les équipes de recherche
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les équipes de recherche
Le mot du Président Fondation Imagine Institut des maladies génétiques Necker-Enfants malades 156, rue de Vaugirard 75015 Paris - France Contacts Karine Rossignol : 01 40 61 55 32 [email protected] Guillaume Huart : 01 40 61 54 14 [email protected] secrétariat : 01 40 61 55 52 Mail: [email protected] 2e Édition 2010 « Les maladies génétiques sont multiples. Bien qu’individuellement rares, elles touchent plus de 30 millions de personnes en Europe et près de 5 millions de personnes en France. Il s’agit de cas complexes pour lesquels les solutions diagnostiques et thérapeutiques sont encore trop limitées. Ces maladies affectent la qualité de vie des patients et de leurs familles. Depuis plus d’un siècle, l’Hôpital Necker-Enfants malades accueille ces patients et a ainsi acquis une renommée nationale et internationale dans le domaine des maladies génétiques. Durant de nombreuses décennies, plusieurs laboratoires de l’INSERM et de l’Université Paris-Descartes ont obtenu des résultats importants, en collaboration étroite avec les unités cliniques. Cette “ boucle vertueuse ” initiée par une observation clinique pertinente a permis de mettre en œuvre des approches scientifiques originales. Ceci a mené à la description de nouvelles maladies, à l’identification des gènes responsables, à la compréhension des mécanismes impliqués ainsi qu’au développement de nouveaux outils diagnostiques, comme le diagnostic prénatal, et de nouvelles thérapies, dont les transplantations et, plus récemment, la thérapie génique. Mais les équipes de recherche ne bénéficient pas de conditions de travail optimales. Elles sont éparpillées sur le site et les plateformes technologiques ne sont pas assez équipées pour maintenir un niveau scientifique élevé. L’INSERM et le Ministère de la Recherche ont reconnu l’excellence scientifique des équipes de recherche de l’Hôpital Necker-Enfants malades en encourageant et en aidant à financer un Institut dédié à la recherche et aux soins sur les maladies génétiques. C’est ainsi qu’a été créée la Fondation Imagine que j’ai le plaisir et l’honneur de présider. Son statut lui permet de rassembler l’aide d’institutions publiques et celle des collectivités, aussi bien que celle des entreprises. L’Assistance publique-Hôpitaux de Paris, l’INSERM, l’Université Paris-Descartes, l’Association Française contre les Myopathies (AFM), la Fondation Hôpitaux de Paris-Hôpitaux de France, le Département de Paris et la région Île-de-France ont adhéré aux valeurs du projet scientifique et alloué les premiers budgets. Nous ne doutons pas du soutien à venir d’institutions et associations ainsi que de donateurs pour atteindre nos objectifs. À travers une recherche translationnelle de qualité, en apportant de nouvelles connaissances sur les maladies génétiques, nos travaux auront un impact sur des maladies plus fréquentes et pourront ainsi valoriser les résultats de nos recherches, notamment en collaborant avec les industries de santé. Aujourd’hui, les ressources obtenues ont permis le projet de construction d’un Institut de 15 000 m² sur le boulevard du Montparnasse, comprenant un laboratoire de recherche et une clinique, en adéquation avec notre vision, notre culture et nos ambitions. De nouvelles équipes de recherche seront sélectionnées par notre prestigieux conseil scientifique international pour rejoindre celles déjà présentes sur le site de Necker-Enfants malades. Ce rassemblement de la recherche scientifique et translationnelle avec la recherche clinique devra fournir des conditions de travail optimales aux chercheurs afin de raccourcir les délais entre les nouvelles découvertes de la recherche et leurs applications, au bénéfice direct des patients. » Professeur Claude Griscelli Président de la Fondation Imagine 22 3 Sommaire Le projet imagine p.5 Les acteurs p.9 Les équipes de recherche p.13 Les plateformes technologiques p.41 le projet architectural p.51 L’organisation d’imagine Le projet Imagine p.55 Publications p.61 4 5 Le projet Imagine L’hôpital pédiatrique Necker-Enfants malades a été créé au début du xixe siècle. Il s’est développé depuis pour devenir une référence en France dans tous les domaines de la médecine et de la chirurgie pédiatriques. Chaque année, plus de 40 000 patients originaires de toute la France et de l’étranger y sont accueillis. On estime que la moitié des enfants qui viennent consulter souffrent de maladies héréditaires. C’est dans ce contexte que la recherche sur les maladies de l’enfant, et notamment sur les maladies génétiques, s’est développée avec succès sur le site de l’Hôpital Necker-Enfants malades et a pu être reconnue à l’échelle internationale. Les causes de plus de 100 maladies héréditaires ont été identifiées par nos équipes, permettant ainsi non seulement d’avancer dans le domaine de la pathophysiologie, mais aussi dans la conception d’outils diagnostiques performants et de nouvelles méthodes thérapeutiques. Aujourd’hui, les activités de recherche rassemblent environ 300 personnes réparties sur le campus et ne permettent pas les interactions nécessaires à une recherche compétitive et efficace reconnue à l’international. C’est de l’intrication entre recherche et soins, nécessaire pour arriver à de nouvelles solutions diagnostiques et thérapeutiques pour les maladies génétiques, qu’est né le projet Imagine. La découverte de nouveaux paramètres est attendue, dans le domaine de la biologie du développement, dans celui des applications médicales innovantes : des outils diagnostiques aux nouvelles méthodes thérapeutiques. Dans cet objectif, c’est par la création de nouvelles synergies entre la recherche et les soins que l’on apportera une recherche translationnelle, innovante et productive. 6 QUI SOMMES-NOUS ? L’Hôpital Necker-Enfants malades est affilié à l’Université Paris-Descartes. Il s’agit principalement, mais pas exclusivement, d’un hôpital pédiatrique. La pédiatrie comprend 240 lits et est divisée en 20 unités recouvrant tous ses domaines de compétence (cardiologie, dermatologie, endocrinologie, ORL, gastro-entérologie, pédiatrie générale, génétique, hématologie, immunologie, soins intensifs, néonatologie, néphrologie, neurologie, neurochirurgie, ophtalmologie, orthopédie, pneumologie, psychiatrie, rhumatologie, transplantation). Alain Fischer Le projet Imagine SIX LABORATOIRES DE RECHERCHE DE L’INSERM SONT aujourd’hui RÉUNIS DANS Imagine 300 personnes, réparties en 24 groupes de recherche sur les maladies génétiques, ont joint leurs efforts dans le projet Imagine. L’Institut peut aussi être fier de ses équipements de clinique et de recherche, tels que le centre de recherche clinique, le département de biothérapie et 18 centres de référence maladies rares dédiés aux maladies génétiques de l’enfant. Le campus de Necker comprend également 16 autres unités de recherche en immunologie, biologie cellulaire, microbiologie et néphrologie, qui constituent l’Institut fédératif de recherche Necker-Enfants malades (Irnem). Beaucoup de ces laboratoires et équipements sont hébergés dans la Faculté de médecine du campus. Arnold Munnich La Fondation Imagine a été créée en 2007. Elle est composée de 6 membres fondateurs (Assistance publique-Hôpitaux de Paris, Inserm, Université Paris-Descartes, Association Française contre les Myopathies, Fondation Hôpitaux de Paris-Hôpitaux de France et Département de Paris) qui siègent tous au conseil d’administration. Elle comporte une direction scientifique et une direction administrative. Le conseil scientifique et ses 8 membres ont pour mission de conseiller Imagine et d’évaluer les groupes de recherche avant leur intégration au projet. NOS OBJECTIFS Mettre en place une structure efficace et attractive pour élargir les recherches sur les maladies génétiques, avec une triple mission : - d ’identifier les mécanismes des maladies et la physiologie qui en est responsable ; - d e développer des applications médicales des nouvelles découvertes, en termes d’outils diagnostiques et thérapeutiques ; - d e former des étudiants en MD et PhD dans cette structure de recherche, en insistant particulièrement sur l’interaction entre ces groupes de recherche et les unités cliniques. COMMENT RÉPONDRE À CES OBJECTIFS ? Où EN SOMMES-NOUS ? Notre nouvelle structure de recherche favorisera de nombreuses interactions qui pourront attirer de nouveaux groupes de recherche (notamment dans le secteur des neurosciences, du développement et de la biologie des cellules souches) et nous permettront de créer des plateformes techniques adéquates. Durant cette phase transitoire, nous renforcerons les plateformes technologiques afin qu’elles soient totalement opérationnelles pour l’ouverture du nouveau bâtiment de recherche en 2012. 11 500 m² de ce nouveau bâtiment seront dédiés à la recherche et 3 500 m² seront dédiés aux soins. Le pôle recherche pourra accueillir environ 380 personnes dont les groupes de recherche déjà présents sur le campus et ceux à venir. Une nouvelle organisation de l’Institut, avec des liens étroits entre la recherche et les départements cliniques, sera proposée afin de faciliter à la fois l’émergence de nouveaux projets de recherche fondés sur des questions cliniques et l’application médicale découlant de ces recherches. Un programme de formation par la recherche et d’enseignement pour les cliniciens sera également développé. Une structure a été mise en place autour du conseil d’administration, de la direction scientifique (réélue tous les quatre ans) et de l’équipe administrative. Les fonds pour la phase de transition (développement des plateformes et composition des équipes) et pour la construction d’un nouveau bâtiment ont été en grande partie sécurisés. Une plateforme génomique a été constituée, comprenant notamment une plateforme « Affymetrix » et un séquenceur haut débit. Deux ingénieurs et un technicien ont pour mission de la faire fonctionner. Nous avons également fait l’acquisition d’un trieur-analyseur de cellules, d’un microscope confocal, d’un vidéomicroscope, d’un analyseur de cellules, d’un microscope laser et d’un extracteur d’ADN. Nous avons également amélioré notre animalerie grâce à l’acquisition de cages ventilées et avons renforcé la plateforme de bio-informatique grâce à de nouveaux équipements et au recrutement de personnes supplémentaires. La construction du bâtiment de recherche commencera fin 2010. 7 Le projet Imagine PROCHAINES ÉTAPES ET AGENDA • Construction de l’Institut de recherche. Le concours d’architecture est en cours et le jury se réunira en mai 2010. La livraison du bâtiment est attendue courant 2012 ; • Améliorer les plateformes de recherche avec un plan annuel d’acquisition de matériels et de recrutement d’équipes ; • Mise en place d’un système d’évaluation, fondé sur les recommandations du Conseil scientifique international, pour choisir les équipes qui occuperont le bâtiment Imagine dès 2012. Il pourra s’agir d’équipes déjà présentes sur le campus de Necker-Enfants malades (appartenant aux unités de recherche qui soutiennent le projet Imagine) ou de nouvelles équipes internationales. Un appel d’offres sera lancé en temps voulu ; 8 • Intégration au sein du campus : définition de la nature des liens avec les infrastructures de recherche clinique et les services cliniques, ainsi qu’avec la recherche de Necker (Institut Fédératif de Recherche – IRNEM) dans son ensemble ; • La levée de fonds sera initiée mi-2010 avec l’aide du groupe de communication Havas/Euro RSCG. Dans cette phase enthousiasmante, nous avons l’ambition de créer un Institut de recherche unique, capable de fournir des conditions de travail optimales aux équipes. C’est grâce à la Fondation Imagine et aux fonds qui seront collectés que ce défi majeur pourra être relevé. Les acteurs 9 Les acteurs Le Conseil scientifique international Conseil scientifique international Elizabeth BLACKBURN Stylianos ANTONARAKIS Aravinda CHAKRAVARTI Pierre CHAMBON Max COOPER Eric OLSON Karl TRYGGVASON Emil UNANUE Présidente : Elizabeth Blackburn Lauréate du Prix Nobel 2009 Department of Biochemistry and Biophysics, University of California, San Francisco, Californie, États-Unis Présidence Président : Claude GRISCELLI Trésorier : Édouard COUTY Direction scientifique Alain FISCHER, directeur Arnold MUNNICH, co-directeur Corinne ANTIGNAC, directrice de la stratégie Laurent ABEL Nadine CERF-BENSUSSAN Laurence COLLEAUX Rémi SALOMON Plateformes techniques Génomique Imagerie cellulaire Transfert de gènes Histologie Cytométrie de flux Banque d’ADN Bio-informatique Laboratoire d’expérimentation animale et de transgénèse (LEAT) ARAVINDA CHAKRAVARTI McKusick-Nathans Institute of Genetic Medicine Johns Hopkins University School of Medicine Baltimore, Maryland, États-Unis Pierre Chambon Institut de génétique et de biologie moléculaire et cellulaire, Strasbourg, France Max Cooper Department of Pathology and Laboratory Medicine, Emory University, Atlanta, Géorgie, États-Unis Direction administrative et financière Guillaume HUART Direction des projets et du développement Karine ROSSIGNOL 24 équipes de recherche 10 STYLIANOS ANTONARAKIS Division of Medical Genetics, University of Geneva Medical School, Genève, Suisse Emil Unanue Department of Pathology and Immunology, Washington University School of Medicine, Saint Louis, Missouri, États-Unis Eric Olson Department of Molecular Biology, UT Southwestern Medical Center, Dallas, Texas, États-Unis Karl Tryggvason Department of Medical Biochemistry and Biophysics, Karolinska Institute, Stockholm, Suède 11 La direction scientifique Alain Fischer est Professeur en Pédiatrie depuis 1986, Directeur du département d’Immunologie et d’hématologie pédiatriques de l’Hôpital Necker-Enfants malades, Université Paris-Descartes. Il est à la tête d’une unité de recherche Inserm. Il a étudié la médecine à Paris, a obtenu son diplôme de docteur en médecine et son PhD en immunologie en 1979. Après avoir obtenu son doctorat, il a étudié l’immunologie au University College London de 1980 à 1981. Ses principaux travaux de recherche portent sur le développement du système immunitaire, les maladies génétiques du système immunitaire et la thérapie génique. Il a écrit ou coécrit plus de 500 publications dans des revues scientifiques depuis 1978. Il est membre du conseil de relecture de Science et du comité de rédaction d’autres revues, dont EMBO J. Il est vice-président du conseil d’administration de l’Institut Pasteur. Il est membre de l’EMBO (European Molecular Biology Organization) et de l’Académie des sciences. Il a reçu le prix L. Jeantet en 2001 et le grand prix Inserm en 2008. Arnold Munnich est Professeur en Génétique depuis 1989, Directeur du département de Génétique de l’Hôpital Necker-Enfants malades, Université Paris-Descartes. Il est la tête d’une unité de recherche Inserm. Il a étudié la médecine à Paris et a obtenu son diplôme de Docteur en médecine en 1979, son PhD en biochimie en 1988, et son certificat en pédiatrie et génétique humaine en 1983. Ses principaux travaux de recherche portent sur la génétique et l’épigénétique des maladies neurométaboliques et des défauts de naissances. Il a écrit ou coécrit plus de 700 publications dans des revues scientifiques depuis 1980. Il est membre du comité de rédaction du Journal of Medical Genetics, European Journal of Human Genetics, Human Genetics, Clinical Genetics et Human Molecular Genetics. Depuis mai 2007, il officie en tant que conseiller du Président de la République française, Nicolas Sarkozy, pour la recherche biomédicale et la santé. Il est membre de la Société américaine de génétique humaine, de la Société européenne de Génétique humaine et de l’Académie des sciences. Il a reçu le grand prix Inserm en 2000 et le prix de la Société européenne de Génétique humaine en 2008. Corinne Antignac est Professeur en génétique depuis 2001 et fait partie du département de génétique de l’Hôpital Necker-Enfants malades, Université Paris-Descartes. Elle est à la tête de l’unité de recherche Inserm Néphropathies héréditaires et rein en développement. Elle a étudié la médecine à Paris et obtenu son diplôme de Docteur en médecine en 1982, son certificat en néphrologie et pédiatrie en 1988 et son PhD en génétique humaine en 1994. Ses travaux de recherche concernent l’identification des gènes impliqués dans les maladies génétiques rares du rein et la caractérisation des protéines encodées par ces gènes. Elle a écrit ou coécrit environ 130 publications dans des revues scientifiques depuis 1985. Elle est membre du comité de rédaction de J Am Soc Nephrol et Kidney Int. Elle a reçu le Prix Éloi Collery de l’Académie nationale de médecine en 2001, le Prix ARRI (Association réalités et relations internationales) en 2008 et le Prix international Lillian Jean Kaplan en 2009. Laurent Abel est Directeur de recherche à l’Inserm. Il a obtenu son diplôme de Docteur en médecine à l’Université Paris-Descartes en 1988 et son PhD en génétique épidémiologique à l’université de Paris Sud en 1993. En 2000, il crée avec Jean-Laurent Casanova le Laboratoire de génétique humaine des maladies infectieuses (Université Paris-Descartes/unité Inserm 550) au sein de la Faculté de médecine de Necker, et le codirige depuis. Il étudie la génétique humaine des maladies infectieuses, dans le but d’identifier les principales susceptibilités génétiques humaines qui contrôlent la réponse à l’infection par de multiples microbes (en particulier, les mycobactéries et les virus oncogènes), et le développement des maladies infectieuses associées. Il a écrit ou coécrit plus de 150 publications dans des revues scientifiques depuis 1986. Il a reçu le Prix André Lwoff du Conseil Pasteur-Weizmann et de l’Académie des sciences en 1999. En 2009, il a été nommé comme Professeur associé à la Rockefeller University de New York. Les équipes de recherche Laurence Colleaux est Directrice de recherche au CNRS depuis 2002, fondatrice et responsable de l’équipe Bases moléculaires et physiopathologie des retards mentaux depuis 1999, au sein de l’unité Inserm dirigée par le Pr. Arnold Munnich à l’Hôpital Necker. Elle a réussi le concours d’entrée à l’École normale supérieure en 1982 et a obtenu son PhD en génétique en 1988. Elle a ensuite étudié la génétique humaine au Medical Research Council à Édimbourg. L’objectif général de ses recherches est d’éclairer sur la plasticité fonctionnelle et structurelle du cerveau humain et de mieux comprendre les bases moléculaires et physiopathologiques du retard mental. Elle a écrit ou coécrit plus de 65 publications dans des revues scientifiques depuis 1986. Elle a reçu le Prix Mémain-Pelletier de l’Académie des sciences en 2006. Nadine Cerf-BENSUSSAN est Directrice de recherche à l’Inserm depuis 1995. Elle a fondé et dirige l’unité de recherche Inserm Interactions de l’épithélium intestinal et du système immunitaire, depuis 1998 à l’Université Paris-Descartes. Elle a étudié la médecine à Paris, a obtenu son diplôme de Docteur en médecine en 1981 et son PhD en immunologie en 1987. Elle a étudié l’immunologie à l’école de médecine de Harvard de 1981 à 1983. Ses principaux travaux de recherche portent sur les mécanismes immunitaires et l’homéostasie intestinale. Elle a écrit ou coécrit plus de 110 publications dans des revues scientifiques depuis 1983. Elle a reçu le Prix Charles Debray en 1990 et le Prix de la recherche clinique Rosa Lamarca en 2001. Rémi Salomon est Professeur en Pédiatrie depuis 2008 et travaille au sein du département de Néphrologie pédiatrique de l’Hôpital Necker-Enfants malades, Université Paris-Descartes. Il coordonne avec Corinne Antignac le centre de référence pour les Maladies rénales héréditaires de l’enfant et de l’adulte (Marhea). Il a étudié la médecine à Paris et a obtenu son diplôme de Docteur en médecine en 1992 et son PhD en génétique en 2000. Ses principaux travaux de recherche portent sur le développement des reins et les maladies génétiques de l’appareil urinaire. Il effectue ses recherches au sein de l’unité Inserm U574, dirigée par Corinne Antignac. Il coordonne plusieurs programmes de recherche clinique multicentriques, notamment sur la néphronophtise et sur l’hypodysplasie rénale chez les enfants et les fœtus, en collaboration avec un obstétricien et des spécialistes des pathologies du fœtus. 12 13 Les équipes de recherche Les équipes de recherche 24 unités de recherche font partie de l’Institut Imagine.Elles sont réparties en 6 unités affiliées à l’Inserm et l’Université Paris-Descartes Arnold Munnich U781 C. Boileau : Génétique et physiopathologie des hypercholestérolémies L. Colleaux : Bases moléculaires et physiopathologiques du retard mental V. Cormier-Daire : Bases moléculaires et physiopathologiques des chondrodysplasies O. Danos : Principes et applications thérapeutiques du transfert de gène G. Gourdon : Études des mécanismes d’instabilité des triplets répétés et de leurs conséquences physiopathologiques dans un modèle murin de la dystrophie myotonique de Steinert A. HOVNANIAN : Maladies génétiques cutanées : des mécanismes pathologiques au traitement M. LE MERRER : GENATLAS, une base de données pour les gènes, leurs fonctions et leurs maladies S. LYONNET : Génétique et embryologie des malformations congénitales A. RÖTIG : Génétique des maladies mitochondriales JM. ROZET : Génétique ophtalmologique A. SMAHI : NF-kB et homéostasie épidermique : de l’incontinentia pigmenti aux dysplasies ectodermiques anhydrotiques C. ANTIGNAC : Bases moléculaires des maladies rénales : cystinose et syndromes néphrotiques héréditaires S. SAUNIER : Bases moléculaires des maladies héréditaires rénales : la néphronophtise et les hypoplasies rénales S. HARVEY : Équipe Avenir : microARNs dans le développement et la fonction rénale Corinne Antignac U574 L. Abel : Génétique humaine des maladies infectieuses : prédisposition complexe J.-L. Casanova : Génétique humaine des maladies infectieuses : prédisposition mendélienne J.-L. Casanova/L. Abel U550 Laurent Abel, Corinne Antignac, Catherine Boileau, Jean-Laurent Casanova, Marina Cavazzana-Calvo, Nadine Cerf-Bensussan, Laurence Colleaux, Valérie Cormier-Daire, Olivier Danos, Anne Durandy, Alain Fischer, Geneviève Gourdon, Claude Griscelli, Scott Harvey, Alain Hovnanian, Sylvain Latour, Martine Le Merrer, Stanislas Lyonnet, Arnold Munnich, Patrizia Paterlini-Bréchot, Frédéric Rieux-Laucat, Agnès Rötig, Jean-Michel Rozet, Geneviève de Saint-Basile, Sophie Saunier, Asma Smahi, Jean-Pierre de Villartay. Alain Fischer U768 Personnel d’Imagine 86 Chercheurs 56 Ingénieurs 12 Membres de l’équipe administrative 20 Techniciens 52 Étudiants postdoctorants 78 Étudiants doctorants TOTAL 304 14 J.-P. de Villartay : Dynamique du génome dans le système immunitaire A. Durandy : Interactions lymphocytaires et maturations terminales des lymphocytes B G. de Saint-Basile : Homéostasie lymphocytaire : le rôle des cellules tueuses S. Latour : Activation lymphocytaire et susceptibilité à l’EBV F. Rieux-Laucat : Modèles pathologiques de défauts de la tolérance au soi M. Cavazzana-Calvo : Thérapies innovantes des déficiences immunitaires primitives N. Cerf-BENSUSSAN : Interactions de l’épithélium intestinal et du système immunitaire Nadine Cerf-BENSUSSAN U793 P. PATERLINI-BRÉCHOT : Diagnostic des maladies génétiques par signalisation calcique et analyse des cellules fœtales circulantes Patricia Paterlini-BRÉCHOT U807 15 Génétique et physiopathologie des hypercholestérolémies L’hypercholestérolémie est une altération métabolique fréquente observée chez un sujet sur vingt. C’est l’un des principaux facteurs de risque de l’athérosclérose et de ses complications cardio-vasculaires. La maladie, la plupart du temps polygénique, a des formes monogéniques, parmi lesquelles des formes transmises sur le mode autosomique dominant (ADH). L’ADH est génétiquement hétérogène avec des formes peu fréquentes, voire très rares. Le but de l’équipe est de démêler les mécanismes pathogènes associés à l’ADH en identifiant de nouveaux gènes responsables de cette maladie, en évaluant leur contribution aux formes monogéniques aussi bien qu’aux formes multifactorielles et en étudiant leur effet sur le métabolisme du cholestérol et des lipoprotéines. Les résultats des recherches de l’équipe ont montré que la maladie est beaucoup plus hétérogène que ce que l’on pensait, avec l’implication non seulement des défauts connus des gènes LDLR et APOB, mais aussi de défauts d’autres gènes inconnus. Nous avons évalué la contribution des défauts de chaque gène au phénotype de l’ADH, localisé un nouveau gène ADH (HCHOLA3) qui s’est avéré être le gène PCSK9 codant pour une nouvelle pro-protéine convertase. Ce travail pionnier a fait la lumière sur un nouvel acteur majeur du métabolisme du cholestérol. Nous avons continué pour montrer que des défauts dans au moins deux autres gènes sont associés à l’ADH : il s’agit des défauts de HCHOLA4 (localisé à 16q22) et HCHOLA5 (que nous avons récemment localisé dans une autre région du génome). Notre projet de recherche est d’étudier plus en détails la séquence d’événements pathogènes qui mènent à l’ADH. Notre objectif est double : tout d’abord, une bonne identification et localisation des nouveaux gènes associés à l’ADH. Ensuite, approfondir l’étude du rôle de PCSK9 et des gènes qui viennent d’être identifiés dans le métabolisme du cholestérol et des lipoprotéines et dans la physiologie de l’ADH. Notre stratégie de recherche combine l’analyse génétique (études familiales, scan de l’intégralité du génome, évaluation moléculaire et cellulaire des gènes candidats) et la dissection in vitro de traits métaboliques intermédiaires d’un gène spécifique par des études métaboliques, cellulaires et protéomiques. Enfin, nous avons également développé deux modèles de souris transgéniques, l’une en surexpression et l’autre en knock-in, pour la mutation p.Arg357His de PCSK9 (une mutation identifiée récemment dans une famille française et localisée dans le domaine catalytique de la protéine). La réalisation de nos objectifs nous permettra d’identifier de nouveaux acteurs du métabolisme du cholestérol et contribuera au développement de nouvelles thérapies pour faire baisser le taux de cholestérol en ouvrant la voie à l’identification de nouvelles cibles pharmacologiques. Catherine Boileau Équipe : Chercheurs : Mathilde Varret Marie-Élisabeth Sansom Yannick Allanore Marianne Abifadel Jean-Pierre Rabès Étudiants doctorants : Alice Marquès Marie Marduel Publications : 1. Abifadel M, Varret M, Rabès J.-P, Allard D, Ouguerram K, Boileau C. Mutations in PCSK9 cause autosomal dominant hypercholesterolemia. Nat Genet. (2003), 34: 154-156. 2. MizuguchiI T, Collod-Béroud G. (co-first authors), Akiyama T, Abifadel M, (18 co-authors), Boileau C. (co-last author), Matsumoto N. Heterozygous TGFBR2 mutations in Marfan syndrome. Nat Genet. (2004) ; 36: 855-861. 3. Allard D, Amsellem S, Abifadel M, Devillers M, Luc L, Varret M, Boileau C, Benlian P, Rabès J.-P. Novel mutations of the PCSK9 gene cause variable phenotype of autosomal dominant hypercholesterolemia. Hum. Mut. (2005) ; 26: 497. 4. Abifadel M, Rabès J.-P, Devillers M, Munnich A, Erlich D, Junien C, Varret M, Boileau C. Mutations and polymorphisms in the Proprotein Convertase Subtilisin Kexin 9 (PCSK9) gene in cholesterol metabolism and disease. Hum Mut, (2009); in press. 5. Dieudé P, Guedj M, Wippf J, Avouac J, (8 co-authors), Boileau C, Allanore Y. The PTPN22 620W allele confers susceptibility to systemic sclerosis: findings in a large casecontrol study of European-Caucasians and a meta-analysis. Arthritis Rheum. (2008); 58(7): 2183-2188. 16 Bases moléculaires et physiopathologiques du retard mental Le retard mental (RM), défini comme « un fonctionnement intellectuel significativement inférieur à la moyenne associé à des limitations des fonctions adaptatives », est un handicap fréquent qui concerne près de 3 % de la population générale. Cependant, l’étiologie de la maladie reste inconnue dans près de 40 % des cas. La compréhension des bases physiopathologiques du RM constitue donc l’un des grands défis scientifiques et médicaux des prochaines années. De plus, l’identification des gènes impliqués dans des RM et le décryptage des mécanismes physiopathologiques sous-jacents à ces phénotypes est une approche de choix pour aborder des questions liées au développement du système nerveux central et à la mise en place des fonctions cognitives chez l’homme. L’équipe de Laurence Colleaux s’intéresse aux causes chromosomiques et monogéniques des retards mentaux via diverses approches. La première approche porte sur le développement et l’application de la technique d’hybridation génomique comparative sur puce à ADN (CGH-array) pour identifier de nouveaux syndromes micro-délétionnels et micro-duplicationnels. La seconde approche a pour but d’identifier les mécanismes physiopathologiques responsables de formes autosomiques récessives de RM. Elle s’appuie sur une collection de familles multiplex et consanguines, une stratégie de cartographie par autozygotie et l’étude de modèles cellulaires ou animaux. Enfin, notre dernier objectif est de préciser le phénotype correspondant à ces nouvelles entités pour aider le clinicien dans sa démarche diagnostique. Depuis quatre ans, cette équipe a ainsi pu : 1) dégager des corrélations génotype-phénotype dans le syndrome de Cornelia de Lange et la délétion 22q13.3, 2) démontrer le rôle prépondérant des anomalies chromosomiques dans l’étiologie des syndromes autistiques et des syndromes d’avances staturales, 3) définir cliniquement et moléculairement deux nouveaux syndromes microdélétionnels (del 9q22.32-q22.33 et del 19q12-q13.1), 4) démontrer que des anomalies du gène TCF4 sont responsables du syndrome de Pitt-Hopkins, 5) identifier huit nouveaux gènes impliqués dans des RM récessifs autosomiques. Enfin, en collaboration avec le groupe de Thomas Préat (ESPCI), l’équipe de Laurence Colleaux a poursuivi l’étude fonctionnelle du gène codant la neurotrypsine, qu’elle avait identifié en 2002 comme le premier gène impliqué dans une forme autosomique récessive de RM isolé. Elle a ainsi montré le rôle majeur de la protéine Tequila, l’orthologue drosophile de la neurotrypsine, dans la plasticité cérébrale et le maintien de la mémoire à long terme. De plus, elle a démontré que le phénotype observé chez les mouches Tequila knock-down était réversible. Outre leur grand intérêt diagnostique, ces résultats attestent de la pertinence des approches génétiques choisies et ont déjà eu d’importantes conséquences en pratique médicale. Sur un plan fondamental, ce travail a permis de mettre en lumière de nouveaux mécanismes physiopathologiques de retard mental contribuant ainsi à une meilleure compréhension des processus normaux médiant la plasticité cérébrale. Laurence COLLEAUX Équipe : Chercheuse : Anne Philippe Étudiants doctorants : Sarah Boissel Orianne Philippe Valérie Malan Publications : 1. Molinari F, Raas-Rothschild A, Rio M, Fiermonte G, Encha-Razavi F, Palmieri L, Palmieri F, Ben-Neriah Z, Kadhom N, Vekemans M, Attie-Bitach T, Munnich A, Rustin P, Colleaux L. Impaired mitochondrial glutamate transport in autosomal recessive neonatal myoclonic epilepsy. Am J Hum Genet. 2005. 76: 334-9. 2. Didelot G, Molinari F, Tchenio P, Comas D, Milhiet E, Munnich A, Colleaux L, Preat T. Tequila, a neurotrypsin ortholog, regulates long-term memory formation in Drosophila. Science. 2006. 313: 851-3. 3. Amiel J, Rio M, de Pontual L, Redon R, Malan V, Boddaert N, Plouin P, Carter NP, Lyonnet S, Munnich A, Colleaux L. Mutations in TCF4, encoding a class I basic helix-loop-helix transcription factor, are responsible for Pitt-Hopkins syndrome, a severe epileptic encephalopathy associated with autonomic dysfunction. Am J Hum Genet. 2007. 80: 988-93. 4. Molinari F, Foulquier F, Tarpey PS, Morelle W, Boissel S, Teague J, Edkins S, Futreal PA, Stratton MR, Turner G, Matthijs G, Gecz J, Munnich A, Colleaux L. Oligosaccharyltransferase-subunit mutations in nonsyndromic mental retardation. Am J Hum Genet. 2008. 82: 1150-7. 5. Boissel S, Reish O, Proulx K, Kawagoe-Takaki H, Sedgwick B, Yeo GS, Meyre D, Golzio C, Molinari F, Kadhom N, Etchevers HC, Saudek V, Farooqi IS, Froguel P, Lindahl T, O’Rahilly S, Munnich A, Colleaux L. Loss-of-function mutation in the dioxygenase-encoding FTO gene causes severe growth retardation and multiple malformations. Am J Hum Genet. 2009. 85: 106-11 17 Bases moléculaires et physiopathologiques des chondrodysplasies La croissance des os longs est due au processus d’ossification endochondrale qui nécessite la différenciation et la prolifération d’une cellule spécifique, le chondrocyte. Le groupe des chondrodysplasies est caractérisé par un retard statural en rapport avec une anomalie de ce processus et des complications orthopédiques. La thématique de recherche de cette équipe est la contribution à la compréhension du processus d’ossification endochondrale en utilisant deux approches : 1) identification des bases moléculaires des chondrodysplasies conduisant à la mise en évidence de nouvelles protéines impliquées dans ce processus, 2) étude de la fonction de ces protéines à l’aide de modèles cellulaires et animaux. Pour le volet génétique, la constitution de cohortes homogènes à partir de l’analyse clinico-radiologique de séries de patients a permis d’identifier, de 1998 à 2009, 10 nouveaux gènes codant pour des protéines de fonction très variées : 1) SHOX, facteur de transcription, dans la dyschondrostéose, 2) Dymecline, à fonction inconnue, localisée au niveau de l’appareil de Golgi dans le syndrome de Dyggve-Melchior-Clausen, 3) CUL7, composant d’un complexe ubiquitine ligase dans le syndrome 3 M 4-5) des récepteurs aux cytokines : LIFR dans le syndrome du Stüve-Wiedemann et CRLF1 dans le syndrome du Crisponi, 6) TXAS, Thromboxane synthase, dans le syndrome du Ghosal 7) DYNC2H1, impliqué dans la génération et la maintenance du cil dans la dystrophie thoracique de Jeune 8) CANT1, une nucléotidase, dans le syndrome de Desbuquois, 9-10) ADAMTSL2 et ADAMTS10, composants de la matrice extracellulaire dans la dysplasie géléophysique et le syndrome de Weill Marchesani. L’équipe a également montré que les mutations d’ADAMTSL2 sont responsables d’une activation de la voie de signalisation TGb. Les études fonctionnelles sont principalement orientées sur la compréhension du rôle d’ADAMTSL2 et d’ADAMTS10 dans le réseau microfibrillaire et la voie de signalisation TGFb. Le but ultime est la mise au point d’une thérapie pour les patients porteurs de dysplasie géléophysique en testant l’efficacité des anticorps neutralisant le TGFb. Des modèles cellulaires humains et un modèle murin généré (KO conditionnel ADAMTSL2) sont utilisés pour les études fonctionnelles et pharmacologiques. En parallèle, l’équipe de Valérie Cormier-Daire travaille spécifiquement sur la fonction de FGFR3, récepteur à activité tyrosine kinase responsable de l’achondroplasie. Les mutations de FGFR3 induisent un gain de fonction du récepteur. Pour identifier de nouveaux partenaires de la voie de signalisation de FGFR3, cette équipe a développé différents modèles cellulaires. Elle a montré que la principale voie de signalisation impliquée était la voie STAT et a démontré que les mutations de FGFR3 induisent une activation constitutive du récepteur, une phosphorylation prématurée du récepteur et une inhibition de la glycosylation du récepteur. L’équipe a également généré un modèle murin FGFR3. Le projet futur est de poursuivre cette analyse de la fonction de FGFR3 mais également de développer des approches pharmacologiques visant à utiliser des inhibiteurs de tyrosine kinase. qui seront testés ex vivo sur des fémurs de souris FGFR3, in vivo chez la souris FGFR3, ainsi que sur des lignées chondrocytaires humaines. Les différents modèles cellulaires ou murins mis en place dans l’équipe sont des outils de choix pour étudier les fonctions et le rôle de ces différents gènes dans les chondrodysplasies. Valérie Cormier-Daire Équipe : Chercheurs : Laurence Legeai-Mallet Martine Le Merrer Geneviève Baujat François Cartault Carine Le Goff Étudiants doctorants : Céline Huber Joyce Hokayem Aurélie Jonquoy Émilie Mugniery Ingénieurs et techniciens : Nathalie Dagoneau Catherine Benoist-Lasselin Publications : 1. Huber C et al. Identification of CUL7 mutations in 3 M syndrome. Nat Genet, 2005. 37: 1119-1124. 2. Geneviève D et al. Thromboxane synthase mutations in an increased bone density disorder (Ghosal syndrome). Nat Genet, 2008. 40: 284-286. 3. Le Goff C. et al. ADAMTSL2 mutations in geleophysic dysplasia reveal a role for ADAMTS-like proteins in the regulation of TGFb bioavailability. Nat Genet, 2008. 49: 1119-1123. 4. Pannier S et al. Activating Fgfr3 Y367C mutation causes hearing loss and inner ear defect in a mouse model of chondrodysplasia. Biochim Biophys Acta. 2009. 1792: 140-147. 5. Dagoneau N, Goulet M et al. DYNC2H1 mutations cause asphyxiating thoracic dystrophy and short rib-polydactyly syndrome, type III. Am J Hum Genet, 2009. 84: 706-711. 18 Principes et applications thérapeutiques du transfert de gène Le transfert de gène est devenu une pratique usuelle dans la recherche biomédicale. C’est un outil essentiel des études de génomique fonctionnelle, utilisé pour l’identification de cibles thérapeutiques et pour la modification des cellules cibles embryonnaires ou adultes, dans un but cognitif ou pour le développement de biothérapies régénératives. Le développement de ces technologies a conduit à la mise en place d’études cliniques de thérapie génique des maladies génétiques ou acquises. Les résultats disponibles aujourd’hui indiquent que la thérapie génique fera sans aucun doute partie de l’arsenal thérapeutique de demain. Ils révèlent également des difficultés et des limitations qui doivent faire l’objet de recherches, dans le but de mieux maîtriser les conséquences du transfert de gène. Cette équipe possède une expertise forte et une reconnaissance internationale dans le domaine du transfert de gène à l’aide de vecteurs viraux, en particulier ceux dérivés de parvovirus et de lentivirus. Son intérêt est centré sur le développement d’outils permettant de contrôler l’intégration d’un transgène dans le chromosome, et d’agir sur la maturation des mRNAs. Une partie de l’activité est dédiée à des aspects « translationnels », qui concernent le développement de thérapies géniques pour des maladies génétiques de l’enfant telles que les maladies de surcharge lysosomale ou les immunodéficiences. Enfin, l’initiative de mettre en place une plateforme dédiée au transfert de gène à Necker-Enfants malades a été prise afin de faciliter l’accès à ces technologies pour les chercheurs et les cliniciens du campus. Olivier DANOS Équipe : Chercheurs : Stéphane Basmaciogullari Araksya Izmiryan Étudiants doctorants : Agathe Eckenfelder Alix Bourdel Christelle Brégnard Ingénieurs : Carine Ros Arnaud Jollet Publications : 1. Goyenvalle A, Vulin A, Fougerousse F, Leturcq F, Kaplan J, Garcia L, Danos O. Rescue of dystrophic muscle through U7 snRNA-mediated exon skipping. Science. (2004). 306: 1796-1799. 2. Bartoli M, Roudaut C, Martin, S, Fougerousse F, Suel L, Poupiot J, Gicquel E, Noulet F, Danos O, Richard I. Safety and efficacy of AAV-mediated calpain 3 gene transfer in a mouse model of limb-girdle muscular dystrophy type 2A. Mol Ther. (2006). 13: 250-259. 3. Fougerousse F, Bartoli M, Poupiot J, Arandel L, Durand M, Guerchet N, Gicquel E, Danos O, Richard I. Phenotypic Correction of alpha-Sarcoglycan Deficiency by Intra-arterial Injection of a Muscle-specifi c Serotype 1 rAAV Vector. Mol Ther. (2007). 15: 53-61. 4. Danos, O. AAV vectors for RNA-based modulation of gene expression. Gene Ther. (2008). 15: 864-9. 5. Lorain S, Gross DA, Goyenvalle A, Danos O, Davoust J, Garcia L. Transient immunomodulation allows repeated injections of AAV1 and correction of muscular dystrophy in multiple muscles. Mol Ther. (2008). 16: 541-7. 19 Études des mécanismes d’instabilité des triplets répétés et de leurs conséquences physiopathologiques dans un modèle murin de la dystrophie myotonique de Steinert La dystrophie myotonique de Steinert (DM1), maladie neuromusculaire la plus fréquente de l’adulte, est une affection multisystémique caractérisée par une myotonie et une détérioration progressive des fonctions neuromusculaires. Il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement pour les différentes formes de cette affection. Dans la forme adulte, l’atteinte musculaire se traduit principalement par une myotonie et une atrophie. Les patients présentent aussi des troubles du rythme et de la conduction cardiaques, une cataracte et des troubles cognitifs, du sommeil, de l’humeur et du comportement. Les symptômes caractéristiques de la forme néonatale que sont l’hypotonie majeure, une détresse respiratoire aiguë, des troubles de la succion et de la déglutition, et un retard du développement psychomoteur très sévère en font une entité différente de la forme adulte. Le défaut génétique de cette maladie, identifié en 1992, correspond à l’amplification d’un triplet répété instable CTG dans la partie 3’ transcrite mais non traduite du gène DMPK, localisé sur le chromosome 19. Dans la population normale, la taille de la répétition varie de 5 à 37 CTG. Elle est stable au cours des générations. En revanche, chez les patients DM1, la taille de la répétition est supérieure à 50 CTG et augmente au cours des générations (instabilité intergénérationnelle) pour parfois atteindre jusqu’à 4 000 CTG dans certaines formes néonatales. Une corrélation étroite a pu être démontrée entre la taille de la répétition, l’âge d’apparition de la maladie et la sévérité des symptômes. Par ailleurs, on observe chez les patients une instabilité somatique : la taille de la répétition de triplets CTG varie d’un tissu à l’autre et au sein d’un même tissu. Cette instabilité somatique continue au cours de la vie du patient et pourrait être corrélée à la progression des symptômes. Les conséquences pathologiques de cette expansion sont complexes et font intervenir différents mécanismes moléculaires. Il est maintenant établi que la majorité des symptômes est due à un effet toxique des ARN porteurs de l’amplification. En effet, les ARN DMPK porteurs d’amplifications sont séquestrés dans le noyau sous forme de foyers d’accumulation (« foci ») et entraînent une perturbation du métabolisme d’autres ARN. Au laboratoire, l’équipe de Geneviève Gourdon a créé des modèles murins reproduisant l’amplification des CTG observée chez l’homme. Ces modèles ont été réalisés dans l’objectif 1) d’étudier les mécanismes d’instabilité des triplets CTG, 2) d’étudier leurs conséquences physiopathologiques, et 3) de disposer d’un modèle animal en vue d’essais thérapeutiques. Geneviève Gourdon Équipe : Chercheur : Mario Gomes-Pereira Étudiants doctorants : Judith Brouwer Oscar Hernandez Géraldine Sicot Ingénieurs : Annie Nicole Aline Huguet Publications : 1. Gourdon G, Radvanyi F, Lia AS, Duros C, Blanche M, Junien C, Hofmann-Radvanyi H. Moderate instability of a 55 CTG repeat in transgenic mice carrying a 45 kb genomic region from an affected DM patient. Nature Genetics. 1997. 15: 190-192 2. Seznec H, Agbulut O, Savouret C, Sergeant N, Ghestem A, Tabti N, Willer JC, Ourth L, Duros C, Brisson E, Fouquet C, Buttler-Browne G, Delacourte A, Junien C, Gourdon G. Mice transgenic for the human myotonic dystrophy region with expanded CTG repeats display muscular and brain abnormalities. Human Molecular Genetics. 2001. 10: 2717-2726. 3. Savouret C, Brisson E, Essers J, Kanaar R, Pastink A, te Riele H, Junien C, Gourdon G. CTG repeat instability and size variation timing in repair-deficient mice. The Embo Journal, 2003, 22: 2264-2273. Maladies génétiques cutanées : des mécanismes pathologiques au traitement La peau joue un rôle de barrière mécanique et immunologique essentiel à la survie de l’organisme. Notre équipe étudie plusieurs maladies génétiques sévères de la peau de l’enfant et de l’adulte dans lesquelles ces fonctions sont profondément altérées. Il s’agit de maladies rares, monogéniques et orphelines dont nous avons identifié les gènes : épidermolyses bulleuses dystrophiques, syndrome de Netherton et maladie de Darier, mais également de maladies fréquentes et polygéniques telle la dermatite atopique. Nos projets visent à mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliqués, à identifier les facteurs responsables de la variabilité phénotypique de ces maladies, afin de développer de nouvelles approches thérapeutiques. Biothérapies, gènes modificateurs et modèles murins des épidermolyses bulleuses dystrophiques (EBDR). Nous avons complété les études pré-cliniques qui nous permettent de préparer un premier essai de phase I/II de thérapie génique ex vivo utilisant des greffes de peau autologue reconstruite génétiquement corrigée à l’aide d’un rétrovirus sécurisé SIN exprimant le collagène VII (collaboration avec le Pr M. Cavazzana-Calvo et le Dr O. Danos). D’autres approches sont également développées telles le saut d’exons, pour lequel nous avons créé une souris humanisée pour COL7A1, et la translecture de mutations non sens. Une étude de transcriptome comparatif est en cours afin d’identifier des gènes modificateurs et les voies biologiques impliquées, pouvant conduire à des approches pharmacologiques ciblées. Syndrome de Netherton (SN) : allergie par dérégulation des protéases épidermiques. Nous avons caractérisé la cascade biologique conduisant à l’allergie et la desquamation anormale dans le SN. Celle-ci est initiée par l’hyperactivité de la kallikréine 5 par défaut d’inhibition par LEKTI, conduisant à l’activation de PAR2 et la production de TSLP. KLK5 constitue donc une cible thérapeutique majeure contre laquelle nous recherchons des inhibiteurs spécifiques par modélisation moléculaire, criblage in silico et expérimental. D’autres approches par biothérapie et plusieurs modèles murins développés par l’équipe sont en cours d’investigation. Maladie de Darier (MD), un modèle de maladie par anomalie de l’homéostasie calcique épidermique. Nous avons récemment montré que le dysfonctionnement de SERCA2, pompe calcique du réticulum endoplasmique qui est mutée dans la maladie, conduit à un stress du reticulum endoplasmique et à des anomalies de transport à la membrane des protéines d’adhésion cellulaire. Une analyse transcriptomique comparative est en cours afin d’identifier les cascades biologiques impliquées. Génétique de la dermatite atopique : anomalies de la barrière épidermique et dysfonction du système immunitaire. Les cascades biologiques identifiées dans le SN et dans un modèle murin d’hypersensibilité médiée par les IgE (collaboration avec le Dr G. Fournié) nous ont conduit à tester par étude d’association des gènes candidats de la barrière cutanée et du système immunitaire au sein d’une cohorte de trios français. Plusieurs gènes candidats montrent des associations suggestives. Ces résultats sont en cours de réplication et font l’objet d’études fonctionnelles. Une étude d’association pangénomique sur des échantillons européens suivie d’une étude familiale de réplication sur trios est en cours. 4. Savouret C, Garcia-Cordier C, Megret J, te Riele H, Junien C and Gourdon G. MSH2-dependent germinal CTG repeat expansions are produced continuously in spermatogonia from DM1 transgenic mice. Molecular and Cellular Biology. 2004. 24: 629-637 5. Gomes-Pereira M, Foiry L, Nicole A, Huguet A, Junien C, Munnich A, Gourdon G. CTG trinucleotide repeat “big jumps”: large expansions, small mice. PloS Genetics. 2007 6. 3(4): epub52. 20 Alain Hovnanian Équipe : Chercheurs : Matthias Titeux Céline Deraison Étudiante doctorante : Sandrina Turczynski Ingénieurs : Audrey Decha Anissa Edir Florine Oualid Nathalie Pironon Publications : 1. Sakuntabhai A, Ruiz-Perez V, Carter S, Jacobsen N, Burge S, Monk S, Smith M, Munro CS, O’Donovan M, Craddock N, Kucherlapati R, Rees JL, Owen M, Lathrop GM, Monaco AP, Strachan T, Hovnanian A. Mutations in ATP2A2, encoding a Ca2+ pump, cause Darier disease. Nat Genet. (1999). 21, 271-7. 2. Chavanas S, Bodemer C, Rochat A, HamelTeillac D, Ali M, Irvine AD, Bonafe JL, Wilkinson J, Taieb A, Barrandon Y, Harper JI, de Prost Y, Hovnanian A. Mutations in SPINK5, encoding a serine protease inhibitor, cause Netherton syndrome. Nat Genet. (2000). 25: 141-142. 3. Descargues P, Deraison C, Bonnart C, Kreft M, Kishibe M, Ishida-Yamamoto A, Elias P, Barrandon Y, Zambruno G, Sonnenberg A, Hovnanian A. Spink5-deficient mice mimic Netherton syndrome through degradation of desmoglein 1 by epidermal protease hyperactivity. Nat Genet. (2005). 37: 56-65. 4. Briot A, Deraison C, Lacroix M, Bonnart C, Robin A, Besson C, Dubus P, Hovnanian A. Kallikrein 5 induces atopic dermatitis-like lesions through PAR2-mediated thymic stromal lymphopoietin expression in Netherton syndrome. J Exp Med. (2009). May. 11. 206(5): 1135-47. a. Les souris invalidées pour le gène Spink5 présentent un décollement de la couche cornée (CC) secondaire à un clivage des desmosomes par la kallikréine 5 (KLK5) hyperactive. b. L’épiderme des patients SN montre une forte expression de TSLP (Thymic Stromal Lymphopoïetin), une cytokine pro-Th2 majeure capable d’induire les réponses allergiques par différenciation des lymphocytes naïfs (Th0) en lymphocytes Th2. La surexpression de TSLP résulte de l’activation de PAR2 par KLK5. 5. Bonnart C, Deraison C, Lacroix M, Uchida Y, Besson C, Robin A, A Briot A, Gonthier M, Lamant L, Dubus P, Monsarrat B, Hovnanian A. Elastase 2 is expressed in human and mouse epidermis and impairs skin barrier function in Netherton syndrome through filaggrin and lipid misprocessing, J. Clin. Invest. (2010) in press. 21 GENATLAS http://www.genatlas.org GENATLAS est une base de données sur les gènes et les maladies, créée en 1986 et depuis constamment mise à jour ; elle met à disposition de la communauté scientifique et médicale internationale des informations concernant la structure, l’expression et la fonction des gènes, leurs mutations et leurs conséquences phénotypiques. GENATLAS repose sur une architecture informatique originale et permet une interrogation facile de trois bases de données intriquées : « gene database », « phenotype database » et une base de références bibliographiques. Les données reposent sur une annotation des articles scientifiques qui est assurée par une veille bibliographique quotidienne (collections et bibliothèques des Université Paris Descartes, CNRS, INSERM). GENATLAS est hébergée à l’Université Paris-Descartes. L’annotation des liens gènes-maladies mais également l’annotation des réarrangements chromosomiques et de leurs phénotypes associés donnent à GENATLAS sa spécificité et lui confèrent sa qualité de véritable compilation des maladies génétiques. GENATLAS s’attache aussi à développer des outils utiles aux chercheurs et aux médecins prenant en compte les nouveaux concepts : outils pour rechercher un gène dans un intervalle donné, prédiction d’ARN messager, utilisation de thésaurus communs élaborés conjointement avec plusieurs bases de données ayant pour intérêt commun les maladies génétiques (ORPHANET, CEMARA, GENATLAS). Enfin des liens réciproques sont établis avec différentes bases données internationales comme Swissprot, HGMD, IGMT, Genew, Genecards, et Orphanet confirmant une reconnaissance internationale (plus de 250 000 visites sur www.genatlas.org sont enregistrées chaque année). MIRIFIXTM http://www.mirifix.com MiRiFixTM est un outil bioinformatique voué à la recherche et à la clinique visant à (1) promouvoir la découverte de gènes de microARNs potentiellement causals dans les maladies génétiques, et (2) identifier les microARNs qui pourraient interférer avec une condition donnée en tant que gènes modificateurs. Ce logiciel est référencé à l’Agence pour la Protection des Programmes. MiRiFixTM est dédié à la communauté des généticiens, scientifiques et cliniciens, qui souhaitent faire face à la révolution de l’ARN non codant. Son positionnement unique lui confère le rôle de base de données intégrative, avec ses propres développements et un portail dynamique ouvert aux outils les plus fiables et reconnus du domaine. Par une interface facile d’utilisation, il est possible d’explorer en un clic la localisation des microARNs par rapport aux annotations sur les gènes codant pour des protéines et le ciblage prédit d’un ARNm au niveau : (1) de SNPs, (2) du 3’UTR et (3) des exons. De plus, l’interface permet d’accéder aux méthodologies adaptées permettant de tester spécifiquement le ciblage microARN-ARNm avec une séquence normale ou mutée. MiRiFixTM est distinct des autres ressources en tant qu’outil : - dédié à la génétique humaine, - permettant une requête directe via la localisation, le gène ou la maladie, - fournissant une dualité d’information concernant le microARN en tant que gène candidat d’une part et gène modificateur d’autre part, - comprenant une base de données globale de littérature annotée manuellement avec une cartographie éprouvée des maladies génétiques, - aggrégeant 18 outils computationnels dédiés aux microARNs avec une ontologie commune facilitant un flux continu entre différents algorithmes, - portail de liens intégrés pour évaluer les ciblages microARN-ARNm et leur validité computationnelle. 22 Martine Le Merrer Alexandra Henrion-Caude Équipe : Chercheur : Catherine Turleau Ingénieur : Claude Mugnier Autres membres de l’équipe : Marie Liesse Chauvet Karine Tanin- Girardot Stéphanie Guignette Patrice Gastiteau Embryologie et architecture génétique des malformations de la crête neurale L’équipe de Stanislas Lyonnet a entrepris un programme scientifique visant à l’identification de gènes responsables de malformations congénitales. Ce groupe a choisi de se concentrer sur les malformations résultant d’une migration, différenciation ou survie anormale des tissus dérivés des crêtes neurales : les neurocristopathies ; ainsi que sur des syndromes comportant un défaut de fermeture du tube neural. Ces thèmes soulèvent d’importantes questions de biologie et de génétique du développement ; les crêtes neurales sont en effet des structures embryonnaires transitoires qui donnent naissance à un nombre de tissus très varié : mésectoderme craniofacial, mélanocytes, système nerveux périphérique et cellules para-endocrines. Ces cellules sont donc d’un intérêt majeur pour les cliniciens par la variété des malformations et des prédispositions aux cancers auxquelles elles sont liées (neurocristopathies). Parallèlement, résoudre la nature des syndromes avec défaut de fermeture du tube neural est aussi d’une grande importance en santé puisque l’identification des gènes impliqués peut contribuer à la fois à la compréhension du modèle multifactoriel qui préside à la plupart des malformations congénitales communes. Le programme de cette équipe s’appuie sur d’importantes cohortes de patients atteints de neurocristopathies dans un campus hospitalo-universitaire tourné vers la prise en charge des malformations, la capacité à étudier les patrons d’expression spatio-temporelle du gène au cours du développement chez l’homme et dans des modèles animaux et des lignées de crêtes neurales humaines primaires récemment établies. Jusqu’à présent, les études ont conduit à la cartographie et l’identification de gènes impliqués dans des syndromes malformatifs, notamment du groupe des ciliopathies. L’équipe de Stanislas Lyonnet a également entrepris des études de corrélation génotype-phénotype à différents loci. Plus récemment, elle a identifié des mutations de séquences non codantes de l’ADN à grande distance de part et d’autre de séquences codantes du locus SOX9 dans une neurocristopathie craniofaciale. Du fait des modèles génétiques complexes rencontrés désormais (hétérogénéité et hérédité multigénique), des études préliminaires de plus haut débit ont été entreprises, visant à générer des répertoires de gènes exprimés dans les tissus relevants. Cela comprend : - L’étude des patrons d’expression spatio-temporelle de gènes au cours du développement humain et dans des modèles animaux ; - Des analyses de transcriptomes au cours de l’organogenèse, tournées essentiellement vers les cellules dérivées des crêtes et du tube neural ; - Et, faisant face à moins de modèles mendéliens, des analyses de transcriptome et de microARN qui visent à identifier des cascades intégrées de gènes impliqués dans le développement des CN et à en sélectionner les candidats les plus pertinents. Stanislas Lyonnet Équipe : Chercheurs : Jeanne Amiel Tania Attié-Bitach Claude Besmond Heather Etchevers Alexandra Henrion-Caude Michel Vekemans Étudiants doctorants : Anne-Sophie Jannot Sophie Thomas Ingénieur : Anna Pelet Publications: 1. Amiel J, Laudier B, Attié-Bitach T, Trang H, de Pontual L et al. Polyalanine expansion and frame shift mutations of the paired-like homeobox gene PHOX2B in congenital central hypoventilation syndrome (Ondine’s curse). Nat Genet. (2003). 33: 459-461. 2. Baala L, Briault S, Etchevers H, Laumonnier F, Natiq A, Amiel J, et al. Homozygous silencing of T-box transcription factor EOMES leads to microcephaly with polymicrogyria and corpus callosum agenesis. Nat Genet. (2007). 39:454-6. 3. Delous M, Baala L, Salomon R, Laclef C, Vierkotten J et al. The ciliary gene RPGRIP1L is mutated in cerebello-oculo-renal syndrome (Joubert syndrome type B) and Meckel syndrome. Nat Genet. (2007). 39: 875-81. 4. Thomas S, Thomas M, Wincker P, Babarit C, Xu et al. Human neural crest cells share a complex molecular signature with embryonic stem cells. Hum Mol Genet. (2008). 17: 3411-25. 5. Benko S, Fantes JA, Amiel J, Kleinjan DJ, Thomas S et al. Disruption of very distant highly conserved non-coding elements on either side of the SOX9 gene is associated with Pierre Robin sequence. Nat Genet. (2009). 41: 359-64. 23 Génétique des maladies mitochondriales Les maladies mitochondriales ont de très nombreuses causes génétiques qui conduisent toutes à un déficit de la chaîne respiratoire. De plus en plus de gènes de maladies mitochondriales sont régulièrement identifiés mais il n’en reste pas moins que, pour plus de 80 % des patients, la mutation responsable de leur maladie est encore inconnue. Ainsi, l’objectif principal de ce groupe est d’identifier de nouveaux gènes responsables de déficits de la chaîne respiratoire. Plusieurs approches sont menées dans ce but. Études génétiques Cette équipe effectuera des études génétiques dans les quelques familles consanguines par utilisation de marqueurs polymorphes (SNP). Ceci permettra d’identifier la position chromosomique du gène de la maladie et d’étudier à ce locus des gènes candidats par séquençage direct. Assemblage de la chaîne respiratoire Le bon fonctionnement de la chaîne respiratoire nécessite une régulation fine de l’assemblage de ses différents constituants. L’équipe d’Agnès Rötig étudie cet assemblage dans différents types de déficits afin de constituer des groupes de patients présentant les mêmes anomalies. Cette caractérisation permettra ensuite de mieux appréhender les gènes à étudier chez ces patients. Anomalies de synthèse des protéines mitochondriales Une partie des déficits multiples de la chaîne respiratoire est due à des anomalies de traduction des protéines codées par l’ADN mitochondrial. Cette équipe recherchera ce type d’anomalie en étudiant le taux d’expression des différentes protéines d’origine nucléaire ou mitochondriale puis en étudiant directement la traduction in organello. Déficits en coenzyme Q10 Les déficits en coenzyme Q10 sont des maladies rares mais parfois traitables qui résultent de mutations dans les enzymes de la voie de biosynthèse de ce composé. Afin de comprendre cette hétérogénéité clinique, l’équipe d’Agnès Rötig va étudier l’expression des différents gènes de la voie de synthèse du CoQ10 dans différents tissus et cellules de patients présentant des mutations de ces gènes et chez des contrôles. Étude d’expression L’expression de l’ensemble des gènes sera étudiée par transcriptome dans des séries cliniquement homogènes de patients sporadiques. L’hypothèse est que plusieurs patients ont le même gène muté et qu’une partie d’entre eux auront des mutations conduisant à un codon stop prématuré et à une diminution de son transcrit. Ainsi, les gènes fortement sous-exprimés seront ensuite séquencés. L’autre aspect de ce travail sera, une fois la mutation identifiée, d’étudier les régulations mises en place dans les cellules de patients en réponse au déficit. Mutations de l’ADN mitochondrial : impact sur son métabolisme et approches thérapeutiques L’effet des mutations NARP et MELAS de l’ADN mitochondrial (ADNmt) sur le nombre de copies de l’ADNmt, sa réplication et l’expression des gènes nucléaires impliqués dans sa maintenance seront étudiés. Ce travail sera fait sur des tissus et des cellules à différents moments de la vie pré et postnatale. Cette équipe déterminera aussi l’impact possible des activateurs de PCGC1 et des agonistes de PPAR sur le taux d’hétéroplasmie dans l’optique de thérapies ultérieures. Agnès Rötig Équipe : Chercheurs : Jean-Paul Bonnefont Valérie Serre Julie Steffann Étudiants doctorants : Marine Beinat Louise Galmiche Clément Meiler Sophie Monnot Ingénieurs et techniciens : Dominique Chrétien Vanessa Vedrenne Publications : 1. Sarzi E, Goffart S, Serre V, Chrétien D, Slama A, Munnich A, Spelbrink JN, Rötig A. Twinkle helicase (PEO1) gene mutation causes mitochondrial DNA depletion. Ann Neurol. (2007). 62: 579-87 2. Mollet J, Giurgea I, Schlemmer D, Dallner G, Chrétien D, Delahodde A, Bacq D, de Lonlay P, Munnich A, Rötig A. Prenyldiphosphate synthase, subunit 1 (PDSS1) and OH-benzoate polyprenyltransferase (CoQ2) mutations in ubiquinone deficiency and oxidative phosphorylation disorders. J Clin Invest. (2007). 117: 765-772 3. Bourdon A, Minai L, Serre V, Jais JP, Sarzi E, Aubert S, Chrétien D, de Lonlay P, Paquis-Flucklinger V, Arakawa H, Nakamura Y, Munnich A, Rötig A. Mutation of RRM2B, encoding p53controlled ribonucleotide reductase (p53R2), causes severe mitochondrial DNA depletion. Nat Genet. (2007). 39: 776-80 4. Zeharia A, Shaag A, Pappo O, Mager-Heckel AM, Saada A, Beinat M, Karicheva O, Mandel H, Ofek N, Segel R, Marom D, Rötig A, Tarassov I, Elpeleg O. Acute infantile liver failure due to mutations in the TRMU gene. Am J Hum Genet. (2009). 85: 401-7 5. Bonnefont JP, Bastin J, Behin A, Djouadi F. Bezafibrate for an inborn mitochondrial betaoxidation defect. N Engl J Med. (2009). 360: 838-40 24 Génétique ophtalmologique Les dystrophies rétiniennes héréditaires (RD) définissent une grande famille d’atteintes dégénératives du couple cellulaire photorécepteur-épithélium pigmentaire, très hétérogènes aux plans clinique, génétique et moléculaire. Elles affectent tous les âges de la vie et conduisent inexorablement à la cécité. La fréquence de ces affections, toutes formes confondues, est estimée à 1/3 000 ; il s’agit d’une cause majeure de malvoyance grave. En France, le site Necker-Enfants malades a accueilli à la fin des années 1980 la première équipe de recherches en génétique ophtalmologique avec pour objectif de décrypter les bases génétiques, moléculaires et physiopathologiques des dystrophies rétiniennes les plus précoces et sévères. Des avancées significatives en matière de démembrement génétique de l’amaurose congénitale de Leber, des dystrophies maculaires, des rétinites pigmentaires liées au chromosome X et plus récemment des neuropathies optiques sont à mettre l’actif de l’équipe. Ces avancées ont largement contribué à une amélioration du conseil génétique et à la prise en charge de ces affections. Au-delà, elles ont permis de mieux comprendre leur physiopathologie, d’améliorer les connaissances en matière de physiologie de la rétine et même d’ouvrir la voie vers des essais thérapeutiques. Si des progrès considérables ont été réalisés au cours de ces deux dernières décennies, de nombreux gènes et de nombreux mécanismes physiopathologiques restent à découvrir tant les dystrophies rétiniennes sont hétérogènes au plan génétique et physiopathologique. Notre projet est de poursuivre les travaux de localisation et d’identification des gènes responsables des maladies héréditaires de la rétine, en particulier l’amaurose de Leber et les neuropathies optiques. Parallèlement, nous mettons en place les outils nécessaires au développement d’approches thérapeutiques pour l’amaurose congénitale de Leber et la maladie de Stargardt. Le premier de nos projets à visée thérapeutique repose sur une stratégie de saut d’exon ciblé sur une mutation du gène CEP290 à l’origine d’une amaurose congénitale de Leber particulièrement sévère et fréquente. Le second projet vise à invalider partiellement le gène ABCA4, impliqué chez l’homme d’un spectre d’affection touchant la rétine centrale, chez un rongeur diurne en vue d’obtenir un modèle animal original, adapté au développement d’outils thérapeutiques des maladies maculaires héréditaires, voire un modèle utile pour les très fréquentes dégénérescences maculaires liées à l’âge. Jean-Michel Rozet Équipe : Chercheurs : Josseline Kaplan Isabelle Perrault Sylvain Hanein Étudiants doctorants : Lucas Fares-Taie Julien Tilleul Julien Cottineau Ingénieurs : Sylvie Gerber Nathalie Delphin Publications : 1. Rozet JM, Perrault I, Calvas P, Gerber S, Camuzat A, Dollfus H, Châtelin S, Souied E, Ghazi I, Leowski C, Bonnemaison M, Le Paslier D, Frézal J, Dufier JL, Pittler S, Munnich A, Kaplan J. Retinal-specific guanylate cyclase gene mutations in Leber’s congenital amaurosis. Nat Genet. (1996). 14(4): 461-4. 2. Ducroq D, Rozet JM, Gerber S, Perrault I, Barbet D, Hanein S, Hakiki S, Dufier JL, Munnich A, Hamel C, Kaplan J. The ABCA4 gene in autosomal recessive cone-rod dystrophies. Am J Hum Genet. (2002). 71(6): 1480-2. 3. Perrault I, Hanein S, Gerber S, Barbet F, Ducroq D, Dollfus H, Hamel C, Dufier JL, Munnich A, Kaplan J, Rozet JM. Retinal dehydrogenase 12 (RDH12) mutations inLeber congenital amaurosis. Am J Hum Genet. (2004). 75(4): 639-46 4. Gerber S, Bonneau D, Gilbert B, Munnich A, Dufier JL, Rozet JM, Kaplan J. USH1A: chronicle of a slow death. Am J Hum Genet. (2006). 78(2): 357-9. 5. Hanein S, Perrault I, Roche O, Gerber S, Khadom N, Rio M, Boddaert N, Jean-Pierre M, Brahimi N, Serre V, Chrétien D, Delphin N, Fares-Taie L, Lachheb S, Rötig A, Meire F, Munnich A, Dufier JL, Kaplan J, Rozet J. TMEM126A, encoding a mitochondrial protein, is mutated in autosomalrecessive nonsyndromic optic atrophy. Am J Hum Genet. (2009). 84(4): 493-8. 25 NF-kB et homéostasie épidermique : de l’incontinentia pigmenti aux dysplasies ectodermiques anhydrotiques Le facteur de transcription NF-kB joue un rôle crucial dans la réponse immunitaire, l’inflammation, le développement et la cancérogenèse. NF-kB est localisé dans le cytoplasme grâce à sa liaison aux inhibiteurs de la familleIkB. Après stimulation, IkB est phosphorylé par le complexe IKK, puis dégradé par la voie du protéasome, permettant à NF-kB de passer dans le noyau afin de transcrire ses gènes cibles. Nous avons identifié plusieurs maladies génétiques causées par des mutations qui affectent les composants clés de cette chaîne, comme NEMO (la sous-unité régulatrice d’IKK), IkB-a, EDAR et EDARADD. Des mutations perte de fonction du gène NEMO sont responsables de l’incontinentia pigmenti, une génodermatose liée au chromosome X, qui affecte les femmes et est caractérisée par une dermatose sévère associée ou non à des anomalies du système nerveux central. Les mutations hypomorphes des gènes NEMO et IkB-a conduisent, chez l’homme, à une dysplasie ectodermique anhydrotique avec immunodéficience (EDA-ID), une immunodéficience sévère associée à des défauts du développement qui affectent les annexes cutanées. Les mutations dans les gènes EDA, EDAR et EDARADD sont responsables d’EDA pure. Les trois protéines sont impliquées dans la même voie de signalisation dépendante de NF-kB et impliquées dans le développement des annexes épidermiques. De plus, nous avons découvert la relation existant entre une autre maladie génétique, la cylindromatose, et la voie NF-kB, en montrant que le gène affecté, CYLD, est un régulateur négatif de l’activation d’IKK dépendante de NEMO. Dans cette pathologie, les mutations de CYLD se traduisent par des tumeurs bénignes se développant à partir des annexes de la peau. Nous comptons poursuivre la caractérisation génétique des maladies décrites ci-dessus et essaierons de comprendre plus précisément leur physiopathologie et les mécanismes moléculaires de l’activation d’IKK/NF-kB qui sont perturbés, afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. De façon plus spécifique, nous utiliserons des approches génétiques pour découvrir de nouveaux participants de la voie NF-kB. Une recherche de nouveaux loci qui causent EDA sera mise en place et une recherche génétique de nouveaux régulateurs de NF-kB sera lancée à grande échelle. Asma Smahi Équipe : Chercheurs : Gilles Courtois Christine Bodemer Smaïl Hadj-Rabia Julie Salomon Étudiants doctorants : Élodie Bal Céline Cluzeau Jérémie Gautheron Ingénieur : Philippe Guigue Publications : 1. Kovalenko A, Chable-Bessia C, Cantarella G, Israël A, Wallach D, Courtois G. The tumor suppressor CYLD negatively regulates NFkappaB signalling by deubiquitination. Nature. (2003). 112: 1108-15. 2. Morlon A. Munnich A, Smahi A. TAB2, TRAF6 and TAK1 are involved in NF-kappaB activation induced by the TNF-receptor, Edar and its adaptator Edaradd. Hum Mol Genet. (2005). Dec1. 14(23): 3751-7. 3. Sebban-Benin H, Pescatore A, Fusco F, Pascuale G, Gautheron J, Yamaoka S, Moncla A, Ursini MV, Courtois G. Identification of TRAF6-dependent NEMO polyubiquitination sites through analysis of a new NEMO mutation causing Incontinentia Pigmenti. Hum. Mol. Genet. (2007). 16: 2805-2815. Bases moléculaires des maladies rénales : cystinose et syndromes néphrotiques héréditaires Les projets de recherche de notre équipe sont centrés sur l’étude de deux néphropathies héréditaires, la cystinose et les syndromes néphrotiques héréditaires. Ces thèmes sont basés sur les travaux antérieurs de notre groupe qui a identifié en 1998 le gène CTNS impliqué dans la cystinose et en 2000, le premier gène impliqué dans le syndrome néphrotique cortico-résistant (SNCR), le gène NPHS2 codant la podocine. La cystinose est une maladie de surcharge lysosomale de transmission autosomique récessive, caractérisée par une accumulation de cystine intra-lysosomale, liée à un défaut de transport de cystine à travers la paroi du lysosome. La première manifestation, la plus sévère, de la cystinose est l’atteinte rénale caractérisée par une tubulopathie proximale qui évolue, en l’absence de traitement spécifique vers l’insuffisance rénale terminale avant l’âge de 10 ans. Le gène en cause, CTNS, code pour la cystinosine, dont nous avons montré que c’est le transporteur lysosomal de cystine. De nombreuses questions demeurent quant à la compréhension de la pathogénie de la cystinose. Certains arguments suggèrent que la cystinosine pourrait avoir d’autres fonctions que celle de transporteur de cystine. Récemment, nous avons montré que la galectine 3 et la V-ATPase, pompe à protons vésiculaire, interagissent avec la cystinosine. Nos projets en cours consistent (1) à caractériser le trafic intra-cellulaire de la cystinosine et son rôle potentiel dans le trafic vésiculaire et la fusion des lysosomes, étant donné la démonstration récente du rôle de la galectine 3 dans le trafic intracellulaire raft-indépendant et de la V-ATPase dans l’endocytose, les voies de dégradation des protéines et la fusion/fission des vacuoles chez la levure (équivalent des lysosomes), et (2) à élucider les mécanismes responsables de la tubulopathie proximale, en utilisant les modèles in vitro et in vivo développés dans le laboratoire. Le syndrome néphrotique est une entité clinique caractérisée par une protéinurie massive, une hypoalbuminémie, une hyperlipidémie et des œdèmes. L’identification de gènes impliqués dans des formes rares de SNCR a mis en évidence le rôle crucial joué par le podocyte, cellule très spécialisée du glomérule, dans le maintien de la barrière de filtration glomérulaire. Au cours des quatre dernières années, nous avons poursuivi nos études sur le SNCR, avec (1) la génération et la caractérisation de plusieurs lignées de souris mutées pour le gène Nphs2, dont un modèle d’inactivation inductible ; (2) la caractérisation de l’effet du fonds génétique et de l’environnement maternel dans la progression de la maladie rénale chez les souris qui présentent une inactivation constitutive du gène Nphs2 ; (3) la caractérisation de corrélations génotype-phénotype dans une grande cohorte de patients avec SNCR ; (4) l’identification d’un nouveau gène muté dans le syndrome de Galloway-Mowat (SNCR et microcéphalie) ; et (5) l’identification de nouvelles cibles de WT1, facteur de transcription du podocyte. Nos projets consistent à identifier de nouveaux gènes impliqués dans les SNCR et à caractériser les protéines codées par ces gènes. Nous allons également utiliser les modèles animaux et cellulaires que nous avons développés pour tester des nouvelles approches thérapeutiques. Corinne Antignac Équipe : Chercheurs : Anne Bailleux Véronique Chauvet Géraldine Mollet Étudiants doctorants : Zuzana Andrzejewska Olivia Boyer Eduardo Machuca Techniciens : Olivier Gribouval Fabien Nevo Nathalie Nevo Lucie Thomas Publications : 1. Town M, Jean G, Cherqui S, Attard M, Forestier L, Whitmore SA, Callen DF, Gribouval O, Broyer M, Bates GP, Van’t Hoff W, Antignac C. A novel gene encoding an integral membrane protein is mutated in nephropathic cystinosis. Nature Genet. (1998). 18: 319-324. 2. Boute N, Gribouval O, Roselli S, Benessy F, Lee H, Fuchshuber A, Dahan K, Gubler M, Niaudet P, Antignac C. The NPHS2 gene encoding a novel glomerular protein, podocin, is mutated in autosomal recessive steroid-resistant nephrotic syndrome. Nature Genet. (2000). 24: 349-354. 3. Gribouval O, Gonzales M, Neuhaus T, Aziza J, Bieth E, Laurent N, Bouton JM, Feuillet F, Makni S, Ben Amar H, Laube G, Delezoide AL, Bouvier R, Dijoud F, Ollagnon-Roman E, Roume J, Joubert M, Antignac C, Gubler MC. Mutations in reninangiotensin system genes are associated with autosomal recessive renal tubular dysgenesis. Nature Genet. (2005). 37: 964-8. 4. Bal E, Baala L, Cluzeau C, El Kerch F, Ouldim K, Hadj-Rabia S, Bodemer C, Munnich A, Courtois G, Sefiani A, Smahi A. Autosomal dominant and recessive anhidrotic ectodermal dysplasias at the EDARRAD locus. Hum. Mutat. (2007).Jul. 28(7): 703-9. 4. Kalatzis V, Cherqui S, Antignac C, Gasnier B. Cystinosin, the protein defective in cystinosis, is a H+-driven lysosomal cystine transporter. EMBO J. (2001). 20: 5940-5949. 5. Mégarbané H, Cluzeau C, Bodemer C, Fraïtag S, Chababi-Atallah M, Smahi A. Unusual presentation of a severe autosomal recessive anhydrotic ectodermal dysplasia with a novel mutation in the EDAR gene. Am. J. of Med.Enet. (2008). 15 146A(20): 2657-62. 5. Mollet G, Ratelade J, Boyer O, Muda AO, Morisset L, Lavin TA, Kitzis D, Dallman MJ, Bugeon L, Hubner N, Gubler MC, Antignac C, Esquivel EL. Podocin inactivation in mature kidneys causes focal segmental glomerulosclerosis and nephrotic syndrome. J Am Soc Nephrol. (2009). 20: 2181-9. Figure: Analyse en microscopie confocale d’un double immunomarquage de rein humain adulte avec des anticorps dirigés contre la podocine (en vert) et contre la synaptopodine (en rouge). Grossissement X650. 26 27 Bases moléculaires des maladies héréditaires rénales : la néphronophtise et les hypoplasies rénales Le projet de recherche du groupe a pour but de définir la physiopathologie de la néphronophtise. De plus, l’équipe a récemment débuté un nouveau projet sur l’hypodysplasie rénale, une autre cause majeure d’insuffisance rénale de l’enfant. La néphronophtise (NPH) est une néphropathie autosomique récessive caractérisée par une fibrose interstitielle et la formation de kystes. C’est la cause génétique la plus fréquente d’insuffisance rénale chez l’enfant. La NPH est associée à des anomalies extra-rénales, telles qu’une dystrophie rétinienne (syndrome de Senior-Løken) et une hypoplasie du vermis cérébelleux (syndrome de Joubert). Au cours des dix dernières années, cette équipe a identifié quatre des gènes responsables de la NPH et des atteintes associées (NPHP1, NPHP4, RPGRIP1L et NPHP11). Le produit de ces gènes, les néphrocystines, sont des protéines cytosoliques co-localisées au niveau des jonctions cellulaires et du cil primaire dans les cellules épithéliales rénales. Le cil primaire est un organelle sensoriel constitué de microtubules à la surface apicale de la membrane des cellules tubulaires rénales où il fonctionnerait tel un mécanosenseur du flux régulant ainsi le cycle cellulaire et la polarité épithéliale. Les travaux récents basés sur les caractéristiques des cellules tubulaires invalidées pour les gènes NPHP par interférence à l’ARN, ont montré le rôle critique des néphrocystines dans la morphogenèse épithéliale et la formation du cil. L’équipe de Sophie Saunier caractérisera le rôle des néphrocystines dans la polarité apico-basale, planaire et la fonction ciliaire et les voies de signalisation impliquées lors de différents processus cellulaires et notamment lors de la tubulogenèse en culture tridimensionnelle. Les membres de l’équipe analyseront également l’impact de l’absence des néphrocystines sur différents organes (rein, yeux) par l’utilisation de modèles animaux (souris mutantes Nphp4-/-, lignées de poisson zèbre traitées par morpholinos contre les néphrocystines) et d’une grande collection de tissus de patients. Enfin, ils exploiteront leurs modèles in vitro afin de cribler des composés chimiques capables de restaurer la fonction des néphrocystines afin d’identifier de nouveaux agents thérapeutiques pour traiter les malades. En parallèle, ce groupe poursuit des études génétiques, d’une part pour identifier de nouveaux gènes responsables de NPH et d’autre part pour identifier des gènes impliqués dans l’hypodysplasie rénale (HDR), pathologie résultant d’un défaut survenant lors des premiers stades de la différenciation rénale. Différentes approches sont utilisées : études familiales ; étude de l’effet épistatique de variants dans les gènes NPHP connus ou dans d’autres gènes ciliaires, qui pourraient expliquer la variabilité du phénotype et les atteintes extra-rénales variables associées à la NPH ; recherche de variations du nombre de copies des gènes au niveau germinal et/ou somatique par quantification sur puces ainsi que de variants au niveau des 3’UTR de gènes impliqués dans la différenciation rénale dans le cas des HDR. Sophie Saunier Équipe : Chercheurs : Cécile Jeanpierre Rémi Salomon Céline Burcklé Kirian Legendre Étudiants : Helori Gaudé Mordi Muorah Lamisse Mansour Techniciens : Flora Legendre Olivier Gribouval Céline Becker Mélanie Parisot Publications : 1. Mollet G et al. The gene mutated in juvenile nephronophthisis type 4 encodes a novel protein that interacts with nephrocystin. Nat Genet. (2002). 32: 300-305. 2. Weber S et al. Prevalence of mutations in renal developmental genes in children with renal hypodysplasia: results of the ESCAPE study. J Am Soc Nephrol. (2006). 17(10): 2864-70. Équipe Avenir : miRNAs dans le développement et la fonction rénale Le but des travaux de recherche, menés par cette équipe, est de définir le rôle de la régulation des gènes par les microARNs dans le rein, et en particulier dans le glomérule et les podocytes. Les microARNs (miARNs) forment un groupe abondant de courts ARNs régulateurs qui agissent comme des répresseurs post-transcriptionnels en se fixant sur les régions 3’UTR d’ARNm cibles, ce qui entraîne l’inhibition de leur traduction ou leur dégradation. Pour étudier la fonction des miARNs dans le rein, l’équipe de Scott Harvey a supprimé leur biogenèse chez la souris par un KO conditionnel de dicer, une enzyme essentielle à la maturation des miARNs. Une inactivation dans les cellules précurseurs du rein engendre une létalité périnatale et une sévère hypoplasie rénale. Les souris avec une inactivation spécifique de dicer dans les podocytes développent une protéinurie plusieurs semaines après la naissance et progressent rapidement vers l’insuffisance rénale terminale. La pathologie podocytaire est caractérisée par l’effacement, la vacuolisation et l’hypertrophie. Les cellules subissent une dédifférenciation qui s’illustre par une désorganisation du cytosquelette. Les podocytes mutés sont incapables de synthétiser des miARNs matures ce qui est mis en évidence par la perte de miR-30, un miARN enrichi dans le rein. Par contre, l’expression des miARNs des cellules glomérulaires endothéliales (miR-126) et mésangiales (miR-145) n’est pas modifiée. Ainsi, les miARNs sont essentiels pour orchestrer le développement rénal, et sont nécessaires pour le maintien du phénotype podocytaire et l’intégrité fonctionnelle de la barrière de filtration glomérulaire. La recherche de cette équipe s’attache maintenant à définir, en termes mécanistiques, les modifications qui participent à la maladie rénale chez les souris avec une inactivation spécifique de dicer dans les podocytes. Les profils transcriptionnels et protéomiques vont servir à caractériser l’expression des gènes dans les glomérules mutants. La « signature » spécifique des miARNs du rein normal et pathologique est en cours de caractérisation au niveau des cellules et de l’organe à l’aide de puces d’expression et d’hybridation in situ. Au final, cette équipe veut attribuer des rôles biologiques à des miARNs spécifiques dans le rein par des études de gain et perte de fonction in vitro et in vivo en générant des souris invalidées pour ces miARNs. Dans un projet collaboratif, l’équipe de Scott Harvey cherche à établir les liens fonctionnels entre les miARNs et WT1, un facteur de transcription clé du podocyte. Nous évaluons l’impact des miARNs sur la régulation de l’expression de WT1, et nous testons si une isoforme spécifique de WT1 est impliquée dans la biogenèse des miARNs et régule leur activité grâce à sa capacité de liaison à l’ARN. Chercheur : Nezha Sdassi Ingénieure : Christelle Mroz Publications : 1. Harvey SJ, Jarad G, Cunningham J, Goldberg S, Schermer B, Harfe BD, McManus MT, Benzing T, Miner JH. Podocyte-specific deletion of dicer alters cytoskeletal dynamics and causes glomerular disease. J Am Soc Nephrol. (2008). 19: 2150-58. 2. Gross O, Borza DB, Anders HJ, Licht C, Weber M, Segerer S, Torra R, Gubler MC, Heidet L, Harvey S, Cosgrove D, Lees G, Kashtan C, Gregory M, Savige J, Ding J, Thorner P, Abrahamson DR, Antignac C, Tryggvason K, Hudson B, Miner JH. Stem cell therapy for Alport syndrome: the hope beyond the hype. Nephrol Dial Transplant. (2009). 24: 731-34. 3. Saal S, Harvey SJ. MicroRNAs and the kidney: coming of age. Curr Opin Nephrol Hypertens. (2009). 18: 317-23. 5. Ratelade J, Arrondel C, Hamard G, Garbay S, Harvey S, Biebuyck N, Schulz H, Hastie N, Pontoglio M, Gubler MC, Antignac C, Heidet L. A murine model of Denys-Drash syndrome reveals novel transcriptional targets of WT1 in podocytes. Human Mol Genet (in press). 4. Delous M et al. The novel ciliary gene RPGRIP1L is mutated in cerebello-oculo-renal syndrome (Joubert syndrome type B) and Meckel syndrome. Nat Genet. (2007).39: 875-881. 5. Delous M, et al. Nephrocystin-1 and nephrocystin-4 are required for epithelial morphogenesis and associate with PALS1/PATJ and Par6. Hum Mol Genet. (2009 Sep 14). [Epub ahead of print]. 28 Équipe : 4. Goldberg S, Harvey SJ, Cunningham J, Tryggvason K, Miner JH. Glomerular filtration is normal in the absence of both agrin and perlecan-heparan sulfate from the glomerular basement membrane. Nephrol Dial Transplant. (2009). 24: 2044-51. 3. Tory K et al. Potential epistatic effect of NPHP6 and AHI1 mutations in patients with NPHP1 mutations. J Am Soc Nephrol. (2007). 18: 1566-1575. Ciliary defect (A) and disorganized multi-lumen structures in 3D type-I collagen matrix (B) in NPHP1 (N1-KD) and NPHP4 (N4-KD) knockdown MDCK cells compared to control. From Delous et al., Hum. Mol. Genet., 2009. Scott Harvey miRNAs are critical for normal glomerular function. In situ hybridization on normal mouse kidneys demonstrating podocyte expression of miR-30a (left), and mesangial expression of miR-145 (center). In podocyte-specific dicer knockout mice, functional ablation of miRNAs causes proteinuria and rapidly progressive glomerulonephritis. At early time-points, mutant glomeruli display segmental staining for podocin (red) and some podocytes show aberrant expression of the mesangial marker desmin (green), indicative of podocyte injury (right). 29 Génétique humaine des maladies infectieuses : prédisposition complexe La réponse à un agent infectieux chez l’homme, notamment le développement de la maladie clinique, dépend en grande partie du patrimoine génétique de l’individu infecté. Le projet de cette équipe vise à identifier les principaux variants génétiques impliqués dans le contrôle des maladies infectieuses communes dues aux mycobactéries et à certains virus oncogènes. Au cours de ces dernières années, les principaux résultats ont été les suivants : 1) identification de variants de susceptibilité à la lèpre dans les gènes PARK2/PACRG et LTA identifiant ainsi de nouveaux circuits de réponse immunitaire au bacille de la lèpre, 2) localisation du premier locus majeur prédisposant à la tuberculose pulmonaire, et de deux autres loci contrôlant l’infection par Mycobacterium tuberculosis, 3) dissection des modes de transmission intrafamiliale du virus herpès 8 (HHV-8) avec la détection d’un gène majeur prédisposant à l’infection par ce virus chez les enfants, 4) démonstration que l’infection actuelle par le virus de l’hépatite C (VHC) a une forte composante familiale expliquée à la fois par des modes de transmission intrafamiliale et par une prédisposition génétique, 5) localisation de deux loci prédisposant à l’infection par le virus HTLV-1 dans l’enfance. Cette équipe va poursuivre et étendre ses travaux sur la lèpre et la tuberculose (TB) en abordant l’étude de nouveaux phénotypes (phénotypes quantifiant l’infection dans la TB, réactions de réversion dans la lèpre), et en recueillant de nouveaux échantillons. Elle va débuter un projet recherchant les bases génétiques de l’ulcère de Buruli, la troisième maladie mycobactérienne commune. Elle continuera ses études sur les infections par les virus HTLV-1, HHV-8 et VHC avec l’identification des loci précédemment détectés par analyse de liaison, ainsi que le début d’études portant sur les phénotypes cliniques liés à ces infections virales. Avec l’équipe de génétique immunologique de Jean-Laurent Casanova, l’équipe de Laurent Abel abordera la question du contrôle génétique de certaines maladies infectieuses à la fois sous l’angle de la prédisposition mendélienne à certains phénotypes rares (par exemple TB disséminée ou sarcome de Kaposi) et sous celui de la prédisposition complexe à des phénotypes plus fréquents (TB pulmonaire ou infection par le HHV-8). Tirant profit des avancées considérables dans les technologies de génotypage à très haut débit, cette équipe réalisera également des études d’association génome entier dans plusieurs maladies infectieuses (TB, lèpre et phénotypes liés à l’infection par le VHC). Tous ces projets sont menés dans le cadre de très larges études de terrain, et impliquent de nombreuses collaborations. L’identification de ces principaux variants génétiques apportera des éléments essentiels pour comprendre les mécanismes pathogéniques impliqués dans la réponse aux agents infectieux, et aura des implications considérables pour le développement de nouvelles stratégies de contrôle des maladies infectieuses. Laurent Abel Équipe : Chercheurs : Alexandre Alcaïs Sabine Plancoulaine Audrey Grant Étienne Patin Étudiants doctorants : Aurélie Cobat Quentin Vincent Ingénieurs : Jérome Flatot Lucile Jannière Publications : 1. Alcais A, Mira MT, Van Thuc N, Moraes MO, Di Flumeri C, Hong Thai V, Chi Phuong M, Thu Huong N, Ngoc Ba N, Xuan Khoa P, Sarno EN, Alter A, Montpetit A, Moraes ME, Moraes JR, Dore C, Gallant CJ, Lepage P, Verner A, Van De Vosse E, Hudson TJ, Schurr E, Abel L. Susceptibility to leprosy is associated with PARK2 and PACRG. Nature. (2004). 427: 636-640. 2. Baghdadi JE, Orlova M, Alter A, Ranque B, Chentoufi M, Lazrak F, Archane MI, Casanova JL, Benslimane A, Schurr E, Abel L. An autosomal dominant major gene confers predisposition to pulmonary tuberculosis in adults. J Exp Med. (2006). 203: 1679-84. Génétique humaine des maladies infectieuses : prédisposition mendélienne La réponse à un agent infectieux chez l’homme, notamment le développement de la maladie clinique, dépend en grande partie du patrimoine génétique de l’individu infecté. Cette équipe formule l’hypothèse que des infections graves survenant chez des enfants par ailleurs bien portants surviennent du fait d’un déterminisme immunologique gouverné par une prédisposition monogénique (mendélienne). Au cours des dernières années, cette équipe a apporté une preuve de principe, en identifiant les premières bases génétiques moléculaires de trois maladies infectieuses pédiatriques. Les formes sévères de tuberculose de l’enfant et les infections causées par les mycobactéries peu virulentes (comme le BCG) peuvent être en rapport avec des anomalies du circuit IL-12-IFN-gamma (mutations des gènes IFNGR1, IFNGR2, STAT1, IL12B, IL12RB1 et NEMO). Les infections pneumococciques invasives, isolées ou dans le cadre d’une dysplasie ectodermale anhidrotique, peuvent être favorisées par des déficits de la voie de signalisation TIR-NF-kB (mutations des gènes NEMO, IKBA, IRAK4, et MYD88). Enfin, les encéphalites herpétiques peuvent résulter de défauts de la voie de signalisation TLR3-IFN-alpha/beta (mutations des gènes UNC93B1 et TLR3). L’équipe de Jean-Laurent Casanova poursuit ces travaux à la fois par des criblages de gènes candidats et par des criblages du génome. Elle élargit également ses champs d’investigation à d’autres maladies infectieuses pédiatriques, comme la candidose cutanéomuqueuse, le sarcome de Kaposi, l’hépatite virale fulminante, la grippe maligne et d’autres viroses graves. Au plan clinique, ses travaux offrent à ces familles un diagnostic moléculaire et un conseil génétique, et ouvrent de nouvelles voies thérapeutiques fondées sur la restauration d’une réponse immunitaire défaillante. Au plan immunologique, ses travaux révèlent que certaines voies de signalisation sont nécessaires à la défense de l’hôte vis-à-vis d’un petit nombre de pathogènes, parfois d’un seul microbe. Jean-Laurent Casanova Équipe : Chercheurs : Emmanuelle Jouanguy Anne Puel Capucine Picard Jacinta Bustamante Pegah Ghadiri-Ghandil Angels Natividad-Sancho Rebecca Perez de Diego Saul Oswaldo Lugo Reyes Vanessa Sancho-Shimizu Étudiants doctorants : Laure Gineau Marjorie Hubeau Ingénieurs : Jacqueline Feinberg Lazaro Lorenzo-Diaz Tony Leclerc Annabelle Cardon Maya Chrabieh Sylvanie Fahy Mélanie Migaud Publications : 1. Dupuis S et al. Impairment of mycobacterial but not viral immunity by a germline human STAT1 mutation. Science (2001); 293: 300-3. 3. Alcais A, Alter A, Antoni G, Orlova M, Van Thuc N, Singh M, Vanderborght PR, Katoch K, Mira MT, Thai VH, Huong NT, Ba NN, Moraes M, Mehra N, Schurr E, Abel L. Stepwise replication identifies a low-producing lymphotoxin-alpha allele as a major risk factor for early-onset leprosy. Nat Genet. (2007). 39: 517-522. 2. Picard C et al. Pyogenic bacterial infections in humans with IRAK-4 deficiency. Science (2003); 299: 2076-9. 4. Plancoulaine S, Mohamed MK, Arafa N, Bakr I, Rekacewicz C, Tregouet DA, Obach D, El Daly M, Thiers V, Feray C, Abdel-Hamid M, Fontanet A, Abel L. Dissection of familial correlations in hepatitis C virus (HCV) seroprevalence suggests intrafamilial viral transmission and genetic predisposition to infection. Gut. (2008). 57: 1268-74. 4. Zhang SY et al. TLR3 deficiency in patients with herpes simplex encephalitis. Science (2007); 317: 1522-7. 3. Casrouge A et al. Herpes simplex virus encephalitis in human UNC-93B deficiency. Science (2006); 314: 308-12. 5. Von Bernuth H et al. Pyogenic bacterial infections in humans with MyD88 deficiency. Science (2008), 321: 691-6. 5. Cobat A, Gallant CJ, Simkin L, Black GF, Stanley K, Hughes J, Doherty TM, Hanekom WA, Eley B, Jais JP, Boland-Auge A, Van Helden P, Casanova JL, Abel L, Hoal EG, Schurr E, Alcais A. Two loci control tuberculin skin test reactivity in an area hyperendemic for tuberculosis. J Exp Med in press. 30 31 Dynamique du génome dans le système immunitaire Jean-Pierre de Villartay Le système immunitaire est le siège d’importantes modifications du génome créées par des mécanismes moléculaires qui participent à la maturation des lymphocytes : la recombinaison V(D)J, la commutation isotypique des immunoglobulines et la maturation des anticorps. À cette dynamique programmée du génome s’ajoutent des altérations aléatoires de l’ADN pendant les phases de prolifération lymphocytaire au cours des réponses immunes. Finalement, le « vieillissement » du système immunitaire est en partie régulé par le contrôle de la taille des télomères. Cette équipe a identifié les causes moléculaires responsables de quatre des formes héréditaires du syndrome lymphohistiocytaire (perforine, Rab27a, Munc13-4 et Munc18-2), leur lieu d’action dans la cellule, et montré le rôle déterminant joué par une perturbation de la fonction tueuse des lymphocytes dans l’apparition de ce syndrome. Des mécanismes efficaces de réparation des lésions de l’ADN sont indispensables non seulement pour accompagner le développement des cellules lymphoïdes T et B mais également pour assurer l’homéostasie harmonieuse de ces cellules en périphérie. Les anomalies de ces voies de réparation de l’ADN sont responsables de divers déficits immunitaires de l’enfant et participent à l’émergence d’hémopathies malignes. Ce groupe a identifié deux acteurs clés (ArtemisetCernunnos)d’un des systèmes majeurs deréparationdeslésionsdel’ADNchezlesmammifères; à partir de l’analyse moléculaire d’enfants présentant des déficits immunitaires. Les objectifs de recherche portent sur une meilleure compréhension des mécanismes de la réparation de l’ADN et de la régulation des télomères. Les projets de cette équipe s’appuient sur plusieurs approches expérimentales : • l’analyse de situations pathologiques humaines caractérisées par des défauts de la réparation de l’ADN et de la régulation des télomères ; • le développement de modèles animaux (souris KO) pour étudier les différentes situations de dynamique du génome au sein du système immunitaire ; • le développement de cribles génétiques pour identifier de nouveaux facteurs de la réparation de l’ADN et de la physiologie des télomères. Pour aborder ces projets, l’équipe de Jean-Pierre de Villartay adopte une stratégie double qui s’appuie sur le recrutement privilégié de patients immunodéprimés à l’Hôpital Necker-Enfants malades, et sur la création de nouveaux modèles animaux d’invalidation génique. Ces modèles animaux sont indispensables pour l’analyse du rôle des facteurs de la réparation de l’ADN dans certains aspects de la dynamique du génome tels que la commutation de classe des immunoglobulines. Ils ont en particulier permis d’identifier un nouveau mécanisme de gestion des lésions de l’ADN. Équipe : Chercheurs : Patrick Revy Despina Moshous Houda Mokrani Étudiante : Gabriela Vera Ingénieurs : Vincent Abramowski Chantal Azerrad Lætitia Gaillard Publications : 1. Buck, D, Malivert, L, de Chasseval, R, Barraud, A, Fondaneche, M. C, Sanal, O, Plebani, A, Stephan, J. L, Hufnagel, M, le Deist, F, Fischer, A, Durandy, A, de Villartay, J. P. and Revy, P. Cernunnos, a novel non-homologous end-joining factor, is mutated in human immunodeficiency with microcephaly. Cell. (2006). 124: 287-99 2. Callebaut, I, Malivert, L, Fischer, A, Mornon, J. P, Revy, P. & de Villartay, J. P. Cernunnos interacts with the XRCC4 x DNA-ligase IV complex and is homologous to the yeast non-homologous end-joining factor Nej1. J Biol Chem. (2006). 281: 13857-60 DNA damages/modification during development and maturation of the immune system 3. Soulas-Sprauel, P, Le Guyader, G, Rivera-Munoz, P, Abramowski, V, Olivier-Martin, C, GoujetZalc, C, Charneau, P. and de Villartay, J. P. Role for DNA repair factor XRCC4 in immunoglobulin class switch recombination. J Exp Med. (2007). 204: 1717-27 Auteurs : Fabien Touzet, Patrick Revy 4. Malivert, L, Callebaut, I, Rivera-Munoz, P, Fischer, A, Mornon, J. P, Revy, P. and de Villartay, J. P. The C-Terminal domainof Cernunnos/XLF is dispensable for DNA repair in vivo. Mol Cell Biol. (2009). 29: 1116-1122 5. Rivera-Munoz, P, Soulas-Sprauel, P, Le Guyader, G, Abramowski, V, Bruneau, S, Fischer, A, Paques, F, and de Villartay, J.P. Reduced immunoglobulin class switch recombination in the absence of Artemis. Blood. (2009). 114: 3601-3609. Interactions lymphocytaires et maturations terminales des lymphocytes B La maturation des anticorps requiert chez l’homme deux événements majeurs : la commutation isotypique des immunoglobulines (ou switch) est la possibilité pour un lymphocyte B de produire non plus de l’IgM mais des anticorps variés (IgG, IgA et IgE) et les mutations somatiques permettent la sélection des anticorps de haute affinité pour l’antigène. L’analyse de patients atteints de défauts héréditaires de la commutation isotypique a permis de montrer le rôle essentiel des molécules Activation-Induced cytidine Deaminase (AID) et Uracil-N Glycosylase (UNG) dans la première étape commune à la commutation isotypique et aux mutations somatiques : AID introduit dans l’ADN des uraciles par déamination des cytidines. Cette lésion de l’ADN est ensuite reconnue et réparée par UNG : UNG induit un site abasique puis une cassure simple brin de l’ADN ; une étape supplémentaire de cassures double brin de l’ADN est cependant requise pour la commutation isotypique. Cependant la plupart des défauts de commutation isotypique restent non encore élucidés sur le plan moléculaire et leur caractérisation devrait permettre de répondre à trois principales questions. Anne Durandy Équipe : 1) Comment AID cible-t-elle les régions de switch ? Les mutations de la partie Cter de AID n’abolissant pas son activité de cytidine déaminase entraînent cependant un défaut total de la commutation isotypique, sans anomalies des mutations somatiques. Cette observation suggère une autre fonction pour AID, qui pourrait être le recrutement d’un cofacteur nécessaire à son ciblage sur les régions de switch. Certains patients atteints d’un défaut de commutation isotypique non encore élucidé présentent un phénotype très semblable ; leur analyse génétique, actuellement en cours, devrait aboutir à la définition de ce cofacteur. Chercheurs : 2) Comment les cassures double brin de l’ADN nécessaires à la commutation isotypique sontelles générées ? L’enzyme PMS2, molécule du mismatch repair (MMR), est l’un des éléments responsables de la génération des cassures double brin de l’ADN au cours de la commutation isotypique. Des résultats préliminaires suggèrent que PMS2 agit par son activité endonucléasique, une hypothèse en cours d’étude grâce à l’utilisation de mutants artificiels dépourvus d’activité endonucléasique. D’autre part, l’étude d’autres défauts d’enzymes du MMR (MSH2/MSH6) permet d’analyser le rôle respectif de ces molécules dans la commutation isotypique et les mutations somatiques. M. Forveille 3) Comment les cassures double brin de l’ADN nécessaires à la commutation isotypique sontelles réparées ? La réparation des cassures simple brin de l’ADN au cours des mutations somatiques fait appel aux enzymes du MMR et à des polymérases infidèles. La réparation des cassures double brin de l’ADN au cours de la commutation isotypique est plus complexe : elle fait essentiellement appel aux molécules du Non Homologous End Joining (NHEJ), mais une voie alternative (AEJ) est parfois utilisée. La commutation isotypique présente un défaut très probablement lié à un défaut de la réparation de l’ADN, comme en témoignent l’apparition de lymphomes B et la radiosensibilité accrue des lignées cellulaires des patients. Toutes les molécules connues pour agir dans la réparation de l’ADN au cours de la commutation isotypique ayant été exclues, un nouveau facteur de la réparation de l’ADN pourrait être impliqué et la caractérisation moléculaire de ces patients devrait en permettre la définition. F. Mazerolles Étudiants doctorants : S. Kracker P. Gardes Ingénieur : Publications : 1. Durandy A, Peron S, Taubenheim N, Fischer A. Activation-induced cytidine deaminase: structure-function relationship as based on the study of mutants. Hum Mutat. (2006). 27: 1185-91. 2. Moschese V, Lintzman J, Callea F, Chini L, Devito R, Carsetti R, Di Cesare S, Geissman F, Brousse N, Rossi P, Durandy A. A novel form of non-X-linked hyperigm associated with growth and pubertal disturbances and with lymphoma development. J Pediatr. (2006). 148: 404-6. 3. Buck D, Malivert L, de Chasseval R, Barraud A, Fondaneche MC, Sanal O, Plebani A, Stephan JL, Hufnagel M, Le Deist F, Fischer A, Durandy A, de Villartay JP, Revy P. Cernunnos, a novel nonhomologous end-joining factor, is mutated in human immunodeficiency with microcephaly. Cell. ( 2006). 124: 287-99. 4. Péron S, Pan-Hammarstrom Q, Imai K, Du L, Taubenheim N, Sanal O, Marodi L, Bergelin-Besançon A, Benkerrou M, de Villartay JP, Fischer A, Revy P, Durandy A. A primary immunodeficiency characterised by defective immunoglobulin class switch recombination and impaired DNA repair. J Exp Med. (2007). 204(5): 1207-16 5. Péron S, Metin A, Gardès P, Alyanakian MA, Sheridan E, Kratz CP, Fischer A, Durandy A. Human PMS2 deficiency is associated with impaired immunoglobulin class switch recombination J Exp Med. ( 2008). 205(11): 2465-72 Picture illustrating an anaphase bridge caused by telomere-telomere fusions. These events are increased in cells expressing the Apollo-D molecule that exerts a dominant negative effect on telomere protection. 32 33 Homéostasie lymphocytaire : rôle des cellules tueuses L’équilibre entre les différentes cellules de défense de l’organisme est maintenu grâce à un contrôle précis de leur production, de leur prolifération et de leur mort. La perturbation des mécanismes en jeu peut avoir des conséquences pathologiques. C’est en particulier le cas dans le syndrome lymphohistiocytaire, une maladie grave qui se manifeste par une réaction immunitaire incontrôlée. Dans cette maladie, les lymphocytes tueurs et les macrophages, dont la fonction est de détruire les cellules infectées ou malignes, s’activent de façon excessive et détruisent en les infiltrant les organes sains. Les formes héréditaires se déclarent généralement avant l’âge d’un an, et sont fatales en l’absence de traitement spécifique. Cette équipe a identifié les causes moléculaires responsables de quatre des formes héréditaires du syndrome lymphohistiocytaire (perforine, Rab27a, Munc13-4 et Munc18-2), leur lieu d’action dans la cellule, et montré le rôle déterminant joué par une perturbation de la fonction tueuse des lymphocytes dans l’apparition de ce syndrome. L’équipe de Geneviève de Saint-Basile souhaite à présent mieux caractériser les autres effecteurs de la fonction tueuse des lymphocytes, les événements moléculaires et cellulaires successifs qui conduisent à l’apparition du syndrome lymphohistiocytaire, et tester de nouvelles approches thérapeutiques. Pour cela, trois objectifs principaux seront développés : • la recherche d’autres effecteurs de la fonction tueuse des lymphocytes qui pourraient interagir avec ceux déjà identifiés ; • la recherche d’autres causes moléculaires responsables de forme héréditaires du syndrome lymphohistiocytaire ; • l’utilisation de modèle murins de ces pathologies, déjà disponibles ou en cours d’établissement par génie génétique, pour mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques et tester de nouvelles approches thérapeutiques. Geneviève de Saint-Basile Équipe : Activation lymphocytaire et susceptibilité au virus Epstein-Barr Le syndrome lymphoprolifératif lié au chromosome X (XLP) est une maladie génétique rare qui touche le système immunitaire. Cette maladie se caractérise principalement par une susceptibilité importante à l’infection par le virus Epstein-Barr (EBV) et l’apparition de lymphomes. Chez les individus sains, le virus EBV est responsable d’une maladie inoffensive et le plus souvent asymptomatique, la mononucléose infectieuse, qui est contrôlée par une réponse immune normale. Chez les patients atteints du syndrome XLP, l’infection par le virus EBV peut être fatale et se traduit par une mononucléose infectieuse sévère et persistante traduisant une réponse immune anormale et défectueuse. Deux causes génétiques responsables du XLP ont été identifées jusqu’à ce jour. Néanmoins, il existe des patients chez lesquels l’origine génétique de la maladie est pour le moment inconnue. Les recherches de cette équipe ont pour but de comprendre et d’identifier les défauts cellulaires, moléculaires et génétiques qui sont responsables d’un syndrome lymphoprolifératif et plus particulièrement qui causent cette susceptibilité particulière à l’infection par le virus EBV chez ces malades. Sylvain Latour Équipe : Chercheurs : Chercheur : Gaël Ménasché Jana Pachlopnik Nadine Nehme Geoffrey Gloire Étudiants doctorants : Cindy Synaeve Stéphane Gerart Fabian Hauck Agathe Burgess Marjorie Côte Ingénieurs : Mathieu Kurowska Nathalie Prince Publications : 1. Stephan V, Wahn V, Le Deist F, Dirksen U, Broker B, Muller-Fleckenstein I, Horneff G, Schroten H, Fischer A, de Saint-Basile G. Atypical X-linked severe combined immunodeficiency due to possible spontaneous reversion of the genetic defect in T cells. N Engl J Med. (1996). 335: 1563-7. 2. Pastural E, Barrat FJ, Dufourcq-Lagelouse R, Certain S, Sanal O, Jabado N, Seger R, Griscelli C, Fischer A, de Saint-Basile G. Griscelli disease maps to chromosome 15q21 and is associated with mutations in the myosin-Va gene. Nat Genet. (1997). 16: 289-92. 3. Ménasché G, Pastural E, Feldmann J, Certain S, Ersoy F, Dupuis S, Wulffraat N, Bianchi D, Fischer A, Le Deist F, de Saint Basile G. Mutations in RAB27A cause Griscelli syndrome associated with haemophagocytic syndrome. Nat Genet. (2000). 25: 173-6. 4. Feldmann J, Callebaut I, Raposo G, Certain S, Bacq D, Dumont C, Lambert N, Ouachee-Chardin M, Chedeville G, Tamary H, Minard-Colin V, Vilmer E, Blanche S, Le Deist F, Fischer A, de Saint Basile G. Munc13-4 is essential for cytolytic granules fusion and is mutated in a form of familial hemophagocyticlymphohistiocytosis (FHL3). Cell. (2003). 115: 461-73. Étudiants doctorants : Ingénieur : Christelle Lenoir Publications : 1. Dong Z, Cruz-Munoz ME, Zhong MC, Chen R, Latour S and Veillette A. Essential function for SAP family adaptors in the surveillance of hematopoietic cells by natural killer cells. Nat. Immunol. (2009). 10(9): 973-80 2. Latour S. NKT cells and X-linked lymphoproliferative syndrome (XLP). Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. (2007). 7(6): 510-4 3. Rigaud S, Fondaneche MC, Lambert N, Pasquier B, Mateo V, Soulas P, Galicier L, Le Deist F, Rieux-Laucat F, Revy P, Fischer A, de Saint-Basile G and Latour S. XIAP deficiency in humans causes an X-linked lymphoproliferative syndrome. Nature. (2006). 444(7115): 110-4 4. Bloch-Queyrat C, Fondaneche MC, Chen R, Yin L, Relouzat F, Veillette A, Fischer A and Latour S. Regulation of natural cytotoxicity by the adaptor SAP and the Src-related kinase Fyn. J Exp Med. (2005). 202(1): 181-92 5. Pasquier B, Yin L, Fondaneche MC, Relouzat F, Bloch-Queyrat C, Lambert N, Fischer A, de Saint-Basile G and Latour S. Defective NKT cell development in mice and humans lacking the adapter SAP, the X-linked lymphoproliferative syndrome gene product. J Exp Med. (2005). 201(5) :695-701. 5. Ménager MM, Ménasché G, Romao M, Knapnougel P, Ho CH, Garfa M, Raposo G, Feldmann J, Fischer A, de Saint-Basile G. Secretory cytotoxic granule maturation and exocytosis require the effector protein hMunc13-4. Nat Immunol. (2007). 8: 257-67. 34 35 Modèles pathologiques de défauts de la tolérance au soi Ce projet est centré sur l’étude de maladies génétiques du système immunitaire qui conduisent à une destruction des cellules de l’organisme par ses propres défenses (autoimmunité). Le syndrome lymphoprolifératif avec autoimmunité est une maladie associée à un déficit d’une protéine de la surface cellulaire (dénommée Fas) capable d’induire la mort programmée (apoptose) de la cellule et en particulier de certains lymphocytes. Ce défaut se traduit par une prolifération non contrôlée de ces lymphocytes et par l’apparition de manifestations autoimmunes comme la destruction des globules rouges et des plaquettes. La variabilité d’expression de cette maladie suggère l’implication d’autres facteurs génétiques. Le but principal de ce projet est de mieux comprendre les bases cellulaires de cette pathologie et d’identifier les autres facteurs génétiques responsables. Le syndrome d’immunodéficience polyendocrinopathie entéropathie lié à l’X (IPEX) est une maladie du nouveau-né qui est la conséquence d’un défaut de lymphocytes T dits régulateurs. Leur absence ou mauvais fonctionnement conduit à une destruction du tube digestif ou des glandes endocrines (comme le pancréas ou la thyroïde) par les lymphocytes appelés effecteurs. Cette maladie autoimmune est associée à des mutations d’un gène essentiel au développement des cellules régulatrices et appelé Foxp3. Chez certains patients, ce gène est normal et nous recherchons le déficit génétique associé à leur maladie. Parallèlement, nous étudions les lymphocytes régulateurs dans cette maladie et dans d’autres pathologies autoimmunes comme l’ALPS. L’ensemble de ce travail devrait permettre de mieux comprendre les mécanismes fondamentaux impliqués dans le contrôle des lymphocytes autoréactifs et d’apporter de nouveaux outils diagnostiques et thérapeutiques pour ces maladies autoimmunes de l’enfant. Frédéric Rieux-Laucat Thérapies innovantes des déficiences immunitaires primitives Severe combined immunodeficiencies and gene therapy Équipe : Chercheur : Aude Magérus-Chatinet Étudiant doctorant : Bénédicte Neven Ingénieurs : Claude Stolzenberg Cécile Daussy Publications : 1. Rieux-Laucat F et al. Mutations in Fas associated with human lymphoproliferative syndrome and autoimmunity. Science. (1995). Jun 2. 268(5215): 1347-9. 2. Holzelova E, Vonarbourg C, Stolzenberg MC, Arkwright PD, Selz F, Prieur AM, Blanche S, Bartunkova J, Vilmer E, Fischer A, Le Deist F, Rieux-Laucat. Autoimmune lymphoproliferative syndrome with somatic Fas mutations. F.N Engl J Med. (2004). Sep 30. 351(14): 1409-18. 3. Rieux-Laucat F et al Inherited and somatic CD3zeta mutations in a patient with T-cell deficiency. N Engl J Med. (2006). May. 4.354(18): 1913-21. 4. Mateo V, Ménager M, de Saint-Basile G, Stolzenberg MC, Roquelaure B, André N, Florkin B, Le Deist F, Picard C, Fischer A, Rieux-Laucat F. Perforin-dependent apoptosis functionally compensates Fas deficiency in activation-induced cell death of human T lymphocytes. Blood. (2007). 15.110(13): 4285-92. 5. Magérus-Chatinet A et al. FAS-L, IL-10, and double-negative CD4- CD8- TCR alpha/beta+ T cells are reliable markers of autoimmune lymphoproliferative syndrome (ALPS) associated with FAS loss of function. Blood. (2009) 113(13): 3027-30. Le groupe de Marina Cavazzana-Calvo a centré sa recherche autour de trois axes : la compréhension des étapes précoces de l’hématopoïèse en situation physiologique et pathologique, le développement de nouvelles thérapies cellulaires, et enfin la découverte de nouvelles sources de cellules souches hématopoïétiques (CSH). Caractérisation des progéniteurs humains lymphoïdes et leur utilisation dans l’allogreffe de cellules souches hématopoïétiques Une population de progéniteurs lymphocytaires humains capable de différencier en cellules T, B et natural killer, et détectables à la fois dans le sang du cordon, dans la moelle osseuse, dans le thymus et en circulation a été récemment décrite. Les données préliminaires montrent que ces progéniteurs lymphocytaires peuvent être extensivement amplifiés et que nous pouvons induire leur différenciation exclusive vers les lymphocytes T après culture sur des cellules stromales exprimant le ligand delta-1 de Notch. Le but ultime de ces travaux est de bâtir un protocole clinique visant à accélérer la reconstitution immunitaire après greffe de CSH HLA partiellement compatible. Description d’une nouvelle forme de DICS, la dysgénésie réticulaire La dysgénésie réticulaire (DR) est caractérisée par une profonde lymphopénie, un arrêt précoce de maturation de la lignée myéloïde au stade des myéloblastes/promyélocytes ainsi qu’une surdité neurosensorielle bilatérale. Les mutations du gène de l’adénylate kinase sont responsables de cette pathologie. À partir de cette découverte, nous essayons de décrire le rôle du gène AK2 dans le développement hématopoïétique humain et murin en utilisant d’une part la délétion du gène AK2 par RNA interférence, et d’autre part un modèle murin de souris K.O. Développement de la thérapie génique Un premier protocole de thérapie génique a été réalisé entre 1999 et 2002 chez 10 patients atteints du Déficit Immunitaire Combiné Sévère (DICS) lié au chromosome X dû à la mutation d’une sous-unité des cytokines hématopoïétiques appelée gamma c (γc). Cet essai, basé sur l’utilisation ex vivo des cellules souches hématopoïétiques génétiquement modifiées, a démontré la possibilité de corriger de façon stable cette maladie avec un bénéfice clinique chez neuf des dix patients traités après un suivi supérieur à 10 ans. Ce protocole a été transitoirement interrompu en raison de la survenue d’une complication de type leucémique chez quatre des patients traités. Cette complication, réversible chez trois d’entre eux, est liée à l’expression non contrôlée d’un oncogène induite par l’LTR du rétrovirus utilisé. L’étude physiopathologique de ces effets adverses nous a permis de proposer un nouveau protocole basé sur l’utilisation d’un virus modifié, qui débutera en 2010. L’évaluation à long terme des paramètres biologiques et immunologiques chez les patients ainsi traités permet non seulement de comprendre la place de la thérapie génique dans l’arsenal thérapeutique des maladies héréditaires, mais également d’appréhender des questions d’immunologie fondamentale concernant la dynamique et l’homéostasie des populations T. Caractérisation d’une nouvelle cellule souche présente dans le liquide amniotique Des cellules souches à haut potentiel hématopoïétique sont présentes dans le liquide amniotique, à la fois de l’homme et de la souris. La compréhension de leur origine embryonnaire et la caractérisation de leur capacité de différenciation nous permettra d’évaluer leur potentiel thérapeutique. 36 Marina Cavazzana-Calvo Équipe : Chercheurs : Salima Hacein-Bey-Abina Isabelle André-Schmutz Emmanuelle Six Ingénieurs : Corinne de Chappedelaine Chantal Lagresle-Peyrou Julie Rivière Julien Rouiller Publications : 1. Neven B, Valayannopoulos V, Quartier P, Blanche, Prieur AM, Debré M, Rolland MO, Rabier D, Cuisset L, Cavazzana-Calvo M, de Lonlay P, Fischer A. Allogeneic bone marrow transplantation in mevalonic aciduria. N Engl J Med. (2007). 356: 2700-3. 2. Deichmann A, Hacein-Bey-Abina S, Schmidt M, Garrigue A, Brugman M, Hu J, Glimm H, Gyapay G, Prum B, Fraser CC, Fischer N, Schwarzwaelder K, Siegler ML, de Ridder D, Pike-Overzet K, Howe SJ, Thrasher AJ, Wagemaker G, Abel U, Staal F, Delabesse E, Villeval JL, Aronow B, Hue C, Prinz C, Wissler M, Klanke C, Weissenbach J, Alexander I, Fischer A, von Kalle C, Cavazzana-Calvo M. Vector integration is non-random, clustered and influences the in vivo fate of lymphopoiesis in SCID-X1 gene therapy. J Clin Invest. ( 2007). 117: 2225-32. 3. Wang GP, Garrigue A, Ciuffi A, Ronen K, Leipzig J, Berry C, Lagresle-Peyrou C, Benjelloun F, Hacein-Bey-Abina S, Fischer A, Cavazzana-Calvo M, Bushman FD. DNA bar coding and pyrosequencing to analyse adverse events in therapeutic gene transfer. Nucleic Acids Res. (2008). 36: e49. 4. Huyn I, Lindvall O, Hrlund-Richter LA, Cattaneo E, Cavazzana-Calvo M, Cossu G, de Luca M, Fox IJ, Gerstle C, Goldstein RA, Hermere G, High KA, Kim HO, Peng Lee H, Levy-Lahad E, Lo B, Marshak DR, McNab A, Munsie M, Nakauchi H, Rao M, Rooke HM, Valles CS, Srivastava A, Sugarman J, Taylor PL, Veiga A, Wong AL, Zoloth L, Daley GQ. New ISSCR guidelines underscore major principles for responsible translational stem cell research. Cell Stem Cell. (2008).3: 607-9. 5. Ditadi A, De Coppi P, Picone O, Gautreau L, Smati R, Six E, Bonhomme D, Ezine S, Frydman R, Cavazzana-Calvo M, André-Schmutz I. Human and murine amniotic fluid c-Kit+Lin- cells display hematopoietic activity. Blood. (2009). 113: 3953-60. 37 Interactions de l’épithélium intestinal et du système immunitaire Avec une surface de 300 m2 et une exposition permanente à des milliards de bactéries et des kilogrammes de produits alimentaires, la muqueuse intestinale est la principale interface de l’organisme avec le milieu extérieur. Au cours de l’évolution, un système immunitaire complexe s’est mis en place : il assure une protection efficace de l’hôte et évite l’emballement de réponses inflammatoires ou allergiques délétères. Les altérations de ce système au cours de maladies mono ou polygéniques ont des conséquences sévères sur les fonctions intestinales et la santé de l’hôte. Le premier projet de cette équipe concerne la maladie cœliaque (MC). La MC affecte de 0,3 à 1 % des Européens et implique des interactions entre des facteurs génétiques partiellement identifiés et un facteur environnemental déclenchant, les protéines dérivées du blé et de céréales apparentées (gluten). La MC est à l’origine de symptômes digestifs et extradigestifs très divers et son diagnostic est encore trop souvent méconnu. Généralement guérie par un régime contraignant à vie, la MC est aussi responsable de complications graves, maladies autoimmunes et lymphomes. Le principal facteur de risque génétique, les molécules du complexe majeur d’histocompatibilité HLA-DQ2/8, joue un rôle clé dans sa pathogénie en permettant l’activation des lymphocytes T intestinaux par les peptides dérivés du gluten. Cette activation est nécessaire mais n’est pas suffisante pour déclencher la maladie. Les objectifs de ce groupe sont : 1) de démontrer le rôle complémentaire d’autres facteurs identifiés par des travaux antérieurs (production excessive d’interleukine 15, altération du transport epithélial de peptides), 2) de poursuivre les travaux sur l’origine et les mécanismes de développement des lymphomes T, la complication la plus grave. Ces travaux s’appuient sur les analyses in situ et ex vivo de biopsies et de lymphocytes intestinaux et sur le développement de modèles murins. Les résultats sont utilisés pour développer des outils diagnostiques et des traitements innovants pour les formes évoluant vers une transformation maligne. Le second projet de cette équipe est d’analyser le dialogue entre l’hôte et le microbiote intestinal à travers le système immunitaire. Ce dialogue contrôle l’homéostasie intestinale et pourrait aussi participer à la régulation de l’allergie et de l’autoimmunité. En utilisant des souris gnotobiotiques, l’équipe de Nadine Cerf-Bensussan a récemment réalisé une analyse systématique des membres du microbiote stimulant la maturation postnatale du système immunitaire intestinal. Ce travail a permis d’identifier le rôle clé d’une bactérie appelée segmented filamentous bacterium (SFB). Les projets de ce groupe sont : 1) d’explorer les mécanismes moléculaires à l’origine des propriétés immunostimulantes de SFB, 2) de continuer à exploiter le modèle des souris gnotobiotiques pour définir l’impact de la flore sur les réponses immunes locales et périphériques en situation basale et dans des modèles d’allergie et d’autoimmunité, 3) selon les résultats, d’identifier une bactérie similaire à SFB dans la flore intestinale humaine et d’analyser sa contribution en physiologie et en pathologie. Le troisième projet de cette équipe est d’analyser les bases génétiques de maladies intestinales mettant en jeu le pronostic vital et se développant au cours de la première année de vie dans une cohorte d’enfants suivis dans le service de pédiatrie gastroentérologique. Ce travail concernera en priorité les anomalies altérant les réponses immunitaires aux antigènes dérivés de l’alimentation et/ ou de la microflore. Diagnostic des maladies génétiques par signalisation calcique et analyse des cellules fœtales circulantes Nadine CERF-BENSUSSAN Les études de cette équipe comprennent deux parties complémentaires : 1. Évaluation de l’impact de l’interaction de la signalisation calcique subcellulaire entre la mitochondrie et le réticulum endoplasmique (RE) dans les maladies de la chaîne respiratoire mitochondriale (MRCD) et les maladies liées au stress du RE ; 2. Développement des tests ISET (Isolation by Size of Epithelial Trophoblastic cells) pour le diagnostic prénatal non invasif des maladies génétiques. Projet 1 : Impact de la signalisation calcique subcellulaire dans les maladies de la chaîne respiratoire mitochondriale (MRCD) et liées au stress du réticulum endoplasmique (RE). 1.1 Dans la mitochondrie, l’énergie est produite suite au bon fonctionnement de la chaîne respiratoire mitochondriale. Nous avons démontré que le déficit du complexe II détermine des modifications de concentration calcique dans la mitochondrie et plus en général dans la cellule. Ces résultats montrent que la modulation pharmacologique des concentrations de calcium à l’intérieur de la cellule pourrait être une voie intéressante pour redonner aux cellules avec ce déficit du complexe II (il s’agit de maladies génétiques rares) la possibilité de réactiver la production énergétique qui est essentielle à la survie cellulaire. 1.2 Des études récentes ont révélé le rôle important des échanges entre le RE et la mitochondrie. Nos études ont montré qu’une protéine décrite dans notre laboratoire en 2001, la protéine S1T, se situe au niveau des sites de contact entre RE et mitochondrie et joue un rôle important dans le stress du RE. Le stress du RE est une pathologie cellulaire qui caractérise des maladies très importantes comme les maladies d’Alzheimer, de Parkinson, le diabète, etc. Nos travaux permettent d’espérer que la correction pharmacologique des échanges calciques entre RE et mitochondrie pourra indiquer une nouvelle voie thérapeutique des maladies liées au stress du RE. Projet 2 : Développement des tests ISET (Isolation by Size of Epithelial Trophoblastic cells) pour le diagnostic prénatal non invasif des maladies génétiques. Notre équipe a validé avec succès la méthode ISET pour le diagnostic prénatal non invasif (NI- PND) de l’amyotrophie spinale (SMA) et de la mucoviscidose (CF) (Paterlini-Bréchot P. et al., soumis pour publication). Ces deux validations ont duré chacune deux ans et ont été réalisées strictement en aveugle. À l’ouverture de l’aveugle, les résultats obtenus par la méthode non invasive se sont révélés identiques à ceux obtenus par la méthode invasive. Il s’agit de la première validation clinique d’un test non invasif de diagnostic prénatal. La suite de ce projet implique la validation clinique de la méthode ISET pour le NI-PND de la trisomie 21. Équipe : Chercheurs : Martine Heyman Valérie Gaboriau-Routhiau Bertrand Meresse Christophe Cellier Sabine Sarnacki Frank Ruemmele Marianne De Paepe Sandrine Ménard Nicolas Monicuquet Emma Ramiro Étudiants doctorants : Juliette Abed Élise Heuvelin Nazia Khen Raja El Machour Émeline Lecuyer Georgia Malamut Julien Verdier Ingénieurs : Corinne Lebreton Bernadette Bègue Sabine Rakotobé Nicolas Guégan Mirette Telle Marie-Christine Launay Publications : Équipe : Chercheurs : Casper Caspersen Ingrid Pfeiffer Hussein Mouawia Étudiants doctorants : Bénédicte Oules Éléonore M’Baya Rachid Fetouchi Basma Njima Martina Marinello Ingénieurs : Rachida Tacine Hélène Massinet Publications : 1. Béroud C, Karliova M, Bonnefont JP, Benachi A, Munnich A, Dumez Y, Lacour B, Paterlini-Bréchot P. Prenatal diagnosis of Spinal Muscular Atrophy (SMA) by genetic analysis of circulating fetal cells. The Lancet, (2003). 361: 1013-4 . 2. Paterlini-Bréchot P, Saigo K, Murakami Y, Chami M, Gozuacik D, Mugnier C, Lagorce D, Bréchot C. Hepatitis B virus-related insertional mutagenesis occurs frequently in human liver cancers and recurrently targets human telomerase gene. Oncogene. (2003). 22: 3911-6. 3. Tieu K, Perier C, Caspersen C, Teismann P, Wu DC, Yan SD, Naini A, Vila M, Jackson-Lewis V, Ramasamy R, Przedborski S. D-beta-hydroxybutyrate rescues mitochondrial respiration and mitigates features of Parkinson disease. J Clin Invest. (2003). 112: 892-901. 1. Cellier, C et al. Refractory sprue, coeliac disease, and enteropathy-associated T-cell lymphoma. French Coeliac Disease Study Group. Lancet 356: 203-208. 2. Mention et al. Interleukin 15: a key to disrupted intraepithelial lymphocyte homeostasis and lymphomagenesis in celiac disease. Gastroenterology. (2003). 125: 730-745 4. Vona G, Estepa L, Béroud C, Damotte D, Capron F, Mineur A, Franco D, Lacour B, Pol S, Bréchot C, Paterlini-Bréchot P. Impact of cytomorphological and molecular characterisation of circulating tumor cells in patients with primary liver cancer. Hepatology. (2004). 39: 792-797. 3. Benahmed, M et al. Gastroenterology 132: 994-1008. 4. Matysiak-Budnik. et al. Secretory IgA mediates retrotranscytosis of intact gliadin peptides via the transferrin receptor in celiac disease. J Exp Med. (2008). 205: 143-154 5. Gaboriau-Routhiau et al. The key role of segmented filamentous bacteria in the coordinated maturation of gut helper T cell responses. Immunity. (2009). 31: 677-689. 38 Patrizia Paterlini-Bréchot 5. Caspersen C, Wang N, Yao J, Sosunov A, Chen X, Lustbader JW, Xu HW, Stern D, McKhann G, Yan SD. Mitochondrial Abeta: a potential focal point for neuronal metabolic dysfunction in Alzheimer’s disease. FASEB J. (2005). 19: 2040-1. Contacts ER-mitochondrie Cellules trophoblastiques circulantes 39 39 Les plateformes technologiques 40 41 Plateforme de génomique Les plateformes technologiques Christine BOLE-feysot MISSIONS Les plateformes technologiques Plusieurs plateformes technologiques ont été mises en place sur le site de Necker-Enfants malades, grâce à l’implication de nos partenaires institutionnels : Inserm, Université Paris-Descartes, Assistance publique-Hôpitaux de Paris. Elles sont à la disposition de tous les chercheurs présents sur le site. Depuis sa création en 2007, Imagine vise à améliorer ces plateformes (à la fois en participant au financement ou à l’achat de nouveaux équipements et en finançant les salaires des ingénieurs) et à en créer de nouvelles (exemple de la plateforme de génomique). Lorsque le bâtiment Imagine sera opérationnel, les plateformes technologiques à disposition de l’ensemble des chercheurs du site seront toujours situées soit au sein du bâtiment Imagine, soit dans les locaux de la Faculté de médecine. En complément du renforcement des plateformes existantes, Imagine mettra en place de nouvelles plateformes techniques au cours des prochaines années, dont une animalerie d’expérimentation de statut A2, SPF. La plateforme de génomique de la Fondation Imagine a été créée en 2008 avec pour mission d’offrir à la communité scientifique du site Necker-Enfants malades des prestations de haut niveau dans le domaine du génotypage, du séquençage très haut débit et de l’expression génique. Le design expérimental, l’analyse et l’interprétation des résultats sont menés en collaboration avec les chercheurs et la plateforme de bioinformatique. Équipements La plateforme est équipée de : • une station GeneChip Affymetrix constituée de deux fours à hybridation, deux stations fluidiques et un scanner à fluorescence ; • un séquenceur nouvelle génération très haut débit SOLiD™ version 3 + d’Applied Biosystems ; • un bioanalyseur 2100 Agilent Technologies ; • un spectrophotomètre Nanodrop ND-1000 (Thermo Scientific) et un fluorimètre QuBit (Invitrogen) ; • un S2 Covaris et un Hydroshear GeneMachines pour fragmenter l’ADN ; • un appareil de PCR en temps réel StepOne (Applied Biosystems). Elle assure : • une aide au design expérimental ; • la vérification de la qualité des échantillons d’ADN et d’ARN ; • l’amplification, le marquage et l’hybridation des sondes sur les puces Affymetrix de type GeneChips® Mapping arrays 250K, puces d’expression et Genome-Wide Human SNP.6 arrays ; • la construction des banques de fragments pour leur analyse sur séquenceur très haut débit ; • l’analyse primaire des données et leur transfert à la plateforme de bioinformatique pour la suite de l’analyse. Équipe : Responsable scientifique : Laurence Colleaux Responsable technique : Christine Bole-Feysot Membres de l’équipe : Mohammed Zarhrate Solenn Pruvost Les applications proposées sont : • gene expression profiling chez l’homme et la souris ; • analyse de Copy Number Variation ; • analyse de liaison et étude d’association ; • reséquençage de régions ciblées ; • séquençage de produits de chromatine-immunoprécipitation (ChIP-Seq). 42 43 Plateforme cytométrie de flux Corinne cordier Missions MISSIONS La cytométrie de flux (FCM) est une technique centrale et aboutie pour la biologie clinique et la recherche fondamentale. Elle permet d’identifier, de caractériser et d’obtenir des mesures qualitatives et quantitatives sur des cellules individuelles préparées à partir d’une population cellulaire hétérogène (organisme, organe ou compartiment cellulaire), avec précision, rapidité et efficacité. La plateforme d’imagerie cellulaire offre aux scientifiques de l’Institut Imagine une variété de microscopes optiques haut de gamme et des outils d’analyses de pointe. En hématologie et immunologie, la FCM permet l’identification et la caractérisation des différentes populations hématopoïétiques chez les sujets normaux ou pathologiques, l’étude des déficits immunitaires et des hémopathies, et le suivi des patients après transplantation de cellules souches hématopoïétiques. Les nouvelles techniques d’imagerie, la microscopie confocale à balayage laser, en combinaison avec de puissants logiciels d’analyses, ont permis aux scientifiques d’avancer au-delà des limites de la résolution optique. En microbiologie, la FCM complète les études d’imagerie cellulaire effectuées sur les bactéries. Le service est équipé d’un cytomètre analyseur (BD LSR Fortessa) et de trois cytomètres trieurs (BD FACS Vantage SE Diva, BD FACS Aria I et BD FACS Aria II SORP). Les cytomètres trieurs associent l’analyse et la caractérisation des sous-populations à la séparation physique de ces sous-populations voire des cellules individuelles. Tous les trieurs du service sont équipés d’un automate de dépôt permettant de trier et déposer une seule cellule (ou un nombre défini de cellules) dans des microtubes pour des études moléculaires (single-cell PCR) ou du clonage cellulaire. Équipements Équipe : BD FACS Aria I Cell analyser Analyse par cytométrie en flux de sang de cordon et des progéniteurs Lin-CD34+ de MO postnatale. Six E. JEM, vol. 204, 24 décembre 2007 BD LSR Fortessa SORP : cofinancé par l’IFR 94, la Fondation Imagine et une bourse de l’ARC Équipe : La plateforme est équipée de microscopes et de logiciels d’analyses performants. Responsables scientifiques : Claude-Agnès Reynaud ÉQUIPEMENTS • Microscopes confocaux à balayage laser • TRIMSCOP Multiphoton Microscope sur un statif Olympus • Vidéomicroscope/TIRF • Microscopes à épifluorescence • Logiciels d’analyses Geneviève de Saint-Basile Gaël Ménasché Responsable technique : Corinne Cordier Membre de l’équipe : Responsable technique : Meriem Garfa-Traoré Assistant Ingénieur : Publications : Nicolas Goudin 1. You, S., Belghith M., Cobbold S., Alyanakian M. A., Gouarin C., Barriot S., Garcia C., Waldmann H., Bach J. F., Chatenoud L. Autoimmune diabetes onset results from qualitative rather than quantitative age-dependent changes in pathogenic T-cells. Diabetes 54 (5), 1415-1422, 2005 Publications : 3. Six, E., Bonhomme D., Monteiro M ., Beldjord K., Jurkowska M., Cordier-Garcia C., Garrigue A., Dal Cortivo L., Rocha B ., Fischer A., CavazzanaCalvo M., and André-Schmutz I. A human postnatal lymphoid-restricted progenitor capable of circulating and seeding the thymus. J.Exp.Med. 204, 3085-3093, 2007 4. Weller, S. , Mamani-Matsuda M. , Picard C., Cordier C., Lecoeuche D. ,Gauthier F . , Weill J. C., and Reynaud C. A. Somatic diversification in the absence of antigen-driven responses is the hallmark of the IgM+IgD+CD27+ B cell repertoire in infants J. Exp. Med. 2008 June 9; 205(6): 1331–1342, 2008 BD FACS Vantage SE Diva D’autre part, nous assurons la formation des utilisateurs aussi bien en acquisition d’images sur nos différents systèmes qu’en analyses. Responsable scientifique : 2. Lambolez, F., Arcangeli M. L., Joret A. M., Pasqualetto V., Cordier C., Di Santo J. P., Rocha B., and Ezine S. The thymus exports long-lived fully committed T cell precursors that can colonize primary lymphoid organs. Nat. Immunol. 7 (1), 76-82, 2006 BD FACS Aria II SORP, financé par la Fondation Imagine Meriem garfa-traoré La microscopie de fluorescence est devenue un outil incontournable dans la recherche biomédicale. Jérome Mégret 44 42 Plateforme d’imagerie cellulaire et moléculaire 1. Auffray Cedric, Fogg Darin K., Garfa Meriem, Elain Gaelle, Join-Lambert Olivier, Kayal Samer, Sarnacki Sabine, Cumano Ana, Lauvau Gregoire, Geissmann Frederic. Patrolling blood monocytes that monitor blood vessels and tissues for damage and infection -Science 3 August 2007, Vol. 317. no. 5838, pp.666-670, DOI:10.1126 / science.1142883 2. Patey-Mariaud de Serre N., Garfa M., Bessiéres B., Noël L.H., Knebelmann B. Collagen alpha5 and alpha2(IV) chain coexpression: Analysis of skin biopsies of Alport patients-Kidney Int. 2007 Jun 6;: 17554254 (P,S,E,B,D) 3. Menager MM, Menasche G, Romao M, Knapnougel P, Ho CH, Garfa M, Raposo G, Feldmann J, Fischer A, de Saint Basile G. Secretory cytotoxic granule maturation and exocytosis require the effector protein hMunc13-4 – Nat Immunol. 2007 Mar;8(3):257-67 5. Gagnerault, M.C. , Lanvin O. , Pasquier V. , Garcia C. , Damotte D. , Lucas B. , and Lepault F. , Autoimmunity during Thymectomy-Induced Lymphopenia: Role of Thymus Ablation and Initial Effector T Cell Activation Timing in Nonobese Diabetic Mice J. Immunol. , 2009, 183: 4913 – 4920, 2009 43 45 Plateforme bioinformatique Plateforme transfert de gènes Patrick nitschké Sylvie Fabrega MISSIONS Au cours de ces dernières années, la recherche biomédicale a vu naître l’émergence d’un grand nombre de nouvelles technologies dites à haut débit. Ces nouvelles technologies génèrent un nombre toujours plus important de données à analyser et à interpréter nécessitant un accroissement des besoins de calcul et de stockage. Le traitement de cette information complexe est nécessairement multidisciplinaire : mathématiques, statistique, informatique, biologie. En 2007, l’Université ParisDescartes a souhaité mettre à la disposition des biologistes une infrastructure performante pour la gestion des données massives de la génomique, transcriptomique et leur analyse. Tout naturellement, les équipes de recherche soutenues par la Fondation Imagine en tant que partenaire de l’Université Paris-Descartes et de la Faculté de médecine bénéficient du support de la plateforme BIP-D. Cela a incité la Fondation Imagine à soutenir et à renforcer la plateforme. La plateforme a développé un pipeline d’analyse original automatisant l’analyse et facilitant l’interprétation des résultats des études de génétique de liaison. Ce pipeline intègre les données brutes de génotypage à haut débit générées par la plateforme de génomique de la Fondation Imagine, il est associé à une interface graphique interactive permettant la visualisation et l’annotation automatique des régions candidates. Depuis 2008, 500 000 000 de génotypes ont ainsi été stockés et analysés. L’un des changements technologiques au cours de ces dernières années a été l’émergence d’une nouvelle génération de séquenceurs « haut débit ». Par rapport aux méthodes de séquençage classiques, il s’agit d’une augmentation d’au moins un facteur 1 000 en capacité de séquençage. Pour mettre en place cette technologie, la Fondation Imagine vient d’équiper sa plateforme de génomique d’un séquenceur haut débit (Solid de Bioapplied). Cette quantité et la nature nouvelle de cette information génèrent de nouveaux défis. En effet, l’analyse de plusieurs Gigabases d’ADN composées de plusieurs milliards de courts fragments nécessite le développement de méthodologies (statistique, informatique) et de stratégies d’analyse nouvelles et originales, ainsi que la mise à disposition de moyens informatiques (stockage et calcul) très importants. La plateforme bioinformatique, grâce au soutien financier de la Fondation Imagine, vient de s’équiper d’un nouveau cluster de calcul et d’un serveur de fichier. ÉQUIPEMENTS Dell Server: 2x Quad-Core Xeon X5355 2.66GHz/2x4MB, 24 Gb Memory, 2 To disk raid 5 PC Desktop: 3 Intel Core Duo 2, 4 Gb Memory, 500 Mo (Linux) 2 Intel 2x Xeon 2.9 Ghz, 2 Gb Memory, 1 To Disk (Windows Xp) MISSIONS Prestations offertes par la plateforme : • Apporter une aide à la conception et à la préparation de vecteurs viraux pour la recherche : lentivirus, rétrovirus, parvovirus et adénovirus ; • Maintenir une base de données des vecteurs disponibles et des protocoles soumis à la commission de génie génétique ; Équipe : • former les utilisateurs ; Équipe : Responsable scientifique : • Préparer des lots de vecteurs pour des études précliniques, conformément aux bonnes pratiques de laboratoire ; Responsable scientifique : • Faciliter les échanges et les partenariats avec d’autres plateformes académiques ou avec des sociétés de biotechnologie spécialisées pour la production de vecteurs à usage clinique. Responsable technique : La plateforme a été reconnue comme plateforme émergente en 2009 par le GIS IBiSA (Infrastructures en biologie santé et agronomie, http://www.ibisa.net/). Membres de l’équipe : Philippe Jais Responsable technique : Patrick Nitschké Membres de l’équipe : Nicolas Cagnard Cécile Masson Jean-Marc Plaza Déwi Vernerey Publications: 1. Gottenberg JE, Loiseau P, Azarian M, Chen C, Cagnard N, Hachulla E, Puechal X, Sibilia J, Charron D, Mariette X, Miceli-Richard C,CTLA-4 +49A/G and CT60 gene polymorphisms in primary Sjögren syndrome. Arthritis Res Ther. 2007;9(2):R24. Olivier Danos Sylvie Fabrega Arnaud Jollet Corinne Millien ÉQUIPEMENTS • La plateforme est équipée pour la culture de tissus cellulaires et la purification de particules virales (PSM, incubateurs CO2, ultracentrifugeuses…). • Deux laboratoires BL2 sont situés sur le site de l’Hôpital Necker . • Une plateforme BL3 est située au Centre de recherche des Cordeliers. 2. Bourdon, A., L. Minai, V. Serre, J.P. Jais, E. Sarzi, S. Aubert, D. Chrétien, P. de Lonlay, V. Paquis-Flucklinger, H. Arakawa, Y. Nakamura, A. Munnich, and A. Rötig, Mutation of RRM2B, encoding p53-controlled ribonucleotide reductase (p53R2), causes severe mitochondrial DNA depletion. Nat Genet, 2007. 39(6): p. 776-80. 3. Fabre S, Carrette F, Chen J, Lang V, Semichon M, Denoyelle C, Lazar V, Cagnard N, DubartKupperschmitt A, Mangeney M, Fruman DA, Bismuth, G.FOXO1 regulates L-Selectin and a network of human T cell homing molecules downstream of phosphatidylinositol 3-kinase. J Immunol. 2008 Sep 1;181(5):2980-9. 4. Jais, J.P., C. Haioun, T.J. Molina, D.S. Rickman, A. de Reynies, F. Berger, C. Gisselbrecht, J. Briere, F. Reyes, P. Gaulard, P. Feugier, E. Labouyrie, H. Tilly, C. Bastard, B. Coiffier, G. Salles, and K. Leroy, The expression of 16 genes related to the cell of origin and immune response predicts survival in elderly patients with diffuse large B-cell lymphoma treated with CHOP and rituximab. Leukemia, 2008. 22(10): p. 1917-24. 5. Cagnard N, Lucchesi C, Chiocchia, GGExMap: An Intuitive Visual Tool to Detect and Analyse Genomic Distribution in Microarray-generated Lists of Differentially Expressed Genes, J Proteomics Bioinform 2009; 2: 051- 059. 44 46 47 45 Banque d’ADN Marie-Alexandra Alyanakian La Banque d’ADN a été créée en 1992 au sein du Département de génétique de l’Hôpital Necker , grâce initialement à une subvention de la Fondation Paribas. Elle est depuis 1995 gérée par l’IRNEM, l’Institut fédératif de Necker. Plus récemment, plusieurs financements (Génopôle Île-de-France, Fondation Wyeth) ainsi que la mise à disposition par l’Inserm IFR 94-IRNEM de 70 m2 de laboratoire ont permis de refaire entièrement la banque d’ADN. La nouvelle banque a ainsi réouvert en avril 2005. Cette plateforme est également soutenue financièrement par l’AP-HP (Hôpital Necker). L’objectif de la banque d’ADN est de réaliser pour les chercheurs et les cliniciens la réception d’échantillons sanguins, la préparation, la conservation à long terme et la mise à disposition de produits dérivés sous différentes formes (ADN, culots de leucocytes, lymphocytes du sang périphérique, lignées cellulaires transformées par l’EBV) selon les recommandations actuelles de préparation et de conservation des échantillons biologiques, dans le respect des réglementations nationales et internationales. Deux catégories d’échantillons sont conservées dans la banque d’ADN : 1) des échantillons provenant de patients (presque toujours des enfants) atteints de maladies génétiques rares et pris en charge dans les différents services du site ; 2) des échantillons de patients constituant des collections autour d’un projet de recherche précis. Le premier groupe d’échantillons est actuellement le plus important et représente plus de 25 000 échantillons. Il s’agit soit de culots de leucocytes (12 000), de lymphocytes du sang périphérique (6 500), soit moins fréquemment de lignées cellulaires (6 000), d’ADN (2 000), provenant d’environ 18 000 patients (et de leurs apparentés qu’ils soient atteints ou non). Le second groupe, constitué par des patients inclus dans différents projets de recherche, est en augmentation constante depuis la réouverture et la réorganisation de la banque d’ADN (environ 50 % par an). En 2010, la banque d’ADN démarrera l’activité d’extraction d’ADN et la préparation d’ADN qualifié et quantifié pour les chercheurs, les cliniciens et leurs collaborateurs (ou pour des centres de génotypage), dès l’acquisition d’un automate d’extraction d’ADN. La constitution d’une plateforme centralisée au sein du bâtiment Imagine permettra de réunir la banque d’ADN avec les autres biobanques de Necker, actuellement dispersées sur le site. Toutes les collections biologiques seront alors conservées de façon sécurisée, dans le respect des réglementations en vigueur et des recommandations bioéthiques. Laboratoire d’expérimentation animale et de transgénèse (LEAT) Cette animalerie comporte environ 4 000 cages, elle accueille actuellement 16 350 rongeurs et assure la reproduction d’un grand nombre de lignées de souris (160 au total). Elle est composée d’un espace de reproduction pour les souris transgéniques, d’une zone expérimentale, d’une zone de quarantaine et propose différents services : – Transfert d’embryons : cette technique est pratiquée à partir d’embryons frais ou congelés. La décontamination est cruciale, car elle produit des animaux de statut « SPF » à partir de souches contaminées. Cette expertise permet d’accueillir de nouvelles lignées en conservant un statut sanitaire rigoureux défini selon les normes du comité de pilotage en charge de la plateforme ; Équipe : – Cryoconservation des embryons. Équipe : Responsable scientifique : En complément du laboratoire central, il existe trois autres animaleries annexes sur le site de l’Hôpital Necker-Enfants malades. Responsable scientifique : Ces animaleries devront à terme fusionner géographiquement avec le laboratoire principal et offrir ainsi davantage de services pour aider les équipes de recherche actuelles et futures sur le site. Ainsi une zone « SOPF », une zone réservée aux risques biologiques de type A2 ou A3 et plusieurs autres activités seront créées prochainement. Responsable technique : Corinne Antignac Membres de l’équipe : Marie-Alexandra Alyanakian Anne Esling Christine Gouarin Laurent Nardelli Fabiola Terzi Poste à pourvoir Membres de l’équipe : Yoan Moreau Amelyne Marcon-David Sarah Marinier Céline Roullé Publications : 1. Storck S, Delbos F, Stadler N, Thirion-Delalande C, Bernex F, Verthuy C, Ferrier P, Weill JC, Reynaud CA, Normal Immune System Development in Mice Lacking the Deltex-1 RING Finger Domain, Mol Cell Biol., 2005, 25(4):1437-45 2. Raji B, Dansault A, Leemput J, de la Houssaye G, Vieira V, Kobetz A, Arbogast L, Masson C, Menasche M, Abitbol M., The RNA-binding protein Musashi-1 is produced in the developing and adult mouse eye. Mol Vis., 2007, 13:1412-27. 3. Benjelloun F, Garrigue A, Demerens-de Chappedelaine C, Soulas-Sprauel P, Malassis-Séris M, Stockholm D, Hauer J, Blondeau J, Rivière J, Lim A, Le Lorc’h M, Romana S, Brousse N, Pâques F, Galy A, Charneau P, Fischer A, de Villartay JP, Cavazzana-Calvo M., Stable and Functional Lymphoid Reconstitution in Artemisdeficient Mice Following Lentiviral Artemis Gene Transfer Into Hematopoietic Stem Cells, Mol Ther., 2008,16(8):1490-9. 4. Brezillon NM, DaSilva L, L’Hôte D, Bernex F, Piquet J, Binart N, Morosan S, Kremsdorf D., Rescue of Fertility in Homozygous Mice for the Urokinase Plasminogen Activator Transgene by the Transplantation of Mouse Hepatocytes. Cell Transplant. 2008,17(7):803-12 5. Pachlopnik Schmid J, Ho CH, Diana J, Pivert G, Lehuen A, Geissmann F, Fischer A, de Saint Basile G., A Griscelli syndrome type 2 murine model of hemophagocytic lymphohistiocytosis (HLH), Eur J Immunol. 2008, 38(11):3219-25. 48 49 47 Les plateformes cliniques La clé du succès pour Imagine est la forte intrication existant entre la recherche et les activités cliniques dispensées sur le site de Necker-Enfants malades. Quatre structures ont ainsi été développées au cours des dernières années : 1/ les centres de référence maladies rares ; 2/ un centre d’investigation clinique et une unité de recherche clinique ; 3/ un centre de biothérapie ; 4/ un centre de ressources biologiques. 1/ Les centres de référence maladies rares Dans le cadre du « Plan national maladies rares 2005-2008 », le Ministère de la Santé a identifié des centres de renommée et d’expertise internationales, labellisés en centres de référence pour une maladie rare ou un groupe de maladies rares. L’excellence des chercheurs et des praticiens de l’Hôpital Necker-Enfants malades a permis la labellisation de 18 centres de référence sur les maladies génétiques rares de l’enfant. Ces centres de référence sont les suivants : Maladies génétiques à expression cutanée, Maladies rares digestives intestinales, Maladies héréditaires du métabolisme, Maladies mitochondriales, Épilepsies rares, Maladies rénales héréditaires de l’enfant et de l’adulte, Déficits immunitaires héréditaires, Arthrites juvéniles, Malformations cardiaques complexes, Maladies rares en ophtalmologie, Dysostoses cranio-faciales, Syndromes drépanocytaires majeurs, Syndrome d’Ondine, Maladies osseuses constitutionnelles, Maladies neuromusculaires, Anomalies du développement embryonnaire d’origine génétique, Déficiences mentales fixées non syndromiques d’origine génétique, Malformations ano-rectales et pelviennes rares. La contribution des centres de référence maladies rares est essentielle au projet Imagine, en ce qui concerne l’amélioration de la qualité de vie des patients et de leurs proches. Ils ont, en effet, pour mission de faciliter le diagnostic et de définir la prise en charge thérapeutique, psychologique ainsi que l’accompagnement social des malades et de leurs familles. 2/ Un centre d’investigation clinique et une unité de recherche clinique La recherche clinique bénéficie d’une forte interaction avec un centre d’investigation clinique (structure mixte Inserm/Assistance publique-Hôpitaux de Paris) situé à proximité de l’Institut Imagine. La partie gérée par l’Inserm est dédiée à la recherche clinique sur les enfants, et comporte une plateforme méthodologique, l’unité de recherche clinique (URC). La partie gérée par l’Assistance publique-Hôpitaux de Paris est une structure de conseil et d’assistance aux chercheurs pour mettre en œuvre des projets de recherche, en contrôler la qualité et la conformité aux règlements applicables actuels. 3/ Un centre de biothérapie Une autre unité de recherche clinique a été créée pour permettre le développement d’essais cliniques impliquant des cellules et/ou des gènes. Il s’agit d’une structure mixte Inserm/Assistance publique-Hôpitaux de Paris. Ce centre de biothérapie a été accrédité par l’Agence nationale française (AFSSAPS) et est totalement opérationnel. Il permet de réaliser des essais de thérapie génique/cellulaire basés sur des projets de recherche menés par Imagine. Le projet architectural 4/ Un centre de ressources biologiques Cette structure se situera également à proximité du futur bâtiment de recherche Imagine. Cette banque de ressources sera assez grande pour contenir les échantillons d’ADN et de cellules des patients et de leurs familles, collectés dans le cadre des projets de recherche. 50 51 Necker-Enfants malades 2009 Necker-Enfants malades 2012 Aujourd’hui, les unités de recherche Imagine sont éparpillées sur le site de l’hôpital Necker-Enfants malades : Unité de recherche Arnold Munnich I Unité de recherche Corinne Antignac Unités de recherche Laurent Abel et Nadine Cerf-Bensussan NOUVEAU BÂTIMENTImagine Nouveau Bâtiment de Biologie Autres activités de recherche NOUVEAU PÔLE MÈRE-ENFANT HÔPITAL NECKER-ENFANTS MALADES Unité de recherche Alain Fischer 52 Unité de recherche Arnold Munnich II Unité de recherche Patrizia Paterlini-Bréchot 53 51 L’excellence au service des enfants dans un bâtiment pionnier Afin de répondre au mieux aux objectifs scientifiques et humanistes qu’elle s’est fixés, la Fondation Imagine a souhaité se doter d’un complexe où tous les acteurs de la recherche sur les maladies génétiques pourront se retrouver. Des chercheurs aux enfants atteints de ces maladies, en passant par les familles, tous auront accès à ce lieu unique au monde de partage et d’échange, véritable interface entre soins et recherches sur les maladies génétiques. Au cœur du site de l’Hôpital Necker-Enfants malades, la fondation Imagine pourra s’installer dans un tout nouvel espace de plus de 15 000 m², construit sur un terrain mis à disposition par l’Assistance publique-Hôpitaux de Paris (AP-HP) dans le cadre d’une convention d’occupation du domaine public. Ce lieu exceptionnel et pionnier, entièrement dédié aux maladies génétiques, réunira recherche fondamentale, recherche clinique et soins innovants sous un même toit, au plus près des malades. Les liens innovants entre les soins, la recherche fondamentale et la recherche clinique seront optimisés par la mise en place d’une nouvelle organisation permettant plus d’interactivité, accélérant ainsi l’ensemble du processus de recherche avec un seul objectif : gagner du temps pour sauver des vies. Au sein de ce bâtiment pionnier, on trouvera une partie recherche de 11 500 m², destinée à accueillir des laboratoires équipés de tous les outils indispensables à la découverte de nouvelles solutions diagnostiques et thérapeutiques, et une partie clinique de 3 500 m², destinée à accueillir des consultations en génétique, un centre d’investigation clinique, un centre de ressources biologiques et des centres de référence maladies rares. Le bâtiment Imagine sera inauguré dès 2012 et permettra d’accueillir de nouvelles équipes internationales. 54 L’organisation d’Imagine 53 55 L’organisation Imagine La coordination des activités de recherche sur les maladies génétiques et leur intégration au sein de l’hôpital sont du ressort de la direction scientifique de la Fondation Imagine. Le directeur scientifique Alain Fischer et le codirecteur Arnold Munnich sont assistés d’une équipe administrative. Ils sont soutenus par une direction scientifique et par des représentants des laboratoires de recherche, du centre de recherche clinique, du centre de recherche clinique de biothérapie, des départements cliniques, et du directeur de l’Institut fédératif de recherche (IRNEM). La direction scientifique est composée de : Pr Corinne Antignac en tant que directrice de la stratégie, Dr Laurent Abel, Mme Laurence Colleaux, Pr Nadine Cerf-Bensussan et Pr Rémi Salomon. Cette équipe, représentant les 24 groupes qui font partie de l’Institut Imagine dans sa phase dite « hors murs » (avant l’ouverture du nouveau bâtiment attendue pour mi-2012), a une mission stratégique. Cette mission consiste à décider de l’orientation scientifique du projet, des évolutions à apporter aux laboratoires, du développement des plateformes technologiques (en collaboration avec l’IRNEM), du recrutement de nouvelles équipes et de la contribution à apporter au développement du centre de recherche clinique. La direction scientifique pilote l’organisation des activités d’enseignement, la communication et la valorisation. La Fondation Imagine et son conseil d’administration sont chargés de lever, gérer, investir et mettre à disposition des fonds permettant la mise en œuvre du plan d’actions validé par la direction scientifique. Le conseil d’administration est composé des représentants des membres fondateurs, c’est-à-dire de l’Assistance publique-Hôpitaux de Paris (AP-HP), de l’Institut national La plateforme projets de la santé et de la recherche médicale (Inserm), de l’Université Paris-Descartes, de l’Association Française contre les Myopathies (AFM), de la Fondation Hôpitaux de Paris-Hôpitaux de France (HP-HF) et de la Ville de Paris, ainsi que de représentants des enseignants et chercheurs, de personnalités qualifiées qui représentent le monde économique et social et de grands entrepreneurs. Le conseil scientifique international (CSI) de la Fondation Imagine, composé de scientifiques prestigieux, donne son avis au conseil d’administration et à la direction sur tout ce qui touche à la réalisation du projet et à la direction de l’Institut. Ceci inclut le projet immobilier, l’orientation stratégique et la sélection de nouvelles équipes suite à un appel d’offres, et plus tard, l’évolution de ces structures et groupes. Ses recommandations sont consultatives. La plateforme projets de la Fondation Imagine a été créée afin de faciliter la mise en œuvre du programme scientifique de l’Institut des maladies génétiques. Elle comporte deux pôles : la direction des projets et du développement et la direction administrative et financière. Le pôle des projets et du développement, dirigé par Karine Rossignol, est l’interface avec la direction scientifique pour tout ce qui concerne l’organisation et la gestion du programme scientifique. Elle traite les demandes et acquisitions d’équipements pour les plateformes technologiques, le recrutement des nouvelles équipes, postdoc et étudiants doctorants, la gestion et le contrôle des offres et subventions. Ce pôle a également pour mission de coordonner des activités avec l’IRNEM, de contrôler et développer les interactions avec les concurrents et les industries pharmaceutiques, tout en surveillant le développement des projets, les problématiques de communication, le financement de la recherche, le développement de partenariats et les relations presse. Le pôle administratif et financier, dirigé par Guillaume Huart, traite les questions juridiques, les ressources humaines, les offres et le contrôle des marchés, les relations avec les institutions (ministères, membres fondateurs, publics et privés), les questions budgétaires, les dons et legs et le suivi financier des placements de la fondation. Chantal Céliset est l’assistante du Pr. Claude Griscelli, Président de la Fondation Imagine. Elle a rejoint son cabinet en 1999 et l’a suivi depuis lors. Ces deux pôles contribuent au développement du projet de l’Institut des maladies génétiques Imagine, à la fois dans ses dimensions administrative et opérationnelle. Tiffany Cheynier a rejoint la Fondation en septembre 2009 et seconde Karine Rossignol en ce qui concerne la communication. Le conseil d’administration de la Fondation Imagine Claude Griscelli Édouard Couty Président : Pr Claude GRISCELLI Trésorier : M. Édouard COUTY (Conseiller maître à la cour des comptes) Membres fondateurs : Université Paris-Descartes (Paris V) - Pr Bruno VARET (Président du conseil scientifique) - M. François PAQUIS (Secrétaire général) Institut national de la santé et la recherche médicale (Inserm) - M. Hervé DOUCHIN (Directeur général adjoint) - Pr Robert BAROUKI (Directeur de recherche) Paris Hospitals (Assistance Publique-Hôpitaux de Paris) 56 - M. Jean-François SAUVAT (Direction de la politique médicale) - M. Christophe MISSE (Directeur de la recherche clinique et du développement) Association française contre les myopathies (AFM) - Mme Laurence TIENNOT-HERMENT (Présidente) - M. Serge BRAUN (Directeur scientifique) Fondation Hôpitaux de Paris-Hôpitaux de France - Mme Bernadette CHIRAC (Présidente) Ville de Paris - M. Jean-Marie LE GUEN (Adjoint au maire chargé de la santé publique) Représentants des enseignants et des chercheurs - Pr Corinne ANTIGNAC (Directrice de l’unité néphropathies héréditaires et rein en développement – Inserm) - Dr Laurent ABEL (Directeur de recherche, codirecteur de l’unité de génétique humaine des maladies infectieuses – Inserm) Guillaume HUART Karine ROSSIGNOL Personnalité qualifiée M. Stéphane FOUKS (Président d’Euro RSCG C&O) Autres sièges à pourvoir : Trois personnalités qualifiées, représentant le monde économique. 57 L’Institut de recherche Necker-Enfants malades (IRNEM) L’IRNEM est constitué d’un regroupement de seize unités de recherche créées par des organisations françaises publiques de recherche telles que l’Inserm (Institut national de la santé et de la recherche médicale), le CNRS (Centre National de la Recherche Scientifique) ou l’Université Paris-Descartes. Il comprend les six unités de recherche de la Fondation Imagine et englobe environ 960 scientifiques (592 équivalents temps plein – ETP), cliniciens, chercheurs en formation, et de performantes équipes d’ingénieurs, de techniciens et d’administratifs. Les principales thématiques du site sont l’immunohématologie, la génétique humaine, la biologie cellulaire, la physiologie et l’infectiologie. L’intégration étroite de la recherche et des services cliniques, en particulier le développement des transplantations rénales et les greffes de moelles, la constitution, le suivi et le phénotypage précis de nombreuses cohortes de maladies autoimmunes, et surtout de maladies génétiques familiales, a grandement contribué aux avancées des équipes du site dans les domaines de la localisation, du clonage, du séquençage, de la description des mutations, de la compréhension des mécanismes et des approches thérapeutiques, des handicaps génétiques des enfants, des menaces de maladies immunodéficientes et autoimmunes. L’IRNEM reçoit un soutien financier du Ministère de l’Enseignement supérieur et de la Recherche français et d’autres sources publiques et privées afin de développer le site et de favoriser les collaborations scientifiques. Depuis sa création en 2000, le principal objectif de l’IRNEM a été d’optimiser au maximum l’utilisation de ses moyens financiers, technologiques et humains afin de créer de bonnes conditions pour la recherche de base et la recherche clinique à son plus haut niveau. La stratégie de l’IFR a été de développer des plateformes technologiques mises en place selon les principaux besoins de la communauté scientifique du site de Necker-Enfants malades. Les plateformes incluent les plateaux techniques de protéomique, l’imagerie cellulaire, la cytométrie de flux, le tri et l’analyse de cellules, une banque d’ADN, une plateforme d’information scientifique, la bioinformatique, le transfert de gènes, la génomique ainsi qu’une animalerie de 16 350 rongeurs et 18 lapins. Plus récemment, l’IRNEM s’est impliqué dans le mouvement de restructuration des forces de recherche de Necker-Enfants malades qui conduit à plus de visibilité et à une organisation efficace. Depuis la création d’Imagine en 2007, les décisions d’amélioration des plateformes sont discutées par l’IRNEM et Imagine, dans l’optique de rendre ces équipements opérationnels pour l’ensemble du site. Finances Plusieurs partenaires, publics et privés, soutiennent la Fondation Imagine Les membres fondateurs sont l’Assistance publique-Hôpitaux de Paris (AP-HP), l’Institut national de la santé et la recherche médicale (Inserm), l’Université Paris-Descartes, le département de Paris, l’Association Française contre les Myopathies (AFM) et la Fondation Hôpitaux de Paris-Hôpitaux de France (HP-HF). Contributions et investissements Les membres fondateurs soutiennent également la Fondation Imagine en mettant à sa disposition des ressources technologiques et humaines. Leur contribution globale à la dotation de la Fondation Imagine s’élève à 12,8 millions d’euros, somme qui inclut la contribution de l’État. L’Université Paris-Descartes et l’Inserm recrutent du personnel pour les plateformes technologiques et administratives. L’Inserm soutient également les acquisitions d’équipements pour les plateformes technologiques et les unités Inserm impliquées dans le projet. Le Ministère de l’Enseignement supérieur et de la Recherche a quant à lui investi 6 millions d’euros sur nos plateformes. Les produits financiers issus du placement de la dotation de la Fondation Imagine servent à financer l’exploitation (emplois, communication et administration générale). Le budget nécessaire pour l’équipement et le personnel est de 8 millions d’euros, à investir sur les quatre prochaines années. La seconde phase commencera à l’ouverture du bâtiment. L’investissement en termes d’équipements pour les plateformes technologiques sera poursuivi. En ce qui concerne le projet immobilier, l’Assistance publique-Hôpitaux de Paris nous alloue un terrain de 5 100 m² pour le nouveau bâtiment qui sera construit à l’angle prestigieux du boulevard Montparnasse et de la rue du Cherche-Midi. Le site sera mis à disposition pour trente ans. Le Ministère de la Santé a octroyé 20 millions d’euros au projet immobilier. L’État et la région Île-de-France fournissent 12 millions d’euros, la Ville de Paris donne 2 millions d’euros, et l’AP-HP investit 12,5 millions d’euros. La Fondation Imagine s’emploie à réunir les derniers fonds nécessaires à la construction de l’Institut des maladies génétiques. Dotation de la Fondation Imagine (en millions d’euros) Gérard Friedlander Président : Gérard Friedlander Vice-président en charge de la stratégie et du programme scientifique : Alain Fischer 58 Bernadette ARNOUX Vice-présidente en charge de la coordination scientifique et administrative : Bernadette Arnoux 59 Prochaines étapes 2006 2009 2010-2011-2012 • Élaboration et organisation du projet scientifique • Réunion du Conseil scientifique international (mars) • Présentation du projet architectural • Renforcement des plateformes technologiques (acquisition d’équipements et recrutement d’ingénieurs techniques pour l’imagerie, le séquençage, l’histologie et l’animalerie) • Appel d’offres pour recruter 8 à 10 nouvelles équipes de recherche • Construction du bâtiment Imagine • Début de la levée de fonds • Réunion du Conseil scientifique international pour évaluer le programme scientifique des nouvelles équipes 2007 • Création de la Fondation Imagine (juin). • Nomination du conseil d’administration (septembre). • Évaluation du budget. 2012 • Inauguration du nouveau bâtiment Imagine • Mise en place de la nouvelle organisation 2008 • Mise en place de la direction scientifique • Nomination du Conseil scientifique international • Élaboration du programme de construction du nouveau bâtiment • Mise en place des plateformes technologiques (acquisition d’équipements et recrutement d’ingénieurs techniques pour les plateformes de génomique, de cytométrie de flux et d’imagerie cellulaire) 60 Les princi- pales publications scientifiques imagine 61 Les principales publications scientifiques Imagine Les principales publications scientifiques Imagine 2009 2008 • Abifadel M, Rabes JP, Devillers M, Munnich A, Erlich D, Junien C, Varret M, Boileau C. Mutations and polymorphisms in the proprotein convertase subtilisin kexin 9 (PCSK9) gene in cholesterol metabolism and disease. Hum Mutat, 2009. • Machuca E, Hummel A, Nevo F, Dantal J, Martinez F, Al-Sabban E, Baudouin V, Abel L, Grunfeld JP, Antignac C. Clinical and epidemiological assessment of steroidresistant nephrotic syndrome associated with the NPHS2 R229Q variant. Kidney Int, 2009. • Benko S, Fantes JA, Amiel J, Kleinjan DJ, Thomas S, Ramsay J, Jamshidi N, Essafi A, Heaney S, Gordon CT, McBride D, Golzio C, Fisher M, Perry P, Abadie V, Ayuso C, Holder-Espinasse M, Kilpatrick N, Lees MN, Picard A, Temple I, Thomas P, Vazquez MP, Vekemans M, RoestCrollius H, Hastie ND, Munnich A, Etchevers HC, Pelet A, Farlie PG, FitzPatrick D, Lyonnet S. Disruption of very distant highly conserved non-coding elements on either side of the SOX9 gene is associated with Pierre Robin sequence. 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