Microscopie électronique pour la Biologie 2014_Emile Béré
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Microscopie électronique pour la Biologie 2014_Emile Béré
Microscopie électronique en biologie Objectif de la microscopie en biologie Imager des structures, Co-localiser les protéines ou certaines molécules Acquisition In vivo A haute résolution Microscopie électronique R R= 0.61 l /nsinm R = Limite de résolution Avantages et limites de la MO M Photonique Signal Photons Résolution 0.2 µm Fixé ou in vivo Fixé ou in vivo Epaisseur l’échantillon 1 à 50 µm Coupe ou culture Durée de préparation Quelques sec à qlq heures Temps d’acquisition Quelques ms en 2D Immunomar quages Marquage et colocalisation Milieu Support 0.2 mm Cheveu en MO Air, liquide Lame, boite de pétri 60 µm Microsphère en MO En fluorescence on ne voit que ce qui est marqué En Microscopie optique Muscle cardiaque en coupe longitudinale Gross . x300 En Microscopie électronique En Microscopie photonique X 1000 X 10000 Principe de la ME : Interaction électron-matière LE Microscope Electronique à Transmission MET Microscope Electronique en Transmission JEOL 100 Kv La Microscopie Electronique en Transmission MO Immunofluorescence d’une protéine de jonction sur culture cellulaire L’image MET la même culture Applications du MET Ultrastructure sur coupe de tissu vivant ou matériaux Immunomarquage des protéines par billes d’or Diffraction électronique Coupe MET dans une feuille d’arabidopsis Effet de peptides microbienne sur cellules cancéreuse Phagocytose Bacteries dans cellules Coloration négative • • • Virus, proteines, molecules Pas de coupes Résultats rapides Phages APT ou AcU à saturation dans l’eau ou alcool 100 nm Immunomarquage, Echantillons Système révélateur billes or (1 à 15 nm) Anticorps primaire Epitope Antigène Echantillon (tissus, cellules, virus, bactéries…) Stage d'immunomarquage en M E, Toulouse le 15 mai 2010 Marquage post synaptique d’une protéine sur coupe de cellules nerveuse LE Microscope Electronique à Balayage MEB Interaction électron-matière Microscope électronique à Balayage 840A de JEOL MO MET L’image MEB correspondante Application du MEB Image de surface cellulaire ou de matériau Immunomarquage des protéines de surface par billes d’or Imagerie en mode électrons rétrodiffusés Spectrométrie X La différence entre la peau humaine et la peau de souris La surface d’un cheveu humain. Notez les plaques de kératine qui se chevauchent comme des écailles 20µm Poil Couchedes cellules desquamentes Poil Chez la souris les plaques s’emboitent entre elles. Epiderme Derme 20µm Images de vaisseaux sanguins en MEB et MET MEB MET Pl Gr N N Gr 2µm Culture cellulaire Fibrocytes Osteoblastes Osteocyte Osteoclaste 200µm 500µm 200µm Œufs et larves(chenilles) du papillon blanc 500µm Charançon perçant le grain de blé Legionella pneumophila traité aux peptides antimicrobienne Les différents types de grain de pollen 20µm 20µm Pomme de terre Crue Pomme de terre cuite 200µm Un poil de barbe coupé par la lame d’un rasoir mécanique Un autre poil qui a été déchiqueté par un rasoir électrique 50µm Cardiomyocite sur lame de culture Cellule sanguine de Wolbachia Col de chemise propre Col de chemise sale 200µm 200µm Contraintes liées à l’échantillon Le plus proche du vivant (Fixé) Ultrafin Epaisseur de coupe Déshydraté Surface conductrice MET et MEB comprise entre 60 et 70 nm MET MET et MEB MEB Etapes de préparations des échantillons pour la MET 3 jours minimum Culture cellulaire Tissu ou Suspensions (virus, bactéries, …) MET Fixation des protéines MEB 1 jour au mini Fixation des protéines Fixation des Lipides Déshydratation Acétone ou Ethanol Déshydratation Acétone ou Ethanol Inclusion dans la résine Appareil par contournement du pt critique du CO2 Polymérisation 60 à 70° C dans étuve (obtention de blocs) CO2 liq par purges à 10°C CO2 liq /gaz 31°C (pt critique) Coupes au microtome Semi-fines ~ 1 µm Ultrafines ~ 60 à 70 nm CO2 gaz 40°C Dessiccation totale Contraste Métallisation Observation Observation Prise de contact : 35 36 Compétence et savoir faire : Préparation d’échantillons biologiques pour l’observation au MET et MEB Techniques classiques de fixation, déshydratation, inclusion et de coupes pour l’analyse ultrastructurale, Techniques immunocytochimiques avec immunomarquage à l’or colloïdal en pré ou post enrobage avec amplification à l’argent si nécessaire. Coloration négative de macromolécules et de fractions cellulaires Réalisation de coupes fines suivi du contraste Métallisation et dessiccation par contournement du point critique. Observation aux microscopes MEB et MET. Collecte des résultats sous forme fichiers numériques Enseignements et formations Nouvelles techniques microscopie Electronique AMW (Automatic Microwave Tissue Processor) Techniques à froid : cryofixation-cryocoupeCryo-MET –cryo-transfert pour le MEB Tomographie électronique MEB 3 view Microscopie à balayage environnementale