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Etude du transcriptome par hybridation sur puces à ADN
Souche
sauvage
Souche
mutante
Contrôle de la quantité et
de la qualité des ARN
Marquage direct ou indirect
des ARN
Amplification des ARN
et marquage
Amplification
des ARN m
Bioanaliseur Agilent 2100
Technique de Miniaturisation d’une électrophorèse sur une puce
Puce
Bioanaliseur 2100 avec les électrodes permettant l’électrophorèse sur puces
Principe de l’électrophorèse
1 : les échantillons migrent à travers les micros canaux depuis leur puit
2 :l’échantillon est injecté dans le canal de séparation
3 : les différents composants de l’échantillon sont séparés par électrophorèse
4 : les différents composants sont détectés par leur fluorescente et représentés en
bandes (comme un gel d’électrophorèse) ou en électrophorégramme
Quantification sur Bioanaliseur Agilent
Intensité de fluorescence
Avant
28S
18s
18S
ARN de transfert
Marqueur de taille ARN messagers
Evaluation de la qualité de l’ARN par RIN: RNA Integrity Number
Disponible sur le Bioanaliseur agilent 2100
La qualité de l’ARN est déterminée par:
-Le rapport entre les 2 bandes 18s et 28s des ARN ribosomaux
-Le tracé complet de l’électrophorégramme incluant la présence ou
l’absence de produits de dégradations
Division de électrophorégramme en 9
régions pour obtenir le calcul du RIN
Obtention d’une échelle de 0 à 10:
O : Dégradation total de l’ARN
10: ARN de grande qualité
Échelle de 0 à
10
Validation faite pour les ARNs totaux de Mammifères à partir de 1300
échantillons
Avantages:
-Facilite interprétation de l’électrophorégramme
-Permet une bonne comparaison des échantillons
-Permet de contrôler la répétabilité des expériences et de
choisir les échantillons pour les hybridations sur « puces à ADN
ARNs utilisés pour le TP
Souche sauvage: SEY
0.5 µg/µl
rRNA Ratio [28S/18S]=1.7
Gain de fonction:Yrr1
0.4µg/µl
rRNA Ratio [28S/18S]=1.7
Techniques de marquages:
Marquages
types d’ARN
Qté d’ARN
De départ
Direct
ARN total
10-20ug
Indirect
(amino-allyl)
Indirect
ARN total
5ug
ARN amplifié
500ng
(2µg aRNA)
Marquage direct des ARN Totaux
ARNtotal
TTT
Hexamères
Transcriptase reverse
+ dUTP-CY
Hydrolyse chimique
par NaOH
ADNc marqué
Schéma du principe du marquage indirect
ARN total
Hexamère
Oligo dT
Transcriptase reverse
+ dUTP-Amino-Allyl
Synthèse du
brin d’ADNc
Hydrolyse chimique
Réaction de
Couplage
NHS- CY
ADNc Marqué
+Bicarbonate
Principe d’amplification linéaire des ARN messagers
Synthèse du 1er brin d’ADNc
AAA
TTT-T7
Reverse Transcriptase
AAA
TTT-T7
Rnase H
Dégradation de l’ARN
AAA
TTT-T7
DNA polymérase
Synthèse du 2nd brin d’ADNc
AAA-T7
TTT-T7
RNA polymérase T7
Transcription in vitro + dUTP-AminoAllyl
==> Amplification des
ARN
AAA-T7
UUU
UUU
UUU
TTT-T7
Dégradation de l’ADN
ARN amplifiés
Marquage de l’ARN amplifié par
couplage avec NHS- CY
ARN amplifiés marqués
Dnase I
UUU
UUU
UUU
Marquage indirect d’ARN total de levure
•Transcription inverse à partir de 5 µg d’ARN total
• Hydrolyse des ARN
•Purification des cibles (colonnes QuiaQuick de Quiagen)
TP de lundi après midi
•Couplage du NHS-ester Cy3/5 avec l'échantillon
•Blocage et purification
•Hybridation des lames
•Pré-hybridiation des lames
•Hybridation manuelle des puces à ADN sur la nuit
TP de mardi matin
•Rinçage des lames
•Lecture des lames