Modèle drosophile (8 heures de cours) I. Présentation du modèle

Modèle drosophile (8 heures de cours)
I. Présentation du modèle Drosophile et de l’organe étudié
a) Plan d’organisation
b) Cycle de développement
c) Présentation de l’oeil composé avec ses différents types cellulaires
d) Biosynthèse et stockage des pigments de l’oeil
II. Isolement de mutants chez la drosophile
a) Comment les générer : notion de souche de référence, mutants spontanés et
mutants induits ; différents types d’agents mutagènes
b) Transgenèse et mutagenèse par insertion d’éléments transposables : le
transposon P
c) Les mutants de couleur de l’oeil
III. Caractérisation phénotypique et génétique des mutants
a) Plusieurs gènes pour un même phénotype
b) Un gène, de nombreux allèles : notion de série allélique
c) Un gène, différents phénotypes affectant différents processus de
développement: notion de pléiotropie
d) Interactions entre gènes différents : notion d’épistasie
e) Cribles génétiques pour l’identification de suppresseurs et « enhanceurs »
IV. Identification des gènes ; de la cartographie génétique au clonage
a) Cartographie génétique
b) Cartographie cytologique
c) Cartographie physique
d) Correspondances entre les trois cartes
e) Clonage du gène
V. Etude fonctionnelle
a) Le mécanisme de phototransduction chez la drosophile et les vertébrés
b) Les rhodopsines
c) Etude des séquences cis-régulatrice du gène rh1
d) Etude d’un modèle drosophile de rétinite pigmentaire
Conclusion : La drosophile : un système modèle pour étudier les maladies humaines
Quelques références bibliographiques
« Analyse génétique moderne » (A.J.F. Griffiths et al., Ed. De Boeck Université)
« La drosophile : des chromosomes aux molécules » (J. Deutsch). Ed. Medecine Sciences,
John Libbey Eurotext.
Sites Web :
http://genetique.snv.jussieu.fr/ (site des enseignements de génétique à l’UMPC)
http://www.edu.upmc.fr/sdv/docs_sdvbmc/ (site de LV304 Biologie du Développement)
http://flybase.bio.indiana.edu/
http://flymove.uni-muenster.de
Notions supposées acquises
(cf programme de l'UE LV203 de l'UPMC)
ƒ Notions de gène, allèle, polymorphisme, mutation
ƒ Phénotype/Génotype
ƒ Mitose/Méiose
ƒ Ségrégation d'un couple d'allèles/ de 2 couples d'allèles
au cours de la méiose
ƒ Indépendance génétique/liaison génétique
ƒ Pourcentage de recombinaison
ƒ Distance génétique en CentiMorgan
1
2
3
4
5
lignée pilote (« driver »)
X
gène X
g
X
GAL4
GAL4
protéine
X X
Protéine
expression du gène X
sous le contrôle de GAL4
UAS
Le système UAS/GAL4
6
7
PROTOCOLE DE TRANSGENESE A L’ELEMENT P
1.
Gène de la
transposase
Pied
gauche
tronqué
Marqueur
((w+…))
Plasmide « helper »
ORI
X
Pied
droit
tronqué
Pied
gauche
Plasmide avec transgène
ORI
AmpR
II
III
Transgène
Pied
droit
AmpR
IV
w-
A embryons w-
P
(lignée germinale)
w-
X
II
III
IV
w-
Adultes G0
•yeux blancs (lignée somatique w-)
•quelques adultes G0 à lignée germinale mosaïque
(insertion au hasard du transgène dans certaines
cellules de la lignée germinale)
Transgène et w+
w-
w-
Transgène et w+
...etc
2
2.
Adultes G0 croisés individuellement avec individus w
wG0 sans insertion
du transgène dans la
lignée germinale
100% descendants G1
à œil blanc
X
II
III
IV
G0 avec insertion
du transgène dans la lignée
germinale (5 à 10% des
embryons injectés)
•Une majorité de descendants G1 à œil blanc
•Quelques descendants G1 à œil
rouge=individus transgéniques
w-
X
II
III
IV
w-
Transgène et w+
w-
ou
ww
Transgène et w+
etc...
•Localisation du transgène
•Obtention d’une lignée homozygote
pour le transgène
8
PROTOCOLE DE MUTAGENESE PAR MOBILISATION D’ELEMENT P
Lignée 1
[y+,Drp+]
X
II
III
Lignée 2
[y-,Drp]
X
IV
y+
y-
y-
II
III
IV
P helper Drop
(dominant)
y-y+
[y+,Drp]
X
Des évènements de transposition
peuvent se produire dans la lignée
germinale de ces mâles: obtention
de différents types de gamètes
y+
y--
II
III
[y-,Drp+]
IV
X
P helper
Drop
yy--
X
[y-,Drp+]
sans transposition
II
III
y-
y-
phénotypes de ces
nouveaux mutants
d’ insertions?
II
[y+,Drp+]
avec transposition
sur le II, ou le III; ces
nouvelles insertions
sont stables (pas de
transposase)
y-
y+
y+
IV
III
IV
9
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12
13
Détection de la recombinaison chez les organismes diploïdes:
croisement de type "back cross"
a+
b+
a+
b+
a1
b1
a+
b+
a1
b1
a+
b+
X
femelle F1
a+
b+
a1
b1
P
R
a+
P2
a1
R1
a+
R2
a1
b+
b1
b1
b+
X
b1
a1
b1
a1
b1
a+
b+
a1
b1
a1
b1
X
a1
b1
a1
b1
4 types de gamètes
=1/4
P
=1/4
=1/4
=1/4
a1
b1
a+
b+
a1
b1
a1
b1
a1
b1
a+
b1
a1
b1
a1
b+
b
b1
R
P1
a+
P2
a1
R1
a+
R2
a1
b+ >1/4
b1
>1/4
b1
<1/4
b+ <1/4
a1
b1
desce da ce F2:
descendance
4 génotypes
descendance F2:
4 génotypes
a1
a1
femelle F1
4 types de gamètes
P1
X
=1/4
=1/4
=1/4
=1/4
Recombinaison par brassage
interchromosomique
P=R
a+
b+
a1
b1
a1
b1
a1
b1
a+
b1
a1
b1
a1
b+
b
a1
b1
>1/4
>1/4
<1/4
<1/4
Recombinaison par brassage
intrachromosomique
("crossing over")
P>R
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18
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Schéma de la méthode de PCR inverse
w+
Extraction
E
t ti de
d l’ADN génomique
é
i
de la souche mutante obtenue
par insertion du transposon P
Digestion enzymatique de l’ADN
génomique (enzyme
qui coupe 1 seule fois dans le
transposon)
w+
Ligation
5L 5U
w+
PCR avec les amorces 5L et 5U
localisées dans les séquences de P
: ADN génomique
Séquençage du produit de PCR
(amorces 5L ou 5U)
5L
5U
Interrogation des banques de
données pour l’identification des
séquences génomiques à côté
des séquences de P
21
Mécanisme de phototransduction chez la drosophile et les vertébrés
d’après Montell (1999). Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 15, 231-268
22
Les rhodopsines de drosophile
A
B
A. Structure de la rhodopsine 1. Les 5 cylindres représentent les 7 domaines
trans-membranaires (TMD); le site d’attachement du rétinol est dans le 7ème TMD.
B. Structure du cis- et du trans-rétinol.
Caractéristiques des 5 rhodopsines de drosophile
d’après Montell (1999). Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 15, 231-268
23
Etude du promoteur du gène rh1 codant pour la Rhodopsine 1
d'après Sheng et al. (1997) Genes and Dev. 11, 1122-1131
A. Le facteur de transcription Pax6 se fixe in vitro à l'élément P3 du promoteur de rh1
Promoteur de rh1
Drh-P3: promoteur de rh1
promoteur de rh1
Drh-P3Mut: p
muté dans le site P3
Expériences de retard sur gel sur
les promoteurs Drh-P3 et Drh-P3Mut
avec des doses décroissantes de Pax6;
D di
D:
dimère;
è M
M: monomère
è
Sonde DrhP3
Sonde DrhP3-Mut
Pax6
B. L’élément P3 fixant Pax6 est nécessaire pour réguler in vivo l'expression de rh1
Coloration au X-Gal de coupes de têtes de drosophile
contenant les transgènes DrhP3-lacZ et DrhP3Mut-lacZ.
Accolade: rétine; flèche: lamina (dans le lobe optique)
24
Etude d’un modèle drosophile de rétinite pigmentaire
d’après Galy et al. (2005) Hum. Mol. Genetics 14, 2547-2557
A. Phénotype de dégénérescence rétinienne induit par une mutation du gène rh1
Coupes transversales d’œil de drosophile sauvages (WT)
ou transgéniques portant la construction P[rh1prom-Rh1P37H]
(notée Rh1P37H), agées de 1 jour ou 21 jours.
Les têtes de flèches indiquent les photorécepteurs R7.
B. Ce phénotype est supprimé par l’expression de la protéine anti-apoptotique p35
Coupes transversales d’œil de drosophile agées de 28 jours
portant seulement la construction P[rh1prom-Rh1P37H] (A) ou
les trois constructions P[rh1prom-Rh1P37H], P[rh1prom-Gal4] et
P[UAS-p35] (B)
Tests de phototaxie (haut)
Electrorétinogramme (bas)
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