« Mesure de l`activité protéolytique de bactéries lactiques isolées à

République Algérienne Démocratique et Populaire.
Ministère de l'enseignement supérieur et de la recherche scientistes
Université d'Oran Es-Sénia.
Faculté Des Sciences.
Département De Biologie.
Laboratoire de Physiologie de la Nutrition et Sécurité Alimentaire
Mémoire du Magister soutenu le : 12/11/2012
Intitulé du Mémoire :
« Mesure de l’activité protéolytique de bactéries lactiques isolées à
partir du lait de vache (Lactococcus sp.) ; étude de leur effet
protecteur sur la muqueuse intestinale de souris balb/c
sensibilisées par voie orale au lait de vache.»
Présenté par : MERAH Rachid
Membres du Jury
Président
- AOUES Abdelkader
-Professeur, Université d’Oran
Rapporteur
- KHEROUA Omar
-Professeur, Université d’Oran
Examinateurs
- CHEKROUN Abdallah -Maître de Conférences, Université d’Oran
- KADDOURI Hanane
-MCA, Université d’Oran
SOMMAIRE
SOMMAIRE ……………………………………………………………………1
ABREVIATION ………………………………………………………………..5
Tableaux et figures ……………………………………………………………...6
INTRODUCTION ………………………………………………………………7
1. LES PROTEINES DE LAIT DE VACHE ………………………………………..8
1.1. Les protéines ………………………………………………………………………….8
1.1.1.
Les caséines ……………………………………………………………………………………8
1.1.2.
Les protéines du lactosérum …………………………………………………………….8
1.1.2.1.1. L'alpha-lactalbumine ………………………………………………………………………8
1.1.2.1.2. La SAB (sérum albumine bovine) ………………………………………………………..10
1.1.2.1.3. La Lactoferrine ……………………………………………………………………10
1.1.2.1.4. Les autres protéines du lactosérum ………………………………………………………10
1.1.2.1.5. La bêta-lactoglobuline …………………………………………………………….10
2. DIGESTION DES PROTEINES DU LAIT
2.1. Digestion des protéines alimentaire in vivo …………………………………….11
2.1.1. Digestion gastrique ………………………………………………………………….11
2.1.2. Digestion intestinale …………………………………………………………………11
2.1.3. Absorption intestinale …………………………………………………………12
2.2. Digestion de la β-lactoglobuline bovine ……………………………………….12
2.2.1. Digestion in vivo ……………………………………………………………...12
2.2.2. Digestion in vitro ……………………………………………………………...14
2.2.3. Modification des propriétés nutritionnelles …………………………………..14
3. ALLERGIE AUX PROTEINES DE LAIT DE VACHE …………………15
3.1. L’allergénicité des protéines en générale …………………………………………….15
3.2. L'allergie aux protéines de lait de vache (APLV) ………………………………16
3.3. Facteurs intervenant dans le développement de I'APLV ……………………….17
3.3.1. Les antécédents familiaux ……………………………………………………17
3.3.2. La sensibilisation …………………………………………………………….17
1
3.3.2.1.
La sensibilisation in utéro ……………………………………………...17
3.3.2.2.
La sensibilisation par le lait maternel …………………………………….17
3.4. Traitement et modalités de substitution ………………………………………….18
3.4.1. Les laits hypoallergéniques et les formules excessivement hydrolysés ……..18
3.5. Effets des traitements technologiques sur l'antigénicité et/ou l'allergénicité de lait
de vache ………………………………………………………………………………..19
3.5.1. Effet de traitements thermiques………………………………………………19
3.5.2. Effet de traitement enzymatique ……………………………………………..19
3.5.3. Effet du traitement par irradiation ……………………………………………20
3.5.4. Effet de la fermentation lactique ……………………………………………..20
4. LES LAITS FERMENTĒS ………………………………………………..21
4.1. Déroulement de la fermentation lactique dans le yaourt ………………………21
4.2. Les ferments utilisés dans les préparations de laits fermentés …………………22
4.2.1. Les ferments lactiques …………………………………………………………….22
4.2.1.1.
Les ferments mésophiles …………………………………………………..22
4.2.1.2.
Les ferments thermophiles ……………………………………………22
4.2.1.3.
Les ferments probiotiques ……………………………………………22
4.2.1.3.1. Les Lactobacilles………………………………………………………… 22
4.2.1.3.2. Les entérocoques ………………………………………………………………23
4.3. Les interactions positives et négatives dans les ferments ………………………23
4.4. Activités biologiques des ferments …………………………………………….25
4.4.1. Activité protéolytiques des ferments ……………………………………………...25
4.4.2. La fermentation de sucres …………………………………………………………25
4.4.3. Production d'arômes …………………………………………………………26
4.4.4. Production de polysaccharides ……………………………………………………26
4.4.5. Propriétés nutritionnelles des laits fermentés ……………………………………26
4.5. Propriétés thérapeutiques des laits fermentés à base de probiotiques ……………26
4.6. Les principaux effets des probiotiques sur la réponse immunitaire …………….27
4.7. Prévention des allergies par l’utilisation de probiotiques ……………………………27
2
4.8. Rôle des probiotiques et de la microflore intestinale …………………………………...28
5. MATRIEL ET METHODE ……………………………………………….32
5.1. Préparation des ferments ………………………………………………………32
5.2. La lyophilisation ……………………………………………………………….32
5.2.1. La méthode de Lowry ………………………………………………………33
5.2.2. Le dosage des α-NH2 …………………………………………………………….34
5.2.3. Electrophorèse sur gèle d'acrylamide en présence de SDS …………………34
5.3. Le gavage des souris 35
5.3.1. Un 1er lot de témoins négatifs (T-) ………………………………………….35
5.3.2. Un 2ème lot de témoins positifs (T+) …………………………………………35
5.3.3. Un 3ème lot pour l’association LF1 …………………………………………..35
5.3.4. Un 4ème lot pour l’association LF2 …………………………………………..35
5.3.5. Le test ELISA ………………………………………………………………..36
5.3.6. Etude histologique …………………………………………………………..36
5.4. Analyse statistique ………………………………………………………………38
6. RESULTATS ……………………………………………………………...40
6.1. Mesure de pH des différents laits ……………………………………………….40
6.2. Mesure des protéines totales des laits fermentés (LF1 et LF2) et dans le lait cru .40
6.3. Mesure des fonctions α-NH2 libres au cours du temps dans des laits fermentés
(LFI et LF2) et dans le lait cru …………………………………………………..42
6.4. Profils électrophorétiques ………………………………………………………..42
6.5. Etude immunoenzymatique des laits fermentés …………………………………43
6.5.1. Souris témoin négatif et positif sensibilisées au lait de vache ………………………44
6.5.2. Souris colonisées avec du lait fermenté LF1, LF2 à J18 …………………………….44
6.5.3. Souris colonisées avec du lait fermenté LF1, LF2 puis sensibilisées au lait de vache
jusqu’à J54 …………………………………………………………………………..44
6.6. Etude histologique ……………………………………………………………….48
6.6.1. Effet de l’immunisation sur la structure intestinale …………………………...48
3
6.6.1.1.
Effet global …………………………………………………………………...48
6.6.1.2.
Effet sur la structure villositaire de l’épithélium intestinal …………………..48
6.6.2. Effet sur le nombre des LIE ………………………………………………………….48
7. DISCUSSION ……………………………………………………………..53
8. CONCLUSION ……………………………………………………………58
9. Références bibliographiques ………………………………………………60
4
ABREVIATION
AA
Acide Aminé
ALA
Alpha-Lactalbumine
APLV
Allergie aux Protéines de Lait de Vache
BLG
bêta-lactoglobuline
CEP
Coefficient d’Efficacité Protéique
CMH
Complexe Majeur d’Histocompatibilité
CPA
Cellules Présentatrices d’Antigènes
ELISA
Enzyme linked immunosorbent assay
IgG
Immunoglobuline G
Lb
Lactobacillus
Lg
Immunoglobuline
PLV
Protéines de lait de vache
SAB
Sérum Albumine Bovine
VB
Valeur Biologique
5
Tableaux et Figures :
Tableau 1 : Propriétés et caractéristiques des protéines solubles (PH=4.6 à 20°C) (Mathieu,
1997)…………………………………………………………………………………………...9
Tableau 2 : composition moyenne d'une micelle de caséine (McMahon et Brown; 1984,
Swaisgood; 1992)…………………………………………………………………………….13
Tableau 3: Caractéristiques des Lactobacilles et des bifidobactéries (Gomez et Malcata ;
1999)………………………………………………………………………………………….24
Figure 1 : Tissus lymphoïdes du tube digestif (a) et réponses immunes associées (b). Schéma
simplifié d’une synapse immunologique entre une cellule dendritique (DC) et un lymphocyte
T immature Th0 (c). Adapté de Janeway et Travers (1997) et Gougeon (1996)……………..29
Tableau 4: Composition des solutions utilisées pour le dosage des protéines totales selon la
Technique de Lowry et al…………………………………………………………………….33
Tableau 6 : Masse de lyophilisat par litre de lait lyophilisé………………………………….40
Tableau 7 : Concentration de protéines totales par litre de lait………………………………41
Tableau 8 : Résultats des fonctions α-NH2 libres avant et après incubation…………………42
Figure 2 : Electrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS de lait cru………..43
Figure3 : Titre en IgG sériques anti-BLG des souris témoin négatif et celles sensibilisées au
lait de vache (LES)……………………………………………………………………………45
Figure 4 : Titre en IgG sériques anti-BLG des souris témoin négatif, des souris sensibilisées
au lait entier de vache et celles des souris colonisées avec des laits fermentés LF1 et LF2….46
Figure 5 : Titre en IgG sériques anti-BLG des souris témoin négatif, des souris sensibilisées
au LES et des souris sensibilisées au lait de vache après colonisation avec des laits fermentés
LF1 et LF2……………………………………………………………………………………47
Figure 6 : Témoins (-) VS Témoins (+) : Effet de l’immunisation par voie orale au lait de
vache hauteur villositaire des fragments de jéjunum de souris Balb/c……………………….49
Figure 7 : Coupe histologique de jéjunum de souris du groupe LF1 avant sensibilisation au
lait VS Groupe LF1 après sensibilisation lait de vache………………………………………50
Figure 8 : Coupe histologique de jéjunum de souris du groupe LF2 avant sensibilisation au
lait VS Groupe LF2 après sensibilisation lait de vache………………………………………51
6
Introduction
Même si l'on attribue aux protéines de lait de vache (PLV) une qualité nutritionnelle
élevée (Léonil et al, 2001), ces derniers constituent l'une des principales sources d'allergies
alimentaires que beaucoup d'enfant développent dès leur première consommation de lait de
vache (Moneret-vautrin, 1999).
En Europe, à peu près 2,5% des enfants expriment cliniquement cette maladie durant la
première année de leur vie (Paupe, 1997). Elle est associée à des désordres de
l'hypersensibilité liée et non liée à aux IgE (Olive et Breton, 1996).
Le traitement de ces allergies consiste simplement en la suppression des agents causals
(les protéines de lait de vache) sous toutes ses formes. Si cette solution n’est pas possible, il
convient de diminuer la charge allergique de ces protéines en utilisant des formules dans
lesquelles l'allergénicité des protéines a été réduite. Beaucoup de formules à base de protéines
hydrolysées ont été adaptées à l'alimentation des enfants allergiques aux PLV. Ces formules
sont en général obtenues par différents procédés : le chauffage, l'hydrolyse enzymatique des
protéines du lait (Lee, 1992) ou par la fermentation lactique (Lorient, 2001).
Les produits laitiers fermentés pourraient présenter une alternative nutritionnelle
intéressante. En effet, l'administration d'un lait fermenté par des bactéries lactiques à des
jeunes enfants, manifestants des symptômes d' « eczéma atypique » durant l'allaitement
maternel, diminue significativement la sévérité de l'eczéma après deux mois de traitement
(Isolauri et al, 2000). De plus, l'administration orale d'un lait fermenté contenant la souche
probiotique E. coli à des bébés, durant une semaine, diminue de façon significative la
fréquence des allergies à l'âge de 20 mois (Lodinova-zadnikova et al, 2003).
Les bactéries lactiques sont, généralement, capables d'hydrolyser la β-lactoglobuline
(principale allergène de lait de vache).
Notre objectif est de vérifier la capacité de protéolyse de la bêta-lactoglobuline de ces
bactéries lactiques et son impact sur l’allergénicité et sur la morphologie de l’intestin. Si elle
existe, cette capacité de protéolyse peut réduire la charge antigénique des protéines du lait.
Dans ce cadre, nous avons préparé deux laits fermentés (LF1 et LF2) à base d’association de
Lactobacilles et d’Entérocoques. Nous avons ensuite réalisé les analyses suivantes : dosage
des protéines caractérisation des peptides par électrophorèse, étude immuno-enzymatique de
ces laits fermentés et enfin leurs impact sur la morphologie de l’intestin.
7
1. Les protéines de lait de vache :
Le lait est synthétisé par les cellules des glandes mammaires des femelles
mammifères. Il est constitué principalement d’eau, glucides (essentiellement le lactose), des
lipides, des protéines (caséines et globulines solubles), des sels minéraux à l'état ionique et
moléculaire et des éléments à l'état de trace (enzymes, vitamines et oligoéléments) (Pougheon
et Goursaud, 2001).
1.1. Les protéines
Le lait de vache contient environ 30 à 35 g de protéines par litre (Fricker et Pousser,
1999). Le taux protéique est variable selon : la race, l'âge, le stade de lactation de la vache, le
nombre de traite, la nourriture, le climat, la saison, et les critères génétiques (Pougheon et
Goursaudizool, 2001). L'action d'une enzyme, la chymosine, ou l'acidification à pH 4,6 du lait
permettent l'obtention de deux fractions : le lactosérum et le caillé qui contient les caséines.
1.1.1. Les caséines :
Les caséines sont les seules protéines synthétisées dans la glande mammaire. Les
quatre caséines du lait (αs1, αs2, β et k) se distinguent les une des autres par leur composition
en acides aminés et par leurs propriétés physico-chimiques.
Les micelles de caséines du lait bovin ont un diamètre moyen d'environ 182 nm et contiennent
92% de protéines et 8% de sels inorganiques, représentés principalement par le phosphate de
calcium.
L'abaissement du pH du lait à 4,6 conduit à la floculation des caséines (pHi).
L'abaissement de pH se fait par l'utilisation d'un acide fort ou par la bioconversion du lactose
en lactate à laide des bactéries lactiques (Léonil et al, 2001).
1.1.2. Les protéines du lactosérum :
Les protéines du lactosérum représentent environ 20 % des protéines totales. Les
principales protéines sont la β-lactoglobuline et l'α-lactalbumine. Les autres protéines du
sérum sont les immunoglobulines, la (SAB) sérum albumine bovine et la lactoferrine et
différents enzymes (tableau 1).
1.1.2.1.
L'alpha-lactalbumine :
L'α-lactalbumine (ALA) est une protéine de 123 acides aminés. C'est une métalloprotéine
8
du type globulaire de structure tertiaire quasi sphérique (Pougheon et Goursaud, 2001). Elle
représente environ 22% des protéines sériques. Son point isoélectrique est de 4,8. Elle ne
possède que deux variants génétiques.
L'ALA est un composant régulateur du système enzymatique de la galactosyle
transférase responsable de la synthèse du lactose (Brow et Gobler ; 1992).
Tableau 1 : Propriétés et caractéristiques des protéines solubles (PH=4.6 à 20°C)
(Mathieu, 1997)
-
α-
Sérum
Immuno-
Peptides-
Lactoglobuline
Lactalbumine
albumine
globulines
Péptones
162
123
582
18363 (A)
14 175 (B)
66 267 (A)
Nombres
d’acides
26 à 107
aminés
Masse
Molaire
(g/mol)
Nombre de
Résklus
cystéines
pHi
5
(2)-S-S- ;1SH
5,23(A)
En g/l dans
le lait
(4)-S-S-
1 000 000
˂ 15 000
35
(17)-S-S ; 1-
?
SH
4,3
4,6
mammaire
mammaire
sanguine
3,2
1,2
0,4
5,30(B)
Origine
6
14000 à
5,6 -7,3
(mammaire)*
sanguine
0,8
3,3- 3,7
B-CN
1
,0
9
1.1.2.2.
La sérum albumine bovine:
La sérum albumine bovine (SAB) est constituée de 123 acides aminés. Elle représente
environ 7% des protéines du sérum. On l'associe au transport de différentes substances
comme certains métabolites physiologiques, d'hormones et d'acides gras insolubles. La
présence de ces acides gras lui confère une résistance vis-à-vis des traitements thermique
(Amiot et al ; 2002).
1.1.2.3.
La Lactoferrine :
Elle représente environ 4% des protéines sériques. Elle est constituée de 689 résidus
d'acides aminés, son point isoélectrique se situe entre 8,4 et 9. Cette protéine est porteuse de
fer, sous forme ferriques (Fe3+) (Amiot et al ; 2002).
1.1.2.4.
La bêta-lactoglobuline :
La β-lactoglobuline bovine (BLG) représente 10% de la fraction protéique du lait de
vache et 50 % de celle du lactosérum. Elle est présente dans les laits de nombreux ruminants
et de quelques monogastriques (truie, jument, chienne, ânesse) (Sawyer et Kontopidis ; 2000).
Au pH du lait (pH 6,8), la BLG est un dimère de 36 kDa. Chaque unité du dimère est
composée de 162 acides aminés (AA). Douze variants génétiques ont été mises en évidence
mais les plus couramment présents dans le lait de vache sont les variants A et B, qui se
trouvent en proportions égales (Sawyer et Kontopidis; 2000). La structure secondaire de la βlg est constituée de 10-15% d'hélice-α, 43% de feuillets-β; (8 feuillets-β antiparallèles) et 47%
de structures désordonnées. Les feuillet-β forment une cavité centrale hydrophobe, d'où sa
classification dans la famille des lipocalines (Sawyer et Kontopidis; 2000).
Cette structure tertiaire lui confère une bonne résistance à l'hydrolyse acide et à la
pepsine gastrique (Reddy et al, 1988, Asselin et al, 1989). La BLG est alors absorbée au
niveau de l'intestin à l'état natif ou légèrement hydrolysée, ce qui explique, en partie, sa forte
allergénicité (Schmidt et al, 1995).
1.1.2.5.
Les autres protéines du lactosérum :
Le lactosérum renferme également des immunoglobulines (Ig) qui représentent moins
de 2% des protéines du lait. Il contient également de la β2-microglobulines, la
lactopéroxidase, la phosphatase alcaline et la catalase (Bush et Helfe, 1996).
10
2. Digestion des protéines du lait
2.1. Digestion et absorption des protéines alimentaire in vivo :
L’hydrolyse des protéines débute dans l’estomac et se poursuit au niveau de l’intestin
grêle où les produits de dégradation (peptides et acides aminés libres) sont alors absorbés.
Plusieurs facteurs peuvent influencer l’efficacité de la digestion, de même que l’absorption
des produits libérés. L’acidité stomacale, la vidange gastrique, le taux de sécrétion des
différentes enzymes digestives, le pH de l’intestin grêle, la durée du transit intestinal et la
flore microbienne sont des exemples de ces facteurs. D’autre part, certaines caractéristiques
des protéines alimentaires peuvent aussi influencer leurs hydrolyses gastro-intestinales telles
que leurs compositions en acides aminés, leurs séquences primaires et leurs conformations.
2.1.1. Digestion gastrique
Dans l’estomac, l’acide chlorhydrique favorise l’exposition des liens peptidiques pour
l’attaque enzymatique. La pepsine, une endoprotéase sécrétée par la muqueuse gastrique sous
forme de pepsinogène, est alors activée par l’acidité de l’estomac, mais aussi par autolyse
(Fruton, 2002). Le pH optimal de la pepsine se situe entre 1,8-3,5 (Samloff, 1971) et sa
spécificité se limite généralement aux acides aminés aromatiques (Fruton, 2002). Bien que les
protéines soient partiellement hydrolysées à leur sortie de l’estomac, cette étape est
importante puisqu’elle permet ensuite une action plus efficace des enzymes pancréatiques.
2.1.2. Digestion intestinale
L’arrivée dans le duodénum du chyme gastrique, fortement acide, stimule alors la
sécrétion d’une hormone intestinale, la sécrétine. Cette hormone stimule à son tour la
sécrétion pancréatique de bicarbonate qui neutralise le chyme gastrique. Cette neutralisation
permet d’inhiber l’action de la pepsine qui subit une dénaturation irréversible à pH 6-7
(Konno et al, 2000).
La digestion des protéines se poursuit au niveau de la lumière intestinale sous l’action
de cinq enzymes protéolytiques d’origine pancréatique: la trypsine, la chymotrypsine,
l’élastase, la carboxypeptidase A et la carboxypeptidase B (Van Dyke, 1989). Les enzymes
pancréatiques sont synthétisées et libérées par les cellules acineuses du pancréas sous forme
de zymogènes inactifs. Elles sont ensuite activées dans le duodénum où elles complètent
l’hydrolyse des protéines en un mélange d’acides aminés libres (30%) et d’oligopeptides de
faible poids moléculaire (70%). Les oligopeptides sont alors hydrolysés par les peptidases de
la bordure en brosse ou absorbés au niveau des entérocytes par des mécanismes de transport
11
spécifiques (Van Dyke, 1989). La bordure en brosse de l’intestin grêle contient plusieurs
peptidases qui participent à la phase finale de la digestion. Ces enzymes sont synthétisées
dans le réticulum endoplasmique rugueux et sont transportées à travers l’appareil de Golgi
jusqu’à la membrane de la bordure en brosse (Van Dyke, 1989; Erickson et Kim, 1990).
2.1.3. Absorption intestinale :
Les acides aminés et les peptides libérés par les enzymes digestives sont ensuite
absorbés au niveau de la paroi intestinale. L’absorption se fait principalement au niveau du
jéjunum, mais aussi dans l’iléon. Dans la bordure en brosse de l’entérocyte, il existe des
mécanismes de transport distincts pour les acides aminés et les peptides (Van Dyke, 1989;
Erickson et Kim, 1990; Ganapathy et al ; 1994). En fait, une portion significative (30-50%)
des acides aminés est absorbée sous forme de courts peptides (Roberts et al ; 1999) par des
transporteurs spécifiques aux dipeptides et tripeptides. Toutefois, des fragments protéiques
peuvent également être absorbés par pinocytose ou par les jonctions paracellulaires. Après
leur absorption, les acides aminés libres et les peptides non-hydrolysés sont détectés dans la
circulation sanguine (Bernier, 1984; Bernier et al ; 1988; Van Dyke, 1989; Ganapathy et al ;
1994). L’azote ingéré sous forme peptidique est absorbé plus rapidement que les acides
aminés libres.
2.2.Digestion de la β-lactoglobuline bovine :
2.2.1. Digestion in vivo :
A pH acide, la conformation globulaire compacte de la BLG est stable et lui confère
une grande résistance à l’hydrolyse enzymatique, en particulier contre l’attaque par la pepsine
(Chobert et al, 1995). Cette résistance a été démontrée lors de nombreuses études in vitro,
mais les études in vivo sont plus rares. Néanmoins, Miranda et Pelissier (1983) ont démontré
que chez des rats alimentés d’un régime à base de lait écrémé, la BLG demeure intacte dans
l’estomac, même après 4 heures. Kitabatake et Kinekawa (1998) ont aussi étudié la
digestibilité in vivo de la BLG chez le rat. Dans cette étude, la protéine native ou dénaturée
par la chaleur a été administrée, puis les contenus stomacal et intestinal ont été récupérés et
analysés. Les résultats ont montré que la BLG à l’état natif n’est pas digérée au niveau de
l’estomac. Cette résistance à l’hydrolyse gastrique pourrait d’ailleurs expliquer son potentiel
allergène, notamment chez les jeunes enfants (Schmidl et al, 1994; Schmitz, 1997; Host &
Halken, 1998).
12
Tableau 2 : composition moyenne d'une micelle de caséine (McMah et Brown;
1984, Swaisgood; 1992).
Composition en protéines de la matière azotée
Concentration dans le lait(g.L-1)
% en protéines
Caséines (total)
80
26,5
α-caséine
40
13,5
β-caséine
24
8
β-caséine
12
4
β-caséine
4
1
Protéines solubles (total)
20
6,5
Lactalbumine
12
4
Lactoglobuline
5
1,6
Immunoglobulines
2
0,6
Autres
1
0,3
Par contre, la BLG dénaturée a été partiellement digérée par la pepsine. Au niveau de
l’intestin, les protéines natives et dénaturées ont été fortement digérées, mais pas
complètement. La protéine serait alors légèrement dégradée par les métallo-peptidases de la
membrane de la bordure en brosse, puis transportée dans la muqueuse iléale par un
mécanisme trans-cellulaire (Guan et al, 1988). Ces observations supportent l’idée que la
dégradation des protéines n’a pas lieu uniquement dans la lumière intestinale, mais aussi au
niveau de la membrane de la bordure en brosse.
13
2.2.2. Digestion in vitro :
La digestibilité in vitro de la BLG a fait l’objet de plusieurs études. Toutefois, les
objectifs visés par ces études étaient variables, de même que les conditions utilisées pour
hydrolyser la protéine. Par exemple, certaines de ces études visaient à reproduire la digestion
in vivo de la protéine, alors que d’autres se sont intéressées à modifier la BLG en vue
d’améliorer ses propriétés fonctionnelles, nutritionnelles ou biologiques.
Certaines études ont permis de confirmer la résistance de la BLG à l’hydrolyse
pepsique. En effet, Kitabatake et Kinekawa (1998) ont démontré que la protéine n’est pas
dégradée en présence de pepsine de différentes sources (porcine, humaine) pour des pH
inférieurs à 3,5. Par contre, à pH 4, il semble qu’un traitement à la pepsine pendant 22 heures
permette d’hydrolyser très faiblement (~10%) la BLG (Otte et al ; 1997b). Li et al. (2004) ont
aussi démontré que les variants A et B de la BLG ne sont pas dégradés après 1 heure de
contact avec un extrait enzymatique stimulant la composition du fluide gastrique.
La susceptibilité in vitro de la BLG à l’attaque par les enzymes pancréatiques est
beaucoup plus élevée. Par exemple, Chobert et al. (1991) ont démontré que la BLG est
fortement hydrolysée par la trypsine à pH 8. L’ouverture partielle de la cavité hydrophobe de
la protéine à pH alcalin (Tanford et al, 1959; Qin et al, 1998a) permettrait d’expliquer
l’efficacité de la trypsine à ce pH. En utilisant du suc duodénal provenant de 20 enfants âgés
entre 3 et 19 mois, Jakobsson et al. (1982) ont étudié la digestibilité in vitro des caséines et de
la BLG sous forme purifiée. Les auteurs ont démontré que la BLG est hydrolysée à un taux de
1 mg de protéine par minute par ml de suc duodénal, alors que l’hydrolyse des caséines s’est
avérée supérieure avec un taux
de 30 mg/min/ml. De plus, une pré-incubation en
présence de fluide gastrique pendant 1 heure à pH 4-5 n’a pas permis d’augmenter de façon
significative les taux obtenus pour les deux protéines.
2.2.3. Modification des propriétés nutritionnelles :
La BLG possède une valeur nutritionnelle de haute qualité, surtout en raison de
l’équilibre de sa composition en acides aminés essentiels et non essentiels. De plus, sa
biodisponibilité semble adéquate malgré sa résistance à l’hydrolyse gastrique, car les indices
de qualité nutritive classent les protéines du lactosérum parmi les meilleures (Gaudichon,
2000) et que la BLG est la plus abondante (~80%) de ces protéines. En effet, le coefficient
d’efficacité protéique (CEP) et la valeur biologique (VB) des protéines de lactosérum sont de
3,6 et 104 respectivement, alors que ces valeurs sont de 3,8 et 100 dans le cas des protéines de
14
l’œuf, considérées comme une référence protéique (O’Carroll, 1980). Par conséquent,
l’hydrolyse enzymatique in vitro de la BLG en vue d’améliorer sa qualité nutritionnelle et sa
digestibilité est plutôt rare. En fait, ce type de traitement est surtout utilisé dans le secteur des
formules lactées pour nourrissons afin de réduire le potentiel allergénique de la BLG.
La BLG bovine est reconnue pour son allergénicité, surtout chez les jeunes enfants,
laquelle est associée à son hydrolyse limitée au niveau de l’estomac (Breiteneder & Mills,
2005). Ainsi, des molécules de BLG demeurent intactes dans le tube digestif, sont absorbées
par la muqueuse intestinale et sont ensuite présentées au système immunitaire qui réagit par
une réponse immune excessive (Wal, 2001). Plusieurs travaux ont donc été réalisés afin de
réduire le potentiel allergène de la BLG par hydrolyse enzymatique, ou encore, en vue
d’induire une tolérance orale par le biais de peptides tolérogéniques. En fait, ces peptides
permettent à l’organisme de tolérer l’absorption d’une certaine quantité de substances
allergènes sans alarmer le système immunitaire.
Dans le cas de la tolérance orale, Pecquet et al. (2000) ont démontré la présence de
peptides tolérogéniques dans un hydrolysat trypsique de BLG. Dans cette étude, l’hydrolysat
a été fractionné sur colonne échangeuse d’ions et une des fractions peptidiques s’est avérée
riche en ce type de peptides. Les propriétés antigéniques de cette fraction étaient 50 fois
inférieures à celles de l’hydrolysat complet. La caractérisation de cette fraction a démontré
que les peptides tolérogéniques avaient une masse moléculaire inférieure à 4-5 kda (8-23
acides aminés).
3. Allergie aux protéines du lait de vache :
3.1.
L’allergénicité des protéines
L'allergénicité d'une protéine se définit par la faculté de cette protéine à induire une
production d'lgE et de stimuler les lymphocytes Th2.
L'allergénicité dépend du nombre d'épitopes et de leur composition en acides aminés.
En effet chaque protéine allergisante comporte de multiples épitopes séquentiels et
conformationnels. Les épitopes conformationnels (épitopes B) sont constitués d’acides aminés
rapprochés dans la structure tertiaire de la protéine. Ils sont reconnus par les
immunoglobulines E (lgE), alors que les épitopes linéaires (épitopes T) sont constitués
d’acides aminés adjacents dans la structure secondaire et sont reconnus par les récepteurs des
lymphocytes T (TCR) (Bute; 2001, Wal; 2002).
15
Les protéines qui constituent les allergènes majeurs de lait de vache sont : la BLG et
l’ALA (vis-à-vis desquels 85% des malades réagissent) (Chatel et al, 1997 ; Bernard et al;
1998) et la sérum albumine bovine.
Les protéines de lait de vache ont une particularité : elles possèdent des épitopes B linéaires,
enterrés dans des parties hydrophiles des molécules et qui ne deviennent accessibles aux IgE
qu'après la protéolyse (Wal; 2001).
De nombreuses études ont été menées pour déterminer les épitopes allergéniques sur
la molécule de la BLG. La principale approche utilisée déterminer ces épitopes consiste à
hydrolyser la BLG, puis à mesurer la capacité de chaque peptide à se lier à des IgE issues de
sérums de patients allergiques au lait (Sélo et al ; 1998, Wal ; 2002).
3.2.
L'allergie aux protéines de lait de vache (APLV):
C’est une réponse immunologique excessive d'hypersensibilité aux protéines de lait de
vache. Elle représente la troisième allergie alimentaire chez les enfants en dessous de 15 ans
avec 8 % des cas derrière l'allergie à l'œuf (34,2%) et à l'arachide (22,9%). Le fait qu'elle
guérisse naturellement, le plus souvent avant l'âge de 2 ans, permet d'espérer que son étude
contribuera à comprendre les mécanismes de l'instauration d'une tolérance alimentaire et
partant de là, à améliorer les tentatives d'institution d’une tolérance au lait, et au-delà, de
dessiner des possibilités thérapeutiques pour l'ensemble des allergies alimentaires de l'enfant
(Moneret-vautrin; 2001) .
La forme la plus couramment observée chez l'enfant par les pédiatres (50% des cas)
est le syndrome d'entérocolite allergique, dominée par l'association de vomissements et de
diarrhée, comportant parfois du sang dans les selles (Host; 1990). Les formes aigues
permettent la suspicion immédiate d'APLV. Le choc anaphylactique et les manifestations
d'urticaire généralisé, d'angio-œdème des lèvres et d'œdème laryngé, pourraient représenter 15
% des cas d'APLV (rang et al, 1996). La dermatite atypique de la première année de la vie est
l'expression préférentielle de l'allergie alimentaire au lait (Isolauri et al, 1995).
L'asthme lié à I'APLV est de diagnostic malaisé, sa possibilité est démontrée par les
formes sévères d'asthme aigu grave (Fox et al; 1999).
Chez l'adulte, l'APLV a longtemps été considérée comme exceptionnelle (Moned-vautrin;
1983). Outre les rares APLV de l'enfant toujours évolutives éventuellement réalisées à la suite
16
de gastroentérites virales, les auteurs suisses ont attiré l'attention sur la prépondérance
féminine, et le fait que les premiers symptômes apparaissent fréquemment pendant la
grossesse. L'APLV peut même apparaître à un âge plus avancé (Moneret-vautrin; 2001).
Les symptômes sont le plus souvent digestif, insidieux et peu évocateurs: les douleurs
abdominales et le météorisme sont plus fréquents que le trouble du transit (Petto et al, 1998).
Comme chez l'enfant, I'APLV peut se manifester par un asthme, un choc anaphylactique
(gerber et Vogt; 1999) ou de l'urticaire. Par ailleurs, l'inhalation de protéines de lait de vache
peut provoquer un asthme allergique professionnel (Moneret-vautrin; 2001).
3.3.
Facteurs intervenant dans le développement de I'APLV :
3.3.1. Les antécédents familiaux :
L'existence d'antécédents familiaux d'atopie (dermatite atypique, asthme infantile,
allergie alimentaire infantile, rhinite allergiques) majore sensiblement le risque d'allergie
alimentaire. Le risque pour un enfant, de famille atypique, de présenter une APLV lorsqu'un
enfant de la fratrie en est atteint est de 1/3 (Moneret-vautrin, 2001
3.3.2. La sensibilisation :
La sensibilisation a lieu dés le premier contact entre l’organisme et les allergènes du
lait de vache. Elle a conduit à suspecter une sensibilisation in utéro (Feiterna et al, 1997) et
une sensibilisation par le lait maternel (tsorva et al ; 1994).
3.3.2.1.
La sensibilisation in utéro :
Dés la onzième semaine, le fœtus est déjà capable de produire des IgE. Un peu plus
tard, les cellules T fœtales apparaissent dés les vingt deuxièmes semaines de gestation. La
sensibilisation est donc possible in utéro à des allergènes alimentaires ingérés par la mère
ainsi qu'à des aéroallergènes inhalés. Cette sensibilisation peu également avoir lieu par la voie
cutanée (Molkhou, 2001).
3.3.2.2.
La sensibilisation par le lait maternel :
Le lait maternel prévient l'apparition de l'allergie du lait de vache dans des populations
non sélectionnées (Sigurs et mal, 1992). Mais dans des populations à risque, il n'y a pas de
prévention à long terme si la mère ne suit pas un régime hypoallergénique pendant
l'allaitement (Vanenplas; 1996).
La sensibilisation par le lait maternel est établie par l'apparition de dermatite atypique au
17
bout de trois mois d'allaitement exclusif, qui disparait sous régime ou d'éviction de lait de
vache (Sorva et al, 1994).
La détection de protéines de lait de vache dans le lait maternel est courante, en effet la
BLG peut atteindre 150 pg/l (Jakobsson et al, 1985 ; Soda et al, 1994). En revanche Restani et
ses collaborateurs (1999) ne confirment pas la présence de la BLG dans le lait maternel. Ils
suggèrent que les résultats contradictoires trouvés dans la littérature sont dus aux réactions
croisées entre les protéines du lait de vache et les protéines du lait humain. Ils concluent que
d'autres composants sont impliqués dans l'induction des symptômes d'allergie chez les enfants
nourris exclusivement au sein.
Traitement et modalités de substitution :
3.4.
Le traitement de l’APLV consiste essentiellement en la suppression des agents causals
(les protéines de lait de vache) sous toutes leurs formes.
Mais, étant donné de l’importance du lait qui reste l’aliment qui répond le mieux aux
besoins nutritionnels et immunitaires du nourrisson, il convient de le substituer par des
formules dans lesquelles l'allergénicité des protéines a été réduite. Ces formules sont obtenues
par l'hydrolyse enzymatique, le chauffage ou la fermentation lactique (Lorient, 2001).
3.4.1. Les laits hypoallergéniques et les formules excessivement hydrolysés :
Les laits hypoallergéniques sont le résultat d'hydrolyse des protéines du lactosérum,
permettant l'obtention de peptides de petites tailles (600 da environ).
Ces derniers contiennent des traces de la BLG native. Ils conservent des épitopes réactogènes
(Makinen-Kijumen et al, 1993). Selon Dean (1997), les préparations hypoallergéniques ne
sont pas conseillées aux enfants déjà sensibilisés aux PLV, puisqu'ils présentent un risque net
de sensibilisation croisée. Une étude récente confirme cette existence du risque et suggèrent
l’existence d’une réaction anaphylactique locale due à l’interaction directe de l’antigène
sensibilisant avec les muqueuses des fragments jéjunaux (Brahim et al, 2011).
Pour les formules excessivement hydrolysais, ce sont des préparations commerciales
(le Peptijunior en Algérie est à base de protéines de lactosérum) qui ne contiennent pas, ou
peu (2%), de lactose. Les hydrolysats poussés de caséines, non disponibles dans les officines
algériennes, contenant des peptides de 1500 dalton peuvent être valablement proposés comme
substituts au lait de vache. Une formule à base d’acides aminés représente une sécurité
absolue et peut être prescrite dans ce cas particulier, ainsi que dans les formes sévères avec
18
retard de croissance ou dans le syndrome des allergies alimentaires multiples (Isolauri et al, 1
995).
Pour les laits fermentés, ils constituent les meilleures véhicules des probiotiques. Ces
derniers présentent des effets bénéfiques pour le développement de la flore intestinale, et
pourraient contribuer à la prévention des risques allergiques (lsolauri et al, 2000).
3.5.
Effets des traitements technologiques sur l'antigénicité/allergénicité des protéines
de lait de vache :
3.5.1. Effet de traitements thermiques :
Les traitements thermiques (stérilisation, pasteurisation et UHT) sont utilisés pour la
destruction de germes pathogènes et pour augmenter la durée de conservation du produit
laitiers. Leurs effets varient fortement en fonction du couple temps-température et des
conditions de milieu telles que : l'hydratation, le pH, présence de glucides ou de lipides.
Le traitement thermique est un procédé qui influence la structure spatiale de la
protéine. Il a été longtemps considéré comme un facteur diminuant l'allergénicité des
protéines (Moneret-vautrin; 1993). Son effet sur l'antigénicité des protéines est exclusivement
lié à la destruction des épitopes conformationnels (Kings, 1 994).
Les protéines affectées par les traitements thermiques sont principalement les protéines du
sérum (les lactalbumines, les lactoglobulines et les immunoglobulines) (Lorient; 2001).
Le traitement thermique du lait de vache par micro-ondes semblent diminuer la
reconnaissance des protéines du lactosérum (BLG et ALA) traitées par les anticorps
spécifiques des protéines natives. En revanche, il ne semble pas être capable d’affecter
considérablement le pouvoir allergénique des ces protéines (Kaddouri 2001, El Mecherfi;
2004).
3.5.2. Effet du traitement enzymatique :
L'hydrolyse enzymatique consiste à couper les protéines en plusieurs fragments de
plus faibles poids moléculaires. Ces coupures détruisent la structure tertiaire des protéines et
dissocient les épitopes conformationnels et linéaires.
L'hydrolyse de la BLG par la chymotrypsine, seule ou associée à la trypsine, et
l'hydrolyse par la pepsine suivie de la chymotrypsine, diminuent de façon significative
l'allergénicité de la BLG, mais sans la réduire totalement (Asselin et al, 1988 et 1989).
19
Un traitement thermique de la BLG avant l'hydrolyse enzymatique améliore la
réduction de l'allergénicité (Bonomi et al; 2003). Toutefois, bien que l'hydrolyse déstabilise
certains épitopes allergéniques, il a été démontré que les IgE de certains patients allergiques
se fixaient plus efficacement à la BLG hydrolysée qu'à la BLG native (Haddad et al, 1979).
Ceci suggère que l'hydrolyse enzymatique dissocie les épitopes conformationnels et démasque
des épitopes initialement enfouis dans la cavité hydrophobe. Cependant, il a aussi été observé
que plus le degré d'hydrolyse des protéines est élevé, plus l'allergénicité résiduelle est faible
(Oldaeus et al; 1999, Giampietro et al, 2000, Fritsché ; 2003).
3.5.3. Effet du traitement par irradiation :
La technique d'irradiation est récente. Selon Lee et al (2000), l'irradiation permet de
diminuer efficacement l'antigénicité des aliments traités. Elle entraîne une perte de l'activité
enzymatique de certaines protéines (Bhattacharya et al, 1995) ainsi que leur immunogénicité
(Yang et al, 1996). En revanche Mimoun (2004) a montré que l'irradiation (aux rayons
gamma) des protéines du lait et de lactosérum bovins (BLG et ALA), ne semblent pas
diminuer l'antigénicité des protéines des laits et des lactosérums traités sous forme liquide ou
de poudre, vis- à-vis des anticorps spécifiques des protéines natives.
3.5.4. Effet de la fermentation lactique :
De nombreuses études mentionnent un effet antiallergique des produits laitiers
fermentés, mais peu d'auteurs précisent si cet effet est lié à l'hydrolyse des épitopes
allergéniques des protéines laitières, ou à une modulation de la réponse immune par les
bactéries lactiques à l'origine de la fermentation (Cross et al, 2001).
De nombreux cas d'allergies ont été rapportés suite à l'ingestion de différents fromages
faits à partir de lait de vache, de chèvre ou de brebis (Umpierrez et al, 1999 ; Besler et al,
2001), mais aucune étude n'a été réalisée sur la modification de l'allergénicité des protéines
laitières au cours de la fabrication fromagère. Par contre, Jedrychowski et Wroblewska (1999)
ont rapporté que la fermentation du lait de vache par des bactéries lactiques mésophiles et
thermophiles induisent une diminution significative de l'antigénicité de l'ALA et de la BLG,
alors qu'elle n'affecte pas l'allergénicité mesurée par des tests sous cutanés.
La diminution de l'allergénicité par l'hydrolyse bactérienne a également été réalisée de
façon indirecte, en mesurant la production d'lL-4 in vitro en présence d'hydrolysat. Ainsi,
Sütas et al (1996) ont rapporté une suppression de la synthèse d'IL-4 par les cellules
mononuclées du sang, en présence de caséine hydrolysée par les enzymes intra20
cytoplasmiques de Lactobacillus rhamnosus GG.
4. Les laits fermentés :
Le lait fermenté est le produit obtenu en faisant coaguler du lait entier par
ensemencement à l'aide de bactéries lactiques, éventuellement en association avec des
levures.
Il existe un grand nombre de laits fermentés, développés dans les pays nordiques, le
bassin méditerranéen et dans les pays de l'Est. Les plus connu dans notre pays sont le L’ben et
le Rïyeb. Les laits fermentés se différencient les un des autres par leur état final : coagulum
plus ou moins ferme, crème plus ou moins visqueuse, liquide du lait. Ils peuvent résulter
d'ensemencements spontanés à température ambiante, ou d'ensemencements par une flore et à
une température contrôlée. Ces produits laitiers fermentés ajoutent leurs propriétés propres
aux qualités nutritionnelles du lait utilisé. Le type de lait fermenté le plus consommé est le
yaourt ou yoghourt (Syndifrais, 1989) qui est obtenu essentiellement sous l'action simultanée
de Lactobacillus bulgaricus et de Stœptococcus thermophilus Marcel, 2002).
4.1.
Déroulement de la fermentation lactique dans le yaourt :
Le lait, après chauffage, est refroidi à la température de fermentation et est alors
ensemencé avec le levain. L'activité des bactéries du levain est, pour la plus grande part,
gouvernée par la température comprise entre 30° et 45°C avec des taux d'inoculation compris
entre 0,5 et 5 %. Dans la pratique actuelle, cette température d'incubation varie entre 42° et
45°C et le taux d'ensemencement est de 2%. Ce qui conduit à une durée de fermentation de 2
h 30 à 3 h. La croissance dans le lait de l'association du streptocoque et du lactobacille
bénéficie généralement d'une synergie active des deux germes car elle est plus rapide que la
croissance en culture pure de chacun d'eux (Corrieu et al, 1994). Il s’ensuit que les
productions d'acide lactique, de composés d'arôme et de matériel polysaccharidique sont
également plus rapides en culture associée. Le streptocoque utilise les peptides et les acides
aminés libérés à partir des protéines du lait par le lactobacille alors que la croissance du
lactobacille est stimulée par divers composés produits par le streptocoque, au premier chef
l'acide formique, le CO2 et l'acide pyruvique. L'abaissement du pH du lait, consécutif à la
production d'acide lactique, déstabilise progressivement les micelles de caséines par libération
de sels de calcium et entraîne ainsi la formation d'un gel (Radke-Mitchell et Sandine, 1984).
21
4.2.
Les ferments utilisés dans les préparations de laits fermentés :
4.2.1. Les ferments lactiques :
Des bactéries lactiques sont aujourd'hui utilisées en industrie sous forme de ferments
pour la fabrication de produits laitiers fermentés. Elles remplacent la flore acidifiante naturelle
du lait cru. Elles permettent de s'affranchir des risques de contamination par des germes
indésirables (Benbrenis, 2001).
Les ferments lactiques laitiers constituent un groupe diversifié des bactéries qui ont
néanmoins un certain nombre de caractéristiques communes : elles fermentent les sucres en
produisant principalement de l'acide lactique. Elles sont Gram positives, catalase négatives et
sont hétérotrophes.
4.2.1.1.
Les ferments mésophiles :
Les ferments lactiques mésophiles sont du genre Lactococcus et Leuconostoc. Leur
croissance optimale se situe entre 25° et 35°C.
4.2.1.2.
Les ferments thermophiles :
Un certains nombre de cultures : Lactobacillus delbreckii ssp, Bulgaricus,
Lactobacillus helveticus, Streptococcus thermophilus, Enterococcus et également des
bifidobactéries sont appelées thermophiles, car leur température optimale de croissance se
situe entre 37° et 47°C (Lamontagne et al, 2002).
4.2.1.3.
Les ferments probiotiques :
Les probiotiques sont des micro-organismes vivants capables d'exercer des effets
physiologiques sur l'hôte (Raid, 1999). Généralement, il s’agit de bactéries ou de levures
qu’on arrive à mettre sous forme de médicaments ou de compléments alimentaires (Bouloche
et al, 1994).
Les principaux microorganismes probiotiques utilisés à ce jour dans la préparation de
laits fermentés sont des bactéries (Lactobacilles, Bifidobactéries, Propionibactéries,
Escherichia coli et Enterocoques) et des levures (Ouwehand et al, 2002). Les deux espèces
utilisées dans notre expérimentation sont des Lactobacilles et des Entérocoques.
4.2.1.3.1. Les Lactobacilles :
Les lactobacilles sont en général des bâtonnets non flagellée, non sporulés et à Grampositif (Gomez et Malcata; 1999). Plus de 56 espèces de lactobacilles ont été dénombrées,
22
dont 21 ont été trouvées chez l'homme. Leurs principales caractéristiques sont : un
métabolisme des sucres homofermentaire ou hétérofermentaire, des conditions de croissance
anaérobies facultatives, un pourcentage de bases azotés (G+C) variant de 32 à 55% et une
faible variabilité dans la composition des peptidoglycanes (tableau 6). Les Lactobacilles ayant
des effets bénéfiques sur la santé humaine sont : Lactobacillus rhamnosus GG, Lactobacillus
johnsoni La 1, Lactobacillus casei Shirota, Lactobacillus acidophilus NCFM, Lactobacillus
plantarum 299V et Lactobacillus casei DN-114 001.
4.2.1.3.2. Les entérocoques :
Les streptocoques isolés de l'intestin ou streptocoques du groupe D étaient
classiquement distingués en deux groupes selon leurs caractéristiques physiologiques : Les
"entérocoques" (Streptococcus faecium et Streptococcus faecalis) capables de croître dans des
conditions hostiles et les "streptocoques du groupe D non-entérocoques" incapables de se
multiplier dans des conditions hostiles.
Actuellement, les entérocoques constituent un genre majeur au sein du groupe des
bactéries lactiques. Ils sont trouvées naturellement dans le tube digestif de l'homme. Les deux
espèces primitivement incluses dans le genre Enterococcus (Enterococcus faecalis et
Enterococcus faecium) présentent un ensemble de caractères phénotypiques caractéristiques :
présence de l'antigène du groupe D de Lancefield, hydrolyse de l'esculine, tolérance à 40 p.
cent de bile, production d'acétoïne, fermentation du ribose, croissance à 10 °C et à 45 °C,
croissance en présence de 6,5 p. cent de NaCl, croissance à pH 9,6 et synthèse d'une
pyrrolidonyl-arylamidase (Bascomb et Manafi 1998).
Ce sont des coques à Gram positif isolée ou en paires ou en courtes chaînes ou en
petits amas. Leur morphologie peut varier selon les conditions de culture. Les entérocoques
sont des bactéries ubiquistes présentes dans l’intestin de l’homme et des animaux, dans les
eaux usées, dans l'eau douce, dans l'eau de mer, dans le sol et sur les végétaux (Bouvet et
Couvry 1994).
La plupart des espèces du genre Enterococcus participent à la composition des flores
intestinales et certaines souches d’Enterococcus faecium posséderaient un effet favorable sur
la croissance des animaux par compétition avec les germes pathogènes.
4.3.
Les interactions positives et négatives dans les ferments :
Il y a de nombreux exemples d'associations bactériennes dans les produits laitiers
fermentés. L'exemple le plus classique est la symbiose (interactions positives observées dans
23
le yaourt, avec Sc. thennophilus et Lb. Delbrueckii subsp. Bulgaricus. En effet Lb.
Delbnleckii subsp. Bulgaricus fourniraient les acides aminés et/ou les peptides nécessaires
pour le développement et la croissance de Sc. thennophilus et à son tour Sc. thermophllus
produirait de l'acide formique stimulant le développement de Lb. Delbrueckii subsp.
Bulgaricus. Cette synergie peut aboutir à une augmentation de la croissance de ces deux
espèces bactériennes et à une acidification du lait plus importante que la somme de ces
activités propres à chacunes des espèces (Marcel, 2002).
Tableau
3:
Caractéristiques
des
Lactobacilles
et
des
bifidobactéries
(Gomez et Malcata ; 1999)
Caractères
Lactobacilles
Bifidobactéries
Physiologie
Anaérobie
Anaérobie
% G+C
Facultative
32-55
55-67
Métabolisme des
Homofermentaire ou
Hétérofermentaire
sucres
Hétérofermentaire
Composition des
peptidoglycanes
Lys-D Asp- Ornlthine
Variable
% G+C Pourcentage des bases Azotés
G : Guanine
C : Cétosine
Quant aux interactions négatives, elles se traduisent par une inhibition due à une
production de peroxyde d'hydrogène, à une compétition vis-à-vis d'un substrat, a un rejet de
produit du catabolisme, à une production de bactériocines ou à la production de phages
(Juillard et al, 1987).
Une majorité de souche de Lb. acidophilus produit une bactériocine d'origine chromosomique
active seulement sur Lb Ieichmanii, Lb delbrueckii subsp bulgaricus, Lb Helviticus et Lb
lattis (Barefoot et Klanhamert; 1983).
Un composé actif (molécule active thermostable) est aussi produit par Streptococcus
thermophilus contre Latococcus lattis, Bacillus, Pseudomonas et des Entérobactéries
(Shahami et al; 1976).
24
4.4.
Activités biologiques des ferments :
4.4.1. Activité protéolytiques des ferments :
Au cours des procédés de fermentation, les protéines laitières sont hydrolysées par les
enzymes des bactéries lactiques. Le système protéolytique des bactéries lactiques se compose
de protéines membranaires, qui hydrolysent les protéines du milieu environnant et libèrent des
peptides, et de peptidases intracytoplasmique qui dégradent les peptides. Les peptidases
peuvent être des endopeptidases ou des exopeptidases.
On distingue les carboxypeptidases des aminopeptidases, qui coupent du coté C- et Nterminal, respectivement. Ces enzymes peuvent libérer un, deux ou trois acides aminée, d'où
l'appellation de di- ou tri-peptidyl carboxypeptidases ou aminopeptidases (Kunji et al, 1996).
La majorité des peptidases sont intracellulaires, mais une certaine activité aminopeptidasique
a été mesurée à l'extérieur des cellules (Shihata et Shah, 2000).
L'activité protéolytique des lactobacilles est de plus en plus étudiée pour son
importance dans la fabrication fromagère et le développement d'arômes (Bintsis et al, 2003).
Le contenu intracellulaire en peptidases est spécifique de chaque souche bactérienne (Kunji et
al, 1996). Cependant, plusieurs souches de L. paracasei sep. paracasei montrent le même
profil d'activité protéolytique.
Leurs activités endopeptidasique et dipeptidyl aminopeptidasique sont faibles, et inférieures
aux activités carboxypeptidasique et dipeptidasique (Bintsis et al, 2003). L'activité
protéolytique des bifidobactéries a été peu étudiée. Toutefois, elle semble assez faible et
inférieure à celle observe avec les lactobacilles (Shihata et Sha; 2000). Leur caractéristique
générale est une activité aminopeptîdasique, bien que des activités dipeptidasique,
tripeptidasique et carboxypeptidasique aient été observées (EI-Soda et al, 1992).
4.4.2. La fermentation de sucres :
La fonction principale des ferments lactiques est d'acidifier le lait, grâce à la βgalactosidase, qui hydrolyse le lactose du lait pour produire le galactose et le glucose. Ce
dernier sera fermenté pour produire des composés acides, du CO2 ou l'alcool.
La plupart des souches ne font pas fermenter le galactose. Ces ferments thermophiles
n'utilisent que la fraction glucose du lactose et le galactose est secrété de la cellule lors de la
fermentation (Lamontagne et al, 2002).
25
4.4.3. Production d'arômes :
Les bactéries tactiques synthétisent un certains nombre d'arômes. Le diacétyl et
l'acétaidéhyde étant considérés comme les plus imposants.
Les lactobacillus (Lb Helvelticus, Lb Bulgaricus) synthétisent de l'acétaldéhyde.
La teneur en acétaldéhyde est à la fois fonction de son degré de synthèse et du rythme de sa
dégradation (Lamontagne et al, 2002).
4.4.4. Production de polysaccharides :
Les
polysaccharides
excrétés
par
les
bactéries
lactiques
sont
appelés
exopolysaccharides (EPS). Au moins trois produits utilisent des souches productrices d'EPS :
le yogourt, les fromages à teneur réduite en gras et certains fromages de types mozzarella. La
production d'EPS est affectée par la température, le pH et la composition du milieu de culture
(Lamontagne et al, 2002).
4.4.5. Propriétés nutritionnelles des laits fermentés :
Les propriétés nutritionnelles de laits fermentés sont déterminées par la composition
chimique du lait (source de carbone, degrés d'hydrolyse des protéines et des matières
provenant de la dégradation des constituants précédents ou d'une synthèse libres de glucose et
galactose, des vitamines et des composés aromatiques (Lorient, 2001). Elle provoque aussi
une amélioration de la digestibilité de protéines de lait. Ceci peut être expliqué par une
hydrolyse partielle des protéines (Maton et al, 1996) et par l'effet de l'acidification qui
disperse les micelles de caséines rendant leur protéolyse plus rapide (Renner et al, 1986).
4.5.
Propriétés thérapeutiques des laits fermentés à base de probiotiques :
Les effets bénéfiques des laits fermentés attribués aux probiotiques sont nombreux.
Les principaux effets rapportés dans la littérature sont : la diminution des diarrhées à
rotavirus, la diminution des diarrhées associées aux antibiotiques, la réduction de la pression
sanguine, la diminution du taux de cholestérol sanguin, la diminution du risque de cancer du
colon, l'amélioration de la digestion du lactose, la modification de l'écologie intestinale et la
stimulation du système immunitaire (Marteau et al, 2001 ; Ouwehand et al, 2002 ; Fooks et
Gibson, 2002).
26
4.6.
Les principaux effets des probiotiques sur la réponse immunitaire :
L’effet in vivo des probiotiques sur la réponse immune est peu documenté.
Toutefois, quelques bonnes études in vitro et in vivo rapportent certains effets qui sont les
suivants :
Stimulation de la prolifération des cellules épithéliales (banale et al; 2002)

Modulation de la maturation des cellules dendritiques (Christensen et al, 2002)

Stimulation des cellules tueuses (Naturel Killer) (Nagao et al, 2000)

Stimulation de la production d'lgA (Fukushima et al, 1998)

Stimulation de la prolifération lymphocytaire (Kirjavainen et al; 1999).
4.7.

Prévention des allergies par l’utilisation de probiotiques:
La composition de la microflore intestinale des enfants allergiques diffère
quantitativement et qualitativement de celle des enfants sains (Bjrksten et al, 2001 ;
Kalliomaki et al, 200 ; Kirjavainen et al, 2002 ; Watanabe et al, 2003). La flore des enfants
allergiques contient moins de bifidobactéries et plus de clostridies que les enfants sains, et
cette différence se maintien jusqu’à l’âge adulte (Apostolou et al, 2001). De plus, la souche
B.adolescentis (caractéristique de la flore des adultes) est majoritairement retrouvée dans la
flore des enfants allergiques, alors que B.bifidum prédomine dans la flore des enfants sains
(He et al, 2001).
La composition de la flore intestinale joue donc un rôle important dans la prévention
des allergies, mais l’administration orale de certaines souches probiotiques semble aussi avoir
un effet bénéfique. En effet, l'administration quotidienne par voie orale de lait fermenté
contenant Lactobacillus rhamnosus GG à des femmes enceintes et à leurs bébés, jusqu'à l'âge
de six mois, diminue de moitié la fréquence de l'eczéma atopique chez les enfants âgés de
deux ans (Kalliomzki et al, 2001). Cet effet protecteur est d'ailleurs maintenu chez les enfants
jusqu'à l'âge de quatre ans (Kalliomzki et al, 2003). De plus, une étude dévoile que
l'administration orale d'un lait fermenté contenant la souche probiotique d’E.coli à des bébés,
durant une semaine, diminue de façon significative la fréquence des allergies à l’âge de 20 ans
(Lodinova Zadnikova et al, 2003).
L'administration de probiotiques chez des nourrissons manifestants des symptômes
d'eczéma atypique durant l'allaitement maternel, diminue significativement la sévérité de
27
l'eczéma après deux mois de traitement (Isolauri et al, 2000). Cet effet a été confirmé par une
étude clinique effectuée par le même groupe de recherche (Kirjavainen et al, 2003).
Ces effets sont en partie expliqués non seulement par le pouvoir protéolytique des
bactéries probiotiques qui vont hydrolyser les principaux épitopes issus des principales
protéines allergéniques mais aussi par la souche elle-même qui induirait une tolérance orale
aux protéines responsables de l’allergie.
Pour l’un ou l’autre des mécanismes, les études révèlent une diminution des IL-4
(Sùtas et al, 1996), la stimulation de la production d'IL-10 (Pesai et al; 2000), l'augmentation
de la production de TGF-β dans le lait maternel (Rautava et al; 2002), la diminution de la
réponse inflammatoire chez les patients allergiques (Petto et al; 1998) et la suppression de la
prolifération lymphocytaire en présence de Lactobacillus rhamnosus GG (Pesai et al; 1999).
Comme cité auparavant, les auteurs mentionnent les effets réels des probiotiques mais
ne précisent pas si ces effets sont liés à l'hydrolyse des épitopes allergéniques des protéines
laitières, ou à une modulation de la réponse immune par les bactéries lactiques à l'origine de
la fermentation par induction de la tolérance orale (Cross et al, 2001).
4.8.
Rôle des probiotiques et de la microflore intestinale :
Les données actuelles suggèrent que les bactéries de la microflore intestinale
pourraient avoir un rôle primordial dans l'émergence et/ou l'activation des cellules T CD4+
régulatrices impliquées dans la tolérance orale. En effet, des bactéries Gram+, comme les
Lactobacillus qui sont présentes constitutivement dans la flore intestinale, ont la capacité
d’orienter in vitro la maturation et la production de cytokines de cellules dendritiques vers un
profil donné et ce en fonction de la souche bactérienne utilisée (Christensen et al, 2002).
Ainsi, L. reuteri, induit la production d’IL-10 (mais pas d’IL-12) ainsi qu’une expression
faible de CD86 et des molécules du CMH de classe II par les CD, alors que L.casei, induit une
importante production d’IL-12 et de TNF-a associée à une forte expression des molécules de
surface (Christensen et al, 2002). Ceci suggère que via un effet sur les CD, les bactéries de la
flore intestinale pourraient participer à l’orientation de la réponse T (Th1, Th2 ou Th3) au
niveau intestinal. Il a été montré que Lactobacillus paracasei favoriserait la différenciation de
cellules T CD4+ en une population productrice d’IL-10 et TGF-b et présentant une faible
capacité proliférative, pouvant donc être assimilée, de part son profil cytokinique et son état
potentiellement anergique, à une population T CD4+ régulatrice (Von der Weid et al, 2001).
28
Plus récemment, il a été démontré que les cellules T CD4+CD25+ régulatrices issues
de différents organes lymphoïdes expriment à leur surface des Toll-like récepteurs (TLR-4, 5, -7 et –8) et que l’engagement du TLR-4 par le lypopolysaccharide (LPS), son principal
ligand, entraîne l’activation des cellules CD4+CD25+ et favorise la survie de ces cellules
ainsi que leur prolifération (Caramalho et al, 2003, Sakaguchi et al, 2003). Le traitement des
cellules T CD4+CD25+ par du LPS augmente leur capacité inhibitrice in vitro et ce, même en
absence de CPAg, suggérant que le LPS agit directement sur le TLR-4 de la cellule
régulatrice (Caramalho et al, 2003, Sakaguchi et al, 2003). Ces observations laissent penser
que les bactéries saprophytes de l'intestin pourraient favoriser les mécanismes de tolérance en
agissant, soit directement sur la survie des cellules T CD4+ régulatrices ou, soit indirectement
sur le conditionnement des CD tolérogènes.
Figure 1 : Tissus lymphoïdes du tube digestif (a) et réponses immunes associées (b).
Schéma simplifié d’une synapse immunologique entre une cellule dendritique (DC) et un
lymphocyte T immature Th0 (c). Adapté de Janeway et Travers (1997) et Gougeon
(1996).
On peut donc conclure que la sensibilisation à des allergènes alimentaire est liée à un
défaut de l'installation d'une « tolérance orale » induite soit par l’hydrolyse des protéines et/ou
par la souche elle-même. Chez le nouveau-né et le nourrisson, la rupture de la tolérance
immunitaire est le résultat d'une immaturité de la fonction intestinale, de déficit transitoire en
29
lgA, d'un terrain atypique, du temps d'exposition à l'antigène et d'effets immunosuppresseurs
des infections virales, d'environnement néfaste (fumée pollution). Chez l'enfant, l'adolescent
et l'adulte, la rupture de la tolérance immunitaire est le résultat d'irritants intestinaux, de
parasites, d'alcool et de candidoses digestives (Molkhou; 1999).
30
MATERIEL ET METHODE
5. Matériel et méthode :
5.1. Préparation des ferments
31
Les bactéries utilisées dans ce protocole sont des lactobacilles (Lactobacillus plantarum et
Lactobacillus sp) et une Entérocoque (Enterococcus feacium). Ces bactéries ont été isolées à
partir de lait de vache cru. Deux laits fermentés ont été préparés à partir de deux associations
de bactéries contenant chacune d’elles deux souches bactériennes différentes de lactobacilles
et d’entérocoques : Enterococcus feacium + Lactobacillus sp pour le lait fermenté LF1 et
Enterococcus feacium + Lactobacillus plantarum pour le lait fermenté LF2
Le lait de vache est fraîchement collecté est rapidement écrémé par centrifugation à 3500
tours/min, pendant 20 minutes. Le lait écrémé (LES) est ensuite stérilisé à 105°C pendant 10
min.
Deux types de ferments ont été préparés : une pré-culture (inoculum) et une culture finale.
Pour les pré-cultures, 1ml de culture sur bouillon MRS de chaque espèce bactérienne (109 à
1011 UFC/ml) est ensemencée dans 10 ml de lait supplémenté de 5 % d'extrait de levure
(0,8g/l). Les pré-cultures sont ensuite incubées à 37°C pendant 24 heures jusqu'à coagulation.
Les cultures finales de chaque espèce bactérienne sont obtenus par ensemencement du lait
avec 5% de pré-culture (1ml/100ml de lait écrémé). Elles sont alors incubées dans un bainmarie à 45°C pendant 4 heures. Nos laits fermentés sont alors prêts : lait fermenté 1 (LF1) et
lait fermenté 2 (LF2).
Les objectifs de la préparation de ces laits fermentés sont : (1) la lyophilisation afin
d’évaluer leurs taux de protéines totales, d’acides aminés ainsi qu’une électrophorèse; (2) et le
gavage des souris pendant une période de 18 jours.
5.2.La lyophilisation
Après congélation, on lyophilise nos préparations de laits fermentés (LF1 et LF2) et de
lait écrémé et stérilisé (LES). Ces lyophilisats sont stocké à 20°C et à l’abri de la lumière et
seront utiliser pour des dosages ultérieurs (Lowry, α-NH2 et électrophorèse).
5.2.1. La méthode de Lowry
Elle permet le dosage des protéines totales. L'addition successive à une solution
protéique diluée d'un sel de cuivre en milieu alcalin, puis d'un réactif de phénol de folincieucalteus (Merk) donne une coloration bleu, celle-ci résulte de la réduction de l'acide
32
phospho-tungsto-molybdique (réactif de folio) par la tyrosine, le tryptophane et la cystéine L
contenues dans les protéines.
Tableau 4: Composition des solutions utilisées pour le dosage des protéines totales selon
la Technique de Lowry et al.
Solution A
NaCO3 Anhydre
2% dans la solution
de soude 0,1N
Solution B1
CUSO4
Solution B2
Tartrate de K et de Na
5%
anhydre
Solution à préparer extemporanément :
Solution B : 1 ml de la solution B1 + 1 ml de la solution B2 + 8 ml d’eau distillée
Solution C : 1 ml de la solution B + 50 ml de la solution A
Solution E : Réactif de Folin dilue au demi (V/V) dans de l’eau distillée.
On prend 1 ml de chaque échantillon (les échantillons sont dilués de façon à ce que la
densité optique et les concentrations restent dans la gamme étalon), puis on ajoute 0,5 ml de
réactif C, bien agiter et laisser agir à la température ambiante pendant 30 minutes .
La lecture se fait au spectrophotomètre (Spectronic 401 Milton Roy) à la longueur d'onde de
750 nm. La concentration des protéines totales est calculée en référence à un courbe étalon
obtenu avec la SAB (sérum albumine bovine).
5.2.2. Le dosage des α-NH2
On prépare notre solution de ninhydrine. On dissolve 0,8 g de Ninhydrine (Merck) dans
un mélange de 80 ml d'éthanol à 99.5%, de 10 ml d'acide acétique et d’l g de chlorure de
cadmium (CdCI2) (préalablement dissout dans un 1 ml d'eau distillée).
Dans des piluliers, nous mettons successivement :
-
500 µl de l'échantillon à doser (préalablement dilué),
33
-
1 ml de la solution de Ninhydrine. Après agitation, les tubes sont chauffés à 84°C
pendant 5 min dans un bain marie jusqu'à la révélation de la couleur pourpre. Les
tubes sont ensuite refroidis dans la glace.
La lecture se fait au spectrophotomètre à la longueur d'onde de 540 nm. La concentration des
fonctions α-NH2 libres est calculée en référence à une courbe étalon de leucine.
5.2.3. Electrophorèse sur gèle d'acrylamide-bisacrylamide en présence du
SDS
Pour évaluer les modifications induites par la fermentation lactique, les protéines des
échantillons sont séparées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS
décrite par Laemmji (1970).
L'électrophorèse est une technique rapide, sensible et capable d'un haut degré de résolution.
Le mélange de protéines est tout d'abord dissous dans une solution de SDS, qui rompe toutes
les interactions non covalentes présentes dans ces molécules natives. Le mercaptoéthanol est
également ajouté afin de réduire les liaisons disulfures.
La charge négative acquise par la fixation du SDS est habituellement beaucoup plus
grande que la charge des protéines natives, cette charge est rendue négligeable, les complexes
SDS-protéines dénaturés sont ensuite soumis à une électrophorèse dans un gel de
polyacrylamide.
Les échantillons, dissous dans du tampon d'échantillon sont déposés dans des puits formés
dans le gel. La migration des protéines se fait sous tension de 0,002 A par plaque pendant 1 h
30 minutes. Après migration, le gel est démoulé et mis dans une solution de coloration au bleu
de Coomassie et la décoloration du gel est réalisée à l'aide d'une solution de décoloration.
5.3.Le gavage des souris
48 souris femelles de souche BALB/c provenant de l’institut Pasteur d’Alger et d’un
poids moyen de 18 à 22 g et âgées de 5 à 7 semaines ont étaient réparties en 4 lots
expérimentaux :
5.3.1. Un 1er lot de témoins négatifs (T-)
12 souris ont reçus par gavage, une solution de NaCl 9‰ à raison de 0,4 ml/j pendant
toute la durée de l’expérimentation. Elles étaient répartis en 2 groupes dont 5 étaient sacrifiées
au 22ème jour et les 7 autres au 54ème jour.
34
5.3.2. Un 2ème lot de témoins positifs (T+)
Là aussi, 12 souris reçoivent par intubation une solution de NaCl 9‰ à raison de 0,4
ml/j pendant 18 jours puis, du 22ème jour jusqu’aux 54 jours, du lait de vache écrémé et
stériliser (LES). Les souris étaient répartis en 2 groupe dont 5 étaient sacrifiés au 22ème jour et
les 7 autres au 54ème jour.
5.3.3. Un 3ème lot pour l’association LF1
12 souris ont été gavé (0,4 ml) pendant 18 jours avec le LF1 (EFl + 22). Il s’ensuivait
une autre période de sensibilisation au LES (toujours par gavage et avec la même quantité) du
22ème jour jusqu’aux 54 jours. Les souris étaient répartis en 2 sous-groupes dont 5 étaient
sacrifiées au 22ème jour et les 7 autres au 54ème jour.
5.3.4. Un 4ème lot pour l’association LF2
Le même procédé utilisé pour le lait fermenté LF1 mais en utilisant des souches
différentes (EFb+ Lp). Ici aussi, les souris étaient répartis en 2 sous-groupes dont 5 étaient
sacrifiées au 22ème jour et les 7 autres au 54ème jour.
Au cours de l’expérimentation, des échantillons sanguins ont été prélevés :
-
avant la colonisation bactérienne à J0
-
avant la sensibilisation au lait de vache (LES) à J22 et ainsi qu’après la sensibilisation
(J54).
Le sang été prélevé à l’aide d’une pipette de pasteur, par ponction du sinus rétro-orbitaire.
Ce sang est centrifugé à 3500 trs/min pendant 20 min à 4 C°. Les sérums sont mis en parties
aliquotes et conservés à -20 C°. Juste après le prélèvement se sang, on sacrifice des souris et
on prélève le jéjunum pour l’histologie.
Le sérum obtenu va nous permettre de faire des dosages Immuno-enzymatique afin de
vérifier les titres sériques en IgG anti-β-Lg. Nous avons utilisé la technique ELISA
« indirecte » décrite par (Walker et al; 1973).
5.3.5. Le test ELISA
Cette technique consiste à faire réagir les anticorps à doser avec l'antigène immobilisé
par adsorption sur une phase solide. Le dosage est effectué sur des plaques de microtitration
en polystyrène à 96 puis (NuNC Puis à fond plat) qui permettent l'adsorption de la plupart des
35
protéines diluées en milieu alcalin. Le sérum des animaux sensibilisés est ajouté. La fixation
des anticorps est détectée par l'addition d'anticorps anti-immunoglobuline G à la peroxydase
(Sigma). On dose l’enzyme marqueur à l'aide d'un substrat spécifique à l'enzyme, le peroxyde
d’hydrogène (H2O2).
Pour détecter le radical « O » formé pendant la réaction enzymatique, on ajoute un
chromogène, l'orthophénylène diamine (OPD).
5.3.6. Etude histologique
Le but est de vérifier l’existence de modification dans la structure histologique de
l’intestin des souris femelles des animaux expérimentaux et témoins.
Traitement des fragments

Fixation
Les tissus sont fixés dans du formol tamponné à 10% ensuite dans du formol dilué au
1/10
ème

pendant 30 minutes.
Déshydratation
Après fixation, les tissus sont déshydratés dans 3 bains successifs d’acétone à
température ambiante. Chaque bain dure 45 minutes.

Clarification
Cette opération s’effectue après la déshydratation. Les pièces sont placées dans deux
bains successifs de toluène à 45 minutes.
Inclusion
L’inclusion est effectuée avec de la paraffine. Les échantillons sont placés dans deux
bains successifs de paraffine pendant une heure chacun dans l’étuve à une température de
56C°, puis coulés dans des moules en plastique à température ambiante.
Traitement des lames
Après inclusion à la paraffine, les blocs contenant le fragment sont coupés à l’aide
d’un microtome à une épaisseur de 4 m.
Etalement sur lames
Une fois les coupes terminées, elles sont mises sur une lame de verre recouvertes de
colle (2 g d’albumine + 50 ml de glycérine dans 1000 ml d’eau distillée) puis placées sur une
36
plaque chauffante réglée à une température convenable, inférieure à celle du point de fusion
de la paraffine. A l’aide d’une pince, les plis de la paraffine sont tirés légèrement de chaque
côté. Ensuite, l’ensemble coupe-lame est retiré de la plaque et égoutté, essoré au papier
Joseph et mis à sécher.
Avant de procéder à la coloration des lames, il faut les déparaffiner et les réhydrater.
Déparaffinage
Pour déparaffiner les lames, il suffit de les placer dans deux bains successifs de
toluène. Chaque bain dure 2 minutes.
Réhydratation
L’hydratation se fait dans 3 bains successifs d’alcool éthylique de degrés décroissants
(100°, 95°, 90°, 70°). Chaque bain dure 2 minutes. Le dernier est suivi d’un rinçage à l’eau
courante.
Coloration
Les lames sont colorées à l’hémalun–éosine, qui représente la plus simple des
colorations combinées. La coloration du noyau est bleu-noir et le cytoplasme rose à rouge. La
préparation du colorant hématoxyline de Harris (Tableau 4).
La coloration des lames est effectuée comme suit :
-
Mettre les lames dans l’hématoxyline de Harris durant 2 à 3 minutes.
-
Laver les lames à l’eau ordinaire.
-
En cas de sur coloration, les lames sont trempées légèrement dans de l’alcool
chlorhydrique pendant quelques secondes (100 ml d’alcool à 95°+ 5 gouttes de Hcl à
1%).
-
Bleuir dans une solution aqueuse saturée de carbonate de lithium (rinçage).
-
Laver les lames à l’eau ordinaire.
-
Mettre les lames dans un bain d’alcool éthylique 1 à 2 minutes.
-
Colorer les lames à l’éosine alcoolisée (2g d’éosine dans 100 ml d’alcool éthylique)
pendant 5 minutes.
-
Rinçage des lames dans deux bains successifs d’alcool éthylique à 70° puis à 95°.
-
Mettre les lames dans du toluène pendant 1 minute.
37
-
Mettre entre lame et lamelle une goutte de baume de Canada ou d’eukitt.
-
Laisser sécher puis observer au microscope.
Mesure de la hauteur villositaire
La mesure de la hauteur villositaire a été effectuée pour vérifier l’existence d’une
atrophie villositaire chez les animaux traités à 0,45% et 1% de tartrazine par rapport aux
témoins.
Principe
Les mensurations des hauteurs villositaires sont effectuées sous un microscope optique
muni d’un micromètre oculaire. Pour déterminer le nombre de microns correspondant pour
chaque objectif, nous plaçons sous un micromètre objectif qui est une sorte de lame présentant
200 divisions, chaque division correspond à 2 µm.
Le micromètre oculaire comporte 100 divisions. Ces 100 divisions correspondent à
128 divisions sur le micromètre objectif pour l’objectif (x 10). Puisque les 200 divisions
correspondent à 1280 µm. Pour l’objectif (x 10) chaque division correspond à 12,8µm.
5.4.Analyse statistique
Les résultats sont exprimés par la moyenne ± erreur standard (X±SE) établie pour
chaque groupe. Les moyennes sont comparées à l’aide du test « t » de Student en utilisant
STATISTICA (version 6) après analyse de variance (ANOVA, 2007). Le seuil de
signification retenu est celui qui est habituellement considéré, soit 5%.
38
RESULTATS
39
6. Résultats
6.1.
Mesure de pH des différents laits
Après 4 h d'incubation, le pH diminue dans les deux laits. Ca valeur est de: 5,57 ± 0,17
pour le lait LF1, 5,63 ± 0,17 pour le lait LF2 et 6,77 ± 0,07 pour le lait écrémé (LES).
On observe une diminution significative du pH pour le lait LF1 par rapport au lait
témoin LES (p<0,005) ainsi qu’une diminution significative du pH pour le lait LF2 par
rapport au lait témoin LES (p<0,003).
La variation de pH entre les deux laits fermentés n’est pas très importante.
6.2.
Mesure des protéines totales des laits fermentés (LF1 et LF2) et dans le lait
cru
Les tests de Lowry et de α-NH2 ont été effectués avec des lyophilisats de laits
fermentés (LF1 et LF2) et de lait écrémé et stérilisé (LES). Les quantités obtenues après
lyophilisation sont mentionnées dans le tableau :
Type de Lait
Gramme de lyophilisat par litre de lait
lyophilisé (g/l)
LES (laits écrémé et stérilisé)
96 g/l
LF1 (Lait fermenté)
95g/l
LF2
94,3 g/l
Tableau 6 : Masse de lyophilisat par litre de lait lyophilisé.
Nous avons mesuré la teneur en protéines totales des deux laits fermentés (LF1, LF2)
après 4 h d'incubation.
Nos résultats montrent que la teneur en protéines totales de LF1 et LF2 ne diminue pas
de façon importante pendant les 4 heures d'incubation.
La teneur en protéines totales au temps initial d’incubation est de 38,53 ± 0,49 g/l pour
le lait témoin LES. Après 4 h d'incubation avec les 02 associations de bactéries, cette teneur
atteint les valeurs suivantes : 35,09 ± 1,76 g/l (p<0,002) pour le lait LF1 et 35,72 ±1,49 g/l
40
(p<0,0025) pour le lait LF2.
D'autre part, nos résultats montrent que la diminution de la teneur en protéines totales
mesurée dans le lait LF1 après 4 h d'incubation n’est pas significativement plus marquée par
rapport à celle mesurée dans le lait LF2 (p<0,29) mais elle est significative par rapport à celle
mesurée dans le lait témoin LES (p<0,002).
De même on observe aussi une diminution significative de la teneur en protéines
totales pour le lait LF2 par rapport au lait témoin LES (p<0,0025).
Ces résultats montrent que pendant la fermentation, la dégradation des protéines du
lait ne se fait pas de façon significative. Cette dégradation n'est pas totale même après 4 h
d'incubation.
Avant incubations
Après 4h d’incubation
38,53 ± 0,49 g/l
/
LF1
/
35,09 +/- 1,76 g/l
LF2
/
35,72 +/- 1,49 g/l
LES (laits écrémé et stérilisé)
Tableau 7 : Concentration de protéines totales par litre de lait.
LF1 : Lait fermenté par Enterococcus feacium + Lactobacillus sp.
LF2: Lait fermenté par Enterococcus feacium + Lactobacillus plantarum.
LES: Lait cru écrémé et stérilisé (témoin). Nombre échantillons = 7
Tous les laits ont été incubés à 45°C pendant 4 heures.
Les valeurs indiquées représentent la moyenne +/- erreur standard (ES).
41
6.3.
Mesure des fonctions α-NH2 libres au cours du temps dans des laits
fermentés (LF1 et LF2) et dans le lait cru
Le tableau 6 représente les résultats de la mesure des fonctions α-NH2 libres pendant
la fermentation, exprimés en équivalent leucine µM/ml (± moyenne erreur standard).
La mesure de la libération des fonctions α-NH2 permet d'évaluer l'activité protéolytique des
associations bactériennes utilisées pendant 4 h d'incubation.
Nous observons pour les deux laits (LF1 et LF2) une légère augmentation de la
libération des fonctions α-NH2. Ceci montre l'existence d'une hydrolyse des protéines du lait
peu importante.
Avant incubations
Après 4h d’incubation
1,08±0,05 µM/ml
/
LF1
/
4,17±0,13 µM/ml
LF2
/
3,77±0,34 µM/ml
LES (laits écrémé et stérilisé)
Tableau 8 : Résultats des fonctions α-NH2 libres avant et après incubation
Au temps initial de l'incubation, la quantité des fondions α-NH2 libres mesurée dans le
lait LES est de : 1,08±0,05 µM/ml. Après 4h d'incubation, la teneur en fonction α-NH2 est de
: 4,17±0,13 µM/ml pour le lait LF1 (p<0,001), et de 3,77±0,34 µM/ml pour le lait LF2
(p<0,001).
D'autre part, nous observons que la quantité des fonctions α-NH2 libres mesurée dans
le lait LF1 n’est pas significativement plus élevée par rapport à celle mesurée dans le lait
témoin LES et dans le LF2 (p<0 ,05).
6.4.
Profils électrophorétiques
L’électrophorèse permet la séparation des protéines de nos différents échantillons de
laits (laits fermentés et lait cru).
Le lait écrémé et stérilisé (LES) a été utilisé comme référence. Le profile
42
électrophorétiques du lait LES et des laits fermentés indiquent l'existence de plusieurs bandes
traduisant la migration des différents composants protéiques analysés.
Plusieurs électrophorèses ont été effectuées aboutissant toujours au même résultat. Ce résultat
de d’électrophorèses est rapporté dans la figure 6.
Figure 2 : Electrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS de lait
cru.
Les puits 1et 4 contient les protéines de référence : Caséine, β-Lactoglobuline, αLactalbumine.
Les puits de 2 et 5 contiennent l’échantillon de lait fermenté LF1 incubé pendant 4h à 45°C.
Les puits de 3 et 6 contiennent l’échantillon de lait fermenté LF2 incubé pendant 4h à 45°C.
6.5.
Etude immunoenzymatique des laits fermentés
La technique ELISA, nous a permis de doser les IgG sériques des souris sensibilisés et
de souris témoins (Figures 7, 8 et 9).
43
6.5.1. Souris témoin négatif et positif sensibilisées au lait de vache
Le degré de sensibilisation des animaux à la BLG a été mesuré par dosage
immuno-enzymatique indirect (ELISA-indirect). Le niveau de production d’IgG spécifiques
anti-BLG dans le témoin positif est significativement élevé (titre 1/105) (***p< 0.001) en
référence au témoin négatif avec un titre de 1/101 (figure 1).
Ces résultats indiquent que la sensibilisation orale au lait de vache stimule la production
d’IgG sériques anti β-Lg.
6.5.2. Souris colonisées avec du lait fermenté LF1, LF2 à J18
Après 18 jours de colonisation avec LF1 le titre en IgG anti β-Lg (1/102.7) est
significativement plus bas (***p< 0.001) que celui obtenu chez le témoin positif (1/105).
Nous obtenons presque le même résultat avec le groupe de souris LF2. Le titre en IgG
anti-BLG (1/102.5) est significativement inférieur par rapport au témoin positif (**p< 0.001).
6.5.3. Souris colonisées avec du lait fermenté LF1, LF2 puis sensibilisées au lait
de vache jusqu’à J54
Dans ce groupe, les souris sont dans un premier temps colonisées avec du lait fermenté
LF1 et LF2 pendant 18 jours puis sont sensibilisées par voie orale au lait de vache écrémé
(LES) jusqu’à J54. Pour le lot de souris du groupe LF1 sensibilisées au LES, on observe une
augmentation d’IgG anti-BLG qui est hautement significative (***p< 0.001) par rapport au
lot de témoin négatif. Par contre lorsqu’on les compare aux témoins positifs les valeurs sont
comparables (figure 8).
Pour le groupe LF2, on retrouve également un faible titre en IgG anti-BLG (1/104.3)
(*p< 0.05) par rapport au témoin positif (figure 8).
La comparaison des titres en IgG spécifique dans les groupes de souris LF1 et LF2
montre qu’il n’existe pas de différence significative entre les deux groupes (1/104.8, 1/104.3)
(figure 9).
44
IgG
Log (1/titre)
6
***
5
4
témoin
3
T+
2
1
0
Moyenne
Figure3 : Titre en IgG sériques anti-BLG des souris témoin négatif et celles
sensibilisées au lait de vache (LES).
Témoin négatif : animaux recevant une solution saline à 9‰
Témoin positif : animaux recevant une solution saline puis sensibilisées par voie oral au
lait de vache (LES).
Les valeurs mentionnées sont : des moyennes ± erreur standard (n=6).
(***p< 0.001) hautement significatif.
45
IgG
Log (1/titre)
6
***
5
4
témoin
***
3
**
T+
A18
2
B18
1
0
Moyenne
Figure 4 : Titre en IgG sériques anti-BLG des souris témoin négatif, des souris
sensibilisées au lait entier de vache et celles des souris colonisées avec des laits
fermentés LF1 et LF2.
Témoin négatif : animaux recevant une solution saline à 9‰.
Témoin positif : animaux recevant une solution saline puis sensibilisées par voie oral au
LES.
LF1 animaux recevant du lait fermenté par (Enterococcus feacium+ Lactobacillus sp) de
J0 à J18 par voie orale.
LF2 animaux recevant du lait fermenté par (Enterococcus feacium+ Lactobacillus
plantarum) de j0 à j18 par voie orale.
Les valeurs mentionnées sont : des moyennes ± erreur standard (n=6).
(***p< 0.001).
46
IgG
Log (1/titre)
6
***
***
***
5
4
témoin
T+
3
A54
2
B54
1
0
Moyenne
Figure 5 : Titre en IgG sériques anti-BLG des souris témoin négatif, des souris
sensibilisées au LES et des souris sensibilisées au lait de vache après colonisation
avec des laits fermentés LF1 et LF2.
Témoin négatif : animaux recevant une solution saline à 9‰.
Témoin positif : animaux recevant une solution saline puis sensibilisées par voie oral au
LES.
LF1 animaux recevant du lait fermenté par (Enterococcus feacium+ Lactobacillus sp) de
J0 à J18 puis sensibilisées par voie oral au LES.
LF2 animaux recevant du lait fermenté par (Enterococcus feacium+ Lactobacillus
plantarum) de j0 à j18 puis sensibilisées par voie oral au LES.
Les valeurs mentionnées sont : des moyennes ± erreur standard (n=6).
(***p< 0.001).
47
6.6.
Etude histologique
L’objectif de cette partie du travail est de vérifier si l’immunisation per os au lait cru
entraîne chez la souris une modification de la structure de l’épithélium intestinal et de la
composition en lymphocytes intra-épithéliaux.
6.6.1. Effet de l’immunisation sur la structure intestinale
6.6.1.1.
Effet global
La figure 6 représente une observation à moyen (X40) grossissement des villosités
jéjunales d’une souris témoin négatif comparée à celle d’une souris témoin positif.
Sur le plan structurale, les villosités du groupe de souris témoin négatif apparaissent
longues et fines, bordées par un épithélium simple unistratifié. Elles sont constituées de
cellules hautes à plateau strié pourvues de noyaux réguliers en position basale. Le chorion est
d’aspect fibreux et apparaît polymorphe contenant diverses cellules immunitaires, peu
abondantes.
En revanche, chez les souris sensibilisées (témoins positifs), on distingue une atrophie
partielle et une pseudostratification de l’épithélium (figure 6). De plus, chez certains animaux,
l’épithélium est détaché du chorion.
Ces résultats suggèrent que l’immunisation par voie parentérale au lait affecte de
manière significative la structure de base de l’épithélium intestinal.
6.6.1.2.
Effet sur la structure villositaire de l’épithélium intestinal
La hauteur villositaire chez les témoins est de 49±1.25µm. Elle est significativement
diminuée chez les souris sensibilisées au LES (38.62±0.66µm, p<0.0005) ainsi que chez les
souris sensibilisées au LES après colonisation au LF1 et LF2 (39.43±0.87µm, p<0.0007)
(figure 7 et 8).
6.6.2. Effet sur le nombre des LIE
On remarque une très importante et très dense infiltration de lymphocytes intraépithéliaux au niveau des villosités jéjunales des deux groupes d’animaux immunisés. Ces
résultats montrent que l’immunisation aux protéines du lait de vache entraîne une
augmentation considérable des cellules immunitaires de l’intestin, résultant probablement
d’une sollicitation accentuée du système immunitaire associé au tube digestif des souris
immunisées.
48
Figure 6 : Témoins (-) VS Témoins (+) : Effet de l’immunisation par voie orale au
lait de vache hauteur villositaire des fragments de jéjunum de souris Balb/c.
Témoins (+): souris immunisées au lait de vache par voie orale.
Témoins (-): souris témoins non immunisées.
On note une diminution significative de la hauteur villositaire dans le lot de souris
immunisées ai lait (LES) par rapport aux témoins.
Les valeurs exprimées sont des valeurs ± erreurs standards (ES).
49
Figure 7 : Coupe histologique de jéjunum de souris du groupe LF1 avant
sensibilisation au lait VS Groupe LF1 après sensibilisation lait de vache.
Les valeurs exprimées sont des valeurs ± erreurs standards (ES).
Témoins (+): souris immunisées au lait de vache par voie orale.
Témoins (-): souris témoins non immunisées.
On note une diminution significative de la hauteur villositaire dans le lot de souris
immunisées ai lait (LES) par rapport aux témoins.
Les valeurs exprimées sont des valeurs ± erreurs standards (ES).
50
Figure 8 : Coupe histologique de jéjunum de souris du groupe LF2 avant
sensibilisation au lait VS Groupe LF2 après sensibilisation lait de vache.
Les valeurs exprimées sont des valeurs ± erreurs standards (ES).
51
DISCUSSION
52
7. Discussion
Ce travail a été réalisé avec comme objectif d’analyser et évaluer les effets des ferments
lactiques (Enterococcus feacium, Lactobacillus sp et Lactobacillus plantarum) isolées à partir
de lait de vache sur l’antigénicité vis-à-vis de la BLG et sur l’influence de ces derniers sur la
structure histologique de l’intestin (jéjunum).
Dans notre travail, nous avons utilisé comme modèle animal des souris femelles de
souche Balb/c immunisées per os au lait de vache fraichement récolté. La voie orale a été
choisis comme voie de sensibilisation car tous les laits fermentés sont ingérés et passent donc
par voie digestive même si cette voie d’administration entraîne une production moins
importante d’IgE spécifiques que la voie intra-péritonéale (Dearman et al, 2003).
Dans ce travail, on a commencé par étudier la capacité de protéolyse de ces bactéries
en les incubant dans du lait, fraichement récolté et écrémé, afin de doser le taux de protéines
totales et d’acides aminés. Une diminution du taux protéique et une augmentation
significative d’acides aminés dans les différents laits aurait été en faveur d’une importante
protéolyse. Ceci n’est pas le cas pour nos laits fermentés dans lesquelles il y a eu
effectivement protéolyse, mais avec un taux très faible. En effet, après 4H d’incubation à
45°C, il y a eu une diminution de seulement 9% et 7% de protéines totale pour les laits LF1 et
LF2. Tandis que l’augmentation en acides aminés est de seulement 2,69 à 3,09 µMol pour les
laits fermentés LF1 et LF2.
Le résultat de l’étude électrophorétiques de ces différents laits confirme ce résultat.
Les bandes d’électrophorèses des différentes protéines se trouvant dans les deux laits
fermentés donnent presque le même profile électrophorétiques que celui du lait écrémé utilisé
comme témoin et comme référence.
Ces trois résultats suggèrent que les bactéries, utilisées en associations, n’hydrolysent
pas les protéines de façon importante. Selon des expériences faites au laboratoire, ces mêmes
bactéries, quand elles sont utilisées individuellement, arrivent à hydrolyser partiellement les
caséines mais pas les autres protéines et notamment la BLG. Dans notre étude, ces même
bactéries quand elles sont utilisées en association, n’arrivent même pas à hydrolyser
partiellement la caséine.
Ceci peut suggérer un antagonisme entre la croissance des bactéries utlisées (Enterococcus
feacium et Lactobacillus sp pour le lait LF1 et Enterococcus feacium et Lactobacillus
plantarum dans le lait LF2).
53
Mais malgré le peu d’hydrolyse bactérienne que provoquent ces bactéries lactiques, le
résultat du test ELISA et de l’histologie prouvent qu’elles ont un effet immunomodulateur et
un effet protecteur de la paroi intestinal.
En effet le titre obtenu pour le groupe de souris (Témoins positifs), ayant été
sensibilisées exclusivement au lait pendant les 54 jours de l’expérience, est de 1/10 5 (***p<
0.001). Ce titre d’anticorps anti-BLG (IgG) est significativement plus élevé que celui des
souris n’ayant rien reçu (titre 1/101). Nous avons montré par là que le protocole
d’immunisation par voie orale chez la souris Balb/c stimule la production d’anticorps sériques
de type IgG anti-BLG.
Tant que les souris recevaient le lait LF1 et LF2 durant les 18 premiers jours, le titre en IgG
anti β-Lg est respectivement de 1/102.7 et 1/102.5 et est significativement plus bas (***p<
0.001) que celui obtenu dans le témoin positif (1/105). On suppose par là un effet antigénique
des laits fermentés sur les souris mais beaucoup moins important que dans le groupe de souris
n’ayant reçues que du lait. Ce qui confirme ce résultat, c’est le retrait après les 18 premiers
jours du lait fermenté et la sensibilisation, ensuite, avec exclusivement du lait de vache
jusqu’à la fin de l’expérience (54ème jour). Après ce changement de régime, le titre d’anticorps
remonte jusqu’à 1/104.8 et 1/104.3 pour les souris ayant consommées respectivement les laits
fermentés LF1 et LF2 en première période.
Ceci suggère un effet positif de ces bactéries, non pas grâce à leur faculté de protéolyse des
épitopes allergène des protéines du lait de vache, mais grâce à leur présence et un effet
« directe » sur le système immunitaire et par là sur la structure de l’intestin.
Selon la littérature, les probiotiques sont capables d’influencer le système immunitaire par
contact avec les cellules immunocompétentes, en transmettant des signaux qui modifient la
réponse immunitaire de l'organisme-hôte et ceci grâce, non pas à leur effet protéolytique mais
grâce à leurs composants intra ou extracellulaires actifs.
Leur action peut conduire à la modification de l’équilibre Th1/Th2 en faveur d’une
augmentation de lymphocytes B produisant des IgA et d’une réduction concomitante de
lymphocytes B sécrétant des IgE responsables des allergies (Ouwehand et al, 2002).
54
Figure 9 : Action des probiotiques et des prébiotiques sur le système immunitaire
de l’intestin. Adapté de Ouwehand et al. (2002).
Par exemple, Lactobacillus casei, L. delbrueckii ssp. bulgaricus et L. acidophilus
augmente la production d’IgG1 en modifiant la balance en faveur de Th2 (Perdigon et al,
2002). Et ce sont les composants bactériens extracellulaires et/ou intracellulaire qui ont cette
propriété de stimuler la réponse immunitaire. En effet, la paroi des bactéries lactiques a une
structure typique des bactéries Gram+ caractérisée par une épaisse multicouche de
peptidoglycane, décorée avec des protéines, des acides teichoïques, des polysaccharides et
entourée, chez certaines espèces, par une couche para cristalline de protéines de la couche S
(Delcour et al, 1999). Des études ont montré que le peptidoglycane, l’acide teichoïque et le
contenu cytoplasmique de bactéries lactiques stimulent la production de certaines cytokines
(IL-1, IFN-γ, IL-6, TNF-α...), l’activité du macrophage et la prolifération des cellules de
plaques de Peyer (Iribe et al, 1981; Yamamoto et al., 1985; Meydani & Ha, 2000; Kankaanpa
et al., 2003).
L’effet immunomodulateur peut être également induit par les protéines de la couche S
de la paroi et d’autres composants intracellulaires (acides nucléiques, peptides, protéines) ou
extracellulaires (exopolysaccharides) (Grogono-Thomas et al. 2003), par l’ADN bactérien
(Klinman et al, 2004).
D’autre part, des composants bactériens extracellulaires ont également la propriété de
stimuler la réponse immunitaire. Ruiz-Bravo et al. (2001) ont indiqué que des
exopolysaccharides produits par le bacille Paenibacillus jamilae CP-7, administré par voie
55
intra péritonéale aux souris Balb/c ont permis de mettre en évidence des effets
immunomodulateurs intéressants en améliorant la résistance à Listeria monocytogenes.
Ces effets des probiotiques et de leurs composantes moléculaire sur l’équilibre
Th1/Th2 est dépendant de la souche probiotique utilisée (Perdigon et al, 2002) et donc l’effet
immunomodulateur des bactéries qu’on a utilisé pour fermenter le lait peut être du à ces
molécules bactériennes.
Afin de vérifier l’impact de ces laits fermentés au niveau intestinal, une étude
histologique a été menée sur des fragments jéjunaux. Les résultats obtenus ont montré que
l’immunisation au lait diminue significativement la hauteur villositaire chez les souris
sensibilisées au lait de vache. Chez certains animaux, l’épithélium intestinal est séparé du
corps de la lamina propria. Ces anomalies ne sont pas observées chez les souris témoins. De
telles observations ont été décrites dans les anaphylaxies dues aux antigènes alimentaires
(Curtis et al, 1990 ; Crow et al, 1994 ; Levine et Saltzman, 1998).
L’atrophie villositaire partielle est remarquée au cours de l’hypersensibilité retardée
non médiée par les IgE chez l’enfant présentant une entéropathie due au lait de vache
(Mauneret-Vautrin, 1999 ; Dupont, 2002). La muqueuse intestinale reproduit les mêmes
stigmates retrouvés au cours de la maladie de cœliaque en phase aigue (Buts, 2003).
Nous avons remarqué aussi une importante augmentation des LIE et des lymphocytes de la
lamina propria chez les souris immunisées. Les LIE sont augmentées sous l’action de
cytokines libérées au cours des réactions inflammatoires (Ebert, 1998).
L’entéropathie par sensibilisation aux protéines du lait de vache provoque une atrophie
villositaire avec infiltrat inflammatoire variable de l muqueuse (Hankard et al, 1997 ;
Guénard-Bilbault et Moneret-Vautrin, 2003).
Notre travail démontre alors que la sensibilisation par voie orale affecte
considérablement la hauteur villositaire ainsi qu’une augmentation des LIE observés chez les
souris ayant ingérées du lait suggérant une réaction antigénique confirmée par le test ELISA.
56
CONCLUSION
57
8. Conclusion :
Le but de ce travail est d’explorer la capacité protéolytique de deux associations de bactéries
lactique isolées à partir de lait de vache (Enterococcus feacium + Lactobacillus sp et
Enterococcus feacium + Lactobacillus plantarum) sur les protéines de lait écrémé et stérilisé
en constituant des laits fermentés LF1 et LF2. Et à partir de là, évaluer l’antigénicité de ces
lait fermentés et leurs impact sur la structure du jéjunum de souris Balb/c.
Dans la première partie du travail, on a évalué ce pouvoir protéolytique bactérien par la
méthode de Lowry, le dosage des α-NH2 et la caractérisation des protéines et des peptides
par électrophorèse.
La méthode de Lowry n’a pas révélé une diminution importante du taux protéique total
pendant les 4h d’incubation à 45°C. Idem pour le dosage des α-NH2 qui n’a mit en évidence
qu’une petite augmentation de la concentration des acides aminés dans les laits fermentés. Ces
deux derniers résultats ont été confirmés par électrophorèse où on a eu des profiles
électrophorétiques identiques entre les deux laits fermentés et le lait de vache prix comme
référence.
Ces résultats nous permettent de conclure que l’utilisation de ces deux associations de
bactéries lactique (Enterococcus feacium + Lactobacillus sp) et (Enterococcus feacium +
Lactobacillus plantarum) n’ont pas un important pouvoir de protéolyse des protéines de lait
de vache.
Dans la deuxième partie du travail, on a évalué l’antigénicité de ces deux associations
de bactéries lactiques. Les anticorps sériques de quatre groupes d’animaux ont été évalués par
la technique immunoenzymatique ELISA indirect. Un groupe de souris a reçu pendant 54
jours exclusivement du lait de vache et un autre groupe n’ayant rien reçu constituent les deux
groupes témoins (Témoins négatifs et témoins positif). Les titres d’IgG sont élevés dans le
groupe de souris sensibilisés exclusivement au lait de vache comparé au groupe non
sensibilisé. Ce résultat confirme le pouvoir immunisant du lait de vache administré par voie
orale. Les deux groupes restants ont reçus chacun d’entre eux un lait fermenté avec l’une des
associations de bactéries lactiques pendant 18 jours. Après ces 18 jours de contact avec les
laits fermentés, nous avons donné exclusivement du lait de vache jusqu’au 54 jour.
Les titres d’IgG des souris ayant reçus des laits fermentés pendant 18 jours sont beaucoup
moins élevés que le groupe de souris sensibilisés qu’avec du lait. Ce même titre augmente
après cette période où ces même souris ont commencé à ne recevoir que du lait.
58
Ce résultat nous permet de suggérer un effet protecteur de ces laits fermentés mais,
puisqu’elles ont un très faible effet protéolytique, nous suggérons que cet effet bénéfique est
dû à l’effet direct de ces bactéries sur le système immunitaire. L’étude histologique nous
permet d’aller aussi dans ce sens. En effet, les coupes histologiques des souris n’ayant reçue
que du lait fermenté sont plus ferme et l’épithélium entérocytaire reste coller au chorion
contrairement aux souris sensibilisées au lait de vache qui ont une structure détachés et une
hauteur villositaire réduite.
59
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Résumé
La Fréquence d’allergie aux protéines de lait de vache augmente d’année en année. Afin de mieux prévenir
cette affection, de nombreuses recherches visent à développer des mesures préventives afin de diminuer
l’incidence de cette affection et le risque déjà très élevé chez une personne ayant un ou des facteurs de risque.
L’utilisation de ferments lactiques pour diminuer la charge allergénique des laits a fait ses preuves dans ce
domaine. Différentes souches bactériennes isolées de milieux variés sont utilisées dans le but d’attaquer les
agents responsables de l’allergie que sont les protéines. L’objectif de ce travail est d’évaluer le pouvoir
protéolytique de deux associations de bactéries lactiques isolées à partir de lait de vache (Enterococcus fecium
+ Lactobacillus plantarum et Enterococcus fecium + Lactobacillus sp) en constituant deux laits fermentés. Il
est aussi de voir l’impact de ces laits fermentés sur la structure de base de l’intestin et sur l’antigénicité
résiduelle à la BLG. Même si le déroulement des expérimentations s’est effectué en même temps, nous
pouvons en distinguer deux grandes parties : Une première partie qui consiste à évaluer la capacité de
protéolyse de nos deux associations de ferments lactiques par le biais des tests de Lowry, de la méthode de
dosage des α-NH2 et de l’électrophorèse sur gel d’acrylamide. Une deuxième partie qui consiste à évaluer
l’antigénicité résiduelle des laits (laits fermentés et non fermenté) par dosage immunoenzymatique indirect
ELISA des anticorps sérique IgG anti-BLG en utilisant 04 groupes de souris Balb/c (n=12 / groupe de souris)
immunisées par voie orale; ainsi qu’une étude histologiques de coupes sur jéjunum de ces mêmes souris pour
voir l’influence de nos laits sur la structure de cette partie de l’intestin. Les résultats obtenus montrent que nos
deux associations de ferments lactiques n’ont pas un important pouvoir protéolytique mais qu’elles arrivent,
quand même, à moduler de façon significative l’antigénicité résiduelle et à mieux protéger la structure de
l’intestin que le lait normal. Ceci peut suggérer un effet direct de ces bactéries sur le système immunitaire et
sur la structure de l’intestin. Ces résultats peuvent être précisés en évaluant les prédominances IgG1 et IgG2a
pour déterminer le type de polarisation ainsi qu’en évaluant les paramètres électrophysiologique en chambre
de Ussing.
Mots clés :
Allergie; Probiotiques; Bactéries lactiques; Enteroccocus faecium; Lactobacilles; Lactobacillus plantarum;
Lait de vache; -lactoglobuline; APLV; Laits fermentés.