Notice Technique

QUANTISPEED BOV TEST
TEST ELISA IMMUNO-ENZYMATIQUE
DE DETECTION QUANTITATIVE
D’ADULTÉRATION PAR DU LAIT DE VACHE
DES LAITS OU FROMAGES
DE CHEVRE OU DE BREBIS
Notice technique
Référence : 250401
Version : Mars 2011
LIBIOS s.a.r.l.
Chemin de la plagne
69210 Bully
FRANCE
Tél : +33 (0)4 74268517
Fax : +33 (0)4 74260547
E-mail : [email protected]
Web : www.libios.fr
Notice Technique QuantiSpeed BOV Test
Réf. : 250401
COMPOSITION DU KIT
1 plaque de 96 puits coatés avec un anticorps spécifique à une protéine de vache
1 flacon témoin positif contenant du lait de vache
1 flacon Traceur
1 flacon ELLMAN
1 flacon de tampon EIA
1 flacon de tampon de lavage concentré
1 flacon de Tween20, liquide
PRINCIPALES CARACTERISTIQUES
Détermination quantitative et semi-quantitative de l’adultération par du lait de vache
Analyse de lait ou de fromage
Gamme de dosage entre 0,5 et 100% de lait de vache
Temps d’analyse : 60 minutes
I. PRÉPARATION DES REACTIFS
1.1 Tampon de lavage
Diluer 2 mL du tampon de lavage concentré dans 0,8L d’eau distillée puis ajouter 400µL de tween 20.
Homogénéiser le mélange à l’aide d’un agitateur magnétique.
(Un volume moins important de tampon de lavage peut être préparé par dilution du tampon de lavage concentré au
1/400ème et en ajoutant du Tween20 à raison de 0,5mL par litre de tampon de lavage)
Le Tween20 étant visqueux, il est nécessaire de le prélever à la seringue.
Péremption 1 mois à +4°C
1.2 Tampon EIA
Reconstituer 1 flacon avec 50mL d’eau distillée. Attendre 5 minutes jusqu’à ce que le contenu soit complètement
dissout puis bien mélanger.
Péremption 1 mois à +4°C
1.3 Traceur (conjugué enzymatique)
Reconstituer 1 flacon avec 20mL d’eau distillée. Attendre 5 minutes jusqu’à ce que le contenu soit complètement
dissout puis bien mélanger.
Péremption 1 mois à +4°C ou 3 mois à -20°C
1.4 Réactif ELLMAN
Reconstituer avec 50mL d’eau distillée. Attendre 5 minutes avant utilisation et bien mélanger.
Péremption 3 jours à +4°C à l’abri de la lumière ou 1 mois à -20°C
1.5 Etalon de lait de vache
L’étalon de lait de vache est à diluer comme mentionné dans le point « III. Etalonnage ».
Péremption : 6 mois à +4°C
II. PRÉPARATION DES ÉCHANTILLONS
2.1 Échantillon de lait :
Diluer 100µL d’échantillon à analyser dans 10mL d’eau
Agiter sur un agitateur magnétique 5 minutes environ
Prélever 100µL de cette solution et ajouter la dans 900µL de tampon EIA
2.2 Échantillon de fromage :
Peser précisément 100 mg de fromage
Ajouter 10mL de NaCl 0,9%
Homogénéiser avec un broyeur de type ULTRA-TURRAX pendant environ 2 minutes
Agiter pendant 30 mn sur un agitateur à tubes
Centrifuger 3000rpm pendant 10 minutes
Prélever 100µL de cette solution et ajouter la dans 900µL de tampon EIA
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Réf. : 250401
III. ETALONNAGE
Diluer 100µL de lait de vache dans 100mL d’eau (=solution mère) puis faire les dilutions suivantes :
0,5mL de solution mère
0,5mL de solution G
0,4mL de solution F
0,4mL de solution E
0,25mL de solution D
0,3mL de solution C
+ 0,5mL tampon EIA = 50%
+ 0,5mL tampon EIA = 25%
+ 0,6mL tampon EIA = 10%
+ 0,6mL tampon EIA = 4%
+ 0,75mL tampon EIA = 1%
+ 0,3mL tampon EIA = 0,5%
(solution G)
(solution F)
(solution E)
(solution D)
(solution C)
(solution B)
Pour le point 0%, mettre 200µL de tampon EIA dans les puits correspondants.
Ces dilutions ne sont données qu’à titre indicatif, nous proposons d’effectuer les points de calibration 0%, 0,5%, 4% et
10% afin d’obtenir une gamme de calibration satisfaisante.
IV. MODE OPERATOIRE
Les barrettes non utilisées doivent être retirées du support pour une utilisation ultérieure.
Laver 5 fois les puits nécessaires avec 300µL de tampon de lavage
Bien éliminer le tampon de lavage du dernier rinçage en tapant fortement sur la paillasse sur du papier absorbant
Déposer dans les puits bien identifiés, 50µL des points de calibration ou standard ou 50µL des échantillons
préalablement dilués
Ajouter 150µL de tampon EIA
Laisser incuber 30 minutes en agitant sur un agitateur de plaque
Vider le contenu des puits
Rincer les puits 5 fois avec 300µL du tampon de lavage (Bien éliminer le tampon de lavage du dernier lavage en
tapotant fortement les puits sur la paillasse sur du papier absorbant)
Ajouter 200 µL de traceur (conjugué enzymatique)
Laisser incuber 10 minutes en agitant sur un agitateur de plaque
Vider le contenu des puits
Rincer les puits 5 fois avec 300µL du tampon de lavage (Bien éliminer le tampon de lavage du dernier lavage en
tapotant fortement les puits sur la paillasse sur du papier absorbant))
Ajouter 200µL de réactif d’ELLMAN
Laisser incuber 30 minutes en agitant sur un agitateur de plaque
Faire la lecture au lecteur de plaque vers 420nm pour un résultat quantitatif.
Il est possible de ne faire qu’une lecture visuelle de la coloration et d’estimer le résultat par comparaison à la gamme
de calibration pour un résultat semi-quantitatif.
V. RÉSULTATS
Déterminer directement la teneur en lait de chèvre d’après la
courbe obtenue avec la gamme d’étalonnage.
Facteur de correction sur les résultats des fromages :
Compte tenu de l’extrait sec des fromages analysés,
Il faudra multiplier le résultat obtenu par un facteur
variable selon le pourcentage d’extrait sec de l’échantillon.
Extrait sec en %
30
Facteur de correction
(x le résultat par)
3
40
0
2,5
5
2
60
0
1,5
7
1
3
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Réf. : 250401
VI. VALIDATION ANALYTIQUE
7.1 Linéarité
Suivant les conditions opératoires décrites, la gamme de dosage se situe entre 0,5% et 100% de lait de vache.
7.2 Limite de détection
La méthode de dosage par la technique ELISA étant une méthode extrêmement sensible, il est possible de doser des
traces de lait de vache dans un autre lait.
Cependant il est raisonnable dans les conditions opératoires décrites de fixer cette limite à 0,5% de lait de vache dans
un lait ou fromage de chèvre ou de brebis.
7.3 Reproductibilité
Pour une adultération de 10% en lait vache dans du lait de chèvre le pourcentage de variation est de l’ordre de 9% sur
3 mesures en intra-jour et de 8% sur 2 jours de mesures (n=6).
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