DETERMINATION DE LA VITESSE INITIALE D`UNE REACTION

DETERMINATION DE LA VITESSE INITIALE D'UNE REACTION ENZYMATIQUE
COURBE [P] = f (t)
I. PAR METHODE CINETIQUE
L'enzyme étudiée est la phosphatase alcaline qui catalyse l'hydrolyse des liaisons esters lorsque l'acide engagé est
l'acide phosphorique mono estérifié.
On utilise la cinétique d'hydrolyse du PNPP (ParaNitroPhényl Phosphate) à 20°C à pH=9,8.
Le PNP (ParaNitroPhénol) est jaune en milieu alcalin. On peut donc suivre l'apparition du PNP au cours de l'hydrolyse en
enregistrant l'absorbance du mélange réactionnel à 410 nm en fonction du temps.
1. SPECTRE D'ABSORPTION DU PNP
A partir d'une solution de PNP, en tampon DEA pH=9,8, à 0,04 mmol/L, tracer le spectre d'absorption du PNP entre 300
et 500 nm (réaliser les mesures d'absorbance tous les 10 nm, puis tous les 5 nm au voisinage de lmax).
Le zéro du spectrophotomètre sera réalisé sur une cuve contenant du tampon DEA pH=9,8.
2. COURBE [P] = f(t)
Dans une cuve spectrophotométrique propre et sèche introduire:
-1mL de solution de PNPP à 5 mmol/L
-1,5 mL de tampon DEA pH=9,8
-0,5 mL de solution de phosphatase alcaline
Noter l'évolution de l'absorbance à 410 nm pendant 10 minutes (les valeurs d'absorbance seront relevées toutes les
minutes).
Le zéro du spectrophotomètre sera réalisé grâce à un blanc de composition suivante:
-1 mL d'eau distillée
-1,5 mL de tampon DEA pH=9,8
-0,5 mL de solution de phosphatase alcaline
3. RESULTATS
-Tracer le spectre d'absorption du PNP: A = f(l en nm).
-Déterminer lmax.
-Calculer ePNP à 410 nm.
-Tracer la courbe A = f(t en min).
-Calculer la vitesse initiale de la réaction (vi) en µmol / L de mr / min (on considèrera la vitesse de la réaction égale à 0
lorsqu'il y a absence d'enzyme).
II. PAR METHODE POINT PAR POINT
L'enzyme étudiée est la b fructosidase qui est une hydrolase capable de scinder les liaisons
b fructofuranosiques.
La réaction utilisée est l'hydrolyse du saccharose (glucide non réducteur) en fructose et glucose (glucides réducteurs)
en milieu tamponné pH=4,7.
a-D-glucopyranosyl(1->2)b-D-fructofuranoside + H2O ----------------> a-D-glucopyranose + b-D-fructofuranose
Saccharose Glucose Fructose
Le mélange d'oses réducteurs appelé sucre inverti est ensuite dosé par méthode colorimétrique au dinitrosalicylate.
1. GAMME D'ETALONNAGE POUR LA METHODE COLORIMETRIQUE AU
DINITROSALICYLATE
Réaliser une gamme d'étalonnage selon le tableau ci-dessous:
Homogénéiser et laisser reposer 10 minutes à la température du laboratoire.
Lire les absorbances à 530 nm contre le témoin réactif ou blanc (tube 0).
2. COURBE [P] = f(t)
On opère en présence d'enzyme et de substrat à concentration constante, en milieu tamponnée pH=4,7 et thermostaté
à 30°C.
On fait varier le temps de contact entre substrat et enzyme en respectant le protocole suivant:
Homogénéiser et laisser reposer 10 minutes à la température du laboratoire.
Lire les absorbances à 530 nm contre le tube 0 (incubation 0 min).
3. RESULTATS
-Tracer la courbe d'étalonnage A = f (nombre de moles de sucre inverti en µmol/tube).
-Déterminer l'équation de cette droite d'étalonnage A = a x n sucre inverti/tube + b.
-Tracer la courbe A = f(t en min).
-Calculer la vitesse initiale de la réaction (vi) en µmol / L de mr / min (on considèrera la vitesse de la réaction égale à 0
lorsqu'il y a absence d'enzyme).
Sommaire
DETERMINATION DES CONSTANTES CINETIQUES
KM ET Vmax D'UNE REACTION ENZYMATIQUE
I. PAR METHODE CINETIQUE
Enzyme utilisée : Phosphatase alcaline
Réaction étudiée : Hydrolyse du PNP
Cf Détermination de la vitesse initiale d'une réaction enzymatique.
1. COURBE vi = f ( [S]i/mr)
On mesure la vitesse initiale de la réaction en présence d'enzyme à concentration constante, en milieu tamponné
pH=9,8 et thermostaté à température ambiante.
On fait varier la concentration en substrat.
-Dans une série de tubes à essai propres et secs, préparer une gamme de dilution du substrat (solution de PNPP à 50
mmol/L) dans de l'eau distillée: dilutions 1/2 , 1/4 , 1/8 , 1/16 , 1/32 , 1/64 , 1/128 , 1/160.
Dans une cuve spectrophotométrique propre et sèche introduire:
-1mL de chacune des dilutions précédentes
-1,5 mL de tampon DEA pH=9,8
-0,5 mL de solution de phosphatase alcaline
Noter l'évolution de l'absorbance à 410 nm pendant 2 minutes (les valeurs d'absorbance seront relevées toutes les 20
secondes).
Le zéro du spectrophotomètre sera réalisé grâce à un blanc de composition suivante:
-1 mL d'eau distillée
-1,5 mL de tampon DEA pH=9,8
-0,5 mL de solution de phosphatase alcaline
2. RESULTATS
-Tracer les 8 courbes cinétiques obtenues, A = f (t), pour les 8 dilutions différentes de la solution de PNPP.
-Calculer la pente de chacune de ces courbes.
-A l'aide de la valeur de ePNP à 410 nm (calculée la semaine précédente), déterminer les valeurs de vi pour chacune
des expériences (on considèrera la vitesse de la réaction égale à 0 lorsqu'il y a absence d'enzyme).
-Calculer les valeurs de [S]i/mr pour chacune des expériences.
-Tracer les courbes vi = f ([S]i/mr) et 1/vi = f (1/[S]i/mr).
-Déterminer KM et Vmax.
Remarque: les valeurs des pentes de chaque courbe, de vi, 1/vi, [S]i/mr et 1/[S]i/mr seront regroupées dans un
même tableau.
II. PAR METHODE POINT PAR POINT
Enzyme utilisée : b-fructosidase.
Réaction étudiée : Hydrolyse du saccharose.
Cf Détermination de la vitesse initiale d'une réaction enzymatique.
1. COURBE vi = f ( [S]i/mr)
On mesure la vitesse initiale de la réaction en présence d'enzyme à concentration constante, en milieu tamponné
pH=4,7 et thermostaté à 30°C.
On fait varier la concentration en substrat.
Le temps de contact entre enzyme et substrat étant identique dans chaque tube.
Suivre le protocole ci-dessous:
Homogénéiser et laisser reposer 10 minutes à la température du laboratoire.
Lire les absorbances à 530 nm contre le tube 0 ([S]i/mr = 0).
2. RESULTATS
-A l'aide de la valeur de l'équation de la droite d'étalonnage A = a x n sucre inverti/tube + b (déterminée la semaine
précédente), calculer les valeurs de vi pour chacune des expériences (on aura au préalable vérifié qu'au bout de 6
minutes la réaction est toujours en période initiale, à l'aide de la courbe [P] = f(t) tracer la semaine précédente) (on
considèrera la vitesse de la réaction égale à 0 lorsqu'il y a absence d'enzyme).
-Calculer les valeurs de [S]i/mr pour chacune des expériences.
-Tracer les courbes vi = f ([S]i/mr) et 1/vi = f (1/[S]i/mr).
-Déterminer KM et Vmax.
Remarque: les valeurs de vi, 1/vi, [S]i/mr et 1/[S]i/mr seront regroupées dans un même tableau.
Sommaire
ETUDE DE L'INFLUENCE DE LA CONCENTRATION EN ENZYME SUR UNE
REACTION ENZYMATIQUE
Enzyme utilisée : Phosphatase alcaline
Réaction étudiée : Hydrolyse du PNP
Méthode employée: méthode cinétique.
Cf Détermination de la vitesse initiale d'une réaction enzymatique.
I. COURBE vi = f ([E]mr)
On mesure la vitesse initiale de la réaction en présence de substrat à concentration constante, en milieu tamponné
pH=9,8 et thermostaté à température ambiante.
On fait varier la concentration en enzyme.
Dans une cuve spectrophotométrique propre et sèche introduire:
-1mL de solution de PNPP à 50 mmol/L
-(2 - x) mL de tampon DEA pH=9,8
-x mL de solution de phosphatase alcaline à 1,25 µg de protéines / mL (x = 0,1 ; 0,2 ; 0,3 ; 0,4 ; 0,5)
Noter l'évolution de l'absorbance à 410 nm pendant 2 minutes (les valeurs d'absorbance seront relevées toutes les 20
secondes).
Le zéro du spectrophotomètre sera réalisé grâce à un blanc de composition suivante:
-1 mL d'eau distillée
-1,5 mL de tampon DEA pH=9,8
-0,5 mL de solution de phosphatase alcaline
II. RESULTATS
-Tracer les 5 courbes cinétiques obtenues, A = f (t), pour les 5 volumes différents de la solution de phosphatase
alcaline.
-Calculer la pente de chacune de ces courbes.
-A l'aide de la valeur de ePNP à 410 nm (calculée la première semaine ), déterminer les valeurs de vi pour chacune des
expériences (on considèrera la vitesse de la réaction égale à 0 lorsqu'il y a absence d'enzyme).
-Calculer les valeurs de [E]mr pour chacune des expériences.
-Tracer la courbe vi = f ([E]mr).
Remarque: les valeurs des pentes de chaque courbe, de vi, et [E]/mr seront regroupées dans un même tableau.
ETUDE DE L'INFLUENCE
ENZYMATIQUE
D'UN
EFFECTEUR
SUR
UNE
REACTION
Enzyme utilisée : Phosphatase alcaline.
Réaction étudiée : Hydrolyse du PNPP.
Méthode employée : méthode cinétique.
Effecteur utilisé : les ions phosphate .
Cf Détermination de la vitesse initiale d'une réaction enzymatique.
I. COURBE vi = f ( [S]i/mr)
On mesure la vitesse initiale de la réaction en présence d'enzyme et d'effecteur à concentration constante, en milieu
tamponné pH=9,8 et thermostaté à température ambiante.
On fait varier la concentration en substrat.
-Dans une série de tubes à essai propres et secs, préparer une gamme de dilution du substrat (solution de PNPP à 50
mmol/L) dans de l'eau distillée: dilutions 1/2 , 1/4 , 1/8 , 1/16 , 1/32 , 1/64 , 1/128 , 1/160.
Dans une cuve spectrophotométrique propre et sèche introduire:
-1mL de chacune des dilutions précédentes
-0,5 mL de solution d'hydrogénophosphate disodique à 4 mmol/L
-1 mL de tampon DEA pH=9,8
-0,5 mL de solution de phosphatase alcaline
Noter l'évolution de l'absorbance à 410 nm pendant 2 minutes (les valeurs d'absorbance seront relevées toutes les 20
secondes).
Le zéro du spectrophotomètre sera réalisé grâce à un blanc de composition suivante:
-1 mL d'eau distillée
-0,5 mL de solution d'hydrogénophosphate disodique à 4 mmol/L
-1 mL de tampon DEA pH=9,8
-0,5 mL de solution de phosphatase alcaline
II. RESULTATS
-Tracer les 8 courbes cinétiques obtenues, A = f (t), pour les 8 dilutions différentes de la solution de PNPP.
-Calculer la pente de chacune de ces courbes.
-A l'aide de la valeur de ePNP à 410 nm (calculée la première semaine), déterminer les valeurs de vi pour chacune des
expériences (on considèrera la vitesse de la réaction égale à 0 lorsqu'il y a absence d'enzyme).
-Calculer les valeurs de [S]i/mr pour chacune des expériences.
-Tracer les courbes vi = f ([S]i/mr) et 1/vi = f (1/[S]i/mr).
-Déterminer KM et Vmax.
-Comparer ces valeurs à celles obtenues la semaine précédente sans effecteur.
Remarque: les valeurs des pentes de chaque courbe, de vi, 1/vi, [S]i/mr et 1/[S]i/mr seront regroupées dans un
même tableau.
Sommaire
INFLUENCE DU pH ET
ENZYMATIQUE
DE LA TEMPERATURE SUR UNE REACTION
I. INFLUENCE DU pH
Enzyme utilisée : b-fructosidase
Réaction étudiée : Hydrolyse du saccharose
Méthode employée : méthode point par point
Cf Détermination de la vitesse initiale d'une réaction enzymatique.
1. COURBE vi = f (pH)
On mesure la vitesse initiale de la réaction en présence d'enzyme et de substrat à concentration constante, en milieu
thermostaté à 30°C.
On fait varier le pH du milieu réactionnel.
B : Blanc; E : Essai
Homogénéiser et laisser reposer 10 minutes à la température du laboratoire.
Lire les absorbances des tubes essai à 530 nm contre les tubes blanc.
II. INFLUENCE DE LA TEMPERATURE
Enzyme utilisée : b-fructosidase
Réaction étudiée : Hydrolyse du saccharose
Méthode employée : méthode point par point
Cf Détermination de la vitesse initiale d'une réaction enzymatique.
1. COURBE vi = f (T)
On mesure la vitesse initiale de la réaction en présence d'enzyme et de substrat à concentration constante, en milieu
tamponné pH= 4,7.
On fait varier la température du milieu réactionnel.
B : Blanc; E : Essai
Homogénéiser et laisser reposer 10 minutes à la température du laboratoire.
Lire les absorbances des tubes essai à 530 nm contre les tubes blanc.
2. RESULTATS
-A l'aide de la valeur de l'équation de la droite d'étalonnage A = a x n sucre inverti/tube + b (déterminée la première
semaine), calculer les valeurs de vi pour chacune des expériences (on considèrera la vitesse de la réaction égale à 0
lorsqu'il y a absence d'enzyme).
-Tracer la courbe vi = f (T).
-Interpréter l'allure de cette courbe