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CHAPITRE 1.1.5.
VALIDATION ET CONTRÔLE QUALITÉ DES
MÉTHODES D'AMPLIFICATION EN CHAÎNE PAR
POLYMÉRASE (PCR) UTILISÉES POUR LE
DIAGNOSTIC DES MALADIES INFECTIEUSES
INTRODUCTION
Le diagnostic de maladies infectieuses est réalisé par la détection directe et/ou indirecte d’agents
infectieux. Par les méthodes directes, les particules des agents et/ou leurs composants, tels que
les acides nucléiques, les protéines structurales ou non-structurales, les enzymes, etc., sont
détectés. Les méthodes indirectes démontrent la présence des anticorps induits par les infections.
Les méthodes les plus usuelles pour la détection directe sont l’isolement ou la culture in vitro, la
microscopie
électronique,
l’immunofluorescence,
l’immunohistochimie,
les
épreuves
immuno-enzymatiques (ELISA), l’hybridation d’acides nucléiques (NAH, Nucleic-acid
Hybridisation), les épreuves à base de micro- et macro-puces et les diverses techniques
d’amplification d’acides nucléiques comme la réaction d’amplification en chaîne par polymérase
(PCR) ou les méthodes d’amplification isothermiques comme l’amplification basée sur les
séquences d’acides nucléiques (NASBA, Nucleic Acid Sequence Based Amplification) ou
l’amplification isothermique par clivage invasif ou par la méthode dite LAMP (Loop-mediated
Isothermal Amplification). Comme les épreuves de NAH, de micro- et macro-puces et les diverses
épreuves d’amplification utilisent pour cibles les molécules d’acides nucléiques, elles sont
également appelées méthodes de diagnostic moléculaire.
Les méthodes les plus usuelles de détection indirecte d’agents infectieux sont les épreuves
sérologiques, telles que la neutralisation virale, l’ELISA, les épreuves d’inhibition de
l’hémagglutination, puis une série de méthodes techniques plus récentes telles que les biocapteurs,
la bioluminétrie, la polarisation de fluorescence, la chimioluminescence, etc. En général, les
laboratoires de diagnostic utilisent simultanément les méthodes directes et indirectes, afin d’obtenir
le plus de certitude possible pour un diagnostic.
Les expériences des deux dernières décennies indiquent que les techniques de PCR vont
finalement supplanter bon nombre des méthodes directes classiques de détection d’agents
infectieux. Il apparaît clairement que la PCR est en train de remplacer l’isolement de virus ou la
culture de bactéries, pour la détection d’agents difficiles ou impossibles à cultiver. Il existe plusieurs
raisons à cette tendance qui incluent le fait que l’isolement de virus nécessite: i) la présence de
microorganismes qui se multiplient (virus ou bactéries) ; ii) des locaux et des équipements coûteux
pour les cultures cellulaires et la maintenance ; iii) un minimum de plusieurs semaines pour réaliser
le diagnostic ; et iv) une expertise particulière qui manque ou diminue aujourd’hui dans bon nombre
de laboratoires. Bien qu’initialement les épreuves de PCR aient été coûteuses et lourdes à mettre
en œuvre, elles sont maintenant devenues des outils relativement peu chers, sûrs et d’emploi facile
dans les laboratoires de diagnostic (2-4, 6, 7, 11-13). La sensibilité et la spécificité de la PCR sont
généralement meilleures que les procédures d’isolement ou les ELISA de capture d’antigène.
L’introduction de diverses méthodes de PCR en temps réel, des automates pour l’extraction des
acides nucléiques et des plateformes automatisées a résulté à l’heure actuelle en un grand arsenal
d’épreuves robustes, très rapides et fiables pour le diagnostic moléculaires. Dans ce chapitre les
applications diagnostiques des diverses méthodes de PCR sont résumées avec un intérêt
particulier pour l’harmonisation et la validation au niveau international.
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Manuel terrestre de l’OIE 2005
Chapitre 1.1.5. — Validation et contrôle qualité des méthodes d'amplification en chaîne par polymérase
(PCR) utilisées pour le diagnostic des maladies infectieuses
A. MÉTHODES DE PCR UTILISÉES EN DIAGNOSTICS MOLÉCULAIRES DE ROUTINE
1.
Les principes de la PCR
La réaction d’amplification en chaîne par polymérase (PCR) implique qu’il y ait dans cette technique une
amplification basée sur une réaction enzymatique. Le terme de « réaction en chaîne » fait référence à plusieurs
cycles de copies de l’ADN spécifique, issus dans ce cas du génome d’un agent infectieux. La région devant être
amplifiée est délimitée par deux (ou plus) séquences nucléotidiques courtes, appelées sites d’amorce, qui
encadrent la séquence cible. Les amorces, oligonucléotides courts complémentaires des sites d’amorce, se lient
à la chaîne d’ADN devant être copiée. En utilisant une polymérase, qui n’est pas dénaturée au cours des cycles
de chaleur, il est possible de copier la séquence ciblée par l’ajout aux amorces de nucléotides libres. En répétant
les cycles de chaleur 20 à 40 fois, le taux de copies d’ADN cibles acquises augmente de façon exponentielle en
en produisant suffisamment pour les opérations suivantes, telles que la détection, le clonage ou le séquençage.
La sensibilité du diagnostic par PCR est très élevée car plusieurs millions de copies de la cible sélectionnée sont
produites. La spécificité peut également être très élevée selon les séquences nucléotidiques spécifiques des
cibles sélectionnées, et le motif des amorces. Les amorces peuvent être choisies pour détecter des séquences
de nucléotides très spécifiques dans les génomes des agents infectieux sélectionnés, ou peuvent être choisies
pour être complémentaires de régions bien conservées du génome, permettant ainsi la détection des membres
d’une famille ou du genre d’un agent infectieux. Une synthèse détaillée des techniques moléculaires a été publiée
(17).
a)
Amplification de l’ADN
Si le génome de l’agent infectieux est de l’ADN, l’amplification est effectuée directement, avec ou sans
purification préalable de l’ADN cible. Dans de nombreux cas, l’utilisation d’ADN extrait ou purifié à partir d’un
matériel devant être analysé (ex : du sang) permet d’augmenter la sensibilité analytique et diagnostique.
b)
Amplification d’ARN (PCR par transcription inverse)
Les génomes de nombreux agents infectieux contiennent de l’acide ribonucléique (ARN) qui ne peut pas
être amplifié directement par PCR. Pour l’amplification par PCR, de l’ADN cible simple brin est nécessaire,
mais n’est pas disponible dans le cas de virus à ARN. Ce problème peut être résolu par l’addition d’une
étape avant de commencer la PCR. En utilisant une transcriptase inverse, il est possible de transcrire l’ARN
en ADN complémentaire (ADNc), qui est un ADN double brin et peut être utilisé dans une épreuve de PCR
(cette procédure est appelée PCR couplée à la transcription inverse : RT-PCR). Traditionnellement, la
réaction de transcription inverse était effectuée dans un tube de réaction séparé et l’ADNc produit, transféré
ensuite dans un nouveau tube pour la PCR. Cependant, sont maintenant disponibles dans le commerce des
polymérases d’ADN stables à la chaleur, ayant une activité de transcriptase inverse, et des tampons
dans lesquels la RT et les polymérases d’ADN sont actives. Les deux permettent de réaliser une réaction de
RT-PCR dans un même tube et en une séquence directe sans manipulations supplémentaires limitant ainsi
les risques de contaminations. Dans la plupart des cas, il sera nécessaire d’extraire et de purifier l’ARN
avant la transcription inverse.
c)
Détection d’amplicon de PCR
Le produit de PCR, ou amplicon, peut être détecté en utilisant une variété de procédures. La plus commune
inclue une détection non spécifique des produits de PCR basée sur la taille de l’amplicon en utilisant
l’électrophorèse en gel d’agarose et la révélation de l’ADN avec un colorant intercalant non spécifique, tel
que le bromure d’éthidium (il est possible actuellement de remplacer ce dernier par des colorants non
carcinogènes comme le GelRed). Une reconnaissance spécifique de la séquence cible amplifiée peut être
effectuée par transfert de l’ADN en Southern blot suivi d’une hybridation avec les sondes d’oligonucléotides
complémentaires de la séquence cible. Les sondes d’hybridation peuvent être une enzyme, être
chimioluminescente, ou marquée par un radionucléotide pour permettre la détection visuelle de la séquence
cible spécifique.
Quelques exemples de méthodes de PCR couramment utilisées sont donnés ci-dessous.
2.
PCR conventionnelle
La « PCR conventionnelle » (ou simplement PCR) utilise une paire d’amorce d’oligonucléotides pour amplifier
une petite partie du génome de l’agent infectieux. La sensibilité analytique est typiquement élevée avec un
nombre minimum de 100 à 1 000 copies de l’ADN cible détectable. La spécificité analytique peut être élevée, en
fonction de la sélection de la cible, le motif des amorces et le test d’optimisation. La sensibilité et la spécificité
analytiques peuvent, toutes les deux, être améliorées en effectuant une PCR nichée (voir le point 3 ci-dessous).
Les méthodes de détection, telles que le Southern blotting suivi de l’hybridation avec des sondes, peuvent encore
améliorer la sensibilité et la spécificité, mais elles demandent du temps, nécessitent la manipulation au
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laboratoire d’ADN amplifié, et l’interprétation des résultats peut être techniquement subjective. Étant donné la
complexité et le coût, ces méthodes de détection ne sont généralement pas considérées aujourd’hui comme des
procédures adaptées à une utilisation courante en laboratoire de diagnostic.
3.
PCR nichée
Les épreuves de PCR nichée utilisent deux jeux de cycles d’amplification avec 4 amorces, désignées amorces
externe et interne. En général, les épreuves de PCR nichée procurent une sensibilité et une spécificité
analytiques supérieures par rapport aux épreuves de PCR conventionnelles. Cependant, il existe un risque
important de contamination croisée car les produits issus du premier cycle d’amplification sont souvent utilisés
comme matrice de départ pour le deuxième cycle, ce qui peut entraîner des transferts de matériel entre les
différents tubes de PCR. La PCR nichée a été en grande partie remplacée par des PCR en temps réel qui sont
aussi sensibles mais au cours desquelles les risques de contamination sont réduits. La limite la plus faible de
détection avec la PCR nichée est classiquement inférieure à 10 copies génomiques de l’ADN cible. La spécificité
analytique est également augmentée car dans la PCR nichée, 4 amorces d’oligonucléotides doivent se lier
spécifiquement avec les cibles sélectionnées afin de donner une réaction positive (4).
4.
PCR en temps réel
La PCR en temps réel diffère de la PCR classique car les produits amplifiés de PCR sont détectés directement
pendant les cycles d’amplification en utilisant des sondes d’hybridation qui augmentent la spécificité de l’épreuve.
Des méthodes variées en temps réel, telles que TaqMan, les amorces Scorpions, le transfert d’énergie résonant
(FRET pour Fluorescence Resonance Energy Transfer), le transfert d’énergie avec sonde-amorce (PriProET pour
Primer-Probe Energy Transfer), SybrGreen, Light-Upon-eXtension (LUX) ou les techniques Molecular Beacon
sont devenues des outils utilisés en routine pour la détection d’agents infectieux. La PCR en temps réel a
été utilisée pour la détection de bactéries, de virus ou de parasites issus d’un grand éventail d’espèces animales
(2-4, 14, 17). Ces nouvelles techniques présentent plusieurs avantages supplémentaires par rapport aux
méthodes de PCR « classiques » conventionnelles ou de PCR nichées. En général, une seule paire d’amorce est
utilisée, ce qui procure une sensibilité souvent proche ou égale à celle de la PCR nichée traditionnelle, mais avec
un risque beaucoup plus faible de contamination. La fluorescence, indiquant la présence du produit amplifié, est
mesurée à travers le couvercle ou le coté du tube de réaction et une manipulation post-PCR de l’ADN amplifié
n’est pas nécessaire. Ces procédures prennent nettement moins de temps comparées à la détection
traditionnelle du produit de PCR post-amplification en gels d’agarose suivi d’une révélation en bromure d’éthidium
ou de colorant équivalent pour la détection de l’ADN, et là encore, le risque de contamination est réduit.
L’utilisation d’un format en plaque de microtitration à 96 puits, sans besoin de PCR nichée, permet d’automatiser
la procédure et de l’adapter à des dosages de grande envergure (10, 17). Le diagnostic peut être encore plus
automatisé par l’utilisation de robots pour les extractions d’ADN/ARN et le pipetage. En comparaison avec les
méthodes classiques d’amplification, un autre avantage de la PCR en temps réel est la possibilité de réaliser une
épreuve quantitative (6, 7). Avec une PCR en temps réel, le délai de diagnostic peut être réduit de quelques
heures à quelques minutes. La PCR en temps réel peut aussi être utilisée comme une PCR à transcription
inverse en utilisant un protocole à une étape ; cela permet aux étapes de RT et de PCR de se dérouler dans le
même tube au cours du même protocole de PCR (17).
5.
PCR multiplexe
Les PCR utilisant des amorces multiples dirigées contre différentes cibles en une seule épreuve sont appelées
épreuves de PCR multiplexe. En PCR multiplexe, des agents infectieux variés peuvent être détectés et
différenciés dans un même tube et en même temps. Les différentes cibles de PCR amplifiées dans une épreuve
classique de PCR sont identifiées à partir de la taille des produits de PCR. L’utilisation des méthodes classiques
de PCR nichée pour la construction d’épreuves multiplexes est compliquée par la nécessité pour les cibles d’être
de différentes tailles, et par le fait que les amorces peuvent entrer en compétition dans le même mélange
réactionnel. Ces deux facteurs peuvent avoir un impact négatif sur l’efficacité de la PCR. En revanche, le concept
de PCR en temps réel (paires d’amorce unique) donne d’excellentes possibilités pour la construction de systèmes
multiplexes à haute sensibilité (4, 9) basés sur une taille plus uniforme des cibles, des conditions d’amplification
uniformes et une détection différentielle des cibles en utilisant des sondes d’hybridation spécifiques marquées
avec des fluorophores différents. Il convient de remarquer que des amorces communes peuvent être utilisées afin
d’amplifier des régions spécifiques du génome d’un groupe d’agents pathogènes, puis des sondes (TaqMan)
fluorescentes peuvent être employées pour discriminer entre les membres de ce groupe. Il ne s’agit pas d’une
PCR multiplexe à proprement parler, bien que cette technique soit décrite à tort comme telle.
6.
Autres méthodes de diagnostic moléculaire
Bien que ce chapitre concerne essentiellement le diagnostic basé sur des techniques de PCR, il convient de
mentionner brièvement qu’outre la PCR, il existe beaucoup de nouvelles méthodes pour la détection moléculaire
des agents pathogènes comme, par exemple, les méthodes d’amplification isothermiques (amplification basée
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sur la séquence des acides nucléiques [NASBA, Nucleic Acid Sequence Based Amplification], amplification
isothermique par clivage invasif ou par la méthode LAMP [Loop-mediated Isothermal Amplification]), diverses
épreuves avec des micro- ou macro-puces utilisant des sondes padlock, des amplifications basées sur un cycle
tournant et d’autres approches moléculaires. Il existe d’autres approches qui sont en cours de développement
pour détecter et analyser les produits de PCR comme MALDI et Luminex. L’avantage de ces approches,
associées avec une PCR multiplexe, est que le typage des différentes souches ou types d’un micro-organisme
est maintenant possible. Il est évident que la gamme des outils du diagnostic moléculaire est renforcée par ces
méthodes.
B. PRINCIPES DE VALIDATION DES ÉPREUVES DE DÉTECTION
DES ACIDES NUCLÉIQUES
Lorsque l’on réalise des analyses sur du matériel clinique, il est important de fournir des données de bonne
qualité. Pour cela, quelques critères clés doivent être remplis. La mise en place de systèmes d’assurance qualité
(AQ) et de contrôle qualité (CQ) est nécessaire, comme par exemple un ensemble de protocoles qualité, incluant
l’utilisation d’échantillons témoins qui assure que le système fonctionne convenablement et confirme la
reproductibilité des données et leur qualité. Les systèmes AQ et CQ, combinés à un personnel compétent et
entraîné, ont déjà été établis dans de nombreux laboratoires de par le monde. Le test de validation est un autre
facteur essentiel pour assurer que les résultats de l’épreuve reflètent le statut réel des échantillons (8).
Pour évaluer la performance d’une épreuve de diagnostic, il est nécessaire d’utiliser une méthode de validation
pour documenter la performance attendue de l’épreuve en question. La validation est une évaluation d’une
épreuve de diagnostic afin de déterminer comment l’épreuve satisfait à une utilisation particulière. Les principes
généraux de la validation d’épreuves peuvent être trouvés dans le Chapitre 1.1.4., « Principes de validation des
méthodes de diagnostic des maladies infectieuses ». Ce chapitre étend ces principes de validation aux épreuves
moléculaires de diagnostic. Pour des explications concernant des termes et des définitions, veuillez consulter le
Chapitre 1.1.4.
C. VALIDITATION D’UNE ÉPREUVE — INTRODUCTION
1.
Choix d’une épreuve adaptée à son emploi futur
Les épreuves de PCR peuvent être adaptées à de nombreux objectifs. Il est en général possible d’utiliser la PCR
chaque fois qu’il faut réaliser la détection directe d’un agent infectieux. Au cours des premières années du
développement des techniques pour le diagnostic par PCR, de nombreux laboratoires ont été confrontés à des
problèmes de performances et de contamination ; la PCR avait donc une mauvaise réputation comme technique
adaptée au diagnostic. Les améliorations de ces dernières années ont inversé cette opinion. Les nouvelles
technologies (par ex : la PCR en temps réel) font que la PCR est moins susceptible de donner de faux résultats
du fait de contaminations et qu’elle est plus facile à réaliser. En outre, l’extraction automatique des acides
nucléiques et les procédures de pipetage automatisées ont considérablement diminué les coûts, amélioré la
répétabilité, et réduit la charge de travail. Pendant les « premières années », de nombreuses épreuves « faites
maison » ont été développées par les laboratoires sans harmonisation ni validation (ou très peu). L’OIE, les
laboratoires nationaux et les Laboratoires de référence de l’Union Européenne (ECRL, European Community
Reference Laboratories) ont un grand rôle à jouer dans la conduite de programmes de validation et
d’harmonisation. Il convient de reconnaître que la technique de PCR telle qu’elle est réalisée à l’heure actuelle est
sûre (les risques de résultats faussement positifs sont considérablement plus faibles), qu’elle est en règle
générale validée sous une forme ou une autre, et bien adaptée aux emplois pour lesquels elle est développée.
Quelques exemples démontrant l’importance de la PCR sont donnés ci-dessous, et les définitions du ou des
objectifs peuvent être trouvées au Chapitre 1.1.4.
•
Permettre le diagnostic quand le titre en anticorps est si faible qu’une exposition à l’agent pathogène ne peut
pas être confirmée par un test sérologique (par ex : le test immuno-enzymatique [ELISA] donnant à
plusieurs reprises des résultats douteux lors de programmes d’éradication de la leucose bovine enzootique).
•
Assurer la distinction entre infection et immunité d’origine maternelle chez les jeunes animaux (par ex : les
veaux lors de programmes d’éradication).
•
Détecter l’acide nucléique (bactérien ou viral) quand les prélèvements pour le diagnostic ne sont pas
compatibles avec l’isolement du fait de leur toxicité (par ex : le sperme, les fœtus momifiés).
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•
Dans les phases finales de programmes d’éradication, quand une recherche approfondie de rares cas est
nécessaire (par ex : en cas de latence avec un herpesvirus ou le dépistage des animaux faiblement réactifs
au cours des programmes d’éradication de la maladie d’Aujeszky).
•
Faire la distinction entre les souches vaccinales et les souches sauvages (stratégie DIVA, differentiating
infected from vaccinated animals).
•
Élaborer les relations phylogénétiques des virus et utiliser ces informations en épidémiologie moléculaire.
•
Permettre un premier diagnostic rapide et sûre lors de l’apparition de foyers (par ex : les foyers d’influenza
aviaire hautement pathogène en 2006).
•
Estimer la charge virale (par ex : dans les infections à circovirus porcin type 2).
•
Dépistage rapide des animaux vaccinés qui semblent présenter des symptômes.
•
Détection d’agents pathogènes mutants résistants aux antibiotiques, etc.
•
Démontrer l’absence d’infection chez les animaux vivants ou les produits d’origine animale. Cependant, il
convient de remarquer que certains animaux infectés peuvent ne pas avoir d’acide nucléique détectable
dans les tissus examinés.
2.
Considérations préliminaires sur le développement d’une épreuve
a)
Précautions et témoins
En raison de l’incertitude en ce qui concerne la sûreté et la fiabilité de la PCR utilisée en routine pour le
diagnostic, des précautions particulières doivent être prises dans les laboratoires utilisant cette technique
pour la détection des agents infectieux afin d’éviter les réactions faussement positives ou faussement
négatives. Ces précautions associées à des témoins internes (imitant les résultats) garantissent une
interprétation correcte des résultats, sans réponses faussement positives dues à des contaminations. Les
témoins internes réels utilisant des « gènes de ménage » rentrent en compétition avec la séquence cible
mais seulement pour les réactifs en excès tels que la polymérase et les nucléotides. Un minimum de
compétition implique que la quantité de la cible soit connue, ce qui n’est pas le cas avec les échantillons de
terrain. Des ARNs « en armure » (Armored RNA®) permet au mime d’être ajouté au cours de l’étape
d’extraction, ce qui permet de savoir si l’extraction a été réalisée avec succès. L’inconvénient de l’utilisation
de « gènes de ménage » comme témoins internes est qu’ils peuvent être présents en grande quantité chez
les agents pathogènes recherchés.
b)
Précautions à prendre pour éviter des résultats faussement positifs
Des réactions faussement positives (échantillons négatifs se révélant positifs lors de la PCR) peuvent
survenir lors de problèmes liés au laboratoire (contaminations croisées) ou de problèmes liés à l’épreuve
elle-même (optimisation insuffisante des performances). Les erreurs proviennent soit du fait d’un transfert de
produit à partir d’un échantillon positif soit, et c’est le cas le plus fréquent, du fait d’une contamination
croisée à partir de produits issus d’expériences précédentes, et divers protocoles et équipements ont été
utilisés pour éviter des réactions faussement positives. Les échantillons et les réactifs doivent être
manipulés dans des hottes à flux laminaire séparées, hottes qui sont par ailleurs régulièrement
décontaminées par des rayons UV (l’utilisation de la lumière ultra-violette exige un bon entretien pour être
efficace) ou de l’eau de Javel. La mise au point et l’utilisation de portoirs et d’instruments pour ouvrir les
tubes peuvent prévenir les résultats faux-positifs (2). En outre, il convient d’appliquer les bonnes pratiques
de laboratoire notamment pour les étapes élémentaires (extraction de l’ADN, préparation du mélange réactif
et des amorces, préparation des échantillons, électrophorèse sur gel d’agarose des produits de
l’amplification, etc.) qui devront être réalisées dans des zones différentes du laboratoire ou dans des locaux
distincts (Fig. 1 ; référence 1, 4, 17). Il faut aussi utiliser des lots différents de pipettes au cours de chaque
étape. L’utilisation d’une pression positive ou de pointes à filtre est recommandée. Les différentes étapes
devraient, dans la mesure du possible, être réalisées par des personnes différentes, chacune d’entre elles
étant confinées à des zones limitées du laboratoire. Le maximum de précautions doit être pris pour éviter
l’introduction de produits d’amplification dans les zones « propres » du laboratoire à partir de zones du
laboratoires potentiellement contaminées en interdisant les échanges de papiers, de matériel, de personnes
ou de tout autre vecteur de contamination. Les mouvements en sens inverse ne devraient être possibles
qu’après décontamination des surfaces, des équipements, des tubes, etc., et après changement des
blouses et des gants. Si l’on suspecte que l’échantillon contient une grande quantité d’agent pathogène ou
d’acide nucléique, il est préférable de le diluer avant son introduction dans les zones « propres » du
laboratoire.
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Figure 1. Organisation recommandée pour un laboratoire réalisant des diagnostics avec des PCR en temps réel.
Les échantillons à tester sont transférés dans la « salle de préparation » pour l’extraction des acides nucléiques. Le mélange
réactionnel pour la PCR est préparé dans la « salle propre » et transféré dans la « salle de préparation » pour réaliser la
répartition dans les plaques de PCR et l’addition de la matrice. Les plaques ou les tubes prêts pour la réaction sont alors
transférés dans la « salle des appareils » pour réaliser la PCR. La « salle propre » n’est utilisée que pour la préparation du
mélange réactionnel de la PCR ; il est interdit d’y introduire de l’ADN ou des produits d’amplification. Il est recommandé de
disposer avant la « salle propre » d’un sas hermétique dans lequel le personnel peut prendre les blouses et les chaussures
uniquement utilisées dans cette salle. La « salle de préparation » ne sert qu’au traitement des échantillons et à la mise en place
de la PCR (avec le mélange réactionnel préparé dans la « salle propre »). Il est interdit d’introduire dans cette salle des produits
d’amplification et rien de ce qui vient de la « salle de préparation » ne doit être introduit dans la « salle propre ». Les thermocycleurs de trouvent dans la « salle des appareils » et aucun produit ne peut retourner de cette salle vers la « salle propre » ou
la « salle de préparation ». Si le laboratoire possède un système de contrôle de la pression de l’air, la « salle propre » doit être
en surpression par rapport aux autres salles. S’il est prévu de réaliser des PCR nichées, il est recommandé d’ajouter 2 autres
salles. Une « deuxième salle de PCR » pour préparer la deuxième réaction de PCR (ce qui implique la manipulation de produits
d’amplification ce qui interdit donc de le faire dans la « salle de préparation), ainsi qu’une « salle d’électrophorèse » pour
l’analyse des produits sur gel d’agarose.
Il est aussi extrêmement important d’inclure des témoins négatifs, par exemple des échantillons semblables
à l’échantillon à tester mais qui ne contiennent pas la cible. Dans les laboratoires qui ont des problèmes de
contaminations croisées, il est recommandé d’inclure au moins un témoin négatif pour 5 échantillons à
tester. En outre, il convient d’inclure en routine des échantillons témoins tant négatifs que positifs dans des
échantillons à tester pour estimer les performances de l’épreuve de PCR.
c)
Précautions à prendre pour éviter des résultats faussement négatifs
La PCR s’est avérée une méthode très efficace pour détecter les acides nucléiques, comme le génome viral
dans des échantillons cliniques. Cependant, dans les phases terminales de l’infection, un animal peut ne
plus héberger d’acide nucléique dans les tissus soumis à l’épreuve. Dans ces cas, les résultats négatifs en
PCR doivent, par conséquent, être considérés comme un élément d’un processus complexe de diagnostic.
Les résultats faux-négatifs (les échantillons contenant l’agent d’intérêt mais détectés comme négatifs)
surviennent majoritairement à cause d’effets inhibiteurs et/ou d’erreurs de pipetage, cependant des
mauvaises manipulations de l’échantillon peuvent aussi être à l’origine de tels résultats. De ce fait, des
témoins internes sont utilisés comme indicateurs d’efficacité de l’épreuve de PCR. Les témoins internes de
PCR peuvent comprendre de l’ADN étranger ajouté à l’échantillon ou de l’ADN ubiquitaire présent
naturellement dans l’échantillon. De l’ADN étranger ajouté à l’échantillon, peut comprendre des mimes
d’ADN ou d’ARN. Les mimes d’ADN, oligonucléotides de synthèse, ont les mêmes séquences de liaison
d’amorce que les cibles de PCR, mais encadrent un fragment d’ADN hétérologue d’une taille différente. Les
séquences de nucléotides identiques de liaison d’amorce permettent la co-amplification de la cible et du
mime dans le même tube avec une compétition minimale. Les différences de taille donnent une
discrimination facile par une analyse en Southern blot. L’Armored RNA®, un concept identique aux mimes
ADN, utilise un fragment d’ARN témoin enveloppé dans des protéines d’enveloppe de bactériophage pour
protéger et stabiliser l’ARN pour le contrôle ou la normalisation des épreuves de RT-PCR (pour plus de
détails sur les témoins, voir ci-dessus).
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Avec les épreuves de PCR en temps réel, il est également possible d’utiliser des témoins internes, un gène
ubiquitaire naturellement trouvé, un fragment sélectionné du génome de l’animal hôte tel que l’actine béta,
GAPDH, ou l’ARN ribosomique. En utilisant en multiplexe un tel témoin intrinsèque coloré avec un
fluorophore rapporteur particulier, il est possible de tester la qualité de l’échantillon et de confirmer
l’efficacité de la PCR, puisque l’agent cible et l’ADN intrinsèque sont détectés simultanément (14).
Les témoins internes (comme les mimes) augmentent la fiabilité du diagnostic par PCR (1, 4). Une
précaution doit être prise lorsque l’on choisit et valide les témoins internes. Un contrôle important est
nécessaire pour s’assurer que l’amplification de PCR du témoin interne ajouté n’entre pas en compétition
avec la PCR du diagnostic et de ce fait ne diminue pas la sensibilité analytique. Les témoins internes sont
utilisés à des concentrations légèrement supérieures à la limite de détection du diagnostic PCR pour
s’assurer de la performance de l’épreuve. Il faut également se rappeler que les témoins internes ont un
inconvénient similaire aux échantillons extrêmement infectés et non représentatifs d’acides nucléiques
cibles et peuvent conduire à des résultats faux-négatifs.
d)
Préparation des étalons
Les laboratoires de référence doivent fournir des échantillons de référence représentatifs d’un agent
infectieux donné. De tels échantillons peuvent être des agents infectieux cultivés ou des prélèvements
cliniques, etc., qui sont distribués de telle sorte que l’agent infectieux soit bien conservé. Ainsi, les
échantillons sont distribués sous forme congelée, dans des solvants organiques (ex. Trizol) ou par d’autres
moyens adaptés. Les échantillons peuvent également être envoyés sous forme d’acides nucléiques
(congelés, déshydratés ou en éthanol). Pour des détails plus spécifiques, il faut se reporter aux chapitres
concernant individuellement les maladies. Les laboratoires de référence doivent également fournir les
mimes appropriés.
La disponibilité d’échantillons de référence est essentielle pour le succès du processus de validation. Il
s’agit, malheureusement, du problème le plus délicat à résoudre lorsque l’on planifie une procédure de
validation. Il ne suffit pas d’utiliser des agents pathogènes cultivés ou des échantillons expérimentaux ; de
vrais échantillons provenant du terrain peuvent présenter des caractéristiques différentes de celles des
échantillons provenant du laboratoire. Il peut être difficile d’obtenir des échantillons du terrain qui soient
vraiment négatifs ou positifs du fait, notamment, que la PCR est généralement considérée comme ayant une
sensibilité analytique supérieure à toutes les méthodes de référence (« gold standard »), ce qui rend difficile
la détermination avec d’autres méthodes du statut des échantillons prévus pour la validation. Comme cela a
été déjà signalé, les laboratoires de référence peuvent fournir de tels échantillons de référence. Une autre
méthode consiste en l’utilisation des méthodes Bayésiennes qui offrent une approche probabilistique pour
valider les tests diagnostics en l’absence de « gold standard » (5) ; ces méthodes ne sont pas abordées plus
avant dans ce chapitre.
D. VALIDATION D’UNE ÉPREUVE — PREMIÈRE ÉTAPE
1.
Optimisation et normalisation des réactifs et détermination des paramètres critiques de
contrôle
La collecte d’échantillon, la préparation et le transport (se reporter au Chapitre 1.1.1., « Prélèvement et expédition
des échantillons pour le diagnostic » de ce Manuel terrestre) et les méthodes d’extraction d’acide nucléique (se
reporter au Chapitre 1.1.7., « Les biotechnologies dans le diagnostic des maladies infectieuses et le
développement des vaccins ») sont tous des paramètres critiques dans la performance d’une épreuve et doivent
être optimisés pour le diagnostic des maladies. Les méthodes adaptées varient en fonction du type d’échantillon
et d’organisme. En général, le sérum sanguin, les tissus et les écouvillons sont des échantillons adaptés à une
extraction facile des acides nucléiques, alors que les échantillons de fèces, les échantillons autolysés et la
semence sont plus difficiles à manipuler. L’extraction des cibles à ARN diffère de l’extraction de cibles à ADN et
l’ARN est plus enclin à la dégradation. Les méthodes commerciales (robotisées, colonnes de centrifugation,
extractions basées sur le magnétisme, etc.) et les méthodes de base reposant sur la chimie sont utilisées pour
l’extraction d’ARN et d’ADN. Il est crucial de déterminer la méthode d’extraction la plus reproductible et efficace
avant de poursuivre la validation d’une épreuve. Si la méthode d’extraction est changée, des données
équivalentes doivent être obtenues ou bien il faut répéter entièrement la procédure de validation.
Tout l’équipement utilisé au cours du processus doit être correctement entretenu. Les appareils (blocs de
chauffage, réfrigérateurs, congélateurs, thermocycleurs, pipettes, etc.) qui nécessitent un étalonnage doivent être
étalonnés en accord avec les protocoles d’assurance qualité du laboratoire. Il aussi important de valider
correctement le matériel et le protocole employé. Un bon exemple en est la généralisation des méthodes
robotisées d’extraction dans les procédures de diagnostic de routine. Il ne suffit pas de comparer les
caractéristiques de cette technique avec celles des autres méthodes d’extraction utilisées. Le robot et le protocole
56
doivent être validés pour vérifier qu’il n’existe pas de risque de contamination croisée, par ex. : travailler sur un
mélange d’échantillons positifs et négatifs.
Au cours du développement d’épreuves de PCR « classique » ou en temps réel, tous les paramètres, protocoles
et réactifs doivent être optimisés. Une épreuve normalisée est une technique qui donne de façon constante le
même résultat à partir d’un échantillon donné quand elle est répétée plusieurs fois et réalisée par du personnel
différent dans des laboratoires différents.
Au cours de l’optimisation de l’épreuve de PCR, il est également possible d’estimer la capacité de la méthode à
ne pas être affectée par de petits changements dans les paramètres principaux. Une documentation sur les
variations intentionnelles au cours de l’exécution d’une épreuve est nécessaire pour caractériser les paramètres
critiques de l’épreuve. Des exemples de tels paramètres incluent : temps et température d’incubation,
concentrations des tampons, des amorces, du MgCl2, du pH, et du taux d’autres composants ajoutés (ex : dNTP,
sérum albumine bovine, etc.). La caractérisation des paramètres critiques de contrôle est cruciale pour identifier
ce qui doit être correctement contrôlés au cours de l’épreuve. Des variations intentionnelles de l’épreuve peuvent
conduire à une estimation préliminaire de la robustesse de l’épreuve.
2.
Répétabilité
Un accord entre les répétitions au sein et entre les réalisations d’une épreuve doit être convenu à cette étape.
Cela donne une information importante sur l’épreuve avant de poursuivre la validation. Si une variabilité
excessive est mise en évidence, elle doit être corrigée avant de continuer le processus de validation.
La répétabilité d’une épreuve de PCR nécessite que chaque réplicat soit traité comme un échantillon
indépendant. Du fait de la variation d’un réplicat (en fait, un triplicat), 3 fractions aliquotes d’un sujet d’analyse de
départ sont préparées et amplifiées, et la variation de la valeur moyenne est déterminée comme un indicateur de
la répétabilité. Il est, par conséquent, inacceptable d’estimer les amplifications des triplicats à partir d’une seule
extraction. De même, les réplicats de plusieurs essais doivent être traités comme des échantillons individualisés.
Cette procédure conduira à des estimations de la variabilité intra- et inter-épreuves. Dans une épreuve de PCR
en temps réel, les valeurs Ct obtenues à partir des échantillons répliqués peuvent être utilisées pour déterminer le
coefficient de variation entre essais (CV ; voir Chapitre 1.1.3., « Gestion de la qualité dans les laboratoires de
diagnostic vétérinaire », section 6.d) « Incertitude »).
Il est important que le sujet d’analyse à détecter par PCR soit dans la même matrice que les échantillons à tester
destinés à être utilisés dans l’épreuve. Si, par exemple, l’épreuve est utilisée pour démontrer l’absence d’un agent
pathogène dans une matrice connue pour ses propriétés inhibitrices dans la PCR (telle que la semence et les
diluants), il est particulièrement important d’évaluer soigneusement la répétabilité.
Quand de nouveaux lots de nucléotides ou d’autres réactifs provenant de nouveaux fabricants sont employés
dans l’épreuve, la répétabilité de l’épreuve doit à chaque fois être établie à nouveau.
3.
Détermination de la spécificité et de la sensibilité analytiques
La sensibilité analytique (ou limite de détection) est définie comme la capacité à distinguer l’agent pathogène
ciblé d’autres agents infectieux. Cette capacité est déterminée par l’analyse d’agents pathogènes génétiquement
apparentés et de matériel clinique obtenus d’animaux atteints par des maladies qui ressemblent à celle pour
laquelle l’épreuve est prévue. Il est préférable d’obtenir des échantillons de terrain à partir d’animaux infectés,
mais cela peut se révéler difficile voire impossible. Dans ces cas, il est possible d’utiliser des virus cultivés sur
cultures cellulaires. Le degré acceptable de réactivité croisée dépend en grande partie de l’objectif poursuivi par
le test et doit être établi pour chaque cas. Il est utile de réaliser des études « par ordinateur » en complément des
estimations par le laboratoire.
La sensibilité analytique (ou limite de détection) est définie comme le plus faible taux d’agent détecté par
l’épreuve, et peut être représentée par le nombre de copies du génome, la dose infectieuse, les unités formant
colonies, les unités formant plaque, etc., de l’agent pathogène qui peut être détecté et distingué d’un résultat nul.
Pour déterminer la sensibilité analytique, une dilution en cascade est utilisée jusqu’à ce que l’épreuve ne puisse
plus détecter la cible en question dans plus de 5 % des replicats. Les fragments clonés des produits de PCR en
question peuvent être utilisés comme échantillons de référence, soit comme ADN ou comme ARN cible, l’ARN
étant transcrit in vitro en ADN. Les estimations de la sensibilité analytique peuvent varier significativement pour la
même épreuve quand différentes matrices échantillons sont utilisées. Lorsqu’on réalise des séries de dilution, il
est important d’employer un diluant dont les qualités sont semblables à la matrice échantillon, par exemple,
dilution d’une semence positive dans de la semence négative et non dans un tampon.
57
E. VALIDATION D’UNE ÉPREUVE — SECONDE ÉTAPE
Les caractéristiques d’exécution (ou paramètres de l’épreuve) apportent les informations sur la façon dont la
méthode fonctionne dans des conditions spécifiques. Quelques unes des caractéristiques d’exécution sont
données dans le Chapitre 1.1.4.
1.
Estimation des performances de l’épreuve
a)
Populations animales de référence
i)
Animaux de référence non infectés / non exposés
Des échantillons réellement négatifs, c’est-à-dire provenant d’animaux qui n’ont pas pu être exposés à
l’agent pathogène sont parfois difficiles à obtenir. Il est souvent possible de récolter des échantillons
dans des pays qui ont éradiqué la maladie en question. Il est important que les échantillons négatifs
soient représentatifs des échantillons qui seront analysés (espèces, âges, sexes, races, etc.).
ii)
Animaux de référence infectés / exposés
Trouver des animaux positifs de référence en nombre suffisant peut poser problème. Des animaux
naturellement ou expérimentalement infectés sont nécessaires dont le statut positif est démontré par
isolement de l’agent pathogène. Avant de recourir à des animaux expérimentalement infectés, voir le
Chapitre 1.1.4.
iii)
Statut de l’animal de référence établi par d’autres épreuves
Le terme « gold standard » est couramment utilisé pour décrire toute épreuve étalon servant à la
comparaison mais devrait être réservé aux méthodes qui classent de façon univoque les animaux en
infectés ou non-infectés. En général, on considère que les nouveaux tests de PCR sont meilleurs que
tous les « gold standard » actuellement existants et le « gold standard » retenu peut, par conséquent,
ne pas être adapté pour la comparaison. Ceci est particulièrement vrai lorsqu’il s’agit de démontrer
qu’un animal négatif de référence est vraiment négatif. La validation des techniques moléculaires en
les comparant à un « gold standard » peut être compliquée du fait que les PCR sont plus sensibles, ce
qui entraîne une spécificité apparente plus faible. Ce problème peut, dans une certaine mesure, être
résolu par une bonne appréciation de l’origine des échantillons, l’historique de la maladie et en
séquençant tous les produits d’amplification de la PCR pour confirmer l’identité de l’agent pathogène.
2.
Détermination du seuil de coupure
La sensibilité du diagnostic (Se-D : proportion d’animaux de référence connus pour être infectés, connus, qui sont
détectés comme positifs dans l’épreuve) et la spécificité du diagnostic (Sp-D : proportion d’animaux de référence
non-infectés et qui sont détectés comme négatifs dans l’épreuve) sont les paramètres les plus importants obtenus
au cours de la validation d’une épreuve. Le nombre d’échantillons de référence requis pour déterminer
l’estimation et l’erreur admissible de la Se-D et la Sp-D peut être calculé. Pour cela, une prédiction raisonnable de
la Se-D et la Sp-D doit être utilisée. Généralement, la confiance dans l’estimation est posée à 95 %. Cependant,
aucune formule ne prend en compte les nombreux facteurs hôte/organisme qui peuvent affecter le résultat d’une
épreuve. Le nombre d’échantillons pour déterminer l’estimation de la Se-D et la Sp-D est indiqué dans le Chapitre
1.1.4. En pratique, il peut être difficile d’obtenir un nombre suffisant d’échantillons pour calculer un intervalle de
confiance satisfaisant, particulièrement dans le cas d’une maladie non endémique ou répandue ; mais avec le
temps, des données supplémentaires améliorent l’estimation du seuil de confiance. L’utilisation d’échantillons
expérimentalement infectés n’est pas appropriée car cela peut ne pas être représentatif d’échantillons
naturellement infectés. Si des échantillons provenant d’animaux naturellement infectés ne sont pas disponibles,
des infections expérimentales réalisées par des moyens qui se rapprochent des infections naturelles peuvent
fournir des échantillons utiles. Un exemple est donné par les maladies transmises par des tiques et pour
lesquelles les animaux sont exposés à des tiques.
Il n’est pas toujours possible de se conformer aux lignes directrices (par ex. : les recommandations de l’OIE pour
la validation des tests). Lorsque l’on ne possède qu’un petit nombre d’échantillons pour une évaluation d’un test
ou en l’absence d’un « gold standard », une approche consiste à déclarer une épreuve moléculaire comme
« partiellement validée » puis à améliorer la validation quand un nombre significatif d’échantillons cliniques est
testé. Dans ce cas, les échantillons positifs sont confirmés par d’autres techniques, telles que l’isolement de
l’agent pathogène en question ou le séquençage ; on vérifie aussi que les échantillons négatifs conviennent à
l’épreuve de PCR (non inhibiteurs) en utilisant les gènes de contrôle. Le principe de cette validation « en cours de
route » permet l’introduction rapide de nouvelles épreuves et la réduction des coûts de la validation. Cette
approche n’est possible que si des tests sur une gamme appropriée de cultures, d’échantillons artificiellement
préparés (pour les données analytiques) et d’échantillons cliniques (pour démontrer que la cible est présente
dans les tissus) apportent des arguments sérieux pour considérer que l’épreuve peut être diffusée comme
« partiellement validée » (15).
58
F. VALIDATION D’UNE ÉPREUVE — TROISIÈME ÉTAPE
1.
Établir la reproductibilité de l’épreuve
La reproductibilité est un paramètre important de la précision d’une épreuve. Elle est déterminée dans plusieurs
laboratoires qui utilisent la même procédure (protocole, réactifs et témoins). Au moins 3 laboratoires réalisent
l’épreuve sur le même panel d’échantillons (un minimum de 20 échantillons), avec des fractions aliquotes
identiques distribuées dans chacun des laboratoires. Cette opération fournira des informations sur la robustesse
de l’épreuve. Les estimations de la reproductibilité sont essentielles avant que l’épreuve puisse être distribuée à
d’autres laboratoires.
À l’heure actuelle, la reproductibilité n’est que rarement évaluée complètement dans les laboratoires de
diagnostic vétérinaire qui réalisent des PCR. Dans le passé, beaucoup de laboratoires ont utilisé des épreuves
mises au point dans ces mêmes laboratoires, vraisemblablement pour des raisons pratiques. Il convient, lorsque
c’est possible, d’appliquer des techniques publiées et normalisées, notamment par les Laboratoires de référence
de l’OIE, les Laboratoires de référence de l’Union Européenne ou les laboratoires nationaux. En outre, des
procédures de validation inter-laboratoires doivent être conduites afin de normaliser les épreuves et d’harmoniser
les activités de diagnostic entre les différents pays.
G. VALIDATION D’UNE ÉPREUVE — QUATRIÈME ÉTAPE
1.
Mise en œuvre du programme
Les Laboratoires de référence jouent un rôle essentiel dans la mise en œuvre de nouvelles épreuves
moléculaires ou d’épreuves déjà existantes en cours de validation. Il est instamment demandé aux Laboratoires
de référence de l’OIE, aux Laboratoires de référence de l’Union Européenne et aux laboratoires nationaux d’aider
à la généralisation de ces épreuves pleines de promesses pour le diagnostic des maladies. Un exemple en est
l’assistance apportée par les laboratoires de l’OIE dans le diagnostic de la grippe aviaire en Europe par des
méthodes moléculaires.
2.
Suivi de la validité des performances de l’épreuve
a)
Interprétation des résultats de l’épreuve — facteurs affectant la validité de l’épreuve
Un facteur essentiel qui affecte l’interprétation des résultats de l’épreuve est la prévalence du sujet
d’analyse dans la population cible. Même une épreuve de PCR très précise et exacte avec une Se-D et une
Sp-D approchant 99 % peut néanmoins conduire à de fausses conclusions (voir Chapitre 1.1.4). En ce qui
concerne les épreuves basées sur les acides nucléiques, les résultats faussement positifs sont
particulièrement préoccupants dans les populations ayant une faible prévalence. Dans ces cas, il peut être
nécessaire de confirmer les résultats positifs en PCR par l’analyse des séquences du produit d’amplification
afin de corriger d’éventuelles erreurs dues à des cibles ou une fixation des amorces non spécifiques.
b)
Maintien des critères de validation
Quand l’épreuve est utilisée en routine, il est important d’assurer un contrôle de qualité interne. L’épreuve
doit donc être suivie et contrôlée constamment pour la répétabilité et l’exactitude. L’OIE recommande que
des estimations de la reproductibilité entre laboratoires (organisation de tests de compétence
inter-laboratoires) soient conduites au moins 2 fois par an (16). Cette procédure est, en général, menée par
un laboratoire de référence qui distribue les panels d’échantillons, récupère les résultats des laboratoires,
analyse les données et rédige un rapport envoyé aux laboratoires. Si une épreuve doit être appliquée dans
une autre région géographique et/ou population, il peut s’avérer nécessaire de revalider ou de documenter
son équivalence dans les nouvelles conditions. La revalidation ou l’équivalence devrait être déterminée si
l’épreuve est appliquée à une matrice différente d’échantillons, par ex. validé sur sang et utilisé sur un autre
tissu, ou validé sur des tissus de bovins et utilisé sur une autre espèce. Des protocoles différents
d’extraction peuvent être nécessaires si des espèces ou des tissus différents sont testés, car certains
peuvent contenir des facteurs inhibiteurs différents. Ceci est particulièrement vrai pour des épreuves PCR
puisqu’il est commun que des mutations ponctuelles surviennent dans de nombreux agents pathogènes (par
exemple les virus à ARN). Les mutations, qui peuvent survenir au sein de sites d’amorces ou de sondes,
peuvent affecter l’efficacité d’une épreuve et de ce fait les critères établis de performance ne sont plus
valides. Il est également recommandé de confirmer régulièrement la séquence cible dans les régions
génomiques sélectionnées pour des isolats nationaux ou régionaux d’agents infectieux. Ceci est
particulièrement vrai pour les sites d’amorce, pour s’assurer qu’ils restent stables et que, de cette manière,
la validation d’une épreuve ne peut pas être mise en question. La validation et l’estimation de la robustesse
59
peuvent nécessiter d’être répétées lorsque l’épreuve est transférée du laboratoire qui le développe vers le
terrain car les conditions peuvent être inférieures aux conditions optimales et le personnel moins bien formé.
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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*
* *
NB : Il existe un Centre collaborateur de l’OIE pour le diagnostic basé sur la biotechnologie des maladies
infectieuses en médecine vétérinaire (se reporter à la liste de la partie 3 de ce Manuel terrestre ou consulter le
site internet de l’OIE pour une liste actualisée : www.oie.int).
60

pcr - OIE

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