La réaction de polymérisation en chaîne - EU

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La réaction de polymérisation en chaîne - EU
Analyse d’échantillons alimentaires pour la
présence d’organismes génétiquement modifiés
Module 6
La réaction de polymérisation en chaîne (PCR)
M. Somma, M. Querci
WORLD HEALTH ORGANIZATION
REGIONAL OFFICE FOR EUROPE
WELTGESUNDHEITSORGANISATION
REGIONALBÜRO FÜR EUROPA
ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTE
BUREAU REGIONAL DE L'EUROPE
ВСЕМИРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ
ЕВРОПЕЙСКОЕ РЕГИОНАЛЬНОЕ БЮРО
La réaction de polymérisation en chaîne (PCR)
2
Table des matières
Module 6
La réaction de polymérisation en chaîne (PCR)
INTRODUCTION
3
CONSTITUANTS, STRUCTURE ET REPLICATION DE L’ADN
3
PRINCIPES DE LA PCR
8
INSTRUMENTATION ET COMPOSANTS POUR LA PCR
12
CONCEPTION DES AMORCES POUR LA PCR
17
PCR SPECIALISEE
22
LA PCR DANS LA PRATIQUE
23
REFERENCES
30
BIBLIOGRAPHIE COMPLEMENTAIRE
32
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La réaction de polymérisation en chaîne (PCR)
3
Introduction
La mise au point de la technique de réaction de polymérisation en chaîne (PCR) par
K. Mullis et ses collaborateurs en 1985 a révolutionné la biologie moléculaire et la
médecine moléculaire (Saiki et al., 1985). La réaction de polymérisation en chaîne
est une technique in vitro utilisée pour amplifier à l’aide d’enzymes une région
déterminée de l’ADN qui se trouve entre deux régions de séquence ADN connue.
Alors qu’autrefois seules de très petites quantités d’un gène spécifique pouvaient
être obtenues, la PCR permet maintenant d’amplifier même une seule copie de gène
à un million d’exemplaires en quelques heures.
Les techniques PCR sont devenues essentielles pour beaucoup de procédures
communes, telles que le clonage de fragments d’ADN spécifiques, la détection et
l’identification de gènes à des fins de diagnostic et en médecine légale ainsi que
dans la recherche sur les modes d’expression génique. Plus récemment, la PCR a
permis l’exploration de nouveaux domaines, tels que le contrôle de l’authenticité de
denrées alimentaires, la présence d’ADN génétiquement modifié et la contamination
microbiologique. Pour comprendre les principes de la PCR et de ses applications, il
faut examiner d’abord la nature de la molécule d’ADN. C’est pourquoi la structure et
la réplication de l’ADN sont décrites dans la section suivante.
Constituants, structure et réplication de l’ADN
Constituants. Une molécule d’ADN est constituée de deux brins complémentaires
enroulés sous forme d’hélice et composés alternativement d’acide phosphorique et
de désoxyribose, reliés transversalement par des bases (purines et pyrimidines),
prenant la forme d’une structure hélicoïdale droite qui porte des informations
génétiques encodées dans la séquence des bases. Dans les cellules eucaryotes, la
majeure partie de l’ADN est contenue dans le noyau et est appelée ADN
chromosomique. Il est séparé du reste de la cellule (cytoplasme) par une double
membrane
(l’enveloppe
nucléaire).
D’autre
part,
les
mitochondries
et
les
chloroplastes contiennent de l’ADN extrachromosomique.
Les éléments constitutifs de l’ADN, appelés nucléotides, sont les suivants:
•
dATP, désoxyadénosine triphosphate;
•
dGTP, désoxyguanosine triphosphate;
•
dTTP, désoxythymidine triphosphate;
•
dCTP, désoxycytidine triphosphate.
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Par commodité, ces quatre nucléotides sont appelés dNTP (désoxynucléoside
triphosphates). Un nucléotide comporte essentiellement les trois parties suivantes:
une base purine (adénine, A, et/ou guanine, G) ou une base de pyrimidine (cytosine,
C, et/ou thymine, T), une molécule de sucre pentose (désoxyribose) et un groupe
triphosphate. Comme le montre la Figure 1, une base purine ou pyrimidine est liée à
un cycle pentose par une liaison N-glucosidique et un groupe phosphate est lié à
l’atome de carbone 5 du sucre par une liaison diester. Dans l’acide ribonucléique,
ARN, la thymine est remplacée par l’uracile (U) et la molécule de désoxyribose est
remplacée par le ribose.
Figure 1. Les composants des nucléotides (image: Andy Vierstraete, 1999)
Structure. La Figure 2 montre comment les nucléotides forment une chaîne d’ADN.
L’ADN se forme par le couplage des nucléotides entre le groupe phosphate d’un
nucléotide (qui est situé sur le cinquième atome C de la molécule de sucre) avec
l’hydroxyle sur le troisième atome C de la molécule de sucre du nucléotide
précédent. À cet effet, un groupe diphosphate se détache (avec libération d’énergie).
Cela signifie que de nouveaux nucléotides sont toujours ajoutés du côté 3' de la
chaîne. La Figure 3 montre que l’ADN est bicaténaire (sauf dans certains virus) et
que les deux brins s’apparient de manière très précise. Chaque base dans un brin
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s’appariera avec un seul type de base dans le brin opposé pour former une paire de
bases (pb): A est toujours apparié à T par deux liaisons hydrogène; C est toujours
apparié à G par trois liaisons hydrogène. De cette façon, les deux chaînes sont
complémentaires entre elles et une chaîne peut servir de modèle pour la production
de l’autre.
Figure 2. Formation d’une chaîne d’ADN à partir des nucléotides (image: Andy
Vierstraete, 1999)
Les bases forment un noyau hydrophobe à l’intérieur de la double hélice. Les sucres
et les groupes phosphate (sous leur forme anionique) constituent la couche
hydrophile externe de la molécule. Dans les conditions physiologiques, l’hélice
d’ADN bicaténaire est plus stable qu’une hélice d’ADN monocaténaire.
Réplication. L’ADN contient l’information génétique complète qui définit la structure
et la fonction d’un organisme. Trois processus différents sont responsables de la
transmission de l’information génétique:
• la réplication;
• la transcription;
• la traduction.
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Figure 3. Structure de l’ADN dans une cellule (image: Andy Vierstraete, 1999)
Au cours de la réplication, un acide nucléique bicaténaire est dupliqué pour donner
des copies identiques. Ce processus perpétue l’information génétique. Lors de la
transcription, un segment d’ADN constituant un gène est lu et transcrit en une
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séquence monocaténaire d’ARN. L’ARN se déplace du noyau vers le cytoplasme.
Enfin, pendant la traduction, la séquence d’ARN est traduite en séquence d’acides
aminés lors de la formation de la protéine (Alberts et al., 1983).
La réplication de l’ADN est le processus sur lequel la PCR est basée, et est décrite
en détail ci-après.
Pendant la réplication, la molécule d’ADN se déroule, chaque brin devenant un
modèle (matrice) pour la synthèse d’un nouveau brin complémentaire. Chaque
molécule fille, consistant en un ancien et un nouveau brin d’ADN, est une copie
exacte de la molécule parent.
Figure 4. La fourche de réplication
Plusieurs enzymes sont nécessaires pour dérouler la double hélice et pour
synthétiser un nouveau brin d’ADN. La topoisomérase et l’hélicase sont
responsables du déroulement de l’ADN par rupture de la structure superenroulée et
coupure d’un seul brin de l’ADN. Ensuite, la primase (une partie d’un agrégat de
protéines
appelé primosome)
fixe
une
petite
amorce
d’ARN
sur
l’ADN
monocaténaire, pour servir d’extrémité 3’OH à partir de laquelle l’ADN polymérase
commence la synthèse. Cette amorce d’ARN est finalement enlevée par la RNase H
et la brèche est comblée par l’ADN polymérase I. À ce stade, l’ADN
polymérase progresse le long d’une molécule monocaténaire d’ADN, incorporant des
dNTP libres pour les lier par liaison hydrogène à leur dNTP complémentaire
approprié sur le brin solitaire (A avec T et G avec C), formant une liaison
phosphodiester covalente avec le nucléotide précédent du même brin. L’énergie
stockée dans le triphosphate est utilisée pour lier de manière covalente chaque
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nouveau nucléotide au deuxième brin en cours de formation. Il y a différentes formes
d’ADN polymérase, mais c’est l’ADN polymérase III qui est responsable de la
synthèse progressive de nouveaux brins d’ADN. L’ADN polymérase n’agit que de 5'
vers 3'. Comme un brin de la double hélice est de sens 5'-3' et l’autre de sens 3'-5',
l’ADN polymérase synthétise une deuxième copie du brin 5'-3' (brin retardé) par
petits fragments (fragments d’Okazaki) (Ogawa et Okazaki, 1980). La synthèse des
nouvelles copies du brin 5'-3' est montrée à la Figure 4. L’autre brin (brin avancé)
peut procéder à la synthèse directement, de 5' vers 3', à mesure que l’hélice se
déroule. L’ADN polymérase ne peut pas commencer à synthétiser ex novo sur un
brin unique nu, mais a besoin d’une amorce avec un groupe 3’OH libre sur lequel il
peut fixer un dNTP.
Une ligase catalyse la formation d’une liaison phosphodiester entre l’hydroxyle en 3’
et le phosphate en 5’. Le trou qui se forme lorsque l’amorce d’ARN est éliminée peut
ainsi être comblé. Il convient de noter que les protéines de liaison monocaténaires
sont importantes pour maintenir la stabilité de la fourche de réplication. Comme
l’ADN monocaténaire est très labile, c’est-à-dire instable, ces protéines s’y
fixent alors qu’il reste monocaténaire, le protégeant ainsi contre la dégradation.
Principes de la PCR
La PCR est basée sur le mécanisme de la réplication de l’ADN in vivo: l’ADN
bicaténaire est déroulé en ADN monocaténaire, puis dupliqué et «réenroulé». Cette
technique comprend les cycles répétitifs suivants:
•
dénaturation de l’ADN par fusion à haute température pour convertir l’ADN
bicaténaire en ADN monocaténaire;
•
hybridation à l’ADN cible de deux oligonucléotides utilisés comme amorces;
•
extension de la chaîne d’ADN par addition de nucléotides à partir des
amorces en utilisant l’ADN polymérase comme catalyseur en présence d’ions
Mg2+.
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Les oligonucléotides consistent généralement en séquences relativement courtes qui
sont
différentes
les
unes
des
autres
et
complémentaires des
sites
de
reconnaissance flanquant le segment d’ADN cible à amplifier. Les étapes de
dénaturation de la matrice, d’hybridation des amorces et d’extension des amorces
constituent un «cycle» dans la méthode de réaction de polymérisation en chaîne. La
Figure 5 illustre les trois étapes principales du processus d’amplification PCR.
Figure 5. Les étapes de l’amplification PCR (image: Andy Vierstraete, 1999)
Après chaque cycle, les brins d’ADN nouvellement synthétisés peuvent servir de
matrices dans le cycle suivant. Comme le montre la Figure 6, le principal produit de
cette réaction exponentielle est un segment d’ADN bicaténaire dont les extrémités
sont définies par les extrémités 5' des amorces d’oligonucléotides et dont la longueur
est définie par la distance entre les amorces. Les produits d’un premier cycle
d’amplification réussi sont des molécules d’ADN de taille hétérogène dont la
longueur peut dépasser la distance entre les sites de fixation des deux amorces.
Dans le deuxième cycle, ces molécules produisent des brins d’ADN de longueur
définie qui s’accumuleront de façon exponentielle lors de cycles d’amplification
ultérieurs et formeront les produits dominants de la réaction. Ainsi, l’amplification, en
tant que nombre final de copies de la séquence cible, est exprimée par l’équation
suivante:
(2n-2n)x
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où n est le nombre de cycles, 2n est le premier produit obtenu après le premier cycle
et le deuxième produit obtenu après le deuxième cycle avec une longueur indéfinie,
et x est le nombre de copies de la matrice originelle. Potentiellement, après 20 cycles
de PCR, il y aura une amplification d’un facteur de 220, en supposant une efficacité
de 100 % pendant chaque cycle. L’efficacité d’une PCR variera d’une matrice à
l’autre et selon le degré d’optimisation atteint.
Une description détaillée des trois étapes de l’amplification PCR (dénaturation de la
matrice, hybridation des amorces et extension) est donnée dans les paragraphes ciaprès (Sambrook et al., 1989).
Figure 6. L’amplification exponentielle de l’ADN dans la PCR
Dénaturation de la matrice
Au cours de la dénaturation, le double brin s’ouvre pour donner de l’ADN
monocaténaire, et toutes les réactions enzymatiques s’arrêtent (c’est-à-dire
l’extension d’un cycle précédent). Les deux chaînes complémentaires sont séparées
par une augmentation de température. C’est ce qu’on appelle la dénaturation. Pour
obtenir la dénaturation de l’ADN, on augmente généralement la température à
environ 93 – 96 °C. De cette façon, les fortes liaisons H sont rompues et le nombre
de bases non appariées augmente. La réaction est complète lorsque tout l’ADN
bicaténaire est devenu de l’ADN monocaténaire. La température à laquelle la moitié
de l’ADN bicaténaire devient monocatenaire est appelée température de fusion, Tf.
Le type de solvant, la concentration de sel et le pH utilisés influencent le processus
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de dénaturation. Par exemple, à faible concentration de sel, à pH élevé et en
présence de solvants organiques tels que le formaldéhyde, la température de fusion
Tf diminue. La concentration de G/C et T/A peut également influencer la valeur de la
Tf. La Tf de la structure de l’ADN contenant une quantité élevée de G/C est
supérieure à celle de l’ADN riche en T/A. Par exemple, Serratia marecescens a une
concentration de G/C approximativement d’environ 60 % et une Tf d’environ 94 °C,
tandis que Pneumococcus a approximativement 40 % de G/C et une Tf d’environ
85 °C.
Hybridation des amorces
L’hybridation, ou réhybridation, des brins d’ADN a lieu à une température plus basse
(généralement 55 – 65 °C). Une fois que la température est abaissée, les deux
chaînes complémentaires d’ADN monocaténaire se reformeront en une molécule
d’ADN bicaténaire. Au cours de cette phase, les amorces se déplacent librement et
des liaisons ioniques sont constamment formées et rompues entre l’amorce
monocaténaire et la matrice monocaténaire. Les liaisons plus stables durent un peu
plus longtemps (amorces qui correspondent exactement à l’ADN matrice) et sur ce
petit morceau d’ADN bicaténaire (matrice et amorce), la polymérase peut se fixer et
commencer à copier la matrice. Une fois que quelques bases sont incorporées, la
liaison ionique est si forte entre la matrice et l’amorce qu’elle ne se rompra pas.
Extension des amorces
Au cours de cette étape, les amorces sont étendues sur la séquence cible en
utilisant une ADN polymérase thermostable (souvent l’ADN polymérase Taq) en
présence de dNTP, ce qui aboutit à une duplication du matériel cible de départ. La
température de travail idéale pour l’ADN polymérase Taq est 72 °C. Lorsque les
amorces ont été étendues de quelques bases, elles possèdent une plus forte
attraction ionique pour la matrice, ce qui réduit la probabilité de survenue du
processus inverse. Les amorces qui ne correspondent pas exactement se détachent
de nouveau (en raison de la température plus élevée) et n’entraînent pas une
extension du fragment. Les bases (complémentaires de la matrice) sont couplées à
l’amorce du côté 3’ (la polymérase ajoute des dNTP de 5’ vers 3’ en lisant la matrice
de 3’ vers 5’). La durée des étapes d’extension des amorces peut être augmentée si
la région de l’ADN à amplifier est longue; cependant, pour la majorité des réactions
PCR, une durée d’extension de 1 minute est suffisante pour obtenir une extension
complète.
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Instrumentation et composants pour la PCR
Instruments
Deux progrès majeurs ont permis d’automatiser le processus de la PCR:
a. L’utilisation d’ADN polymérases thermostables, qui résistent à l’inactivation aux
hautes températures. Ainsi, une partie aliquote initiale de polymérase peut durer
pendant un grand nombre de cycles du protocole.
b. Le développement des bains de température, qui peuvent augmenter et abaisser
rapidement leur température de manière automatisée et programmée. On les
appelle des thermocycleurs ou machines PCR.
Plusieurs types de dispositifs de variation de la température sont utilisés. Par
exemple: chauffage et refroidissement par des fluides, chauffage par résistance
électrique et refroidissement par un fluide, chauffage par résistance électrique et
refroidissement par semi-conducteurs. La Figure 7 montre un profil typique de cycles
de température pour un protocole en trois étapes.
Figure 7. Profil de cycles de température PCR
Les paramètres des cycles de température, comme la dénaturation, l’hybridation des
amorces et l’extension des amorces, déjà mentionnés, ainsi que les composants
utilisés et le nombre de cycles, décrits dans les paragraphes ci-dessous, sont
essentiels pour le succès de la PCR.
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ADN cible
En principe, la PCR peut être effectuée si au moins une copie intacte du gène cible
est présente. Un plus grand nombre de copies cibles améliore la probabilité de
succès l’amplification de l’ADN. Tout dommage, tel qu’une entaille dans l’ADN cible,
bloquera la PCR. La taille de la séquence cible peut se situer entre moins de 0,1 et
quelques kilobases. La quantité totale d’ADN généralement utilisée pour la PCR est
de 0,05 à 1,0 µg, ce qui permet la détection de copies uniques de la séquence cible.
Même si un échantillon ne doit pas être hautement purifié, certains contaminants,
tels que l’héparine, des hèmes, le formol, des chélateurs Mg2+, ainsi que des
détergents, doivent être éliminés pour éviter l’inhibition du processus d’amplification.
Amorces
D’une façon générale, les amorces utilisées ont une longueur de 16–30 nucléotides,
ce qui autorise une température d’hybridation raisonnablement élevée. Les amorces
doivent être exemptes de suites de séquences de polybases (poly-dG, par exemple)
ou de motifs répétitifs, ceux-ci pouvant s’hybrider de manière inadéquate avec la
matrice. Il convient d’éviter les séquences répétées inversées afin d’empêcher la
formation de structures secondaires dans l’amorce, ce qui empêcherait l’hybridation
avec la matrice. Les séquences complémentaires d’autres amorces utilisées dans la
PCR devraient également être évitées afin d’empêcher l’hybridation entre amorces
ou la formation de dimères d’amorce (particulièrement important pour l’extrémité 3’
de l’amorce). Si possible, l’extrémité 3’ de l’amorce devrait être riche en bases de G
et C pour une meilleure hybridation de l’extrémité qui sera étendue. La distance entre
les amorces devrait être inférieure à 10 Kb. En général, on observe une réduction
substantielle du rendement lorsque les amorces sont distantes de plus de 3 Kb
environ. Des oligonucléotides sont généralement utilisés à la concentration de 1 µM
dans la PCR, ce qui est suffisant pour au moins 30 cycles d’amplification. Une
concentration plus élevée d’oligonucléotides peut entraîner l’amplification de
séquences non cibles indésirables. Inversement, la PCR est inefficace lorsque la
concentration d’amorce est trop faible.
ADN polymérase
La méthode PCR originelle utilisait le fragment Klenow de l’ADN polymérase d’E. coli
(Saiki et al., 1985). Toutefois, cette enzyme se dénature à des températures plus
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basses que celle requise pour la dénaturation de la plupart des matrices
bicaténaires. Ainsi, dans les premières expériences, de l’enzyme fraîche devait être
ajoutée à la réaction après chaque cycle. En outre, les échantillons devaient être
déplacés d’un bain de température à un autre pour permettre les différentes étapes
de dénaturation, d’hybridation et de polymérisation. Il est évident que l’utilisation
d’ADN polymérase thermorésistante a facilité le processus, car l’ajout d’enzymes
après chaque étape de dénaturation n’est plus nécessaire. En général, les ADN
polymérases ne peuvent incorporer que des nucléotides de l’extrémité 3’ d’un
polynucléotide. La première ADN polymérase thermostable utilisée était l’ADN
polymérase Taq, isolée dans la bactérie Thermus aquaticus (Saiki et al., 1988). Bien
que cette enzyme soit probablement celle qui est la plus largement utilisée dans les
applications de la PCR, plusieurs autres ADN polymérases sont commercialisées. Le
Tableau 1 indique les propriétés de certains ADN polymérases thermostables
actuellement utilisées pour la PCR (Newton et Graham, 1994).
Tableau 1. Caractéristiques de certaines ADN polymérases utilisées pour la PCR
Source
Application
T½ d’activité à
95 ºC (mn)
Activité
exonucléase
5’ 3’
Activité
exonucléase
3’ 5’
Processivité
Vitesse
d’extension
(nt/s)
Extrémités
d’ADN
résultantes
PM en kDa
Taq/
AmpliTaq®
Vent™
DeepVent™
Pfu
Tth
UITma™
Thermus
aquaticus
Thermococcus
litoralis
Pyrococcus
GB-D
Pyrococcus
Furiosus
Thermus
thermophilus
Thermotoga
maritima
Taq:
AmpliTaq
naturelle:
pour génie
génétique
Pour génie
génétique
Pour génie
génétique
Naturelle
Pour génie
génétique
Pour génie
génétique
40
1380
400
>120
20
>50a
Oui
Non
Non
Non
Oui
Non
Non
Oui
Oui
Oui
Non
Oui
50-60
?
7
?
30-40
?
75
?
>80
60
>33
?
3’A
>95 %
franches
>95 %
franches
?
3'A
franches
94
?
?
92
94
70
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15
ADN polymérase Taq/AmpliTaq®. Comme indiqué plus haut, cette enzyme a été
isolée chez la bactérie Thermus aquaticus, qui vit dans une source thermale dans le
parc national Yellowstone aux États-Unis, à des températures proches de 85 °C. La
température de travail optimale de cette enzyme est de 70–80 °C. À cette
température,
la
bactérie
synthétise
l’ADN
à
une
vitesse
de
35–100
nucléotides/seconde. Le nombre moyen de nucléotides qu’une enzyme incorpore
dans l’ADN avant de se détacher de la matrice est appelé processivité. L’ADN
polymérase AmpliTaq® est une enzyme génétiquement modifiée exprimée par E.
coli. Comme AmpliTaq® est recombinante, la pureté et la reproductibilité de cette
enzyme sont plus élevées que celles du type sauvage. Toutefois, une contamination
potentielle peut se produire pendant l’amplification de l’ADN avec certaines
séquences homologues d’E. coli. Dans ce cas, il est recommandé d’utiliser une ADN
polymérase qui n’a pas été exprimée, avec E. coli comme organisme hôte. Les ADN
polymérases tant Taq qu’AmpliTaq® possèdent une activité exonucléase 5’ 3’, qui
élimine les nucléotides en avant de la chaîne en progression.
ADN polymérases Vent™, DeepVent™, Pfu et UITma™. Ces enzymes ont une
activité exonucléase 3’ 5’ qui permet l’élimination des résidus mésappariés jusqu’à
ce qu’il se forme un terminus à bases correctement appariées. Cependant, l’activité
exonucléase 3’ 5’ peut causer une dégradation des amorces. Par conséquent, il
convient de n’ajouter l’enzyme qu’après que la réaction a commencé ou d’utiliser des
amorces chimiquement modifiées.
ADN polymérase AmpliTaqGold™. Cette enzyme consiste en une ADN
polymérase AmpliTaq inactive à la température ambiante et ne peut être activée
qu’au cours d’une période d’incubation à 94 °C. Dans ce cas, le programme du
thermocycleur devrait comprendre une période de pré-incubation à une température
de 92–95 °C. Pour la PCR « à libération contrôlée », la pré-incubation peut être
éliminée, mais au moins 10 cycles de plus que dans la PCR classique doivent être
exécutés.
Tampons de réaction et MgCl2 dans les réactions PCR
Outre les réactifs qui interviennent directement dans la réaction, la PCR requiert un
tampon approprié. La composition du tampon dépend du type et des caractéristiques
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de l’enzyme utilisée et la plupart des fournisseurs fournissent généralement un
tampon 10x pour utilisation avec l’enzyme respective. Le tampon de réaction le plus
couramment utilisé avec l’ADN polymérase Taq/AmpliTaq® contient:
•
10 mM de Tris, pH 8,3
•
50 mM de KCl
•
1,5-2,5 mM de MgCl2
La présence de cations bivalents dans la PCR est essentielle. La concentration de
MgCl2 dans le mélange de réaction final est généralement de 0,5 à 5,0 mM, et la
concentration optimale est déterminée empiriquement (Innis et Gelfand, 1990).
Les ions Mg2+:
•
forment un complexe soluble avec les dNTP, ce qui est essentiel pour
l’incorporation des dNTP,
•
stimulent l’activité polymérase,
•
augmentent la Tf de l’interaction amorce/matrice (et stabilisent par conséquent
l’interaction entre les deux chaînes).
En général, une faible concentration de Mg2+ conduit à un faible rendement (ou à une
production nulle), alors qu’une concentration de Mg2+ élevée entraîne une
accumulation de produits non spécifiques («mésamorçage»). Il est important d’éviter
la présence, dans la solution d’ADN matrice, d’une concentration élevée de
chélateurs tels que l’EDTA ou de groupes ioniques à charge négative tels que le
phosphate. On trouve dans la littérature actuelle des discussions sur différents
tampons et suppléments PCR, tels que le DMSO, le PEG 6000, le formamide, le
glycérol, la spermidine et des détergents non ioniques, utilisés pour accroître la
spécificité ou l’efficacité de la réaction (Roux, 1995). Certaines ADN polymérases
atteindront en effet leur niveau d’activité optimal (Rolfs et al., 1992) seulement en
présence de ces suppléments.
Désoxyribonucléoside triphosphates
Des désoxyribonucléoside triphosphates libres (dNTP) sont nécessaires pour la
synthèse de l’ADN. Les concentrations de dNTP pour la PCR devraient être de 20 à
200 µM pour chaque dNTP et les quatre dNTP devraient être utilisés à des
concentrations
équivalentes
pour
réduire
au
minimum
les
erreurs
de
mésincorporation (Innis et al., 1988). Des dNTP de grande pureté sont fournis par
plusieurs fabricants sous forme soit de quatre stocks individuels, soit de mélange des
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quatre dNTP. Les solutions de stock de dNTP (généralement 100 mM) devraient être
ajustés à un pH de 7,0–7,5 avec 1 M de NaOH pour que le pH de la réaction finale
ne tombe pas au-dessous de 7,1 (Sambrook et al., 1989); cependant, beaucoup de
solutions de stock de dNTP sont maintenant fournies avec un pH déjà ajusté.
Nombre de cycles et effet plateau
Le nombre de cycles d’amplification nécessaires pour produire une bande visible sur
un gel dépend en grande partie de la concentration initiale d’ADN cible. Pour
amplifier 50 molécules cibles, 40–45 cycles sont recommandés, tandis que 25–30
cycles sont suffisants pour amplifier 3x105 molécules de la même concentration
(Innis et Gelfand, 1990). Cette non-proportionnalité est due à l’effet plateau, qui est
l’atténuation du taux exponentiel d’accumulation de produit dans les dernières étapes
d’une PCR, lorsque le produit atteint 0,3–1,0 nM. Cela peut être dû à la dégradation
des réactifs (dNTP, enzyme), à l’épuisement de réactifs (amorces – problème avec
les produits courts, dNTP – problème avec les produits longs), à l’inhibition du
produit final (formation de pyrophosphate), à la compétition pour les réactifs par les
produits non spécifiques, compétition pour la liaison avec les amorces par
réhybridation du produit concentré (10 nM) (Innis et Gelfand, 1990). Si le produit
désiré n’est pas obtenu en 30 cycles, un petit échantillon (1 µl) du produit amplifié
devra être prélevé, mélangé et ré-amplifié en 20–30 cycles dans un nouveau
mélange réactif, plutôt que d’augmenter le nombre de cycles. Dans certains cas où la
concentration de matrice est faible, cette ré-amplification peut produire un bon
produit, contrairement à la prolongation à 40 cycles ou plus.
Conception des amorces pour la PCR
La conception des amorces est sans doute le paramètre le plus important pour le
succès de la PCR. Toutes choses égales par ailleurs, une amorce mal conçue peut
empêcher le fonctionnement de la réaction PCR. La séquence d’amorce détermine
plusieurs choses, telles que la position et la longueur du produit, sa température de
fusion et finalement le rendement (Innis et Gelfand, 1994). Une amorce mal conçue
peut conduire à une production faible, voire nulle, en raison d’une amplification non
spécifique et/ou à la formation de dimères d’amorce, qui peuvent devenir
suffisamment
compétitifs
pour
inhiber
la
formation
de
produit.
Cette note
d’application a pour but d’établir des règles dont il convient de tenir compte lors de la
Analyse d’échantillons alimentaires pour la présence d’organismes génétiquement modifiés
Module 6
La réaction de polymérisation en chaîne (PCR)
18
conception d’amorces pour la PCR. Ce sujet est traité plus en détail dans d’autres
publications (Dieffenbach et al., 1995).
Sélection des amorces
Plusieurs variables doivent être prises en considération lors de la conception des
amorces pour la PCR. En voici quelques-unes des plus importantes:
•
longueur de l’amorce,
•
température de fusion (Tf),
•
spécificité,
•
séquences d’amorce complémentaires
•
teneur en G/C et suites polypyrimidine (T, C) ou polypurine (A, G),
•
séquence à l’extrémité 3’.
Chacun de ces éléments essentiels est examiné dans les sections suivantes.
Longueur de l’amorce
Comme la spécificité, la température et le temps d’hybridation dépendent en partie
de la longueur de l’amorce, ce paramètre est essentiel pour le succès de la PCR. En
général, les oligonucléotides entre 18 et 24 bases sont extrêmement spécifiques de
la séquence, à condition que la température d’hybridation soit optimale. La longueur
de l’amorce est également proportionnelle à l’efficacité de l’hybridation. En général,
plus l’amorce est longue, moins l’hybridation est efficace. Le nombre de matrices
amorcées diminuant à chaque étape, cela peut aboutir à une diminution sensible de
produit amplifié. Les amorces ne devraient toutefois pas être trop courtes, à moins
que l’application l’exige spécifiquement. Comme indiqué ci-dessous, l’objectif est de
concevoir une amorce dont la température d’hybridation est d’au moins 50 °C.
La relation entre la température d’hybridation et la température de fusion est l’une
des «boîtes noires» de la PCR. Une règle générale est d’utiliser une température
d’hybridation qui est 5 °C plus basse que la température de fusion. Souvent, la
température d’hybridation déterminée de cette façon ne sera pas optimale et il faudra
procéder empiriquement pour déterminer la température optimale. À cet effet, le plus
facile est d’utiliser un thermocycleur à gradient.
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Module 6
La réaction de polymérisation en chaîne (PCR)
19
Température de fusion (Tf)
Il est important de se rappeler que deux amorces sont ajoutées à une PCR dirigée
sur un site ou une cible. Les deux amorces d’oligonucléotides doivent être conçues
de sorte qu’elles aient des températures de fusion semblables. Si les amorces ne
concordent pas en termes de Tf, l’amplification sera moins efficace ou peut ne pas
fonctionner du tout, car l’amorce avec la Tf la plus élevée haut va mésamorcer aux
basses températures et l’amorce avec la Tf plus basse peut ne pas fonctionner aux
hautes températures. Les températures de fusion des oligonucléotides sont
déterminées le plus exactement à l’aide de calculs thermodynamiques du type «plus
proches voisins» avec la formule suivante:
Tfamorce = ∆H [∆S+ R ln (c/4)] -273.15°C + 16.6 log 10 [K+]
(2)
où H est l’enthalpie et S est l’entropie pour la formation de l’hélice, R est la constante
molaire des gaz et c est la concentration d’amorces.
Le plus simple est d’utiliser les logiciels de conception d’amorces déjà disponibles
sur le marché (Sharrocks, 1994). Heureusement, une bonne approximation de cette
valeur (généralement valide pour les oligonucléotides de 18–24 bases) peut être
obtenue à l’aide de la formule suivante:
Tf = 2(A+T) + 4(G+C)
(3)
où A, T, G et C sont les bases purine et pyrimidine.
Au Tableau 2 figurent des valeurs calculées pour des amorces de différentes
longueurs à l’aide de cette équation (appelée formule de Wallace) et en supposant
une teneur en GC de 50 % (Suggs et al., 1981).
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Module 6
La réaction de polymérisation en chaîne (PCR)
20
Tableau 2. Calcul de la température de fusion des amorces avec l’équation de
Wallace
Longueur de
l’amorce
Tf = 2 (A+T) + 4(G+C)
Longueur de
l’amorce
Tf = 2 (A+T) + 4(G+C)
4
12 °C
22
66 °C
6
18 °C
24
72 °C
8
24 °C
26
78 °C
10
30 °C
28
84 °C
12
36 °C
30
90 °C
14
42 °C
32
96 °C
16
48 °C
34
102 °C
18
54 °C
36
108 °C
20
66 °C
38
114 °C
Les températures calculées à l’aide de la règle de Wallace sont imprécises pour les
valeurs extrêmes de ce Tableau. Lors du calcul des températures de fusion des
amorces, il convient de veiller à ce que la température de fusion du produit est
suffisamment basse pour obtenir une fusion de 100 % à 92 °C. Bien que ce
paramètre contribue à assurer une PCR plus efficace, il n’est pas toujours
nécessaire pour le succès de la PCR. En général, les produits entre 100 et 600
paires de base sont efficacement amplifiés dans de nombreuses réactions PCR. En
cas de doute, la Tf du produit peut être calculée à l’aide de la formule suivante:
Tf =81.5 + 16.6 (log10[K+] + 0.41 (%G+C)-675/longueur
(4)
Spécificité
Comme mentionné plus haut, la spécificité de l’amorce dépend au moins
partiellement de la longueur de l’amorce. Il est évident qu’il y a beaucoup plus
d’oligonucléotides uniques à 24 paires de bases qu’à 15 paires de bases. Ceci dit,
les amorces doivent être choisies de telle sorte qu’elles aient une séquence unique
dans l’ADN matrice qui doit être amplifié. Une amorce conçue avec une séquence
hautement répétitive conduira à une traînée lors de l’amplification d’ADN génomique.
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La réaction de polymérisation en chaîne (PCR)
21
Toutefois, la même amorce peut donner une bande unique si un clone unique d’une
bibliothèque génomique est amplifié. Comme l’ADN polymérase Taq est active dans
une large gamme de températures, l’extension de l’amorce se produira aux basses
températures d’hybridation. Si la température est trop basse, un amorçage non
spécifique peut se produire, qui peut être étendu par la polymérase s’il y a
une homologie courte à l’extrémité 3’. En général, une température de fusion de 55–
72 °C donne les meilleurs résultats (à noter que cela correspond à une longueur
d’amorce de 18–24 bases avec la règle de Wallace).
Séquences d’amorce complémentaires
Les amorces doivent être conçues absolument sans aucune homologie intra-amorce
au-delà de 3 paires de bases. Si une amorce possède une telle région d’autohomologie, des structures partiellement doubles brin en «épingles à cheveux»
peuvent se former, qui perturberont l’hybridation avec la matrice. Un autre risque
connexe est l’homologie inter-amorce. L’homologie partielle dans les régions
centrales de deux amorces peut interférer avec l’hybridation. Si l’homologie se situe
à l’extrémité 3’ de l’une ou de l’autre amorce, la formation de dimères d’amorce se
produira, ce qui, par compétition, empêchera le plus souvent la formation du produit
désiré.
Teneur en G/C et suites polypyrimidine (T, C) ou polypurine (A, G)
Les amorces devraient être composées à 45-55 % de GC. La séquence d’amorce
doit être choisie de telle sorte qu’il n’y ait aucune suite poly-G ou poly-C pouvant
promouvoir une hybridation non spécifique. Les suites poly-A and poly-T doivent
également être évitées, car elles «respireront» et ouvriront des parties du complexe
amorce-matrice. Cela peut réduire l’efficacité de l’amplification. Les suites
polypyrimidine (T, C) et polypurine (A, G) devraient également être évitées.
Idéalement, l’amorce présentera un mélange presque aléatoire de nucléotides, une
teneur de 50 % en GC et une longueur d’environ 20 bases. La Tf se situera alors
entre 56 et 62 °C (Dieffenbach et al., 1995).
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22
Séquence à l’extrémité 3’
Il est établi que la position terminale 3’ dans les amorces PCR est essentielle pour
empêcher le mésamorçage. Le problème des homologies d’amorce se produisant
dans ces régions a déjà été examiné. Une autre variable à considérer est l’inclusion
d’un résidu G ou C à l’extrémité 3’ des amorces. Ce « crampon GC » contribue à la
fixation correcte à l’extrémité 3’ en raison de la liaison hydrogène plus forte des
résidus G/C. Cela contribue également à une plus grande efficacité de la réaction en
réduisant au minimum la «respiration» qui pourrait se produire.
PCR spécialisée
Outre l’amplification d’une séquence d’ADN cible par les procédures PCR habituelles
déjà décrites, plusieurs types spécialisés de PCR ont été mis au point pour des
applications spécifiques.
PCR nichée
Des séries d’amorces successives peuvent être utilisées pour améliorer le
rendement PCR de la séquence d’ADN cible (Newton et Graham, 1994). La PCR
nichée est effectuée en 15 à 30 cycles avec une série d’amorces, puis en 15 à 30
cycles supplémentaires avec une deuxième série d’amorces, pour une région interne
du premier produit ADN amplifié. Ainsi, le plus grand fragment produit lors des
premiers cycles de la PCR est utilisé comme matrice pour la seconde PCR. La PCR
nichée peut augmenter considérablement la sensibilité et la spécificité de
l’amplification de l’ADN. La spécificité est particulièrement améliorée parce que cette
technique élimine presque toujours tout faux produit d’amplification non spécifique.
Cela est dû au fait qu’après la première PCR il est peu probable que les produits non
spécifiques soient suffisamment complémentaires des amorces successives pour
pouvoir servir de matrice pour une amplification supplémentaire, la séquence cible
désirée étant dès lors amplifiée préférentiellement. Toutefois, le risque accru de
contamination est un inconvénient de cette sensibilité extrême et l’exécution de ces
PCR doit avoir lieu avec le plus grand soin, particulièrement en laboratoire
diagnostique.
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23
PCR multiplex
Alors que la PCR standard utilise généralement une paire d’amorces pour amplifier
une séquence spécifique, la PCR multiplex utilise des paires multiples d’amorces
pour amplifier simultanément un grand nombre de séquences. La présence de
nombreuses amorces PCR dans un seul tube pourrait poser beaucoup de
problèmes, tels que la formation accrue de produits PCR mésamorcés, de dimères
d’amorce et la discrimination d’amplification de fragments d’ADN plus longs (Atlas et
Bey, 1994).
Pour ce type d’amplification PCR, on choisit des amorces ayant des températures
d’hybridation semblables. Les longueurs des produits amplifiés devraient être
semblables; de grandes différences de longueur des ADN cibles favoriseront
l’amplification de la cible courte par rapport à la cible longue, ce qui aboutit à des
différences de rendement de produits amplifiés. En outre, les tampons utilisés pour la
PCR multiplex contiennent la polymérase Taq, qui diminue la compétition entre les
amplicons et la discrimination de fragments d’ADN plus longs pendant la PCR
multiplex.
Les produits de la PCR multiplex peuvent subir une hybridation supplémentaire avec
une sonde spécifique du gène pour vérification.
La PCR dans la pratique
Comme déjà indiqué dans les sections précédentes, la PCR est une puissante
technique analytique et préparatoire qui est largement utilisée. Cependant, en raison
de la nature de cette procédure, des traces de contaminants de l’ADN pourraient
servir de matrices, ce qui conduirait à l’amplification du mauvais acide nucléique
cible (faux positifs). Par conséquent, il est essentiel d’effectuer l’amplification PCR
dans un environnement exempt d’ADN. Les zones de travail physiquement séparées
et dotées d’équipements spécialisés réduisent le risque de contamination. Le respect
strict des exigences en matière de décontamination (décontamination des acides
nucléiques, prévention des aérosols, etc.) est la condition préalable la plus
importante pour réduire au maximum le taux de faux positifs. La contamination PCR
peut provenir de plusieurs sources:
•
paillasses de laboratoire, équipements et dispositifs de pipetage, qui peuvent
être contaminés par des préparations ADN précédentes ou par des fragments
de restriction épurés,
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•
contamination croisée entre échantillons,
•
produits d’amplifications PCR précédentes.
24
Cette section contient un certain nombre de recommandations, le but étant de définir
les exigences habituelles pour l’établissement et l’entretien d’un environnement
propre pour tout système de dosage basé sur la PCR, indépendamment du nombre
d’échantillons traités (Roth et al., 1997).
Méthodes physiques de prévention
Équipements de laboratoire. Afin d’éviter une contamination, des zones de travail
physiquement séparées devront être établies de la manière suivante.
1. Zone de préparation des échantillons
Cette pièce consiste en une zone où ont lieu toutes les étapes précédant
l’amplification de l’ADN matrice (par exemple, isolement et purification de l’ADN).
2. Zone de préparation de la PCR
Cette pièce «propre» est consacrée aux procédures de préparation de la PCR
(par exemple, mastermix, dilution des amorces, etc.).
3. Zone post-PCR
La zone est consacrée à l’amplification de la séquence d’ADN cible ainsi qu’à la
détection et à l’analyse des produits PCR.
En outre, il convient de respecter les règles générales suivantes.
•
Toutes les pièces doivent contenir des équipements spécialisés (tabliers, gants,
réactifs et fournitures).
•
Les réactifs et appareils doivent être étiquetés avec indication du contenu et de la
date de préparation.
•
Utiliser un système de flux unidirectionnel, c’est-à-dire ne jamais transférer des
matières, des échantillons ou des équipements des zones post-PCR vers les
zones pré-PCR.
•
Utiliser des tubes PCR jetables qui sont exempts de DNase et de RNase.
•
Utiliser des embouts de pipette spéciaux résistants aux aérosols et un ensemble
de pipettes réservé exclusivement à la PCR, de préférence des pipettes à
déplacement positif.
•
Si possible, préparer la PCR sous une hotte d’aspiration équipée d’un éclairage
UV. Sous la hotte d’aspiration, placer une microcentrifugeuse et des gants
jetables utilisés uniquement pour la PCR.
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•
25
Laver périodiquement les paillasses et les étagères à l’eau de Javel à 10 %, puis
à l’éthanol à 70 %.
Manipulation des échantillons
•
Toujours utiliser des techniques stériles et porter des gants neufs lors du travail
dans les zones décrites précédemment. Changer les gants fréquemment,
particulièrement si on suspecte qu’ils ont été contaminés par des solutions
contenant l’ADN matrice.
•
Toujours utiliser des ustensiles en verre/plastique et des pipettes neufs ou
stérilisés pour la préparation des réactifs PCR et de l’ADN matrice.
•
Stériliser à l’autoclave tous les réactifs et solutions qui peuvent subir ce
traitement sans problème pour leur performance. Bien sûr, les amorces, les
dNTP et l’ADN polymérase Taq ne devront pas être stérilisés à l’autoclave.
•
Avoir à disposition son propre ensemble de réactifs et de solutions PCR qui ne
sont utilisés que pour la PCR, et stocker ces réactifs en petites parties aliquotes.
•
Lors du pipetage d’ADN, éviter de créer des aérosols qui peuvent transporter des
contaminants.
•
Toujours prévoir des réactions de contrôle, par exemple un contrôle négatif («pas
d’ADN») qui contient tous les composants de la réaction sauf l’ADN matrice, et
un contrôle positif qui a été utilisé avec succès dans des PCR antérieures.
Méthodes biochimiques de prévention
Uracile-ADN glycosylase. La PCR peut amplifier un milliard de fois une seule
molécule. Par conséquent, même des quantités infimes d’un contaminant peuvent
être amplifiées et conduire à un faux positif. Ces contaminants sont souvent des
produits d’amplifications PCR antérieures (contamination par transfert). C’est
pourquoi des méthodes permettant d’éviter cette contamination ont été mises au
point.
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La réaction de polymérisation en chaîne (PCR)
26
Une méthode couramment utilisée consiste à substituer le dUTP au dTTP pendant
l’amplification PCR pour produire de l’ADN contenant de l’uracile (U-ADN) (Longo et
al., 1990). Le traitement des mélanges PCR par l’uracile-ADN glycosylase (UNG)
avant l’amplification PCR, suivi du clivage des polynucléotides pyrimidine à haute
température (95 °C) dans des conditions alcalines (pendant l’étape de dénaturation
initiale) débarrassera l’échantillon de l’U-ADN contaminant (voir Figure 8).
Figure 8. Réaction à l’uracile-ADN glycosylase
Cette méthode exige bien sûr que toutes les PCR dans le laboratoire soient
effectuées avec le dUTP au lieu du dTTP.
Remarques concernant l’utilisation de produits PCR contenant du dUTP dans les
applications en aval:
•
les performances des produits PCR contenant du dUTP sont aussi bonnes que
celles des produits contenant du dTTP lorsqu’ils sont utilisés comme cibles
d’hybridation ou comme matrices pour le séquençage didésoxy;
•
les produits PCR contenant du dUTP peuvent être clonés directement s’ils sont
transformés en hôtes bactériens reconnaissant l’UNG;
•
un substrat contenant du dUTP est aisément digéré par certaines enzymes de
restriction courantes (EcoR I et BamH I, par exemple), tandis que d’autres
présentent une activité réduite (Hpa I, Hind II, Hind III, par exemple) sur ces
substrats;
•
l’utilisation d’ADN contenant du dUTP n’est pas recommandée pour les études
sur la fixation des protéines ou les interactions ADN-protéines.
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Module 6
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27
DNase I, exonucléase III. D’autres méthodes biochimiques sont basées sur le
traitement de l’ADN contaminé par la DNase I, l’exonucléase III ou par une enzyme
de restriction contenant une séquence de reconnaissance dans l’ADN cible.
Cependant, en raison des strictes conditions de réaction exigées, ces enzymes
présentent l’inconvénient de réduire l’efficacité de l’amplification PCR.
Préparation du mélange pour la réaction PCR (mastermix)
Les composants réactifs essentiels pour la PCR sont l’eau, le tampon de réaction,
une
ADN
polymérase
thermostable,
des
amorces
d’oligonucléotides,
des
désoxynucléotides (dNTP), de l’ADN matrice (cible) et des ions magnésium (Mg2+).
En général, tous les réactifs (sauf l’ADN matrice) sont mélangés dans un seul tube
en quantités suffisantes pour le nombre de réactions à effectuer (mastermix). Le
mastermix est ensuite réparti en parties aliquotes dans plusieurs tubes et l’ADN
matrice est ajouté. L’utilisation d’une solution mastermix réduit le risque de
contamination et améliore la performance de la réaction PCR pour les raisons
suivantes:
•
une qualité uniforme de la solution est garantie pour tous les réactifs pour une
série d’analyses,
•
le risque de contamination du parent et des solutions résultantes est réduit,
•
de plus grands volumes peuvent être prélevés par pipette,
•
les pipetages sont moins nombreux, ce qui fait gagner du temps.
Le succès de l’amplification de la région d’intérêt dépend de la quantité et de la
qualité de l’ADN matrice. La quantité de matrice nécessaire dépend de la complexité
de l’échantillon d’ADN. Étant donné que la taille du génome nucléaire varie d’un
organisme à l’autre, la concentration en ADN doit être maintenue constante
(généralement 10 ng/µl). Au Tableau 3 figure une comparaison de la taille du
génome d’espèces végétales fréquemment utilisées dans la transformation de
plantes et du nombre correspondant de copies du génome dans une quantité définie
d’ADN.
Par exemple, dans un plasmide de 4 kb contenant un insert de 1 kb, 25 % de l’ADN
de départ constituent la cible d’intérêt. Inversement, un gène de 1 kb dans le génome
du maïs (5 x 109 pb) représente approximativement 0,00002 % de l’ADN de départ.
Environ 1 000 000 plus d’ADN génomique de maïs est nécessaire pour maintenir le
même nombre de copies cibles par réaction. Pour des résultats optimisés, plus de
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La réaction de polymérisation en chaîne (PCR)
28
104 copies de la séquence cible doivent être utilisées comme matrice initiale pour
obtenir un signal en 25–30 cycles.
Tableau 3. Comparaison de la taille du génome de certaines espèces végétales et
copies correspondantes du génome dans une quantité définie d’ADN
Échantillon
Taille du
Copies du génome dans
Copies du génome dans
génome
1 µg d’ADN
1 ng d’ADN
Maïs
5 x 109 pb
1,85 x 105
185
Soja
1,55 x 109 pb
5,98 x 105
598
2,43 x 10
5
245
2,31 x 10
6
2 310
Tabac
Riz
9
3,8 x 10 pb
8
4 x 10 pb
Même si, dans la pratique, moins de 10 copies d’une séquence cible peuvent être
amplifiées, dans ce cas davantage de cycles PCR peuvent être nécessaires pour
détecter un signal par électrophorèse sur gel. Les protocoles généraux couramment
appliqués considèrent un certain nombre de cycles de 30 à 40. Il convient d’être
prudent lorsqu’on augmente encore le nombre de cycles, car cela peut accroître
l’amplification non spécifique.
Contrôles
Comme indiqué dans la section précédente, on trouve des sources potentielles de
contamination partout dans le laboratoire. Les échantillons, le personnel du
laboratoire, la climatisation, les équipements et les réactifs peuvent tous être une
source de contamination. Parmi les agents contaminants, on peut citer les suivants:
1. contamination par transfert d’ADN cible amplifié lors de PCR antérieures;
2. contamination croisée entre échantillons, ce qui conduit au transfert d’ADN cible
d’un échantillon à l’autre;
3. ADN génomique de préparations d’échantillons antérieures;
4. produits de dégradation de réactions de décontamination.
Alors que les trois premières formes de contamination produisent des faux positifs, le
dernier type conduit à des faux négatifs. Cette forme de contamination, observée
pour la première fois par Niederhauser et collaborateurs en 1994, provoque
l’inhibition des réactions PCR (Niederhauser et al., 1994). En fait, la décontamination
selon la méthode UNG favorise la formation de complexes avec les amorces.
Analyse d’échantillons alimentaires pour la présence d’organismes génétiquement modifiés
Module 6
La réaction de polymérisation en chaîne (PCR)
29
Pour obtenir des résultats fiables, des contrôles tant positifs que négatifs doivent
toujours être utilisés pendant une réaction PCR. Le Tableau 4 indique quelques-uns
des contrôles les plus couramment utilisés pour assurer la performance des
procédures d’amplification d’acide nucléique.
Tableau 4. Contrôles à introduire dans les tests basés sur la PCR
Contrôle
Méthode
Contamination des réactifs par l’ADN Contrôle négatif sans
cible
(seulement mastermix)
Spécificité de la réaction
ADN
matrice
Contrôles pour trouver les
secondaires et non spécifiques
produits
Développement et sensibilité de la Contrôles positifs/négatifs pour vérifier que
réaction
les conditions et les rendements désirés
sont obtenus
Intégrité du mélange PCR
Contrôle positif pour l’ADN
Contrôles positifs
L’efficacité de l’extraction de l’ADN et de son amplification doit être vérifiée au moyen
de contrôles positifs. Idéalement, les limites de détection devraient être données en
tant qu’équivalents génomiques, ce qui permettrait la production de contrôles à
sensibilité définie, avec de petits nombres de copies. En règle générale, il faut
disposer d’une préparation de référence contenant une concentration connue de
l’ADN cible à l’étude.
Contrôles négatifs
Une contamination (transfert de produits ou acides nucléiques amplifiés) peut se
produire pendant l’isolement et la purification de l’ADN cible, ainsi que pendant la
préparation du mélange de la réaction d’amplification. Il est donc nécessaire
d’ajouter un contrôle négatif au mélange de la réaction d’amplification.
Analyse d’échantillons alimentaires pour la présence d’organismes génétiquement modifiés
Module 6
La réaction de polymérisation en chaîne (PCR)
30
Références
Alberts, B., Bray, D., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K. and Watson, J.D. (1983).
Molecular biology of the cell. Garland Publishing, Inc., New York.
Atlas, R.M. and Bej, A.K. (1994). Polymerase Chain Reaction. In: Gerhardt, P.,
Murrey, R.G.E., Wood, W.A. and Krieg, N.R., (Eds.) Methods for general and
molecular bacteriology. Washington, D.C.: American Society for Microbiology, pp.
418–435.
Dieffenbach, C.W., Lowe, T.M.J. and Dveksler, G.S. (1995). General Concepts for
PCR Primer Design. In: Dieffenbach, C.W, and Dveksler, G.S. (Eds.) PCR
Primer: a Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, NY, USA, pp. 133–155.
Innis, M.A. and Gelfand, D.H. (1990). Optimization of PCRs. In: Innis, M.A., Gelfand,
D.H., Sninsky, J.J., and White, T.J. (Eds.) PCR Protocols: a Guide to Methods
and Applications. New York: Academic Press, pp. 3–12.
Innis, M.A., and Gelfand, D.H. (1994). Optimization of PCRs. In: Innis, M.A., Gelfand,
D.H., Sninsky, J.J., and White, T.J. (Eds.) PCR Protocols: a Guide to Methods
and Applications. London: CRC Press, pp. 5–11.
Innis, M.A., Myambo, K.B., Gelfand, D.H. and Brow, M.A. (1988). DNA sequencing
with Thermus aquaticus DNA polymerase and direct sequencing of polymerase
chain reaction-amplified DNA. Proceedings of the National Academy of Science
USA 85, 9436-9440.
Longo, M.C., Berninger, M.S. and Hartley, J.L. (1990). Use of uracil DNA glycosylase
to control carry-over contamination in polymerase chain reaction. Gene 93, 125–
128.
Newton, C.R. and Graham, A. (1994). PCR. BIOS Scientific Publishers, Limited,
Oxford.
Analyse d’échantillons alimentaires pour la présence d’organismes génétiquement modifiés
Module 6
La réaction de polymérisation en chaîne (PCR)
31
Niederhauser, C., Höfelein, C., Wegmüller, B., Lüthy, J. and Candrian, U. (1994).
Reliability of PCR Decontamination Systems. PCR Methods and Applications 4,
117–123.
Ogawa, T. and Okazaki, T. (1980). Discontinuous DNA replication. Annual Review of
Biochemistry 49, 421–457.
Roux, K.H. (1995). Optimization and troubleshooting in PCR. PCR Methods and
Applications 4, 185-194.
Rolfs, A., Schuller, I., Finckh, U. and Weber-Rolfs, I. (1992). Substances affecting
PCR: Inhibition and enhancement, 51-58. In: PCR: Clinical diagnostics and
research, Springer.
Roth, A., Mauch, H. and Göbel, U. (1997). Nucleic Acid Amplification Techniques –
Recommendations for Employing Molecular Methods in Diagnostic Routine
Microbiology Laboratories and Measures for Internal Quality Assurance. Gustav
Fischer Verlag, Stuttgart.
Saiki, R.K., Scharf, S.J., Faloona, F., Mullis, K.B., Horn, G.T., Erlich, H.A. and
Arnheim, N. (1985). Enzymatic amplification of ß-globin genomic sequences and
restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 230, 1350.
Saiki, R.K. et al. (1988). Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a
thermostable DNA polymerase. Science 239, 487.
Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989). In vitro Amplification of DNA by
the Polymerase Chain Reaction. In: Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T.
(Eds.) Molecular Cloning: a Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, chapter 14.
Sharrocks, A.D. (1994). The design of primers for PCR. In: Griffin, H.G. and Griffin,
A.M (Eds.) PCR Technology: Current Innovations. London: CRC Press, pp. 5–11.
Analyse d’échantillons alimentaires pour la présence d’organismes génétiquement modifiés
Module 6
La réaction de polymérisation en chaîne (PCR)
32
Suggs, S.V., Hirose, T., Miyake, E.H., Kawashima, M.J., Johnson, K.I., and Wallace,
R.B. (1981). Using Purified Genes. In ICN-UCLA Symp. Developmental Biology,
Vol. 23, Brown, D.D. Ed., Academic Press, New York, 1981, 683.
Bibliographie complémentaire
Gayer-Herkert, G., (1992). Molekularbiologische Methoden für den Nachweis von
Mikroorganismen in Mischpopulationen – eine Literaturstudie. Bioengineering 5 +
6, 55–64.
Horton, H., Moran, L., Ochs, R., Rawn, J. and Scrimgeour, K., (1994). Principes de
Biochimie. De Boeck – Wesmael, S.A., Bruxelles.
Knippers, R. (1995). Molekulare Genetik. Georg Thieme Verlag, Stuttgart.
Kwok, S., Kellog, D.E., McKinney, N., Spasic, D., Goda, L., Levenson, C. and
Sninsky, J.J. (1990). Effects of primer-template mismatches on the polymerase
chain reaction: Human Immunodeficiency Virus 1 model studies. Nucleic Acids
Research 18, 999–1005.
Larzul, D. (1993). Le PCR: un procédé de réplication in vitro. Tec & Doc-Lavoisier,
Paris.
Stryer, L. (1991). Biochemie. Spektrum Akademischer Verlag, GmbH, Heidelberg.
Watson, D.J., Hopkins, N., Roberts, J., Steitz, J. and Weiner, A. (1988). Molecular
Biology of the Gene. The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., New
York.
Analyse d’échantillons alimentaires pour la présence d’organismes génétiquement modifiés
Module 6