Universite de la mediterranee la degradation du materiel organique

Transcription

UNIVERSITE DE LA MEDITERRANEE
Centre d'Océanologie de Marseille
Observatoire des Sciences de l'Univers
Ecole Doctorale "Sciences de l'Environnement Marin"
THESE
Présentée par Christian TAMBURINI
Pour l'obtention du grade de Docteur de l'Université de la Méditerranée
Spécialité : Sciences de l'Environnement Marin
LA DEGRADATION DU MATERIEL ORGANIQUE PAR LES
MICROFLORES PROFONDES : DE LA MESURE DES VITESSES
POTENTIELLES AU FLUX DE CO2 GENERE IN SITU
Directeur de thèse : Armand BIANCHI
Soutenue le 18 octobre 2002
Jury composé de :
Pr Bernard QUEGUINER (Centre d'Océanologie de Marseille)
Dr Sylvie BECQUEVORT (Université de Bruxelles, Belgique)
Dr Jean-Pierre GATTUSO (OSU Villefranche-sur-Mer)
Dr Armand BIANCHI (Centre d'Océanologie de Marseille)
Pr David KIRCHMAN (University of Delaware, USA)
Dr. Alain DINET (Chargé de Mission CNRS – INSU)
Président du Jury
Rapporteur
Rapporteur
Examinateur
Examinateur
Invité
Avant Propos
Je tiens à remercier sincèrement Dr Sylvie Becquevort et Dr Jean-Pierre Gattuso d'avoir
accepté d'être les rapporteurs de ce travail ainsi qu'au Professeur Bernard Quéguiner
d'avoir accepté de faire partie du Jury. A special thank to Professor David Kirchman who
has accepted to be member to the thesis committee. Mes vifs remerciements à Monsieur
Alain Dinet, Chargé de Mission auprès de l'INSU, pour avoir accepté de participer à ma
soutenance de thèse.
Cette thèse a été cofinancée par la Société TotalFinaElf et le CNRS-INSU. Je remercie
particulièrement Monsieur Tramier, Directeur Développement Durable et Environnement
du Service Environnement de la Société TotalFinaElf, qui m'a ainsi permis de réaliser ce
travail de recherche.
Bien que je sois le seul auteur de ce document, je tiens à souligner l'importance du travail
en équipe, des collaborations, des échanges et des rencontres nécessaires pour mener à bien
un travail de recherche.
Difficile de trouver les mots pour transmettre toute ma reconnaissance à Armand Bianchi,
mon Directeur de thèse. Ces trois années passées à ses côtés me laisseront une trace
indélébile d'un point de vue scientifique bien sûr mais également humain. J'espère être
digne de la confiance qu'il a pu m'accorder. Sa rigueur scientifique, son ouverture d'esprit,
sa disponibilité constitueront pour moi un exemple que je tacherai de ne jamais oublier
lorsque je parlerai de mon "Maaaîîître"…merci Armand.
Là encore, comment trouver les mots pour définir l'amitié sincère que j'éprouve pour le 2ème
monsieur Pression! Certes nos sangs latins ont parfois fait des petites étincelles mais
n'ont jamais fait chuter la Pression. Merci Jean de m'avoir petit à petit ouvert les portes de
tes secrets, de tes armoires et de ton amitié. Tous ces moments passés ensemble sur les
différents bateaux qui nous ont brinqueballés resteront des moments inoubliables.
Je tiens à remercier tout particulièrement Micheline Bianchi, Directrice du Laboratoire de
Microbiologie Marine, de m'avoir accueilli au sein de son équipe, "petite" par le nombre
mais "grande" pour son enthousiasme scientifique et humain. C'est vous Micheline qui
arrivait à insuffler cet esprit d'équipe, cette convivialité… Merci également de la confiance
que vous me témoignez.
Merci à France (pour sa disponibilité, sa coopération, son aide …un vrai livre ouvert avec
de la gentillesse en plus!!), à Richard (pour ses critiques constructives et ses points de vues
biochéochimiques, philosophiques…), à Madeleine (sa joie de vivre et pour nos discussions
de couloir très constructives), Raymond (le Géo Trouve-Tout du LMM), Fabienne (pour
sa gentillesse), Michel et bien sûr à Danielle avec qui j'ai partagé de jolis pâtés de
sédiments et de sympathiques missions ou meeting. Une "spéciale dédicace" à Cathy pour
…tout!
Une pensée spéciale pour les thésards du LMM (Christos, Nico, Caro et le p'tit nouveau
…Marc) ainsi qu'aux différent(e)s étudiant(e)s qui sont passé(e)s par le LMM… et
particulièrement ceux avec qui j'ai travaillé plus étroitement.
Mes vifs remerciements aux différentes personnes du Centre d'Océanologie de Marseille
avec qui j'ai pu avoir des échanges fructueux. A Jean-Pierre Durbec (pour sa collaboration
sur l'analyse statistique), à Gérald Grégori (pour les mesures au cyto. et son amitié), à
Karine Leblanc (pour les analyses des silicates), à Dominique Lefèvre (pour les mesures
d'oxygène), à Valérie Michotey (pour son étroite collaboration et ses précieux conseils en
biologie moléculaire).
Thank you very much Tracy Bentley for improving my English.
Je remercie cordialement Thierry Heulin (directeur du Laboratoire d'Ecophysiologie
Végétale et de Microbiologie) et Catherine Brutesco pour les séquençages réalisés et ceux
à venir.
Mes sincères remerciements à J.C. Marty (coordinateur du programme DYFAMED)
ainsi qu'à M.D. Pizay, J. Chiavérini et J.C. Miquel et une pensée particulière pour
Laurence Guidi-Guilvard.
Mes vifs remerciements à Francis de Bovée avec qui nous avons malheureusement effectué
qu'une seule mission enthousiasmante sur le plan technologique, scientifique et humain.
Thanks to the BioDeep Group and especially for Cesare Corselli (BioDeep coordinator),
Laura Giuliano (BioDeep sub-coordinator), Micha Yakimov (Chief Scientist of BioDeep
Cruise) and everybody of the BioDeep Cruise...quelle expérience enrichissante un
programme Européen!
A special thank to Cindy Lee and her staff. I have spent some weeks in her lab; it was very
exiting and very important for me.
Enfin, je tiens à remercier tout particulièrement les gens de Mer que j'ai pu rencontrer au
cours des différentes campagnes auxquelles j'ai participé : les capitaines et les équipages
français du Thétys II et du feu Professeur Georges Petit, ceux de l'Europe et ceux du N/O
italien l'Urania. Merci à vous tous, au travail professionnel dont vous faites preuve et à
votre convivialité.
Bien sûr une pensée affectueuse à ma famille qui a cru en moi et en particulier à ma
maman.
Pour finir, je remercie énormément ma tendre épouse Sophie qui me supporte et
m'encourage. Merci ma p'tite chérie… Enfin, the last but not the least, je ne peux oublier
mon p'tit Roucao, qui me suit partout…
Homme libre toujours tu chériras la mer !
Charles Baudelaire.
A mes Grands-Parents
ABSTRACT
Different steps involved in the organic matter degradation (ectoenzymatic activities, aminopetidase,
phosphatase, bacterial biomass production, 14C-glutamic acid assimilation and respiration) were
studied throughout the whole water column, in the near-bottom water layer and in superficial
sediments in the Ligurian Sea, the Gulf of Lion and the Ionian Sea. The relative homeothermy of the
Mediterranean has permitted us to examine the effect of pressure on microbial activities independently
of the temperature decrease. Data demonstrate that in deep waters, each step involved in the organic
matter degradation is carried out by bacteria adapted to the ambient pressure. Indeed, during
stratification period, metabolic rates measured on decompressed samples are underestimated by a
factor equal to 3.6 ± 4.3 (mean ± S.D.; n=99). Because the pressure effect is highly variable, a single
factor cannot be used to correct rates measured with decompressed samples.
The use of pressure retaining samplers allowed us to demonstrate that the cells observed in the deep
(>3500 m) anoxic brines (S>300) of the Ionian Sea were actually living organisms adapted to extreme
conditions for life. Our data suggest that these cells are autochtonous populations able to participate to
the geochemical cycles in these environments.
Sinking particulate matter is the major vehicle for exporting carbon and energy from the sea surface to
the deep-sea. In spring 2000 in the Ligurian Sea, high fluxes of relatively fresh particles generated
relatively small depth-integrated hydrolysis rates (490 mg C m-2 d-1 aminopeptides hydrolyzed
between 1000 and 2000 m), but a high glutamate growth yield (GYG = 65%). In contrast, in fall, a
minimal flux of aged particles generated maximal depth-integrated hydrolysis rates (1960 mg C m-2 d1
) and lower GYG (12%). These results suggest that when the flow of particles is extremely low,
bacteria must extract carbon and energy from the semi-refractory part of the dissolved organic bulk,
such processes are costly in energy (GYG = 12 %). In fall, the taxonomic structure of deep-sea
bacterial populations were less diverse but different from surface populations. This discrepancy was
probably due to the adaptation to high hydrostatic pressure conditions, and to the necessity to use more
refractory dissolved organic matter.
Although decompression of deep-sea water samples leads to underestimation of microbial activities,
decompression of near-bottom water samples provokes an overestimation relative to the actual rates
measured in situ using a benthic lander. This apparent contradiction can be due to the difference in
origin for deep-sea water and benthic water microbial populations. Metabolic rates measured on
superficial sediment samples are higher by one order of magnitude relative to those measured in the
whole water column. Potential fluxes of organic matter mineralization calculated through the surficial
waters (until 200 m depth), intermediate and deep-sea waters (200-2000 m) and benthic layer (nearbottom waters and superficial sediments) suggest that in the deep compartments of the Ocean, the
potential metabolic processes are far from negligible.
Since attached bacteria plays an important role in the mineralization of particles and in the recycling of
biogenic elements (silicate and carbonate), we did an experiment to simulate the fall of particles
through the whole water column. This experiment demonstrates that bacteria attached to the sinking
phytoplankton aggregates are influenced by increasing pressure. The gear we developed for this
experiment will allow to precize calculations for sinking particle mineralization and dissolution
throughout the whole water column.
The experimental approaches we used to study deep-sea waters, sinking particles and benthic waters,
respecting the main conditions of these deep-sea environments, permit to study quantitative and
qualitative evolution of the chemical composition of the organic matter, microbial diversity, from the
sea surface to to the bottom. This strategy will lead towards a better estimation of carbon and energy
fluxes that insure pelagos-benthos coupling, one of the main keys of the Global Ocean functioning.
LISTE DES ABREVIATIONS
Abréviation
…en anglais
…en français
AA
Amino acids
Acides aminés
BB
Bacterial Biomass
Biomasse bactérienne
BP
Bacterial Biomass Production
Production de biomasse bactérienne
BR
Bacterial Respiration
Respiration bactérienne
Da
Dalton
Dalton
DCAA
Dissolved Combined Amino Acids
Acides aminés dissous combinés
DFAA
Dissolved Free Amino Acids
Acides aminés dissous libres
DHAB
Deep Hypersaline Anoxic Brine
DOC
Dissolved Organic Carbon
Bassin hypersalés profonds et
anoxiques
Carbone organique dissous
DOM
Dissolved Organic Matter
Matière organique dissoute
EAA
Aminopeptidase Activity
Activité aminopeptidasique
EEA
Ectoenzymatic Activity
Activité ectoenzymatique
GA
14
Assimilation du 14C-Glutamate
Glu
Glutamic acid or glutamate
Acide glutamique ou glutamate
GR
14
C-Glutamic acid respiration
Respiration du 14C-Glutamate
GU
14
C-Glutamic acid uptake (GA+GR)
Respiration du 14C-Glutamate
GYG
14
C-Glutamic acid assimilation yield
(GA/GU)
High Molecular Weight compounds
Rendement d'assimilation du 14CGlutamate (GA/GU)
Composé de haut poids moléculaire
> 1000 Da for geochemist
> 1000 Da pour les géochimistes
> 600 Da for microbiologist
> 600 Da pour les microbiologistes
HP-5L
5 liters – bottle High Pressure
Bouteille haute pression de 5 litres
HPSS
High Pressure Serial Sampler
HPSU
High Pressure Serial Unit
Echantillonneur multiple haute
pression
Bouteille de prélèvement hyperbare
Hr
Hydrolysis rate
Taux d'hydrolyse
Km
Michaëlis-Menten constant
Leu
Leucine
Constante de demi-saturation de
Michaëlis-Menten
Leucine
HMW
C-Glutamic acid assimilation
NBW
Low Molecular Weight compounds
< 1000 Da for geochemist
< 600 Da for microbiologist
Near Bottom Water
Composé de faible poids moléculaire
< 1000 Da pour les géochimistes
< 600 Da pour les microbiologistes
Eau proche du fond
NBW/EPF
Near Bottom Water
Eau proche du fond
PA
Phosphatase activity
Activité phosphatidique
Pa
Pascal
Pascal
POC
Particulate Organic Carbon
Carbone organique particulaire
POM
Particulate Organic Matter
Matière organique particulaire
SDS
Sodium Dodecyl Sulfate
Sodium Dodecyl Sulfate
SED
Sediment
Sédiment
TC
Total Count (bacteria)
Comptage total (bactéries)
THAA
Total Hydrolyzable Amino Acids
Acides aminés totaux hydrolysables
Tt
Turnover time (biomass/production)
Temps de renouvellement bactérien
UF
Fluorescence Unit
Unité de fluorescence
VDEC
Rate obtained with decompressed
sample (atmospheric pressure)
VHP
Rate obtained with uncompressed
sample
Vmax
Maximal velocity
Vitesse obtenue à partir d'un
échantillon décomprimé (pression
atmosphérique)
Vitesse obtenue à partir d'un
échantillon maintenue à pression in
situ
Vitesse maximale
Vtr
"Trace" rate
WWC
Whole Water Column
LMW
Vitesse mesurée dans les conditions
traces
Colonne d'eau océanique
SOMMAIRE
Introduction ................................................................................................................................ 1
I.
L'étude du domaine océanique profond : intérêts et imperatifs ......................................... 3
I.1
Intérêt biogéochimique............................................................................................... 3
I.2
Processus de minéralisation de la matière organique............................................... 10
I.3
Adaptation des microflores à la forte pression hydrostatique .................................. 12
I.4
Manuscrit n°1 ........................................................................................................... 19
Effect of pressure conditions on microbial activity measurements in deep-sea water: a review
.................................................................................................................................................. 19
II.
Matériel et Méthodes........................................................................................................ 35
II.1
Présentation des sites d'étude ................................................................................... 35
II.2
Moyens à la mer ....................................................................................................... 41
II.3
Abondance et biomasse bactérienne ........................................................................ 46
II.4
Mesure des activités ectoenzymatiques.................................................................... 49
II.5
Mesure de la production de biomasse bactérienne................................................... 55
II.6
Utilisation de composés de faibles poids moléculaires............................................ 56
II.7
Manuscrit n°2 ........................................................................................................... 59
A simple and highly reproducible technique to measure the bacterial respiration of 14C-labeled
compounds in seawater samples .............................................................................................. 59
III.
Activités microbiennes dans le domaine pélagique profond........................................ 69
III.1
Introduction .............................................................................................................. 69
III.2
Manuscrit n°3 ........................................................................................................... 71
Biopolymer hydrolysis and bacterial production under ambient hydrostatic pressure through a
2000 m water column in the NW Mediterranean..................................................................... 71
Préambule............................................................................................................................. 72
Données complémentaires.................................................................................................... 88
III.3
Manuscrit n°4 ........................................................................................................... 91
Role of deep-sea bacteria in organic matter mineralization and adaptation to hydrostatic
pressure conditions in the NW Mediterranean Sea .................................................................. 91
Préambule............................................................................................................................. 92
Données complémentaires.................................................................................................. 111
III.4
Synthèse des données obtenues dans la colonne d'eau du site DYFAMED .......... 112
III.5
Manuscrit n°5 ......................................................................................................... 117
Microbial life in the deep anoxic hypersaline basins of the Eastern Mediterranean.............. 117
Préambule........................................................................................................................... 118
III.6
IV.
Adaptation à la pression hydrostatique : données complémentaires et synthèse ... 131
Activités microbiennes dans le domaine benthique profond ..................................... 135
IV.1
Validation des mesures d'activité microbienne à l'interface benthique.................. 137
IV.2
Comparaison de méthode d'estimation de l'activité microbienne dans le domaine
benthique profond .............................................................................................................. 147
IV.3
Activités microbiennes dans l'épaisseur sédimentaire ........................................... 152
IV.4
Couplage pelagos-benthos...................................................................................... 155
V.
Essais complémentaires et perspectives ......................................................................... 161
V.1
Simulation de la chute de particules....................................................................... 161
V.2
Activités aminopeptidasiques mesurées à l'aide de la LYA-peptides .................... 166
V.3
Approche moléculaire ............................................................................................ 176
VI.
Conclusion.................................................................................................................. 183
Références .............................................................................................................................. 191
Annexes………………………………………………………………………………………………………207
INTRODUCTION
Introduction
INTRODUCTION
La découverte en 1977 des sources hydrothermales océaniques profondes à proximité
immédiate desquelles se développe une vie exubérante basée sur une production primaire
d'origine chimiosynthétique (Corliss et al., 1979) a suscité l'intérêt du monde scientifique pour
le domaine océanique profond. L'intérêt biotechnologique inhérent à la découverte
d'organismes adaptés à des conditions extrêmes (température élevée, haute pression,…) et le
fait que ces organismes pourraient représenter les premières formes de vies apparues sur notre
Planète, ont incité la communauté scientifique à fournir des efforts de recherche considérables
sur ces sites. Ces écosystèmes sont certes passionnants, ouvrant des nouvelles perspectives en
physiologie et taxonomie microbienne, mais ils ne représentent en fait que des "oasis" au sein
de l'immensité des profondeurs océaniques. S'ils ont peut-être joué un rôle primordial dans
l'apparition de la vie, ils ne jouent actuellement, d'un point de vue biogéochimique, qu'un rôle
mineur dans le fonctionnement du cycle global des océans.
La communauté scientifique est confrontée depuis quelques décennies à la problématique de
l'augmentation de la concentration en gaz carbonique (CO2) dans l'atmosphère, en relation
avec le début de l'ère industrielle. Le pouvoir de "pompe biologique" a été assigné à l'Océan.
Cependant, le rôle des microorganismes dans la minéralisation de la matière organique et les
flux en CO2 induits par ces processus restent à quantifier. De même on n'a pas encore défini le
rôle des microorganismes du domaine profond dans ces processus. Le domaine océanique
profond (défini en dessous de 1000 m), représente environ 88 % du volume des océans.
Pourtant, ce sont les processus microbiens intervenant dans le fonctionnement des systèmes
océaniques superficiels qui sont les mieux connus et qui sont les seuls correctement
quantifiés. Ceux intervenant dans les systèmes profonds n’ont été qu'exceptionnellement
appréhendés, vraisemblablement en raison de difficultés technologiques, et la signification
réelle des mesures effectuées reste souvent à démontrer.
Certes, le domaine océanique profond apparaît peu hospitalier. La lumière solaire, source de
vie pour la zone productive de surface qui apporte l'énergie nécessaire pour la production
primaire, y est absente. Le domaine océanique profond est considéré comme extrêmement
oligotrophe car dans le cas général les apports en matériels organiques dépendant presque
exclusivement de la productivité de la couche euphotique sont considérablement amoindris
lors de leur transit dans la colonne d'eau. De plus, dans ces eaux obscures, les températures
sont faibles (entre 1 et 4°C) excepté pour les eaux méditerranéennes (température
1
Introduction
d'environ13°C). Enfin, l'élément le plus caractéristique de cet environnement inhospitalier est
l'accroissement de la pression hydrostatique avec l'augmentation de la profondeur (environ 1
bar tous les 10 m).
L’objectif principal de cette étude est d’améliorer la représentativité des mesures d’activité
microbienne dans les eaux et les sédiments profonds. Pour cela, il convenait de surmonter
différentes difficultés technologiques qui concernent :
-
La nécessité de sélectionner, parmi la grande diversité des processus microbiens, ceux
qui interviennent de manière plus significative dans le fonctionnement de
l’écosystème profond, car les systèmes de collecte spécialisés, ainsi que la durée des
opérations en milieu profond, limitent considérablement le nombre et le volume des
échantillons disponibles au cours d'une campagne de prélèvement.
-
Le concept même de mesure d’activité microbienne qui implique la nécessité de
maintenir les échantillons dans des conditions les plus proches possibles de celles
exercées in situ, en particulier les conditions les plus caractéristiques du milieu étudié.
Ce qui est le cas de la pression hydrostatique et l'extrême oligotrophie en milieu
océanique profond.
2
Chapitre I
L'ETUDE DU DOMAINE OCEANIQUE
PROFOND : INTERETS ET IMPERATIFS
Chapitre I – L'Etude du domaine océanique profond : intérêts et impératifs
I. L'ETUDE DU DOMAINE OCEANIQUE PROFOND :
INTERETS ET IMPERATIFS
I.1 Intérêt biogéochimique
L'océan mondial est considéré comme le plus large réservoir de carbone réactif sur la planète
Terre. La presque totalité (>97 %) de ce réservoir de carbone est sous forme de matière
organique dissoute (DOM) (Benner et al., 1992). Les bactéries hétérotrophes sont considérées
comme les consommateurs et reminéralisateurs de la DOM dans les océans (Williams &
Gray, 1970; Pomeroy, 1974). Elles jouent un rôle de pivot dans le recyclage de la matière
organique au sein de la boucle microbienne et du réseau trophique qui en découle (Azam et
al., 1983; Ducklow & Carlson, 1992). Dans la zone euphotique, environ 50 % de la
production primaire journalière est utilisée par les processus microbiens pour produire de la
biomasse et satisfaire aux besoins énergétiques au travers de la respiration bactérienne
(Ducklow & Carlson, 1992). D'un point de vue biogéochimique, l'étude du rôle des processus
réalisés par les microorganismes planctoniques doit être étendue à la zone aphotique afin
d'élucider la contribution des communautés microbiennes profondes dans les flux océaniques
de carbone.
Dans les paragraphes suivants, nous essaierons de caractériser au mieux la DOM disponible
pour les microorganismes du domaine profond afin de choisir les proxys nécessaires à
l'évaluation des processus microbiens profonds et leur rôle dans la minéralisation de la
matière organique.
I.1.1
Caractérisation de la DOM
I.1.1.1 Classes de taille de la DOM
La distinction selon la taille de la matière organique dans les systèmes aquatiques est basée
sur la séparation physique à travers une membrane ou un filtre de porosité variable. Pour les
géochimistes, la séparation de la matière organique particulaire (POM) et dissoute (DOM) est
réalisée sur des filtres ayant des pores de 0,2 à 1,0 µm. En pratique, les géochimistes évitent
souvent l'étape de filtration (source de contamination) en particulier dans les échantillons
d'eaux profondes où la fraction particulaire est infime (~1 % du carbone organique total ou
TOC). La biomasse bactérienne est donc le plus souvent incluse dans cette fraction dissoute.
3
Les techniques d'ultrafiltration tangentielle permettent de séparer en deux classes de taille la
DOM. Les membranes les plus souvent utilisées, de 1000 daltons1 (soit ~1 nm de diamètre de
porosité), séparent la DOM de faible poids moléculaire (LMW DOM pour low molecular
weight DOM ) de la DOM de haut poids moléculaire (HMW DOM pour high molecular
weight DOM).
En surface, la majorité (60-75 %) du carbone organique dissous (DOC) passe au travers des
membranes d'ultrafiltration de porosité de 1000 Da. Dans les eaux profondes, le LMW DOC
représente 75-80 % du DOC, indiquant que la fraction LMW DOM est la fraction majoritaire
de la matière organique dans les océans (Benner, 2002). La majorité du LMW DOM dans les
eaux profondes est sous forme combinée, comme en témoignent les conditions hydrolytiques
sévères requises pour libérer les acides aminés libres dissous (DFAA pour Dissolved Free
Amino Acids) et les sucres neutres (polysaccharides) lors de leur caractérisation moléculaire
(Druffel et al., 1992; Borch & Kirchman, 1997; Skoog & Benner, 1997). Les formes
monomériques des principales classes de biomolécules (i.e. acides aminés, sucres, acides
gras) ont typiquement des tailles moléculaires supérieures à 100 Da, ce qui signifie que
l'ultrafiltration tangentielle à 1000 Da laisse passer au travers de ses pores des molécules
ayant moins de 10 sous-unités de monomère (Benner, 2002). Malheureusement, cette coupure
à 1000 Da, devenue classique pour les données de géochimie, ne correspond pas à la limite de
taille des molécules pouvant traverser directement les membranes cellulaires des
microorganismes (<~600Da) (Nikaido & Vaara, 1985).
I.1.1.2 Teneurs en DOC dans les eaux profondes
Les progrès analytiques en géochimie ont été considérables ces 20 dernières années depuis les
travaux controversés de Suzuki et al. (1985) et Sugimura & Suzuki (1988) décrivant un
"nouveau" DON et DOC (Hedges, 2002). Actuellement, les mesures analytiques utilisent
deux types de références fournies par le Hansell Laboratory (Université de Miami) : (1) une
référence d'eau de mer profonde correspondant à des échantillons collectés à 2600 m dans la
Mer des Sargasses (Deep Sea Water Reference à 44-46 µM DOC, Bermuda Biological Station
for Research, INC.) et (2) une référence de faible contenu en carbone (Low Carbon Water
d'un contenu d'environ 2 µM DOC).
1
Unité de masse souvent utilisée par les biochimistes, le dalton, qui est la masse d’un atome d’hydrogène, vaut 1,67×10-24 g.
Il est symbolisé par Da.
4
Les concentrations en DOC sont relativement uniformes en profondeur (Amon & Benner,
1996), variant entre ~35 et 45 µM dans les océans (Sharp et al., 1995; Benner, 2002) et ~50
µM en Méditerranée (Cauwet et al., 1997; Avril, 2002; Sempéré et al., 2002). Cette
uniformité de la teneur en DOC des eaux profondes semble refléter une large fraction
réfractaire (Amon & Benner, 1996). Le pool du DOC apparaît effectivement résistant
lorsqu'on considère son age apparent estimé entre 4000 et 6000 ans, respectivement dans
l'Océan Atlantique Nord (Williams & Druffel, 1987) et l'Océan Nord Pacifique (Bauer et al.,
1992). Une telle longévité, en contraste avec une homogénéité des teneurs en DOC, nous
incite à rechercher les processus intervenant dans la régulation du DOC dans le domaine
océanique profond.
I.1.1.3 Disponibilité de la DOM
Le stock de DOM dans les océans se présente sous une large gamme de composés allant des
petites molécules simples (tels que les acides aminés libres dissous (DFAA) ou les
carbohydrates) qui ont un "turn over" de la minute à la journée (Keil & Kirchman, 1991;
Kirchman et al., 1991; Keil & Kirchman, 1992) aux structures moléculaires complexes (tels
que les substances humiques) qui ont un "turn over" du siècle au millénaire (Williams &
Druffel, 1987; Bauer et al., 1992). Carlson (2002) propose un schéma conceptuel présentant
les différentes fractions du DOC le long de la colonne d'eau (Figure I-1).
Afin de prendre en compte à la fois la faible disponibilité, le faible poids moléculaire et la
fraction non-caractérisée de la DOM, Amon & Benner (1996) proposent le modèle du
"continuum taille-réactivité". Ce modèle suggère que lorsque la matière organique est
décomposée, elle devient moins bioréactive et plus petite en taille. Ainsi, la bioréactivité de la
matière organique décroît comme suit : POM → HMW DOM → LMW DOM; chaque
fraction de taille se compose d'un continuum de composition, de réactivités et d'états
diagénétiques (Amon & Benner, 1996).
5
0
500
Labile
1000
Sem i-labile
Profondeur (m)
1500
R éfractaire
2000
B
A
2500
3000
3500
4000
0
10
20
30
40
50
60
70
D O C (µM C)
Figure I-1. Schéma conceptuel de la distribution du DOC réfractaire, semi-labile et labile le long de la colonne
d'eau. Le pool réfractaire est séparé en DOC ayant un turn over sur une échelle de temps (A) supérieure et (B)
inférieure à la durée du cycle de la circulation générale des océans (Carlson, 2002).
I.1.1.4 Accumulation de la DOM
La DOM réfractaire serait formée à partir de composés labiles, par des réactions de
condensation par la lumière et les métaux, ou par la modification du matériel LMW au cours
des processus biologiques (Carlson, 2002 et références incluses). Ainsi, Keil & Kirchman
(1994) ont démontré que des protéines labiles sont transformées abiotiquement en protéines
réfractaires. Ogawa et al. (2001) ont démontré, qu'en moins de 48 heures, de la HMW DOM
réfractaire est produite après utilisation de composés labiles (acide glutamique, glucose) et
persiste pendant plus d'une année. Hedges et al. (2000) suspectent que la matière organique
serait "capsulée" créant ainsi un bouclier rendant les processus de minéralisation des
microflores hétérotrophes plus difficiles.
La Figure I-1 présente le DOC du domaine océanique profond réfractaire à l'échelle de temps
(A) supérieure ou (B) inférieure à la durée du cycle de la circulation générale des océans. Les
travaux de Hansell & Carlson (1998), qui mettent en évidence un gradient de DOC profond de
14 µM entre l'Atlantique Nord et le Pacifique Nord, semblent indiquer qu'une portion du DOC
profond réfractaire disparaît à une vitesse de l'ordre 10-3 à 10-4 an-1. Anderson & Williams
(1999) proposent un modèle couplant photochimie et biologie dans lequel le DOC profond est
6
biologiquement réfractaire mais photochimiquement réactif. Une fois exposée aux radiations
UV de surface, le DOC réfractaire serait transformé par photo-oxydation ou par cassage de la
DOM réfractaire en DOM labile et utilisé par les bactéries hétérotrophes (Mopper et al.,
1991). Ces mécanismes photochimiques interviennent certainement dans la disparition de la
DOM réfractaire de surface, mais comme le fait remarquer Williams (2000), ces processus
sont limités à la zone de sub-surface et ne peuvent être pris en compte dans le gradient de
DOC réfractaire observé par Hansell & Carlson (1998). Williams (2000) propose un autre
modèle de décomposition du DOC profond, dans lequel les bactéries associées aux particules
en cours de chute supportent une courte phase de croissance et servent ainsi d'intermédiaires à
la disparition du DOC profond réfractaire. Mais peut-on attribuer aux bactéries associés aux
particules qui chutent la disparition du DOC profond réfractaire ? La pression hydrostatique
qui augmente le long de la colonne d'eau n'a-t-elle pas un effet inhibiteur sur ces bactéries
originaires des couches océaniques superficielles et donc en principe adaptées à la seule
pression atmosphérique ? Des processus physiques, chimiques, microbiens doivent donc
réguler ce DOC profond dit "réfractaire" puisque ses teneurs restent stables et que l'océan
profond ne s'est pas encore transformé en "soupe" de matière organique réfractaire!
I.1.1.5 Composition moléculaire de la DOM
La composition moléculaire de la matière organique dissoute n'est que peu référencée,
pourtant il y a un besoin évident de la caractériser dans un futur proche (Hedges, 2002). Les
profils complets sur l'ensemble de la colonne d'eau n'ont été réalisés que pour 2 classes
biochimiques, les acides aminés et les sucres (Benner, 2002). Les acides aminés les plus
abondants sont l'acide glutamique, l'acide aspartique, la glycine et l'alanine (Huberton et al.,
1995; Mccarthy et al., 1996; Amon et al., 2001; Benner, 2002). Les profils des acides aminés
totaux dissous (THAA) affichent des concentrations variant entre 200 et 500 nM en surface et
entre 80 et 160 nM en profondeur dans les océans polaires (Huberton et al., 1995). Keil &
Kirchman (1999) donnent des concentrations en Mer des Sargasses variant entre 167 nM à
1000 m et 810 nM en surface. Les acides aminés constitueraient environ 1 à 3 % du DOC en
surface et 0,8 à 1,8 % du DOC en profondeur. Les substances humiques représenteraient entre
5 et 25 % du pool de DOC en surface, et entre 15 et 25 % dans l'océan profond, la plus grande
part du DOC restant en fait chimiquement indéfinie (Benner, 2002).
7
I.1.2
Apports nutritifs au domaine profond
I.1.2.1 Le POC, principal vecteur de carbone et d'énergie en profondeur
Le milieu pélagique profond est caractérisé, entre autres, par une teneur en composés
organiques directement assimilables insuffisante pour soutenir la croissance des bactéries
profondes. Le flux de particules constitue la principale source de carbone et d'énergie
utilisable pour le métabolisme des microflores profondes. Ainsi 40 à 100 % du flux de
carbone organique particulaire (POC) seraient utilisés par les bactéries dans la zone
mésopélagique (200-1000 m), suggérant un couplage étroit entre le flux de POC et les
bactéries libres de la zone mésopélagique (Cho & Azam, 1988). Récemment, Nagata et al.
(1998) suggéraient que ce transfert "POC en cours de chute → DOC → bactéries" existe
également dans la zone bathypélagique (en dessous de 1000 m de profondeur), permettant la
mise en place d'une "boucle microbienne" dans le domaine océanique profond (Tanaka &
Rassoulzadegan, 2002). En effet, au cours de leur chute, les particules sont solubilisées à la
fois par des processus de solubilisation et de fragmentation abiotiques (Karl et al., 1988), et
par des processus d'hydrolyse enzymatique (Cho & Azam, 1988). L'intervention des bactéries
lors de la chute des particules pourrait avoir une grande influence sur le cycle océanique du
carbone (Azam & Long, 2001; Kiørboe & Jackson, 2001). Nous discuterons plus en détail de
ce couplage possible entre la chute des particules et le métabolisme des microflores profondes
dans le manuscrit n°4 (Tamburini et al., soumis-c).
La matière organique qui a été produite en surface subit donc d'importantes transformations
au cours de son transit à travers la colonne d'eau (Wakeham & Lee, 1989). Il est
classiquement admis que plus de 90 % de cette matière organique sont en fait recyclés dans la
colonne d'eau. La nature chimique de la matière organique qui atteint le sédiment est donc à la
fois le reflet de sa source, des processus de dégradation subits au cours de son transit,
processus qui dépendent eux même de sa vitesse de chute, et de sa composition d'origine.
I.1.2.2 Composition moléculaire du POC
Les acides aminés les plus abondants dans le POC sont, comme dans le DOC, l'acide
glutamique, l'acide aspartique, la glycine, et l'alanine. Les acides aminés contribueraient pour
environ un quart du carbone organique total en surface, et pour environ 16 % en profondeur
(Cowie & Hedges, 1994; Lee et al., 2000). Cowie & Hedges (1992), ainsi que Lee et al.
(2000), estiment que l'acide glutamique (Glu), l'arginine (Arg) et les acides aminés
aromatiques sont plus labiles que les autres acides aminés puisque leur teneur diminue avec la
8
profondeur. Par contre, la glycine (Gly) et la sérine (Ser) seraient mieux conservés le long de
la colonne d'eau (Cowie & Hedges, 1994; Nguyen & Harvey, 1997). La Figure I-2 illustre la
composition relative en acides aminés retrouvée à différents niveaux de l'océan.
25
105 m
1000-3000 m
20
Sediment
% mole
15
10
5
0
Asp
Glu
Ser
His
Gly
Thr
Arg
Ala
Tyr
Met
Val
φ-Ala
Ile
Leu
Lys
Figure I-2. Composition relative moyenne des acides aminés (en % mole) du POC à105m, entre 1000 et 3500m
et dans les sédiments du Pacifique Central Equatorial. Schéma réalisé d'après les données de Lee et al. (2000).
Les échantillons provenaient de pièges à particules situés à 105 m de profondeur; pièges à particules situés
à 1000 et 3000 m de profondeur; sédiments. Asp, acide aspartique; Glu, acide glutamique; Ser, sérine; His,
histidine, Gly, glycine; Thr, thréonine; Arg, arginine; Ala, alanine; Tyr, tyrosine; Met, méthionine; Val, valine;
Φ-Ala, phénylalanine; Ile, isoleucine; Leu, leucine; Lys, lysine.
Ce qu'il y a de plus surprenant dans les nombreuses données recueillies sur le carbone
organique particulaire dans l'Océan Pacifique Central Equatorial (Wakeham et al., 1997;
Hedges et al., 2000; Lee et al., 2000; Hedges et al., 2001), c'est la proportion de carbone
organique non caractérisé qui augmente avec la profondeur (Figure I-3).
9
Figure I-3. Flux de carbone organique particulaire (POC) et fractions correspondantes en acides aminés,
carbohydrates, lipides et la fraction non caractérisée du carbone organique (contenu en C d'une classe de
composé en pourcentage du carbone organique total) dans des échantillons de plancton, de pièges à sédiment, et
de sédiments dans le Pacifique Central Equatorial. La fraction du carbone organique non-caractérisée d'un point
de vue moléculaire augmente avec la profondeur pour devenir le constituant majeur des échantillons de POC
profonds (Wakeham et al., 1997; Hedges et al., 2000).
I.2 Processus de minéralisation de la matière organique
Ce travail de thèse a pour objectif l'estimation des processus microbiens agissant dans la
dégradation de la matière organique, en respectant le plus possible les conditions du milieu
profond. Cet objectif nous emmène (1) à définir et choisir des traceurs pertinents et, (2) à
maintenir les conditions de prélèvement et d'incubation les plus proches de celles des
conditions in situ.
Dans les paragraphes précédents, on a pu constater que le stock de matière organique dans les
environnements aquatiques profonds est principalement sous forme de macromolécules qui
nécessitent un pré-conditionnement préalable avant leur incorporation à l'intérieur des cellules
bactériennes. Une hydrolyse enzymatique extracellulaire est nécessaire pour scinder les
molécules de taille supérieure à 600 Da qui ne peuvent être transportées à travers les
membranes cellulaires microbiennes (Nikaido & Vaara, 1985). L'activité de ces enzymes est,
dans la plupart des cas le facteur limitant à la fois la décomposition du matériel organique et
la croissance bactérienne (Hoppe, 1983; Chrost & Velimirov, 1991). Ces enzymes sont
exprimées principalement par les bactéries. Selon la définition donnée par Priest (in Hoppe,
10
1983), les enzymes extracellulaires sont généralement localisées à l'extérieur de la membrane
cytoplasmique (on parle d'ectoenzymes ou enzymes extracellulaires).
En l'état actuel des connaissances, les données de la géochimie organique ne permettent pas
de définir clairement le contenu de la matière organique dans les océans. Toutefois, la classe
de composés la mieux connue est vraisemblablement celle des peptides et des acides aminé;
c'est donc sur l'utilisation de ce groupe de composés que j'ai basé ce travail de thèse. La
Figure I-4 schématise les différentes mesures réalisées qui focalisent essentiellement sur la
minéralisation des polymères organiques peptidiques, leur utilisation pour soutenir la
biomasse bactérienne et leur minéralisation par les populations profondes (le produit final des
processus métaboliques étant le CO2). Les mesures que nous avons systématiquement
réalisées sont :
-
comptage total des cellules bactériennes,
-
mesure des activités ectoenzymatiques aminopeptidase et phosphatase,
-
assimilation et respiration du 14C-glutamate,
-
production de biomasse bactérienne.
Figure I-4. Schéma des processus microbiens impliqués dans la reminéralisation de la matière organique en
milieu profond. En jaune, apparaissent les mesures réalisées au cours de ces travaux : activités
ectoenzymatiques, activités aminopeptidase et phosphatase; Assimilation et respiration DOM < 600 Da :
utilisation du 14C-glutamate pour suivre l'assimilation et la respiration d'un monomère simple; Production
bactérienne, mesurée à l'aide de la leucine tritiée.
Les microflores profondes sont-elles adaptées à utiliser la matière organique profonde dite
réfractaire ? Comment peut-on s'approcher de la mesure de vitesses réelles plutôt que
potentielles dans le domaine océanique profond ?
11
I.3 Adaptation des microflores à la forte pression hydrostatique
La découverte des sources hydrothermales océaniques profondes en 1977 a suscité un nouvel
intérêt pour le domaine océanique profond, mais en fait les premières études biologiques du
domaine océanique profond peuvent être créditées à l'Expédition du Challenger (1873-1876)
(in Jannasch & Taylor, 1984). La découverte de spécimens vivant à de grandes profondeurs
détruisait la théorie d'une zone azoïque, au-dessous de 600 m, suggérée dans les années 1840
par Edward Forbes. Dès 1883, Certes, (cité par Jannasch & Taylor, 1984) a pu observer au
microscope des bactéries dans des échantillons profonds (jusqu'à 5000 m) de sédiments et
d'eaux. Il note que des bactéries survivent à de fortes pressions hydrostatiques, semblant vivre
dans un état de "vie suspendue" jusqu'à 5000 m de profondeur. En 1904, Portier utilise un
tube en verre stérile et scellé comme moyen de prélèvement, ce qui lui permet de reporter et
compter des bactéries vivantes et formant des colonies à différentes profondeurs (Richard,
1907 in Jannasch & Taylor, 1984). Ce sont ZoBell & Johnson qui réalisent en 1949 les
premiers travaux dévolus à comprendre l'effet de la pression hydrostatique sur les
microorganismes marins. La synthèse des travaux réalisés par ZoBell et collaborateurs sur les
effets des conditions de haute pression hydrostatique sur la physiologie des bactéries
profondes peut être trouvée dans la revue de ZoBell (1970).
La pression est définie comme une force appliquée sur une surface. Dans la colonne d'eau
océanique, la pression hydrostatique augmente d'environ 1 bar [0,1 MPa] tous les 10 m.
Différentes unités de pression sont utilisées dans la littérature (1 atm = 1,01325 bars =
1,01325 ×105 Pascals) mais l'unité légale internationale est le Pascal2. Ainsi, la profondeur
moyenne de l'océan global étant de 3800 m, la pression hydrostatique moyenne est donc
d'environ 38 MPa.
ZoBell & Johnson3 (1949) in Yayanos (1995) créent le mot "barophile" pour décrire les
bactéries qui ont la capacité de croître et d'entretenir leur métabolisme aussi bien, ou même
mieux, sous une pression élevée qu'à la pression atmosphérique. Yayanos (1995) propose le
terme de piezophile plus approprié d'un point de vue étymologique puisque le préfixe "piezo"
donne le sens de "pression" alors que "baro" a un sens de "poids". Dès 1949, ZoBell &
Johnson montrent qu'il y a des effets concomitants dus à la basse température et à la forte
2
Par définition l'unité légale de pression est le Pascal de symbole Pa. C’est la pression exercée par une force
pressante de 1 N sur une surface plane de 1 m2.
3
….barophilic [piezophilic] is a term to describe "the ability to grow and carry on metabolism as well or better
under increased pressure"
12
pression sur le métabolisme bactérien; on parle alors de bactéries psychropiezophiles lorsque
les bactéries sont adaptés à la fois à la température basse et la forte pression. La Figure I-5
schématise les relations entre les taux de croissance microbienne et la pression hydrostatique.
Taux de croissance [Td-1 (h-1)]
0,5
piezotolérante
piezophile
0,4
0,3
0,2
piezosensible
0,1
0
0
20
40
60
80
100
Pression (MPa)
Figure I-5. Comportement des différents types de bactéries, exprimé par leur taux de croissance en fonction de la
pression hydrostatique (Abe & Horikoshi, 2001).
La suite de ce chapitre présentera dans un premier temps les principaux travaux de laboratoire
consacrés aux effets de la pression hydrostatique au niveau cellulaire et moléculaire. Ces
travaux décrivant les différentes adaptations
physiologiques mises en évidence sur des
cultures de bactéries piezophiles nous amèneront à considérer, dans un deuxième temps, les
techniques qu'il est nécessaire de mettre en œuvre pour obtenir une mesure réellement
significative des activités métaboliques exercées par les microflores dans les écosystèmes
soumis à de fortes pressions hydrostatiques.
I.3.1
Expériences en laboratoire
De nombreux travaux ont été réalisés sur les effets d'un accroissement de la pression
hydrostatique sur des bactéries non marines mais piezotolérantes comme Escherichia coli.
Ces travaux apportent, sans aucun doute, des informations majeures sur la capacité des
bactéries à s'adapter à un stress quelconque comme l'accroissement de la pression
hydrostatique. Toutefois, nous ciblerons cette analyse plus spécifiquement sur les travaux
effectués sur des bactéries isolées du milieu océanique profond et ayant un comportement
piezophile. L'objet de ce paragraphe est de réaliser une synthèse des connaissances actuelles
de la réponse des bactéries adaptées aux fortes pressions hydrostatiques à des variations de ce
facteur.
13
I.3.1.1 Taxonomie
Le prélèvement, la culture et la purification sans décompression de bactéries prélevées à très
grande profondeur a nécessité la mise en œuvre d'une technologie spécifique. Ainsi, très peu
d'espèces bactériennes ont pu être isolées et identifiées dans ces conditions du domaine
benthique profond. La première culture pure d'une souche bactérienne réellement piezophile
(souche CNPT-3) a été reportée en 1979 (Yayanos et al., 1979). Cette culture a été obtenue à
partir de crustacés collectés au moyen d'un piège maintenant la pression hydrostatique in situ.
Cette bactérie, de type Spirillum, présentait un temps de doublement compris entre 4 et 13
heures sous une pression de 50 MPa alors qu'à pression atmosphérique son temps de
doublement était de 3 à 4 jours et ne permettait pas la formation de colonies.
L'analyse des séquences de l'ADNr 16S et 5S a montré que toutes les bactéries piezophiles et
psychrophiles, isolées et identifiées, sont affiliées à l'un des 5 genres de la subdivision gamma
de la classe des Proteobacteria (γ-Proteobacteria) : Shewanella, Photobacterium, Colwellia,
Moritella et un nouveau groupe contenant la souche CNPT-3 (Delong et al., 1997; Kato,
1999; Yanagibayashi et al., 1999). Le Tableau I-1 présente la liste des espèces de bactéries
piezophiles isolées et identifiées.
Tableau I-1.Liste des espèces de bactéries isolées du domaine profond identifiées comme des bactéries
piezophiles (Kato & Qureshi, 1999).
Genre
Espèce
Souche
Piezophilie
1
Référence
Colwellia
C. hadaliensis
BNL-1
extrême
(Deming et al., 1988)
Photobacterium
P. profundum
SS9, DSJ4
modérée2
(Nogi et al., 1998b)
Shewanella
S. benthica
PT-99, DB-
modérée,
(Deming et al., 1984; Macdowell &
series
obligatoire et
Moritella
Colwell, 1985; Kato et al., 1998; Li et al.,
extrême
1998; Nogi et al., 1998a)
S. violacea
DSS12
modérée
(Nogi et al., 1998a)
M. japonica
DSK1
modérée
(Nogi et al., 1998a)
M. yayanosii
DB21MT-5
extrême
(Kato et al., 1998; Nogi & Kato, 1999)
1
Bactéries piezophiles extrêmes sont définies comme les bactéries qui ne sont pas capables de croître à des
pressions inférieures à 50 MPa. 2Bactéries piezophiles modérées sont définies comme les bactéries ayant un
optimum de croissance à une pression de moins de 40 MPa et capables de croître à pression atmosphérique.
Les études menées sur ces bactéries piezophiles nous renseignent sur l'adaptation des
structures membranaires et des processus vitaux aux fortes pressions hydrostatiques, et a
contrario, sur les effets d'une décompression sur ces mêmes structures.
14
I.3.1.2 Modifications au niveau de la structure membranaire
Les bactéries marines attachées à des particules chutant dans la colonne d'eau, ou migrants
avec des organismes, ou soumises à des processus de transports verticaux de masses d'eaux
subissent des changements drastiques de pression hydrostatique. L'accroissement de la
pression hydrostatique, tout comme la diminution de la température, provoquerait un
changement dans la composition phospholipidique des membranes cellulaires entraînant une
rigidification de la membrane lipidique (Delong & Yayanos, 1985). L'isolation de la bactérie
piezophile, CNPT-3, qui a un optimum de croissance entre 30 et 50 MPa, a permis de prouver
que la composition membranaire d'une bactérie adaptée à de fortes pressions hydrostatiques
était différente de celle de ses homologues du même genre mais non adaptées à la pression.
Une plus grande quantité en acides gras insaturés est retrouvée chez les bactéries se
développant sous de fortes pressions hydrostatiques. Delong & Yayanos (1985) ont observé
que les changements de composition membranaire en acides gras induits par une
augmentation de pression étaient similaires à ceux provoqués par une diminution de la
température. L'augmentation de la pression, tout comme la baisse de la température, provoque
une rigidification de la membrane cellulaire et une diminution de la fluidité membranaire.
Pour compenser ce phénomène, les bactéries piezophiles et les bactéries piezotolérantes
assurent le maintien de la fluidité membranaire en augmentant la proportion des acides gras
monoinsaturés (Abe et al., 1999).
Bartlett et al. (1989) ont montré que la protéine transmembranaire OmpH (outer membrane
protein, H pour haute pression) est produite en grande quantité par la souche SS9 de
Photobacterium profondeum (barophile facultative ou piezomesophile dont l'optimum de
croissance est situé autour de 20-30 MPa). Ces auteurs montrent que la souche SS9 exprime
un programme génétique pour développer la synthèse de protéines de type OmpH en réponse
à un accroissement de pression hydrostatique, alors que les porines fonctionnant à pression
atmosphérique (OmpL) sont sensibles à l'accroissement de pression hydrostatique. Les
porines de type OmpH fourniraient un plus gros canal, et seraient moins spécifiques que les
porines de type OmpL. Une telle propriété fournirait un avantage nutritionnel à ces
organismes vivant dans les conditions particulièrement oligotrophes du domaine océanique
profond (Bartlett, 1999).
15
I.3.1.3 Modifications au niveau du mécanisme respiratoire
Pour étudier la régulation du système respiratoire par la pression, les cytochromes de type-c
et une quinol-oxydase terminale ont été purifiés de S. benthica DB172F (Qureshi et al.,
1998a; Qureshi et al., 1998b). Ces auteurs ont purifié deux cytochromes c (l'un membranaire;
c-551, l'autre cytoplasmique; c-552). Ils montrent que le cytochrome c-551 est exprimé à 0,1
MPa et à 60 MPa tandis que le cytochrome c-552 est exprimé seulement à 60 MPa (Qureshi et
al., 1998b). A cette forte pression un complexe quinol-oxydase membranaire a été identifié et
considéré comme l'accepteur terminal d'électrons (Qureshi et al., 1998a). Kato (1999) montre
qu'un changement de pression altère les composantes de la chaîne respiratoire. Cet auteur
suggère l'existence de 2 types de systèmes respiratoires, l'un fonctionnant à 0,1 MPa et l'autre
à 60 MPa. Il fait l'hypothèse qu'à 0,1 MPa, 3 complexes enzymatiques rentrent en jeu alors
qu'à 60 MPa la chaîne respiratoire est plus compacte avec 2 systèmes enzymatiques qui
permettent le transport d'électron avec comme accepteur terminal d'électron une quinoloxydase.
I.3.1.4 Adaptation au niveau des enzymes ectocellulaires
L'activité protéasique de la serine alkaline d'une bactérie piezotolérante (croissance optimale à
0,1 MPa) Sporosarcina sp. isolée de la fosse du Japon à 6500 m de profondeur est quasiment
doublée à 60 MPa par rapport à son activité à pression atmosphérique (Kato et al., 1995).
L'activité de cette protéase augmente lorsque la pression augmente montrant qu'il peut y avoir
une adaptation au niveau de l'activité ectoprotéasique bactérienne. Les bactéries du domaine
océanique profond semblent donc être munies des "outils" nécessaires pour hydrolyser les
macromolécules en plus petits composés pour subvenir à leurs besoins anaboliques et
cataboliques.
I.3.1.5 Mécanismes moléculaires régulés par la pression
Les équipes du laboratoire japonais DEEPSTAR et du laboratoire de Bartlett ont mis en
évidence la présence de 3 cadres ouverts de lecture (open reading frame appelés ORF1, ORF2
et ORF3) et de 5 sites d'initiations de la transcription régulés par la pression de la bactérie
piezophile S. benthica DB6075 (Kato, 1999; Kato & Qureshi, 1999). ORF1 et ORF2 forment
ainsi un seul promoteur transcriptionnel régulé par la pression et a pu être cloné à une bactérie
mésophile (S. violacea DSS12) qui a ainsi exprimé son maximum transcriptionnel à une
pression plus élevée (50 MPa au lieu de 30 MPa) (Abe et al., 1999). Selon les résultats des
analyses de transcription, ces auteurs ont montré que la transcription est exprimée à forte
16
pression hydrostatique (maximale à 70 MPa) pour la souche de S. benthica DB6705.
Toutefois, les fonctions et les régulations précises des ORF1 et 2 dans l'opéron "pressionrégulée" sont en cours d'investigation.
I.3.2
Activités
microbiennes
obtenues
en
condition
de
pression
hydrostatique in situ
Après avoir isolé un nombre conséquent de bactéries du domaine océanique profond, ZoBell
(1968 in (Jannasch & Taylor, 1984) statue que : "Bien que la plupart des bactéries provenant
du domaine océanique profond survivent, cette observation ne permet pas de prouver que
certaines bactéries, les plus sensibles d'entre elles, ne sont pas détruites au cours de la
décompression. La réponse à cette interrogation requiert l'examen des bactéries originaires du
domaine océanique profond en maintenant les conditions in situ de pression sans leur faire
subir de décompression". Deux approches peuvent être développées pour satisfaire cette
requête :
-
La première est la mesure d'activités microbiennes in situ. Cette technologie nécessite
l'emploi de sous-marins, actuellement remplacés par des ROVs (remotely-operated
vehicle) ou l'utilisation de chambres benthiques. Cette approche est destinée avant tout
à l'étude du domaine benthique : l'eau proche du fond et les sédiments superficiels.
-
La seconde est le développement de systèmes de prélèvement permettant de maintenir
la pression hydrostatique au cours du prélèvement d'un échantillon, lors de sa
remontée et lors de son incubation.
Cette dernière approche permet avant tout d'étudier les bactéries libres du domaine
océanique profond. L'article qui est présenté ci-après (manuscrit n°1 - Bianchi et al.,
soumis-a) présente une synthèse bibliographie des activités microbiennes mesurées à
l'aide de système de prélèvement d'échantillon en maintenant les conditions de pression
hydrostatique.
17
18
I.4 Manuscrit n°1
EFFECT OF PRESSURE CONDITIONS ON MICROBIAL
ACTIVITY MEASUREMENTS IN DEEP-SEA WATER: A
REVIEW
Armand Bianchi*, Christian Tamburini, Jean Garcin
Microbiologie Marine, UMR 6117 CNRS - INSU, Université de la Méditerranée, COM,
Campus de Luminy, case 907, F-13288 Marseille, cedex 9, France
*Corresponding author: [email protected]
Manuscript submitted to Marine Ecology Progress Series
(in revision in December 2002)
19
Préambule
Entre les travaux de ZoBell & Johnson sur les effets de la pression hydrostatique sur le
métabolisme bactérien publiés en 1949 et la fin des années soixante, peu d'études ont été
consacrées aux activités microbiennes du domaine océanique profond. Ce n'est qu'un accident
de navigation qui a suscité un regain d'intérêt pour ce thème de recherche. En effet, en 1968,
l'Alvin, le sous-marin de l'Institut Océanographique de Woods Hole, coule par 1500 m de
profondeur en emportant heureusement avec lui que les sandwiches destinés à son équipage.
Lorsque l'Alvin est renfloué 10 mois plus tard, les sandwiches sont retrouvés intacts. Cette
absence de dégradation d'un apport en matériel organique, pourtant fortement énergétique, ne
manque pas de surprendre les microbiologistes de Woods Hole. Ainsi, dès la remise en état de
l'Alvin,
Holger
W.
Jannasch
et
ses
collaborateurs
s'engagent
dans
une
série
d'expérimentations in situ à l'interface benthique par 1500 m de fond au large de leur Institut.
Ces auteurs utilisent l'Alvin pour déposer sur le fond océanique différentes solutions nutritives
qui restent en incubation in situ sur des périodes s'étalant jusqu'à 51 semaines. Ces premiers
résultats conduisent Jannasch et al. (1973) à conclure à un effet inhibiteur de la pression
hydrostatique sur les bactéries du domaine océanique profond puisque les activités mesurées
in situ à 1830 m étaient d'un à trois ordres de grandeurs plus faibles que celles mesurées sur
des échantillons témoins incubés à pression atmosphérique. Or, en opposition avec les
conclusions de cette équipe pionnière, il est maintenant clairement accepté que la
décompression affecte le métabolisme bactérien (ZoBell & Oppenheimer, 1950; Jaenicke,
1987; Straube et al., 1990; Turley & Lochte, 1990; Bianchi & Garcin, 1993; Bianchi &
Garcin, 1994; Poremba, 1994; Patching & Eardly, 1997; Tholosan et al., 1999).
Afin d'éclaircir ce paradoxe de nature à obérer toute conclusion sur les activités réelles des
microflores profondes, nous présentons, dans l'article qui suit, l'évolution des techniques
d'expérimentation in situ et de collecte d'échantillons en maintenant les conditions de pression
ambiantes ainsi qu'une synthèse de l'ensemble des mesures d'activités microbiennes obtenue
sans décompression publiées à ce jour dans la littérature.
20
I.4.1
Abstract
The deep-sea account for almost 90 % of the total global ocean volume. Here bacteria are
subjected to hydrostatic pressures exceeding 10 MPa. Since these pressure conditions are
known to affect bacterial growth kinetics, it is important to prevent pressure shock from
occurring when measuring microbial activity in samples taken from the deep-sea. This review
discusses the different experimental strategies devised to satisfy this requirement. Of the 117
assays reported in the current literature, 105 assays of these report metabolic rates measured
on samples collected and incubated without pressure shock (Vhp) and concomitantly on their
decompressed counterpart (Vdec). Using this data set, the difference between the two
measured rates is highly significant (p<0.0002), and Vhp = Vdec x 2.95 ± 5.10 (mean ± SD,
n=105). This ratio demonstrates that when the water column is stratified, the metabolic rates
measured on decompressed samples have been substantially underestimated. Conversely,
during periods of mixed water, the rates measured on decompressed samples have been
overestimated by more than one order of magnitude relative to those measured under in situ
pressure conditions. Because the pressure effect is highly variable, a single factor cannot be
used to correct rates measured with decompressed samples.
KEY WORDS: Bacteria. Respiration. Production. Enzymatic activity. Deep-sea. Pressure
I.4.2
Introduction
The World's oceans have an average depth of 3800 m, and the deep-sea, usually defined as
below 1000 m (Jannasch & Taylor, 1984), accounts for 88% of its global area. Bacteria are
well known to colonize this large domain until its deepest part (Yayanos, 1985). Research into
the effects of high-pressure conditions on the physiology of deep-sea bacteria has been
developed over the last century, and a synthesis of these works can be found in ZoBell (1970).
In this early period, the effect of pressure on microbial activity was studied on samples
subjected to a double pressure shock, decompression during retrieval and then recompression.
This stress is likely to alter the measurements of microbial activities suspected to intervene in
the nutrient cycling in the ocean. This lead to the development of techniques for collecting
deep-seawater samples avoiding decompression. The aims of this paper are 1) to present the
different approaches which have been used to sample and cultivate bacteria without
decompression, 2) to present the published data on microbial activity measurements which
have been carried out in deep-sea waters under ambient pressure conditions, 3) to use this data
set to statistically define whether or not pressure conditions intervene on the measurement of
21
microbial activities in deep-water samples, and ultimately 4) to estimate if the whole data set
allowed to calculate a single factor to significantly correct rates measured with decompressed
samples.
I.4.3
Data from the literature
The first assays to measure bacterial activity without decompression were performed by Seki
& Robinson (1969). They compared glucose uptake (250 µg l-1 final substrate concentration)
measured on samples decompressed during retrieval then incubated at atmospheric pressure or
recompressed in the laboratory. Their counterparts were incubated within the sampling
bottles, which were kept “in situ” at the filling depth for 4 hours. Authors showed that for
samples collected at 200 m, decompression did not affect the measured activity. However at
400-m decompression induced significant reduction for up to 60% of the uptake measured in
situ (Table 1).
The first pressure retaining-samplers were described by Macdonald & Gilchrist (1969) and by
Gundersen & Mountain (1972). However, these authors did not use these samplers for
bacterial activity measurements. Then, Jannasch & Wirsen (1973) performed a series of
incubations at the water-sediment interface at 1830 m depth, using the manned submersible
Alvin. Sterile incubation bottles containing starch, agar or gelatine solution at 1g l-1 were
deposited on the seafloor and filled with bottom seawater. Incubation was in situ until
recovery by means of the submersible, i.e. over a 51-weeks period. For other experiments, in
situ incubation lasted 14 weeks and added substrates were
14
C-labeled mannitol, acetate,
glutamate or casamino acids at final concentrations of 30, 10, 5 and 2 µg l-1. In both
experiments, substrate degradation was determined by a single end point measurement. Data
are reported as the percentage of substrate utilised during the incubation period (Table 1).
Incubation periods were 12 months for samples maintained on the seafloor, and only onemonth for those incubated under atmospheric pressure. To compare the efficiency of bacterial
degradation over the 2 incubation conditions, the authors applied a multiplying factor of 12 to
the rates measured under atmospheric pressure. The authors used this factor with no evidence
of the linearity of degradation rates over so long incubation periods in 120-ml closed systems.
Indeed, it is obvious that this factor introduced an overestimation of the rates estimated under
atmospheric pressure conditions. Furthermore, during the in situ experiments, bacteria were
submitted to decompression during the filling of the sampling bottles (Jannasch & Wirsen,
1973). These experimental defects may explain the observed slow down in the response of
22
deep-sea microbial populations when kept under ambient pressure conditions relative to their
decompressed controls.
To overcome the problems of decompression during filling, and to the single end point
measurement, Jannasch et al. (1973) designed a 1-l pressure retaining sampler/incubation
vessel. This equipment was used to compare microbial activity in 4 pairs of ambient pressure
samples and decompressed deep-sea samples (Jannasch et al. 1976). Data they presented refer
to time course experiments lasting up to 16 days (Table 1). Added substrates were L-U-14Cglutamic acid in the former assay, and a mixture of U-14C-labeled amino acids in the later;
final concentrations were about 5 mg l-1. This equipment allows 13-ml sub-samples to be
retrieved without decompression in the main culture, but each sub-sample requires the
addition of an equivalent volume of sterilised seawater, which then dilutes the remaining
culture.
As the high-pressure samples were incubated within the sampling bottle, the several day
incubation periods limit the sample numbers to be analysed during a cruise. To overcome this
limitation Jannasch & Wirsen (1977) designed a sampler to retrieve deep water at ambient
pressure, and to concentrate microbial populations. Bacteria from a 3-liter sample were
concentrated into a 13-ml volume and stored, independently of the sampling unit, under
ambient pressure and temperature. The sampler may then be sterilised again ready for other
deployments, while the concentrated sample is processed immediately, or later in the land
laboratory. The authors used this equipment to collect water samples at 2600m depth in the
North Atlantic. These samples were concentrated and stored for 45 days before transferring
into incubation bottles where experiments were carried out to measure the incorporation and
respiration of 14C-labeled casamino acids at a final concentration of 5 mg l-1. Incubations were
maintained over 13 days for a time series experiment, with sub-sampling avoiding
decompression of the main culture at 1, 3, 5, 8, 11 and 13 days (Table 1).
Ultimately Jannasch & Wirsen (1982) published data from a series of 15 pairs of seawater
samples, each pair including a sample collected at ambient pressure using the high-pressure
sampler and its decompressed counterpart collected using a Niskin baggy sampler. Samples
were retrieved at depths ranging from 1800 to 6000 m at 8 sampling stations in the Atlantic
Ocean. The authors used a series of diverse
14
C-labeled organic compounds (glutamate,
casamino acids, glucose, or acetate) at one of two final concentrations, 0.5 and 5.0 mg l-1.
Time series experiments lasted between 300 and 550 hours, the first sub-sample being
23
withdrawn within 12 to 80 hours of incubation. Data are presented as a series of graphs
showing substrate utilisation (incorporation or respiration) throughout the incubation period in
both decompressed and ambient pressure samples. Jannasch and Wirsen (1982) reported a
single “barophilic” response in samples collected at 4500-m depth. In all other assays the rates
of
14
C incorporation and respiration measured were lower at ambient pressure than in the
decompressed controls (Table 1). These observations lead the authors concluding that ambient
pressure conditions had a negative effect on microbial activity in the deep-sea. The plethoric
substrate enrichment, and the delay between the starting point of the incubation period and the
first sub-sampling, could support these conclusions.
Simultaneously, Colwell and collaborators developed two samplers (sample volume 350 and
400 ml) and a pressure retaining transfer system (Tabor & Colwell, 1976). Deming et al.
(1980) reported measurements carried out on 5 samples taken at ambient pressure in the
Puerto Rico trench at 3450-7730-m depth. Substrates were labelled using 14C-glutamic acid or
14
C-amino acid mixture (final concentrations ranging between 0.12 and 0.50mg l-1), and
incubation was between 43 and 326 days. More than 73 % of the utilised substrate was used
for energy yielding processes. But the percentage of added substrate utilised was surprisingly
low relative to previous observations (Deming et al. 1980). This article reports data referring
to the deepest sample never collected and incubated respecting ambient pressure conditions
(7750-m). Unfortunately, these authors did not measure activities in the same samples after
decompression (Table 1), preventing any estimation of the effect of pressure conditions on
metabolic activity measurement.
Using the same equipment, Tabor et al. (1981) provided data of substrate utilisation by
microbial populations from 5 samples collected at 3500 or 5220 m depth in the Atlantic.
Added substrates were 14C- glutamic acid (between 21 and 96 µg l-1, final concentration) and
14
C- sodium acetate (4.6 µg l-1). Total uptake rates were obtained using sub-samples drawn off
over time intervals of 1 to 130 days. The data set reports 5 uptake rates measured under
ambient pressure conditions ranging from 10 to 71 ng l-1 d-1. Within this data set, authors
compared samples taken at ambient pressure and their decompressed counterparts for a
unique pair of sample. The rate measured from ambient pressure samples was 38 times greater
than that measured under atmospheric pressure (Table 1).
Bianchi & Garcin (1993) used a 1.5-l high-pressure sampler, and a pressure-retaining transfer
bench. Six samples were collected using this gear from the Mediterranean Sea at 1100-m, in
the Gulf of Marseille during a period of water stratification. Bacterial incorporation of
24
14
C-
glucose (1.0 µg glucose l-1, final concentration) was studied over time course experiments
lasting 3 hours. Carbon incorporation rates measured in sub-samples transferred in 150-ml HP
syringes kept under ambient pressure conditions. These rates were compared to those obtained
from subsamples transferred to the 150-ml HP syringes, but decompressed following transfer,
and to those obtained from samples decompressed during collection using a Niskin bottle
fixed 1 m above the pressure-retaining sampler on the same hydrowire. Incubation was
carried out at in situ temperature (i.e. 13°C). These assays used a short incubation period to
minimise changes in bacterial communities in enclosed containers. Data, presented in the
form of kinetics graphs, showed that during the period of water stratification the incorporation
rate measured within the ambient pressure samples is higher relative to their decompressed
counterpart (Table 1).
The same authors used this equipment to collect water at 1100 m in the Ligurian Sea, at
periods in the year where different hydrological conditions could be observed. During the
warmer period the water column was stratified, in the winter period the water masses were
mixed (Bianchi & Garcin, 1994). Incorporation rates of
14
C-glucose (added at 5.8 nM, final
concentration) were measured during time course experiments lasting 3 hours at 13°C (in situ
temperature). During the stratified water period, bacteria exhibited barophilic behaviour, as
previously observed in the Marseille area. They were significantly (at p <0.05) more active
when incubated under ambient pressure (59.5 ± 10.9 pg C l-1 h-1, n = 8) than under
atmospheric pressure (23.6 ± 14.4 pg C l-1 h-1, n = 8) (Table 1). In stratified water conditions,
samples collected at 1100-m depth are actually representative of the deep water-masses. Such
deep-water masses include bacteria adapted to the ambient pressure conditions.
During the mixed-water period, bacteria collected at the same depth from the same sampling
station responded differently. Bacteria in samples decompressed appeared significantly (at p
<0.005) more active (421.2 ± 43.3 pg C incorporated l-1 h-1, n = 3) than the ambient pressure
samples (14.5 ± 6.3 pg C incorporated l-1 h-1, n = 3). During the winter period, cooling of the
sea surface locally produces a cascading of surficial water to the depth. In these mixed water
conditions, samples collected at 1100 m correspond to surface water recently downwelled to
the sampling depth with its native bacterial population. These surficial organisms are not
adapted to the effects of high-pressure conditions, so their metabolic rates are slowed down
when kept under deep-sea conditions. This inhibition being reversible, they retrieve their
original metabolic rates when incubated under atmospheric pressure conditions. Due to the
Mediterranean Sea homeothermy, except the superficial layer, temperature conditions are
25
quite identical (13°C) through the whole water column whatever the season. Incubation
conditions respected this homogeneous ambient temperature, so the observed change in
metabolic activity resulted only from change in pressure conditions.
The results show that even at 1100-m bacterial activities vary depending on the season and on
hydrological conditions. Such variability highlights the necessity to collect microbial activity
measurements along side with conventional hydrological parameters, which determine the
origin and the history of the studied water masses. Ignoring these key parameters could make
difficult interpretation of microbial activity variability through time and space.
To allow high-pressure growth experiments to be conducted over a time course using a single
undivided bacteriological culture, Tholosan et al. (1999) designed a 5-l high-pressure sampler
(HPS). They used this equipment to study 27 pairs of samples. Each pair included the water
sample taken at ambient pressure and incubated in the HPS, and a decompressed sub-sample
withdrawn from the high-pressure sampler. Twenty-four samples were collected in the
Ligurian Sea between 800 and 2000 m at the same sampling station. Additionally, 3 samples
were collected between 900 and 1150 m in the Gulf of Marseille. Twenty four sub-samples
were labelled using 14C-glucose or 14C-amino acids mixture (10 nM, final concentration), and
15 sub-samples were labelled using 3H-thymidine (10 nM, final concentration), to measure
14
C- uptake and bacterial production rates, respectively. Incubation was at in situ temperature
(13°C), and time course experiments lasted 12 hours. Graphs present the depth profiles of 14Cuptake rates or bacterial biomass production rates, for ambient pressure samples and
decompressed samples obtained during each of the 6 cruises successively done on this
sampling station (Table 1). This allows a statistical study on the effect that pressure conditions
have on measured metabolic rates to be carried out. The effect of decompression is estimated
by the ratio of the rate measured under ambient pressure conditions to the rate measured on
decompressed samples (Pe). Among this set of 39 pairs of data, 34 showed a decrease in
potential metabolic activity when samples were analysed away from their natural hydrostatic
conditions (Pe >1). Only one sample showed a negative effect of ambient pressure (Pe =
0.89), while four others appeared unaffected by pressure (Pe ~ 1). An overall estimation of Pe
shows that the measured metabolic rates were nearly 3.5 times higher in the ambient pressure
samples than in their decompressed counterparts: Pe = 3.72 ± 1.17, n = 24, for carbon uptake
and Pe = 3.48 ± 1.22, n = 15, for bacterial production rates.
This series of repetitive sampling demonstrated that, even in the deep-water masses, bacterial
activity is far from constant throughout the year. This variability can not be restricted to a
26
seasonal scale. Important variations in metabolic rates may be observed in the same water
masses over just a few days. Bianchi et al. (1999 a) repeatedly collected seawater samples at
1150 m at the same sampling station during a 12-day cruise. During this interval of time,
amino acid uptake and bacterial biomass production rates increased 8- and 24-fold,
respectively (Table 1). Furthermore, bacterial populations collected at the beginning and end
of this period reacted differently to changes in pressure conditions. In the earlier phase of the
study, bacteria collected at 1150 m were adapted to ambient pressure (Pe = 2.2 and 1.5 for
uptake and production rates, respectively), while those collected 12 days later were unaffected
by pressure conditions (Pe ~1). During the same period, the scanning electron microscope
observations and in situ observations using an Underwater Video Profiler showed a 2-fold
increase in particle concentrations. Most of these particles were identified as faecal pellets
produced by zooplankton which migrate regularly through the water column. The authors
suggest that such repetitive migration could induce the selection of bacterial populations
which are unaffected by pressure changes.
In order to obtain microbial activity data, unbiased by decompression during retrieval, but
having the same frequency of sampling used in measurement of other hydrological
parameters, and avoiding any delay in sample processing as implicated by the gear proposed
by Jannasch & Wirsen (1977), Bianchi et al. (1999 b) developed a high-pressure serial
sampler (HPSS). This device, based on a commercially available multi-sampling device that
includes a CTD, may be equipped with eight 500-ml high-pressure bottles. The HPSS allows
to collect 8 ambient pressure water samples at different depths during the same hydrocast,
down to a depth of 3500 m. In this article, authors used 3H-leucine (5 nM final concentration)
to determine bacterial carbon production in samples collected at 850, 1300, 1500 and 2000-m
from the same water column in the Ligurian Sea. Decompressed and ambient pressure
samples were treated in exactly the same way: each pair of samples was collected into 2
identical high-pressure bottles, which were filled at the same time through the same 2-way
valve. One of these bottles was kept at the in situ pressure, the other, fitted without a check
valve, was progressively decompressed as it came up to the surface. Data shows that during a
stratified water period, production rates measured on decompressed samples are
underestimated (Table 1).
Previous studies performed under ambient deep-sea conditions measured bacterial production
or the uptake of low molecular weight compounds. Yet, deep-sea bacteria are mainly fuelled
by high-molecular weight compounds carried down by sinking particles. Indeed,
27
ectoenzymatic hydrolysis of large biopolymers into smaller molecules is a preliminary and
obligatory step for the degradation of organic matter in aquatic systems (Chrost, 1991). The
first assays to measure ectoenzymatic activities of deep-seawater natural microbial
communities under ambient pressure conditions were carried out by Tamburini et al. (2002).
These authors used the HPSS to measure aminopeptidase and phosphatase rates and bacterial
production rates, on decompressed and ambient pressure samples collected between 1000 and
2000-m, through the same water column in the Ligurian Sea (Table 1). Assays were run over
time course experiments at in situ temperature using the analogue substrates (Leu-MCA and
MUF-phosphate, respectively) at saturation concentrations. At 2000 m, the rates for
aminopeptidase and phosphatase activities measured under ambient pressure conditions
ranged between 386 and 835 pM MCA h-1, and 443 and 468 pM MUF h-1, respectively.
During the water stratification period, decompression of samples inhibited hydrolytic activity
by nearly 50%, and the effect appeared at 1000 m.
I.4.4
Discussion
I.4.4.1 Advantages and disadvantages of previous experimental strategies
To measure microbial activities in deep-water samples under ambient pressure conditions, 3
different experimental strategies have been used:
a) In situ incubation of seawater samples within the sampling bottle kept at depth with the
hydrowire (Seki & Robinson, 1969). Such processing implies that the research vessel is
immobilised for the entire incubation period. An excessive cost in ship time is likely to be the
reason why this technique has not been used by other microbiologists.
b) In situ incubation of samples at the water sediment interface, by using a man-operated
submersible (Jannasch & Wirsen, 1973). In addition to the excessive cost of diving
operations, the difficulty to manage an adequate incubation period and the impossibility to
carry out time course experiments have drastically restricted the use of this strategy.
c) Sampling and incubation using pressure-retaining bottles (Jannasch et al. 1973; Tabor et al.
1981; Bianchi & Garcin, 1993). The advantage of this experimental strategy is that time
course experiments may be run as sub-samples can be taken off without decompressing the
main culture. When stowed on a multi-sampler device, microbial activity measurements may
be modelled on the sampling strategy used for other hydrological parameters (Bianchi et al.,
1999).
28
I.4.4.2 Influence of factors other than pressure conditions on the measured
metabolic rates
The pioneering studies under ambient pressure conditions used incubation periods up to 1
year (Jannasch & Wirsen, 1973), and plethoric substrate concentrations ranging between 5 µg
l-1 and 5 g l-1. Furthermore, these authors used different periods of incubation for
decompressed and ambient pressure samples (Jannasch & Wirsen, 1973). Today such
conditions appear unsatisfactory, as the linearity of metabolic rates for so long incubation
periods in small volume sealed vessels is unlikely, making difficult to define what does the
microbial activities measured during these assays mean. The comparisons between
decompressed and undecompressed samples published during this early period are made
difficult by diverse experimental inconsistencies, like the use of different samplers and
incubation vials to measure activities under ambient pressure and under atmospheric pressure
conditions. These experimental differences probably explain the discrepancies between
experimental results reported by these authors. Some authors (Seki & Robinson, 1969; Tabor
et al. 1981; Bianchi & Garcin, 1993) observed an inhibitory effect of decompression relative
to the samples incubated under ambient pressure condition, whereas Jannasch & Wirsen,
(1973; 1982) observed the opposite behaviour.
Evidence that decompression alters microbial activity measurement in deep-sea water samples
has only been provided recently using the high-pressure serial sampler. This equipment
enables the comparison of metabolic rates measured on two samples simultaneously collected
into two identical containers, via the same entry valve, and then processed exactly in the same
manner, except pressure conditions (Bianchi et al. 1999 b). Moreover, each step of the
bacterial organic matter mineralization is adapted to ambient pressure conditions (Bianchi et
al. 1999 a,b; Tholosan et al. 1999; Tamburini et al. 2002)
I.4.4.3 Is there statistical evidence showing the effect of sample decompression on
metabolic rates measurement?
To define whether or not decompression of deep-sea samples affects the measure of metabolic
rates, we used the set of data that concomitantly report the metabolic rates measured on the
undecompressed sample and on its decompressed counterpart (table 1). Only data obtained
using different incubation period for undecompressed and decompressed samples (Jannasch &
Wirsen, 1973) were excluded from this study. This comparison concerns 105 pairs of
samples. A t-test performed on this set of data shows that the pressure effect ratio is
29
statistically different from 1 (p<0.0002). This means that there is a highly significant
difference between metabolic rates measured under ambient pressure conditions and their
counterparts measured on decompressed samples.
I.4.4.4 Is it possible to define a factor to correct data obtained on decompressed
samples?
This evidence suggests that most of the microbial activity data currently published from deepwater samples are under-estimated, as they were obtained using conventional samplers, and
were therefore decompressed during retrieval. It should be of interest to find a correction
factor in order to validate these data. When we consider the above cited pool of 105 pairs of
samples, the average value for the pressure effect is 2.95 ± 5.10 (± SE). The Box-and-Whisker
plots, shows that the median value for Pe is 1.7 (n=105) (Fig. 1), but only fifty percent of the
values are included between 1.0 and 2.6. Such a distribution and variability of the ratio Pe
suggest that there is little value in using either the average or the median value as a constant
factor to correct microbial metabolic rates obtained from decompressed samples.
Pe
45
40
35
n = 77
Average = 4.5
Median = 2.2
30
25
20
15
10
5
0
Figure 1. Box-and-Whisker plot of the pressure effect (Pe) in stratified period conditions. n=77 with 14 data
from (Bianchi & Garcin, 1994); 3 from (Bianchi et al., 1999a); 39 from (Tholosan et al., 1999); 7 from
(Tholosan, 1999); 4 from (Bianchi et al., 1999b); 10 from (Tamburini et al., 2002).
30
I.4.4.5 Conclusion
The collected data set shows that decompression affects microbial activity measurement of
deep seawater samples. Decompression affects all the metabolic processes studied, bacterial
respiration and assimilation, protein biosynthesis, thymidine incorporation into DNA and also
ectoenzymatic activity like aminopeptidase and alkaline phosphatase. Effects of
decompression are variable, making difficult to use a constant factor to correct the metabolic
rates measured on decompressed samples. Specific equipment allows valuable measurements
of microbial activity in deep seawater to be made at the same frequency as other parameters.
The immediate task for marine microbiologists will be to improve the sensitivity of the
microbiological techniques and decrease the substrate addition so as to mimic natural
concentrations, in order that actual metabolic rates can be measured in deep-sea microbial
populations. From this, it should be possible to calculate the actual flow of matter and energy
processed via microbial activity throughout the water column, including the deep sea. This
would produce better integration of microbiological data when modelling nutrient cycling in
the oceans.
Acknowledgements. - This work was partially funded by the Institut National des Sciences de l'Univers and
Total-Fina-Elf (grant n° 11 997 – CNRS/ENTREPRISE). C.T. was supported by a fellowship co-funded by
INSU and Total-Fina-Elf. Authors greatly thank Jean Pierre Durbec for helpful comments for statistical
treatment of data, and Tracy Bentley for improving the English language.
I.4.5
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33
34
Chapitre II
MATERIEL ET METHODES
Chapitre II – Matériel et méthodes
II. MATERIEL ET METHODES
II.1 Présentation des sites d'étude
Les sites d'études présentés dans ce mémoire sont localisés en Méditerranée (Figure II-1) :
-
en Mer Ligure, dans le programme DYFAMED,
-
en Mer Ionienne, lors de la campagne Européenne BioDeep,
-
en Méditerranée Nord-occidentale, dans le Golfe du Lion dans le Canyon LacazeDuthiers.
La Méditerranée fournit la possibilité d'étudier la minéralisation de la matière organique par
les microflores profondes en séparant les effets de deux facteurs abiotiques généralement
concomitants : l'accroissement de pression hydrostatique et la chute de température. En effet,
contrairement aux Océans, la Mer Méditerranée présente une relative homéothermie de 13°C
dès la sub-surface jusqu'en profondeur. De plus, cette mer constitue un véritable modèle
réduit de l'océan en général puisque dans une échelle spatiale limitée on peut trouver la
formation d'eau profonde et de mouvement d'upwelling et des systèmes de type oligotrophe
jusqu'à des zones plus riches en éléments nutritifs (zones eutrophes).
Figure II-1. Carte représentant les différents sites étudiés.
35
II.1.1 Mer Ligure
La station DYFAMED (DYnamique des Flux de mAtière en MEDiterranée) est située à 28
milles nautiques au sud-est de Nice (43°25' N, 07°52' E; profondeur maximale de 2300 m) sur
la radiale Nice-Calvi (Figure II-2) et présente l'avantage d'être une station d'études à séries
temporelles du programme pluridisciplinaire JGOFS-France (Joint Global Ocean Flux
Studies) depuis 1988. Un des objectifs du programme JGOFS est de mieux comprendre le rôle
de l'Océan dans le cycle global du carbone. Le centre du bassin Liguro-Provençal Catalan, où
se situe la station DYFAMED, constitue un milieu homogène isolé des apports terrigènes
directs de la côte et hors influence du courant provençal-catalan. Seuls les apports
atmosphériques constituent des apports terrigènes significatifs. Pour ces raisons, la station
DYFAMED est considérée comme une station océanique généralement dépourvue
d'advection horizontale (Marty et al., 1994).
Figure II-2. Localisation de la station DYFAMED, station de séries temporelles JGOFS-France.
Bénéficiant des différentes études pluridisciplinaires sur ce site, nous pouvons le caractériser
d'un point de vue hydrologique et géochimique.
La structure hydrologique de la Méditerranée Nord Occidentale est maintenant bien connue
(voir la synthèse récente de Send et al., 1999). Très succinctement, la colonne d'eau de la
station DYFAMED épaisse de 2300 m comprend selon Béthoux et al. (1988) : (1) une masse
d'eau de surface (0-200 m) caractérisée par des variations saisonnières de température, (2) une
eau intermédiaire d'origine Levantine (Levantine Intermediate Water, LIW) caractérisée par
36
une salinité supérieure à 38,45, une forte concentration en nutriments et un minimum
d'oxygène situé entre 300 et 400 m et (3) une eau profonde plus froide et moins salée que la
LIW. Cette masse d'eau, l'eau profonde méditerranéenne occidentale (Western Deep
Mediterranean Water, WDMW), caractérisée par une température (12,70°C) et une salinité
(38,40) stable toute l'année, est formée via des convections profondes dans le Golfe du Lion.
Entre les eaux de surface et la LIW, l'eau intermédiaire d'hiver (Winter Intermediate Water,
WIW) est souvent observée.
La synthèse des concentrations en nutriments et des pigments phytoplanctoniques réalisée par
Marty et al. (2002) de 1991 à 1999 nous renseigne sur les systèmes de production variant en
fonction des successions hydrologiques saisonnières du système mésotrophe au printemps au
système oligotrophe en été et en automne. Dès 200 m de profondeur, les concentrations en
nitrates sont comprises entre 7 et 8 µM, en phosphates entre 0,4 et 0,5 µM et en silicates
entre 5 et 8 µM. Les concentrations en nitrates, phosphates et silicates atteignent
respectivement 2-3, 0,15-0,2 et 2-3 µM au cours des mélanges hivernaux. Les concentrations
des nutriments décroissent en surface avec l'accroissement de la stratification pour atteindre
des concentrations à la limite de détection des méthodes (<0,05 µM) de Juin à Novembre. La
distribution de la biomasse phytoplanctonique suit l'hydrologie de la zone et la distribution
des nutriments. Marty et al. (2002) ont établi que dans cette zone, les eaux de surface
montrent une limitation en N en hiver et au printemps et une limitation en P durant les
conditions oligotrophes en été et en automne.
La production primaire annuelle varie entre 86 et 232 g C m-2 an-1. La moyenne sur 7 ans (de
1993 à 1999) est égale à 156 g C m-2 an-1, ce qui permet de considérer la zone comme étant
oligotrophe (Marty & Chiaverini, 2002). Les valeurs maximales atteignent 1,8 g C m-2 d-1 en
mars ou avril; les valeurs les plus basses sont observées d'octobre à janvier, dans une gamme
de 100 à 300 mg C m-2 d-1. Ces mêmes auteurs estiment que l'export potentiel de production
varie dans une gamme de 19 à 71 g C m-2 an-1, valeurs concordantes avec celles de Béthoux
(1989) obtenues en utilisant une méthodologie différente. L'export annuel de carbone
organique dissous (DOC) pour les 100 premiers mètres est estimé à 12 g C m-2 an-1 (Avril,
2002), valeur proche de celle observée par Carlson et al. (1994). Ces valeurs apparaissent
largement plus importantes que les flux particulaires moyens mesurés à l'aide de piège à
sédiments à 200 et 1000 m de profondeur (respectivement 5 g C m-2 an-1 et 1,2 g m-2 an-1 par
Miquel et al., 1994; 7 g C m-2 an-1 par Marty et al., 1994) et que les flux de grosses particules
qui représentent environ 10 % de la production primaire durant la période mésotrophe
37
(Stemmann et al., 2002). Ce résultat suggèrerait qu'à la station DYFAMED, le carbone
exporté par diffusion et advection des masses d'eau vers le domaine profond est
essentiellement issu du COD accumulé dans la couche de surface (Lefèvre et al., 1996).
La station DYFAMED a été visitée en avril 2000, septembre 2000, mars 2001 et novembre
2001 pour un échantillonnage le long de la colonne d'eau entre 10 et 2000 m de profondeur.
Les prélèvements de sédiments n'ont pu être réalisés qu'en septembre 2000, les conditions
météorologiques n'ayant pas permis la réalisation de carottages lors des autres campagnes
programmées dans ce but.
II.1.2 Mer Ionienne
Au cours de la campagne européenne BioDeep (BIOtechnology from the DEEP), 4 bassins
profonds hypersalés et anoxiques (DHAB) ont été visités (Figure II-3); trois bassins très
proches, Discovery (35°16'61N, 21°41'42E), L'Atalante (35°18'14N, 21°23'43E), et Urania
(35°13'70N, 21°31'14E), et le bassin Bannock (34°21'64N, 20°02'26E). Ces DHAB sont à
une profondeur d'environ 3500 m. Pour pouvoir comparer les vitesses des activités mesurées
dans ces environnements extrêmes très particuliers, nous avons également échantillonné
l'ensemble de la colonne d'eau sus-jacente.
Figure II-3. Localisation des bassins profonds hypersalés et anoxiques visités lors de la campagne BioDeep.
38
Trois masses d'eaux principales peuvent être caractérisées en mer Ionienne (Malanotte-Rizzoli
et al., 1997). Les eaux atlantiques modifiées (MAW pour Modified Atlantic Water; Tmoy =
17,84 / Smoy = 38,46) présentent un minimum de salinité en sub-surface (entre 30 et 200 m de
profondeur). Cette masse d'eau surplombe les eaux intermédiaires levantines (LIW pour
Levantine Intermediate Water), identifiées par une salinité maximale, aux profondeurs situées
entre 200 et 600 m. La masse d'eau profonde, en-dessous de 1600 m, est plus froide et moins
salée que les eaux méditerranéennes orientales (EMDW pour Eastern Mediterranean Deep
Water), la principale origine de cette masse profonde étant l'eau de mer profonde de
l'Adriatique (ADW pour Adriatic Deep Water). A ces trois masses d'eaux principales, deux
masses d'eaux peuvent être ajoutées : une couche de transition (mélange des LIW et EMDW)
occupe les profondeurs situées entre 600 et 1600 m, et une eau de sub-surface qui, en été,
peut être différenciées de la MAW car plus salée et plus chaude (Figure II-4).
17,0
16,5
IDW
16,0
MADW
Theta (°C)
15,5
LIW
15,0
14,5
14,0
Transition
de EMDW
13,5
13,0
ADW
12,5
12,0
38,7
38,8
38,8
38,9
38,9
39,0
39,0
Salinité
Figure II-4. Diagramme Theta/S (température/salinité) en Mer Ionienne obtenu à l'aide de la CTD de l'HPSS au
cours de la campagne BioDeep en Août 2000. ADW: eaux adriatiques profondes (Adriatic Deep Water);
Transition de EMDW: masses d'eaux profondes, transition entre eaux méditerranéennes profondes orientales
(Eastern Mediterranean Deep Water) et ADW; LIW : eaux levantines intermédiaires (Levantine Intermediate
Water); MAW: eaux atlantiques modifiées (Modified Atlantic Water). Masses d'eaux déterminées d'après
Malanotte-Rizzoli et al. (1997).
La production primaire de surface et le flux particulaire (à 200m), estimés par Moutin &
Raimbault (2002) entre mai et juin 1996 dans la même zone, étaient respectivement de 303 et
4,2 mg C m-2 d-1. Le DOC est maximum vers 70-100 m de profondeur (≈2,5 mg C l-1;
Henneke & De Lange, 1990). En dessous cette couche, ces auteurs montrent que la
concentration en DOC est quasi constante avec une valeur d'environ 1,5 mg C l-1. Les valeurs
de POC décroissent graduellement avec la profondeur de 20 à 5 µg C l-1. Henneke & De
39
Lange (1990) ont montré que le DOC et le POC s'accumulent à l'interface eau de mer
oxygénée/saumure atteignant des valeurs respectives d'environ 4 mg C l-1 et de 150 µg C l-1.
Dans les saumures de Bannock, les concentrations en POC (50 µg l-1) sont 10 fois plus
importantes que dans l'eau de mer oxique susjacente. Les concentrations en DOC varient,
dans les saumures entre 2,5 et 4 mg C l-1 (Henneke & De Lange, 1990).
II.1.3 Mer Méditerranée Nord-occidentale
Au cours de la campagne AMIBE (Activités Microbiennes BEnthiques), l’ensemble des
prélèvements de sédiments profonds (18 carottages multitube et 3 positionnements de la
Chambre Benthique) s’inscrit dans un carré de moins de 900 m de coté dans l’axe du Canyon
Lacaze-Duthiers à 900 m de profondeur (42°27 N, 03°29 E). La zone de référence côtière est
située dans la baie de Banyuls à 37 m de profondeur (42°27 N, 03°09 E).
Le Canyon Lacaze-Duthiers se situe dans le Golfe du Lion en Méditerranée Nord Occidentale
(Figure II-5). La sédimentation et la distribution des particules sont contrôlées principalement
par l'environnement hydrodynamique. La circulation océanique est influencée par le courant
Liguro-Provençal Catalan (LPC), courant cyclonique arrivant de la Mer Ligure le long de la
pente continentale du Golfe du Lion. Le LPC entraîne les eaux atlantiques modifiées de
surface (MAW d'une profondeur de 100-200 m) entrées par le détroit de Gibraltar et une
partie des eaux levantines (LIW). Sous les LIW, l'eau méditerranéenne profonde occidentale
(WMDW) suit également les isobathes vers le sud-ouest (Millot, 1990). Les apports de
matières organiques sont à la fois d'origine continentale issus du plateau et de la pente
continentale, et d'origine biologique (production primaire) (Monaco et al., 1990a,b). Les
apports terrigènes dans la zone d'étude sont à 90 % assurés par le Rhône (Monaco et al.,
1990a). Les échantillons des pièges à sédiments et des sédiments disposés dans le Canyon
Lacaze-Duthiers dévoilent un caractère détritique plus marqué en hiver. A l'opposé, les
apports advectifs de matière organique fraîche sont accrus de mars à mai (Buscail et al., 1990;
Monaco et al., 1990a,b). La partie superficielle du sédiment ("fluf") contient environ 0,8 % de
TOC (poids sec, Buscail et al., 1990). L'apport annuel des flux de carbone déterminés à l'aide
de pièges à sédiments en 1994-1995 donnait un flux de 10,7 g C m-2 an-1 dans l'axe du
Canyon (Heussner et al., 1996 in Schmiedl et al., 2000).
40
Figure II-5. Localisation des stations visitées au cours de la campagne AMIBE dans l'axe du canon LacazeDuthiers. AXE : station profonde 900 m (42°27 N, 03°29 E); VC : vase côtières de la Baie de Banyuls à 37 m de
profondeur (42°27 N, 03°09 E).
II.2 Moyens à la mer
II.2.1 Prélèvements dans la colonne d'eau de mer
II.2.1.1 Description de l'HPSS
Les prélèvements d'eau de mer ont été effectués en utilisant le préleveur multiple hyperbare
(HPSS pour High Pressure Serial Sampler, Figure II-6). Brièvement (pour des détails
complémentaires voir Bianchi et al., 1999b), l'HPSS est constitué d'un Carrousel SBE 32 nonmodifié (Sea-Bird Electronics Inc.; Bellevue, WS 98005, USA) sur lequel on peut installer,
par exemple, 6 bouteilles de prélèvement hyperbares d'un volume interne de 500 ml (HPSU
pour High Pressure Sampler Unit) aux côtés de 5 bouteilles Niskin. Couplée au Carrousel, la
sonde CTD SBE 911plus nous permet de contrôler en temps réel, via le câble électroporteur
du navire jonction entre le Carrousel et l'unité de pont (SBE 11plus Deck Unit) et un
41
ordinateur, la pression hydrostatique à l'intérieur des HPSU en même temps que les données
hydrologiques classiques (salinité, température, pression, oxygène, etc…).
Figure II-6. Photographie du préleveur multiple hyperbare (HPSS) (Bianchi et al., 1999b).
II.2.1.2 Principe d'une HPSU
Le principe d'une bouteille de prélèvement hyperbare (HPSU) est basé sur celui d'une
seringue (Figure II-7). Le corps est en acier inoxydable chemisé d'un revêtement
chimiquement inerte en PEEK.
Avant de virer l'HPSS à l'eau, le piston est positionné en butée en tête de l'HPSU; le traceur
(choisi pour la mesure d'une activité microbienne) est injecté dans la canalisation d'entrée. Au
cours de la descente, l'étanchéité des bouteilles est vérifiée en s'assurant que la pression
interne des HPSU reste égale à 0,1 MPa. A la profondeur désirée pour remplir l'HPSU, la
vanne d'ouverture est déclenchée (par commande directe via l'ordinateur de bord et la CTD).
La pression hydrostatique externe provoque le déplacement du piston. Ce déplacement est
ralenti par un frein hydraulique, la chambre basse de l'HPSU étant remplie d'eau distillée qui
s'écoule lentement au travers d'un fin cathéter (0,01") dans le réservoir de fuite à pression
atmosphérique. Ce dispositif
permet un remplissage progressif et sans changement de
pression hydrostatique de l'échantillon, ce qui est vérifié par l'enregistrement en continu de ce
paramètre.
42
Figure II-7. Schéma du remplissage d'une bouteille de prélèvement hyperbare (HPSU). (*) La vanne d'ouverture
est déclenchée par l'expérimentateur via le câble électroporteur du navire. Lorsque la vanne d'ouverture est
déclenchée, la pression hydrostatique pousse le piston flottant posé sur un frein hydraulique. L'eau distillée en
chambre basse de la seringue, va s'évacuer lentement dans le réservoir de fuite à pression atmosphérique via un
fin cathéter (Bianchi et al., 1999b).
Une fois le remplissage terminé (environ 15 min), lors de la remontée, la pression
hydrostatique de l'échantillon est maintenue par des clapets anti-retour.
A bord du navire, les HPSU sont incubées à température in situ. Le prélèvement de souséchantillons s'effectue en exerçant une contre pression, supérieure d'environ 0,2 MPa à la
pression in situ pour faire remonter le piston. Ainsi, l'échantillon principal ne subit pas de
décompression tout au long de l'incubation, et l'analyse des sous-échantillons permet de suivre
le devenir au cours du temps du traceur injecté en début de manipulation.
II.2.1.3 Cas particulier de l'échantillonnage sans décompression dans les DHAB
Lors de la campagne BioDeep, les prélèvements dans la colonne d'eau oxique ont été
effectués à l'aide de l'HPSS; par contre, dans les bassins profonds hypersalés et anoxiques
(DHAB) ont été réalisés à l'aide d'une bouteille hyperbare d'un volume de 5 litres (HP-5L). Le
principe de l'HP-5L est identique à celui des HPSU. Pour les besoins particuliers de la
43
mission, un module autonome de prélèvement (nommé MODUS/SCIPACK) adapté à prélever
à l'intérieur des bassins hypersalés a été conçu par la société Tecnomare S.p.A. L'HP-5L était
installée sur ce module aux côtés de bouteilles Niskin (Figure II-8). L'échantillon obtenu à
l'aide de l'HP-5L était transféré sans décompression dans des bouteilles de prélèvements
hyperbares de 500 ml (HPSU) et le devenir des traceurs injectés suivis au cours du temps
comme décrit précédemment.
Figure II-8. Photographie de la bouteille hyperbare de 5 litres (HP-5L) montée aux côtés de bouteille Niskin sur
un support (Scipack) spécifiquement conçu par la société Tecnomare S.p.A. pour pénétrer dans les bassins
profonds hypersalés et anoxiques (DHAB).
II.2.2 Prélèvements du sédiment
Les activités métaboliques microbiennes dans l'eau proche du fond et les sédiments ont été
mesurées sur différents types d’échantillons :
-
Des échantillons prélevés classiquement dans une carotte (carottier multitubes :
diamètre de 10 cm, longueur entre 30-50 cm) dans laquelle on prélève d’abord l’eau
proche du fond par siphonnage, puis les niveaux sédimentaires successifs par souscarottage au moyen d’une seringue à l’extrémité tronquée. Ces différents souséchantillons sont incubés séparément en présence de traceurs (14C-glutamate, MCALeu, MUF-P) fournis dans différentes gammes de concentrations, du niveau trace (i.e.
inférieur à la concentration naturelle) jusqu’à une concentration saturante.
-
Des incubations in situ au moyen du "Banyuls Lander" effectuées en collaboration
avec Francis de Bovée (OSU Banyuls-sur-Mer), les traceurs étant injectés dans l’eau
44
surnageante. Dans ce cas l’incubation est effectuée à la température et à la pression in
situ (Figure II-9), des sous-échantillons sont prélevés séquentiellement dans l’eau
surnageante pour définir la cinétique de minéralisation du glutamate, ou d’hydrolyse
du polymère injecté. Pendant toute la durée d’incubation la consommation d’oxygène
est mesurée dans une chambre analogue à la chambre d’injection (Picon, 2000).
-
Des échantillons où l’interface eau-sédiment est préservée, en mettant en incubation
aussitôt après leur collecte des tubes du carottier contenant le sédiment et son eau
surnageante non perturbée. Les mêmes traceurs que ci-dessus sont injectés dans l’eau
surnageante à concentration trace ou à concentration saturante. Ces carottes incubées
nous permettaient de suivre l'évolution du traceur injecté en essayant de perturber le
moins possible les conditions in situ (interface eau-sédiment conservée, température in
situ) excepté le facteur de pression hydrostatique seul paramètre différant de celui des
incubations effectuées à l'aide du "Banyuls Lander".
3
1
2
Figure II-9. Schéma d'une chambre benthique. (1) barreau d'agitation; (2) sonde à oxygène; (3) seringues de
prélèvement et d'injection. Dans le cas du "Banyuls Lander" qui comporte 4 chambres benthiques, 2 chambres
étaient équipées de sondes à oxygène (2), les 2 autres de seringues (3).
45
II.3 Abondance et biomasse bactérienne
II.3.1 Préparation des échantillons d'eau de mer
Pour le comptage des cellules bactériennes, des sous-échantillons (de 5 à 20 ml) étaient
récupérés juste après l'échantillonnage et fixés par addition de 2 ml de formaldéhyde
tamponné par 70 g l-1 de borate (concentration finale égale à 2 %, filtré sur Acrodisc® 0,2 µm)
et conservé à 4°C. L'échantillon est alors filtré, sur une membrane en polycarbonate noire (0,2
µm de porosité, 25 mm de diamètre ; Poretics® Products) posée sur un pré-filtre Whatman
GF/C pour homogénéiser la surface de filtration, et coloré par du DAPI à 2-2,5 µg ml-1 en
concentration finale (Porter & Feig, 1980). La coloration se fait directement dans la tourelle
de filtration pendant 10 min, puis les filtres sont disposés entre lame et lamelle avec de l'huile
à immersion (Olympus UVFL.SI). Les lames sont préparées à bord et peuvent être stockées à
–18°C jusqu'à visualisation au microscope à épifluorescence. Les bactéries apparaissent alors
fluorescentes bleues sous lumière UV.
II.3.2 Préparation des échantillons de sédiment
Contrairement aux échantillons d'eau de mer, le protocole de comptage des bactéries des
sédiments ne bénéficie pas d'une méthodologie consensuelle. Les caractéristiques de
granulométrie, de porosité, de structures et de qualités sédimentaires rendent impossible
l'utilisation d'une méthode standardisée.
II.3.2.1 Technique de la dilution
L'échantillon de sédiment destiné au comptage des cellules bactériennes a été préalablement
dilué au 1/2 par de l'eau surnageante filtrée sur 0,2 µm et formolée à 5 %. Des dilutions
successives sont réalisées (Figure II-10) en effectuant une sonication pendant 2 min.
(puissance 75 watts, 60 % d'efficacité) au suspension 1/4 et 1/40. Pour éviter une prolifération
bactérienne, la suspension finale (1/1600) est fixée par 1 % de formol en concentration finale.
Un volume de 1 ml est filtré sur membrane Poretics® noire de porosité 0,2 µm puis coloré au
DAPI (5 µg l-1 en concentration finale) comme les échantillons d'eau de mer.
46
1 ml
1/2
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
9 ml
9 ml
3 ml
EMF
EMF
EMF
EMF
1/4
1/40
1/400
1/1600
Ultrasonication
(2', 75 W, efficacité = 60 %)
Figure II-10. Extraction-dilution du sédiment pour le comptage des cellules bactériennes.
II.3.2.2 Technique de Parkes
Cette technique basée sur les protocoles expérimentaux décrits par Fry (1990) et Getliff et al.
(1992) préconise de déposer une quantité définie de 8 µl de sédiment sur un filtre Nuclepore
noir de porosité 0,2 µm. Au moins 400 cellules ou 100 champs du microscope doivent être
comptés (Fry, 1990) et le nombre de bactéries comptabilisé est doublé pour tenir compte des
bactéries supposées cachées sous la face inférieure des particules (Getliff et al., 1992). A
partir d'un échantillon dilué au 1/2, 160 µl de sédiment sont dilués dans 10 ml d'eau de mer
filtrée formolée. Une sonication de 2 min (puissance 75 watts, 60 % d'efficacité) est effectuée.
Un ml de cette solution (i.e. 8 µl de sédiment) est déposé sur le filtre, coloré au DAPI (5 µg l-1
en concentration finale) et filtré comme précédemment. Au vu des premiers essais montrant
une sous-estimation d'environ deux ordres de grandeurs par rapport à la technique
précédemment décrite, et probablement due au tapis de particules couvrant le filtre, nous
avons intercalé, avant la filtration, une phase de 4 heures de décantation.
II.3.2.3 Choix de la technique utilisée
La comparaison des deux méthodes a été réalisée sur des échantillons de sédiments profond
prélevés le 30 et 31 août 1999 sur le site DYFAMED. Les niveaux A, B et C correspondent
aux niveaux sédimentaires 0-2 cm, 2-4 cm et 4-6 cm. Les résultats obtenus sont résumés dans
le Tableau II-1. Si la méthode de Parkes (M3) peut être écartée sans difficulté, un test t
47
(méthode des couples) montre que les valeurs obtenues par la méthode M1 sont
significativement (p=0,007; n=6) différents de ceux obtenus par la méthode M2. Ce résultat
suggère que pour des vases profondes, la technique de la dilution au 1/1600ème s'avère être la
plus efficace et a donc été utilisée au cours de cette étude.
Tableau II-1. Comparaison de trois méthodes pour le comptage des bactéries dans les sédiments marins
profonds. M1 : méthode dilution (1/1600); M2 : méthode de "Parkes" avec décantation de 4 heures; M3 :
méthode de "Parkes". Niveau A : 0-2 cm; B : 2-4 cm et C : 4-6 cm.
Niveau A
Niveau B
Niveau C
Echantillon du 30/08/02
M1
M2
M3
4,50 × 107
2,45× 107
4,47 × 105
2,67 × 107
1,65 × 107
3,87 × 105
7
7
1,82 × 10
1,53 × 10
3,59 × 105
Echantillon du 31/08/02
M1
M2
M3
3,53 × 107
2,01 × 107
2,44 × 105
3,16 × 107
2,27 × 107
2,76 × 105
7
7
1,86 × 10
1,03× 10
2,23 × 105
II.3.3 Estimation du nombre de bactéries
Pour les échantillons d'eau pélagique, le comptage peut s'effectuer semi-automatiquement
grâce à un analyseur d'image (Van Wambeke, 1988; Van Wambeke, 1995). Le système
utilisé pour ce type de comptage est constitué d'un microscope (Olympus BH-2), muni d'une
caméra vidéo (LHESA 4036) connectée à un écran de contrôle de l'image et à une carte de
numérisation (Néotech) implantée dans un micro-ordinateur (Macintosh).
La digitalisation des images et le comptage sont réalisés à l'aide du logiciel de comptage
Micromar développé sur Labview qui numérise x champs du filtre pris au hasard et les
enregistre dans un dossier. Le coefficient de variation est généralement compris entre 3 et 20
%. Les fortes valeurs de ce coefficient parfois observées (20 %) correspondent
essentiellement à une mauvaise répartition des cellules sur les filtres. Le nombre de bactéries
par champ est automatiquement transformé en nombre de bactéries par ml à partir des
données de référence de l'échantillon (volume filtré, coefficient de dilution), du système de
filtration utilisé (surface interne de la tourelle), de la calibration du microscope (facteur de
conversion µm-pixel, surface du champ de détection).
Ce dispositif automatique ne peut être utilisé ni pour les échantillons d'eaux profondes, ni
pour les eaux proche du fond ni pour les échantillons de sédiment. La présence de nombreuses
particules de taille identique à celle des bactéries, non différenciées par l'analyseur d'image
monochrome, entraîne dans ces cas des surestimations de l'effectif bactérien. Ces préparations
sont donc traitées de manières conventionnelles avec dénombrement par l'opérateur. Le
nombre total de bactérie est estimé comme suit :
B = N bact× N champs × V ech + V formol × 1 × 1
V ech
D V filtré
où
(Équation II-1)
B = nombre total de cellules bactériennes par ml
48
Nbact = nombre moyen de bactéries par champs
Nchamps = nombre total de champs sur le filtre (surface grille/surface filtration)
Vech = volume de l'échantillon (ml)
Vformol = volume du formol (ml)
D = dilution éventuelle
Vfiltré = volume d'échantillon filtré (ml)
II.3.4 Estimation de la biomasse bactérienne
La biomasse bactérienne peut être estimée à partir d'un facteur de conversion
biomasse/biovolume ou biomasse/cellule. Le facteur de conversion de 20 fg C bactérie-1
proposé par Lee & Fuhrman (1987) est le plus couramment utilisé dans la littérature pour
donner une estimation de la biomasse carbonée bactérienne. Cependant, il apparaît préférable
d'utiliser le facteur de 15 fg de carbone bactérie-1 déterminé par Caron et al. (1995) sur des
peuplements bactériens de la mer des Sargasses, mer reconnue comme très oligotrophe. Ce
facteur est depuis couramment utilisé dans les systèmes oligotrophes : Tanaka &
Rassoulzadegan (2002) sur le site DYFAMED, Fukuda et al. (1998) et Nagata et al. (2000)
dans les eaux profondes du Pacifique.
II.4 Mesure des activités ectoenzymatiques
Le stock de matière organique dans les environnements aquatiques est sous forme de
macromolécules non directement utilisables pour une incorporation à l'intérieur des cellules
bactériennes. En effet, les molécules de taille supérieure à 600 D (HMW DOM) ne peuvent
être transportées à travers les membranes cellulaires microbiennes (Nikaido & Vaara, 1985).
Ce matériel doit être pré-conditionné par des enzymes extracellulaires, fournissant des
composés de faibles poids moléculaires (<600 Da, LMW DOM), avant d'être incorporé à
l'intérieur de la cellule et être utilisable pour la croissance bactérienne. L'activité de ces
enzymes est, dans la plupart des cas, le facteur limitant à la fois la décomposition du matériel
organique et la croissance bactérienne (Hoppe, 1983).
Les substrats hydrolysés par les ectoenzymes sont en général des protéines, des
carbohydrates, des acides gras et des composés organiques phosphatés. En écologie
microbienne, l'estimation quantitative de l'activité enzymatique extracellulaire a été
déterminée pour la première fois par Hoppe (1983) et Somville & Billen (1983). Les
méthodes décrites par ces auteurs reposent sur l'utilisation de substrats modèles fluorogènes
composés
d'un
agent
fluorescent,
le
4-méthylcoumarinyl-7-amide
49
(MCA)
et
le
méthylumbelliferone (MUF). Deux types d'activités ectoenzymatiques ont été mesurées au
cours de cette étude, l'activité aminopeptidasique (EAA) à l'aide du substrat analogue MCALeu et l'activité phosphatidique (PA)
à l'aide du substrat analogue MUF-P. En ce qui
concerne l'activité aminopeptidasique, un nouveau substrat analogue a été également testé (cf.
chapitre V) : LYA-Ala4 (Pantoja et al., 1997).
II.4.1 Activité aminopeptidasique estimée à l'aide de l'analogue MCA-Leu
II.4.1.1 Echantillons aqueux
Les échantillons de la colonne d'eau, des saumures de fosses profondes anoxiques, et de l'eau
surnageante aux sédiments ont été traités de la même manière. Seules, les gammes de
concentrations finales en substrat sont différentes selon de la nature des échantillons.
Le substrat classiquement utilisé pour la mesure d'activité aminopeptidasique est la L-leucine7-amino-4-methylcoumarin (MCA-Leu – Sigma Chemical Co.) (Chrost, 1991). La
détermination des paramètres cinétiques (la vitesse maximale Vmax et la constante de demisaturation Km) a été réalisée sur les échantillons décomprimés selon la méthode des
multiconcentrations. Pour les échantillons d'eau de mer et les saumures, le substrat MCA-Leu
a été ajouté à 8 concentrations finales différentes : 0,05, 0,1, 0,25, 0,50, 1, 1,5, 2, et 5 µM.
Pour les échantillons d'eau surnageante, les concentrations finales utilisées étaient : 0,001,
0,005, 0,010, 0,025, 0,050, 0,100, 0,250, 0,500, 1, 2, 5 et 10 µM. Les cultures étaient réalisées
en duplicata et incubées à l'obscurité et à température in situ. L'évolution de l'hydrolyse du
substrat MCA-Leu était suivie au cours du temps : 0, 2, 4, 6 et 12 heures pour les échantillons
d'eau de mer profonde. Pour des échantillons de surface, ou les échantillons d'eau
surnageante, les temps d'incubation étaient plus courts et adaptés à l'évolution de l'activité
enzymatique. L'accroissement de la fluorescence du chromophore MCA, produit de
l'hydrolyse du substrat MCA-Leu après clivage de la liaison peptidique, était quantifiée à
l'aide d'un spectrofluorimètre (Kontron SFM 25) aux longueurs d'onde d'émission et
d'excitation de 365 et 455 nm. La calibration était réalisée à partir du 4-méthylcoumarinyl-7amide (MCA) sur les mêmes échantillons que les mesures d'activité aminopeptidasique dans
les gammes adaptées aux mesures réalisées. Les paramètres cinétiques de Michaëlis-Menten
(Vmax et Km) ont été estimés en utilisant une équation de régression non-linéaire qui
minimise les erreurs à l'aide du programme Kinetics (Brooks, 1992).
La MCA-Leu est un composé artificiel et sa concentration dans le milieu naturel ne peut donc
pas être déterminée. Comme la MCA-Leu est considérée comme un bon analogue des
50
peptides et des protéines (Chrost, 1991), nous émettons l'hypothèse que nous pouvons utiliser
la concentration naturelle des acides aminés dissous combinés (DCAA) comme estimation de
la concentration théorique en MCA-Leu des échantillons d'eau de mer. Etant donné que nous
manquons de données concernant la concentration des DCAA en mer Méditerranée, nous
prenons comme référence les valeurs mesurées par Keil & Kirchman (1999) dans la mer des
Sargasses, de 0,167 µM DCAA à 1000 m, et de 0,810 µM DCAA en surface. Ainsi, dans la
zone méditerranéenne étudiée, considérée comme moins oligotrophe que la mer des
Sargasses, on peut supposer que la concentration de 0,05 µM de MCA-Leu est inférieure à la
concentration des substrats naturels avec lesquels cette molécule entre en compétition.
Comme nous n'avons aucune certitude concernant cette hypothèse, nous considérons que les
vitesse mesurées à la concentration en MCA-Leu de 0,05 µM sont une approche de la mesure
de la vitesse trace (Vtr exprimée en pM h-1 ou pmol C l-1 h-1) et de la constante d'hydrolyse
(Hr exprimée en % d-1).
Pour les mesures effectuées en condition hyperbare, la technique des multi-concentrations ne
peut être que difficilement utilisée (i.e. se limiterait à l'étude d'une seule activité sur un seul
échantillon par journée de temps de navire). Nous avons donc effectué des cinétiques temps
en utilisant la concentration saturante, ou la concentration dite "trace" (cf. supra), définies sur
les échantillons décomprimés prélevés à la même profondeur au cours de la même campagne.
Les vitesses des activités aminopeptidasiques sont exprimées en µmol MCA-Leu hydrolysée
l-1 h-1. Comme la MCA-Leu est utilisée comme modèle de substrats peptidiques et protéiques,
les vitesses d'hydrolyse aminopeptidasique peuvent être exprimées en µmol C produit l-1 h-1
en utilisant un rapport carbone par mole de 4,2 (correspondant à la moyenne du nombre de
carbone par mole d'acides aminés) plutôt que le rapport carbone par mole de 6 (correspondant
aux 6 atomes de carbone de la leucine) (Lamy et al., 1999).
II.4.1.2 Echantillons sédimentaires
Comme pour les échantillons aqueux, les paramètres cinétiques (Vmax et Km) ont été estimés
selon la méthode de cinétique multiconcentrations avec les concentrations finales suivantes :
1, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500 et 1000 µM. Pour ce faire, des volumes de 1 ml de sédiment
(dilué au 1/2 avec de l'eau surnageante filtrée sur 0,2 µm) sont distribués dans des tubes
Eppendorf de 2 ml pour chacun des niveaux sédimentaires étudiés. Pour réaliser les
différentes concentrations finales, un volume constant de 111 µl de solution de MCA-Leu est
rajouté à chacune des suspensions de sédiments. Cela nécessite de préparer au préalable dans
de l'eau de mer filtrée bouillie une gamme de différentes solutions filles de MCA-Leu. Les
51
échantillons étaient incubés à température in situ et à l'obscurité pendant 4 heures pour les
sédiments profonds du site DYFAMED et du Canyon Lacaze-Duthiers. Dans le cas des
sédiments des fosses anoxiques hypersalées, les temps d'incubation s'étalaient sur 24 heures.
Le sodium dodecyl sulfate (SDS – 1 % concentration finale) a été utilisé comme agent
inhibiteur des activités aminopeptidiques (Delmas & Garet, 1995) pour stopper les réactions
enzymatiques dans les sédiments avant congélation des échantillons (cf. paragraphe II.4.1.5).
Enfin d'incubation, les échantillons étaient centrifugés pendant 3 min à 3000 tours/min. Un
volume de 50 µl de l'eau surnageante était prélevé et dilué dans 3 ml d'eau milliQ pour lecture
au spectrofluorimètre comme décrit ci-dessous.
II.4.1.3 Contrôles
Une partie de la fluorescence peut être attribuée à une hydrolyse non biologique de la MCALeu. Des contrôles ont donc été effectués sur des échantillons d'eau et de sédiment stérilisé
après une ébullition de 20 minutes. Cette opération a été réalisée pour chacune des
concentrations finales en MCA-Leu.
II.4.1.4 Choix des longueurs d'ondes d'excitation et d'émission
De nombreuses longueurs d'ondes d'excitation et d'émission sont proposées dans la littérature.
Le Tableau II-2, sans être exhaustif, présente les longueurs d'ondes les plus couramment
utilisées pour mesurer l'hydrolyse de la MCA-Leu.
Tableau II-2 : Différentes longueurs d'ondes d'excitation (λ ex.) et d'émission ( λem.) citées dans la littérature
pour la mesure de l'hydrolyse de la MCA-Leu.
λ ex. (nm)
380
λ em. (nm)
440
364
365
365
365
445
460
460
455
360
355
364
445
470
445
445
Spectrofluorimètre
Kontron SFM 25
LS50 Perkin-Elmer
Shimadzu RF5000U
Kontron SFM 25
Kontron SFM 25
Hoeffer TKO 100
Jasco FP-550
Kontron SFM 25
Jasco 820-FP
Shimadzu RF 1501
Hoefer TKO 100
Aminco-Bowman
52
Référence
Hoppe (1993); Hoppe et al. (1993)
Delmas & Garet (1995); Van Wambeke
et al. (2001)
Jorgensen et al. (1999)
Ammerman & Glover (2000)
Hoppe & Ullrich (1999)
Talbot & Bianchi (1997)
Talbot et al. (1997)
Meyer-Reil (1986)
Tamburini et al. (2002)
Unanue et al. (1999)
Stepanauskas et al. (1999)
Tholosan et al. (1999)
Pantoja & Lee (1999)
Si en théorie, le substrat MCA-Leu n'est pas fluorescent, il s'avère montrer une autofluorescence qui peut interférer avec les mesures du chromophore MCA produit. Cette
anomalie est exacerbée lorsque la MCA-Leu est utilisée en très faibles concentrations et dans
des eaux où les vitesses d'hydrolyse ectoenzymatique sont faibles, ce qui est le cas des eaux
méditerranéennes. La Figure II-11 présente les spectres d'excitation et d'émission de la MCALeu (1µM) et de la MCA (1 µM) réalisés en faisant varier alternativement la longueur d'onde
d'excitation (λex.) et d'émission (λem.) pour un voltage de 275 V. Les longueurs d'onde
fixées correspondent aux longueurs d'onde
d'excitation et d'émission préconisées par
Molecular Probes Ltd (comm. pers. et lien hypertexte du spectre de la molécule de la MCA :
Spectra — 7-Amino-4-methylcoumarin/pH 7.0). Notre choix correspond à un compromis
entre des longueurs d'onde d'excitation et d'émission optimales et le non-chevauchement des
spectres entre le substrat et son produit d'hydrolyse, soit 365 nm de longueur d'onde
d'excitation et 455 nm de longueur d'onde d'émission (Figure II-11).
180
MCA ex.
160
MCA ém.
MCA-leu ém.
140
120
UF
100
80
60
MCA-leu ex.
40
20
0
300
320
340
360
380
400
420
440
460
480
500
λ (nm)
Figure II-11. Spectre d'émission de la MCA-Leucine et de la MCA. UF = unité de fluorescence; λ = longueur
d'onde; ex. = longueur d'onde d'excitation; em. = longueur d'onde d'émission.
II.4.1.5 Choix de l'agent stoppant
Pour les échantillons aqueux, l'analyse des échantillons au spectrofluorimètre pouvait être
effectuée immédiatement tout au long de l'incubation. Par contre, pour les sédiments, le temps
de manipulation beaucoup plus important, aurait diminué le nombre d'échantillons pouvant
être traités quotidiennement à bord du navire océanographique, nous avons donc recherché un
agent stoppant efficace. Delmas & Garet (1995) signalent que la simple congélation des
53
échantillons affecte l'estimation des paramètres cinétiques (Vmax et Km). Le formaldéhyde,
classiquement utilisé pour stopper les activités microbiennes, ne peut être pas utilisé pour
deux raisons : (1) il perturbe le signal de fluorescence et (2) il inhibe le métabolisme bactérien
mais sans toutefois inhiber intégralement les enzymes ectopériplasmiques déjà produites par
les bactéries. Ainsi, le choix d'un agent stoppant devait pallier aux deux problèmes rencontrés
avec le formol i.e. (1) pas de perturbation du signal de fluorescence et (2) inhibition des
activités ectoenzymatiques.
Plusieurs agents inhibiteurs de l'activité aminopeptidique sont décrits dans la littérature.
Bélanger et al. (1997) proposent une acidification (pH<5) par du HCl (concentration finale de
11,2 mM) pour stopper les activités d'hydrolyse ectopeptidique. Avant analyse, l'échantillon
est neutralisé à un pH de 7-8 en ajoutant 200 µl de tampon neutralisant (0.25 M NaOH et 0,25
M de tampon phosphate à pH 8,0). Christian & Karl (1995) préconisent le chlorure
mercurique pour stopper les activités ectoenzymatiques. Enfin, Delmas & Garet (1995)
propose l'utilisation du sodium dodecyl sulfate (SDS) à une concentration finale de 1 % avant
congélation des échantillons. Le SDS qui est un fort agent dénaturant de la structure tertiaire
des protéines s'avère être le meilleur inhibiteur que nous ayons testé. C'est donc cet inhibiteur
qui a été utilisé au cours des différentes campagnes d'étude du milieu benthique.
II.4.2 Activité phosphatidique estimée à l'aide de l'analogue MUF-P
L'activité des phosphatases a été encore moins bien étudiée que l'activité aminopeptidasique
dans le domaine océanique profond. A notre connaissance, les travaux de Hoppe & Ullrich
(1999) et de Koike & Nagata (1997) sont les seuls concernant le domaine pélagique profond.
Leurs résultats, quelque peu surprenants, nous ont incité à réaliser des mesures des activités
phosphatidiques dans les eaux et les sédiments profonds de Méditerranée. Bien que,
contrairement à la zone photique, le domaine bathypélagique ne soit pas limité en nutriments
(N, P…), ces auteurs ont montré un accroissement des activités phosphatidiques dans le
domaine profond. Hoppe & Ullrich (1999) émettent l'hypothèse que l'accroissement de
l'activité phosphatidique en profondeur est développé pour pallier au manque de carbone
organique immédiatement utilisable, et non pas pour utiliser les phosphates produits par cette
hydrolyse.
II.4.2.1 Echantillons aqueux
Le protocole de mesure de l'activité phosphatidiques est calqué sur celui des aminopeptidases
en utilisant 365 et 460 nm comme longueurs d'onde d'excitation et d'émission. Dans l'eau de
54
mer, on a utilisé le 4-méthylumbellyferone-phosphate avec les mêmes gammes de
concentrations que pour la MCA-Leu (de 0,05 à 5 µM pour le domaine pélagique et de 0,01 à
10 µM pour les eaux proches des sédiments). Des concentrations supplémentaires ont été
testées (10, 50, 100, 250 µM) mais les concentrations de 5 et 10 µM se sont avérées être
saturantes pour les eaux pélagiques et surnageantes, respectivement. En fait, tout comme pour
la MCA-Leu (Tholosan et al., 1999; Unanue et al., 1999), l'activité MUF-P présente une
multiphasicité mais nous avons choisi de nous placer dans la gamme de concentrations la
plus faible, notre but étant de se rapprocher au mieux des vitesses réellement exercées in situ.
II.4.2.2 Echantillons de sédiment
Les activités phosphatidiques dans les sédiments profonds ont été mesurées de la même
manière que les activités aminopeptidasiques, mais en utilisant une gamme de concentrations
beaucoup plus forte pour atteindre la saturation en substrat (100, 200, 300, 400, 500, 1000,
2500 et 5000 µM). De plus, dans le cas des phosphatases, le SDS n'a pas été utilisé comme
agent stoppant car étant moins efficace que pour les activités d'hydrolyse des polypeptides.
II.5 Mesure de la production de biomasse bactérienne
Trois méthodes sont le plus souvent utilisées pour mesurer la production bactérienne :
-
la mesure de la fréquence de division cellulaire (FDC - Hagström et al., 1979),
-
la détermination du taux de synthèse de l'ADN bactérien par incorporation de la
thymidine tritiée (3H-Thy - Fuhrman & Azam, 1980),
-
la détermination du taux de synthèse protéique par l'incorporation de la leucine tritiée
(3H-Leu - Kirchman et al., 1986; Simon & Azam, 1989; Kirchman, 1993; Kirchman &
Ducklow, 1993). Les deux premières méthodes correspondent à une estimation du
taux de la production bactérienne, alors que l'estimation de l'incorporation de la 3HLeu dans les protéines, qui est la plus usitée actuellement, mesure un accroissement de
la biomasse bactérienne.
Au cours de cette étude, la production de biomasse bactérienne a été estimée au moyen
d'expérimentations de type cinétique-temps en utilisant le traceur L-[4,5-3H]-Leucine (activité
spécifique de 55 Ci mmol-1, Amersham Corp.), à des concentrations de 20 nM pour les eaux
de la couche euphotique et de 10 nM pour les eaux mésopélagiques et benthiques. Ces
concentrations ont été vérifiées comme étant saturantes en réalisant une cinétiqueconcentration lors de chaque mission et pour chacun des niveaux étudiés (couches euphotique,
mésopélagique et bathypélagique). Pour convertir le nombre de pmol de 3H-Leu incorporé par
55
litre et par heure en biomasse de carbone produite, nous utilisons le facteur empirique de 1,55
ng C par pmol de leucine incorporée proposé par Simon & Azam (1989), en supposant le
facteur de dilution isotopique négligeable dans ces conditions de concentrations saturantes en
substrat.
II.6 Utilisation de composés de faibles poids moléculaires
Les acides aminés les plus abondants dans le réservoir de matière organique dissoute (DOM)
sont l'acide glutamique, l'acide aspartique, la sérine, l'alanine (McCarthy et al., 1996; Lee et
al., 2000; Amon et al., 2001; Benner, 2002). La vitesse d'utilisation de composés de faibles
poids moléculaires fournit une approche de l'activité hétérotrophe potentielle des peuplements
microbiens. Le principe de la mesure est basé sur la capacité qu'ont les bactéries hétérotrophes
à consommer un substrat (dans notre cas du
14
C-glutamate) à des fins anaboliques (synthèse
cellulaire de molécules nécessaire pour les besoins constitutifs de la cellule) et cataboliques
(source d'énergie de la cellule induisant une libération de CO2). Ainsi, l'étude de l'utilisation
du glutamate, parallèlement aux mesures d'activités ectoenzymatiques, constitue une approche
intéressante pour comprendre le rôle des microorganismes dans les processus de
minéralisation de la fraction protéique du réservoir de la matière organique.
II.6.1 Echantillons de la colonne d'eau et des saumures
Une solution de L-(U-14C)-glutamate, d'activité spécifique de 254 mCi mmol-1 (Amersham
Corp.), est ajoutée aux concentrations finales, vérifiées comme saturantes, de
20 nM
(échantillons collectés entre 0 et 200 m de profondeur) ou 10 nM (échantillons collectés en
dessous de 200 m de profondeur). Pour les échantillons de l'eau surnageante, une cinétique
concentrations (entre 2 et 250 nM de
14
C-glutamate) est réalisée, nous permettant de
déterminer les paramètres cinétiques Vmax et Km. Le devenir au cours du temps (incubation
de 12 heures maximum pour les échantillons profonds et de 36 heures pour les saumures) du
14
C-glutamate pour des fins anaboliques et cataboliques est mesuré en incubant les
échantillons à température in situ et à l'obscurité. A la fin de chaque période d'incubation, les
sous-échantillons sont empoisonnés avec du formol boraté (1 % concentration finale, v/v).
Les sous-échantillons sont de 40 ml pour les prélèvements effectués dans la zone euphotique
(0-200 m), de 70 ml pour ceux de la zone mésopélagique (200-1000 m) et 130 ml pour les
échantillons de la zone profonde (<1000 m) et les saumures. Pour les échantillons de l'eau
proche du fond, le volume des sous-échantillons est de 20 ml et l'incubation est réalisée
pendant 4 heures. Les cellules bactériennes sont collectées par filtration douce sur des filtres à
56
0,2 µm en polycarbonate (Nuclepore®) pré-saturés en glutamate froid. Les filtres sont à
nouveau rincés avec du glutamate froid. Le filtrat est récupéré et traité afin d'extraire le
carbone minéral marqué au carbone 14 résultant de la respiration du
14
C-glutamate. Dans
l'eau de mer, milieu ayant un pouvoir tampon important, le CO2 est sous forme de bicarbonate
(H-14CO3-). Le H-14CO3- est extrait de la phase liquide par acidification de la culture sous
forme de 14CO2, lui-même piégé à l'aide d'éthanolamine comme décrit dans (manuscrit n°2 Tamburini & Tedetti, soumis-a). Cette méthode ("the fishing method"), présentée ci-après,
propose un protocole simple et reproductible qui permettrait de standardiser les techniques de
mesures de respiration réalisées à l'aide de composés marqués au carbone 14.
Le carbone 14 récupéré sur les filtres et les pièges à CO2 est quantifié à l'aide d'un compteur à
scintillation Packard 1600 TR. Les échantillons sont corrigés des blancs en incluant les temps
t0 dans la régression permettant de calculer les vitesses d'assimilation (GA) et de respiration
(GR) du glutamate. Les vitesses intégrées de
respiration et
14
14
C-glutamate assimilation,
14
C-glutamate
C-glutamate utilisation (GU=GA+GR) nous ont permis d'estimer le
pourcentage de respiration (R%, pourcentage du
14
C-glutamate respiré par rapport au
14
C-
glutamate globalement utilisé).
II.6.2 Echantillons du sédiment
La mesure de la respiration du
14
C-glutamate a été réalisée comme décrit dans Tholosan,
(1999). Les difficultés d'extraction des cellules du sédiment nous empêchent de mesurer
l'incorporation du 14C-glutamate dans les populations bactériennes sédimentaires. Un volume
de 200 µl de sédiment dilué au 1/2 avec de l'eau surnageante filtrée sur 0,2 µm est injecté
dans des fioles à pénicilline en verre stériles de 15 ml. En fin d'incubation, pour récupérer le
14
CO2, des bandelettes de papier filtre imbibées d'éthanolamine sont placées au-dessus de la
suspension de sédiment à l'intérieur des flacons, qui sont ensuite fermés hermétiquement par
un septum en caoutchouc. Pour extraire le CO2, 200 µl de HCl (6N) sont injectés au travers
du septum à l'aide d'une seringue. L'extraction du CO2 est réalisée pendant 3 heures, et les
bandelettes sont récupérées et placées dans des flacons à scintillation. La radioactivité est
mesurée par scintillation liquide en présence de liquide scintillant (Ready Safe Beckman).
57
58
II.7 Manuscrit n°2
A SIMPLE AND HIGHLY REPRODUCIBLE TECHNIQUE
TO MEASURE THE BACTERIAL RESPIRATION OF 14CLABELED COMPOUNDS IN SEAWATER SAMPLES
Christian Tamburini* & Marc Tedetti
Microbiologie Marine, UMR 6617CNRS/INSU – Université de la Méditerranée, Centre
d’Océanologie de Marseille, case 907, 13288 Marseille, cedex 9, France
Tel. : +33-4-91829049 ; fax : +33-4-91829051
*E-mail: [email protected]
Manuscript submitted to Hydrobiologia in May 2002
59
II.7.1 Abstract
To avoid the artefacts in respiration assays using 14C-compounds, we suggest a simple
method to keep the trapping agent for carbon dioxide directly into the scintillation vial
hanging in the degassing flask. Efficiency of the carbon dioxide extraction is up to 95 % when
using extraction vials and incubation time closely adapted to the sample volume. To validate
this protocol the radioactivity (disintegration per minute) due to 14C-carbon dioxide resulting
from the degassing of sodium (14C) bicarbonate (NaH14CO3) in seawater was plotted against
the radioactivity of these added bicarbonate solutions. A whole set of samples (n = 42) gives a
percentage of recovery equal to 99 % and with a very low variability (± 1 %, at 95 %).
Key words: Bacteria, respiration, degassing, technique, carbon dioxide, seawater.
II.7.2 Introduction
Carbon dioxide production by heterotrophic microorganisms is a key parameter to understand
the global carbon cycle. This demand has stressed the need for accurate measurements of
bacterial respiration rates. Respiration rates on specific substrates are commonly estimated by
measuring the carbon dioxide produced during defined incubation periods from seawater
samples amended with an easy to degrade
frequently compounds used are
14
C-glucose,
14
C radiolabeled organic compound. The most
14
C-glutamic acid,
14
C-leucine and
14
C - amino
acid mixture (Williams, 1970; Dawson & Gocke, 1978; Unanue et al., 1998, 1999; Bianchi et
al., 1999) and radiolabeled protein (Nagata et al., 1998). Due to the buffering capacity of
seawater, carbon dioxide resulting from respiration processes remains trapped in the form of
HCO3-. This step ends by extraction of the
14
CO2 produced by acidifying the culture, its
recovering with an absorbent and the radioactivity’s measurement by scintillation counting.
Several techniques have been used to trap carbon dioxide from the culture. The most
frequently used are those suggested by Williams & Askew (1968), Hobbie & Crawford
(1969) and Kuparinen & Uusi-Rauva (1980). Practitioners of these measurements know that,
whatever their application, this step suffers from poor reproducibility, with respiration rates
from duplicate subsamples frequently diverging. Furthermore, these methods can not be
considered as standardized, as efficiency of the recovery of produced 14CO2 is frequently not
determined.
60
The aim of this study was to design a simple protocol to provide standardized and
reproducible respiration rates, that is easy to operate on large sets of samples on board
research vessels and that requires only usual disposable glassware.
II.7.3 Material and methods
To recover the 14CO2 released by acidification of the 14C-labeled culture, we suggest to keep
the trapping agent directly into the scintillation vial, hanging up in the culture flask. This
technique excludes (1) the strip of chromatography paper used to increase the trapping surface
(Dawson & Gocke, 1978), (2) the glass (or plastic) cup used to contain the trapping agent
(Kuparinen & Uusi-Rauva, 1980), or, alternatively, (3) the bubbling circuit used to extract the
CO2 (Garabétian, 1991).
To check for the efficiency and reproducibility of the degassing step independently of any
biological process, we used seawater samples previously fixed by adding 1 % (final
concentration) of buffered formaldehyde. For each experiment, six 70-ml samples were
distributed in 500-ml polycarbonate bottles (Narrow-mouth square bottle, Nalgene) holding
a teflon covered stir bar (10 × 13.6 mm). Flasks were screw-capped with septum closure
(Thermoplastic elastomere septum, Nalgene). Each of the 6 samples was labeled by adding
the same volume of a NaH14CO3 solution (CEA Corp., 55 mCi mmol-1 specific activity). We
did a series of 10 experiments using NaH14CO3 ranging between 150 and 7000 DPM per
sample. This range corresponds to the counts usually obtained from respiration assays done in
oligotrophic water column samples.
To trap the CO2 expected to result from the degassing of these solutions, we used
ethanolamine, which has a better absorbent property than phenethylamine as demonstrated by
Kuparinen & Uusi-Rauva (1980). One ml of ethanolamine was directly introduced in a 20 mlscintillation vial. The vial was suspended from the cap of the bottle by the way of a fish-hook
at the end of a nylon yarn (see Fig. 1). The flask was tightly closed, and then seawater was
acidified by injecting 1 ml HCl 6N through the cap, using a 1-ml syringe fitted with a thin
needle. In these conditions (pH ~1.5), the aqueous H-14CO3- evolved to gaseous
14
CO2. The
flask was set on a fifteen-position electromagnetic stirrer, allowing gentle agitation (300 rpm)
at room temperature.
At the end of the stirring period, the scintillation vial was taken out of the polycarbonate
bottle and carefully wiped using a paper towel moisten with a decontaminating solution (RBS
25®, Chemical Products). Ten ml of Ready Safe (Packard) scintillation cocktail were added,
61
and the radioactivity was counted with a Packard 1600 TR liquid scintillation counter. Data
were corrected against those from control samples.
To check for the radioactivity actually injected during each experiment, we distributed the
same volume of the same NaH14CO3 solution directly in one milliliter of ethanolamine in four
scintillation vials that were counted in the scintillation counter in the same manner as those
resulting from the degassing experiment.
To choose the best extraction period, we did a time series experiment lasting between 10
minutes and 12 hours, using an intermediate NaH14CO3 concentration (i.e. corresponding to
4100 DPM).
In another series of experiments, we checked for the efficiency of the protocol in sample
volumes ranging from 20 to 130 ml. This range covers the volumes commonly used in
respiration assays in samples from the sea surface down to deep waters in an oligotrophic
area. This series allowed us to check the effect of changing the sample and the volumes using
same geometry bottles (square polycarbonate bottles, Nalgene®).
septum
screw
capped
fish-hook
scintillation vial
ethanolamine
polycarbonate bottle
seawater
stir bar (10 × 13.6 mm)
Figure 1. Schema of a reaction vial used to extract carbon dioxide from seawater sample.
62
II.7.4 Results
Table 1 shows that within a range of sample volumes from 20 to 130 ml, the efficiency of the
suggested protocol remains consistent so long as the degassing process is in the same reactive
vial. Moreover, changing the reactive vial’s volume modifies the efficiency of the protocol.
By reducing the headspace in the bottle and increasing the incubation period, recovery (over
95 %) is improved. This result is a combination of improved agitation and vial geometry for
CO2 absorption in the bottle. In this case the extraction efficiency should be determined for
each kind of extraction vial. Alternatively, it should be possible to determine the actual
percentage of recovery by using the same vial’s volume for the whole series of samples.
Table 1. The effect of sample volume and extraction vial volume upon the efficiency of degassing
process. Extraction was at room temperature with a stirring speed of 300 rpm. Extraction vials were
square polycarbonate Nalgene® bottles.
Sample volume (ml)
Extraction vial
Incubation time (h)
volume (ml)
Percentage of
recovery
130
500
4
90 ± 1 (n=6)
130
250
4
93 ± 2 (n=6)
130
500
2
77 ± 2 (n=6)
70
500
2
77 ± 1 (n=62)
70
250
2
82 ± 1 (n=6)
70
250
4
99 ± 1 (n=42)
40
500
2
80 ± 2 (n=6)
40
250
2
95 ± 1 (n=6)
20
500
2
78 ± 1 (n=6)
20
125
2
97 ± 1 (n=6)
63
Figure 2 presents the efficiency of carbon dioxide retrieval get from 70 ml samples during
increasing degassing periods (15, 30 minutes, 1, 2, 4, 8 and 12 hours) using 250 ml bottles
(Nalgene®). Efficiency is clearly time dependant, and stable recovery near 100 % occurs from
4 hours. This means that each practitioner will have to find a compromise between the highest
recovery efficiency and the shortest incubation time, because this last parameter can not be
neglected when processing large sets of samples on board research vessels.
Percentage of recovery of
14
CO2
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0
2
4
6
8
10
12
Time (h)
Figure 2. Efficiency of carbon dioxide recovery through extraction periods ranging between 10
minutes and 12 hours. Seawater samples (70 ml) were labeled with a NaH14CO3 solution (4100 DPM
per vial), extraction was at room temperature with a stirring speed of 300 rpm.
Figure 3 reports the efficiency of 14CO2 extraction from a set of 42 assays (70 ml of sample
extracted for 4 hours in 250 ml vials) covering the range of DPM usually got during
respiration measurements from the sea surface to the deep waters. Results indicate that the
degassing efficiency of the carbon dioxide extraction was 99 % with a determination
coefficient of 0.99. It was also highly reproducible with a variation of ± 1 % (for a variation
coefficient of 95 %; n = 42).
64
9000
8000
Trapped DPM
7000
6000
5000
4000
3000
2000
1000
0
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
Added DPM
Figure 3. Linear regression between actually added and trapped14CO2 expressed as DPM
(disintegration per minute). Extraction was realized at room temperature for 4 hours with a stirring speed of
300 rpm, from 70-ml samples distributed in 250-ml polycarbonate bottles (Nalgene). y = 0.993
(p<0.0001; n = 42; R2 = 0.996 with 0.973<y<1.014 with determination coefficient of 95 %).
II.7.5 Discussion
This protocol is a modification of previously described trapping techniques, based on the
affinity of ethanolamine for carbon dioxide. The proposed protocol avoids the artefacts of
previous versions, which lead to poor reproducibility. In the most commonly used protocol, a
drop of ethanolamine is adsorbed on a small strip of chromatography paper suspended in the
atmosphere of the degassing vessel. This technique introduces several possible artifacts. Some
are due to the variability of the actual area of each strip of paper for ethanolamine absorption,
and then for 14CO2 trapping. Another source of variability is contact of the strip with the flask
wall, leading to a loss of 14CO2-loaded ethanolamine, and so an underestimation of respiration
rates. At the other extremes, the paper strip may be contaminated by 14C-labeled seawater by
contact with the flask wall, or by seawater droplets created by untoward racing of the
magnetic stirrer. Due to the high amount of the tracer, contamination of the strip by even an
extremely small droplet of labeled seawater is sufficient to cause a large overestimate of the
DPM count.
65
Another degassing protocol is to flush the 14CO2 by unlabeled CO2 (or N2) through two serial
trapping vials containing a trapping cocktail ethanolamine/methanol (ratio 1/1, v/v). This
protocol appears efficient (Garabétian, 1991), but variability between two replicates may be
important. Main sources of underestimation of the respiration rates are possible gas leaks, or
contamination of the blowing circuit by seawater aerosols produced by accidental over
bubbling.
The proposed protocol avoids all these sources of variability:
1) The volume of the trapping agent is defined by the precision of the used volumetric
micro-pipette. The absorbing surface is also reproducible, variability of the diameter
of the used scintillation vials being lower than measurable.
2) Contamination by droplets (or aerosols) of
14
C-labeled seawater is unlikely, because
the trapping agent is protected by the scintillation vial. If the outer wall of the vial is
contaminated, it should be eliminated by the wiping of the vials before their
introduction in the scintillation counter. Moreover, being outside of the scintillation
cocktail, such a contamination should escape to scintillation counting.
3) Suppression of the flushing circuit removes any possibility as well for leaks at the
junctions, as well for contamination of the trapping agent by over bubbling in the
seawater sample.
II.7.6 Conclusions
Efficiency of
14
CO2 extraction from labeled cultures varies from 77 to 99 %. This range of
efficiency depends primarily on the extraction period, and on the volumetric ratio between
sample and its extraction vial. To validate the measured respiration rates, the extraction
protocol and its efficiency should be clearly specified.
The protocol we suggest allows a high percentage of recovery with a low variability in a
range of 1000 to 8000 DPM. Results should be reproducible with the same efficiency in any
laboratory because it requires only widely available glassware.
In conclusion, when the excepted measured respiration activity will allow to use one of the
protocol already assayed (Table 1), it will be possible to apply the corresponding efficiency
coefficient we determined. Otherwise, to validate the data, practitioners should calibrate and
test their protocol.
66
Acknowledgements - This work was partially funded by the Institut National des Sciences de l'Univers and TotalFina-Elf (grant n° 11 997 – CNRS/ENTREPRISE). C.T. was supported by a fellowship co-funded by INSU and
Total-Fina-Elf. This work was benefited from constructive comments and help from Armand Bianchi. Authors
thanks J. Kuparinen for helpful comments on the manuscript.
II.7.7 References
Bianchi, A., J. Garcin & O. Tholosan, 1999. Effects of hydrostatic pressure on microbial
activity through a 2000 m deep water column in the NW Mediterranean Sea. Mar. Ecol. Prog.
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Dawson, R., & K. Gocke, 1978. Heterotrophic activity in comparison to the free amino acid
concentrations in Baltic sea water samples. Oceanol. Acta 1: 45-54.
Garabétian, F., 1991.
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C-glucose uptake and
14
C-CO2 production in surface microlayer and
surface-water samples: influence of UV and visible radiation. Mar. Ecol. Prog. Ser. 77: 21-26.
Hobbie, J.E., & C.C. Crawford, 1969. Respiration corrections for bacterial uptake of
dissolved organic compounds in natural waters. Limnol. Oceanogr. 17: 725-730.
Kuparinen, J., & A. Uusi-Rauva, 1980. A simplified technique to measure respiration rates of
aerobic heterotrophic populations. Hydrobiologia 75: 113-115.
Nagata, T., R. Fukuda, I. Koike, K. Kogure & D.L. Kirchman, 1998. Degradation by
bacteria of membrane and soluble protein in seawater. Aquat. microb. Ecol. 14: 29-37.
Unanue, M., I. Azua, J.M. Arrieta, A. Labirua-Iturburu, L. Egea & J. Iriberri, 1998. Bacterial
colonization and ectoenzymatic activity in phytoplankton-derived model particles: cleavage of
peptides and uptake of amino acids. Microb. Ecol. 35 (2): 103-112.
Unanue, M., B. Ayo, D. Slezak, G.J. Herndl, & J. Iberri, 1999. Ectoenzymatic activity and
uptake of monomers in marine bacterioplankton described by a biphasic kinetic model.
Microb. Ecol. 37 (1): 36-48.
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Williams, P. J. Le B., & C. Askew, 1968. A method of measuring the mineralization by
micro-organisms of organic compounds in sea-water. Deep-Sea Res. 15: 365-375.
Williams, P. J. Le B., 1970. Heterotrophic utilization of dissolved organic compounds in the
sea. I. Size distribution of population and relationship between respiration and incorporation
of growth substrates. J. mar. Biol. Ass. U.K. 50: 871-881.
68
Chapitre III
ACTIVITES MICROBIENNES DANS LE
DOMAINE PELAGIQUE PROFOND
Chapitre III – Activités microbiennes dans le domaine pélagique profond
III. ACTIVITES MICROBIENNES DANS LE DOMAINE
PELAGIQUE PROFOND
III.1 Introduction
Le domaine océanique profond apparaît comme un milieu hostile où la faible température, le
faible apport en matière organique et la forte pression hydrostatique constituent des
contraintes auxquelles les microorganismes doivent s'adapter.
Le métabolisme des microflores profondes dépend essentiellement du matériel produit en
surface qui chute le long de la colonne d'eau. Ce matériel subit une dégradation plus ou moins
importante au cours de son transit (selon sa qualité, sa vitesse de chute…). A partir d'une
certaine profondeur, la matière organique directement assimilable par les bactéries (acides
aminés libres, sucres,…) est totalement épuisée. On peut donc supposer que les bactéries
profondes s'appuient sur les activités d'hydrolyse des macromolécules pour répondre à la
limitation en carbone directement assimilable du domaine océanique profond.
Le but de ce travail de thèse étant de s'approcher au mieux de l'estimation de flux réels de
minéralisation plutôt que de flux potentiels, il est apparu important d'évaluer, le plus
précisément possible, les activités ectoenzymatiques dans le domaine profond, étape limitante
pour le métabolisme des microflores profondes. Le manuscrit inséré ci-après (manuscrit n°3 –
Tamburini et al., 2002) présente donc la première étude de l'effet de la pression hydrostatique
sur les activités aminopeptidasiques et phosphatidiques réalisée sur des communautés
naturelles non soumises au stress de décompression.
Dans une deuxième étape, nous avons abordé l'étude du rendement de croissance bactérien
dans le domaine pélagique profond, en recherchant une méthode capable de préciser les effets
de la décompression des échantillons sur la mesure de ce paramètre. Le manuscrit n° 4
(Tamburini et al., soumis-c) focalise sur l'adaptation aux conditions de pression hydrostatique
du métabolisme des microflores profondes (activités ectoenzymatiques, assimilation et
respiration de petits monomères, rendement de croissance) et ces conséquences sur le rôle des
microflores profondes dans la minéralisation de la matière organique. Les manuscrits n°3 et 4
font référence à 2 campagnes (l'une au printemps et l'autre à l'automne 2000) réalisées sur le
site DYFAMED en Mer Ligure.
Enfin, le programme Européen BioDeep (BIOtecnology from the DEEP) nous a permis de
réaliser des mesures d'activités microbiennes en maintenant les conditions de pression
69
hydrostatique jusqu'à 3000 m de profondeur dans l'eau de mer profonde oxique de la Mer
Ionienne, ainsi que des environnements extrêmes, les bassins hypersalés profonds et
anoxiques (DHAB) de la Mer Ionienne, à plus de 3500 m de profondeur (manuscrit n°5 Tamburini et al., soumis-b). Cette étude présentait donc un double intérêt : (1) Réaliser des
mesures d'activités microbiennes en maintenant les conditions de pression hydrostatique dans
des profondeurs jamais atteintes par l'HPSS. (2) Evaluer la présence d'activité microbienne
dans des environnements aussi extrêmes en maintenant toutes les conditions in situ (forte
pression hydrostatique, anoxie, hypersalinité, température, équilibre ionique,…).
Comme le souligne Yayanos (1995), peu d'études d'activités microbiennes en milieu profond
ont été réalisées en considérant uniquement les effets de la pression hydrostatique. En effet,
dans la plupart des cas, on ne peut dissocier les effets de l'accroissement de pression et de la
baisse concomitante de la température, de règle dans le domaine profond de l'Océan global.
En cela, nos mesures d'activités microbiennes sans décompression des échantillons effectuées
en Méditerranée constituent un apport original puisque cette mer est une des rares exceptions
offrant une colonne d'eau homéotherme (environ 13°C) de la sub-surface à ses plus grandes
profondeurs.
70
III.2 Manuscrit n°3
BIOPOLYMER HYDROLYSIS AND BACTERIAL
PRODUCTION UNDER AMBIENT HYDROSTATIC
PRESSURE THROUGH A 2000 M WATER COLUMN IN
THE NW MEDITERRANEAN
Christian Tamburini*, Jean Garcin and Armand Bianchi
Microbiologie Marine, UMR 6117 CNRS - INSU, Université de la Méditerranée, COM,
Campus de Luminy, case 907, F-13288 Marseille, cedex 9, France
*E-mail address: [email protected]
Deep-Sea Research II 49 (2002): 2109-2123
71
Préambule
Plusieurs travaux ont été consacrés à la mesure des activités aminopeptidasiques dans les eaux
océaniques et les sédiments profonds (Rosso & Azam, 1987; Hoppe et al., 1993; Boetius &
Lochte, 1994; Poremba, 1994; Koike & Nagata, 1997; Talbot & Bianchi, 1997; Talbot et al.,
1997; Tholosan & Bianchi, 1998; Hoppe & Ullrich, 1999; Coolen & Overmann, 2000; Sass et
al., 2001). Par contre, seuls les travaux de Koike & Nagata (1997) et de Hoppe & Ullrich
(1999) montrent que l'activité phosphatidique augmente en profondeur, non pas pour fournir
du phosphate disponible en quantité importante dans le domaine océanique profond mais pour
répondre à la demande carbonée des bactéries.
Les quelques onze études citées ci-dessus ont malheureusement été réalisées sans tenir
compte de l'effet de la pression hydrostatique, paramètre abiotique le plus caractéristique du
domaine océanique profond, sur les activités ectoenzymatiques mesurées. L'étude en
laboratoire de Kato et al. (1995) démontrait l'adaptation d'une enzyme ectoprotéasique,
purifiée d'une bactérie piezotolérante, à de fortes pressions hydrostatiques (cf. paragraphe
I.3.1.4). Les mesures d'activités ectoenzymatiques effectuées sur des populations naturelles
soumises à la décompression pouvaient donc être biaisée par ce stress. Il convenait donc
d'utiliser l'équipement hyperbare disponible au laboratoire pour effectuer les premières
mesures d'activités ectoenzymatiques sur des échantillons profonds non décomprimés pour
préciser le rôle du facteur pression hydrostatique sur ces processus enzymatiques.
72
Deep-Sea Research II 49 (2002) 2109–2123
Biopolymer hydrolysis and bacterial production under ambient
hydrostatic pressure through a 2000 m water column in the
NW Mediterranean
Christian Tamburini*, Jean Garcin, Michel Ragot, Armand Bianchi
Laboratoire de Microbiologie Marine, Universite! de la M!editerran!ee, COM, CNRS - INSU, UMR 6117, Campus de Luminy, Case 907,
163 avenue de Luminy, 13288 Marseille cedex 9, France
Accepted 24 November 2001
Abstract
Kinetic parameters for aminopeptidase, phosphatase, and bacterial production rates were studied during spring and
fall through a 2000 m water column in the NW Mediterranean. Bacterial production ranged from 60.4 ng at 30 m to
0.2 ng C l1 h1 at 2000 m. For both ectoenzymatic activities, the Km values ranged from 0.44 to 1.13 mM for
aminopeptidase activity and from 0.05 to 1.23 mM for phosphatase activity. Depth profiles of the potential activity of
aminopeptidase and phosphatase activity drastically decreased below depths of 100 m. At 1000 m, hydrolytic activities
were one order of magnitude lower than the maximal rate measured in the surface layer. Despite this decrease, depthintegrated rates through the thickness of different water masses showed that the potential hydrolysis fluxes within the
productive surface layer (10–200 m), through the twilight zone (200–1000 m depth), and through the deep water mass
(1000–2000 m) were roughly the same order of magnitude. This study used the first assay for measuring ectoenzymatic
activities of deep-sea microbial populations where pressure stresses were eliminated during sampling and incubation.
The results showed that prokaryotic induced ectoenzymatic activities are affected by pressure conditions. Generally,
aminopeptidase and phosphatase rates measured in samples maintained under in situ pressure conditions were 2.3 times
higher than those measured in their decompressed counterparts. r 2002 Elsevier Science Ltd. All rights reserved.
prokaryotic activities within the deeper water
masses and at the water-sediment boundary layer
(Deming, 1985; Hoppe et al., 1993; Poremba,
1994a; Turley and Mackie, 1994; Turley et al.,
1995; Tholosan and Bianchi, 1998). Nevertheless,
the measurement of mineralization fluxes between
the surface water layers and the underlaying layers
remains poorly documented. In deep water masses,
the measured mineralization rates appear very low,
commonly one or two orders of magnitude lower
than those measured in the corresponding surface
waters (Bianchi et al., 1998). However, when these
1. Introduction
Most of the organic material produced in the
photic zone is recycled in the upper layer of the
ocean; however, part of this production is exported downwards through the water column.
Mineralization of this material depends on the
*Corresponding author. Tel.: +33-4-91-82-90-49;
fax: Tel.: +33-4-91-82-90-51.
E-mail address: [email protected]
(C. Tamburini).
0967-0645/02/$ - see front matter r 2002 Elsevier Science Ltd. All rights reserved.
PII: S 0 9 6 7 - 0 6 4 5 ( 0 2 ) 0 0 0 3 0 - 9
73
2110
C. Tamburini et al. / Deep-Sea Research II 49 (2002) 2109–2123
The aims of our study were primarily to measure
the maximum potential velocity (Vmax ) of ectoenzymatic hydrolysis through a 2000 m deep-water
column in the NW Mediterranean, then to attempt
to measure the actual rates and ultimately to
understand the possible adaptation of ectoenzymatic activities to pressure conditions.
rates are integrated through the thickness of each
water mass, the mineralization flow via prokaryotic populations located deeper than 200 m
appears far from negligible (Lefe" vre et al., 1996;
Bianchi et al., 1998).
The depth (2300 m), and absence of horizontal
advection currents (Andersen and Prieur, 2000),
establishes the DYFAMED sampling area as an
important zone for following the mineralization
fluxes from the prokaryotic compartment through
the water column. It is now well accepted that
high-pressure conditions affect bacteria metabolism (ZoBell and Oppenheimer, 1950; Jaenicke,
1987; Straube et al., 1990; Turley, 1993; Poremba,
1994b). In previous studies we showed that
changes in hydrostatic pressure conditions during
sampling affect the uptake rate of low molecular
weight compounds by deep-sea bacterial populations (Bianchi and Garcin 1993, 1994; Tholosan
et al., 1999a). In deep-sea waters these metabolic
processes are probably limited by labile monomer
availability. Even if the bulk of dissolved organic
matter (DOM) in the ocean essentially includes
small molecules, these compounds cycle slowly
and they are relatively unavailable to microorganisms. Moreover, high molecular weight (HMW;
>1 kDa) DOM might be utilized faster and to a
greater extent than the corresponding low molecular weight (LMW; o1 kDa) DOM (Amon and
Benner, 1994). Molecules larger than 600 Da
cannot be transported across the microbial cell
membranes (Nikaido and Vaara, 1985). Thus,
enzymatic hydrolysis of HMW compounds is the
initial and obligatory step for the prokaryotic
processes involved in the decomposition of organic
matter in aquatic environments. This step is
commonly described as the limiting step for
prokaryotic utilization of the organic bulk in
marine systems (Chrost, 1991). Thus the efficiency
of the microbial processes involved in the hydrolysis of HMW biopolymers appears to be highly
determining in deep-sea waters. However, these
processes remain poorly studied in deep-sea
environments, probably due to the unsuitability
of the analytical methods for measuring the
low hydrolysis rates expected in characterizing
nutrient-depleted deep-sea waters (Hoppe and
Ullrich, 1999).
2. Materials and methods
2.1. Sampling area and sampling protocol
Sampling was carried out over two cruises
(April and September, 2000) in the north-western
Mediterranean Sea, at the DYFAMED timesseries station (for more information see Marty
et al., 2002). This station is located at 52 km
southeast of Nice (431250 N, 071520 E). Sampling
was carried out using a High Pressure Serial
Sampler (HPSS) (for a complete description see
Bianchi et al., 1999a). The HPSS is a Sea-Bird
Carousel that can be simultaneously fitted with
conventional 12-l Niskin bottles and 500 ml
pressure retaining bottles (HPBs). HPBs are
autoclaved before being fitted on the Carousel.
Immediately before immersion of the Carousel, the
labeled compound used to measure a metabolic
activity is injected in the HPB through the
injection port, and thus the compound is mixed
to the sample volume during filling. During
retrieval and subsequent incubation periods, pressure conditions for each HPB were recorded
continuously on the computer, via the Deck Unit
of the CTD (Sea-Bird 911 plus). Incubations of
HPBs were carried out in a temperature-controlled
water bath to keep the samples at in situ
temperature. During the incubation period, a
series of sub-samples were successively collected
without causing any pressure loss in the culture
vessels to enable time-course experiments (for an
exhaustive description of high-pressure processing
see Bianchi et al., 1999a).
The daily sampling protocol was carried out as
following. During the same hydrocast, three
samples were collected using Niskin bottles (one
in the surface layer (0–200 m), one in the intermediate layer (200–800 m), and one in the deep
74
water layer (800–2000 m) and three pairs of HPB
samples were collected between 800 and 2000 m.
Each pair of HPB samples included a sample
maintained at in situ pressure and its decompressed counterpart.
To assess the effect of pressure conditions on
ectoenzymatic activity, two HPBs were simultaneously filled at the same sampling depth: one was
kept under in situ pressure, the other was
decompressed during its rise through the water
column by partly opening the closing valve. The
enzymatic rates measured in these two HPBs were
then compared. These assays were run in timecourse experiments over 0, 2, 4, 6 and 12 h of
incubation (Bianchi et al., 1999a).
2111
For the assays made using high-pressure bottles,
we used saturation concentrations those defined
during multi-concentration experiments previously
done on decompressed samples collected at the
same depth.
We did not get natural concentrations for
Leu-MCA and MUF-Phosphate analogs in the
DYFAMED area. To compensate, we referred to
Keil and Kirchman (1999) who estimated that in
the Sargasso Sea (a paragon of oligotrophic sea
through the global Ocean), dissolved combined
amino acids ranged from 167 to 810 nM between
1000 m deep and subsurface waters. Yet, the
50 nM of labeled substrate we added may be,
supposed, lower than what could be the natural
concentration of competitive analog substrates for
Leu-MCA in this NW Mediterranean area, less
oligotrophic than the Sargasso Sea. As we do not
have any certitude about this hypothesis, we
considered the rates measured using such 50 nM
substrate concentrations only as a rough approach
of what could be the actual trace velocity (Vtr ) and
the actual hydrolysis rate constant (Hr ).
For aminopeptidase and phosphatase activities,
the average coefficient of variation for the Vmax
calculation was 16.5% (n ¼ 62), and 24.9% for the
Vtr or Hr calculation (n ¼ 53).
2.2. Ectoenzymatic degradation of biopolymers
Referring to the technique described by Hoppe
(1993), we used the fluorogenic substrates
L-leucine-7-amino-4-methylcoumarin (Leu-MCA)
and 4-methylumbelliferyl-phosphate (MUF-P)
(Sigma Chemical Co.) to measure aminopeptidase
and phosphatase activity. These fluorogenic substrates compete well with easily degradable natural
compounds (Chrost, 1991).
Determination of the kinetic parameters (the
maximum velocity, Vmax ; and the Michaelis constant, Km ) was performed on samples decompressed during retrieval, according to the
multi-concentration kinetic method (Wright and
Hobbie, 1966). Substrate was added at 8 different
concentrations (50, 100, 250, 500, 1000, 1500, 2500
and 5000 nM final concentration). Incubations
were carried out in duplicate in the dark at in situ
temperature (13711C). Enzyme assays were run in
time-course experiments over 0, 2, 4, 6 and 12 h,
and any increase in fluorescence was determined
using a Kontron SFM 25 spectrofluorometer,
(emission and excitation wavelengths of
455/365 nm, and 460/365 nM for Leu-MCA and
MUF-phosphate, respectively). To quantify the
MCA (7-amino-4-methylcoumarin) or the MUF
(4-methylumbelliferone) liberated by bacterial
hydrolysis during these experiments, calibration
curves were run using 2 series of known concentrations of MCA and MUF in seawater.
2.3. Bacterial biomass production
This parameter was measured over time-course
experiments following the protocol described
above, comparing samples at in situ pressure with
their decompressed counterparts. The labeled
tracer was 3H-leucine, specific activity 55 Ci mmol1
(Amersham Corp.), used to give a final concentration of 20 and 10 nM in samples from the
euphotic and aphotic zones, respectively. To
calculate bacterial production we used the empirical conversion factor of 1.55 ng C pmol1 of
incorporated leucine according to Simon and
Azam (1989), assuming that isotope dilution was
negligible under these saturating concentrations.
2.4. Bacterial counts
Subsamples were collected for bacterial counts
immediately after retrieval of the sampler. They
75
2112
were immediately fixed in 2% buffered formalin
and slides were prepared aboard the research
vessel as soon as possible. Cells were collected onto
a 25 mm black polycarbonate Nuclepore membrane with 0.2 mm pore size and stained with
diamidinophenylindole (Porter and Feig, 1980).
Slides were stored frozen until their enumeration
by epifluorescence microscopy (Olympus, BH2).
All the experiments were processed onboard the
research vessel, immediately after sample retrieval.
In spring, bacterial production rates ranged
between 60.4 and 0.2 ng C l1 h1 at 30 and 600 m,
respectively. In fall, production rates were between
23.8 and 0.2 ng C l1 h1 at 10 and 2000 m
(Fig. 1b).
3.2. Kinetic parameters and depth profiles of
ectoenzymatic activities
Several saturation curves were drawn to determine the Michaelis–Menten kinetic parameters
using the multi-concentration method. It was
observed that the saturation concentration for
MUF-phosphate and Leu-MCA was 5 mM
(Fig. 2). Subsequently, we chose this as the final
substrate concentration to measure the maximal
velocity (Vmax ).
For both substrates 50 nM appeared as the
lowest concentration capable of giving a significant response after the incubation period. We used
this concentration to measure what could be an
approach of the hydrolysis rate in trace conditions
(Vtr ), according to the single concentration method (Gocke, 1977).
The Michaelis constant (Km ) for peptidase
activity ranged between 0.16 and 0.52 mM in spring
and 0.34 and 1.13 mM in fall. For phosphatase
activity, Km values ranged between 0.05 and
0.56 mM in spring, and between 0.17 and 1.82 mM
in fall.
For aminopeptidase and phosphatase potential
activity, the maximal rates appeared in the subsurface layer, irrespective of sampling season (Figs. 3
and 4). In the spring, the average Vmax for
phosphatase was 1119 in surface waters and
222 pM h1 in deep waters. In fall, corresponding
average values were 1518 and 1227 pM h1. Depth
profiles of aminopeptidase activity (Fig. 3) exhibited the same behavior as observed for phosphatase activity, but average Vmax values in the surface
layer were 8 times greater than in deeper waters in
spring, and 3 times higher in fall (Table 1).
For aminopeptidase and phosphatase, the
strongest hydrolysis rate constant (Hr ) appeared
in the subsurface layer in fall. The average values
for Hr for phosphatase were 18.4% d1 in surface
water and 4.1% d1 in deep water. For aminopeptidase activity the corresponding values were
3. Results
3.1. Hydrological conditions, bacterial distribution
and production
The DYFAMED area is known to be relatively
free of advective currents. Basically in this 2300 mdeep water column, one can describe four water
masses (Be! thoux et al., 1988). The surface layer,
known as the Modified Atlantic Water (MAW),
reaches a depth of 200 m, and is characterized by
low salinity and temperature. Between this layer
and 600–800 m is the Levantine Intermediate
Water (LIW), characterized by salinity levels
>38.45, high nutrient concentrations, and a
minimal oxygen concentration between 300–
400 m. In its deepest stratum, LIW usually
accommodates large concentrations of gelatinous
macro-zooplankton (Gorsky et al., 1991). These
organisms produce large amounts of organic
material such as feces and dead bodies. Between
800 and 1000 m there is an intermediate layer
formed by the mixing of over- and underlying
waters. Below 1000 m the Deep Mediterranean
Water (DMW) is characterized by stable temperature (12.701C) and salinity (38.40) throughout the
year.
In this area, bacterial counts and bacterial
production profiles classically decrease with depth;
however, both showed an increase between 300
and 400 m (Fig. 1). These peaks coincided with the
minimal oxygen concentration in the LIW. Bacterial densities ranged between 14.4 and 4.3 105
cells ml1 in surface waters (10–100 m) and between 8.5 and 3.6 104 cells ml1 in deep-water
samples (1000–2000 m) (Fig. 1a).
76
103 cell sml -1
(a)
0
500
1000
ng C l -1 h-1
1500
2000
0
dept (m)
(b)
0
20
40
60
80
100
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
0
50
50
100
100
150
2113
0
100
200
300
400
500
100
200
200
400
400
600
600
800
800
1800
1000
1800
1200
1800
1400
1800
1600
1800
1800
2000
2000
sp ring
fall
Fig. 1. Depth profiles for bacterial counts (a) and bacterial production (b) trough the water column in spring and fall conditions. –E–
spring; –’– fall conditions. Note different scales for superficial waters and deeper layers.
5.4 and 4.5% d1. Depth profiles for Hr (Figs. 3
and 4) showed a similar pattern to that of the
potential activities, with the peak in the oxygenminimum layer more evident for aminopeptidase
than for phosphatase activity.
resulted in a 1.5–2.8-fold increase in the rates
measured on samples at in situ pressure compared
to their decompressed counterparts. Variability of
the pressure effect did not appear to be linked to
substrate concentration.
3.3. Effect of hydrostatic pressure conditions on
prokaryotic activities
3.4. Seasonal variability of ectoenzymatic activities
In the photic zone, between spring and fall,
bacterial production and aminopeptidase rates
decreased, whilst phosphatase rates increased. In
the deeper water column, bacterial production
remained constant, whilst both enzymatic activities increased in fall, irrespective of the added
substrate concentration (Table 1).
In the surface layer, aminopeptidase rates were
1.6 times higher than the Vmax obtained for
phosphatase in spring, but in fall the two enzymatic activities were quite identical. Deeper in the
water column, the rates were identical in spring
As shown in previous studies (Bianchi et al.,
1999a), bacterial production rates measured on
decompressed deep water samples have been
underestimated when compared to samples maintained at in situ pressure (Table 2). During these
two cruises we were able to measure for the first
time prokaryotic ectoenzymatic activities on undecompressed deep-water samples. Both assays
(i.e. using trace and saturation substrate concentrations) showed a positive effect of high-pressure
conditions on the measured Vmax and Vtr : This
77
(a)
900
MCA-Leu hydrolysis rate (pmol l-1 h-1)
2114
800
700
600
500
400
300
200
100
0
0
1
2
3
[Leu-MCA] (µM)
4
5
0
1
2
3
[MUF-P] (µM)
4
5
MUF-P hydrolysis rate (pmol l-1 h-1)
(b) 2500
2000
1500
1000
500
0
Fig. 2. Saturation curves for (a) aminopeptidase activity and (b) phosphatase activity in water samples collected at the DYFAMED
station.
appear as an adaptation by bacterial assemblages
to the variability of the substrate concentration in
the natural environment (Talbot and Bianchi,
1997; Lamy et al., 1999; Tholosan et al., 1999b;
Unanue et al., 1999). The possibility of biphasic
kinetics can give rise to an overestimation of
measured rates, particularly if the experimentally
added substrate concentration is clearly over the
possible range of concentrations found in the
natural environment. In order to get a significant
determination of the kinetic parameters, the added
substrate concentrations must be close to the
expected range of variation in the studied
conditions, but due to a drastic increase of
phosphatase in fall, this activity was 2.7 times
higher than aminopeptidase; the bacterial production rate remained quite constant.
4. Discussion
4.1. Km values and substrate affinity
The specific diversity of natural prokaryotic
assemblages can facilitate the development of
biphasic ectoenzymatic kinetics. Such kinetics
78
-1 -1
Vmax (pmol l h )
(a)
depth (m)
0
1000
2000
3000
Hr (% d -1)
(b)
4000
0
0
0
200
200
400
400
600
600
800
800
1000
1000
1200
1200
1400
1400
1600
1600
1800
1800
2000
2000
2115
10
20
30
40
spring
fall
Fig. 3. Depth profiles of aminopeptidase activity through the water column in spring and fall conditions. Comparison of (a) maximal
velocity of hydrolysis (Vmax ) and (b) rates measured at 0.05 mM (Vtr ). –E– spring; –’– fall conditions.
-1 -1
Vmax (pmol l h )
(a)
depth (m)
0
1000
2000
3000
-1
Hr (% d )
(b)
4000
0
0
0
200
200
400
400
600
600
800
800
1000
1000
1200
1200
1400
1400
1600
1600
1800
1800
2000
2000
10
20
30
40
spring
fall
Fig. 4. Depth profiles of phosphatase activity through the water column in spring and fall conditions. Comparison of (a) maximal
velocity of hydrolysis (Vmax ) and (b) rates measured at 0.05 mM (Vtr ). –E– spring; –’– fall conditions.
79
26.679.7
0.470.4
1.5%
10–200
200–2000
200–2000/10–200
h
ng C l
1
Vmax : maximum velocity determined with multi-concentration kinetic method; Hr : hydrolysis rate constant measured at 0.05 mM; value7SE: standard error. Deep/
surface: relative contribution of processes within the intermediate and deep-water layer to the flow throughout the surface layer. (n.d. not determined)
15187260
12277590
81%
11.472.4
0.470.2
4.4%
17867222
228767
13%
n.d.
4.472.1
n.d.
1119775
2227122
20%
5.472.9
4.574.7
83%
14387170
4557205
32%
7.872.3
3.371.0
42%
Hr 7SE
(% d1)
Vmax 7SE
(pM h1)
Vmax 7SE
(pM h1)
Hr 7SE
(% d1)
Vmax 7SE
(pM h1)
Hr 7SE
(% d1)
Vmax 7SE
(pM h1)
Hr 7SE
(% d1)
Fall
Spring
Fall
Spring
1
Fall
Spring
Phosphatase
Aminopeptidase
Production
Layer (m)
Table 1
Comparison of average rates of enzyme activity and bacterial production within the surface layer (10–200 m deep) and the intermediate and deepwater layer (200–2000 m
deep) at the DYFAMED station in spring and fall conditions
18.478.3
4.171.9
22%
2116
environment. Concentrations of dissolved proteins
in marine systems are usually lower than 5 mM
(Druffel et al., 1992; Keil and Kirchman, 1994;
Kroer et al., 1994). Recently, Keil and Kirchman
(1999) estimated that dissolved combined amino
acids (DCAA) ranged from 0.167 to 0.810 mM
between deep (1000 m) and subsurface waters in
the oligotrophic Sargasso Sea. The final concentrations of labeled compounds we used in this
study, ranging from 0.05 to 5 mM, are close to the
expected natural concentrations in this area,
making likely the Km kinetics parameters we
measured.
The multi-concentration technique allows us to
calculate the Michaelis constant, Km : The Km we
calculated ranged between 0.16 and 1.13 mM for
aminopeptidase and between 0.05 and 1.82 mM for
phosphatase activities. These values fall within the
range of values obtained by other authors (Unanue et al., 1999; Ammerman and Glover, 2000)
using similar ranges of added substrate concentration. This result confirms that marine prokaryotic
assemblages are able to use the very low substrate
concentrations characteristic of deep-sea waters.
4.2. Depth profiles of enzymatic rates and
adaptation of prokaryotic ectoenzymatic activities
to deep-sea conditions
Depth profiles of aminopeptidase and phosphatase values for Vmax show that in this area of the
Mediterranean the drastic decrease in enzymatic
rates appears above 200 m (i.e. above the boundary between Modified Atlantic Water and Levantine Intermediate Water). Both enzymatic
activities peaked in the LIW, at approximately
400 m, i.e. in the layer of minimal oxygen
concentration. At a depth of 1000 m, aminopeptidase and phosphatase rates were one order of
magnitude lower than in the corresponding surface
waters (Figs. 3 and 4). This decrease agrees with
that previously described by Rosso and Azam
(1987), who reported an order of magnitude
decrease in proteolytic activities from the surface
(o100 m) to the deep waters (500–900 m) in the
Santa Monica Basin. In the central Pacific Ocean,
Koike and Nagata (1997) observed a 2- to 3-order
of magnitude decrease in b-glucosidase activity
80
2117
Table 2
Effect of hydrostatic pressure conditions on microbial activities. Comparison of bacterial production, aminopeptidase and phosphatase
rates measured on samples maintained under ambient pressure conditions (VHP) to the rates measured on their decompressed
counterparts (VDEC)
Depth (m)
1000
1500
2000
2000
Bacterial production
ng C l1 h17SE
Aminopeptidase
Vmax (pM MCA h1)7SE
Hr (% d1)7SE
Phosphatase
Vmax (pM MUF h1)7SE
Hr (% d1)7SE
VDEC
VHP
Rates
VDEC
VHP
0.4870.10
0.2870.12
0.2170.11
0.1370.14
0.7770.15
0.7470.39
0.4770.11
2.0670.06
Hr
3.972.4
11.074.4
Vmax
Vmax
571768
137796
835799
386720
Rates
VDEC
VHP
Hr
Vmax
Vmax
3.170.7
335740
168770
7.271.9
4687203
4437199
Vmax : maximum velocity determined with multi-concentration kinetic method; Hr : hydrolysis rate constant measured at 0.05 mM.
between surface and deep waters, whilst the
decrease in alkaline-phosphatase activity was
limited to 50% of its initial value. Hoppe and
Ullrich (1999) described a virtually constant Vmax
rate, or even a slight increase in aminopeptidase
activity, at depth in an oligotrophic area in the
Arabian Sea. Conversely, these authors observed a
drastic increase in phosphatase activity in deep
water.
In intermediate and deep-waters, the average
Vmax for aminopeptidase represented only 13 and
32% of the corresponding rates in surface waters
in spring and in fall periods, respectively. For
phosphatase activity, corresponding ratios were
20% in spring and 81% in fall (Table 1). However,
depth integration of Vmax values showed that the
potential hydrolysis flow due to prokaryotic
populations located deeper than 200 m is far from
negligible. Results presented in Table 3 show that,
when one takes into account ambient pressure,
more than 50% of the potential aminopeptidase
activity through the whole water column could be
due to the activity of organisms located within the
intermediate and deep-water layers (i.e. 67% in
spring and 91% in fall). For phosphatase, 74%
and 94% of the potential activities are in the
intermediate and deep-water layers in spring and
fall conditions, respectively. These data confirm
previous observations on the vertical distribution
of diverse bacterial activities through the water
column. In studying the catabolism of 14C-glucose,
we calculated that in an oligotrophic area of the
NE Atlantic 46% of the carbon dioxide potentially
produced by pelagic bacteria could be due to the
activity of prokaryotic populations in intermediate
and deep waters (Bianchi et al., 1998). Using ETS
activity, Lefe" vre et al. (1996) showed that 75% of
the metabolic CO2 produced in the water column
occurs at depths between 200 and 1000 m. It
appears that even if the metabolic rates measured
in samples collected below 200 m are drastically
lower than those measured in surface waters, the
fluxes of metabolites produced in the surface and
the deep layers could result in the same order of
magnitude.
This study pinpoints the impact of pressure
conditions on the efficiency of prokaryotic populations processing on biopolymer hydrolysis. For
example, in fall, the integrated potential aminopeptidase activity calculated by using decompressed samples was 947 mmol MCA hydrolyzed
m2 h1, while the same calculation using undecompressed samples was 2-fold higher (Table 3).
To get the organic carbon made easily assimilated
for prokaryotic organisms through the hydrolysis
process, we hypothesized that one mole of
MCA hydrolyzed corresponds to 1 mol of
leucine released. This calculation showed that
prokaryotic ectoenzymatic activity could release
1.1 mmol C m2 h1 through the superficial layer
(10–200 m depth). In the 200–2000 m deep-water
layer, the same calculation lead to the release of
5.6 or 11.0 mmol C m2 h1 depending on the use
of decompressed or undecompressed samples,
81
respectively. This example shows that the use of
Niskin samplers instead of pressure-retaining
devices introduces an underestimation of 50% of
the flow of low molecular weight compounds
potentially released by prokaryotic hydrolysis
throughout a 200–2000 m deep-water column.
Adaptation of deep-sea bacteria to high-pressure
conditions has been demonstrated for monomer
assimilation and for the corresponding energyyielding reactions (Bianchi and Garcin, 1993,1994;
Bianchi et al., 1999a, b; Tholosan et al., 1999a). To
our knowledge, this study is the first to measure
ectoenzymatic activities of deep-sea prokaryotic
populations by using an experimental strategy
avoiding pressure stresses during sample retrieval
and incubation.
This adaptation of enzymatic processes to in situ
pressure conditions first appears at or above
1000 m (Table 2). Pressure effects on the enzymatic
rates (Pe ) can be estimated by the relation
Pe =VHP/VDEC, where VHP is the rate measured
in samples kept under ambient pressure conditions, and VDEC the rate measured on their
decompressed counterparts. As an average of the
whole data set, including Vmax and Vtr values, we
obtained for the 2 enzymatic activities,
Pe =2.370.6 (n ¼ 6). Kato et al. (1995) reported
that, in laboratory conditions, alkaline serine
ectoprotease activity of a strain of Sporosarcina
sp. isolated from the Japan Trench at 6500 m was
nearly doubled at 60 MPa compared to the rate
measured at atmospheric pressure. Such a behavior suggests that this protease may be adapted to
the high-pressure environment found in the deep
sea. Recently, Bull et al. (2000) confirmed that
some enzyme production by deep-sea bacteria can
be increased by high-pressure.
Studies based on bacteria grown in culture
media under different pressure conditions suggested that prokaryotic adaptation to high-pressure conditions could control the rates of overall
prokaryotic activity in the deep sea (Yayanos et al.,
1982). This assumption is supported by our data
obtained from natural deep-sea prokaryotic assemblages, since the studied ectoenzymatic activities appear to be adapted to in situ pressure
conditions. Nevertheless, we have to acknowledge
that our observations were made during the
Vmax : maximum velocity determined with multi-concentration kinetic method; Vtr : rate measured with the substrate added at 0.05 mM; value7SE: standard error 200–
2000 part (%) in ambient pressure: relative contribution of processes within the intermediate and deep waters to the flow throughout the whole water column under
ambient pressure conditions.
2397260
21447590
374571237
39847960
94%
6710
3475
5875
6477
90%
156775
3227121
4377122
5937105
74%
22766
163790
300790
322780
94%
1937170
9477205
18407205
20337191
91%
6715
39711
62714
68714
91%
10–200
200–2000 decompressed
200–2000 in ambient pressure
10–2000 in ambient pressure
200–2000 part (%) in ambient pressure
Vmax 7SE
2389710
94170.4
121970.4
360776
34%
127472
68270.2
297670.2
422272
70%
2727222
324767
551781
8237156
67%
Vtr 7SE
Vmax 7SE
Vmax 7SE
Vmax 7SE
Spring
Fall
Spring
Vtr 7SE
Fall
Vtr 7SE
Vmax 7SE
Vtr 7SE
Fall
Spring
Phosphatase
m mol m2 h1
Aminopeptidase
m mol m2 h1
Production
mg C m2 h1
Layer (m)
Table 3
Integrated enzyme activities (mmol m2 h1) and bacterial production (mg C m2 h1) through different water layers at the DYFAMED station in spring and fall
conditions: trapezoidal integration of measured rates through the Modified Atlantic Water layer (10–200 m), through the intermediate and deep-water layer (200–
2000 m) calculated on samples decompressed (decompressed) and under ambient pressure conditions, and throughout the whole water column (10–2000 m deep) under
ambient pressure conditions
51744
11871
16471
214743
76%
2118
82
2119
phosphate availability. Koike and Nagata (1997)
hypothesized that the most probable origin of
phosphatase activity in the deep sea could be from
the phytoplankton particles sinking from the
upper layers of the ocean. Conversely, at the
DYFAMED station, chlorophyll a and particle
flow were lower in fall than in spring (Carroll et al.,
1998; Marty and Chiave! rini, 2002).
Hoppe and Ullrich (1999) considered a conceptual model of the different mechanisms for
phosphatase increase in the deep ocean. These
authors suggested that their observation of phosphatase increase in the deep Indian Ocean was
related to the strict C-limitation of bacteria in deep
sea and not with the P-demand. We could
speculate that following the summer period, when
deep waters are particularly impoverished in
organic nutrients, deep-sea bacteria have to draw
their carbon sources from the bulk of resistant
polymers to compensate for the lack of readily
available organic monomers. This pattern could
provoke an acceleration of hydrolytic activities in
fall, and particularly of the phosphatase rates,
because, as suggested by Hoppe and Ullrich
(1999), a preliminary enzymatic hydrolysis seems
to be necessary to allow the uptake of even small
phosphomonoesters by bacteria.
stratified water period, and that adaptation to
pressure conditions depends on the origin of
bacterial populations. Indeed bacterial adaptation
to pressure may vary according to hydrological
conditions. We already have observed a negative
effect of high pressure on potential metabolic
activities of deep-sea bacteria during the mixed
water period, when downwelling of surface water
takes surface bacteria to the depths (Bianchi and
Garcin, 1994). In the same manner, we observed
that bacteria linked to fecal pellets of migrating
zooplankton collected at depth may be unaffected
by pressure conditions (Bianchi et al., 1999b).
4.3. Seasonal variability of prokaryotic
ectoenzymatic activity
Seasonal variability of prokaryotic activity in
the photic layer is well documented. However, the
literature reports few examples of such studies
through the deep-water layers. This lack of interest
is probably due to the progressive weakness of
seasonal fluctuations in physical and chemical
parameters with increasing depth. The two series
of samples we studied at a 6-month interval give
some indication of the seasonal variability of
potential ectoenzymatic activities at depth.
To follow the evolution of potential enzymatic
activities within surface and deep waters during
the two sampling periods, we used the ratio
F =S=fall flux/spring flux. In surface waters
bacterial production and aminopeptidase activity
decreased between the two cruises (F =S=0.5 and
0.7, respectively), meanwhile phosphatase activity
increased (F =S=1.5). In deep-waters, bacterial
production and both enzymatic activities increased: F =S ratio was 2.4 for biomass production,
3.3 for aminopeptidase, and 8.6 for phosphatase.
Theoretically this increase should not be related to
phosphate concentration, which is usually greater
than 0.40 mM in water layers deeper than 200 m
(M.D. Pizay pers. comm.). Due to the continually
high concentration of reactive phosphate, deep-sea
bacteria should not have to hydrolyze P-substrates
(like esters and anhydrides of phosphoric acid) to
produce phosphoric acid (Jansson et al., 1988).
Thus, at depth, whatever the season, phosphatase
activity should be continuously repressed by
4.4. The coupling or uncoupling of ectoenzymatic
activities with bacterial density and biomass
production
Hydrolytic activities reflect a specialized adaptation of prokaryotic consortia. To appreciate the
suitability of this adaptation, the measured enzymatic rates may be normalized to the bacterial
abundance (i.e. leading to the estimation of the
cell-specific activity). We observed (Table 4) that
cell-specific aminopeptidase activity, and to a
greater extent, phosphatase activity, is higher in
deep waters than in the shallow waters. This
increase shows that deep-sea bacteria are more
closely adapted to HMW polymer hydrolysis than
surface bacteria. Yet, the cell-specific activity
serves only as a rough guide to bacterial adaptation, as the percentage of viable bacteria amongst
the total count varies greatly (Bianchi and
Giuliano, 1996).
83
2120
Table 4
Comparison of averaged potential ectoenzymatic activity rates normalized by bacterial production or by total counts within the surface
layer (10–200 m deep) and the intermediate and deep-water layer (200–2000 m deep) at the DYFAMED station in spring and fall
conditions
HyP=MH/BP (nmol MH nmol1 C synthesized)
MH/TC(amol MH cell1h1)
Layer (m)
Aminopeptidase
Vmax
Phosphatase
Vmax
10–200
200–2000
10–200
200–2000
3.4
13.3
1.9
3.5
4.6
30.1
1.9
7.7
HyP=MH/BP: macromolecular hydrolysis (MH) versus bacterial production (BP); MH/TC: macromolecular hydrolysis (MH) versus
total counts (TC).
of these 2 enzymatic processes through space and
time could indicate the relative contribution of
non-bacterial enzymes to the processes of organic
polymer decomposition.
Data presented in Table 4 show that HyP values
are higher in deep waters than in the surface layers
for both enzymatic activities. Theoretically, this
means that in the 200–2000 m depth, it should be
necessary to hydrolyze about 3.4 times more
amino-peptides, or 6.5 times more P-polymers, to
produce the same bacterial biomass observed in
the photic layer (10–200 m depth). Such an
increase of hydrolyzed compounds to bacterial
production at depth agrees with an organic bulk
devoid of readily utilizable monomers. It demonstrates that deep-sea assemblages are well adapted
to find carbon and energy sources in the HMW
compounds. Moreover, aminopeptidase activity is
highly correlated with bacterial abundance
(r ¼ 0:89; po0:0001; n ¼ 21) and with bacterial
production (r ¼ 0:81; po0:0001; n ¼ 15), whilst
phosphatase activity is only significantly correlated to bacterial abundance (r ¼ 0:53; po0:05;
n ¼ 24) and bacterial production (r ¼ 0:58;
po0:05; n ¼ 19). Highly significant correlation
observed between aminopeptidase and bacterial
parameters agrees with an admitted exclusive
bacterial origin for these enzymatic systems.
Microbial ectoenzymatic activities are expected
to be the preliminary step for bacterial degradation of the organic bulk. The question remains for
a possible limiting role of this preliminary step.
Comparing ectoenzymatic activities with the estimation of the overall prokaryotic metabolism
could help to answer this question. It is obvious
that the difficulty lies in defining a precise
indicator of overall microbial metabolism. We
decided to use an index that should be able to
quantify the participation of organic compounds
resulting from the hydrolysis of biopolymers to the
production of bacterial biomass HyP=Vmax ‘‘hydrolysis rate/bacterial production rate’’. This ratio
is open to criticism, as there is no proof that
defined ectoenzymatic activity is actually performed by the same bacteria as those producing
the bacterial biomass (Talbot et al., 1997). Nevertheless, HyP normalizes the hydrolytic potential in
relation to a unit of overall prokaryotic metabolism (i.e. the mass of hydrolyzed biopolymer
related to the production of one unit of bacterial
organic C). In this way, HyP relates the energy
spent in the preliminary step to the end product of
heterotrophic growth, i.e. bacterial biomass production.
This hypothesis implies that hydrolytic ectoenzymes are exclusively produced by bacteria. A
major microbial origin is accepted for enzymes like
aminopeptidase (Hoppe, 1984), but in the case of
phosphatase other origins are also possible. All
components of the aquatic biota could produce
phosphatase, but the most important should be
due to bacteria, phytoplankton and zooplankton
(Jansson et al., 1988). The respective HyP patterns
5. Conclusion
The present study showed that relative to the
rates measured under ambient pressure conditions,
decompression of deep-water samples provoked a
84
slowing of hydrolytic activities of nearly 50%.
Such a slowing down suggests that in the deep
ectoenzymatic processes depend, at least for a
significant part, on pressure adapted organisms.
Despite this adaptation to pressure conditions, the
measured hydrolysis rates drastically decrease a
few tenths of meters below the sea surface.
Meanwhile, the flow of readily utilizable low
molecular-weight compounds potentially released
from biopolymers by microbial activities through
the intermediate and deep-water layers results
quite similar to the corresponding flow released
in the productive layer.
2121
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Acknowledgements
This work was partially funded by the Institut
National des Sciences de l’Univers, (Programme
Flux Oce! aniques DYFAMED) and Total-Fina-Elf
(grant no. 11 997FCNRS/ENTREPRISE). C.T.
was supported by a fellowship co-funded by
INSU and Total-Fina-Elf. Authors greatly
appreciated specific information given by
J.-C. Marty, DYFAMED Program leader,
and by J. Chiave! rini. We are grateful to M.D.
Pizay to provide data on phosphate analyses. We
thank J.-P. Durbec, F. Van Wambeke, M. Goutx
and two anonymous reviewers for helpful comments on the manuscript, and Tracy Bentley for
improving the English language. Authors thank
the captains and crews of R.V. Tethys II for cruise
assistance.
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87
Données complémentaires
A partir des cinétiques concentrations réalisées pour les mesures des activités
aminopeptidasique (EAA) et phosphatidique (PA), on peut déduire les paramètres cinétiques
de Michaelis-Menten que sont la vitesse maximale de réaction du système enzymatique
(Vmax) et la constante d'affinité (K). K permet d'appréhender comment les consortiums
microbiens utilisent certains composés spécifiques dans la gamme des concentrations
naturelles de l'environnement étudié. La constante d'affinité ne peut-être déduite que si la
concentration
naturelle
en
substrat
est
connue.
La
technique
de
cinétique
multiconconcentrations fournit la constante de Michaelis (Km), Km=K+Sn, où Sn est la
concentration naturelle en substrat. Les composés modèles, que sont la MCA-Leu (pour EAA)
et la MUF-P (pour PA), ne sont pas des composés naturels et ne se trouvent donc pas dans
l'eau de mer. Ainsi, le Km calculé peut être considéré comme étant l'estimation maximale de
la constante d'affinité K (Wright & Hobbie, 1966).
Toutefois, peu de références rapportent des valeurs de Km dans la colonne d'eau de mer. Nous
avons trouvé dans la littérature moins d'une dizaine de références fournissant des estimations
de Km sur des échantillons d'eaux de surface, et aucune provenant d'échantillons d'eaux
profondes. Le Tableau III-2 reporte ces valeurs de Km, et les concentrations en substrats
relatives à la détermination des paramètres Michaelis-Menten, dans différentes zones marines.
La plupart des études ont été réalisées en utilisant des concentrations en substrat plus élevées
que les nôtres. Par exemple, pour déterminer les valeurs des Km des EAA dans les eaux
eutrophes de la Mer Baltique, Chrost & Velimirov (1991) ont réalisé des cinétiques
concentrations dans une gamme de 12,5 à 200 µM de MCA-Leu, alors que nous avons utilisé
des concentrations en MCA-Leu variant de 0,05 µM à 5 µM, en concordance avec les
gammes basses de concentrations de Unanue et al. (1999). Comme nous l'avons précisé dans
le manuscrit, ces faibles gammes de concentrations en substrat choisies par Unanue et al.
(1999) ainsi que par Ammerman & Glover (2000) sont en concordances avec les faibles
concentrations en substrat naturellement rencontrées dans les eaux de la Mer Ligure.
88
Tableau III-1. Synthèse des valeurs des Km provenant d'échantillons d'eau de mer reportées dans la littérature
pour les activités ectoenzymatiques aminopeptidase (EAA) et phosphatase (PA).
Région
Prof.
(m)
Activité
Concentration
en
substrat
(µM)
0,001-10
0,001-10
10-100
10-100
12,5-200
2,2
2,5
17,8
35,5
206
Unanue et al.
(1999)
Rath et al. (1993)
Km (µM) Référence
Mer Méditerranée NO 20-50
(côtier)
EAA
Mer Baltique
Surface
EAA
Mer des Caraïbes
Oligotrophe
Eutrophe
0.5
EAA
0,1-25
0,1-25
0,59
47,6
Golfe du Mexique
1-2
EAA
0,1-10
1-10
1-10
7,8-1000
Ammermam &
2,2
Glover (2000)
0,7
4,7
181 ± 13 Delmas & Garet
(1995)
48-218
Christian & Karl
(1998)
0,44-1,13 Cette étude
Ammermam &
0,3
Glover (2000)
0,2
0,2
0,05-1,23 Cette étude
Atlantique
Surface
Marais côtier
Péninsule Antarctique
EAA
Méditerranée NO
Golfe du Mexique
10-2000
1-2
EAA
PA
Méditerranée NO
10-2000
PA
n.d.-1000
0,05-5
0,01-10
0,01-10
0,1-10
0,05-5
Chrost and
Velimirov (1991)
La Figure III-1 présente les valeurs moyennes des Km des activités des PA et des EAA
estimées au printemps et en automne au profondeur 10-200, 200-1000 et 1000-2000 m. On
peut constater qu'en automne les valeurs des Km sont supérieures à celles du printemps
décrivant une plus grande affinité vis-à-vis du substrat au printemps par rapport à l'automne.
Cette remarque semble valable pour les deux activités considérées mais est exacerbée pour les
phosphatases.
89
a)
0
0,5
b)
Km (µM)
1
1,5
2
2,5
3
0
10-200
10-200
200-1000
200-1000
1000-2000
1000-2000
0,5
Km (µM)
1
1,5
2
2,5
Figure III-1. Valeurs moyennes (± écarts types) des constantes de demi-saturation (Km) des activités des
phosphatases (a) et des aminopeptidases (b) au printemps et en automne aux profondeurs 10-200, 200-1000
et 1000-2000 m sur le site DYFAMED.
Pour les phosphatases, le Km augmente avec la profondeur montrant que l'affinité des
enzymes impliquées dans l'hydrolyse des composés phosphatés diminue avec la profondeur.
Contrairement aux observations de Hoppe & Ullrich (1999) qui observent une augmentation
des Vmax de PA en profondeur, nous n'observons pas la même tendance. Toutefois, les
systèmes enzymatiques des phosphatases se comportent de manière particulière en
comparaison de ceux des aminopeptidases. La croissance et la maintenance des
microorganismes dans le domaine océanique profond dépendent principalement de l'apport en
carbone (déficient dans ce domaine) et non de l'apport en phosphate qui est en quantité
importante dans les zones profondes. Cette plus faible affinité des phosphatases en profondeur
pourrait être une adaptation des microflores profondes permettant de réaliser des réactions
enzymatiques moins spécifiques. Cette adaptation à un plus large spectre de composition de la
matière organique permettrait de récupérer le carbone nécessaire au fonctionnement de la
machinerie cellulaire.
90
3
ROLE OF DEEP-SEA BACTERIA IN ORGANIC MATTER
MINERALIZATION AND ADAPTATION TO HYDROSTATIC
PRESSURE CONDITIONS IN THE NW MEDITERRANEAN
SEA
Christian Tamburini,* Jean Garcin, Armand Bianchi
Laboratoire de Microbiologie Marine, CNRS - INSU, UMR 6117, Université de la Méditerranée, Centre
d’Océanologie de Marseille, Campus de Luminy, Case 907, 13288 Marseille CEDEX 09, France
*E-mail: [email protected]
Manuscript submitted to Aquatic Microbial Ecology
91
Préambule
Comme nous l'avons vu dans le manuscrit précédent (manuscrit n°3 – Tamburini et al., 2002),
l'étape qui limite le métabolisme bactérien est l'hydrolyse des macromolécules en plus petites
molécules directement assimilables par la cellule bactérienne. Cette deuxième étape
d'assimilation mais aussi d'intégration dans la cellule bactérienne de petits monomères aboutit
à la formation de gaz carbonique par respiration (CO2). Les bactéries hétérotrophes réalisent
donc deux principales fonctions dans la transformation de la matière organique. Une fraction
de la matière organique consommée est utilisée pour produire de la biomasse nouvelle
(production de biomasse bactérienne - BP), l'autre est utilisée à des fins énergétiques
produisant du carbone inorganique (respiration bactérienne - BR).
Le but de ce manuscrit est donc d'évaluer quelle est la vitesse potentielle d'utilisation de la
matière organique par les bactéries, en distinguant la part utilisée pour la production de CO2
de celle utilisée pour la production de biomasse, et donc de déterminer quel est le rendement
de croissance bactérienne. Toutefois les techniques classiquement utilisées pour mesurer le
rendement de croissance bactérienne ne peuvent être mises en œuvre en évitant le stress
provoqué par la décompression des échantillons. Nos travaux antérieurs, ayant mis en
évidence le biais introduit par ce stress dans les mesures d'activités métaboliques, nous
suggérons un protocole permettant une estimation du rendement bactérien sans
décompression des échantillons. Nous proposons donc d'utiliser un monomère marqué au
carbone 14 (14C-Glutamate) pour suivre son assimilation (GA) et sa respiration (GR) et
évaluer le rendement d'assimilation du glutamate (GYG=GA/(GA+GR)). Nous évaluerons
ainsi le rôle des microflores profondes dans la minéralisation de la matière organique et leur
adaptation aux conditions de pression hydrostatique en Mer Ligure (DYFAMED) lors de deux
périodes trophiques différentes : une période où le flux particulaire est important (printemps
2000) et une période où les apports en matériel organique particulaire sont très faibles
(automne 2000).
92
III.3.1 Abstract
Over spring and fall, ectoaminopeptidase activity (EAA), 14C-glutamic acid assimilation (GA)
and respiration (GR) rates were measured whilst maintaining in situ hydrostatic pressure
condition through a 2000-m water column in the NW Mediterranean. Depth-integrated EAA
was maximal in the deep-sea layer due to the lack of ready-to-use compounds. Conversely,
depth integrated fluxes for GA and GR in the bathypelagic zone, though far from negligible,
were much lower than in the photic layer, the exception being in the 1000-2000 m layer
during fall when respiration fluxes and particle fluxes were optimal. Metabolic rates obtained
from samples recovered and incubated under in situ pressure conditions were 4.53 ± 4.45
(mean ± SD; n = 19) times higher than their decompressed counterparts, proving that deep-sea
bacteria were adapted to high pressure.
14
C-glutamic acid uptake rates (GU=GA+GR)
measured under in situ pressure conditions were used to calculate the bacterial 14C-glutamic
acid assimilation yield (GYG = GA/GU). In decompressed samples this yield was always
lower by around 20 % than in those measured in in situ pressure conditions. Because
experiments currently used to estimate bacterial growth efficiency (BGE) are not done in in
situ pressure conditions, we hypothesize that pressure affects BGE in the same way that it
affects GYG. Thus, the stress caused by decompression induces an increase in energy cost,
and so underestimates BGE. Growth of deep-sea bacteria is highly dependent on the quantity
and quality of sinking particles reaching 1000 m. During mesotrophic conditions (spring),
high fluxes of relatively fresh particulate organic carbon generated relatively small depthintegrated EAA rates (20.6 mg C m-2 h-1) and high GYG (65 %). Meanwhile, during
oligotrophic conditions (fall), a minimal flux of old organic matter generated maximal depthintegrated EAA rates (62.2 mg C m-2 h-1) and lower GYG (12 %). From these observations
and from the literature, we explore the relationship between the nutritive sources available to
deep-sea bacteria, their role in the mineralization of peptide compounds and consequently the
implications for the global carbon cycle.
Key words: Deep-sea; bacteria; organic matter; mineralization; peptidase activity; BGE;
bacterial growth efficiency; Mediterranean Sea.
93
III.3.2 Introduction
Around 50 % of the organic carbon produced daily by photosynthetic organisms in the
euphotic zone is processed by bacteria and used to produce new bacterial biomass and satisfy
the energy requirements for bacterial respiration (Ducklow & Carlson 1992). Deeper in the
water column, bacteria consume between 40 and 100 % of the sinking fluxes of particulate
organic carbon (POC). This indicates that there is a tight coupling between sinking particles
and free-living bacteria in the mesopelagic (Cho & Azam 1988, Smith et al. 1992) and
bathypelagic layers (Nagata et al. 2000).
Bacterial activity rates measured in the deep-water layer of the ocean appear low relative to
those described in the surface layer. However, when the measured rates are integrated through
the depth of each water layer, the mineralization fluxes mediated by prokaryotic populations
at depths deeper than 200 m appear far from negligible (Lefèvre et al. 1996, del Giorgio et al.
1997, Bianchi et al. 1998, Tamburini et al. 2002).
Most of the organic compounds produced in natural waters have a polymeric structure. Such
high molecular weight (HMW) biopolymers must be transformed into low molecular weight
(LMW) compounds by ectoenzymatic processes. This is because only LMW compounds (<
600 Da) are able to enter into the cell (Nikaido & Vaara 1985, Chrost 1991, Chrost &
Velimirov 1991) to produce bacterial biomass and energy yielding reactions that ultimately
lead to carbon dioxide production. These ectoenzymatic activities are considered to be the
limiting step for the heterotrophic mineralization of organic matter (Chrost 1991).
The DYFAMED time-series station, which is devoid of horizontal advection currents
(Andersen & Prieur 2000), is an interesting zone for studying the mineralization fluxes
generated by the prokaryotic compartment through the water column from the sea surface
down to 2300 m. Moreover, this water column is relatively homoeothermic (13°C from the
subsurface to the bottom), enabling us to focus on the effects of increasing hydrostatic
pressure on microbial activity, independently from the effects of decreasing temperature,
which is usually encountered in deep-sea waters. It is now well accepted that high-pressure
conditions affect the metabolism of marine bacteria (ZoBell & Oppenheimer 1950, Deming et
al. 1980, Tabor et al. 1981, Jaenicke 1987, Straube et al. 1990, Turley & Lochte 1990,
Poremba 1994, Yayanos 1995). In previous studies, we demonstrated that changes in
hydrostatic pressure during sampling affect the uptake rate of low molecular weight
compounds by deep-sea bacteria (Bianchi & Garcin 1993, Bianchi & Garcin 1994, Tholosan
et al. 1999). More recently, we demonstrated that pressure conditions also affect bacterial
populations carrying out biopolymer hydrolysis in deep-sea waters (Tamburini et al. 2002).
94
In this study, we focus on the coupling between the rates of HMW biopolymer hydrolysis (via
aminopeptidase activity) and the uptake rates of LMW amino acids (resulting from the
hydrolysis process), through the water column (down to 2300 m) in the NW Mediterranean.
All the assays were concomitantly performed under in situ and atmospheric pressure
conditions. Thus, we are be able to examine the effects of high hydrostatic pressure on the
microbial transformation of single organic compounds by heterotrophic bacteria, into new
bacterial biomass and inorganic C. From the transformation of a single organic substrate we
discuss the effects of environmental conditions (depth, season, pressure conditions) on the
corresponding bacterial growth yield , and its consequent implications on the role of microbes
in nutrient cycling.
III.3.3 Materials and methods
III.3.3.1 Sampling area and sampling protocol
Sampling was carried out over two cruises (April and September, 2000) in the Northwestern
Mediterranean Sea, at the DYFAMED times-series station (Fig.1). This station is located 28
miles southeast of Nice (43°25' N, 07°52' E).
Fig.1. Location of the DYFAMED time-series station.
95
Sampling was carried out using a High Pressure Serial Sampler (HPSS – Bianchi et al. 1999),
which can be simultaneously fitted with conventional 12-l Niskin bottles and 500-ml pressure
retaining bottles (HPB). The labeled compound used to measure metabolic activity is injected,
before immersion, into the HPB through the injection port, so it is mixed into the sample
volume during filling (Fig. 2). During retrieval and subsequent incubation periods, pressure
conditions in each HPB were recorded continuously, via the deck unit of the CTD (Sea-Bird
911 plus). Incubations of HPB's were carried out in a temperature controlled water bath, so
that the samples were kept at the in situ temperature. In order to perform time-course
experiments, a series of sub-samples were successively collected without causing any
pressure loss into the culture vessels.
The daily sampling protocol was carried out as follow: during the same hydrocast, three
samples were collected using Niskin bottles (one in the surface layer (0-200 m), one in the
intermediate layer (200 - 800 m), and one in the deep-water layer (800-2000 m). Three
duplicates of HPB samples were collected between 800 and 2000 m. Each duplicate included
two HPBs concomitantly filled through the same filling valve, one being maintained at in situ
pressure meanwhile the second was decompressed during retrieval (Fig. 2). All bacterial
activity measurements were processed onboard the research vessel, immediately following
sample retrieval.
96
Fig.2. Diagrammatic representation of the high-pressure bottles (HPB) in configuration of
samples filling. The filling valve is set off by the scientist on board the ship. When the filling
valve is opened, the natural hydrostatic pressure pushes down the floating piston and the
seawater enters into the upper chamber of 2 HPBs. The distilled water is flushed out from the
lower chamber of the syringes to the exhaust tanks, through a nozzle that acts as an hydraulic
brake (Bianchi et al. 1999b). During retrieval, hydrostatic pressure is maintained thanks to a
check valve that avoided any decompression within the "high pressure" HPB, in contrast to
the "decompressed" HPB that were devoid of check valve.
III.3.3.2 Ectoenzymatic degradation of biopolymers.
The fluorogenic substrate L-leucine-7-amino-4-methylcoumarin (Leu-MCA – Sigma
Chemical Co.) was used to measure aminopeptidase activity (Hoppe 1993).
For each
sampling depth, determination of the maximum velocity (Vmax) was performed using 8 final
concentrations (0.05, 0.1, 0.25, 0.5, 1.0, 1.5, 2.5 and 5.0 µM), according to the multiconcentration kinetic method. Incubations were carried out in duplicate in the dark at in situ
temperature (13 ± 1°C). Enzyme assays were run in time-course experiments over 0, 2, 4, 6
and 12 hours and the increase in fluorescence was determined using a Kontron SFM 25
spectrofluorometer, (emission and excitation wavelengths of 455/365 nm). As we had not at
our disposal the 24 HPBs necessary to monitor concomitantly 8 final concentrations (each
97
concentration should need 3 HPBs: 2 for duplicates and 1 for boiled blank), these multiconcentration assays were realized using samples collected with a Niskin sampler. These
assays allowed to determine the saturation concentration for each sampling depth.
For the experimental assays done under ambient pressure conditions using the high-pressure
bottles, for each sampling depth substrate was added at the saturation concentration defined
during the multi-concentration experiments above mentioned. Leu-MCA was used as the
model substrate for proteins, so Vmax was expressed in µM C h-1, using a C per mole ratio of
4.2 (i.e. average C per mole ratio of amino acids) instead of the leucine ratio (6 C per mole
leucine) (Lamy et al. 1999).
III.3.3.3 Uptake of Low Molecular Weight Compounds
The most abundant amino acids in the marine DOM pool are glutamic acid, aspartic acid,
glycine, serine and alanine (McCarthy et al. 1996, Lee et al. 2000, Amon et al. 2001, Benner
2002). A solution of L-(U-14C)-glutamic acid, specific activity 254 mCi mmol-1 (Amersham
Corp.), was added to obtain a final concentration of 20 nM (samples collected between 0 and
200 m) or 10 nM (samples collected below 200 m) ensuring Vmax conditions. Sample
processing was as described for the ectoenzymatic measurements. At the end of each
incubation period, subsamples were fixed by the addition of buffered formalin (1 % final
concentration, v/v). Bacterial cells were collected by gentle vacuum filtration onto 0.2 µm
polycarbonate filters (Nuclepore®) pre-washed with unlabelled glutamate solution. Filters
were then washed twice with 5 ml of 0.2 µm filtered seawater. The filtrate was treated to
recover the 14CO2 released by acidification as described in Tamburini & Tedetti (submitted).
Labeled carbon on the filters and in the CO2-traps was counted using a Packard 1600 TR
liquid scintillation counter.
and
14
14
C-glutamate assimilation (GA),
14
C-glutamate respiration (GR)
C-glutamate utilization (GU = sum of assimilated and respired label) rates were
computed from these time series data. Samples were corrected for blanks, as the time zero
was included in the regression.
III.3.4 Results
III.3.4.1 Hydrological conditions and depth profile of glutamic acid uptake
In the DYFAMED area, Béthoux et al. (1988) describe: the surface water (down to 200 m) as
having a seasonally variable temperature; the intermediate water which is of Levantine origin
(LIW) as having high salinity levels (S>38.45), high nutrient concentrations, and minimal
98
oxygen concentrations (at depths of 300-400 m); and the deep water, which is colder and less
saline than the LIW. This water mass, the Western Deep Mediterranean Water (WDMW),
characterized by stable temperature (12.70°C) and salinity (38.40) throughout the year, is
formed via deep convection in the Gulf of Lions. In surficial waters, production varies with
the seasonal hydrological regime, from mesotrophy in spring to oligotrophy in fall (Marty et
al. 2002).
Figure 3 shows that the maximal rates for
14
C-glutamic acid assimilation and respiration
appeared in the subsurface layer irrespective of sampling season. In spring, the Vmax for 14Cglutamic acid assimilation (Fig. 3a) was 2580 pg C l-1 h-1 at 10 m, it decreased one order of
magnitude at 200 m, and was around 24 pg C l-1 h-1 down to 800 m. Respiration rates always
surpassed assimilation rates (Fig. 3b). In fall and in spring, the general trend for the depth
profiles was quite similar, but in the intermediate and deep-waters CO2 production was
greatly enhanced in fall.
(a) Glutamic acid assimilation (pg C l-1 h-1)
0
1000
2000
3000
4000
5000
100
200
300
400
500
0
Depth (m)
200
(b) Glutamic acid respiration (pg C02 l-1 h-1)
0
1000
2000
3000
4000
5000
100
200
300
400
500
0
200
400
400
600
600
800
800
1000
1000
1200
1200
1400
1400
1600
1600
1800
1800
2000
2000
Fig.3. Depth profiles for potential glutamic acid assimilation (a) and glutamic acid respiration
(b) through the water column in spring and fall periods.
spring;
fall. Note different
scales for surface waters and deeper layers
99
III.3.4.2 Pressure effect
Table 1 shows that all the metabolic rates were always higher when measured under ambient
pressure conditions (VHP) than in their decompressed counterpart (VDEC), in spring as well as
in fall. The pressure effect (Pe = VHP/VDEC) appears highly variable. From the whole Pe data
set (Table 1 ), the average value equals to 4.5 ± 4.4 (mean ± SE, n = 19). Moreover, Pe is
different for the assimilation and the respiration processes. For example, in spring, for the
glutamic acid assimilation, Pe is equal to 1.5 and 4.8 at 1000 and 2000 m depth, respectively;
meanwhile for the corresponding respiration processes, Pe is equal to 1.8 and 1.9.
Table 1. The ratio of undecompressed (VHP) to decompressed (VDEC) rate measurements for
aminopeptidase, bacterial production, glutamic acid assimilation, glutamic acid respiration
and glutamic acid uptake rates.
Depth
(m)
spring
fall
Aminopeptidase
1000
Glutamic acid
Glutamic acid
Glutamic acid
assimilation
respiration
uptake
1.5
1.8
1.3
2000
1.5
4.8
1.9
2.9
1000
2.8
2.4
1.2
1.3
1500
15.4
12.7
13.4
2000
4.3
7.0
5.2
1.8
n.d.
n.d.
2000
2.8
III.3.4.3 Depth integrated aminopeptidase activity and glutamic acid uptake
Fluxes of peptides potentially released from aminopeptidase activities (Fig.4a) were
calculated from maximum velocity rates (Vmax) according to the multi-concentration kinetic
method. For example in the upper water layer (10-200 m), in spring, potential aminopeptidase
activity was highest at 13.7 mg C m-2 h-1. We observed that depth-integrated aminopeptidase
activity was higher in the deep-water layer than in the shallow water layer (Fig.4a).
Conversely, depth integrated fluxes for glutamic acid assimilation and respiration were
maximal in the photic layer, with exception of the respiration flux, which was optimal in the
1000-2000 m layer in fall (Fig.4b). Finally, depth integrated fluxes calculated from rates
measured under in situ pressure condition were always higher than those measured by using
decompressed samples (Fig.4).
100
a) Aminopeptidase Vmax (mg C m-2 h-1)
0
20
40
60
80
100
120
10-200 m
200-1000 m
1000-2000 m
b) Glutamic acid assimilation (µg C m-2 h-1)
0
50
100
150
200
c) Glutamic acid repiration (µg C m-2 h-1)
0
10-200 m
10-200 m
200-1000 m
200-1000 m
1000-2000 m
1000-2000 m
100
200
300
400
Fig.4. Integrated aminopeptidase activity (a – EAA), glutamic acid assimilation (b – GA), and
glutamic acid respiration (c – GR) through different water layers at the DYFAMED timeseries station: trapezoidal integration of measured rates through the upper layer (10-200 m),
through the mesopelagic layer (200-1000 m) and through the bathypelagic layer (1000-2000
and in fall . Between
m). Calculations were performed on samples collected in spring
1000 and 2000m depth, the first part of the bar correspond to fluxes measured under
atmospheric pressure. The entire bar correspond to fluxes measured under ambient pressure
condition.
III.3.5 Discussion
III.3.5.1 Bacterial growth efficiency
Bacterial growth efficiency (BGE) is a key parameter in studying C cycling in the ocean.
BGE is the quantity of new bacterial biomass produced per unit of organic C substrate
assimilated. It is a way to relate bacterial production (BP) and bacterial respiration (BR): BGE
= (BP)/(BP+BR) (del Giorgio & Cole 1998). Two main approaches are presently used to
101
measure BGE: (1) Concomitant measurements of BP and BR, generally measured as O2
consumption or CO2 production. (2) Dilution culture in which a filter-sterilized water sample
is re-inoculated with a small aliquot of its native bacterial assemblage, and then incubated in
batch conditions for several days or weeks. Long-term incubation periods are required to
measure significant changes in dissolved organic carbon (DOC), oxygen (O2), dissolved
inorganic carbon (DIC) and particulate organic carbon (POC) concentrations in surficial water
samples (see review by del Giorgio & Cole 1998). Unfortunately, technological difficulties
make it impossible to apply these methods to deep-sea water samples. This is because: (1) In
deep-sea waters, metabolic rates are slower by almost one order of magnitude (Bianchi et al.
1998, Tamburini et al. 2002) relative to those in the productive surficial layer. Hence, to get
significant changes in DOC, O2, DIC, or POC concentrations, deep-sea samples would have
to be incubated for several months. During long incubation periods, wall effects could
provoke changes in the microbial densities and metabolic activities. (2) Since pressure
conditions affect the metabolic rates of deep-sea bacterial communities (Tholosan et al. 1999,
Tamburini et al. 2002), BGE assays should be made maintaining the in situ pressure
conditions. Unfortunately, if we are able to measure bacterial biomass production maintaining
hydrostatic pressure conditions, we cannot, presently, measure O2 consumption (or CO2
production) in time-series experiments under high-pressure conditions. (3) The dilution
culture approach implies that bacteria must be separated from other planktonic components by
filtration. Filtration, and further sample processing, should raise serious technical difficulties
to be done without decompression.
To be pragmatic, we have chosen to use 14C-glutamic acid as an example of ready-to-use low
molecular weight compounds. This will enable us to measure the proportion of metabolized
carbon which is incorporated into the bacterial biomass and the proportion used as an energy
yielding source. Biases due to the utilization of a single radiolabeled substrate are well
known. Intracellular isotope dilution and non-steady-state conditions result in a high
incorporation of radiolabeled compounds into the bacterial biomass (King & Berman 1984),
leads to underestimating CO2 production and overestimating BGE. Moreover, in natural
conditions bacteria simultaneously use a large diversity of organic substrates, so extrapolation
from a single model compound may lead to significant overestimation of the actual BGE (del
Giorgio & Cole 1998). Growth efficiency depends on the nature of the organic compounds
added as the labeled substrate: for example, amino acids are usually incorporated more
efficiently in the cell biomass than sugars (Joint & Morris 1982).
102
In spite of problems, we can directly obtain (i.e. without resorting to the use of conversion
factors) the organic carbon quantity used by bacteria for energy yielding reactions and for cell
anabolism. Data shown in Fig.4b and Fig.4c enable us to calculate the
14
C-glutamic acid
assimilation yield (GYG = GA/GU). In spring, GYG was higher in the bathypelagic layer (52
%) than in the mesopelagic (36 %) and the euphotic layers (45 %). This enhancement of the
growth yield in the deep-sea waters in spring may be associated with an exceptional supply of
organic particles at depth in the DYFAMED area during this period (308 mg C m-2 d-1
measured in the sediment trap at 1000m, Miquel pers. comm.). Rapidly sinking detritus
provides fresh organic material to the deep-sea waters. During this period, the deep-sea
bacteria are fuelled by labile compounds, and so limit their energy expenses. In contrast, in
fall, POC fluxes are much lower, and surprisingly the particle flux at 1000 m (17.5 mg C m-2
d-1) is higher than at 200 m (5.3 mg C m-2 d-1; Miquel pers. comm.). This could be due to a
decoupling between primary production in surficial waters and the particle fluxes reaching
depth. Greater fluxes in deep-sea than in shallow waters might correspond to the arrival at
depth of slowly sinking particles. A longer sinking period implies that the most labile fraction
of this material has been exhausted by heterotrophic bacteria during its transit through the
superficial and intermediate water layers. So, in the deep-water layer, to synthesize the
ectoenzymes needed to hydrolyze the less labile residual compounds, bacteria should have to
spend more energy than usual. This behavior is translated into higher CO2 production
(Fig.4c). In the meantime, bacteria produce little biomass, which implies low BGE. This
assumption is supported by the GYG values we found. In fall, GYG was equal to 58 % in the
upper layer and then decreased down to 13 % between 200 and 1000 m, to be only 9 % in the
1000 – 2000 m layer.
Data obtained using the High Pressure Serial Sampler enabled us to compare GYG obtained
from assays performed under in situ pressure conditions to their counterpart concomitantly
obtained from decompressed samples. This comparison provides an estimate of the adaptation
of bacteria to deep-sea conditions. In spring, as well as in fall, GYG was 20 % lower from
decompressed samples than from assays performed under in situ pressure condition. Indeed,
these results confirm that decompression of deep-sea water samples provokes physiological
stress in deep-sea bacteria. This stress induces an increase of energy yielding processes, and
so, assuming the effects of pressure would be identical on BGE and GYG, decompression of
deep-sea samples would provoke an underestimation of BGE. Such behavior differs from that
observed by Turley & Lochte (1990) during their assays to monitor the effect of hydrostatic
pressure on BGE on near bottom water samples decompressed during retrieval and then
103
recompressed on board the research vessel. Samples recompressed at 45 MPa showed higher
mineralization rates and lower BGE than those incubated under atmospheric pressure
condition. This difference in pressure effect on BGE could be due either to the double
pressure shock suffered by bacteria during decompression–recompression experiments, or to a
physiological discrepancy between the bathypelagic bacterial populations we studied and the
benthic populations studied by Turley & Lochte (1990).
III.3.5.2 Energy source and microbial mineralization in deep-sea waters
Quantification of the contribution of heterotrophic bacteria in the carbon cycle in deep-sea
waters is poorly documented. In deep-sea waters, microbial activity is not limited by N and P
concentrations which is not usual in the productive surface layer, so limitation is more likely
to be due to the poor availability of organic carbon. In the deep-sea, organic material is
mainly in the dissolved form, and the molecular size of DOM decreases with increasing depth
(Benner et al. 1992, Ogawa & Ogura 1992, Fig.5). Yet, only LMW compounds (<600 Da) can
enter directly through the cell membrane of bacteria (Nikaido & Vaara 1985). The LMW
compounds that accumulate in deep waters are the leftovers of previous bacterial attacks on
the organic material produced in the upper part of the water column. These LMW residues of
uncharacterized nature form the least reactive fraction of DOM (r-LMW in Fig.5). Amon &
Benner (1996) proposed the size-reactivity continuum model providing a framework to
interpret the diagenetic alterations leading to such material. This conceptual model links the
physical size of organic matter to its diagenetic state, suggesting a decrease in size with
increasing diagenesis and chemical alteration. Hence, stability of the DOM concentration
measured in deep-sea waters (Cauwet et al. 1997, Avril 2002, Benner 2002, Sempéré et al.
2002) might reflect its status as a residual fraction difficult to utilize. Consequently, deep-sea
bacteria do not find their main nutrient source in the r-LMW DOM, but in the particulate
material sinking through the water column (see Fig.5). Therefore, deep-sea microbial growth
may be highly dependent on the quantity and quality of the sinking particles. Indeed, in spring
we observed that high fluxes of relatively fresh POC produced high GYG (65 %) and a low
104
Fig.5. Participation of microorganisms in the mineralization processes. This interpretation
compares the sources of organic matter available for bacteria in the euphotic layer and in the
mesopelagic and bathypelagic layers. It relies on the relationship with the size-reactivity
continuum model for organic matter decomposition in deep-sea waters (Amon and Benner
1996), and integrates the concept of microbial activity enhancement in the plume following
the fall of an organic particle through the water column. The plume is formed by enzymatic
dissolution of colonizing bacteria (Kiørboe & Jackson 2001). The marine snow and the plume
may become the focus of a complex food web (Azam & Long 2001). HMW DOC: high
molecular weight dissolved organic carbon; l-LMW DOC: labile low molecular weight DOC;
r-LMW DOC: refractory-LMW DOC; B-Bacteria: bacteria adapted to high hydrostatic
pressure; b-Bacteria: bacteria un-adapted to high hydrostatic pressure condition.
105
depth-integrated potential EAA (2305 µg C m-2 h-1). Meanwhile in fall a low flux of relatively
old organic matter lead to higher potential depth-integrated EAA (62163 µg C m-2 h-1) and
lower GYG (12 %). Such activities make accessible to deep-sea bacteria the semi-labile
fraction that escaped microbial degradation during its descent through the water column.
During mesotrophic conditions (i.e. in spring), we observed a tight coupling between the flow
of sinking particles and bacterial metabolism. Indeed, sinking particles show a loss of carbon
between 200 and 1000 m of 200 mg C m-2 d-1 (sediment trap gave 528 mg m-2 d-1 at 200 m,
and 308 mg m-2 d-1 at 1000 m). During the same period, assuming a growth yield of 10 %, and
a bacterial biomass production of 14 mg C m-2 d-1 (calculated from Tamburini et al. 2002)
bacterial carbon demand is equal to 137 mg C m-2 d-1 and aminopeptidase activities release
169 mg C m-2 d-1 (Fig.4). In contrast, during oligotrophic conditions (i.e. in fall), the particle
flux is very low showing a decoupling between the trap at 200 m depth and that at 1000 m
(5.3 and 17.5 mg C m-2 d-1, respectively, Miquel pers. comm.). Such a decoupling implies that
bacteria must find carbon and energy from another source than the POM. In this case, deepsea bacteria over-express their ectoenzymatic system, which is costly in energy, to extract
from the bulk DOM carbon and energy sources necessary for their metabolism.
From these observations and those cited in the literature, we can discuss the relationships
between the nutritive sources available for deep-sea bacteria, the role of these organisms in
the mineralization of peptide compounds, and consequently their implication for the global
carbon cycle. During their descent to the bottom, particles release DOC by abiotic processes
(Karl et al. 1988) and by enzymatic hydrolysis of biopolymers processed by the attached
bacteria (Cho & Azam 1988, Kiørboe & Jackson 2001). The released monomers fuel the
production of free-living bacteria biomass in the mesopelagic zone (Cho & Azam 1988, Smith
et al. 1992). This POC → DOC → bacteria link goes on within the bathypelagic environment
(Nagata et al. 2000, Tanaka & Rassoulzadegan 2002, this study in spring). The response of
bacteria to the DOM streaming behind sinking particles of marine snow may have a major
influence on the oceanic carbon cycle (Azam & Long 2001, Kiørboe & Jackson 2001).
Kiørboe & Jackson (2001) model the formation of this plume. They predict that free-living
bacteria can take advantage of the plume and use it to fuel a population explosion. Despite
occupying only a small fraction of the ocean's volume, the plumes may provide important
growth habitats for free living bacteria and account for a significant proportion of bacterial
production throughout the mesopelagic and bathypelagic water masses (Fig.5). Some of our
preliminary assays to simulate the descent of diatoms through the water column demonstrated
that enzymatic hydrolysis rates performed by attached bacteria were affected by increasing
106
pressure as and when particles descent (Tamburini 2002). This behavior shows the importance
of maintaining in situ conditions for free-living bacteria, and for those attached to sinking
particles that constitute the main source of organic inputs to the deep-sea, when evaluating the
role of deep-sea bacteria in the mineralization of organic matter.
Acknowledgements. This work was partially funded by the Institut National des Sciences de
l'Univers, (Programme Flux Océaniques DYFAMED) and Total-Fina-Elf (grant n° 11 997 –
CNRS/ENTREPRISE). C.T. was supported by a fellowship co-funded by INSU and TotalFina-Elf. Authors sincerely appreciated the critical comments on the draft provided by F. Van
Wambeke and D. Kirchman, the improving of English language performed by T. Bentley, and
are grateful to J.C. Miquel to provide data on POC flow. We thank captains and crews of RV
"Tethys II" for cruise assistance.
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Données complémentaires
Les mesures du rendement de croissance bactérienne constituent un challenge pour l'écologie
microbienne (revue de del Giorgio, 1998). Les études consacrées à l'assimilation et la
respiration d'une molécule
14
C dans le but d'évaluer le rendement de croissance bactérienne
(BGE) ont été abandonnées au profit des techniques moins spécifiques, évaluant soit la
respiration de la communauté bactérienne, soit la diminution du pool de DOC dans des
expériences de biodégradation, en même temps que la production bactérienne (del Giorgio,
1998). Comme nous l'avons vu précédemment, la BGE ne peut être évaluée de cette manière
dans les eaux de mer profondes, et del Giorgio (1998) signale qu'une seule tentative
d'évaluation de la BGE dans le domaine profond approchant le comportement de ce paramètre
vis-à-vis de la forte pression hydrostatique a été réalisée par Turley & Lochte (1990), sur des
échantillons d'eaux proches du fond décomprimés puis recomprimés.
De plus, le modèle proposé par del Giorgio (1998), qui permet d'évaluer la BGE à partir de la
production bactérienne (Equation III-1), ne peut être utilisé pour notre étude :
BGE=
0,037+0,65BP
1,8+BP
Equation (1)
En effet, la BGE évaluée grâce à l'équation (1) est d'environ 2,1 % au travers de la colonne
d'eau sauf à 10 m de profondeur (BGE = 2,6 %). Ceci est dû à la limite du modèle qui n'est
pas applicable dans des eaux oligotrophes où la production de biomasse bactérienne est très
faible (del Giorgio, 1998).
Il paraissait donc indispensable de pouvoir évaluer le rendement de croissance bactérienne
dans le domaine pélagique profond en tenant compte des conditions de pression ambiantes
qui, on l'a vu, influencent les activités métaboliques des populations bactériennes.
La technologie hyperbare disponible nous permet de mesurer les vitesses potentielles
d'incorporation et de respiration d'un composé
14
C en respectant les conditions de pression
ambiantes pour chaque échantillon. Cette méthode est certes restrictive, car basée sur
l'utilisation d'un composé organique simple, ici le
14
C-glutamate, mais dans les conditions
actuelles, c'est la seule qui puisse nous permette de prouver que le rendement d'utilisation de
la matière organique est affecté par la pression hydrostatique. Les résultats obtenus montrent
que toutes les mesures d'activités microbiennes sont affectées par la décompression des
échantillons qui entraîne généralement une sous-évaluation du rôle réel des microflores
profondes dans le cycle du carbone.
111
III.4 Synthèse des données obtenues dans la colonne d'eau du
site DYFAMED
III.4.1 Variations à court terme des vitesses métaboliques en profondeur
Le Tableau III-2 présente les variations des vitesses potentielles d'utilisation du glucose
(Glucose), de production bactérienne (BP) et de l'activité phosphatidique (PA) mesurées à
quelques jours d'intervalle à la fois sur des échantillons décomprimés (DEC) et sur des
échantillons maintenus à pression in situ (HP). Ces variations à court terme peuvent atteindre
jusqu'à un ordre de grandeur à 24 heures d'intervalle (Tholosan et al., 1999).
Tableau III-2. Variations à court terme des vitesses potentielles d'utilisation du glucose (Glucose), de production
bactérienne (BP) et de l'activité phosphatidique (PA) mesurées sur des échantillons décomprimés (DEC) et
maintenus à pression in situ (HP). Les échantillons ont été collectés à quelques jours d'intervalle aux profondeurs
1000, 1500 et 2000 m sur le site DYFAMED.
Activité
Profondeur
Glucose
pM C h-1 ± e.t
1000 m
Glucose
pM C h-1 ± e.t
1500 m
09/10/94 4,80 ± 0,60
12/09/94 18,90 ± 0,30
Variation
+294 %
2000 m
08/10/94 3,40 ± 0,50 6,60 ± 0,60
Tholosan et al.
11/09/94 37,30 ± 4,30 37,90 ± 4,50
(1999)
Variation
1000 %
+474 %
BP
-1 -1
ng C l h ± e.t.
2000 m
04/09/00 0,21 ± 0,11
05/09/00 0,13 ± 0,14
Variation
-38 %
PA
(pM MUF h-1) ± e.t.
2000 m
02/04/00
04/04/00
Variation
Glucose
pM C h-1 ± e.t
Date
DEC
HP
Référence
10/10/94 53,30 ± 8,70 63,20 ± 2,70
Tholosan et al.
13/10/94 16,0 ± 2,0 15,90 ± 4,50
(1999)
Variation
-70 %
-75 %
168 ± 70
335 ± 40
+99 %
8,4 ± 0,5
33,6 ± 2,1
300 %
Tholosan et al.
(1999)
0,47 ± 0,11
Tamburini et al.
2,06 ± 0,06
(2002)
-338 %
443 ± 199
468 ± 203
+6 %
Tamburini et al.
(2002)
Si de telles variations à court terme sont rares, elles sont plus classiquement observées dans
les eaux oligotrophes où la distribution des nutriments n'est pas uniforme (Azam &
Ammerman, 1983), une particule en cours de chute provoquant dans son sillage la formation
d'une plume riche en éléments nutritifs (Azam & Long, 2001; Kiørboe & Jackson, 2001).
L'évolution des activités microbiennes est gouvernée à la fois par des processus dynamiques
rapides et des processus lents (Karl & Knauer, 1984), non seulement dans la zone productive
112
de surface mais aussi dans la zone bathypélagique. Il semble donc nécessaire d'augmenter la
fréquence d'échantillonnage dans le domaine océanique profond comme le suggérait déjà
Ducklow (1983), Lefèvre et al. (1996), Bianchi et al. (1998) et Tholosan et al. (1998).
III.4.2 Biomasse bactérienne et temps de renouvellement des cellules
bactériennes
La biomasse bactérienne (BB) intégrée pour différentes masses d'eau (10-200, 200-1000 et
1000-2000 m) est reportée dans le Tableau III-3. La BB intégrée dans la couche d'eaux
profondes est plus faible que celle des eaux de surface, variant entre 1,31 et 2,00 g C m-2 au
printemps et en automne, respectivement. La plus faible valeur de BB est trouvée dans la zone
mésopélagique (200-1000 m) avec des valeurs de 0,92 et 0,75 g C m-2 au printemps et en
automne respectivement. Exceptée entre 200 et 1000 m, la biomasse bactérienne est toujours
supérieure en automne qu'au printemps ce qui apparaît en contraste avec la production de
biomasse bactérienne (BP) toujours supérieure au printemps qu'en automne, sauf dans la zone
bathypélagique (Tableau III-3).
Tableau III-3. Biomasse bactérienne (BB) et production bactérienne (BP) intégrées au travers des masses d'eau
de surface (10-200 m), mésopélagique (200-1000 m) et bathypélagique (1000-2000 m) et le temps de
renouvellement bactérien (Tt pour "turnover time"; biomasse/production) au printemps et à l'automne. DEC :
échantillon décomprimé; HP : échantillon maintenu à la pression hydrostatique.
Masse d'eau
(m)
10-200
200-1000
1000-2000 DEC
1000-2000 HP
Biomasse
Production bactérienne
Tt
bactérienne
-2
-2 -1
(g C m )
(mg C m h )
(d)
printemps automne printemps
automne
printemps automne
2,09
2,38
2,39
1,27
36
78
0,92
0,75
0,57
0,22
67
145
1,31
2,00
0,37
0,47
148
179
0,65
(2,76) 0,96*
85
(30) 87*
La valeur entre parenthèses correspond à la valeur de production bactérienne mesurée le 05/09/00 (Pe de 15,4)
tandis que la valeur donnée sans parenthèses correspond à la production bactérienne mesurée en décomprimant
l'échantillon multipliée par la moyenne des Pe (=2,4) obtenues lors de la campagne d'automne.
Pour évaluer la dynamique bactérienne sur une échelle de temps, nous avons divisé la BB par
la BP. Ce calcul fournit le temps de renouvellement bactérien maximum (Tt pour "turnover
time") des cellules actives en cours de division car plusieurs approximations sont réalisées :
(1) le dénombrement total des cellules bactériennes comprend les cellules mortes
("fantomes"), en état de dormance, inactives et plus ou moins actives (Zweiffel & Hagström,
1995). (2) la biomasse bactérienne a été calculée le long de la colonne d'eau en utilisant un
seul facteur (15 fg C bactérie-1, cf. paragraphe II.3.4) estimé pour des assemblages bactériens
d'eau de mer de surface (Caron et al., 1995). (3) la production bactérienne a également été
113
calculée en utilisant un seul facteur de conversion pour transformer les picomoles de leucine
tritiée assimilée en ng de carbone de biomasse bactérienne produite (Simon & Azam, 1989)
pour tous les échantillons de la colonne d'eau. Toutefois, ce calcul nous permet de comparer
le temps de renouvellement maximum de la biomasse bactérienne (Tt) entre les différentes
masses d'eau et les saisons. Pour chacune des couches considérées, le Tt apparaît supérieur en
automne par rapport au printemps et il augmente avec la profondeur (Tableau III-3) : le Tt
calculé apparaît 2,1, 2,2 et 1,2 fois plus long en automne qu'au printemps entre 10-200, 2001000 et 1000-2000 m de profondeur respectivement. Ceci semble confirmer la variation
saisonnière observée, et montre que la biomasse bactérienne est étroitement couplée au flux
particulaire puisque c'est au printemps que le flux particulaire est très marqué (Miquel
comm.pers.).
Pour les eaux profondes, les estimations des Tt de 148 jours (pour les échantillons
décomprimés - DEC) ou de 85 jours (pour des échantillons maintenus à pression ambiante HP) au printemps et de 179 jours (DEC) ou de 87 jours (HP) en automne, apparaissent plus
faibles que celles citées dans la littérature. Nagata et al. (1998) donnent des valeurs de Tt
variant entre 949 et 6022 jours dans l'Océan Subarctique. Toutefois, il semble peu probable
que de telles valeurs soient réellement représentatives de la croissance des microflores
profondes : des populations dotées d'un temps de renouvellement aussi long ne pourraient se
maintenir dans leur environnement où les protozoaires, adaptés à la forte pression
hydrostatique du domaine profond, exercent une pression de broutage permanente (Turley et
al., 1988; Tanaka & Rassoulzadegan, 2002). Puisqu'un tel réseau microbien semble perdurer
tout au long de l'année (Tanaka & Rassoulzadegan, 2002), les temps de renouvellement de la
biomasse bactérienne de l'ordre de 80 jours semblent plus réalistes.
III.4.3 Comportement des microflores profondes en fonction du matériel
organique disponible
Pour expliquer les faibles valeurs de BGE trouvées dans les environnements oligotrophes del
Giorgio (1998) suggère que la croissance des cellules bactériennes est co-limitée par l'apport
en carbone, en nutriments minéraux et en énergie. Pour le domaine profond du site
DYFAMED, l'estimation du GYG, concomitante avec la mesure de l'activité aminopeptidique,
nous permet de proposer un scénario similaire. La communauté bactérienne du domaine
océanique profond est dépendante de l'exportation en carbone et en énergie à partir de la
production de surface, la concentration en nutriments (N, P..) ne constituant pas un facteur
limitant dans le domaine océanique profond. Le rendement d'utilisation du
114
14
C-glutamate
(GYG), comme la BGE (del Giorgio, 1998), diminuent selon les conditions trophiques et le
long de la colonne d'eau. La production d'ectoenzymes provoque une dépense énergétique, ce
qui provoque une baisse du GYG. Lorsque le flux de carbone organique particulaire (POC) est
important (au printemps) les bactéries du domaine océanique profond synthétisent moins
d'ectoenzymes et produisent plus de biomasse. Au printemps, entre 1000 et 2000 m, la
respiration du glutamate est d'environ 35 % du carbone utilisé. Potentiellement, l'activité
aminopeptidique (EAA) pourrait fournir à elle seule le carbone organique (490 mg C m-2 d-1)
nécessaire à la croissance bactérienne. Dans ce cas, la croissance bactérienne, en zone
bathypélagique, est étroitement couplée au flux de POC (528 à 100 m et 308 mg C m-2 d-1 à
1000 m, Miquel comm. pers.) comme le suggéraient Nagata et al. (2000) et Tanaka &
Rassoulzadegan (2002).
Par contre, lorsque le flux particulaire est quasi nul (en automne, POC = 5,3 à 100 m et 17,5
mg C m-2 d-1 à 1000 m, Miquel comm. pers.), pour compenser le déficit en carbone, les
activités ectoenzymatiques (aminopeptidase et phosphatase) sont exacerbées, ce qui provoque
une dépense énergétique considérable (respiration du
14
C-glutamate entre 1000 et 2000 m ≈
90 %) et par conséquent un GYG de seulement 10 %. Dans ce cas, nous suggérons que le
métabolisme des microflores profondes est basé sur la matière organique dite "réfractaire".
Pour survivre, les microorganismes doivent adopter une stratégie où les ectoenzymes, moins
spécifiques vis-à-vis de leur substrat, minéralisent le DOC dit "réfractaire".
On peut supposer que le domaine océanique profond est composé de deux types de
populations microbiennes, ou que deux types de populations se succèdent dans le temps en
fonction des apports en matière organique. L'une opportuniste, qui adopte une stratégie-r
c'est-à-dire capable d'utiliser immédiatement, et donc, de croître rapidement, lorsque de la
matière organique facilement utilisable est disponible. L'autre, qualifiée de population
équilibrée, adopte une stratégie-k c'est-à-dire capable d'utiliser la matière organique dissoute
de faible poids moléculaire (LMW DOM) moins bioréactive. Cette distribution de populations
réagissant selon deux stratégies vis-à-vis de la qualité de la matière organique a déjà été mise
en évidence dans un lac eutrophe par Weinbauer & Höfle (1998).
115
116
MICROBIAL LIFE IN THE DEEP ANOXIC HYPERSALINE
BASINS OF THE EASTERN MEDITERRANEAN
Christian Tamburini∗, Jean Garcin & Armand Bianchi
MS submitted in Applied and Environmental Microbiology in September 2002
Laboratoire de Microbiologie Marine, UMR 6117 CNRS – INSU Université de la Méditerranée,
Centre d'Océanologie de Marseille, Campus de Luminy, case 907, F-13288 Marseille, cedex 9, France.
∗
To whom correspondence should be addressed to C.T. (e-mail: [email protected])
117
Préambule
L'aire d'investigation de la campagne BioDeep (BIOtechnology from the DEEP) se situe en
Mer Ionienne et focalise principalement sur l'étude biologique de bassins hypersalés,
anoxiques et profonds (DHAB, bassins de l'Urania, L'Atalante, de Discovery et de Bannock).
Dans les années 80, les recherches sur ces DHAB étaient dévolues à l'échantillonnage,
l'analyse et la description des paramètres physico-chimiques (De Lange & Ten Haven, 1983;
De Lange et al., 1990; Henneke & De Lange, 1990). L'aspect biologique n'avait été abordé
jusque là que dans les sédiments (Coolen & Overmann, 2000; Sass et al., 2001). Seules des
hypothèses étaient alors avancées quant à une activité bactérienne possible dans ces
environnements offrant des conditions extrêmes pour la vie.
Notre rôle dans ce programme européen était d'apporter la preuve ou non d'une activité
microbienne, d'essayer de l'évaluer et de démontrer ou non l'adaptation de ces
microorganismes à des conditions extrêmes pour la vie (forte pression >35 MPa, hypersalinité
[S>300], anoxie). Des mesures d'activités ont donc été réalisées en maintenant les conditions
in situ à l'aide de l'HP-5L montée sur un carrousel spécifiquement conçu pour aller prélever
dans les saumures (cf chapitre II). La preuve de la présence d'une activité microbienne et de
leur adaptation à des conditions extrêmes permettrait d'ouvrir et d'encourager les recherches
en biotechnologies pour isoler de nouvelles souches et/ou fonctions microbiennes.
Afin de pouvoir évaluer les activités microbiennes que nous allions mesurer dans ces DHAB,
il convenait d'effectuer des mesures d'activités dans l'eau de mer "oxique" directement située
au-dessus. Cette campagne nous a ainsi permis d'effectuer des mesures d'activités
(aminopeptidase, phosphatase, utilisation du 14C-glutamate et production bactérienne) le long
de la colonne d'eau en Mer Ionienne jusqu'à 3000 m de profondeur, profondeur que nous
n'avions jamais échantillonné avec l'HPSS.
118
III.5.1 Abstract
In the eastern Mediterranean Sea, deep hypersaline anoxic basins (DHABs) are characterised
by hypersalinity (between 160 and 300), high hydrostatic pressure (~35 MPa) and anoxic
conditions. In 4 of these basins we determined the maximum velocity (Vmax) for
ectoaminopeptidase and phosphatase activities, bacterial biomass production and 14C-glutamic
acid assimilation and respiration rates. At the oxic seawater – brine interface, the hydrolysis
rates of biopolymers were clearly higher than in the immediately overlaying oxic water.
Vmax ranged from 0.23 to 2.96 and from 0.92 to 2.91 nmol hydrolyzed l-1 h-1 for
aminopeptidase and phosphatase activities, respectively. Conversely, metabolic rates based on
the utilization of labile compounds were slower than those observed in the oxic seawater.
Within the brines, all microbial activities, although generally lower than in the interface layer,
were unambiguously detected in all samples. To define the physiological status of the
organisms responsible of these processes, we used equipment that enabled us to measure
metabolic rates in samples kept in the physical and chemical conditions of the DAHBs. These
assays showed that metabolic rates measured in brine samples kept under ambient pressure
conditions were 12.5 ± 23.6 (mean ± SD) times higher than those obtained on their
decompressed counterparts. Hence we demonstrate that microbial growth and microbial
activities are possible in these extreme environments, thanks to microorganisms adapted to
high salinity, high hydrostatic pressure and anoxic conditions.
III.5.2 Introduction
Several deep hypersaline anoxic basins (DHABs) have been discovered on the seafloor in
different oceanographic provinces, like the Gulf of Mexico (20), the Red Sea (16) and the
Mediterranean Sea (7). In the Mediterranean Sea, DHABs were most likely developed by the
dissolution of 5- to 8-million year-old Messinian evaporites which became exposed to
seawater during the collision of the African and Eurasian tectonic plates (5). Alternatively,
brines of DHABs could be relics of fossil evaporated seawater in Late-Miocene sediments
that had accumulated in these deep basins (24).
The deep hypersaline anoxic basins L’Atalante, Bannock, Discovery and Urania are
characterized by peculiar conditions, including anoxia, extremely high salinity and high
hydrostatic pressure. Their contents are so dense that they do not mix with the overlying
seawater and as such they represent unique environments that have been isolated from the
global ocean for millions of years (7, 19). Obviously, so particular environments could
119
provide us novel phylogenetically-distinct microorganisms possessing unusual adaptation
strategies. However, little is known about the organisms that could live, or survive, in these
brines. So far, L’Atlalante and Discovery basins remained closed for biological exploration.
Microscopic observations have shown that prokaryotic cells are present in the Bannock and
Urania brines (14). Unfortunately, such observations do not allow us to determine the
physiological status of these cells nor their role in the functioning of biogeochemical cycles in
these particular environments.
In this paper we compare the microbial activities measured in these 4 brine basins to those in
the overlying oxic water column. Moreover, we had the opportunity to examine the
physiological status of microbial populations in DHABs by measuring their metabolic rates
using a specific equipment that maintains during sample retrieval and incubation the physical
and chemical conditions that characterize the DAHBs.
III.5.3 Material and Methods
III.5.3.1 Sampling site
During the BIODEEP II cruise of R/V "Urania" four DHABs were visited in August and
September 2001 (Fig.1): the Discovery (35°16' 61N, 21°41'42E), the L'Atalante (35°18'14N,
21°23'43E), the Urania (35°13'70N, 21°31'14E), and the Bannock basins (34°21'64N,
20°02'26E). Samples were collected from two levels:
-
The interface between the oxic seawater and the brines, a thin layer characterised by
drastic gradients in salinity and oxido-reduction conditions. As it is usual in every
boundary layer, this niche may provide exceptional conditions for the growth of highly
diversified microbial consortia from the two adjacent layers.
-
The body brines, where anoxic conditions and hypersalinity are clearly established in a
system quasi-closed to the general oceanic circulation over geological time, offering
the possibility for specifically adapted autochthonous microbes to dominate.
120
FIG. 1. Location of the four deep hypersaline anoxic basins (DHABs) in the eastern
Mediterranean.
III.5.3.2 Sampling protocol and incubation under ambient pressure conditions
To be able to grow in DHABs environments, microorganisms must be adapted to high
salinity, high hydrostatic pressure and anoxic conditions. In order to obtain evidence that
bacterial growth is possible in such extreme conditions, it is necessary to preserve as closely
as possible all the characteristic environmental conditions throughout the entire experimental
protocol. This has been achieved by collecting the brine samples using 5-liter high-pressure
samplers (HP-5L) that maintain all physical and chemical parameters at ambient conditions
during retrieval and incubation (1). The HP-5L samplers were fitted, in addition to the
conventional Niskin bottles, on the MODUS/SCIPACK system (4). This gear includes a ROV
(remotely-operated vehicle) that samples at accurate depths and positions, which is required to
sample a relatively thin interface layer. On board the research vessel, brine samples collected
by using the HP-5L pressure-retaining sampler were transferred without decompression to
500-ml high-pressure bottles (HPB). To compare the metabolic rates measured under ambient
conditions with those measured under atmospheric pressure conditions, two identical 500-ml
HP bottles were filled simultaneously from the HP-5l sampler. One of these was kept under
121
ambient pressure conditions, the other was decompressed at approximately 36 MPa h-1 to
simulate the decompression rate experienced during retrieval in a Niskin sampler.
The HP-5L and 500-ml HP bottles were autoclaved and tightly closed until filling. Such
processing prevents sample contamination, a possible source of artefacts when studying
microbial life in extreme environments. Similarly, samples collected using HP bottles were
never exposed to the atmosphere and contamination by molecular oxygen. Incubation was
performed at in situ pressure (ranging between 33 and 35 MPa depending on sample) and in
situ temperature (13±1°C). Time course experiments were done by successively withdrawing
aliquots without decompression of the main culture (1, 3).
To compare activities in the brines samples with those in the oxic seawater of this part of the
Mediterranean, we also studied samples collected from the overlaying seawater column. In
the oxic water column, samples were collected using 500-ml HP bottles fitted on a Sea Bird
Carousel (2). For each sampling level, two 500 ml HP bottles were filled through the same
filling valve, with one kept under ambient pressure conditions and the other slowly
decompressed during retrieval by a intentional leak on the filling circuit.
III.5.3.3 Microbial enzyme activity
Aminopeptidase and phosphatase activities were determined using the fluorogenic substrate
analogues L-leucine-7-amino-4-methylcoumarin (Leu-MCA) and 4–methylumbelliferylphosphate (MUF-P), respectively (11, 12) according to the multi-concentration kinetic
method at concentrations ranging from 0.05 to 10 µM (duplicates and 1 boiled blank for each
concentration). Fluorescence resulting from substrate hydrolysis was measured in a Kontron
SFM 25 fluorometer at 365-455 nm and 365-465 nm (excitation-emission wavelengths) for
Leu-MCA and MUF-P respectively (22).
III.5.3.4 Microbial biomass production
Microbial biomass production was measured using L-[4,5-3H] leucine at the saturated
concentration of 10 nM. Samples (in duplicates) were incubated in the dark at in situ
temperature. Time course experiments lasted for 12 h for oxic deep-sea water and 36 h for
brines. Samples were corrected for blanks and the time zero was included in the regression.
Production was calculated using the conversion factor of 1.55 ng C per pmol of incorporated
leucine (21).
122
III.5.3.5 Uptake of Low Molecular Weight Compounds
Uptake of L-(U-14C)-glutamic acid was measured at saturated concentration of 10 nM.
Samples (in duplicates) were incubated as above. To determine the glutamic acid assimilation
rate, bacterial cells were collected by gentle vacuum filtration on 0.2 µm polycarbonate filters
(Nuclepore®) prewashed with an unlabeled glutamate solution. Filters were washed twice
with 5 ml of 0.2 µm filtered water samples. To determine the glutamic acid respiration rate,
14
CO2 was recovered from the filtrate (23). The efficiency of 14CO2 recovery was determined
for all seawater – brine interface and brine waters. The radioactivity was counted by using a
Packard 1600 TR liquid scintillation counter. Samples were corrected for blanks, as the time
zero was included in the regression.
III.5.4 Results and discussion
At the oxic seawater - brine interface, as well as within the body brines, we detected microbial
activities in all samples. Maximum rates of ectoenzymatic hydrolysis ranged from 0.23 to
2.96 nmol l-1 h-1 for aminopeptidase activity, and from 0.92 to 2.91 nmol l-1 h-1 for
phosphatase activity. These rates were clearly higher than those we measured in the
immediately overlaying deep oxic seawater, 0.27 and 0.13 nmol l-1 h-1 for aminopeptidase and
phosphatase activities respectively, and at least the same order of magnitude as those
measured in the productive photic layer of this oceanic area (Fig. 2). Utilisation of lowmolecular weight compounds,
14
C-glutamic acid assimilation and respiration, microbial
biomass production, were always detected, but the rates measured were slower than those
observed in the oxic seawater (Fig. 2).
As all samples had metabolic activity, it was obvious that living microbes were present in the
four brine lakes we studied. To determine whether these organisms are physiologically
adapted species (i.e. able to actually grow under these environmental conditions) or whether
they are allochtonous cells that can only survive in the brines, we compared the rates in
samples maintained under ambient pressure conditions to those of decompressed counterparts.
Table 1 shows that all the metabolic rates we measured, both in the deep oxic seawater and in
the brine lakes, were higher in samples kept under ambient pressure conditions than in those
decompressed during retrieval. Pressure effects on the metabolic rates (Pe) can be estimated
by the relation Pe = VAP/ VDEC, where VAP is the rate measured in samples kept under ambient
pressure conditions, and VDEC is the rate measured on their decompressed counterparts. For
bacterial biomass production within the brines of L'Atalante basin Pe is equal to 1.7. For the
123
whole set of metabolic rates we measured using the high-pressure sampler within the Bannock
basin Pe=3.9 (n=6) (Tab. 1). Such results demonstrate that the dominant microbial
populations living within the brines are adapted to the extreme environmental conditions.
TABLE 1. Effect of decompression on measured metabolic rates
Depth
Aminopeptidase Phosphatase
Glutamic acid
assimilation
Glutamic acid
respiration
Bacterial
production
DEC
DEC
AP
DEC
AP
DEC
AP
(m)
AP
DEC
AP
Oxic deep-sea waters
1500
0.10
0.37
0.7
1.2
1.7
2.7
1.5
3.2
2500
0.27
0.56
0.9
4.0
7.9
29.8
0.1
1.5
2500
20.6
112.2
3000
2.3
15.7
0.7
1.6
0.07
3.98
0.36
1.24
0.07
0.12
Brine: Bannock Basin
3300
0.13
0.44
1.46
2.28
3.42
15.02
Brine: L'Atalante basin
3500
The units of maximum rates are nmol l-1 h-1 for aminopeptidase activity, phosphatase activity,
glutamic acid assimilation and glutamic acid respiration and ng C l-1 h-1 for bacterial
production. Rates measured on samples maintained under ambient pressure conditions (AP)
and their decompressed counterparts (DEC).
124
(a) Aminopeptidase nmol l-1 h-1
Depth (m)
0
2
1
3
(b) Phosphatase nmol l-1 h-1
4
5
0
0
0
500
500
1000
1000
1500
1500
2000
2000
2500
2500
3000
3000
(c) Glutamic acid uptake nmol l-1 h-1
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
8
6
0
2
4
6
0.0
0.1
0.2
0.3
8
10
0
0.02
Depth (m)
4
(d) Bacterial production ng C l-1 h-1
0.6
0
2
0.04
0.06
0.08
500
500
1000
1000
0.4
0.5
1500
1500
2000
2000
2500
2500
3000
3000
FIG. 2. Maximum rates of aminopeptidase activity (a), phosphatase activity (b), glutamic acid
uptake (assimilation + respiration) (c) and bacterial production (d) through the whole oxic
seawater column
, at the seawater-brine interface
seawater, Discovery basin,
and within the body brine
L'Atalante basin, + Urania basin and Bannock basin.
125
;
Oxic
Because several independent approaches revealed microbial activity, we conclude that
microorganisms can grow in the DAHBs and therefore actively participate, via their metabolic
activities, in biogeochemical cycles of theses basins. Participation of microorganisms to
biogeochemical cycles (i-e. biopolymer hydrolysis and organic matter mineralization) appears
even more likely when we compare the patterns of these heterotrophic processes in the oxic
water column and in the DHABs. In all samples from the brine and the halocline layer,
utilisation of low molecular weight compounds was always detectable, but drastically slower
than those measured in the oxic seawater. Conversely, hydrolysis of high molecular weight
compounds appeared to be considerably elevated relative to those measured in the oxic
seawater samples (Fig. 2). These data, obtained from 4 different brine lakes, confirm and
extend to the whole set of DHABs, the importance of
hydrolytic activities previously
observed at the seawater – brine interface of the Urania basin (18, 25). The increase in
aminopeptidase activity we observed within the brines (Fig. 2) demonstrates that bacteria
living in the DHABs are able to produce the enzymes required to hydrolyse high molecular
weight organic matter into smaller compounds. However, the lower bacterial biomass
production we observed in these samples suggests either this enzymatic capacity not actually
operating in situ, or that a great squandering of the microbial metabolism to transfer the
hydrolysis products into the production of microbial biomass. This pattern suggests a shift in
microbial activity towards ectoenzymatic hydrolysis of high molecular weight compounds.
This shift is probably due to the adaptation of the DAHBs microbial communities to the lack
of labile organic monomers, and/or to the probable difficulties for microorganisms to
incorporate low molecular weight compounds through the cell membrane when the cell has to
cope under conditions of extreme salinity and high hydrostatic pressure (13).
These basins are considered as physically isolated from the overlaying seawater for over 5
millions years due to the strong halocline (4, 7). Indeed, organic particles sinking through the
water column accumulate at the density barrier, producing a mat of detritus and associated
organisms at the upper interface of the brine lakes (9, 10). This accumulation of nutrients
within a redox gradient stimulates microbial activities that frequently result in rates as high as
in the productive surface layer of this Mediterranean area (Fig. 2). As a result of these
microbial processes, the labile fraction of the sinking organic particles is very likely
eliminated, and so the material that accumulates at the interface is limited to its more
refractory part. When the mat falls into the brine lake due to overloading (9), it provokes an
126
input of refractory nutrients and attached microorganisms into the brine. Before it can be
mineralised by microbial populations, this particulate material must be previously hydrolysed
into small (<600 Da) molecules able to pass through the cell membrane (6), hence the
increase in ectoenzymatic hydrolytic processes we observed in the brine samples. Microbes
imported from the oxic seawater concomitantly with the particles included in the falling mat
are unlikely to be adapted to the high salinity and anoxic conditions prevailing in the brines.
Indeed, the high ectoenzymatic activities we measured in the body brines appeared optimal
when all the ambient conditions, including high hydrostatic pressure, were preserved. This
result demonstrates that, in addition to the allochtonous marine organisms introduced by the
sinking particles (organisms that are commonly obtained in culture conditions (18)), the brine
lakes are also colonised by autochthonous microbes equipped to hydrolyse recalcitrant
biopolymers, and adapted to grow in such extreme conditions.
Microbial life adapted to deep hypersaline anoxic basins opens up new perspectives in the
search for novel microbial species and products of their metabolism. Microorganisms with
high enzymatic properties that thrive in so extreme environments may have a potential interest
for biotechnology purposes (17). Yet, these organisms, which are the most adapted to so
extreme chemical and physical conditions, are the most difficult to cultivate in laboratory
conditions (15, 18). Understanding the in situ metabolic activities, along with their degree of
adaptation to ambient conditions, may be helpful in further attempts to isolate new microbial
strains representative of the autochthonous microbial community. Such microorganisms
adapted to high salt concentrations, strong anoxia and high hydrostatic pressure conditions are
also interesting from an evolutionary point of view in ultimately understanding the origin of
life (8).
ACKNOWLEDGEMENTS
This work was supported by the European Commission's Sustainable Marine Ecosystems Program, under the
BIODEEP project (contract EVK3-2000-22057). C.T. was supported by a fellowship co-funded by INSU and
Total-Fina-Elf (grant n° 11 997 – CNRS/ENTREPRISE). The authors appreciated the critical comments
provided by A. Sass, F. Van Wambeke, R. Sempéré, M. Goutx, & M. Bianchi. Special thanks to D. Kirchman
who, in addition to its comments, greatly improved the English language of this manuscript. We sincerely thank
Prof. C. Corselli, head of the BIODEEP project, F. Gasparoni (Tecnomare S.p.A.) for his help allowing to fit the
HP-5L on the Scipack , and the officers & crew of R/V URANIA for their kind contribution in the field.
127
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129
130
III.6 Adaptation à la pression hydrostatique : données
complémentaires et synthèse
III.6.1 Preuve statistique de l'effet de la décompression sur la mesure des
activités métaboliques microbiennes
Le but de ce paragraphe est de compléter la synthèse présentée dans le manuscrit n°1 en
ajoutant les mesures réalisées sur les échantillons maintenus en conditions hyperbares et leurs
homologues décomprimés des manuscrits n°4 et 5 (Tamburini et al., soumis-c&b). Les
résultats sont regroupés dans un tableau similaire à celui du manuscrit n°1 (Annexe 2 : Table
annex 2). Ainsi, 113 couples d'échantillons peuvent être comparés : 1 de Seki & Robinson
(1969), 17 de Bianchi & Garcin (1994), 7 de Bianchi et al. (1999a), 4 de Bianchi et al.
(1999b), 39 de Tholosan et al. (1999), 7 de Tholosan (1999), 10 de Tamburini et al. (2002),
11 de Tamburini et al. (soumis-c) et 17 de Tamburini et al. (soumis-b). Un test t a été réalisé
sur ce jeu de données montrant que le rapport Pe (échantillon comprimé/échantillon
décomprimé) est significativement supérieur à 1 (p<0.001).
III.6.2 Définition d'un facteur de correction afin de corriger les activités
mesurées sur des échantillons décomprimés
Si preuve est faite que les mesures d'activités obtenues en décomprimant les échantillons
faussaient l'évaluation réelle des activités des microflores profondes, nous avons montré dans
le manuscrit n°1 (Bianchi et al., soumis-a) qu'il était difficile de fournir un facteur de
correction permettant de valider les données acquises avec des systèmes de prélèvement
classique. En effet, le facteur Pe obtenu sur les 113 échantillons (85 échantillons compilés
dans Bianchi et al. (soumis) + 21 Tamburini et al. (soumis-b&c)) présente une moyenne de
3,86 ± 6,47 (± e.t.). Un tel écart à la moyenne nous empêche formellement d'utiliser cette
moyenne comme facteur de correction pour des échantillons décomprimés.
Toutefois, cette moyenne a été évaluée en tenant compte de l'ensemble des mesures obtenues
quelles que soient les conditions hydrologiques rencontrées. La Figure III-2 représente la
distribution du rapport Pe en fonction des conditions hydrologiques sous forme de graphe en
boîte (ou boîte de Tukey) et montre la disparité des Pe que l'on peut trouver en fonction des
conditions hydrologiques. Dans le cas d'échantillonnage dans des conditions d'eaux
mélangées ou de flux importants en pelotes fécales, le rapport Pe est inférieur à 1 montrant
131
que dans certains cas, i.e. lorsque les communautés microbiennes prélevées en profondeur ne
sont adaptées qu'à de très faibles pressions atmosphériques, les activités mesurées sur des
échantillons décomprimés (DEC) apparaissent supérieures à celles mesurées sur des
échantillons maintenus à la pression in situ (HP) (Bianchi & Garcin, 1994; Bianchi et al.,
1999a). Par contre, lorsque les échantillons sont prélevées lors de la période de stratification
des eaux (cas le plus commun) ou dans des environnements très particuliers comme les
bassins profonds hypersalés et anoxiques (DHAB), les activités mesurées sur des échantillons
maintenus en pression sont toujours supérieures à celles mesurées sur des échantillons
décomprimés (Figure III-2).
55
45
35
11,88 ± 22,06
n=6
med.=2,38
0,03± 0,01
n=3
med.=0,04
DHAB
Mixées
0,99± 0,11
n=4
med.=0,96
3,63 ± 4,27
n = 99
med.=2,15
Pe
25
15
5
-5
Pelotes fécales
Stratifiées
Figure III-2. Graphe en boîte (boîte de Tukey) de l'effet de la pression Pe selon différentes conditions
hydrologiques. DHAB : bassins profonds hypersalés et anoxiques (Tamburini et al., soumis-b); Mixées : période
hivernale de mélanges des eaux (Bianchi et al., 1994); Pelotes fécales : pèriode d'un flux de pelotes fécales
(Bianchi et al., 1999a); Stratifiées : période où les masses d'eau sont stratifiées (14 de Bianchi & Garcin, 1994; 3
de Bianchi et al., 1999a; 4 de Bianchi et al. 1999b; 39 de Tholosan et al., 1999; 7 de Tholosan, 1999; 10 de
Tamburini et al., 2002; 11 de Tamburini et al., soumis-c; 11 de Tamburini et al., soumis-b)
Regardons de manière plus attentive les 99 échantillons obtenus en période de stratification
des eaux. La boîte de Tukey montre que la médiane est égale à 2,15 mais que 50 % des
échantillons sont compris entre 1,55 et 3,73 (corps de la boîte).
La Figure III-3 permet de visualiser si cette hétérogénéité est en relation avec la profondeur
d'échantillonnage. Nous avons regroupé par profondeur les rapports Pe obtenus en période de
stratification des eaux et là encore, il n'est pas possible de définir une tendance
d'augmentation du Pe avec la profondeur d'échantillonnage (Figure III-3). Toutefois, un plus
132
grand nombre d'échantillons devront être traités dans les eaux situées à des profondeurs
supérieures à 2000 m.
30
25
3,43 ± 3,80
n=7
med.=1,22
7,61± 6,15
n=4
med.=4,93
4,88±6,761
n = 22
med.=2,21
2,79± 2,25
n = 43
med.=2,10
20
Pe
3,31±3,75
n = 20
med.=2,16
3,75±2,67
n=3
med.=2,32
15
10
5
0
800
1000
1500
2000
2500
3000
Profondeur (m)
Figure III-3. Graphe en boîte (boîte de Tukey) de l'effet de la pression Pe selon la profondeur. 800 : Pe sur
échantillons prélevés à 800 m (1 de Bianchi et al., 1999b; 1 de Tholosan, 1999; 5 de Tholosan et al., 1999); 1000
: Pe sur échantillons prélevés à 1000, 1100 et 1150 m (14 de Bianchi & Garcin, 1994; 3 de Bianchi et al., 1999a;
1 de Tholosan, 1999; 17 de Tholosan et al., 1999; 2 de Tamburini et al., 2002); 1500 : Pe sur échantillons
prélevés à 1300 et 1500 m (2 de Bianchi et al., 1999b; 2 de Tholosan, 1999; 8 de Tholosan et al., 1999; 2 de
Tamburini et al., 2002; 2 de Tamburini et al., soumis-c; 4 de Tamburini et al., soumis-b); 2000 : Pe sur
échantillons prélevés à 2000 m (1 de Bianchi et al., 1999b; 3 de Tholosan, 1999; 9 de Tholosan et al., 1999; 6 de
Tamburini et al., 2002; 3 de Tamburini et al., soumis-c); 2500 : Pe sur échantillons prélevés à 2000 m (4 de
Tamburini et al., soumis-b); 3000 : Pe sur échantillons prélevés à 3000 m (3 de Tamburini et al., soumis-b).
Le regroupement par activités métaboliques mesurées donne une disparité tout aussi
importante ne nous permettant pas, pour l'instant, de fournir un facteur permettant de corriger
les activités mesurées sur des échantillons décomprimés.
III.6.3 Conclusion
Il apparaît donc sans ambiguïté que la décompression des échantillons affecte la mesure des
activités métaboliques des microflores profondes. Les effets de la décompression sont
d'ampleur variable rendant difficile la détermination d'un facteur de correction pour valider les
mesures d'activités d'échantillons décomprimés. Toutefois, peut-on réellement concevoir de
définir un facteur de correction unique pour des mesures réalisées dans des conditions
environnementales différentes ? Le fondement de toute mesure d'activité en écologie n'est-il
pas de réaliser celle-ci dans les conditions les plus proches de celles du milieu environnant
lors de l'échantillonnage ?
133
134
Chapitre IV
ACTIVITES MICROBIENNES DANS LE
DOMAINE BENTHIQUE PROFOND
Chapitre IV – Activités microbiennes dans le domaine benthique profond
IV. ACTIVITES MICROBIENNES DANS LE DOMAINE
BENTHIQUE PROFOND
Une part de la matière organique produite dans la couche euphotique des océans chute ou
diffuse au travers de la colonne d'eau océanique. L'interface eau-sédiment constitue le
terminus de tout ce matériel qui chute, ce qui constitue un compartiment privilégié pour le
développement d'activités microbiennes intenses. Les peuplements microbiens sont reconnus
comme consommateurs de la matière organique qui chute de la couche productrice de surface
jusqu'à l'eau proche du fond et les sédiments (Deming, 1985; Hoppe et al., 1993; Poremba,
1994a; Turley & Mackie, 1994; Poremba, 1995). Ainsi, la quantité et la qualité de la matière
organique enrichissant le sédiment dépendent de son temps de résidence dans la colonne
d'eau. Les particules et les agrégats qui chutent rapidement le long de la colonne d'eau
passent, en partie, au travers du filtre biologique pélagique et constituent la principale source
d'énergie du sédiment profond (Turley et al., 1995). Par conséquent, dans le domaine
benthique profond, la source de matière organique biodisponible est sous forme de composés
de haut poids moléculaire (Boetius & Lochte, 1994). Pour pouvoir les utiliser pour leur
métabolisme, les microflores benthiques profondes devront préalablements hydrolyser ces
polymères (Chrost, 1991).
Le maintien des conditions naturelles lors de la mesure des activités microbiennes dans le
domaine benthique profond est délicate. Deux problèmes majeurs sont à prendre en compte :
(1) la décompression des échantillons et (2) la conservation de l'intégrité du sédiment et de
l'eau proche du fond constituant l'interface entre la colonne d'eau et le compartiment
sédimentaire (NBW).
Concernant le premier point, nous avons montré dans le chapitre III que les prélèvements
d'échantillons d'eau de mer profonde sans décompression sont actuellement réalisables et qu'à
défaut de maintenir les conditions de pression in situ, les mesures d'activités microbiennes
sont faussées par le stress engendré par une variation de pression hydrostatique (Bianchi et
al., soumis-a; manuscrit n°1). Nous avons souligné dans ce manuscrit les difficultés
technologiques rencontrées pour réaliser de tels prélèvements dans la colonne d'eau. Ces
difficultés sont accrues dans le cas d'échantillons sédimentaires et pour le moment, seul le
système japonais décrit dans Kyo et al. (1991) permet de prélever la couche de sédiment
superficiel sans décompression. Grâce à cet engin de prélèvement manipulable qu'avec l'aide
d'un submersible, le groupe du JAMSTEC a pu isoler des souches piezophiles mais, au moins
135
à notre connaissance, aucune publication reporte des mesures d'activités microbiennes qui
auraient été effectuées en condition hyperbare à partir d'échantillons de sédiment. Cette
lacune pourrait être due à la nature des échantillons récoltés par cet équipement qui en fait
prélève un mélange à parts variables, de sédiment superficiel et d'eau surnageante.
Les seules études concernant les effets de la pression hydrostatique sur le métabolisme des
microflores à l'interface eau-sédiment (NBW) ont été réalisées in situ par le biais de
submersibles (Jannasch, 1973; Cahet et al., 1990) ou par la recompression des échantillons de
sédiment à leur pression d'origine (Deming et al., 1980; Cahet et al., 1981; Lochte & Turley,
1988; Turley & Lochte, 1990; Meyer-Reil & Köster, 1992; Poremba, 1994b; Poremba, 1995;
Poremba & Hoppe, 1995). Cependant Bianchi & Garcin (1993), ont montré que des
échantillons recomprimés présentaient des activités métaboliques inférieures à celles
mesurées en maintenant les conditions de pression hydrostatique, et parfois même inférieures
à celles mesurées sur les échantillons simplement décomprimés. L'objectivité et la validité des
valeurs obtenues en imposant aux organismes un double stress en recomprimant les
échantillons décomprimés lors de la collecte paraissent donc peu fiables. Pour les échantillons
de sédiment, les mesures ont donc été effectuées à la pression atmosphérique introduisant un
biais qu'il nous est impossible d'évaluer. Par contre, pour les échantillons d'eau proche du
fond, grâce à une collaboration avec Francis de Bovée, nous avons pu utiliser la chambre
benthique autonome (ou Lander) de Banyuls-sur-Mer qui permet d'effectuer des mesures
d'activités microbiennes in situ (Tengberg et al., 1995; Picon, 2000). Dans le but d'estimer les
effets de la décompression sur les mesures d'activités à l'interface eau-sédiment, nous avons
comparé les mesures obtenues in situ avec le Lander avec celles effectuées sur des
échantillons décomprimés. Ces mesures ont été effectuées sur des carottes intactes (Novitsky,
1983; Picon, 2000) obtenues à l'aide d'un carottier multitube et maintenues, en incubation à
bord du bateau à température in situ avec une agitation douce mais à la pression
atmosphérique. Seul le paramètre de "pression hydrostatique" différenciait les mesures
d'activités effectuées dans les carottes incubées à bord de celles réalisées dans les chambres
benthiques du Lander.
Les difficultés technologiques rencontrées pour réaliser une mesure représentative de la
minéralisation de la matière organique dans le compartiment benthique, ainsi que les aléas
météorologiques provoquant de nombreux avortements de carottages en zone profonde ont
réduit quelque peu les objectifs initialement fixés. Toutefois, deux campagnes originales ont
136
pu être réalisées : l'une dévolue uniquement à l'étude du compartiment benthique (campagne
AMIBE), l'autre pour tenter de réaliser un couplage pelagos-benthos des activités
microbiennes profondes (campagne DYFAMED - septembre 2000).
Au cours de la campagne AMIBE (Activités MIcrobiennes en milieu BEnthique) réalisée en
mai 2000 sur le site du Canyon Lacaze-Duthiers dans le Golfe du Lion, plusieurs objectifs
étaient visés :
-
réaliser un échantillonnage haute fréquence pour obtenir une mesure statistiquement
représentative de l'activité microbienne benthique, et estimer sa variabilité à petite
échelle spatiale,
-
comparer différentes stratégies d'échantillonnage pour mesurer la vitesse de
minéralisation de la matière organique à l'interface eau-sédiment,
-
estimer l'effet de la décompression sur les activités microbiennes impliquées dans la
minéralisation de la matière organique dans l'eau proche du fond.
C'est en septembre 2000, sur le site DYFAMED, que nous avons réussi de coupler à une étude
de la minéralisation dans le domaine pélagique (de la surface jusqu'à 2000 m de profondeur),
des mesures d'activités microbiennes dans le domaine benthique (eau proche du fond et
sédiments).
IV.1 Validation des mesures d'activité microbienne à l'interface
benthique
D'une manière générale, la durée des prélèvements dans le domaine benthique profond et le
plan de charge des navires océanographiques limitent considérablement le nombre
d'échantillons pouvant être analysé au cours d'une campagne hauturière. Ainsi, dans la plupart
des cas, les mesures décrivant des activités bactériennes dans les sédiments profonds ont été
obtenues par l'analyse d'une seule carotte par station étudiée (Deming, 1993; Boetius &
Lochte, 1994; Tholosan & Bianchi, 1998; Coolen & Overmann, 2000; Bianchi et al.,
submitted). Ce protocole généralisé ne permet pas d'évaluer la variabilité spatio-temporelle à
petite-échelle, et peut donc obérer l'interprétation de la variabilité à l'échelle d'un bassin
océanique qui est l'objectif principal des travaux cités ci-dessus. Dans le but d'estimer cette
variabilité à petite échelle, au cours de la campagne AMIBE, nous avons effectué une série de
19 carottages multitubes (Tableau IV-1) s’inscrivant dans un carré d'environ 900 m de coté
(Figure IV-1) dans l’axe du Canyon Lacaze-Duthiers à 900 m de profondeur.
137
Tableau IV-1. Nomenclature des échantillons, profondeur et position des stations au cours de la campagne
AMIBE. KTB : carotte; CI : Carotte Incubées; CB : Chambre Benthique; * échantillon côtier.
Date
10/05/2000
Echantillon
KTB 1
Profondeur (m) Position du carottage
899
N 42°27' 697
E 03°29' 595
11/05/2000
KTB 2
896
N 42°27' 861
E 03°29' 562
12/05/2000
KTB 3
895
N 42°27' 50
E 03°29' 632
12/05/2000
KTB 4 >> CI 1
895
N 42°27' 861
E 03°29' 562
12/05/2000
KTB 5 >> CI 2
896
N 42°27' 777
E 03°29' 680
13/05/2000
KTB 6
896
N 42°27' 729
E 03°29' 687
13/05/2000
KTB 7>> CI 3
896
N 42°27' 711
E 03°29' 703
14/05/2000
KTB 8 >> CI 4
896
N 42°27' 713
E 03°29' 704
14/05/2000
KTB 9 >> CI 5
893
N 42°27' 765
E 03°29' 678
16/05/2000
KTB 10
890
N 42°27' 807
E 03°29' 566
16/05/2000
KTB 11 >> CI 6
893
N 42°27' 726
>> CI 7
E 03°29' 639
17/05/2000
KTB 12
893
N 42°27' 743
E 03°29' 659
17/05/2000
KTB 13
892
N 42°27' 755
E 03°29' 676
17/05/2000
KTB14
894
N 42°27' 747
E 03°29' 669
18/05/2000
KTB 15 >> CI 8
896
N 42°27' 719
>> CI 9
E 03°29' 651
18/05/2000
KTB 16
894
N 42°27' 747
E 03°29' 714
37
N 42°29' 625
19*/05/2000 KTB17 >> KTB17
E 03°09' 595
>> CI 10
>> CI 11
19*/05/2000 KTB18 >> KST 1
37
N 42°29' 627
E 03°09' 596
37
N 42°29' 625
19*/05/2000 KTB 19 >> KST 2
E 03°09' 598
>> KST 3
>> KST 4
16-17/05/2000
CB
894
N 42°27' 747
E03°29' 717
138
42,476
42,474
KTB4-Ci1
KTB2
KTB10
42,472
KTB5-Ci2
Latitude (N)
KTB13
KTB11-Ci6&7
42,470
KTB1
KTB12
KTB15-Ci8&9
KTB9-Ci5
KTB16
KTB14
CB
KTB6
KTB7-Ci3
KTB8-Ci4
42,468
42,466
42,464
42,462
3,498
KTB3
3,499
3,500
3,501
150 m
3,502
3,503
3,504
Longitude (E)
Figure IV-1. Position des carottages profonds effectués lors de la campagne AMIBE. KTB : carotte obtenue à
l'aide du carottier multitube; Ci : carotte incubée; CB : chambre benthique.
Pour réaliser un échantillonnage comparable, nous avons respecté scrupuleusement la même
démarche :
-
Nous avons choisi de ne pas prélever, lors du siphonnage de l'eau proche du fond, le
"fluff" considérant qu'il appartenait à la fraction sédimentaire.
-
Les 6 premiers centimètres du sédiment (au moins) ont été découpés tous les 2 cm.
-
La dilution du sédiment (1/1, v/v) a été réalisée en utilisant de l'eau proche du fond de
la même carotte, filtrée sur 0,2 µm.
L'objectif de ce travail étant de mesurer des vitesses métaboliques des microflores profondes
dans les conditions les plus proches des conditions in situ, on a utilisé des gammes de
concentration en substrat correspondant à la gamme basse de concentrations telle que définie
dans le cas d'activités multiphasiques (Talbot & Bianchi, 1997; Tholosan et al., 1999; Unanue
et al., 1999).
C'est donc sur ces bases que la variabilité spatiale à petite échelle des mesures d'activités
microbiennes a été appréhendée.
139
IV.1.1 Essai de modélisation
Les activités des aminopeptidases et les vitesses d'utilisation du glutamate mesurées en
cinétique concentrations ont été comparées sur l'eau proche du fond et les couches du
sédiment 0-2, 2-4 et 4-6 cm de différentes carottes indiquées dans le Tableau IV-2.
Tableau IV-2. Données utilisées pour analyser les variations à petite échelle spatiale des activités des
aminopeptidases dans l'eau proche du fond et les sédiments, et d'utilisation du 14C-glutamate dans l'eau proche
du fond
MCA-Leu
MCA-Leu
14
C-glu
NBW
Sed
NBW
KTB1
KTB2
√
√
√
KTB6
√
√
√
KTB9
√
√
KTB10
√
√
√
MCA-Leu : activité aminopeptidasique; 14C-glu : activités mesurées à l'aide du
proche du fond; Sed : couches sédimentaires (0-2, 2-4 et 4-6 cm).
14
KTB13
√
√
√
KTB16
√
√
C-glutamate; NBW : eau
Il est généralement reconnu, et ceci nous sert d'hypothèse de base pour l'analyse statistique,
que les activités microbiennes dans les écosystèmes naturels suivent une cinétique de type
Michaelis-Menten (Wright & Hobbie, 1965; Packard, 1979; Li, 1983; Fry, 1990). Selon ce
modèle, la vitesse de réaction enzymatique (V) dépend de la concentration en substrat
disponible suivant l'équation :
Équation IV-1
:
V = Vmax × S
Km + S
où Vmax est la vitesse maximale de réaction enzymatique et Km représente la constante de
demi-saturation ou constante de Michaelis-Menten indiquant l'affinité de l'enzyme pour son
substrat.
IV.1.1.1 Description de l'analyse statistique utilisée
Cette analyse statistique a été réalisée en collaboration avec le Professeur Jean-Pierre Durbec
(Centre d'Océanologie de Marseille). Une méthode de régression non-linéaire (procédure
NLIN du programme SAS, SAS/STAT, 1990, vers 8.1, SAS inco, Cary, USA) a été utilisée
pour ajuster les courbes de Michaelis-Menten. Les comparaisons entre les courbes ont été
réalisées à l'aide d'un test du rapport de vraisemblance.
Les différentes carottes réalisées correspondent à des catégories. Si on a q catégories, i = 1,
2,…q alors on a pour l'observation j, j = 1,…ni de la ième catégorie (condition). L'équation
utilisée pour ce test statistique est :
Équation IV-2
:
ln y ij =
ai × S j
bi + S j
140
+ ε ij où εij est un terme d'erreur.
Le test du maximum de vraisemblance est égal à :
Équation IV-3
( )
L = σ ²ω
σ ²Ω
:
+ n
2
où σ²Ω est l'estimation de la variance des résidus lorsque tous les paramètres sont différents
(hypothèse H1) et σ²ω est l'estimation de la variance des résidus lorsque 2 coefficients ou plus
sont égaux (hypothèse H0). Si H0 est vérifiée, -2 ln L, statistique du rapport de vraisemblance,
est distribuée approximativement comme une variable du χ² à d degrés de liberté (ddl) :
Équation IV-4
(
λ = -2 ln L = − n ln σ ² ω
σ ²Ω
:
)
Le nombre de degré de liberté (ddl) est égal au nombre de paramètres estimés sous H1 moins
le nombre de paramètres estimés en supposant H0 vérifiée.
IV.1.1.2 Traitement des données
IV.1.1.2.1 Activité aminopeptidasique
L'ensemble des résultats statistiques obtenus pour l'analyse de l'activité aminopeptidasique
dans l'eau proche du fond et dans les différentes couches sédimentaires est résumé dans le
Tableau IV-3.
Tableau IV-3. Paramètres obtenus lors des différentes analyses statistiques effectuées à partir des mesures
d'activités aminopeptidasiques.
a (e.t.)
b (e.t.)
Echantillon
σ²Ω
σ²ω
n
λ
ddl
Prob χ²
NBW
0,5693
0,5462
104
4,3078
8
0,83
0,002 (0,0003)
1,65
(0,88)
0-2 cm
0,7078
0,5869
54
9,2022
10
0,51
3,30
(0,24)
41,11
(12,05)
2-4 cm
8,8727
7,2483
46
9,3018
10
0,50
0,56
(0,30)
73,71
(122,50)
4-6 cm
6,1486
5,0866
46
8,7223
10
0,56
0,60
(0,23)
60,49
(73,04)
µM h
-1
µM
NBW : eau proche du fond; σ²Ω : estimation de la variance des résidus lorsque tous les paramètres sont différents
(hypothèse H1); σ²ω : estimation de la variance des résidus lorsque 2 coefficients ou plus sont égaux (hypothèse
H0); n : nombre d'échantillons; λ : valeur obtenue pour le test de maximum de vraisemblance; ddl : nombre de
degré de liberté; Prob χ² : probabilité du chi²; a et b : paramètres estimés à partir du modèle (Équation IV-2)
lorsque l'hypothèse H0 ne peut être rejetée.
IV.1.1.2.1.1 Eau proche du fond
Chaque échantillon nécessite une équation de type Michaelis-Menten différente. La première
étape est conduite en supposant tous les paramètres différents. La procédure NLIN converge
au bout de 21 itérations avec une précision supérieure à 10-6 sur les estimations. La variance
σ²Ω estimée dans ce cas (hypothèse H1) est égale à 0,56. Lorsque tous les paramètres sont
141
supposés égaux (hypothèse H0), un seul modèle rend compte des variations pour l'ensemble
des carottes. La variance σ²ω estimée lorsque tous les paramètres sont égaux (hypothèse H0)
est égale à 0,5472 (Tableau IV-3). Le nombre d'échantillons utilisés pour cette analyse est de
104. L'égalité entre les différents paramètres est testée à l'aide de la statistique de rapport du
maximum de vraisemblance (Équation IV-4) :
- 2 ln L = − 54 ln 

0 , 5693
0 , 5462
 = 4,3078

Sous l'hypothèse H0, -2 ln L suit une loi du chi² à 8 ddl. La probabilité du χ² (ddl= 8; 4,3078)
est égale à 0,83, ce qui est non négligeable (Tableau IV-3). Les données ne contiennent pas
d'information suffisante à l'encontre de l'hypothèse H0. Celle-ci est donc conservée. Le
modèle estimé peut donc être adopté :
Équation IV-5 :
1,81× S
ln V=
1,65 + S
(avec V en nM h-1 et S en µM)
La Figure IV-2 présente le modèle adopté pour estimer les activités aminopetidasiques dans
l'eau proche du fond de l'axe du Canyon Lacaze-Duthiers comparé aux valeurs mesurées
moyennées. On constate que le modèle est plus fiable pour les fortes concentrations que pour
les faibles et n'est d'ailleurs pas valable pour des concentrations en MCA-Leu inférieures à
0,5 µM.
2,5
2,0
-1
ln V (nM h )
1,5
1,0
PRED
LOW95
0,5
ln V
UP95
0,0
0
2
4
6
8
10
-0,5
S (µM)
-1,0
Figure IV-2. Figure représentant le modèle adopté pour les activités aminopeptidasiques dans l'eau proche du
fond de l'axe du Canyon Lacaze-Duthiers. ln V : moyenne des vitesses mesurées; PRED : valeurs prédites par
le modèle; UP95 et LOW95 : intervalle de confiance à 95 %.
142
IV.1.1.2.1.2 Couche sédimentaire superficielle (0-2 cm)
L'analyse des différentes mesures obtenues dans la couche sédimentaire 0-2cm a été réalisée
comme pour l'eau proche du fond avec n=54 échantillons. L'analyse converge sous
l'hypothèse H1 (σ²Ω = 0,7078) et sous l'hypothèse H0 (σ²ω =0,5969 ). La statistique du rapport
de vraisemblance conduit à conserver l'hypothèse H0 et d'accepter le modèle suivant pour la
couche 0-2 cm (Prob(10χ², 9,20)=0,51) :
Équation IV-6 :
ln V=
3,30 × S
41,11+ S
(avec V en µM h-1 et Km en µM)
La Figure IV-3 présente le modèle adopté pour estimer les activités aminopetidasiques dans
l'eau proche du fond de l'axe du Canyon Lacaze-Duthiers comparé aux valeurs mesurées
moyennées. Là encore, le modèle apparaît mieux ajusté pour de fortes concentrations en
substrats ajoutées comparativement aux faibles concentrations. Dans cette couche
sédimentaire superficielle, le modèle ne s'ajuste plus aux données pour des concentrations
inférieures à 5 µM.
4,0
3,0
ln V (µM h-1)
2,0
PRED
LOW95
1,0
ln V
UP95
0,0
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
-1,0
S (µM)
-2,0
Figure IV-3. Figure représentant le modèle adopté pour les activités aminopeptidasiques dans la couche 0-2 cm
du sédiment de l'axe du Canyon Lacaze-Duthiers. ln V : moyenne des vitesses mesurées; PRED : valeurs
prédites par le modèle; UP95 et LOW95 : intervalle de confiance à 95 %.
143
IV.1.1.2.1.3 Couche 2-4 cm
De la même manière, nous avons analysé les sous-échantillons de sédiment de la couche 2-4
cm. Lorsque tous les paramètres sont supposés différents, l'algorithme de calcul diverge et les
paramètres ne peuvent être estimés. Le caractère biphasique des activités aminopeptidasiques
a été démontré (Talbot & Bianchi, 1997; Tholosan et al., 1999; Unanue et al., 1999). Les
concentrations en MCA-Leu utilisées étaient identiques à celles utilisées dans la couche 0-2
cm (1, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500 et 1000 µM). Les activités aminopeptidasiques mesurées
pour les couches 2-4 cm (tout comme les couches 4-6 cm) semblent présenter une seconde
phase à partir de la concentration 1000 µM (Figure IV-4).
18
16
V (µmol l-1 h-1
14
12
10
8
6
4
2
0
0
200
400
600
800
1000
[MCA-Leu] (µM)
Figure IV-4. Exemple de cinétiques concentrations obtenues pour les activités aminopeptidasiques dans les
couches 0-2 cm ( ) et 2-4 cm ( ). La valeur à 1000 µM a été rejetée correspondant apparemment à une
deuxième phase de l'activité aminopeptidasique.
Le but de ce travail étant de mesurer les activités aminopeptidasiques les plus proches de
celles des activités in situ, nous faisons le choix de considérer la gamme de concentrations la
plus basse. Ainsi, l'analyse statistique a été reconduite en éliminant toutes les vitesses
obtenues avec une concentration en MCA-Leu de 1000 µM. Dans ce cas, il est possible
d'estimer les paramètres de la cinétique Michaelienne, lorsque tous les paramètres du modèle
sont définis comme différents (hypothèse H1) et lorsque tous les paramètres sont définis
comme égaux (hypothèse H0). Le seuil de significativité du test du maximum de
vraisemblance n'est pas négligeable (Prob(10χ², 9,301)=0,50) ce qui nous permet de conserver
l'hypothèse H0 et d'accepter le modèle suivant pour la couche 2-4 cm :
Équation IV-7 :
ln V=
0,56 × S
73,71+ S
144
IV.1.1.2.1.4 Couche 4-6 cm
L'analyse statistique a été établie comme précédemment (couche 2-4 cm) en éliminant les
vitesses mesurées avec 1000 µM de concentration en MCA-Leu. Le test du maximum de
vraisemblance nous permet d'accepter le modèle suivant :
Équation IV-8 :
ln V=
0,60 × S
60,49 + S
IV.1.1.2.2 Utilisation du 14C-glutamate
14
La même démarche a été appliquée pour le traitement des vitesses d'utilisation du
C-
glutamate par les microflores de l'eau proche du fond de 5 carottes. Le Tableau IV-4 résume
les paramètres estimés par l'analyse statistique. Des modèles convergents ont pu être trouvés
pour les échantillons de l'interface eau-sédiment (mesure de l'assimilation et de la respiration
du 14C-glutamate).
L'analyse statistique sur la respiration du
14
C-glutamate dans le sédiment n'a pas pu être
effectuée car seules 3 cinétiques concentrations ont été réalisées au cours de cette mission.
Tableau IV-4. Paramètres obtenus lors des différentes analyses statistiques effectuées à partir des vitesses
estimées à l'aide du 14C-glutamate.
a (e.t).
b (e.t.)
Echantillon
σ²Ω
σ²ω
n
λ
ddl
Prob χ²
NBW GA
2,385
2,2499
35
2,0410
6
0,92
6,64
(0,47)
3,52
(1,51)
NBW GR
3,758
3,6692
35
0,8370
6
0,99
6,58
(0,53)
1,48
(0,84)
14
pM h
-1
nM
14
NBW : eau proche du fond; GA: assimilation du C-glutamate; GR: respiration du C-glutamate; σ²Ω
: estimation de la variance des résidus lorsque tous les paramètres sont différents (hypothèse H1); σ²ω : estimation
de la variance des résidus lorsque 2 coefficients ou plus sont égaux (hypothèse H0); n : nombre d'échantillons; λ :
valeur obtenue pour le test de maximum de vraisemblance; ddl : nombre de degré de liberté; Prob χ² : probabilité
du chi²; a et b : paramètres estimés à partir du modèle (Équation IV-2) lorsque l'hypothèse H0 ne peut être
rejetée.
Le modèle pour l'assimilation du glutamate est donc le suivant :
Équation IV-9 :
ln V=
6,64 × S
(avec V en pM h-1 et Km en nM).
3,52 + S
Le modèle pour la respiration du glutamate est le suivant :
Équation IV-10 :
6,58 × S
ln V=
(avec V en pM h-1 et Km en nM)
1,48 + S
145
IV.1.1.3 Interprétation
En montrant que la variabilité entre les activités mesurées sur une petite échelle spatiale peut
être considérée comme négligeable, la démarche utilisée nous permet de valider d'un point de
vue statistique la stratégie conventionnelle de mesures des activités microbiennes en milieu
profond. Un modèle (Équation IV-2 basée sur le modèle de Michaelis-Menten) peut être
adopté pour chacune des activités (EAA, GA et GR) et chacun des niveaux considérés (eau
surnageante pour EAA, GA et GR) et pour chaque couche de sédiment 0-2, 2-4 et 4-6 cm
pour EAA).
Le modèle testé n'est ajustable qu'en effectuant une transformation logarithmique des valeurs
des vitesses mesurées afin de minimiser l'estimation des erreurs. De ce fait, le paramètre (a)
de l'Équation IV-2 est donc une estimation de la vitesse maximale après transformation
exponentielle : Vmax = exp(a).
Les équations définies pour chacun des compartiments permettent d'estimer la vitesse réelle
d'hydrolyse aminopeptidasique, ou d'utilisation du glutamate, dans le cas où les
concentrations naturelles en polypeptides et glutamate seraient connues. La MCA-Leu étant
considérée comme un bon analogue des peptides et des protéines (Chrost, 1991), nous
émettons l'hypothèse que la concentration naturelle des acides aminés dissous combinés
(DCAA) peut être considérée comme une estimation de la concentration théorique en MCALeu des échantillons d'eau de mer (cf. chapitre II). Dans les sédiments, seuls les acides aminés
totaux sont estimés. Connaissant la concentration naturelle en AA totaux, on peut donc
évaluer la vitesse "réelle" d'hydrolyse ectoenzymatique des acides aminés dissous combinés.
Buscail & Germain (1997) estiment que dans les sédiments de l'axe du Canyon LacazeDuthiers, la concentration en acides aminés totaux est égale à 1090 µg g-1 de sédiment, soit
environ 12,2 mM. A l'aide de l'Équation IV-6, la vitesse "réelle" d'hydrolyse des
aminopeptides dans ces sédiments superficiels en période printanière peut être estimée à
environ 26,8 µmol AA l-1 h-1. Cette étude constitue une première approche vers une mesure
plus réelle des activités des microflores profondes dans l'eau proche du fond et les sédiments.
Malheureusement, les contraintes technologiques ne nous ont pas permis d'effectuer les
analyses en respectant les conditions de pression hydrostatique. La concentration en acides
aminés disponible dans les sédiments nous permet toutefois, par la technique d'estimation des
activités microbiennes en cinétique multiconcentrations, d'obtenir des vitesses maximales
proches des vitesses réellement exercées in situ puisque la gamme de concentrations ajoutée
146
(entre 1 et 1000 µM) constitue un apport trace par rapport à la concentration naturelle en
substrat (12,2 mM).
IV.2 Comparaison
de
méthode
d'estimation
de
l'activité
microbienne dans le domaine benthique profond
IV.2.1 L'interface eau-sédiment
Trois types d'échantillons ont été obtenus pour l'eau proche du fond (NBW) : (1) NBW
siphonnée du carottier multitube et incubée indépendamment de la fraction sédimentaire
(NBWS); (2) NBW maintenue au contact de la fraction sédimentaire pour mesurer des
activités métaboliques microbiennes sur des carottes intactes incubées à pression
atmosphérique (Ci) et (3) sur des échantillons incubés in situ à l'aide des chambres benthiques
du Lander (CB).
Le Tableau IV-5 présente les vitesses mesurées pour les aminopeptidasiques (EAA) et les
phosphatases (PA) selon deux conditions (1) NBWS et (2) Ci (échantillons décomprimés). Le
Tableau IV-6 présente les vitesses d'assimilation (GA) et de respiration (GR) du
14
C-
glutamate dans les différentes conditions (1, 2 et 3).
Tableau IV-5. Activités aminopeptidasique (EAA) et phosphatidique (PA) selon différentes conditions
d'incubation. NBWS : eau proche du fond siphonnée et incubée à température in situ; Ci : carottes non
perturbées incubées à pression atmosphérique et température in situ.
Station
Substrat
Canyon Lacaze-Duthiers [MCA-Leu] = 1 µM
Canyon Lacaze-Duthiers [MCA-Leu] = 2 µM
DYFAMED / KTB101
Canyon Lacaze-Duthiers
[MCA-Leu] = 5 µM
[MUF-P] = 5 µM
Canyon Lacaze-Duthiers [MUF-P] = 0,05 µM
DYFAMED / KTB101
EAA
(nmol l-1 h-1) ± e.t.
NBWS*
2,0
Ci 2
17,8 ± 0,2
Ci 4
15,8 ± 5,6
NBWS*
2,7
Ci 2
20,3 ± 3,2
NBWS**
1,5 ± 0,1
Ci
28,5 ± 0,3
PA
(nmol l-1 h-1) ± e.t.
NBWS**
21,7 ± 2,3
KTB9 / Ci5
34,3 ± 1,5
NBWS**
0,6 ± 0,03
KTB9 / Ci5
1,4 ± 0,3
NBWS**
1,0 ± 0,2
Ci
11,0 ± 0,1
Echantillon
[MUF-P] = 5 µM
*calculé à l'aide de l'Équation IV-5 pour EAA pour les mêmes concentrations; ** déterminé pour les mêmes
concentrations.
147
Les différentes activités mesurées (EAA, PA, GA, GR) sont toujours plus élevées lorsqu'on
maintient l'eau proche du fond en contact avec son sédiment que lorsqu'on la sépare
arbitrairement du sédiment (Tableaux IV-5 et IV-6). Le rapport Ci/NBWS est statistiquement
supérieur à 1 (p=0,0118; n=8).
Ce résultat montre, une nouvelle fois, que pour toute mesure biologique, l'expérimentateur
doit, autant que possible, maintenir les conditions d'incubation aussi proches que possible de
celles in situ. Toutefois, cette technique d'incubation de carottes non fractionnées n'est pas
totalement satisfaisante car les conditions de pression hydrostatique ne sont pas maintenues.
Les aléas des conditions météorologiques lors des campagnes et de la programmation des
navires océanographiques nous ont permis de réaliser seulement quatre mesures d'activité en
respectant les conditions de pression hydrostatique à l'aide du Lander de l'OSU de Banyulssur-Mer. Ces résultats sont présentées dans le Tableau IV-6.
Tableau IV-6. Assimilation (GA) et respiration (GR) du 14C-glutamate selon différentes conditions d'incubations.
NBWS : eau proche du fond siphonnée et incubée à température in situ; Ci : carottes non perturbées incubées à
pression atmosphérique et température in situ; CB : activités mesurées en conditions in situ à l'aide de la
chambre benthique. Echantillons prélevées au cours de la même campagne dans le quadrilatère définie Figure
IV-1.
Substrat
Echantillon
[14C-glu] = 2 nM
[14C-glu] = 6 nM
NBWS*
Ci 1
CB
NBWS*
Ci 3
CB
GA
(pmol l-1 h-1) ± e.t.
11,1
23,2 ± 1,0
2,1 ± 1,0
67,7
n.d.
20,6 ± 1,6
GR
(pmol l-1 h-1) ± e.t.
43,9
182,5 ± 9,5
11,5 ± 2,2
200,1
n.d.
34,1 ± 6,4
*calculé à l'aide de l'Équation IV-9 pour GA et l'Équation IV-10 pour GR pour les mêmes concentrations. n.d. :
non déterminée.
Sur les 4 échantillons étudiés dans les conditions in situ, tous présentent des vitesses
d'utilisation du glutamate inférieures aux mesures effectuées à pression atmosphérique. Les
vitesses mesurées dans les conditions in situ (CB) sont inférieures d'un ordre de grandeur à
celles mesurées à la pression atmosphérique à bord du bateau (Ci). Ces résultats confirment
ceux obtenus par Picon (2000), présentés avec la Figure IV-5, qui montraient que la
minéralisation du
14
C-glutamate était surestimée lorsque les échantillons étaient incubés à
bord du bateau (Ci) par rapport aux activités mesurées dans les conditions in situ (CB).
148
90
80
70
%
60
50
40
30
20
10
0
VTC (35m)
VL (85 m)
INT2 (330 m)
AXE (910 m)
Figure IV-5. Proportion du 14C extrait sous forme de carbone inorganique, en pourcentage de la radioactivité
totale récupérée, à la suite d'incubations effectuées à pression atmosphérique (Ci) au cours de la campagne
BBLL 3 (août 1997) et à pression in situ (CB)
au cours de la campagne BBLL2 (février 1997) selon un
transect côte-large dans le Golge du Lion. VTC : vase terrigène côtière; VL : vase du large; INT2 : interfluve de
l'axe du Canyon Lacaze-Duthiers; Axe : axe Canyon Lacaze-Duthiers (Picon, 2000).
Picon (2000) montre que l'écart entre les vitesses de minéralisation mesurées à bord et celles
mesurées in situ augmente avec la profondeur. Le fait que les minéralisations mesurées à bord
soient supérieures à celles obtenues in situ dans la station la plus côtière (située à 35 m de
profondeur) montre que des facteurs autres que la pression hydrostatique ont une influence sur
la mesure du métabolisme microbien. Toutefois, Picon (2000) souligne que les comparaisons
des mesures de minéralisation qu'il a réalisées in situ et à bord sont assujetties à deux
critiques :
-
D'une part, la différence peut être également assignée à une variation saisonnière,
puisque les mesures réalisées lors d'incubation à bord du bateau (à pression
atmosphérique) et celles réalisées in situ n'ont pas été effectuées simultanément (l'une
en février, l'autre en août 1997).
-
D'autre part les conditions d'incubation différaient également par l'absence d'agitation
pendant les incubations à bord, alors qu'une agitation était réalisée dans les chambres
benthiques incubées in situ.
Pour pallier ces défauts, nous avons comparé les deux techniques d'incubation lors d'une
même campagne. De plus, à l'aide d'un agitateur magnétique, nous avons reproduit dans les
carottes incubées à bord l'agitation lente installée dans les chambres benthiques, simulant
autant que possible l'hydrodynamisme de l'eau proche du fond (Picon, 2000). En effet, le
149
courant de fond, en provoquant la remise en suspension du matériel organique fraîchement
déposé, peut influencer sa dégradation (Smith et al., 1987).
De ces quelques échantillons (n=5) obtenus à l'interface eau-sédiment, il est difficile de
pouvoir conclure de manière définitive quant à l'effet de la décompression sur les activités des
microflores de l'eau proche du fond. Comme nous l'avons vu, peu de résultats ont été publiés,
à notre connaissance, sur l'effet de la pression hydrostatique sur les activités métaboliques à
l'interface eau-sédiment en évitant toute perturbation des conditions de pression hydrostatique
(Jannasch, 1973; Cahet et al., 1990). Les conclusions de ces deux groupes sont d'ailleurs
opposées puisque Jannasch & Wirsen (1973) montrent que la décompression provoque une
surestimation de l'activité métabolique des bactéries benthiques, et que Cahet et al. (1990)
démontrent l'inverse. Nos résultats, ainsi que ceux obtenus par Picon (2000), montrent que la
décompression des échantillons d'eau proche du fond affecte la mesure de l'activité
microbienne en la surestimant jusqu'à un ordre de grandeur.
IV.2.2 Le compartiment sédimentaire
La majorité des études d'activité microbienne dans les sédiments a été réalisée sur des
sédiments mis en suspension (King & Berman, 1984; Mayer, 1989; Helmke & Weyland,
1991; Boetius & Lochte, 1994; Poremba & Hoppe, 1995; Talbot & Bianchi, 1997; Tholosan
& Bianchi, 1998; Tholosan et al., 1999). Cette technique sépare physiquement et
arbitrairement l'eau proche du fond du sédiment, et découpe la carotte prélevée en plusieurs
couches sédimentaires. Cette technique de mesure des activités microbiennes peut être
assujettie à des problèmes de reproductibilité. En effet, plusieurs critiques peuvent être
soulignées :
-
La séparation des phases liquide et solide de l'interface benthique est effectuée par
siphonnage de l'eau surnageante. Dans quelle phase doit-on inclure le "fluff" ? En fait,
c'est cette microcouche à très forte charge en particules qui constitue la véritable
interface entre les domaines benthique et pélagique.
-
Quel critère adopter pour définir les différents niveaux d'étude du sédiment ? Opter
pour la profondeur de changement de potentiel redox serait un choix objectif.
Cependant la grande variabilité de cette profondeur (de quelques mm dans les zones
eutrophes à une vingtaine de cm dans les zones oligotrophes) empêcherait toute
comparaison inter-zones.
-
La dilution du sédiment avec de l'eau proche du fond filtrée sur 0,2 µm (1/1, v/v)
détruit les micro-niches caractéristiques des milieux poreux. Les conditions
150
d'oxydoréduction qui régissent les échanges syntrophiques et les équilibres interspécifiques sont de ce fait quelque peu perturbées par rapport aux conditions in situ.
-
Ce type d'expérimentation ne peut être réalisé que sur des échantillons de sédiment
ramenés en surface et donc décomprimés.
Toutefois, malgré ces inconvénients cette démarche présente des avantages irremplaçables :
-
La mesure des activités microbiennes dans différentes couches de sédiment permet
d'estimer un flux d'activité à travers l'épaisseur sédimentaire et de suivre son évolution
au cours de l'enfouissement.
-
Enfin, seule cette technique permet de réaliser des cinétiques concentrations
fournissant les paramètres de Michaelis-Menten, Vmax et Km, indispensables pour
estimer les conditions d'utilisation des substrats par les microflores.
Une autre technologie respecte la structure physique du sédiment, et permet donc de se
rapprocher des conditions naturelles. Cette technique est moins utilisée (Meyer-Reil, 1986;
Meyer-Reil, 1987). Cet auteur a montré que les vitesses mesurées sur les suspensions de
sédiment sont, en moyenne, d'un ordre de grandeur plus élevées que celles provenant de
l'injection du substrat dans les sédiments intacts (Meyer-Reil, 1986). Toutefois, si l'approche
est élégante, elle n'est pas exempte de critiques :
-
Le substrat est injecté au sein de la carotte à l'aide d'une micro-seringue au travers du
tube de la carotte préalablement perforé de plusieurs points d'injection. La faible
porosité des sédiments marins profonds limite la diffusion homogène du substrat dans
la colonne sédimentaire (Meyer-Reil, 1986).
-
Cette diffusion, plus ou moins limitée autour de chaque point d'injection, provoque
différents gradients de concentrations en substrat. Ces différents gradients de
concentration provoquent des gradients de réactivité des peuplements microbiens,
rendant difficilement comparables les vitesses mesurées.
-
De plus, les vitesses mesurées se réfèrent à des sous-échantillons de sédiments dont la
concentration initiale ne peut être déterminée avec précision du fait de la mauvaise
répartition du substrat (Meyer-Reil, 1986).
Du fait de ces critiques, les mesures d'activité microbienne obtenues par l'injection de substrat
dans le sédiment intact paraissent tout aussi potentielles que celles obtenues sur des
suspensions de sédiments. Pour cela, nous avons opté pour cette dernière technique plus
couramment utilisée.
151
IV.3 Activités microbiennes dans l'épaisseur sédimentaire
Les mesures de respiration du 14C-glutamate (GR) et des activités aminopeptidasiques (EAA)
et phosphatidiques (PA) ont été réalisées tous les 2 cm entre 0 et 22 cm de profondeur dans le
Canyon Lacaze-Duthiers (mai 2000) à 920 m de profondeur, et à la station DYFAMED
(septembre 2000) à 2300 m de profondeur (Figure IV-6).
On peut remarquer que la variabilité des vitesses maximales mesurées dans le sédiment du
Canyon Lacaze-Duthiers apparaît plus importante que celle rencontrée dans le sédiment du
site DYFAMED. La topographie particulière des zones de canyon privilégie l'accumulation de
matière organique, souvent associée aux apports en particules détritiques par l'intermédiaire
des courants de fond (Buscail & Germain, 1997).
Au site DYFAMED, l'activité EAA est maximale dans les six premiers centimètres du
sédiment et diminue drastiquement en dessous. Dans le Canyon Lacaze-Duthiers, si l'activité
EAA ne diminue que lentement entre 0 et 8 cm, elle est quasi-nulle en dessous.
L'activité PA affiche des comportements tout à fait différents entre les deux sites. Le profil
dans le Canyon Lacaze-Duthiers est proche de celui de l'activité EAA mais avec des vitesses
maximales d'un ordre de grandeur plus élevées. A l'opposé dans le sédiment de la station
DYFAMED, l'activité PA est du même ordre de grandeur que l'activité EAA, avec un profil
similaire (avec un maximum d'activité pour la couche 2-4 cm). Tholosan & Bianchi (1998)
ont déjà signalé que l'activité aminopeptidasique dans la couche 2-4 cm pouvait être plus
élevée que dans la couche 0-2 cm, pourtant plus riche en élément nutritif. Dans cette couche
de surface, la flore microbienne est probablement régulée par les prédateurs comme les
nématodes qui peuvent constituer plus de 90 % de la méïofaune des régions sédimentaires
profondes (De Bovée et al., 1990).
La vitesse de respiration du
14
C-glutamate (GR) diminue drastiquement entre les quatre
premiers centimètres du sédiment. Dans le sédiment du site DYFAMED, en dessous de 6 cm
cette activité respiratoire est insignifiante, correspondant au minimum d'oxygène
classiquement rencontré dans le sédiment du site DYFAMED (Gehlen et al., 1997). Dans le
sédiment du Canyon Lacaze-Duthiers, cette activité hétérotrophe est perceptible jusqu'à 10 cm
de profondeur. D'ailleurs, à cette profondeur, la GR, moyennée sur 3 échantillons, augmente
significativement.
152
-1
0
-1
-1
µmol MUF l h
a)
pmol
100
14
-1
CO2 l h
200
300
400
500
0
2
2
4
4
6
6
8
10
12
100
200
300
400
500
0
0
Profondeur (cm)
Profondeur (cm)
0
-1
µmol MUF l h
14
-1 -1
pmol CO2 l h
b)
-1
8
10
12
14
14
GR
16
GR
16
PA
PA
EAA
EAA
18
18
20
20
0
10
20
30
µmol MCA l
40
-1
50
0
60
10
20
30
40
-1
-1
50
60
-1
µmol MCA l h
h
), d'activités
Figure IV-6. Profil des vitesses maximales de respiration du 14C-glutamate (GR,
) dans l'épaisseur sédimentaire (a) du Canyon
phosphatidique (PA,
) et aminopeptidasique (EAA,
Lacaze-Duthiers et (b) de la station DYFAMED. Valeurs moyennées (et barres d'erreurs) obtenues (a) au cours
de la campagne AMIBE (mai 2000) et (b) au cours de la campagne DYFABAC II (septembre 2000) sur des
échantillons sédimentaires découpés tous les 2 cm et dilués avec de l'eau proche du fond filtrée sur 0,2 µm
(dilution 1/1).
Le site du Canyon Lacaze-Duthiers est reconnu comme étant le siège d'une forte bioturbation
(De Bovée et al., 1990; Gerino, 1992). Cette importante bioturbation peut expliquer une
meilleure distribution de la matière organique dans la colonne sédimentaire. La décroissance
des activités microbiennes au fur et à mesure de l'enfouissement dans le sédiment est le
modèle le plus classiquement reporté dans la littérature (King, 1986; Meyer-Reil, 1987;
Mayer, 1989; Talbot & Bianchi, 1997; Tholosan & Bianchi, 1998). Toutefois, des profils
irréguliers montrant un pic d'activité d'ectoenzymes hydrolytiques au dessous de la couche
superficielle du sédiment ont été également reportés (Boetius & Lochte, 1994; Poremba &
Hoppe, 1995; Tholosan & Bianchi, 1998). Ce pic d'activités ectoenzymatiques peut être lié à
une diminution drastique de la matière organique facilement utilisable (et donc
potentiellement inhibitrice des activités hydrolytiques) en dessous la couche superficielle du
sédiment (Chrost, 1991; Boetius & Lochte, 1994). La forte activité de respiration du
153
14
C-
glutamate et les activités EAA et PA relativement faibles dans la couche superficielle du
sédiment corroborent cette hypothèse.
Le Tableau IV-7 reporte les valeurs des flux de respiration du 14C-glutamate (GR), ainsi que
des activités phosphatidique (PA) et aminopeptidasique (EAA) calculées par intégration
trapézoïdale des vitesses mesurées à travers les dix premiers centimètres d'épaisseur
sédimentaire dans le Canyon Lacaze-Duthiers (920 m) et à la station DYFAMED (2300 m).
Tableau IV-7. Flux potentiels de la respiration du 14C-glutamate (GR), des activités phosphatidiques (PA) et
aminopeptidasiques (EAA) à travers les dix premiers centimètres d'épaisseur sédimentaire dans le Canyon
Lacaze-Duthiers (mai 2000) et la station DYFAMED (septembre 2000).
GR
PA
EAA
µmol 14CO2 m-2 h-1 µmol MUF m-2 h-1 µmol MCA m-2 h-1
Canyon Lacaze-Duthiers
12
12003
1586
DYFAMED
5
776
2154
Les flux potentiels de GR et de PA sont plus importants dans le sédiment du Canyon LacazeDuthiers que dans le sédiment de la station DYFAMED, alors que la situation inverse est
observée pour les flux potentiels d'EAA. Ce n'est pas la quantité de matière organique qui
peut seule expliquer ces différences. En période non-exceptionnelle, la quantité de carbone
organique en surface est égale à environ 0,8 % dans le sédiment du Canyon Lacaze-Duthiers
(Buscail et al., 1990) et environ 0,6 % dans le sédiment de la station DYFAMED. Ainsi, nous
ne pouvons qu'émettre deux hypothèses pour expliciter cette forte activité phosphatidique
(PA) dans les sédiments du Canyon Lacaze-Duthiers :
-
Une différence de qualité de la matière organique entre les deux sites. Dans le Canyon
Lacaze-Duthiers, les composés de type phosphoester constitueraient une part plus
importante (ou plus bio-disponible) que les composés de type polypeptidique. Dans la
zone du Canyon Lacaze-Duthiers, la période de mars à mai est considérée comme
celle où les apports advectifs de matière organique fraîche sont accrus (Buscail et al.,
1990; Monaco et al., 1990a; Monaco et al., 1990b). La matière organique fraîche
constituerait donc un apport en matière organique bio-disponible de type phosphoester
favorisant les processus d'activités phosphatidiques. Koike & Nagata (1997) ainsi que
Hoppe & Ullrich (1999) ont montré que dans la colonne d'eau profonde les activités
phosphatidiques étaient exacerbées dans des zones caractérisées par une forte
productivité de surface et des taux de sédimentation importants.
154
-
Une activité PA réalisée par d'autres organismes que les bactéries. Dans la colonne
d'eau photique, les organismes responsables des activités PA sont les bactéries, le
phytoplancton et le zooplancton (Jansson et al., 1988). Les organismes de la
méïofaune pourraient développer comme les organismes zooplanctoniques des
activités ectophosphatidiques contribuant pour une part non-négligeable à l'activité PA
totale mesurée dans les sédiments. Le site du Canyon Lacaze-Duthiers étant
particulièrement riche en organismes de la méïofaune (De Bovée et al., 1990; Gerino,
1992), cette activité PA serait ainsi exacerbée par rapport au site DYFAMED.
A notre connaissance, peu d'études concernant l'activité PA dans les sédiments ont été
publiées (Marxsen & Schmidt, 1993; Coolen & Overmann, 2000). Nous avons pu obtenir une
seule référence publiant des vitesses de PA mesurées dans des sédiments profonds (Coolen &
Overmann, 2000). Les vitesses potentielles mesurées sur le site DYFAMED sont du même
ordre de grandeur que celles rapportées par ces auteurs pour des sédiments profonds en
Méditerranée, alors que celles que nous avons mesurées dans les sédiments du Canyon
Lacaze-Duthiers s'approchent des vitesses mesurées par Coolen et al. (2000), dans des
sédiment côtiers de la Mer des Wadden (Mer du Nord).
IV.4 Couplage pelagos-benthos
Les réactions biogéochimiques sédimentaires sont largement déterminées par les apports
particulaires provenant de la colonne d'eau océanique. La quantité de matière déposée à
l'interface eau-sédiment, mais aussi sa qualité (réactivité), jouent un rôle essentiel dans les
variations des réactions biogéochimiques dans le sédiment. Dans l'océan ouvert, les flux de
particules sont largement dominés par la composante biogène issus de la production de
surface (Pomeroy, 1974; Azam et al., 1983; Turley & Lochte, 1990; Turley et al., 1995;
Azam & Long, 2001).
Au cours de ce travail de thèse, c'est lors de la campagne d'automne 2000 sur le site
DYFAMED que nous avons pu effectuer l'étude couplée des activités microbiennes
intervenant dans la dégradation de la matière organique dans l'ensemble de la colonne d'eau
(WWC), l'eau proche du fond (NBW) et les sédiments (SED). Les prélèvements ont été
réalisés à l'aide de bouteilles Niskin et de l'HPSS dans la colonne d'eau et à l'aide d'un
carottier multitubes pour échantillonner l'eau proche du fond et le sédiment. Les mesures
d'activités réalisées conjointement dans ces différents compartiments sont la respiration du
14
C-glutamate (GR), l'activité phosphatidique (PA) et l'activité aminopeptidasique (EAA). La
155
Figure IV-7 présente les profils des vitesses maximales (Vmax) de ces différentes activités
mesurées sur des échantillons décomprimés. Les vitesses diminuent de la surface vers le fond,
avec un pic au niveau du minimum d'oxygène vers 400 m de profondeur, puis augmentent
dans l'eau proche du fond pour atteindre des valeurs sensiblement équivalentes à celles
mesurées dans les eaux de surface. En effet, à l'exception de la PA dont l'activité diminue
quelque peu dans l'eau proche du fond par rapport à la mesure réalisée à 2000 m, les vitesses
de la GR et l'EAA augmentent d'environ 500 et 10 fois respectivement entre les mesures
réalisées à 2000 m et celles réalisées dans l'eau proche du fond. Dans le sédiment, les vitesses
mesurées sont exacerbées étant 220 fois supérieures pour GR, 12000 fois supérieures pour PA
et 19000 fois supérieures pour EEA par rapport à leurs homologues dans l'eau surnageante.
Toutefois, toutes ces estimations sont attachées d'artefacts puisqu'on a vu que, du fait de la
décompression, les mesures d'activités dans la colonne d'eau profonde étaient sous-estimées
d'un facteur moyen égal à 3,86 ± 6,47 (cf. paragraphe III.6), que les mesures dans la NBW
semblaient surestimées d'un facteur pouvant être égal à 10 (cf. paragraphe IV.2.1) et que, dans
l'état actuel des connaissances, rien ne nous permettait de conclure quant à l'effet de
décompression sur les activités métaboliques microbiennes dans les sédiments.
156
a)
Profondeur (cm)
0
200
pmol
14
CO2 l
400
-1
h
b)
-1
600
800
1000
0
pmol MUF l
500
1000
1500
-1
h
c)
-1
2000
2500
3000
3500
0
0
0
0
200
200
200
400
400
400
600
600
600
800
800
800
1000
1000
1000
1200
1200
1200
GR
1400
1600
1600
1600
1800
1800
1800
2000
2000
2000
2200
2200
2200
nmol 14CO2 l-1 h-1
Profondeur (cm)
0
100
150
200
250
1000
1500
µmol MUF l-1 h-1
300
350
h
2000
-1
2500
3000
400
0
4
8
12
3500
EAA
1400
50
500
-1
PA
1400
0
pmol MCA l
µmol MCA l-1 h-1
16
20
0
0
0
4
4
4
8
8
8
12
12
12
16
16
16
10
20
30
40
50
60
Figure IV-7. Profils des vitesses maximales (a) de la respiration du 14C-glutamate (GR,
), (b) de l'activité phosphatidique (PA,
) et (c) de l'activité
aminopeptidasique (EAA,
) dans la colonne d'eau
, dans l'eau proche du fond
, et dans les sédiments
au site DYFAMED en septembre 2000. Notez le
changement d'échelle entre les vitesses maximales mesurées dans la colonne d'eau et l'eau proche du fond et dans les sédiments.
Pour pouvoir estimer le rôle des activités microbiennes dans les différents systèmes
océaniques, il est nécessaire de calculer les flux de matière résultant de ces processus dans
chaque compartiment. Le Tableau IV-8 rappelle les valeurs intégrées des flux potentiels des
activités GR, PA et EAA dans chacun des compartiments (colonne d'eau – WWC, eaux
proches du fond – NBW et sédiments – SED).
Tableau IV-8. Flux potentiels de respiration du 14C-glutamate, de l'activité phosphatidique et de l'activité
aminopeptidasique dans la colonne d'eau (WWC), dans l'eau proche du fond (NBW) et les sédiments (SED) au
site DYFAMED en septembre 2000. DEC : flux potentiels estimés sur des échantillons décomprimés; HP : flux
potentiels estimés sur des échantillons maintenus à pression ambiante.
Respiration du
14
C-glutamate
Phosphatase
Aminopeptidase
µmol m-2 h-1
WWC : 10Æ 200 m
10
239
196
WWC : 200Æ 1000 m
4
533
181
WWC : 1000Æ 2000 m (DEC)
16
1611
730
WWC : 1000Æ 2000 m (HP)
42
3212
1623
NBW*
9
12
15
SED (0-10 cm)
5
776
2154
Total (DEC)
44
3171
3276
Total (HP)
70
4772
4169
* avec comme hypothèse une épaisseur de l'eau proche du fond égale à 10 m.
Si on considère les mesures estimées uniquement sur des échantillons décomprimés (DEC),
on constate que le compartiment benthique (NBW+SED) contribuerait, potentiellement, pour
32 % à la minéralisation du 14C-glutamate, pour 25 % de l'hydrolyse de phosphoesters et pour
66 % de l'hydrolyse des aminopeptides. Alors que pour la minéralisation du 14C-glutamate, les
flux théoriques apparaissent du même ordre de grandeur entre les sédiments et l'eau proche du
fond, les activités ectoenzymatiques dans les sédiments sont 65 fois pour PA et 140 fois pour
EAA plus importants dans le sédiment que dans l'eau proche du fond. Le couplage entre les
activités ectoenzymatiques et la respiration du
14
C-glutamate apparaît plus étroit dans l'eau
proche du fond que dans le sédiment. Ainsi, si la colonne d'eau profonde doit être prise en
compte dans l'estimation des flux de minéralisation, le compartiment sédimentaire ne peut
être négligé, d'autant plus que les flux estimés dans le compartiment benthique sont
probablement plus proches des flux réels que ceux obtenus pour la colonne d'eau. En effet,
pour les différentes activités mesurées, les concentrations en substrat ajoutées aux
158
échantillons d'origine benthique sont en concentrations traces par rapport aux concentrations
naturelles (cf. paragraphe IV.1.1.3). Par contre,
l'ultraoligotrophie et l'importance de la
fraction organique non-chimiquement définie dans le domaine pélagique profond nous
contraignent, pour l'instant, à la mesure de la Vmax, bien définie du point de vue cinétique,
mais seulement potentielle.
On dispose maintenant de suffisamment de données expérimentales pour affirmer que la
décompression des échantillons d'eau profonde affecte la mesure des activités métaboliques
des microflores pélagiques (Bianchi et al., soumis-a). Malheureusement, il nous est difficile
de conclure aussi nettement quant à l'effet de la décompression sur la mesure des activités
microbiennes à l'interface eau-sédiment. Toutefois, si on tient compte de nos résultats
préliminaires ainsi que ceux obtenus par Picon (2000), les activités mesurées classiquement
sur des échantillons décomprimés seraient sur-estimées par rapport à celles réellement
exercées à l'interface benthique profonde. Les valeurs précisées dans le Tableau IV-8 pour
l'eau proche du fond (NBW) correspondraient donc à des valeurs hautes par rapport à celle
réellement exercées in situ. Par contre, nous ne disposons d'aucune donnée expérimentale
permettant d'estimer quels sont les effets de la décompression des échantillons de sédiments
profonds sur la mesure des activités microbiennes dans les dépôts sédimentaires récents. Un
effort ultérieur devra donc être conduit dans l'étude des processus de minéralisation dans l'eau
proche du fond et les sédiments profonds.
159
160
Chapitre V
ESSAIS COMPLEMENTAIRES ET
PERSPECTIVES
Chapitre V – Essais complémentaires et perspectives
V. ESSAIS COMPLEMENTAIRES ET PERSPECTIVES
V.1 Simulation de la chute de particules
Le domaine océanique profond est essentiellement alimenté par la chute des particules.
Cependant, les différents engins de prélèvement, que ce soient les bouteilles Niskin classiques
ou les bouteilles hyperbares, ne permettent pas de collecter les particules en cours de chute.
Les activités microbiennes mesurées sur les échantillons d'eau concernent donc
essentiellement les bactéries libres dans les masses d'eau. De ce fait, même s'il est bien connu
que les bactéries pélagiques colonisent les diatomées vivantes (Smith et al., 1995), les détritus
"frais" de diatomées (Biddanda & Benner, 1997), les phyto-agrégats de neige marine (Smith
et al., 1992) et d'une manière générale toutes les particules organiques en cours de chute
(Azam & Long, 2001; Kiørboe & Jackson, 2001) en exprimant de fortes activités
d'ectoenzymes hydrolytiques (protéase, α- et β-glucosidase, alkaline phosphatase, lipase et
chitinase), nos connaissances sur les activités exercées in situ par les microflores associées
aux particules sont limitées.
Les bactéries qui sont transportées par attachement ou incorporation à ces particules (Turley
& Mackie, 1995) subissent des variations de pression hydrostatique qui influenceraient leur
comportement au cours de leur chute à travers la colonne d'eau (Turley, 1993). Cependant, à
notre connaissance, aucune étude ne prouve ou infirme la possibilité d'adaptation progressive
de la microflore en réponse à cette augmentation de pression. La réponse de ces organismes à
ce stress physiologique va conditionner à la fois :
1) la vitesse de dégradation du matériel particulaire, (i.e. évolution vers les formes
dissoutes et colloïdales et minéralisation proprement dite),
2) l'évolution de la diversité spécifique, et donc physiologique et fonctionnelle, des
microflores qui colonisent les particules, et à terme,
3) la diversité taxonomique et les potentialités de reminéralisation des microflores du
domaine benthique, en particulier dans le fluff, qui est le système présentant les plus
fortes concentrations bactériennes et les vitesses instantanées d'hydrolyse et de
reminéralisation les plus élevées de l'ensemble du domaine océanique.
161
Les diatomées dominent les blooms phytoplanctoniques dans les Océans et jouent un rôle
essentiel dans la pompe biologique de CO2 (Nelson et al., 1995) et la sédimentation du
matériel siliceux est un important convoyeur de carbone organique vers les eaux profondes et
le sédiment (Tréguer et al., 1995). Tréguer et al. (1995) montrent qu'un atome de silice est
recyclé 39 fois avant d'être enfouis dans les sédiments profonds. La dissolution de la silice
biogène qui intervient dans la couche de surface et dans la colonne d'eau est actuellement très
mal connue. Si la température de l'environnement, le broutage par le zooplancton et
l'agrégation des diatomées jouent un rôle certain dans la dissolution de la silice (Tréguer et
al., 1989; Nelson et al., 1995; Dugdale & Wilkerson, 1998), il semble clair que les eubactéries
(et probablement les archaebactéries) jouent un rôle majeur dans le contrôle de cette
dissolution (Bidle & Azam, 1999; Bidle & Azam, 2001) en colonisant et en dégradant par des
processus ectoprotéolytiques la matrice organique des frustules des diatomées. Il est important
de comprendre quel est le rôle des processus microbiens impliqués dans la régénération de la
silice qui contrôle ainsi la productivité des diatomées et le sort de la silice et du carbone de
dans les océans (Bidle & Azam, 1999).
Bidle & Azam (1999, 2001) ont testé l'action d'assemblages naturels de bactéries pélagiques
marines sur la lyse de la gangue protéique des frustules de diatomées mortes. Leur attention
s'est portée sur des diatomées mortes parce que une fraction substantielle de la productivité
des diatomées, en particulier après un bloom, peut échapper au broutage et subit une lyse
cellulaire en réponse à des stress physiologiques (Berges & Falkowski, 1998). Les cellules
phytoplanctoniques mortes qui ont tendance à s'agréger chutent dans la colonne d'eau,
exportant le carbone de la surface vers le fond des océans (Alldredge et al., 1995). Nous
avons montré que l'activité des bactéries est tributaire de la pression ambiante, ce facteur
peut-être critique dans le cas des organismes soumis à des variations importantes de pression
hydrostatique du fait de la chute rapide dans la colonne d'eau. Ainsi, nous avons réitéré
l'expérimentation de Bidle & Azam (1999), mais en simulant la chute de diatomées mortes le
long de la colonne d'eau à l'aide des bouteilles hyperbares de 500 ml. Par ces essais
préliminaires, nous tentons d'appréhender l'effet de l'augmentation de la pression
hydrostatique sur les activités ectohydrolytiques des bactéries colonisant des diatomées lysées
en cours de chute.
Cette étude a été réalisée grâce à une étroite collaboration au sein du Centre d'Océanologie de
Marseille : Beatriz Beker pour la culture des diatomées, Gérald Grégori pour le comptage des
162
diatomées et des bactéries à l'aide du cytomètre en flux, Karine Leblanc pour les analyses des
silicates et Dominique Lefèvre pour le dosage de l'oxygène.
V.1.1 Matériel & Méthodes
V.1.1.1 Croissance, maintenance des diatomées et préparation des lysats
Une culture axénique de Thalassiosira weissflogii (CCMP1336) a été obtenue du ProvasoliGuillard National Center for Culture of Marine Phytoplankton (West Boothbay Harbor,
Maine, USA). Une fraction de cette culture a été cultivée dans un milieu liquide minimum f/2
(Guillard, 1975). Les échantillons sont récupérés dans plusieurs tubes à centrifuger stériles,
les culots de centrifufation sont réunis dans un tube et les diatomées sont re-suspendues dans
de l'eau de mer filtrée (0,2 µm) et bouillie. A partir de cette suspension cellulaire, le lysat frais
de diatomées est obtenu en réalisant 7 cycles consécutifs de congélation rapide (neige
carbonique/bain d'éthanol) et de chauffage dans un bain thermostaté à 55°C (Bidle & Azam,
2001). Ce lysat de diatomées est congelé à –20°C jusqu'à utilisation. L'analyse par cytométrie
en flux nous a permis de vérifier l'intégrité membranaire des cellules des diatomées.
V.1.1.2 Procédure expérimentale
Les diatomées ont été ajoutées à 500 ml d'eau de mer (fraîchement prélevée au large de
Marseille sous la couche photique à 200 m de profondeur) pour obtenir 400 µg C l-1 POC
(choisie pour simuler une sénescence d'un bloom de diatomées) et incubée à température in
situ (13°C) dans des bouteilles hyperbares (HPSU). Deux cultures ont été suivies de manière
concomitante, une où la pression était maintenue à pression atmosphérique (ATM) et l'autre
où la pression hydrostatique était augmentée de 1,5 MPa par jour (HP) simulant une chute des
particules à la vitesse de 150 m par jour. Des sous-échantillons ont été prélevés à J0, J4 (4
jours) et J8 (8 jours) pour réaliser les mesures de l'activité aminopeptidasique (EAA), le
dosage des silicates (Si(OH)4) et le comptage des cellules bactériennes.
L'activité aminopeptidasique (EAA) a été mesurée en utilisant le substrat fluorescent MCALeucine à une concentration finale égale à 100 µM. Cinquante millilitres de la culture
principale ont été transférés dans des bouteilles HPSU à pression atmosphérique pour
l'échantillon ATM, et à la pression correspondante au jour du prélèvement (soit à 2 MPa à J0,
à 8 MPa à J4 et à14 MPa à J8) et incubés à température in situ et maintenu à la pression de
prélèvement pour l'échantillon HP. Le devenir de la MCA-Leu a été suivi au cours du temps
comme décrit précédemment sur une période d'incubation d'environ 4 heures.
163
La concentration en acide orthosilicilique (Si(OH)4) a été analysée par la technique de
colorimétrie décrite par Strickland & Parsons (1972) et modifiée par Brzezinski & Nelson
(1986) et mesurée à l'aide d'un spectrofluorimètre CECIL (CE 1011) avec une limite de
détection de 50 nM. Pour le dosage du Si particulaire, 20 ml de sous-échantillon sont filtrés
sur une membrane de 0,6 µm de porosité et de 47 mm de diamètre (Nuclepore). La silice
biogénique (BSi) a été mesurée en utilisant la technique de digestion avec du NaOH chaud
pendant 45 min. comme décrit par (Nelson et al., 1989). La précision de la méthode était de
0,008 µmol l-1 et la limite de détection égale à 0,010 µmol l-1.
Pour le comptage des cellules bactériennes, 4,5 ml de sous-échantillon sont fixés par 0,5 ml
de paraformaldéhyde 20 % puis analysés au cytomètre en flux.
La mesure de la concentration en oxygène en début et fin de manipulation nous a permis de
vérifier la stabilité oxique de la culture.
V.1.2 Résultats et discussion
La Figure V-1 résume les résultats que nous avons obtenus au cours de cette première
expérience. Les histogrammes représentent les activités aminopeptidasiques (EAA)
spécifiques par cellule bactérienne estimée sur un échantillon incubé à pression
atmosphérique (ATM) et sur un échantillon où la pression atmosphérique croît de 1,5 MPa par
jour. Les courbes présentent l'évolution de la concentration en Si(OH)4 au cours de
l'expérimentation.
Les bactéries s'adaptent à l'apport massif en matière organique en stimulant leur activité EAA
plus rapidement lorsque l'incubation est réalisée à pression atmosphérique que lorsqu'on
simule une chute des particules. En effet, l'EAA passe de 10 à 509 amol cell-1 h-1 en 8 jours
lorsque la culture était incubée à pression atmosphérique et passe de 6 à 311 amol cell-1 h-1 en
8 jours lorsque la culture est soumise à une pression hydrostatique croissante. De même, la
dissolution de la silice est plus rapide sur un échantillon maintenu à pression atmosphérique
(passant d'une concentration en Si(OH)4 de 12,0 à 17,5 µM) que lorsque la pression
hydrostatique augmente (la concentration en Si(OH)4 passe de 13,8 à 19,3 µm).
164
500
25
ATM
20
HP
400
15
300
10
200
[Si(OH)4] (µM)
Vitesse d'hydrolyse (amol cell-1 h-1)
600
5
100
0
0
J0
J4
J8
Temps (d)
Figure V-1. Vitesses d'hydrolyse aminopeptidasique par cellule microbienne et concentration en Si(OH)4
mesurées au cours d'une incubation de 8 jours d'un assemblage bactérien naturel prélevé à 200 m de profondeur
au large de Marseille en présence de détritus de T. weissflogii. Les activités aminopeptidasiques (exprimées en
amol cell-1 h-1) ont été mesurées à pression atmosphérique (ATM,
) et sous pression hydrostatique (HP,
)
égal à 2, 8 et 14 MPa à J0, J4 et J8 respectivement (simulant ainsi une chute du matériel particulaire égale à 150 m
par jour).
Les activités estimées sur les échantillons incubés à pression atmosphérique sont proches de
celles mesurées par Bidle & Azam (1999, 2001). Ces auteurs estiment que la dissolution
réalisée par les bactéries génèrerait 40 à 73 % de silice à partir de T. weissflogii en supposant
une vitesse de chute égale à 1 m d-1 (Smayda, 1970). Toutefois, cet auteur donne comme
vitesse de sédimentation une fourchette allant de 1 m d-1 à 510 m d-1. Les données de la
littérature sont ambiguës quant à la vitesse de chute des cellules phytoplanctoniques. Par
exemple, Shanks & Trent (1980) donnent une vitesse de chute pour la neige marine variant
entre 43 et 95 m d-1 (moyenne égale à 68 m d-1) alors que Mccave (1975) donne une vitesse de
chute de 105 m d-1, Kajihara (1971 in Shanks & Trent, 1980) de 185 m d-1, Alldredge (1979)
de 90 m d-1. La vitesse de chute que nous avons choisie (150 m d-1), bien que relativement
élevée, n'est donc pas irréaliste. Cette première expérimentation montre que l'augmentation de
la pression hydrostatique a une influence sur l'activité ectoenzymatique des bactéries qui
chutent le long de la colonne d'eau. On ne peut donc négliger l'impact de ce paramètre lors de
la mesure des activités des bactéries attachées aux particules. En effet, ces activités seraient
les premières responsables de la dissolution de la matière organique en cours de chute (Azam
165
& Long, 2001; Kiørboe & Jackson, 2001) et constitueraient ainsi les premiers vecteurs de
transition de la matière organique particulaire (POM) en matière organique dissoute (DOM).
De tels processus constituent une étape majeure dans le fonctionnement de l'Océan global
d'une part car les apports particulaires sont la principale source de matière organique pour le
domaine profond, et d'autre part, par l'importance de leurs interventions dans les cycles
d'éléments biogènes tels que la silice et les carbonates.
Le dispositif de simulation de chute des particules mis au point pour réaliser cet essai
préliminaire suggère une stratégie originale qui devrait permettre une estimation de ces
différents flux de minéralisation et de dissolution des particules lors de leur chute à travers
l'ensemble de la colonne d'eau.
V.2 Activités aminopeptidasiques mesurées à l'aide de la LYApeptides
V.2.1 Introduction
Actuellement, l'activité ectoprotéolytique est classiquement quantifiée en suivant le devenir
de la MCA-Leucine. Cet analogue peptidique est compétitif des protéines et des polypeptides
(Chrost, 1991). L'hydrolyse de la liaison peptidique MCA-Leu est mesurée par
spectrofluorimétrie, en suivant l'augmentation de fluorescence provoquée par la libération du
fluorochrome MCA lors de la rupture de la liaison peptidique MCA-Leu.
Pantoja et al. (Pantoja et al., 1997; Pantoja & Lee, 1999) ont présenté une nouvelle approche
pour étudier l'effet de la structure et de la taille du substrat analogue sur l'hydrolyse
peptidique. Cette technique est basée sur l’utilisation de polypeptides (poly-alanines ou
leucines) représentatifs des protéines naturelles, comportant un fluorochrome en position Nterminal (LYA - Lucifer Yellow Anhydride). Elle a été mise au point sur l'eau et les
sédiments d'un marécage (Flax Pond, Long Island, NY, US). Nous avons testé les possibilités
d'application de cette technique à l'étude du domaine pélagique, car elle présentait, au moins
d'un point de vue théorique, des avantages et des perspectives enthousiasmantes :
-
Pantoja & Lee (1999) ont démontré que les peptides contenant plus de 2 acides aminés
sont hydrolysés de 10 à 400 fois plus rapidement que les dipeptides ou que le substrat
fluorescent MCA-Leucine. Ce résultat semble cohérent avec le fait que les bactéries
transportent facilement à travers leur membrane des composés d'un poids inférieur à
600 daltons (Nikaido & Vaara, 1985); les dipeptides ayant un poids moléculaire
166
inférieur à 600 D, les systèmes enzymatiques microbiens sont moins adaptés à
dépenser de l'énergie pour scinder de tels composés qui transiteraient directement à
travers leur membrane cellulaire.
-
Par rapport aux mesures effectuées au moyen de la MCA-Leu, les vitesses d'hydrolyse
mesurées au moyen de la LYA-peptides apparaissent plus rapides et les concentrations
en substrat ajouté (Pantoja et al., 1997; Pantoja & Lee, 1999) étant faibles (autour de
0,15 µM avec possibilité de réduire encore cette concentration) on pouvait présager
une plus grande sensibilité de cette nouvelle technique par rapport à celle utilisant de
la MCA-Leu.
-
Les produits de l’hydrolyse de la LYA-Ala4 sont séparés par HPLC et dosés par
détection UV : on a ainsi la possibilité de suivre simultanément la consommation du
substrat et l'apparition de ses produits d'hydrolyse.
-
Enfin, il est théoriquement possible de greffer à la molécule fluorescente LYA
n'importe quel acide aminé ou polypeptide. On peut donc envisager de greffer la LYA
des peptides contenant des acides aminés radioactifs (14C-glutamate, par exemple) ce
qui permettrait de déterminer, à partir d'un seul substrat de départ, les vitesses
d'hydrolyse des macromolécules et les vitesses d'incorporation et de respiration des
monomères résultant de cette hydrolyse. La mesure couplée de l'assimilation et de la
respiration des produits d'hydrolyse d'un substrat d'analogues peptidiques radioactifs
s'effectuerait en condition simulant les étapes de dégradation réalisés in situ
permettant ainsi une estimation des vitesses réelles d'incorporation et de respiration
des composés de faibles poids moléculaires.
V.2.2 Matériel & Méthodes
V.2.2.1 Synthèse des analogues peptidiques et purification
L'apprentissage du protocole de synthèse, et la synthèse des analogues LYA-peptides ont été
réalisés dans le laboratoire du Professeur Cindy Lee (Marine Organic Geochemistry
Department, Stony Brook, NY, USA). Quatre analogues peptidiques ont ainsi pu être
synthétisés : LYA–ala, LYA-ala2, LYA-ala3 et LYA-ala4. Ces dérivés fluorescents ont été
synthétisés suivant la procédure d'imidization de Stewart (Stewart, 1981) modifiée par Pantoja
et al. (Pantoja et al., 1997). Brièvement, la fonction amine N-terminale du peptide (ou de
l'acide aminé) est condensée avec le Lucifer Yellow Anhydride (LYA : 4-amino-3,6-disulfo1,8-naphtalic anhydride, Sigma-Aldrich) dans un tampon aqueux d'acétate (Lithium Acétate,
167
1M) en reflux à pH 5 et à 105°C. Les progrès de la réaction d'imidization sont suivis par
analyse HPLC (Shimadzu 10AS HPLC avec un fluorimètre Shimadzu RF-551 avec comme
longueur d'onde d'excitation 424 nm et longueur d'onde d'émission 470 nm).
Les produits de la réaction finale sont purifiés par HPLC en utilisant une colonne (C18) de
chromatographie en phase inverse avec 0,1 % TFA-eau et 0,1 % TFA-Acétronitrile, avec un
gradient de solvants organiques jusqu'à 25 % en 40 min à 1,2 ml min-1 jusqu'à apparition
d'une bande jaune montrant la fluorescence des dérivés élués. Les fractions sont re-analysées
par HPLC pour vérifier l'obtention d'un unique pic d'absorbance. Une colonne C18
Ultrasphère-ODS 5µm (25 cm × 4,6 mm) est utilisée avec une phase mobile de 0,05 M de
KH2PO4 (pH 4,5) et de méthanol (1 ml min-1). Le gradient de méthanol utilisé est de 0 à 25 %
de méthanol en 25 min, puis 25 à 50 % en 5 min.
Les dérivés LYA-Alax ainsi synthétisés sont quantifiés par rapport aux standards existants. Ils
ont été ensuite lyophilisés pour être transportés jusqu'en France.
V.2.2.2 Quantification et calibration
Le protocole d’analyse a été mis en application au LMM sur un HPLC de type Waters 1525.
Les analogues peptidiques sont détectés par un détecteur d'absorbance UV à 272 nm (Waters
474). Une colonne C18 de type Symetry (150 × 4,6 mm) de 5 µm est utilisée à 37 °C avec une
phase mobile de 0,05 M de KH2PO4 (pH 4,5) et de méthanol (1 ml min-1) pour séparer les
analogues-LYA. Les différents analogues-LYA fluorescent à la même longueur d'onde (424
nm d'excitation et 550 nm d'émission) mais présentent des temps de rétention différents.
Le temps d’analyse a été réduit à 18 minutes ; le gradient d’élution utilisé est reporté dans le
Tableau V-1.
Tableau V-1: Gradient d'élution utilisé pour l'analyse des dérivés peptidiques LYA-Alax.
Flux
Temps
%
%
(ml mn-1)
(mn)
MeOH
KH2PO4
1
0
12
88
1
0,1
12
88
1
6
30
70
1
8,5
100
0
1
12
100
0
1
16
12
88
1
18
12
88
168
Les temps de rétention des différents analogues ont pu être déterminés comme suit (Figure
-
LYA-ala = 3,2 mn,
-
LYA-ala3 = 3,5 mn,
-
LYA-ala4 = 3,9 mn.
LYA-ala
LYA-ala4
LYA-ala2 = 2,6 mn,
LYA-ala2
-
LYA-ala3
V-2) :
Figure V-2 : Chromatographe représentant les pics des analogues peptidiques et leur temps de rétention.
Des courbes de calibration pour le substrat d'hydrolyse (LYA-Ala4) et pour le principal
produit d'hydrolyse (LYA-Ala2) ont été réalisées pour leur quantification.
-
Pour le composé LYA-Ala4 : Aire du pic = 6,98.102 [LYA-Ala4] + 1,34. 10-4 (R2=0,987),
-
Pour le composé LYA-Ala2 : Aire du pic = 9,25.102 [LYA-Ala2] + 2,85. 103 (R2=0,977).
Le seuil de détection pour les LYA-Alax est de 6 nM avec une boucle d’injection de 200 µl.
V.2.2.3 Hydrolyse peptidique en eau de mer oligotrophe
Des essais préliminaires ont été réalisés sur des profils verticaux (de la surface jusqu'à
2000 m) en mer Méditerranée (station DYFAMED, 28 MN au SE de Nice). Les
concentrations choisies en LYA-Ala4 ont été calquées sur celles utilisées pour la MCA-Leu
c'est-à-dire entre 0,05 et 5 µM (concentrations finales). Malheureusement, après plus de
24 heures d'incubation aucune hydrolyse de la LYA-Ala4 n'a été détectée.
169
Lors de la campagne LYSE effectuée dans la zone de rejet du grand émissaire urbain
marseillais, une stratégie d'échantillonnage a été définie selon un gradient eutropheoligotrophe (Figure V-3) pour évaluer l'effet de la concentration en matériel organique sur
l'activité ectoenzymatique mesurée à l'aide de la LYA-Ala4. Les résultats seront comparés aux
mesures effectuées à l'aide de la MCA-Leucine. Le point A, localisé derrière l’île Plane, est
considéré comme le point plus oligotrophe (étant protégé du panache du rejet) ; le point C',
très proche de l’émissaire correspond à la station la plus eutrophe. Les point B et B' sont,
selon les conditions météorologiques, situés à l'intérieur ou à l'extérieur du panache ou au
niveau du front de la nappe.
Figure V-3 : Stations de prélèvements choisies lors de la campagne LYSE (janvier 2002) et positionnement de la
nappe de pollution provoquée par le rejet du grand émissaire urbain marseillais dans la Calanque de Cortiou.
V.2.2.4 Protocole
Le substrat LYA-Ala4 est ajouté à 20 ml d'échantillon d'eau de mer (prélevé à 5 m de
profondeur) placé dans un flacon en polypropylène de 50 ml selon la méthode
multiconcentration (Wright & Hobbie, 1966) avec des concentrations finales en LYA-Ala4
variant de 0,05 à 5 µM, ou selon la méthode cinétique temps avec la concentration finale de
0,15 µM utilisée par les auteurs qui ont mis au point la méthode (Pantoja et al., 1997; Pantoja
& Lee, 1999; Kuznetsova & Lee, 2001).
Les échantillons sont incubés dans le noir à
température in situ (13°C). Des sous-échantillons d'environ 1 ml sont prélevés au cours du
170
temps, filtrés sur 0,2 µM et immédiatement congelés à –20°C jusqu'à analyse au laboratoire.
La diminution de la LYA-Ala4 et l'augmentation concomitante de la LYA-Ala2 sont analysées
par HPLC comme décrit précédemment.
La vitesse d'hydrolyse de la LYA-Ala4 est mesurée en suivant la décroissance de la LYA-Ala4
au cours du temps. Ce calcul prend en compte le temps de latence éventuel.
V.2.3.1 Détermination des paramètres cinétiques
Les échantillons des trois stations A, B et C ont été étudiés en ajoutant des concentrations de
LYA-Ala4 de 0,05, 0,15, 1,00, 2,50 et 5,00 µM. Pour les stations A et B, il n'est pas possible
de doser la diminution de LYA-Ala4 au cours du temps pour des concentrations supérieures à
1 µM. La Figure V-4 montre que dans ces eaux peu riches en matière organique, à la
concentration de 1 µM, la diminution de la LYA-Ala4 n'est pas décelable au cours du temps,
alors que l'augmentation de la LYA-Ala2 est non ambiguë. L'hydrolyse de la LYA-Ala4
s'effectue, puisque de la LYA-Ala2 apparaît, mais la méthodologie analytique ne permet pas
de la quantifier. La LYA-Ala2, n'étant pas le seul produit d'hydrolyse, il n'est pas possible de
calculer une vitesse d'hydrolyse de la LYA-Ala4 à partir du dosage de la LYA-Ala2.
1400
50
45
1200
10 00
35
30
800
25
600
20
15
400
[LYA-Ala2] (nM)
[LYA-Ala4] (nM)
40
10
200
5
0
0
0
5
10
15
20
Temps (h)
25
30
35
Figure V-4 : Hydrolyse de la LYA-Ala4 à la station B pour une concentration supérieure à 1000 nM le 26/01/02.
LYA-Ala4 ;
LYA-Ala2.
171
La Figure V-5 présente les vitesses d'hydrolyse mesurées à la station proche de la sortie de
l'émissaire (station C) en fonction des concentrations en LYA-Ala4. Ce graphe montre que
dans cette gamme de concentrations, l'hydrolyse de la LYA-Ala4 ne correspond pas à un
modèle de type Michaëlis-Menten. Comme pour le substrat analogue MCA-Leu, il pourrait
exister un modèle de cinétique multiphasique (Talbot & Bianchi, 1997; Tholosan et al., 1999;
Unanue et al., 1999). Dans un milieu aussi eutrophe que la sortie d'un émissaire urbain, il
conviendrait d'utiliser une gamme de concentration plus étendue jusqu'à 400 µM, comme
celle utilisée pour la MCA-Leu. Cependant, on peut craindre que la technique analytique ne
permette pas de quantifier la décroissance de la LYA-Ala4 au cours du temps pour des
concentrations trop élevées.
LYA-Ala4 hydrolysée (nM/h)
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0
1
2
3
4
5
6
[LYA-Ala4] (µM)
Figure V-5 : Cinétique concentration à la station la plus proche de l'émissaire de Cortiou (station C le 26/01/02).
V.2.3.2 Hydrolyse de la LYA-Ala4 selon les conditions trophiques
Les figures V-6a, V-6b et V-6c présentent le type de courbe que nous avons obtenu lors de la
campagne LYSE sur des échantillons prélevés à la station eutrophe (station C, près de
l'émissaire de Cortiou), à la station intermédiaire (station B) et à la station oligotrophe (station
A). Nous reportons sur ces figures la décroissance du substrat fourni (LYA-Ala4), et
l'apparition de son principal produit d'hydrolyse (LYA-Ala2) au cours du temps pour une
concentration d'environ 0,15 µM (Pantoja et al., 1997; Pantoja & Lee, 1999).
Concernant la décroissance de la LYA-Ala4, aucun temps de latence n'est observé à la station
eutrophe C, par contre on observe un temps de latence de plus de 15 heures à la station B, et
de plus de 20 heures à la station la plus oligotrophe A. Kuznetsova & Lee (2001) ont
également observé un temps de latence lorsqu'elles utilisent le substrat LYA-Ala4 pour
172
comparer la capacité d'hydrolyse peptidique entre la micro-couche de surface air-mer (ML) et
l'eau de mer directement sous-jacente (SS) (Kuznetsova & Lee, 2001). Ces travaux, réalisés
en zone mésotrophe (sortie du port de Stony Brook, Long Island, NY, US), font suite à ceux
de Pantoja et al. (1997) et Pantoja & Lee (1999) qui étaient réalisés sur un milieu marécageux
très eutrophe (Flax Ponds, Long Island, NY, US) où la présence d'un temps de latence n'était
qu'exceptionnelle. L'hydrolyse de la LYA-Ala4 est toujours plus lente et le temps de latence
observé (5 – 12 h) est en général plus long, dans les échantillons de sub-surface (SS), que
dans la micro-couche de surface (ML). Parallèlement, l'analyse des acides aminés totaux
hydrolysables (THAA) montre que cette couche de surface est enrichie, d'un facteur 5 à 20,
par rapport à la sub-surface. En d'autres termes, l'eau de surface est plus pauvre en substrats
hydrolysables, les vitesses d'hydrolyse de la LYA-Ala4 sont plus faibles et les temps de
latence plus sont longs que dans la micro-couche de surface. Nos résultats, obtenus dans une
zone encore plus oligotrophe, sont donc en parfaite concordance avec ceux observés par
Kuznetsova & Lee (2001).
Aux mêmes stations, et le même jour, des mesures d'hydrolyse de la MCA-Leu ont été
effectuées suivant la méthode de cinétique multiconcentrations. Les concentrations ajoutées
variant entre 0,5 et 400 µM ont permis de déterminer les paramètres cinétiques Michaëliens
(Vmax et Km). Ces paramètres cinétiques permettent d'estimer la vitesse instantanée de la
MCA-Leu à partir d'une concentration théorique en substrat. Ainsi, il nous est possible de
comparer la vitesse d'hydrolyse ectoenzymatique mesurée à l'aide de la LYA-Ala4 avec une
concentration de 0,15 µM, et celle estimée pour la MCA-Leu à cette même concentration
(Tableau V-2).
Tableau V-2 : Comparaison des vitesses instantanées d'hydrolyse ectoenzymatique mesurées à l'aide de la MCALeu et de la LYA-Ala4. Vmax, Km : constantes de Michaëlis-Menten ; Vi0,15 : vitesse instantanée mesurée à
0,15 µM.
Station A
Station B
Station C
oligotrophe mesotrophe eutrophe
MCA-Leu
Vmax (nmol l-1 h-1)
1,40
11,98
5,29
Km (µM)
7,36
61,68
15,79
0,03
0,02
0,06
Vi
0,15
-1
-1
(nmol l h )
LYA-Ala4
Vi0,15 (nmol l-1 h-1)
0,59
173
0,69
1,31
60
200
a) Station C
(eutrophe)
160
50
140
40
120
30
100
80
20
60
40
[LYA-Ala2] (nM)
[LYA-Ala4] (nM)
180
10
20
0
0
0
10
20
30
40
50
b) Station B
(mesotrophe)
200
180
18
16
14
140
12
120
10
100
8
80
6
60
40
4
20
2
0
0
0
10
200
20
30
40
50
6
c) Station A
(oligotophe)
180
160
5
140
4
120
3
100
80
2
60
40
[LYA-Ala2] (nM)
[LYA-Ala4] (nM)
[LYA-Ala2] (nM)
[LYA-Ala4] (nM)
160
1
20
0
0
0
10
20
30
40
50
Temps (h)
Figure V-6 : Hydrolyse de la LYA-Ala4 et apparition concomitante de la LYA-Ala2 selon un gradient eutrophie
vers oligotrophie, i.e. aux stations C (a), B (b) et A (a) le 26/01/02.
LYA-Ala4 ;
LYA-Ala2. Notez le
changement d'échelle pour la LYA-Ala2.
174
Ainsi, les vitesses d'hydrolyse ectoenzymatique mesurées à l'aide de la LYA-Ala4
apparaissent 20, 30 et 21 fois plus importantes que celles mesurées à l'aide de la MCA-Leu
respectivement aux stations A, B et C. Ces résultats sont cohérents avec ceux obtenus par
Pantoja & Lee (1999) qui démontraient que les peptides contenant plus de 2 acides aminés
étaient 10 à 400 fois plus rapidement hydrolysés qu'un dipeptide, ou que la MCA-Leu.
Enfin, la Figure V-7 confirme que sur un maillage plus serré que précédemment (sur 6
stations au lieu de 3, voir Figure V-3), l'hydrolyse de la LYA-Ala4 augmente d'un milieu
oligotrophe vers un milieu eutrophe. Le pic à la station B correspond au front de la nappe de
diffusion des eaux usées visuellement observée lors du prélèvement.
LYA-Ala4 hydrolysée (nM/h)
7
6
5
4
3
2
1
Oligotrophie
Eutrophie
0
A
A'
B
B'
C
C'
Figure V-7 : Hydrolyse de la LYA-Ala4 (Ci = 150 nM ) estimée le 28/01/02 selon un gradient oligotrophie vers
eutrophie.
Front de la nappe de diffusion des eaux usées.
V.2.4 Conclusion
Cette étude effectuée en milieu côtier montre les limites d'utilisation de ce nouveau substrat
analogue (LYA-peptides) pour des eaux oligotrophes. Les temps d'incubation et les temps de
latence apparaissent de plus en plus longs sur un gradient eutrophe-oligotrophe, rendant
l'emploi de ce nouveau substrat problématique en milieu oligotrophe si ce n'est impossible
dans des milieux ultra-oligotrophes comme le domaine océanique profond.
Toutefois, la recherche de nouveaux analogues peptidiques doit être poursuivie. Puisque les
activités ectoenzymatiques paraissent être l'étape limitante de la minéralisation de la matière
175
organique, il convient de rechercher une molécule traceur permettant à la fois la mesure de
l'activité ectoenzymatique et le suivi du devenir des composés de faible poids moléculaire
issus de cette hydrolyse pour l'anabolisme (utilisation des monomères pour produire de la
biomasse bactérienne) et le catabolisme bactérien (utilisation des monomères pour les besoins
énergétiques de la cellule, entraînant une production de CO2). Ainsi, il nous serait possible
d'estimer les vitesses réelles (plutôt que les vitesses potentielles) d'utilisation de composés de
faible poids moléculaire directement issus de l'hydrolyse de composés de haut poids
moléculaire.
V.3 Approche moléculaire
Les avancées majeures en biologie moléculaire ont rendu possible le développement des
méthodes "d'empreintes génétiques" (fingerprint) d'ADN d'une communauté bactérienne
naturelle sans étape de culture et d'isolation. Ces méthodes permettent l'extraction de l'ADN
d'une communauté microbienne, l'amplification par PCR des séquences d'intérêt et l'analyse
d'une partie de l'information génétique. Les différentes séquences amplifiées peuvent être
séparées par migration différentielle électrophorétique sur gels d'agarose ou en
polyacrylamide, soit en fonction de leur taille (Terminal-Restriction Fragment Length
Polymorphism – TRFLP, Ribosomal Intergenic Spacer Analysis – RISA), soit en fonction de
leur séquence (Denaturing Gel Gradient Electrophoresis – DGGE, Thermal Gel Gradient
Electrophoresis – TGGE, Single Strand Conformation Polymorphism – SSCP). Ces méthodes
"fingerprint" fournissent des profils de bande d'ADN qui sont représentatifs de la structure
génétique de la communauté microbienne, dans son ensemble ou d'une fraction de cette
communauté, en fonction des amorces (primers) utilisées et des gènes amplifiés. Des bandes
d'ADN peuvent être extraites des gels, séquencées, ou hybridées par des sondes moléculaires
permettant de donner des informations sur les groupes phylogénétiques constituants une
communauté.
Ces techniques moléculaires basées sur l'amplification directe des gènes ribosomiaux codant
pour le 16S-RNA de l'environnement ont été très usitées pour caractériser et analyser la
diversité génétique du picoplancton marin depuis les premiers travaux de Giovannoni et al.
(1990b), (Stahl et al., 1984; Muyzer et al., 1993). La structure de la communauté microbienne
varie déjà dans les premières centaines de mètres de la colonne d'eau (Massana et al., 1997;
Murray et al., 1998; Massana et al., 2000). Toutefois, les microflores du domaine océanique
profond sont encore mal connues (Fuhrman & Davis, 1997; Massana et al., 1997; Giuliano et
176
al., 1999; Karner et al., 2001; Lopez-Garcia et al., 2001). La plupart des études sur la
diversité microbienne du domaine océanique profond ont été réalisées dans des
environnements très particuliers comme les sources hydrothermales (Muyzer et al., 1995;
Takai & Horikoshi, 1999; Reysenbach et al., 2000), ou les bassins profonds hypersalés et
anoxiques (Eder et al., 2001; Sass et al., 2001). Les sédiments marins profonds ont fait l'objet
d'une attention particulière notamment par le groupe JAMSTEC essentiellement dans le but
d'isoler des souches piezophiles comme nous l'avons vu dans le chapitre I (Kato, 1999;
Vetriani et al., 1999; Kato et al., 2000; Kato & Nogi, 2001).
Le but de cette étude préliminaire est de comparer la structure des communautés microbiennes
du domaine pélagique profond (2000 m) à celles des eaux de surface (10 m) au site
DYFAMED. La technique employée est l'analyse par DGGE des séquences d'ADN
génomique naturel extrait du milieu marin. Dans un deuxième temps, nous chercherons à
identifier les populations qui apparaîtraient dominantes. Cette étude a été réalisée en
collaboration avec Valérie Michotey pour les analyses par DGGE (Centre d'Océanologie de
Marseille) et le séquençage des bandes DGGE d'ADN caractérisées a été réalisé en
collaboration avec Catherine Brutesco du Laboratoire d'Ecophysiologie Végétale et de
Microbiologie dirigé par Thierry Heulin (CEA Cadarache).
V.3.1 Matériel & méthodes
V.3.1.1 Extraction de l'ADN bactérien d'échantillons d'eau de mer
L'extraction d'ADN a été réalisée sur des échantillons d'eau de mer prélevés à l'aide de
bouteilles Niskin (préalablement nettoyées à l'aide d'acide HCl 6N) à 10 et 2000 m de
profondeur à la station DYFAMED. Les échantillons (respectivement 5 et 10 l) ont été filtrés
sur 0,2 µm (Supor 200 filters, Pall – Gelman), puis stockés à –20°C dans une solution tampon
de stockage (Giovannoni et al., 1990a). Les échantillons ont été décongelés dans la glace
avant l'extraction de l'ADN. Les cellules ont été lysées au cours d'une incubation de 20 min à
37°C avec 1 mg ml-1 de lysozyme (Sigma Chemical Co.), suivie par une incubation de 2
heures à 37°C avec 0,5 % de sodium dodecyl sulfate (SDS) et 160 µg ml-1 de protéinase K
(Sigma Chemical Co.). Un traitement RNase (10 µg ml-1 RNase A) a été réalisé à température
ambiante pendant 1 heure. Le lysat ainsi obtenu a été séquentiellement extrait avec du
phénol/chloroforme et du chloroforme. L'ADN a été finalement précipité avec de l'éthanol
froid et purifié à l'aide d'un kit d'extraction de l'ADN (Dneasy Tissue Kit – QIAGEN) selon
les instructions du fournisseur.
177
V.3.1.2 Amplification PCR des fragments de 16S-rDNA
Une région du 16S-rDNA d'environ 668 bp a été amplifiée en utilisant l'amorce GM5F (5'CGCCCGCCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGC
AG-3’)
et
un
mélange
de
deux
CCGTCAATTCCTTT(A/G)AGTTT-3’)
amorces
et
reverses,
l'amorce
l'amorce
907R
907RA
(5’(5’-
CCGTCAATTCATTTGAGTTT-3’) (Muyzer et al., 1995). Une séquence nucléotidique riche
en GC (GC-clamp) a été attachée au brin 5' de l'amorce GM5F pour améliorer la détection des
bandes des fragments d'ADN révélés par la DGGE (électrophorèse sur gel de polyacrylamide
en présence d’un gradient d’agent dénaturant) (Muyzer et al., 1998). Ces amorces sont
spécifiques pour la plupart des fragments de 16S-rDNA des eubactéries. Comme pour le
témoin, 100 ng d'ADN naturel extrait ont été ajoutés au mélange réactif de PCR. Le volume
de la réaction PCR a été ajusté à 100 µl. Les amplifications PCR ont été réalisées dans 20 mM
de Tris-HCl, 50 mM de KCl, 1,5 mM de MgCl2, contenant 0,2 mM de chaque
desoxyribonucleotide triphosphate, 50 pM de chaque amorce oligonucléotidique et 0,5 units
de Taq polymerase (Boehringer Mannheim). Les conditions PCR ont été identiques à celles
utilisées par Muyzer et al. (1993). Le programme des cycles de température a été réalisé
comme suit : dénaturation initiale à 94°C pendant 3 min, dénaturation à 94°C pendant 1 min
et fin de cycle par refroidissement de 65 à 55°C pendant 1 min (température décroissant de
1°C pour chaque seconde de cycle jusqu'à la température de 55°C), refroidissement à 55°C
pendant 1 min pour les 14 cycles suivants et enfin une amplification des amorces à 72°C
pendant 1 min. Une amplification supplémentaire à 72°C pendant 5 min a été également
réalisée.
V.3.1.3 Analyse DGGE
La DGGE a été réalisée en utilisant un système Dcode (Bio-rad Laboratories Inc).
L'équivalent de 80 µl de chaque réaction PCR a été déposé sur un gel de polyacrylamide
(6 %, poids/vol) d'un millimètre d'épaisseur en présence d'un gradient d'agent dénaturant (30 à
50 %). L'électrophorèse s'est déroulée pendant 6,5 h à 150V en utilisant du 1xTAE (40 mM
Tris-HCl (pH 8,3), 20 mM acide acétique, 1 mM EDTA) comme tampon d'électrophorèse. A
la fin du processus d'électrophorèse, l'ADN a été révélé en incubant le gel pendant 30 min
dans du 1xTAE contenant 0,5 µg ml-1 de bromure d'éthidium et
transillumination UV.
178
photographié sous
V.3.1.4 Séquençage des fragments des gènes de 16S-rDNA
Les principales bandes DGGE ont été excisées du gel. Chaque bande isolée a été récupérée
par diffusion dans de l'eau distillée stérile et ré-amplifiée par PCR dans les mêmes conditions.
Après analyse des bandes ré-amplifiées par DGGE pour vérifier la pureté des produits, les
produits PCR ont été séquencés. Le séquençage a été réalisé au Laboratoire d'Ecophysiologie
Végétale et de Microbiologie (CEA Cadarache). Chaque fragment d'ADN (environ 50 ng)
extrait du gel d'agarose et purifié a été mis en présence de 4 pmol d'amorce et de 4 µl de Mix
terminator ready réaction mix (fourni par le fabriquant du séquenceur, ABI PRISM). Le cycle
PCR pour amplifier les fragments d'ADN a été réalisé 25 fois comme suit : 10 sec à 96°C, 5
sec à 50°C, 4 min à 60°C. L'ADN amplifié a été re-suspendu dans 26 µl d'eau milliQ et 64 µl
d'éthanol à 95 %. Après agitation et incubation à température ambiante pendant 15 min,
l'échantillon a été centrifugé pendant 20 min (vitesse maximale). Le surnageant a été
délicatement retiré puis le culot a été lavé avec de l'éthanol 70 %. Après une nouvelle
centrifugation de 10 min et élimination du surnageant, l'échantillon a été mis à sécher pendant
5 à 10 min à 65°C. Les culots secs peuvent être stockés à 4°C. Les tubes de réactions ont été
déposés dans le séquenceur pour analyse (ABI PRISM, Model 310).
La Figure V-8 présente la photographie des profils d'ADN obtenus par DGGE pour des
échantillons d'eau de mer collectées à 2000 m de profondeur (A) et à 10 m de profondeur (B)
au site DYFAMED en automne 2000. Ces profils DGGE sont notablement différents. Sept
bandes d'ADN peuvent être révélées selon leur mobilité électrophorétique (de D1 à D7) pour
l'échantillon collecté à 2000 m de profondeur alors qu'aucune bande ne peut être clairement
différenciée à 10 m de profondeur.
Cette absence de différenciation en bandes distinctes suggère que la communauté microbienne
de surface est à la fois complexe et d'une grande biodiversité. Cette analyse DGGE montre
sans ambiguïté qu'il y a un changement drastique des communautés microbiennes entre la
surface océanique et les eaux profondes. Parmi les 7 bandes révélées à 2000 m, 3 contiennent
un fort pourcentage en G+C (D1 à D3) et 2 un faible pourcentage en G+C (D6 et D7).
179
M
A
B
D7
D6
D5
D4
D3
D2
D1
Figure V-8. Négatif de l'image des profils DGGE des fragments de 16S-rDNA obtenus à l'aide d'amorces
spécifiques du domaine des Eubacteria d'ADN extrait de 10 l d'eau de mer collectée à 2000 m de profondeur
(A) et de 5 l d'eau de mer collectée à 10 m de profondeur (B) au site DYFAMED en automne 2000. M
correspond à un mélange de produits PCR amplifiés, du bas vers le haut : 99 ng pour Clostridium perfringens
(GC% : 26,5), 87 ng pour Marinobacter hydrocarbonoclasticus sp. cab (GC% : 68) et 67 ng pour Micrococcus
luteus (GC% : 72) utilisé comme contrôle.
Les 7 bandes ont été excisées du gel, ré-amplifiées et analysées de nouveau sur un gel DGGE.
Une seule bande a été obtenue pour chaque échantillon (D1 à D7) sur ce nouveau gel DGGE
(données non montrées) permettant d'écarter la possible formation d'hétéroduplex4 et
permettant de supposer que chaque bande reflétait une seule population. Malheureusement, le
séquençage des bandes amplifiées par PCR n'a pas permis d'identifier avec certitude les
bandes DGGE mises en évidence. Une étape supplémentaire de clonage-séquençage est en
cours de réalisation pour purifier les fragments d'ADN et identifier les communautés
microbiennes correspondant aux fragments D1 à D7.
De plus, cette étude n'apparaîtrait pas complète si nous ne nous contentions que de l'étude des
Eubacteria. DeLong et ses collaborateurs (Delong et al.,1999; Karner et al., 2001; Massana et
al., 1997 ) ont montré que les Archaebacteria représentent une part non négligeable des
communautés microbiennes du domaine océanique profond. Ainsi, Karner et al. (2001) ont
démontré que le nombre de cellules d'Archae (et essentiellement celles du groupe des
180
Crenarchaeota) est quasiment nul dans les eaux de surface de l'Océan Pacifique, il augmente
à partir de 100 m pour atteindre un nombre équivalent à ceux des Eubacteria dès 2000 m de
profondeur et jusqu'à 5000 m de profondeur. Nous allons donc analyser la communauté des
Archébactéries par la même technique mais en utilisant des amorces spécifiques, afin
d'apprécier la diversité de la structure communautaire des Archaea dans ces eaux profondes
Méditerranéennes.
V.3.3 Conclusion
Ce travail bien que partiel, montre la différence de structure entre les microflores pélagiques
de surface et celles de fond au site DYFAMED au cours d'une période de stratification des
eaux. Cette étude préliminaire s'inscrit dans une perspective de recherche nécessaire pour
déterminer le rôle des microorganismes profonds dans la minéralisation de la matière
organique. Il convient en effet de passer à une nouvelle étape pour évaluer le rôle des
microorganismes dans la minéralisation de la matière organique, c'est-à-dire répondre à la
question : qui fait quoi ? L'identification des communautés dominantes dans le domaine
pélagique profond pourrait nous permettre de synthétiser des sondes spécifiques. La
détermination de sondes spécifiques pourrait permettre de caractériser quels sont les
organismes responsables de telle ou telle activité, de déterminer leur nombre spécifique, de
différencier les microflores actives des inactives. Les outils de biologie moléculaire
apparaissent donc comme incontournables si on souhaite appréhender quels sont les processus
qui régissent les grands flux océaniques, par qui et de quelle manière. Ce concept, que les
écologistes microbiens peuvent relier à la structure de la communauté microbienne des
processus biogéochimiques spécifiques ou "fonctions" (correspondant aux fondements de
l'écologie microbienne) retrouve depuis peu un nouvel élan (Gray & Head, 2001) et ouvre,
grâce aux techniques nouvelles, des perspectives enthousiasmantes pour déterminer le rôle de
la diversité spécifique dans les cycles biogéochimiques globaux (Giovannoni & Rappé, 2000;
Kirchman, 2002). Dans les eaux de surface, les bactéries appartenant aux groupes des
Proteobacteria et Cytophaga-Flavobacteria apparaissent comme les plus abondantes parmi
les bactéries hétérotrophes (Kirchman, 2002). Elles seraient donc les principales responsables
des processus biogéochimiques se réalisant en surface. Dans le domaine pélagique profond, la
méconnaissance de la diversité des communautés microbiennes ne nous permet pas encore de
4
Molécule de DNA constituée de deux brins d'origine chromosomique ou de nature différente et comprenant une
région non complémentaire, c'est-à-dire présentant un mésappariement.
181
déterminer quels sont le ou les grands groupes dominants du domaine pélagique profond
même si on sait déjà que le compartiment des Archaea ne pourra pas être négligé. Fuhrman et
al. (1997) qui ont tenté de repérer les différents types de procaryotes dans les eaux profondes
de l'Océan Pacifique et de l'Océan Atlantique, concluent que le domaine océanique profond
contient de nombreuses espèces non identifiées et une distribution phylogénétique étendue. Le
domaine océanique profond qui représente l'habitat le plus volumineux de la planète Terre est
pourtant le plus mal connu d'un point de vue biologique.
182
Chapitre VI
CONCLUSION
Chapitre VI – Conclusion
VI. CONCLUSION
Le domaine océanique profond (<1000 m) constitue environ 88 % du volume océanique
global, il est pourtant peu étudié d'un point de vue biogéochimique par rapport à la zone
productive de surface. Les contraintes technologiques, les faibles vitesses de minéralisation
observées ont contribuées à négliger l'étude ce compartiment. Toutefois, lorsque les vitesses
de minéralisation mesurées le long de la colonne d'eau et dans les sédiments superficiels sont
intégrées en fonction de l'épaisseur de chacun des compartiments considérés, les flux de
minéralisation potentiellement réalisables par les microflores des zones profondes sont loin
d'être négligeables. Le paradigme considérant que le domaine océanique profond est un
milieu homogène où règne une activité minéralisatrice négligeable apparaît désuet. Il paraît
donc important d'améliorer notre connaissance des vitesses de réaction des communautés
microbiennes dans les différents étages du domaine océanique afin d'estimer plus précisément
les flux de minéralisation qui en résultent, chaque fois que possible, non pas sous forme de
flux potentiels, mais de flux réels.
Pour chacun des compartiments étudiés, la stratégie expérimentale a toujours été définie dans
le souci de maintenir les échantillons dans les conditions les plus proches possibles de celles
réellement exercées in situ : (1) à l'aide de l'équipement hyperbare du laboratoire (HPSS) pour
les mesures d'activités dans la colonne d'eau, et pour la simulation de la chute des particules
dans la colonne d'eau, (2) à l'aide du Lander de l'OSU de Banyuls-sur-Mer pour la mesure des
activités microbiennes à l'interface eau-sédiment. Les concentrations en substrat ajouté ont
toujours été choisies dans les gammes de concentrations les plus basses permises par la
sensibilité des techniques analytiques dans le but de soit se rapprocher le plus possible des
concentrations réelles naturelles (cas de la colonne d'eau), soit de se mettre en conditions
traces par rapport aux concentrations naturelles (cas du sédiment). Dans le cas de la colonne
d'eau profonde, les concentrations naturelles particulièrement faibles (i.e. à la limite de
détection des techniques analytiques) ne permettent pas d'utiliser des concentrations traces en
substrat. Nous avons donc utilisé des concentrations saturantes les plus faibles possibles pour
éviter les palliers successifs résultant de cinétiques multiphasiques. Dans ce cas, les mesures
définissent la vitesse maximale cinétiquement définie mais potentielle, alors que dans les
sédiments les vitesses mesurées en concentrations théoriquement "traces" nous permettraient
d'estimer des vitesses plus proches du processus réel.
183
La relative homéothermie de la colonne d'eau Méditerranéenne nous a permis d'apprécier les
effets de la pression hydrostatique sur les activités microbiennes indépendamment des effets
des faibles températures habituellement observées dans les océans profonds. Nous avons
démontré que, dans des eaux stratifiées, la décompression d'un échantillon d'eau de mer
prélevée en dessous de 1000 m entraîne une sous-estimation moyenne de son activité
métabolique de 3,6 ± 4,3 ( ± e.t.; n = 99). Toutefois, il ne nous est pas possible, actuellement,
de donner un facteur de correction permettant de valider des mesures d'activités réalisées sur
des échantillons décomprimés, comme le montre l'écart type relatif à la valeur moyennée citée
précédemment.
La matière organique du domaine profond étant essentiellement sous une forme non
directement assimilable par les bactéries, l'étape préliminaire à sa minéralisation par les
microflores profondes est donc l'hydrolyse ectoenzymatique des molécules de haut poids
moléculaire (HMW) en molécules utilisables par les bactéries (<600 Da). Par exemple, nous
avons démontré que pour produire la même biomasse bactérienne, les bactéries de la zone
aphotique (200-2000 m) doivent hydrolyser 3,4 fois plus d'aminopeptides que leurs
homologues de la zone euphotique (10-200m). Les microflores profondes sont donc bien
adaptées à récupérer le carbone nécessaire à leur survie dans des composés de haut poids
moléculaire. La vitesse de production des petits composés issus de ces réactions hydrolytiques
régule leur utilisation à des fins anaboliques pour produire de la biomasse bactérienne
nouvelle, et à des fins cataboliques dont le dioxyde de carbone constitue le produit final. Ce
travail présente les premières études à notre connaissance sur les effets de la pression
hydrostatique sur la mesure d'activités ectoenzymatiques (aminopeptidase et phosphatase)
effectuées sur des échantillons naturels non décomprimés. Cette étude a permis de prouver
que, dans le domaine pélagique profond, chaque étape conduisant à la minéralisation de la
matière organique (de l'hydrolyse des macromolécules jusqu'à la production finale de CO2) est
réalisée par des organismes adaptés aux conditions ambiantes de forte pression hydrostatique.
Au cours de deux campagnes réalisées au printemps et en automne 2000, sur le site
DYFAMED, nous avons pu montrer que les activités des microflores profondes présentent
des variations saisonnières. Contrairement à la zone euphotique, les activités microbiennes
dans le domaine pélagique profond ne sont pas limitées par les concentrations en N et P mais
184
par l'apport en carbone organique facilement utilisable. Dans le domaine océanique profond,
le matériel organique est principalement sous forme dissoute et de faible poids moléculaire
(LMW DOM < 1000 Da, Benner et al., 1992; Ogawa & Ogura, 1992; Fig.4 du manuscrit n°4
– Tamburini et al., soumis-c). Pourtant, seuls les composés organiques de petits poids
moléculaires (LMW DOM < 600 Da) peuvent entrer directement au travers de la membrane
cellulaire bactérienne (Nikaido & Vaara, 1985). Les composés LMW (< 1000 Da) qui
s'accumulent dans les eaux profondes sont les résidus des attaques microbiennes préalables
(Keil & Kirchman, 1994; Ogawa et al., 2001) et constituent la fraction réfractaire de la LMW
DOM (r-LMW DOM, Fig. 4 du manuscrit n°4 – Tamburini et al., soumis-c). De ce fait, les
microflores profondes doivent tirer l'essentiel de leur demande carbonée de la matière
particulaire qui chute le long de la colonne d'eau. C'est le cas au printemps 2000 à la station
DYFAMED où un flux de 308 mg C particulaire m-2 d-1 (Miquel comm. pers.) atteint la
profondeur de 1000 m. Les bactéries pélagiques profondes libres présentent alors des activités
aminopeptidasiques (EAA) répondant étroitement à cet apport en matériel frais (le flux
potentiel d'aminopeptides hydrolysés entre 1000 et 2000 m est égal à 490 mg C m-2 d-1) et un
"rendement de croissance bactérien" (estimé à partir de l'utilisation du
14
C-glutamate) élevé
(GYG = 65 %). Au contraire, en automne, le flux particulaire à 1000 m est faible (17,5 mg C
m-2 d-1) et les bactéries exacerbent leurs activités ectoenzymatiques (flux potentiel
d'aminopeptides hydrolysés entre 1000 et 2000 m est égal à 1963 mg C m-2 d-1) ce qui
provoque une dépense énergétique importante d'où un "rendement de croissance bactérien"
très faible (GYG = 12 %). En automne, les activités EAA potentielles ne sont pas cohérentes
avec le faible flux de particules organiques ce qui suggère qu'au cours des périodes d'ultraoligotrophie, les microflores profondes doivent puiser leur source de carbone dans la matière
organique dissoute plus réfractaire, ce qui les contraint à dépenser plus d'énergie. Nous
émettons l'hypothèse que, dans ce type de carence nutritive, les microflores développent des
stratégies leur permettant de consommer au moins en partie le r-LMW DOC (compris entre
600 et 1000 Da), empêchant ainsi son accumulation définitive au cours du temps dans les
eaux océaniques profondes. Ces attaques microbiennes sont certainement concomitantes à des
altérations physico-chimiques de cette matière organique dissoute dite "réfractaire".
Une estimation plus précise des flux de minéralisation de la matière organique dans les océans
nécessite une étroite collaboration pluridisciplinaire (1) en poursuivant la recherche de
nouvelles molécules analogues pour nous permettre d'évaluer au mieux la minéralisation de la
185
matière organique (2) en affinant la caractérisation de la composition de la matière organique
océanique (d'un point de vue quantitatif mais aussi qualitatif). Il faut être conscient que
l'utilisation de petits substrats analogues, constitué d'un chromophore (methylumbelluferone –
MUF ou 4-méthylcoumarinyl-7-amide – MCA) lié de manière covalente à un monomère
(acide aminé, sucre, phosphate,…) ne représente pas correctement la structure
tridimensionnelle d'un substrat de haut poids moléculaire et que les paramètres cinétiques
déterminés aux moyens des substrats analogues usuels peuvent être différents de ceux des
polymères naturels (Feller et al., 1996). De plus, nous avons vu l'intérêt de l'étude simultanée
des vitesses des deux étapes, hydrolyse des polymères et minéralisation des monomères,
intervenant dans la dégradation de la matière organique en zone profonde. La technique
proposée par l'équipe de Cindy Lee (Pantoja et al., 1997) paraissait à ce titre très prometteuse
car nous comptions synthétiser des analogues LYA avec des peptides radioactifs. De tels
substrats permettraient de mesurer, en une seule et même expérimentation, à la fois la vitesse
d'hydrolyse ectoenzymatique et les vitesses d'utilisation (incorporation dans la biomasse et
minéralisation) des produits de cette hydrolyse. Malheureusement, et pour des raisons que
nous définissons mal, dans un environnement oligotrophe l'utilisation des composés LYAAla4 s'est avérée infructueuse. L'échec de cette étude préliminaire ne remet pas en cause la
stratégie expérimentale mais devrait nous orienter vers d'autres traceurs.
Si en période de stratification, la décompression des échantillons prélevés dans la colonne
d'eau profonde provoque une sous-estimation de la mesure des activités microbiennes, la
décompression des échantillons d'eau proche du fond donne des résultats opposés. Toutefois,
cette contradiction n'est pas abberrante. Du fait de la colonisation des particules en cours de
chute, des bactéries hétérotrophes sont transportées en grand nombre de la zone productive de
surface vers la zone profonde. L'interface eau-sédiment qui est le réceptacle de ces particules
est donc un compartiment colonisé à la fois par des bactéries autochtones adaptées à la
pression hydrostatique locale, et par des bactéries allochtones, non-adaptées à ce facteur. Une
hypothèse préliminaire peut être avancée (Figure VI-1) : les bactéries attachées aux particules
issues des zones superficielles sont, pour certaines d'entre elles, des bactéries piezotolérantes.
Lors de leur chute dans la colonne d'eau, leurs activités métaboliques sont inhibées par
l'augmentation de pression mais cet effet n'est pas létal. Lorsque, lors d'un carottage, ces
populations sont remontées en surface, les échantillons sont décomprimés et ces bactéries
retrouvent leurs conditions de pression optimales et leurs activités métaboliques sont
186
exacerbées. Les mesures d'activités effectuées sur les échantillons incubés à la pression
atmosphérique apparaissent alors supérieures à celles réalisées en condition in situ (Jannasch
& Wirsen, 1973; Picon, 2000; cette étude). Cette hypothèse est valable lors de flux
particulaires suffisants pour enrichir l'interface eau-sédiment en bactéries allochtones
originaires de la surface de l'océan. Toutefois, dans le cas de flux particulaires faibles, la
proportion de bactéries allochtones peut être inférieure à celle des bactéries autochtones, les
mesures d'activités effectuées à la pression atmosphérique seraient alors inférieures à celle
réalisée in situ comme démontré par Cahet et al. (1990).
Au niveau non plus de l'interface benthique mais du sédiment proprement dit, aucune mesure
d'activité microbienne n'a été réalisée, à notre connaissance, en maintenant les conditions de
pression hydrostatique. Les résultats que nous avons obtenus dans les autres compartiments
(colonne d'eau et interface eau-sédiment) montrent que les peuplements microbiens naturels
sont sensibles aux variations de pression. On peut donc supposer que les peuplements
sédimentaires sont eux aussi sensibles aux variations de ce facteur, et que la décompression
des échantillons affecte également la mesure des activités microbiennes dans les sédiments.
Cette mesure est-elle surestimée ou sous-estimée lorsque les échantillons sont décomprimés ?
Dans la couche sédimentaire superficielle peuvent coexister des bactéries autochtones adaptée
à la pression hydrostatique ambiante élevée (puisque toutes les bactéries piezophiles isolées
sont issues de la première couche du sédiment, cf. Tableau I-1; Kato & Qureshi, 1999) et
allochtones (provenant d'apports plus ou moins fréquents de la zone de surface). Par contre, il
semble peu probable qu'au cours de l'enfouissement ces dernières puissent survivre de
manière dominante face à des bactéries mieux adaptées à leurs conditions environnementales.
Nous pouvons donc avancer l'hypothèse que les activités métaboliques microbiennes
classiquement mesurées sur des échantillons de sédiment profond décomprimés sont sousestimées par rapport à celles réellement exercées in situ. Par contre, il nous est impossible
d'évaluer l'importance de la sous-estimation due à la décompression d'échantillons
sédimentaires.
187
Figure VI-1. Bactéries adaptées et non adaptées à la pression hydrostatique. Les bactéries qui chutent avec les
particules originaires de surface s'accumulent à l'interface eau-sédiment. Elles ont leurs activités métaboliques
inhibées lorsqu'elles sont soumises à de fortes pressions hydrostatiques (mesures in situ), mais retrouvent leurs
capacités métaboliques lorsqu'on les ramène en surface (mesures à pression atmosphérique). Les mesures sur des
échantillons décomprimés et incubés à pression atmosphérique sont alors surestimées. A l'opposé, les bactéries
libres du domaine océanique profond sont adaptées à de fortes pressions hydrostatiques (mesures in situ), et la
décompression des échantillons inhibe leurs activités métaboliques (mesures à pression atmosphérique). Les
mesures sur des échantillons décomprimés sont alors sous-estimées.
Dans le compartiment sédimentaire, les concentrations naturelles en matière organique nous
permettent de nous placer théoriquement à des concentrations idéales (traces) pour mesurer
des vitesses plus proches des activités réelles. A contrario, dans le domaine pélagique profond
l'ultraoligotrophie et l'importance de la fraction organique non chimiquement définie ne nous
permettent de mesurer, pour l'instant, qu'une Vmax, bien définie d'un point de vue cinétique,
mais seulement potentielle. Ainsi, dans notre étude de la répartition du flux de minéralisation
au site DYFAMED (Tableau IV-8) la part dévolue au domaine benthique est probablement
plus juste que celle attribuée au domaine pélagique profond. La quantification des fonctions
biologiques en terme de flux de production, de transformation et minéralisation de la matière
organique dans la colonne d'eau et le sédiment récent, ainsi que les mécanismes de transfert
pelagos - benthos devront être développés en associant mesures de terrain, simulation de flux
et études de processus.
188
Un des défis majeurs de l'Océanologie contemporaine est d'améliorer la connaissance des
processus biologiques à l'échelle de la population et de l'organisme (y compris au niveau
physiologique, taxonomique et génétique) et d'intégrer cette connaissance à l'estimation du
rôle de ces processus dans le fonctionnement de l'écosystème. La simulation de la chute de
particules dans la colonne d'eau est une stratégie adaptée à cette étude de processus. Cette
approche originale devrait permettre de mesurer les vitesses de minéralisation et de
dissolution des particules lors de leur chute et donc d'affiner les estimations des flux en
matière organique et en éléments biogènes vers le domaine océanique profond.
189
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206
ANNEXES
1830
(b)
1830
(b)
1830
(b)
N.W Atlantic
N.W Atlantic
N.W Atlantic
3450
Puerto Rico
Trench
Gillis Deep
6040
2600
N.W Atlantic
Bermuda area 3130
Bermuda area 3000
Bermuda area 1800
400
(a)
Cglutamate
14
Cglutamate
14
CCasamino
acids
14
CCasamino
acids
14
Cglutamate
14
C
14
Gelatin
Agar
Starch
Cglucose
14
HP: 1
year,
DEC: 1
month
HP:1 year,
DEC 1
month
HP: 1
year,
DEC: 1
month
9 days
16 days
6 days
8 days (d)
161 days
43 days
1.0 g l-1
5 µg l-1
5 µg l-1
5 mg l-1
0.12 mg l-1
0.16 mg l-1
5 µg l-1
1.0 g l-1
0.3 g l-1
4 hours
250 µg l-1
Depth Added Concentration Incubation
(m) substrate
period
N. Pacific
coast
Sampling
Area
% of substrate
utilization
% of substrate
total substrate
utilization
% of substrate
utilization
% of substrate
utilization
% of substrate
utilization
% of substrate
utilization
% of substrate
utilization
% of substrate
utilization
Substrate
uptake
Metabolic
process
0.205
0.046
ND (e)
ND
ND
ND
4.85 %
(1 year)
1.5 %
(1 year)
11.0 %
(1 year)
Ambient
Pressure
(HP)
NI
ND
ND
ND (e)
ND
ND
ND
50.3 %
(1 month)
13.0 %
(1 month)
16.0 %
(1 month)
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
Jannasch
& Wirsen
(1973)
Jannasch
& Wirsen
(1973)
Seki &
Robinson
1969
Jannasch
& Wirsen
(1973)
ND
ND
HP=0.40DEC
Jannasch
& Wirsen
(1976)
Deming et
al. 1980
Deming et
HP=0.47DEC Jannasch et
al. (1976)
al. (1976)
al. (1976)
HP=0.01DEC
(c)
HP=0.01DEC
(c)
HP=0.06DEC
(c)
HP=1.66DEC
Decompressed Hydrological Pressure effect Reference
(DEC)
conditions
Table annex 1: Microbial activity measurements in deep-sea waters under ambient pressure conditions compiled from the current literature.
Annexe 1 : Microbial activity in deep-sea water: a review of data obtained under in situ pressure conditions (Table annex 1)
7730
Brownson
Deep
Puerto Rico
Trench
N.W Atlantic
14
14
Bermuda area 1800
Bermuda area 3000
N.W Atlantic
1830
14
3060
N.W Atlantic
CCasamino
Cglutamate
Cglutamate
Cglutamate
14
1830
N.W Atlantic
Angola Basin 5200
Cape
5220
Basin
Cape
5225
Basin
Angola Basin 5220
3550
7350
6040
Gillis Deep
amino
acids
14
Cglutamate
14
Cglutamate
14
Cglutamate
14
Cglutamate
14
Cacetate
14
Cglutamate
14
Cglutamate
14
Cglutamate
14
Cglutamate
48 days
130 days
17 days
21 days
40 days
27 days
3 weeks
0.18 mg l-1
40 µg l-1
4.6 µg l-1
31 µg l-1
21 µg l-1
96 µg l-1
0.5 mg l-1
0.426 mg l-1
5.78 mg l-1
5,58 mg l-1
3 weeks
3 weeks
3 weeks
3 weeks
159 days
0.50 mg l-1
0.615 mg l-1
326 days
0.18 mg l-1
total substrate
utilization
total substrate
utilization
total substrate
utilization
total substrate
utilization
% of substrate
utilization
% of substrate
utilization
% of substrate
utilization
total uptake
rate
total uptake
rate
total uptake
rate
total uptake
rate
total uptake
rate
total substrate
utilization
utilization
ND (e)
ND (e)
ND (e)
ND (e)
ND (e)
11 ng l-1d-1
71 ng l-1d-1
10 ng l-1d-1
15 ng l-1d-1
38 ng l-1d-1
0.259
0.206
0.058
ND (e)
ND (e)
ND (e)
ND (e)
ND (e)
ND
ND
ND
ND
~1 ng l-1d-1
ND
ND
ND
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
ND
ND
ND
HP=0.41DEC
HP=0.50DEC
HP=0.19DEC
HP=0.31DEC
HP=0.37DEC
ND
ND
ND
ND
HP=~ 38 DEC
Deming et
al. 1980
Deming et
al. 1980
Deming et
al. 1980
Tabor et al.
(1981)
Tabor et al.
(1981)
Tabor et al.
(1981)
Tabor et al.
(1981)
Tabor et al.
(1981)
Jannasch
& Wirsen
(1982) (f)
Jannasch
& Wirsen
(1982) (f)
Jannasch
& Wirsen
(1982) (f)
Jannasch
& Wirsen
(1982) (f)
Jannasch
& Wirsen
al. 1980
14
14
4500
1770
3850
1750
4620
Bermuda
N.W Atlantic
N.W Atlantic
N.W Atlantic
N.W Atlantic
Mediterranean 1100
C-
Cacetate
Cacetate
14
Cacetate
14
Cacetate
14
Cglucose
14
Cglucose
14
1850
Bermuda
Cglucose
14
6000
Puerto Rico
N.W Atlantic
N.W Atlantic
N.W Atlantic
acids
14
3500
CCasamino
acids
14
3130
CCasamino
acids
14
1830
Cglucose
3 weeks
0.350 mg l-1
5.8 nM
4.25 mg l-1
5.86 mg l-1
0.452 mg l-1
0.483 mg l-1
5.46 mg l-1
6.09 mg l-1
3 hours
3 weeks
3 weeks
3 weeks
3 weeks
3 weeks
3 weeks
3 weeks
3 weeks
1.40 mg l-1
0.189 mg l-1
3 weeks
-1
0.286 mg l
incorporation
total substrate
utilization
total substrate
utilization
total substrate
utilization
total substrate
utilization
total substrate
utilization
total substrate
utilization
total substrate
utilization
total substrate
utilization
total substrate
utilization
total substrate
utilization
78.5±24
ND (e)
ND (e)
ND (e)
ND (e)
ND (e)
ND (e)
ND (e)
ND (e)
ND (e)
ND (e)
30.7±10
ND (e)
ND (e)
ND (e)
ND (e)
ND (e)
ND (e)
ND (e)
ND (e)
ND (e)
ND (e)
Stratified
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
HP=2.55DEC
HP=0.69DEC
HP=1.00DEC
HP=0.99DEC
HP=0.59DEC
HP=2.65DEC
HP=0.75DEC
HP=0.45DEC
HP=0.96DEC
HP=0.41DEC
HP=0.48DEC
(1982) (f)
Jannasch
& Wirsen
(1982) (f)
Jannasch
& Wirsen
(1982) (f)
Jannasch
& Wirsen
(1982) (f)
Jannasch
& Wirsen
(1982) (f)
Jannasch
& Wirsen
(1982) (f)
Jannasch
& Wirsen
(1982) (f)
Jannasch
& Wirsen
(1982) (f)
Jannasch
& Wirsen
(1982) (f)
Jannasch
& Wirsen
(1982) (f)
Jannasch
& Wirsen
(1982) (f)
Bianchi &
Mediterranean
(Ligurian) (j)
Mediterranean
(Ligurian sea)
Mediterranean
(Ligurian sea)
Mediterranean
(Ligurian sea)
Mediterranean
(Ligurian sea)
Mediterranean
(Marseille)
Mediterranean
(Ligurian) (j)
800
800
1150
(i)
1150
(i)
1150
(i)
1150
(i)
800
Mediterranean 1150
(Ligurian sea) (i)
Mediterranean 1150
(Ligurian sea) (i)
14
Mediterranean 1150
(Ligurian sea) (i)
C
amino
acids
14
C
amino
acids
14
C
amino
acids
3
Hthymidine
3
Hthymidine
3
Hthymidine
3
Hthymidine
14
Cglucose
14
C
amino
acids
14
Cglucose
Cglucose
14
Cglucose
14
glucose
Mediterranean 1100
(Ligurian sea) (h)
(Gulf of
(g)
Marseille)
Mediterranean 1100
(Ligurian sea) (h)
12 hours
12 hours
12 hours
5 nM
10 nM
10 nM
12 hours
12 hours
5 nM
10 nM
12 hours
5 nM
12 hours
10 nM
12 hours
12 hours
10 nM
5 nM
12 hours
3 hours
3 hours
10 nM
5.8 nM
5.8 nM
total uptake
total uptake
total uptake
production
production
production
production
total uptake
total uptake
total uptake
incorporation
incorporation
31.4±2.6
pM C h-1
7.83±0.4
pM C h-1
7.06±0.8
pM C h-1
107.5±4.0
pM C h-1
196.0±6.0
pM C h-1
58.4±3.2
pM C h-1
209.8±10.6
pM C h-1
209.8±10
pM C h-1
pgC l-1 h-1
± SE, n=6
59.5±11
pgC l-1 h-1
± SE, n=8
14.5±6
pgC l-1 h-1
± SE, n=3
48.9±7.8
pM C h-1
±SE n=3
209.2±7.1
pM C h-1
5.7±1.1
pM C h-1
Stratified
5.0±1.0
pM C h-1
4.6±0.7
pM C h-1
120.2±2.1
pM C h-1
169.6±8.2
pM C h-1
5.2±0.5
pM C h-1
222.6±6
pM C h-1
Stratified
HP=5.5DEC
HP=1.6DEC
HP=0.9DEC
HP=0.9DEC
Bianchi et
al. (1999a)
Bianchi et
al. (1999a)
Garcin
(1994)
HP=2.52DEC Bianchi &
Garcin
(1994)
HP=0.03DEC Bianchi &
Garcin
(1994)
HP=2.2DEC Bianchi et
al. (1999a)
Tholosan
et al.(1999)
Bianchi et
al. (1999a)
Stratified
HP=1.5DEC Bianchi et
al. (1999a)
Fecal pellets HP=0.9DEC Bianchi et
al. (1999a)
Fecal pellets HP=1.1DEC Bianchi et
al. (1999a)
Stratified
HP=11.2DEC Tholosan
et al.(1999)
Stratified
HP=0.94DEC Tholosan
et al.(1999)
Fecal pellets
Fecal pellets
Stratified
Mixed
Stratified
222.6±13
pM C h-1
pgC l-1 h-1
± SE, n=6
23.6±14
pgC l-1 h-1
± SE, n=8
421.2±43
pgC l-1 h-1
± SE, n=3
22.7±1.8
pM C h-1
±SE n=3
212.2±5.4
pM C h-1
1500
1500
1500
1500
1500
1150
1150
1150
1150
1150
1000
1000
1000
1000
1000
Mediterranean 2000
Mediterranean
(Ligurian) (j)
Mediterranean
(Ligurian) (j)
Mediterranean
(Ligurian) (j)
Mediterranean
(Ligurian) (j)
Mediterranean
(Ligurian) (j)
Mediter.Sea
Ligurian (j)
Mediterranean
(Marseille)
Mediterranean
(Marseille)
Mediterranean
(Marseille)
Mediterranean
(Marseille)
Mediterranean
(Ligurian) (j)
Mediterranean
(Ligurian) (j)
Mediterranean
(Ligurian) (j)
Mediterranean
(Ligurian) (j)
Mediterranean
(Ligurian) (j)
Cglucose
14
Cglucose
14
Cglucose
14
Cglucose
14
Cglucose
14
Cglucose
14
Cglucose
14
Cglucose
14
Cglucose
14
Cglucose
14
Cglucose
14
Cglucose
14
Cglucose
14
Cglucose
14
C
amino
acids
14
C-
14
12 hours
12 hours
10 nM
10 nM
12 hours
12 hours
12 hours
12 hours
12 hours
12 hours
12 hours
12 hours
12 hours
12 hours
12 hours
12 hours
12 hours
12 hours
10 nM
10 nM
10 nM
10 nM
10 nM
10 nM
10 nM
10 nM
10 nM
10 nM
10 nM
10 nM
10 nM
10 nM
total uptake
total uptake
total uptake
total uptake
total uptake
total uptake
total uptake
total uptake
total uptake
total uptake
total uptake
total uptake
total uptake
total uptake
total uptake
total uptake
6.6±0.6 pM 3.4±0.5 pM C
15.9±4.5
16.0±2.0
-1
pM C h
pM C h-1
63.5±2.7
51.0±8.7
-1
pM C h
pM C h-1
8.0+2.1
5.4±1.1
-1
pM C h
pM C h-1
12.3±5.4
8.0±1.8
-1
pM C h
pM C h-1
2.2±0.6
1.1±0.1
-1
pM C h
pM C h-1
7.1±0.4
3.6±0.2
-1
pM C h
pM C h-1
209.2±7.1
212.2±5.4
-1
pM C h
pM C h-1
48.9±7.8
22.7±1.8
-1
pM C h
pM C h-1
78.2±13.6
15.1±3.2
-1
pM C h
pM C h-1
35.4±2.7
4.4±0.8
-1
pM C h
pM C h-1
8.4±0.5 pM 4.8±0.6 pM C
C h-1
h-1
33.9±2.1
18.9±0.3 pM
-1
pM C h
C h-1
25.0±2.3
19.9±0.8 pM
-1
pM C h
C h-1
9.6±1.5
4.6±0.1 pM C
-1
pM C h
h-1
294.6±22.0 142.3±11.9
pM C h-1
pM C h-1
Stratified
Stratified
Stratified
Stratified
Stratified
Stratified
Stratified
Stratified
Stratified
Stratified
Stratified
Stratified
Stratified
Stratified
Stratified
Stratified
HP=1.94DEC
HP=2.07DEC
HP=2.08DEC
HP=1.25DEC
HP=1.80DEC
HP=1.75DEC
HP=8.00DEC
HP=5.20DEC
HP=2.15DEC
HP=0.99DEC
HP=1.97DEC
HP=2.00DEC
HP=1.53DEC
HP=1.48DEC
HP=1.25DEC
HP=0.99DEC
Tholosan
Tholosan
et al.(1999)
Tholosan
et al.(1999)
Tholosan
et al.(1999)
Tholosan
et al.(1999)
Tholosan
et al.(1999)
Tholosan
et al.(1999)
Tholosan
et al.(1999)
Tholosan
et al.(1999)
Tholosan
et al.(1999)
Tholosan
et al.(1999)
Tholosan
et al.(1999)
Tholosan
et al.(1999)
Tholosan
et al.(1999)
Tholosan
et al.(1999)
Tholosan
et al.(1999)
Mediterranean
(Ligurian) (j)
Mediterranean
(Ligurian) (j)
Mediterranean
(Ligurian) (j)
Mediterranean
(Ligurian) (j)
Mediterranean
(Ligurian) (j)
Mediterranean
(Ligurian) (j)
Mediterranean
(Ligurian) (j)
Mediterranean
(Ligurian) (j)
Mediterranean
(Ligurian) (j)
Mediterranean
(Ligurian) (j)
Mediter.Sea
Ligurian (j)
(Ligurian) (j)
Mediterranean
(Ligurian) (j)
Mediterranean
(Ligurian) (j)
Mediterranean
(Ligurian) (j)
Mediterranean
(Ligurian) (j)
1500
1150
1150
1150
1000
1000
1000
1000
800
800
2000
2000
2000
2000
2000
glucose
14
Cglucose
14
Cglucose
14
Cglucose
14
C
amino
acids
14
Cglucose
3
Hthymidine
3
Hthymidine
3
Hthymidine
3
Hthymidine
3
Hthymidine
3
Hthymidine
3
Hthymidine
3
Hthymidine
3
Hthymidine
3
Hthymidine
5 nM
5 nM
5 nM
5 nM
5 nM
5 nM
5 nM
5 nM
5 nM
5 nM
12 hours
12 hours
12 hours
12 hours
12 hours
12 hours
12 hours
12 hours
12 hours
12 hours
12 hours
12 hours
10 nM
10 nM
12 hours
12 hours
12 hours
10 nM
10 nM
10 nM
production
production
production
production
production
production
production
production
production
production
total uptake
total uptake
total uptake
total uptake
total uptake
1.8±0.2 pM
C h-1
196.1
pM C h-1
479.2
pM C h-1
113.2
pM C h-1
53.3
pM C h-1
19.6
pM C h-1
73.6
pM C h-1
7.8
pM C h-1
7.1
pM C h-1
107.5
pM C h-1
50.0
pM C h-1
C h-1
37.9±4.5
pM C h-1
10.0±0.7
pM C h-1
22.2±1.4
pM C h-1
156.0±2.6
pM C h-1
0.72±0.1 pM
C h-1
166.9
pM C h-1
173.0
pM C h-1
8.8
pM C h-1
35.8
pM C h-1
9.3
pM C h-1
60.6
pM C h-1
5.0
pM C h-1
4.6
pM C h-1
120.3
pM C h-1
22.1
pM C h-1
h-1
37.9±4.3 pM
C h-1
6.6±0.5 pM C
h-1
0.79±1,4. pM
C h-1
120.2±2.6 pM
C h-1
Stratified
Stratified
Stratified
Stratified
Stratified
Stratified
Stratified
Stratified
Stratified
Stratified
Stratified
Stratified
Stratified
Stratified
Stratified
HP=2.26DEC
HP=0.89DEC
HP=1.56DEC
HP=1.57DEC
HP=1.22DEC
HP=2.12DEC
HP=1.49DEC
HP=12.9DEC
HP=2.76DEC
HP=1.17DEC
HP=2.50DEC
HP=1.29DEC
HP=28.1DEC
HP=1.51DEC
HP=1.00DEC
Tholosan
et al.(1999)
Tholosan
et al.(1999)
Tholosan
et al.(1999)
Tholosan
et al.(1999)
Tholosan
et al.(1999)
Tholosan
et al.(1999)
Tholosan
et al.(1999)
Tholosan
et al.(1999)
Tholosan
et al.(1999)
Tholosan
et al.(1999)
Tholosan
et al.(1999)
et al.(1999)
Tholosan
et al.(1999)
Tholosan
et al.(1999)
Tholosan
et al.(1999)
Tholosan
et al.(1999)
Mediterranean
(Ligurian) (j)
Mediterranean
(Ligurian) (j)
Mediterranean
(Ligurian) (j)
Mediterranean
(Ligurian) (j)
Mediterranean
(Ligurian) (j)
Mediterranean
(Ligurian) (j)
Mediterranean
(Ligurian) (j)
Mediterranean
(Ligurian) (j)
Mediterranean
(Ligurian) (j)
Mediterranean
(Ligurian) (j)
Mediterranean
(Ligurian) (j)
Mediterranean
(Ligurian) (j)
Mediterranean
(Ligurian) (j)
Mediterranean
(Ligurian) (j)
Mediterranean
(Ligurian) (j)
Mediterranean
(Ligurian) (j)
2000
1500
1300
850
2000
2000
2000
1500
1500
1000
800
2000
2000
2000
1500
1500
Hthymidine
3
Hthymidine
3
Hthymidine
3
Hthymidine
3
Hthymidine
3
Hthymidine
3
Hthymidine
3
Hthymidine
3
Hthymidine
3
Hthymidine
3
Hthymidine
3
Hthymidine
3
Hleucine
3
Hleucine
3
Hleucine
3
Hleucine
3
5 nM
5 nM
5 nM
5 nM
5 nM
5 nM
5 nM
5 nM
5 nM
5 nM
5 nM
5 nM
5 nM
5 nM
5 nM
5 nM
12 hours
12 hours
12 hours
12 hours
12 hours
12 hours
12 hours
12 hours
12 hours
12 hours
12 hours
12 hours
12 hours
12 hours
12 hours
12 hours
production
production
production
production
production
production
production
production
production
production
production
production
production
production
production
production
35.4
pM C h-1
102.8
pM C h-1
3.3
pM C h-1
88.1
pM C h-1
18.8
pM C h-1
197.5
pM C h-1
186.4
pM C h-1
100.8
pM C h-1
73.8
pM C h-1
188.6
pM C h-1
87.5
pM C h-1
45.6
pM C h-1
2.37
ngC l-1h-1
1.31
ngC l-1h-1
1.20
ngC l-1h-1
1.05
ngC l-1h-1
15.4
pM C h-1
65.8
pM C h-1
1.9
pM C h-1
54.6
pM C h-1
1.1
pM C h-1
162.5
pM C h-1
86.8
pM C h-1
37.3
pM C h-1
28.9
pM C h-1
98.5
pM C h-1
35.8
pM C h-1
10.8
pM C h-1
2.00
ngC l-1h-1
0.79
ngC l-1h-1
0.54
ngC l-1h-1
0.48
ngC l-1h-1
Stratified
Stratified
Stratified
Stratified
Stratified
Stratified
Stratified
Stratified
Stratified
Stratified
Stratified
Stratified
Stratified
Stratified
Stratified
Stratified
HP=2.19DEC
HP=2.22DEC
HP=1.66DEC
HP=1.19DEC
HP=4.22DEC
HP=2.44DEC
HP=1.91DEC
HP=2.55DEC
HP=2.70DEC
HP=2.15DEC
HP=1.22DEC
HP=17.08DEC
HP=1.61DEC
HP=1.74DEC
HP=1.56DEC
HP=2.30DEC
Tholosan
et al.(1999)
Tholosan
et al.(1999)
Tholosan
et al.(1999)
Tholosan
et al.(1999)
Tholosan
et al.(1999)
Tholosan
(1999)
Tholosan
(1999)
Tholosan
(1999)
Tholosan
(1999)
Tholosan
(1999)
Tholosan
(1999)
Tholosan
(1999)
Bianchi et
al. (1999b)
Bianchi et
al. (1999b)
Bianchi et
al. (1999b)
Bianchi et
al. (1999b)
MUFphosphate
2000
MUFphosphate
1500
phosphatase
Vmax
1
443±199
pM MUF h-
1
0.77±0.10
ngC l-1h-1
production
0.74±0.39
ngC l-1h-1
production
0.47±0.11
ngC l-1h-1
production
2.06±0.06
ngC l-1h-1
aminopeptidase 11.0 %±4.4
Hr (%±SE)
aminopeptidase 835±99 pM
Vmax± SE
MCA h-1
aminopeptidase 386±20 pM
Vmax
MCA h-1
phosphatase
7.2 %±1.9
Hr (%±SE)
phosphatase
468±203
Vmax
pM MUF h-
production
168±70
pM MUF h-1
335±40
pM MUF h-1
571±68 pM
MCA h-1
137±96 pM
MCA h-1
3.1 %±0.7
0.48±0.15
ngC l-1h-1
0.28±0.12
ngC l-1h-1
0.21±0.11
ngC l-1h-1
0.13±0.14
ngC l-1h-1
3.9 %±2.4
Stratified
Stratified
Stratified
Stratified
Stratified
Stratified
Stratified
Stratified
Stratified
Stratified
HP=2.64DEC
HP=1.40DEC
HP=2.32DEC
HP=2.82DEC
HP=1.46DEC
HP=2.82DEC
HP=15.8DEC
HP=2.23DEC
HP=3.52DEC
HP=1.60DEC
Tamburini
et al (2002)
Tamburini
et al (2002)
Tamburini
et al (2002)
Tamburini
et al (2002)
Tamburini
et al (2002)
Tamburini
et al (2002)
Tamburini
et al (2002)
Tamburini
et al (2002)
Tamburini
et al (2002)
Tamburini
et al (2002)
a: in situ incubation into the sampler kept at the sampling depth during the whole incubation period
b: in situ incubation at the water sediment boundary layer using man-operated submersible
c: calculated by applying a factor 12 to the % of utilization measured under atmospheric pressure conditions during a 1-month
incubation period
d: sample held in storage in the transfer unit for 45 days before transfer in the incubation vessel
e: data originally presented as graphs of time course incorporation, or respiration, of the added substrates
f: within the set of data presented in this reference authors note that most of the experiments were conducted immediately after
sampling, but some were done using undecompressed and concentrated subsamples kept in cold storage for an undetermined
12 hours
12 hours
5 µM
5 µM
12 hours
12 hours
12 hours
12 hours
12 hours
12 hours
12 hours
12 hours
0.05 µM
5 µM
2000 MCA-leu
0.05 µM
10 nM
10 nM
10 nM
10 nM
5 µM
Hleucine
3
H-t
leucine
3
Hleucine
3
Hleucine
MCA-leu
3
2000 MCA-leu
1000
2000
2000
1500
1000
Mediterranean 2000
MUF(Ligurian) (j)
phosphate
Mediterranean
(Ligurian) (j)
Mediterranean
(Ligurian) (j)
Mediterranean
(Ligurian) (j)
Mediterranean
(Ligurian) (j)
Mediterranean
(Ligurian) (j)
Mediterranean
(Ligurian) (j)
Mediterranean
(Ligurian) (j)
Mediterranean
(Ligurian) (j)
Mediterranean
(Ligurian) (j)
period before processing at the laboratory at shore. Authors did not indicate in this article what were exactly the samples analyzed
after storage in high-pressure conditions.
g: a set of 6 samples collected 30 miles South-East of Marseille, at the same sampling station and at the same depth (reported data
are mean value ± SE)
h: a set of samples collected in the Ligurian sea, 28 miles south of Nice at the same sampling station and at the same depth,
(idem)
i: a set of samples collected at the same sampling station at the same depth in the Ligurian sea, 28 miles south of Nice, at a few day
interval, some of them being within a swarm of fecal pellets of migrating zooplankters
j: a set of samples collected in the Ligurian sea, at the same sampling station 28 miles south of Nice, but at diverse depths
NI: not indicated in the cited reference
ND: not determined by authors
10 nM
10 nM
10 nM
10 nM
10 nM
10 nM
10 nM
10 nM
10 nM
14
Mediterranean 1000
C(Ligurian) (j)
glutamate
14
Mediterranean 1000
C(Ligurian) (j)
glutamate
14
Mediterranean 1000
C(Ligurian) (j)
glutamate
14
Mediterranean 1000
C(Ligurian) (j)
glutamate
14
Mediterranean 1000
C(Ligurian) (j)
glutamate
14
Mediterranean 1500
C(Ligurian) (j)
glutamate
14
Mediterranean 1500
C(Ligurian) (j)
glutamate
14
Mediterranean 2000
C(Ligurian) (j)
glutamate
12 hours
12 hours
12 hours
12 hours
12 hours
12 hours
12 hours
12 hours
12 hours
Depth Added Concentration Incubation
(m) substrate
period
14
Mediterranean 1000
C(Ligurian) (j)
glutamate
Sampling
Area
assimilation
respiration
assimilation
respiration
assimilation
respiration
assimilation
respiration
assimilation
Metabolic
process
1.52±0.05
pM C h-1
32.16±1.03
pM C h-1
12.03±3.63
pM C h-1
22.10±0.32
pM C h-1
4.15±1.47
pM C h-1
4.76±1.21
pM C h-1
6.05±0.04
pM C h-1
6.20±1.02
pM C h-1
Ambient
Pressure
(HP)
1.67±0.70
pM C h-1
0.35±0.05
pM C h-1
2.52±0.75
pM C h-1
0.78±0.28
pM C h-1
18.90±0.75
pM C h-1
1.72±0.04
pM C h-1
2.47±0.50
pM C h-1
1.25±0.16
pM C h-1
3.37±1.21
pM C h-1
1.11±0.89
pM C h-1
Stratified
Stratified
Stratified
Stratified
Stratified
Stratified
Stratified
Stratified
Stratified
HP=1.50DEC Tamburini
et al
(soumis-c)
et al
(soumis-c)
et al
(soumis-c)
et al
(soumis-c)
et al
(soumis-c)
et al
(soumis-c)
et al
(soumis-c)
et al
(soumis-c)
et al
(soumis-c)
Decompressed Hydrological Pressure effect Reference
(DEC)
conditions
Table annex 2: Microbial activity measurements in deep-sea waters under ambient pressure conditions compiled from the current literature (following).
10 nM
14
Mediterranean 3000
C(Ionian) (k)
glutamate
Hleucine
Hleucine
Hleucine
3
10 nM
14
Mediterranean 2500
C(Ionian) (k)
glutamate
Mediterranean 3000
(Ionian) (k)
10 nM
14
Mediterranean 2500
C(Ionian) (k)
glutamate
3
10 nM
14
Mediterranean 2500
C(Ionian) (k)
glutamate
Mediterranean 2500
(Ionian) (k)
10 nM
14
Mediterranean 1500
C(Ionian) (k)
glutamate
10 nM
10 nM
10 nM
10 nM
14
Mediterranean 1500
C(Ionian) (k)
glutamate
3
10 nM
14
Mediterranean 2000
C(Ligurian) (j)
glutamate
Mediterranean 1500
(Ionian) (k)
10 nM
14
Mediterranean 2000
C(Ligurian) (j)
glutamate
12 hours
12 hours
12 hours
12 hours
12 hours
12 hours
12 hours
12 hours
12 hours
12 hours
12 hours
production
production
production
assimilation
assimilation
respiration
assimilation
respiration
assimilation
assimilation
respiration
0.90±0.38
pM C h-1
1.72±0.04
pM C h-1
0.72±0.04
pM C h-1
0.50±0.20
pM C h-1
0.16±0.06
pM C h-1
1.58±0.00
ngC l-1h-1
1.51±0.28
ngC l-1h-1
3.18±0.27
ngC l-1h-1
15.7±3.1
pM C h-1
112.19±9.43
pM C h-1
0.68±00
ngC l-1h-1
0.09±0.00 pM
C h-1
1.52±0.27 pM
C h-1
2.30±0.04 pM
C h-1
20.60±3.07
pM C h-1
29.81±7.69 7.87±1.92 pM
pM C h-1
C h-1
3.97±1.33
pM C h-1
2.66±0.65
pM C h-1
1.21±0.83
pM C h-1
0.93±0.12
pM C h-1
1.15±0.24
pM C h-1
Stratified
Stratified
Stratified
Stratified
Stratified
Stratified
Stratified
Stratified
Stratified
Stratified
Stratified
et al
(soumis-c)
et al
(soumis-c)
et al.
(soumis-b)
et al.
(soumis-b)
et al.
(soumis-b)
et al.
(soumis-b)
et al.
(soumis-b)
et al.
(soumis-b)
et al.
(soumis-b)
et al.
(soumis-b)
et al.
10 nM
14
Mediterranean 3500
C(Ionian) (l)
glutamate
5 µM
5 µM
Mediterranean 3500 MCA-leu
(Ionian) (l)
Mediterranean 3500
MUF(Ionian) (l)
phosphate
12 hours
phosphatase
Vmax
production
uptake
respiration
assimilation
production
18.99±1.93
pM C h-1
15.02±1.93
pM C h-1
3.98±0.0
pM C h-1
0.12±0.05
ngC l-1h-1
1
2282±54
pM MUF h-
1.24±0.07
ngC l-1h-1
±SE
12 hours aminopeptidase 440.3±116
Vmax
pM MCA h-1
12 hours
12 hours
12 hours
12 hours
12 hours
12 hours aminopeptidase 563.0±44.1
Vmax
pM MCA h-1
12 hours aminopeptidase 373.4±37.3
Vmax
pM MCA h-1
1463±80
pM MUF h-1
0.36±0.11
ngC l-1h-1
±SE
132.5±12.9
pM MCA h-1
3.48±0.49
pM C h-1
3.42±0.49
pM C h-1
0.07±0.01
pM C h-1
0.07±0.0
ngC l-1h-1
269.9±23.9
pM MCA h-1
104.6±16.9
pM MCA h-1
Anoxic
brines
Anoxic
brines
Anoxic
brines
Anoxic
brines
Anoxic
brines
Anoxic
brines
Anoxic
brines
Stratified
Stratified
HP=1.56DEC
HP=3.32DEC
HP=3.44DEC
HP=5.45DEC
HP=4.39DEC
HP=56.8DEC
HP=1.71DEC
HP=2.09DEC
HP=3.57DEC
j: a set of samples collected in the Ligurian sea, at the same sampling station 28 miles south of Nice, but at diverse depths
k: oxic water column
l: anoxic brines underlying the above cited oxic water column
10 nM
Hleucine
3
10 nM
14
Mediterranean 3500
C(Ionian) (l)
glutamate
Mediterranean 3500
(Ionian) (l)
10 nM
10 nM
14
Mediterranean 3500
C(Ionian) (l)
glutamate
Hleucine
3
5 µM
(Ionian) (k)
Mediterranean 3500
(Ionian) (k)
5 µM
(Ionian) (k)
(soumis-b)
Tamburini
et al.
(soumis-b)
Tamburini
et al.
(soumis-b)
Tamburini
et al.
(soumis-b)
Tamburini
et al.
(soumis-b)
Tamburini
et al.
(soumis-b)
Tamburini
et al.
(soumis-b)
Tamburini
et al.
(soumis-b)
Tamburini
et al.
(soumis-b)
Tamburini
et al.
(soumis-b)
RESUME
Les différentes étapes de la minéralisation (activités ectoenzymatiques (aminopeptidase –
EAA et phosphatase – PA), production de biomasse bactérienne (BP), assimilation (GA) et
respiration (GR) de monomères) ont été étudiées dans l'ensemble de la colonne d'eau, à
l'interface benthique et dans les dépôts récents en Mer Ligure, Golfe du Lion et Mer Ionienne.
La relative homéothermie de la colonne d'eau Méditerranéenne nous a permis d'apprécier les
effets de la pression hydrostatique sur les activités microbiennes indépendamment des effets
des faibles températures habituellement observées dans les océans profonds. Cette étude a
permis de prouver que, dans le domaine pélagique profond chaque étape conduisant à la
minéralisation de la matière organique (de l'hydrolyse des macromolécules jusqu'à la
production finale de CO2) est réalisée par des organismes adaptés aux conditions ambiantes de
pression. En effet, en période de stratification, la décompression d'un échantillon profond
entraîne une sous-estimation moyenne de son activité métabolique de 3,6 ± 4,3 (± e.t.; n =
99). Malheureusement, un tel écart à la moyenne empêche d'utiliser cette moyenne comme
facteur de correction des mesures effectuées sur des échantillons décomprimés.
Les microflores profondes doivent tirer l'essentiel de leur demande carbonée de la matière
particulaire qui chute le long de la colonne d'eau. C'est le cas au printemps 2000 à la station
DYFAMED où les bactéries pélagiques profondes libres présentent des activités
aminopeptidasiques (EAA) répondant étroitement à l'apport en matériel frais (le flux potentiel
d'aminopeptides hydrolysés entre 1000 et 2000 m est égal à 490 mg C m-2 d-1) et un
rendement d'utilisation de l'acide glutamique élevé (65 %). En automne, les fortes activités
ectoenzymatiques potentielles ne sont pas cohérentes avec le très faible flux de particules
organiques, ce qui suggère qu'au cours des périodes d'ultra-oligotrophie, les microflores
profondes doivent puiser leur source de carbone dans la matière organique dissoute
réfractaire. L’utilisation de ce matériel nécessite plus d'énergie : le rendement d'utilisation
n’est plus que de 12 %. La structure taxonomique des microflores profondes est différente de
celle des eaux de surface, conséquence probable d'une adaptation à la forte pression
hydrostatique et à un matériel organique plus réfractaire.
Si la décompression des échantillons de la colonne d’eau induit une sous-estimation des
activités microbiennes, celle des échantillons d'eau proche du fond provoque une surestimation des mesures. Cette divergence est attribuée à la différence d’origine des
peuplements microbiens dans la colonne d’eau et dans le néphéloïde de fond. Les vitesses
métaboliques mesurées dans les sédiments superficiels sont supérieures d’un ordre de
grandeur à celles mesurées dans la colonne d’eau. Cependant, le calcul des flux potentiels de
dégradation et de minéralisation à travers les eaux superficielles (jusqu’à 200 m), les eaux
intermédiaires et profondes (200-2000m) et l’étage benthique (eaux surnageantes et sédiment
mélangé) suggère un potentiel métabolique qui est loin d’être négligeable dans les
compartiments profonds. Pour affiner ces estimations, on a utilisé une approche expérimentale
originale pour simuler la chute du matériel particulaire dans la colonne d’eau.
La stratégie adoptée, respectant les conditions caractéristiques du domaine profond, permet
une étude de l’évolution quantitative et qualitative de la composition chimique de la matière
organique, et de la diversité des microflores, de la zone productrice de surface jusqu’au fond
océanique. Cette stratégie conduira à une estimation plus réaliste des flux de matière et
énergie qui assurent le couplage pelagos–benthos, l’une des clés principales du
fonctionnement de l’Océan global.

Universite de la mediterranee la degradation du materiel organique

Transcription

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