2.1 - Aviesan

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TRL 2
Criblage de chimiothèques ou de banques de peptides
CONCEPTION DU TEST DE CRIBLAGE
Lors de sa conception le test envisagé doit répondre à un certain nombre de critères parmi lesquels :
Relevance pharmacologique et pertinence du test dans le cadre du projet.
A titre d’exemples : utiliser la forme « active » de la protéine, les isoformes les plus significatives pour la
pathologie visée, un milieu de culture et/ou croissance cellulaire adéquat pour le criblage phénotypique.
Miniaturisation du test
La miniaturisation du test, les outils disponibles pour sa réalisation ainsi que sa sensibilité et sa robustesse
déterminent le format des plaques qui sera utilisé. En particulier et à titre d’exemple, le temps de réalisation
des mesures du test sur un format de plaque et un système robotique donnés, doit être pris en compte dès la
conception du test et dans le choix du format des plaques. Il convient en particulier de s’assurer que le temps
de mesure est concordant avec le temps de réaction, la décroissance de la luminescence,...
Le format des plaques (96 à 3 456 puits) est donc directement lié au test choisi, aux conditions de sa
réalisation, au temps de lecture imposé (taille de la plaque, temps de réaction,…), au matériel robotique
utilisé,…
Choix de la méthode de lecture des tests
Il est varié : absorbance, bioluminescence, fluorescence ; analyseur d’image… (FRET ; BRET ; MTT ; ATP
(Luc) ; 7AAD (fluo/facs). Dans tous les cas, il convient d’apprécier la sensibilité de la méthode et les
interférences possibles avec les molécules elles-mêmes.
Le choix de l’une ou l’autre de ces méthodes de lecture est susceptible d’imposer directement le format de la
plaque pour prendre en compte le temps de réalisation de la mesure relativement au temps de la réaction à
mesurer.
Robustesse du test dans les conditions de criblage
Soumettre le test et le format de sa réalisation aux conditions robotiques de criblage est essentiel. Il s’agit
notamment de :
1. Vérifier que la mesure est statistiquement discriminante :
• Ce calcul peut utiliser le facteur « Z’ » à partir des mesures réalisées sur le contrôle négatif (valeurs «
basses ») et le contrôle positif (valeurs « hautes »). Le test est prédictif si 99 % des valeurs hautes et
basses sont séparées par au moins 3 déviations standard. Idéalement, Z’ égale 1 ; entre 0,75 et 1, le
test est excellent ; entre 0,5 et 0,75, le test est valide ; en dessous de ces valeurs, le test n’est pas
discriminant et ne peut être utilisé en HTS.
http://help.arcgis.com/fr/arcgisdesktop/10.0/help/index.html#//005p00000006000000
http://en.wikipedia.org/wiki/Z-factor
• d’autres méthodes statistiques tout aussi simples et informatives existent.
2. Identifier les biais potentiels et de qualifier les faux positifs et faux négatifs possibles à envisager dès la
conception du test.
Coût du criblage
L’ensemble des choix précédents (méthode de lecture, taille des plaques,…) conditionnent directement le
coût au point. Le coût du criblage est proportionnel à la taille de la chimiothèque utilisée. A titre indicatif, le
coût au point varie de 0,10€ à 5€ ; l’analyse de 75 000 composés sur un test déjà miniaturisé s’élève à 1520k€. Il importe donc de prendre en compte dès la phase de conception le coût du test au regard du budget
disponible.
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Criblage de chimiothèques ou de banques de peptides
Choix de la chimiothèque
et réalisation du test
Questions
Coût
Quel sera le coût au point du test envisagé ?
Quel sera le coût du criblage au regard du budget disponible et des choix
qui seront faits : taille des plaques, système de lecture, choix futur de la
taille de la chimiothèque…)
Conception du test
Le test envisagé est-il miniaturisable ?
Pertinence pharmacologique du test
La molécule ciblée dans le test est-elle la forme la plus significative vis-à-vis
de la pathologie ?
Le milieu de culture choisi pour le test est-il le plus approprié pour un
criblage phénotypique ?
Robustesse du test
Quels faux positifs et faux négatifs attendre ?
L’écart de mesure entre le contrôle négatif et le contrôle positif est-il
suffisant pour une lecture significative ?
Design expérimental statistique
Peut-on s'attendre à des effets de bords importants?
La détection fiable des touches nécessite-t-elle une double (à minima) ou
une triple mesure ?
Temps de mesure et temps de réaction
Le format des plaques, le système robotique et la méthode de lecture
choisis sont-ils compatibles avec le temps de réaction et de réalisation du
test ?
Le système robotique permet-il une mesure effectivement compatible avec
le temps de réaction attendu après lequel la mesure doit être faite ?
La cadence du système de lecture en fonction du format des plaques est-il
compatible avec ce temps de réaction ?
Méthode de lecture
La méthode choisie est-elle susceptible d’interférer avec les molécules
analysées ?
Format des plaques
La réalisation des « plaques-filles » par pipetage automatisé de faibles
volumes à partir des « plaques stock » est-il réalisable au format proposé ?
Le format des plaques de la chimiothèque achetée est-il compatible avec le
test envisagé, le fonctionnement de la plate-forme, le prestataire qui gère la
plate-forme ?
Références
• Malo N. et al (2006) Statistical practice in high-throughput screening data analysis. Nature
Biotechnology. 24:167-175
• Hibert M. (2009) French/European academic compound library initiative. Drug discovery today. 14:
723-725
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Criblage de chimiothèques ou de banques de peptides
CHOIX ET CRITÈRES D’APPRÉCIATION DE LA CHIMIOTHÈQUE
Caractéristiques générales de la chimiothèque
La chimiothèque peut être généraliste (commerciale ou patrimoniale), dédiée (ou focalisée) (kinases ;
protéases …) ou restreinte selon le projet.
La chimiothèque généraliste est le plus souvent utilisée lorsque peu d’informations sont disponibles sur la
cible. Elle permet dans certains cas d’explorer de nouvelles zones de l’espace chimique.
Les chimiothèques dédiées sont utilisées si la famille de cibles à analyser a déjà été caractérisée ou étudiée
dans le passé ou si la cible a été classée selon un type de mécanisme d’action (ex chimiothèques
spécialisées de kinases, de transporteurs, d’inhibiteurs protéine-protéine,…) Une chimiothèque dédiée peut
être aussi identifiée, caractérisée ou construite par un criblage in silico. Cette approche réduit la taille de la
chimiothèque et donc le coût tout en augmentant les chances de succès.
Plusieurs sociétés (Sigma, Prestwick Chemicals, etc.) proposent également des collections constituées de
molécules approuvées par la Food and Drug Administration. Ces collections peuvent permettre de valider un
test, d'identifier des faux-positifs, de préciser la stratégie "post-criblage" et parfois de découvrir de nouvelles
applications pour des principes actifs déjà connus. De plus, les molécules trouvées actives à l'issue du
criblage de ces collections peuvent orienter le choix de collections ultérieurement criblées, comme par
exemple des collections de molécules présentant un pharmacophore donné.
Taille, diversité et choix d’inclusion de la chimiothèque
Pour le criblage HTS, une chimiothèque d’environ 500 000 molécules est utilisée (environ 50 000 molécules
sur les plateformes académiques); elle est plus restreinte (25 000 à 50 000 molécules) pour le criblage MTS.
La taille doit être appréciée au moment du choix de la chimiothèque.
Cependant, la diversité chimique associée à ces bibliothèques doit être considérée pour éviter la redondance
structurale. La diversité structurale d’une chimiothèque est un critère important pour évaluer une chimiothèque
généraliste. Elle conditionne l’étendue de l’espace chimique qui sera analysé. Elle constitue également un
critère de comparaison entre différentes chimiothèques dédiées. Elle ne se mesure pas au nombre de
molécules mais peut être estimée notamment au moyen du coefficient de Tanimoto1 combiné avec des
approches de clustering.
Choix d’inclusion : certaines caractéristiques physicochimiques comme le logP, alertes structurales et les
règles selon lesquelles la chimiothèque a été constituée (règle de Lipinski,…) sont à prendre en compte.
Dans tous les cas, la taille de la chimiothèque impacte directement le coût du criblage.
Considérations pratiques
Le choix de la chimiothèque repose aussi sur des critères pratiques :
1. Format des plaques
2. Volume et concentration des molécules
3. Solvant utilisé pour le conditionnement
4. Modalités de stockage
5. Contrôle qualité des plaques
L’accès possible à des données complémentaires sur la chimiothèque tel que l’historique des précédents
criblages, la disponibilité des molécules, la connaissance de la cytotoxicité, les caractéristiques (théoriques ou
physico-chimique des molécules, présence de "frequent hitters",…), constitue un critère d’appréciation
supplémentaire dans le choix d’une chimiothèque.
1 Le
coefficient de Tanimoto mesure la similitude entre 2 molécules ; compris entre 0 et 1, la valeur de 0,8
correspond au seuil de similitude souvent utilisé. Les molécules avec T>0,8 sont considérées comme similaires.
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Criblage de chimiothèques ou de banques de peptides
Choix de la chimiothèque
et réalisation du test
Questions
Chimiothèque généraliste, dédiée ou restreinte
Le mécanisme d’action est-il partiellement connu ? Connait-on en partie
ou non la cible (ou la famille) étudiée ?
Taille et diversité de la chimiothèque
La chimiothèque présente-t-elle une diversité structurale suffisante pour
explorer l’espace chimique le plus large possible ?
Le solvant de solubilisation et de dilution est-il compatible avec le
système biologique étudié ?
Critères pratiques de choix de la chimiothèque
Quel sera le volume final obtenu après dilution ? Quelles seront les
conditions et modalités de stockage des plaques ?
Appréciation de la qualité et retour d’expérience
sur la chimiothèque
Quelles sont les modalités du contrôle qualité ? Des informations sontelles disponibles sur les molécules de la chimiothèque : leur
cytotoxicité, historique des précédents criblages, disponibilité des
composés,… ?
Ressources
Privé
-
AFSSI afssi.fr
-
DiverChim diverchim.com (Ile de France)
-
Helixem helixem.com (Languedoc
Roussillon)
-
Prestwick Chemical
prestwickchemical.com
-
Chem-X-Infinity chem-x-infinity.com (Ile de
France)
Public
-
GDR ChemBioScreen chembioscreen.fr
-
Chimiothèque nationale chimiotheque-nationale.org
Plates-formes GIS Ibisa (ibisa.net) :
-
G5C (CEA Grenoble et CEA Saclay)
-
PCBIS (Strasbourg) pcbis.fr
-
CDithem (Paris, Lille – essentiellement les
modulateurs d’interaction protéines-protéines)
cdithem.fr
-
KISSf, (Roscoff, inhibiteurs de protéines kinases)
-
Primacen (Rouen) primacen.crihan.fr
Références
• Baell J.B., Holloway G.A. (2010) New substructure filters for removal of pan assay interference compounds
(PAINS) from screening libraries and for their exclusion in bioassays. J. Med. Chem., 53: 2719-2740.
• Hann N.M., Keserü G.M. (2012) Finding the sweet spot: the role of nature and nurture in medicinal chemistry.
Nat. Rev. Drug. Discov. 11: 355-365.
• Villoutreix B. et al. (2014) Drug-Like Protein-Protein Interaction Modulators: Challenges and Opportunities for
Drug Discovery and Chemical Biology. Mol. Inform. 33:414-437.
• Feng B.Y., Shoichet B.K. (2006) A detergent-based assay for the detection of promiscuous inhibitors Nat.
Protoc. 1:550-553.
• Rishton G.M. (2003) Nonleadlikeness and leadlikeness in biochemical screening. Drug Disc. today 8:86-96
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