Low Cost detection of Glyphosate: an evaluation

Transcription

Strategy towards toxins
detection in a
multicomponent
biosensing system
I. Bazin, D. Pignol, M ; Ensaldi, A. Rodrigue, D. Garcia, N. Ginet, P. Cholat,
J.R. Fantino
CEA Cadarache,
Ecole des Mines d’Alès ( Laboratoire Génie de l’Environnement Industriel )
CNRS Marseille
INSA Lyon
Société AP2E Aix en Provence
Institut Mines-Télécom
Cadre général des travaux (2006-2014)
Savoir-faire de l’equipe: Gestion de la
ressource
Equipe ESAH: Eau, Systèmes
Anthropiques et Hydrosystèmes
bio détection de polluants et d’effets toxiques
Développer des
ressources alternatives:
recycler les eaux polluées
Qualité de l’eau et gestion
de la rareté
2014
Gestion durable des
ressources à l’échelle d’un
territoire
Modélisation de scénarios
et prévision
Diagnostic
Bilan matière, flux
Diagnostic physico-chimique
Biodétection
Evaluation de d’effets biologiques
Equipe Ecodiag: Diagnostic des
écosystèmes anthropiques et gestion des
ressources
2011
Systèmes anthropiques
Fonctionnement, optimisation
Réutilisation/recyclage
Evaluation environnementale (ACV)
Gestion durable des ressources
Ecologie Industrielle
Identification des synergies
Acteurs clefs et jeux d’acteurs
Aspects socio-économiques
Equipe Biodiagnostic et métrologie
2
2006
Gestion Environnementale de flux polluants liquides et
Développement de systèmes de Biodétection
DEVELOPPEMENT D’OUTILS DE BIODETECTION POUR UNE
GESTION ENVIRONNEMENTALE INTEGREE DES MATRICES
AQUEUSES
Polluants Prioritaires/ cibles
Utilisation de bio
détecteurs simples
et transposables
sur site
Approche globale par
la biotoxicité
Les besoins
 Directive Européenne sur l’Eau (2000):Besoins de disposer de méthodes de contrôle
“bon marché” et fiables pour le suivi sur site de la qualité des eaux

Avoir des analyseurs de polluants ou/et de toxicité en ligne pour une prise de
décision rapide
Eau usées traitées
Eau de canal à potabilisation
Composés spécifiques pour lesquels
Additivité de polluants en dessous de la
NQE a-t-elle un effet sur l’écosystème et
pouvons nous le prévoir?
-
Enjeu sanitaire important
-
problématique économique
-
La détection par les analyses
classiques est difficile
Développer des outils qui puissent être utilisables directement sur site voir
s’intégrer dans un système de surveillance
4
Pourquoi la biodétection pour la gestion de
l’eau?
 Thématique qui remonte au niveau des stratégies européenne, nationale et régionale
Zéro pesticide
en LR
Grand défis sociétaux
Gestion sobre des ressources
Smart monitoring
5
Stratégie 3 S en LR
Biodétection et biocapteur
Schéma du principe de
fonctionnement d'un
biocapteur d’après Minh, 1991
Reconnait sélectivement une
molécule cible
Permet de détecter et de quantifier
les molécules recherchées
« Système analytique qui convertit une réponse biologique en un signal physique mesurable »
Le biorécepteur
Biorécepteur cellulaire
et détection d’effets
Biorécepteur d’affinité et
détection de polluants
7
Biorécepteur d’affinité et détection de polluants
Biorécepteur d’affinité et
détection de polluants
OTA, OTB
Mycrocistine LR
Glyphosate
Chalenge: détecter des concentrations qui n’èxedent pas le µg/l
COMBITOX: multicomponent biosensing system
(ANR Ecotech)
LABO
Detection
Biosensor of
toxins
Transduction
Biosensor of
pathogenic bacteria
Biosensor of
metals
Common module of
Transduction
Prototype
Development and
construction of
prototype
Monitoring and
installing in a hosting
On site
9
TMSB-2014, Barcelona, Spain
Multi analyte determination
10
Multi analyte determination
3 toxics families
3 biological systems
common luminescence detection
1 monitoring system
→ Our system is to provide a unique device capable of measuring heavy metals,
pathogens or toxins pollution.
11
Metal sensors: exemple of lead
C. metallidurans
For each biosensor, promoters and regulatory genes specific to Cd, Zn, Hg, As, Co
and Ni have been fused to the lux CDABE operon encoding the bacterial luciferase
12
Metal Library biosensors
Biosensors
Strain
Genetic system
Metal
Limit of detection
Nickel
Zinc
Mercury
Lead
Cadmium
Copper
13
Phagosensors: detection of pathogens
Luminescence
Genetic
modification of the
phage genome
PrplU nluc
Infection
kanR
Injection of phage’s DNA
Production of
luciferase
PCR fragment
We have genetically modified bacteriophages
using fusions between the promoter of the
integrase, a gene transcripted at the early stages
of the infection, with the lux CDABE operon
HK620 genome
0.5 kb
14
Phagosensors: detection of pathogens
Infection with phage
1E7
1,00E+07
The proof of concept has
been obtained with the
detection of E. coli
TD2158
1,00E+06
1E6
1,00E+05
1E5
1E4
1,00E+04
1E3
1,00E+03
1,00E+02
1,00E+01
1,00E+00
0
0,25
0,5
0,75
1
1,25
Hours
15
1,5
Immunosensors: detection of toxins
OTA, OTB
Mycrocistine LR
Glyphosate
Chalenge: detect concentrations that do not exceed 1 µg/l
16
Immunosensors: principle
Optical detection
pollutants
pollutant-HRP
Biomembrane
AB C
D
Bioreceptor
foam
17
Affinity biosensor and detecting pollutants
Some pollutants are not immunogenic:
development of peptides
Proteine carrier
hapten congugated
www.Immunogene.com
Hapten
Ochratoxine A
AMPA
Glyphosate
Bazin et al. Biosensors and bioelctronics; 2013, 2014
18
Materials and methods:
peptides selection
Phage display
Molecular structure, interaction
with different amino-acide
Hexapeptide
(Giraudi et al. 2007)
for SPE
Peptide selection for detection of
glyphosate
S.Tria “New method of detection of
pollutant in water by artificial peptides”
3 Hexapeptides
3 peptides with 13 amino-acide
(oxydo reductase, anti-oxydant
properties, reactive molecules)
Potential binding verified by HPLC
19
Biosensor for ochratoxin A: identification of
a new antibody-like peptide
Absorbance (mV)
Absorbance (mV)
Absorbance (mV)
*
*
*
Retention time (min)
Peptide vs neg ctrl
Peptide vs pos ctrl
Peptide vs OTA
* Arrow indicates the peak corresponding to the peptide
Peptide-based binding assays. Representative HPLC profiles of three reaction media corresponding to NF04 incubation with
lactic acid as negative control (left panel), hydroquinone as positive control (center panel) and OTA (right panel).
Bazin et al. Biosensors and bioelctronics; 2013
20
Peptide-based competitive ELISA
B
A
100
Red wine OTA
100
80
B/B0 (%)
B/B0 (%)
80
60
40
20
0
60
40
PBS OTA
20
PBS OTB
0
5
10
15
20
25
30
0
1
OTA Concentration (ppb)
10
-1
Mycotoxin concentration (µg l )
Bazin et al. Toxines ; 2011, 2013
Bazin et al. Biosensors and bioelctronics; 2013
21
Improved performance for detection in µg/l
Surface functionalization and molecular recognition:
Principle
Protein orientation
His 6x
Ni
BRE
Presentation of D. Lopez-Ferber
“Microfabricated biosensors for
amperometric monitoring of
ochratoxin A”
Catalytic layer
chitosan
Chitosane Ni++
22
biomembrane
Surface functionalization and molecular recognition
Ochratoxin A-HRP
Ochratoxin A
Peptide-tag
histidine
Protein G-histidine
Zn2+
Zn2+
Zn2+
Zn2+
Zn2+ Chitosan Foam
Schematic of the peptide-based competitive ELISA
assays for the detection of OTA.
23
q (mg.g-1)
Sorption of divalent metal ions; sorption mono-component
isotherms for Zn(II), Co(II) and Ni(II).
240
Zn(II) Experimental data
Co(II) experimental data
210
Ni(II) Experimental data
Langmuir model
180
150
120
90
60
30
0
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
Ce (mg.L-1)
24
Fluorescent microscopy images of chitosan foam:
correct orientation of BRE
Specific assembly with 6His-tagged protein was performed using two proteins : GFP tagged and non tagged 6His.
The ability to bind histidine tagged proteins was tested with the metal
25
Optimization of peptide ELISA based on chitosan foam parameters
Luminescence*1000 (RLU)
1000
Control
C ter
N ter
Influence of the orientation of the
peptide NFO4
800
600
400
200
0
250 µg/L
500 µg/L
400
1000 µg/L
OTA HRP concentration
Optimization of peptide NFO4
concentrations and OTA-HRP
concentration
Luminescence*1000 (RLU)
166 µg/L
1000
500
350
300
250
200
150
100
50
1E-8
1E-7
1E-6
1E-5
1E-4
Peptide concentration (mol/L)
26
Optimization of chitosan foam volume and SEM images
a.
12 3
4
b. 1
2
3
c.
Luminescence (RLU)
6,0x105
4,0x105
2,0x105
0,0
0
20
40
60
80
100
Chitosane foam volume (µL)
27
Detection of OTA : OTA calibration curves
28
Comparison test of wine sample from Inter
Rhone laboratory and the peptide ELISA
based on chitosan foam.
29
Wine sample
#
%B/B0
OTA concentration in
sample (ppb)
OTA concentration
mesured (ppb)
161
41.55
1.3
1.84
164
54.57
2.9
1.02
170
28.16
3.0
3.14
173
24.48
4.0
3.67
176
27.96
3.9
3.16
179
13.84
5.7
6.77
191
17.14
5.4
5.32
Environmental application: real world water
analysis
Validation of the entire system will be
followed by the installation of one or
possibly several prototypes at the
SIVOM Luberon Durance and BRL
engineering.
30
Conclusions

Phagosensor
 Detection of 1E3 Coli


Metal sensor
specific to Cd, Zn, Hg, As, Co and Ni

Immunosensor


31
Mycotoxines (OTA, OTB); Phycotoxines (Microcystines,
acide okadaic), pesticides (Glyphosate, AMPA, Chlordécone)
Sensors capable of determining several analytes simultaneously
allow a reduction in time and sample volume and other reagents
required and thus constitute a valuable tool for environmental
monitoring
Thank you for your
attention

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