Détermination des amines primaires aromatiques dans le

Détermination des amines primaires
aromatiques dans le simulant B ayant été
mis en contact avec les ustensiles de
cuisine en polyamide
SOP 23/0558/F
V7
Annexe: 0
Niveau : 3
P. : 1/10
Table des matières
1 Objet et domaine d’application ..................................................................................................3
2 Définitions et abréviations..........................................................................................................3
3 Principe de la méthode ...............................................................................................................3
4 Sécurité.........................................................................................................................................3
5 Prélèvement, réception, circulation, stockage et évacuation des échantillons ...................3
6 Partie expérimentale ...................................................................................................................4
6.1
Produits consommables .............................................................................................4
6.2
Equipement et matériel de laboratoire.......................................................................4
6.3
Préparation des solutions ...........................................................................................4
6.3.1
6.3.2
6.4
Préparations des solutions des standards de référence ........................................................4
Préparation des solutions pour l’analyse................................................................................6
Préparation des échantillons ......................................................................................6
6.4.1
6.4.2
6.4.3
6.4.4
Echantillons inconnus ............................................................................................................6
Blanc réactif ...........................................................................................................................6
Blanc matrice .........................................................................................................................6
Echantillon de contrôle à 5 ppb..............................................................................................6
6.5
Extraction des échantillons ........................................................................................6
6.6
Courbe d’Etalonnage ...................................................................................................6
6.7
Analyse par LC-MS/MS ................................................................................................7
6.7.1
6.7.2
Conditions LC ........................................................................................................................7
Conditions MS........................................................................................................................7
6.8
Programme de mesure ................................................................................................7
6.9
Evaluation des mesures ..............................................................................................8
6.9.1
6.9.2
Interprétation qualitative.........................................................................................................8
Interprétation quantitative.......................................................................................................8
7 Evaluation des résultats d’analyse............................................................................................9
7.1
Solvant ..........................................................................................................................9
7.2
Standard de référence .................................................................................................9
7.3
Blanc réactif..................................................................................................................9
7.4
Blanc matrice................................................................................................................9
7.5
Echantillon de contrôle ...............................................................................................9
7.6
Courbe d’Etalonnage ...................................................................................................9
7.7
Echantillon inconnus...................................................................................................9
8 Validation de la méthode ............................................................................................................9
9 Rapports d’essai..........................................................................................................................9
10 Contrôle de qualité ......................................................................................................................9
Détermination des amines primaires
aromatiques dans le simulant B ayant été
mis en contact avec les ustensiles de
cuisine en polyamide
SOP 23/0558/F
V7
Annexe: 0
Niveau : 3
P. : 2/10
11 Normes et Référence...................................................................................................................10
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aromatiques dans le simulant B ayant été
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SOP 23/0558/F
V7
Annexe: 0
Niveau : 3
P. : 3/10
Objet et domaine d’application
Les amines aromatiques primaires (AAP) sont utilisées dans la production de colorants azotés donnant
une couleur noire aux ustensiles de cuisine en nylon.
Le but de cette procédure est de vérifier la conformité des ustensiles en nylon émis sur le marché belge,
destinés aux consommateurs. En effet, une limite spécifique de migration de 0,020 mg/kg aliment (ou
simulant alimentaire), soit de 0,0033 mg/dm2 (en se référant au rapport conventionnel de 6 dm2 par kg
d’aliment), est mentionné dans la Directive 2002/72/ECC Annexe V part A pour 4,4’diaminodiphenylmethane. Etant donné qu’un amendement apporté à cette directive mentionnant que les
matériaux en plastique ne devraient pas relâcher une quantité d’amines primaires aromatiques dépassant
la limite de 0,01 mg/kg, une série d’analyses supplémentaires ont été effectuées dans le dossier de
validation.
Dans le cadre du nouveau Règlement EC 10/2011, la recherche des amines primaires aromatiques
s’étend aux trois molécules suivantes : aniline (ANL), 2.4-diaminotoluene (2.4-TDA) et 4.4’methylenediaminodiphenylmethane (4.4’-MDA).
La méthode analytique à appliquer pour la détermination de ces amines aromatiques primaires dans des
ustensiles en polyamide/nylon s’effectue par UPLC-MS/MS. Le processus de validation concerne la
méthode analytique pour la détermination de ces PAAs provenant des ustensiles de cuisine dans le
simulant.
2
Définitions et abréviations
dp
AAP
UPLC-MS/MS
4,4’-MDA
ANL
2.4-TDA
SML
3
Diamètre des particules
Amine aromatique primaire
Chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem
4,4’-diaminodiphenylmethane (synonyme : 4,4’-methylenedianiline)
Aniline
2.4-Diaminotoluene
Specific Migration Limit
Principe de la méthode
Les ustensiles (à usage répété) sont mis en contact avec le simulant en respectant les conditions de
temps et température de contact pour extraire les amines aromatique primaires (ANL, 2.4-TDA et 4.4’MDA). Après trois migrations successives le liquide de migration est analysé par UPLC-MS/MS.
4
Sécurité
Toutes les précautions seront prises lors de la manipulation des échantillons et des solutions étalons
pour éviter toutes contaminations. Le port de gants est recommandé lors des différentes étapes de
l’analyse. L’utilisation de solvants organiques se fera de préférence sous une hotte bien ventilée.
L’élimination des solvants et des solutions se fait dans les bidons « solvants » appropriés.
Rem : Il est conseillé de manipuler avec précaution le réactif pur (masque) et d’utiliser des gants car il est
irritant pour la peau et les voies respiratoires.
5
Prélèvement, réception, circulation, stockage et évacuation des échantillons
Les échantillons sont prélevés par le client.
La réception des échantillons à l’I.S.P. est décrite dans la SOP I/03/12/NF.
La distribution ainsi que l’enregistrement des échantillons dans la section se fait selon le DOC
40/DIS/003/NF.
La gestion des échantillons (réception, analyses et destruction) est retracée dans le LIMS.
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aromatiques dans le simulant B ayant été
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6
6.1
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Niveau : 3
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Partie expérimentale
Produits consommables
Les réactifs doivent être de qualité analytique et prévus pour la LC-MS. Ci-dessous les différents
standards utilisés dans cette méthode. Leurs numéros de CAS, leurs fournisseurs et leur place de
stockage sont également renseignés.
Aniline
2.4-diaminotoluene
4.4-diaminophenylmethane
ANL
2.4-TDA
4.4-MDA
Acide Formique
Acétonitrile
Méthanol
Eau préparée par le système Milli-Q
Acide acétique
Acétate d’ammonium
6.2
62-53-3
95-80-7
101-77-9
Sigma-Aldrich
Sigma-Aldrich
Acros
Armoire chimique
Armoire chimique
Armoire chimique
(LC Grade, Biosolve)
(LC Grade, Biosolve)
(LC Grade, Biosolve)
(Millipore)
(HPLC grade, Merck)
(Fluka)
Equipement et matériel de laboratoire
Pipettes en verre
Pipettes pasteur
Ballons jaugés en verre
Tube Falcon de 15 mL (Eppendorf)
Fioles à injection pour UPLC (Alltech)
Bain à Ultrasons
Balance analytique 0,1 mg (Satorius CP 2245)
Agitateur Vortex
Centrifugeuse
UPLC-Xevo ou équivalent + Masslynx software + consommables liés à l’appareil analytique (Waters)
Colonne Acquity UPLC C18 BEH 2.1 X 100mm, 1.7 µm (Waters)
Rem : Du matériel équivalent peut être utilisé.
6.3
Préparation des solutions
6.3.1
Préparations des solutions des standards de référence
Rem.: l’étiquetage de toutes les solutions s’effectue selon le SOP I/03/27/NF. Si pas applicable, créez
une étiquette contenant les données suivantes :
Code de la solution
Solvant
Nom de la personne préparant la solution
Date de préparation
Date de péremption
Mode de conservation
Solutions stock des Amines Aromatiques Primaires (AAP) à 1000 mg/L
Chaque standard séparément en solution.
Préparer des solutions stock de 1000 mg/L des différents standards de référence des amines
aromatiques primaires.
Peser avec précision 100 mg de substance pure dans un ballon jaugé ombré de 100 mL et mettre au trait
avec du méthanol.
Etiqueter et conserver 5 ans au congélateur (≤ -15 °C).
La pureté et le poids de la substance définissent la concentration exacte de la solution.
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Niveau : 3
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Solutions intermédiaires des AAP à 10 mg/L
Effectuer une dilution du stock afin d’obtenir une solution standard intermédiaire avec une concentration
d’environ 10 mg/L pour chaque AAP.
Transférer environ
100 µL de la solution ANL 1000 mg/L
100 µL de la solution 2.4-TDA 1000 mg/L
100 µL de la solution 4.4’-MDA 1000 mg/L
dans un ballon jaugé ombré de 10 ml et porter au trait avec de l’eau Milli Q.
Déterminer avec précision la teneur en mg/L de cette solution.
Etiqueter et conserver 1 mois au congélateur (≤ -15 °C).
Solutions intermédiaires des AAP à 5 mg/L
Effectuer une dilution du stock afin d’obtenir une solution standard intermédiaire avec une concentration
d’environ 5 mg/L pour chaque AAP.
Transférer environ
50 µL de la solution ANL 1000 mg/L
50 µL de la solution 2.4-TDA 1000 mg/L
50 µL de la solution 4.4’-MDA 1000 mg/L
dans un ballon jaugé ombré de 10 ml et porter au trait avec de l’eau Milli Q.
Déterminer avec précision la teneur en mg/L de cette solution.
Etiqueter et conserver 1 mois au congélateur (≤ -15 °C).
Solutions intermédiaires des AAP à 2.5 mg/L
Effectuer une dilution du stock afin d’obtenir une solution standard intermédiaire avec une concentration
d’environ 2.5 mg/L pour chaque AAP.
Transférer environ
25 µL de la solution ANL 1000 mg/L
25 µL de la solution 2.4-TDA 1000 mg/L
25 µL de la solution 4.4’-MDA 1000 mg/L
dans un ballon jaugé ombré de 10 ml et porter au trait avec de l’eau Milli Q.
Déterminer avec précision la teneur en mg/L de cette solution.
Etiqueter et conserver 1 mois au congélateur (≤ -15 °C).
Solutions intermédiaires des AAP à 0.5 mg/L
Effectuer une dilution du stock afin d’obtenir une solution standard intermédiaire avec une concentration
d’environ 0.5 mg/L pour chaque AAP.
Transférer environ 500 µL de la solution intermédiaire des AAP à 10 mg/L dans un ballon jaugé ombré de
10 ml et porter au trait avec de l’eau Milli Q.
Déterminer avec précision la teneur en mg/L de cette solution.
Etiqueter et conserver 1 mois au congélateur (≤ -15 °C).
Solution pour la courbe d’étalonnage
Ajouter des volumes différentes des solutions intermédiaire des amines aromatiques primaires à 1 mg/L
dans des ballons jaugés ombrés de volumes différents, comme indiquées dans le tableau ci-dessous afin
d’obtenir une courbe d’étalonnage.
Niveau
« CAL 0 »
« CAL 1 »
« CAL 2 »
« CAL 3 »
« CAL 4 »
« CAL 5 »
« CAL 6 »
« CAL 7 »
V (Solution intermédiaire
des AAP à 0.5 mg/L)
V (Solution intermédiaire
des AAP à 10 mg/L)
10 µL
20 µL
40 µL
100 µL
10 µL
20 µL
30 µL
Mettre au trait avec de l’eau Milli Q avec 3 % acide acétique.
V final (mL)
[AAP] (µg/L)
10 mL
10 mL
10 mL
10 mL
10 mL
10 mL
10 mL
10 mL
0
0.5
1
2
5
10
20
30
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aromatiques dans le simulant B ayant été
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Annexe: 0
Niveau : 3
P. : 6/10
Calculer avec précision la teneur de ces solutions.
Etiqueter et conserver 3 jours au frigo (≤ 10 °C).
6.3.2
Préparation des solutions pour l’analyse
Eau Milli Q avec 3% acide acétique
Estimer le volume de la solution nécessaire et préparer la solution comme décrit ci-dessous :
Par exemple : Pour un volume de 100 mL :
Mettre 3 mL d’acide acétique dans un ballon jaugé de 100 mL.
Amener au trait avec de l’eau Milli Q.
Etiqueter et renouveler après 1 mois.
Phase mobile A : 0.1% acide formique dans l’acétonitrile
Mélangez 1 mL de l’acide formique avec 999 mL d’acétonitrile.
Etiqueter et renouveler après un mois.
6.4
Préparation des échantillons
6.4.1
Echantillons inconnus
Rem : Les guidelines du document “ Technical guidelines on testing the migration of primary aromatic
amines from polyamide kitchenware and for for formaldehyde from melamine kitchenware “ du EU-RL
doivent être suivies. (Voir site CRL JRC)
Mettre l’échantillon dans un bécher.
Si l’étiquette indique des instructions avant l’usage des outils, ils doivent être suivis avant l’analyse.
Si rien n’est mentionné, immerger complètement l’échantillon avec le simulant.
Suivre la procédure 6.5.
6.4.2
Blanc réactif
Mettre du simulant dans un vial.
6.4.3
Blanc matrice
Mettre un extrait du matériel de référence dans un vial.
6.4.4
Echantillon de contrôle à 5 ppb
Mettre 5 mL d’un extrait du matériel de référence dans un tube en verre.
Ajouter 50 µL de la solution intermédiaire des AAP à 0.5 mg/L
Mettre en vial.
6.5
Extraction des échantillons
Pour les échantillons, suivre les étapes suivantes :
Placer à l’étuve 2h à 100°C ± 3°C.
Il faut répéter 3 fois l’opération de migration.
Le liquide issu de la troisième migration est analysé directement par LC-MS/MS.
6.6
Courbe d’Etalonnage
Injecter les différentes solutions « CAL 0 » - « CAL 7 » afin de construire la courbe d’étalonnage.
Détermination des amines primaires
aromatiques dans le simulant B ayant été
mis en contact avec les ustensiles de
cuisine en polyamide
6.7
SOP 23/0558/F
V7
Annexe: 0
Niveau : 3
P. : 7/10
Analyse par LC-MS/MS
6.7.1
Conditions LC
Colonne LC
Volume d’injection
Phase mobile A
Phase mobile B
Acquity UPLC BEH C18, 2.1 I.D. x 100 mm, 1.7 µm dp
10 µL
0.1% acide formique dans l’acétonitrile
Eau Milli Q
Gradient pour l’analyse :
Phase mobile A
Temps
(%)
0
5
1
5
2.5
95
3
95
5
5
6.7.2
Phase mobile B
(%)
95
95
5
5
95
Flux
(mL/min)
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
Courbe
1
6
6
6
1
Conditions MS
Ionisation mode
Capillary voltage
Cone voltage
Source offset
Source Temperature
Desolvation temperature
Cone gas flow
Desolvation gas flow
Collision gas flow
ESI+
3 kV
30 V
30 V
150 °C
450 °C
50 L/hr
650 L/hr
0.15 mL/min
La méthode d’acquisition MS décrit les transitions suivies pour chaque molécule:
Segment Ion parent (MH+) (m/z) Ions filles (m/z) Collision Energy (eV)
Analyte
1
ANL
94
51
25
77*
20
1
2.4-TDA
123
77
20
108*
20
2
4.4’-MDA
199
89
15
106*
25
* Ion fille utilisé pour la quantification
6.8
Programme de mesure
Le programme suivant reprend les différentes injections qui doivent se trouver dans la séquence
(contrôle, blancs, etc) et l’ordre dans lequel ces injections doivent être faites. En fonction des analyses à
effectuer, des injections de solvant peuvent être ajoutées si c’est nécessaire.
Détermination des amines primaires
aromatiques dans le simulant B ayant été
mis en contact avec les ustensiles de
cuisine en polyamide
aaaammjj_Solvant01
aaaammjj_Stdref01
aaaammjj_BR
aaaammjj_BM01
aaaammjj_Spike01
aaaammjj_Solvant02
aaaammjj_Cal00
aaaammjj_Cal01
aaaammjj_Cal02
aaaammjj_Cal03
aaaammjj_Cal04
aaaammjj_Cal05
aaaammjj_Cal06
aaaammjj_Cal07
aaaammjj_Solvant03
aaaammjj_Routine01
aaaammjj_Routine02
…..
aaaammjj_Solvant04
aaaammjj_Stdref02
6.9
SOP 23/0558/F
V7
Annexe: 0
Niveau : 3
P. : 8/10
Standard de référence = Courbe d’étalonnage « CAL 3 »
Blanc réactif
Blanc matrice
Echantillon de contrôle 5 ppb
Courbe d’étalonnage « CAL 0 »
Courbe d’étalonnage « CAL 1 »
Courbe d’étalonnage « CAL 2 »
Courbe d’étalonnage « CAL 3 »
Courbe d’étalonnage « CAL 4 »
Courbe d’étalonnage « CAL 5 »
Courbe d’étalonnage « CAL 6 »
Courbe d’étalonnage « CAL 7 »
Echantillon inconnu: Réf de l’échantillon
Echantillon inconnu: Réf de l’échantillon
Standard de référence = Courbe d’étalonnage « CAL 3 »
Evaluation des mesures
6.9.1
Interprétation qualitative
L’identification des amines aromatiques primaires dans un échantillon s’effectue en se basant sur le
temps de rétention et le ratio des ions spécifiques pour chaque amine aromatique primaire :
On considère qu’il y a présence de AAP si :
• Le temps de rétention ne varie pas plus de 5 % en comparant avec le temps de rétention de
l’analyse de référence (échantillon de contrôle ou standard de référence)
• Il y a la confirmation du rapport des ions spécifique des AAP : Le rapport d’intensité du signal des
deux ions filles obtenu pour les échantillons ne peut pas différer plus que 30 % comparé avec le
rapport obtenu de l’analyse de référence (échantillon de contrôle ou standard de référence).
6.9.2
Interprétation quantitative
Les résultats sont interprétés sur base de la courbe d’étalonnage. L’aire des pics chromatographiques
des ions utilisés pour quantifier, obtenus pour les standards en fonction des concentrations en AAP
permet de déterminer la droite de calibration. L’aire du pic chromatographique d’AAP pour les
échantillons est rapporté dans la droite de calibration afin d’obtenir la concentration en AAP contenue
dans l’échantillon. Les résultats bruts en mg/L sont ensuite corrigés en fonction du taux de récupération
obtenu.
Les résultats sont exprimés en mg/dm² après avoir tenu compte du volume d’extraction et de la surface
de contact de l’ustensile avec le liquide de migration puis reconvertis en mg/kg en tenant compte du
facteur conventionnel de 6 pour exprimer le résultat final.
Y=aX+b
avec
a = coefficient angulaire de la droite,
b = origine de la droite,
Y = aire AAP,
X = concentration AAP (mg/L) après correction
Résultat AAP en mg/dm² = (X*V)/S avec
V = Volume de simulant (L),
S = Surface de l’ustensile en contact avec le simulant (dm2)
Détermination des amines primaires
aromatiques dans le simulant B ayant été
mis en contact avec les ustensiles de
cuisine en polyamide
7
7.1
SOP 23/0558/F
V7
Annexe: 0
Niveau : 3
P. : 9/10
Evaluation des résultats d’analyse
Solvant
L’injection de solvant ne devrait donner aucun pic au temps de rétention des composés recherchés, ce
qui démontre l’absence d’effet de mémoire significatif.
7.2
Standard de référence
Le standard de référence en début de programmation sert de référence pour contrôler le bon
fonctionnement du système avant la nouvelle série d’analyses.
Tous les composés recherchés doivent être présents avec une intensité pour lequel S/N > 6.
Le standard de référence à la fin de la programmation sert de référence pour contrôler le bon
fonctionnement du système à la fin de la série d’analyses.
Tous les composés recherchés doivent être présents avec une intensité pour lequel S/N > 6.
7.3
Blanc réactif
Le blanc réactif permet de vérifier qu’il n’y a pas de contamination dans la procédure (solutions, vaisselle,
micropipettes, ...) et qu’il n’y a pas d’interférences pouvant être introduites par des contaminations
environnementales.
7.4
Blanc matrice
Le blanc matrice permet de vérifier qu’il n’y a pas d’analyte dans le matériel de référence considéré.
7.5
Echantillon de contrôle
L’échantillon de contrôle correspond à un échantillon blanc fortifié à 5 ppb pour chaque analyte.
Les résultats quantitatifs sont encodés dans la carte de contrôle et doivent se situer dans les limites
acceptables.
7.6
Courbe d’Etalonnage
La droite d’étalonnage sert à quantifier les résultats. Le coefficient de corrélation de la droite doit être égal
ou supérieur à 0,98.
7.7
Echantillon inconnus
La présence d’un pic au temps de rétention relatif à un des analystes et présentant les ions diagnostiques
recherchés implique la présence de la molécule. Donc, la quantification est aussi exécutée pour
déterminer la concentration en analyte(s) dans l’échantillon.
8
Validation de la méthode
Voir le dossier de validation DOC 23/0558/F.
9
Rapports d’essai
Utiliser les instructions de la procédure 22/F/25
10 Contrôle de qualité
Une évaluation régulière de la qualité de chaque essai doit être réalisée à plusieurs niveaux :
Au moins deux des trois lignes de contrôles doivent, si possible, être appliquées.
Détermination des amines primaires
aromatiques dans le simulant B ayant été
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SOP 23/0558/F
V7
Annexe: 0
Niveau : 3
P. : 10/10
Contrôle de 1ère ligne :
Le résultat de l’échantillon de contrôle est encodé dans une carte de contrôle afin de valider la série
d’analyse.
Contrôle de 2ème ligne :
Analyse d’un échantillon dopé à une valeur inconnue, préparé par le responsable du programme.
L’échantillon est analysé par l’analyste. Cette analyse doit être réalisée au minimum une fois par an si
une troisième ligne de contrôle n’est pas effectuée.
Contrôle de 3ème ligne :
Participation au minimum une fois par an, à des essais d’aptitude ou des tests interlaboratoires lorsque
ceux-ci sont organisés.
Voir aussi la SOP I/03/24/NF pour une description plus détaillée du contrôle qualité.
11 Normes et Référence
•
•
Les normes d’assurance de qualité ISO 17025 sont d’application pour les analyses.
“Technical guidelines on testing the migration of primary aromatic amines from polyamide
kitchenware and for for formaldehyde from melamine kitchenware”, EU-RL, NRL-FCM
publication, version 7, April 30th, 2011.