(TD : Evaluation d`une nouvelle méthode pour le dosage des

Travail de diplôme
Evaluation d’une nouvelle méthode
pour le dosage des anticorps
dirigés contre le virus Epstein-Barr
Carole Fracheboud
Ecole Supérieure de la Santé
TAB 51
Département d’immunologie
Accompagnants : Mercedes Cipolli et Jean-Michel Druon
Novembre 2011 - Avril 2012
Travail de diplôme
Immunologie
Nov. 2011 – Avril 2012
Table des matières
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Résumé ............................................................................................................................................... 3
Introduction ...................................................................................................................................... 4
2.1
Description du laboratoire...................................................................................................4
2.2
Généralités................................................................................................................................ 5
2.2.1
Le cycle de multiplication du virus........................................................................... 5
2.2.2
Transmission.....................................................................................................................6
2.2.3
Pathogénicité..................................................................................................................6
2.2.4
Diagnostic......................................................................................................................... 7
2.2.5
Traitement .......................................................................................................................9
2.3
Caractéristiques des deux méthodes .............................................................................. 10
But .......................................................................................................................................................11
Développement..............................................................................................................................12
4.1
Matériel ....................................................................................................................................12
4.2
Méthode ...................................................................................................................................14
4.3
Résultats ...................................................................................................................................16
4.3.1
Répétabilité .................................................................................................................. 20
4.3.2
Reproductibilité............................................................................................................22
4.3.3
Exactitude ......................................................................................................................24
4.3.4
Contamination entre échantillons ..........................................................................24
4.3.5
Sensibilité et spécificité ...............................................................................................25
4.4
Discussion des résultats........................................................................................................28
4.4.1
Enzygnost® Anti-EBV/IgM II.....................................................................................28
4.4.2
Enzygnost® Anti-EBV/IgG.........................................................................................29
4.4.3
Enzygnost® Anti-EBV/IgM II/conjugué IgA......................................................... 30
Conclusion.........................................................................................................................................31
Remerciements ..............................................................................................................................32
Bibliographie ..................................................................................................................................33
Lexique .............................................................................................................................................35
Annexe..............................................................................................................................................36
9.1
Annexe 1 : Résultats des IgM, IgG et IgA testés sur le Bep 2000 ............................36
9.2
Annexe 2 : Résultats des reproductibilités pour les IgM, IgG et IgA ..................... 70
9.3
Annexe 3 : Résultats de la répétabilité des IgM, IgG et IgA ...................................101
9.4
Annexe 4 : Résultats des IgM, IgG et IgA testés sur des sérums avec des
Early Antigen positifs......................................................................................................... 107
Les mots surlignés en bleu dans le texte se trouvent dans le lexique à la page 36.
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Travail de diplôme
1
Immunologie
Nov. 2011 – Avril 2012
Résumé
Ce travail de diplôme repose sur une comparaison de méthodes entre Virotech (méthode de
référence) et Siemens (méthode à tester). Les tests réalisés avec ces deux méthodes sont des
tests immunoenzymatiques appelés ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay).
Cette comparaison de méthodes est effectuée pour le dosage des anticorps dirigés contre le
virus Epstein-Barr. Ce dernier appartient à la famille des Herpesviridae et est retrouvé chez
95% de la population mondiale. Ce virus intervient dans la mononucléose infectieuse, est
associé au lymphome de Burkitt et se retrouve également dans le syndrome lymphoprolifératif
post-transplantation.
Pour diagnostiquer une infection à EBV, des tests sérologiques sont effectués (recherche
d’anticorps dirigés contre les protéines VCA, EBNA et EA).
Pour réaliser cette comparaison, j’ai utilisé 73 échantillons de sérum sur lesquels les EBV IgM,
IgG et IgA ont été testés. Les résultats ont ensuite été comparés avec ceux de la méthode de
référence.
Pour déterminer si la nouvelle méthode peut être utilisée en routine, plusieurs critères ont été
vérifiés comme la sensibilité, la spécificité, la reproductibilité et la répétabilité.
Suite aux résultats obtenus, nous pourrons décider si cette méthode peut être ou non introduite
en routine.
1
Summary
This diploma work is based on the comparison of two methods : Virotech (reference method)
and Siemens (method to be tested). The tests employing these two methods are enzyme
immunoassay conscript ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay).
This comparison of methods is carried out to measure out the antibodies directed against the
Epstein-Barr virus which belongs to the Herpesviridae family and affects 95 % of the world
population. This virus intervenes in the infectious mononucleosis, is associated with the
lymphoma of Burkitt and is also found in the post-transplant lymphoproliferative syndrome.
In order to diagnose an EBV infection,serological tests are made (search for antibodies directed
against proteins VCA, EBNA and EA).
To realize this comparison, I used 73 samples of serum on which the EBV IgM, IgG and IgA were
tested. The results were then compared with those of the reference method.
To determine if the new method can be used routinely, several criteria were verified, such as
sensitivity, specificity, reproducibility and repeatability.
According to the obtained results, we can decide if this method can be introduced routinely or
not.
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Travail de diplôme
Immunologie
2
Introduction
2.1
Description du laboratoire
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Le laboratoire Synlab BBR-LTC à Lausanne fait partie de la Société AMS SA du groupe
international de laboratoires Synlab. Ces différents laboratoires sont implantés dans plusieurs
villes de Suisse.
A Lausanne, le laboratoire est divisé en plusieurs secteurs : immunologie-sérologie, chimie
clinique, hématologie-hémostase, biologie moléculaire, bactériologie et génétique. Les
prélèvements reçus dans ce laboratoire proviennent d’hôpitaux, de cliniques, de cabinets
médicaux et des centres de prélèvements.
C’est dans le département d’immunologie-sérologie que j’ai effectué mon stage ainsi que ce
travail de diplôme.
Figure 1 : Répartition des laboratoires Synlab en Suisse
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Travail de diplôme
2.2
Immunologie
Nov. 2011 – Avril 2012
Généralités
Le virus Epstein-Barr (EBV) est un virus retrouvé chez la majorité de la population mondiale.
La plupart du temps, chez l’enfant, ce virus ne produit aucun symptôme alors que chez
l’adolescent et le jeune adulte, il se traduit par un état de fatigue intense, une forte fièvre, des
adénopathies le plus souvent constantes ainsi qu’une angine tenace. Ces signes cliniques sont
regroupés sous le nom de mononucléose infectieuse.
Le virus Epstein-Barr fait partie de la famille des Herpesviridae. La particule virale est
composée d’une capside icosaédrique entourée d’une enveloppe dans laquelle sont insérées des
glycoprotéines virales qui permettent l’attachement du virus à sa cellule hôte. C’est un virus à
ADN bicaténaire qui peut coder 100-150 gènes. Grâce à des séquences répétitives à l’extrémité
de chaque brin, le génome est capable de se circulariser. La circularisation du génome est la
première étape du processus réplicatif. Dans le virion, le génome est toujours sous forme
linéaire. [1 ; 2]
Figure 2 : Structure et organisation du virus Epstein-Barr
2.2.1 Le cycle de multiplication du virus
Le cycle lytique
Le début du cycle commence par l’attachement du virus à la surface de sa cellule hôte par
interaction entre la glycoprotéine gp350/220 de son enveloppe et le récepteur CD21 du
lymphocyte B mature. Ensuite la particule virale est internalisée, puis elle migre vers le noyau
de la cellule infectée. Durant ce trajet, la capside migre vers les pores nucléaires en se
désintégrant progressivement pour ne laisser entrer que la molécule d’ADN virale. Les gènes
« très précoces » du génome viral sont transcrits, ce qui amène à l’activation de l’expression des
gènes précoces. Les produits de ces gènes, comme l’ADN-polymérase virale ainsi que d’autres
enzymes, répliquent l’ADN. C’est grâce à ces nouvelles molécules linéaires du génome EBV que
les gènes tardifs sont transcrits. Les protéines de la capside et des glycoprotéines de l’enveloppe
sont produites. L'encapsidation de l'ADN viral a lieu dans le noyau de la cellule. Les virions
nouvellement produits sont transportés à la surface de la cellule. Durant ce transport ils
acquièrent une enveloppe et des glycoprotéines qui leur serviront à s’attacher à une cellule
hôte. Ils sont ensuite libérés dans le milieu extracellulaire et la cellule est lysée. [1]
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Travail de diplôme
Immunologie
Nov. 2011 – Avril 2012
La latence
Le virus a la capacité d’établir une infection latente (arrêt de la réplication) des lymphocytes
B, les rendant ainsi immortels. Toutes les personnes EBV-séropositives ont du génome EBV dans
quelques lymphocytes B tissulaires ou sanguins. [1]
2.2.2 Transmission
Le virus Epstein-Barr, à l’origine de la mononucléose infectieuse, se transmet par contact direct
avec la salive (d’où le nom de « maladie du baiser ») ou par contact avec des objets
contaminés par de la salive infectée tels que des verres et des ustensiles.
Exceptionnellement, il peut aussi se transmettre par transfusion sanguine ou lors d’une
transplantation d’organe. Une personne infectée par cette maladie peut transmettre le virus
durant plusieurs mois après sa guérison. [1 ; 3]
2.2.3 Pathogénicité
Plus de 95% de la population mondiale a été infectée par le virus Epstein-Barr.
•
La mononucléose infectieuse
Selon une étude française1 effectuée auprès de plusieurs médecins généralistes entre 1990-1991,
l’incidence de la mononucléose en France se situe entre 29’000-114'000 cas/an, dont 87%
apparaissent avant l’âge de 25 ans. La primo-infection à EBV, chez l’adulte, donne dans 50 %
des cas une mononucléose infectieuse. Mais la plupart des primo-infections à EBV se font très
tôt dans l’enfance et passent inaperçues. Après une incubation de 4-8 semaines, les symptômes
qui apparaissent se traduisent sous forme de fatigue intense, forte fièvre, angine et
adénopathie. Dans plus de 50% des cas, une splénomégalie est observée. La maladie se guérit
entre 2-4 semaines, en laissant néanmoins persister une fatigue plus ou moins intense. Parfois,
la mononucléose peut évoluer en infection chronique. La sérologie est utilisée pour le diagnostic
et le traitement est symptomatique. [1]
•
Infection chronique à EBV
C’est une infection chronique ou une mononucléose infectieuse récurrente grave dont les
symptômes durent plus d’un an. Ce cas est rare et survient chez des personnes
immunocompétentes. Si elle est grave, cette infection est associée à une forte mortalité (43%).
Elle peut également évoluer vers un lymphome. [1]
•
Infection persistante normale
Après la primo-infection à EBV, le virus demeure toute la vie dans l’organisme. Le plus souvent
il persiste à l’état latent dans les lymphocytes B, le patient n’a donc aucun symptôme. Mais
parfois, le virus peut se réactiver. [1]
1
M.G.G., D. Abramowitch, J. M. Mosnier & A. Cohen. 1992
Incidence de la mononucléose infectieuse diagnostiquée en médecine générale en France. (http://www.bioforma.net/cahiers/cahier36.pdf)
Carole Fracheboud
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Travail de diplôme
•
Immunologie
Nov. 2011 – Avril 2012
Réactivation
Après la primo-infection, l’EBV persiste à vie dans quelques lymphocytes B chez le sujet
immunocompétent. Lors d’une immunodéficience, une minorité de lymphocytes B infectés de
façon latente entrent en infection lytique, c’est la réactivation du virus. Le sujet excrète alors le
virus dans sa salive.
•
Tumeurs malignes
L’EBV est associé au lymphome de Burkitt, au carcinome rhinopharyngé et à la maladie de
Hodgkin. Les mécanismes qui entrent en jeu dans ces maladies sont très complexes.
•
Syndrome lymphoprolifératif post-transplantation
Lorsqu’un patient séronégatif pour EBV reçoit une greffe, il présente un grand risque de
syndrome lymphoprolifératif post-transplantation. Ce risque est dû à une immunité cellulaire
anti-EBV déficiente à cause du traitement immunosuppresseur administré lorsqu’une greffe est
effectuée. [1]
2.2.4 Diagnostic
Le diagnostic de l’infection par le virus Epstein-Barr est réalisé dans la plupart des cas par la
recherche d’anticorps spécifiques et l’analyse du profil sérologique. Un frottis sanguin peut
également être effectué. Parfois, chez les patients immunodéprimés, la détection du génome
viral (PCR) est nécessaire.
2.2.4.1
Hématologie
En cas de mononucléose infectieuse, le diagnostic repose sur l’examen clinique et la mise en
évidence, par un frottis sanguin, de l’augmentation du nombre de lymphocytes et de
monocytes et la présence de lymphocytes stimulés (lymphocytes hyperbasophiles). Ces derniers
se caractérisent par leur grande taille et un cytoplasme étendu fixant les colorants basiques.
2.2.4.2
Sérologie
Pour diagnostiquer une infection à EBV, il est nécessaire d’effectuer des tests sérologiques
(recherche d’anticorps dirigés contre les protéines VCA, EBNA et EA). La cinétique des
différents anticorps luttant contre ce virus permet de dater l’infection.
•
Anticorps hétérophiles : ce sont des anticorps non spécifiques de l’EBV qui surviennent au
cours de la mononucléose infectieuse. Ce sont des IgM qui ont la capacité d’agglutiner des
globules rouges animaux (mouton, cheval, bœuf) ou des particules de latex recouvertes
d’antigènes érythrocytaires.
C’est un bon test pour identifier cette maladie. Néanmoins, ces anticorps ne sont détectables
au début de la mononucléose infectieuse que pour 60 à 80% des patients.
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Immunologie
Nov. 2011 – Avril 2012
•
VCA (Virus Capsid Antigen) : les IgM anti-VCA, très précoces, apparaissent dès les
premiers symptômes et disparaissent en 2 à 3 mois après le début de ceux-ci. Les IgG antiVCA apparaissent 2 à 3 semaines après les premiers symptômes et persistent toute la vie.
Lorsque le virus se réactive, une augmentation du titre des anticorps anti-VCA peut être
observée.
•
EA (Early Antigen) : les anticorps anti-EA apparaissent dès le début de la maladie et
disparaissent en 2 à 3 mois. Ils peuvent réapparaître chez des patients immunodéficients et
traduisent alors une réactivation virale.
•
EBNA (Epstein-Barr Nuclear Antigen) : les anticorps IgG anti-EBNA apparaissent
environ 3 mois après la primo-infection. Ils restent présents dans le sang durant toute la vie
mais peuvent diminuer, et parfois disparaître, s’il y a une baisse de l’immunité cellulaire T. [1]
Figure 3 : Cinétique des anticorps lors d’une infection à EBV
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Travail de diplôme
Immunologie
Nov. 2011 – Avril 2012
L’interprétation du profil sérologique est représentée dans le tableau ci-dessous :
VCA IgG
VCA IgM
VCA IgA
EA IgG
EBNA
-
-
-
-
-
- ou +
+
- ou +
++ ou -
-
+ ou ++
-
-
-
+ ou ++
Réactivation
+++
-
+ ou -
++
+
Lymphome de Burkitt
associé à l’EBV
+++
-
-
+++
+ ou -
Carcinome indifférencié du
nasopharynx
+++
-
+++ ou
++
+++
++ ou
+++
Sujet séronégatif
MNI aiguë
Infection ancienne
Tableau 1 : Profil sérologique EBV
2.2.5 Traitement
Le traitement est essentiellement symptomatique. Cependant, dans certaines situations, des
corticoïdes et des anti-viraux peuvent être recommandés. Parfois, des antipyrétiques et des
analgésiques sont également prescrits.
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Travail de diplôme
2.3
Immunologie
Nov. 2011 – Avril 2012
Caractéristiques des deux méthodes
Méthode
Référence
Nouvelle
Fournisseur
Diasorin
Siemens
Appareil
ETIMAX 3000™
BEP 2000 Advance®
Technique
ELISA indirect (Virotech)
ELISA indirect (Siemens)
Antigènes
Anticorps dosés
VCA
IgM
Unité
EBNA
IgG
Index
IgG
VCA, EA, EBNA
IgM
IgG
IgA
Absorbance (IgM, IgA)
U/ml (IgG)
Figure 5 : Kit Enzygnost® Anti-EBV/
IgM II de Siemens
Figure 4 : Kit Virotech EBNA-IgG
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Travail de diplôme
3
Immunologie
Nov. 2011 – Avril 2012
But
Evaluation d’une nouvelle méthode (Enzygnost de Siemens) utilisée en routine pour le dosage
des anticorps dirigés contre le virus Epstein-Barr par la technique ELISA, sur l’appareil
Bep2000 Advance® de Siemens.
BEP2000 Advance
Pipeteur
Tiroir d‘accès à
l‘unité de
lavage
Tiroir pour les
embouts jetables et
plaques de pré
dilution
Echantillon et
réactifs
Station de rinçage
pipeteur
Ejection des embouts
Chargement des
plaques
Figure 6 : Description du Bep2000 Advance
BEP2000 Advance
Transport des microplaques
Incubateurs (x4)
Photomètre
Laveur
Eau distillée
Flacons déchets liquides
Solutions lavage (x3)
+ 1 eau distillée
Figure 7 : Description du tiroir des solutions de lavage du Bep2000 Advance
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Travail de diplôme
4
Immunologie
Nov. 2011 – Avril 2012
Développement
4.1
Matériel
Automate :
Bep 2000 Advance® de Siemens
Bep 1 n° de série : 9163000641
Bep 2 n° de série : 9163000565
Réactifs communs pour EBV IgM, IgG et IgA :
Diluant
Lot : 426726/426727
Date d’expiration : 20.10.2012/29.12.2012
Substrat
Lot : 450758/450763
Date d’expiration : 11.01.2013/09.08.2013
Chromogène
Lot : 450657/450662
Date d’expiration : 16.12.2012/13.07.2013
Solution Stop
Lot : 450406 A/450492 A
Date d’expiration : 31.07.2013/06.04.2015
Solution Wash
Lot : 450182/450163
Date d’expiration : 18.01.2013/19.06.2014
Réactif à ajouter pour le kit IgM et IgA :
RF-absorbant
Lot : 441737
Date d’expiration : 04.08.2012
Conjugué IgM
Lot : 441237
Date d’expiration : 14.08.2012
Conjugué IgA
Lot : 441617
Date d’expiration : 19.09.2012
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Travail de diplôme
Immunologie
Nov. 2011 – Avril 2012
Contrôles pour le kit IgM et IgA :
Contrôle positif
Lot : 441437
Date d’expiration : 14.08.2012
Contrôle négatif
Lot : 441337
Date d’expiration : 14.08.2012
Réactif à ajouter pour le kit IgG :
Conjugué IgG
Lot : 423985/423986
Date d’expiration : 27.08.2012/24.05.2014
Contrôle pour le kit IgG :
Contrôle P/N
Lot : 426688/426689
Date d’expiration : 04.07.2012/14.09.2012
82 échantillons de sérum frais ou congelés
Matériel standard de laboratoire
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Travail de diplôme
4.2
Immunologie
Nov. 2011 – Avril 2012
Méthode
Les dosages immunoenzymatiques sont apparus relativement récemment. Les premiers ELISA
(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) sont effectués en 1971. C’est une technique
biochimique permettant de détecter la présence d’un antigène ou d’un anticorps se trouvant
dans un échantillon (sérum).
Différentes étapes sont effectuées lors de la réalisation de la technique ELISA pour le virus
Epstein-Barr sur le Bep2000 Advance :
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Fixation de l’antigène sur la plaque : pour l’appareil mentionné ci-dessus, une plaque
de microtitration commerciale est utilisée où l’antigène est déjà fixé au fond des puits.
L’antigène est obtenu sur des cellules lymphoblastoïdes infestées par l’EBV. Dans chaque
puits se trouvent des antigènes de la capside virale (Ag VCA), des antigènes présents sur
le noyau cellulaire de l’EBV (Ag EBNA) et des antigènes dits « précoces » (Ag EA).
Dépôt du sérum du patient à tester puis incubation : les anticorps de l’EBV présents
dans l’échantillon se fixent spécifiquement sur l’antigène.
Lavage de la plaque qui permet aux anticorps qui ne se sont pas liés à l’antigène d’être
éliminés. Après le lavage, il ne reste que des complexes antigène-anticorps fixés au fond
du puits.
Ajout des anticorps anti-immunoglobulines humaines marqués par une enzyme
(conjugué) : ils vont se lier aux complexes antigène-anticorps.
Lavage de la plaque qui permet d’éliminer les anticorps en excès qui ne se sont pas liés
aux complexes antigène-anticorps.
Ajout du substrat incolore (chromogène) : si la réaction est positive (l’échantillon
contient des anticorps dirigés contre le virus Epstein-Barr), le substrat est dégradé et
une coloration bleue apparaît. Cette réaction est stoppée grâce à l’ajout d’une solution
d’arrêt POD qui colore la solution en jaune.
Quantification du résultat par une mesure spectrophotométrique de la réaction colorée
à 450 nm et 650 nm comme référence. L’intensité de la coloration est proportionnelle à
la concentration de l’anticorps recherché dans l’échantillon. [4 ; 5]
Figure 8 : Technique ELISA
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Travail de diplôme
Immunologie
Nov. 2011 – Avril 2012
Pour la recherche d’IgM et d’IgA, afin d’éviter qu’il y ait de faux positifs dus à la présence de
facteurs rhumatoïdes dans l’échantillon, un traitement est effectué à l’aide d’un réactif
absorbant ces facteurs. Le RF-absorbant se fixe aux IgG de l’échantillon à tester afin d’éviter
des faux positifs (facteurs rhumatoïdes) et des faux négatifs par compétition de site. Ce
traitement permet d’augmenter la sensibilité du test. [5]
Selon Siemens, le dosage des IgA anti-EBV spécifiques est parfois utile au diagnostic. Les
échantillons sur lesquels ce test doit être réalisé sont ceux dont le test Enzygnost® Anti-EBV/IgG
a démontré une activité > 650 U/ml et pour lesquels il est important de savoir si c’est une
réactivation de l’EBV ou une infection chronique et persistante. En général, les enfants n’ont
pas de valeur > 650 U/ml, ce dosage n’est donc pas utilisé pour eux. [5]
Statut de
l’échantillon
Négatif
Anti-EBV/IgM
Anti-EBV/IgG
Anti-EBV/IgA
négatif
négatif
-
Primo-infection
positif
positif ou négatif
-
Infection ancienne
négatif
positif
-
Réactivation
-
> 650 U/ml
positif
Tableau 2 : Résultats sérologiques combinés de l’exploration de l’EBV et leurs interprétations : SIEMENS
Carole Fracheboud
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Travail de diplôme
4.3
Immunologie
Nov. 2011 – Avril 2012
Résultats
Pour réaliser une évaluation de méthode, il faut analyser au minimum 20 échantillons. Ces
derniers doivent couvrir l’intégralité du domaine physiologique. Pour ce faire, il faut des
valeurs basses, moyennes et hautes. Les tests sont effectués avec la méthode de référence
(Virotech) et la nouvelle méthode (Enzygnost de Siemens). Les valeurs de Virotech sont celles
obtenues en routine. [6]
Pour cette évaluation de méthode, 73 échantillons ont été testés. Neuf échantillons early
antigen positifs ont également été testés. Les résultats se trouvent dans les tableaux ci-dessous :
Enzygnost
N° éch
1201140005
1112010270
1111250345
1111250255
1111240330
1112020198
1112025248
1111250290
1111255417
1201190104
1201195060
1201190371
1201170356
1201182053
1201180179
1201175476
1201120114
1201125230
1201170296
1201122027
1201130068
1201130213
1201210009
1201200341
1201230370
1201200235
1201200266
1201230305
1201260208
1201252085
1201255209
1201252131
1201275001
1201260319
1201285040
1201270018
1201270280
1109265219
IgM
(absorb.)
0.457
0.033
0.028
0.025
0.035
0.043
0.035
0.331
0.386
0.036
0.028
0.048
0.061
0.048
0.039
0.041
0.031
0.025
0.032
0.019
0.025
0.026
0.037
0.050
0.045
0.036
0.029
0.014
0.040
0.014
0.026
0.021
0.019
0.011
0.026
0.027
0.016
0.039
Carole Fracheboud
ESSante/TAB 51
IgG
(U/ml)
<25
126
52
55
82
117
184
<25
56
58
154
29
141
132
88
90
25
<25
<25
43
158
48
257
414
164
137
32
<25
234
268
83
1612
348
<25
95
<25
292
<25
IgA
(absorb.)
0.604
0.706
0.165
0.015
0.022
0.013
0.142
0.152
0.248
0.015
0.050
0.587
0.018
0.049
0.061
0.130
0.019
0.006
0.008
0.003
0.076
0.066
0.037
0.050
0.045
0.036
0.029
0.006
0.546
0.033
0.119
0.148
0.004
0.001
0.036
0.001
0.074
0.000
Virotech
IFI
Virotech
Monotest
(pos/neg)
VCA-IgM
(index)
VCA-IgM
(titre)
VCA-IgG
(index)
EBNA-IgG
(index)
pos
neg
neg
neg
neg
neg
neg
pos
pos
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
6.6
0.1
0.3
0.2
0.3
0.6
0.6
8.6
8.1
0.4
0.1
0.5
0.6
0.3
0.2
0.2
0.2
0.1
0.6
0.0
0.2
0.1
0.3
0.1
0.4
0.3
0.1
0.3
0.3
0.2
0.5
0.2
0.4
0.0
0.1
0.1
0.1
0.6
>40
<10
<10
<10
<10
<10
<10
>40
>40
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
4.9
7.7
5.0
5.7
7.8
4.8
7.1
1.1
4.1
5.0
5.3
4.1
4.9
7.0
5.4
4.9
4.0
0.2
0.6
4.4
6.6
3.5
8.4
8.5
7.2
8.8
4.5
0.4
7.1
5.4
1.9
9.0
6.7
0.2
7.7
0.2
7.3
0.1
2.2
2.3
3.2
3.8
7.2
4.1
1.7
0.2
0.2
2.6
3.2
1.0
1.6
6.5
6.5
6.2
5.1
0.0
0.1
3.7
4.3
1.5
0.8
1.9
0.5
3.2
5.5
0.5
8.1
4.6
4.0
8.1
8.1
0.1
7.2
0.1
6.6
0.0
16/113
Travail de diplôme
Immunologie
Enzygnost
Nov. 2011 – Avril 2012
Virotech
IFI
Virotech
N° éch
IgM
(absorb.)
IgG
(U/ml)
IgA
(absorb.)
Monotest
(pos/neg)
VCA-IgM
(index)
VCA-IgM
(titre)
VCA-IgG
(index)
EBNA-IgG
(index)
1110185474
1111045382
1111095333
1112075464
1112075274
1112125327
1112195097
1112225226
1112225110
1112215427
1111145258
1111155071
1201305418
1202025177
1202025176
1202025175
1202035175
1202065404
1202015248
1202015275
1202010238
1202022085
1202035056
1112125328
1108305522
1109295263
1109235191
1109235217
1109095319
1109095321
1201265069
1107015084
1108045198
1201195091
1112095327
0.021
0.020
0.013
0.019
0.051
0.012
0.018
0.011
0.013
0.019
0.028
0.322
0.056
0.026
0.026
0.068
0.034
0.062
0.051
0.064
0.024
0.024
0.026
0.081
0.089
0.421
0.123
0.161
0.053
0.108
0.393
0.082
0.048
0.039
0.598
<25
<25
38
<25
<25
<25
<25
<25
<25
<25
80
<25
81
79
39
47
247
55
105
156
183
141
228
<25
332
<25
112
<25
50
36
<25
<25
67
79
55
0.000
0.000
0.013
0.003
0.003
0.005
0.004
0.003
0.001
0.003
0.144
0.071
0.068
0.067
0.008
0.058
0.305
0.065
0.043
0.197
0.457
0.038
0.034
0.009
0.115
0.074
0.126
0.033
0.001
0.037
0.048
0.073
0.147
0.021
0.709
neg
neg
neg
neg
pos
neg
neg
neg
neg
neg
pos
pos
neg
neg
pos
pos
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
pos
neg
pos
neg
pos
pos
pos
pos
neg
neg
pos
pos
0.1
0.1
0.2
1.0
0.3
0.0
0.2
0.0
0.1
0.8
0.4
4.8
0.9
0.0
0.0
4.3
0.7
0.4
2.5
2.6
0.1
1.3
0.4
1.3
4.3
4.0
6.1
4.1
2.8
3.0
5.6
2.4
1.5
0.4
6.1
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
>40
<10
<10
<10
>40
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
>40
>40
>40
40
>40
>40
>40
>40
>40
<10
<10
>40
0.2
0.3
6.0
0.3
0.3
0.1
0.0
0.0
0.6
0.2
6.8
3.7
7.1
8.2
4.1
7.4
7.2
5.8
9.8
8.0
8.0
8.5
8.0
4.0
6.6
3.4
7.0
7.1
6.1
5.4
8.2
1.4
7.6
7.7
5.9
0.1
0.0
3.6
0.1
0.1
0.2
0.1
0.0
0.2
0.1
2.5
0.1
4.0
4.8
2.3
0.0
8.0
6.7
9.8
4.9
6.2
9.4
6.7
0.2
3.2
0.1
0.9
0.2
0.1
0.0
0.2
0.2
4.1
6.6
0.2
N°échantillon
2011.12.28.6197
2012.01.05.4523
2012.01.14.4730
2012.01.23.4073
2012.01.24.4167
2012.01.25.4350
2012.01.27.4638
2012.02.02.6445
2012.02.06.4042
Carole Fracheboud
ESSante/TAB 51
Enzygnost
IgM
IgG
(absorbance)
(U/ml)
0.051
277
0.028
253
0.059
47
0.028
492
0.043
269
0.036
510
0.406
90
0.046
1042
0.031
1089
IgA
(absorbance)
0.331
0.216
0.036
0.013
0.015
0.658
0.213
0.806
1.132
Luminex
EA-IgG
(U/ml)
458
185
386
162
231
170
705
250
187
17/113
Travail de diplôme
Immunologie
Nov. 2011 – Avril 2012
Les valeurs de référence se trouvent dans le tableau ci-dessous :
Enzygnost
Négatif
IgM
(absorb.)
< 0.120
Douteux
Positif
IgG
(absorb.)
< 0.100
> 0.200
IFI
Index
Titre
< 0.9
< 10
EA-IgG
(U/ml)
< 100
0.9 – 1.1
10
100 – 120
> 1.1
≥ 20
> 120
IgA
(absorb.)
< 0.600
0.100 – 0.200
≥ 0.120
Virotech
≥ 0.600
Luminex
Remarque : Dans la notice du fournisseur, l’interprétation des valeurs est faite en densité
optique, c’est pour cette raison que les valeurs de référence des IgG sont données dans cette
unité.
Lorsque les EBV IgM et IgA sont testés sur Siemens, les puits des plaques de microtitration sont à
double : la rangée gauche de chaque barrette est recouverte d’antigène obtenu sur des cellules
lymphoblastoïdes infestées par l’EBV, alors que la rangée droite est recouverte d’antigène
obtenu sur des cellules pour lesquelles la synthèse virale a été inhibée (antigène de contrôle).
Tous les résultats des paramètres IgM et IgA sont rendus en absorbance corrigée. Cette dernière
permet d’éliminer les fluctuations et les perturbations lors des mesures. C’est ce que l’on appelle
le lissage. Les variations que nous pouvons rencontrer sont en fonction de la série et du numéro
de lot. Le lissage permet donc d’obtenir de plus faibles coefficients de variations pour la
reproductibilité.
L’absorbance corrigée se calcule de la manière suivante :
1.
Calculer l’absorbance moyenne pour l’Anti-EBV positif.
∆D.O. = Puits avec l’Ag EBV – puits avec l’Ag de contrôle
2. Diviser la valeur nominale indiquée par le fabricant par cette valeur moyenne de
∆D.O. obtenue pour l’Anti-EBV positif. On obtient ainsi le facteur de correction.
valeur nominale
Facteur de correction = ——————————————————
valeur moyenne ∆D.O. Anti-EBV pos
3. Calculer la moyenne pour chaque échantillon et multiplier le résultat par le facteur
de correction.
D.O. corrigée = ∆D.O. échantillon ∗ facteur de correction [5]
Carole Fracheboud
ESSante/TAB 51
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Travail de diplôme
Immunologie
Nov. 2011 – Avril 2012
Les Early Antigen IgG (EA-IgG) ont été testés par le laboratoire de St-Gall selon la méthode
Luminex.
Grâce à cette méthode, il est possible de mesurer plusieurs analytes dans 50µl de sérum, de
plasma ou d’une culture cellulaire.
Des microbilles de polystyrène sont colorées avec différentes concentrations de deux
fluorophores (rouge et infrarouge) permettant d’individualiser 100 types de microbilles.
Chaque type de billes est marqué avec un antigène spécifique. Un kit comprend une solution
qui est composée d’un mélange de différents types de microbilles (avec différents antigènes
spécifiques), ceci permettant la détection de plusieurs antigènes en une seule fois.
Le sérum du patient est ajouté sur les billes de polystyrène et les anticorps présents dans
l’échantillon vont se fixer sur l’antigène spécifique. Un anticorps marqué par un fluorochrome
est ajouté et se lie au complexe bille-antigène/anticorps.
Antigène
Microbille
Anticorps
du patient
Anticorps marqué
par un
fluorochrome
Le Luminex analyzer est doté d’un double laser :
•
un laser rouge qui excite les fluorochromes incorporés aux billes pour l’identification
précise de chacune d’elles. Les billes excitées par le laser rouge réémettent, de façon
différente, une fluorescence rouge et infrarouge. Elles sont donc identifiées par l’intensité
des deux fluorescences qui sont enregistrées par un capteur à la sortie du flux.
•
un laser vert qui excite le fluorochrome couplé à une molécule reporter (ex : antiimmunoglobuline) et qui détecte l’interaction antigène/anticorps se produisant à la
surface de la bille après avoir ajouté un conjugué marqué avec un fluorochrome
émettant dans le vert. La fluorescence témoigne de la réaction à la surface de la bille et
détermine si la réaction est positive en fonction d’un seuil de fluorescence propre à
chaque bille. [7]
Figure 9 et 10 : Lasers rouge et vert excitant une microbille
Carole Fracheboud
ESSante/TAB 51
19/113
Travail de diplôme
Immunologie
Nov. 2011 – Avril 2012
4.3.1 Répétabilité
Elle contribue à vérifier la fidélité des résultats obtenus lors de l’analyse d’un même échantillon
pour un paramètre défini dans des conditions standardisées (même méthode réalisée par le
même opérateur, utilisant le même appareil ainsi que les mêmes réactifs pendant un court
intervalle de temps). Cette étude est effectuée au cours d’une même série en utilisant, dans la
mesure du possible, des échantillons de niveaux de concentration différents (bas, moyen, haut).
Les échantillons choisis sont dosés 3-4 fois pour le paramètre défini. Puis on détermine la
moyenne, l’écart-type et le coefficient de variation (CV). Celui-ci est comparé avec le CV du
fabricant. [6]
Répétabilité EBV IgM
5263-29.09.11
1
0.492
2
0.456
3
0.533
4
0.483
Moyenne
0.491
CV%
6.50
5333-09.11.11
1
0.023
2
0.019
3
0.018
4
0.013
Moyenne
0.018
CV%
22.5
CV du fabricant : 5.2 % (échantillon positif)
6.1 % (échantillon négatif)
Le CV de l’échantillon positif est un peu plus haut que celui du fabricant, mais il est néanmoins
évalué comme bon.
Répétabilité EBV IgG
341-20.01.12
1
520
2
567
3
544
4
537
Moyenne
542
CV%
3.59
5217-23.09.11
1
0.023
2
0.019
3
0.025
4
0.034
Moyenne
0.025
CV%
25.1
CV du fabricant : 7.6 %
Le CV de l’échantillon positif est bon et est également meilleur que celui annoncé par le
fabricant.
Carole Fracheboud
ESSante/TAB 51
20/113
Travail de diplôme
Immunologie
Nov. 2011 – Avril 2012
Répétabilité EBV IgA
Il n’est pas possible de tester la répétabilité sur plusieurs niveaux de concentration pour le
paramètre EBV IgA car il n’y a pas de sérum positif en quantité suffisante pour le séparer en 4
tubes. Elle a donc été réalisée sur un seul échantillon négatif.
5226-22.12.11
1
0.001
2
0.001
3
0.000
4
0.004
Moyenne
0.002
CV%
115
CV du fabricant : 3.9 % (échantillon négatif)
Pour les échantillons négatifs de chaque paramètre, nous obtenons de grands coefficients de
variation. Ces CV élevés sont dus à des résultats rendus en absorbance avec de très petites
valeurs. Une variation minime de ces valeurs donne un très grand CV. Il n’y a pas de différence
significative entre les valeurs des échantillons négatifs.
Nous pouvons donc considérer les répétabilités de ces trois paramètres comme bonnes dans ces
conditions de travail.
Carole Fracheboud
ESSante/TAB 51
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Travail de diplôme
Immunologie
Nov. 2011 – Avril 2012
4.3.2 Reproductibilité
Elle consiste à vérifier la fidélité des résultats obtenus lors de l’analyse d’un même échantillon
pour un paramètre défini dans des conditions différentes (facteurs environnementaux, autre
opérateur, jours différents). Cette étude est effectuée au cours de séries consécutives. Il est
préconisé d’employer plusieurs niveaux de concentration (bas, moyen, haut). Les échantillons
choisis sont dosés 3-4 fois pour le paramètre défini. Puis on détermine la moyenne, l’écart-type
et le coefficient de variation (CV). Celui-ci est comparé avec le CV du fabricant. [6]
Reproductibilité EBV IgM
5263-29.09.11
1 jour
0.542
e
2
0.574
3e
0.500
4e
0.535
5e
0.505
Moyenne
0.531
CV%
5.67
er
5464-07.12.11
1 jour
0.035
2e
0.043
3e
0.037
4e
0.037
5e
0.036
Moyenne
0.038
CV%
8.33
er
CV du fabricant : 2.1 % (échantillon positif)
2.8 % (échantillon négatif)
Les CV de l’échantillon positif et négatif sont un peu plus élevés que ceux du fabricant mais
sont toutefois considérés comme bons.
Reproductibilité EBV IgG
5001-27.01.12
1 jour
335
2e
273
3e
240
4e
289
5e
203
Moyenne
268
CV%
18.6
er
5217-23.09.12
1 jour
0.044
e
2
0.024
3e
0.026
4e
0.040
5e
0.025
Moyenne
0.032
CV%
29.7
er
CV du fabricant : 9.5%
Le CV de l’échantillon positif est plus haut que celui annoncé par le fabricant. Néanmoins, ce
résultat est bon.
Pour l’échantillon négatif, le CV est un peu élevé. Cependant, il n’y a pas de différence
significative entre les valeurs obtenues pour cet échantillon.
Carole Fracheboud
ESSante/TAB 51
22/113
Travail de diplôme
Immunologie
Nov. 2011 – Avril 2012
Reproductibilité EBV IgA
5327-09.12.11
1 jour
0.955
2e
1.022
3e
0.927
4e
0.963
5e
0.844
Moyenne
0.942
CV%
6.89
er
5226-22.12.11
1 jour
0.001
2e
0.001
3e
0.000
4e
0.007
5e
0.003
Moyenne
0.002
CV%
116
er
CV du fabricant : 7.1 % (échantillon positif)
3.9 % (échantillon négatif)
Le CV de l’échantillon positif est bon et meilleur que celui annoncé par le fabricant.
Pour l’échantillon négatif, un CV de 116 % est obtenu. Cette grande valeur est due à des
résultats très petits donnés en absorbance. Une petite variation de ces valeurs donne un très
grand CV.
La reproductibilité est bonne pour les trois paramètres ci-dessus.
Carole Fracheboud
ESSante/TAB 51
23/113
Travail de diplôme
Immunologie
Nov. 2011 – Avril 2012
4.3.3 Exactitude
L’exactitude indique la proximité entre la valeur mesurée d’un échantillon et sa valeur vraie
ou valeur cible. Pour ce test, un contrôle de qualité externe (CQ) peut être utilisé comme
échantillon. La valeur vraie de cet échantillon correspond à la moyenne de l’ensemble des
valeurs trouvées par les laboratoires participants à cette analyse. [6]
Biais % =
(m − v)
∗ 100
v
m = valeur mesurée
v = valeur vraie
Il m’est impossible de tester ce paramètre car il n’existe pas de standard international pour
l’EBV et nous ne possédons pas de valeur de contrôle de qualité externe pour ce virus sur le kit
Siemens.
4.3.4 Contamination entre échantillons
Ce test est utilisé pour vérifier que le rinçage de l’automate est efficace. Il faut d’abord rincer
l’appareil, puis passer un échantillon fortement positif en triplicata, suivi d’un échantillon
négatif en triplicata. Pour déterminer la contamination, il faut calculer le coefficient de
variation des échantillons négatifs. Il doit être sensiblement le même que celui de la
reproductibilité. [6]
Le Bep 2000 change l’embout de la pipette entre chaque échantillon et chaque réactif ce qui
diminue fortement le risque de contamination. La seule contamination possible est au niveau
du peigne avec lequel il aspire les différents liquides.
Il n’est pas nécessaire de réaliser ce test de contamination, car une validation est effectuée à la
fin de chaque semaine, avec un kit de validation Siemens. Cette validation vérifie plusieurs
étapes :
•
•
•
•
Précision et distribution d’une petite et grande quantité de liquide
Précision du pipetage d’une petite et grande quantité de liquide
Efficacité de l’aspiration
Tests de lavage (deux barrettes doivent être remplies uniformément et deux
autres barrettes doivent être complètement vides ce qui permet de vérifier
que les lavages sont effectués de manière adéquate et que le peigne ne
présente aucun problème).
Si aucun des résultats du test de validation n’est indiqué comme « défectueux », et si
l’inspection visuelle ne montre aucun problème, le test est validé et l’appareil peut être utilisé
sans aucune restriction. [8]
Carole Fracheboud
ESSante/TAB 51
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Immunologie
Nov. 2011 – Avril 2012
4.3.5 Sensibilité et spécificité
Lorsqu’une nouvelle méthode ou un nouveau test est en développement, il est important de
déterminer sa sensibilité et sa spécificité. Pour ce faire, plusieurs échantillons déjà testés sur la
méthode de référence (gold standard) sont utilisés afin de mesurer la capacité de la nouvelle
méthode ou du nouveau test à prédire si la maladie est présente ou non.
Un gold standard est un test qui sert de référence dans un domaine pour établir la validité
d'un résultat ou d’une méthode par exemple.
Un vrai positif (VP) est un échantillon dont le résultat est rendu positif par les deux
méthodes (nouvelle méthode et méthode de référence).
Un vrai négatif (VN) est un échantillon dont le résultat est rendu négatif par les deux
méthodes.
Un faux positif (FP) est un échantillon trouvé négatif avec la méthode de référence et
positif avec la nouvelle méthode alors qu’un faux négatif (FN) est un échantillon trouvé
positif avec la méthode de référence et négatif avec la méthode à tester.
Voici les deux tableaux avec lesquels ont été calculées la sensibilité et la spécificité des IgM et
des IgG :
IF
IgM
Siemens
Positif
Négatif
Positif
9 (VP)
6 (FN)
15
Négatif
0 (FP)
58 (VN)
58
9
64
73
Pour le paramètre IgM, l’ELISA est utilisé comme test de screening et l’immunofluorescence
indirecte (IF) comme test de confirmation. C’est pour cette raison que la sensibilité est calculée
en comparaison avec l’immunofluorescence indirecte (gold-standard).
IgG
Siemens
Carole Fracheboud
ESSante/TAB 51
Positif
Négatif
Virotech
Positif
Négatif
43
0
15
15
58
15
43
30
73
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Travail de diplôme
Immunologie
Nov. 2011 – Avril 2012
La sensibilité est la probabilité d’avoir un test positif quand le patient est malade.
Sensibilité % =
VP
∗ 100
VP + FN
9
∗ 100 = 60 %
9+6
Sensibilité % (IgM) =
Sensibilité % (IgG) =
43
∗ 100 = 74 %
43 + 15
Sensibilité donnée par le fabricant (IgM) : 96 %
Sensibilité donnée par le fabricant (IgG) : 92 %
Les sensibilités ont été testées en parallèle avec Enzygnost® Anti-EBV/IgM II, Enzygnost® AntiEBV/IgG et des méthodes comparables.
La spécificité est la probabilité d’avoir un test négatif quand le patient n’est pas malade.
Spécificité % =
VN
∗ 100
VN + FP
Spécificité % (IgM) =
58
∗ 100 = 100 %
58 + 0
Spécificité % (IgG) =
15
∗ 100 = 100 %
15 + 0
Spécificité donnée par le fabricant (IgM) : 99.3 %
Spécificité donnée par le fabricant (IgG) : 100 %
Les spécificités ont été testées en parallèle avec Enzygnost® Anti-EBV/IgM II, Enzygnost® AntiEBV/IgG et des méthodes comparables.
Carole Fracheboud
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Nov. 2011 – Avril 2012
La valeur prédictive positive (VPP) du test est la probabilité d’avoir la maladie quand le
test est positif.
VPP % =
VP
∗ 100
VP + FP
VPP % (IgM) =
9
∗ 100 = 100 %
9+0
VPP % (IgG) =
43
∗ 100 = 100 %
43 + 0
La valeur prédictive négative (VPN) du test est la probabilité de ne pas avoir la maladie
quand le test est négatif.
VPN % =
Carole Fracheboud
ESSante/TAB 51
VN
∗ 100
VN + FN
VPN % (IgM) =
58
∗ 100 = 91 %
58 + 6
VPN % (IgG) =
15
∗ 100 = 50 %
15 + 15
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Travail de diplôme
4.4
Immunologie
Nov. 2011 – Avril 2012
Discussion des résultats
Dans les kits Enzygnost de Siemens utilisés sur le Bep2000, les antigènes du virus Epstein-Barr
(VCA-IgG, VCA-IgM, EBNA-IgG) sont tous dans le même puits. Avec les kits Virotech utilisés sur
l’Etimax, chaque antigène se trouve dans un puits différent.
Les résultats obtenus pour la reproductibilité et la répétabilité de chaque paramètre (IgM, IgG
et IgA) sont satisfaisants et sont donc validés.
4.4.1 Enzygnost® Anti-EBV/IgM II
Des discordances pour les résultats des IgM ont été observées entre les deux méthodes. Plusieurs
échantillons rendus positifs avec la méthode Virotech sont sortis négatifs avec la méthode
Siemens. C’est pour cela que la sensibilité des IgM est de 60%.
Prenons comme exemple ces quatre échantillons :
Enzygnost
Virotech
IFI
Virotech
N°éch
IgM
(absorb.)
IgG
(U/ml)
IgA
(absorb.)
Monotest
(pos/neg)
VCA-IgM
(index)
VCA-IgM
(titre)
VCA-IgG
(index)
EBNA-IgG
(index)
1202025175
1112125328
1109095319
1109095321
0.068
0.081
0.053/0.055
0.108/0.115
47
<25
50
36
0.058
0.009
0.001
0.037
pos
pos
pos
pos
4.3
1.3
2.8
3.0
>40
>40
>40
>40
7.4
4.0
6.1
5.4
0.0
0.2
0.1
0.0
Le profil typique d’une primo-infection est le suivant :
Monotest
VCA-IgM
VCA-IgG
EBNA-IgG
pos
pos
pos
neg
Nous constatons donc, grâce à la méthode de référence (Virotech), que tous ces patients
souffrent d’une primo-infection.
La méthode Siemens rend tous les IgM négatifs, elle est donc moins sensible et moins bonne que
celle de référence.
Carole Fracheboud
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Immunologie
Nov. 2011 – Avril 2012
4.4.2 Enzygnost® Anti-EBV/IgG
En ce qui concerne les EBV IgG, la sensibilité est de 74%. Les résultats rendus douteux par le
Bep2000 sont considérés comme négatifs selon le protocole d’utilisation Enzygnost® AntiEBV/IgG.
Si nous utilisons les résultats douteux comme des résultats positifs, la sensibilité augmente à
86%.
IgG
Positif
Négatif
Siemens
Virotech
Positif
Négatif
50
0
8
15
58
15
Sensibilité % =
Sensibilité % (IgG) =
50
23
73
VP
∗ 100
VP + FN
50
∗ 100 = 86 %
50 + 8
Il serait peut-être plus judicieux de considérer tous les résultats douteux comme des résultats
positifs.
Nous pouvons également nous demander si la cinétique des anticorps est décalée.
Prenons les échantillons ci-dessous comme exemple :
Enzygnost
N° éch
1201140005
1111250290
1111155071
1112125328
1109295263
1109235217
1201265069
1107015084
IgM
(absorb.)
0.457
0.331
0.322
0.081
0.421
0.161
0.393
0.082
IgG
(U/ml)
<25
<25
<25
<25
<25
<25
<25
<25
IgA
(absorb.)
0.604
0.152
0.071
0.009
0.074
0.033
0.048
0.073
Monotest
(pos/neg)
pos
pos
pos
pos
pos
pos
pos
neg
Virotech
IFI
VCA-IgM
(index)
6.6
8.6
4.8
1.3
4.0
4.1
5.6
2.4
VCA-IgM
(titre)
>40
>40
>40
>40
>40
>40
>40
>40
Virotech
VCA-IgG
(index)
4.9
1.1
3.7
4.0
3.4
7.1
8.2
1.4
EBNA-IgG
(index)
2.2
0.2
0.1
0.2
0.1
0.2
0.2
0.2
Pour tous les échantillons se trouvant dans le tableau ci-dessus, les IgG sont négatifs avec la
méthode Enzygnost et positifs avec la méthode Virotech.
Carole Fracheboud
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Un mois plus tard, le patient 0005-14.01.12 a été repiqué : le numéro d’échantillon est le 009323.02.12. Voici ci-dessous les résultats obtenus pour cet échantillon :
Virotech
IFI
Virotech
N° éch
Monotest
(pos/neg)
VCA-IgM
(index)
VCA-IgM
(titre)
VCA-IgG
(index)
EBNA-IgG
(index)
1202230093
neg
3.7
>40
6.7
0.2
Nous pouvons observer que les IgG testés avec Virotech sont positifs et les EBNA sont devenus
négatifs. Ce résultat confirme l’idée que la cinétique est décalée. Pour être sûr de cette théorie,
ces patients auraient dû être repiqués deux semaines plus tard. Cela n’était pas possible car
plusieurs sérums utilisés pour cette évaluation de méthode proviennent de la sérothèque du
laboratoire.
Nous constatons également la présence de faux positifs avec les EBNA Virotech en cas de
mononucléose infectieuse.
4.4.3 Enzygnost® Anti-EBV/IgM II/conjugué IgA
Pour les IgA, la situation est plus complexe car seuls 3 échantillons sont positifs sur les 73 testés.
Le dosage des IgA est recommandé lorsqu’il y a suspicion de réactivation virale, d’infection
chronique persistante et lorsque la valeur des IgG est > 650 U/ml.
Cependant, nous avons constaté que les IgA peuvent être positifs également lorsque les IgG
sont très en-dessous de 650 U/ml et lors d’une primo-infection. Ce dosage n’a donc pas
beaucoup d’intérêt.
Carole Fracheboud
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5
Immunologie
Nov. 2011 – Avril 2012
Conclusion
Le but de ce travail est d’effectuer une évaluation de méthode (Enzygnost de Siemens) pour le
dosage en routine des anticorps dirigés contre le virus Epstein-Barr en comparaison avec la
méthode Virotech.
Résumé de l’ensemble des résultats :
1. La répétabilité est bonne pour les trois paramètres (IgM, IgG et IgA).
2. La reproductibilité est bonne pour les trois paramètres (IgM, IgG et IgA).
3. La contamination est vérifiée une fois par semaine par un kit Siemens.
4. La sensibilité est de 60% pour les IgM et de 74% pour les IgG.
5. La spécificité est de 100% pour les IgM et les IgG.
Au niveau de la répétabilité, de la reproductibilité, de la contamination et de la spécificité
cette méthode peut être validée. Le problème de cette méthode se situe au niveau de la
sensibilité des tests IgM et IgG. Cette dernière est faible pour les IgM et insuffisamment élevée
pour les IgG. Nous passerions à côté des mononucléoses infectieuses en utilisant les kits Siemens.
Ces sensibilités ne sont pas assez satisfaisantes pour pouvoir utiliser cette méthode d’analyse
pour la détection des anticorps dirigés contre le virus Epstein-Barr. Nous avons donc décidé
d’abandonner la méthode Siemens.
Durant le déroulement de cette évaluation de méthode, la difficulté rencontrée était d’obtenir
des sérums avec des IgM positifs ainsi que des IgG négatifs afin de pouvoir calculer les
sensibilités et les spécificités sur un nombre correct d’échantillons.
J’ai rapidement testé les kits Novagnost VCA-IgM, VCA-IgG et EBNA-IgG de Siemens pour la
détection des anticorps du virus Epstein-Barr. Ce test a une meilleure sensibilité que celle
obtenue avec les kits Enzygnost de Siemens. La méthode Novagnost est sûrement celle qui sera
choisie pour détecter les anticorps dirigés contre le virus Epstein-Barr.
Personnellement, ce travail m’a permis de bien comprendre le déroulement d’une
comparaison de méthode. Cela m’a également permis de voir la mise en place d’un nouvel
automate en routine. Le Bep 2000 a été installé un mois après mon arrivée au laboratoire
Synlab. J’ai donc également effectué une comparaison de méthode pour les paramètres cidessous :
•
•
•
•
•
Varicelle IgM et IgG
Rougeole IgM et IgG
Oreillons IgM et IgG
Helicobacter pylori IgG et IgA
Herpes simplex IgG
Carole Fracheboud
ESSante/TAB 51
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Travail de diplôme
6
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Nov. 2011 – Avril 2012
Remerciements
•
M. Druon Jean-Michel, biologiste et coresponsable de mon travail de diplôme.
•
Mme Cipolli Mercedes, technicienne en analyses biomédicales et coresponsable de mon
travail de diplôme.
•
Mmes Monti Véronique, Liniger Corinne et Burgener Bénédicte pour leur soutien durant la
réalisation de mon travail de diplôme.
Carole Fracheboud
ESSante/TAB 51
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Travail de diplôme
7
Immunologie
Nov. 2011 – Avril 2012
Bibliographie
Texte :
[1] Seigneurin, J.-M., Fafi-Kremer, S., Baccard, M. & Morand, P. (2006). Cahier de formation,
biologie médicale n°36 : Le virus Epstein-Barr et les marqueurs de l’infection [Page Web].
Accès :
http://www.bioforma.net/cahiers/cahier36.pdf (page consultée le 11 janvier 2012)
[2] Faculté de médecine Pierre et Marie Curie (8 février 2008). Les Herpesviridae [Page Web].
Accès :
http://www.chups.jussieu.fr/polys/viro/poly/POLY.Chp.3.2.html (page consultée le 12 janvier
2012)
[3] Passeportsanté.net (janvier 2011). Mononucléose [Page Web]. Accès :
http://www.passeportsante.net/fr/Maux/Problemes/Fiche.aspx?doc=mononucleose_pm
(page consultée le 12 janvier 2012)
[4] Elisa (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) [Page Web]. Accès :
http://www.memobio.fr/html/immu/im_au_eli.html (page consultée le 13 janvier 2012)
[5] Protocole d’utilisation Enzygnost® Anti-EBV/IgM II, Siemens Healthcare Diagnostics
Products GmbH, Edition 2011
[6] 42 GS Lignes directrices pour l’évaluation de méthodes, Groupes AMS, crée le 12.05.2009
[7] Moalic V., Mercier B. & Ferec C. (2004). Technologie luminex™ : principe, applications et
perspectives [Page Web]. Accès :
http://www.elasitalia.it/files/341_9_4.pdf (page consultée le 2 avril 2012)
[8] Classeur de liaison Bep® 2000, Procédure d’évaluation, Siemens Healthcare Diagnostics
Products GmbH, Mars 2009
Carole Fracheboud
ESSante/TAB 51
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Travail de diplôme
Immunologie
Nov. 2011 – Avril 2012
Illustrations :
Figure 1 : Répartition des laboratoires Synlab en Suisse
http://www.synlab.ch/3667.html?L=7
Figure 2 : structure et organisation du virus Epstein-Barr
http://cullenlab.duhs.duke.edu/research/ebv/
Figure 3 : Cinétique des anticorps lors d’une infection à EBV
http://www.memobio.fr/html/viro/vi_ebv_di.html
Figure 4 : Kit Virotech EBNA-IgG
Photo prise avec mon appareil photo au laboratoire Synlab à Lausanne
Figure 5 : Kit Enzygnost® Anti-EBV/IgM II de Siemens
Photo prise avec mon appareil photo au laboratoire Synlab à Lausanne
Figure 6 : Description du Bep2000 Advance
Siemens (4 mars 2010). Solution pour l’automatisation des techniques ELISA, microplaques
[Présentation Power Point]
Figure 7 : Description du tiroir des wash du Bep2000 Advance
Siemens (4 mars 2010). Solution pour l’automatisation des techniques ELISA, microplaques
[Présentation Power Point]
Figure 8 : Technique ELISA
http://www.liv.ac.uk/~agmclen/Medpracs/practical_5/theory_5.html
Figure 9 et 10 : Lasers rouge et vert excitant une microbille
http://www.elasitalia.it/files/341_9_4.pdf
Tableaux :
Tableau 1 : Profil sérologique EBV
http://www.bioforma.net/cahiers/cahier36.pdf
Tableau 2 : Résultats sérologiques combinés de l’exploration de l’EBV et leurs interprétations :
SIEMENS
Protocole d’utilisation Enzygnost® Anti-EBV/IgM II, Siemens Healthcare Diagnostics Products
GmbH, Edition juin 2011
Carole Fracheboud
ESSante/TAB 51
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Travail de diplôme
8
Immunologie
Nov. 2011 – Avril 2012
Lexique
Absorbance : intensité d’absorption d’une lumière monochromatique par une substance en
solution. L’absorbance est directement proportionnelle à la concentration de la substance.
ADN (acide désoxyribonucléique) : polymère de nucléotides double brin localisé dans les
chromosomes qui contient l’information génétique.
Analyte : substance à analyser
Anticorps : protéine complexe utilisée par le système immunitaire pour détecter et neutraliser
les agents pathogènes de manière spécifique. Les anticorps sont sécrétés par des cellules
dérivées des lymphocytes B (les plasmocytes).
Antigène : macromolécule naturelle ou synthétique, reconnue par des anticorps ou des
cellules du système immunitaire et capable d'engendrer une réponse immunitaire.
Les antigènes sont généralement des protéines, des polysaccharides et leurs dérivés lipidiques.
Bicaténaire : double brin
Capside : chez un virus, la capside est la structure qui entoure le génome, l’acide nucléique
(ADN ou ARN).
Carcinome : cancer développé à partir d'un tissu épithélial (peau, muqueuse).
Glycoprotéines : groupe de protéines conjuguées, constituées de protéines et de glucides
Lymphome : cancer du système lymphatique
Sérothèque : lieu d’entreposage des sérums gardés durant une durée limitée
Spectrophotométrie : méthode analytique quantitative qui consiste à mesurer l'absorbance
ou la densité optique d'une substance chimique donnée, généralement en solution.
Virion : particule virale complète avec son enveloppe protéinique externe (capside) et sa
molécule d’ADN à l’intérieur.
Carole Fracheboud
ESSante/TAB 51
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Travail de diplôme
9
9.1
Immunologie
Nov. 2011 – Avril 2012
Annexe
Annexe 1 : Résultats des IgM, IgG et IgA testés sur le Bep 2000
Carole Fracheboud
ESSante/TAB 51
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Travail de diplôme
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02208511
04519811
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Carole Fracheboud
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Immunologie
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17029611
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ESSante/TAB 51
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Travail de diplôme
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41/113
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42/113
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43/113
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19509711
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01023811
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02524811
14000511
17029611
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ESSante/TAB 51
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27001811
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19509711
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ESSante/TAB 51
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12523011
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ESSante/TAB 51
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02208511
04519811
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19509711
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ESSante/TAB 51
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Annexe 2 : Résultats des reproductibilités pour les IgM, IgG et IgA
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72/113
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73/113
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74/113
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ESSante/TAB 51
Immunologie
Nov. 2011 – Avril 2012
75/113
Travail de diplôme
Carole Fracheboud
ESSante/TAB 51
Immunologie
Nov. 2011 – Avril 2012
76/113
Travail de diplôme
Carole Fracheboud
ESSante/TAB 51
Immunologie
Nov. 2011 – Avril 2012
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Travail de diplôme
Carole Fracheboud
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Immunologie
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Travail de diplôme
Carole Fracheboud
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Immunologie
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Travail de diplôme
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Travail de diplôme
Carole Fracheboud
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Travail de diplôme
Carole Fracheboud
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Immunologie
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Travail de diplôme
Carole Fracheboud
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Immunologie
Nov. 2011 – Avril 2012
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Travail de diplôme
Carole Fracheboud
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Immunologie
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Travail de diplôme
Carole Fracheboud
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Immunologie
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Travail de diplôme
Carole Fracheboud
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Travail de diplôme
Carole Fracheboud
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Immunologie
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Travail de diplôme
Carole Fracheboud
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Immunologie
Nov. 2011 – Avril 2012
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Travail de diplôme
Carole Fracheboud
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Travail de diplôme
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Travail de diplôme
Carole Fracheboud
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Immunologie
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Travail de diplôme
Carole Fracheboud
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Immunologie
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Travail de diplôme
Carole Fracheboud
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Immunologie
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Travail de diplôme
Carole Fracheboud
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Immunologie
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Travail de diplôme
Immunologie
Nov. 2011 – Avril 2012
6197
Carole Fracheboud
ESSante/TAB 51
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Travail de diplôme
Carole Fracheboud
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Immunologie
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Travail de diplôme
Carole Fracheboud
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Immunologie
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Travail de diplôme
Carole Fracheboud
ESSante/TAB 51
Immunologie
Nov. 2011 – Avril 2012
100/113
Travail de diplôme
9.3
Immunologie
Nov. 2011 – Avril 2012
Annexe 3 : Résultats de la répétabilité des IgM, IgG et IgA
Carole Fracheboud
ESSante/TAB 51
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Travail de diplôme
Carole Fracheboud
ESSante/TAB 51
Immunologie
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Travail de diplôme
Carole Fracheboud
ESSante/TAB 51
Immunologie
Nov. 2011 – Avril 2012
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Travail de diplôme
Carole Fracheboud
ESSante/TAB 51
Immunologie
Nov. 2011 – Avril 2012
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Travail de diplôme
Carole Fracheboud
ESSante/TAB 51
Immunologie
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Travail de diplôme
Carole Fracheboud
ESSante/TAB 51
Immunologie
Nov. 2011 – Avril 2012
106/113
Travail de diplôme
9.4
Immunologie
Nov. 2011 – Avril 2012
Annexe 4 : Résultats des IgM, IgG et IgA testés sur des sérums avec
des Early Antigen positifs
Carole Fracheboud
ESSante/TAB 51
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Travail de diplôme
Immunologie
Nov. 2011 – Avril 2012
29526311c
Carole Fracheboud
ESSante/TAB 51
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Travail de diplôme
Carole Fracheboud
ESSante/TAB 51
Immunologie
Nov. 2011 – Avril 2012
109/113
Travail de diplôme
Carole Fracheboud
ESSante/TAB 51
Immunologie
Nov. 2011 – Avril 2012
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Travail de diplôme
Carole Fracheboud
ESSante/TAB 51
Immunologie
Nov. 2011 – Avril 2012
111/113
Travail de diplôme
Immunologie
Nov. 2011 – Avril 2012
6197
Carole Fracheboud
ESSante/TAB 51
112/113
Travail de diplôme
Carole Fracheboud
ESSante/TAB 51
Immunologie
Nov. 2011 – Avril 2012
113/113