Diapositives présentées - Académie Nationale de Pharmacie

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« Les chevelus racinaires, une alternative à la
production en champs pour les principes actifs
d’origine végétale »
Professeur Michèle Boitel-Conti
Académie Nationale de Pharmacie
30 septembre 2015
« Les chevelus racinaires, une alternative à la
production en champs pour les principes actifs
d’origine végétale »
Professeur Michèle Boitel-Conti
Membre fondateur
Conseiller scientifique
Académie Nationale de Pharmacie
30 septembre 2015
Les chevelus racinaires, une alternative à la production en champs pour les principes actifs d’origine
végétale
Système de production hétérologue
Arômes
Parfums
Insecticides
Principes actifs
Protéines recombinantes
(insuline, lipase gastrique humaine,…)
Attraction des insectes pollinisateurs
Répulsion pour des pathogènes
Insecticides, fongicides
Allélopathie
Métabolites
spécialisés
(alkaloïdes, terpenes,
…)
Métabolites primaires
(sucres, acides organiques, hormones
…)
Croissance
Energie
Respiration
Morphogenese
végétale
Principes actifs
INDUSTRIES PHARMACEUTIQUES, DES COSMETIQUES
Arômes
INDUSTRIES AGRO-ALIMENTAIRES
Datura inoxia
hyoscyamine, scopolamine, …
Aujourd’hui
- Molécules restreintes à quelques familles
Catharanthus roseus
Extraction
vinblastine, vincristine,…
- Généralement à faibles concentrations
- Plantes cultivées au champs
- Importées ou cultures encadrées
- > 500 000 molécules d’intérêt
Marché non couvert
Papaver somniferum
codéine, morphine,…
Biotechnologies ?
végétale
Problématiques
Plantes supérieures
Grande taille
Organes pluricellulaires hétérogènes
Activités métaboliques qui évoluent :
- âge
Culture en fiole d’1 clone
- sollicitations environnement
Lieux de biosynthèse et de stockage :
- cellules
- organes
- molécules circulantes
- faibles teneurs
végétale
Biotechnologies ?
Demain
- Plantes à potentialités bio synthétiques amplifiées,
Datura inoxia
PGM
- Culture en milieu confiné et contrôlé
Catharanthus roseus
Papaver somniferum
- Dédifférenciation
- Simplification de la « plante »
culture de cellules
- Transformation génétique
perte du métabolisme spécialisé
culture d’organe
végétale
Biotechnologies ?
- Transformation génétique
culture d’organe
Datura inoxia
Catharanthus roseus
Les chevelus racinaires
Papaver somniferum
ou
Métabolisme spécialisé?
« hairy roots »
végétale
Qu’est-ce qu’un chevelu racinaire?
Il est issu d’un évènement naturel
Bactéries en symbiose avec les plantes
au sein de la rhizosphère
Rhizobium rhizogenes
Certaines cellules de racines naturelles
transfère certains de ses gènes
(blessures mécaniques)
sans
avec
végétale
Rhizobium rhizogenes
Certaines cellules de racines naturelles
transfère certains de ses gènes
(blessures mécaniques)
Au laboratoire
Culture in vitro de plantes
Culture de R. rhizogenes
Piqure avec
aiguille infectée
après 10 à 15 jours de co-culture
Les gènes bactériens se sont
insérés dans le génome des
cellules de la plante
Les bactéries sont tuées par
un antibiotique : le céfotaxime
Racine
transgénique
végétale
1 clone
-
On coupe la racine transformée
-
On la place sur un milieu de culture solide stérile : sucres et sels minéraux
-
Chaque racine donnera un clone racinaire issu d’une seule piqure
6 clones
Culture en fiole d’1 clone
Culture en bioréacteurs de 3, 15 et 20 litres:
milieu confiné et contrôlé
- sans lumière
- entre 20° et 25°
- eau + sucre + sels minéraux
et les molécules d’intérêt ?
végétale
Les alcaloïdes morphiniques ?
P. Somniferum produit les alcaloides
benzylisoquinoline
à partir de la L-tyrosine.
Voie de biosynthèse
codéine
thébaine
Morphine (2 cycles arômatiques suppl.)
Anthony G. Millgate et al, 2004, Nature
végétale
Les alcaloïdes morphiniques ?
Alcaloides
(contenus en % Poids sec)
Hairy roots
(HR)
Racines
naturelles
Total
0.46
+/- 0.06
0.32
+/- 0.05
morphine
0.26 +/- 0.04
0.27
+/- 0.05
sanguinarine
codeine
0.02 +/- 0
0.18
+/- 0.02
Le Flem-Bonhomme V. et al, 2004, Planta
0.05
+/-0
0.05
+/- 0
Milieu de culture
(HR)
0.255
0.014
+/- 0.03
+/- 0
végétale
stilbènes/ Vitis vinifera:
exploration analytique et développement de procédé
resvératrol
stratégies
Photos BIOPI 2015: Léo-Paul Tisserant
Hairy roots de Vitis vinifera
végétale
stilbènes/ Vitis vinifera:
exploration analytique et développement de procédé
?
Pics connus
Exploration analytique
?
?
?
??
?
??
1
stratégies
Elicitation de la
voie de biosynthèse
X 1500
Sécrétion de stilbènes totaux :
150 mg. l-1 de milieu de culture
Vin (France) : 5,4 ± 1,2 mg·l1
Grain de raisin sec (Thomson seedless) : 486 mg·kg-1
Renouée du Japon : 10 mg.kg-1
végétale
Chevelus racinaires :
Alternative aux systèmes microbiens et CHO
pour les protéines complexes
?
Systèmes défaillants:
- diabète/insuline
- croissance/ h-GH
- Immunité/ IFNγ
- Coagulation/ facteur VIII
Extraction tissus humains
stratégies
Systèmes recombinants
Ivan Boublik, CRBM UMR 5237 CNRS
Systèmes cellulaires
Insatisfaisant pour les protéines complexes
Production de protéines recombinantes :
50 Milliards $ en 1997
300 Milliards $ en 2015
CHO
Organismes transgéniques
végétale
Chevelus racinaires :
Alternative aux systèmes microbiens et CHO
pour les protéines complexes
?
Génération de racines
porteuses du gène codant la
protéine d’intérêt
Végétaux comestibles
Transformation
génétique
R. rhizogenes
Culture de racines
en milieu confiné (bioréacteur)
Sélection /
mise en culture
Protéine d’intérêt
thérapeutique
(insuline, anticorps,
vaccins,…)
Extraction /
purification
Pathologie caractérisée
(déficience en une protéine)
Identification
séquençage
gène
Médicaments
(traitements
hormonaux,
antiviraux,
vaccins,…)
végétale
Etude de cas: GFP (I)
RB
Gène d’intérêt
PromSP
nptII
Term Prom
LB
RB
Term
Vecteur binaire
Rol A
Prom
Rol B
TermProm
Rol C
TermProm
LB
Term
Plasmide pRi
Co-transfert des deux T-DNAs dans le génome de la cellule infectée (feuille, tige…
Génération de racines adventives type « hairy root » porteuses du gène d’intérêt
stratégies
Type sauvage GFP
Type sauvage GFP
Brassica rapa rapa
(navet)
lumière blanche
lumière bleue
GFP
végétale
Marqueur
Protéines
totales
sécrétées
37 kDa
Brassica rapa rapa
25 kDa
Plate forme RhizoProt
GFP
Gel acrylamide coloré au
coomassie
Directement à partir du milieu de culture et
sans aucune étape de purification
La GFP représente plus de 70% des protéines totales
sécrétées (120 mg/L)
18
végétale
Système historique tabac
Plateforme RhizoProt
(Brassicaceae)
Sécrétion GFP
0.8 mg/L*
100 mg/L
Durée de vie de la
culture
< 40 jours
> 3 mois =>production en
continu
Stabilité des protéines
sécrétées
Présence de protéases**
stable
Toxicité
Alcaloïdes (nicotine…)
Végétaux alimentaires
*Medina-Bolivar et al.;
2004
** Pham et al.; 2011
RhizoProt :
Plateforme de production de biomolécules
- innovante
- performante
- sans pathogène,
- à faible coût,
- confiné et contrôlé
Brevet UPJV 2010
19
végétale
Valorisation industrielle:
Développement d’un procédé de production/sécrétion de protéines
recombinantes à partir de chevelu racinaire (brevet WO2011138233A1)
Start-up de biotechnologie créée en 2011
Exploitant exclusif du brevet et de la
plateforme RhizoProt
Développement
de candidats
médicaments
Industrialisation
du procédé
20
 3 protéines propriétaires (enzymes humaines) en développement pour le traitement de patients atteints de
végétale
stratégies
L’équipe et moi-même vous remercions de votre attention
végétale
stratégies
végétale
La démarche, les outils, les compétences
500 000 molécules découvertes
10 molécules d’intérêt à l’étude
Chimie analytique
Application en
industrie
Génie métabolique
10 ans
Génie génétique
ESSAIS CLINIQUES
Systèmes modèles
transfert
Développement industriel
Recherche
fondamentale
Génie des bio-procédés
1 seule produite
H3C N
H C H2OH
O C1
3
C2
O

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