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PASTOREX™ ROTAVIRUS TESTING PROCEDURE SPECIMEN PREPARATION å ç é 1. Stool dilution 1:11 in Sample Diluent R1 / Diluer les selles au 1:11 dans le Diluant Echantillon R1 / Disolución de heces 1:11 en diluyente de muestra R1 / Stuhlprobe 1:11 in Probenverdünnungsmittel R1 verdünnen / Diluizione delle feci 1:11 con Diluente campione R1 / Diluição das fezes a 1:11 em diluente de amostras R1 2. Vortex mixing (1 min.) / Mélanger au vortex (1 min.) / Mezclar en el vortex (1 min.) / Auf dem Vortex mischen (1 Min.) / Miscelazione mediante Vortex (1 min.) / Mistura por agitação em vortex (1 min) 3. Centrifugation and use supernatant / Centrifuger et utiliser le surnageant / Centrifugar y utilizar el sobrenadante / Abzentrifugieren und Überstand abnehmen / Centrifugazione e utilizzazione del supernatante / Centrifugação e uso do sobrenadante AGGLUTINATION REACTION è ê ë í 4. After homogenization, dispense one drop of R2 and R3 in two adjacent circles / Après homogénéisation, distribuer une goutte de R2 et R3 dans deux cercles adjacents / Después de realizar la homogeneización, suministrar una gota de R2 y una de R3 en dos círculos adyacentes / Nach dem Homogenisieren einen Tropfen R2 und R3 in zwei benachbarte runde Reaktionsfelder pipettieren / Al termine dell'omogeneizzazione, dispensare una goccia di R2 e R3 in due pozzetti adiacenti / Após a homogeneização, dispense uma gota de R2 e R3 em dois círculos adjacentes 5. Dispense one drop of specimen in both circles / Distribuer une goutte de l’échantillon dans chaque cercle / Distribuir una gota de la muestra en ambos círculos / In beide Reaktionsfelder je einen Tropfen der Probe pipettieren / Dispensare una goccia di campione in entrambi i pozzetti / Dispense uma gota da amostra em ambos os círculos 6. Mix drops in each circle using different sticks / Mélanger les gouttes dans chaque cercle à l’aide de bâtonnets différents / Mezclar las gotas en cada círculo utilizando varillas diferentes / Tropfen in jedem Reaktionsfeld mit getrennten Stäbchen mischen / Miscelare le gocce in ciascun pozzetto utilizzando bastoncini diversi / Misture as gotas em cada círculo utilizando varetas diferentes 7. Spread over the entire circle section and rotate 5 minutes / Etaler sur la totalité du cercle et appliquer un mouvement circulaire pendant 5 minutes / Extender por toda la sección circular y girar durante 5 minutos / Über das gesamte Reaktionsfeld verteilen und 5 Minuten drehen / Spargere il liquido su tutta la superficie del pozzetto e ruotare per 5 minuti / Espalhe por toda a secção circular e ponha a girar por cinco minutos INTERPRETATION (Read within 5 minutes / lire dans les 5 minutes / leer en los 5 minutos / innerhalb von 5 Minuten ablesen / Lettura entro 5 minuti / leitura em 5 minutos) Positive / Positif / Positivo / Positiv / Positivo / Positivo R3: Red homogenous or slightly granular suspension without visible aggregates / Suspension rouge homogène ou légèrement granulaire sans agrégats visibles / Suspensión roja homogénea o ligeramente granulada sin agregados visibles / Rote homogene oder leicht granuläre Suspension ohne sichtbare Aggregate / Sospensione omogenea o leggermente granulare di colore rosso senza aggregati visibili / Suspensão vermelha homogénea ou ligeiramente granulosa sem agregados visíveis R2: Cleared suspension with visible aggregates easily seen with naked eye / Suspension claire avec des agrégats visibles à l’œil nu / Suspensión clara con agregados visibles a simple vista / Geklärte Suspension mit sichtbaren Aggregaten mühelos mit bloßem Auge erkennbar / Sospensione su fondo trasparente con aggregati visibili facilmente rilevabili ad occhio nudo / Suspensão clarificada com agregados visíveis facilmente perceptíveis a olho nu Negative / Négatif / Negativo / Negativ / Negativo / Negativo R3: Red homogenous or slightly granular suspension, without visible clumps / Suspension rouge homogène ou légèrement granulaire sans agrégats visibles / Suspensión roja homogénea o ligeramente granulada, sin grumos visibles / Rote homogene oder leicht granuläre Suspension ohne sichtbare Klumpen / Sospensione omogenea o leggermente granulare di colore rosso senza aggregati visibili / Suspensão vermelha homogénea ou ligeiramente granulosa sem grumos visíveis R2: Red homogenous or slightly granular suspension, without visible clumps / Suspension rouge homogène ou légèrement granulaire sans agrégats visibles / Suspensión roja homogénea o ligeramente granulada, sin grumos visibles / Rote homogene oder leicht granuläre Suspension ohne sichtbare Klumpen / Sospensione omogenea o leggermente granulare di colore rosso senza aggregati visibili / Suspensão vermelha homogénea ou ligeiramente granulosa sem grumos visíveis Invalid / Invalide / No válido / Ungültig / Non valido / Inválido R3: Suspension with visible aggregates easily seen with naked eye / Suspension avec des agrégats visibles à l’œil nu / Suspensión con agregados visibles a simple vista / Suspension mit sichtbaren Aggregaten mühelos mit bloßem Auge sichtbar / Sospensione su fondo con aggregati visibili facilmente rilevabili ad occhio nudo / Suspensão com agregados visíveis facilmente perceptíveis a olho nu PASTOREX™ ROTAVIRUS 52300 30 TESTS POUR LA DETECTION DE L’ANTIGENE DU ROTAVIRUS HUMAIN DANS LES SELLES PAR METHODE D’AGGLUTINATION LATEX INTERET CLINIQUE Le rotavirus est la première cause mondiale de diarrhées sévères chez les nourrissons et les jeunes enfants, entraînant le décès de plus de 600,000 enfants chaque année, principalement dans les pays en voie de développement (1). On estime que chaque année plus de 25 millions de consultations et plus de 2 millions d’hospitalisations sont dues aux infections par le rotavirus (2). Les souches les plus fréquemment rencontrées appartiennent aux sérotypes G1, G2, G3, G4 et G9, avec de fortes disparités géographiques (3). Le diagnostic précoce de l’infection humaine par le rotavirus est essentiel pour une prise en charge adaptée des patients et le contrôle de l’infection. Le diagnostic de gastroentérite à rotavirus peut être réalisé soit par la détection des particules virales par microscopie électronique ou par détection de l’antigène viral dans les selles à l’aide de méthodes d’immuno-détection spécifiques. DOMAINE D’UTILISATION Pastorex™ Rotavirus est un test d’agglutination latex pour la détection directe de l’antigène du rotavirus dans les selles humaines. Le test peut être utilisé comme aide au diagnostic des patients diarrhéiques. PRINCIPE Des particules de latex recouvertes d’anticorps anti-rotavirus sont agglutinées en présence de selles contenant de l’antigène du rotavirus. Un control latex négatif est testé en parallèle pour éliminer les réactions d’agglutination non spécifiques. REACTIFS Chaque kit de Pastorex™ Rotavirus contient les éléments suivants: Etiquetage R1 R2 R3 R4 Xi-irritant Sample Diluent Nature des réactifs Diluant Echantillon : Tampon Phosphate pH 7,5, 0,1% Tween® 20, < 1,5% ProClin™ 300 Test Latex : Particules de latex colorées en rouge et recouvertes d’anticorps polyclonal de lapin anti-rotavirus (flacon compte-goutte avec bouchon blanc), < 1,5% ProClin™ 300 Contrôle Négatif : Particules de latex colorées Negative en rouge et recouvertes d’anticorps polyclonal Control de lapin (flacon compte-goutte avec bouchon vert), < 1,5% ProClin™ 300 Latex Test Positive Contrôle Positif : Antigène de rotavirus (flacon Control compte-goutte avec bouchon rouge) PROTOCOLE Recueil des échantillons Recueillir les échantillons de selles dans un récipient approprié. Les selles doivent être testées immédiatement. Si ce n’est pas le cas, les échantillons devront être conservés immédiatement et jusqu’à 24 heures à +2-8°C, ou à -20 or -80°C au-delà de 24 heures. Présentation 1 x 50 ml 1 x 1,5 ml 1 x 1,5 ml 1 x 0,5 ml (qs 5 tests) Cartes d’agglutination jetables avec 8 cercles par cartes x8 Bâtonnets plastiques jetables x 80 Attention: certains réactifs contiennent du ProClin™ 300 < 1.5% R43: Peut entraîner une sensibilisation par contact avec la peau. S23-24-37-60: Ne pas respirer les vapeurs/aérosols. Éviter le contact avec la peau. Porter des gants appropriés. Éliminer le produit et son récipient comme un déchet dangereux. La Fiche de Données de Sécurité est disponible sur demande. Matériel nécessaire non fourni : micro-tubes échantillons, vortex, centrifugeuse, gants, lunettes de protection et pipettes (50 µl, 100 µl) Matériel optionnel : agitateur orbital CONSERVATION ET VALIDITE DES REACTIFS Se référer aux indications mentionnées sur le coffret pour les conditions de conservation et la date d’expiration. Tous les réactifs sont stables jusqu’à la date d’expiration indiquée sur l’étiquette, sous réserve d’être conservés à +2-8°C et en l’absence de contamination microbienne (y compris après ouverture). Conserver les flacons des réactifs latex en position verticale. Les réactifs latex ne doivent pas être congelés. Préparation des échantillons • Diluer l’échantillon au 1/11 dans le Diluant Echantillon R1: 100 µl de selle pour un échantillon liquide (ou 100 mg de selles non liquide) et 1 ml de Diluant Echantillon R1. • Boucher le micro-tube et agiter vigoureusement (vortex). • Centrifuger l’échantillon dilué (5 minutes à 3000g). • Il est recommandé de ne pas procéder à plus de 3 cycles de congélation / décongélation. Procédure La réaction d’agglutination doit être réalisée sur le surnageant de l’échantillon dilué. Note: si le surnageant n’est pas homogène après centrifugation, il est important de ne pas prendre de particules en suspension. • Laisser les réactifs revenir à température ambiante (+18-30°C). • Après un mélange vigoureux pour homogénéiser les réactifs (vortex), déposer une goutte du Test Latex (R2) et une goutte du Contrôle Négatif R3 dans des cercles séparés adjacents d’une nouvelle carte d’agglutination. • Déposer dans chaque paire de cercles, et à côté de chaque goutte de R2 ou R3, 50 µl du surnageant des selles (ou du Contrôle Positif R4). • A l’aide de bâtonnets différents, mélanger le contenu des deux cercles en répartissant le mélange sur la totalité de la surface du cercle. • Donner à la carte un mouvement délicat de rotation (100 rpm) à température ambiante (+18-30°C) pendant 5 minutes manuellement ou à l’aide d’un agitateur orbital. • Observer l’apparition d’une agglutination visible à l’oeil nu dans les 5 minutes. Se référer au schéma du protocole décrit en première page de la notice. Interprétation des résultats Le Contrôle Positif (R4) doit être testé régulièrement durant la période d’utilisation du kit. Se référer à la première page de la notice pour le mode d’interprétation des résultats. Important : Le test est considéré invalide lorsque : • Une réaction positive est obtenue avec le Contrôle Négatif (Echantillon + R3). • Une réaction négative est obtenue avec le Contrôle Positif (R4 + R2) LIMITATIONS • Il est recommandé d’effectuer le test sur des selles recueillies dans les 7 jours suivant l’apparition de la diarrhée. Les échantillons recueillis au-delà de 7 jours peuvent donner des résultats faussement négatifs (4). • Un résultat invalide avec le Contrôle Négatif (R3) n’exclut pas la présence de rotavirus. Dans cette situation, il est recommandé de tester un nouvel échantillon ou de re-tester le même échantillon à l’aide d’une autre méthode. • Des résultats invalides peut être observés en cas de lecture au delà de 5 minutes. • La contamination des selles par l’urine peut interférer lors de la réaction. • Il est recommandé de préparer un nouvel extrait de selles en cas de résultat invalide. • La présence d’antigène du rotavirus dans les selles n’exclut pas la présence d’autres agents infectieux. • Le diagnostic d’une infection récente par Rotavirus ne peut être établi que sur la base d’un ensemble de données cliniques et sérologiques. Le résultat d’un seul dosage ne constitue pas une preuve suffisante pour le diagnostic d’une infection récente. PERFORMANCES Les performances du kit Pastorex™ Rotavirus ont été évaluées par 2 sites sur un panel de 393 échantillons testés à l’aide de méthodes EIA et/ou moléculaires. La spécificité et la sensibilité relatives du kit Pastorex™ Rotavirus sont respectivement de 98,9% [CI95%=96,2%-99,9%] (184/186) et 92,8% [IC95%=88,3%-95,9%] (192/207). La limite de détection du test a été calculée à 1,3x107 FFU/ml (Fluorescent Focus Units) à l’aide d’une souche de Rotavirus simien. Le kit Pastorex™ Rotavirus a été testé sur un panel de pathogènes intestinaux fréquemment retrouvés dans les selles : Astrovirus, Adenovirus, Norovirus, E. coli, Shigella sp., Salmonella sp., Campylobacter sp. Aucune réaction croisée n’a été observée avec ces pathogènes. Aucun effet crochet n’a été observé en présence de 4 selles fortement concentrées en antigène de Rotavirus. 3 échantillons (négatif, positif faible, positif fort) ont été testés pendant 20 jours consécutifs afin de déterminer la reproductibilité du test. Aucun changement d’intensité d’agglutination n’a été noté au niveau du Test Latex et du Contrôle Négatif. PRECAUTIONS CONTROLE QUALITE DU FABRICANT La qualité des résultats dépend du respect des Bonnes Pratiques de Laboratoires. • Pour utilisation diagnostique in vitro uniquement • Tous les réactifs doivent être utilisés à température ambiante (+18-30°C). • Ne pas toucher avec les doigts la surface réactionnelle des cartes d’agglutination. • Changer de pipette ou d’embout jetable entre chaque échantillon testé. • Agiter les flacons de latex avant utilisation. • Essuyer l’embout des flacons compte-gouttes pour obtenir des gouttes bien calibrées. • Tenir les flacons réactifs en position verticale pour la distribution des gouttes. • Changer les bâtonnets de mélange entre chaque réaction. • Eliminer le matériel jetable utilisé dans une poubelle autoclavable ou un bac désinfectant. Hygiène et consignes de sécurité Toujours appliquer les méthodes recommandées et respecter les précautions préconisées pour la protection contre les risques infectieux potentiels. Tous les échantillons manipulés doivent être considérés comme potentiellement infectieux. Tous les produits fabriqués et commercialisés par la société Bio-Rad sont placés sous un système d’assurance qualité de la réception des matières premières jusqu’à la commercialisation des produits finis. Chaque lot de produit fini fait l’objet d’un contrôle de qualité et n’est commercialisé que s’il est conforme aux critères d’acceptation. La documentation relative à la production et au contrôle de chaque lot est conservée par le fabricant. REFERENCES 1. Parashar U.D., Gibson C.J., Bresee J.S., Glass R.I. Rotavirus and severe childhood diarrhea. Emerg. Infect. Dis. 2006; 12: 304-306. 2. WHO Weekly Epidemiological Record. 2007; 32: 285-296. 3. WHO Weekly Epidemiological Record. 2008; 47: 421-428 4. Richardson S., Grimwood K., Gorrell R., Palombo E., Barnes G., Bishop R. Extended excretion of rotavirus after severe diarrhea in young children. Lancet, 1998; 351: 1844-1848. Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 Fax : +33 (0) 1 47 41 91 33 10/2010 code: 881054