
: 23, 42, 8l
et 114mg/kg.
Gains de poids : les gains de poids moyens de
chaque groupe sont donnés dans le tableau 2.
L'analysestatistiquemontre que, de J6 à Jl3, le
groupe INT présenteune meilleure croissanceque
les autres groupes. De J13 à JzO, après le
traitement, le gain de poids des poulets non
infectés est significativement plus important que
celui des autresgroupeset tous les groupestraités
ont une meilleure croissance que les oiseaux
infectés non traités. Sur la duree totale de l'essai
(J6 à J20), le garn de poids moyen des oiseaux
infectés non traités est significativement moins
élwé que celui desoiseauxnon infectésou infectés
non traités.
Réisolementde Mycoplasmagalliseptictlrt .' tous
les pouletsinfectésnon traités sont porteursde MG
à J2L. Pour les groupestraités ITI à IT4, les
nombresd'oiseauxpositifs sont respectivement40,
19, I et 0 (tableau3). L'analysestatistiquemontre
que les nombresd'oiseaux positifs en culture des
groupestraités sont différents de celui du groupe
infecté non traité. Les groupes IT3 et IT4 ne
diftrent pas significativement du groupe non
infecté.
Sérologie : les nombres d'oiseaui possedantdes
anticorpsspecifiquesde MG à J2l sont 0, 46.24.
4, 0 et 0/60 pour les groupesNINT, INT et ITI à
IT4 respectivement (tableau 3). L'analyse
statistique rwèle que les nombres de poulets
séropositifsdes groupes IT2. IT3 et IT4 ne
diftrent pas significativcmentdu groupe non
infecté
Discussion
Le modèleexpérimental: desoiseauxde di.xjours
sontinoculéspar voie intra-trachéale
et intranasale
avecune culturede la soucheMG R-P10.Six jours
après infection, les poulets présentent des
symptômesrespiratoiresdont I'intensité augmente
jusqu'à la dernièreobsen'ationà J20 Le gain de
poidsdesoiseauxest diminuécomparéà celui des
sujetstémoinsnou inoculés.Des lésionsdes sacs
aérienssontobsen'éssur prèsde 70%odesoiseaux
et à J2l. onze jours après inocultion. tous les
pouletssontporteursde MG.
Références
XX
Charleston,B. and L. Reeve-Johnson.l996.
World Poultry Congress.September1996, NewDehli,Inde.
Frey. M. C.. Hanson.R. P. and D.O. Anderson.
1968,Am. J. Vet.Res.29.2164-217L
Kempf. I., Cacou.P.M.. Guiftet,M., OllMer. C.,
Morin. M., L'Hospitalier,R., and G. Bennejean.,
1988.AvianPathologyl7: 601616.
Kirst. H A.. Willard. M.. Toth. J.E., Truedell.
B.A.. Leeds. J.P. OtL J.L.. Felty-Duckwotth.
A.M.. Coubter.FT. Ose. E.E. Crouse,GD..
Tustin. J.M.. and S. Omura., 1989. Journal of
Antibiotics42: 16'13-1684
Nougayrede.P.. Gaillard-Penin. G. and B.
Andral..1985. Le PointVét. l'7 : 127-140.
Comparaison des traitements. la tilmicosrne
donnéeaux oiseauxaux dosesde 50. 100. 200 ou
30Omg/litred'eau de boissonpendanttrois jours.
deux avant et trois après inoculaûon.permet de
réduire de façon significativeet identiquequelle
que soit la dose.le retardde croissanceprovoquee
par I'infection. Les indices symptomatiques
moyenssont égalementdiminués par rapport au
groupetémoininfecténon traité. Avec les dosesde
I00. 200 ou 300 mg/litre. les lésions
et de péritonitesont moinssévères.
d'aérosacculite
La dose la plus élevée perrnet de réduire
significativementles lésionsdes sacsaérienspar
rapportaux deux dosesinférieuresUne réduction
du nombre de suiets porteursde MG à JZl et
possédantdes anticorps spécifiquesde MG est
obtenueavecla dosede 50mg/l . Avec la dosela
plus elerée (300mgÂ),aucun poulet n'est trouvé
porteur de MG à J2l Pour les dosesde 200 ou
300mg/1.aucun oiseau ne possèded'anticorps
spécifiques
de MG à J2l
Conclusion
Dans les conditionsde cette e$érimentation. la
tilmicosine administréeà la dose de 50mg/litre
d'eau de boissonpendantcinq jours parait moins
efificaceque les trois autresdoses: les lésionsdes
sacsaérienssont encoreimportanteset deux tiers
dessujetsrestentporteursde MG onzejours après
inoculation.Avec les dosesde 100 ou 200 ou 300
mg/I. les signes cliniques et les lésions sont
signihcativementréduits.Les deux dosesles plus
élevées semblent permettre de contrôler cette
infection expérimentale comme le suggère
I'importanteréduction.voire I'absenced'animaux
présentantdesanticorpsà J21.
t5l
TABLEAU 1 : indicescliniqueset lésionnelsmoyens
groupe
NINT
INT
ITI
TT2
IT3
TT.1
symptômes*
Jl3
0"
0.5"
0,39""
0.30"o
0.23*
0.15"
symptômes
Jl6
symptômes
120
00
00
1.05
0.47'
0.47"
0.50"
0,65'
1.85"
0.30'
0.33
0-39"
0.47'
peritonite
lésion**
rt rl.
d'aérosacculite
00
0.00'
1.63"
1.29"
1.55"
0,62"
0.52'
0-27-"
0.23*
0.05*
0.15
0.07-
*notésde0à3
**notéesde0à4
A l'intérieur d'une mêmecolonne,lesvaleurssuiviesd'une mêmelettrene sontpassignificativement
différenæs(p>0,05)
TABLEAU 2 : gainsde poids
groupe
NINT
INT
ITI
tT2
IT3
IT4
J6-Jl3
59.7"
64,E"
57.2
57.9"
57.6"
56,0"
Jr3-J20
92.4
66.1
85.75'
88.4
86,3
87.4'
I6-120
152.I
130.9"
142-9"
l,+6.3'
143.9'
t43.2'
A I'intérieur d'une mêmecolonne,les valeurssuiviesd'une mêmelettre ne sont passignificativement
différentes(p>0.05)
TABLEAU 3 : réisolementde Mycoplasmagallisepticum àpartir destracheeset sérologie
qrouDe
NI
culture*
orcoa
AIII *'r
orcoa
INT
60/60b
46/58b
rrl
n2
40/(/JC
24tûc
:-f,rcOd
4rcOa
IT3
trc}a
orc}a
0rc04
IT4
oÆ74
A l'intérieur d'une mêmecolonne,les valeurszuiviesd'une mêmelettre ne sont passignificativement
différentes(p>0,05)
* nombred'oiseauxpositifs en culture/nombred'oiseauxtestés
**nombre de sérumspositifV nombrede serumstestés
t52
ABRETIVEMENT DES VOLAILLES LORS DE PATHOLOGIE RESPIRATOIRE :
CONSEQUENCESPRATIQUESPOUR L'ANTIBIOTHERAPIE DANS L'EAU DE BOISSON
MogenetLaurent, Karembe Hamadi
SanofiSantéNutrition Animale.La BallastièreBP 126- 33501LIBOLJRNECedex
Résumé
La consommation
d'eaude dindeset pouletsatteintsde colibacilloserespiratoireestétudiéepar l'obsen'ationdu
desanimaux,ou I'emploid'un colorantdansl'eaude boisson.Tousles sujets- horsles mourants
comportement
- s'abreuvent
en l'espacede 3 heuresdansles cas les plus favorables,et en 6 à 8 heurespour desniveauxde
morbiditéélevéset des conditionsd'élevagemoins favorables.Afin d'apprécierobjectivementle rythme de
consommationd'eaudes lots malades,une adaptationde la méthodedu colorant marqueurest proposéeEnfin
certainseffetssur l'abreuvementde la température.de la luminosité, ou de I'ajout de selsdans I'eaude boisson
sontprecisés.
Introduction
En pathologieaviaire. la consommationd'eauest
un facteur déterminant dans le choix d'une
stratégiede traitement,et tout particulièrement:
- de la voie d'administration: si l'abreuvement
est
insuffrsant,un traitement par voie injectable peut
êtreindiqué(Leoratet al., 1995).
- du rythme d'administraton, notammentpour les
bactéricides
concentrationantibiotiques
dépendants,commepar exemplela fluméquine ou
l'amoxicilline vis-à-vis d'Escherichia coli. Leur
administraûon journalière sur 3 heures, plus
efficacequ'enmodecontinu (Bezille et al.. 1996).
se heurte cependantà la sous-consommationdes
zujetslesplus atteints.
Peu d'auteurs ont étudié l'incidence du niveau
d'abreuvementsur I'effrcacitéde l'antibiothérapie
orale. Sur des modèlesde colibacillose,Kempf et
et Bezilleet al., 1996,ont rapportéque
a1.,1995,
l'état moribond des oiseauxinoculésest une cause
possibled'échecau traitement.tendantà montrer
I'intérêt d'une forte dose apportée dans les
premièresheures.Cependantles fortes posologies
peuvent aussi être inappétentes,aggravant la
déshydratation.
Récemment,le rythme d'abreuvementa surtout été
étudiéà des fins vaccinales(Grieve et al. 1992)
Dansde bonnesconditionson obtientcouramment
100% de sujets vaccinés en 3 heures ; mais
s'agissantde sujetssains préalablementassoiffés.
ces donnéesne sont qu'indicativespour des lots
malades.
Cette énrdea été réaliséedans le but de mieux
d'eauet
cernerles relationsentrela consommation
au clinicien, en particulier
les critèresaccessibles
le niveaude morbiditédesanimaux.
De plus, l'incidence de facteurs conmrs pour
modifier la consommaton d'eau a été quantifiée :
luminosité,température.
ou ajoutde selsdansI'eau
de boisson.
1. Matériels et méthodes
1.1.Relationsentre morbidité et abreuvement
- Cadre d'étude:
* Essaiscontrôlés1S"" de Pathologredu Bétail.
ENV Lyon) : deux groupesde 25 poulets âgésde
2l jours ont étéinoculéspar une souchepathogène
d'E.coli, l'un par voie aérosol, I'autre par voie
intramusculaire.et comparésà un groupe témoin
non inoculé.
* Observationsen élevage: elles ont été réalisées
sur 4 lots de dindes atteintes de colibacillose
resprratorre.
deslots de dindes
TABLEAU 1 : Caractéristiques
inclusdansl'étude
Lot 4
Lot 3
Lot2
Lot I
8300
7915
9364
8364
Nombre
5',7i
41i
60i
s2i
Age
7.2
7l
7.1
Nombre M 8 . 5
F 79 82 8.9 7.8 100 8.2 100 83
lmz
l:,
85
65
Nombre M I '
/plasson F 92 80 82 72 100 83 92 80
2
I
4
8
Lisneseau
gravité
eravité
Pression
eravité DOInDE
24h| 24 24h/ 24
Eclairement 2 4 h / 2 4 2 h / 4
Ventilation statroue dyrnm. statique stâtloue
2T"C
29"c
20"c
Toambiante 24"C
- Méthodologie:
* Chaquegroupe de poulets a été observéchaque
matin, durant6 jours consécutifs.
153
Deuxièmes Journées de la Recherche Avicole, Tours, 8-10 avril 1997
* Les lots de dindesont étésuivissur unejournée:
après estimation de la morbidité, un colorant
alimentairea étéajoutédansI'eau.Le pourcentage
de sujetscolorés(langue.caroncules)a été suivi
sur 5 heurespar échantillonnage
de 30 sujetspar
heureen différentspointsdu bâtrrnent.
sans symptôme respiratoire. L'abreuvement est
fortement perturbé : 50 o des sujets s'abreuvent
par heure,et le volume d'eauconsomméest réduit
de moitié par rapport au témoin. Les investigateurs
remarquentpar contre que ces poulets s'abreuvent
plus longuementqueceuxdesautresgroupes.
- Critèresde jugement:
* La morbiditéprenden comptele pourcentage
de
suletsprostrés(sujetsabanus.se déplaçantou non
à la sollicitation) et le pourcentagede sujets
présentantdessignesrespiratoires
(gonllementdes
sinus.toux).
* La fréquenced'abreuvemenl
cst le pourcentage
de sujetss'étantabreuvés
par intervallede temps.
- Observationssur dindes(tableau3, figure l) :
* Les lots I et 2 0nt une mortalité et un niveau de
prostration faibles : seul le lot 2 présentedes
symptômesrespiratoires(SR). Les animaux sont
vifs
et la consommation d'eau est normale. La
fr{uence d'abreuvementdu lot 2 est légérement
inférieure au lot l, mais tous deux atteignent au
moins 95 7o de sujetsmarquésdans un délai de
2h30.
* Les lots 3 et 4 sont sévèrementtouchés : la
prostration et la mortalité sont élevees,auxquels
s'ajoutent les symptômesrespiratoires. Après 5
heuresde suivi le pourcentagede sujets marqués
par le colorantest de 90 % (ot 3) et 80 oÂ(lot 4\.
La fréquence horaire d'abreuvement est très
inférieure aux lots précedents.et on remarqueun
ecart plus important entre mâles (M) et femelles
(F).
1.2. Essais de stimulants de la consommation
d'eau
- Cadre d'étude : les essaisont été réalisésà la
Station Avicole du CNEVA Ploufragan. sur des
lots de 24fi) pouletssains.âgésde 2l à 28jours.
- Méthodologie: lesessaiscomparent50lux v.çl0
lu,r (21jours). 23"C vs zl"C (24jours),ou une eau
additionneede sels à 5gll vs une eau claire (28
jours).
- Les critères de jugement sont la consommation
d'eau,et la fréquenced'abreuvement
estimeepar le
pourcentagede zujetscolorés(sur échantillonde
100) jusqu'à 5 heures après le début de la
stimulation.
2. Résultats
2.1. Relationsentre morbidité et abreuvement
- Obsen'ationssur poulets(tableau2) :
* Le groupe inoculé par voie locale (aérosol)
présente une pathologie benigne avec faible
prostration (premier jour) et symptômes
respiratoires.Le volume et la frequence de
consommationd'eau sont identiquesau témoin.
Chaquejour 100% dessujetss'abreuvent
au moins
une fois par heure.avecune moyennede 2 fois par
heurepour chaquesujet.
* Le groupeinoculé par voie généraledéveloppe
une colisepticemie.caractériséepar une forte
prostration,
TABLEAU 2 : Observationssur poulets(à 6 j
post-inoculation)
Inoculés
Témoin
Aérosol I.M.
Morraliré
lVo
32q% O o/n
(l o/o
Suietsorostrés
o%
95 0Â
Suietsà s. respiratoires 40 Vo
0Yo
00Â
Eau (ml / suiet/ iour)
280
140
280
Suietsabreuvés/ heure 100%
50 o/o 100%
TABLEAU 3 : Observationssur dindonneaux
Lot I I.at2 Lot 3 Lot 4
5
)
Nombre
M
52
t2
F
7
J
de morts
I
3
<l
<l
%zujets M
)
l0
<l
<l
orostrés F
l0
25
<5
50
50
60
%zujets M
<5
F
50
àSR
35
l0
70
7osujets
M
E5
60
50
90
75
abreuvés/h F
50
40
FIGURE I : Pourcentagede dindes colorees
(moyennedesmiâleset desfemelles)en fonction du
en minutes
lfi) -190 +I
80
ï
70 1
û
50
4{)
30 I
I
+
+
*
I
n
l0
1
lot2
Lot 3
1
I.ot4
I
l
0
60
t20
180
240
300
360
t54
2.2. Essais de stimulants de la consommation
d'eau
- Volume de consommation d'eau : les trois
paramètrestestésaugmententcette consommation.
La stimulation est forte et durableavec la solution
saline (tableau 6) ; la luminosité a des résultats
moins prononces(tableau4), et la températuredes
effetsimmédiatsmais transitoires(tableau5).
- Fréquence d'abreuvement : aucun des
paramètresétudiésn'augmentesignificativementle
pourcentage de sujets colorés, sinon de façon
passagère.Les valeurs assezfaibles à 21 jours
s'expliquentpar la difficulté de lecture : le volume
d'eaupar prise étant d'autantplus faible que les
sujets sont jeunes, les faux négatifs sont plus
nombreux.
TABLEAU 4 : Lumrnositéet consommaûon
d'eau
(poulet
Eau (cumul mVsuiet)
Suietscoloréso/o
l0lux 50lux
Ecart
l 0 l u x 50lux
6.7
6.7
lh
0
45
64'
+ 1 3 . ) Â 83
2h
tt.7
t3.2
95'
gg"
+ 8o/o
5h
31.9
34.4
9l
mêrne lettre en
non diffèrentes au seuil de 5%
TABLEAU 5 : Température et consommaton
24
d'eau
Eau (cumul mUsuiet)
Suietscolorés7o
2l"c
23"c
Ecart
2L"C
23"C
98
I 1 . 5 + I7 o/o
lh
96
94
gg"
+9oA
20.9
22.1
2h
95"
+ l%"
472
5h
46.8
même lethe en exposant : valeurs non diffèrentes au seuil de 5olo
TABLEAU 6 : Solution saline et consommation
28
d'eau
Eau (cumul mVsuiet)
Suietscolorés7o
Eau
Sels
Ecart
Eau
Sels
10.4
10"4
76
lh
0
84
))\
+ 12%io 8 l
25.1
2h
81
gg"
+ l4yo
78.8
90.0
5h
97'
même leiire m ehôsânt
exposant : valerrn
non di{Ërmtes
au seuil de
3. Discussion
3.1. Relationsentre morbidité et abreuvement
- Vatidité et intérêt de la méthodedu colorant :
On peut penserque le taux de dindesmarquéesest
sous-estimédans les lots 3 et 4. En effet la
frQuence des relevésrend nécessairele comptage
d'un nombrelimite d'animaux à chaquepoint, d'oir
une estimation peu precise ; de plus les relevés
répetésont peut+tre nui à l'abreuvement(surtout
zur le lot 3 zubissantun stressthermique).
Ajoutons que, même sur des lots sains,une faible
proportion de zujets non colorés persistetoujours
(usqu'à 5 %odela population).
Malgré les réservescideszus (sensibilité,stress)la
méthode du colorant reste fiable, tant que
I'echantillonnageest aléatoire (représentativitédu
lot) et que la même méthodeest appliquéepar le
mêmelecteur(comparabilitédeslots).
On peut conseiller au plus deux dénombrements:
sur I heure avant début du traitement (estimé a
priori de la fréquencehoraire d'abreuvement)et à 6
heures après début du traitement (contrôle a
postériori de la qualité de la distribution).
- Importance desconditionsd'élevage:
Rappelonsles conditions matérielles d'une bonne
antibiothérapiedansI'eaude boisson:
* Distribution fiable : bac et canalisatonspropres,
plassonsnon bouchés,pressionsufrsante.
* Accèsfacile à I'eau : plassonsnombreux(1 pour
70-80dindes),bien éclairés,en positon basse.
* Ambianceconfortable: températurecorecte (+2
à 3oC),litière de bonnequalité.
Le tableau I souligne plusieurshandicapsdes lots
3 et 4 par rapportaux lots I et2 :
* des lignes d'eau moins nombreuses,d'où une
supérieure.
distancemoyenneoiseau-plasson
* des bacs à gravité, responsables d'une
distribution retardée(usqu'à 2 heuresà I'extrémité
du bâtment), et hétérogène (par désamorçage,
poche d'air, consommation différente entre
parquets).
* enfin pour le lot 3, une températureambiante
élevéequi a aggravél'état de fatigue des animaux
et qui s'ajoute à une densité par plasson assez
élevee.
- Un facteur clé : le pourcentage de sujets
prostrés
Par leur faible consommationles sujets les plus
malades sont le facteur limitant des traitements
oraux. Il faut donc les dénombreret connaîtreleur
rythme de consommation. Ce suivi est difficile
dans un lot d'élevage, notamment parce qu'il
modifie le comportement.Ainsi des informatons
précieuses sont tirees du test d'inoculation :
provoqrxmt une pathologie homogène,il permet
I'observationdu comportementde peûts effectifs
placésdansle mêmeenvironnement.
De cesétudessur dindeset poulets,il apparaîtque
* L'affecûon des voies respiratoires suÉrieures
fatigue les animaux mais n'empêche pas les
déplacements(sauf cécité par conjonctivite) : les
sur I'abrewementsont donc limitees.
consequences
* La prostration est la principale composantede
morbidité inlluençant I'abrewement car elle
exprime la capacité des sujets à se rendre aux
points d'eau. L'observaton d'un lot en semiobscurité pennet de reconnaître aisement 3
155
catégoriesd'individus : des sujetsvifs, des sujetsà
la locomotion lente mais possible,et des sujets ne
se déplaçantpas du tout, dont I'autopsieconfirme
l'absence totale de colorant. Sans traitement
injectable, ces sujets sont perdus : un calcul
économique permet donc de savoir si la voie
injectableestjustifi ée.
- Quel rythne de traitement dans I'eau de
boisson
L'approcheinjectableétant - cas général - écartée,
encorefaut-il savoir sousquel délai tous les sujets
auront consommé un traitement dans I'eau de
boisson.
Un calcul simple peut aider à répondre : si 4O oÂ
des sujetsboivent par heure (cas du lot 4), 40 %o
des60 %orestantsboiront dans I'heure qui suit soit
0,4x0,6 = 24 oÂ.Ainsi 40+24 = 64 %odes sujets
auront bu au terme des 2 heures Le tableau 7
donne les résultats pour différentes fréquences
horaires : bien que théoriques, ces valeurs
modélisentassezbien les résultatsdeslots I à 4.
TABLEAU 7 : Calcul approché du rythme de
consofiunatron
7ode sujets
% de sujets
abreuvés/ heure abreuvéspour différentsdélais
2h
4h
6h
8h l0h
80
96
t00 100 100 100
60
84
97
100 100 100
40
64
87
95
98
99
3.2. Essais de stimulants de la consommation
d'eau
Les trois stimulaûons étudiées augmentent le
volume d'eau consommé, non la fréquence
d'abreuvernent(mais pour ce critère la méthodedu
colorant est peu sensible).Deux techniques,faciles
à mettre en oeuvre, paraissent particulièrement
intéressantes
pour destraitementscourts :
* l'augmentation de la températurede consigne,
aux effets peu durables mais immédiats , elle est
sowent souhaitable aussi pour le confort des
amrnaux* I'augmentaûonde la luminosité, aux effets moins
precocesmais prolongéssur 5 heures.
Par rapport à une stimulation mecaniqueparfois
utilisee qui consisteà marcher dans le bâtment,
elles oftent I'avantagede solliciter naturellement
les animauxet d'eviter tout stressinutile.
Pour destmitementsde plus longue durée (12 à 24
heures par jour) et particulièrement s'ils sont
inappétents, l'emploi d'une soluton saline est
envisageable,solts réserve de stabilité avec le
médicament; I'influence sur sa pharmacocinétque
dewa égalementêtre prise en compte.
Conclusion
Cette étude présente deux niveaux d'applicâtron
pratique sur l'antibiothérapie des volailles dans
I'eaude boisson:
l- Par ses résultats. alors qu'une administration
journalière de 3 heuresparaît suffsante pour ûaiter
tous les individus dans les cas favorables
(prostration faible, bonnesconditions d'élevage),6
à 8 heuressont nécessaires
dans les cas les plus
difficiles. De plus la consommationd'eaupouvant
êtretrèsvariableen tel contexte,mieuxvaut ne pas
miser sur un volume trop faible pour une
distributionsur quelquesheures.
2- Par les critères proposés : I'appréciaûon
objective des conditions d'élevageet du niveau de
morbiditéesttrèsutile dansle choix d'unestratégie
de traitement. Au besoin un test avec colorant
permet de mesurer exactement le rythme de
consommatron.
Sans remettre en cause I'intérêt de doses
quoûdiennes concentréesdans le temps. ces
résultats soulignent donc la nécessité d'une
approcheclinique précise pour assurerI'efficacité
destraitementsdansI'eaude boisson.
On pourraît diviser en deux types les mesures
permettantd'optimisercetteefficacité :
* Médicament -> Oiseau : faciliter I'accès au
médicamenten améliorantla qualité du réseau.
* Oiseau
consommaton en intervenanf sur I'environnement
desanimaux.
Références
Bezille P., Borne P M., Proceedingsof the XX
1996
WPSACongress,
Grieve D.8., BoerboomG.I., Muir S K., 1992,
Journalof AppliedPoultryResearch,l, 415-418.
Kempf L, GesbertF., Guillet M. , Froyman R..
DelaporteJ., BennejeanG., 1995,Avian Diseases,
39,480-488.
Leont J., MogenetL, 1996.Relue de Médecine
Vétérinaire,147,4, 291-300.
Remerciements
Les auteurs remercient particulièrement Mrs J.F.
Gloaguen, C. Mao, R. Hemon et le Dr J.M.
Guillaume pour leur contribution aux études de
terrau\ et Mr H. Valancony et Pr. P. Bezille pour
les étudesexpérimentales.
r56
UN NOIIVEAU CONCEPT DE DIAGNOSTIC RAPIDE DES ^8"CO'TAVIAIRES ET ID'ETUDE
PRECOCE DE LEUR SENSIBILITE ATIX ANTIBIOTIQUES
lContant Geneviève,lBeauppre Françoise,2M"thoo Nain,2Bonal Francis et
JLc Blanc Jean-Paul
I Serbio,Départementde Microbiologie,92,Geryrevilliers,2 CabinetVétérinairedesDrs Mathonet Bonal.85'
Boufféré,3 Agro-Bio, 41, Villeny
Résumé
Le diagnosticbactériologiquede la colibacilloseaviaire necessiteun isolementde 24h sur gélose.Le nouveau
concepévitece délar,ilionsiste : (l) à sépareret concentrerlesbactériesdesbiopsiesdansun gel, (2) à révéler
leur ictivité enrymatque après 2 heures de culture, (3) à les dénombrer et à les récupérer pour realiser
I'anûbiognmme(ATB).
est > 95 o/9 après2h d'incubationà 37oC ; celle du test
La sensibilitédu test de dépistage-numération
4h (bactéries> 105/d à partir de 262poolsd'organes).
d'identificationd'E coli e* de 7Oo/oaprès
des
E.
coli de 282 lots de volailles a montré une bonne corrélation
recuperation
L'ATB réalisé après
(exactitude:85 Y$ avecI'ATB standard.
Abstract
A new conceptfor avian E. coli rapid detecting,identifying and early susceptibilitytesting to antibiotics.
The bacteriologicaldiagnosisof avian colibacillosis requires a 24 hov-agar isolation step The new concept
and concentratingbactenafrom biopsiesin a gel- (ii) in
avoids this delay, it consists: (i) in separaûng
-a
revealing their enzymatic a4ivity after 2 hour-culture, (iii) in enumerating and recuperating them for
susceptibilitytesting(ST).
The sensitvity of déteaion-enumerationtest is > 95 o after 2 hours incubation at 37oCand the one of E- coli
identification test is 70 %oafter4 hours incubation(> 10) bacteria/ml hom 262 organ pools).
ST after E. coti recuperationfrom 282 lots of poultry was shownto be well-conelated (accuracy85 7o)with the
standardmethod.
Introduction
La colibacillose est ta pathologie aviaire la plus
fréquente.L'infection, géneralemàntsecondaireà une
infection virale à tropisme respiratoire ou
mycoplasmiqueest le plus sowent systémique.Elle
ptonoqoetequemmenfunemortalitésourceàe pertes
é.onooriqo"rimportantes.
La preventoo ef l. traitement de la colibacillosesont
basessur une antibiothérapieadapteeen fonction des
résultatsde labiologie.
Le diagnosticbactériologiquerepose$r :
- I'isolementde la bactérie en24h sur gélose,à partir
desdift rentesbiopsies,
- I'identificaton d'E coli basee sur la mise en
évidence du métabolisme commun à toutes les
souchesd'8. coli,
- I'antibiogramme(ATB) en 24h sur gélose,
- des tests complémentairesporu caractériser la
souche isolê comme pathogène ou non
pathogène.
L'objectif principal est d'obtenir I'ATB précoce des
souches pathoçnes. Le nouveau concept de
diagnostic que nous avons développé évrte l'étape
d'isolement de 24h qui précède la réalisation de
I'ATB Il est uûlisable directement à partir de
prélèvements provenant de volarlles suspectesde
colibacilloæ(Sojkaet al., 1961-,Cloudet al'. l9E5) :
il indique, dans un délai de 2 heures,la présencede
bactériès (> 104/d) et identifie E' coli' La
numératon permet de standardiser I'inoculum
bactérien de I'ATB qui peut ainsi être interprété en
mêmetemPsque le sérotYPage.
Matériels et méthodes
l. Réalisationdu test raPide
l0 à 12 cËsesde 10 pl des biopsies de différents
organes: rate, foie, et coeur (RFC), poumon,trachée
et vitellus ou autre (PTA) ou RSCPTA ont été
ensemencéespar flacon de milieu de prélevement
pour les volailles mortes d'une part, et pour les
volailles malades du même lot d'autre part. Pour
chaque flacon ensemencé,3 tubes de dépistage-
DeuxièmesJoumées fu ta RechercheAvbolc, Tours, ï10 Avril 1997
r57
numératon des bactérieset I tube d'identification
d'8. coli (E coli p451TM Agro-Bio, 4l - Villeny,
F.) ont été testés,centnfugés l0 min. à 3000 g
(4500TPM) puis incubés2h à 37"C.Le dépistagedes
bactériesa été positif dès le changementde couleur
(du violet au rose ou à I'incolore)et I'identification
d'E coli dèsI'apparitionde la fluorescence
du gel. En
casde négativité,I'incubationa étéprolongée.
2. Réalisationde la méthodesur géloseconsidérée
commeréférence
Une oësede biopsie de chacun des organesa été
ensemencéedirectement sur géloses au sang,
Drigalski et Chapman.Le dépistagedesbacténeset
I'identification d'E coli ont été réaliséspour des
volailles mortesd'une part, et des volailles malades
du mêmelot d'autrepart. Ils ont étépositrfsdèsque >
l0z coloniesétaientprésentespour au moins un des
organesaprès24h d'incubationà 37'C
:
3. Réalisationde I'antibiogramme
L'antibiogrammea été réalisé par la méthodedes
disques sur gélose Mueller-Hinton après 24h
d'incubation
à 37"C :
- à partrr de colonies isoleesd'une part. selon le
protocolehabituel.
- à panir des bactériesrécupéréesdu premier tube
positif de dépistage-numération
d'autrepart. Après
rejet du surnageant.le gel du tube a été repris en
solution saline (NaCl 0.9 %) pour obterur la
solutionconcentréede bactéries.La standardisation
de I'inoculuma été effectuéepar dilution de cette
solution en tenant compte des résultats de -la
numération.
4. Réalisationdu sérotyprge d'E. coli
Le sérotlpage(réactifsBioVac. 49 - Beaucouzéet
LDA. 22 - Ploufragan)a été réalisé à partir des
colonies isolees d'8. coli sur gélose Drigalski
ensemencée
:
- soit directementà partir desbiopsiespar la méthode
de référence.
- soit à partir des bactéries récuperées comme
précédemmentdu tube d'identification d'8. coli
positif.
Principe du test rapide
Il estbasésur :
l. une centrifugationpermettant:
- la séparaton selectve des bactéries des autres
composantsdes biopsiesaprèsleur ensemencement
en milieu de prélèvement,
- la concentraton desbactériesde lechantillon dans
la phaseGEL d'un tubecapillarre.
2. une incubationà 37oCpermettant.
- la culture des bacténesau sein de la phaseGEL
contenant un milieu de culture adapté à leurs
besoins,
- la révélation de l'activité des déshydrogénases
bactériennes à l'aide d'un substrat chromogène
(Walker et al., 1959) ou de I'actvité de la
glucuronidased'8. coli à l'aide d'un substrat
fluorogène(Trepetaet al., 1984) inclus dans la
phaseGEL.
Le changement de couleur est lu à I'oeil nu par
rapport à une gammede couleur et l'apparition de la
fluorescenceest lue sousune lampeUV.
En présence d'un test positf, les bactéries sont
récupéréesaprès éliminaûon du surnageant pour
réaliser I'ATB habituel. Après ajout de volumes
variables d'echantillon, les bactéries dénombrées
selon un abaquesont diluéesde façon à standardiser
I'inoculumbactérien.
Résultats
Le test rapide a été effectuésr 262 pools d'organes
de l2I lots de volailles, parallèlementà la méthode
sur gélose. 3O o/o des lots étaient suspects de
colibacilloseà l'exarnenanatomopathologique.
1. Dépistage-numérationdesbactéries
92 yo des biopsies étudiées contenaient > rcz
bactéries/ml et 70 %
sensibilité du test rapide a été trouvee à E4 Yo en
présencede > l0-2 bactéries/ml,et a atteint 94 %oen
présencede 2 l0) bactérieVmlaprès2h d'incubaûon.
La moitié des lots contenant > l0) bact/ml a été
posiûve dès lh d'incubation. Les lots contenant 104
bact/ml (n = 4) ont pu être dépistés après 4h
d'incubation.
Les cas de faux positifs ont tous été confirmés sur
gélose après récuperaton des bactéries contenues
dans le gel. Ces faux positifs étaient liés au mode
: biopsiesdirectementsur géloseet
d'ensemencement
biopsiesen flacon de prélwement sur tube ; donc à la
probabilité de prélever les bactéries au niveau des
lésions.
2. Identification d'8. coli
La fréquenced'isolementd'E. coli a été de 75 %o.ll a
été isolé seul (49 o/o des lots), associé à d'autres
bactéries (ll % des lots) ou à d'autres souches
d'8. coli (15 % des lots). La sensibilitédu test de
86.5yo en présence de > 102 E. colihnt a atteint
97 %o en présence de > 105E colilnl après
158
poolscontenant> 105E
24h d'incubation.4O%odes
colilrrûont étépositifsaprès2h d'incubationet 74 o
après4h.
Références
Cloud S.S., Rosenberger J.K., Fries P.A.
29.
WilsonR.A., Odor E.M. 1985.Avian diseases,
1084-1093.
Environ 8 7o des échantillons contenaient des
Iritani B. and Irzana T.J. 1988.Journalof Clinical
souchesd'E. coli "défrcient" (Iritani et al., 1988 ;
26, 564-566.
Microbiology,
Paceet al., 1996) dont I'activité enzymatiquede la
Pace M.A., Doyle M.L. Scantling M.K. and
glucuronidase était lente (déteaable en 24h
Waldroup A.L. 1996. General Meeting of the
seulement
ou non détectable).
American Societyfor Microbiology, New Orleans,
Nous avons remarquéque ces souchesétaient des Louisiana,lvlay 19-23.
Sojka W.J. and CarnaghanR.B.A. 1961. Res. Vet.
souchestypables.principalementO78K80.
Un décalageentrela positivitédu testde numération Sci..2,340-352.
et celle du test d'identificationindique la présence Trepeta R.W. and Edberg S.C. 1984. Journal of
Clinical Microbiology, 19, 172-174.
d'une bactérieautre qu'E coli, ou son associationà
WalkerH.W., CofhnW.J.and AyresJ.C. 195s Food
E coli, ou exceptionnellement
la présenced'un E
13,578-581.
Technology,
coli déficient
3. Antibiogramme(ATB)
L'étudede la sensibilitésur géloseà 9 anûbiotiquesa
été réalisée après récupération des bacténes.
comparativementà la méthodeusuelle à partir de
coloruesisolees
3l-l poolsde biopsiesde 184 lots de volaillesn'ont
comportéqu'uneseuleespècebactérienneaprèsleur
récuperationet 160 pools de biopsiesde 98 lots de
volaillesont comportédeuxespèces.
Les résultatsont montré une concordanceentre les
deux méthodesde 85 7o en présenced'une seule
espècebactérienne.el 860Â en présencede deux
especes(TABLEAU). La présenced'un inoculum
trop riche explique les résultatsininterprétables Les
discordancesles plus importantesont été obtenues
pour les antibiotiques les plus sensibles au\
variationsde l'inoculum.
4. Sérotypage:
Le sérotypageest réalisable quel que soit le mode
d'ensemencement
de la gélose. Les résultats sont
similaires lorsqu'elle est directement ensemenc&
et
avecles biopsies(63 % de souchessérotypables)
après récupérationdes bactéries (58 % de souches
sérotypables). Ces résultats dépendent de la
probabilité de prélever les bactéries au niveau des
lésions.
Conclusionet discussion
Les cas de suspicion de colibacilloseà I'examen
anatomopathologrque
ont été confirmés dans les 2 à
4h par le test rapide de dépistagedes bactéries et
d'identification d'E coli. Le test a aussi été positif
dans 67 %o des cas non suspectsà I'examen des
biopsies.Il a été de realisaûonsimple et pratique. Il a
reduit le temps d'analyseet a permis un gain de 24h
sur le rendude I'antbiogramme.
t59
TABLEAU : Résultatsde I'antibiogrammeà partir de la récuperaton desbactfies (ATB Test), parallèlement
à I'ATB Référenceà partir de coloniesisolees.
ATB Test/Référence
Nombre
Concordance(7o)
Discordancesmineures: dm (7o)
Discordancesmajeures: DM (%o)
Discordancestrès majeures: DTM
(o/"1
lnintemréables (7o)
Présenced'une seuleespece
bactérienne
Poolsde
Lots de
bioosies
volailles
3t4
184
85
87
9.9
6.5
1.6
1.6
0
0
3.5
4.9
Présencede deux esprèces
bactériennes
Lots de
Poolsde
bioosies
volailles
98
160
88
86.2
J
6.3
t
t.2
-t
1.9
1.4
)
160
METHODE PRATIQUE D'EVALUATION DE LA QUALITE DE LA DECONTAMINATION
DES POULNLLERS DE VOLNLLES AU SOL
RoseNicolas,Drouin Pierre, Toux Jean-Yves
CNEVA - Unité de Rechercheen Epidémiologieet Qualité en Aviculture
BP 53 .22440 PLOUFRAGAN
Résumé
La méthodedesboîtesde contacta été utilisée pour évaluer la qualité de la décontaminationdespoulaillers de
volaillesélevéesau sol. Cetteméthodea étéappliquée,avantla miseen placedespoussins,à l0 poulaillersde
pouletsde chair et l0 poulaillersde poulettesfuturespondeuses
élevéesau sol Deux typesde mrlieuxde culture
(VRBG et ENTEROCOTINT) ont été comparés ainsi que les lieux d'application des boîtes de contacts
(mangeoireset basde parois).Le niveaude contaminationdespoulaillers appréciépar la méthodedesboîtesde
contacta été comparéau statuthygiéniquede cesmêmespoulaillers vis à vis de salmonella
Les résultatsobtenusavecles deux typesde milieu étaient positivementcorrélés.les niveaux de contamination
observéssur les mangeoireset les bas de parois n'étaient pas significativement différents. Le contrôle de
décontaminationeffectué à I'aide des boîtes de type VRBG a présentéune lien significatif avec le statut
hygiéniquedu bâtimentvis à vis de salmonella.
Introduction
La persistancede salmonella dars I'environnement
des volailles est un risque important de
recontaminaûondes lots suivants @aggesenet al.,
1992 ; Davies et Wray, 1996a). Cependant, la
détection de salmonella en poulailler vide
décontaminé nécessitela réalisation de nombreux
prélwements qur doivent être associés pour
augmenterla sensibilitéde détecton (Caldwell et al.,
1994 ; Davies et Wray, 1996c). D'autre part le
traitement bactériologique de ces échantllons
necessite un minimum de 72 heures avec les
techniquesclassiques(Humbertet al., 1995).La mise
au point d'une technique de contrôle de
decontamination rapide, fiable et corrélée avec le
statut sanitaire du poulailler vis à vis de salmonella
serait d'une grande utilité pour les organisations
professionnellessoucieusesde garantir la qualité
sanitairede leurs produits.
L'intérêt de I'utilisatron des boîtes de contact pour
I'appréciation de la qualité de la décontamination
dansles poulaillers@rouin et al., 1988)ou dans les
locaux de sewagedes porcelets @oucheret Madec,
1991) a déjà été mis en âridence. Cependant,
I'utlisation d'une telle méthode dans le cadre du
contrôle du statut hygénique des poulailler vis à vis
de salmonellaest encoremal connue.
Matériel et méthodes
l. Echantillon
l0 poulaillers de pouletsde chair et l0 poulaillers de
poulettes funres pondeuseséleveesau sol ont été
enquêtésen Bretagnede novembre 1995 à juillet
1996.L'interventionavait lieu ar,'antla miseen place
despoussins.en poulailleréquipe.
2. Contrôte bactériologiquede décontamination
Des boîtes de contact de 25 crn2 de surfaceont été
uûlisées.Deux milieux de culture ont été employés:
le milieu ENTEROCOUNT (AEBr227loC. AES
laboratoire, Combourg) pour la culture des
streptocoques fecaux et le milieu VRBG
(A88153202, AES
laboratoire. Combourg).
de désinfectant(507114"
neutralisant
additionnéde
pour la culture des
Lugny),
LCB,
laboratoire
enterobactériestotales. Pour chacun de ces milieux.
16 boîtes ont été appliquées par poulailler en
maintenant une pression moyenne pendant 5
Les lieux d'applicationétaient:
secondes.
l) les bas de parois,à 20 cm du sol (2 boîtespar
quartier pour chacun des milieux, soit 8 boîtes
ENTEROCOUNT et 8 boîtes VRBG Par
poulailler)
2) les mangeoires(2 boîtes par quartier pour
8
boîtes
soit
chacun des milieux,
ENTEROCOUNT et 8 boîtes VRBG Par
poulailler)
Après application, les boîtes de contact ont été
transporteesdans un container isotherme à +4oC'
Elles ont été placeesà l'étuve à 31"C pendant 24
heures. Après incubation, les colonies de
streptocoquesfécaux apparaissaientroses violacées
sur le fond jaune de la géloseENTEROCOUNT, les
colonies " enterobactéries totales" apparaissaient
violacees sur le fond rose de la géloseVRBG. Les
boîtes de contact ont été dénombrees; au delà de
DeuxièmesJournéesde la RechercheAvîcolc, Tours, &10 cr'ril 1997
300 coloniesles boîtes étaient considéréescotnme
envahies.Les boîtes contenant des colonies mal
délimitéesou à caractèreconfluant ainsi que les
boîtescontenantdesmoisissures
ont étééliminées.
3. Statut sanitaire des poulaillers vis à vis de
salmonella
Les prélèvementsont été réalisés à I'aide de
chiffonnettesstérilesadditionnéesde neutralisantde
désinfectant.Chaque poulailler a été divisé en 4
quartierset les chiffonnettesont été appliquéessur 4
typesde surfacedifférents:
l) parois et bas de parois (l chiffonnettepar
quartier appliquéesur une surfacede 10 m2,
soit 4 chiffonnettespar poulailler)
2) mangeoires(l chiffonnette par quartier
appliquée sur 10 mangeoires, soit 4
chiffonnettespar poulailler)
3) abreuvoirs (l chiffonnette par quartler
appliquée sur l0 abreuvoirs ou l0 godets
récupérateursd'eau des pipettes. soit 4
chiffonnettespar poulailler)
,1) admissionsou sorties d'air (l chiffonnette
par quartier appliquéesur l0 m linéaire de
trappes ou chacun des ventilateurs, soit 4
chiffonnettespar quartier)
milieu utlisé (VRBG / ENTEROCOUNT) ont été
effectuéesgrâceau test du Chi-2 de Mantel-Haenszel,
restreintà 2 classes:
- classeA : moinsde 30 coloniespar boîte
- classeB : plus de 30 coloniesparboîte
Afin de comparer les résultats de contrôle de
décontaminationavec le statut sanitaire des élevages
vis à vis de salmonella,le niveaude contamination
résiduelle de chaque élevage a été défini par la
effectuéssur I'ensemble
médianedesdénombrements
desboîtesappliquéesdanscet élevage.La distibution
des 20 médianes obtenuespour chaque milieu de
culture a été comparéeaux résultats des recherches
de salmonellagrâceau testexactde Fisher.
Le niveaude signilication retenuest de 5olo.
Résultats
1. Différences de niveaux de contamination entre
les deux productions(figure 1)
Sur I'ensemble des boîtes appliquées, les l0
poulaillers de poulets de chair ont présentésdes
niveaux de contamination plus élwés que les l0
poulaillers de poulettes. La proportion de boîtes
correspondantà des niveaux de contaminaûonélevés
(>30 coloniespar boîte) étart plus importantepour la
Les prélèvementsont subi une phase de préproducûonde pouletsde chair que de poulettes(chi-2
enrichissementen eau peptonéetamponnée(22h à
= 13.1,p = 0.004pour le milieu VRBG et Chi-2:
37"C)- survie d'une étape d'enrichissementsur
milieu semi-solide de Rappaport Vassiliadis et
12.2. p = 0.007 pour le milieu ENTEROCOLJNT).
(21h
puis
isolementsur milieu
tétrathionate
à 12"C),
Cette même analyseajusteesur la nature du milieu
(24h
poulailler
X1,'lose
LysineTergitol 4
à 37'C). Le
utilisé a condurt à la même conclusion (Chi-2 de
prélèvement
moins
un
Mantel-Haenszel 19.3, p
contaminé
si
au
a été déclaré
sur les 16 réalisésétait positif.
comparaisonseffectuéespar la suite ont donc été
ajustees sur la nature de la producton pour
neutraliserune éventuelleconfusionintroduite par les
3. Analysestatistique
niveaux de contaminationdifférentsobservésdansles
Le logiciel Systat5.1 sousWindowsa étéutilisé.
l0 poulaillersde pouletset dansles 10 poulaillersde
Les dénombrements
effectuéssur les boîtesde contact poulettes.
ont conduit à constituer 4 classespermettant la
répartitionla plus homogènepossiblede l'ensemble 2. Comparaisondes2 types de milieux (tableau1)
desboîtesde contactappliquées.Sur un total de 627
Les résultatsde comptageréalisessur les deux types
boîtes dénombrées,la répartition par classea été la
:
de milieu ont présenté une corrélation positive
suivante
- classeI : 0 colonie,n1 = 255boîtes
significative (coefficient de conélation de Spearman
= 0.56, p < 1 p. 1000).Les boîtesENTEROCOIJNT
- classe2 : I à 30 colonies,n2 : 194boîtes
- classe3 : 3l à 120colonies,n3:77 boîtes
en classe 4 (>120 colonies) correspondaient
- classe4 : plus de 120 colonies.n4 = l0l
majoritairementà desboîtesVRBG très contaminees
(> I20 colonies). Par contre les boîtes
boîtes.
ENTEROCOUNT en classe I (0 colonie)
Le test de corrélation des rangs de Spearmana été correspondaientpour 38.4 yo à des boîtes VRBG en
des2 milieux uûlisés.
classeI et pour 43 yo à desboîtesVRBG en classe2
utilisé pour la comparaison
(l à 30 colonies). De même, les boîtes
pour
en classe3 (31 à 120 colonies)
la
Pearson
a
été
utilisé
ENTEROCOIINT
Le test du Chi-2 de
à des boîtes VRBG
majoritairement
la
niveaux
de
contaminaton
selon
correspondaient
des
comparaison
naturede la production ou les lieux d'applicaûon des en classe4.
boîtes.Cescomparaisons,ajustéessur la nature de la
production (poulets de chair ou poulettes) ou du
t62
3. Comparaison des lieux
(mangeoireset bas de parois)
d'application
Après ajustementsur la nature de la production, la
localisaton " bas de parois"
n'était pas
significativementplus contamineeque la localisation
" mangeoire" (Chi-2 de MantelHaenszel= 2.3, NS)
4. Lien avecla contaminationsalmonellique
Seul le milieu VRBG (enterobactériestotales) a
permis de mettre en évidence un lien significatif
entre le niveau de contamrnation résiduelle du
poulailler et son statut sanitaire vis à vis de
Ila (tableau2, p : O.O2)
salmone
TABLEAU 2 : lable de contingence entre les
résultats de contrôles de décontamination (boîtes
VRBG) et le statut hygréniquedu poulailler vis à vis
de salmonella
sqlntonella
cfu / boîte
(vRBG)
<30
>30
Négatif
9
J
Positif
I
7
Discussion
Pour des niveaux de contamination du poulailler
équivalents, les informations fournies par les deux
types de milieux se sont revéléesêtre liées. Dans un
environnement très contâminé les boîtes VRBG
étaient rapidement envahies alors que les boîtes
ENTEROCOIINT étaient encore dénombrables.Par
contre, en milieu peu contaminé, les boîtes
ENTEROCOIJNTresteesstérilesne permettaientp:rs
de discerner les élevages non contaminés des
élwages peu contaminésvoire très contaminés. La
méthodeutilisant les boîtes ENTEROCOLJNTs'est
donc révélée être moins sensibleau cours de cette
étude.
Les deux lieux d'application (bas de parois et
mangeoires) ont présentéspeu de diftrences de
niveau de contamination. Il a donc été difficile de
définir une localisation " facteur limitant " pouvant
constituer un bon indicateur du niveau de
contaminaton globale du bâtment. Drouin et al.
(1988) ont observéque la contamination résiduelle
était plus importante sur les surfacesrugueuseset
difficiles à désinfecter(bas de parois). La différence
observéeici selon la nature de la production (poulets
de chair ou poulettes) pounait s'expliquer par la
naturedesmatériauxutlises. Si les matériauxutilisés
pour les bas de parois ne diffèrent pas ou peu, le
matériel d'alimentation utlisé dansla production des
poulettesest en général plus ancien et difficilement
decontaminable (assiettes en métal galvanise ou
chaines linéaires métalliquescontre des assiettesen
PVC en production de poulets). D'autre part, un
certain nombre de difficultés, dont la présence
d'aliment et de poussières d'aliment sur les
mangeoiresrendant la lecture diffrcile, ont conduit à
considérerle lieu " bas de parois " corrme indicateur
meilleur et préférable.
Les rézultats des contrôles de décontaminaton
réalisés à I'aide des boîtes de type VRBG ont
présenté un lien significatif avec les résultats des
recherches de salmonelles, même pour cet
échantillon de taille relativement restreinte. Ceci
confirme I'importance de la qualité de la
I'assainissement des
décontamination pour
poulaillers contaminéspar salmonella (Fis et Van
den Bos, 1995 ; Davies et Wray, 1996b).Une telle
méthodepermettraitde détenir un indicateurprédictif
du statut hygiénique du poulailler vis à vis des
salmonelles,avant la mise en place des poussins.
Cependant,l'inconvénient des boîtes de contact de
type VRBG additionneesde neutralisantest leur non
disponibilité dans le cornmerce et leur mauvaise
conservation, ce qui n'est pas le cas des
ENTEROCOUNT. Les 2 tlpes de milieux ayant
monûé entre eux une liaison significatve, il est
possibleque les résultatsobtenusà I'aide des boîtes
ENTEROCOLTNTn'aient pas permis de mettre en
evidenceun lien significatif avec la contaminaton
par salmonella du fait d'un manquede puissancelié
à la petite taille de l'echantillon. Une telle
comparaisonmenéesur un echantillon de taille plus
importante mériterait d'être effectuee, d'une part
pour confirmer les obsen'atons réalisees pour le
milizu \1RBG et d'autre part pour approfondir les
résultatsobtenusavecle milieu ENTEROCOTJNT.
Références
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lères journeesde la rechercheavicole - Angers - 28,
29, 30 mars1995.
FIGURE I : Distributon du nombrede boitesde contactpour chacunedesproductions
(pouletsde chair ou poulettes) selonle niveaude contamination
Nombre de boites
Milieu VRBG
Nornbrede boites
150
150
100
100
50
Milieu ENTEROCOUNT
50
0
<30
0
>31
>31
cfu/boite
cfu/boite
i ctri- 2 (MH)= 19.30p < I p. lfiD1
entreles résultatsde comptageeffectuéssur 307boîtesVRBG et 307boîtes
TABLEAU I : correspondance
ENTEROCOIINT appliquéessimultanémentau mêmesite.
0
(classel)
0
(classe1)
Milieu
1à30
(classe2)
ENTEROCOUNT 31 à 120
(classe3)
(cfu/boîte)
> 120
(classe4)
TOTAL
n1,1= 68
(38.4%)
ft2,l ='7
(e3vù
Milieu VRBG (cfu/boîte)
3l à 120
1à30
(classe3)
(classe2)
> 120
(classe4)
TOTAL
n1,2:16
(43.0 o/o\
n1,3: 16
(e.0w
n 1 , a =l 7
(e.6%)
ne: I77
(100.0%)
n2p= 33
(44.0 %)
n23= 2l
(28.0%)
n2,4=14
(r8.7 %)
n€: 75
(100.0%)
î3,2= 4
n3J=g
(28.6%)
n3,4= 16
n"=28
(100.0%)
ne:27
(100.0%)
rl3,l= 0
(00%)
(r4.3%)
n+,t= 0
(00%)
(rr.r%)
n+,3= I
(3.7%)
114,4=23
nu:75
nv= 116
nu=46
nr:70
nl,2 = 3
(s7.r%)
(85.2W
N=307
légende : N = nombre total de paires VRBG-ENTEROCOLINT,n,n= nombre total de boîtes VRBG dans la
=
classeconsidérée,n" = nombre total de boîtes ENTEROCOIJNT dans la classeconsidérée,nç nombre de
paires VRBG-ENTEROCOLINTcorrespondantà I'intersecton des 2 classesconsidérées,les nombres entre
parenthèsesreprésententles proportions de boîtes ENTEROCOLINT dans la caseconsidéréepar rapport au
total en ligne (n")
t64
A]VTPLMICATIONDE LA REPONSEIMMUNITAIRE AU NIVEAU INTESTINAL ET SYSTEMIQUE
SUITE A L'IMMUNISATION DE POULETS PER O^SPARUNE PROTEINE RECOMBINANTE
PARASITAIRE ASSOCIEE A IDETIXADJWANTS :
TOXTNE CHOLERTQUE OU TSCOMS
Girard x'abiennel,Péry Pierre2, Naciri Muriell, Quéré Pascalel
lstution de PathologieAviaire et Pamsitologie,INRA- 37380Nouzilly.
2laboratoirede Virologieét ImmunologieMolécuiaires,INRA- 78352Jouy-en-Josas
Résumé
La mise au point d'unevaccinaton par desprotéinesrecombinantescontre desparasitesintestinauxcommeles
Eimeria aviairesoblige à l'induction, au niveau intestinal, d'une réponseimmune forte, durableet orientéevers
la productiond'IgA. Les propriétésadjwantes, de la toxine cholériqueet de I'incorporation dansdes ISCOMS,
qui ont été démontreesau niveau de la muqueuseintestinaledes mammifères,aprèsune administtationper os,
ont ététesteeschez le poulet. L'administration per os de 4x200pg de l'antigène recombinantimmunodomrnant
lPEl, commun à plusieurs especes d'Eimeria, n'induit qu'une faible reponse IgM dans I'intestin.
L'incorporaûon dans des ISCOMS n'améliore pas la réponse immune en anticorps. La toxine cholérique
(4x501tg)per os, induit une réponsesignificatve en anticorps,au niveausérique(IgA et IgG) dèsla semaineI
pi et intestinal (IgG) dèsla semaine3, preuvede la conservationde son immunogénicité.Elle exercede plus un
effet adjuvantsignificatif sur la réponseimmune contre lPEt. intestinale (IgAen semaine3 et IgG en semaine
4, dansle duodénum)et serique(IgA en semaine2). Neanmoinscet effet restefaible.
Introduction
La coccidioseaviaire est due à un protozoaire du
gewe Eimeria, parasite intracellulaire qui se
développedans les entérocytes.Les mesures de
lutte reposentactuellementsur la chimioprevenûon
systématiquepar des antcoccidiens. Cependantla
nécessitéde limiter les intrants chimiques dans les
productons animales, la fréquencecroissantedes
souches chimiorésistantes, et l'impossibilité de
traiter certainesfilières de production, imposentde
powoir recourir à d'autresméthodesde préventon
cornmela vaccination.Mais la mise au point d'un
vaccin utlisant des protéinesrecombinantespasse
par la nécessitéd'induire une réponse immune
forte et durable au niveau du lieu de
dnveloppement intestinal du parasite, et
qualitativementadé$nte. Après une infection par
Eimeria chez le poulet, la réponselocale cellulaire
sembleprimordiale dans la lutte contre le parasite,
descontroverseszubsistantquant au type cellulaire
impliqué préferentiellement (Lillehoj, 1989;
Lillehoj et Bacon, 1991; Vervelde et al., 1993;
Rothwell et al., 1995). Les IgA sécrétoires
pourraient également jouer un rôle important
(Daviset al.,1918; Davis et Porter,1979;Mockett
etRose,1986).
Pour obtenir une bonne réponseimmune, il faut
doncutliser un adjuvantadapté.Dorrée per os,la
toxine cholérique a fait la prewe chez les
mammiferesde sonefficacité commeadjuvantpour
induire une immunité intestnale forte, durable et
orientee vers une réponse auxiliaire de type 2
associê à la production d'IgA sécrétoires(Lycke et
Holmgren.1986:Munoz et al., 1990:Wilson er
al., l99O'.Xu-Amanoet a|..1993).Soneffetesttrès
peu étudié chez le poulet (Hoshi et al . 1995). La
protecûon de I'anûgènedans des ISCOMS. qui
incorporent de plus de la Quil A, un adjuvant des
muqueusesefficace.s'avèreaussiintéressantepour
permettre I'induction d'une immunité après
délivrance per os (Mowat et Donachie l99l:
Kazanji et al.. 1994;Maloy et al..1994).
L'objectif de notre étude est d'évaluer. chez des
poulets,la réponseimmune en anticorpsaprèsune
administraton per os de I' antigène recombinant
lPEl, commun à plusieurs especesd'Eimeria
(Laurentet a|.,1994),associéà la toxine cholérique
ou à des ISCOMS. L'immunité locale est évaluée.
au niveau de deux portions intestinales,duodénum
et caecuns, par la quantité d'anticorps relargrrés
après une mise en culture ex vivo de 16 heures
(Zigtermanet al., 1993).
Matériel et méthodes
1. Poulets
Des poulets d'une lignée histocompatibleLeghorn
blanche(Bl3/Bl3) ont étéutlisés à l'âge de
2 mois.
2. Antigène et adjuvants
Le gène codant pour l'antigène lPEl a été isolé
d'une banque d'ADNc obtenueà partir d'oocystes
sporulés d'8. acentulina (Laurent,1994). La
protéine est expriméedansE. coli grâceau vecteur
Deuxibnes fournées de Ia RechercheAvicolc, Tours, &10 avrÊl1997
d'expressionpGEx (Smith et al.. 1988). Les
ISCOMS sont préparés selon la procédure
originale de Lôvgren et al., (1987), modifiée par
Kazanji et al " (1994).La présence
de lPEl dans
les ISCOMSest vérifiéepar électrophorèse
en gel
de polyacrylamide-SDS.
La quantitéde protéine
incorporéedansles ISCOMSestestiméepar le tesl
à I'acidebicinconinique(BCA. Pierce).La toxine
cholérique:st obtenuechezSigma
TABLEAU 1 : Dosagedesimmunoglobulines
spécifiques
anti-lPEl. IgM (l/l). IgA (l/l) et IgG (l/4) au
niveauduodénalet caecal.3 et 4 semainesaprèsune immunisationavecl'antigènerecombinantlPEl incorporé
ou non dansdesISCOMSet associéou non à un adjuvant.la toxinecholérique
Témoinssains
lPEl
ISCOMS lPEl
ISCOMS 1PET
+Tox. cholérique
Duodénum
Semaine 3
IgM
lgA
IgG
Semaine{
IgM
IgA
lgG
Semaine3
IgM
IgA
IgG
Semaine{
IgM
IgA
IgG
0.042+0.(xr8*a
0.29{10.031
0.244+0.041
0.092+0.0099
0"290û.022#c
0.178*0.003
0,098+0,013b
0,321+0,029
0.137+0,018
0,103+0,0189
,
0,382+0.022Ïd
0.174+0,031"
0.012r0.(x)34
0.259f0.038
0.177+0.025
b
0.087*0.015
0.3t3+0,039
0.172r0.066c
Caecum
o.ill+0.018b
0.400+0,046
0"t9l+0,037e
0,106*0,016b
0.370*0,031
.0.807*0,270(Lr
a
o.036+0.(x)5
o.l7l+o.028^
0.+90+0.093
0.099+0.017
0.109+0.017.b
P
o-25-t+0.012oD 0.284+0.02?D
0.465+0.025"
0.443+0.06"
0,110+0.019P
0.290+0.018:
0.489+0.l
l l'
o
0.ol:i+0.00-t
a
0.10210.012
0.606+0.065
r).lr)3r0.005
P
D
0.309+0.018
0.60410.125
0.129*0.012P
0.362+0.031o
1.232+0332
u.10.1+0,002P
0.308+0.025D
0.632+0.096
a. b valeurssignihcativement
différentes(Testde Student)entrela D O+OSdespouletstémoinssainset celle
despouletsimmunisésavecI'antigènerecombinantlPEl incorporéou non dansdesISCOMS,associés
ou non
à la toxinecholérique.
c. d : valeurssignifrcativementdifférentes(Test de Student)entre la D O+OSdes pouletsimmunisésavec
I'antigènerecombinantlPEl et celle despouletsimmunisésavecl'antigènerecombinantlPEl incorporédans
desISCOMSet associéà la toxinecholérique.
e. f : r,aleurssignificativement
différentes(Testde Student)entrela D. O+OSdespouletsimmunisésavec
I'antigènerecombinantlPEl incorporédansdesISCOMSet celledespouletsimmunisésavecI'antigène
recombinantlPEl incorporédansdesISCOMSet associéà la toxinecholérique
l'10
TABLEAU 2 : Dosagedesimmunoglobulines
specifiquesanû-toxinecholérique,IgM (1/1), IgA (l/a) et IgG
(l/16) au niveauduodénalet caecal,3 et 4 semainesaprèsune immunisationavecI'anûgènerecombinantlPEl
incorporédansdesISCOMS et associéou non à un adjuvant,la toxine cholérique.
ISCOMS lPEl
ISCOMS lPEl+Tox. cholérioue
Semaine3
Semaine4
Semaine3
Semaine 4
IsM
0.030+0.008
0.022+0.005
0.052+0.010
IgA
0.102+0.015
0.107+0.016
0.092+0.015
IgG
0,001+0,b0la
o.ôos+0.ôota
0.264+0.054*h"
Caecum
Semaine3
Semaine4
Semaine3
Semaine4
IgM
0,040+0,011
0,031+0,006
0.060+0.0006
0,067+0,002
IgA
0,032+0,012
0.022+0.003
0,060+0,01Q
IgG
0,002+0,0014
0.004+0.0024
0.655a{.081D
représente
la moyennede la différencede densitéoptiquemesuréeentret. 0 et t. 16 pour 6 poulets(saufpour#
où N:5) avecpour chaquesegmentintestinal 3 ou 4 répetitions(Moy. + S. E M).
a. b : valeurssignificativementdifférentes(Test de Student)entre la D. O+OSde pouletsimmunisésavec
l'antigènerecombinantlPEl incorporédans des ISCOMS et celle des poulets immunisésavec I'antigène
recombinantlPEl incorporédansdesISCOMSet associéà la toxine cholénque.
c. d : valeurssignificativementdifférentes(Testde Student)entre la D. O+OSmesuréeau niveauduodénalou
caecaldespouletsimmunisésavecI'antigènerecombinantlPEl incorporédans des ISCOMSet associéà la
toxinecholénque
e. f : valeurssignificativementdifférentes(Testde Student)entrela D. O+OSmesuréeentreles semaines3 et 4
aprèsI'immunisaûondespouletsimmunisésavecI'antigènerecombinantlPEl incorporédansdesISCOMSet
associéà la toxinecholérique
Duodénum
r.:â'.tjr13'fr'.1"
3. Protocoleexpérimental
Quatre groupesde 12 poulets ont été constitués.
dont un témoin non immunisé (0). Un deuxième
groupe a reçu 4 inoculaûonsper os de 200pg de
lPEl à 2 jours d'intervalle.Un troisièmegroupea
été immunisé de la même manière avec 200pg
d'lPEl incorporé dans des ISCOMS ( ISCOMS
lPEt). Un quatrièmegroupea reçu 4 fois 200pg
d'ISCOMS-IPEI avec 50pg de toxine cholérique
flSCOMS lPElÆC). Des prises de sang sont
effectuéesde la première à la quatrième semaine
après la dernièreimmurusation.Six poulets par
groupe sont sacrifiésà la troisièmeet quatrième
semainepi afin de déterminerla production des
anticorps locaux au niveau du duodénum et des
caecums.
4. Techniquede production des anticorps locaux
intestinaux
La technique de culture ex vivo des fragments
intestinaux chez le poulet a été mise au point par
Ziglernan et al., (1993) Quatrerépetitionsde lg
sonteffectuéespar portion intestinale.
5. TestsE.L.LS.APour le dosage des antcorps du serum ou des
surnageantsde culture intestnaux, lPEl (spglrù)
est adsorbésur desplaquesde microtitraton Nunc,
et la toxine cholérique (2pgllll'l) sur des plaques
Dynatech Immulon IL Les isotypesdes anticorps
specifiquementfixés sur I'antigène,sont révéléspar
un sérum polyclonal anû-chaine a de l'IgA de
poulet @ethyl) couplé à la peroxydase,ou par un
sérum polyclonal de lapin anu-fragment Fc de
I'IgG de poulet (Interchim) coupléà la phosphatase
alcaline (pour lPEl) ou à la peroxydase(pour la
toxine cholérique dans la réponseintestinale), ou
par un sérumpolyclonal de chàne anti-chainep de
I'IgM de poulet @ethyl) coupléà la peroxydase.
6. Analyse statistique
Les moyermes(SEM sont donnéespour 6 ou 12
poulets. I-a comparaison des moyennes est
effectuéepar le test t de Student.
Résultatset discussion
Nos résultatsmontrent que l'administration per os
de 4x200pg de I'antigène lPEl sans adjuvant
induit une faible réponseIgM au niveau duodénal
et caecalen semaines3 (p<0.01)et 4 (p<0.001)pi
ainsi qu'une réponse de type IgA au niveau
duodénalet caecalpendant la semaine3 (p<0.01)
et 4 (p<0.001)(TABLEAU l). Par contreaucune
réponsesérique n'est observee(TABLEAU 3), ce
qui est conforme avec les études chez les
mammifères(Lycke et Holgem, 1986; Wilson e/
al., l99O).
L'incorporation de lPEl dans des ISCOMS,
n'améliorepas, dans notre étude,I'amplitude ou la
qualité de la réponseimmune en anticorps locaux
sériques
l)
ou
intestinaux (TABLEAU
(TABLEAU 3) après une administration per os.
Les ISCOMS sont des particules de 40nm de
t7l
présentaûon
diamètre,
combinant
une
multimérique de l'antigène avec un adjuvant
incorporé, la Quil A. Le rapport entre I'adjuvant et
I'antigèneincorporésrestetoutefoisempirique. Les
ISCOMS ont démontré leur efficacité dans des
stratégies d'immunisation per o,r chez les
mammifèresdu fait de leur résistanceaux acideset
aux sels biliaires (Mowat et Donachie, 1991.
Kazenji et al., 1994;.Maloy et al., 1994).D'autres
étudessont nécessaireschez le poulet en modifiant
les protocolesd'immunisation,pour démontrerleur
possibleeffet d'adjuvant au niveau de la muqueuse
intestinale.
Par contre, notre étude montre que la toxrne
cholérique, administréepar voie orale chez le
poulet reste immunogène,ce qui prouve donc que,
s'il y a dégradationdans I'intestin, cellerci reste
partielle. Au niveau de la muqueuseduodénaleet
caecale,une forte réponse spécifique anti-toxine
cholénque, signifrcative de type IgG est observée
dèsla semaine3 pi (p<0.001)(TABLEAU 2). De
plus dès la semaine I pi, apparaît une réponse
sériquesignificatve en IgA (p<0.05)et très forte
en IgG (p<0.001) (TABLEAU 4). Ces résultats
sontoriginaux chezle poulet.
Non seulement la toxine cholérique garde ses
capacitésimmunogènes,mais elle exerceaussi de
façon indubitable un effet adjwant sur la réponse
immune contre lPEl. Les IgA spécifiques
duodénalessont augmentéessignificaûvement en
semaine3 (p<0.05) et les IgG specifiquessont
augmentées significatvement au niveau du
duodénumen semaine4 (p<0.05) et de façon
moindre au niveau du caecum,où la réponsenon
specifiquereste élevée(TABLEAU l). La réponse
IgA sérique est significativement accrue en
semaine2, et celle en IgG commenceà croître en
semaine4 (TABLEAU 3).
En conclusion,la toxine cholériquesemblepouvoir
jouer un rôle adjwant per os dans la réponse
immune contre un antigène non réplicatf, avec
une orientation vers la production d'IgA comme
pour les mammifères(Wilson et al.. l99O'. XuAmon et al., 1993). Toutefois cet effet adjuvant
restede faible amplitude,ce qui posela questionde
son utilisaûon dansla pratique.
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TABLEAU 3 : Dosagedes immunoglobulinesspécifiquesanti lPEl IgA (l/160) et IgG (11640)au niveau
sérique,une, deux, trois et quatre semainesaprès une immunisation avec I'antigènerecombinantlPEl
incorporéou non dansdesISCOMSet associéou non à un adjuvant,la toxinecholérique.
SemaineI (N=12)
Semaine2 (N=12)
Semaine3 (Nd)
Semaine4 (Nd)
Témoinssains
lPEI
0.060+0 004
0.062+0 0204
0. 079*0.006
0.063+0005
0.069+0004
0. 065+0.0054
0. 063*0.005
0.06410.004
0 073+0.005
0. 076+0.0044
0 069+0.013
0. 060+0.003
0. r02fl.022
0. l5l+o.046D
0. 069+0.013
0. 069+0.007
0. 400+0.070
0 420i0.050
0 . 4 1 6 + 00 2 6
0.397+0.t24
0. 530+0.058
0. 480'10.099
0. 395+0.0 5 L
0. 564+0 116'
0 508+0.045
0 330+0.026
o 317a0.045
0 526+0.062
0 . 7 0 1 + 0l.l 4
0. 414+0.044
0.315+0.055
0. 90r*0. 288
TSCOMSlPEl
ISCOMS 1PEI
+Tox. chollrique
IsG
SemaineI (N=12)
Semaine2 (N=12)
Semaine3 (Nd)
Semaine4 (Nd)
a. b . valeurssignificativementdlfférentes(Testde Student)entrela D. O+OSde pouletstémoinssainset celle
de pouletsimmunisésavecI'antgènerecombinantlPEl incorporéou non dansdesISCOMSet associés
ou non
à la toxinecholérique.
TABLEAU 4 : Dosagedesimmunoglobulinesspécifiquesanti toxine cholériqueIgA (l/80) et IgG (l/640) au
niveausérique.I. 2" 3 et 4 semainesaprèsune immunisationavecI'antigènerecombinantlPEl incorporéou
non dansdesISCOMSet associéou non à un adjuvant.la toxinecholérique.
IPEl
SemaineI (N=12)
Semaine2 (N=12)
Semaine3 (N=6)
Semaine4 (N=f)
0.040+0,00,+
a
0.029+0.004
a
0,029+0,010
a
0,058+0,007
Semaine1(N=12)
Semaine2 N:f2)
Semaine3 (Nd)
Semaine4 (Nd)
0.017+0.004
0.038*0.007a
a
0.032È0.013
a
0,031+0.012
ISCOMS lPEl
ISCOMSTPET
+Tox. cholérique
0,065+0,006:-
t;t^t^1*t^t-ti
0.097+0,01
î.
Do
0.I1310.009
0.055i0,007'
a
0.053+0.007
a
0.068+0,024
a
0.015+0.008
1"150+0.158::
2.0g0fl,2?3?1
;";;;;ô:.0;;?d.
0(I
2.565+0.073
représentela moyenneN=6 (tN=5) de la densitéoptique mesuréeau niveau sérique(Moy + S E lO
a. b : valeurssignificativement
différentes(Testde Student)entrela D. O+OSdespouletslPEl ou ISCOMS
lPEl et celledespouletsISCOMSlPEl + Tox. cholérique.
c. d : valeurssignificativement
différentesentrela D. O+OSdessemaines1,2.3 et 4, pour lespouletsISCOMS
lPEl + Tox. cholérique
173
INTERACTIONS CRYPTOSPORIDIES . VIRUS DE LA MALADIE DE MAREK CHEZ LE
POULET
Hayet Abbassi, Françoise Coudert et Muriel Naciri
37380Nouzilly
INRA, Stationde PathologieAviaire et de Parasitologie,
Résumé:
QuarantedeuxpouletsEOPS813/813 ont étédivisésen 4lots pour comparerI'effetde I'associatondu virus de
(JGa))et de Cryptosporidiumbaileyi inoculépar voie
la maladiede Marek (HPRS16)administréà la naissance
orale4 jours plus tard (J0) (Lot A), à deslots témoinsayantreçule virus seul(B), desC. baileyi seuls(C), et à
un lot témoin sain (D). Les animauxdu lot A ont présentéun état généraltrès altéré,avec des symptômes
respiratoiresgravesqui ont conduità la mort de tousles sujetsentreJ8 et J39. 8l,8Vode cespouletssontmorts
avant I'installation des premièreslésions de la maladie de Marek. La mortalité dans le lot B (27,3Vo)n'a
commencéqu'àJ55alorsqu'aucunemortalitén'aéténotéedansleslots C et D. L'excrétionparasitairedu lot A a
ététès élevéeet plusdurablede J4jusqu'àla mort desanimaux(J39),parrapportà celledu lot C (J4 à J2l). Une
infestationmassivede la trachée,despoumonset souventdesreins par C. baileyi a éténotée(lot A) à côtéde
celledesBoursesde Fabricius(BF) et du cloaque(LotsA et C). L'infectiondespouletspar le virus de la maladie
de Marek sembleinduire I'expressiond'un pouvoir pathogèneexacerbédesC. baileyi, considéréescommeagents
non pathogènesaprèsadministrationpar voie orale.
Introduction
Les cryptosporidies, protozoaires du genre
Cryptosporidinn,comportentau moinsdeuxespèces
chez les volailles : C. meleagridls responsablede
diarrhéeschezla dinde (Tyzzer,1929,Slavin, 1955)
etC. baileyi décriteplus tard,colonisantla boursede
Fabricius(BF) et l'appareilrespiratoire(Currenter a/.
1986).La maladiede Marek, due à un herpesvirusqui
induit une prolifération tumorale des cellules
lymphoïdesde type T dansun grandnombrcd'organes
et de tissus,se manifestepar destroublesgénérauxet
la mort avec souvent des paralysies (Cauchy et
Coudert, 1986). Un effet immunodépresseurest
associéà I'infection par ce virus (Schat, 1996).Les
cryptosporidies ont été décrites associéesà des
infectons virales dans des élevagesde volailles à
problèmes,commela réovirose(Ritter et al.1986),la
bursiteinfectieuse(Fletcher,1976,Randall,1982),la
maladiede Marek (Fletcher,1976,Naciri etMazznlla,
1988),et I'anémieinfectieuse(Dobos-Kovacs
et al.,
1994).Leffet synergiquedescesco-infectionsviruspour
crytosporidiesa été confinné expérimentalement
la réovirosechez les colins avec Cryptosporidiumsp
(Guy et al. 1987),et chez le poulet avecC. baileyi
(Guy et aL 1988).L' effet synergiquede I'association
entre C. baileyi et le virus de la bursite infecteuse a
été contreversé(Levy et al. 1988, Blagburn et al.
1991). Naciri et al. (1989) ont démontré un effet
synergiquedu virus de la maladiede Marek (HPRS
16) et Cryptosporidiumsp à tropismeinæstinal.
Notre objectif est d'étudier I'effet du virus HPRS 16
associé à C. baileyi à tropisme différent de
Cryptosporidiumsp.
Matériel et méthodes
1- Animaux et netériels
Quarantedeuxpoules EOPSde raceLeghornblanche,
souchehistocompatibledtaplotype Bl3/813 ont été
utilisés pour leur grandesensibilitéà la maladiede
les pouletsont étédivisésen
Marek.Dèsla naissance,
4 lots installésséparémentdansdesisolateursventilés
dansune salle protégéeen dépression.
en surpression
Les pouletsbaguésà I'aile à 8 jours, sont restésen
(62jours
isolateursjusqu'àla fin de I'expérimentation
aliment
avec
un
libitum
: J58).Ils ont été nourrisad
granulénon supplémentéet abreuvésà volonté' J0
étant le jour d'inoculation des cryptosporidies,la
répartitiondeslots aétéla suivante:
Lot A (l l poulets): Infectéspar le virus de la maladie
de Marek (inoculation à J(-4)), et par des oocystesde
C. baileyi (inoculationà J0)
Lot B (11 poulets) : Ténoins maladiede Marek
(inoculationà J(-4))
Lot C (10 poulets) : Témoins cryptosporidiose
(inoculationà J0)
Lot D (10 poulets): Témoinssains( non inoculés)
2- Inoculums
Virus : La soucheHPRS16du virus de la maladie
de Marek régulièrementpasséein vivo sur poulets
B 13/BI 3 a été administréepar voie intrapéritonéaleà
raison de 0,1 ml par poulet. Il s'agit de sang
d'animauxmaladesconservéà - 180"C,
Cryptosporidies : Ces cryptosporidies
proviennentà I'origine d'un élevagede canardsde
Barbarie.Les oocystesont été isolésdes boursesde
Fabricius(BF) et ia souchea été entretenuepar des
passagessur poulets ou cannetonsEOPS tous les
deuxou trois mois.Les oocystesde C. baileyi ont été
conservésà +4oC dansdu bichromatede potassiumà
2Vo.Aa momentde I'utilisation,le bichromatea été
éliminé et le nombred'oocystesa été ajusté à2,5xLO6
par ml, après numération à I'aide des cellules de
Thoma. Chaquepoulet a reçu 0,2 ml, soit 5x105
oocystespar voie orale.
Avicole,Tours,8-10avril 1997
Deuxiùrues
louméesfu h Recherche
3- Critères étudiés
Excrétion d'oocystes de C. baileyi : D e s
prélèvementsindividuels desfientesont étéréalisésau
moins trois fois par semaine.Les oocystesde C.
baileyi ont été mis en évidenceet numéréspar une
de
méthodesemiquantitative,utilisantle saccharose
densité1,27.l-es excrétionsont été notéesselonun
scorede 0 à 5 établien fonctiondu nombred'oocystes
par champ microscopique(x250). L'équivalent de
chaquescoreen nombred'oocystespar grammede
fientesa étédéterminélors d'unessaipréliminaire(1 :
< r 0 5 , 2 : d e 1 0 5à 1 0 6 , 3: d e 1 0 6à 5 x 1 0 6 , 4 :d e
5x106 à 107,5 : > 107oocystespar grammede
fientes).
Suivi clinique : Des observationsquotidiennesdes
symptômescliniquesont étéréaliséeset les mortsont
Leslésionsmacroscopiques
étéidentifiéset autopsiés.
duesaux cryptosporidies
et/ouà la maladiede Marek
ont été enregistrées.Des prélèvementsde certains
organes(nerfssciatiques,trachée,poumons,reins,et
BF) ont étéeffectuéspour uneétudehistologiqueafin
de compléærle diagnosticde la maladiede Mareket de
mettre en évidence la présenceéventuelle des
cryptosporidiessur les coupeshistologiques.La
localisationdesC. baileyi a aussiété étudiéeà l'état
frais par raclage de la muqueuse intestinale
jéjunum,iléum,caecumet cloaque),de la
(duodénum,
BF, de la trachée,et surdesfrottis despoumons,foie,
reins, et sacsaériens.A la fin de I'expérimentation,
les animaux restant en vie ont été sacrifiés et
autopsiés.
Résultats
Lot A : Une atteinte de l'état généralavec un retard
de croissancetrès marquéont été notésà partir de J6.
Les poulets étaient faibles, anorexiques,prostrés,
plumes ébouriffées et souvent immobiles. Des
symptômesrespiratoiresgraves: toux, éternuements,
bruits respiratoireset halètements,ont conduit à la
mort tous les poulets entre J8 et 139 (Figure l).
L'excrétionparasitaireétait très élevéeet durablede
10"à l0' oocystespar gËrnmede fientesde J8jusqu'à
la mort de tous les poulets (Figure 2). 8l,8%odes
poulets sont morts avant I'apparitiondes premières
lésions de la maladie de Marek. Les résultatsdes
et
et histologiques)
autopsies(lésionsmacroscopiques
ceux de la localisationde C. baileyi à l'étatfrais sont
résumésdansles Tableaux1 et 2
Lot B : Les premiers symptômesvisibles de la
maladiede Marek sont apparusautourde J36 sous
forme d'anémie(pâleur des crêtes).La mortalité a
débuté à J55 et n'a été que de 27.3% à la fin de
(JSSXFigure
I'expérimentation
1). Tousles pouletsde
ce loÇ morts naturellementou sacrifiés,ont développé
des lésions spécifiques de la maladie de Marek
par deshypertrophiesdesnerfssciatiques,
caractérisées
du foie etlou de la rate et parfois du coeur, et des
tumeursdesnerfs,desgonades,du coeur,du foie et/ou
retroorbitales.Dans ce lot, les animauxn'ontjamais
excrétéde cryptosporidies,la morbiditévis-à-visde la
maladiede Marek a étéde lW%o.
Lot C : Une légère diarrhée et un faible retard de
croissancetransitoiresont été notés chez certains
sujets.L'excrétiond'oocystesa duré 18jours de J4 à
J2l et lors de I'autopsieà J58, aucunoocystede C.
baileyi n'étaitprésentsur tousles organesexplorésà
l'état frais. Aucunemortalité n'a éténotéedansce lot.
Lot D : Les 10 poulets n'ont jamais excrétéde
cryptosporidies,ni présentéde symptômesde la
maladiedeMarek.
I'IGURE 1: Mortalité cumuléedeslots A et B
#Lot
^
100
B
Lot A
tBo
\o
60
;40
b20
Ê
0
NCOOO)CDôI
Fôlôllf(O
âge en jours
Discussion
Les résultatsde notreétude,de I'associationdu virus
de la maladie de Marek inoculé à des poulets
Bl3Æ13 à la naissanceet de Cryptosporidium
baileyi inoculé 4 jours plus tard (J0) (Lot A)
révèlentun effet synergiquede I'associationdes2
agentspathogènes.C. baileyi inoculé seul,par voie
orale, aux poulets (Lot C) n'entraîne pas de
symptômesgraves.Comne I'ont indiqué d'autres
auteurs(Lindsayet Blagburn,1990)le parasitese
localiseexclusivementdansle cloaqueet la BF et
I'infectionpassele plus souventinaperçuesauf si
l'on examine les fientes. Le développement
de C. baileyi chezles pouletsdu
asymptomatique
Lot C s'accompagned'une excrétion d'oocystes
pendantI 8 jours de J4 à J2I avecun pic d'excrétion
à J10alorsquedansle Lot A I'excrétioncommence
aussià J4 maispersisteà un scoreélevéde 3 à 4,5
conespondanta tO6-107oocystespar grammede
fientesjusqu'àla mort desanimaux.Quelleque soit
la voie d'inoculation,les oocystesde C. baileyi
sont excrétéspendantune périodeplus ou moins
longue mais limitée. La durée des périodes
prépatenteet patentevarient en fonction de l'âge du
poulet et de la dose d'inoculation (Lindsay et
Blagburn, 1990, Rhee et al., 1995). Dans notre
étude,I'infection devientchroniqueet dure 39 jours
au lieu de 18jours montrantI'absenced'acquisition
d'immunitévis-à-vis de C. baileyi par les poulets
du Lot A. Dans les élevagesde volailles où C.
baileyi a été observéassociéà des problèmes
respiratoires parfois graves et même à de la
mortalité, d'autresagentspathogènessont souvent
mis en évidence.L'affinité de C. baileyi pour les
cellules épithéliales du tractus respiratoire a été
démontréeaprèsinoculationpar
expérimentalement
voiesintra-Eachéaleou intra-péritonéale(Currenter
al., 1986,Lindsay et Blagburn, 1990). Or, dans
176
FIGURE2:Cinétiqued'excrétionmoyenned'oocystesdeC.baileyi.Méthodedeflottation:1:<à1,
2 : de là 5. 3 : de 6 à 20.4 : de20à 30.5 : > à 30 ooc
ro5
,64
o
o3
E2
'6 +t--
$r
Eo
chezles pouletsdu lot A.
TABLEAU 1 : Lésionsenregistrées
'| Etude
de Nanæspar Y. CIIEREL
réaliséeà
Nbr de suJets
morts
Lésions
de JE à J15
:6
Petirctaille, cachexie,inflammation de la muqueuse Nerfs: RAS
buccale (aspectnoirâtre), uratesabondantsdansles
conduitsurinaires.
de J16 à
J2O z2
àJ25:1
àJ29:l
àJ39:1
Lésions llistologiques
Macroscopiques
*
Petitetaille, cachexie,inllammation de la muqueuse
buccale(aspectnoirâtre), uratesabondantsdans
les conduitsurinaires,néphriteaiguë:reins à aspect
encéphaloide.
Nerfs: RAS
BF: Picnosesunoul corticale,phagocytos€médullaire'
Hyperplasieet vacuolisationépithéliale, cryptosporidies#
TiÀchée: Hyperplasieépithéliale, cryptosporidiesr+r
Poumons:Conqestionléeùe.
Petiætaille, cachexie,inflammaion de la muqueuse
buccale (aspectnoirâtre), néphrite,mucus
abondantdansla trachée,paeumonie,transudat
dansla région thoracique.
Nerfs: RAS
BF: Inflammarionsévère,atmphie, cryptosporidies+*
Relns: Nécroseuretéraleet cryptosporidiesr++. Népfuose
multifocale. Petitesinfiltrations interstitielles.Présencede rares
crvotosooridiesdansde petir tubesacidophiles'
Petiætaille, cacbexie,inflammation de la muqueuse
buccale (aspectnoirâtre), sacsaériensopaques,
reins décolorés,mucusabondantdansla trachée,
oedèrnedespoumons,pneumonie,transudatdansla
région thoracique.
Petitetaille, rnaigre,mucusabondantdansla
trachée,oedèmedes poumons,transudatdu côté
thoracique,hypertrophiedes nerfs sciatiques,
tumeus du coeuret de I'ovaire.
nmbablement tumoral.
TABLEAU 2 : Localisationdesoocystesde C. baileyi (méthodede flomation).b : organes:
Lar : larynx,Tr: trachée,Pm: poumon,SA: sacsaériens,Cae:caecum,Clq: cloaque,- : non
++ +
++ +
+
+++
+++
+++
+++
+
+++
++
+
+++
++
+
++
+++
+
+++
+++
++
+
++
+++
notre étude,aprèsinoculation par voie orale, tous les
poulets du Lot A ont présentédes symptômes
respiratoiresgraves.Ces symptômessont apparustès
tôt (J6) et ont conduit à une mort précoce,de J8 à J39,
tous les pouletstandisqu'aucunsymptômeet aucune
mortalité n'étaientobservéschezles pouletsdu Lot C.
?
+
+
++
++
+
++
++
++
++
++
++
++
Les pouletsdu Lot A ne parviennentpasà éliminer le
parasite,aucontrafue,ce dernierinfested'autresorganes
et se multiplie plus intensément.Lindsay et
Blagburn, (1990) ont montré que ce parasite se
développerarement (<lOVo)dans la trachéeet les
bronchesaprèsune inoculationpar voie orale,L'état
immunitaire des poulets pourrait être la cause
principaledu développement
massifet continude C.
baileyi car le virus de la maladiede Marekinduit deux
phasesd'immunodépression
qui concernent
successives
surtoutI'immunité cellulaire (Schat,1996).De plus,
des poulets thymectomisés,inoculéspar voie orale
avec C. baileyi, révèlent une excrétion deux fois
supérieureen quanûtéet en duréepar comparaisonà
des témoins non thymectomisés,montrant le rôle
majeur de I'immunité à médiationcellulaire dans le
contrôle de la cryptosporidiose(Sréteret al. 1996).
Cetteimmunodépressiondue au virus de la maladiede
Marek pourrait donc favoriserle développement
des
cryptosporidies.
intenseet durable,
Ce développement
en I'absencede réinfection,pourraits'expliquerpar le
recyclagedesmérozoilesde type I et I'excystationdes
oocystessporulésà paroi mincein situ (Cunentet al.
1986). Naciri et al. (1989) ont obtenudes résultats
similaires avec Cryptosporidium sp. à tropisme
intestinal,associéégalementau virus de la maladiede
Marek. Chez les poulets du Lot A, I'infestation
massiveet précocedu tractusrespiratoireet I'invasion
du tractusurinaire à J.14 (non recherchéeavantJ14)
par C. baileyi laissesuggérerque les pouletsne se
sontpasinfectéstardivementpar inhalationmais que
la barrière immunitaire locale a été franchie.Notre
hypothèseestdifférentede celle de Lindsayet Blagbum
(1990)qui suggèrent
quela localisationdansla trachée
peut être liée à I'inspirationou I'inhalationd'oocystes
excrétésdansles fienteset dissipésdansI'air : dans
leur étude,et contrairementà la nôtre,I'infestationde
la trachée n'apparaîtque tardivement(17 et 19
joursPl).La localisationurinaireestûèsrare,elle a été
constatéechezun fringillidé (Gardineret Imes 1984),
chez un oiseau en captivité (Gallus sonneratii)
(Randall 1986) et une seule fois chez des poules
pondeuses
(Nakamuraet Abe 1988)maisn'ajamaispu
être reproduite expérimentalement(Lindsay et
Blagburn,1990).La sévéritéde la maladierespiratoire
augmenteconsidérablement
quandles cryptosporidies
sontassociées
à despathogènes
respiratoires
commele
virus de la bronchite infectieuseou les E. coli
(Blagburn et al. l99I). Dansnotre essai,despoulets
SPF ont été utilisés et maintenusen isolateurs,dans
des conditions bien contrôlées,empêchanttoute
contamination par d'autres agents pathogènes,en
particulier,ceux du tractusrespiratoire.Nos résultats
confirmentque l'infection par C. baileyi, inoculépar
voie orale, peut s'étendreà d'autresorganesque le
cloaqueet la BF, quandelle estprécédéed'uneinfection
par le virus HPRS 16. Lors de notre étude, nous
constatons IOOTode mortalité dont 81,87o sont
suryenusavantle développement
despremièreslésions
de la maladiede Marek et sont probablementdus à la
cryptosporidioserespiratoire.Un tel taux de mortalité
n'a jamais été observédansles conditionsnaturelles.
Ceci pourrait s'expliquerpar une chargevirale moins
importantedans les élevages,ou par le fait que les
poulets sont souvent vaccinés contre plusieurs
maladiesvirales.Cesproblèmespeuventsurvenirdans
le casd'un échecou d'unerupturede vaccinationdus à
unemauvaisevaccination(Naciri etMazznlla19E8)ou
à une infection par dessouchestrès virulentescapables
de franchir I'immunité vaccinale.Il est à noterquedans
les élevages,lors de I'infestationde la trachéepar ce
parasite, des pertes ciliaires totales peuvent être
observées(Lindsay et Blagburn, 1990) ce qui
prédisposeraient
à une invasionsecondairedu tractus
respiratoirepar d'autresagentscornmeles E. coli qui
profitent de la destructionde la barrière mucociliaire
pour exprimer une certaine pathogénicité. En
conclusion,sousI'effet d'uneinfectionpar le virus de
la maladie de Marek, connu par son effet
baileyi inoculé par voie orale
immunodépresseur,C.
infeste des sites inhabituelset exprime un pouvoir
pathogèneexacerbé.Cette étude montre I'importance
de mieux connaîtreces parasites,dont I'effet propre
resûediscuté.
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Vifs remerciementsaux équipes des Maladies à
et de Virologie et OncologieAviairesde
Protozoaires
I'INRA de Nouzilly.
178
INHIBITION DU DEVELOPPEMENT T',EIMERIA TENELLA ET DE TOXOPL./ISMAGONDII DANS
LES T'IBROBLASTESET LES MACROPHAGES DE POULETS ACTIVES PAR DES
SURNAGEANTS CONTENANT DE L'IFN-g
Quéré Pascalel, Dimier- PoissonIsabellC , Naciri Muriell, Bout Daniel2
IINIRA,Stationde Pathologieaviaireet de Parasitologie.37380Nouzilly .
2 UFR desSciences
Pharmaceutiques,Equipe
INRA. Laboratoired' ImmunologieParasitaire.
associée
3l avenueMonge.37200Tours
Résumé
Les Eimeria sont des parasitesprotozoaires,obligatoirementintracellulaires.qui infectent l'épithélium
intestinal.Bien que les mécanismes
de protectioncontreles coccidiosesaviairessoient encoremal connus-il
est désormaisétabli que I'immunitéà médiationcellulairejoue un rôle prédominantdansla défensede I'hôte
contrele parasite.Enparticulier,cornmepour les protozooses
des mammiferes.l'IFN-y pourrait être une des
moléculeseffectricesspecifiquesresponsablede cette protection.L'IFN-T recombinantaviaire n'étant pas
disponible,des surnageantsde culture de splénocr4esactivéspar de la ConcanavalineA ou d'une lignée
lymphoide transforméepar le virus de la Réticuloendothélioseont été utilisés comme sourced'IFN-y Après
traitementde macrophages
de moelleosseuse
et de fibroblastesembryonnaires
de pouletaveccessurnageants.
une inhibition du développementintracellulaire d' E. tenella ou de ?" gondii est observée.et ceci de façon
En conclusion.I'IFN-y par son effet inducteurd'une activité microbiostatiquesur certaines
dosedépendante.
cellules.pourraitjouer un rôle essentieldansla limitation de I'invasionparasitairedansle casde la coccidiose
avlalre
disponible Les surnageantsde splénoq'tesstimulés
par la Concanavaline A ou de lymphoqtes
Les coccidiosesaviairessont duesà des protozoaires transforméspar le virus de la réticuloendothéliose
du genre Eimeria, qui se dweloppent dans les
contiennentune activitéde typeIFN-1 (Kasperset al .
cellulesépithélialesde la muqueuseintestinale Elles
1994t Lowenthal et al. 1994) L'objectif de nolre
sont responsablesd'importantespertes économiques étude a été de déterminer I'effet in vitro de
en élevageindustriel. Les méthodesde lutte reposant I'activationpar ces surnageantsde macrophages
ou
sur la chimioprwention systématique,n'apportent de fibroblastesde poulet. sur la multiplication de
plus actuellement toute satsfaction, ce qui accroît
protozoaires. E. tenella elT. gorulii
l'intérétde la mrseau point de vaccinsen particulier
recombinants.La connaissancedes mécanismesde
l. Matériel et méthodes
défenseimmunitairesmis en placelors de I'infection
par Eimeria s'avèredonc être indispensable.Elle
1.1.Parasites
resteencoretrés fragmentaire.Toutefois,un certain
nombre de travaux souligne le rôle prédominant de
La souched' E. tenella utilisée est la souchesauvage
l'immunité à médiation cellulaire dans les
PAPI36, isolée au laboratoire des Maladies à
mécanismesde protection (Rose, 1982; Lillehoj,
Protozoaires et celle de T. gondii est la souche
1987). Plus précisémentau niveau du lieu de
sawagevinrlenteRH (Sabin,l94l).
mulûplication local intestinal, plusieurs études ont
évoqué une participation des cellules NK et des
1.2. Surnageantsde culture contenantde I'IFN1
lymphocytesT yô+ ou CD8+ dans la première ligne
de dèfense contre diverses Eimeria aviaires Les splénocytes
de pouletsPAl2 (Leghornblanche)
(Lillehoj.1989:Trout et Lillehoj. 1995;Rothwellet
(107 cellules par ml) sont stimulés par la
al.. I995)
ConcanavalineA (t0pg par ml) pendant 48h (Sn
Con A).Les cellules de la lignee lymphoblastoide
Presquerien n'est connu sur les cytokinesimpliquees transformeepar le virus de la Réticuloendothéliose
72h
(105 par nrlj sont cultvees pendant
dans la lutte contre la multiplication des Eimeriq
aviaires. Mais d'après la littérature sur d'autres (Sn RE$. Le milieu de culture est du RPMI
protozoairescomme Toxoplasmagondii (Susuki et
(Gibco) complété avec lo%o de sérum de veau
décomplémenté.
1993),
1988;
Dimier
Bout,
I'IFN-T
Orenalla,
et
pourrait jouer un rôle prédominant. Le gène de
I'IFN-T de poulet a été identifié @igby et Lowenthal,
1995).La protéine recombinanten'est toutefoispas
Introduction
DeuxièmesJournéesde la RechercheAvicole, Tours, &10 avril 1997
179
1.3.Culturescellulaires
Les macrophages
sont obtenusà partir de la moelle
osseusede poulets PAl2 agés de 12 jours par
adhérence sur plastique. Les fibroblastes
embryonnaires sont préparés à partir d'oeufs
embryonnés
de l0 jours
la présenced'IFN-y dans les surnageântsCon A et
REV, maisn'exclutpasla présenced'autresqtokines
commel'IFN-a/bet l'lL2
Les résultats de multiplication d'E tenella sur
macrophageset fibroblastesembryonnaires(Fig.l)
montrentune forte incorporationd'Uraciletritié après
48h de culture,ce qui signeune multiplicationrapide
1.4. Test de multiplication parasitaire et
et marquée du parasite La préincubation des
d'inhibition
macrophages
et fibroblastesavecles surnageants
Con
A et REV réduit considérablement cette
La proliferation parasitaire est évaluée par
incorporation.Ladilution minimale effectiveest de
l'incorporationd'Uracile tritié Les macrophages
ou
l/512 pour le surnageantREV et de l/256 pour le
les fibroblastessont mis à incuberpendant24 à 48h
surnageantCon A. Les surnageantspurs n'ont pas
dansdesplaquesde culture96 puits(2.5. 104ceilules d'effettoxiquevisible sur lescultures.Les résultatsde
par puits). Puis un prétraitementpar les surnageants multiplication de 7" gondii (Fig2) s'averenrêtre
Con A ou REV à diversesdilutions. est effectué similairespour le surnageantCon A. Par contreun
pendant 24h. Les sporozoitesd'E. tenellu ou les effet biphasiqueest observépour le surnageantREV.
tachl'zoôtes
de T.gontlii sontensuiteajoutés(5. 104 dont I'actioninhibitrice estvisible desdilutions l/4 à
par puits) et deux heuresplus tard- 0.5 pCi d'Uracile l/32 pour les fibroblastes,et desdilutrons l/8 à I/32
tritié (Amersham. activité spécifique 50 Ci par
pour les macrophages.Il est improbable que I'effet
nmole).Les culturessontprélevéessur filtre de fibre
inhibiteursoit du à un effetdirectde I'IFN-g, puisque
de verre 48h après.et la radioactivitéincorporéeest les cellulessontlavéesavantI'additiondu parasite.
déterminéepar un compteurà scintillation liquide
(LKB)
En conclusion,nos expériencesmontrent que des
macrophageset des fibroblastesde poulet. stimulés
1.5.Analysestatistique
par des surnageantscontenant une activité IFN-g,
possèdentune capacité microbiostatique.puisqu'ils
Les résultatssont expriméspar la mol'enne(SEM) inhibent la multiplicationd' E.tenel/a. specifiquedu
des coups par minutes de 3 mesures L'analyse poulet, mais aussi de T.gondii.Donc.ceci suggére
statistiquedesdifférencesentremovennesse fait par
que, dans la coccidioseaviaire (Kogut et Lange,
le testt de Student
1989) comme dans d'autres protozooses de
mammifères(Susuki et Orenalla, 1988; Dimier et
2. Résultatset discussion
Bout, 1993), fIFN-g pourrait être un médiateur
majeur de la résistanceau niveau local intestinal.
La présenced'une activité de rype IFN-g dans les D'autresétudessont nécessaires
pour déterminerla
surnageants
Con A et REV a étévérifiéepar 4 tests. significationin vivo de cephénomène.
qui. pris isolément. ne sont pas spécifiques.mais
dont la combinaisonpermet d'identifier celle-ci Le
Références
test d'inhibition de la multiplication du virus de la
permetune identificationd'une Digby
Stomatitevésiculeuse
M.R.,Lowenthal J.W..l995.J.Interferon
activité de type IFN. sanspouvoir distrnguerI'IFN-g
CytokineRes.,15.939-945
de I'IFN-aô.Nos surnageants
ont un effet inlubiteur DimierI., BoutD.. l993.Eur.J. Immunol.,23.98l
la
drlution
ll32.Le
test
d'induction de la
Kaspers8., Lillehoj H.S.,JenkinsM.C., Phar G T..
lusqu'à
production d'oryde nitnque par les macrophages 1994,Vet. Immunol Immunopathol..44.7 I-94
signeavecune forte présomptionla présenced'IFNKogutM.H., Lange,1989 J.Parasitol.
, 75, 317-320
g.l'IFN-aô n'étantpasactif. Le surnageantCon A est LillehojH.S., 1987.Infect.Immun.,55,1616-162l
positif jusqu'" la dilution l/32 et le surnageantREV
Lillehoj H.S.,1989.Infect.Immun.,57, 1879-1884
jusqu'à la dilution l/l28.Les deux surnageants LowenthalJ.W., York J.J.,Digby M.R., 1994.in:
induisentl'augmentationdesantigènesde classeII à
Advances in avian immunological research.
qui peut être le fait
la surfacedes macrophages,ce
(DavidsonT.F., BumsteadN.. Kaiser P.) Carfar,pp
d'autreslymphokinescommel'1L2. et I'apparitionde
179-186
ces mêmesantigênesà la surfacedes fibroblastes, Rose M.E., 1982. in: The biology of the coccidia
action assez spécifique de I'IFN-g.Enfin le test (Long P.L. edit.) University Park Press,Baltimore,
d'inductiond'une activité cyostasiqueactive sur les pp330-371
cellules de lignée transforméespar le virus de la
Rothwell L., Graminski R.4., Rose M.E.. Kaiser
maladie de Marek et médiéepar les macrophages, P.,1995.ParasiteImmunol.,17, 525-533
n'estpas exclusif de I'IFN-g. Les deux surnageants SusukiY., OrenallaM., 1988.Science,
240,516-517
induisentune inhibitionjusqu'àla dilution l/l6.Donc
Trout J.M., Lillehoj H.S., 1995.J.Parasitol.,79,790la positivité de ces4 testsest fortement en faveur de
792
180
FIGTIRE 1 : Inhibitionde I'incorporadon
d'uraciletritié parEimeria tenelladans
lescuirures
de macrophages
de moelleosseuseI ou de fibroblastes
embrvonnaires$l activésparles
surnageants
REV ou ConA à différentes
dilurions.Les résultacsonrexprimésparla moyenne
(SElvl)de 3 mesures.
IIs sontreprésenntifs
d'au-moinsrroise.rpériences
indépendanres.
CPM
ÉqS
t9
-tJ-
-
r-i
Sn ReV
CPNI
sæË
==s
Sn Con A
sE ç
_e= F
É
t8l
FIGURE 2 : Inhibition de I'incorporationd'uraciletritié par To.roplasma
gondii dansles
culturesde macrophages
de moelleosseuse
I ou de fibroblastesembryonnaires
$l acdvés
par les surnageants
REV ou ConA à différentesdilutions.Les résulrarssonr.*pri*-., par
la
moyenne(SEM) de 3 mesures.Ils sont représentatifs
d'au-moinsrrois expériences
indépendantes.
CPM
2000
OOÉNtfæ\Oôlçæ
XX\.\.\.Fi(t)\Côl
êoFrFFi\'\'\'
-FlF-\.
t
+
-
SnRev
CPM
5000
OOFrôlçæ
xx\.\\.
OOÉÉFÉi
!+sn
\e
r-l
ôl
(1
\.
\.
Ft
t-{
ConA
çæ\oç
\o
ôl
\.-ôlO
\\
rn
êl
\
F
182
ETUDED'UNE METHODED'EPRETIVE
POUREVALUER
L'EFf,'ICACITED'UN VACCINANTICOCCIIIEN POURLE POULET
RaymondB.lVilliams
Mallinckrodt Veterinary Limited, BreakspearRoad South,Harefield,
Uxbridge, Middlesex UB9 6LS, United Kingdom
Résumé
Au coursde cesdernièresannées,desvaccinspermettantle contrôle de la coccidiosedespouletssont apparus.
Compte tenu des problèmes croissants de résistanceaux anticoccidiens, leur utilisation ra certainement
s'étendre.De ce fait, il est important de mettre au point des méthodesvalablesd'évaluaûon de I'effrcacité de
ces vaccins. Precédemment,les scores lésionnels ont souvent été employés pour estimer I'effrcacité des
substancesanticoccidiennes,mais nous savonsmaintenant que, chez les poulets partiellement ou totalement
immuns, une infection d'éprewe peut entraîner des lésions coccidiennessans produire d'effets cliniques
défavorables.Dans ce contexte,une techniqued'épreuve s'appuyant,en tant que critère essentielde mesurede
la protection anticoccidienne,sur le taux de croissanceaprès épreuve, a été développee.Des résultats de
conûôle de I'efficacité du vaccin Paracoxru(Mallinckrodt Veterinary Limited) sont présentésà titre d'exemple
de cetteméthode.
Abstract
A challengemethodfor assessing
the efrrcacyof anticoccidialvaccinesfor chickens
In recentyears, sweral vaccineshavebeen introduced for the control of coccidiosesin chickens.Their use is
likely to becomemore widespreadin view of the increasingproblemsof drug resistanceto anticoccidialagents.
It is important, therefore,to developvalid methodsfor the assessmentof efrcacy of vaccines.Lesion scores
haveoften beenusedto assessdrug efficacy,but it is known that in partially or completelyimmune chickensa
challengeinfection may induce coccidial lesionswithout causingadverseclinical efrects.A challengemethod
has thereforebeen developedwhich uses growth rate after challenge as the primary criterion for protection
againstcoccidioses.Resultsare presentedto show how the methodmay be usedto demonstratethe effrcacyof
ParacoxrMvaccine(Mallinckrodt Veterinary Limited).
(Long et coll., 1980),ce critère utilisé seul n'estpas
appropriéaux vaccins.
Introduction
Au cours de ces dernièresannées,quelquesvaccins
permettant le contrôle de la coccidioæ des poulets
sont apparus. Il est probable que leur emploi va
s'étendreface aux problèmescroissantsde résistance
aux agents antcoccidiens. Au cours du
dweloppement du vaccin atténué PatacoxrM
(Mallinckrodt Veterinary Limited), il nous a été
necessairede mettre en place une méthode de
démonstrationde la protection apporteepar le vaccin
contrela coccidioseclinique.
Pour
les
substances antcoccidiennes, la
démonstrationde I'efficacité a pu utiliser, dans des
essaisen parquet et sur le terrain, la sevérité des
lésions observeessur les poulets. CÆttes€vérité est
étroitementconéleeau oontrôlecoccidienapportépar
ces substances.Mais du fait que, chez les poulets
partiellement ou totalement immuns, des lésions
coccidiennespewent suwenir, en réponse à une
éprewe, sansentraînerd'effetscliniques indésirables
C'est pourquoi si aucun autre critère n'est pris en
considération,les oiseauxvaccinésqui présententdes
lésionspourraient injustementêtre considéréscomme
atteints d'une coccidiosesévère.C'est pour cela que
l'état clinique des oiseaux, particulièrement leur
performance de croissance, doit êue le critère
essentiel de jugement. lvlalheureusement,s'il est
possible de démontrer par comptage des oocystes
dans la litère ou par testsELISA que les pouletsont
été infectés, seule l'épreuve par des coccidies
vinrlentes peut apporter la certitude que les oiseaux
sont protégés@ntre la coccidiose.
Pour ces raisons, nous avons développeun contrôle
de la protection s'appuyantsur le taux de croissance
comparatif après éprewe vinrlente des poulets
vaccinés et non vaccinés. Contrairement à d'autres
critères variés tels que la mortalite, les scores
lésionnels, les scores fécaux, les hématocrites, la
DeuxièmesJournées de Ia RechercheAvicole, Tourc, 8'10 awÛl1997
producûonoocystale,etc., ce cntère permetà la fois
la comparaison
de I'immunitédesoiseauxvis-à-visde
I'ensembledes es$ces et reflète leur statut clinique
fondamental.
Méthodes
Ce protocole d'épreuve a été employe séparément
pour trois lots diftrents de vaccin anticoccidien
ParacoxrMde productioncommerciale.Les grandes
lignes en sont les suivantes: des poussinsd'un jour
Lohmann Brown (200de chaquesexe,sansaucune
vaccinaûon) nous sont parvenus d'un producteur
commercial.Deux cent vingt (ll0 de chaquesexe)
ont été placésau sol à une densiténormaledansdes
parquetsdésinfectés
et surune litière de copeaux.
Leur I'alimentation et leur eau de boisson ne
ni facteur
contenaientni substancemédicamenteuse,
de croissance.Pour les conserver indemnes de
coccidies,les autrespoussinsont été placésdans un
autre bâûment désinfecté à I'intérieur de cages
équipeesd'un plancherplein recouvertd'une litière.
Les soins aux animaux ont été assurés par du
personnel différent pour les deux bâtiments. Les
poussinsen parquetsont été vaccinésà 6jours d'âge
avec le vaccin antcoccidien ParacoxrM.La prise
r,'accinalea été confirméepar comptagedes oocystes
dans des echantillons de litière récupérés à 7 et
l4jours aprèsvaccinaûon.Pour confirmer que les
oiseaux restaientbien indemnesde coccidies,les
fècesdes poussinsen cagesont été contrôlés2 fois
par semaine Quand les poussinsont eu 34jours
d'âge(4 semainesaprèsla vaccination),une épreuve
virulente a été mise en place pour contrôler leur
protection contre I'ensemble des 7 espèces de
coccidies contenues dans le vaccin (Eimeria
acervulina. E. brunetti. E. maxima, E. mitis,
E. necatrix,E. praecoxel E. tenella).
Pour l'épreuve virulente, les oiseaux provenant des
parquetset des cagesà plancher plein ont été mis
dans des cages à plancher gnllage dans un
3èmebâtiment désinfecté et dont I'entretien étart
encoreassurépar du personneldifférent. Avant qu'ils
soient placés dans leurs nouvelles cages, tous les
oiseaux vaccinés proverurnt des parquets ont été
individuellementbaguésà I'aile et pesés,puis mis en
lot de façon à ce que les poids moyens soient
approximativementéquivalents. Les oiseaux élevés
indemnesde coccidiesont étébagués,peseset mis en
lot de la même mamère. Pour chaque espèce
coccidienned'épreuve,il y avait 3 lots de traitement.
Les contrôles absolus étaient représentés p:u
20 oiseaux indemnes de coccidies (10 de chaque
sexe)provenantdescages: cestémoinsnon éprouvés
non vaccinés (TNN) ont été repartis entre les
7 espècescoccidiennes.Pour chaqueespèce,il y avait
un autrelot de 20 oiseauxindemnesde coccidies(10
de chaque sexe) provenant égalementdes cages:
c'était les 7 lots de témoins éprouvésnon vaccinés
(TEIII) Enfin, pour contrôler I'immunité vis-à-ns de
chaque espèce,7 lots de 20 oiseaux (10 de chaque
sexe) provenant des parquets: c'était les oiseaux
éprouvésvaccinés(E9. De ce fait, pour chacunedes
7 espècescoccidiennes,il y avait 3 lots de traitement,
chacun de 20 oiseaux, avec des poids moyens
approximativementéquivalents.
Chaque souchevirulente des 7 espècesde coccidies
utlisées pour les épreuvesa été préalablementtitrée
en utlisant desoiseauxLohmann Brown, de manière
à déterminerle nombred'oocystessporulésnécessaire
dans chaqueinoculum pour entraîner une réducton
statistiquement significaûve (p < 0,05) du gain de
poids au coursde la semainequi suivait I'infectron.
La dose appropriéede chaqueespececoccidiennea
été donnéeà 20 oiseauxTEN et à 20 oiseauxEV : les
oiseauxTNN n'ont pas été infectésmais ont reçu un
placebo d'eau. Sept jours après l'épreuve, tous les
oiseauxfurent pesésà nouveauet leur gain de poids
après épreuve a été calculé individuellement. Pour
chaqueespèce,le gain de poids moyendes 3 groupes
de traitement (TNN, TEN et EV) a été comparépar
analyse de variance et test de Tukey. En plus du
critère essentiel de gain de poids, les lésions
d'Eimeria acervulina. E. brunetti, E. mæima,
E. necatrix et E. tenella ont été cotees selon la
méthode de Johnson et Reid (1970) de manière à
contrôler si ce critère reflétait ou non la santé
clinique desoiseauximmuns. Ceci n'a paspu être fait
pour E mitis et E. praecox qui n'entraînent pas de
lésionsdansles atteintesdiscrètes.
Résultats
Les résultatsobtenusont été similaires pour chacun
des 3 lots de vaccin PalacoxrMconûôlés.Pour chaque
espècecoccidienne, le groupe TEN a présentéun
gain de poids significaûvementplus bas que celui du
groupeTNN, ce qui a confirmé le caractère
pathogènede l'éprewe. De plus, chaquegroupeEV a
eu un gain de poids significativementplus élevé que
celui du groupeTEN, confirmant que les oiseaux
vaccinés étaient immuns vis-à-vis de l'épreuve
virulente par chaqueespece.Dans la plupart des cas
(17 sur 2I), il n'y eut pas de différence
statstiquement significaûve entre les gains de poids
des gloupesEV et TNN montrant que les oiseaux
vaccinés ont exprimé leur taux maximal de
croissance.A tiûe d'exemple,le tableauI résumela
comparaisondes gains de poids pour I'un des lots de
vaccinconEôlés.
184
TABLEAU I : Gain de poids pendantles 7 jours suivantl'épreuved'oiseauxvaccinés(ED et non vaccinés
(TEN) expriméen pourcentage
destémoinsnon éprouvésnon vaccinés(TNNI Dans lescolonnes,les gainsde
poidspartageantla mêmelettre ue sontpasdifférentsd'unemanièrestatisûquement
significative(p > 0,05) les
uusdesautres.
Groupe
Espècesd'Eimeri a d'épreuve
acen'ulina
TNN
EV
TEN
100%oa
99%oa
74Yob
brunetti
maxtma
IOOoÂa
lO7 %oa
t7 0Âb
IOOYoa
109oÂa
51Yob
Fréquemmentil a été noté que les scoreslésionnels
auraient pu induire des résultats erronés. Par
exemple,un grouped'oiseauxvaccinéséprouvéspar
Einreria brunetti (tableau2) a obtenu IOÛp o/o
(femelles)et 98.0% (mâles)du gain de poids des
témoinsnon éprouvésnon vaccinésmalgré que45 oÂ
desoiseauxprésentaient
deslésionsde scoreI ou 2.
Il n'y avait pasde corrélationentreles gainsde poids
necatrix
IOOoÂa
lO3 Voa
650 b
IOO%oa
96 o/oa
40Âb
praecox
1ù0oÂa
ll0%oa
75Yob
tenella
l00/oa
ll2Yoa
34%ob
moyens et les scores lésionnels des oiseaux à
l'intérieur de chaquelot de traitement. Les femelles
les plus lourdesavaientdeslésions,mais les femelles
les plus légèresn'en avaientpas. Parmi les m.âles.le
gain de poids moyendes oiseauxavecdes lésions de
score2 était plus important que le gain moyen de
ceuxavecdesscoreslésionnelsde l. Tousles oiseaux
du lot TEN présentaientdeslésionsde score3 ou 4.
TABLEAU 2 : Absencede conélation entre les scoreslésionnelset les gains de poids desoiseauxvaccinés
pendantTjours aprèsépreuvepar dessouches
virulentesd'8. brunetti.
Scoreslésionnelsfemelles
Gain de poidsindividuel(g)
du lot EV
tL2
114
t29
14l
t46
t22
129
134
150
126
Gain de poidsmoyen(g)
t28.4
133,8
126.0
Moyenneglobale(g)
(en% de TNN)
La même conclusion globale peut être tirée des
donnéesconcernantE. maxima présentéesdans le
tableau3. Dans ce cas. les oiseaux vaccinés
présentant les scores lésionncls lcs plus élcr'és
présentaient
lesgainsde poidsmoyensles plus élevés
130.3
100.9010
Scoreslésionnelsmâles
150
t74
182
184
201
178,2
r 35
157
142
145
186
146.0
1s7,7
165,6
98.ÙYo
à la fois pour les mâleset les femelles.Les oiseaux
les plus lourds et les plus légersne présentaientpas
de lésions.A nouveau,tous les oiseauxdu groupe
TEN présentaient
deslésionsde score3 ou 4.
I85
TABLEAU 3 : Absencede corrélationentreles scoreslésionnelset les gains de poids desoiseauxvaccinés
pendant7 jours aprèsépreuvepar dessouches
virulentesd'E.mæima.
Scoreslésionnelsfemelles
Scoreslésionnelsmâles
012012
Gain de poids individuel (g)
du lot EV
Gainde poidsmoyen(g)
108
t23
Lt7
r24
138
r49
I28
132
l3s
127,2
t29,5
Moyenneglobale(g)
(en % de TNN)
Il en est conclu que le critère de gain de poids
pendant les Tjours suivant l'épreuve par des
souches de coccidies virulentes démontre
I'immunité des oiseaux contre les coccidioses
provoquées par l'ensemble des 7 espèces qui
parasitentle poulet.Quoi qu'il en soit, si I'absence
de lésionschezles oiseauxvaccinéspeut toujours
être considéréecornmeune démonstrationde la
protection,il doit être noté que la présencede
143
157
165
1,67
170
205
170
172
185
192
180
143,0
t72,8
179,8
180,0
129,7
98,6yo
t76,3
101,8%o
lésions n'indique pas obligatoirementune absence
deprotecûonenversunemaladieclinique.
Références
JohnsonJ., Reid W.M., 1970. Exp. Parasitol.,28,
30-36.
LongP.L., JohnsonJ.,WyattR.D., 1980. Poult.
Sci.,59,2221-2224.
t86
EFFICACITE IN WTRO DE DIFFERENTS PRODUITS,A L'ENCONTRE DE TETRATNCHOMONAS
GALLINARUM. COMPARAISON AVEC LE DIMETRID AZNLE.
ReynaudMarie-Ctaudet, PascalonAnnette r et ChauveClaude I
I
Equipe associeeLN.RÀÆ.N.V.L., Laboratoire de Parasitologie,EcoleVétérinaire de Lyon,l, avenue
Bourgelat,692t0 MARCY L'ETOILE, FRANCE
Résumé
L'efficacité de diftrents produitsà I'encontrede Teffanichomonasgallinc,rum a été testeein vitnt et comparée
à celle du dimétridazole. Le Water-treet, le détartrant-acidifiantainsi que le complexe d'extraits d'huiles
essentiellesparaissent les plus efficaces. La Tiamutine 2O Vo et l:oxytétrasycline HCI agisænt aux
concentrationscorrespondantà leur posologle.Le dimétridazolerestecependantle produit le plus effrcace.
Abstract
Effectivenessof different medicinestested in vilro against Tûrstrichomonas gallinarum.
Comparisonwith dimetridazole.
The efrectivenessof different drugs against Tetratrichomonasgallinarum has been tested in vitro. and
comparedwith dimetridazole.Water-treet." detartrant-acidifiant" and the mixing of extractsfrom essential
oils seemto be more effective than Tiamutine 2OVoand oxvtetracvclineHCl. Dimetridazole is still the most
effectivednrg.
additionné à la dose de 0,12 mg par ml pour
l'isolement.
Introduction
Le dimétrinezoleest un médicamenttrès effrcace
contreles flagellés.Jusquàson interdiction, il était
très utilise dansles élevagesde canardspour lutter
contre le " syndrome flagellé ". Ce qyndrome
apparaît dès la troisième semainede la vie avec
une aggravation au moment du gavage, il se
manifesæpar de I'apathie suivie de nervosité,.du
pica et des troubles entéritiques.Le traitement au
dimétri'lazole fait disparaître ces troubles. Le
dimétridezolea été interdit en tant que traitement
le 23.09.95,par contre, il reste autoriséen tant
qu'additif pour le moment.Il devient necessairede
trouver dessubstances
susceptiblesde le remplacer.
L'objet de cette énrde est de tester in vitro
I'effrcacité de divers produits à I'encontre de
Tetratrichomonasgallinae. Ces produits utilisés
pour
indications
pourraient
d'autres
eventuellementremplacerle dimétridazoledans le
tmitementde la trichomonosedu canard.
L'observaûon des caractèresmorphologiquesdes
flagellés isolés permet de les identifier oomme
Tetratrichornonasgallinarum. Ensuite I'entretien
de la soucheest assurépar deux repiquageschaque
semainesur les milierrx décrits precédemmentet
conservation
en étuveà37"C. La cultureprécedant
immédiatementla réalisation des testsest toujours
effectueesansantibiotiqueet_lenombrede flagellés
par ml estde I'ordre de 2.106pour chaqueessii.
1.2.Milieux d'épreuve
Selon les différents produits à tester, trois milieux
sont utilisés pour realiser le contact avec les
flagellés:
- Milieu diphasique(milieu de Dobell et Laidlaw)
- Milieu M. 199 enrichi, dont la compositionest la
suivante;
l. Materiel
l.l. Flagellés: isolementet entretien
La sourcede flagellés est consttuee par les fientes
de canards Pékin Anas plat-whynchos, infectés
naturellement.Les isolementssont réalisessoit sur
milieu diphasique(milieu de Dobell et Laidlaw).
soit sur milieu liquide M. 199enrichi;en raisonde
l'importancede la contaminationbactérienneun
antibiotique. le chloramphénicol. est toujours
yo
...........75
f M. 199sansbicarbonate
yo
poulet
75.
Ertrait
d'embryon
ultra-filtrat
..5
de
f
yo
.........10
I Sérumde chevalinactvéà la chaleur..
yo
I Ringerserum(amidonde riz : 12 mg/ml).....lO
- Milieu M. 199 enrichi et additiorné d'agar à
l/1000.
187
Deuxièmcs Journées de la Rechcrchc Avicole, Tours, 8-10 avril 1997
1.3. Différents produits testés
l. Tiamutine 20 Vo Posologie indiquee: 100
mg/kgljour(soit 20 mglkgljourde produitpur).
2. Lincomix ll0. Posologie indiquee: 45
mg/kgljour (soit 5 mg/kgljour de produit pur).
3 Oryétracycline HCI Posologieindiquée: 50
mg/kg/jour.
4. Sulfaquinoxalinesodique.Posologieindiquée:
80 mglkg/jour
5. Détartrant-acidifiant.
Posologieindiquée: 2 à 3
ml par litre d'eaude boisson.
6 Water-lreet.Posologieindiquee2 à 3 ml par litre
d'eaude boisson.
7. Dehem P (complexe d'exûarts d'huiles
essentielles).
Posologienon précisée.
8. DimélridazoleDMZ 30 Coophavet.Posologie
indiquée: 50 mg/kg/jour (soit 15 mglkg/jour de
produitpur). Ceproduitservirade référence.
Pour le complexed'extraitsd'huilesessentielles,
le
choix des concentratonsest indépendantd'une
posologiequi està déterminer.
2.2. Réalisationdestests
Mis à part les tests concernantle Water-treetet le
complexed'huiles essentielles,
tous les tests sont
réaliséssur le milieu diphasique.L'effrcacité du
Water-treet a été recherchéesur le milieu M 199
enrichi et I'effrcacité du complexe d'huiles
essentielles
sur ce mêmemilieu additionnéd'agar
à l/1000 qui permetde stabiliserl'émulsion.Tous
les tests sont réalisés en double. et pour chaque
série, deux tubes Témoin sont préparés.Tous les
tubes sont ensemencés avec une suspension
homogènede Trichomonas,de fgeon à obtenir une
concentrationde I'ordre de 2.10' Trichomonaspar
ml. Les tubessont incubésdansune étuveà 37oC
pendant24 heures.
2. Méthode
2.3. Lecture
2.1. Choix desconcentrations
Pour 5 desproduits,les posologiesindiquéessont
expriméespar kg de poidsvifet parjour et pour les
produits liquides (détartrant-acidifiantet Watertreet) par litre d'eau de boisson,les animau-xétant
traitésplusieursjoursde suite.
Pour déterminerles concentrationsà étudier in
vitro, 1l a fallu proposerune correspondance
entre
la posologiepar kg de poidsvrfet la concentration
en produit par ml de culture.Nousavonschoisi la
correspondance
suivante: n mg par kg de poids vif
équivalant à n pg par ml de culture (ce qui
constituela plus faible concentrationétudiée= C).
Pour déterminer la concentration théorique
maximum (C.T.M.) atteinte dans I'intestin après
adrninistration du produit à la posologie
recommandée,Vuillaume et Panko (1993) font
intervenir,non pâsle poidsvif de I'animal. maisle
poids du contenuintestrnal.ce qui donneen théorie
pour un animal de 7 semaines(choix arbitraire)
pesant 3 kg, un poids de contenu intestinal
d'environ 15 g. soit un rapportde 200. Ce rapport
nous amèneainsi à proposerpour notre étude in
vitro qve n mg par kg de poids r.if correspondeà
200fois n pg par ml de culture(C.T.M.:200 C)
Pour le détartrantacidifiant et le Water-treet.nous
ne connaissons
pasla posologiepar kg de poidsvif
et par Jour, nous I'avons évaluéeen considérant
qu'un canardde 7 semainesconsommant0.5 litre
d'eauparjour. reçoit 1,5ml de détartrantacidifianl
ou de Waler-treelpar.jour(posologie
choisie3 ml
par litre d'eau de boisson) Excepté pour le
complexed'huiles essentielles.
les concentrations
de produit étudiéespar rnl de culturc sont les
suivantcs
c. c x 10.c x 100er c x 200(= c T.M.)
A la fin du temps d'incubation.le comptageest
effectuéà I'aide de la cellule de Malassez.Le
pourcentaged'efficacité du produit est calculé par
rapport au nombre de Trichomonas vivants
comptésdansles hrbesTémoin.
Lorsque la lechre est négative, I'absence de
Trichomonasvivants est confirméepar une culture
de contrôle.
3. Résultatset discussion
Les résultatsobtenuscorrespondentà la moyenne
des lecturesde deux tubes.Ils sont regroupésdans
lestableauxI et 2.
Les culturesde contrôledestinéesà confirmer une
effrcacité de 100 o se sont toutes révélées
négativesau termede 24 heuresd'incubation.
Pour qu'un produit mérite d'être retenu,il faut que
I'on puisseobtenir une efficacitéde 100 7o à une
drlution compatibleavecla posologieutilisée chez
lesanimaux.
Le dimétridazole,produit connu pour son efficacité
à I'encontredesTrichomonasestactifà 100% dès
la plus faible concentrationtestée.Lbffrcacité 100
%oin vitro est obtenuepour 5 des produits testés:
Water-treet,détartrant-acidifiant,Tiamutine 20 %o,
orytétraryclineHCI et complexed'extraitsd'huiles
essentiellesmais à des concentrationsdifférentes.
En efiet le Water-treetest effrcaceà 100 % dès la
concentrationde 5 prl/ml (C x l0), le détartrant
acidifiant à une concentrationl0 fois plus élevée
(C x 100) mais la Tiamutine 20 Y. et
I'oryétrarycline HCI ne sont efficacesà 100 %
| 8ti
qu'à la concentrationthéorique maximum (C x
200). Le complexed'huiles essentellesprésente
une efficacité de 100 o/o à une concentration
relativementfaible : 1/3000.
résultats sont diffrcilement interprétables, ceci
étant probablementlié à satrès mauvaisesolubilité.
En conclusion, le dimétrida'ole reste le plus
efficace in vitro, cependant des études
complémentarresseraient à envisager pour au
moins 2 des produits testés: Water-treetet hurles
essentielles.
Pour deux des produits testés (sulfaquinoxaline
sodiqueet Lincomix 110) une efficacitéde 100 %
n'est jamais obtenue.Pour le Lincomix I10. les
TABLEAU 1. Pourcentages
d'efficacitédesprodurtstestésûzvitro à I'encontrede Tetratricho,nonas
après24
heuresde contactaux différentesconcentrations.
Produit testé
C
Cx10
Cx100
Tiamutine20 %
0,1mg
0Yo
0,045mg
20,80Â
0,05mg
62.50Â
0,08mg
lmg
44.5Yo
0,45mg
l0 mg
99.5Yù
4,5mg
64-t oÂ
)mg
99.5Yo
8mg
10.3Yo
50 pl
IOOYo
50 pl
100%
5mg
100Yo
Cx200
c.T.M.
20 mg
100Yo
9mg
56.'l Yo
10mg
L00Yo
16mg
t)
Lincomix I l0
OxwétracvclineHCI
Sulfaqurnoxaline
sodioue
Détartrant-acidifiant
Water-treet
Dimétridazole
DMZ30
0 o/o
0.5 mg
85.2Yo
0,8 mg
0Yo
5pl
25.90Â
5pl
100%
0,5 mg
100Yo
00Â
0,5 pl
0Yo
Cx2:lpl
gs',yo
(z',,
0,05mg
r00 yo
40 0Â
100pl
lO0 Vo
100pl
100%
l0 mg
I00 0Â
(l) Lesconcentrations
sontexpriméesen mg ou en pl par ml de milieu.
(2) Pourle Water-treetla plus faible dosetestée: C x 2
TABLDAU 2. Pourcentage
testéin vitro à I'encontre
d'effcacité du complexed'extraitsd'huiles essentielles
de Tetratrichomonas
après24 heuresde contact
Concentration
efficacité
l/3000
t00 vo
1/4500
99.5Yo
l/6000
43 Yo
Références
ReynaudM. Cl., ChauveC.M., 1987,Bull. Soc.Fr.
Parasit..5- 16'7-174.
VuillaumeA., PankoA., 1993, Bull. Acad. Vét
de France.66-87-93.
1/9000
34%
l/12000
0Yo
r/15000
34 0Â
l/18000
25 o/o
ENQUETES SEROLOGIQUES ET PARASITAIRES SUR LA PINTADE
EN ELEVAGE VILLAGEOIS AU BENIN
oJ-P'wertheimer
tc. chrysostome,'P.
Allard.'F. Demey''J G. Bell.
'gNlvERStTe NATIONALE DU BENIN - FacultédesSciencesAgronomiques- B-P 526 CotonouBENIN
.tNsTt1-t-lt DE MEDECINETROPICALE- Nationalestrnnt.l55 2000Antwerpen.BELGIQUE.
,wSrtrur AGRONOMIeUEET VETERINAIREHASSAN II - B P 6202.RabatInstituts.MAROC.
'SYI,IBIOLAB - 38. rue JulesSimon- 37000Tours.FRANCE
Résumé
de 9l sérumssanguinset d'examenscoprologiquesde 135 échantillonsde
A partir d'analysessérologiques
parasitisme
,rruiièr", fécalei. h prévalJncède certainesmaladiei infectieusesa été étudiéeet un inventaire du
destrtres
aucun
ayiairede la pintadéélevéeen milieu villageoisa été effectué.Pour la maladiede Newcastle.
un seul
sérums'
9l
les
(1.09).
Sur
des sérumstestésne dépassent5. avecune moyennegéométriquefaible
infections
des
avec
règle'
de
est
échantillon érait positif pour Salmonellapullôrum. ie potl'pàrasitisme
mo\ennesà élevéespour les ascariset les coccidies.
Summarl'
Serologicaland Parasitical surveyson Guineafowl
at village level in Benin
was studiesfrom 9 t serumsamplesfrom villleS guineafowls and an
The prevalanceof two infectiousdiseases
rvere
ilr.enton of parasitesu'ascarriedout from 135 facealsamples.No antrbodytitres for Newcastledisease
for
titre
antibody
positile
a
had
9l
sera
of
grearertiian i. The geometricmeanwaslow (1.09).One sampleout
and
of
ascaradia
infection
high
to
moderate
a
SalnonellapulloruÀ. Inrernalpollparasistismis significanrwith
coccidia,
dépasse2()pour cent durantle premiermois aprèsla
naissutt"e"s'amplifie à la suitedesdégâtscauséspar
peu
Pour pallier le déficit alimentaire en protéines les prédateurs de toutes sortes Il existe
de
pathologiques
animalesdans les palrs en voie de développement. d'informationssur les dominantes
c'es1
Béuin'
au
traditionnel
l'accent est souventmis sur le développementdes la pintade en élevage
d'analyses
l'intermédiaire
par
espècesà rycle court. Parmi celles+i. les espèces pourquol.
dans des
hasard
pris
au
sanguins
aviaires en milieu vrllageois assurentla majeure d'échàntittons
de
prévalence
[a
sur
étude
une
I'Atacora.
de
villages
partie du ravitaillement des populations en Afrique
a
été
la
salmonellose
de
et
Newcastle
de
ta
matadie
subsahélienne.Les informations disponiblesdans ce
nous a
secteurau Bénin sont rares. Dans les pays voisins décidée.Par la même occasion' l'enquête
le
sur
conduit à apporter une connaissance
lorsqu'ellesexistent,elles traitent beaucoupplus de
la
établissant
en
parasitismede cetteespeceaviaire.
l'élelage de la poule. Certainesespècescomme la
cause.
liste destypesde parasltesen
pintade et le canard sont pourtant présentesdans les
Bénin
du
Dans
la
région
septentrionale
basses-cours.
Matériel et méthode
la pintade est appréciée pour la qualité
de sa chair, de sesoeufsqui sont par
organoleptique
queles oeufsde la poule Quatrevingt onze(91) sérumset les matièresfécales
ailleursplus commercialisés
dè centtrentecinq (135)pintadesadultesde la région
locale. Si les disponibilitésalimentarresdu milieu
nord-ouestdu Bénin ont été examrnés'Ces pintades
les
villageois sont favorablesà l'élevage extensif.
étaientprisesau hasarddars desélevageséloignésle
risques sanitaires constituent le principal frein au
plus possibleles uns des autreset situésdans quatre
développement de I'aviculture traditionnelle. La
agricolesdifférents' Cesanimaur n'ont subi
i..t"*t
pintadejouit d'une grande réputation de rusticité en
aucun traitement ni aucune vacccirntion' Les
ce qui concernesa résistanceaux maladiesquandelle
analysesserologiquesde la maladiede Newcastleont
est exploitéesur le mode fermier traditionnel. Mais.
été effecnréesà I'aide du test de I'inhibition de
commele soulignenttous ceux qui s'intéressentà ce
selonAllan et Gough.(1911)' La
rype d'élwage (Verger. 1986) la perennité de ces I'hémagglutination
le
Salmonellapullorum est faite par
contre
recherclie
troupeauli demeurealéatoire en raison d'une forte
sur lame (Blaxlandet coll''
rapide
séro-aggluûnation
mortalité qur dépasselargement 50 pour cent. Elle
Introduction
IJ
DeuxièmesJournées de la RechercheAvicole, Tours, 8-;'0 avril 1997
I95tt) utilisant des antigènes du laboratoire
départemental des Côtes d'Armor (Ploufragan) Pour
les examens coprologiques. une flottaison (chlorure
de sodium à saturation) est pratiquée sur les matières
fécales récoltées.L'énumération des ookysteset les
oeufs d'helminthes a été réaliséepar les techniques
définies par Troncy (19'77) et Thienpont et coll
(1979) Les trichomonas ont été examinés seulement
quantitativement
Résultats
Le tableau I indique les résultats des analyses
sérologiques de la maladie de Newcastle Aucun des
titres des sérums testés ne dépassent5 La moyenne
géométrique obtenue sur l'ensemble des sérunrs est
alors très faible et égaleii l.(X)
Eu ce qul concerne les anall'ses sérologiques de
l'infection Salmonellapullorum. les résultatsmettent
en ér'idencela présenced'anticorps agglutinantschez
une pintade sur un effectif total de 9l soit l.l 'Zr de
l'effectif
Du point de vue parasilaire. le tiùleau 2 des
fréquencesd'infestation moutre que la proportron des
pintades hébergeantdes coccidies.des trichonronas.
des ascaridias. des caprllaires. des q'ngames est
élevée : par contre celle des pintades hébergeant des
héterakis. des Raillietina el des trichostrongvlus est
faible Seuls 6-7 Yo des 135 échantillons de matières
fécalesexarninésne sont pas parasités L'irssociatiou
parasitaire (tableau 3) repose sur la base des
coccidies. des ascaris. des capillaires et des s!'ngames
âvec une fréquente présence des trichomonas. Les
coccidiesqui apparaissentchez 7l.l '% des pintades
sont souvent très nombreuses (l9l en moyenne.
maximnm 3200 pour un sujet . tableau -l). Les
charges parasitaires des capillaires et des $ingames
sont assezfaibles (<l() parasitesipintade)
Discussion
La fréquenced'anticorps contre le virus de la maladie
de Newcastle observéechez la pintade est plus faible
que celle obsewée chez le poulet dans la région
(Chrysostomeet coll.. 1994) et dans d'autre pays
voisins (Moallin. 1984 : Grunder et coll.. 1988 : Bell
et coll.. 1990 . Courtecuisse.1990) L'ensemble des
pintades étudiées ont développé des ûtres très bas
d'anticorps spécifrques contre la maladie de
Newcastle. Au cours des enquêtes, les pintades ne
présentaient aucun symptôme de la maladie La
présence d'anticorps pourrait être expliquée par une
réponse immunologique après un passage de la
rnaladie de Neu'castle Les faibles taux d'anticorps
enregistrés peuvent s'expliquer par le fait que la
pintade semble être moins sensible que les gallinés.
De nos propres observations et selon les déclarations
des éleveurs au cours de nos enquêtes. on enregistre
de farbles taux de mortalité des pintades lors des
épidémies de la maladie de Newcastle.
En ce qur concerne la salmonellose pullorose le taux
d'infection obsewé est très bas par rapport à ce qui a
été observé sur des poulets locaux dans le pays ou
dans d'autres pays africains (Grunder et coll.. 1988 :
Chrysostome et coll . 1995 ; Bouzoubaa et coll .
1992) Chez le poulet. on obsen'eune faible mortalité
et des s.vmptômesvagues . Grunder et coll (l9tt8) les
attribuant à la présencede souchesà faible virulence
Chez la pintade aucune forme épidémique n'a été
obsenée Valentini et Cavallero. (1971) ont signalé
cette affection chez la pintade causant parfois des
hémorragies. il sembleraitque la pintade locale au
Bénin est naturellernentrésistanteà cetle affectlon.
L'élevage tradionnel de la pintade au Bénrrt cst un
élevage fermier extensif pratiqué en libeflé lotale
autour des concessions.il est lié à l'élevage des aulres
espècesaviaires Il est rare de rencontrer la pintade
comlne seule espèce de volailles dansla basse-cour,
La règle généraleest l'élevage de plusieurs espèces
avec un mélange des âges. On comprend alors
pourquoi différents parasrtes et associatiolt de
parasites affectent la pintade et aussi pourquol ces
parasites obserr,'éssont semblables à ceux que l'ott
rencontre chez le poulet. Les parasites ici obsenés
ont été égalment signalés par divers auteurs (Avehi et
coll. 1982 : Tager-Kaganet coll . 1992) Les charges
parasitairessont assezéler'ées. les pintades éludiées
étant en bon état d'engraissement.il aurait fallu en
plus des anlaysescoprologiquesfaire des autopsles
pour obsen'er les muqueuses digestives La
prévalenced'infestation à la trichomonoseest fitiblc
par rapport aux observations faites au Niger (TagcrKagan et coll . 1992) . par contre celle des coccidies
est forte. avec un niveau coccidien élevé Les
enquêtesayant été effectuéessur des pintades adultes.
on peut alors imaginer la gravité des problèrnes qrri
se posent chez les jeunes : une action sanitaire dcr.'rait
prendre en compte cette protozoose. même si ott
pense que le caractère extensif de l'élevage peut
atténuer ces problèrnes.
Conclusion
Les enquêtes dans les élevagestraditionnels ont mis
en évidence que les pintades ont développé de faible
taux d'anticorps spécifique à la maladie de
Newcastle. un faible taux d'infection pour la
salmonellose pullorose mais un parastitisme
abondant et varié. Compte tenu de I'expérience
acquise au Burkina Faso, une action sanitaire
améliorerait cet élevage. Mais \tt I'importance
acutelle de la maladie de Newcastle en milieu
vaillageois et de la pratique du mélande des espèces.
il serait intéressant de tester la réplication et
I'excrétion du virus dans ces pintades pour voir si
elles peuventiouer le rôle de réservoir naturel.
TABLEAU I : Résultatsdestestsd'inhibition de I'hémaggluûnation
titrespositfs
effectif
Secteur
agricole
l8
22
26
20
86
22
23
26
Dioueou
Ouaké
Toucountouna
2tJ
Boucoumbé
Total ou movenne 9 l
moyenne
géométrique
>)
<)
0.42
0.I
34
07
4
I
0
0
logz m.g
0
0
o.l2
1.09
5
d'infestation
TABLEAU 2 . Fréquences
Secteursagricoles
Nbre échantillons
Catégoriesde
Darasrtes
Protistes:
- Coccidies
- Trichornonas
Dlougou
n:45
nombre
oositifs
:i0
I(X)
Toussecteurs
n= 135
nombre ,r/n
nositifs
7t . l
96
2,|"3
90.9
0
0
48
30
100
l l'7
0
o
6
2(l
u.I
l8
t2
l5
0
50
22.2
L2
5l
5I
0
5{.4
36.4
0
35.6
86.7
tt.9
37.8
37.8
9
6.7
0
o
0
2
t1
Ouaké
n:27
Toucouutoutra
n=33
Boucoumbé
n: 30
nombre 0//t l
positifs
81.8
27
nombre
nositifs
o/
/o
nombre
oositifs
o/
/rl
2'7
60
t2
44.4
9
t8
44.4
66"7
30
Hétérakis
6
60
8(r.7
13.3
t2
Ascaridia
2'l
39
0
0
-'t
6
l5
Cappillaires
ùYngames
Raillietina
J J..]
'73.3
-) -t
r3.3
6
Trichostrongvlus
6"7
-t
t t .t
-)
0
0
o
at/
/o
0
0
0
TABLEAU 3 . Associationparasitaire
Secteursagricoles Diousou
Nbre de parasite
nombre o/ /o
assocrés
6.7
Aucun
3
6;7
J
I
6.7
J
2
26.6
-)
L2
26.6
1
l2
20
)
9
-)
6-',|
6
t00
Total
45
Toucounlouna
Ouaké
nombre
o/
/o
-1
ll.l
J
22.2
33.3
)))
0
ll.l
6
6
9
(r
-)
0
0
27
0
0
100
nombre
9
t2
J
0
-)J
Boucoumbé
o./
/o
nombre
o/
nombre
lt/
/1>
9.1
0
2',1.3
36.4
18.2
9.1
0
100
0
0
9
0
0
9
6.7
9
6.7
30
70
0
0
0
100
30
5l
2l
l2
22.2
37.8
15.5
21
0
0
0
30
/ll
TABLEAU 4 : Chargeparasitaire(parasitesdominants)
Parasites
Coccidies
Ascaris
Caoillaires
Svngames
Récolte totale
18318
1862
317
r5l
SuietsDroterus
96
TI7
5l
5l
Moyenne
I9l
lnfestationmax.
3200
I6
2r0
6
65
T4
J
Toussecteurs
J
135
8.9
2.2
100
Remerciements
Les auteurs remercientla socité GALOR pour sa
participation
à la réalisation
de cetravail.
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